KR20220137668A - Klk5에 대한 항체 - Google Patents

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KR20220137668A
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피터 찰스 엘리엇
세페 프란스 로만 레이센
션 메이슨
데이비드 제임스 맥밀런
질리언 클레어 네스
니콜로 펭고
마틴 앤서니 레드헤드
앨리슨 터너
케리 루이스 타이슨
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유씨비 바이오파마 에스알엘
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Abstract

본 발명은 KLK5에 결합하여 이를 억제하는 항체, 및 이를 사용하여 KLK5 불균형에 의해 야기된 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 KLK5에 결합하는 억제 항체, 및 네더톤병, 아토피성 피부염 및 암의 치료에 있어서 이의 용도에 관한 것이다.

Description

KLK5에 대한 항체
본 발명은 KLK5에 결합하여 이를 억제하는 항체, 및 이를 사용하여 KLK5 조절이상에 의해 야기된 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 항-KLK5 항체, 및 네더톤병(Netherton disease), 선천성 어린선과 같은 어린선, 아토피성 피부염 및 암의 치료에 있어서 이의 용도에 관한 것이다.
칼리크레인(kallikrein) 관련 펩티다제(KLK로서 알려짐)는 인간 게놈에서 프로테아제 코딩 유전자의 가장 큰 중단 없는 클러스터(염색체 19q13.4)에 의해 코딩된 15개의 고도로 보존된 트립신 또는 키모트립신 유사 세린 프로테아제의 단일 패밀리를 구성한다(Sotiropoulou G. et al., 2009; JBC 284:48, 32989-94).
KLK는 단백질분해 프로세싱되어 불활성 전구형태를 분비하는 불활성 예비-전구형태로서 합성된다. 그 후, 이러한 전구형태는 다른 KLK 또는 엔도펩티다제에 의한, 또는 칼리크레인 5(KLK5)의 경우와 같은 자가촉매 절단에 의한 그의 N-말단 전구펩타이드의 특이적 단백질분해성 제거에 의해 성숙 펩티다제로 활성화된다.
KLK5는 여러 조직에서 발견되나, 피부에서 가장 풍부하게 발현된다. KLK5는 KLK7과 함께 피부의 상부 극돌기 및 과립 수준으로 발현되고, 이때 각질형성세포는 말기 분화를 겪고 각질층을 구축하는 각질세포에서 형질전환된다. 각질층은 외부 환경에 대한 장벽으로서 기능하고 박리 과정에 의해 탈락된 각질세포의 지속적인 교체를 통해 유지된다. KLK5는 전구 KLK7 및 다른 칼리크레인을 활성화시킬 수 있기 때문에, 박리에서의 그의 역할은 필수적이다.
활성화 후, 성숙 KLK5는 SPINK5 유전자에 의해 코딩되는 내생성 억제제 림프상피 카잘형(Kazal-type) 억제제(LEKTI)에 의해 불활성화된다(Chavans P et al., 2005; Nat Genet 37, 56-65). LEKTI는 KLK5와 긴밀한 복합체를 형성하는 15-도메인 세린 프로테아제 억제제 도메인을 함유한다. pH의 변화는 복합체로부터 활성 KLK5를 방출하는 산성 pH와의 이 긴밀한 상호작용을 좌우한다(Deraison C et al. 2007; Mol Biol Cell 18 3607-19).
SPINK5 유전자의 기능 상실 돌연변이는 심각한 염증, 피부 스케일링, 상승된 IgE 수준 및 지속적인 알레르기성 증상발현을 동반하는 어린선 특징을 특징으로 하는 희귀 상염색체 열성 피부 질환인 네더톤 증후군을 야기한다(Hovnanian A. 2013; Cell Tissue Res 351 289-300). 표피 프로테아제 과다활성에 부차적인 LEKTI의 결핍은 데스모글레인(desmoglein) 및 데스모좀(desmosome)에 대한 KLK5 활성에 의해 야기된 각질층 탈착을 야기하고, 이 탈착은 아토피성 피부염 유사 병변을 야기하는 다양한 알레르겐들에 대한 높은 투과성에 유리하다. KLK7에 대한 KLK5 활성은 알레르겐 및 미생물 침투 및 IL-1베타 생성으로 이어지는 결함 있는 피부 장벽에도 기여한다.
SPINK5 - / - 마우스는 질환의 피부 측면과 염증 측면을 복제하는 네더톤 증후군을 매우 연상시키는 표현형을 재현한다(Yant T et al.; 2004, Genes Dev 18 2354-58). 네더톤 증후군 환자로부터의 SPINK5 - / - 표피는 KLK5-PAR2-TSLP(흉선 간질 림포포이에틴) 축을 포함하는 전구염증 및 전구신호전달 경로의 활성화를 유지하는 것으로 보이는 반대되지 않는 KLK5 및 KLK7 프로테아제 활성을 나타낸다.
SPINK5 - / - 마우스 및 KLK5 - / - 마우스 둘 다에서, KLK5 넉아웃은 LEKTI 넉아웃의 이러한 피부 증상발현을 교정하기에 충분하였으므로, 이는 피부 항상성에 있어서 KLK5의 중요한 역할을 예증한다.
최근, 여러 연구는 아토피성 피부염(AD)과, LEKTI의 비정상적인 변이체가 발현되는 LEKTI 다형성 사이의 유전적 연관성을 보고하였다(Hovnanian A. 2013; Cell Tissue Res 351 289-300).
현재까지, SPINK5 렌티바이러스 또는 아데노바이러스 벡터에 의한 유전자 추가 및 유전적으로 교정된 환자 각질형성세포의 자가 이식을 포함하는, LEKTI의 교체를 목적으로 하는 요법만이 추구되어 왔다(Di WL. et al.; 2011, Mol Ther 19 408-16).
따라서, KLK5의 조절이상과 관련되어 있거나 이에 의해 야기되는 질환에서 치료 효과를 발휘할 수 있는 KLK5 억제를 목적으로 하는 수동 면역 요법과 같은 항-KLK5 요법이 필요하다.
본 발명은 하기 실시양태에 따른 억제성 항-KLK5 항체를 제공함으로써 상기 확인된 필요를 해결한다.
실시양태 1: 칼리크레인 5(KLK5)에 결합하는 항체로서, 항체가 가변 경쇄 및 가변 중쇄를 포함하며,
a. 가변 경쇄가 서열번호 1 또는 서열번호 62 또는 서열번호 63을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 2를 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 3을 포함하는 CDR-L3을 포함하고;
b. 가변 중쇄가 서열번호 4를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5를 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 6을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 항체.
실시양태 2: 실시양태 1에 있어서,
a. 가변 경쇄가 서열번호 1을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 2를 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 3을 포함하는 CDR-L3을 포함하고;
b. 가변 중쇄가 서열번호 4를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5를 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 6을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 항체.
실시양태 3: 칼리크레인 5(KLK5)에 결합하는 항체로서, 서열번호 51을 참조할 때 아미노산 잔기 Arg87, Ala107, Arg110, Lys111, Lys112, Val113, Val137, Lys138, Ser139, Ile140, Pro141, His142, Pro143, Tyr145, Ser146 및 His147을 포함하는 인간 KLK5의 에피토프에 결합하는 항체.
실시양태 4: 실시양태 3에 있어서, 에피토프가 X-선 결정학에 의해 특징규명되는 항체.
실시양태 5: 실시양태 1 내지 4 중 어느 한 실시양태에 있어서, KLK5의 프로테아제 활성을 억제하거나 감소시키는 항체.
실시양태 6: 실시양태 1 내지 5 중 어느 한 실시양태에 있어서, KLK5가 LEKTI 또는 LEKTI의 단편에 결합에 결합될 때 KLK5에 결합하는 항체.
실시양태 7: 실시양태 1 내지 6 중 어느 한 실시양태에 있어서, KLK5에의 결합에 대해 LEKTI 또는 LEKTI의 단편과 경쟁하지 않는 항체.
실시양태 8: 실시양태 1 내지 7 중 어느 한 실시양태에 있어서, LEKTI 또는 LEKTI의 단편에 결합된 KLK5와 복합체를 형성하는 항체.
실시양태 9: 실시양태 6 내지 8 중 어느 한 실시양태에 있어서, LEKTI의 단편이 서열번호 54의 아미노산 1 내지 64를 포함하는 인간 LEKTI 도메인 5 또는 서열번호 61의 아미노산 1 내지 71을 포함하는 LEKTI 도메인 8인 항체.
실시양태 10: 상기 실시양태들 중 어느 한 실시양태에 있어서, 인간 KLK5, 바람직하게는 서열번호 53을 포함하는 인간 KLK5, 및 사이노몰구스 원숭이(cyno) KLK5, 바람직하게는 서열번호 60을 포함하는 cyno KLK5에 결합하는 항체.
실시양태 11: 상기 실시양태들 중 어느 한 실시양태에 있어서, 인간 또는 cyno 칼리크레인 2(KLK2); 또는 인간 또는 cyno 칼리크레인 4(KLK4); 또는 인간 또는 cyno 칼리크레인 7(KLK7)에 결합하지 않는 항체.
실시양태 12: 실시양태 3 내지 11 중 어느 한 실시양태에 있어서, 가변 경쇄 및 가변 중쇄를 포함하는 항체로서,
a. 가변 경쇄가 서열번호 1 또는 서열번호 62 또는 서열번호 63을 포함하는 CDR-L1, 바람직하게는 서열번호 1을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 2를 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 3을 포함하는 CDR-L3을 포함하고;
b. 가변 중쇄가 서열번호 4를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5를 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 6을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 항체.
실시양태 13: 상기 실시양태들 중 어느 한 실시양태에 있어서, 키메라 또는 인간화된 항체인 항체.
실시양태 14: 상기 실시양태들 중 어느 한 실시양태에 있어서, 전체 길이 항체인 항체.
실시양태 15: 실시양태 13에 있어서, 전체 길이 항체가 IgG1, IgG4 또는 IgG4P로부터 선택되는 항체.
실시양태 16: 실시양태 1 내지 13 중 어느 한 실시양태에 있어서, Fab, Fab', F(ab')2, scFv, dAb 또는 VHH로부터 선택되는 항체.
실시양태 17: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서,
a. 서열번호 7 또는 11 또는 15 또는 19 또는 23을 포함하는 가변 경쇄; 및/또는
b. 서열번호 9 또는 27 또는 31 또는 35 또는 39 또는 43을 포함하는 가변 중쇄
를 포함하는 항체.
실시양태 18: 실시양태 1 내지 15 또는 17 중 어느 한 실시양태에 있어서,
a. 서열번호 13 또는 17 또는 21 또는 25를 포함하는 경쇄; 및
b. 서열번호 29 또는 33 또는 37 또는 41 또는 45를 포함하는 중쇄
를 포함하는 항체.
실시양태 19: 실시양태 17 또는 18에 있어서, 서열번호 15 또는 17을 참조할 때 위치 24에서 L-CDR1의 아미노산 잔기 글루타민(Gln; Q)이 아르기닌(Arg; R) 또는 라이신(Lys; K)으로 교체되어 있는 항체.
실시양태 20: 상기 실시양태들 중 어느 한 실시양태에 있어서, KLK5가 서열번호 51 또는 52 또는 53을 포함하는 인간 KLK5, 또는 서열번호 60을 포함하는 cyno KLK5인 항체.
실시양태 21: a. 실시양태 1 내지 20 중 어느 한 실시양태에 따른 항체와 KLK5에의 결합에 대해 경쟁하고/하거나;
b. KLK5에의 결합에 대해 실시양태 1 내지 20 중 어느 한 실시양태에 따른 항체를 교차차단하거나 이러한 항체에 의해 교차차단되고/되거나;
c. 실시양태 1 내지 20 중 어느 한 실시양태에 따른 항체와 동일한 에피토프에 KLK5를 결합시키고/시키거나;
d. 서열번호 29 또는 33 또는 37 또는 41 또는 45에 따른 서열에 대한 적어도 90% 동일성 또는 유사성을 가진 중쇄 가변 영역을 포함하고/하거나;
e. 서열번호 13 또는 17 또는 21 또는 25에 따른 서열에 대한 적어도 90% 동일성 또는 유사성을 가진 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체.
실시양태 22: 실시양태 1 내지 20 중 어느 한 실시양태에 따른 항체를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드.
실시양태 23: 실시양태 22에 있어서,
a. 경쇄 가변 영역을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드로서,
i. 서열번호 8(또는 서열번호 8의 뉴클레오타이드 1 내지 330) 또는 12(또는 서열번호 12의 뉴클레오타이드 1 내지 330) 또는 16 또는 20 또는 24 또는 64 또는 66과 적어도 90% 동일하거나,
ii. 서열번호 8(또는 서열번호 8의 뉴클레오타이드 1 내지 330) 또는 12(또는 서열번호 12의 뉴클레오타이드 1 내지 330) 또는 16 또는 20 또는 24 또는 64 또는 66을 포함하거나,
iii. 본질적으로 서열번호 8(또는 서열번호 8의 뉴클레오타이드 1 내지 330) 또는 12(또는 서열번호 12의 뉴클레오타이드 1 내지 330) 또는 16 또는 20 또는 24 또는 64 또는 66으로 이루어지는 단리된 폴리뉴클레오타이드; 또는
b. 중쇄 가변 영역을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드로서,
i. 서열번호 10 또는 28 또는 32 또는 36 또는 40 또는 44와 적어도 90% 동일하거나,
ii. 서열번호 10 또는 28 또는 32 또는 36 또는 40 또는 44를 포함하거나,
iii. 본질적으로 서열번호 10 또는 28 또는 32 또는 36 또는 40 또는 44로 이루어지는 단리된 폴리뉴클레오타이드; 또는
c. 경쇄를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드로서,
i. 서열번호 14 또는 18 또는 22 또는 26 또는 65 또는 67 또는 100 또는 101 또는 102 또는 103 또는 104와 적어도 90% 동일하거나,
ii. 서열번호 14 또는 18 또는 22 또는 26 또는 65 또는 67 또는 100 또는 101 또는 102 또는 103 또는 104를 포함하거나,
iii. 본질적으로 서열번호 14 또는 18 또는 22 또는 26 또는 65 또는 67 또는 101 또는 102 또는 103 또는 104로 이루어지는 단리된 폴리뉴클레오타이드; 또는
d. 중쇄를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드로서,
i. 서열번호 30 또는 34 또는 38 또는 42 또는 46과 적어도 90% 동일하거나,
ii. 서열번호 30 또는 34 또는 38 또는 42 또는 46을 포함하거나,
iii. 본질적으로 서열번호 30 또는 34 또는 38 또는 42 또는 46으로 이루어지는 단리된 폴리뉴클레오타이드.
실시양태 24: 실시양태 22 또는 23에 따른 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 클로닝 또는 발현 벡터.
실시양태 25: a. 실시양태 22 또는 23에 따른 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드, 또는
b. 실시양태 24에 따른 하나 이상의 발현 벡터
를 포함하는 숙주 세포.
실시양태 26: 실시양태 1 내지 20 중 어느 한 실시양태에 따른 항체를 제조하는 방법으로서, 항체를 생성하기에 적합한 조건 하에서 실시양태 25에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계 및 상기 숙주 세포에 의해 생성된 항체를 단리하는 단계를 포함하는 방법.
실시양태 27: 실시양태 1 내지 20 중 어느 한 실시양태에 따른 항체 및 1종 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물.
실시양태 28: 실시양태 1 내지 20 및 27 중 어느 한 실시양태에 있어서, 치료에 사용하기 위한 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 약학 조성물.
실시양태 29: 실시양태 1 내지 20 및 27 중 어느 한 실시양태에 있어서, KLK5의 조절이상 또는 KLK5 억제의 조절이상을 특징으로 하는 질환의 치료에 사용하기 위한 항체 또는 약학 조성물.
실시양태 30: 실시양태 29에 있어서, 질환이 네더톤 증후군, 아토피성 피부염, 어린선, 주사비, 천식 또는 암, 예컨대, 난소암 또는 방광암, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 항체.
실시양태 31: 실시양태 30에 있어서, 질환이 네더톤 증후군인 항체.
실시양태 32: 실시양태 30에 있어서, 질환이 아토피성 피부염인 항체.
실시양태 33: 환자에서 KLK5의 조절이상 또는 KLK5 억제의 조절이상을 특징으로 하는 질환을 치료하는 방법으로서, 실시양태 1 내지 20 중 어느 한 실시양태에 따른 항체 또는 실시양태 27에 따른 약학 조성물의 치료 유효량을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
실시양태 34: 실시양태 33에 있어서, 질환이 네더톤 증후군, 아토피성 피부염, 어린선, 주사비, 천식 또는 암, 예컨대, 난소암 또는 방광암으로부터 선택되는 방법.
실시양태 35: 실시양태 34에 있어서, 질환이 네더톤 증후군인 항체.
실시양태 36: 실시양태 34에 있어서, 질환이 아토피성 피부염인 항체.
도 1. 크기 배제 크로마토그래피(SEC). 패널 A 및 B는 인간 KLK5 단독(실선, 맨 오른쪽), 토끼 Fab 항체 10236 단독(점선), 인간 KLK5 + LEKTI D5(긴 파선, 패널 A) 또는 인간 KLK5 + LEKTI D8(긴 파선, 패널 B) 및 인간 KLK5 + LEKTI D5 + 토끼 Fab 항체 10236(짧은 파선, 맨 왼쪽, 패널 A) 또는 인간 KLK5 + LEKTI D8 + 토끼 Fab 항체 10236(짧은 파선, 맨 왼쪽, 패널 B)의 용출 프로파일을 보여준다.
도 2. 도 1A 및 1B에 표시된 SEC의 피크 분획의 SDS-PAGE. 레인 1, MW 마커. 레인 2, 이원 복합체 인간 KLK5 + LEKTI D5의 피크 분획. 레인 3, 삼원 복합체 KLK5 + LEKTI D5 + 토끼 Fab 항체 10236의 피크 분획. 레인 4, 이원 복합체 KLK5 + LEKTI D8의 피크 분획. 레인 5, KLK5 + LEKTI D8 + 토끼 Fab 항체 10236의 삼원 복합체의 피크 분획.
도 3. X-선 결정학 연구를 위해 생성된 KLK5의 SDS-PAGE. 레인 M, MW 마커. 레인 1, 키푸넨신(kifunensine)(kif)의 존재 하에서 생장된 배양물로부터 정제된 인간 KLK5. 레인 2, 키푸넨신 배양물로부터 정제되고 엔도글리코시다제 H(Endo H)로 처리된 인간 KLK5.
도 4. 토끼 Fab 항체 10236과 복합체를 형성한 인간 KLK5 에피토프의 도식적 표현. A) Fab 중쇄(진회색) 및 경쇄(연회색)는 밑그림으로 투명 표면으로 표시되어 있다. KLK5는 검은색 리본으로서 표시되어 있다. 항체 10236에 의해 결합된 인간 KLK5의 에피토프의 일부인 KLK5의 잔기는 검정색 막대로서 표시되어 있다. B) 토끼 Fab10236에 결합된 KLK5(리본)의 결정 구조(표면 렌더링됨)에서 모델링된 류펩틴(Leupeptin)(표면 및 막대). Fab10236은 KLK5의 99-루프와 접촉한다. C) 아연의 존재 하에서 KLK5의 99-루프 및 측쇄 위치 His147 및 His150에서의 이동을 강조하는, 결정 구조 2PSX(흰색, 아연 없음) 및 2PSY(회색, 아연 포함)의 중첩. 류펩틴은 흰색 표면과 막대로 표시되어 있다. D) Fab10236과 복합체를 형성한 KLK5의 결정 구조 상에의 결정 구조 2PSX(류펩틴에 결합된 KLK5)의 중첩. 두 구조를 비교할 때, 99-루프 및 측쇄 위치 His147 및 His150에서의 이동이 강조되어 있다. 결정 구조 2PSX 및 KLK5에 결합된 Fab10236의 결정 구조에서 상기 루프 및 His 잔기의 입체구조는 각각 흰색 및 검은색으로 표시되어 있다. His147 주위의 흰색 파선 직사각형(결정 구조 2PSX)은 이 입체구조가 Fab10236(회색 표면)과 충돌할 것임을 표시한다. His147은 KLK5-Fab10236 구조에서 상이한 입체구조로 존재한다. His150 주위의 흰색 파선 원(KLK5와 Fab10236의 복합체에서 관찰된 검정색)은 이것이 류펩틴과 같은 기질이 결합할 KLK5 활성 부위인 S2 포켓을 가리킴을 표시한다. 결정 구조 2PSX의 류펩틴(회색 표면 및 막대)은 기질이 KLK5 활성 부위에서 결합할 것으로 예상되는 위치를 보여준다.
도 5. 토끼 Fab 항체 10236 및 10273과 복합체를 형성한 인간 KLK5의 결정 구조의 양 방향. 인간 KLK5는 리본 표시로서 표시되어 있고, 토끼 Fab 항체 10236 및 10273은 고체 표면으로서 표시되어 있다.
도 6. 항체 10236의 토끼 가변 경쇄 서열의 인간화. 이식편 10236gL5, gL6, gL7 및 gL8은 수용자 프레임워크로서 IGKV1-6 인간 생식세포계열을 사용하는 항체 10236의 토끼 가변 경쇄의 인간화된 이식편이다. 공여자 잔기는 볼드체/이탤릭체로 표시되어 있고 회색 음영으로 처리되어 있다: Y2, D3 및 K63. CDR은 볼드체/밑줄로 표시되어 있다. pI를 증가시키는 CDRL1의 돌연변이는 볼드체/밑줄로 표시되어 있고 강조되어 있다: Q24R 또는 Q24K.
도 7. 항체 10236의 토끼 가변 중쇄 서열의 인간화. 이식편 10236gH9, gH10, gH11, gH12 및 gH14는 수용자 프레임워크로서 IGHV4-4 인간 생식세포계열을 사용하는 항체 10236의 토끼 가변 중쇄의 인간화된 이식편이다. CDR은 볼드체/밑줄로 표시되어 있다. 공여자 잔기는 볼드체/이탤릭체로 표시되어 있고 회색 음영으로 처리되어 있다: F67, Q71, S73, T76 및 V78.
도 8. 항체 10236 gL6gH12 대 칼리크레인 패널 및 LEKTI D5 토끼 Fc 대 인간 및 cyno KLK5의 억제 활성.
도 9. Ab 10236 gL6gH12에 의한 HaCat 세포로부터의 IP-1 방출의 억제. IP-1 방출은 KLK5를 HaCat 세포에 첨가함으로써 자극되었다. 항체 10236 gL6gH12는 기준 LEKTI D5 토끼 Fc 단백질에 필적할만한 수준으로 IP-1의 거의 완전한 억제를 달성하였다. A33 Hu IgG4는 이소타입 대조군이다.
도 10. 항체 10236 gL6gH12(A) 및 모 토끼 항체(B)의 작용 기작. Kobs 값은 항체 10236 및 LEKTI D5 토끼 Fc 단백질(후자는 (A)에서만)에 대한 기질 농도에 대해 작도되었다. 제시된 데이터는 10 nM 항체 10236 및 2 nM LEKTI D5 토끼 Fc에 대한 데이터이다. 기울기는 항체 10236이 비경쟁적 억제제인 반면, LEKTI 단백질이 경쟁적 억제제임을 보여준다.
도 11. 재구성된 인간 피부 표피 모델에서 피부 구조 및 각질층 무결성을 보여주는 헤마톡실린 및 에오신 염색. 배지, 항체 10236 gL6gH12 IgG4P(Ab 10236)를 갖거나 갖지 않은 MC903 또는 이소타입 대조군(hIgG4P)의 효과.
도 12. 대조군 완충제(A) 또는 항체 10236 gL6gH12 IgGP4(B)로 처리한 아토피성 피부염 피부 박편에서 세린 프로테아제 활성을 보여주는 제자리 자이모그래피(zymography) 어세이.
도 13. 경쇄 CDR3의 Asn(94)Ser 모티프에서 탈아미드화 성향을 평가하기 위한 항체 10236 gL6gH12 IgG4P(10236gL6gH12로서 명명됨)의 응력 연구.
본 개시내용은 지금부터 특정 비제한적 측면 및 이의 실시양태, 및 특정 도면 및 예와 관련하여 기재될 것이다.
달리 표시되어 있지 않은 한, 기술 용어는 그의 통상의 의미로 사용된다. 특정 의미가 특정 용어에 전달되는 경우, 용어의 정의는 그 용어가 사용되는 맥락에서 제공될 것이다.
용어 "포함하는"이 본 명세서 및 청구범위에서 사용되는 경우, 이것은 다른 요소를 배제하지 않는다. 본 개시내용의 목적을 위해, 용어 "로 이루어지는(로 구성된)"은 용어 "를 포함하는"의 바람직한 실시양태인 것으로 간주된다.
다른 것이 구체적으로 언급되지 않은 한, 단수 명사를 언급할 때 부정관사 또는 정관사가 사용되는 경우, 이것은 그 명사의 복수형을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료", "치료하는" 등은 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 수득하는 것을 의미한다. 상기 효과는 질환 또는 이의 증상을 완전히 또는 부분적으로 예방한다는 관점에서 예방적일 수 있고/있거나, 질환 및/또는 질환에 기인할 수 있는 부작용에 대한 부분적 또는 완전한 치유의 관점에서 치료적일 수 있다. 따라서, 치료는 포유동물, 특히 인간에서 질환의 임의의 치료를 포함하고, (a) 질환에 취약할 수 있으나 아직 질환을 가진 것으로서 진단되지 않은 대상체에서 질환이 발생하는 것을 예방하는 것; (b) 질환을 억제하는 것, 즉 그의 발생을 저지하는 것; 및 (c) 질환을 경감시키는 것, 즉 질환의 퇴행을 야기하는 것을 포함한다.
"치료 유효량"은 질환을 치료하기 위해 포유동물 또는 다른 대상체에게 투여될 때 질환에 대한 이러한 치료를 생성하기에 충분한 KLK5 항체의 양을 지칭한다. 치료 유효량은 항-KLK5 항체, 질환 및 이의 중증도, 및 치료될 대상체의 연령, 체중 등에 따라 달라질 것이다.
용어 "단리된"은 본 명세서 전체에 걸쳐, 경우에 따라 항체 또는 폴리뉴클레오타이드가 자연에서 발생할 수 있는 물리적 환경과 상이한 물리적 환경에 존재함을 의미한다.
본 발명의 제1 측면에서, 칼리크레인 5(KLK5)에 결합하는 항체로서, 항체가 가변 경쇄 및 가변 중쇄를 포함하며,
a. 가변 경쇄가 서열번호 1 또는 서열번호 62 또는 서열번호 63을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 2를 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 3을 포함하는 CDR-L3을 포함하고;
b. 가변 중쇄가 서열번호 4를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5를 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 6을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 것인 항체를 제공한다.
바람직하게는, 칼리크레인 5(KLK5)에 결합하고 가변 경쇄를 포함하는 항체는 서열번호 1을 포함하는 CDR-L1을 포함한다.
따라서, 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 칼리크레인 5(KLK5)에 결합하고 가변 경쇄 및 가변 중쇄를 포함하는 항체는 서열번호 1을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 2를 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 3을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄; 및 서열번호 4를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5를 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 6을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄를 특징으로 한다.
칼리크레인 5(KLK5, KLK-L2, SCTE 또는 임의의 다른 알려진 동의어)는 트립신 유사 활성을 가진다. 이것은 예비-전구형태로 발현되며 생물정보학 도구 SignalP 5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/index.php)에 따른 29개 아미노산 신호 펩타이드에 이어 37개 아미노산 전구펩타이드 서열을 포함한다. 전구펩타이드의 절단은 세린-프로테아제의 전형적인 촉매 트라이어드(triad) 잔기를 가진 활성 부위를 보유하는 237개 아미노산으로 구성된 활성 성숙 효소를 생성한다(Michael I.P et al., 2005; JBC 280:15, 14628-35).
달리 특정되어 있지 않은 한, 용어 KLK5는 임의의 천연 예비형태 및 전구형태(즉, 신호 서열 및 활성화 펩타이드를 포함하는 프로세싱되지 않은 KLK5), 대안적 스플라이싱 또는 천연 변이체, 돌연변이체 및 다른 종(마우스, 사이노몰구스 원숭이 등)의 KLK5, 및 활성 KLK5(자가절단 또는 다른 방식으로부터 생성됨)를 지칭한다. 인간 KLK5가 특정될 때, 인간 KLK5는 서열번호 53으로 제공된 서열(활성 인간 KLK5)을 포함한다. 본원에서 언급된 다른 KLK5 서열은 서열번호 52(신호 서열을 결여하는 인간 KLK5 전구형태) 또는 서열번호 51(신호 및 전구펩타이드 서열을 가진 전체 길이 인간 KLK5), Uniprot Q9Y337에 상응하는 서열, 또는 (서열번호 51을 참조할 때) 위치 55 및 153에서 돌연변이를 포함하는 천연 변이체를 포함한다. 이 돌연변이의 예는 잔기 55에서 Arg로의 Gly의 돌연변이 변화(G55R)를 갖고/갖거나 잔기 153에서 Asn으로의 Asp의 변화(D153N)를 가진 서열번호 51에 따른 잔기 23 내지 293을 포함하는 인간 KLK5를 포함한다.
본 발명에 따른 항체는 중쇄로부터 3개의 상보성 결정 영역(CDR) 및 경쇄로부터 3개의 CDR을 포함한다. 일반적으로, CDR은 프레임워크에 있고 함께 가변 영역을 형성한다. 통상적으로, 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 가변 영역에 있는 CDR은 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3으로서 지칭되고, 경쇄 가변 영역에 있는 CDR은 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3으로서 지칭된다. 이들은 각각의 쇄의 N-말단에서 C-말단 방향으로 순차적으로 넘버링된다.
CDR은 통상적으로 카바트 연구진(Kabat et al.)에 의해 고안된 시스템에 따라 넘버링된다. 이 시스템은 문헌[Kabat et al., 1991, in Sequences of Proteins of Immunological Interest, Department of Health and Human Services, NIH, USA(이하 "(상기) 문헌[Kabat et al.]")에 기재되어 있다. 달리 표시되어 있는 경우를 제외하고, 이 넘버링 시스템이 본 명세서에서 사용된다.
카바트 잔기 표기는 항상 아미노산 잔기의 선형 넘버링에 직접적으로 상응하지는 않는다. 실제 선형 아미노산 서열은 기본 가변 도메인 구조의 구조적 구성요소인 프레임워크 또는 상보성 결정 영역(CDR)의 단축 또는 이러한 구성요소 내로의 삽입에 상응하는, 엄격한 카바트 넘버링보다 더 적거나 더 많은 아미노산을 함유할 수 있다. 주어진 항체에 대한 잔기의 정확한 카바트 넘버링은 "표준" 카바트 넘버링된 서열을 가진 항체의 서열에서 상동성 잔기의 정렬에 의해 결정될 수 있다.
중쇄 가변 도메인의 CDR은 카바트 넘버링 시스템에 따라 잔기 31 내지 35(CDR-H1), 잔기 50 내지 65(CDR-H2) 및 잔기 95 내지 102(CDR-H3)에 위치한다. 그러나, 초티아(Chothia)(Chothia, C. and Lesk, A.M. J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987))에 따르면, CDR-H1에 해당하는 루프는 잔기 26부터 잔기 32까지 걸쳐 있다. 따라서, 달리 표시되어 있지 않은 한, 본원에서 사용된 'CDR-H1'은 카바트 넘버링 시스템과 초티아의 위상학적 루프 정의의 조합에 의해 기재될 때 잔기 26 내지 35를 지칭하기 위한 것이다.
경쇄 가변 도메인의 CDR은 카바트 넘버링 시스템에 따라 잔기 24 내지 34(CDR-L1), 잔기 50 내지 56(CDR-L2) 및 잔기 89 내지 97(CDR-L3)에 위치한다.
CDR 루프 이외에, 프레임워크 3(FR3)에 의해 형성된 네 번째 루프가 CDR-2(CDR-L2 또는 CDR-H2)와 CDR-3(CDR-L3 또는 CDR-H3) 사이에 존재한다. 카바트 넘버링 시스템은 프레임워크 3을 중쇄의 위치 66 내지 94 및 경쇄의 위치 57 내지 88로서 정의한다.
한 바람직한 실시양태에서, 항체는 서열번호 1을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 2를 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 3을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 서열번호 4를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5를 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 6을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 항체는 서열번호 62를 포함하는 CDR-L1, 서열번호 2를 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 3을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호 4를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5를 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 6을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 항체는 서열번호 63을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 2를 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 3을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호 4를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5를 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 6을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
이러한 CDR 서열들을 포함하는 항체는 이 서열들이 KLK5, 바람직하게는 인간 KLK5에 대한 고친화성, KLK5 생물학적 기능에 대한 높은 억제, 및 제조 가능성에 필수적인 높은 안정성을 가진 항체를 제공하기 때문에 특히 발명적 가치가 있다. 예를 들어, 서열번호 3(QQGYT NS NIINT;)을 포함하는 CDR-L3에서 (서열번호 15를 참조할 때) "ND"로의 모티프 "NS"의 돌연변이는 KLK5 친화성의 현저한 감소를 초래하였다.
본 발명의 제2 측면에서, 칼리크레인 5(KLK5)에 결합하는 항체로서, 서열번호 51을 참조할 때 아미노산 잔기 Arg87(36), Ala107(56), Arg110(59), Lys111(60), Lys112(61), Val113(62), Val137(86), Lys138(87), Ser139(88), Ile140(89), Pro141(90), His142(91), Pro143(92), Tyr145(94), Ser146(95) 및 His147(96)을 포함하는 인간 KLK5의 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다. 바람직하게는, 상기 에피토프는 X-선 결정학에 의해 특징규명된다. 괄호 안의 숫자는 프로테아제 명명법에 상응한다.
바람직한 실시양태에서, 칼리크레인 5(KLK5)에 결합하는 항체는 서열번호 51을 참조할 때 아미노산 잔기 Arg87, Ala107, Arg110, Lys111, Lys112, Val113, Val137, Lys138, Ser139, Pro141, His142, Pro143, Tyr145, Ser146 및 His147을 포함하는 인간 KLK5의 에피토프에 결합하고 가변 경쇄 및 가변 중쇄를 포함하고, 이때
a. 가변 경쇄는 서열번호 1 또는 서열번호 62 또는 서열번호 63, 바람직하게는 서열번호 1을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 2를 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 3을 포함하는 CDR-L3을 포함하고;
b. 가변 중쇄는 서열번호 4를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5를 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 6을 포함하는 CDR-H3을 포함한다.
본 발명 내에서, 용어 "에피토프"는 입체구조적 에피토프 및 선형 에피토프 둘 다에 대해 교환 가능하게 사용된다. 입체구조적 에피토프는 항원의 아미노산 1차 서열의 불연속 구획으로 구성되고, 선형 에피토프는 연속 아미노산에 의해 형성된 서열에 의해 형성된다.
에피토프는 본 발명에 의해 제공된 항체들 중 어느 한 항체와 조합된, 당분야에 알려진 임의의 적합한 에피토프 맵핑 방법에 의해 확인될 수 있다. 이러한 방법의 예는 본 발명의 항체 또는 이의 단편에의 결합에 대해 전체 길이 KLK5로부터 유래한 다양한 길이의 펩타이드를 스크리닝하는 단계 및 항체에 의해 인식되는 에피토프의 서열을 함유하는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 가장 작은 단편을 확인하는 단계를 포함한다. KLK5 펩타이드는 합성에 의해, 또는 KLK5의 단백질분해성 절단에 의해 생성될 수 있다. 항체에 결합하는 펩타이드는 예를 들어, 질량 분광측정 분석에 의해 확인될 수 있다. NMR 분광법 또는 X-선 결정학과 같은 방법을 이용하여 항체에 의해 결합된 에피토프를 확인할 수 있다. 전형적으로, 에피토프 결정이 X-선 결정학에 의해 수행될 때, CDR로부터 4 Å 이내에 있는 항원의 아미노산 잔기는 에피토프의 아미노산 잔기 부분인 것으로 간주된다. 일단 확인되면, 에피토프는 본 발명의 항체에 결합하는 단편을 제조하는 데 사용될 수 있고, 필요한 경우 동일한 에피토프에 결합하는 추가 항체를 수득하기 위한 면역원으로서 사용된다.
본 발명을 설명하는 측면 및 실시양태에서 표시된 에피토프는 바람직하게는 X-선 결정학에 의해 특징규명된 에피토프이다.
본 개시내용의 맥락에서 사용된 용어 '항체'는 전체 항체 및 이의 기능적 활성 단편, 즉 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인을 함유하는 분자(항원 결합 단편으로서도 지칭됨)를 포함한다. 문맥이 달리 표시하지 않은 한, 항체와 관련하여 본원에 기재된 특징은 항원 결합 단편에도 적용된다. 항체는 단일클론성, 다가, 다중특이적, 이중특이적, 완전 인간, 인간화된 또는 키메라 항체일 수 있다(또는 이들로부터 유래할 수 있다).
"면역글로불린(Ig)"으로서도 알려진 전체 항체는 일반적으로 온전한 또는 전체 길이 항체, 즉 어셈블링되어 특징적인 Y형 3차원적 구조를 정의하는, 디설파이드 결합에 의해 상호연결된 2개의 중쇄와 2개의 경쇄의 요소들을 포함하는 항체를 의미한다. 고전적인 천연 전체 항체는 한 유형의 항원에 결합한다는 점에서 단일특이적이고, 2개의 독립적인 항원 결합 도메인을 가진다는 점에서 2가이다. 용어 "온전한 항체", "전체 길이 항체" 및 "전체 항체"는 본원에서 정의된 Fc 영역을 포함하는, 천연 항체 구조와 유사한 구조를 가진 단일특이적 2가 항체를 지칭하기 위해 교환 가능하게 사용된다.
각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서 VL로서 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역(CL)으로 구성된다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서 VH로서 약칭됨), 및 Ig 클래스에 따라 3개의 불변 도메인 CH1, CH2 및 CH3 또는 4개의 불변 도메인 CH1, CH2, CH3 및 CH4로 구성된 중쇄 불변 영역(CH)으로 구성된다. Ig 또는 항체의 "클래스"는 불변 영역의 유형을 지칭하고 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM을 포함하고, 이들 중 몇몇은 서브클래스, 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4로 더 나뉠 수 있다. 항체의 불변 영역은 면역 시스템의 다양한 세포(예를 들어, 이펙터 세포) 및 고전적인 보체 시스템의 제1 성분(C1q)을 비롯한 숙주 조직 또는 인자와 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "불변 영역(들)" 또는 "불변 도메인(들)"은 가변 영역의 외부에 있는 항체의 도메인(들)을 지칭하기 위해 교환 가능하게 사용된다. 불변 도메인은 동일한 이소타입의 모든 항체들에서 동일하지만 이소타입마다 상이하다. 전형적으로, 중쇄의 불변 영역은 N 말단부터 C 말단까지 3개 또는 4개의 불변 도메인을 포함하는 CH1-힌지-CH2-CH3-임의적으로 CH4에 의해 형성된다.
