KR20220144334A - 보툴리늄 독소 전위 도메인 및 엔도라이신을 포함하는 단백질 복합체 및 이를 포함하는 항균 조성물 - Google Patents

보툴리늄 독소 전위 도메인 및 엔도라이신을 포함하는 단백질 복합체 및 이를 포함하는 항균 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 본 발명은 보툴리늄 독소 전위 도메인 및 엔도라이신을 포함하는 단백질 복합체에 관한 것이다.
본 발명의 보툴리늄 독소 전위 도메인 및 엔도라이신을 포함하는 단백질 복합체를 이용하는 경우, 항균 효과를 나타내므로 항균용 조성물 또는 항생제로 사용할 수 있다.

Description

보툴리늄 독소 전위 도메인 및 엔도라이신을 포함하는 단백질 복합체 및 이를 포함하는 항균 조성물{Protein Complex Comprising Botulinum Toxin Translocation Domain and Endolysin, and Anti-Bacterial Composition Comprising Thereof}
본 발명은 보툴리늄 독소 전위 도메인 및 엔도라이신을 포함하는 단백질 복합체에 관한 것이다.
다양한 항생제에 내성을 가지는 다제내성균에 의한 감염증은 한국을 비롯한 세계 각국에서 심각한 의료 문제를 야기하고 있다. 국내에서는 2010년 12월 [감염병의 예방 및 관리에 관한 법률]의 시행에 따라 6종의 항생제 내성균 (VRSA (vancomycin-resistant Staphylococcus aureus), VRE(vancomycin-resistant Enterococcus), MRSA(methicillin-resistant Staphylococcus aureus), MRPA (multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa), MRAB(multidrug-resistant Acinetobacter baumannii), CRE(carbapenem-resistant Enterobcteriaceae)을 감시 대상으로 지정하여 관리하고 있다. 미국 질병관리본부에서는 병원 유래 다제내성균 6종(Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, 및 Enterobacter spp. ESKAPE) 및 ESBL(extended spectrum β-lactamase) 균주와 카바페넴 내성균 등 각종 다제내성균에 의한 의료 문제의 심각성을 지적하고 있다. 이러한 다제내성균에 의한 병원 내 감염은 특히 중증 환자의 경우에서 더 많이 발생하는 것으로 보고되어 있으며, 이들이 점점 더 강력한 항생제에 대한 내성을 획득하고 있기 때문에 치료가 점차 어려워지고 있다.
세균(bacteria)은 세포벽 구조에 따른 그람 염색 양상의 차이를 기준으로 그람 양성균과 그람 음성균으로 분류되며, 각각의 세포벽 구조는 다음과 같다. 그람양성은 '세포 내막 (inner membrane), 펩티도글리칸 (peptidoglycan)'으로 구성되어 있고, 그람 음성은 '세포 내막(inner membrane), 펩티도글리칸 (peptidoglycan), 세포 외막 (outer membrane)'으로 구성되어 있다. 그 중에서도 그람 음성균의 세포 외막은 항균 소재를 비롯한 각종 물질이 세포 내부로 전달되는 것을 차단하는 작용을 하는 것으로 알려져 있다.
따라서, 표적 균주의 내부로 목적 단백질을 효과적으로 전달하기 위한 항균 물질의 개발의 필요성이 있다.
본 발명자들은 표적 균주의 내부로 목적 단백질을 효과적으로 전달하기 위한 항균 물질을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 보툴리늄 독소의 전위 도메인을 이용하는 경우 목적 단백질을 균주의 내부로 효과적으로 전달가능함을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 보툴리늄 독소 전위 도메인 및 엔도라이신을 포함하는 단백질 복합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 단백질 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 단백질 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터로 형질 전환된 숙주세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 단백질 단편을 혼합하는 단계 및 혼합된 단백질 단편을 결합하는 단계를 포함하는 단백질 복합체의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 단백질 복합체를 포함하는 항균용 조성물을 제공하는 것이다.
한편, 본 발명의 또 다른 목적은 표적 균주에 상기 단백질 복합체를 반응시키는 단계 및 항균 활성을 나타내는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 단백질 복합체의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 보툴리늄 독소 전위 도메인 및 엔도라이신을 포함하는 단백질 복합체를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 보툴리늄 독소 전위 도메인은, 서열번호 29, 38, 39의 아미노산 서열 중 선택되는 어느 하나이상일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 엔도라이신은, lys, LysPA26, PB1_gp48, LysAB2_P3, PlyF307, AcLys, PlyPA03, PlyPA91, Abtn-4, WCHABP1_gp01, WCHABP12_gp19, gh-1p12, B3ORF25, phi-13Sp4, phi-6S_4, KP27_166, KP13_gp066, BI057_gp221, LPSE_00024, STP4a_120, Lys68, SPN1S_0028 및 P22gp66으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 단백질 복합체는 수용체 부착 단백질을 추가적으로 포함하는 것일 수 있다. 상기 수용체 부착 단백질은, 일 예로 PRD1_04, P1301_0153, P24_0149, Pb5, AbTJ_gp52, AbTJ_gp53, phiAB6_gp40, S, A318_gp060, rv5_gp030, rv5_gp033, PaoP5_075, BH773_gp153, AU075_gp145, CPT_Sugarland_191, JIPhKp127_0170, AmPhEK80_0178, P22_gp19, DET7_207, HWD08_gp154, BI021_gp088, HWD21_gp023, HWC41_gp146, HOS12_gp017, HOU44_gp075, I133_gp019, HWC50_gp066 및 HOS34_gp106으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 단백질 복합체는 '엔도라이신, 보톨리늄 독소 전위 도메인 및 수용체 부착 단백질'의 순서로 구성될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 단백질 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 단백질 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터로 형질 전환된 숙주세포를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 21의 핵산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 보툴리늄 독소 전위 도메인을 포함하는 제1 단백질 단편 및 엔도라이신을 포함하는 제2 단백질 단편을 혼합하는 단계 (a); 및 상기 혼합된 단백질 단편을 결합하는 단계 (b);를 포함하는 단백질 복합체의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 혼합하는 단계 (a)는 보툴리늄 독소 전위 도메인을 포함하는 제1 단백질 단편 및 엔도라이신을 포함하는 제2 단백질 단편을 혼합하는 단계에서 수용체 부착 단백질을 포함하는 제3 단백질 단편을 더 혼합할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 단백질 단편은 인테인을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 단백질 단편을 결합하는 단계 (b)는 단백질 트랜스 스플라이싱 반응에 의해 이루어지는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 단백질 단편은 스파이 택&캐쳐를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 단백질 복합체를 포함하는 항균용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 표적 균주에 상기 단백질 복합체를 반응시키는 단계; 및 상기 단백질 복합체가 표적 균주에 대한 항균 활성을 나타내는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 항균 활성 단백질 복합체의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 보툴리늄 독소 전위 도메인 및 엔도라이신을 포함하는 단백질 복합체를 제공한다. (b) 본 발명은 상기 단백질 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질 전환된 숙주세포를 제공한다. (c) 본 발명은 단백질 단편을 혼합하는 단계 및 결합하는 단계를 포함하는 단백질 복합체의 제조 방법을 제공한다. (d) 본 발명은 단백질 복합체를 포함하는 항균용 조성물을 제공한다. (e) 본 발명의 보툴리늄 독소 전위 도메인 및 엔도라이신을 포함하는 단백질 복합체를 이용하는 경우, 항균 효과를 나타내므로 항균용 조성물 또는 항생제로 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 표적 균주에 단백질 복합체를 반응시키는 단계 및 항균 활성을 나타내는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 단백질 복합체의 스크리닝 방법을 제공한다.
도 1은 전장 트랜스라이신 제조를 위한 벡터를 나타낸다.
도 2는 SDS 젤 전기영동으로 트랜스라이신을 확인한 결과를 나타낸다.
도 3은 SDS 젤 전기영동으로 이노라이신을 확인한 결과를 나타낸다.
도 4는 배양액의 탁도를 통해 확인한 트랜스라이신과 이노라이신의 세포 내 발현 유무에 따른 용균 효과를 나타낸다.
도 5는 배양액의 탁도를 통해 확인한 트랜스라이신, 이노라이신, 엔도라이신의 세포 내 발현 유무에 따른 생장 양상을 그래프로 나타낸다.
도 6의 (A)는 트랜스라이신을 제조하는데 사용하는 4종의 단백질 단편(LysPA26-Gp41.1N, PB1_gp48-Gp41.1N, Gp41.1C-iLCHN-CfaN, CfaC-PRD1_04)을 나타낸다. 도 6의 (B)는 트랜스라이신을 제조하는데 사용하는 3종의 단백질 단편(LysPA26-Gp41.1N, Gp41.1C-iLCHN-SpyC003, SpyT003-PRD1_04)을 나타낸다.
도 7은 시간에 따른 PB1_gp48과 iLCHN의 트랜스 스플라이싱 결과를 나타낸다.
도 8은 시간에 따른 LysPA26과 iLCHN의 트랜스 스플라이싱 결과를 나타낸다.
도 9는 시간에 따른 iLCHN과 PRD1의 트랜스 스플라이싱 결과를 나타낸다.
도 10은 시간에 따른 PB1_gp48, iLCHN과 PRD1의 트랜스 스플라이싱 결과를 나타낸다.
도 11은 시간에 따른 LysPA26, iLCHN과 PRD1의 트랜스 스플라이싱과 생체접합의 결과를 나타낸다.
도 12는 스팟팅 어세이을 수행하는 방법을 나타내는 모식도이다.
도 13은 스팟팅 어세이를 통해 확인한 사균에 대한 LysPA26-Gp41.1N 단편의 용균 활성을 나타낸다.
도 14는 스팟팅 어세이를 통해 확인한 사균에 대한 PB1_gp48-Gp41.1N 단편의 용균 활성을 나타낸다.
도 15는 스팟팅 어세이를 통해 확인한 생균에 대한 트랜스라이신 (LysPA26-iLCHN-PRD1) 및 엔도라이신 단편의 용균 활성을 나타낸다.
도 16은 스팟팅 어세이를 통해 확인한 생균에 대한 트랜스라이신 (PB1_gp48-iLCHN-PRD1) 및 엔도라이신 단편의 용균 활성을 나타낸다.
도 17은 스팟팅 어세이를 통해 확인한 생균에 대한 트랜스라이신 (PB1_gp48-iLCHN-PRD1) 및 엔도라이신 단편, 이노라이신의 용균 활성을 나타낸다.
도 18은 스팟팅 어세이를 통해 확인한 생균에 대한 트랜스라이신 (LysPA26-iLCHN-PRD1) 및 엔도라이신 단편, 이노라이신의 용균 활성을 나타낸다.