존재하는 경우, 본 발명의 항체 분자의 불변 영역 도메인은 항체의 제안된 기능, 특히 필요할 수 있는 이펙터 기능을 고려하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 불변 영역 도메인은 인간 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM 도메인일 수 있다. 특히, 인간 IgG 불변 영역 도메인, 특히 항체가 치료적 용도를 위한 것이고 항체 이펙터 기능이 요구될 때 IgG1 및 IgG3 이소타입이 사용될 수 있다. 대안적으로, 항체가 치료 목적을 위한 것이고 항체 이펙터 기능이 요구되지 않을 때 IgG2 및 IgG4 이소타입이 사용될 수 있다. 이 불변 영역 도메인들의 서열 변이체도 사용될 수 있음을 인식할 것이다. 예를 들어, 위치 241에서 세린(카바트 넘버링 시스템에 따라 넘버링됨)이 문헌[Angal et al. (Angal et al., 1993)]에 기재된 바와 같이 프롤린으로 바뀐 IgG4. SDS-PAGE 분석 동안 관찰된 바와 같이 키메라 마우스/인간(IgG4) 항체의 불균질성을 없애는 단일 아미노산 치환(Mol Immunol 30, 105-108)이 사용될 수 있다. 이것은 본원에서 IgG4P로서 지칭된다. 이 단일 아미노산 치환은 IgG4 분자의 중쇄가 교환되어 키메라 분자를 생성하는 천연 성향을 방해한다.
"Fc 영역", "Fc 단편" 또는 간단히 "Fc"는 제1 불변 영역 면역글로불린 도메인을 제외한 항체의 불변 영역을 포함하는 항체의 C-말단 영역을 지칭하기 위해 교환 가능하게 사용된다. 따라서, Fc는 IgA, IgD 및 IgG의 마지막 2개의 불변 도메인인 CH2 및 CH3, 또는 IgE 및 IgM의 마지막 3개의 불변 도메인, 및 이들 도메인의 N-말단에 있는 유연한 힌지를 지칭한다. 인간 IgG1 중쇄 Fc 영역은 그의 카르복실 말단에서 잔기 C226을 포함하는 것으로 본원에서 정의되고, 이때 넘버링은 카바트에서와 같이 EU 인덱스에 따른다. 인간 IgG1의 경우, 카바트에서와 같이 EU 인덱스에 따라 하부 힌지는 위치 226 내지 236을 지칭하고, CH2 도메인은 위치 237 내지 340을 지칭하고, CH3 도메인은 위치 341 내지 447을 지칭한다. 다른 면역글로불린의 상응하는 Fc 영역은 서열 정렬에 의해 확인될 수 있다.
본 개시내용의 맥락에서, 존재하는 경우, 불변 영역 또는 Fc 영역은 상기 정의된 바와 같이 천연일 수 있거나, 이것이 기능성 FcR 결합 도메인, 바람직하게는 기능성 FcRn 결합 도메인을 포함하는 한, 다양한 방식으로 변형될 수 있다. 바람직하게는, 변형된 불변 영역 또는 Fc 영역은 기능 및/또는 약동학의 개선을 유발한다. 변형은 Fc 단편의 특정 부분의 결실을 포함할 수 있다. 변형은 항체의 생물학적 성질에 영향을 미칠 수 있는 다양한 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. FcRn 결합을 증가시킴으로써 생체내 반감기를 증가시키는 돌연변이도 존재할 수 있다. 변형은 항체의 글리코실화 프로파일의 변형을 추가로 포함할 수 있다. 천연 Fc 단편은 위치 297에서 아스파라긴 잔기(Asn297)에 결합된 N-글리칸이 2개의 중쇄 각각에 존재하는 CH2 도메인에서 글리코실화된다. 본 개시내용의 맥락에서, 항체는 당변형될 수 있고, 즉 특정 글리코실화 프로파일을 갖도록 조작될 수 있고, 이것은 예를 들어, 개선된 성질, 예를 들어, 개선된 이펙터 기능 또는 개선된 혈청 반감기로 이어진다.
항체의 항원 결합 단편은 단일 쇄 항체(예를 들어, scFv 및 dsscFv), Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 단일 도메인 항체 또는 나노바디(예를 들어, VH 또는 VL, 또는 VHH 또는 VNAR)를 포함한다. 본 발명에 사용하기 위한 다른 항체 단편은 국제 특허 출원 공개 제WO2011/117648호, 제WO2005/003169호, 제WO2005/003170호 및 제WO2005/003171호(이들은 모두 본원에 참고로 포함됨)에 기재된 Fab 및 Fab' 단편을 포함한다.
이 항체 단편을 생성하고 제조하는 방법은 당분야에 잘 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181] 참조).
본원에서 사용된 전형적인 "Fab' 단편" 또는 "Fab'"는 중쇄와 경쇄 쌍을 포함하고, 이때 중쇄는 가변 영역 VH, 불변 도메인 CH1 및 천연 또는 변형된 힌지 영역을 포함하고, 경쇄는 가변 영역 VL 및 불변 도메인 CL을 포함한다. 본 개시내용에 따른 Fab'의 이량체는 F(ab')2를 생성하고, 이때 이량체화는 예를 들어, 힌지를 통한 이량체화일 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "단일 도메인 항체"는 단일 단량체성 가변 항체 도메인으로 구성된 항체 단편을 지칭한다. 단일 도메인 항체의 예는 VH 또는 VL 또는 VHH 또는 V-NAR을 포함한다.
"Fv"는 2개의 가변 도메인, 예를 들어, 협력 가변 도메인, 예컨대, 동족 쌍 또는 친화성 성숙된 가변 도메인, 즉 VH 및 VL 쌍을 지칭한다.
본원에서 사용된 "단일 쇄 가변 단편" 또는 "scFv"는 VH 가변 도메인과 VL 가변 도메인 사이의 펩타이드 링커에 의해 안정화된 단일 쇄 가변 단편을 지칭한다.
본원에서 사용된 "디설파이드 안정화된 단일 쇄 가변 단편" 또는 "dsscFv"는 VH 가변 도메인과 VL 가변 도메인 사이의 펩타이드 링커에 의해 안정화되고 VH와 VL 사이의 도메인간 디설파이드 결합도 포함하는 단일 쇄 가변 단편을 지칭한다(예를 들어, 문헌[Weatherill et al., Protein Engineering, Design & Selection, 25 (321-329), 2012], 국제 특허출원 공개 제WO2007109254호 참조).
가변 도메인 VH와 VL 사이의 디설파이드 결합은 하기 나열된 잔기들 중 2개의 잔기 사이에 있다(문맥이 달리 표시하지 않은 한, 하기 목록에서 카바트 넘버링이 사용됨)(Protein Science 6, 781-788 Zhu et al (1997); Weatherill et al., Protein Engineering, Design & Selection, 25 (321-329), 2012; J Biochem. 118, 825-831 Luo et al (1995); FEBS Letters 377 135-139 Young et al (1995); Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 90 pp.7538-7542 Brinkmann et al (1993); Proteins 19, 35-47 Jung et al (1994) Biochemistry 29 1362-1367; Glockshuber et al (1990)). 카바트 넘버링이 언급될 때마다, 관련 참고자료는 문헌[Kabat et al., 1991 (5th edition, Bethesda, Md.), in Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA]이다.
Figure pct00001
VH37 + VL95C;
Figure pct00002
VH44 + VL100;
Figure pct00003
VH44 + VL105;
Figure pct00004
VH45 + VL87;
Figure pct00005
VH55 + VL101;
Figure pct00006
VH100 + VL50;
Figure pct00007
VH100b + VL4
Figure pct00008
VH98 + VL46;
Figure pct00009
VH101 + VL46;
Figure pct00010
VH105 + VL43,
Figure pct00011
VH106 + VL57; 및
분자에 위치한 가변 영역 쌍에서 이들에 상응하는 위치 또는 위치들.
본원에서 사용된 용어 "항체"는 1가, 즉 하나의 항원 결합 도메인만을 포함하는 항체(예를 들어, "절반 항체"로서도 지칭되는, 상호연결된 전체 길이 중쇄 및 전체 길이 경쇄를 포함하는 1-아암 항체)도 포괄한다.
용어 "항체"는 다중특이성을 포함하는 다가 항체, 예를 들어, 이중특이적 또는 삼중특이적 또는 다중특이적 항체도 포괄한다.
본원에서 사용된 "다중특이적" 또는 "다중특이적 항체"는 적어도 2개의 결합 도메인, 즉 2개 이상의 결합 도메인, 예를 들어, 2개 또는 3개의 결합 도메인을 가진, 본원에 기재된 항체를 지칭하고, 이때 적어도 2개의 결합 도메인은 동일한 항원 상의 2개의 상이한 항원 또는 2개의 상이한 에피토프에 독립적으로 결합한다(다중파라토프성으로서도 지칭됨). 다중특이적 항체는 일반적으로 각각의 특이성(항원)에 대해 1가이다. 본원에 기재된 다중특이적 항체는 1가 및 다가, 예를 들어, 2가, 3가, 4가 다중특이적 항체를 포괄한다.
본원에서 사용된 "항원 결합 도메인"은 표적 항원과 특이적으로 상호작용하는 항체의 부분을 지칭하고, 이 부분은 하나 이상의 가변 도메인의 일부 또는 전부, 예를 들어, 한 쌍의 가변 도메인 VH 및 VL의 일부 또는 전부를 포함한다. 결합 도메인은 단일 도메인 항체를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 각각의 결합 도메인은 1가이다. 바람직하게는, 각각의 결합 도메인은 1개 이하의 VH 및 1개의 VL을 포함한다.
다양한 다중특이적 항체 포맷이 당분야에 공지되어 있다. 다양한 분류가 제안되었으나, 다중특이적 IgG 항체 포맷은 예를 들어, 문헌[Spiess et al., 67(2015):95-106]에 기재된 바와 같이, 일반적으로 이중특이적 IgG, 부착된 IgG, 다중특이적(예를 들어, 이중특이적) 항체 단편, 다중특이적(예를 들어, 이중특이적) 융합 단백질 및 다중특이적(예를 들어, 이중특이적) 항체 접합체를 포함한다.
이중특이적 항체의 제조 기법은 크로스맙(CrossMab) 기술(Klein et al., Methods 154 (2019) 21-31), 놉스-인-홀스(Knobs-in-holes) 조작(예를 들어, 국제 특허출원 공개 제WO1996027011호 및 제WO1998050431호), 듀오바디(DuoBody) 기술(예를 들어, 국제 특허출원 공개 제WO2011131746호), 아자이메트릭(Azymetric) 기술(예를 들어, 국제 특허출원 공개 제WO2012058768호)을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 이중특이적 항체의 추가 제조 기술은 예를 들어, 문헌[Godar et al., 2018, Expert Opinion on Therapeutic Patents, 28:3, 251-276]에 기재되어 있다. 이중특이적 항체는 특히 크로스맙 항체, DAF(two-in-one), DAF(four-in-one), 듀타맙(DutaMab), DT-lgG, 놉스-인-홀스 공통 LC, 놉스-인-홀스 어셈블리, 전하 쌍, Fab-아암 교환, SEEDbody, 트리오맙(Triomab), LUZ-Y, Fcab, κλ-바디 및 오르토고날(orthogonal) Fab를 포함한다.
부착된 IgG는 고전적으로 추가 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 단편을 IgG의 중쇄 및/또는 경쇄의 N-말단 및/또는 C-말단에 부착함으로써 조작된 전체 길이 IgG를 포함한다. 이러한 추가 항원 결합 단편의 예는 sdAb 항체(예를 들어, VH 또는 VL), Fv, scFv, dsscFv, Fab, scFav를 포함한다. 부착된 IgG 항체 포맷은 예를 들어, 문헌[Spiess et al., Alternative molecular formats and therapeutic applications for bispecific antibodies. Mol Immunol. 67(2015):95-106]에 기재된 바와 같이, 특히 DVD-IgG, lgG(H)-scFv, scFv-(H)lgG, lgG(L)-scFv, scFv-(L)lgG, lgG(L,H)-Fv, lgG(H)-V, V(H)-lgG, lgC(L)-V, V(L)-lgG, KIH IgG-scFab, 2scFv-lgG, lgG-2scFv, scFv4-lg, 자이바디(Zybody) 및 DVI-IgG(four-in-one)를 포함한다.
다중특이적 항체 단편은 예를 들어, 문헌[Spiess et al., for bispecific antibodies. Mol Immunol. 67(2015):95-106]에 기재된 바와 같이, 나노바디, 나노바디-HAS, BiTE, 디아바디, DART, TandAb, sc디아바디, sc-디아바디-CH3, 디아바디-CH3, 트리플 바디, 미니항체; 미니바디, Tri Bi 미니바디, scFv-CH3 KIH, Fab-scFv, scFv-CH-CL-scFv, F(ab')2, F(ab')2-scFv2, scFv-KIH, Fab-scFv-Fc, 4가 HCAb, sc디아바디-Fc, 디아바디-Fc, 탠뎀(Tandem) scFv-Fc; 및 인트라바디(intrabody)를 포함한다.
다중특이적 융합 단백질은 독 앤 락(Dock and Lock), ImmTAC, HSAbody, sc디아바디-HAS, 및 탠뎀 scFv-독소를 포함한다. 다중특이적 항체 접합체는 IgG-lgG; Cov-X-Body; 및 scFv1-PEG-scFv2를 포함한다.
추가 다중특이적 항체 포맷은 예를 들어, 문헌[Brinkmann and Kontermann, mAbs, 9:2, 182-212 (2017)], 특히 도 2에 기재되어 있고, 예를 들어, 탠뎀 scFv, 트리플바디, Fab-VHH, taFv-Fc, scFv4-Ig, scFv2-Fcab, scFv4-IgG, 비바디(Bibody), 트리바디, 및 이들의 제조 방법은 예를 들어, 국제 특허출원 공개 제WO99/37791호에 개시되어 있다.
예를 들어, 모두 본원에 참고로 포함되는 국제 특허출원 공개 제WO2009/040562호, 제WO2010035012호, 제WO2011/030107호, 제WO2011/061492호, 제WO2011/061246호 및 WO2011/086091호에 기재된 바와 같이, 부착된 IgG 및 부착된 Fab는 적어도 하나의 추가 항원 결합 도메인(예를 들어, 2개, 3개 또는 4개의 추가 항원 결합 도메인), 예를 들어, 단일 도메인 항체(예컨대, VH 또는 VL, 또는 VHH), scFv, dsscFv, dsFv를 상기 IgG 또는 Fab의 중쇄 및/또는 경쇄의 N-말단 및/또는 C-말단에 부착함으로써 조작된 각각 전체 IgG 또는 Fab 단편을 포함한다. 특히, Fab-Fv 포맷은 국제 특허출원 공개 제WO2009/040562호에 처음 개시되었고 이의 디설파이드 안정화된 버전인 Fab-dsFv는 국제 특허출원 공개 제WO2010/035012호에 처음 개시되었다. dsFv가 Fv의 VL 또는 VH 도메인과 Fab의 LC 또는 HC의 C-말단 사이의 단일 링커를 통해 Fab에 연결되어 있는 단일 링커 Fab-dsFv는 본원에 참고로 포함되는 국제 특허출원 공개 제WO2014/096390호에 처음 개시되었다. dsFv를 IgG의 중쇄 또는 경쇄의 C-말단에 부착함으로써 조작된 전체 길이 IgG1을 포함하는 부착된 IgG는 본원에 참고로 포함되는 국제 특허출원 공개 제WO2015/197789호에 처음 개시되었다.
대안적으로, 또 다른 다중특이적 포맷은 2개의 scFv 또는 dsscFv에 연결된 Fab를 포함하고, 이때 각각의 scFv 또는 dsscFv는 동일하거나 상이한 표적에 결합한다(예를 들어, 치료 표적에 결합하는 하나의 scFv 또는 dsscFv, 및 예를 들어, 알부민에 결합함으로써 반감기를 증가시키는 하나의 scFv 또는 dsscFv). 이러한 항체 단편은 전체적으로 본원에 참고로 포함되는 국제 특허출원 공개 제WO2015/197772호에 기재되어 있다. 또 다른 포맷은 예를 들어, 본원에 참고로 포함되는 국제 특허출원 공개 제WO2013/068571호 및 문헌[Dave et al., Mabs, 8(7) 1319-1335 (2016)]에 기재된 바와 같이 하나의 scFv 또는 dsscFv에만 연결된 Fab를 포함한다.
다중특이적 항체의 다른 잘 알려진 포맷은 하기 포맷들을 포함한다:
본원에서 사용된 디아바디는 제1 Fv의 VH가 제2 Fv의 VL에 연결되고 제1 Fv의 VL이 제2 Fv의 VH에 연결되어 있는 2개의 Fv 쌍, 즉 제1 VH/VL 쌍 및 2개의 Fv간 링커를 가진 추가 VH/VL 쌍을 지칭한다.
본원에서 사용된 트리아바디는 3개의 Fv 및 3개의 Fv간 링커를 포함하는, 디아바디와 유사한 포맷을 지칭한다.
본원에서 사용된 테트라바디는 4개의 Fv 및 4개의 Fv간 링커를 포함하는, 디아바디와 유사한 포맷을 지칭한다.
본원에서 사용된 탠뎀 scFv는 단일 Fv간 링커가 존재하도록 단일 링커를 통해 연결된 적어도 2개의 scv를 지칭한다.
본원에서 사용된 탠뎀 scFv-Fc는 각각 하나가 예를 들어, 힌지를 통해 불변 영역 단편 -CH2CH3의 CH2 도메인의 N-말단에 부착되어 있는 적어도 2개의 탠뎀 scFv를 지칭한다.
본원에서 사용된 Fab-Fv는 중쇄의 CH1 및 경쇄의 CL 각각의 C-말단에 부착된 가변 영역을 가진 Fv 단편을 지칭한다. 이 포맷은 이의 PEG화된 버전으로서 제공될 수 있다.
본원에서 사용된 Fab'-Fv는 FabFv와 유사하고, 이때 Fab 부분은 Fab'로 교체된다. 이 포맷은 이의 PEG화된 버전으로서 제공될 수 있다.
본원에서 사용된 Fab-dsFv는 Fv내 디설파이드 결합이 부착된 C-말단 가변 영역을 안정화시키는 FabFv를 지칭한다. 이 포맷은 이의 PEG화된 버전으로서 제공될 수 있다.
본원에서 사용된 Fab-scFv는 경쇄 또는 중쇄의 C-말단에 부착된 scFv를 가진 Fab 분자이다.
본원에서 사용된 Fab'-scFv는 경쇄 또는 중쇄의 C-말단에 부착된 scFv를 가진 Fab' 분자이다.
본원에서 사용된 DiFab는 그의 중쇄의 C-말단을 통해 연결된 2개의 Fab 분자를 지칭한다.
본원에서 사용되는 DiFab'는 그의 힌지 영역에서 하나 이상의 디설파이드 결합을 통해 연결된 2개의 Fab' 분자를 지칭한다.
본원에서 사용된 sc디아바디는 분자가 3개의 링커를 포함하고 추가 Fv 쌍의 가변 영역들 중 하나에 각각 연결된 VH 및 VL 말단을 가진 정상 scFv를 형성하도록 Fv내 링커를 포함하는 디아바디이다.
본원에서 사용된 sc디아바디-Fc는 예를 들어, 힌지를 통해 불변 영역 단편 -CH2CH3의 CH2 도메인의 N-말단에 각각 하나씩 부착된 2개의 sc디아바디이다.
본원에서 사용된 scFv-Fc-scFv는 -CH2CH3 단편의 중쇄 및 경쇄 둘 다의 N-말단 및 C-말단에 각각 하나씩 부착된 4개의 scFv를 지칭한다.
본원에서 사용된 sc디아바디-CH3은 예를 들어, 힌지를 통해 CH3 도메인에 각각 연결된 2개의 sc디아바디 분자를 지칭한다.
본원에서 사용된 IgG-scFv는 각각의 중쇄 또는 각각의 경쇄의 C-말단에서 scFv를 가진 전체 길이 항체이다.
본원에서 사용된 scFv-IgG는 각각의 중쇄 또는 각각의 경쇄의 N-말단에서 scFv를 가진 전체 길이 항체이다.
본원에서 사용된 V-IgG는 각각의 중쇄 또는 각각의 경쇄의 N-말단에서 가변 도메인을 가진 전체 길이 항체이다.
본원에서 사용된 IgG-V는 각각의 중쇄 또는 각각의 경쇄의 C-말단에서 가변 도메인을 가진 전체 길이 항체이다.
DVD-Ig(이중 V 도메인 IgG로서도 알려짐)는 각각의 중쇄 및 각각의 경쇄의 N-말단에서 하나씩 4개의 추가 가변 도메인을 가진 전체 길이 항체이다.
한 바람직한 실시양태에서, 칼리크레인 5(KLK5)에 결합하는 항체는 KLK5의 프로테아제 활성을 억제하거나 감소시키고 가변 경쇄 및 가변 중쇄를 포함하고, 이때
a. 가변 경쇄는 서열번호 1 또는 서열번호 62 또는 서열번호 63을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 2를 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 3을 포함하는 CDR-L3을 포함하고;
b. 가변 중쇄는 서열번호 4를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5를 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 6을 포함하는 CDR-H3을 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 항체는 서열번호 51을 참조할 때 아미노산 잔기 Arg87, Ala107, Arg110, Lys111, Lys112, Val113, Val137, Lys138, Ser139, Ile140, Pro141, His142, Pro143, Tyr145, Ser146 및 His147을 포함하는 인간 KLK5의 에피토프에 결합하고 KLK5의 프로테아제 활성을 억제하거나 감소시킨다.
본 발명 내에서, 용어 "억제한다"(및 이의 문법적 파생어)는 본 발명에 따른 항체가 KLK5 생물학적 활성과 관련하여 갖는 효과를 표시한다. 바람직하게는, KLK5의 생물학적 활성은 프로테아제 활성, 바람직하게는 세린 프로테아제 활성이다. 효과는 KLK5의 세린 프로테아제 활성을 완전히 또는 부분적으로 방해한다.
이론에 구속받고자 하지는 않지만, 본 발명에 따른 항체는 KLK5에 결합하고,
i) KLK5의 프로테아제 활성(바람직하게는 세린 프로테아제 활성)을 (예를 들어, 완전히 또는 부분적으로) 억제하거나 감소시키고/시키거나;
ii) KLK5가 LEKTI 또는 LEKTI의 단편에 결합될 때 KLK5에 결합하고/하거나;
iii) KLK5에의 결합에 대해 LEKTI 또는 LEKTI의 단편과 경쟁하지 않고/않거나;
iv) LEKTI 또는 LEKTI의 단편에 결합된 KLK5와 복합체를 형성한다(즉, 본 발명의 항체, KLK5 및 LEKTI 또는 LEKTI의 단편을 포함하는 복합체를 형성한다).
본 발명 내에서, 용어 "LEKTI"는 15개의 도메인으로 구성된 림프-상피 카잘형 관련 억제제를 지칭하고, 프로테아제 푸린과 같은 전구단백질 전환효소에 의해 더 작은 기능성 단편으로 절단되어, 하나 이상의 도메인으로 구성된 LEKTI 단편을 생성한다. 이 단편은 KLK5와 같은 프로테아제와 억제 복합체를 형성할 수 있는 세포외 공간 내로 분비된다. LEKTI는 세린 프로테아제 억제제 카잘형 5(SPINK5)로서도 알려져 있고 인간에서 SPINK5 유전자에 의해 코딩되는 단백질이다. 인간에서, COOH-말단 영역만이 상이한 동형체인 단백질의 전체 길이 동형체, 긴 동형체 및 짧은 동형체를 생성하는 3개의 LEKTI mRNA 스플라이스 변이체가 생성된다.
SPINK5는 세린 프로테아제의 억제제를 코딩하는 염색체 5q32에 위치한 유전자 패밀리 클러스터의 구성원이다. 이것은 용어 "LEKTI" 내에서 본 발명에도 포함되는 다른 표피 단백질 SPINK6 및 LEKTI-2(SPINK9)를 포함한다.
용어 "복합체를 형성한다"(및 이의 임의의 문법적 파생어)는 KLK5가 또 다른 단백질, 예컨대, LEKTI 또는 LEKTI의 단편, 또는 또 다른 항체 또는 항체 단편, 예컨대, Fab에 이미 결합되어 있을 때 본 발명에 따른 항체가 KLK5에 결합할 수 있음을 의미한다.
KLK5에 결합할 수 있고 KLK5 생물학적(즉, 프로테아제) 활성을 억제할 수 있지만 KLK5에의 결합에 대해 LEKTI 또는 LEKTI 단편과 경쟁하지 않는 항체와 관련된 이점은 LEKTI가 KLK5:LEKTI 복합체로부터 해리되는 조건, 예컨대, 표피의 기저층부터 각질층까지 점진적으로 산성을 띠는 환경에서 KLK5 활성의 억제를 가능하게 한다.
본 발명의 항체와 "경쟁하거나", 본 발명의 항체를 "교차차단하거나", 본 발명의 항체에 의해 "교차차단되거나", 본 발명의 항체와 "동일한 인간 KLK5의 에피토프에 결합하는"(및 이의 임의의 문법적 파생어) 항체는 본 발명의 항체에 결합된 KLK5와 복합체를 형성할 수 없는 항체를 지칭한다.
본 발명에 따른 한 실시양태에서, LEKTI의 단편은 서열번호 54의 아미노산 1 내지 64를 포함하는 인간 LEKTI 도메인 5 또는 서열번호 61의 아미노산 1 내지 71을 포함하는 LEKTI 도메인 8이다.
따라서, 바람직한 실시양태에서, 칼리크레인 5(KLK5)에 결합하는 항체는
i. KLK5가 LEKTI 또는 LEKTI의 단편에 결합될 때 KLK5에 결합하고/하거나;
ii. KLK5에의 결합에 대해 LEKTI 또는 LEKTI의 단편과 경쟁하지 않고/않거나;
iii. LEKTI 또는 LEKTI의 단편에 결합된 KLK5와 복합체를 형성하고;
이때 바람직하게는 LEKTI의 단편은 서열번호 54의 아미노산 1 내지 64를 포함하는 인간 LEKTI 도메인 5 또는 서열번호 61의 아미노산 1 내지 71을 포함하는 LEKTI 도메인 8이고, 상기 항체는 가변 경쇄 및 가변 중쇄를 포함하고, 이때
a. 가변 경쇄는 서열번호 1 또는 서열번호 62 또는 서열번호 63을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 2를 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 3을 포함하는 CDR-L3을 포함하고;
b. 가변 중쇄는 서열번호 4를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5를 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 6을 포함하는 CDR-H3을 포함한다.
본 발명에 따른 또 다른 실시양태에서, 항체는 KLK5, 바람직하게는 인간 KLK5에 결합하고, 이때 상기 항체는 서열번호 51을 참조할 때 아미노산 잔기 Arg87, Ala107, Arg110, Lys111, Lys112, Val113, Val137, Lys138, Ser139, Ile140, Pro141, His142, Pro143, Tyr145, Ser146 및 His147을 포함하는 인간 KLK5의 에피토프에 결합하고,
i. KLK5가 LEKTI 또는 LEKTI의 단편에 결합될 때 KLK5에 결합하고/하거나;
ii. KLK5에의 결합에 대해 LEKTI 또는 LEKTI의 단편과 경쟁하지 않고/않거나;
iii. LEKTI 또는 LEKTI의 단편에 결합된 KLK5와 복합체를 형성하고;
이때 바람직하게는 LEKTI의 단편은 서열번호 54의 아미노산 1 내지 64를 포함하는 인간 LEKTI 도메인 5 또는 서열번호 61의 아미노산 1 내지 71을 포함하는 LEKTI 도메인 8이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 서열번호 53을 포함하는 인간 KLK5에 결합하고, cyno KLK5, 바람직하게는 서열번호 60을 포함하는 cyno KLK5에도 결합한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체는 인간 또는 사이노몰구스 원숭이(cyno) 칼리크레인 2(KLK2); 또는 인간 또는 cyno 칼리크레인 4(KLK4); 또는 인간 또는 cyno 칼리크레인 7(KLK7)에 결합하지 않는다. 다시 말해, 항체는 KLK5에 특이적이고 다른 칼리크레인에는 특이적이지 않는다.
본원에서 사용된 "특이적"은 특이적 항원만을 인식하는 항체, 또는 비특이적 항원(예를 들어, 다른 칼리크레인)에의 결합에 비해 특이적 항원(예를 들어, KLK5)에 대해 유의미하게 더 높은 결합 친화성, 예를 들어, 적어도 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배 더 높은 결합 친화성을 가진 항체를 지칭하기 위한 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따르면, 항체와 KLK5의 결합은 약 500 pM 이하, 바람직하게는 약 172 pM의 해리 상수(KD)를 특징으로 한다.
본원에서 사용된 용어 "KD"는 Kd 대 Ka의 비(즉, Kd/Ka)로부터 수득된 해리 상수를 지칭하고, 몰 농도(M)로서 표현된다. Kd 및 Ka는 각각 특정 항원-항체(또는 이의 항원 결합 단편) 상호작용의 해리 속도 및 결합 속도를 지칭한다. 항체에 대한 KD 값은 당분야에 잘 확립된 방법을 이용함으로써 측정될 수 있다. 항체의 KD를 측정하는 방법은 재조합 KLK5 또는 이의 적합한 융합 단백질/폴리펩타이드를 사용하는 표면 플라즈몬 공명, 예컨대, 본원의 실시예에 기재된 Biacore® 시스템을 이용하는 것이다. 한 예에서, 친화성은 본원의 실시예에 기재된 바와 같이 재조합 KLK5를 사용함으로써 측정된다. 표면 플라즈몬 공명을 위해, 표적 분자를 고체상에 고정시키고 유동 셀을 따라 흐르는 이동상의 리간드에 노출시킨다. 리간드와 고정된 표적의 결합이 일어나는 경우, 국소 굴절률이 변화하여, SPR 각도의 변화를 유발하고, 이것은 반사된 광의 강도 변화를 검출함으로써 실시간으로 모니터링될 수 있다. SPR 신호의 변화 속도를 분석하여, 결합 반응의 결합 및 해리 단계에 대한 겉보기 속도 상수를 산출할 수 있다. 이 값들의 비는 겉보기 평형 상수(친화성)를 제공한다(예를 들어, 문헌[Wolff et al, Cancer Res. 53:2560-65(1993)] 참조).
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체는 cyno 또는 마우스 KLK5보다 인간 KLK5에 대해 더 높은 결합 친화성(즉, 더 작은 KD)을 가진다. 용어 "친화성"은 항체와 KLK5 간의 상호작용의 강도를 지칭한다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체는 KLK5 프로테아제 활성의 차단에 대해 800 pM 미만의 IC50을 갖고, 바람직하게는 본 발명에 따른 항체는 본원에 기재된 시험관내 어세이에서 KLK5 프로테아제 활성의 차단에 대해 18 pM 미만의 IC50을 가진다.
본원에서 사용된 용어 IC50은 본 발명에서 KLK5의 프로테아제 활성인 특정 생물학적 또는 생화학적 기능을 억제하는 데 있어서 항체와 같은 물질의 효능의 척도인 절반 최대 억제 농도를 의미한다. IC50은 얼마나 많은 특정 물질이 주어진 생물학적 과정 또는 기능 또는 활성을 절반까지 억제하는 데 필요한지를 표시하는 정량적 척도이다.
본 발명에 따른 항체는 항체가 생성된 동물의 프레임워크 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체가 토끼에서 생성된 경우, 이것은 상기 정의된 CDR, 및 토끼 항체, 예컨대, 서열번호 7에 따른 경쇄 가변 영역(뉴클레오타이드 서열은 서열번호 8 또는 서열번호 8의 뉴클레오타이드 1 내지 330으로 표시됨) 및 서열번호 9에 따른 중쇄 가변 영역(뉴클레오타이드 서열은 서열번호 10으로 표시됨)을 포함하는 항체의 프레임워크 영역을 포함할 것이다.
한 실시양태에서, 항체는 키메라 또는 인간화된 항체일 수 있다.
키메라 항체는 전형적으로 재조합 DNA 방법을 이용함으로써 생성된다. DNA는 인간 L 및 H 쇄 불변 영역에 대한 코딩 서열을 상응하는 비인간(예를 들어, 뮤린 또는 토끼) H 및 L 불변 영역으로 치환시킴으로써 변형될 수 있다(Morrison; PNAS 81, 6851(1984)).
인간 항체는 항체의 가변 영역 또는 전체 길이 쇄가 인간 생식세포계열 면역글로불린 유전자를 사용하는 시스템으로부터 수득되는 경우 특정 생식세포계열 서열"의 생성물"이거나 이러한 서열"로부터 유래한" 중쇄 또는 경쇄 가변 영역, 또는 전체 길이 중쇄 또는 경쇄를 포함한다. 이러한 시스템은 인간 면역글로불린 유전자를 보유하는 형질전환 마우스를 관심 있는 항원으로 면역화하거나, 파지 상에 표시된 인간 면역글로불린 유전자 라이브러리를 관심 있는 항원으로 스크리닝하는 것을 포함한다. 인간 생식세포계열 면역글로불린 서열"의 생성물"이거나 이러한 서열"로부터 유래한" 인간 항체 또는 이의 단편은 예컨대, 인간 항체의 아미노산 서열을 인간 생식세포계열 면역글로불린의 아미노산 서열과 비교하고 서열 면에서 인간 항체의 서열에 가장 가까운(즉, 최대 % 동일성) 인간 생식세포계열 면역글로불린 서열을 선택함으로써 확인될 수 있다. 특정 인간 생식세포계열 면역글로불린 서열"의 생성물"이거나 이러한 서열"로부터 유래한" 인간 항체는 예를 들어, 천연 생성 체세포 돌연변이 또는 부위 지정 돌연변이의 의도적 도입으로 인해 생식세포계열 서열에 비해 아미노산 차이를 함유할 수 있다. 그러나, 선택된 인간 항체는 전형적으로 아미노산 서열이 인간 생식세포계열 면역글로불린 유전자에 의해 코딩된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일하고 다른 종의 생식세포계열 면역글로불린 아미노산 서열(예를 들어, 뮤린 생식세포계열 서열)과 비교될 때 인간 항체를 인간으로서 식별하는 아미노산 잔기를 함유한다. 일부 경우, 인간 항체는 아미노산 서열이 생식세포계열 면역글로불린 유전자에 의해 코딩된 아미노산 서열과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 적어도 95%, 또는 심지어 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일할 수 있다. 전형적으로, 특정 인간 생식세포계열 서열로부터 유래한 인간 항체는 인간 생식세포계열 면역글로불린 유전자에 의해 코딩된 아미노산 서열과 10개 이하의 아미노산 차이를 나타낼 것이다. 일부 경우, 인간 항체는 생식세포계열 면역글로불린 유전자에 의해 코딩된 아미노산 서열과 5개 이하, 또는 심지어 4개, 3개, 2개 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 나타낼 수 있다.
인간 항체는 당분야에서 숙련된 자에게 공지되어 있는 다수의 방법에 의해 생성될 수 있다. 인간 항체는 인간 골수종 또는 마우스-인간 이종골수종 세포주를 이용하는 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있다(Kozbor, J Immunol; (1984) 133:3001; Brodeur, Monoclonal Isolated Antibody Production Techniques and Applications, pp51-63, Marcel Dekker Inc, 1987). 대안적 방법은 인간 가변 영역 레퍼토리를 사용하는 파지 라이브러리 또는 형질전환 마우스의 사용을 포함한다(Winter G; (1994) Annu Rev Immunol 12:433-455, Green LL, (1999) J Immunol Methods 231:11-23).
본 발명의 한 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체는 인간화된다.
본 발명에 따른 항체는 당분야에 공지되어 있는 임의의 적합한 방법을 이용함으로써 수득될 수 있다. KLK5(이의 융합 단백질을 포함함), 또는 KLK5를 (재조합적으로 또는 천연적으로) 발현하는 세포를 사용하여 KLK5를 특이적으로 인식하는 항체를 생성할 수 있다. 본원에 기재된 다양한 형태의 KLK5를 사용할 수 있다.
한 실시양태에서, 사용된 항원은 바람직하게는 하기 실시예에 기재된 바와 같이 생성된 활성 KLK5이다.
숙주를 면역화하는 데 사용될 KLK5 또는 이의 단편은 발현 시스템을 포함하는 유전적으로 조작된 숙주 세포로부터 당분야에 잘 공지되어 있는 과정에 의해 제조될 수 있거나, 천연 생물학적 공급원으로부터 회수될 수 있다. KLK5 또는 이의 단편은 일부 경우 예를 들어, 친화성 태그 등에 융합된 융합 단백질과 같은 더 큰 단백질의 일부일 수 있다.
본 발명에 따라 KLK5에 대해 생성된 항체는 동물의 면역화가 필요한 경우, 잘 알려져 있는 관용적인 프로토콜을 이용하여 KLK5를 동물, 바람직하게는 비인간 동물에게 투여함으로써 수득될 수 있다(예를 들어, 문헌[Handbook of Experimental Immunology, D. M. Weir (ed.), Vol 4, Blackwell Scientific Publishers, Oxford, England, 1986] 참조). 많은 온혈 동물, 예컨대, 토끼, 마우스, 래트, 양, 소, 낙타 또는 돼지가 면역화될 수 있다. 그러나, 일반적으로 마우스, 토끼, 돼지 및 래트가 가장 적합하다.
단일클론 항체는 당분야에 공지되어 있는 임의의 방법, 예컨대, 하이브리도마 기법(Kohler & Milstein, 1975, Nature, 256:495-497), 트리오마 기법, 인간 B 세포 하이브리도마 기법(Kozbor et al., 1983, Immunology Today, 4:72) 및 EBV-하이브리도마 기법(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp77-96, Alan R Liss, Inc., 1985)에 의해 제조될 수 있다.
본 발명에 사용하기 위한 항체는 예를 들어, 문헌[Babcook, J. et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(15):7843-7848l]; 국제 특허출원 공개 제WO92/02551호, 제WO2004/051268호 및 제WO2004/106377호에 기재된 방법으로 특정 항체의 생성을 위해 선택된 단일 림프구로부터 생성된 면역글로불린 가변 영역 cDNA를 클로닝하고 발현시켜 단일 림프구 항체 방법을 이용함으로써 생성될 수도 있다.
항체에 대한 스크리닝은 KLK5에의 결합을 측정하는 어세이 및/또는 KLK5 생물학적 활성, 바람직하게는 KLK5 프로테아제 활성의 억제를 측정하는 어세이를 이용함으로써 수행될 수 있다.
한 바람직한 실시양태에서, 칼리크레인 5(KLK5)에 결합하는 항체는 키메라 또는 인간화된 항체, 바람직하게는 인간화된 항체이고, 가변 경쇄 및 가변 중쇄를 포함하고, 이때
a. 가변 경쇄는 서열번호 1 또는 서열번호 62 또는 서열번호 63, 바람직하게는 서열번호 1을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 2를 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 3을 포함하는 CDR-L3을 포함하고;
b. 가변 중쇄는 서열번호 4를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5를 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 6을 포함하는 CDR-H3을 포함한다.