도 19는 트랜스라이신의 처리 유무 및 시간에 따른 생균의 전자현미경 이미지를 나타낸다.
도 20은 CFU reduction assay를 통한 트랜스라이신과 이노라이신의 용균 활성을 나타낸다.
도 21은 목표 균주에 대한 트랜스라이신 라이브러리 스크리닝 모식도를 나타낸다.
도 22는 목표 균주의 생균에 대한 각 트랜스라이신의 농도별 용균 양상을 나타낸다.
도 23은 본 발명의 트랜스라이신 구조의 모식도이다.
도 24는 본 발명의 트랜스라이신의 작용 기전의 모식도이다.
도 25는 인테인을 활용한 트랜스라이신의 합성 방법의 모식도이다.
도 26은 인테인과 스파이 택&캐쳐를 활용한 트랜스라이신 합성 방법의 모식도이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 보툴리늄 독소 전위 도메인 및 엔도라이신을 포함하는 단백질 복합체를 제공한다.
본 명세서 상의 용어 단백질 복합체는 "트랜스라이신(translysin)"과 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
본 명세서 상의 용어 "보툴리늄 독소 전위 도메인"이란 보툴리늄 독소의 경쇄를 신경세포의 내부로 전달하는 기능을 갖는 단백질을 의미하며, 상기 전달하는 과정은 보툴리늄 독소가 내포작용을 통해 세포 내부로 이입된 이후 엔도솜 내부가 산성화됨에 따라 전위 도메인이 효소 활성을 나타내게 되며, 결과적으로 경쇄가 엔도솜에서 세포질로 전달되는 과정이 이루어진다. 본 발명의 용어 보툴리늄 독소 전위 도메인은 "보툴리늄 독소 전위 도메인 HN", "전위 도메인", "HN" 등으로도 지칭될 수 있다. 본 발명에서 "보툴리늄 독소 전위 도메인"은 본 발명의 단백질 복합체가 세포막 (세포 외막)을 통과할 수 있게 하는 역할을 하게 된다. 이를 통해 본 발명의 단백질 복합체는 세포 외막과 내막 사이에 존재하는 펩티도글루칸에 접근할 수 있게 된다
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 보툴리늄 독소 전위 도메인은, 서열번호 29, 38, 39의 아미노산 서열 중 선택되는 어느 하나이상일 수 있다.
본 명세서에서, 폴리뉴클레오타이드("유전자"와 혼용될 수 있음) 또는 폴리펩타이드("단백질"과 혼용될 수 있음)가 "특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열을 포함한다" 또는 "특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열로 이루어진다" 함은 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드가 상기 특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열을 필수적으로 포함하는 것을 의미할 수 있으며, 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 본래의 기능 및/또는 목적하는 기능을 유지하는 범위에서 상기 특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열에 변이(결실, 치환, 변형, 및/또는 부 가)가 가해진 "실질적으로 동등한 서열"을 포함하는 것(또는 상기 변이를 배제하지 않는 것)으로 해석될 수 있다. 일 예에서, 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드가 "특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열을 포함한다" 또는 " 특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열로 이루어진다 또는 표현된다" 함은 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드가 (i) 상기 특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열을 필수적으로 포함하거나, 또는 (ii) 상기 특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열과 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 또는 99.9% 이상의 상동성 (identity)을 갖는 아미노산 서열로 이루어지거나 이를 필수적으로 포함하고 본래의 기능 및/또는 목적하는 기능을 유지하는 것을 의미할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 단백질 복합체는 보툴리늄 독소 경쇄(Light chain, LC)를 추가적으로 포함할 수 있다. 보툴리늄 독소 경쇄(Light chain, LC)가 추가됨으로써 보툴리늄 독소 전위 도메인을 수용성 형태로 발현하는데 도움을 줄 수 있다. 이때, 상기 보툴리늄 독소 경쇄는 불활성된 상태인 것을 사용하는 것이 좋다. 본 발명의 실시예에 따르면, 보툴리늄 독소 경쇄는 아연과 결합하는 서열을 변이시켜 불활성 형태로 유도된다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 불활성된 보툴리늄 독소 경쇄(iLC)는 서열번호 30, 40, 41 등의 아미노산 서열 중 선택되는 어느 하나이상일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 보툴리늄 독소 전위 도메인은 상기 불활성된 보툴리늄 독소 경쇄(iLC)와 연결될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 보툴리늄 독소 전위 도메인과 상기 불활성된 보툴리늄 독소 경쇄가 연결된 폴리펩타이드는 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서 상의 용어 "엔도라이신"이란 세균을 숙주로 하여 감염을 일으키는 바이러스에서 발현하는 단백질을 의미하며, 상기 엔도라이신은 숙주 세균의 세포벽을 용해시키는 활성을 나타낸다. 엔도라이신은 그 자체로는 세포 외막을 투과하지 못하기 때문에 그람 양성균에 대한 엔도라이신의 용균 활성만이 알려져 있다. 또한, 엔도라이신은 세균의 펩티도글라이칸을 기질로 하는 특성으로 인해 사람을 비롯한 진핵생물에 대해 세포 독성을 나타내지 않으며, 엔도라이신에 대한 내성을 갖는 세균이 출현한 사례가 보고되지 않았다.
본 발명에서는 "보툴리늄 독소 전위 도메인"에 의해 세포 외막을 통과하여 펩티도글루칸에 접근한 본 발명의 단백질 복합체가, 내재되어 있는 엔도라이신에 의해 펩티도글루칸을 분해함으로써 항균활성을 발휘하게 되는 것이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 엔도라이신은, lys, LysPA26, PB1_gp48, LysAB2_P3, PlyF307, AcLys, PlyPA03, PlyPA91, Abtn-4, WCHABP1_gp01, WCHABP12_gp19, gh-1p12, B3ORF25, phi-13Sp4, phi-6S_4, KP27_166, KP13_gp066, BI057_gp221, LPSE_00024, STP4a_120, Lys68, SPN1S_0028 및 P22gp66으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 다만, 용균 활성을 나타내는 엔도라이신은 어느 것이나 본 발명에 사용될 수 있기 때문에, 반드시 특정의 것으로 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 단백질 복합체는 수용체 부착 단백질을 추가적으로 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서 상의 용어 "수용체 부착 단백질"이란 박테리오파지가 숙주 세포를 감염할 때 세포벽의 특정 수용체를 인식하고 부착하는 과정에 관여하는 구조 단백질을 의미한다. 수용체 부착 단백질은 감염 과정에서 박테리오파지의 유전 물질이 숙주 세포 내부로 전달되는 동안 안정적인 결합을 유지시키는 역할을 하며, 그람 음성 및 양성균 모두에 대해 결합가능한 것으로 알려져 있어, 본 발명은 상기 수용체 부착 단백질의 특성을 사용하여 단백질 복합체의 균주와의 접촉 및 단백질 전달 효율을 증대시켰다. 즉, 본 발명에 '수용체 부착 단백질'이 포함됨으로써, 본 발명의 단백질 복합체가 사멸 대상 미생물에 보다 쉽고 견고하게 결합될 수 있게 하는 것이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 수용체 부착 단백질은, PRD1_04, P1301_0153, P24_0149, Pb5, AbTJ_gp52, AbTJ_gp53, phiAB6_gp40, S, A318_gp060, rv5_gp030, rv5_gp033, PaoP5_075, BH773_gp153, AU075_gp145, CPT_Sugarland_191, JIPhKp127_0170, AmPhEK80_0178, P22_gp19, DET7_207, HWD08_gp154, BI021_gp088, HWD21_gp023, HWC41_gp146, HOS12_gp017, HOU44_gp075, I133_gp019, HWC50_gp066 및 HOS34_gp106으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 다만, 목표 균주와 상호작용이 가능한 수용체 부착 단백질이라면 어느 것이나 사용할 수 있기 때문에, 반드시 특정의 종류로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 단백질 복합체는 엔도라이신, 보툴리늄 독소 전위 도메인 및 수용체 부착 단백질과 같은 순서로 위치한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 단백질 복합체는 단백질 복합체의 구성이 아미노 말단에서 카르복실 말단의 방향으로, '엔도라이신, 보툴리늄 독소 전위 도메인 및 수용체 부착 단백질'의 순서로 위치하는 것이 좋다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 단백질 복합체는 단백질 복합체의 구성이 아미노 말단에서 카르복실 말단의 방향으로, '엔도라이신, 보툴리늄 독소 경쇄, 보툴리늄 독소 전위 도메인 및 수용체 부착 단백질'의 순서로 위치하는 것이 좋다.
다만, 상기 기재된 단백질 복합체의 구성의 순서는 단지 예시적인 기재이므로, 상기 구성의 순서는 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 단백질 복합체는 엔도라이신이 보툴리늄 독소 전위 도메인의 아미노 말단에 결합하는 것이고, 수용체 부착 단백질이 보툴리늄 독소 전위 도메인의 카르복실 말단에 결합하는 것이 좋다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 단백질 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 명세서 상의 용어 "벡터"는 용어는 숙주 세포에 삽입되어 숙주 세포 게놈과 재조합되고 이에 삽입되거나, 또는 에피좀으로서 자발적으로 복제하는 컴피턴트 뉴클레오티드 서열을 포함하는 임의의 핵산을 의미한다. 이러한 벡터로는 선형 핵산, 플라스미드, 파지미드, 코스미드, RNA 벡터, 바이러스 벡터 등이 있다
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 단백질 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터로 형질 전환된 숙주세포를 제공한다. 이때, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 21의 핵산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
숙주 세포는 생체내 또는 시험관내에서 본 발명의 재조합 벡터 또는 폴리뉴클레오티드로 형질감염되거나, 형질 전환되거나 또는 감염된 세포를 포함한다. 본 발명의 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포는 재조합 숙주 세포, 재조합 세포, 재조합 미생물 또는 변이 미생물이다.
본 명세서 상의 용어 "형질 전환"이란 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외의 인자로서, 또는 염색체로의 삽입에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다.
본 명세서 상의 용어 "~에 의해 코딩되는" 또는 "~를 코딩하는"이란 폴리뉴클레오타이드가 폴리펩타이드 서열을 발현하는 것을 의미한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 보툴리늄 독소 전위 도메인을 포함하는 제1 단백질 단편 및 엔도라이신을 포함하는 제2 단백질 단편을 혼합하는 단계 (a); 및 상기 혼합된 단백질 단편을 결합하는 단계 (b);를 포함하는 단백질 복합체의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 혼합하는 단계 (a)는 보툴리늄 독소 전위 도메인을 포함하는 제1 단백질 단편 및 엔도라이신을 포함하는 제2 단백질 단편외에 수용체 부착 단백질을 포함하는 제3 단백질 단편을 추가로 혼합할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 혼합하는 단계 (a)는 보툴리늄 독소 전위 도메인을 포함하는 제1 단백질 단편, 엔도라이신을 포함하는 제2 단백질 단편 및 수용체 부착 단백질을 포함하는 제3 단백질 단편을 각각 1-5:1-5:1-5의 몰비로 혼합하는 것이 좋다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 혼합하는 단계는 상기 제1 단백질 단편, 제2 단백질 단편, 제3 단백질 단편을 각각 1:1:1의 몰비로 혼합하는 것이 좋다.