본 발명에 따른 또 다른 실시양태에서, KLK5에 결합하는 항체는 서열번호 51을 참조할 때 아미노산 잔기 Arg87, Ala107, Arg110, Lys111, Lys112, Val113, Val137, Lys138, Ser139, Ile140, Pro141, His142, Pro143, Tyr145, Ser146 및 His147을 포함하는 인간 KLK5의 에피토프에 결합하고, 가변 경쇄 및 가변 중쇄를 포함하고, 이때
a. 경쇄 가변 쇄는
i. 서열번호 1 또는 서열번호 62 또는 서열번호 63, 바람직하게는 서열번호 1을 포함하는 CDR-L1,
ii. 서열번호 2를 포함하는 CDR-L2, 및
iii. 서열번호 3을 포함하는 CDR-L3
을 포함하고;
b. 중쇄 가변 영역은
iv. 서열번호 4를 포함하는 CDR-H1,
v. 서열번호 5를 포함하는 CDR-H2, 및
vi. 서열번호 6을 포함하는 CDR-H3
을 포함하고,
상기 항체는 키메라 또는 인간화된 항체이고; 바람직하게는, 상기 항체는 인간화된 항체이다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, KLK5에 결합하는 인간화된 항체는 가변 경쇄 및 가변 중쇄를 포함하고, 이때
a. 경쇄 가변 쇄는
i. 서열번호 1 또는 서열번호 62 또는 서열번호 63, 바람직하게는 서열번호 1을 포함하는 CDR-L1,
ii. 서열번호 2를 포함하는 CDR-L2, 및
iii. 서열번호 3을 포함하는 CDR-L3
을 포함하고;
b. 중쇄 가변 영역은
iv. 서열번호 4를 포함하는 CDR-H1,
v. 서열번호 5를 포함하는 CDR-H2, 및
vi. 서열번호 6을 포함하는 CDR-H3
을 포함하고,
상기 항체는 KLK5의 프로테아제 활성을 억제하거나 감소시키고/시키거나; KLK5가 LEKTI 또는 LEKTI의 단편에 결합될 때 KLK5에 결합하고/하거나; KLK5에의 결합에 대해 LEKTI 또는 LEKTI의 단편과 경쟁하지 않고/않거나; LEKTI 또는 LEKTI의 단편에 결합된 KLK5와 복합체를 형성한다.
보다 바람직하게는, 인간화된 항체는 서열번호 51을 참조할 때 Arg87, Ala107, Arg110, Lys111, Lys112, Val113, Val137, Lys138, Ser139, Ile140, Pro141, His142, Pro143, Tyr145, Ser146 및 His147을 포함하는 인간 KLK5의 에피토프에 결합하고; 이때 상기 항체는 가변 경쇄 및 가변 중쇄를 포함하고, 이때
a. 경쇄 가변 쇄는
i. 서열번호 1 또는 서열번호 62 또는 서열번호 63, 바람직하게는 서열번호 1을 포함하는 CDR-L1,
ii. 서열번호 2를 포함하는 CDR-L2, 및
iii. 서열번호 3을 포함하는 CDR-L3
을 포함하고;
b. 중쇄 가변 영역은
i. 서열번호 4를 포함하는 CDR-H1,
ii. 서열번호 5를 포함하는 CDR-H2, 및
iii. 서열번호 6을 포함하는 CDR-H3
을 포함하고,
상기 항체는 KLK5의 프로테아제 활성을 억제하거나 감소시키고/시키거나; KLK5가 LEKTI 또는 LEKTI의 단편에 결합될 때 KLK5에 결합하고/하거나; KLK5에의 결합에 대해 LEKTI 또는 LEKTI의 단편과 경쟁하지 않고/않거나; LEKTI 또는 LEKTI의 단편에 결합된 KLK5와 복합체를 형성한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "인간화된" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄가 수용자 항체(예를 들어, 인간 항체)의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역 프레임워크에 이식된 공여자 항체(예를 들어, 비인간 항체, 예컨대, 뮤린 또는 토끼 단일클론 항체)로부터의 하나 이상의 CDR(원하는 경우, 하나 이상의 변형된 CDR을 포함함)을 함유하는 것인 항체를 지칭한다. 검토를 위해, 문헌[Vaughan et al, Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998]을 참조한다. 한 실시양태에서, 전체 CDR이 전달되기보다는 오히려, 상기 본원에 기재된 CDR 중 어느 한 CDR로부터의 특이성 결정 잔기 중 하나 이상의 잔기만이 인간 항체 프레임워크로 전달된다(예를 들어, 문헌[Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34] 참조). 한 실시양태에서, 상기 본원에 기재된 CDR 중 하나 이상의 CDR로부터의 특이성 결정 잔기만이 인간 항체 프레임워크로 전달된다. 또 다른 실시양태에서, 상기 본원에 기재된 CDR 각각으로부터의 특이성 결정 잔기만이 인간 항체 프레임워크로 전달된다.
CDR이 이식될 때, CDR이 유래한 공여자 항체의 클래스/유형을 고려하여 마우스, 영장류 및 인간 프레임워크 영역을 비롯한 임의의 적절한 수용자 가변 영역 프레임워크 서열을 사용할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 인간화된 항체는 인간 수용자 프레임워크 영역뿐만 아니라 본원에 구체적으로 제공된 CDR 중 하나 이상의 CDR도 포함하는 가변 도메인을 가진다. 따라서, 한 실시양태에서, KLK5, 바람직하게는 인간 KLK5에 결합하는 차단 인간화된 항체를 제공하고, 이때 가변 도메인은 인간 수용자 프레임워크 영역 및 비인간 공여자 CDR을 포함한다.
본 발명에 사용될 수 있는 인간 프레임워크의 예는 KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY 및 POM이다(상기 문헌[Kabat et al.] 참조). 예를 들어, KOL 및 NEWM은 중쇄에 사용될 수 있고, REI는 경쇄에 사용될 수 있고, EU, LAY 및 POM은 중쇄 및 경쇄 둘 다에 사용될 수 있다. 대안적으로, 인간 생식세포계열 서열들이 사용될 수 있고; 이들은 http://www.imgt.org/에서 입수될 수 있다.
본 발명에 따른 인간화된 항체에서, 수용자 중쇄 및 경쇄는 반드시 동일한 항체로부터 유래할 필요는 없고, 원하는 경우, 상이한 쇄로부터 유래한 프레임워크 영역을 가진 복합 쇄를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 인간화된 항체의 경쇄에 적합한 프레임워크 영역은 서열번호 47을 가진 인간 생식세포계열 IGKV1-6 JK4로부터 유래하고 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 48로 표시된다.
본 발명에 따른 인간화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄에 적합한 프레임워크 영역은 서열번호 49로 표시된 서열을 가진 인간 생식세포계열 IGHV4-4 JH4로부터 유래하고, 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 50으로 표시된다.
따라서, 한 실시양태에서, KLK5에 결합하는 인간화된 항체로서, 가변 경쇄 및 가변 중쇄를 포함하는 항체를 제공하고, 이때
a. 경쇄 가변 쇄는
i. 서열번호 1 또는 서열번호 62 또는 서열번호 63, 바람직하게는 서열번호 1을 포함하는 CDR-L1,
ii. 서열번호 2를 포함하는 CDR-L2, 및
iii. 서열번호 3을 포함하는 CDR-L3
을 포함하고;
b. 중쇄 가변 영역은
i. 서열번호 4를 포함하는 CDR-H1,
ii. 서열번호 5를 포함하는 CDR-H2, 및
iii. 서열번호 6을 포함하는 CDR-H3
을 포함하고,
이때, 경쇄 프레임워크 영역은 서열번호 47을 포함하는 인간 생식세포계열 IGKV1-6 JK4로부터 유래하고; 중쇄 프레임워크 영역은 서열번호 49를 포함하는 인간 생식세포계열 IGHV4-4 JH4로부터 유래한다. 바람직하게는, 항체는 KLK5의 프로테아제 활성을 억제하거나 감소시키고/시키거나; KLK5가 LEKTI 또는 LEKTI의 단편에 결합될 때 KLK5에 결합하고/하거나; KLK5에의 결합에 대해 LEKTI 또는 LEKTI의 단편과 경쟁하지 않고/않거나; LEKTI 또는 LEKTI의 단편에 결합된 KLK5와 복합체를 형성한다.
또 다른 실시양태에서, KLK5에 결합하는 인간화된 항체로서, 서열번호 51을 참조할 때 Arg87, Ala107, Arg110, Lys111, Lys112, Val113, Val137, Lys138, Ser139, Ile140, Pro141, His142, Pro143, Tyr145, Ser146 및 His147을 포함하는 인간 KLK5의 에피토프에 결합하고 가변 경쇄 및 가변 중쇄를 포함하는 항체를 제공하고, 이때
a. 경쇄 가변 쇄는
i. 서열번호 1 또는 서열번호 62 또는 서열번호 63, 바람직하게는 서열번호 1을 포함하는 CDR-L1,
ii. 서열번호 2를 포함하는 CDR-L2, 및
iii. 서열번호 3을 포함하는 CDR-L3
을 포함하고;
b. 중쇄 가변 영역은
i. 서열번호 4를 포함하는 CDR-H1,
ii. 서열번호 5를 포함하는 CDR-H2, 및
iii. 서열번호 6을 포함하는 CDR-H3
을 포함하고,
이때 경쇄 프레임워크 영역은 서열번호 47을 포함하는 인간 생식세포계열 IGKV1-6 JK4로부터 유래하고; 중쇄 프레임워크 영역은 서열번호 49를 포함하는 인간 생식세포계열 IGHV4-4 JH4로부터 유래한다. 바람직하게는, 상기 항체는 KLK5의 프로테아제 활성을 억제하거나 감소시키고/시키거나; KLK5가 LEKTI 또는 LEKTI의 단편에 결합될 때 KLK5에 결합하고/하거나; KLK5에의 결합에 대해 LEKTI 또는 LEKTI의 단편과 경쟁하지 않고/않거나; LEKTI 또는 LEKTI의 단편에 결합된 KLK5와 복합체를 형성한다.
본 발명에 따른 인간화된 항체에서, 프레임워크 영역은 수용자 항체의 서열과 동일한 정확한 서열을 갖지 않을 수 있다. 예를 들어, 드문 잔기는 그 수용자 쇄 클래스 또는 유형에서 더 자주 발견되는 잔기로 변화될 수 있다. 대안적으로, 수용자 프레임워크 영역에서 선택된 잔기는 공여자 항체의 동일한 위치에서 발견되는 잔기에 상응하도록 변화될 수 있다(문헌[Reichmann et al., 1998, Nature, 332, 323-324] 참조). 이러한 변화는 공여자 항체의 친화성을 회복하는 데 필요한 최소한으로 유지되어야 한다. 변화될 필요가 있을 수 있는 수용자 프레임워크 영역의 잔기를 선택하는 프로토콜은 국제 특허출원 공개 제WO91/09967호(본원에 참고로 포함됨)에 기재되어 있다.
따라서, 한 실시양태에서, 프레임워크 내의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 8개의 잔기는 대안적 아미노산 잔기로 교체된다.
따라서, 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 인간화된 항체를 제공하고, 이때 가변 경쇄의 위치 2 및/또는 3 및/또는 63(서열번호 47 또는 서열번호 15를 참조할 때) 각각의 잔기는 공여자 잔기이다. 바람직하게는, 가변 경쇄의 위치 2의 잔기는 티로신이고 가변 경쇄의 위치 3의 잔기는 아스파르트산이다. 일부 실시양태에서, 가변 경쇄의 위치 63의 잔기는 라이신이다.
또 다른 실시양태에서, 인간화된 항체를 제공하고, 이때 적어도 가변 중쇄의 위치 68, 72, 74, 77 및 79(서열번호 49를 참조할 때; 또는 서열번호 39를 참조할 때 위치 67, 71, 73, 76 및 78) 각각의 잔기는 공여자 잔기이다.
바람직하게는, 가변 중쇄의 위치 72의 잔기는 글루타민이고, 위치 74의 잔기는 세린이고, 위치 79의 잔기는 발린이다. 일부 실시양태에서, 가변 중쇄의 위치 68의 잔기는 페닐알라닌이고/이거나, 위치 77의 잔기는 트레오닌이다.
한 바람직한 실시양태에서, 인간화된 항체는 KLK5에 결합하고, 이때 인간화된 항체는
- 서열번호 11 또는 15 또는 19 또는 23을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 27 또는 31 또는 35 또는 39 또는 43을 포함하는 중쇄 가변 영역; 또는
- 위치 24의 아미노산 잔기가 아르기닌(Arg; R) 또는 라이신(Lys; K)인 서열번호 15를 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 27 또는 31 또는 35 또는 39 또는 43을 포함하는 중쇄 가변 영역
을 포함한다. 바람직하게는, 상기 항체는 KLK5의 프로테아제 활성을 억제하거나 감소시키고/시키거나; KLK5가 LEKTI 또는 LEKTI의 단편에 결합될 때 KLK5에 결합하고/하거나; KLK5에의 결합에 대해 LEKTI 또는 LEKTI의 단편과 경쟁하지 않고/않거나; LEKTI 또는 LEKTI의 단편에 결합된 KLK5와 복합체를 형성한다.
또 다른 실시양태에서, KLK5에 결합하는 인간화된 항체로서, 서열번호 51을 참조할 때 Arg87, Ala107, Arg110, Lys111, Lys112, Val113, Val137, Lys138, Ser139, Ile140, Pro141, His142, Pro143, Tyr145, Ser146 및 His147을 포함하는 인간 KLK5의 에피토프에 결합하는 항체를 제공하고; 이때 상기 항체는
- 서열번호 11 또는 15 또는 19 또는 23을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 27 또는 31 또는 35 또는 39 또는 43을 포함하는 중쇄 가변 영역; 또는
- 위치 24의 아미노산 잔기가 아르기닌(Arg; R) 또는 라이신(Lys; K)인 서열번호 15를 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 27 또는 31 또는 35 또는 39 또는 43을 포함하는 중쇄 가변 영역
을 포함한다.
바람직하게는, 상기 항체는 KLK5의 프로테아제 활성을 억제하거나 감소시키고/시키거나; KLK5가 LEKTI 또는 LEKTI의 단편에 결합될 때 KLK5에 결합하고/하거나; KLK5에의 결합에 대해 LEKTI 또는 LEKTI의 단편과 경쟁하지 않고/않거나; LEKTI 또는 LEKTI의 단편에 결합된 KLK5와 복합체를 형성한다.
본 발명의 한 바람직한 실시양태에서, 상기 항체는 서열번호 15를 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 39를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
보다 바람직하게는, 인간화된 항체는 서열번호 51을 참조할 때 아미노산 잔기 Arg87, Ala107, Arg110, Lys111, Lys112, Val113, Val137, Lys138, Ser139, Ile140, Pro141, His142, Pro143, Tyr145, Ser146 및 His147을 포함하는 인간 KLK5의 에피토프에 결합하고; 이때 상기 항체는 서열번호 15를 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 39를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
훨씬 더 바람직하게는, 인간화된 항체는 KLK5의 프로테아제 활성을 억제하거나 감소시키고/시키거나; KLK5가 LEKTI 또는 LEKTI의 단편에 결합될 때 KLK5에 결합하고/하거나; KLK5에의 결합에 대해 LEKTI 또는 LEKTI 단편과 경쟁하지 않고/않거나; LEKTI 또는 LEKTI 단편에 결합된 KLK5와 복합체를 형성한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 서열과 80% 유사하거나 동일한 서열, 예를 들어, 관련 서열의 일부 또는 전부, 예를 들어, 가변 도메인 서열, CDR 서열, 또는 CDR을 제외한 가변 도메인 서열에 걸쳐 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 유사하거나 동일한 서열을 포함하는 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 관련 서열은 서열번호 15이다. 한 실시양태에서, 관련 서열은 서열번호 39이다.
한 실시양태에서, KLK5에 결합하는 항체는 경쇄 및 중쇄를 포함하고, 이때 가변 경쇄는 서열번호 15를 포함하는 서열에 대한 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성 또는 유사성을 가진 서열을 포함하고/하거나, 가변 중쇄는 서열번호 39를 포함하는 서열에 대한 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성 또는 유사성을 가진 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, KLK5에 결합하는 항체는 서열번호 15로 제공된 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 유사하거나 동일한 경쇄를 포함하나, 상기 항체는 CDR-L1에 대해 서열번호 1(또는 서열번호 62 또는 63)을 포함하는 서열, CDR-L2에 대해 서열번호 2를 포함하는 서열 및 CDR-L3에 대해 서열번호 3을 포함하는 서열을 가진다.
본원에서 사용된 바와 같이, "동일성", "동일한" 또는 이의 문법적 파생어는 정렬된 서열의 임의의 특정 위치에서 아미노산 잔기가 서열들 사이에 동일함을 표시한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "유사성", "유사한" 또는 이의 문법적 파생어는 정렬된 서열의 임의의 특정 위치에서 아미노산 잔기가 서열들 사이에 유사한 유형의 아미노산 잔기임을 표시한다. 예를 들어, 류신은 이소류신 또는 발린으로 치환될 수 있다. 종종 서로 치환될 수 있는 다른 아미노산은 하기 아미노산들을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다:
- 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판(방향족 측쇄를 가진 아미노산);
- 라이신, 아르기닌 및 히스티딘(염기성 측쇄를 가진 아미노산);
- 아스파르테이트 및 글루타메이트(산성 측쇄를 가진 아미노산);
- 아스파라긴 및 글루타민(아미드 측쇄를 가진 아미노산); 및
- 시스테인 및 메티오닌(황 함유 측쇄를 가진 아미노산).
동일성 및 유사성의 정도는 용이하게 계산될 수 있다(Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987, Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991, the BLAST™ software available from NCBI (Altschul, S.F. et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, W. & States, D.J. 1993, Nature Genet. 3:266-272. Madden, T.L. et al., 1996, Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, S.F. et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang, J. & Madden, T.L. 1997, Genome Res. 7:649-656).
한 실시양태에서, 항체는 바람직하게는 IgG1, 및 IgG4 또는 IgG4P로부터 선택된 전체 길이 항체이다.
따라서, 본 발명은 KLK5에 결합하고
a. i. 서열번호 1을 포함하는 CDR-L1,
ii. 서열번호 2를 포함하는 CDR-L2, 및
iii. 서열번호 3을 포함하는 CDR-L3
을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및
b. iv. 서열번호 4를 포함하는 CDR-H1,
v. 서열번호 5를 포함하는 CDR-H2, 및
vi. 서열번호 6을 포함하는 CDR-H3
을 포함하는 중쇄 가변 영역
을 포함하는 전체 길이 인간화된 항체를 제공한다.
바람직하게는, 전체 길이 인간화된 항체는 서열번호 51을 참조할 때 아미노산 잔기 Arg87, Ala107, Arg110, Lys111, Lys112, Val113, Val137, Lys138, Ser139, Ile140, Pro141, His142, Pro143, Tyr145, Ser146 및 His147을 포함하는 인간 KLK5의 에피토프에 결합하고, 상기 항체는 IgG4P 동형체이다.
또 다른 실시양태에서, 서열번호 51을 참조할 때 아미노산 잔기 Arg87, Ala107, Arg110, Lys111, Lys112, Val113, Val137, Lys138, Ser139, Ile140, Pro141, His142, Pro143, Tyr145, Ser146 및 His147을 포함하는 인간 KLK5의 에피토프에 결합하는 전체 길이 인간화된 항체로서, IgG4P 동형체인 인간화된 항체를 제공한다.
당분야에서 숙련된 자는 항체가 다양한 번역 후 변형을 겪을 수 있다는 것도 이해할 것이다. 이 변형의 유형과 정도는 종종 항체를 발현하는 데 사용되는 숙주 세포주 및 배양 조건에 의해 좌우된다. 이러한 변형은 글리코실화, 메티오닌 산화, 디케토피페라진 형성, 아스파르테이트 이성질체화 및 아스파라긴 탈아미드화의 변경을 포함할 수 있다. 빈번한 변형은 (문헌[Harris, RJ. Journal of Chromatography 705:129-134, 1995]에 기재된 바와 같이) 카르복시펩티다제의 작용으로 인한 카르복시 말단 염기성 잔기(예컨대, 라이신 또는 아르기닌)의 상실이다. 따라서, 항체 중쇄의 C-말단 라이신은 부재할 수 있다.
한 실시양태에서, 항체의 C-말단 아미노산은 번역 후 변형 동안 절단된다.
한 실시양태에서, 항체의 N-말단 아미노산은 번역 후 변형 동안 절단된다.
한 바람직한 실시양태에서, KLK5에 결합하는 항체는 서열번호 15를 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 39를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 전체 길이 항체이다. 바람직하게는, 상기 항체는 서열번호 51을 참조할 때 아미노산 잔기 Arg87, Ala107, Arg110, Lys111, Lys112, Val113, Val137, Lys138, Ser139, Ile140, Pro141, His142, Pro143, Tyr145, Ser146 및 His147을 포함하는 인간 KLK5의 에피토프에 결합한다.
또 다른 실시양태에서, KLK5에 결합하는 항체는 서열번호 17을 포함하는 경쇄 및 서열번호 41을 포함하는 중쇄를 포함하는 전체 길이 IgG4 항체이다. 바람직하게는, 상기 항체는 서열번호 51을 참조할 때 아미노산 잔기 Arg87, Ala107, Arg110, Lys111, Lys112, Val113, Val137, Lys138, Ser139, Ile140, Pro141, His142, Pro143, Tyr145, Ser146 및 His147을 포함하는 인간 KLK5의 에피토프에 결합한다.
또 다른 실시양태에서, 항체는 서열번호 15를 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 39를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 Fab' 단편이다.
또 다른 실시양태에서, 항체는 서열번호 15를 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 27 또는 31 또는 35 또는 39 또는 43을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 예를 들어, 항체는 서열번호 15를 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 27 또는 31 또는 35 또는 39 또는 43, 바람직하게는 서열번호 39를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 전체 길이 IgG4 항체이다. 한 실시양태에서, 서열번호 15를 참조할 때 아미노산 글루타민 24(Gln; Q)는 아르기닌(Arg; R) Q24R 또는 라이신(Lys; K) Q24K이다.
또 다른 실시양태에서, 항체는 서열번호 11을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 27 또는 31 또는 35 또는 39 또는 43을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 전체 길이 IgG4 항체이다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 서열번호 11에 따른 경쇄 가변 영역 및 서열번호 27 또는 31 또는 35 또는 39 또는 43을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 Fab' 단편이다.
또 다른 실시양태에서, 항체는 서열번호 19에 따른 경쇄 가변 영역 및 서열번호 27 또는 31 또는 35 또는 39 또는 43을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 전체 길이 IgG4 항체이다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 서열번호 19에 따른 경쇄 가변 영역 및 서열번호 27 또는 31 또는 35 또는 39 또는 43을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 Fab' 단편이다.
또 다른 실시양태에서, 항체는 서열번호 23에 따른 경쇄 가변 영역 및 서열번호 27 또는 31 또는 35 또는 39 또는 43을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 전체 길이 IgG4 항체이다.
또 다른 실시양태에서, 항체는 서열번호 23에 따른 경쇄 가변 영역 및 서열번호 27 또는 31 또는 35 또는 39 또는 43을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 Fab' 단편이다.
또 다른 실시양태에서, KLK5에 결합하는 항체는
1. 서열번호 13을 포함하는 경쇄 및 서열번호 29 또는 33 또는 37 또는 41 또는 45를 포함하는 중쇄; 또는
2. 서열번호 17을 포함하는 경쇄 및 서열번호 29 또는 33 또는 37 또는 41 또는 45를 포함하는 중쇄
3. 글루타민 24(Gln; Q)가 아르기닌(Arg; R) Q24R 또는 라이신(Lys; K) Q24K인 서열번호 17을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 29 또는 33 또는 37 또는 41 또는 45를 포함하는 중쇄; 또는
4. 서열번호 21을 포함하는 경쇄 및 서열번호 29 또는 33 또는 37 또는 41 또는 45를 포함하는 중쇄; 또는
5. 서열번호 25를 포함하는 경쇄 및 서열번호 29 또는 33 또는 37 또는 41 또는 45를 포함하는 중쇄
를 포함하는 전체 길이 IgG4 항체이다.
바람직하게는, 항체는 서열번호 51을 참조할 때 아미노산 잔기 Arg87, Ala107, Arg110, Lys111, Lys112, Val113, Val137, Lys138, Ser139, Ile140, Pro141, His142, Pro143, Tyr145, Ser146 및 His147을 포함하는 인간 KLK5의 에피토프에 결합한다.
한 바람직한 실시양태에서, KLK5에 결합하는 항체는 서열번호 17을 포함하는 경쇄 및 서열번호 41을 포함하는 중쇄를 포함하는 전체 길이 IgG4 항체이고; 이때 상기 항체는 서열번호 51을 참조할 때 아미노산 잔기 Arg87, Ala107, Arg110, Lys111, Lys112, Val113, Val137, Lys138, Ser139, Ile140, Pro141, His142, Pro143, Tyr145, Ser146 및 His147을 포함하는 인간 KLK5의 에피토프에 결합한다.
본 발명은 또 다른 항체에 결합된 KLK5, 바람직하게는 인간 KLK5와 복합체를 형성하는 전술된 항체도 제공하고, 이때 상기 또 다른 항체는
1. 서열번호 68을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 69를 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 70을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄; 및 서열번호 71을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 72를 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 73을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄; 및/또는
2. 서열번호 74를 포함하는 가변 경쇄 및 서열번호 76을 포함하는 가변 중쇄; 및/또는
3. 서열번호 75를 포함하는 뉴클레오타이드에 의해 코딩된 가변 경쇄 및 사열번호 77을 포함하는 뉴클레오타이드에 의해 코딩된 가변 중쇄
를 포함한다.
한 실시양태에서, KLK5에 결합하는 항체는 바람직하게는 서열번호 51을 참조할 때 아미노산 잔기 Arg87, Ala107, Arg110, Lys111, Lys112, Val113, Val137, Lys138, Ser139, Ile140, Pro141, His142, Pro143, Tyr145, Ser146 및 His147을 포함하는 인간 KLK5의 에피토프에 결합하고,
1. 서열번호 1을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 2를 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 3을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄; 및 서열번호 4를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5를 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 6을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄; 또는
2. 서열번호 7 또는 11 또는 15 또는 19 또는 23을 포함하는 가변 경쇄; 및 서열번호 9 또는 27 또는 31 또는 35 또는 39 또는 43을 포함하는 가변 중쇄
를 포함하고;
이때 상기 항체는
1. 서열번호 68을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 69를 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 70을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄; 및 서열번호 71을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 72를 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 73을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄; 및/또는
2. 서열번호 74를 포함하는 가변 경쇄 및 서열번호 76을 포함하는 가변 중쇄; 및/또는
3. 서열번호 75를 포함하는 뉴클레오타이드에 의해 코딩된 가변 경쇄 및 서열번호 77을 포함하는 뉴클레오타이드에 의해 코딩된 가변 중쇄
를 포함하는 또 다른 항체에 결합된 KLK5, 바람직하게는 인간 KLK5와 복합체를 형성한다.
따라서, 본 발명은 KLK5, 바람직하게는 인간 KLK5에 결합하는 항체로서,
1. 서열번호 68을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 69를 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 70을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄; 및 서열번호 71을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 72를 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 73을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄; 및/또는
2. 서열번호 74를 포함하는 가변 경쇄 및 서열번호 76을 포함하는 가변 중쇄; 및/또는
3. 서열번호 75를 포함하는 뉴클레오타이드에 의해 코딩된 가변 경쇄 및 서열번호 77을 포함하는 뉴클레오타이드에 의해 코딩된 가변 중쇄
를 포함하고 임의로 인간화되는 항체도 제공한다.
나아가, 본 발명은
a. KLK5, 바람직하게는 인간 KLK5; 및
b. KLK5에 결합하는 항체로서, 바람직하게는 서열번호 51을 참조할 때 아미노산 잔기 Arg87, Ala107, Arg110, Lys111, Lys112, Val113, Val137, Lys138, Ser139, Ile140, Pro141, His142, Pro143, Tyr145, Ser146 및 His147을 포함하는 인간 KLK5의 에피토프에 결합하고,
1. 서열번호 1을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 2를 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 3을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 4를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5를 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 6을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄; 또는
2. 서열번호 7 또는 11 또는 15 또는 19 또는 23을 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 9 또는 27 또는 31 또는 35 또는 39 또는 43을 포함하는 가변 중쇄
를 포함하는 항체; 및
c. 1. 서열번호 68을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 69를 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 70을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 71을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 72를 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 73을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄; 및/또는
2. 서열번호 74를 포함하는 가변 경쇄 및 서열번호 76을 포함하는 가변 중쇄; 및/또는
3. 서열번호 75를 포함하는 뉴클레오타이드에 의해 코딩된 가변 경쇄 및 서열번호 77을 포함하는 뉴클레오타이드에 의해 코딩된 가변 중쇄
를 포함하고, 임의로 인간화되는 또 다른 항체
를 포함하는 KLK5-항체 복합체도 포함한다.
하기 실시예에 의해 확인된 바와 같이, 소위 "또 다른 항체"는 본원에 기재된(그리고 서열번호 51을 참조할 때 아미노산 잔기 Arg87, Ala107, Arg110, Lys111, Lys112, Val113, Val137, Lys138, Ser139, Ile140, Pro141, His142, Pro143, Tyr145, Ser146 및 His147을 포함하는) 에피토프와 상이하고 중복되지 않는 에피토프에서 KLK5, 바람직하게는 인간 KLK5에 결합하는 것으로 이해되어야 한다. 이와 관련하여 이러한 항체는 서로 경쟁하지 않는다.
나아가, 본 발명은 서열번호 51을 참조할 때 아미노산 잔기 Arg87, Ala107, Arg110, Lys111, Lys112, Val113, Val137, Lys138, Ser139, Ile140, Pro141, His142, Pro143, Tyr145, Ser146 및 His147을 포함하는 인간 KLK5의 에피토프에 결합하는 항체를 교차차단하거나 이 항체에 의해 교차차단됨으로써 KLK5, 바람직하게는 인간 KLK5에의 결합에 대해 경쟁하는 항체로서,
1. 서열번호 1을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 2를 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 3을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 4를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5를 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 6을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄; 또는
2. 서열번호 62를 포함하는 CDR-L1, 서열번호 2를 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 3을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 4를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5를 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 6을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄; 또는
3. 서열번호 63을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 2를 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 3을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 4를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5를 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 6을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄; 또는
4. 서열번호 7 또는 11 또는 15 또는 19 또는 23을 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 9 또는 27 또는 31 또는 35 또는 39 또는 43을 포함하는 가변 중쇄; 또는
5. 서열번호 15를 참조할 때 아미노산 잔기 글루타민 24(Gln; Q)가 아르기닌(Arg; R) 또는 라이신(Lys; K)인 서열번호 15를 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 9 또는 27 또는 31 또는 35 또는 39 또는 43을 포함하는 가변 중쇄; 또는
6. 서열번호 13 또는 17 또는 21 또는 25를 포함하는 경쇄, 및 서열번호 29 또는 33 또는 37 또는 41 또는 45를 포함하는 중쇄
를 포함하는 항체도 제공한다.
한 실시양태에서, 이러한 경쟁 항체는 서열번호 29 또는 33 또는 37 또는 41 또는 45를 포함하는 서열에 대한 적어도 80% 동일성 또는 유사성을 가진 중쇄 가변 영역; 및/또는 서열번호 13 또는 17 또는 21 또는 25 또는 30을 포함하는 서열에 대한 적어도 80% 동일성 또는 유사성을 가진 경쇄 가변 영역을 가진다.
당분야에서 임의의 적합한 방법을 이용하여, 예를 들어, 교차차단하거나 교차차단됨으로써 경쟁 항체에 의한 KLK5의 결합이 본 발명의 항체의 결합을 방해하거나 그 반대의 경우가 일어나는 경쟁 ELISA 또는 BIAcore 어세이를 이용하여 경쟁 항체를 확인할 수 있다. 이러한 경쟁 어세이는 단리된 천연 또는 재조합 KLK5 또는 이의 적합한 융합 단백질/폴리펩타이드를 사용할 수 있다. 한 예에서, 경쟁은 재조합 인간 활성 KLK5(예를 들어, 서열번호 53을 포함함)를 사용함으로써 측정된다.
항체 또는 단편과 같은 생물학적 분자는 산성 및/또는 염기성 작용기를 함유함으로써, 순 양전하 또는 음전하를 분자에 제공한다. 전체 "관찰된" 전하의 양은 물질의 절대 아미노산 서열, 3D 구조에서 하전된 기의 국소 환경 및 분자의 환경 조건에 의해 좌우될 것이다. 등전점(pI)은 특정 분자 또는 이의 용매 접근 가능한 표면이 순 전기 전하를 운반하지 않는 pH이다. 한 예에서, 서열번호 51을 참조할 때 아미노산 잔기 Arg87, Ala107, Arg110, Lys111, Lys112, Val113, Val137, Lys138, Ser139, Ile140, Pro141, His142, Pro143, Tyr145, Ser146 및 His147을 포함하는 인간 KLK5의 에피토프에 결합하는, KLK5 결합 항체는 적절한 등전점을 갖도록 조작될 수 있다. 이것은 보다 강력한 성질, 특히 적합한 용해도 및/또는 안정성 프로파일 및/또는 개선된 정제 특성을 가진 항체로 이어질 수 있다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 바람직하게는 서열번호 51을 참조할 때 아미노산 잔기 Arg87, Ala107, Arg110, Lys111, Lys112, Val113, Val137, Lys138, Ser139, Ile140, Pro141, His142, Pro143, Tyr145, Ser146 및 His147을 포함하는 인간 KLK5의 에피토프에 결합하고 최초 확인된 항체의 등전점과 상이한 등전점을 갖도록 조작된 KLK5 결합 항체로서,
a. 서열번호 7 또는 11 또는 15 또는 19 또는 23을 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 9 또는 27 또는 31 또는 35 또는 39 또는 43을 포함하는 가변 중쇄; 또는
b. 서열번호 13 또는 17 또는 21 또는 25를 포함하는 경쇄, 및 서열번호 29 또는 33 또는 37 또는 41 또는 45를 포함하는 중쇄
를 포함하는 항체를 제공한다.
항체는 예를 들어, 아미노산 잔기를 교체함으로써, 예컨대, 산성 아미노산 잔기를 하나 이상의 염기성 아미노산 잔기로 교체함으로써 조작될 수 있다. 대안적으로, 염기성 아미노산 잔기를 도입할 수 있거나 산성 아미노산 잔기를 제거할 수 있다. 대안적으로, 분자가 허용될 수 없을 정도로 높은 pI 값을 가진 경우, 필요에 따라 산성 잔기를 도입하여 pI를 낮출 수 있다. pI를 조작할 때 항체 또는 단편의 바람직한 활성을 유지하기 위해 주의를 기울여야 한다는 것이 중요하다. 따라서, 한 실시양태에서, 조작된 항체는 "비변형된" 항체 또는 단편과 동일하거나 실질적으로 동일한 활성을 가진다.
프로그램, 예컨대, ** ExPASY http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html, 및 http://www.iut-arles.up.univ-mrs.fr/w3bb/d_abim/compo-p.html을 이용하여 항체의 등전점을 예측할 수 있다.
본 발명에 의해 제공된 항체의 친화성은 당분야에 공지되어 있는 임의의 적합한 방법을 이용함으로써 변경될 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 본 발명은 또한 KLK5, 특히 인간 KLK5에 대해 개선된 친화성을 가진 항체의 변이체에 관한 것이다. 이러한 변이체는 CDR의 돌연변이(Yang et al., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995), 쇄 셔플링(Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), 대장균의 돌연변이유발자 균주의 사용(Low et al., J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996), DNA 셔플링(Patten et al., Curr. Opin Biotechnol., 8, 724-733, 1997), 파지 디스플레이(Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996) 및 성적 PCR(Crameri et al., Nature, 391, 288-291, 1998)을 비롯한 다수의 친화성 성숙 프로토콜에 의해 수득될 수 있다.
원하는 경우 본 발명에 따른 항체는 하나 이상의 이펙터 분자(들)에 접합될 수 있다. 이펙터 분자는 본 발명의 항체에 부착될 수 있는 단일 모이어티를 형성하도록 연결된 단일 이펙터 분자 또는 2개 이상의 이러한 분자를 포함할 수 있음을 인식할 것이다. 이펙터 분자에 연결된 항체의 단편을 수득하고자 하는 경우, 이것은 항체 단편이 직접적으로 또는 커플링제를 통해 이펙터 분자에 연결되는 표준 화학적 또는 재조합 DNA 절차에 의해 제조될 수 있다. 이러한 이펙터 분자를 항체에 접합시키는 기법은 당분야에 잘 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Hellstrom et al., Controlled Drug Delivery, 2nd Ed., Robinson et al., eds., 1987, pp. 623-53]; 문헌[Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev., 62:119-58]; 및 문헌[Dubowchik et al., 1999, Pharmacology and Therapeutics, 83, 67-123] 참조). 구체적인 화학적 절차는 예를 들어, 국제 특허출원 공개 제WO 93/06231호, 제WO 92/22583호, 제WO 89/00195호, 제WO 89/01476호 및 WO 03/031581호에 기재된 절차들을 포함한다. 대안적으로, 이펙터 분자가 단백질 또는 폴리펩타이드인 경우, 예를 들어, 국제 특허출원 공개 제WO 86/01533호 및 유럽 특허 제0392745호에 기재된 바와 같이 재조합 DNA 절차를 이용하여 연결을 달성할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 이펙터 분자는 예를 들어, 항신생물제, 약물, 독소, 생물학적 활성 단백질, 예를 들어, 효소, 다른 항체 또는 항체 단편, 합성 또는 천연 생성 중합체, 핵산 및 이의 단편, 예를 들어, DNA, RNA 및 이의 단편, 방사성핵종, 특히 방사성요오드화물, 방사성동위원소, 킬레이팅된 금속, 나노입자 및 리포터 기, 예컨대, 형광 화합물, 또는 NMR 또는 ESR 분광법에 의해 검출될 수 있는 화합물을 포함한다.
이펙터 분자의 예는 세포에 유해한(예를 들어, 세포를 사멸시키는) 임의의 작용제를 포함하는 세포독소 또는 세포독성 작용제를 포함할 수 있다. 예는 콤브레스타틴, 돌라스타틴, 에포틸론, 스타우로스포린, 메이탄시노이드, 스폰지스타틴, 리족신, 할리콘드린, 로리딘, 헤미아스테린, 탁솔, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포사이드, 테노포사이드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디히드록시 안트라신 디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 및 퓨로마이신 및 이들의 유사체 또는 동족체를 포함한다.
이펙터 분자는 항대사물질(예를 들어, 메토트렉세이트, 6-머캡토퓨린, 6-티오구아닌, 사이타라빈, 5-플루오로우라실 데카바진), 알킬화제(예를 들어, 메클로레타민, 티오에파 클로람부실, 멜팔란, 카무스틴(BSNU) 및 로무스틴(CCNU), 사이클로토스파미드, 부설판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C 및 시스-디클로로디아민 백금(II)(DDP) 시스플라틴), 안트라사이클린(예를 들어, 다우노루비신(이전에 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제(예를 들어, 닥티노마이신(이전에 악티노마이산), 블레오마이신, 미트라마이신, 안트라마이신(AMC), 칼리케아미신 또는 듀오카마이신) 및 항-유사분열 작용제(예를 들어, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)도 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
다른 이펙터 분자는 111In 및 90Y, Lu177, 비스무쓰213, 캘리포늄252, 이리듐192 및 텅스텐188/레늄188과 같은 킬레이팅된 방사성핵종; 또는 알킬포스포콜린, 토포이소머라제 I 억제제, 탁소이드 및 수라민과 같은, 그러나 이들로 제한되지 않는, 약물을 포함할 수 있다.
다른 이펙터 분자는 단백질, 펩타이드 및 효소를 포함한다. 관심 있는 효소는 단백질분해 효소, 하이드롤라제(hydrolase), 리아제(lyase), 이소머라제(isomerases), 트랜스퍼라제(transferase)를 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 관심 있는 단백질, 폴리펩타이드 및 펩타이드는 면역글로불린, 독소, 예컨대, 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소 또는 디프테리아 독소, 단백질, 예컨대, 인슐린, 종양 괴사 인자, α-인터페론, β-인터페론, 신경 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자 또는 조직 플라스미노겐 활성화제, 혈전제 또는 항혈관신생제, 예를 들어, 안지오스타틴 또는 엔도스타틴, 또는 생물학적 반응 변형제, 예컨대, 림포카인, 인터류킨-1(IL-1), 인터류킨-2(IL-2), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 신경 성장 인자(NGF) 또는 기타 성장 인자 및 면역글로불린을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
다른 이펙터 분자는 예를 들어, 진단에 유용한 검출 가능한 물질을 포함할 수 있다. 검출 가능한 물질의 예는 다양한 효소, 보결분자단, 형광 물질, 발광 물질, 생체발광 물질, 방사성핵종, 양전자 방출 금속(양전자 방출 단층촬영에 사용됨) 및 비방사성 상자성 금속 이온을 포함한다. 진단제로서 사용하기 위해 항체에 접합될 수 있는 금속 이온에 대해서는 일반적으로 미국 특허 제4,741,900호를 참조한다. 적합한 효소는 호스라디쉬 퍼록시다제, 알칼리성 포스파타제, 베타 갈락토시다제 또는 아세틸콜린에스테라제를 포함하고; 적합한 보결분자단은 스트렙타비딘, 아비딘 및 바이오틴을 포함하고; 적합한 형광 물질은 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 및 파이코에리트린을 포함하고; 적합한 발광 물질은 루미놀을 포함하고; 적합한 생체발광 물질은 루시퍼라제, 루시페린 및 애쿠오린을 포함하고; 적합한 방사성핵종은 125I, 131I, 111In 및 99Tc를 포함한다.
또 다른 예에서, 이펙터 분자는 생체내에서 항체의 반감기를 증가시킬 수 있고/있거나, 항체의 면역원성을 감소시킬 수 있고/있거나, 상피 장벽을 가로질러 면역 시스템으로의 항체의 전달을 향상시킬 수 있다. 이 유형의 적합한 이펙터 분자의 예는 중합체, 알부민, 알부민 결합 단백질 또는 알부민 결합 화합물, 예컨대, 국제 특허출원 공개 제WO05/117984호에 기재된 분자들을 포함한다.
이펙터 분자가 중합체인 경우, 이것은 일반적으로 합성 또는 천연 생성 중합체, 예를 들어, 임의로 치환된 직쇄 또는 분지쇄 폴리알킬렌, 폴리알케닐렌 또는 폴리옥시알킬렌 중합체, 또는 분지된 또는 비분지된 다당류, 예를 들어, 동종다당류 또는 이종다당류일 수 있다.
상기 언급된 합성 중합체에 존재할 수 있는 특정 임의적 치환기는 하나 이상의 하이드록시, 메틸 또는 메톡시 기를 포함한다.
합성 중합체의 구체적인 예는 임의로 치환된 직쇄 또는 분지쇄 폴리(에틸렌글리콜), 폴리(프로필렌글리콜), 폴리(비닐알코올) 또는 이들의 유도체, 특히 임의로 치환된 폴리(에틸렌글리콜), 예컨대, 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 또는 이들의 유도체를 포함한다.
구체적인 천연 생성 중합체는 락토스, 아밀로스, 덱스트란, 글리코겐 또는 이들의 유도체를 포함한다.
한 실시양태에서, 중합체는 알부민 또는 이의 단편, 예컨대, 인간 혈청 알부민 또는 이의 단편이다.
본원에서 사용된 "유도체"는 반응성 유도체, 예를 들어, 말레이미드 등과 같은 티올 선택적 반응성 기를 포함하기 위한 것이다. 반응성 기는 직접적으로 또는 링커 분절을 통해 중합체에 연결될 수 있다. 이러한 기의 잔기는 일부 경우 항체 단편과 중합체 사이의 연결 기로서 생성물의 일부를 형성할 것임을 인식할 것이다.
중합체의 크기는 원하는 대로 변경될 수 있으나, 일반적으로 500 Da 내지 50000 Da, 예를 들어, 5000 내지 40000 Da, 예컨대, 20000 내지 40000 Da의 평균 분자량 범위 내에 있을 것이다. 중합체 크기는 특히 생성물의 의도된 용도, 예를 들어, 종양과 같은 특정 조직에 국한시키거나 순환 반감기를 연장하는 능력을 기반으로 선택될 수 있다(검토를 위해서는 문헌[Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 531-545] 참조). 따라서, 예를 들어, 생성물이 예를 들어, 종양의 치료에 사용되기 위해 순환계를 떠나 조직을 침투하도록 의도된 경우, 예를 들어, 분자량이 대략 5000 Da인 저분자량 중합체를 사용하는 것이 유리할 수 있다. 생성물이 순환계에 남아 있는 적용의 경우, 예를 들어, 20000 Da 내지 40000 Da 범위 내의 분자량을 가진 고분자량 중합체를 사용하는 것이 유리할 수 있다.
적합한 중합체는 폴리알킬렌 중합체, 예컨대, 폴리(에틸렌글리콜) 또는 특히 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 또는 이들의 유도체, 및 특히 약 15000 Da 내지 약 40000 Da 범위 내의 분자량을 가진 폴리알킬렌 중합체를 포함한다.
한 예에서, 본 발명에 따른 항체는 폴리(에틸렌글리콜)(PEG) 모이어티에 부착된다. 한 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체 및 PEG 분자는 항체 단편에 위치한 임의의 이용 가능한 아미노산 측쇄 또는 말단 아미노산 작용기, 예를 들어, 임의의 유리 아미노, 이미노, 티올, 하이드록실 또는 카르복실 기를 통해 부착될 수 있다. 이러한 아미노산은 항체 단편에 천연적으로 존재할 수 있거나 재조합 DNA 방법의 이용을 통해 항체 내로 조작될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,219,996호 및 제5,667,425호; 국제 특허출원 공개 제WO98/25971호 및 제WO2008/038024호 참조). 한 예에서, 본 발명의 항체는 변형된 Fab 단편이고, 이때 변형은 이펙터 분자의 부착을 허용하는 하나 이상의 아미노산을 그의 중쇄의 C-말단에 추가하는 것이다. 적합하게는, 추가 아미노산은 이펙터 분자가 부착될 수 있는 하나 이상의 시스테인 잔기를 함유하는 변형된 힌지 영역을 형성한다. 여러 부위를 사용하여 2개 이상의 PEG 분자를 부착할 수 있다.
적합하게는, PEG 분자는 항체 단편에 위치한 적어도 하나의 시스테인 잔기의 티올 기를 통해 공유결합된다. 변형된 항체 단편에 부착된 각각의 중합체 분자는 단편에 위치한 시스테인 잔기의 황 원자에 공유결합될 수 있다. 공유결합은 일반적으로 디설파이드 결합 또는 특히 황-탄소 결합일 것이다. 티올 기가 부착점으로서 사용되는 경우, 적절하게 활성화된 이펙터 분자, 예를 들어, 말레이미드 및 시스테인 유도체와 같은 티올 선택적 유도체가 사용될 수 있다. 활성화된 중합체는 전술된 바와 같이 중합체 변형된 항체 단편의 제조에서 출발 물질로서 사용될 수 있다. 활성화된 중합체는 티올 반응성 기, 예컨대, α-할로카르복실 산 또는 에스테르, 예를 들어, 요오도아세트아미드, 이미드, 예를 들어, 말레이미드, 비닐 설폰 또는 디설파이드를 함유하는 임의의 중합체일 수 있다. 이러한 출발 물질은 상업적으로 입수될 수 있거나(예를 들어, Nektar(이전 명칭: Shearwater Polymers Inc.), 미국 앨라배마주 헌츠빌 소재), 통상적인 화학적 절차를 이용함으로써 상업적으로 입수 가능한 출발 물질로부터 제조될 수 있다. 구체적인 PEG 분자는 20K 메톡시-PEG-아민(Nektar(이전 명칭: Shearwater); Rapp Polymere; 및 SunBio로부터 입수 가능함) 및 M-PEG-SPA(Nektar(이전 명칭: Shearwater)로부터 입수 가능함)를 포함한다.
한 실시양태에서, 항체는 예를 들어, 유럽 특허 제0948544호 또는 제1090037호에 개시된 방법에 따라 PEG화된, 즉 공유부착된 PEG(폴리(에틸렌글리콜))를 가진 변형된 Fab 단편, Fab' 단편 또는 diFab이다(문헌["Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications", 1992, J. Milton Harris (ed), Plenum Press, New York, "Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications", 1997, J. Milton Harris and S. Zalipsky (eds), American Chemical Society, Washington DC and "Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences", 1998, M. Aslam and A. Dent, Grove Publishers, New York; Chapman, A. 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 2002, 54:531-545] 또한 참조). 한 예에서, PEG는 힌지 영역 내의 시스테인에 부착된다. 한 예에서, PEG 변형된 Fab 단편은 변형된 힌지 영역에서 단일 티올 기에 공유결합된 말레이미드 기를 가진다. 라이신 잔기는 말레이미드 기에 공유결합될 수 있고, 대략 20,000 Da의 분자량을 가진 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 중합체는 라이신 잔기 상의 각각의 아민 기에 부착될 수 있다. 따라서, Fab 단편에 부착된 PEG의 총 분자량은 대략 40,000 Da일 수 있다.
구체적인 PEG 분자는 PEG2MAL40K로서도 알려져 있는, N,N'-비스(메톡시폴리(에틸렌 글리콜) MW 20,000) 변형된 라이신의 2-[3-(N-말레이미도)프로피온아미도]에틸 아미드를 포함한다(Nektar(이전 명칭: Shearwater)로부터 입수 가능함).
PEG 링커의 대안적 공급원은 GL2-400MA3(이때 하기 구조에서 m은 5임) 및 GL2-400MA(이때 m은 2임)를 공급하는 NOF를 포함하고, n은 대략 450이다:
Figure pct00012
따라서, 한 실시양태에서, PEG는 SUNBRIGHT GL2-400MA3으로서 알려져 있는 2,3-비스(메틸폴리옥시에틸렌-옥시)-1-{[3-(6-말레이미도-1-옥소헥실)아미노]프로필옥시}헥산이다(2개의 아암 분지된 PEG, -CH2)3NHCO(CH2)5-MAL, Mw 40,000).
하기 유형의 추가 대안적 PEG 이펙터 분자는 닥터 레디(Dr Reddy), NOF 및 젠켐(Jenkem)으로부터 입수될 수 있다:
Figure pct00013
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 Fab 또는 Fab'는 PEG 분자에 접합된다.
한 실시양태에서, 본 개시내용은 하나 이상의 PEG 중합체, 예를 들어, 1개 또는 2개의 중합체, 예컨대, 40 kDa 중합체 또는 중합체들을 포함하는 Fab'PEG 분자를 제공한다.
본 개시내용에 따른 Fab'-PEG 분자는 Fc 단편과 무관한 반감기를 가진다는 점에서 특히 유리할 수 있다. 한 실시양태에서, 중합체, 예컨대, PEG 분자, 전분 분자 또는 알부민 분자에 접합된 Fab'를 제공한다. 한 실시양태에서, 중합체, 예컨대, PEG 분자, 전분 분자 또는 알부민 분자에 접합된 scFv를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 Fab 또는 Fab'는 인간 혈청 알부민에 접합된다. 한 실시양태에서, 항체 또는 단편은 예를 들어, 반감기를 증가시키기 위해 전분 분자에 접합된다. 전분을 단백질에 접합시키는 방법은 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제8,017,739호에 기재되어 있다.
본 발명은 본 발명에 따른 항체를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드도 제공한다. 본 발명에 따른 단리된 폴리뉴클레오타이드는 예를 들어, 화학적 프로세싱에 의해 생성된 합성 DNA, cDNA, 게놈 DNA 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
분자생물학의 표준 기법을 이용하여 본 발명의 항체를 코딩하는 DNA 서열을 제조할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 합성 기법을 이용하여 원하는 DNA 서열을 완전히 또는 부분적으로 합성할 수 있다. 부위 지정 돌연변이유발 및 중합효소 연쇄 반응(PCR) 기법을 적절하게 이용할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 단리된 폴리뉴클레오타이드는 하기 a 내지 d를 코딩한다:
a. 경쇄 가변 영역, 이때 폴리뉴클레오타이드는
i. 서열번호 8(또는 서열번호 8의 뉴클레오타이드 1 내지 330) 또는 12(또는 서열번호 12의 뉴클레오타이드 1 내지 330) 또는 16 또는 20 또는 24 또는 64 또는 66과 적어도 90% 동일하거나;
ii. 서열번호 8(또는 서열번호 8의 뉴클레오타이드 1 내지 330) 또는 12(또는 서열번호 12의 뉴클레오타이드 1 내지 330) 또는 16 또는 20 또는 24 또는 64 또는 66을 포함하거나;
iii. 본질적으로 서열번호 8(또는 서열번호 8의 뉴클레오타이드 1 내지 330) 또는 12(또는 서열번호 12의 뉴클레오타이드 1 내지 330) 또는 16 또는 20 또는 24 또는 64 또는 66으로 구성됨;
b. 중쇄 가변 영역, 이때 폴리뉴클레오타이드는
i. 서열번호 10 또는 28 또는 32 또는 36 또는 40 또는 44와 적어도 90% 동일하거나;
ii. 서열번호 10 또는 28 또는 32 또는 36 또는 40 또는 44를 포함하거나;
iii. 본질적으로 서열번호 10 또는 28 또는 32 또는 36 또는 40 또는 44로 구성됨;
c. 경쇄, 이때 폴리뉴클레오타이드는
i. 서열번호 14 또는 18 또는 22 또는 26 또는 65 또는 67 또는 100 또는 101 또는 102 또는 103 또는 104와 적어도 90% 동일하거나;
ii. 서열번호 14 또는 18 또는 22 또는 26 또는 65 또는 67 또는 100 또는 101 또는 102 또는 103 또는 104를 포함하거나;
iii. 본질적으로 서열번호 14 또는 18 또는 22 또는 26 또는 65 또는 67 또는 100 또는 101 또는 102 또는 103 또는 104로 구성됨;
d. 중쇄, 이때 폴리뉴클레오타이드는
i. 서열번호 30 또는 34 또는 38 또는 42 또는 46과 적어도 90% 동일하거나;
ii. 서열번호 30 또는 34 또는 38 또는 42 또는 46을 포함하거나;
iii. 본질적으로 서열번호 30 또는 34 또는 38 또는 42 또는 46으로 구성됨.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 10 또는 28 또는 32 또는 36 또는 40 또는 44로 제공된 서열을 포함하는 본 발명의 항체 Fab' 단편, 또는 IgG1 또는 IgG4 항체의 중쇄를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 서열번호 8(또는 서열번호 8의 뉴클레오타이드 1 내지 330) 또는 12(또는 서열번호 12의 뉴클레오타이드 1 내지 330) 또는 16 또는 20 또는 24 또는 64 또는 66으로 제공된 서열을 포함하는 본 발명의 항체 Fab' 단편, 또는 IgG1 또는 IgG4 항체의 경쇄를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드도 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 IgG4(P) 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드를 제공하고, 이때 상기 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 30 또는 34 또는 38 또는 42 또는 46으로 제공된 서열을 포함하고, 상기 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 14 또는 18 또는 22 또는 26 또는 65 또는 67 또는 100 또는 101 또는 102 또는 103 또는 104로 제공된 서열을 포함한다.
본 발명은 본원에 기재된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 클로닝 또는 발현 벡터도 제공한다. 한 예에서, 본 발명에 따른 클로닝 또는 발현 벡터는 서열번호 14 또는 18 또는 22 또는 26 또는 65 또는 67 또는 100 또는 101 또는 102 또는 103 또는 104 또는 30 또는 34 또는 38 또는 42 또는 46으로부터 선택된 서열을 포함하는 하나 이상의 단리된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
벡터를 구축할 수 있는 일반적인 방법, 형질감염 방법 및 배양 방법은 당분야에서 숙련된 자에게 잘 알려져 있다. 이와 관련하여, 문헌["Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F. M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, New York] 및 콜드 스프링 하버 퍼블리싱(Cold Spring Harbor Publishing)에 의해 제작된 매니아티스(Maniatis) 매뉴얼을 참조한다.
또한, 본 발명에 따른 하나 이상의 단리된 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 본 발명의 항체를 코딩하는 하나 이상의 단리된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 클로닝 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 임의의 적합한 숙주 세포/벡터 시스템이 본 발명의 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 발현을 위해 사용될 수 있다. 세균, 예를 들어, 대장균 및 다른 미생물 시스템이 사용될 수 있거나, 진핵생물, 예를 들어, 포유동물 숙주 세포 발현 시스템도 사용될 수 있다. 적합한 포유동물 숙주 세포는 CHO, 골수종 또는 하이브리도마 세포를 포함한다.
본 발명에 사용하기에 적합한 유형의 중국 햄스터 난소(CHO) 세포는 DHFR 선택 마커와 함께 사용될 수 있는 CHO-DG44 세포 및 CHO-DXB11 세포와 같은 dhfr- CHO 세포를 비롯한 CHO 및 CHO-K1 세포, 또는 글루타민 합성효소 선택 마커와 함께 사용될 수 있는 CHOK1-SV 세포를 포함할 수 있다. 항체를 발현하는 데 사용되는 다른 유형의 세포는 림프구 세포주, 예를 들어, NSO 골수종 세포 및 SP2 세포, COS 세포를 포함한다. 숙주 세포는 본 발명에 따른 단리된 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 발현 벡터에 의해 안정적으로 형질전환될 수 있거나 형질감염될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 숙주 세포는 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 바람직하게는 서열번호 8(또는 서열번호 8의 뉴클레오타이드 1 내지 330), 10, 12(또는 서열번호 12의 뉴클레오타이드 1 내지 330), 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 64, 65, 66, 67, 100, 101, 102, 103 또는 104를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터에 의해 안정적으로 형질감염된 CHO-DG44 세포이다.
본 발명은 항체 생성에 적합한 조건 하에서 본 발명에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 이로써 생성된 항체를 단리하는 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 KLK5 결합 항체를 제조하는 방법도 제공한다.
항체는 중쇄 또는 경쇄만을 포함할 수 있고, 이 경우 중쇄 또는 경쇄 폴리뉴클레오타이드 서열만이 숙주 세포를 형질감염시키는 데 사용될 필요가 있다. 중쇄 및 경쇄 둘 다를 포함하는 항체의 생성을 위해, 세포주를 2개의 벡터, 즉 경쇄를 코딩하는 제1 벡터 및 중쇄를 코딩하는 제2 벡터로 형질감염시킬 수 있다. 대안적으로, 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단일 벡터를 사용할 수 있다.
따라서, 숙주 세포를 배양하고 항체를 발현시키고, 항체를 단리하고, 임의로 이를 정제하여 단리된 항체를 제공하는 방법을 제공한다. 따라서, 한 실시양태에서, KLK5, 바람직하게는 인간 KLK5에 결합하는 단리된 항체, 예컨대, 인간화된 항체, 특히 본 발명에 따른 항체를, 내독소 및/또는 숙주 세포 단백질 또는 DNA로부터 실질적으로 정제된, 특히 이들을 결여하거나 실질적으로 결여하는 상태로 제공하고, 이때 상기 항체는
1. 서열번호 1을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 2를 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 3을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 4를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5를 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 6을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄; 또는
2. 서열번호 62를 포함하는 CDR-L1, 서열번호 2를 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 3을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 4를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5를 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 6을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄; 또는
3. 서열번호 63을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 2를 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 3을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 4를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5를 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 6을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄; 또는
4. 서열번호 7 또는 11 또는 15 또는 19 또는 23을 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 9 또는 27 또는 31 또는 35 또는 39 또는 43을 포함하는 가변 중쇄; 또는
5. 서열번호 15를 참조할 때 아미노산 잔기 글루타민 24(Gln; Q)가 아르기닌(Arg; R) 또는 라이신(Lys; K)인 서열번호 15를 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 9 또는 27 또는 31 또는 35 또는 39 또는 43을 포함하는 가변 중쇄; 또는
6. 서열번호 13 또는 17 또는 21 또는 25를 포함하는 경쇄 및 서열번호 29 또는 33 또는 37 또는 41 또는 45를 포함하는 중쇄
를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, KLK5, 바람직하게는 인간 KLK5에 결합하는 단리된 항체, 예컨대, 인간화된 항체, 특히 본 발명에 따른 항체를, 내독소 및/또는 숙주 세포 단백질 또는 DNA로부터 실질적으로 정제된, 특히 이들을 결여하거나 실질적으로 결여하는 상태로 제공하고, 이때 상기 항체는 서열번호 51을 참조할 때 아미노산 잔기 Arg87, Ala107, Arg110, Lys111, Lys112, Val113, Val137, Lys138, Ser139, Ile140, Pro141, His142, Pro143, Tyr145, Ser146 및 His147을 포함하는 인간 KLK5의 에피토프에 결합하고, 상기 항체는
1. 서열번호 1을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 2를 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 3을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 4를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5를 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 6을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄; 또는
2. 서열번호 62를 포함하는 CDR-L1, 서열번호 2를 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 3을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 4를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5를 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 6을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄; 또는
3. 서열번호 63을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 2를 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 3을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 4를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5를 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 6을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄; 또는
4. 서열번호 7 또는 11 또는 15 또는 19 또는 23을 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 9 또는 27 또는 31 또는 35 또는 39 또는 43을 포함하는 가변 중쇄; 또는
5. 서열번호 15를 참조할 때 아미노산 잔기 글루타민 24(Gln; Q)가 아르기닌(Arg; R) 또는 라이신(Lys; K)인 서열번호 15를 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 9 또는 27 또는 31 또는 35 또는 39 또는 43을 포함하는 가변 중쇄; 또는
6. 서열번호 13 또는 17 또는 21 또는 25를 포함하는 경쇄 및 서열번호 29 또는 33 또는 37 또는 41 또는 45를 포함하는 중쇄
를 포함한다.
내독소를 실질적으로 결여한다는 것은 일반적으로 항체 생성물 mg당 1 EU 이하, 예컨대, 생성물 mg당 0.5 또는 0.1 EU의 내독소 함량을 의미하기 위한 것이다.
숙주 세포 단백질 또는 DNA를 실질적으로 결여한다는 것은 일반적으로 항체 생성물 mg당 400 ㎍ 이하, 예컨대, mg당 100 ㎍ 이하, 특히 적절한 경우 mg당 20 ㎍의 숙주 세포 단백질 및/또는 DNA 함량을 의미하기 위한 것이다.
본 발명의 항체가 병리학적 상태의 치료, 진단 및/또는 예방에 유용하기 때문에, 본 발명은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제 중 하나 이상과 함께 본 발명에 따른 항체를 포함하는 약학 또는 진단 조성물도 제공한다.
바람직하게는, 약학 또는 진단 조성물은 KLK5, 바람직하게는 인간 KLK5에 결합하는 항체를 포함하고, 이때 상기 항체는
1. 서열번호 1을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 2를 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 3을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 4를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5를 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 6을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄; 또는
2. 서열번호 62를 포함하는 CDR-L1, 서열번호 2를 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 3을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 4를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5를 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 6을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄; 또는
3. 서열번호 63을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 2를 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 3을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 4를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5를 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 6을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄; 또는
4. 서열번호 7 또는 11 또는 15 또는 19 또는 23을 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 9 또는 27 또는 31 또는 35 또는 39 또는 43을 포함하는 가변 중쇄; 또는
5. 서열번호 15를 참조할 때 아미노산 잔기 글루타민 24(Gln; Q)가 아르기닌(Arg; R) 또는 라이신(Lys; K)인 서열번호 15를 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 9 또는 27 또는 31 또는 35 또는 39 또는 43을 포함하는 가변 중쇄; 또는
6. 서열번호 13 또는 17 또는 21 또는 25를 포함하는 경쇄 및 서열번호 29 또는 33 또는 37 또는 41 또는 45를 포함하는 중쇄
를 포함한다.
바람직하게는, 항체는 서열번호 51을 참조할 때 아미노산 잔기 Arg87, Ala107, Arg110, Lys111, Lys112, Val113, Val137, Lys138, Ser139, Ile140, Pro141, His142, Pro143, Tyr145, Ser146 및 His147을 포함하는 인간 KLK5의 에피토프에 결합한다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체는 유일한 활성 성분이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체는 하나 이상의 추가 활성 성분과 함께 사용된다. 대안적으로, 약학 조성물은 유일한 활성 성분인 본 발명에 따른 항체를 포함하고, 다른 치료제, 진단제 또는 완화제와 함께(예를 들어, 동시에, 순차적으로 또는 별도로) 환자에게 개별적으로 투여될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 약학 조성물은 KLK5, 바람직하게는 인간 KLK5에 결합하는 항체 및 1종 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하고, 이때 상기 항체는
1. 서열번호 1을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 2를 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 3을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 4를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5를 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 6을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄; 또는
2. 서열번호 62를 포함하는 CDR-L1, 서열번호 2를 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 3을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 4를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5를 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 6을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄; 또는
3. 서열번호 63을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 2를 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 3을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 4를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5를 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 6을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄; 또는
4. 서열번호 7 또는 11 또는 15 또는 19 또는 23을 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 9 또는 27 또는 31 또는 35 또는 39 또는 43을 포함하는 가변 중쇄; 또는
5. 서열번호 15를 참조할 때 아미노산 잔기 글루타민 24(Gln; Q)가 아르기닌(Arg; R) 또는 라이신(Lys; K)인 서열번호 15를 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 9 또는 27 또는 31 또는 35 또는 39 또는 43을 포함하는 가변 중쇄; 또는
6. 서열번호 13 또는 17 또는 21 또는 25를 포함하는 경쇄 및 서열번호 29 또는 33 또는 37 또는 41 또는 45를 포함하는 중쇄
를 포함한다.
바람직하게는, KLK5에 결합하는 항체를 포함하는 약학 조성물은 서열번호 51을 참조할 때 아미노산 잔기 Arg87, Ala107, Arg110, Lys111, Lys112, Val113, Val137, Lys138, Ser139, Ile140, Pro141, His142, Pro143, Tyr145, Ser146 및 His147을 포함하는 인간 KLK5의 에피토프에 결합한다. 보다 바람직하게는, KLK5에 결합하는 항체를 포함하는 약학 조성물에서 상기 항체는 서열번호 51을 참조할 때 아미노산 잔기 Arg87, Ala107, Arg110, Lys111, Lys112, Val113, Val137, Lys138, Ser139, Ile140, Pro141, His142, Pro143, Tyr145, Ser146 및 His147을 포함하는 인간 KLK5의 에피토프에 결합하고, 서열번호 15의 경쇄 가변 영역 및 서열번호 39의 중쇄 가변 영역을 포함한다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 필요한 치료 유효량을 확인하기 위해 환자에게 적절하게 투여될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "치료 유효량"은 표적화된 질환 또는 병태를 치료하거나, 호전시키거나 예방하거나, 검출 가능한 치료 또는 예방 효과를 나타내는 데 필요한 치료제의 양을 지칭한다. 임의의 항체의 경우, 치료 유효량은 먼저 세포 배양 어세이 또는 동물 모델, 통상적으로 설치류, 토끼, 개, 돼지 또는 영장류에서 추정될 수 있다. 동물 모델을 사용하여 적절한 농도 범위와 투여 경로도 결정할 수 있다. 그 다음, 이러한 정보는 인간에게 투여하는 데 유용한 용량 및 경로를 결정하는 데 사용될 수 있다.
인간 대상체에 대한 정확한 치료 유효량은 질환 상태의 중증도, 대상체의 일반적인 건강, 대상체의 연령, 체중 및 성별, 식이, 투여 시간 및 빈도, 약물 조합(들), 반응 민감성 및 치료에 대한 내성/반응에 의해 좌우될 것이다. 일반적으로, 치료 유효량은 0.01 mg/kg 내지 500 mg/kg, 예를 들어, 0.1 mg/kg 내지 200 mg/kg, 예컨대, 100 mg/kg일 것이다. 약학 조성물은 용량당 소정양의 본 발명의 활성제를 함유하는 유닛 용량 형태로 편리하게 제공될 수 있다.
치료 조성물에서 약학적으로 허용되는 담체는 액체, 예컨대, 물, 식염수, 글리세롤 및 에탄올을 추가로 함유할 수 있다. 추가로, 보조 물질, 예컨대, 습윤제 또는 유화제 또는 pH 완충 물질이 이러한 조성물에 존재할 수 있다. 이러한 담체는 약학 조성물이 환자에 의한 섭취를 위해 정제, 환제, 당의정, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리 및 현탁액으로서 제제화될 수 있게 한다.
투여에 적합한 형태는 예를 들어, 정맥내, 흡입 가능한 또는 피하 형태로 주사 또는 주입에 의한, 예를 들어, 볼루스 주사 또는 연속 주입에 의한 비경구 투여에 적합한 형태를 포함한다. 생성물이 주사 또는 주입용인 경우, 상기 생성물은 유성 또는 수성 비히클 중의 현탁액, 용액 또는 유화액의 형태를 취할 수 있고 현탁제, 보존제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제제화 작용제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 본 발명에 따른 항체는 사용되기 전에 적절한 멸균 액체에 의해 재구성될 건조 형태로 존재할 수 있다. 주사 전에 액체 비히클 중의 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태도 제조될 수 있다.
일단 제제화되면, 본 발명의 조성물은 대상체에게 직접적으로 투여될 수 있다. 따라서, 본원은 의약의 제조를 위한 본 발명에 따른 항체의 용도를 제공한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 약학 조성물은 인간 대상체에게 투여되기에 적합하다.
따라서, 또 다른 측면에서, 본 발명은 치료에 사용하기 위한, KLK5에 결합하는 항체 또는 이 항체를 포함하는 약학 조성물을 제공하고, 이때 상기 항체는
1. 서열번호 1을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 2를 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 3을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 4를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5를 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 6을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄; 또는
2. 서열번호 62를 포함하는 CDR-L1, 서열번호 2를 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 3을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 4를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5를 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 6을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄; 또는
3. 서열번호 63을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 2를 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 3을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 4를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5를 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 6을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄; 또는
4. 서열번호 7 또는 11 또는 15 또는 19 또는 23을 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 9 또는 27 또는 31 또는 35 또는 39 또는 43을 포함하는 가변 중쇄; 또는
5. 서열번호 15를 참조할 때 아미노산 잔기 글루타민 24(Gln; Q)가 아르기닌(Arg; R) 또는 라이신(Lys; K)인 서열번호 15를 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 9 또는 27 또는 31 또는 35 또는 39 또는 43을 포함하는 가변 중쇄; 또는
6. 서열번호 13 또는 17 또는 21 또는 25를 포함하는 경쇄 및 서열번호 29 또는 33 또는 37 또는 41 또는 45를 포함하는 중쇄
를 포함한다.
바람직하게는, 상기 항체는 서열번호 51을 참조할 때 아미노산 잔기 Arg87, Ala107, Arg110, Lys111, Lys112, Val113, Val137, Lys138, Ser139, Ile140, Pro141, His142, Pro143, Tyr145, Ser146 및 His147을 포함하는 인간 KLK5의 에피토프에 결합한다.
바람직한 실시양태에서, 치료에 사용하기 위한, KLK5에 결합하는 항체 또는 이 항체를 포함하는 약학 조성물을 제공하고, 이때 상기 항체는
1. 서열번호 1을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 2를 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 3을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 4를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5를 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 6을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄; 또는
2. 서열번호 15를 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 39를 포함하는 가변 중쇄; 또는
3. 서열번호 17을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 41을 포함하는 중쇄
를 포함한다.
바람직하게는, 상기 항체는 서열번호 51을 참조할 때 아미노산 잔기 Arg87, Ala107, Arg110, Lys111, Lys112, Val113, Val137, Lys138, Ser139, Ile140, Pro141, His142, Pro143, Tyr145, Ser146 및 His147을 포함하는 인간 KLK5의 에피토프에 결합한다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 치료에 사용하기 위한, KLK5에 결합하는 항체 또는 이 항체를 포함하는 약학 조성물을 제공하고, 이때 상기 항체는 서열번호 51을 참조할 때 아미노산 잔기 Arg87, Ala107, Arg110, Lys111, Lys112, Val113, Val137, Lys138, Ser139, Ile140, Pro141, His142, Pro143, Tyr145, Ser146 및 His147을 포함하는 인간 KLK5의 에피토프에 결합하고, 상기 항체는
1. 서열번호 1을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 2를 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 3을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 4를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5를 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 6을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄; 또는
2. 서열번호 15를 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 39를 포함하는 가변 중쇄; 또는
3. 서열번호 17을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 41을 포함하는 중쇄
를 포함한다.
특히, 치료에서의 사용은 KLK5의 조절이상 또는 KLK5 억제의 조절이상을 특징으로 하는 하나 이상의 질환의 치료에서의 사용을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 환자에서 KLK5의 조절이상 또는 KLK5 억제의 조절이상을 특징으로 하는 하나 이상의 질환을 치료하는 방법으로서, KLK5에 결합하는 항체 또는 이 항체를 포함하는 약학 조성물의 치료 유효량을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공하고, 이때 상기 항체는
1. 서열번호 1을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 2를 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 3을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 4를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5를 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 6을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄; 또는
2. 서열번호 62를 포함하는 CDR-L1, 서열번호 2를 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 3을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 4를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5를 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 6을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄; 또는
3. 서열번호 63을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 2를 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 3을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 4를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5를 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 6을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄; 또는
4. 서열번호 7 또는 11 또는 15 또는 19 또는 23을 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 9 또는 27 또는 31 또는 35 또는 39 또는 43을 포함하는 가변 중쇄; 또는
5. 서열번호 15를 참조할 때 아미노산 잔기 글루타민 24(Gln; Q)가 아르기닌(Arg; R) 또는 라이신(Lys; K)인 서열번호 15를 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 9 또는 27 또는 31 또는 35 또는 39 또는 43을 포함하는 가변 중쇄; 또는
6. 서열번호 13 또는 17 또는 21 또는 25를 포함하는 경쇄 및 서열번호 29 또는 33 또는 37 또는 41 또는 45를 포함하는 중쇄
를 포함한다.
바람직하게는, 상기 항체는 서열번호 51을 참조할 때 아미노산 잔기 Arg87, Ala107, Arg110, Lys111, Lys112, Val113, Val137, Lys138, Ser139, Ile140, Pro141, His142, Pro143, Tyr145, Ser146 및 His147을 포함하는 인간 KLK5의 에피토프에 결합한다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 환자에서 KLK5의 조절이상 또는 KLK5 억제의 조절이상을 특징으로 하는 하나 이상의 질환을 치료하는 방법으로서, 치료 유효량의 상기 항체 또는 이 항체를 포함하는 약학 조성물을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공하고, 이때 상기 항체는
1. 서열번호 1을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 2를 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 3을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 4를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5를 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 6을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄; 또는
2. 서열번호 15를 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 39를 포함하는 가변 중쇄; 또는
3. 서열번호 17을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 41을 포함하는 중쇄
를 포함한다.
바람직하게는, 상기 항체는 서열번호 51을 참조할 때 아미노산 잔기 Arg87, Ala107, Arg110, Lys111, Lys112, Val113, Val137, Lys138, Ser139, Ile140, Pro141, His142, Pro143, Tyr145, Ser146 및 His147을 포함하는 인간 KLK5의 에피토프에 결합한다.
또 다른 측면에서, KLK5에 결합하는 항체 또는 이 항체를 포함하는 약학 조성물을 제공하고, 이때 상기 항체는 KLK5의 조절이상 또는 KLK5 억제의 조절이상을 특징으로 하는 하나 이상의 질환의 치료에 사용하기 위한 것이고, 상기 항체는
1. 서열번호 1을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 2를 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 3을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 4를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5를 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 6을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄; 또는
2. 서열번호 62를 포함하는 CDR-L1, 서열번호 2를 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 3을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 4를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5를 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 6을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄; 또는
3. 서열번호 63을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 2를 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 3을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 4를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5를 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 6을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄; 또는
4. 서열번호 7 또는 11 또는 15 또는 19 또는 23을 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 9 또는 27 또는 31 또는 35 또는 39 또는 43을 포함하는 가변 중쇄; 또는
5. 서열번호 15를 참조할 때 아미노산 잔기 글루타민 24(Gln; Q)가 아르기닌(Arg; R) 또는 라이신(Lys; K)인 서열번호 15를 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 9 또는 27 또는 31 또는 35 또는 39 또는 43을 포함하는 가변 중쇄; 또는
6. 서열번호 13 또는 17 또는 21 또는 25를 포함하는 경쇄 및 서열번호 29 또는 33 또는 37 또는 41 또는 45를 포함하는 중쇄
를 포함한다.
바람직하게는, 상기 항체는 서열번호 51을 참조할 때 아미노산 잔기 Arg87, Ala107, Arg110, Lys111, Lys112, Val113, Val137, Lys138, Ser139, Ile140, Pro141, His142, Pro143, Tyr145, Ser146 및 His147을 포함하는 인간 KLK5의 에피토프에 결합한다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, KLK5에 결합하는 항체 및 이 항체를 포함하는 약학 조성물을 제공하고, 이때 상기 항체는 KLK5의 조절이상 또는 KLK5 억제의 조절이상을 특징으로 하는 하나 이상의 질환의 치료에 사용하기 위한 것이고, 상기 항체는
1. 서열번호 1을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 2를 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 3을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 4를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5를 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 6을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄; 또는
2. 서열번호 15를 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 39를 포함하는 가변 중쇄; 또는
3. 서열번호 17을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 41을 포함하는 중쇄
를 포함한다.
바람직하게는, 상기 항체는 서열번호 51을 참조할 때 아미노산 잔기 Arg87, Ala107, Arg110, Lys111, Lys112, Val113, Val137, Lys138, Ser139, Ile140, Pro141, His142, Pro143, Tyr145, Ser146 및 His147을 포함하는 인간 KLK5의 에피토프에 결합한다.
바람직하게는, KLK5의 조절이상 또는 KLK5 억제의 조절이상을 특징으로 하는 하나 이상의 질환은 네더톤 증후군, 아토피성 피부염, 어린선, 주사비, 천식 또는 암, 예컨대, 난소암 또는 방광암, 또는 이들의 조합으로부터 선택된다.