본 발명에서 상기 단백질 복합체의 제조 방법은 각각의 단백질 단편을 혼합하는 순서에는 제한이 없다. 예를 들어, 보툴리늄 독소 전위 도메인을 포함하는 제1 단백질 단편 및 수용체 부착 단백질을 포함하는 제3 단백질 단편을 혼합하여 반응한 후, 엔도라이신을 포함하는 제2 단백질 단편을 상기 생성물과 혼합하여 반응시켜 단백질 복합체를 제조할 수도 있다.
본 발명의 상기 보툴리늄 독소 전위 도메인, 엔도라이신 및 수용체 부착 단백질은 본 발명의 일 양태인 단백질 복합체에 포함되는 것이므로, 중복되는 내용에 대해서는 본 명세서의 과도한 중복성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 단백질 단편들 즉, 제1 단백질 단편, 제2 단백질 단편, 제3 단백질 단편은 인테인을 포함하는 것일 수 있다. 인테인은 분할된 스플릿 인테인 (split intein)의 IntN, IntC 두 단편이 자발적으로 펩타이드 결합을 생성하여 각각의 단편에 연결되어있는 익스테인 (extein)을 결합시키는 반응을 주관하며, 이 과정에서 결합된 인테인은 새롭게 결합된 익스테인으로부터 분리, 제거된다. 인테인에 의한 단백질 결합반응은 단백질 트랜스 스플라이싱(protein trans-splicing)으로 지칭된다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 제1 단백질 단편은 상술한 보툴리늄 독소 전위 도메인의 양 말단에 서로 다른 종류의 인테인, IntAC 및 IntBN를 포함하고; 상기 제2 단백질 단편은 IntAN 및 엔도라이신을 포함하며; 상기 제3 단백질 단편은 수용체 부착 단백질 및 IntBC를 포함한다. 상기 IntA 및 IntB는 서로 다른 종류의 인테인임을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 단백질 단편의 보툴리늄 독소 전위 도메인, 엔도라이신, 수용체 부착 단백질 및 인테인은 링커에 의해 연결될 수 있다.
본 명세서 상의 용어 "링커"란, 2개의 단백질을 연결하여 단백질을 만드는 경우 이들 단백질의 구조적 유연성을 증가시키거나 각 단백질의 활성이 증진될 수 있도록, 단백질과 단백질 사이에 삽입하는 펩타이드를 의미한다. 링커는 융합되는 각 단백질의 활성을 저해하지 않으면서 불필요한 면역반응을 일으키지 않는 것이라면 제한이 없으며, 상기 링커는 유연성 아미노산 링커, 비유연성 링커, 절단 가능한 아미노산 링커 및 화합물 링커로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 인테인은 Gp41.1, Cfa, NRDJ-1, IMPDH-1, Npu, Ssp, Rma, Ppu, Gp41.8 및 NrdA-2으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 단백질 단편을 결합하는 단계는 단백질 트랜스 스플라이싱 반응에 의해 이루어지는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 단백질 단편은 스파이 택&캐쳐를 포함하는 것일 수 있다. 스파이 택(Spy Tag)과 스파이 캐쳐(Spy catcher)는 재조합 단백질의 비가역적인 접합(congugation)을 위한 기술로, 스파이 택과 스파이 캐쳐는 자발적으로 반응하여 그 사이에 분자간 이소펩타이드 결합(intermolecular isopeptide bond)을 형성하게 됨으로써 두 재조합 단백질 사이 불가능한 생체접합(bioconjugation)이 가능하게 된다. 본 발명에서는 보툴리늄 독소 전위 도메인의 C 말단에 스파이 캐쳐(Spy catcher), 수용성 부착 단백질에는 스파이 택(Spy Tag)이 포함되어 있으며 스파이 캐쳐와 스파이 택의 이소펩타이드 결합을 통해 보툴리늄 독소 전위 도메인과 수용성 부착 단백질의 결합 효율을 높일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 단백질 단편을 결합하는 단계는 생체접합(Bioconjugation)에 의해 이루어지는 것일 수 있다. 생채접합(bioconjugation)은 두 생체 분자를 연결하는 화학반응으로, 일반적으로 단백질-단백질의 접합에 대한 것이며, 이를 통해 생체분자를 다른 기질에 연결하는 중요한 전략으로 작용되는 기술이다. 일 예로는 라이신(lysine), 시스테인(cystein), 티로신(tyrosine) 아미노산 잔기의 커플링과, 트립토판(tryptophan) 아미노산 잔기의 변형과, N- 및 C- 말단의 변형 등이 있다. 본 발명에서는 상기에서 서술한 바와 같이 스파이 캐쳐와 스파이 택의 이소펩타이드 결합을 통해 보툴리늄 독소 전위 도메인과 수용성 부착 단백질의 결합 효율을 높이게 되는 것이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 단백질 복합체를 포함하는 항균용 조성물을 제공한다. 이때, 상기 항균용 조성물은 pH를 바람직하게 7.4로 맞추는 것이 좋으며, 당 업계에서 공지된 조건이라면 어느 것에든 제한되지 않는다. 본 발명의 항균용 조성물은 그람 양성균 및 그람 음성균에 대해 항균활성을 나타낸다.
상기 그람 양성균은 스타필로코커스 속(Staphylococcus), 리스테리아 속(Listeria), 스트렙토코쿠스 속(Streptococcus), 코리네박테리움 속(Corynebacterium), 락토바실러스 속(Lactobacillus), 클로스트리듐 속(Clostridium), 엔테로코쿠스 속(Enterococcus), 에리시펠로트릭스 속(Erysipelothrix) 및 바실러스 속(Bacillus)을 포함하는 그람 양성균으로 당업계에 공지된 모든 그람 양성균을 포함할 수 있다.
상기 그람 음성균은 대장균 속(Escherichia), 슈도모나스 속(Pseudomonas), 살모넬라 속(Salmonella), 렙토스피라 속(Leptospira), 클렙시엘라 속(Klebsiella), 헬리코박터 속(Helicobacter) 및 엔테로박터 속(Enterobacter)을 포함하는 그람 음성균으로 당업계에 공지된 모든 그람 음성균을 포함할 수 있다.
본 발명의 항균용 조성물은 하기와 같은 병원균에 대하여 항균활성을 나타내는 것이나, 이에 제한되지는 않는다:
아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii), 방사선균류속(Actinomyces sp.)(예를 들어, 악티노미세스 이스라에라이(Actinomyces israelii) 및 악티노미세스 네스런다이(Actinomyces naeslundii)), 에로모나스 속(Aeromonas sp.)(예를 들어, 에로모난스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila), 에로모나스 베로나이 비오바 소브리아(에로모나스 소프리아)(Aeromonas veronii biovar sobria(Aeromonas sobria)) 및 에로모나스 카비에(Aeromonas caviae)), 아나플라스마 페토사이도필럼(Anaplasma phagocytophilum), 알칼리제니스 자일로스옥시단(Alcaligenes xylosoxidans), 악티노바실러스 악티노미세템코미탄(Actinobacillus actinomycetemcomitans), 바실루스 속(Bacillus sp.)(예를 들어 탄저균(Bacillus anthracis), 세레우스균(Bacillus cereus), 고초균(Bacillus subtilis), 투린지엔시스균(Bacillus thuringiensis), 및 바실루스 스티로서머필러스(Bacillus stearothermophilus), 가세균 속(Bacteroides sp.)(예를 들어, 박테로이드 프레질리스(Bacteroides fragilis)), 바르토넬라 속(Bartonella sp.)(예를 들어, 바르토넬라 바실리포르미스(Bartonella bacilliformis) 및 바르토넬라 핸셀레(Bartonella henselae)), 비피더스균 속(Bifidobacterium sp.), 보데텔라 속(Bordetella sp.)(예를 들어 백일해균(Bordetella pertussis), 파라백일해균(Bordetella parapertussis) 및 보데텔라 브론카이셉티카(Bordetella bronchiseptica)), 보렐리아 속(Borrelia sp.)(예를 들어, 회귀열보렐리아(Borrelia recurrentis) 및 보렐리아 버그도르페리(Borrelia burgdorferi)), 브루셀라균 속(Brucella sp.)(예를 들어, 소유산균(Brucella abortus), 개유산균(Brucella canis), 말타열균(Brucella melintensis) 및 돼지유산균(Brucella suis)), 버르크홀데리아 속(Burkholderia sp.)(예를 들어, 버르크홀데리아 수도말레이(Burkholderia pseudomallei) 및 버르크홀데이라 세파시아(Burkholderia cepacia)), 캄필로박터 속(Campylobacter sp.)(예를 들어, 공장캄필로박터(Campylobacter jejuni), 캄필로박터 콜리(Campylobacter coli), 캄필로박터 라리(Campylobacter lari) 및 캄필로박터 태아고균(Campylobacter fetus)), 캅노사이토파가 속(Capnocytophaga sp.), 카르디오박테리움 호미니스(Cardiobacterium hominis), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 클라미도필라 수모니에(Chlamydophila pneumonia), 앵무병 클라미도필라 (Chlamydophila psittaci), 시트로박터속 콕시엘라 부르네티(Citrobacter sp. Coxiella burnetii), 코리네박테리아 속(Corynebacterium sp.)(예를 들어, 디프테리아균(Corynebacterium diphtheria), 코리네박테리움 제이키움(Corynebacterium jeikeum) 및 코리네박테리움(Corynebacterium)), 클로스트리듐 속(Clostridium sp.)(예를 들어, 웰치균(Clostridium perfringens), 클로스트리듐 디피실리균(Clostridium difficile), 클로스트리듐 보툴리늄(Clostridium botulinum) 및 파상풍균(Clostridium tetani)), 에이케넬라 코로덴스(Eikenella corrodens), 엔테로박터 속(Enterobacter sp.)(예를 들어, 엔테로박터 에어로게네스균(Enterobacter aerogenes), 엔테로박터 아글로메란스(Enterobacter agglomerans), 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae) 및 장독성원소 대장균(enterotoxigenic E. Coli), 장침입성 대장균(enteroinvasive E. Coli), 장병원성 대장균(enteropathogenic E. Coli), 장출혈성 대장균(enterohemorrhagic E. Coli), 장관집합성 대장균(enteroaggregative E. Coli) 및 요로질환유발성 대장균(uropathogenic E. coli)과 같은 기회 감염성 대장균을 포함하는 대장균(Escherichia coli)), 장구균 속(Enterococcus sp.)(예를 들어 엔데로코쿠스 페칼리스(Enterococcus faecalis) 및 엔테로코쿠스 페슘(Enterococcus faecium)), 에르리치아 속(Ehrlichia sp.)(예를 들어, 에르리치아 카핀시아(Ehrlichia chafeensia) 및 에프리치아 카니스(Ehrlichia canis)), 돼지단독균(Erysipelothrix rhusiopathiae), 유박테리움 속(Eubacterium sp.), 야토병균(Francisella tularensis), 누클레아튬균(Fusobacterium nucleatum), 가드네렐라 베지날리스(Gardnerella vaginalis), 게멜라 모르빌로럼(Gemella morbillorum), 헤모필루스 속(Haemophilus sp.)(예를 들어, 인플루엔자균(Haemophilus influenzae), 헤모필루스 듀크레이(Haemophilus ducreyi), 헤모필루스 에이집티우스(Haemophilus aegyptius), 헤모피루스 헤모인플루엔자(Haemophilus parainfluenzae), 헤모필루스 헤모리티쿠스(Haemophilus haemolyticus) 및 헤모필루스 파라헤모리티쿠스(Haemophilus parahaemolyticus)), 헬리코박터 속(Helicobacter sp.)(예를 들어, 헬리코박터 피포리(Helicobacter pylori), 헬리코박터 시네디(Helicobacter cinaedi) 및헬리코박터 페넬리에(Helicobacter fennelliae)), 킹겔라 킹게(Kingella kingii), 클레프시엘라 속(Klebsiella sp.)(예를 들어, 폐렴간균 (Klebsiella pneumoniae), 클레브시엘라 그라눌로마티스(Klebsiella granulomatis) 및 클레브시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca)), 젖산균 속(Lactobacillus sp.), 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes), 렙토스피라 인테로간스(Leptospira interrogans), 레지오필라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 렙토스피라 인테로간스(Leptospira interrogans), 펩토사슬알균 속(Peptostreptococcus sp.), 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhalis), 모르가넬라 속(Morganella sp.), 모비룬쿠스 속(Mobiluncus sp.), 미구균 속(Micrococcus sp.), 마이코박테리움 속(Mycobacterium sp.)(예를 들어, 나병균(Mycobacterium leprae), 마이코박테리움 인트라셀룰레어(Mycobacterium intracellulare), 조형결핵균(Mycobacterium avium), 소결핵균(Mycobacterium bovis) 및 마이코박테리움 마리넘(Mycobacterium marinum)), 마이코플리즘 속(Mycoplasm sp.)(예를 들어, 폐렴 마이코플라즈마(Mycoplasma pneumoniae), 마이코플라즈마 호미니(Mycoplasma hominis) 및 마이코플라즈마 제니탈리움(Mycoplasma genitalium)), 노카르디아균(Nocardia sp.)(예를 들어, 노카르니아 에스테로이드(Nocardia asteroides), 노카르디아 시리아시지오지카(Nocardia cyriacigeorgica) 및 노카르디아 브라질리엔시스(Nocardia brasiliensis)), 나이세리균(Neisseria sp.)(예를 들어, 임균(Neisseria gonorrhoeae) 및 수막염균(Neisseria meningitidis)), 파스튜렐라 멀토시다(Pasteurella multocida), 플레시오 모나스 시겔로이드(Plesiomonas shigelloides), 프리보텔라 속(Prevotella sp.), 포르피로모나스 속(Porphyromonas sp.), 프리보텔라 멜로니노게니카(Prevotella melaninogenica), 프로테우스 속(Proteus sp.)(예를 들어, 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris) 및 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis)), 프로비덴시아 속(Providencia sp.)(예를 들어, 프로비덴시아 알칼리파시엔(Providencia alcalifaciens), 프로비덴시아 레트게리(Providencia rettgeri) 및 프로비덴시아 스투아르테(Providencia stuartii)), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 프로피온산균 에크니(Propionibacterium acnes), 로도코쿠스 에쿠이(Rhodococcus equi), 살모넬라균 속(Salmonella sp.)(예를 들어, 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 장티푸스균(Salmonella typhi), 파라티푸스균(Salmonella paratyphi), 장염균(Salmonella enteritidis), 살모넬라 식중독(Salmonella cholerasuis) 및 쥐티푸스균(Salmonella typhimurium), 세라티아 속(Serratia sp.)(예를들어, 영균(Serratia marcesans) 및 세라티아 리뮈파시엔(Serratia liquifaciens)), 시겔라 속(Shigella sp.)(예를 들어, 지하적리균(Shigella dysenteriae), 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri), 보이드 설사균(Shigella boydii) 및 시겔라 소네이균(Shigella sonnei)), 포도상국균 속(Staphylococcus sp.)(예를 들어, 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 표피포도상구균(Staphylococcus epidermidis), 스타필로코쿠스 헤모리티쿠스(Staphylococcus hemolyticus), 스타필로코쿠스 사프로피티쿠스(Staphylococcus saprophyticus)), 연쇄상구균 속(Streptococcus sp.)(예를 들어, 폐렴 연쇄상구균(Streptococcus pneumoniae), 스펙티노마이신-내성 혈청형 6B 폐렴 연쇄상구균(Spectinomycin-resistant serotype 6B Streptococcus pneumoniae), 스트렙토마이신-내성 혈청형 9V 폐렴 연쇄상구균(Streptomycin-resistant serotype 9V Streptococcus pneumoniae), 에리스로마이신-내성 혈청형 14 폐렴 연쇄상구균(Erythromycin-resistant serotype 14 Streptococcus pneumoniae), 옵토힌-내성 혈청형 14 폐렴 연쇄상구균(Optochin-resistant serotype 14 Streptococcus pneumoniae), 리팜피신-내성 혈청형 18C 폐렴 연쇄상구균(Rifampicin-resistant serotype 18C Streptococcus pneumoniae), 테트라사이클린-내성 혈청형 19F 폐렴 연괘상구균(Tetracycline-resistant serotype 19F Streptococcus pneumoniae), 페니실린-내성 혈청형 19F 폐렴 연쇄상구균(Penicillin-resistant serotype 19F Streptococcus pneumoniae) 및 트리메소프림-내성 혈청형 23F 폐련 연쇄상구균(Trimethoprim-resistant serotype 23F Streptococcus pneumoniae), 클로람페니콜-내성 혈청형 4 폐렴 연쇄상구균(Chloramphenicol-resistant serotype 4 Streptococcus pneumoniae), 스트렙토마이신-내성 혈청형 9V 폐렴 연쇄상구균(Streptomycin-resistant serotype 9V Streptococcus pneumoniae), 옵토힌-내성 혈청형 14 폐렴 연쇄상구균(Optochin-resistant serotype 14 Streptococcus pneumoniae), 리팜피신-내성 혈청형 18C 폐렴 연쇄상구균(Rifampicin-resistant serotype 18C Streptococcus pneumoniae), 페니실린-내성 혈청형 19F 폐렴 연쇄상구균(Penicillin-resistant serotype 19F Streptococcus pneumoniae) 또는 트리메소프림-내성 혈청형 23F 폐련 연쇄상구균(Trimethoprimresistant serotype 23F Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코쿠스 아갈락티에(Streptococcus agalactiae), 스트렙토코쿠스 뮤탄(Streptococcus mutans), 화농성 연쇄상구균(Streptococcus pyogenes), A군 용혈연쇄구균(Group A streptococci), 화농성연쇄상구균(Streptococcus pyogenes), B군 용혈연쇄구균(Group B streptococci), 스트렙토코쿠스 아갈락티에(Streptococcus agalactiae), C군 용혈연쇄구균(Group C streptococci), 스트렙토코쿠스 안지노수스(Streptococcus anginosus), 스트렙토코쿠스 이퀴스밀리스(Streptococcus equismilis), D군 용혈연쇄구균(Group D streptococci), 스트렙토코쿠스 보비스(Streptococcus bovis), F군 용혈연쇄구균(Group F streptococci) 및 스트렙토코쿠스 안지노수스(Streptococcus anginosus), G 군 용혈연쇄구균(Group G streptococci), 스피릴룸 마이너스(Spirillum minus), 모닐리포르미스연쇄간균 (Streptobacillus moniliformi), 트레포네마균 속(Treponema sp.)(예를 들어, 트레포네마 카라튬(Treponema carateum), 트레포네마 페테뉴(Treponema petenue), 매독트레포네마(Treponema pallidum) 및 트레포네마 엔데미쿰(Treponema endemicum), 트로페리마 위펠리(Tropheryma whippelii), 유레아플라스마 유레알티쿰(Ureaplasma urealyticum), 메요넬라 속(Veillonella sp.), 비브리오균 속(Vibrio sp.)(예를 들어, 아시아콜레라균(Vibrio cholerae), 장염비브리오균(Vibrio parahemolyticus), 비브리오 불니피쿠스균(Vibrio vulnificus), 장염비브리오균(Vibrio parahaemolyticus), 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus), 비브리오 알지노리티쿠스(Vibrio alginolyticus), 비브리오 미미쿠스(Vibrio mimicus), 비브리오 홀리세(Vibrio hollisae), 비브리오 플루비알리스(Vibrio fluvialis), 비브리오 메치니코비(Vibrio metchnikovii), 비브리오 뎀셀라(Vibrio damsela) 및 비브리오 푸르니시(Vibrio furnisii)), 예르시니아 속(Yersinia sp.)(예를 들어, 여시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica) 및 페스트균 (Yersinia pestis)) 및 말토필리아(Xanthomonas maltophilia).
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 항균용 조성물은 항균용 약제학적 조성물이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 유효성분인 상기 조성물 외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 예컨대 척추강 내 투여, 정맥내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 근육내 투여, 복강내 투여, 흉골 내 투여, 종양 내 투여, 비내 투여, 뇌내 투여, 두개골 내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량(약제학적 유효량)을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.0001-100 ㎎/㎏이다.