따라서, 본 발명은 환자에서 네더톤 증후군, 아토피성 피부염, 어린선, 주사비, 천식 또는 암, 예컨대, 난소암 또는 방광암, 또는 이들의 조합을 치료하는 방법으로서, KLK5에 결합하는 항체 또는 이 항체를 포함하는 약학 조성물의 치료 유효량을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공하고, 이때 상기 항체는
1. 서열번호 1을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 2를 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 3을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 4를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5를 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 6을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄; 또는
2. 서열번호 62를 포함하는 CDR-L1, 서열번호 2를 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 3을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 4를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5를 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 6을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄; 또는
3. 서열번호 63을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 2를 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 3을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 4를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5를 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 6을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄; 또는
4. 서열번호 7 또는 11 또는 15 또는 19 또는 23을 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 9 또는 27 또는 31 또는 35 또는 39 또는 43을 포함하는 가변 중쇄; 또는
5. 서열번호 15를 참조할 때 아미노산 잔기 글루타민 24(Gln; Q)가 아르기닌(Arg; R) 또는 라이신(Lys; K)인 서열번호 15를 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 9 또는 27 또는 31 또는 35 또는 39 또는 43을 포함하는 가변 중쇄; 또는
6. 서열번호 13 또는 17 또는 21 또는 25를 포함하는 경쇄 및 서열번호 29 또는 33 또는 37 또는 41 또는 45를 포함하는 중쇄
를 포함한다.
바람직하게는, 상기 항체는 서열번호 51을 참조할 때 아미노산 잔기 Arg87, Ala107, Arg110, Lys111, Lys112, Val113, Val137, Lys138, Ser139, Ile140, Pro141, His142, Pro143, Tyr145, Ser146 및 His147을 포함하는 인간 KLK5의 에피토프에 결합한다.
보다 바람직하게는, 상기 방법은 네더톤 증후군 및/또는 아토피성 피부염을 치료하기 위한 것이다.
또 다른 측면에서, KLK5에 결합하는 항체 또는 이 항체를 포함하는 약학 조성물을 제공하고, 이때 상기 항체는 네더톤 증후군, 아토피성 피부염, 어린선, 주사비, 천식 또는 암, 예컨대, 난소암 또는 방광암, 또는 이들의 조합의 치료에 사용하기 위한 것이고, 상기 항체는
1. 서열번호 1을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 2를 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 3을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 4를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5를 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 6을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄; 또는
2. 서열번호 62를 포함하는 CDR-L1, 서열번호 2를 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 3을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 4를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5를 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 6을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄; 또는
3. 서열번호 63을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 2를 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 3을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 4를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5를 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 6을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄; 또는
4. 서열번호 7 또는 11 또는 15 또는 19 또는 23을 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 9 또는 27 또는 31 또는 35 또는 39 또는 43을 포함하는 가변 중쇄; 또는
5. 서열번호 15를 참조할 때 아미노산 잔기 글루타민 24(Gln; Q)가 아르기닌(Arg; R) 또는 라이신(Lys; K)인 서열번호 15를 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 9 또는 27 또는 31 또는 35 또는 39 또는 43을 포함하는 가변 중쇄; 또는
6. 서열번호 13 또는 17 또는 21 또는 25를 포함하는 경쇄 및 서열번호 29 또는 33 또는 37 또는 41 또는 45를 포함하는 중쇄
를 포함한다.
바람직하게는, 상기 항체는 서열번호 51을 참조할 때 아미노산 잔기 Arg87, Ala107, Arg110, Lys111, Lys112, Val113, Val137, Lys138, Ser139, Ile140, Pro141, His142, Pro143, Tyr145, Ser146 및 His147을 포함하는 인간 KLK5의 에피토프에 결합한다.
보다 바람직하게는, 상기 항체는 네더톤 증후군 및/또는 아토피성 피부염의 치료에 사용하기 위한 것이다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 환자에서 네더톤 증후군, 아토피성 피부염, 어린선, 주사비, 천식 또는 암, 예컨대, 난소암 또는 방광암, 또는 이들의 조합을 치료하는 방법으로서, KLK5에 결합하는 항체 또는 이 항체를 포함하는 약학 조성물의 치료 유효량을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공하고, 이때 상기 항체는
1. 서열번호 1을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 2를 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 3을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 4를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5를 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 6을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄; 또는
2. 서열번호 15를 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 39를 포함하는 가변 중쇄; 또는
3. 서열번호 17을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 41을 포함하는 중쇄
를 포함한다.
바람직하게는, 상기 항체는 서열번호 51을 참조할 때 아미노산 잔기 Arg87, Ala107, Arg110, Lys111, Lys112, Val113, Val137, Lys138, Ser139, Ile140, Pro141, His142, Pro143, Tyr145, Ser146 및 His147을 포함하는 인간 KLK5의 에피토프에 결합한다.
보다 바람직하게는, 상기 방법은 네더톤 증후군 및/또는 아토피성 피부염을 치료하기 위한 것이다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, KLK5에 결합하는 항체 또는 이 항체를 포함하는 약학 조성물은 네더톤 증후군, 아토피성 피부염, 어린선, 주사비, 천식 또는 암, 예컨대, 난소암 또는 방광암, 또는 이들의 조합의 치료에 사용하기 위한 것이고, 이때 상기 항체는
1. 서열번호 1을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 2를 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 3을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 4를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5를 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 6을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄; 또는
2. 서열번호 15를 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 39를 포함하는 가변 중쇄; 또는
3. 서열번호 17을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 41을 포함하는 중쇄
를 포함한다.
바람직하게는, 상기 항체는 서열번호 51을 참조할 때 아미노산 잔기 Arg87, Ala107, Arg110, Lys111, Lys112, Val113, Val137, Lys138, Ser139, Ile140, Pro141, His142, Pro143, Tyr145, Ser146 및 His147을 포함하는 인간 KLK5의 에피토프에 결합한다.
보다 바람직하게는, 상기 항체는 네더톤 증후군 및/또는 아토피성 피부염의 치료에 사용하기 위한 것이다.
본 발명은 KLK5에 결합하는 항체 또는 이 항체를 포함하는 약학 조성물도 제공하고, 이때 상기 항체는 네더톤 증후군, 아토피성 피부염, 어린선, 주사비, 천식 또는 암, 예컨대, 난소암 또는 방광암, 또는 이들의 조합의 치료에 사용하기 위한 것이고, 상기 항체는 서열번호 51을 참조할 때 아미노산 잔기 Arg87, Ala107, Arg110, Lys111, Lys112, Val113, Val137, Lys138, Ser139, Ile140, Pro141, His142, Pro143, Tyr145, Ser146 및 His147을 포함하는 인간 KLK5의 에피토프에 결합한다.
또한, 본 발명은 환자에서 네더톤 증후군, 아토피성 피부염, 어린선, 주사비, 천식 또는 암, 예컨대, 난소암 또는 방광암, 또는 이들의 조합을 치료하는 방법으로서, KLK5에 결합하는 항체 또는 이 항체를 포함하는 약학 조성물의 치료 유효량을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공하고, 이때 상기 항체는 서열번호 51을 참조할 때 아미노산 잔기 Arg87, Ala107, Arg110, Lys111, Lys112, Val113, Val137, Lys138, Ser139, Ile140, Pro141, His142, Pro143, Tyr145, Ser146 및 His147을 포함하는 인간 KLK5의 에피토프에 결합한다.
본 발명은 KLK5의 조절이상 또는 KLK5 억제의 조절이상을 특징으로 하는 하나 이상의 질환을 치료하기 위한 의약의 제조를 위한, KLK5에 결합하는 항체 또는 이 항체를 포함하는 약학 조성물의 용도도 제공하고, 이때 상기 항체는 서열번호 51을 참조할 때 아미노산 잔기 Arg87, Ala107, Arg110, Lys111, Lys112, Val113, Val137, Lys138, Ser139, Ile140, Pro141, His142, Pro143, Tyr145, Ser146 및 His147을 포함하는 인간 KLK5의 에피토프에 결합하고, 이러한 조절이상은 바람직하게는 네더톤 증후군, 아토피성 피부염, 어린선, 주사비, 천식 또는 암, 예컨대, 난소암 또는 방광암, 또는 이들의 조합, 보다 바람직하게는 네더톤 증후군 및/또는 아토피성 피부염이다.
구체적으로, 본 발명은 또한 KLK5의 조절이상 또는 KLK5 억제의 조절이상을 특징으로 하는 하나 이상의 질환을 치료하기 위한 의약의 제조를 위한, KLK5에 결합하는 항체 또는 이 항체를 포함하는 약학 조성물의 용도를 제공하고, 이때 상기 항체는 서열번호 51을 참조할 때 아미노산 잔기 Arg87, Ala107, Arg110, Lys111, Lys112, Val113, Val137, Lys138, Ser139, Ile140, Pro141, His142, Pro143, Tyr145, Ser146 및 His147을 포함하는 인간 KLK5의 에피토프에 결합하고, 이러한 조절이상은 바람직하게는 네더톤 증후군, 아토피성 피부염, 어린선, 주사비, 천식 또는 암, 예컨대, 난소암 또는 방광암, 또는 이들의 조합, 보다 바람직하게는 네더톤 증후군 및/또는 아토피성 피부염이고, 상기 항체는
1. 서열번호 1을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 2를 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 3을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 4를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5를 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 6을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄; 또는
2. 서열번호 62를 포함하는 CDR-L1, 서열번호 2를 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 3을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 4를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5를 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 6을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄; 또는
3. 서열번호 63을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 2를 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 3을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 4를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5를 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 6을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄; 또는
4. 서열번호 7 또는 11 또는 15 또는 19 또는 23을 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 9 또는 27 또는 31 또는 35 또는 39 또는 43을 포함하는 가변 중쇄; 또는
5. 서열번호 15를 참조할 때 아미노산 잔기 글루타민 24(Gln; Q)가 아르기닌(Arg; R) 또는 라이신(Lys; K)인 서열번호 15를 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 9 또는 27 또는 31 또는 35 또는 39 또는 43을 포함하는 가변 중쇄; 또는
6. 서열번호 13 또는 17 또는 21 또는 25를 포함하는 경쇄 및 서열번호 29 또는 33 또는 37 또는 41 또는 45를 포함하는 중쇄
를 포함한다.
또한, 본 발명은 예를 들어, 네더톤 증후군, 아토피성 피부염, 어린선, 주사비, 천식 또는 암, 예컨대, 난소암 또는 방광암을 진단하기 위한 진단 활성제로서 또는 진단 어세이에서 KLK5에 결합하는 항체의 용도를 제공하고, 이때 상기 항체는 서열번호 51을 참조할 때 아미노산 잔기 Arg87, Ala107, Arg110, Lys111, Lys112, Val113, Val137, Lys138, Ser139, Ile140, Pro141, His142, Pro143, Tyr145, Ser146 및 His147을 포함하는 인간 KLK5의 에피토프에 결합한다.
보다 바람직하게는, 상기 항체는
1. 서열번호 1을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 2를 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 3을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 4를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5를 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 6을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄; 또는
2. 서열번호 62를 포함하는 CDR-L1, 서열번호 2를 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 3을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 4를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5를 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 6을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄; 또는
3. 서열번호 63을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 2를 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 3을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 4를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5를 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 6을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄; 또는
4. 서열번호 7 또는 11 또는 15 또는 19 또는 23을 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 9 또는 27 또는 31 또는 35 또는 39 또는 43을 포함하는 가변 중쇄; 또는
5. 서열번호 15를 참조할 때 아미노산 잔기 글루타민 24(Gln; Q)가 아르기닌(Arg; R) 또는 라이신(Lys; K)인 서열번호 15를 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 9 또는 27 또는 31 또는 35 또는 39 또는 43을 포함하는 가변 중쇄; 또는
6. 서열번호 13 또는 17 또는 21 또는 25를 포함하는 경쇄 및 서열번호 29 또는 33 또는 37 또는 41 또는 45를 포함하는 중쇄
를 포함한다.
진단은 바람직하게는 생물학적 샘플에 대해 수행될 수 있다. "생물학적 샘플"은 개체로부터 수득된 다양한 유형의 샘플을 포함하고 진단 또는 모니터링 어세이에 사용될 수 있다. 상기 정의는 혈액, 예컨대, 혈장 및 혈청, 및 생물학적 기원의 다른 액체 샘플, 예컨대, 소변 및 타액, 뇌척수액, 고체 조직 샘플, 예컨대, 생검 표본, 예컨대, 피부 생검 또는 조직 배양물, 또는 이들로부터 유래한 세포 및 이들의 자손을 포괄한다. 상기 정의는 샘플의 조달 후 임의의 방식으로, 예컨대, 시약을 사용한 처리, 가용화, 또는 폴리뉴클레오타이드와 같은 특정 성분에 대한 농후화에 의해 조작된 샘플도 포함한다.
진단 검사는 바람직하게는 인간 또는 동물의 신체와 접촉하지 않는 생물학적 샘플에 대해 수행될 수 있다. 이러한 진단 검사는 시험관내 검사로서도 지칭된다. 시험관내 진단 검사는 i) 생물학적 샘플을 본원에 기재된 항체와 접촉시키는 단계; 및 ii) 항체와 KLK5의 결합을 검출하는 단계를 포함하는, 개체로부터 수득된 생물학적 샘플에서 KLK5를 검출하는 시험관내 방법에 의존할 수 있다. 검출된 KLK5 수준 또는 특정 번역 후 변형된 형태의 KLK5(임의의 전구형태를 포함함)의 존재를 적절한 대조군과 비교함으로써, KLK5의 조절이상 또는 KLK5 억제의 조절이상을 특징으로 하는 하나 이상의 질환을 확인할 수 있다. 따라서, 이러한 검출 방법은 대상체(배아 또는 태아를 포함함)가 KLK5의 조절이상 또는 KLK5 억제의 조절이상을 특징으로 하는 질환을 갖거나 이러한 질환을 발생시킬 위험이 있는지를 확인하는 데 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 KLK5에 결합하는 항체로서, 바람직하게는 서열번호 51을 참조할 때 아미노산 잔기 Arg87, Ala107, Arg110, Lys111, Lys112, Val113, Val137, Lys138, Ser139, Ile140, Pro141, His142, Pro143, Tyr145, Ser146 및 His147을 포함하는 인간 KLK5의 에피토프에 결합하는 항체를 제공하고, 이때 이 항체는 KLK5의 조절이상 또는 KLK5 억제의 조절이상을 특징으로 하는 하나 이상의 질환의 진단, 바람직하게는 네더톤 증후군, 아토피성 피부염, 어린선, 주사비, 천식 또는 암, 예컨대, 난소암 또는 방광암의 진단에 사용하기 위한 것이고, 상기 항체는
1. 서열번호 1을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 2를 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 3을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 4를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5를 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 6을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄; 또는
2. 서열번호 62를 포함하는 CDR-L1, 서열번호 2를 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 3을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 4를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5를 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 6을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄; 또는
3. 서열번호 63을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 2를 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 3을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 4를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5를 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 6을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄; 또는
4. 서열번호 7 또는 11 또는 15 또는 19 또는 23을 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 9 또는 27 또는 31 또는 35 또는 39 또는 43을 포함하는 가변 중쇄; 또는
5. 서열번호 15를 참조할 때 아미노산 잔기 글루타민 24(Gln; Q)가 아르기닌(Arg; R) 또는 라이신(Lys; K)인 서열번호 15를 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 9 또는 27 또는 31 또는 35 또는 39 또는 43을 포함하는 가변 중쇄; 또는
6. 서열번호 13 또는 17 또는 21 또는 25를 포함하는 경쇄 및 서열번호 29 또는 33 또는 37 또는 41 또는 45를 포함하는 중쇄
를 포함한다.
따라서, 본 발명은 하기 실시양태에 관한 것이다:
실시양태 1: 칼리크레인 5(KLK5)에 결합하는 항체로서, 항체가 가변 경쇄 및 가변 중쇄를 포함하며,
a. 가변 경쇄가 서열번호 1 또는 서열번호 62 또는 서열번호 63을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 2를 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 3을 포함하는 CDR-L3을 포함하고;
b. 가변 중쇄가 서열번호 4를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5를 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 6을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 항체.
실시양태 2: 실시양태 1에 있어서,
a. 가변 경쇄가 서열번호 1을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 2를 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 3을 포함하는 CDR-L3을 포함하고;
b. 가변 중쇄가 서열번호 4를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5를 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 6을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 항체.
실시양태 3: 칼리크레인 5(KLK5)에 결합하는 항체로서, 서열번호 51을 참조할 때 아미노산 잔기 Arg87, Ala107, Arg110, Lys111, Lys112, Val113, Val137, Lys138, Ser139, Ile140, Pro141, His142, Pro143, Tyr145, Ser146 및 His147을 포함하는 인간 KLK5의 에피토프에 결합하는 항체.
실시양태 4: 실시양태 3에 있어서, 에피토프가 X-선 결정학에 의해 특징규명되는 항체.
실시양태 5: 실시양태 1 내지 4 중 어느 한 실시양태에 있어서, KLK5의 프로테아제 활성을 억제하거나 감소시키는 항체.
실시양태 6: 실시양태 1 내지 5 중 어느 한 실시양태에 있어서, KLK5가 LEKTI 또는 LEKTI의 단편에 결합될 때 KLK5에 결합하는 항체.
실시양태 7: 실시양태 1 내지 6 중 어느 한 실시양태에 있어서, KLK5에의 결합에 대해 LEKTI 또는 LEKTI의 단편과 경쟁하지 않는 항체.
실시양태 8: 실시양태 1 내지 7 중 어느 한 실시양태에 있어서, LEKTI 또는 LEKTI의 단편에 결합된 KLK5와 복합체를 형성하는 항체.
실시양태 9: 실시양태 6 내지 8 중 어느 한 실시양태에 있어서, LEKTI의 단편이 서열번호 54의 아미노산 1 내지 64를 포함하는 인간 LEKTI 도메인 5, 또는 서열번호 61의 아미노산 1 내지 71을 포함하는 LEKTI 도메인 8인 항체.
실시양태 10: 상기 실시양태들 중 어느 한 실시양태에 있어서, KLK5, 바람직하게는 서열번호 53을 포함하는 인간 KLK5, 및 사이노몰구스 원숭이(cyno) KLK5, 바람직하게는 서열번호 60을 포함하는 cyno KLK5에 결합하는 항체.
실시양태 11: 상기 실시양태들 중 어느 한 실시양태에 있어서, 인간 또는 cyno 칼리크레인 2(KLK2); 또는 인간 또는 cyno 칼리크레인 4(KLK4); 또는 인간 또는 cyno 칼리크레인 7(KLK7)에 결합하지 않는 항체.
실시양태 12: 실시양태 3 내지 11 중 어느 한 실시양태에 있어서, 가변 경쇄 및 가변 중쇄를 포함하는 항체로서,
a. 가변 경쇄가 서열번호 1 또는 서열번호 62 또는 서열번호 63을 포함하는 CDR-L1, 바람직하게는 서열번호 1을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 2를 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 3을 포함하는 CDR-L3을 포함하고;
b. 가변 중쇄가 서열번호 4를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5를 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 6을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 항체.
실시양태 13: 상기 실시양태들 중 어느 한 실시양태에 있어서, 키메라 또는 인간화된 항체인 항체.
실시양태 14: 상기 실시양태들 중 어느 한 실시양태에 있어서, 전체 길이 항체인 항체.
실시양태 15: 실시양태 13에 있어서, 전체 길이 항체가 IgG1, IgG4 또는 IgG4P로부터 선택되는 항체.
실시양태 16: 실시양태 1 내지 13 중 어느 한 실시양태에 있어서, Fab, Fab', F(ab')2, scFv, dAb 또는 VHH로부터 선택되는 항체.
실시양태 17: 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서,
a. 서열번호 7 또는 11 또는 15 또는 19 또는 23을 포함하는 가변 경쇄; 및/또는
b. 서열번호 9 또는 27 또는 31 또는 35 또는 39 또는 43을 포함하는 가변 중쇄
를 포함하는 항체.
실시양태 18: 실시양태 1 내지 15 또는 17 중 어느 한 실시양태에 있어서,
a. 서열번호 13 또는 17 또는 21 또는 25를 포함하는 경쇄; 및
b. 서열번호 29 또는 33 또는 37 또는 41 또는 45를 포함하는 중쇄
를 포함하는 항체.
실시양태 19: 실시양태 17 또는 18에 있어서, 서열번호 15 또는 17을 참조할 때 위치 24에서 L-CDR1의 아미노산 잔기 글루타민(Gln; Q)이 아르기닌(Arg; R) 또는 라이신(Lys; K)으로 교체된 항체.
실시양태 20: 상기 실시양태들 중 어느 한 실시양태에 있어서, KLK5가 서열번호 51 또는 52 또는 53을 포함하는 인간 KLK5, 또는 서열번호 60을 포함하는 cyno KLK5인 항체.
실시양태 21: 상기 실시양태들 중 어느 한 실시양태에 있어서,
a. 서열번호 68을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 69를 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 70을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 71을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 72를 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 73을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄; 및/또는
b. 서열번호 74를 포함하는 가변 경쇄 및 서열번호 76을 포함하는 가변 중쇄; 및/또는
c. 서열번호 75를 포함하는 뉴클레오타이드에 의해 코딩된 가변 경쇄 및 서열번호 77을 포함하는 뉴클레오타이드에 의해 코딩된 가변 중쇄
를 포함하는 또 다른 항체에 결합된 KLK5, 바람직하게는 인간 KLK5와 복합체를 형성하는 항체.
실시양태 22: KLK5, 바람직하게는 인간 KLK5에 결합하는 항체로서,
a. 서열번호 68을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 69를 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 70을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄, 및 서열번호 71을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 72를 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 73을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄; 및/또는
b. 서열번호 74를 포함하는 가변 경쇄 및 서열번호 76을 포함하는 가변 중쇄; 및/또는
c. 서열번호 75를 포함하는 뉴클레오타이드에 의해 코딩된 가변 경쇄 및 서열번호 77을 포함하는 뉴클레오타이드에 의해 코딩된 가변 중쇄
를 포함하는 항체.
실시양태 23: a. KLK5, 바람직하게는 인간 KLK5,
b. 실시양태 1 내지 18 중 어느 한 실시양태에 따른 항체, 및
c. 실시양태 19 또는 실시양태 20에 따른 항체
를 포함하는 KLK5-항체 복합체.
실시양태 24: a. 실시양태 1 내지 20 중 어느 한 실시양태에 따른 항체와 KLK5에의 결합에 대해 경쟁하고/하거나;
b. KLK5에의 결합에 대해 실시양태 1 내지 20 중 어느 한 실시양태에 따른 항체를 교차차단하거나 이 항체에 의해 교차차단되고/되거나;
c. 실시양태 1 내지 20 중 어느 한 실시양태에 따른 항체와 동일한 에피토프에 KLK5를 결합시키고/시키거나;
d. 서열번호 29 또는 33 또는 37 또는 41 또는 45에 따른 서열에 대한 적어도 90% 동일성 또는 유사성을 가진 중쇄 가변 영역을 포함하고/하거나;
e. 서열번호 13 또는 17 또는 21 또는 25에 따른 서열에 대한 적어도 90% 동일성 또는 유사성을 가진 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체.
실시양태 25: 실시양태 1 내지 20 중 어느 한 실시양태에 따른 항체를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드.
실시양태 26: 실시양태 25에 있어서,
a. 경쇄 가변 영역을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드로서,
i. 서열번호 8(또는 서열번호 8의 뉴클레오타이드 1 내지 330) 또는 12(또는 서열번호 12의 뉴클레오타이드 1 내지 330) 또는 16 또는 20 또는 24 또는 64 또는 66과 적어도 90% 동일하거나;
ii. 서열번호 8(또는 서열번호 8의 뉴클레오타이드 1 내지 330) 또는 12(또는 서열번호 12의 뉴클레오타이드 1 내지 330) 또는 16 또는 20 또는 24 또는 64 또는 66을 포함하거나;
iii. 본질적으로 서열번호 8(또는 서열번호 8의 뉴클레오타이드 1 내지 330) 또는 12(또는 서열번호 12의 뉴클레오타이드 1 내지 330) 또는 16 또는 20 또는 24 또는 64 또는 66으로 이루어지는 단리된 폴리뉴클레오타이드;
b. 중쇄 가변 영역을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드로서,
i. 서열번호 10 또는 28 또는 32 또는 36 또는 40 또는 44와 적어도 90% 동일하거나;
ii. 서열번호 10 또는 28 또는 32 또는 36 또는 40 또는 44를 포함하거나;
iii. 본질적으로 서열번호 10 또는 28 또는 32 또는 36 또는 40 또는 44로 이루어지는 단리된 폴리뉴클레오타이드;
c. 경쇄를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드로서,
i. 서열번호 14 또는 18 또는 22 또는 26 또는 65 또는 67 또는 100 또는 101 또는 102 또는 103 또는 104와 적어도 90% 동일하거나;
ii. 서열번호 14 또는 18 또는 22 또는 26 또는 65 또는 67 또는 100 또는 101 또는 102 또는 103 또는 104를 포함하거나;
iii. 본질적으로 서열번호 14 또는 18 또는 22 또는 26 또는 65 또는 67 또는 100 또는 101 또는 102 또는 103 또는 104로 이루어지는 단리된 폴리뉴클레오타이드;
d. 중쇄를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드로서,
i. 서열번호 30 또는 34 또는 38 또는 42 또는 46과 적어도 90% 동일하거나;
ii. 서열번호 30 또는 34 또는 38 또는 42 또는 46을 포함하거나;
iii. 본질적으로 서열번호 30 또는 34 또는 38 또는 42 또는 46으로 이루어지는 단리된 폴리뉴클레오타이드.
실시양태 27: 실시양태 25 또는 26 중 어느 한 실시양태에 따른 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 클로닝 또는 발현 벡터.
실시양태 28: a. 실시양태 25 또는 26 중 어느 한 실시양태에 따른 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드; 또는
b. 실시양태 27에 따른 하나 이상의 발현 벡터
를 포함하는 숙주 세포.
실시양태 29: 실시양태 1 내지 20 중 어느 한 실시양태에 따른 항체를 제조하는 방법으로서, 항체의 생성에 적합한 조건 하에서 실시양태 28에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계 및 상기 숙주 세포에 의해 생성된 항체를 단리하는 단계를 포함하는 방법.
실시양태 30: 실시양태 1 내지 20 중 어느 한 실시양태에 따른 항체 및 1종 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물.
실시양태 31: 실시양태 1 내지 20 및 30 중 어느 한 실시양태에 있어서, 치료에 사용하기 위한 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 약학 조성물.
실시양태 32: 실시양태 1 내지 20 및 30 중 어느 한 실시양태에 있어서, KLK5의 조절이상 또는 KLK5 억제의 조절이상을 특징으로 하는 질환의 치료에 사용하기 위한 항체 또는 약학 조성물.
실시양태 33: 실시양태 32에 있어서, 질환이 네더톤 증후군, 아토피성 피부염, 어린선, 주사비, 천식 또는 암, 예컨대, 난소암 또는 방광암, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 항체.
실시양태 34: 실시양태 33에 있어서, 질환이 네더톤 증후군인 항체.
실시양태 35: 실시양태 33에 있어서, 질환이 아토피성 피부염인 항체.
실시양태 36: 환자에서 KLK5의 조절이상 또는 KLK5 억제의 조절이상을 특징으로 하는 질환을 치료하는 방법으로서, 실시양태 1 내지 20 중 어느 한 실시양태에 따른 항체 또는 실시양태 30에 따른 약학 조성물의 치료 유효량을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
실시양태 37: 실시양태 34에 있어서, 질환이 네더톤 증후군, 아토피성 피부염, 어린선, 주사비, 천식 또는 암, 예컨대, 난소암 또는 방광암으로부터 선택되는 방법.
실시양태 38: 실시양태 35에 있어서, 질환이 네더톤 증후군인 항체.
실시양태 39: 실시양태 35에 있어서, 질환이 아토피성 피부염인 항체.
실시양태 40: 실시양태 1 내지 20 및 30 중 어느 한 실시양태에 있어서, KLK5의 조절이상 또는 KLK5 억제의 조절이상을 특징으로 하는 하나 이상의 질환을 치료하기 위한 의약의 제조를 위한 항체 또는 약학 조성물.
실시양태 41: 실시양태 40에 있어서, 질환이 네더톤 증후군, 아토피성 피부염, 어린선, 주사비, 천식 또는 암, 예컨대, 난소암 또는 방광암, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 항체.
실시양태 42: 실시양태 40에 있어서, 질환이 네더톤 증후군 또는 아토피성 피부염, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 항체.
실시양태 43: 실시양태 1 내지 20 중 어느 한 실시양태에 있어서, KLK5의 조절이상 또는 KLK5 억제의 조절이상을 특징으로 하는 하나 이상의 질환의 진단을 위해 진단제로서 사용하거나 진단 어세이 또는 진단 키트에 사용하기 위한 항체.
실시양태 44: 실시양태 43에 있어서, 질환이 네더톤 증후군, 아토피성 피부염, 어린선, 주사비, 천식 또는 암, 예컨대, 난소암 또는 방광암, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 항체.
본 발명에 포함된 서열은 표 1에 표시되어 있다:
Figure pct00014
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본 발명은 지금부터 첨부된 도면에 예시된 실시양태를 참조함으로써 실시예를 통해 더 설명될 것이다.
실시예
실시예 1: 칼리크레인 단백질 및 LEKTI 도메인의 클로닝, 발현 및 정제
서열번호 51에 따른 단백질을 코딩하는 최적화된 뉴클레오타이드 서열을, HindIII/EcoRI 부위를 사용하여 사내 포유동물 발현 벡터 내로 클로닝하여, 태그를 갖지 않은 인간 KLK5 단백질을 코딩하는 벡터를 생성하였다.
마우스 및 사이노몰구스 원숭이(cyno) KLK5 서열을 유사하게 클로닝하여, 각각 서열번호 59 및 60을 포함하는 활성 형태의 단백질의 생성을 가능하게 하였다.
각각 잔기 292 내지 353 및 490 내지 558(Uniprot의 넘버링에 따름)을 포함하는 인간 LEKTI(Uniprot Q9NQ38)의 도메인 5(D5) 및 도메인 8(D8)을 클로닝하고 시험관내 어세이에서 기준 단백질로서 사용하기 위해 발현시켰다.
포유동물 세포에서의 발현을 위해 최적화된 인간 LEKTI 도메인 5 및 도메인 8 뉴클레오타이드 서열을, HindIII/XhoI 부위를 사용하여 토끼 Fc 태그를 코딩하는 사내 포유동물 발현 벡터 내로 따로 클로닝하여, C-말단 토끼 Fc 태그를 가진 LEKTI 도메인 5 서열(서열번호 54) 또는 C-말단 토끼 Fc 태그를 가진 LEKTI 도메인 8 서열(서열번호 61)을 코딩하는 벡터를 생성하였다. 코딩된 단백질은 각각 LEKTI D5 토끼 Fc 및 LEKTI D8 토끼 Fc로서 지칭될 것이다.
제조사의 프로토콜에 따라 Expi293™ 발현 시스템(Life Technologies™)을 사용한 일시적 형질감염으로 KLK5, LEKTI 도메인 5 및 LEKTI 도메인 8 토끼 Fc 융합 단백질을 발현시켰다. 발현 동안, KLK5는 자가활성화되어, 상청액에서 활성 KLK5(서열번호 53, 또는 서열번호 51의 잔기 I67 내지 S293을 포함함)를 생성한다. 형질감염시킨 지 5일 후에 세포를 회수하고 상청액을 즉시 정제에 사용하였다. 인간(또는 마우스 또는 cyno) 활성 KLK5를 포함하는 상청액을 완충제 A(50 mM Tris pH 7.0, 50 mM NaCl)로 4배 희석하고 HiTrap SP HP 양이온 교환 컬럼에 로딩하였다. 완충제 A(50 mM Tris pH 7.0, 50 mM NaCl) 및 완충제 B(50 mM Tris pH 7.0, 1 M NaCl)를 사용하여 총 10 컬럼 부피에 걸쳐 생성된 염 구배로 결합된 단백질을 용출하였다. 정제된 인간(또는 마우스 또는 cyno) 활성 KLK5를 함유하는 분획을 풀링하고 농축하고 pH 7.2에서 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 5% 글리세롤로 구성된 완충제에 의해 평형화된 S200 26/60 컬럼 상에서 크기 배제 크로마토그래피로 더 정제하였다. SDS-PAGE 분석은 단백질이 발현 동안 글리코실화를 겪었음을 표시하였다. 질량 분광측정에 의한 분석은 예상된 분자량을 제공하였다. (서열번호 54에 따른) 인간 LEKTI D5 토끼 Fc 융합 단백질을 포함하는 상청액을 먼저 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 적용하였다. 상청액을 5 ㎖ HitrapTM 단백질 A 컬럼에 로딩하였다. 결합된 단백질을 1 M 구연산 완충제(pH 2.0)로 용출하고 분획을 2 M Tris-HCl(pH 8.5)로 중화시켰다. LEKTI D5 토끼 Fc 융합 단백질을 함유하는 분획을 풀링하고, 농축하고, PBS에 의해 평형화된 S200 26/60 컬럼을 사용한 크기 배제 크로마토그래피로 더 정제하였다. 이어서, 정제된 인간 LEKTI D5 토끼 Fc 융합 단백질을 함유하는 분획을 풀링하고 농축하였다. (서열번호 61에 따른) LEKTI D8 토끼 Fc 융합 단백질을 형질감염된 세포 배양 상청액으로부터 유사하게 정제하였다.
(서열번호 94 및 95에 따른) LEKTI D5 Fab 융합 분자를 발현시키고 양이온 교환 크로마토그래피로 정제하였다. Gly4Ser 링커를 코딩하는 서열에 의해 5' 및 3' 말단에서 플랭킹된 LEKTI 도메인 5 뉴클레오타이드 서열을, 알부민에 특이적인 Fab의 중쇄 서열의 프레임워크 3에 통합하였고(본원에 참고로 포함되는 국제 특허출원 공개 제WO2020011868호에 기재됨); 10x His 서열을 코딩하는 태그도 Fab H 쇄의 3' 말단에 배치하였다. 포유동물 세포에서의 발현을 위해 LEKTI D5 Fab 융합 중쇄 서열을 최적화하고, 사내 발현 벡터 내로 클로닝하고, 마찬가지로 포유동물 발현을 위해 최적화된 적절한 경쇄와 함께 CHO SXE 세포에 공-형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 32℃에서 13일 동안 통기 플라스크에서 배양하였다. 상청액을 회수하고 농축하고 완충제를 20 mM Tris, 50 mM NaCl, pH 7.0으로 교환한 후, SP 세파로스 HP 컬럼에 로딩하였다. 완충제 A(50 mM Tris pH 7.0, 50 mM NaCl) 및 완충제 B(50 mM Tris pH 7.0, 1 M NaCl)를 사용하여 총 10 컬럼 부피에 걸쳐 생성된 염 구배로 결합된 단백질을 용출하였다. LEKTI D5 Fab 융합 단백질을 함유하는 분획을 풀링하고 PBS(pH 7.4)에 의해 평형화된 S200 컬럼을 사용한 크기 배제 크로마토그래피로 더 정제하였다. 관련 분획을 풀링하였다.
전체 길이 KLK7 단백질을 코딩하는 인간 및 cyno 뉴클레오타이드 서열을 인간 KLK5와 유사한 방식으로 발현시켜, 전구 KLK7을 생성하였다(각각 서열번호 55 및 57을 포함함). KLK5와 달리, KLK7은 발현 동안 자가활성화되지 않으므로, 각각의 정제된 단백질로부터 전구펩타이드 서열을 절단하기 위해 써모라이신을 사용하여 활성 형태의 인간 및 cyno KLK7(각각 서열번호 56 및 58을 포함함)을 생성하였다. 인간 및 cyno 전구 KLK7 단백질(서열번호 55 및 57을 포함함)을 활성화 완충제(50 mM Tris pH 7.5, 10 mM CaCl2, 150 mM NaCl, 0.05% Brij 35)로 1 mg/㎖까지 희석하였다. SigmaTM의 써모라이신(25 mg)을 25 ㎖ 분해 완충제(50 mM Tris pH 8.0, 0.5 mM CaCl2)에 재현탁하고, 37℃에서 45분 동안 전구 KLK7 단백질에 1:10의 비로 첨가한 후, 써모라이신에 결합하여 이를 제거하기 위해 음이온 교환 DEAE 수지(GE Life SciencesTM)와 혼합하였다. 통과 유동물을 활성(인간 또는 cyno) KLK7로서 수집하고 완충제를 50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 5% 글리세롤, 1 mM EDTA로 교환하고 약 3.2 mg/㎖까지 농축하였다. 마우스 전구 KLK7을 유사하게 생성하고 절단하여 활성 효소를 생성하였다.
인간 KLK2를 활성 단백질로서 R&D Systems™(카탈로그 # 4104-SE-010)으로부터 공급받았다.
인간 KLK4를 전구형태로서 R&D SystemsTM(카탈로그 # 1719-SE)로부터 공급받았고 다음과 같이 활성화시켰다. 인간 전구 KLK4를 50 mM Tris, 10 mM CaCl2, 150 mM NaCl, pH 7.5로 200 ㎍/㎖까지 희석하였다. 세균 써모라이신을 R&D SystemsTM(카탈로그 # 3097-ZN)로부터 공급받았고 동일한 완충제로 2 ㎍/㎖까지 희석하였다. 동등한 부피의 전구 인간 KLK4와 써모라이신을 조합하고 실온에서 10분 동안 인큐베이션하여 활성화를 허용하였다. 10 mM의 최종 농도로 EDTA를 사용하여 반응을 중단시켰다.
실시예 2: KLK5를 사용한 면역화에 의한 항체의 생성
암컷 뉴질랜드 흰토끼(>2 kg)는 동등한 부피의 완전 프로인트 아쥬번트(SigmaTM)와 혼합된 100 ㎍의 0.4 mg/㎖ 인간 활성 KLK5 및 인간 활성 KLK7(실시예 1에 따라 발현됨)을 사용한 피하 면역화를 받았다. 동물은 동등한 부피의 불완전 프로인트 아쥬번트(SigmaTM)와 혼합된 100 ㎍의 동일한 면역원으로 구성된 부스트 주사를 21일 간격으로 받았다. 비장, 골수 및 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 단일 세포 현탁액을 제조하고 -80℃에서 태아 소 혈청(FCS) 중의 10% 디메틸 설폭사이드(DMSO)에서 냉동시켰을 때 최종 부스트로부터 14일 후에 종료하였다.
문헌[Tickle et al., 2015 J Biomol Screen: 20(4), 492-497]에 기재된 방법과 유사한 방법을 이용하여 B 세포 배양물을 제조하였다. 요약하건대, B 세포 자극 상청액(BSS)의 존재 또는 부재 하에서 CD40L 및 IL-2를 발현하는 피더(feeder) 세포를 사용하여, 면역화된 동물의 림프절 세포, 비장세포 또는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를, 10% FCS(Sigma AldrichTM), 2% HEPES 용액(Sigma AldrichTM), 2% L-글루타민 용액(GibcoTM), 1% 페니실린/스트렙토마이신 용액(GibcoTM), 0.2% 노르모신(Normocin)(InvivogenTM) 및 0.1% β-머캡토에탄올(GibcoTM)로 보충된 200 ㎕/웰 RPMI 1640 배지(GibcoTM)를 가진 바코딩된 96웰 조직 배양 플레이트에서 웰당 2000개 세포의 밀도로 배양하였다. 6일 동안 유사분열제 포볼-12-미리스테이트-13-아세테이트(PMA) 및 파이토헤마글루티닌-L(PHA-L)의 존재 하에서 PBMC를 배양하여 BSS를 생성한 후 상청액을 회수하였다. 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 6일 동안 인큐베이션하였다. 모든 면역화된 동물의 B 세포를 사용하여 배양을 설정하고 총 약 1 x 109개의 B 세포를 스크리닝하였다.
6일 후, 표적 항원의 공급원으로서 바이오티닐화된 인간 KLK5로 코팅된 Sol-R2 스트렙타비딘 비드(TTP LabtechTM), 및 대조 스크리닝을 위해 관련 KLK7로 코팅된 Sol-R4 스트렙타비딘 비드(TTP LabtechTM)를 사용하는 다중체 균질 형광 기반 결합 어세이로 인간 KLK5(실시예 1에서와 같이 제조됨)에의 결합에 대해 상청액을 스크리닝하였다. 모든 라이신 잔기의 완전한 변형을 피하기 위해 공급자의 프로토콜에 비해 5배 몰 과량의 단백질을 사용하여 단백질을 바이오티닐화하기 위해 라이트닝-링크 신속 바이오틴(Lightning-Link Rapid Biotin) B형(ExpedeonTM)을 사용하였다. 아질런트 브라보(Agilent Bravo) 액체 처리기를 이용하여 바코딩된 96웰 조직 배양 플레이트로부터 총 10 ㎕의 상청액을, 상기 바이오티닐화된 KLK 코팅된 Sol-R 비드 및 FITC 접합된 염소 항-토끼 Fc 단편 특이적 항체(Jackson ImmunoResearchTM)를 함유하는 바코딩된 384웰 흑벽 어세이 플레이트로 옮겼다. 1시간 인큐베이션 후, 플레이트를 미러볼 기기(TTP-LabtechTM)에서 판독하였다.
1차 스크리닝 후, 벡만 코울터(Beckman Coulter) BiomekNXPTM 히트 선별 로봇을 이용하여 KLK5에의 결합에 대해 양성을 띠는 상청액을 96웰 바코딩된 마스터 플레이트에 통합하고 세포 배양 플레이트 내의 B 세포를 -80℃에서 냉동시켰다. 먼저, 플루오로메트릭 마이크로부피 어세이 기술(FMAT)로 인간 KLK5에의 결합을 확인하기 위해 통합된 상청액을 다시 스크리닝하였다. 요약하건대, 10 ㎕의 상청액을 바코딩된 검정색 그레이너(Greiner) 플레이트로 옮겼다. 50 ㎕/플레이트의 10 ㎛ 수퍼아비딘(Bangs BeadsTM)을 Alexa-647TM 염소 항-토끼 IgG Fc 단편 특이적 항체(Jackson ImmunoResearchTM)와 혼합된 인간 바이오티닐화된 KLK5로 코팅하였다. 그 다음, 상청액을 첨가하고 플레이트를 Applied BiosystemsTM 세포 검출 시스템 8200에서 판독하였다.
KLK5에의 결합에 대해 다수의 항체들을 선택한 후, KLK5를 특이적으로 억제하는 이들의 능력 및 다른 칼리크레인에 비해 KLK5에 대한 이들의 특이성에 대해 조사하였다.
실시예 3: KLK5 억제 항체의 확인
복합체 B 세포 상청액에 존재하는 프로테아제 및 프로테아제 억제제 중에서 KLK5 활성을 특이적으로 억제할 수 있는 항체를 확인하기 위해, 스크리닝 어세이를 개발하였다. 넌크 맥시소르프(Nunc Maxisorp) 검정색 384(Sigma AldrichTM)를 카르보네이트 완충제 중의 10 ㎍/㎖의 F(ab')2 단편 염소 항-토끼 IgG Fc 단편 특이적 항체(Jackson ImmunoResearchTM)로 코팅하고 4℃에서 하룻밤 동안 방치하였다. 플레이트를 PBS/0.1% Tween-20으로 Biotek™ 플레이트 세척기에서 3회 세척하고 실온에서 1시간 동안 20 ㎕/웰 PBS/1% BSA로 차단하였다. 억제에 대한 양성 대조군으로서 대조군 웰에 첨가된 25 ㎕의 1 nM LEKTI D5 토끼 Fc 융합 단백질과 함께 B 세포 상청액을 플레이트에 첨가하고 어세이 완충제 A(50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.05%(v/v) Tween-20, pH 7.6)를 억제에 대한 음성 대조군으로서 별도의 대조군 웰 세트에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 하룻밤 동안 인큐베이션한 후, PBS/0.1% Tween-20으로 Biotek™ 플레이트 세척기에서 3회 세척하였다. 어세이 완충제 A 중의 250 pM 인간 KLK5 10 ㎕를 각각의 웰에 첨가하고 플레이트를 실온에서 하룻밤 동안 인큐베이션하여 완전한 회합을 허용하였다. 어세이 완충제 A 중의 Boc-VPR-AMC 기질(Cambridge Research Biochemicals™)을 600 μM의 최종 농도로 웰에 첨가하고 PHERAStar FSX(BMG Labtech™) 플레이트 판독기를 이용하여 4시간 후에 형광(λex380 nm λem430 nm)을 측정하였다.
하기 방정식을 이용하여 KLK5 활성의 퍼센트 억제를 측정하기 위해 데이터를 분석하였다:
Figure pct00032
상기 식에서, 시험은 시험 항체에 대한 형광 값이고, 양성은 억제 웰에 대한 양성 대조군의 형광 값의 평균이고, 음성은 억제 웰에 대한 음성 대조군의 평균 형광 값이다.
>40% 억제를 보이는 상청액은 히트로서 간주되었다. 이것은 모든 스크리닝된 상청액의 약 4%에 해당한다. 가변 영역 회수를 위해 이 항체를 선택하였다.
특정 항체 분비 세포를 확인하여 불균질한 활성화된 B 세포 집단으로부터 항체 가변 영역 유전자를 회수할 수 있게 하기 위해, 디콘볼루션(deconvolution) 단계를 수행해야 했다. 형광 초점 방법(Clargo et al., 2014)을 이용하였다. 요약하건대, 항체 분비 세포를 바이오티닐화된 인간 KLK5 및 염소 항-토끼 Fc 단편 특이적 FITC 접합체(Jackson ImmunoResearchTM)로 코팅된 스트렙타비딘 비드(New England BiolabsTM)의 존재 하에서 1시간 동안 37℃에서 정적으로 인큐베이션하였다. 그 후, 항원 특이적 항체 분비 세포를 이들 주변의 형광 후광으로부터 확인하였다. 그 다음, 올림푸스(Olympus) 현미경을 이용함으로써 확인된 다수의 이 개별 B 세포 클론들을 Eppendorf™ 마이크로조작기로 선별하여 PCR 튜브에 넣었다. 단일 세포로부터의 cDNA를 표준 RT-PCR로 수득하였고, 면역글로불린 유전자 특이적 프라이머를 사용하여 중쇄 및 경쇄에 대한 가변 면역글로불린 서열의 후속 PCR을 수행한 다음, 토끼 IgG(VH) 또는 토끼 카파(VL) 포유동물 발현 벡터 내로의 가변 영역의 직접 클로닝을 허용하는 중첩 벡터 부위를 혼입하는 네스티드 PCR을 수행하였다. ExpiFectamineTM(Life TechnologiesTM)을 사용하여 중쇄 및 경쇄 구축물을 ExpiHEK-293 세포에 공-형질감염시키고 재조합 항체를 30 ㎖ 부피로 125 ㎖ ErlenmeyerTM 플라스크에서 발현시켰다. 5일 내지 7일의 배양 후, 상청액을 회수하고 AKTA 순수 크로마토그래피 시스템을 이용하여 단백질 A 친화성 포획으로 항체를 정제하였다. 1 ㎖ 단백질 A HiTrap MabSelect™ SuRe™ 컬럼(GE Healthcare)을 시스템에 부착하고 컬럼을 PBS(pH 7.4)로 평형화시킨 후, 세포 배양 상청액을 0.25 ㎖/분의 유속으로 컬럼에 적용하였다. 이어서, 컬럼을 PBS(pH 7.4)로 세척하고, 결합된 물질을 구연산나트륨(pH 3.4)으로 용출하고, 적절한 부피의 2 M Tris-HCL(pH 8.5)로 중화시켰다. 용출된 분획을 PBS(Sigma)(pH 7.4)로 완충제 교환하고 0.22 ㎛ 필터를 통과시켰다. 최종 정제된 물질을, A280 스캔, SE-UPLC(BEH200 방법) 및 내독소에 대해 Endosafe® PTSTM 시스템을 이용하여 어세이하였다.
이 분석으로부터, 토끼 항체 10236 및 10273은 강력한 억제를 보여주었고 추가 특징규명을 위해 선택되었다.
실시예 4: KLK5 특이적 억제 항체의 확인
그 다음, 정제된 토끼 항체 10236 및 10273을 스크리닝하여, KLK5에 대한 이들의 억제 활성을 확인하고 뮤린 및 cyno KLK5 및 KLK7과 함께 KLK2, KLK4 및 KLK7을 비롯한 다른 인간 서열 칼리크레인 패밀리 구성원의 패널을 사용하여 KLK5에 대한 특이성을 측정하였다. 600 nM 내지 20 pM 범위로 연속 10점 절반 로그 희석물을 각각의 항체에 대해 제조하고 벡만 코울터 FXTM 및 멀티드롭(Multidrop) 시스템을 이용하여 5 ㎕를 검정색 384웰 어세이 플레이트(CorningTM, 카탈로그 번호 3575)로 옮겼다. 15 ㎕의 활성 재조합 인간 칼리크레인 단백질을 적절한 웰에 첨가하여 하기 최종 어세이 농도를 달성하였다: 어세이 완충제 A(50 mM Tris, 150 mM NaCl, 200 μM EDTA, 0.05%(v/v) Tween-20, pH 7.6) 중의 60 pM KLK5, 250 pM KLK7, 500 pM KLK2, 30 pM KLK4, 30 pM cyno KLK5, 500 pM cyno KLK7, 30 pM 마우스 KLK5 또는 10 nM 마우스 KLK7. 대조군으로서, 0% 활성을 위해 20 ㎕ 어세이 완충제 A만(KLK 단백질 없음)을 웰에 첨가하였다. LEKTI D5 토끼 Fc를 억제에 대한 양성 대조군으로서 사용한 반면(항체와 동일한 농도 범위에 걸쳐 시험됨), 100% 활성 기준물을 위해 각각의 활성 인간 칼리크레인 단백질 15 ㎕를 5 ㎕ 어세이 완충제 A에 첨가하였다. 플레이트를 하룻밤 동안 실온에서 인큐베이션한 후, 멀티드롭 장치를 이용하여 하기 펩타이드 기질을 첨가하였다: 인간 KLK5(300 μM), 인간 KLK2(30 μM), 뮤린 KLK5(300 μM) 및 cyno KLK5(450 μM)의 경우 Boc-VPR-AMC(Cambridge Research Biochemicals™); 인간 및 cyno KLK7(각각 90 μM 및 150 μM)의 경우 KHLF-AMC(Cambridge Research Biochemicals™); 인간 KLK4(200 μM)의 경우 PFR-AMC(R&D Systems™); 및 뮤린 KLK7(150 μM)의 경우 Mca-RPKPVE-Nval-WRK(Dnp)-NH2(R&D SystemsTM). 샘플을 4시간 동안 인큐베이션하고 페라스타(Pherastar) FSX 플레이트 판독기(BMG LabtechTM)에서 Boc-VPR-AMC, PFR-AMC 및 KHLF-AMC에 대해 λex380 nm 및 λem430 nm에서 판독하고 Mca-RPKPVE-Nval-WRK(Dnp)-NH2에 대해 λex320 nm 및 λem400 nm에서 판독하였다. 데이터를 실시예 3에 기재된 바와 같이 분석하여 퍼센트 억제를 측정하였다. 데이터를 시험 항체의 농도에 대해 작도하고 4-파라미터 S자 곡선을 피팅하여 IC50을 측정하였다(Genedata ScreenerTM).
토끼 항체 10236 이외에, 이 측정을 위해 항체 10236 및 10273의 토끼 가변 영역의 폴리뉴클레오타이드 서열을, S171C 돌연변이를 포함하는 변형된 마우스 C 카파 벡터 버전에 클로닝하여, 토끼 VK 경쇄에서 발견되고 마우스 불변 영역에 존재하지 않는 추가 디설파이드 결합을 재생성하였다(토끼 항체 10273 mIgG의 경우 서열번호 80 및 81, 및 토끼 항체 10236 mIgG의 경우 서열번호 84 및 85(또는 서열번호 85의 뉴클레오타이드 1 내지 1314)). 이것은 토끼 항체 10236 mIgG의 경우 서열번호 82 및 83을 포함하는 항체, 및 토끼 항체 10273 mIgG의 경우 서열번호 78 및 79를 포함하는 항체를 생성하였다.
토끼 항체 10236 및 10237 mIgG는 시험된 다른 인간 패밀리 구성원(인간 KLK2, KLK4 및 KLK7)에 대한 활성을 갖지 않으면서(즉, 실시예 2의 선택 기준에 따라 40% 역치 미만) 인간 KLK5의 강력한 억제를 보였다. cyno KLK5의 강력한 억제도 입증되었으나, cyno KLK7의 강력한 억제는 입증되지 않았다. 마우스 KLK5 또는 KLK7에 대한 억제 활성이 없다는 것은 분명하였다. 토끼 항체 10236, 10273 및 LEKTI D5 토끼 Fc에 대한 IC50 결과는 표 2에 제시되어 있다.
Figure pct00033
실시예 5: KLK5 특이적 Ab의 친화성 측정
인간 KLK5에 결합하는 뮤린 IgG 분자의 동역학을 25℃에서 표면 플라즈몬 공명(Biacore T200, (GE Life SciencesTM))으로 평가하였다.
아민 커플링 화학반응을 통해 염소 항-마우스 IgG Fc 특이적 항체(Jackson ImmunoResearch)를 대략 7000 RU의 수준으로 CM5 센서 칩에 고정시켰다. 각각의 분석 주기는 항-KLK5 IgG 분자를 항-Fc 표면에 포획하는 단계, KLK5 피분석물(사내에서 준비됨)을 30 ㎕/분으로 300초 동안 주입하는 단계, 및 이어서 600초 해리 단계로 구성되었다. 각각의 주기의 말기에서 50 mM HCl의 60초 주입에 이은 5 mM NaOH의 30초 주입 및 50 mM HCl의 최종 60초 주입을 이용하여 표면을 10 ㎕/분의 유속으로 재생시켰다. 최종 농도 300 mM의 NaCl로 보충된 HBS-EP+ 런닝 완충제(GE Healthcare)로 인간 KLK5를 20 nM부터 0.25 nM까지(4 x 3배 연속 희석) 적정하였다. 기기 노이즈(noise) 및 드리프트(drift)를 차감하기 위해 완충제 블랭크 주입을 포함시켰다.
Biacore T200 평가 소프트웨어를 사용하는 1:1 결합 모델을 이용하여 동역학 파라미터를 결정하였다.
토끼 항체 10236 및 10273의 친화성은 표 3에 표시되어 있다.
Figure pct00034
실시예 6: 항체 10236의 특징규명
항체 10236의 존재 하에서 LEKTI와 KLK5의 결합
표면 플라즈몬 공명(SPR) 실험을 수행하여, 항체 10236이 인간 KLK5에의 결합에 대해 LEKTI D5 단백질과 경쟁하는지를 확인하였다. 이 어세이는 KLK5 단백질 단독에 대한 LEKTI D5 Fab 융합체의 친화성을, 항체 10236과 복합체를 형성한 인간 KLK5에 대한 LEKTI D5 Fab 융합체의 친화성과 비교할 수 있게 하였다.
Biacore T200(GE Life SciencesTM)을 이용하여 LEKTI D5 Fab 융합 단백질과 인간 KLK5의 결합에 대한 동역학 측정치를 수득하였다. 표면을 준비하기 위해, CM5 칩(GE Life SciencesTM)을 먼저 EDC/NHS 혼합물(GE Life SciencesTM)의 5분 주입(30 ㎕ 분-1)으로 활성화시킨 후, 아세테이트 완충제(pH 5.0)(GE Life SciencesTM) 중의 100 ㎍ ㎖-1 LEKTI D5 Fab 융합체(UCB)를 주입하여 칩 표면에 고정된 80 RU의 LEKTI D5 Fab 융합체를 달성하였다. 마지막으로, 1 M 에탄올아민 염산염-NaOH(pH 8.5)의 주입를 이용하여 표면을 불활성화시켰다. 그 후, HBS-EP 완충제(GE Life SciencesTM)에서 0.32 nM부터 32 nM까지 증가하는 농도의 인간 KLK5를 단일 주기 동역학 모드로 주입하였다. 완충제 단독 주입로부터 얻은 값을 KLK5 주입에 대해 수득된 값으로부터 차감하고 BIAcore 평가 소프트웨어(GE Life SciencesTM)에서 1:1 결합 모델에 피팅함으로써 동역학을 측정하였다.
인간 KLK5가 토끼 항체 10236에 의해 결합되었을 때 인간 LEKTI가 인간 KLK5에 결합할 수 있는지를 확인하기 위해, 실시예 4에 기재된 바와 같이 포획된 염소 항-토끼 Fc 다중클론 및 Ab 10236을 사용하여 항체 포획 표면을 준비하였다. 그 다음, 표면이 포화 상태에 도달할 때까지 20 nM의 인간 KLK5를 주입하였다. 이어서, LEKTI D5 Fab 융합 단백질(실시예 1에 기재된 바와 같이 생성됨)을 30 pM 내지 100 nM의 농도로 주입하였다. 먼저 완충제 단독 주입로부터 얻은 값을 피분석물로 얻은 값으로부터 차감한 후, Biacore™ 평가 소프트웨어(GE Life Sciences™)에서 1:1 결합 동역학 모델에 피팅하였다.
기준물로서, LEKTI D5 Fab 융합 단백질을 칩 표면에 고정시킨 후, 인간 KLK5와의 상호작용을 모니터링하였다. 인간 LEKTI D5 Fab 융합 단백질은 인간 KLK5가 120 nM의 친화성으로 토끼 항체 10236과 이미 복합체를 형성하고 있을 때 인간 KLK5에 결합할 수 있었다(표 4A). 토끼 항체 10236의 부재 하에서 인간 KLK5에 대한 인간 LEKTI의 친화성이 더 높지만(40 pM), 이 분석은 토끼 항체 10236이 인간 LEKTI의 존재 또는 부재 하에서 인간 KLK5에 결합함으로써 인간 KLK5에 대한 추가 억제 활성을 제공할 수 있음을 입증한다.
[표 4A]
Figure pct00035
LEKTI-KLK5-항체 10236 복합체 형성
KLK5를, N-말단 TEV 절단 가능한 8xHis 태그를 가진 분비 단백질로서 HEK293 세포에서 생성하였다. 먼저 Ni2+ 친화성 크로마토그래피로 컨디셔닝된 배지로부터 상기 단백질을 정제하였다. KLK5를 함유하는 Ni2+ 컬럼의 분획을 풀링하고 TEV 프로테아제로 분해하여 His 태그를 제거한 다음, 제2 Ni 친화성 단계를 수행하여 TEV 프로테아제를 제거함으로써, 절단된 KLK5가 컬럼을 통해 유동하게 하였다. 제2 Ni2+ 컬럼으로부터의 통과 유동 분획을 농축하고 50 mM Tris pH 7, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5% 글리세롤로 크기 배제 컬럼에서 런닝시켰다. SEC로부터 KLK5 분획을 풀링하고 대략 10 mg/㎖까지 농축하고 -80℃에서 저장하였다.
서열번호 98에 따른 LEKTI 도메인 5(LEKTI D5 Fc) 및 서열번호 99에 따른 LEKTI 도메인 8(LEKTI D8 Fc)을, C-말단 TEV 절단 가능한 Fc 태그를 가진 분비 단백질로서 HEK293 세포에서 생성하였다. 컨디셔닝된 배지를 단백질 A 비드 위로 통과시켜 이 단백질들을 정제하였다. 결합된 단백질을 0.1 M 구연산(pH 2.0)으로 용출하고 2 M Tris-HCl(pH 8.5)을 첨가하여 분획을 중화시켰다. LEKTI 도메인 5 또는 도메인 8을 함유하는 단백질 A 컬럼의 분획을 풀링하고 Fc 태그를 TEV 프로테아제로 제거하여 LEKTI D5 또는 LEKTI D8을 제공하였다. 크기 배제 크로마토그래피를 위해 절단된 단백질을 약 15 mg/㎖까지 농축하였다. SEC를 PBS(pH 7.2)에서 수행하였다. LEKTI 함유 분획을 풀링하고 약 10 mg/㎖까지 농축하고 -80℃에서 냉동 저장하였다.
토끼 Fab 항체 10236을 분비 단백질로서 HEK293 세포에서 발현시켰다. 서열번호 87 및 89를 포함하는 발현 구축물을 1:1 몰 비로 공-형질감염시켰다. 컨디셔닝된 배지를 단백질 G 비드 위로 통과시킴으로써 분비된 Fab(서열번호 86 및 88을 포함함)를 정제하고 0.1 M 글리신(pH 2.7)으로 용출하였다. 2 M Tris-HCl(pH 8.5)을 첨가하여 분획을 중화시켰다. 단백질을 PBS(pH 7.2)로 투석한 다음, 약 10 mg/㎖까지 농축하고 -80℃에서 냉동 저장하였다.
먼저 25 μM KLK5를 25 μM LEKTI D5 또는 LEKTI D8과 함께 얼음 위에서 60분 동안 인큐베이션한 후 25 μM 토끼 Fab 항체 10236을 첨가하고 얼음 위에서 또다시 60분 동안 인큐베이션을 계속함으로써 KLK5, LEKTI D5 또는 LEKTI D8 및 토끼 Fab 항체 10236의 복합체를 형성하였다. 혼합물을 HPLC에 직렬로 연결되어 있는, PBS(pH 7.2)에 의해 평형화된 Superdex 200® 크기 배제 컬럼에 주입하였다. SDS-PAGE에 의한 분석을 위해 피크 분획을 수집하였다. 도 1A 및 1B는 인간 KLK5 단독(실선, 맨 오른쪽), 토끼 Fab 항체 10236 단독(점선), 인간 KLK + LEKTI D5 또는 D8의 이원 복합체(각각 도 1A 또는 1B, 긴 파선), 및 KLK5 + LEKTI D5 또는 D8 + 토끼 Fab 항체 10236의 삼원 복합체(각각 도 3A 또는 3B, 짧은 파선, 맨 왼쪽)의 SEC 크로마토그램을 보여준다.
각각의 피크의 성분의 분자량(MW)을 도 2에 나타낸 바와 같이 SDS-PAGE로 확인하였다.
전반적으로, KLK5, LEKTI D5 또는 LEKTI D8 및 토끼 Fab 항체 10236 사이의 복합체는 인간 KLK5를 각각의 LEKTI 단편과 개별적으로 혼합한 다음 이원 복합체를 토끼 Fab 항체 10236과 함께 인큐베이션함으로써 1:1:1 비로 혼합되었을 때 쉽게 형성되었다. 이원 복합체와 삼원 복합체를 피크 분획의 SEC 및 SDS-PAGE로 관찰하였는데, 이는 이들이 안정하고 다른 종으로부터의 단리/정제에 적합함을 시사한다.
실시예 7: KLK5/Fab 항체 10236 복합체의 결정화
5 mM 최종 농도로 키푸넨신(Sigma®)을 첨가하면서 제조사의 프로토콜에 따라 Expi293™ 발현 시스템(Life Technologies™)을 이용하여 일시적으로 형질감염시킴으로써 인간 KLK5를 발현시켰다. 키푸넨신은 만노시다제 I 효소의 강력한 억제제이고 주로 높은 만노스 당단백질을 만들기 위한 세포 배양에 사용된다.
KLK5의 발현 동안, 단백질은 자가활성화되어 상청액에서 활성 KLK5 단백질(서열번호 53의 잔기 I67 내지 S293(UniProt Q9Y337 넘버링))을 생성한다. 형질감염시킨 지 5일 후에 세포를 회수하고 상청액을 즉시 정제에 사용하였다. 인간 활성 KLK5를 포함하는 상청액을 완충제 A(50 mM Tris pH 7.0, 50 mM NaCl)로 4배 희석하고 HiTrap SP HP 양이온 교환 컬럼에 로딩하였다. 완충제 A(50 mM Tris pH 7.0, 50 mM NaCl) 및 완충제 B(50 mM Tris pH 7.0, 1 M NaCl)를 사용하여 총 10 컬럼 부피에 걸쳐 생성된 염 구배로 결합된 단백질을 용출하였다. 정제된 인간 활성 KLK5를 함유하는 분획을 풀링하고, 농축하고, pH 7.2에서 20 mM Tris 및 150 mM NaCl에 의해 평형화된 S200 26/60 컬럼에서 크기 배제 크로마토그래피로 더 정제하였다.
KLK5는 SDS-PAGE에 의해 특징규명되었고 높은 만노스 글리코실화된 단백질의 예상 분자량(MW)인 약 35 내지 38 kDa과 일치하는 겔 상의 위치로 이동하였다(도 3).
그 다음, 인간 KLK5 단백질을 1:100의 비로 엔도글리코시다제 H(Endo H) 단백질로 처리하고 4℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하여 구조 연구용 균질 탈글리코실화된 KLK5 단백질을 형성하였다. 엔도글리코시다제 H(Endo H)는 스트렙토마이세스 플리카투스(Streptomyces plicatus)로부터 클로닝되고 대장균에서 과다발현된 재조합 글리코시다제이다. Endo H는 높은 만노스의 키토바이오스 코어(chitobiose core) 및 제한된 수의 하이브리드 올리고당을 N 결합 당단백질로부터 절단한다. 이것은 복잡한 글리칸을 절단하지 않는다. 효소적 절단은 올리고당의 디아세틸키토바이오스 코어에 있는 2개의 N-아세틸글루코사민 잔기들 사이에서 일어나, 하나의 N-아세틸글루코사민 잔기를 아스파라긴에 남긴다. 이 단계는 균질한 인간 KLK5가 결정학 연구에 사용될 수 있게 하기 위해 수행되었다. KLK5는 SDS-PAGE에 의해 특징규명되었고(도 3) 탈글리코실화된 단백질의 예상 분자량(MW)인 약 25 kDa과 일치하는 겔 상의 위치로 이동하였다.
토끼 Fab 항체 10236을 실시예 6에 기재된 바와 같이 발현시켰다. 토끼 Fab 항체 10236(서열번호 86 및 88을 포함함)을 실시예 6에 기재된 바와 같이 발현시켰다. 요약하건대, 서열번호 87 및 89를 포함하는 발현 구축물을 1:1 몰 비로 공-형질감염시켰다. 컨디셔닝된 배지를 단백질 G 비드 위로 통과시킴으로써 토끼 Fab 항체 10236을 정제하고 0.1 M 글리신(pH 2.7)으로 용출하였다. 2 M Tris-HCl(pH 8.5)을 첨가하여 분획을 중화시켰다. 각각의 개별 단백질을 PBS(pH 7.2)로 투석하고 약 10 mg/㎖까지 농축하고 -80℃에서 냉동 저장하였다.
1.5:1 몰 비의 인간 KLK5/토끼 Fab 항체 10236 혼합물을 만들고 4℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하고 크기 배제 크로마토그래피(20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.2 용출 완충제)로 정제하였다. 형성된 복합체를 단리하고 결정화 전에 약 10.0 mg/㎖까지 농축하였다.
여러 상업적으로 입수 가능한 결정화 스크린을 이용하여 인간 KLK5/토끼 Fab 항체 10236 복합체에 대한 결정화 조건을 확인하였다. Swissci 96웰 2-점적 MRC 결정화 플레이트(몰레큘라 디멘션스(Molecular Dimensions)로부터 공급됨, 카탈로그 번호 MD11-00-100)를 사용하여 시팅(sitting) 점적 포맷으로 이것을 수행하였다. 먼저, 마이크로랩(Microlab) STAR 액체 처리 시스템(Hamilton)을 이용하여 스크린에서 75 ㎕의 각각의 결정화 용액으로 저장소를 채웠다. 그 다음, 모스퀴토(Mosquito) 액체 처리기(TTP LabTech)를 이용하여 300 nl의 인간 KLK5/토끼 Fab 항체 10236 복합체 및 300 nl의 저장소 용액을 결정화 플레이트의 웰에 분배하였다. 프로컴플렉스 스위트(ProComplex Suite)(Qiagen)의 조건 88(웰 H4)에서 단일 결정을 수득하였다. 이 조건은 1.4 M 말론산나트륨을 함유한다. 결정을, 1.4 M 말론산나트륨 및 25% 글리세롤을 함유하는 점적으로 간단히 옮겼다. 결정을 액체 질소에서 급속 냉동하고 빔라인 I03(Diamond Light Source, UK)에서 회절 데이터를 수집하였다. XDS(Kabsch, W. XDS. Acta Cryst. D66, 125-132 (2010))를 이용하여 데이터를 인덱싱하고 통합한 후, AIMLESS(Evans PR, Murshudov GN. How good are my data and what is the resolution? Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2013;69(Pt 7):1204-1214)를 이용하여 스케일링하였다. 페닉스(Phenix) 소프트웨어 스위트(Adams PD, Afonine PV, Bunkoczi G, et al. The Phenix software for automatic measurement of macromolecular structures. Methods. 2011;55(1): 94-106)의 페이저(Phaser)(McCoy, A.J., Grosse-Kunstleve, R.W., Adams, P.D., Winn, M.D., Storoni, L.C., & Read, R.J. Phaser crystallographic software. J. Appl. Cryst. (2007). 40, 658-674)를 이용하여 분자 교체로 인간 KLK5/토끼 Fab 항체 10236 복합체 구조를 풀었다. 이 절차에서, 토끼 Fab 항체 10273 및 10236과 복합체를 형성한 KLK5의 본 발명자들의 결정 구조에서 관찰된 KLK5 및 토끼 Fab 항체 10236의 구조를 분자 교체 모델로서 사용하였다. Coot(P. Emsley; B. Lohkamp; W.G. Scott; Cowtan (2010). "Features and Development of Coot". Acta Crystallographica. D66: 486-501) 및 phenix.refine(Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. P.V. Afonine, R.W. Grosse-Kunstleve, N. Echols, J.J. Headd, N.W. Moriarty, M. Mustyakimov, T.C. Terwilliger, A. Urzhumtsev, P.H. Zwart, and P.D. Adams. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 68, 352-67 (2012))을 수동 모델 완성 및 개선의 다음 주기에서 사용하였다. 표 4B는 본 발명이 처음 기재되었을 때의 개선 통계자료를 보여준다.
[표 4B]
Figure pct00036
단일 인간 KLK5/토끼 Fab 항체 10236 복합체가 결정 비대칭 유닛에서 관찰되었다. 도 4b는 KLK5에 대한 항체 결합 부위가 기질 결합 부위와 구별된다는 것을 보여준다. CCP4 소프트웨어 스위트의 NCONT를 사용하여, Fab10236 분자에 의해 인식되는 KLK5의 에피토프를 정의하였다. KLK5 아미노산 넘버링은 괄호 안의 키모트립시노겐에 기반한 표준 프로테아제 넘버링을 이용한 UnitProtKB 항목 Q9Y337에 기반한다.
4 Å 접촉 거리에서 토끼 Fab 항체 10236에 의해 결합된 인간 KLK5 에피토프는 서열번호 51을 참조할 때 잔기 Arg87(36), Ala107(56), Arg110(59), Lys111(60), Lys112(61), Val113(62), Val137(86), Lys138(87), Ser139(88), Ile140(89), Pro141(90), His142(91), Pro143(92), Tyr145(94), Ser146(95) 및 His147(96)로 구성되는 반면, 괄호 안의 숫자는 프로테아제 명명법에 상응한다. 결합 부위는 도 4a에 더 상세히 표시되어 있다.
KLK5의 활성 부위와 관련하여 Fab10236의 결합 부위를 시각화하기 위해, 본원에 제시된 KLK5-Fab10236 구조와 활성 부위(2PSX)에서 결합된 류펩틴을 가진 KLK5의 공개된 구조의 구조 중첩을 수행하였다(도 4b). 중첩은 Fab10236이 류펩틴의 위치에 의해 표시된 활성 부위의 코어에서 KLK5에 결합하지 않음을 보여주나(도 4b), Fab10236의 경쇄는 KLK5의 활성 부위 틈의 일부를 형성하는 99-루프와 접촉을 형성한다. 본원에 제시된 KLK5-Fab10236 구조를, PDB ID 2PSX 및 2PSY로서 개시된 구조와 같은 이전에 공개된 KLK5의 구조와 비교하였다. 결정 구조 2PSX는 그의 활성 부위에서 펩타이드성 프로테아제 억제제 류펩틴에 결합된 KLK5를 보여주는 반면, 결정 구조 2PSY는 활성 부위에 인접한 아연 이온뿐만 아니라 류펩틴에 결합된 KLK5도 보여준다. 아연은 비경쟁적 방식으로 KLK5를 억제하는 것으로 알려져 있다. 구조 2PSX와 2PSY의 비교는 아연이 His147(96) 및 His150(99)의 측쇄의 실질적인 위치 변화를 동반하는, 99-루프의 골격 입체구조의 이동을 유도함으로써 프로테아제 활성에 영향을 미친다는 것을 보여주었다. 골격 99-루프 이동뿐만 아니라 히스티딘 측쇄 이동도 구조 중첩에서 확인되고(도 4c, 흰색 아연 없음 및 검정색 + 아연), 특히 아연이 결합될 때 His147(99)이 아연의 부재 하에서의 바깥쪽 위치로부터 안쪽 위치로 이동하는 것이 확인된다(도 4c, 파선 화살표는 히스티딘 측쇄 이동을 표시함).
KLK5-Fab10236 구조와 아연 없는 KLK 류펩틴 구조(2PSX)의 구조 중첩은 99-루프의 골격 이동, 및 His147(96) 및 His150(99)의 측쇄 이동을 강조한다(도 4d, 99-루프 및 히스티딘 측쇄가 상세히 표시됨 - 검정색은 KLK5-Fab10236 구조이고 흰색은 아연 없는 KLK5-류펩틴 구조임).
Fab10236과 KLK5의 결합 시, 99-루프에 위치한 His147(96)이 결정 구조 2PSX에서 이전에 관찰된 입체구조를 채택할 수 없는데, 이것은 Fab 경쇄와의 입체적 충돌을 야기할 수 있기 때문이다(파선 사각형, 도 4d). Fab10236의 결합을 수용하기 위해, 99-루프는 바깥쪽 위치로부터 안쪽 위치로 선회하는 His147(96)을 가진 상이한 입체구조를 채택한다(아연이 결합할 때 관찰되는 것과 유사함; 도 4d, His147(96) 이동을 표시하는 파선 화살표). 동시에, His150(99)의 측쇄는 그 자신을 S2 포켓 쪽으로 이동시키는 위치 변화를 겪고, 이 포켓에서 기질 결합을 차단할 수 있다. 도 4d에 나타낸 바와 같이, S2 포켓은 모델링된 류펩틴에 의해 점유되고 His150(99) 측쇄와 류펩틴 사이의 충돌은 흰색 파선 원으로 강조된다.
실시예 8: KLK5/Fab 항체 10236/Fab 항체 10273 복합체의 결정화
일단 상청액이 HiTrap SP HP 양이온 교환 컬럼에 로딩되면, 결합된 단백질을 10 컬럼 부피에 걸쳐 완충제 B(50 mM Tris pH 7.0, 1 M NaCl) 구배로 용출하였다는 점을 제외하고 실시예 7에서와 같이 인간 KLK5를 발현시켰다. 추가 정제, 엔도글리코시다제 처리 및 분석적 특징규명을 실시예 7에서와 같이 수행하였다.
토끼 Fab 항체 10236을 실시예 6에서와 같이 발현시켰다. 토끼 Fab 항체 10273(서열번호 90 및 92를 포함함)을 토끼 Fab 항체 10236에 대해 기재된 바와 같이 클로닝하였다. 요약하건대, 서열번호 91 및 93을 포함하는 발현 구축물을 1:1 몰 비로 공-형질전환시켰다. 컨디셔닝된 배지를 단백질 G 비드 위로 통과시킴으로써 분비된 단백질을 정제하고 0.1 M 글리신(pH 2.7)으로 용출하였다. 2 M Tris-HCl(pH 8.5)을 첨가하여 분획을 중화시켰다. 단백질을 PBS(pH 7.2)로 투석한 다음, 약 10 mg/㎖까지 농축하고 -80℃에서 냉동 저장하였다.
1:1.5:1.5 인간 KLK5/토끼 Fab 항체 10273/토끼 Fab 항체 10236 복합체를 만들고 4℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하고 크기 배제 크로마토그래피(20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.2 용출 완충제)로 정제하였다. 복합체를 함유하는 단일 피크를 결정화 전에 약 10.8 mg/㎖까지 농축하였다.
여러 상업적으로 입수 가능한 결정화 스크린을 이용하여 인간 KLK5/토끼 Fab 항체 10273/토끼 Fab 항체 10236 복합체에 대한 결정화 조건을 확인하였다. Swissci 96웰 2-점적 MRC 결정화 플레이트(몰레큘라 디멘션스로부터 공급됨, 카탈로그 번호 MD11-00-100)를 사용하여 시팅 점적 포맷으로 이것을 수행하였다. 먼저, 마이크로랩 STAR 액체 처리 시스템(Hamilton)을 이용하여 스크린에서 75 ㎕의 각각의 결정화 용액으로 저장소를 채웠다. 그 다음, 모스퀴토 액체 처리기(TTP LabTech)를 이용하여 300 nl의 인간 KLK5/토끼 Fab 항체 10273/토끼 Fab 항체 10236 복합체 및 300 nl의 저장소 용액을 결정화 플레이트의 웰에 분배하였다. MIDAS+ HT-96 스크린(Molecular Dimensions, 카탈로그 번호 MD1-107)의 조건 16(웰 B4)에서 단일 결정을 수득하였다. 이 조건은 45% v/v 펜타에리트리톨 프로폭실레이트(5/4), 0.2 M NaCl 및 0.1 M MES 일수화물(pH 6.0)을 함유한다. 결정을 액체 질소에서 급속 냉동하고 빔라인 I03(Diamond Light Source, UK)에서 회절 데이터를 수집하였다. XDS(Kabsch, W. XDS. Acta Cryst. D66, 125-132 (2010))를 이용하여 데이터를 인덱싱하고 통합한 후, AIMLESS(Evans PR, Murshudov GN. How good are my data and what is the resolution? Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2013;69(Pt 7):1204-1214)를 이용하여 스케일링하였다. 페닉스 소프트웨어 스위트(Adams PD, Afonine PV, Bunkoczi G, et al. The Phenix software for automatic measurement of macromolecular structures. Methods. 2011;55(1): 94-106)의 페이저(McCoy, A.J., Grosse-Kunstleve, R.W., Adams, P.D., Winn, M.D., Storoni, L.C., & Read, R.J. Phaser crystallographic software. J. Appl. Cryst. (2007). 40, 658-674)를 이용하여 분자 교체로 인간 KLK5/토끼 Fab 항체 10273/토끼 Fab 항체 10236 복합체 구조를 풀었다. 이 절차에서, KLK5 구조 2PSX(Debela M, Goettig P, Magdolen V, Huber R, Schechter NM, Bode W. Structural based of zinc inhibitory of human tissue kallikrein 5. J Mol Biol. 2007 Nov 2;373(4):1017-31) 및 전매특허 Fab 모델을 분자 교체 주형으로서 사용하였다. 허용 가능한 Rwork, Rfree 및 Ramachandran 통계자료(몰프로비티(Molprobity)(Williams et al. (2018) MolProbity: More and better reference data for improved all-atom structure validation. Protein Science 27: 293-315)에 의해 분석됨)가 수득될 때까지 Coot(P. Emsley; B. Lohkamp; W.G. Scott; Cowtan (2010). "Features and Development of Coot". Acta Crystallographica. D66: 486-501) 및 phenix.refine(Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. P.V. Afonine, R.W. Grosse-Kunstleve, N. Echols, J.J. Headd, N.W. Moriarty, M. Mustyakimov, T.C. Terwilliger, A. Urzhumtsev, P.H. Zwart, and P.D. Adams. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 68, 352-67 (2012))을 수동 모델 완성 및 개선의 다음 주기에서 사용하였다.