본 명세서에서 용어 "약제학적 유효량"은 상술한 질환을 예방 또는 치료하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 명세서에서 용어 "예방"은 질환 또는 질환 상태의 방지 또는 보호적인 치료를 의미한다. 본 명세서에서 용어 "치료"는 질환 상태의 감소, 억제, 진정 또는 근절을 의미한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 내복약, 주사제 등 다양하게 제조될 수 있고, 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 좌제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 단백질 복합체를 포함하는 항균용 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 세균 감염증 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 명세서 상의 용어 "세균 감염증"이란, 세균의 감염에 의하여 발병되는 질환을 의미하며, 일 예로서는 상술한 병원균에 의해 유발되는 결핵, 폐렴, 식중독, 패혈증, 독성 쇼크 증후군, 성홍열, 디프테리아, 브루셀라증, 리스테리아증, 장티푸스, 파라티푸스, 콜레라, 보툴리늄 중독증, 파상풍, 한센병, 렙토스피라증 등이 있으나 이에 제한되지는 않는다.
본 명세서에서 사용된 용어, "투여" 또는 "투여하다"는 본 발명의 조성물의 치료적, 또는 예방적 유효량을 상기 대상 질환을 겪거나, 겪을 가능성이 있는 대상체(개체)에 직접적으로 투여함으로써 대상체의 체내에서 동일한 양이 형성되도록 하는 것을 말한다.
상기 조성물의 "치료적 유효량"은 조성물을 투여하고자 하는 대상체에게 치료적 또는 예방적 효과를 제공하기에 충분한 조성물의 함량을 의미하며, 이에 "예방적 유효량"을 포함하는 의미이다.
또한, 본 명세서에서 사용된 용어, "대상체(개체)"는 인간, 마우스, 랫트, 기니아 피그, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 원숭이, 침팬지, 비비 및 붉은털 원숭이 등을 포함하는 포유류이다. 가장 구체적으로는, 본 발명의 대상체는 인간이다.
본 발명의 상기 세균 감염증 예방 또는 치료방법은 본 발명의 일 양태인 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법이므로, 중복되는 내용에 대해서는 본 명세서의 과도한 중복성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 단백질 복합체를 포함하는 사료 첨가제를 제공한다.
상기 사료 첨가제는 액상 또는 건조 상태일 수 있으며, 예컨대, 건조된 분말형태일 수 있다.
또한, 상기 사료 첨가제는 상기 항생제 외에 사료의 보존성을 높일 수 있는 통상의 첨가제들을 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에서, 상기 사료 첨가제는 시판되는 사료, 또는 곡물류, 근과류, 식품가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 제약 부산물류, 유지류, 전분류, 박류, 곡물부산물류, 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 단세포 단백질, 동물성 플랑크톤류, 남은 음식물 등에 첨가될 수 있으며, 이에 제한되지는 않는다.
다른 예는 상기 단백질 복합체를 유효성분으로 포함하는 식품 첨가제 또는 음용수 첨가제를 제공한다. 상기 단백질 복합체를 음용수에 혼합하여 공급함으로써, 음용수 내의 균주의 수를 감소시킬 수 있다.
본 발명의 단백질 복합체는 보툴리늄 독소 전위 도메인을 이용함으로써, 목표 균주의 내부로 엔도라이신을 전달가능하게 하고, 상기 기능을 통해 그람 양성균뿐만 아니라 엔도라이신이 활성을 나타내기 힘든 그람 음성균에 대해서도 용균 활성을 나타낼 수 있다. 또한, 수용체 부착 단백질을 사용함으로써, 상기 단백질 전달 시스템의 활용성을 향상시킬 수 있다.
본 발명의 단백질 복합체의 항균 활성은 보툴리늄 독소 전위 도메인의 단백질 전달 시스템에 의한 것으로, 엔도라이신 및 수용체 부착 단백질은 목표 균주에 맞게 다양하게 선택 가능하고, 엔도라이신 및 수용체 부착 단백질의 종류에 관계없이 항균 활성을 나타낼 수 있다.
더 나아가, 전장 단백질 복합체를 한 번에 제조하는 것보다 보툴리늄 독소 전위 도메인, 엔도라이신 각각의 단백질 단편을 반응(단백질 트랜스 스플라이싱)시켜 단백질 복합체를 제조하는 경우 제조과정에서 쉽게 변성되지 않고, 물리화학적 스트레스에 취약하지 않아 제조 효율이 개선된다는 점을 확인하였다.
한편, 본 발명은 표적 균주에 상기 단백질 복합체를 반응시키는 단계; 및 상기 단백질 복합체가 표적 균주에 대한 항균 활성을 나타내는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 항균 활성 단백질 복합체의 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 스크리닝하는 방법을 통해 수용체 부착 단백질 후보물질 및 엔도라이신 후보물질이 포함된 단백질 복합체를 표적 균주와 반응시킨 후, 상기 표적 균주에 대하여 항균 활성을 나타내는지의 여부를 확인함으로써, 상기 후보물질들이 수용체 부착 단백질 및 엔도라이신으로서 사용할 수 있는지 여부를 결정할 수 있다.
상기 항균 활성을 나타내는지 여부를 확인하는 방법은 특별히 제한되지 않으나, 공지의 방법을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 방법은 스팟팅 어세이를 통해 수행될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.
<보툴리늄 독소 전위 도메인, 트랜스라이신(Translysin, 단백질 복합체)의 제조를 위한 엔도라이신, 수용체 부착 단백질, 인테인, 스파이 택&캐쳐>
보툴리늄 독소 전위 도메인(표 1), 트랜스라이신의 제조를 위한 엔도라이신(표 2), 수용체 부착 단백질(표 3), 인테인(표 4), 스파이 택&캐쳐(표 5)을 다음과 같이 표에 나타내었다.
보툴리늄 독소 전위 도메인 (HN)
명칭 예측된 기능 크기(a.a) 유래 NCBI Accession #
BoNT A2 Translocation domain Translocation domain 422 Clostridium botulinum strain Kyoto/Type A2 Q45894 (449-870 region)
BoNT C1 Translocation domain Translocation domain 416 Clostridium botulinum C bacteriophage P18640 (450-865 region)
BoNT E1 Translocation domain Translocation domain 397 Clostridium botulinum Q00496 (423-819 region)
트랜스라이신의 제조를 위한 엔도라이신
명칭 예측된 기능 크기(a.a) 유래 NCBI Accession #
lys L-alanyl-D-glutamate endopeptidase (M15) 137 Escherichia virus T5 YP_006868
LysPA26 Muramidase (GH24) 145 Pseudomonas phage JD010 KY615005
PB1_gp48 Chitinase (GH19) 220 Pseudomonas phage PB1 NC_011810
LysAB2_P3 Chitinase (GH19) 185 Acinetobacter phage phiAB2 HM755898
PlyF307 Muramidase (GH24) 146 Acinetobacter phage RL-2015 KJ740396
AcLys Muramidase (GH24) 184 Acinetobacter baumannii AB5075 prophage WP_000208716
PlyPA03 Muramidase (GH24) 144 Pseudomonas aeruginosa prophage WP_070344501
PlyPA91 Muramidase (GH24) 154 Pseudomonas aeruginosa prophage CRR10611
Abtn-4 Chitinase (GH19) 185 Acinetobacter phage vB_AbaP_D2 AVP40474
WCHABP1_gp01 N-acetylmuramidase (GH108) 171 Acinetobacter phage WCHABP1 AST13128
WCHABP12_gp19 Chitinase (GH19) 202 Acinetobacter phage WCHABP12 ARB06760
gh-1p12 N-acetylmuramoyl-L-
alanine amidase		 146 Pseudomonas phage gh-1 NP_813758
B3ORF25 Membrane-bound lytic murein transglycosylase F 264 Pseudomonas phage B3 YP_164061
phi-13Sp4 P5 muramidase 245 Pseudomonas phage phi13 NP_690810
phi-6S_4 Peptidase_U40 220 Pseudomonas phage phi6 NP_620343
KP27_166 L-alanyl-D-glutamate endopeptidase 131 Klebsiella phage vB_KpnM_KP27 AEX26632
KP13_gp066 Muramidase (GH24) 160 Klebsiella phage vB_KpnS_Kp13 AZF89867
BI057_gp221 T4-like lysozyme 164 Shigella phage SHFML-26 YP_009279119
LPSE_00024 Soluble Lytic Transglycosylases 162 Salmonella phage LPSE1 APU02985
STP4a_120 Soluble Lytic Transglycosylases 166 Salmonella phage STP4-a AHJ86974
Lys68 Soluble Lytic Transglycosylases 162 Salmonella phage phi68 AHY18890
SPN1S_0028 Chitinase (GH19) 209 Salmonella phage SPN1S YP_005098003
P22gp66 Lysozyme 146 Salmonella virus P22 NP_059622
수용체 부착 단백질 (RBP, Receptor binding protein)
명칭 예측된 기능 크기(a.a) 유래 NCBI Accession #
PRD1_04 Adsorption protein 591 Enterobacteria phage PRD1 NC_001421
P1301_0153 Receptor-binding protein 593 Bacteriophage T5-like chee130_1 ASU02516
P24_0149 Receptor-binding protein 585 Bacteriophage T5-like chee24 NC_047885
Pb5 Receptor-binding tail protein 640 Escherichia virus T5 NC_005859
AbTJ_gp52 Tail fiber protein 202 Acinetobacter phage AbTJ QAU04145
AbTJ_gp53 Tail fiber protein 699 Acinetobacter phage AbTJ QAU04146
phiAB6_gp40 Tail fiber 699 Acinetobacter phage phiAB6 ALA12264
S Tail fiber protein 504 Escherichia phage Mu NC_000929
A318_gp060 Receptor-binding tail protein 585 Escherichia phage vB_EcoS_AKFV33 NC_017969
rv5_gp030 Tail fiber protein 347 Escherichia phage rV5 YP_002003532
rv5_gp033 Putative tail fiber protein 346 Escherichia phage rV5 YP_002003535
PaoP5_075 Structural protein 243 Pseudomonas phage PaoP5 YP_009224766
BH773_gp153 Putative tail fiber protein 670 Pseudomonas phage K5 YP_009273830
AU075_gp145 Putative tail fiber protein 499 Pseudomonas phage C11 YP_009186965
CPT_Sugarland_191 Receptor-binding protein 658 Klebsiella phage Sugarland ATW62004
JIPhKp127_0170 Receptor-binding protein 658 Klebsiella phage JIPh_Kp127 QFR57578
AmPhEK80_0178 Receptor-binding protein 658 Klebsiella phage AmPh_EK80 QFR57428
P22_gp19 Tail spike protein 667 Salmonella phage P22 NC_002371
DET7_207 Tail spike protein 708 Salmonella phage Det7 YP_009140379
HWD08_gp154 Receptor-binding tail protein 585 Salmonella phage L6jm YP_009856550
BI021_gp088 Receptor-binding protein 595 Salmonella phage NR01 YP_009283429
HWD21_gp023 Receptor-binding tail protein 640 Salmonella phage oldekolle YP_009857757
HWC41_gp146 Receptor-binding protein 593 Salmonella phage SE24 YP_009848613
HOS12_gp017 Receptor-binding protein 585 Salmonella phage SP01 YP_009792475
HOU44_gp075 Receptor-binding protein 593 Salmonella phage STG2 YP_009815133
I133_gp019 Receptor recognition protein 249 Salmonella phage vB_SenM-S16 YP_007501289
HWC50_gp066 Receptor-binding tail protein 585 Salmonella virus VSe12 YP_009849685
HOS34_gp106 Receptor-binding tail protein 585 Shigella phage SSP1 YP_009794581
인테인
명칭 도메인 시퀀스 서열번호 비고
Gp41.1 Int-N CLDLKTQVQTPQGMKEISNIQVGDLVLSNTGYNEVLNVFPKSKKKSYKITLEDGKEIICSEEHLFPTQTGEMNISGGLKEGMCLYVKE 1
Int-C MMLKKILKIEELDERELIDIEVSGNHLFYANDILTHN 2
Cfa Int-N CLSYDTEILTVEYGFLPIGKIVEERIECTVYTVDKNGFVYTQPIAQWHNRGEQEVFEYCLEDGSIIRATKDHKFMTTDGQMLPIDEIFERGLDLKQVDGLP 3
Int-C MVKIISRKSLGTQNVYDIGVEKDHNFLLKNGLVASN 4
NRDJ-1 Int-N CLVGSSEIITRNYGKTTIKEVVEIFDNDKNIQVLAFNTHTDNIEWAPIKAAQLTRPNAELVELEIDTLHGVKTIRCTPDHPVYTKNRGYVRADELTDDDELVVA 5
Int-C MIEAKTYIGKLKSRKIVSNEDTYDIQTSTHNFFANDILVHN 6
IMPDH-1 Int-N CFVPGTLVNTENGLKKIEEIKVGDKVFSHTGKLQEVVDTLIFDRDEEIISINGIDCTKNHEFYVIDKENANRVNEDIHLFARWVVHAEELDMKKHLLIELE 7
Int-C MKFKLKEITSIETKHYKGKVHDLTVNQDHSYNVRGTVVHN 8
Npu Int-N CLSYETEILTVEYGLLPIGKIVEKRIECTVYSVDNNGNIYTQPVAQWHDRGEQEVFEYCLEDGSLIRATKDHKMTVDGQMLPIDEIFERELDLMRDNLPN 9 DnaE
Int-C MIKIATRKYLGKQNVYDIGVERDHNFALKNGFIASN 10
Ssp Int-N CLSFGTEILTVEYGPLPIGKIVSEEINCSVYSVDPEGRVYTQAIAQWHDRGEQEVLEYELEDGSVIRATSDHRFLTTDYQLLAIEEIFARQLDLLTLENIKQTEEALDNHRLPFPLLDAGTIK 11 DnaE
Int-C MVKVIGRRSLGVQRIFDIGLPQDHNFLLANGAIAAN 12
Rma Int-N CLAGDTLITLADGRRVPIRELVSQQNFSVWALNPQTYRLARVSRARVSRAFCTGIKPVYRLTTRLGRSIRATANHRFLTQGWKRVDELQPGDYLALPRRIPTASTPTLTEAELALLGHLIGD 13 DnaB
Int-C MWDPIVSIEPDGVEEVFDLTVPGPHNFVADNIIAGNS 14
Ppu Int-N CISKFSHIMWSHVSKPLFNFSIKKSHMHNGNKNIYQLLDQGEAFISRQDKKTTYKIRTNSEKYLELTSNHKILTLRGWQRCDQLLCNDMITTQIGFELSRKKKYLLNCIPFSLCNFET 15 DnaB
Int-C MLANINISNFQNVFDFAANPIPNFIANNIIVHNS 16
Gp41.8 Int-N CLSLDTMVVTNGKAIEIRDVKVGDWLESECGPVQVTEVLPIIKQPVFEIVLKSGKKIRVSANHKFPTKDGLKTINSGLKVGDFLRSRA 17
Int-C MCEIFENEIDWDEIASIEYVGVEETIDINVTNDRLFFANGILTHN 18
NrdA-2 Int-N CLTGDAKIDVLIDNIPISQISLEEVVNLFNEGKEYVLSYNIDTKEVEYKEISDAGLISESAEVLEIIDEETGQKIVCTPDHKVYTLNRGYVSAKDLKEDDELVFS 19
Int-C MGLKIIKRESKEPVFDITKVKDNSNFFANNILVHN 20
스파이 택&캐쳐
명칭 도메인 시퀀스 서열번호 비고
Spy001 Catcher GAMVDTLSGLSSEQGQSGDMTIEEDSATHIKFSKRDEDGKELAGATMELRDSSGKTISTWISDGQVKDFYLYPGKYTFVETAAPDGYEVATAITFTVNEQGQVTVNGKATKGDAHI 32
Tag AHIVMVDAYKPTK 33
Spy002 Catcher AMVTTLSGLSGEQGPSGDMTTEEDSATHIKFSKRDEDGRELAGATMELRDSSGKTISTWISDGHVKDFYLYPGKYTFVETAAPDGYEVATAITFTVNEQGQVTVNGEATKGDAHTGSSGS 34
Tag VPTIVMVDAYKRYK 35
Spy003 Catcher VTTLSGLSGEQGPSGDMTTEEDSATHIKFSKRDEDGRELAGATMELRDSSGKTISTWISDGHVKDFYLYPGKYTFVETAAPDGYEVATPIEFTVNEDGQVTVDGEATEGDAHT 36
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다만, 표 1 내지 5에 기재된 내용은 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위는 상기 표에 의해 제한되지는 않는다.
[실시예 1: 전장 트랜스라이신의 세포 내 발현 및 용균 효과의 검증]
발현 숙주인 E. coli 셔플 T7에서 전장 트랜스라이신(Translysin)(엔도라이신-HN-RBP)을 발현하기 위해 이를 암호화하는 플라스미드를 설계하였다. 상기 단백질 복합체는 보툴리늄 독소 HN 도메인의 아미노기 말단과 카르복실기 말단에 각각 엔도라이신(T5 lys)과 RBP(Pb5)가 결합된 형태를 갖도록 설계되었으며, 이를 pET 벡터에 삽입하여 플라스미드를 제작하였다 (도 1). 벡터에 삽입된 전장 트랜스라이신의 서열은 서열번호 21에 나타내었다. 상기 플라스미드를 42℃에서 E. coli 숙주에 도입하고, 이를 50 μg/mL 농도의 카나마이신(kanamycin)이 첨가된 LB(Luria-Bertani) 한천 배지에서 배양함으로써 형질 전환된 E. coli 균주를 선별하였다.
선별된 형질 전환 균주를 LB 배양액에 접종하고 이를 계대 배양하여 1 mM의 IPTG(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 첨가한 뒤 37℃에서 4시간 동안 배양하여 트랜스라이신을 발현하고 이를 SDS 젤 전기영동으로 확인하였다 (도 2). 대조군으로는 엔도라이신 단편 또는 이노라이신(Innolysin)(T5 lys-linker-Pb5)을 암호화하는 플라스미드의 형질 전환 균주와 야생형 균주를 사용하였으며, SDS 젤 전기영동으로 이노라이신의 발현을 확인하였다 (도 3). 이노라이신의 서열을 서열번호 22에 나타내었다. 트랜스라이신의 활성은 발현 이후 배양액의 탁도를 기준으로 균주의 생장을 측정하여 유추하였는데, 발현된 단백질 복합체가 세포막을 통과하여 세포벽의 펩티도글라이칸을 용해할 경우 균주가 사멸하여 탁도가 감소할 것으로 판단하였다.
발현 결과 엔도라이신 단편과 이노라이신이 발현된 균주는 야생형 균주의 생장 양상과 유의적인 차이를 나타내지 않았으나, 본 발명 트랜스라이신이 발현된 경우 생장이 현저하게 저하되는 것이 확인되었으므로 막 전달이 효과적으로 일어났다는 것을 유추할 수 있었다 (도 4 및 5).
[실시예 2: 인테인(Intein)에 의한 단백질 단편의 단백질-트랜스-스플라이싱(protein trans-splicing)]
실시예 1에서 발현된 전장 트랜스라이신은 발현 과정에서, 1) 발현 숙주가 용해되어 충분한 세포 농도에 도달하기 힘들고, 2) 약 180 kDa에 달하는 크기의 발현 산물의 접힘(folding)이 원활하지 못해 쉽게 변성되어 수용성 형태의 발현양이 낮으며, 3) 발현 산물의 크기가 약 180 kDa에 달하여 분리 및 정제 과정의 물리 화학적 스트레스에 취약하다는 문제점을 가지고 있었다. 따라서 본 발명에서는 이를 극복하기 위해 엔도라이신, iLCHN(불활성된 보툴리늄 독소 경쇄+보툴리늄 독소전위 도메인), RBP를 인테인과 연결된 각각의 단편으로 발현, 정제하여 인 비트로에서 결합시키는 방식을 채택하였다.
인테인의 결합 조건과 반응 속도를 고려하여 표 4에서 Gp41.1 인테인과 Cfa 인테인을 선택하고 이를 각각 엔도라이신-iLCHN, iLCHN-RBP 결합에 적용하였다. 이 때 엔도라이신은 표 2의 LysPA26과 PB1_gp48을, RBP는 표 3의 PRD1_04을 선택하였다.
단백질 단편을 제조하기 위한 방법은 실시예 1에 기재된 방법과 동일하며, 단백질 단편을 제조하기 위해 사용한 서열은 다음과 같다;
LysPA26-Gp41.1N: 서열번호 23;
PB1_gp48-Gp41.1N: 서열번호 24;
Gp41.1C-iLCHN-CfaN: 서열번호 25;
CfaC-PRD1_04: 서열번호 26.
결과적으로 4종의 단백질 단편 (LysPA26-Gp41.1N, 27.5 kDa; PB1_gp48-Gp41.1N, 35.3 kDa; Gp41.1C-iLCHN-CfaN, 117.2 kDa; CfaC-PRD1_04, 69.3 kDa)을 발현 및 정제하여 단백질 트랜스-스플라이싱 반응을 진행하였다 (도 6의 (A)).
먼저, Gp41.1 인테인과 Cfa 인테인 각각의 트랜스-스플라이싱 효과를 확인하기 위해 각 단편을 1:1의 몰 비율로 혼합하여 반응을 진행한 결과 완충 용액에서 128.7 kDa (LysPA26-iLCHN-CfaN), 136.5 kDa (PB1_gp48-iLCHN-CfaN), 168.9 kDa (gp41.1C-LCHN-PRD1_04)의 반응 산물들이 생성되어 30분 이후 포화되는 것을 확인하였다 (도 7 내지 9). 각 단편을 1:1:1의 몰 비율로 혼합하여 반응을 진행한 결과에서도 환원제 유무와 무관하게 완충용액에서 189.1 kDa의 최종 산물과 136.5 kDa (PB1_gp48-iLCHN-CfaN), 168.9 kDa (Gp41.1C-iLCHN-PRD1_04)의 중간 산물이 생성되는 것을 확인하였다 (도 10).