인간 KLK5/토끼 Fab 항체 10273/토끼 Fab 항체 10236 복합체가 결정 비대칭 유닛에서 관찰되었다. CCP4 소프트웨어 스위트의 NCONT를 사용하여, Fab10273 및 Fab10236 분자에 의해 인식되는 KLK5의 에피토프를 확인하였다. KLK5 아미노산 넘버링은 괄호 안의 키모트립시노겐에 기반한 표준 프로테아제 넘버링을 이용한 UnitProtKB 항목 Q9Y337에 기반한다. 표 4C는 본 발명이 처음 기재되었을 때의 개선 통계자료를 보여준다.
[표 4C]
Figure pct00037
4 Å 접촉 거리에서 토끼 Fab 항체 10236에 의해 결합된 인간 KLK5 에피토프는 서열번호 51을 참조할 때 잔기 Arg87(36), Ala107(56), Arg110(59), Lys111(60), Lys112(61), Val113(62), Val137(86), Lys138(87), Ser139(88), Ile140(89), Pro141(90), His142(91), Pro143(92), Tyr145(94), Ser146(95) 및 His147(96)로 구성되는 반면, 괄호 안의 숫자는 프로테아제 명명법에 상응한다. 결합 부위는 도 4d에 더 상세히 표시되어 있다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 항체 10236 및 10273은 매우 상이한 비중첩 결합 부위를 갖고 인간 KLK5의 상이한 에피토프에 결합한다.
실시예 8: 항체 10236 인간화 및 특징규명
Ab 10236의 인간화
토끼 V 영역의 CDR을 인간 생식세포계열 항체 V 영역 프레임워크에 이식함으로써 토끼 항체 10236을 인간화하였다. 항체의 활성을 회복하기 위해, 토끼 V 영역으로부터의 다수의 프레임워크 잔기들도 인간화된 서열에서 유지되었다. 문헌[Adair et al. (1991) (Humanized antibodies. WO91/09967)]에 의해 요약된 프로토콜을 이용하여 이 잔기들을 선택하였다. 토끼 항체(공여자) V 영역 서열과 인간 생식세포계열(수용자) V 영역 서열의 정렬은 설계된 인간화된 서열과 함께 도 6 및 7에 제시되어 있다. 공여자 서열로부터 수용자 서열로 이식된 CDR은 조합된 초티아/카바트 정의가 사용되는 CDR-H1을 제외하고 카바트(Kabat et al., 1987)에 의해 정의된 바와 같다(문헌[Adair et al., 1991 Humanized antibodies. WO91/09967] 참조).
항체 10236의 경우, 경쇄 CDR에 대한 수용자로서 인간 V 영역 IGKV1-6 + JK4 J 영역(IMGT, http://www.imgt.org/)을 선택하였다. 10236 경쇄의 인간화된 이식편의 프레임워크 잔기는 서열번호 15를 참조할 때 각각 공여자 잔기 티로신(Y2), 아스파르트산(D3) 및 라이신(K63)이 유지된 잔기 2, 3 및 63을 포함하는 군으로부터의 하나 이상의 잔기를 제외하고 모두 인간 생식세포계열 유전자로부터 유래한다(도 6). 공여자 잔기 Y2 및 D3의 유지는 인간 KLK-5와의 가장 높은 친화성 결합에 필수적이었다.
항체 10236의 중쇄 CDR에 대한 수용자로서 인간 V 영역 IGHV4-4 + JH4 J 영역(IMGT, http://www.imgt.org/)을 선택하였다. 많은 토끼 항체들과 마찬가지로, 항체 10236의 VH 유전자는 선택된 인간 수용자보다 더 짧다. 인간 수용자 서열과 정렬될 때, 항체 10236의 VH 영역의 프레임워크 1은 인간화된 항체에서 유지되는 N-말단 잔기를 결여한다(도 7). 10236 토끼 VH 영역의 프레임워크 3도 베타 시트 가닥 D와 E 사이의 루프에서 2개의 잔기(75 및 76)를 결여한다: 인간화된 이식편에서 갭은 선택된 인간 수용자 서열(도 7)로부터의 상응하는 잔기(라이신 75, K75; 아스파라긴 76, N76), 또는 대안적으로 라이신 및 트레오닌(라이신 75, K75; 트레오닌 76, T76)으로 채워진다. 10236 중쇄의 인간화된 이식편의 프레임워크 잔기는 서열번호 39를 참조할 때 각각 공여자 잔기 페닐알라닌(F67), 글루타민(Q71), 세린(S73) 및 발린(V78)이 유지된 잔기 67, 71, 73 및 78을 포함하는 군으로부터의 하나 이상의 잔기를 제외하고 모두 인간 생식세포계열 유전자 서열로부터 유래한다. 공여자 잔기 Q71, S73 및 V78의 유지는 인간 KLK-5와의 가장 높은 친화성 결합에 필수적이었다. 균질한 생성물의 발현 및 정제를 제공하기 위해, 인간 프레임워크의 위치 1에 있는 글루타민 잔기를 글루탐산(E1)으로 교체하였다: 항체 및 항체 단편의 N-말단에서 피로글루타메이트로의 글루타민의 전환이 널리 보고되어 있다. 인간화된 10236 항체의 이론적인 pI는 약 6.3 내지 6.6이다. 다운스트림 프로세싱 동안 이온 교환 크로마토그래피에 의한 불순물의 제거를 용이하게 하기 위해, 이식편 gL6의 CDRL1에서 잔기 24를 글루타민(Q)에서 아르기닌(R) 또는 라이신(K) 잔기로 돌연변이시켜 pI를 증가시켰다.
친화성이 인간화 절차에 의해 영향을 받는지를 평가하기 위해 인간화된 이식편을 토끼/인간 항체 10236으로 시험하였다. 토끼/인간 항체 10236을, S171C 돌연변이를 포함하는 변형된 인간 C 카파 벡터 버전에 클로닝하여, 토끼 VK 경쇄에서 발견되고 인간 불변 영역에 존재하지 않는 추가 디설파이드 결합을 재생성하여, 서열번호 96 및 97에 따른 토끼/인간 항체 10236을 생성하였다.
Ab 10236 인간화된 이식편의 친화성 측정
아민 커플링 화학반응을 통해 대략 6000 RU의 수준으로 염소 항-인간 IgG Fc 특이적 항체(Jackson ImmunoResearch)를 CM5 센서 칩에 고정시켰다. 각각의 분석 주기는 상청액으로부터 항-KLK5 IgG를 항-Fc 표면에 포획하는 단계, KLK5 피분석물(사내에서 준비됨)을 30 ㎕/분으로 180초 동안 주입하는 단계, 및 이어서 600초 해리 단계로 구성되었다. 각각의 주기의 말기에서 50 mM HCl의 60초 주입에 이은 5 mM NaOH의 30초 주입 및 50 mM HCl의 최종 60초 주입을 이용하여 표면을 10 ㎕/분의 유속으로 재생시켰다. 최종 농도 300 mM의 NaCl로 보충된 HBS-EP+ 런닝 완충제(GE Healthcare®)로 상청액에 대해 인간 KLK5를 20 nM부터 0.08 nM까지(5 x 3배 연속 희석) 적정하였다. 기기 노이즈 및 드리프트를 차감하기 위해 완충제 블랭크 주입을 포함시켰다. Biacore T200 평가 소프트웨어(버전 3.0)를 사용하는 1:1 결합 모델을 이용하여 동역학 파라미터를 측정하였다. 실험을 25℃에서 수행하였다.
토끼/인간 키메라 항체는 어세이의 시작과 끝에서 분석되었고 우수한 정밀도를 보여주었다. 표 5에 요약된 바와 같이 모든 샘플들에 대해 고품질 데이터가 생성되었다.
Figure pct00038
표 5에 나타낸 바와 같이, Q24R/K 돌연변이가 있거나 없는 이식편 10236gL6gH12는 인간 KLK5에 대한 고친화성을 유지하였다.
인간화된 항체의 프로파일링
KLK5 선택성
토끼 항체 10236의 인간화가 다른 칼리크레인에 비해 KLK5 선택성을 변경하지 않고 친화성 또는 억제 활성을 감소시키지 않음을 확인하기 위해 일련의 조사를 수행하였다. 이어서, 정제된 항체를 실시예 4에 기재된 방법에 따라 스크리닝하여 KLK5에 대한 그의 억제 활성을 확인하였다. 항체를 600 nM 내지 20 pM 범위로 일련의 10점 절반 로그 희석물에 대해 시험하였다. 벡만 코울터 FXTM 및 멀티드롭 시스템을 이용하여 5 ㎕의 각각의 항체를 검정색 384웰 어세이 플레이트(CorningTM, 카탈로그 번호 3575)로 옮기고, 어세이 완충제 A(150 mM NaCl, 50 mM Tris, 200 μM EDTA, 0.5%(v/v) Tween-20, pH 7.6) 중의 선택된 활성 재조합 칼리크레인 효소 15 ㎕를 적절한 웰에 첨가하여 하기 최종 어세이 농도를 달성하였다: 60 pM 인간 KLK5(UCB), 250 pM KLK7(UCB), 500 pM KLK2(R&D SystemsTM), 30 pM KLK4(UCB), 30 pM cyno KLK5(UCB), 500 pM cyno KLK7, 30 pM 마우스 KLK5(UCB) 및 5 nM 마우스 KLK7(UCB). UCB에서 제조된 효소는 괄호 안에 표시되어 있고 상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조된다. 상업적으로 입수 가능한 효소의 공급원은 괄호 안에 표시되어 있다.
0% 활성을 위해 20 ㎕ 어세이 완충제 A만을 웰에 첨가하였다. LEKTI D5 토끼 Fc(상기 기재된 바와 같이 UCB에서 제조됨)를 억제 활성에 대한 기준물로서 사용하였고; 10236 항체의 경우 사용된 농도 범위와 동일한 농도 범위에서 5 ㎕의 LEKTI D5 토끼 Fc를 15 ㎕의 칼리크레인 효소에 첨가하였다. 5 ㎕의 어세이 완충제 A에 첨가된 15 ㎕의 인간 KLK5를 100% 활성 기준물로서 사용하였다.
항체 및 칼리크레인을 하룻밤 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 멀티드롭을 이용하여 하기 펩타이드 기질을 첨가하였다: 인간 KLK5(300 μM), 인간 KLK2(30 μM), 뮤린 KLK5(300 μM) 및 cyno KLK5(450 μM)의 경우 Boc-VPR-AMC(Cambridge Research Biochemicals™); 인간 및 cyno KLK7(각각 90 μM 및 150 μM)의 경우 KHLF-AMC(Cambridge Research Biochemicals™), 인간 KLK4(200 μM)의 경우 PFR-AMC(R&D Systems™), 및 뮤린 KLK7(150 μM)의 경우 Mca-RPKPVE-Nval-WRK(Dnp)-NH2(R&D SystemsTM). 샘플을 4시간 동안 인큐베이션하고 페라스타 FSX 플레이트 판독기(BMG LabtechTM)에서 Boc-VPR-AMC, PFR-AMC 및 KHLF-AMC에 대해 λex380 nm 및 λem430 nm에서 판독하고 Mca-RPKPVE-Nval-WRK(Dnp)-NH2에 대해 λex320 nm 및 λem400 nm에서 판독하였다. 데이터를 실시예 3에 기재된 바와 같이 분석하여 퍼센트 억제를 측정하였다. 데이터를 시험 항체의 농도에 대해 작도하고 4-파라미터 S자 곡선을 피팅하여 IC50을 측정하였다(Genedata ScreenerTM).
Ab 10236의 인간화된 이식편은 KLK5에 대한 특이적 억제 활성을 유지하였고 시험된 다른 KLK 패밀리 구성원의 억제를 거의 또는 전혀 보이지 않았다. Ab 10236 gL6gH12는 비인간화된 모 항체와 유사한 효능을 유지하는, 인간 및 cyno KLK5의 강력한 억제제이다(표 6, 각각의 값은 개별 측정치임). 인간 KLK2, KLK4 및 KLK7, cyno KLK7, 마우스 KLK5 또는 마우스 KLK7에 대한 활성이 없다는 것(즉, 실시예 2의 선택 기준에 따라 40% 역치 미만)은 분명하였다(도 8).
Figure pct00039
인간화된 항체 10236의 존재 하에서 LEKTI과 KLK5의 결합
실시예 5에 기재된 표면 플라즈몬 공명(SPR) 실험을 수행하여, 모 토끼 항체 10236에 대해 수행된 바와 같이 인간화된 항체 10236 gL6gH12와 복합체를 형성한 KLK5에 대한 LEKTI의 친화성을 측정하였다.
항-인간 Fc 칩 표면을 준비한 것을 제외하고 실시예 5에 기재된 실험 조건을 사용하였고, 결과를 표 6에서 보고한다.
모 토끼 10236 항체와 유사하게, LEKTI D5 Fab 융합 단백질은 인간 KLK5 단독보다 더 낮은 친화성으로, 항체 10236 gL6gH12와 이미 복합체를 형성한 KLK5에 결합할 수 있었다(표 7, 540 nM 대 40 pM).
Figure pct00040
KLK5-PAR2 세포 어세이
KLK5는 각질형성세포의 표면에서 프로테아제 활성화 수용체-2(PAR2) 수용체를 활성화시키는 것으로 밝혀졌다(K. Oikonomopoulou et al. Kallikrein-mediated cell signaling: targeting proteinase-activated receptors (PARs). Biol Chem, 387 (2006), pp. 817-824). 이것은 NFkB 유도 염증 캐스케이드 및 TSLP와 같은 관련 사이토카인의 방출을 야기한다.
PAR2는 Gq 커플링 G-단백질 커플링 수용체(GPCR)이기 때문에, 활성화는 포스포리파제 신호전달 및 이노시톨 모노포스페이트(IP-1)의 생성으로 이어진다. KLK5에의 노출에 의해 HaCat 각질형성세포에서 발현된 내생성 PAR2의 활성화를, 시스바이오(Cisbio)의 어세이 키트를 사용한 IP1의 검출로 모니터링하였다.
전면생장 HaCat 세포를 회수하고 10,000개 세포/웰로 384 플루오블록(Fluoblock) 플레이트(CorningTM)에 플레이팅하고 37℃ 및 5% CO2에서 하룻밤 동안 DMEM 배지 + 10% FBS + 2 mM L-글루타민 + Pen/Strep(Life TechnologiesTM)에서 배양한 후, IP-One Gq 어세이 프로토콜(CisbioTM)에 따라 처리하였다. 시험될 항체(항체 10236 gL6gH12 및 음성 인간 IgG4 A33)를 1x 자극 완충제 B(IP-One Gq 어세이 키트, CisbioTM)로 2 μM의 최고 농도부터 연속적으로 희석하고 200 nM 인간 KLK5의 존재 하에서 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 항체/KLK5 혼합물을 HaCat 세포에 첨가하고 시너지 네오(Synergy Neo) 플레이트 판독기에서 665 nM 및 620 nM에서 형광을 판독하는 IP-One Gq 어세이 프로토콜에 따라 이노시톨 1 포스페이트(IP1)를 검출하였다.
항체 10236 gL6gH12는 LEKTI D5 토끼 Fc 단백질에 대한 IP1 방출의 유사한 최대 억제를 보여주면서, KLK5로 처리된 HaCat 세포로부터의 IP1 방출을 거의 완전히 억제할 수 있었다(도 9).
항체 10236 작용 기작
억제 항체의 작용 기작을 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 비경쟁적 효소 억제제는 효소의 활성을 감소시키지만 기질의 존재 또는 부재 하에서 효소에 동등하게 잘 결합할 수 있다. 억제제와 기질은 둘 다 효소에 동시에 결합할 수 있으나, 생성물이 형성될 수 없어, 효소-기질-억제제 복합체만이 효소-기질 또는 효소-억제제 복합체로 분해될 수 있게 한다. 비경쟁적 억제제의 경우, 억제율은 기질 농도의 증가에 의해 영향을 받지 않을 것이다.
항체 10236 gL6gH12 또는 LEKTI D5 토끼 Fc 단백질을 어세이 완충제(150 mM NaCl, 50 mM Tris, 200 μM EDTA, 0.05%(v/v) Tween-20, pH 7.6)에서 인간 KLK5에 대한 IC50의 300배, 30배 또는 3배로 제조하였다. 10 ㎕의 항체 10236 gL6gH12를 코닝(Corning) 저결합 검정색 저플랜지 384웰 어세이 플레이트(Corning®)에 첨가하였다. 30 mM 내지 300 μM Boc-VPR-AMC(Cambridge Research Biochemicals™)의 5점 연속 희석물 10 ㎕를 상기 플레이트에 첨가하였다. 10 ㎕의 1.8 nM 인간 KLK5(Boc-VPR-AMC < 1 mM) 또는 180 pM KLK5(Boc-VPR-AMC > 1 mM)의 주입을 통해 페라스타 FSX 플레이트 판독기(BMG LabtechTM)를 이용하여 반응을 동시에 시작하고 30초마다 형광(λex380 nm λem430 nm)을 모니터링하였다. 최종 반응 조건은 인간 KLK5에 대해 측정된 IC50의 100배, 10배 또는 1배로 항체 10236 gL6gH12 또는 LEKTI D5 토끼 Fc 단백질, 10 mM 내지 100 μM의 연속 Boc-VPR-AMC 희석물 및 60 또는 600 pM 인간 KLK5를 함유하였다. 비억제 대조군을 설정하기 위해 항체를 어세이 완충제로 교체하였고 배경 대조군을 설정하기 위해 효소를 완충제로 교체하였다.
각각의 시점에서 배경 형광을 차감하고 시간에 대해 형광을 작도함으로써 데이터를 분석하였다. 데이터를 하기 방정식에 피팅하였다(GraphPad Prism®, GraphPad Software):
Figure pct00041
이것은 관찰된 시간 의존적 억제율인 k obs 가 측정될 수 있게 하였고, 이때 v i 는 초기 반응 속도이고 v s 는 최종 속도이다. 억제 기작을 확인하기 위해 k obs 에 대한 값을 기질 농도에 대해 작도하였다.
항체 10236 gL6gH12(도 10A) 및 토끼 항체 10236(도 10B)에 의한 인간 KLK5의 억제율은 기질 농도가 증가함에 따라 변하지 않는데, 이는 항체 10236 gL6gH12가 인간 KLK5의 비경쟁적 억제제임을 입증한다. 대조적으로, LEKTI D5 토끼 Fc 단백질은 기질 농도가 증가함에 따라 억제율의 감소를 보여줌으로써, 이것이 인간 KLK5의 경쟁적 억제제임을 입증한다.
실시예 9: 시험관내 피부 시스템 연구
인간 시험관내 전체 두께 피부 시스템 EpiDermFT(MatTekTM Corporation; Morizane, Shin et al. "Kallikrein expression and cathelicidin processing are independently controlled in keratinocytes by calcium, vitamin D(3), and retinoic acid." The Journal of investigative dermatology vol. 130,5 (2010): 1297-306. doi:10.1038/jid.2009.435)을 이용하여, 인간 KLK5에 대한 항체 10236 gL6gH12 IgG4P의 기능적 효과를 입증하였다.
비타민 D3 유사체인 MC903은 생체내에서 아토피성 피부염 유사 표현형을 유도하기 때문에 이를 사용하여 시험관내 피부 시스템을 처리하였다(Naidoo, Karmella et al. "Eosinophils Determine Dermal Thickening and Water Loss in an MC903 Model of Atopic Dermatitis." The Journal of investigative dermatology vol. 138,12 (2018): 2606-2616. doi:10.1016/j.jid.2018.06.168).
EpiDermFT™ 전체 두께 재구성된 피부 조직을 37℃ 및 5% CO2에서 하룻밤 동안 EFT-400-ASY 어세이 배지(MatTek Corporation™)로 평형화시켰다. 0일째 날, 배지를 웰로부터 제거하고 2.5 ㎖ EFT-400-ASY 배지로 교체하였다. 조직을 25 ㎕의 하기 물질로 국소 처리하였다: 배지 단독; 2 nmol의 최종 농도를 제공하도록 EFT-400-ASY 배지에 희석된 MC903(Tocris Bioscience®); 배지(2 nmol)에 희석된 MC903 + 10 ㎍/㎖ 항체 10236 gL6gH12 IgG4P 또는 hIgG4P 이소타입 대조군(사내 생성됨). 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 기본 배지를 매일 교체하고 국소 처리를 매일 적용하였다. 4일째 날에 실험을 중단하였다.
조직을 트랜스웰(Costar Snapwell™)로부터 제거하고 멸균 페트리 접시에서 메스를 사용하여 이등분하고 조직학적 분석을 위한 준비로 OCT 조직 포매 매트릭스(Cellpath™)에 넣었다. 헤마톡실린 및 에오신을 사용하여 구조적 무결성을 평가하기 위해 6 ㎛의 박편을 절단하고 염색하고, 면역형광으로 KLK5를 검출하고, 제자리 자이모그래피 어세이를 통해 프로테아제 활성을 평가하였다.
KLK5 면역형광 염색의 경우, 박편을 실온에서 10분 동안 공기 건조하고 PBS 중의 0.1% Tween 20으로 3회 세척하고 PBS로 1회 세척하였다. 그 다음, 박편을 PBS 중의 5% BSA로 10분 동안 차단하였다. PAP 펜을 사용하여 박편에 동그라미를 표시하고 가습 챔버 내에서 37℃에서 1시간 동안 10 ㎍/㎖의 마우스 항-huKLK5 항체(Abcam®)와 함께 인큐베이션하였다. 항체 인큐베이션 후, 박편을 다시 세척하고 10분 동안 4% PFA에 고정시켰다. 그 후, 박편을 가습 챔버 내에서 37℃에서 1시간 동안 2차 염소 항-마우스 IgG Alexa 546(Life Technologies®)과 함께 인큐베이션하였다. 박편을 세척하고 DAPI(Vector Labs™)를 함유하는 탑재 배지를 사용하여 탑재하였다. 형광 영상을 자이스 악시오 스캔(Zeiss Axio Scan)에서 20배 배율로 획득하였다.
제자리 자이모그래피의 경우, 박편을 실온에서 10분 동안 공기 건조하고 PBS 중의 2% tween으로 1회 세척하고 PBS로 3회 세척하였다. 그 다음, 박편을 가습 챔버 내에서 37℃에서 3시간 동안 10 ㎍/㎖의 카제인-BODIPY-FL 형광 기질(Invitrogen®)과 함께 인큐베이션하였다. 박편을 PBS로 3회 세척하고 DAPI(Vector Labs™)를 함유하는 탑재 배지를 사용하여 탑재하였다. 형광 영상을 자이스 악시오 스캔에서 20배 배율로 즉시 획득하였다.
항체 10236 gL6gH12 IgG4P를 사용한 경우와 사용하지 않은 경우 MC903 처리 후 조직 구조의 비교는 KLK 억제가 인간 피부 모델에서 각질층 파괴를 예방할 수 있음을 입증한다(도 11).
더욱이, KLK5 발현은 변경되지 않았을지라도, 항체 10236 gL6gH12 IgG4P로 처리된 피부 시스템에서 세린 프로테아제 활성은 감소하였다(데이터는 나타내지 않음).
실시예 10: 아토피성 피부염 샘플의 제자리 자이모그래피
중등도 내지 중증 아토피성 피부염 환자의 피부 펀치 생검(National Bioservice Russia)을 시험하여 항-KLK5 항체의 억제 효과를 평가하였다. 생검(4 mm)을 OCT 조직 포매 매트릭스(Cellpath™)에 포매하고 -80℃에서 저장하였다. 카제인-BODIPY-FL 대신에 형광 켄칭된 기질 [5-FAM]-FVNRSYPP-Lys(Dabcyl)-아미드를 20 μM 최종 어세이 농도로 사용하여 실시예 9에 이미 기재된 바와 같이 조직 박편을 절단하고(6 ㎛) 제자리 자이모그래피 분석에 사용하였다. 조직 박편에서 기질의 절단은 자이스 악시오 스캔TM에서 20배 배율로 형광 영상으로서 검출되는 형광을 생성한다.
각질층(표피의 최상층) 및 과립층(각질층 바로 아래)에서 실질적으로 감소된 흰색 염색에 의해 확인된 바와 같이, 데이터는 아토피성 피부염 조직 박편과 항체 10236 gL6gH12 IgG4P의 사전인큐베이션이 억제제 없이 처리된 박편에 비해 세린 프로테아제 활성 수준을 감소시킬 수 있음을 보여준다(도 12).
실시예 11: 인간화된 항체의 생물물리학적 특징규명
(IgG4P 및 IgG1 이소타입으로서) 10236 gL6gH12의 생물물리학적 성질을 측정하여 개발 가능성을 평가하였다. 이것은 열 안정성(Tm), 실험 pI, 겉보기 소수성, 용해도(PEG 침전 어세이) 및 AC-SINS에 의한 자체 상호작용(응집 성향)의 평가를 포함하였다.
추가로, 항체 10236 gL6N94D gH12 돌연변이체를 시험하여, 화학적 안정성, 즉 경쇄 CDR3에서 Asn(94)Ser 모티프(서열번호 15 참조)의 탈아미드화 성향을 평가하였다(표 8).
Figure pct00042
질량 분광측정에 의한 특징규명
Xevo® G2 Q-ToF 질량 분광측정기를 장착한 워터스(Waters) ACQUITY UPLC 시스템을 사용하여 LC-MS로 중쇄 및 경쇄의 온전한 질량을 측정함으로써 항체 10236 IgG1 및 IgG4P의 동일성을 확인하였다. 샘플(약 5 ㎍)을 37℃에서 40분 동안 150 mM 아세트산암모늄 중의 5 mM 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP)으로 환원시켰다. LC 컬럼은 80℃에서 유지되고 0.6 ㎖/분의 유속으로 95% 용매 A(물/0.02% 트리플루오로아세트산(TFA)/0.08% 포름산) 및 5% 용매 B(95% 아세토니트릴/5% 물/0.02% TFA/0.08% 포름산)에 의해 평형화된 워터스 BioResolveTM RP mAb 폴리페닐(450 Å, 2.7 μM)이었다. 단백질을 8.8분에 걸쳐 5% 내지 50% 용매 B의 구배로 용출한 후, 95% 용매 B로 세척하고 재평형화시켰다. UV 데이터를 280 nm에서 획득하였다. MS 조건은 다음과 같았다: 이온 모드: ESI 양이온, 해상 모드, 질량 범위: 400 내지 5000 m/z 및 NaI을 사용한 외부 보정. 워터스 MassLynxTM 및 MaxEnt 소프트웨어를 이용하여 데이터를 분석하였다.
온전한 질량 분광측정으로 판단하였을 때, 예상 분자 질량과 관찰 분자 질량 사이의 차이는 관찰되지 않았다(표 9).
Figure pct00043
열 안정성(Tm) 측정
열 이동 어세이를 이용하여 융점(Tm) 또는 언폴딩 중간점의 온도를 측정하였다.
이 어세이를 위해, 온도가 증가함에 따라 노출되게 되는 소수성 영역에 결합하는 형광 염료 SYPRO® 오랜지를 사용하여 단백질 언폴딩 과정을 모니터링하였다. 반응 혼합물은 시험 완충제로 5000배 농축물로부터 희석한 5 ㎕의 30x SYPRO® 오랜지 단백질 겔 염료(Thermofisher science, S6651)를 함유하였다. PBS(pH 7.4), 또는 50 mM 아세트산나트륨 및 125 mM 염화나트륨(pH 5.0) 중의 0.2 mg/㎖ 샘플 45 ㎕를 염료에 첨가하고 혼합하였다(통상의 예비제제화 완충제임). 10 ㎕의 이 용액을 384 PCR 광학 웰 플레이트에 4중으로 분배하고 퀀트스튜디오(QuantStudio) 7 실시간 PCR 시스템(Thermofisher™)에서 런닝시켰다. PCR 시스템 가열 장치를 20℃로 설정하고 1.1℃/분의 속도로 99℃까지 증가시켰다. 전하 커플링 장치는 웰의 형광 변화를 모니터링하였다. 형광 강도 증가를 작도하고, 기울기(들)의 변곡점을 사용하여 겉보기 중간점 온도(Tm)를 생성하였다. 데이터는 표 10에 제시되어 있다.
10236gL6gH12(IgG4P)에 대해 2개의 언폴딩 전이가 관찰되었다. 첫 번째는 CH2 도메인에 기인할 수 있고 두 번째는 Fab 언폴딩 도메인 및 CH3 도메인의 평균 Tm에 기인할 수 있다. IgG1 분자의 경우, CH2 및 Fab 도메인의 평균 Tm에 기인하는 하나의 언폴딩 도메인이 관찰되었다. 이것은 문헌(Garber E. Demerest SJ. Biochem Biophys Res Commun. 2007 Apr;355(3):751-7)과 일치한다.
Figure pct00044
실험적 등전점(pI) 측정
iCE3TM 전체 모세관 영상화된 모세관 등전 집속(cIEF) 시스템(ProteinSimple)을 이용하여 pI를 실험적으로 측정하였다. 하기 성분들을 혼합하여 샘플을 제조하였다: 30 ㎕ 샘플(HPLC 등급 물 중의 1 mg/㎖ 스톡으로부터), 35 ㎕의 1% 메틸셀룰로스 용액(ProteinSimple, 101876), 4 ㎕의 pH 3 내지 10 약제(ProteinSimple, 042-848), 0.5 ㎕의 4.65 합성 pI 마커 및 0.5 ㎕의 9.77 합성 pI 마커(ProteinSimple, 102223 및 102219), 및 12.5 ㎕의 8 M 우레아 용액(Sigma Aldrich®). HPLC 등급 물을 사용하여 최종 부피를 100 ㎕로 만들었다. 1.5 kV에서 1분 동안 샘플에 초점을 맞춘 다음 3 kV에서 5분 동안 초점을 맞추고, 프로테인 심플(Protein Simple) 소프트웨어를 사용하여 모세관의 280 nm 영상을 촬영하였다. iCE3 소프트웨어를 사용하여 생성된 전기영동도를 분석하였고 pI 값을 할당하였다(pI 마커들 사이의 선형 관계). 데이터는 표 11에 요약되어 있다.
10236gL6gH12(hIgG4P)의 pI는 상응하는 IgG1 분자보다 더 낮은 것으로 밝혀졌다. 어느 분자의 경우에도 개발 가능성/제조 문제가 없을 것으로 예상되고, pI는 제제화에 일반적으로 사용되는 완충제의 pI(약 pH 5)보다 더 높다.
Figure pct00045
소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)
소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)는 소수성이 증가하는 순서로 분자를 분리한다. 분자는 고농도의 극성 염의 존재 하에서 소수성 고정상에 결합하고 염의 농도가 감소함에 따라 이동상 내로 탈착된다. 더 긴 체류 시간은 더 큰 소수성에 해당한다.
2 mg/㎖에서 10236 gL6gH12의 두 가지 이소타입(IgG4P 및 IgG1)을 1.6 M 황산암모늄 및 PBS(pH 7.4)로 1:2 희석하였다. 10 ㎍(10 ㎕)의 샘플을, 형광 검출기를 가진 아질런트(Agilent) 1200 이원 HPLC에 직렬로 연결된 디오넥스(Dionex) ProPac™ HIC-10 컬럼(100 mm x 4.6 mm)에 주입하였다. 고유 형광(여기 및 방출 파장, 각각 280 nm 및 340 nm)으로 분리를 모니터링하였다. 완충제 A(0.8 M 황산암모늄, 100 mM 포스페이트, pH 7.4) 및 완충제 B(100 mM 포스페이트, pH 7.4)를 사용하는 하기 구배 용출을 이용하여 샘플을 분석하였다: (i) 0% B에서 2분 유지, (ii) 30분 이내에 0% 내지 100% B의 선형 구배(0.8 ㎖/분), (iii) 컬럼을 2분 동안 100% B로 세척하고 다음 샘플 주입 전에 10분 동안 0% B로 재평형화시켰다. 컬럼 온도를 20℃로 유지하였다. 체류 시간(분)은 표 12에 표시되어 있다.
Figure pct00046
두 분자들 사이에 체류 시간의 작은 차이가 있었는데, 이때 10236 gL6gH12(IgG4P)는 상응하는 IgG1 포맷보다 약간 더 큰 겉보기 소수성을 보였다. 두 분자들은 다른 시판되는 항체의 결과에 기반할 때 평균적으로 응집하는 성향을 가질 것으로 예상된다(Jain et al "Biophysical properties of theclinical-stage antibody landscape" Proc Natl Acad Sci U S A. 2017 Jan 31;114(5):944-949. doi: 10.1073/pnas.1616408114. Epub 2017 Jan 17).
폴리에틸렌 글리콜(PEG) 측정을 이용한 용해도 측정
폴리에틸렌 글리콜(PEG) 침전의 효과를 조사함으로써 콜로이드 안정성(용해도)의 이해를 도출할 수 있다. PEG의 농도(w/v)를 증가시키고 용액에 남아있는 단백질의 양을 측정함으로써 정량적으로 정의 가능한 방식으로 단백질 용해도를 감소시키기 위해 PEG를 사용하였다. 이 어세이는 통상적인 농축 방법을 이용하지 않으면서 고농도 용해도의 효과를 모방하는 역할을 한다.
PBS(pH 7.4); 50 mM 아세트산나트륨, 125 mM 염화나트륨 pH 5.0(통상의 예비제제화 저장 완충제); 및 50 mM 히스티딘, 250 mM 프롤린 pH 5.5(통상의 제제화 완충제)로 스톡 40% PEG 3350(Merck, 202444) 용액(w/v)을 제조하였다. 어시스트 플러스(Assist Plus) 액체 처리 로봇(INTEGRA, 4505)으로 연속 적정을 수행하여, 40% 내지 15.4% 범위의 PEG 3350을 생성하였다. 비-평형 침전을 최소화하기 위해, 샘플 제조는 1:1 부피 비로 단백질과 PEG 용액을 혼합하는 단계로 구성되었다. 액체 처리 로봇으로 35 ㎕의 PEG 3350 스톡 용액을 96웰 v 바닥 PCR 플레이트(A1 내지 H1)에 첨가하였다. 35 ㎕의 2 mg/㎖ 샘플 용액을 PEG 스톡 용액에 첨가하여, 1 mg/㎖ 시험 농도를 생성하였다. 이 용액을 자동화된 느린 반복 피펫팅으로 혼합하고 37℃에서 0.5시간 동안 인큐베이션하여, 임의의 비-평형 응집체를 재용해하였다. 그 다음, 샘플을 20℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 샘플 플레이트를 20℃에서 1시간 동안 4000 x g로 원심분리하였다. 50 ㎕의 상청액을 UV-Star®, 절반 면적, 96웰, μClear®, 마이크로플레이트(Greiner, 675801)에 분배하였다. FLUOstar® Omega 다중검출 마이크로플레이트 판독기(BMG LABTECH)를 이용하여 280 nm에서 UV 분광광도측정으로 단백질 농도를 측정하였다. 그래프패드 프리즘(Graphpad prism) 버전 7.04를 이용하여 결과 값을 작도하고, S자형 용량 반응(가변 기울기) 피팅의 중간점으로부터 PEG 중간점(PEGmdpnt) 점수를 유도하였다.
데이터는 표 13에 제시되어 있다. PEG 중간점(%)이 높을수록; 고농도 안정성/용해도에 대한 가능성이 커진다.
완충제 조건에 따라 두 이소타입 사이에 차이가 관찰되었다. PBS pH 7.4에서, 10236gL6gH12(IgG4P)는 10236gL6gH12(IgG1)보다 더 큰 용해도를 보인 반면; 50 mM 아세트산나트륨, 125 mM 염화나트륨 pH 5에서는 그 반대 결과가 관찰되었다. 10236gL6gH12(IgG4P)의 용해도는 더 전형적인 제제화 완충제, 즉 50 mM 히스티딘, 250 mM 프롤린 pH 5.5를 사용함으로써 개선될 수 있다.
Figure pct00047
AC-SINS(친화성 포획 자체 상호작용 나노입자 분광법)를 이용한 자체 상호작용의 평가
AC-SINS 어세이(Liu Y. MAbs. 2014 Mar-Apr;6(2):483-92)를 이용하여, 자체 상호작용 성향을 확인하여 잠재적인 응집 안정성에 대한 정보를 제공함으로써 10236gL6gH12의 개발 가능성을 평가하였다. 이것을 PBS pH 7.4에서 수행하였다.
염소 항-인간-Fcγ 특이적 포획 항체(Jackson ImmunoResearch)를 20 mM 아세트산나트륨(pH 4.3)으로 완충제 교환하고 0.4 mg/㎖까지 희석하고 50 ㎕를 450 ㎕의 시트레이트 안정화된 20 nm 금 나노입자(TedPella, USA)에 첨가하고 실온에서 하룻밤 동안 방치하였다. 접합된 나노입자를 55 ㎕의 PEG-티올로 1시간 동안 차단하고, 21,000 x g에서 6분 동안 원심분리하고, 상청액을 제거하고 최종 부피 150 ㎕까지 20 mM 아세트산나트륨(pH 4.3)에 재현탁하였다.
10236gL6gH12(IgG4P 및 IgG1)를 PBS(pH 7.4)(200 ㎕)로 22 ㎍/㎖까지 희석하고 동등한 부피의 비특이적 전체 IgG(Jackson ImmunoResearch)에 첨가하고 잠시 볼텍싱하고 72 ㎕를 96웰 플레이트에 첨가하였다. 8 ㎕의 나노입자를 각각의 웰에 첨가하였다(n = 4). 500 내지 600 nm에서 BMG 플레이트 판독기에서 흡광도를 판독하고 로렌지안(Lorenzian) 곡선(RShiny)에 피팅하고 PBS만을 샘플로부터 차감하여 Δλmax를 제공하였다. 데이터는 표 14에 요약되어 있다.