[실시예 3: 인테인(Intein)과 스파이 택(Tag)&캐쳐(Catcher)에 의한 단백질 단편의 전장 단백질로의 전환]
실시예 2에서 생성되는 전장 트랜스라이신의 경우 인테인의 제거가 가능하지만 트랜스-스플라이싱 효율이 약 25% 정도로 낮다는 문제점을 가지고 있다. 따라서 본 발명에서는 이를 극복하기 위해서 엔도라이신, iLCHN, RBP를 인테인과 스파이 택&캐쳐와 연결된 각각의 단편으로 발현, 정제하여 인 비트로에서 결합시키는 방식을 채택하였다.
인테인의 결합 조건과 반응 속도 및 트랜스라이신의 작용 기전을 고려하여 표 4에서 Gp41.1 인테인을 선택하고 이를 엔도라이신-iLCHN 결합에 적용하였다. 스파이 택&캐쳐의 반응 속도를 고려하여 표 5에서 3세대 스파이 택&캐쳐를 선택하고 이를 iLCHN-RBP 결합에 적용하였다. 이때 엔도라이신은 표 2의 LysPA26을, RBP는 표 3의 PRD1_04을 선택하였다.
단백질 단편을 제조하기 위한 방법은 실시예 1에 기재된 방법과 동일하며, 단백질 단편을 제조하기 위해 사용한 서열은 다음과 같다;
LysPA26-Gp41.1N: 서열번호 23;
Gp41.1C-iLCHN-SpyC003: 서열번호 42
SpyT003-PRD1_04: 서열번호 43
결과적으로 3종의 단백질 단편 (LysPA26-Gp41.1N, 27.5 kDa; Gp41.1C-iLCHN-SpyC003, 117.8 kDa; SpyT003-PRD1_04, 67.0 kDa)을 발현 및 정제하여 인 비트로에서 전장 트랜스라이신으로의 반응을 진행하였다 (도 6의 (B)).
먼저, Gp41.1 인테인의 트랜스-스플라이싱 효과를 확인하기 위해 각 단편을 1:1의 몰 비율로 혼합하여 반응을 진행한 결과 완충 용액에서 129.1 kDa (LysPA26-iLCHN-SpyC003)의 반응 산물들이 생성되어 30분 이후 포화되는 것을 확인하였다 (도 11). 그리고 스파이 택&캐쳐에 의한 단백질 결합을 확인하기 위해 각 단편을 1:1의 몰 비율로 혼합하여 반응을 진행한 결과 완충 용액에서 184.8 kDa (gp41.1C-iLCHN-Spy-PRD1_04)의 반응 산물이 생성되는 것을 확인하였다 (도 11). 각 단편을 1:1:1의 몰 비율로 혼합하여 반응을 진행한 결과에서도 완충용액에서 196.1 kDa의 최종 산물과 129.1 kDa (Gp41.1C-iLCHN-Spy-PRD1_04)의 중간 산물이 생성되는 것을 확인하였다 (도 11).
[실시예 4: 전장 트랜스라이신과 단백질 단편의 용균 활성 검증]
실시예 2와 3에서 생성한 전장 트랜스라이신의 막 전달 및 용균 활성을 확인하기 위해 목표 균주에 대한 스팟팅 어세이(spotting assay)를 수행하였다. 스팟팅 어세이는 LB 한천 배지 위에 0.4%의 연 한천(soft agar)과 목표 균주의 균질 혼합물을 덮어씌우고(overlay), 이를 건조한 뒤 단백질 시료를 스팟팅하여 배양한 후 론(lawn)에서 균주의 사멸 또는 생장 저해 양상을 확인하는 실험 방법이다 (도 12).
스팟팅 어세이는 두 집단에서 수행하였는데, 우선 엔도라이신의 용균 활성을 검증하기 위해 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa) KACC 10186 균주의 외막(outer membrane)을 파괴시킨 사균을 사용하여 실험을 진행하였다. 이를 위해 목표 균주를 지수기(exponential phase, OD600 < 2.0)까지 배양한 것을 고압멸균기(autoclave)로 121℃에서 멸균한 다음 완충 용액 (50 mM Tris, 100 mM NaCl; pH 7, LysPA26 / pH 6, PB1_gp48)으로 1회 세척하여 최종 100배 농축된 사균 용액을 제작하였고, 0.4% 연 한천의 탁도가 OD600 = 10이 되도록 희석하여 90Ø 페트리 디쉬(petri dish)의 LB 한천 배지 위에 5 mL씩 덮어씌웠다. 연 한천이 건조된 이후 각각의 엔도라이신 시료의 원액(10 μg/μL)과 희석액 (1 μg/μL, 0.1 μg/μL, 0.01 μg/μL)을 10 μL씩 스팟팅 하였으며, 음성대조군으로 완충 용액을 사용하였다. 실험 결과 LysPA26과 PB1_gp48 엔도라이신 단편 모두 론(lawn)에 용해 존(lysis zone)을 형성하였으므로 목표 균주의 펩티도글라이칸에 용균 활성을 나타내는 것이 확인되었다 (도 13 및 14).
다음으로 막 전달 활성을 확인하기 위해 슈도모나스 퓨티다(Pseudomonas putida) KCTC 1643 생균에 동일한 조건으로 단백질 시료를 처리하여 실험을 진행하였다. 이를 위해 LB 배양액에서 37℃, 오버나잇(overnight)으로 정지상(stationary phase)까지 배양된 생균 100 μL를 5 mL의 0.4% LB 연 한천과 균질 혼합하여 덮어씌움으로써 생균의 생장이 촉진되는 환경을 조성하였다. 연 한천이 건조된 이후 트랜스라이신(PB1_gp48-iLCHN-PRD1_04, LysPA26-iLCHN-PRD1_04)과 엔도라이신 단편(PB1_gp48-Gp41.1N, LysPA26-Gp41.1N)의 원액 (4 μg/μL) 및 희석액 (0.4 μg/μL, 0.04 μg/μL)을 10 μL씩 스팟팅하였으며, 음성대조군으로 완충 용액을 사용하였다. 실험 결과 각각의 엔도라이신 단편을 처리한 경우 모두 용균 작용이 일어나지 않았던 반면, 전장 트랜스라이신을 처리하였을 때는 용해 존이 형성되었으므로 단백질이 목표 균주의 외막 내부로 효과적으로 전달되어 세포를 용해하였음을 확인할 수 있었다(도 15 및 16).
같은 조건으로 스파이 택&캐쳐를 통해 조립한 트랜스라이신(PB1_gp48-iLCHN-PRD1_04, LysPA26-iLCHN-PRD1_04)과 엔도라이신 단편(PB1_gp48-Gp41.1N, LysPA26-Gp41.1N), 그리고 이노라이신 (LysPA26-iLCHN-PRD1_04, PB1_gp48-iLCHN-PRD1_04)을 각각 3.6 μM, 360 nM씩 처리하였다. 실험 결과 각각의 엔도라이신 단편을 처리한 경우 모두 용균 작용이 일어나지 않았던 반면, 전장 트랜스라이신과 이노라이신을 처리하였을 때에는 용균 존이 형성되는 것을 확인할 수 있었다. 전장 트랜스라이신의 경우 3.6 μM, 360 nM 모두에서 효과를 보였으나 이노라이신의 경우 3.6 μM에서 효과가 나타났다(도 17 및 18).
[실시예 5: 트랜스라이신의 용균 활성의 시각화]
실시예 4에서 검증된 트랜스라이신(Translysin)의 용균 활성을 시각적으로 확인하고자 투과 전자 현미경 (Transmission Electron Microscope, TEM) 분석을 수행하였다 (도 19). 이를 위해 목표 균주 P. putida KCTC 1643을 LB 배양액에 OD600 = 0.1의 탁도로 접종하여 37℃에서 2시간 동안 이른 지수기(early exponential phase)(OD600 = 1.0)까지 배양한 뒤 이를 PBS(Phosphate buffered saline) 용액으로 2회 세척하여 생균 상태로 준비하였다. 다음으로 1 mL의 생균 용액에 약 370 nM 농도로 트랜스라이신(PB1_gp48-iLCHN-PRD1_04, LysPA26-iLCHN-PRD1_04)을 혼합하여 25℃에서 배양하면서 지정된 시점에 10 μL의 혼합물을 채취하여 골드 그리드(Gold grid)에 1분간 고정한 이후 초산 우라닐(uranyl acetate)로 10초간 염색하여 TEM 시료를 제작하였다. 음성대조군으로는 각각의 엔도라이신 단편 (PB1_gp48-Gp41.1N, LysPA26-Gp41.1N)을 약 370 nM 농도로 처리하거나, 어떠한 처리도 하지 않은 균주를 사용하여 상기 방법과 동일하게 시료를 제작하였다. 에너지여과 투과 전자현미경 (Energy-Filtering TEM, 120 kv) (Carl Zeiss, Libra 120)을 통해 분석을 수행한 결과 음성대조군에서는 외형적인 손상이 확인되지 않았던 반면 트랜스라이신을 처리한 실험군에서는 시간이 지남에 따라 세포벽이 손상되어 균주가 사멸하는 양상을 확인할 수 있었다 (도 19).
[실시예 6: 트랜스라이신의 용균 활성의 수치화]
실시예 4에서 검증된 트랜스라이신(Translysin)의 용균 활성을 수치적으로 확인하고자 CFU (Colony Forming Unit) Reduction assay를 수행하였다. 이를 위해 목표 균주 P. putida KCTC 1643을 LB 배양액에 OD600 = 0.1의 탁도로 접종하여 37℃에서 1.5시간 동안 이른 지수기(early exponential phase)(OD600 = 0.6)까지 배양한 뒤 이를 20 mM HEPES-NaOH (pH = 7.4) 용액으로 3회 세척 후 100배 희석하여 생균 상태로 준비하였다. 다음으로 100 uL의 생균 용액에 30 uM 농도로 트랜스라이신(LysPA26-iLCHN-PRD1_04) 혹은 이노라이신 (LysPA26-PRD1) 100 uL를 혼합하여 37℃에서 1시간 반응시켰다. 음성대조군으로는 20 mM Hepes-NaOH를 사용하여 상기 방법과 동일하게 시료를 제작하였다. 그 후 적절한 희석배수로 희석 후 LB agar 배지에 도말 후 37℃, O/N 배양하였다. 항균 활성은 음성대조군과 비교하여 트랜스라이신 혹은 이노라이신 처리한 샘플의 평균 대수 세포 농도의 차이를 기반으로 결정되었다. 실험 결과 트랜스라이신은 이노라이신에 비해 약 2배 가량의 용균 활성을 보이는 것을 확인할 수 있었다(도 20).
[실시예 7: 트랜스라이신 라이브러리 기반 항균 소재 스크리닝]
본 발명의 단백질 전달 시스템을 활용하여 다양한 균주에 대한 항균 소재를 발굴하기 위해 트랜스라이신 스크리닝 방법을 고안하였다 (도 21). 구체적으로 표 2, 표 3의 엔도라이신과 RBP를 조합하여 트랜스라이신 라이브러리를 구축하고 표 6의 목표 균주의 생균을 0.4% LB 연 한천에 균질 혼합하여 론(lawn)을 형성한 이후 스팟팅 어세이를 통해 용균 활성을 확인함으로써 균주별 신규 항균 소재를 탐색할 수 있다.
후보 세균 비고
Pseudomonas aeruginosa PAO1
Pseudomonas aeruginosa KACC 10186
Pseudomonas aeruginosa ATCC 15692
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
Pseudomonas putida KCTC 1643
Escherichia coli BL21
Escherichia coli MG1655
Escherichia coli ATCC 43889 O157:H7, Stx2, hemolytic uremic syndrome
Escherichia coli ATCC 43890 O157:H7, Stx1
Escherichia coli ATCC 43895 O157:H7, Stx1, Stx2, hemorrhagic colitis
Escherichia coli ATCC 35150 O157:H7, hemorrhagic colitis
Escherichia coli ATCC 25922 O6, clinical isolate
Salmonella Typhimurium SL1344
Salmonella Typhimurium UK-1
Salmonella Typhimurium 14028s
Salmonella Typhimurium LT2
Salmonella Typhimurium DT104 zoonotic pathogen, MDR
Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae ATCC 10031
Klebsiella pneumoniae KCTC 2242
Klebsiella pneumoniae ATCC 13883
Klebsiella pneumoniae Revco 41
본 발명에서는 P. putida KCTC 1643 균주에 6종의 트랜스라이신 (PB1_gp48-iLCHN-PRD1, PB1_gp48-iLCHN-chee24, LysPA26-iLCHN-PRD1, LysPA26-iLCHN-chee24, T5Lys-iLCHN-PRD1, T5Lys-iLCHN-chee24)을 처리하여 용균 활성을 나타내는 조합을 확인한 결과 PRD1_04 RBP를 포함하는 트랜스라이신은 모두 목표 균주에 대한 용균 활성을 나타내는 것을 확인하였다 (도 22).
상기 트랜스라이신을 제조하기 위해 추가로 사용한 서열은 다음과 같다:
T5Lys-Gp41.1N: 서열번호 27;
CfaC-T5 like chee24: 서열번호 28.
본 발명의 트랜스라이신은 박테리오파지 유래의 항균 단백질 엔도라이신과 수용체 부착 단백질 (Receptor binding protein, RBP)을 보툴리늄 독소의 전위 도메인 HN과 결합한 단백질 복합체로, HN을 중심으로 카르복실 말단(C-terminal)에 RBP, 아미노 말단 (N-terminal)에 엔도라이신을 배치한 구조로 설계되었다 (도 23).
이러한 설계를 바탕으로 트랜스라이신이 목표 균주와의 상호작용 시 카르복실 말단의 RBP가 세포 외막(outer membrane)에 위치한 수용체를 인식하여 부착된 후 HN이 세포막 내부로 이입되고, 아미노 말단의 엔도라이신이 펩티도글라이칸(peptidoglycan)에 근접하여 용해 작용을 유발함으로써 세포를 사멸시키는 효과를 나타내었다(도 24).
본 발명의 트랜스라이신은 크기가 약 180 kDa에 달할 것으로 예측되었는데, 이를 발현 및 정제하는 과정에서 수율과 순도의 문제가 발생할 가능성을 고려하여 전장 단백질을 발현하는 방법과 분할된 단백질 단편을 각각 발현하여 인 비트로 상에서 결합하는 방법을 시도하여 그 결과를 비교한 결과, 분할된 단백질 단편을 각각 발현하여 결합하는 방법이 기존의 방식의 단점을 보완하고 온전한 전장 단백질을 생성할 수 있었다.
본 발명에서는 엔도라이신, 전위 도메인, RBP 각각의 단편을 결합하는 수단으로 인테인(intein)과 스파이 택&캐쳐를 도입하여 단백질 트랜스 스플라이싱 반응과 생체접합(Bioconjugation)을 통해 단백질 단편을 전장 단백질로 결합하는 방식을 택하였다(도 25 및 26). 또한, 인테인과 스파이 택&캐쳐를 활용하여 다양한 엔도라이신과 RBP를 조합함으로써 트랜스라이신 라이브러리를 구축하고 각각의 트랜스라이신의 용균 작용을 확인하여 신규 항균 소재를 스크리닝이 가능하다.
<110> MVRIX Co.,Ltd. <120> Protein Complex Comprising Botulinum Toxin Translocation Domain and Endolysin, and Anti-Bacterial Composition Comprising Thereof <130> YP-21-258 <150> KR 10-2021-0050767 <151> 2021-04-19 <160> 43 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 88 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Gp41.1 Int-N <400> 1 Cys Leu Asp Leu Lys Thr Gln Val Gln Thr Pro Gln Gly Met Lys Glu 1 5 10 15 Ile Ser Asn Ile Gln Val Gly Asp Leu Val Leu Ser Asn Thr Gly Tyr 20 25 30 Asn Glu Val Leu Asn Val Phe Pro Lys Ser Lys Lys Lys Ser Tyr Lys 35 40 45 Ile Thr Leu Glu Asp Gly Lys Glu Ile Ile Cys Ser Glu Glu His Leu 50 55 60 Phe Pro Thr Gln Thr Gly Glu Met Asn Ile Ser Gly Gly Leu Lys Glu 65 70 75 80 Gly Met Cys Leu Tyr Val Lys Glu 85 <210> 2 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Gp41.1 Int-C <400> 2 Met Met Leu Lys Lys Ile Leu Lys Ile Glu Glu Leu Asp Glu Arg Glu 1 5 10 15 Leu Ile Asp Ile Glu Val Ser Gly Asn His Leu Phe Tyr Ala Asn Asp 20 25 30 Ile Leu Thr His Asn 35 <210> 3 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Glu Val Lys Glu Asn Thr 355 360 365 Val Thr Ile Gly Asn Tyr Thr Thr Thr Leu Ser Ser Ala Tyr Tyr Ala 370 375 380 Val Tyr Lys Thr Asp Gly Tyr Gly Gly Ala Thr Cys Phe Ile Ala Ser 385 390 395 400 Gly Gly Ala Gly Ile Ser Ala Leu Val Gln Leu Gln Asp Asn Ser Val 405 410 415 Leu Asp Val Leu Tyr Tyr Ser Leu Pro Leu Ser Leu Gly Gly Ser Lys 420 425 430 Ala Ala Ile Asp Glu Trp Val Ala Asn Asn Cys Gly Leu Phe Pro Met 435 440 445 Ser Gly Gly Leu Asp Lys Thr Thr Leu Leu Glu Ile Pro Arg Arg Gln 450 455 460 Leu Glu Ala Ile Asn Pro Gln Asp Gly Pro Gly Gln Tyr Asp Leu Phe 465 470 475 480 Ile Leu Asp Asp Ser Gly Ala Tyr Ala Ser Phe Ser Ser Phe Ile Gly 485 490 495 Tyr Pro Glu Ala Ala Tyr Tyr Val Ala Gly Ala Ala Thr Phe Met Asp 500 505 510 Val Glu Asn Pro Asp Glu Ile Ile Phe Ile Leu Arg Asn Gly Ala Gly 515 520 525 Trp Tyr Ala Cys Glu Ile Gly Asp Ala Leu Lys Ile Ala Asp Asp Glu 530 535 540 Phe Asp Ser Val Asp Tyr Phe Ala Tyr Arg Gly Gly Val Met Phe Ile 545 550 555 560 Gly Ser Ala Arg Tyr Thr Glu Gly Gly Asp Pro Leu Pro Ile Lys Tyr 565 570 575 Arg Ala Ile Ile Pro Gly Leu Pro Arg Gly Arg Leu Pro Arg Val Val 580 585 590 Leu Glu Tyr Gln Ala Val Gly Met Ser Phe Ile Pro Cys Gln Thr His 595 600 605 Cys Leu Gly Lys Gly Gly Ile Ile Ser Lys Val *** 610 615 620

Claims (12)

  1. 보툴리늄 독소 전위 도메인 및 엔도라이신을 포함하는 단백질 복합체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 단백질 복합체는,
    수용체 부착 단백질을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 복합체.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 단백질 복합체는,
    '엔도라이신, 보톨리늄 독소 전위 도메인 및 수용체 부착 단백질'의 순서로 구성되는 것을 특징으로 하는 단백질 복합체.
  4. 제2항의 단백질 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터.
  5. 제2항의 단백질 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터로 형질 전환된 숙주세포.
  6. 보툴리늄 독소 전위 도메인을 포함하는 제1 단백질 단편 및 엔도라이신을 포함하는 제2 단백질 단편을 혼합하는 단계 (a); 및
    상기 혼합된 단백질 단편을 결합하는 단계 (b);를 포함하는 단백질 복합체의 제조 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 혼합하는 단계 (a)는,
    보툴리늄 독소 전위 도메인을 포함하는 제1 단백질 단편 및 엔도라이신을 포함하는 제2 단백질 단편의 혼합시, 수용체 부착 단백질을 포함하는 제3 단백질 단편을 더 혼합하는 것을 특징으로 하는 단백질 복합체의 제조방법.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 단백질 단편은,
    인테인을 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 복합체의 제조 방법.
  9. 제6항에 있어서,
    상기 단백질 단편을 결합하는 단계 (b)는,
    단백질 트랜스 스플라이싱 반응에 의해 이루어지는 것을 특징으로 하는 단백질 복합체의 제조 방법.
  10. 제6항에 있어서,
    상기 단백질 단편은.
    스파이 택&캐쳐를 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 복합체의 제조 방법.
  11. 제1항의 단백질 복합체를 포함하는 항균용 조성물.
  12. 표적 균주에 제2항의 단백질 복합체를 반응시키는 단계; 및
    상기 단백질 복합체가 표적 균주에 대한 항균 활성을 나타내는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 항균 활성 단백질 복합체의 스크리닝 방법.
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