IgG4P 및 IgG1 이소타입으로서 10236gL6gH12는 낮은 λmax 및 Δλmax(PBS 배경으로부터)를 보여주었는데, 이것은 PBS(pH 7.4)에서 자체 상호작용 성향이 낮고 응집 위험이 낮음을 암시한다.
Figure pct00048
Asn(94)(경쇄 CDR3)에서 탈아미드화 성향을 평가하기 위한 가속화된 응력 연구
탈아미드화 모티프 Asn(94)Ser은 10236gL6gH12의 경쇄 CDR3에 존재한다. 탈아미드화 성향/속도는 1차 서열 및 3D 구조뿐만 아니라 용액 성질에도 의존하기 때문에 예측될 수 없다(R. C. Stephenson and S. Clarke (1989); K. Diepold et al (2012); Jasmin F. Sydow et al (2014); N.E Robinson et al (2004)). 따라서, Asn(94)에서 10236 gL6gH12의 탈아미드화 성향을 측정하기 위해 가속화된 응력 연구를 설정하였다. 10236gL6gH12(IgG4P)에 대해서만 이것을 수행하였고; 탈아미드화 모티프가 가변 영역에 존재하기 때문에 IgG1에 대한 탈아미드화 속도는 동일할 것으로 추정되었다.
기본 탈아미드화 수준(응력이 없는 샘플)도 측정하였고; 낮은 수준은 탈아미드화에 대한 낮은 감수성을 표시하나, 이것은 상이한 제조 배치/조건으로 인해 달라질 수 있다.
항체 10236 gL6gH12(IgG4P)를 (i) Asn(N) 잔기(37℃에서 Tris pH 8.0/125 mM NaCl)의 탈아미드화에 유리한 것으로 알려진 조건 및 (ii) 대조군 완충제(37℃에서 아세테이트, pH 5.0/125 mM NaCl)로 완충제 교환하였다. 각각의 완충제 중의 최종 샘플 농도는 pH 8.0에서 5.9 mg/㎖이었고 pH 5.0에서 6.6 mg/㎖이었으며, 그 후 이들을 2개의 분취액으로 분할하였고, 최대 2주 동안 하나의 분취액을 4℃에서 저장하고 나머지 하나의 분취액을 37℃에서 저장하였다. 분취액을 즉시(T0) 및 2주에서 제거하고 -20℃에서 저장하였다.
-20℃에서 PBS(pH 7.4)에 저장된 스톡 샘플을 분석함으로써 기본 탈아미드화를 수득하였다.
모든 샘플들을 해동하고 하기 방법을 이용하여 질량 분광측정(MS)을 이용한 펩타이드 맵핑으로 분석하였다:
응력을 받은 단백질의 샘플을 TCEP로 환원시키고 0.1% w/v RapigestTM 세제를 함유하는 Tris-HCL 완충제(pH 8.0) 중의 클로로아세트산으로 알킬화하였다. 트립신/LysC 혼합물을 첨가하고(1:50 w/w) 샘플을 37℃에서 1시간 동안 분해한 후, 키모트립신(1:50 w/w)을 첨가하고 분해를 실온에서 하룻밤 동안 계속하였다. 포름산을 1% v/v로 첨가하여 단백질분해를 중단하고 샘플을 0.5 mg/㎖까지 희석한 후 원심분리하여 침전된 RapigestTM를 제거하였다. 생성된 펩타이드 풀을 분리하고, CID 단편화와 함께 양이온, 데이터 의존적 오비트랩-오비트랩 방법을 실행하는 써모 퓨전(Thermo Fusion) 질량 분광측정기에 접속된 워터스 BEH C18 컬럼에서 분석하였다. 써모 XcaliburTM 및 PepfinderTM 소프트웨어를 이용하여 LC-MS 데이터를 분석하였다.
KLK5 10236 L-CDR3의 기본 탈아미드화 수준은 Asn94에서 0.7%이었다(PepfinderTM를 사용하여 계산함). 이것은 2주 동안 Tris(pH 8.0)에서 37℃에서 인큐베이션된 샘플의 경우 최대 10%까지 증가하였다(도 13).
탈아미드화 성향은 낮았고 제조, 저장 및 제제화 동안 높은 pH 완충제의 사용을 최소화함으로써 제어될 수 있었다.
완전히 탈아미드화된 생성물의 친화성 측정: 10236 gL6-N94DgH12(경쇄 CDR3에서 DS로의 NS의 돌연변이)
10236gL6gH12의 경쇄를 돌연변이시켜 Asn94를 Asp로 교체함으로써(Asn94Asp), 10236gL6gH12의 완전히 탈아미드화된 생성물에 대한 대용 분자를 생성하였다.
인간 KLK5에 대한 항체 10236gL6gH12 및 10236gL6-N94DgH12의 결합 동역학을 25℃에서 표면 플라즈몬 공명(Biacore T200, GE Life SciencesTM)으로 평가하여 100% 탈아미드화의 영향을 평가하였다.
아민 커플링 화학반응을 통해 대략 6000 RU의 수준으로 염소 항-인간 IgG Fc 특이적 항체(Jackson ImmunoResearch)를 CM5 센서 칩에 고정시켰다. 각각의 분석 주기는 항-KLK5 IgG 분자를 항-Fc 표면에 포획하는 단계, KLK5 피분석물(사내 준비됨)을 30 ㎕/분으로 300초 동안 주입하는 단계, 및 이어서 600초 해리 단계로 구성되었다. 각각의 주기의 말기에서 50 mM HCl의 60초 주입에 이은 5 mM NaOH의 30초 주입 및 50 mM HCl의 최종 60초 주입을 이용하여 표면을 10 ㎕/분의 유속으로 재생시켰다. 최종 농도 300 mM의 NaCl로 보충된 HBS-EP+ 런닝 완충제(GE Healthcare)로 인간 KLK5를 20 nM부터 0.03 nM까지(6 x 3배 연속 희석) 적정하였다. 기기 노이즈 및 드리프트를 차감하기 위해 완충제 블랭크 주입을 포함시켰다. Biacore T200 평가 소프트웨어(버전 3.0)를 사용하는 1:1 결합 모델을 이용하여 동역학 파라미터를 측정하였다. 데이터는 표 15에 요약되어 있다.
실험 재현 가능성을 입증하기 위해, 2회의 10236gL6gH12 반복실험을 포함시켰다. 경쇄 CDR3의 Asn94Asp 돌연변이는 KLK5에 대한 친화성을 4.5배 감소시켰다.
따라서, 광범위한 탈아미드화는 제조, 저장 및 제제화 조건이 모니터링되지 않고 제어되지 않는 경우 10236gL6gH12의 효능에 영향을 미칠 수 있다. 가속화된 응력 실험은 Asn94 잔기에서 탈아미드화에 대한 낮은 성향을 표시하였므로 분자로부터 위험을 제거하였다.
Figure pct00049
항체 10236 gL6gH12(hIgG4P)에 대한 상이한 농도에서의 점도 평가
높은 항체 농도에서 낮은 점도는 치료 분자의 피하 투여에 중요하다. 통상의 예비제제화 완충제인 50 mM 히스티딘/250 mM 프롤린 pH 5.5에서 항체 10236 gL6gH12의 농도가 증가할 때 점도를 측정하여 그의 점도 거동을 조사하였다.
연구는 (i) 샘플의 초기 농도 및 (ii) 아래에 상세히 기재된 점도 측정에 의해 수행되었다.
(i) 농도
20℃에서 4000 x g로 Vivaspin® 20(MWCO 30 kD) 원심분리 필터(Z14637, Sigma-Aldrich)를 사용하여 총 23 ㎖의 항체 10236 gL6gH12(hIgG4P)를 회전 농축함으로써, 체류물 부피가 대략 950 ㎕일 때까지 항체를 농축하였다. 체류물 용액을 회수하고 NanoDropTM 1000 기기를 이용하여 280 nm에서의 UV 흡광도 및 1.46 ㎖/(mg cm)의 흡광 계수를 사용하여 항체 10236 gL6gH12(hIgG4P)의 최종 농도를 측정하였다. 농축된 샘플은 이론적인 농도의 84% 회수를 제공하는 185 mg/㎖(3회 반복실험의 평균)인 것으로 확인되었다. 손실은 이 방법에 대한 예상 범위 내에 있었다.
이어서, 50 mM 히스티딘, 250 mM 프롤린 pH 5.5를 사용하여 항체 샘플을 희석함으로써, 점도 측정에 적합한 농도 범위를 제공하였다. 희석된 샘플 농도는 280 nm에서 UV 흡광도 측정에 의해 159.8 mg/㎖, 63.6 mg/㎖ 및 33.2 mg/㎖인 것으로 확인되었다.
(ii) 점도 측정
온도 제어를 위한 펠티에르(Peltier) 플레이트 및 액체 냉각 시스템, 및 측정을 위한 20 mm 스테인리스강 평행 플레이트 기하구조를 갖춘 디스커버리 하이브리드 유동계(Discovery Hybrid Rheometer)-1(DHR-1, TA Instruments)을 이용하여 각각의 농도에서 점도를 측정하였다. 다양한 농도(33.2 mg/㎖, 63.6 mg/㎖ 및 159.8 mg/㎖)의 샘플(80 ㎕)을 펠티에르 플레이트의 중앙에 놓고 전단 속도를 2.87918 s-1부터 287.918 s-1까지 변화시키면서 20℃에서 정상 상태 유동 스위프(sweep) 절차 설정을 이용하여 점도(mPa·s 또는 cP)를 측정하였다. 각각의 전단 속도 점에서의 값이 일정하였을 때(SD±5%) 측정된 점도의 평균을 산출하였다. 상이한 농도에서 10236 gL6gH12(IgG4P)의 점도는 표 16에 요약되어 있다.
항체 10236 gL6gH12(hIgG4P)의 경우 농도와 점도 계수 사이에 증가하는 성향이 관찰되었다. 점도는 33.2 mg/㎖ 내지 159.8 mg/㎖의 농도 범위에서 2.8 cP부터 6.4 cP까지 증가하였다. 모든 이 샘플들은 다양한 전단 속도에서 일정한 점도 계수(5% 미만의 가변성)를 보여주었다. 이 연구는 항체 10236 gL6gH12(hIgG4P)가 50 mM 히스티딘/250 mM 프롤린 pH 5.5에서 고농도(약 150 mg/㎖)에서 낮은 점도를 나타내므로, 피하 투여에 적합한 것으로 생각될 수 있음을 보여주었다.
Figure pct00050
SEQUENCE LISTING <110> UCB Biopharma SRL <120> ANTIBODIES AGAINST KLK5 <130> PF0196-WO <150> GB2001447.8 <151> 2020-02-03 <160> 104 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L1 <400> 1 Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala 1 5 10 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L2 <400> 2 Leu Ala Ser Thr Leu Ala Ser 1 5 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L3 <400> 3 Gln Gln Gly Tyr Thr Asn Ser Asn Ile Ile Asn Thr 1 5 10 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H1 <400> 4 Gly Phe Pro Leu Ser Asn Tyr Ala Met Ser 1 5 10 <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H2 <400> 5 Asp Ile Tyr Pro Ser Asp Ile Ile Asp Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 1 5 10 15 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H3 <400> 6 Asp Asn Asn Asp Tyr Gly Leu Asp Ile 1 5 <210> 7 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rabbit VL <400> 7 Ala Tyr Asp Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Val Ala Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Leu Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Lys Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Glu Cys 65 70 75 80 Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Thr Asn Ser Asn 85 90 95 Ile Ile Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 100 105 110 <210> 8 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rabbit VL nucl. <400> 8 gcctatgata tgacccagac tccagcctct gtggaggtag ctgtgggagg cacagtcacc 60 atcaagtgcc aggccagtca gagcattagc agttggttag cctggtatca gcagaaacca 120 ggtcagcctc ccaagctcct gatctatctg gcatccactc tggcatctgg ggtctcatcg 180 cggttcaaag gcagtggatc tgggacacag ttcactctca ccatcagcgg cgtggagtgt 240 gccgatgctg ccacttacta ctgtcaacag ggttatacta atagtaatat tattaatact 300 ttcggcggag ggaccgaggt ggtggtcaaa cgtacg 336 <210> 9 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rabbit VH <400> 9 Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Pro Leu Ser Asn Tyr Ala 20 25 30 Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Asp Ile Tyr Pro Ser Asp Ile Ile Asp Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Gln Thr Ser Thr Thr Val Glu Leu Lys Ile Thr 65 70 75 80 Gly Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Asn 85 90 95 Asn Asp Tyr Gly Leu Asp Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val 100 105 110 Ser Ser <210> 10 <211> 342 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rabbit VH nucl. <400> 10 cagtcggtgg aggagtccgg gggtcgcctg gtcacgcctg ggacacccct gacactcacc 60 tgcaccgtct ctgggttccc cctcagtaat tatgcaatga gctgggtccg ccaggctcca 120 gggaaggggc tggaatggat cggagacatt tatcctagtg atatcataga ctacgcgagc 180 tgggcgaaag gccgattcac catctcccaa acctcgacca cggtggagct gaaaatcacg 240 ggtccgacaa ccgaggacac ggccacctat ttctgtgcca gagacaacaa tgactatggt 300 ctggacatct ggggcccagg caccctggtc accgtctcga gt 342 <210> 11 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 10236 gL5 VL <400> 11 Ala Tyr Asp Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Leu Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Thr Asn Ser Asn 85 90 95 Ile Ile Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 12 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 10236 gL5 VL nucl. <400> 12 gcctacgaca tgactcagtc cccatcctcc ctgtccgcat ccgtggggga tagagtcacc 60 atcacctgtc aagccagcca gtcaattagc tcgtggctgg cctggtatca gcagaagccg 120 ggaaaggctc ccaagttgct gatctacctg gcctcaacgc tcgcgtcggg agtgcctagc 180 cgctttaagg gttccggatc tggcaccgac ttcactctca ccatttcgag ccttcaaccg 240 gaggacttcg ccacttacta ctgccagcag ggttacacca actccaacat catcaacacc 300 ttcggcggag ggaccaaagt ggaaatcaag cgtacg 336 <210> 13 <211> 217 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 10236 gL5 Light Chain <400> 13 Ala Tyr Asp Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Leu Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Thr Asn Ser Asn 85 90 95 Ile Ile Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 110 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 115 120 125 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 130 135 140 Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 145 150 155 160 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 165 170 175 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 180 185 190 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 195 200 205 Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 14 <211> 657 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 10236 gL5 Light chain nucl. <400> 14 gcctacgaca tgactcagtc cccatcctcc ctgtccgcat ccgtggggga tagagtcacc 60 atcacctgtc aagccagcca gtcaattagc tcgtggctgg cctggtatca gcagaagccg 120 ggaaaggctc ccaagttgct gatctacctg gcctcaacgc tcgcgtcggg agtgcctagc 180 cgctttaagg gttccggatc tggcaccgac ttcactctca ccatttcgag ccttcaaccg 240 gaggacttcg ccacttacta ctgccagcag ggttacacca actccaacat catcaacacc 300 ttcggcggag ggaccaaagt ggaaatcaag cgtacgcgta cggtggccgc tccctccgtg 360 ttcatcttcc caccctccga cgagcagctg aagtccggca ccgcctccgt cgtgtgcctg 420 ctgaacaact tctacccccg cgaggccaag gtgcagtgga aggtggacaa cgccctgcag 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cctgctgaac 420 aacttctacc cccgcgaggc caaggtgcag tggaaggtgg acaacgccct gcagtccggc 480 aactcccagg aatccgtcac cgagcaggac tccaaggaca gcacctactc cctgtcctcc 540 accctgaccc tgtccaaggc cgactacgag aagcacaagg tgtacgcctg cgaagtgacc 600 caccagggcc tgtccagccc cgtgaccaag tccttcaacc ggggcgagtg c 651 <210> 19 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 10236 gL7 VL <400> 19 Ala Ile Asp Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Leu Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Thr Asn Ser Asn 85 90 95 Ile Ile Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 20 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 10236 gL7 VL nucl. <400> 20 gcgatcgaca tgactcagag cccgtccagc ctgtccgcgt ccgtgggaga tcgcgtgact 60 atcacgtgtc aggcctcaca atccattagc tcctggctgg cctggtacca gcagaagcca 120 gggaaggctc cgaagctgct gatctacctg gcctccaccc ttgcctccgg cgtgccttca 180 cggttttctg gatccggctc gggaaccgac ttcaccctca ccatctcgtc gctccaaccc 240 gaggacttcg caacctacta ctgccaacag gggtatacca acagcaacat catcaacacc 300 ttcggtggcg gaactaaggt cgaaatcaag 330 <210> 21 <211> 217 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 10236 gL7 Light Chain <400> 21 Ala Ile Asp Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Leu Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Thr Asn Ser Asn 85 90 95 Ile Ile Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 110 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 115 120 125 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 130 135 140 Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 145 150 155 160 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 165 170 175 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 180 185 190 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 195 200 205 Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 22 <211> 645 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 10236 gL7 Light Chain nucl. <400> 22 gcgatcgaca tgactcagag cccgtccagc ctgtccgcgt ccgtgggaga tcgcgtgact 60 atcacgtgtc aggcctcaca atccattagc tcctggctgg cctggtacca gcagaagcca 120 gggaaggctc cgaagctgct gatctacctg gcctccaccc ttgcctccgg cgtgccttca 180 cggttttctg gatccggctc gggaaccgac ttcaccctca ccatctcgtc gctccaaccc 240 gaggacttcg caacctacta ctgccaacag gggtatacca acagcaacat catcaacacc 300 ttcggtggcg gaactaaggt cgaaatcaag gtggccgctc 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gcccagagag gaacagttca actccaccta ccgggtggtg 900 tccgtgctga ccgtgctgca ccaggactgg ctgaacggca aagagtacaa gtgcaaggtg 960 tccaacaagg gcctgccctc cagcatcgaa aagaccatct ccaaggccaa gggccagccc 1020 cgcgagcccc aggtgtacac cctgccccct agccaggaag agatgaccaa gaaccaggtg 1080 tccctgacct gtctggtcaa gggcttctac ccctccgaca ttgccgtgga atgggagtcc 1140 aacggccagc ccgagaacaa ctacaagacc accccccctg tgctggacag cgacggctcc 1200 ttcttcctgt actctcggct gaccgtggac aagtcccggt ggcaggaagg caacgtcttc 1260 tcctgctccg tgatgcacga ggccctgcac aaccactaca cccagaagtc cctgtccctg 1320 agcctgggca ag 1332 <210> 47 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human IGKV1-6 JK4 acceptor framework <400> 47 Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp 20 25 30 Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 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210 215 <210> 91 <211> 648 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 10273 Light Chain Fab nucl. <400> 91 gcagtcgtgc tgactcagac accatcaccc atgtctgcag ctgtgggagg cacagtcacc 60 atcagttgcc agtccagtca gagtgtttat aataataacg acttagcctg gtatcagcag 120 aaaccagggc agcctcctaa gctcctgatc tacagggcat ccactctggc atctggggtc 180 ccgtcgcggt tcagcggcag tggatctggg acacagttca ctctcaccat cagcggcgtg 240 cagtgtgacg atgctgccac ttactactgt ctaggcggtt atgatgatga tgttgatacg 300 tatactttcg gcggagggac cgaggtggtg gtcaaacgta cgccagttgc acctactgtc 360 ctcatcttcc caccagctgc tgatcaggtg gcaactggaa cagtcaccat cgtgtgtgtg 420 gcgaataaat actttcccga tgtcaccgtc acctgggagg tggatggcac cacccaaaca 480 actggcatcg agaacagtaa aacaccgcag aattctgcag attgtaccta caacctcagc 540 agcactctga cactgaccag cacacagtac aacagccaca aagagtacac ctgcaaggtg 600 acccagggca cgacctcagt cgtccagagc ttcaataggg gtgactgt 648 <210> 92 <211> 228 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 10273 Heavy Chain Fab <400> 92 Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Gly 20 25 30 Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Ile Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Ala 65 70 75 80 Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Asp His 85 90 95 Ile Tyr Arg Tyr Asp Asp Tyr Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Tyr Gly Met 100 105 110 Asp Pro Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gln Pro 115 120 125 Lys Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Cys Gly Asp Thr Pro 130 135 140 Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Leu Pro Glu 145 150 155 160 Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Thr Leu Thr Asn Gly Val Arg 165 170 175 Thr Phe Pro Ser Val Arg Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 180 185 190 Val Val Ser Val Thr Ser Ser Ser Gln Pro Val Thr Cys Asn Val Ala 195 200 205 His Pro Ala Thr Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Ala Pro Ser Thr 210 215 220 Cys Ser Lys Pro 225 <210> 93 <211> 684 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 10273 Heavy Chain Fab nucl. <400> 93 cagtcggtgg aggagtccgg gggtcgcctg gtcacgcctg ggacacccct gacactcacc 60 tgcacagtct ctggattctc cctcagtagc tatggaatga gctgggtccg ccaggctcca 120 gggaaggggc tggaatggat cggaattatt agtagtagtg gtagcacata ctacgcgagc 180 tgggcgaaag gccgattcac catctccaag acctcgacca cggtggatct gaaaatcgcc 240 agtccgacaa ccgaggacac ggccacctat ttctgtgcca gagatcacat ttataggtac 300 gatgactatg gtgattaccc tacctactac ggcatggacc cctggggccc aggcaccctg 360 gtcaccgtct cgagtgggca acctaaggct ccatcagtct tcccactggc cccctgctgc 420 ggggacacac ccagctccac ggtgaccctg ggctgcctgg tcaaaggcta cctcccggag 480 ccagtgaccg tgacctggaa ctcgggcacc ctcaccaatg gggtacgcac cttcccgtcc 540 gtccggcagt cctcaggcct ctactcgctg agcagcgtgg tgagcgtgac ctcaagcagc 600 cagcccgtca cctgcaacgt ggcccaccca gccaccaaca ccaaagtgga caagaccgtt 660 gcgccctcga catgcagcaa gccc 684 <210> 94 <211> 316 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human LEKTI D5 Fab H chain <400> 94 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 65 70 75 80 Gly Gly Gly Ser Arg Glu Ile Val Lys Leu Cys Ser Gln Tyr Gln Asn 85 90 95 Gln Ala Lys Asn Gly Ile Leu Phe Cys Thr Arg Glu Asn Asp Pro Ile 100 105 110 Arg Gly Pro Asp Gly Lys Met His Gly Asn Leu Cys Ser Met Cys Gln 115 120 125 Ala Tyr Phe Gln Ala Glu Asn Glu Glu Lys Lys Lys Ala Glu Ala Arg 130 135 140 Ala Arg Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Lys Asn Thr Val 145 150 155 160 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 165 170 175 Cys Ala Arg Thr Val Pro Gly Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu 180 185 190 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 195 200 205 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 210 215 220 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 225 230 235 240 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 245 250 255 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 260 265 270 Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val 275 280 285 Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys 290 295 300 Ser Cys His His His His His His His His His His 305 310 315 <210> 95 <211> 217 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human LEKTI D5 Fab L chain <400> 95 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Pro Ser Val Trp Ser Asn 20 25 30 Phe Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Glu Ala Ser Lys Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Ile 85 90 95 Ser Asp Thr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 110 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 115 120 125 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 130 135 140 Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 145 150 155 160 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 165 170 175 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 180 185 190 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 195 200 205 Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 96 <211> 217 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rabbit/human chimeric chain (hCK S171C) 10236 <400> 96 Ala Tyr Asp Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Val Ala Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Leu Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Lys Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Glu Cys 65 70 75 80 Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Thr Asn Ser Asn 85 90 95 Ile Ile Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys Arg Thr 100 105 110 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 115 120 125 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 130 135 140 Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 145 150 155 160 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Cys Thr Tyr 165 170 175 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 180 185 190 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 195 200 205 Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 97 <211> 441 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rabbit/human chimeric heavy chain 10236 <400> 97 Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Pro Leu Ser Asn Tyr Ala 20 25 30 Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Asp Ile Tyr Pro Ser Asp Ile Ile Asp Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Gln Thr Ser Thr Thr Val Glu Leu Lys Ile Thr 65 70 75 80 Gly Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Asn 85 90 95 Asn Asp Tyr Gly Leu Asp Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val 100 105 110 Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys 115 120 125 Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys 130 135 140 Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu 145 150 155 160 Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu 165 170 175 Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr 180 185 190 Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val 195 200 205 Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro 210 215 220 Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 225 230 235 240 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 245 250 255 Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr 260 265 270 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 275 280 285 Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 290 295 300 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 305 310 315 320 Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 325 330 335 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met 340 345 350 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 355 360 365 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 370 375 380 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 385 390 395 400 Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val 405 410 415 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 420 425 430 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 <210> 98 <211> 308 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LEKTI-D5-Fc TEV <400> 98 Glu Ile Val Lys Leu Cys Ser Gln Tyr Gln Asn Gln Ala Lys Asn Gly 1 5 10 15 Ile Leu Phe Cys Thr Arg Glu Asn Asp Pro Ile Arg Gly Pro Asp Gly 20 25 30 Lys Met His Gly Asn Leu Cys Ser Met Cys Gln Ala Tyr Phe Gln Ala 35 40 45 Glu Asn Glu Glu Lys Lys Lys Ala Glu Ala Arg Ala Arg Asn Leu Glu 50 55 60 Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 65 70 75 80 Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 85 90 95 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 100 105 110 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 115 120 125 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 130 135 140 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 145 150 155 160 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 165 170 175 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 180 185 190 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 195 200 205 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val 210 215 220 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 225 230 235 240 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 245 250 255 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 260 265 270 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 275 280 285 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 290 295 300 Ser Pro Gly Lys 305 <210> 99 <211> 315 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LEKTI-D8Fc TEV <400> 99 Glu Ala Ala Lys Glu Ile Cys Ser Glu Phe Arg Asp Gln Val Arg Asn 1 5 10 15 Gly Thr Leu Ile Cys Thr Arg Glu His Asn Pro Val Arg Gly Pro Asp 20 25 30 Gly Lys Met His Gly Asn Lys Cys Ala Met Cys Ala Ser Val Phe Lys 35 40 45 Leu Glu Glu Glu Glu Lys Lys Asn Asp Lys Glu Glu Lys Gly Lys Val 50 55 60 Glu Ala Glu Lys Val Leu Glu Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Val Asp 65 70 75 80 Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 85 90 95 Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 100 105 110 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 115 120 125 Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 130 135 140 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 145 150 155 160 Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 165 170 175 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 180 185 190 Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 195 200 205 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 210 215 220 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 225 230 235 240 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 245 250 255 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 260 265 270 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 275 280 285 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 290 295 300 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 305 310 315 <210> 100 <211> 651 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 10236 gL5 Light Chain nucl. Minus RS <400> 100 gcgtatgaca tgactcagag cccgtccagc ctgtccgcgt ccgtgggaga tcgcgtgact 60 atcacgtgtc aggcctcaca atccattagc tcctggctgg cctggtacca gcagaagcca 120 gggaaggctc cgaagctgct gatctacctg gcctccaccc ttgcctccgg cgtgccttca 180 cggtttaaag gatccggctc gggaaccgac ttcaccctca ccatctcgtc gctccaaccc 240 gaggacttcg caacctacta ctgccaacag gggtatacca acagcaacat catcaacacc 300 ttcggtggcg gaactaaggt cgaaatcaag cgtacggtgg ccgctccctc cgtgttcatc 360 ttcccaccct ccgacgagca gctgaagtcc ggcaccgcct ccgtcgtgtg cctgctgaac 420 aacttctacc cccgcgaggc caaggtgcag tggaaggtgg acaacgccct gcagtccggc 480 aactcccagg aatccgtcac cgagcaggac tccaaggaca gcacctactc cctgtcctcc 540 accctgaccc tgtccaaggc cgactacgag aagcacaagg tgtacgcctg cgaagtgacc 600 caccagggcc tgtccagccc cgtgaccaag tccttcaacc ggggcgagtg c 651 <210> 101 <211> 651 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 10236 gL7 Light Chain nucl. Plus RS <400> 101 gcgatcgaca tgactcagag cccgtccagc ctgtccgcgt ccgtgggaga tcgcgtgact 60 atcacgtgtc aggcctcaca atccattagc tcctggctgg cctggtacca gcagaagcca 120 gggaaggctc cgaagctgct gatctacctg gcctccaccc ttgcctccgg cgtgccttca 180 cggttttctg gatccggctc gggaaccgac ttcaccctca ccatctcgtc gctccaaccc 240 gaggacttcg caacctacta ctgccaacag gggtatacca acagcaacat catcaacacc 300 ttcggtggcg gaactaaggt cgaaatcaag cgtacggtgg ccgctccctc cgtgttcatc 360 ttcccaccct ccgacgagca gctgaagtcc ggcaccgcct ccgtcgtgtg cctgctgaac 420 aacttctacc cccgcgaggc caaggtgcag tggaaggtgg acaacgccct gcagtccggc 480 aactcccagg aatccgtcac cgagcaggac tccaaggaca gcacctactc cctgtcctcc 540 accctgaccc tgtccaaggc cgactacgag aagcacaagg tgtacgcctg cgaagtgacc 600 caccagggcc tgtccagccc cgtgaccaag tccttcaacc ggggcgagtg c 651 <210> 102 <211> 651 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 10236 gL8 Light chain nucl. Plus RS <400> 102 gcgtatcaga tgactcagag cccgtccagc ctgtccgcgt ccgtgggaga tcgcgtgact 60 atcacgtgtc aggcctcaca atccattagc tcctggctgg cctggtacca gcagaagcca 120 gggaaggctc cgaagctgct gatctacctg gcctccaccc ttgcctccgg cgtgccttca 180 cggttttctg gatccggctc gggaaccgac ttcaccctca ccatctcgtc gctccaaccc 240 gaggacttcg caacctacta ctgccaacag gggtatacca acagcaacat catcaacacc 300 ttcggtggcg gaactaaggt cgaaatcaag cgtacggtgg ccgctccctc cgtgttcatc 360 ttcccaccct ccgacgagca gctgaagtcc ggcaccgcct ccgtcgtgtg cctgctgaac 420 aacttctacc cccgcgaggc caaggtgcag tggaaggtgg acaacgccct gcagtccggc 480 aactcccagg aatccgtcac cgagcaggac tccaaggaca gcacctactc cctgtcctcc 540 accctgaccc tgtccaaggc cgactacgag aagcacaagg tgtacgcctg cgaagtgacc 600 caccagggcc tgtccagccc cgtgaccaag tccttcaacc ggggcgagtg c 651 <210> 103 <211> 651 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 10236 gL6 Light Chain nucl. Q24R Plus RS <400> 103 gcgtatgaca tgactcagag cccgtccagc ctgtccgcgt ccgtgggaga tcgcgtgact 60 atcacgtgtc gggcctcaca atccattagc tcctggctgg cctggtacca gcagaagcca 120 gggaaggctc cgaagctgct gatctacctg gcctccaccc ttgcctccgg cgtgccttca 180 cggttttctg gatccggctc gggaaccgac ttcaccctca ccatctcgtc gctccaaccc 240 gaggacttcg caacctacta ctgccaacag gggtatacca acagcaacat catcaacacc 300 ttcggtggcg gaactaaggt cgaaatcaag cgtacggtgg ccgctccctc cgtgttcatc 360 ttcccaccct ccgacgagca gctgaagtcc ggcaccgcct ccgtcgtgtg cctgctgaac 420 aacttctacc cccgcgaggc caaggtgcag tggaaggtgg acaacgccct gcagtccggc 480 aactcccagg aatccgtcac cgagcaggac tccaaggaca gcacctactc cctgtcctcc 540 accctgaccc tgtccaaggc cgactacgag aagcacaagg tgtacgcctg cgaagtgacc 600 caccagggcc tgtccagccc cgtgaccaag tccttcaacc ggggcgagtg c 651 <210> 104 <211> 651 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 10236 gL6 Light Chain nucl. Q24K Plus RS <400> 104 gcgtatgaca tgactcagag cccgtccagc ctgtccgcgt ccgtgggaga tcgcgtgact 60 atcacgtgta aggcctcaca atccattagc tcctggctgg cctggtacca gcagaagcca 120 gggaaggctc cgaagctgct gatctacctg gcctccaccc ttgcctccgg cgtgccttca 180 cggttttctg gatccggctc gggaaccgac ttcaccctca ccatctcgtc gctccaaccc 240 gaggacttcg caacctacta ctgccaacag gggtatacca acagcaacat catcaacacc 300 ttcggtggcg gaactaaggt cgaaatcaag cgtacggtgg ccgctccctc cgtgttcatc 360 ttcccaccct ccgacgagca gctgaagtcc ggcaccgcct ccgtcgtgtg cctgctgaac 420 aacttctacc cccgcgaggc caaggtgcag tggaaggtgg acaacgccct gcagtccggc 480 aactcccagg aatccgtcac cgagcaggac tccaaggaca gcacctactc cctgtcctcc 540 accctgaccc tgtccaaggc cgactacgag aagcacaagg tgtacgcctg cgaagtgacc 600 caccagggcc tgtccagccc cgtgaccaag tccttcaacc ggggcgagtg c 651

Claims (36)

  1. 칼리크레인 5(KLK5)에 결합하는 항체로서, 항체가 가변 경쇄 및 가변 중쇄를 포함하며,
    a. 가변 경쇄가 서열번호 1 또는 서열번호 62 또는 서열번호 63을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 2를 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 3을 포함하는 CDR-L3을 포함하고;
    b. 가변 중쇄가 서열번호 4를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5를 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 6을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 항체.
  2. 제1항에 있어서,
    a. 가변 경쇄가 서열번호 1을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 2를 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 3을 포함하는 CDR-L3을 포함하고;
    b. 가변 중쇄가 서열번호 4를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5를 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 6을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 항체.
  3. 칼리크레인 5(KLK5)에 결합하는 항체로서, 서열번호 51을 참조할 때, 아미노산 잔기 Arg87, Ala107, Arg110, Lys111, Lys112, Val113, Val137, Lys138, Ser139, Ile140, Pro141, His142, Pro143, Tyr145, Ser146 및 His147을 포함하는 인간 KLK5의 에피토프에 결합하는 항체.
  4. 제3항에 있어서, 에피토프가 X-선 결정학에 의해 특징규명되는 항체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, KLK5의 프로테아제 활성을 억제하거나 감소시키는 항체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, KLK5가 LEKTI 또는 LEKTI의 단편에 결합될 때, KLK5에 결합하는 항체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, KLK5에의 결합에 대해 LEKTI 또는 LEKTI의 단편과 경쟁하지 않는 항체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, LEKTI 또는 LEKTI의 단편에 결합된 KLK5와 복합체를 형성하는 항체.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, LEKTI의 단편이 서열번호 54의 아미노산 1 내지 64를 포함하는 인간 LEKTI 도메인 5 또는 서열번호 61의 아미노산 1 내지 71을 포함하는 LEKTI 도메인 8인 항체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 KLK5, 바람직하게는 서열번호 53을 포함하는 인간 KLK5, 및 사이노몰구스 원숭이(cyno) KLK5, 바람직하게는 서열번호 60을 포함하는 cyno KLK5에 결합하는 항체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 또는 cyno 칼리크레인 2(KLK2); 또는 인간 또는 cyno 칼리크레인 4(KLK4); 또는 인간 또는 cyno 칼리크레인 7(KLK7)에 결합하지 않는 항체.
  12. 제3항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 가변 경쇄 및 가변 중쇄를 포함하며,
    a. 가변 경쇄가 서열번호 1 또는 서열번호 62 또는 서열번호 63을 포함하는 CDR-L1, 바람직하게는 서열번호 1을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 2를 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 3을 포함하는 CDR-L3을 포함하고;
    b. 가변 중쇄가 서열번호 4를 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5를 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 6을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 항체.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 또는 인간화된 항체인 항체.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 전체 길이 항체인 항체.
  15. 제14항에 있어서, 전체 길이 항체가 IgG1, IgG4 또는 IgG4P로부터 선택되는 항체.
  16. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, Fab, Fab', F(ab')2, scFv, dAb 또는 VHH로부터 선택되는 항체.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    a. 서열번호 7 또는 11 또는 15 또는 19 또는 23을 포함하는 가변 경쇄; 및/또는
    b. 서열번호 9 또는 27 또는 31 또는 35 또는 39 또는 43을 포함하는 가변 중쇄
    를 포함하는 항체.
  18. 제1항 내지 제15항 및 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    a. 서열번호 13 또는 17 또는 21 또는 25를 포함하는 경쇄; 및
    b. 서열번호 29 또는 33 또는 37 또는 41 또는 45를 포함하는 중쇄
    를 포함하는 항체.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 서열번호 15 또는 17을 참조할 때 위치 24에서 L-CDR1의 아미노산 잔기 글루타민(Gln; Q)이 아르기닌(Arg; R) 또는 라이신(Lys; K)으로 교체되어 있는 항체.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, KLK5가 서열번호 51 또는 52 또는 53을 포함하는 인간 KLK5, 또는 서열번호 60을 포함하는 cyno KLK5인 항체.
  21. a. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 항체와 KLK5에의 결합에 대해 경쟁하고/하거나;
    b. KLK5에의 결합에 대해 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 항체를 교차차단하거나 이러한 항체에 의해 교차차단되고/되거나;
    c. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 항체와 동일한 에피토프에 KLK5를 결합시키고/시키거나;
    d. 서열번호 29 또는 33 또는 37 또는 41 또는 45에 따른 서열에 대한 적어도 90% 동일성 또는 유사성을 가진 중쇄 가변 영역을 포함하고/하거나;
    e. 서열번호 13 또는 17 또는 21 또는 25에 따른 서열에 대한 적어도 90% 동일성 또는 유사성을 가진 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체.
  22. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 항체를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드.
  23. 제22항에 있어서,
    a. 폴리뉴클레오타이드가 경쇄 가변 영역을 코딩하며, 폴리뉴클레오타이드는
    i. 서열번호 8(또는 서열번호 8의 뉴클레오타이드 1 내지 330) 또는 12(또는 서열번호 12의 뉴클레오타이드 1 내지 330) 또는 16 또는 20 또는 24 또는 64 또는 66과 적어도 90% 동일하거나,
    ii. 서열번호 8(또는 서열번호 8의 뉴클레오타이드 1 내지 330) 또는 12(또는 서열번호 12의 뉴클레오타이드 1 내지 330) 또는 16 또는 20 또는 24 또는 64 또는 66을 포함하거나,
    iii. 본질적으로 서열번호 8(또는 서열번호 8의 뉴클레오타이드 1 내지 330) 또는 12(또는 서열번호 12의 뉴클레오타이드 1 내지 330) 또는 16 또는 20 또는 24 또는 64 또는 66으로 이루어지거나; 또는
    b. 폴리뉴클레오타이드가 중쇄 가변 영역을 코딩하며, 폴리뉴클레오타이드는
    i. 서열번호 10 또는 28 또는 32 또는 36 또는 40 또는 44와 적어도 90% 동일하거나,
    ii. 서열번호 10 또는 28 또는 32 또는 36 또는 40 또는 44를 포함하거나,
    iii. 본질적으로 서열번호 10 또는 28 또는 32 또는 36 또는 40 또는 44로 이루어지거나; 또는
    c. 폴리뉴클레오타이드가 경쇄를 코딩하며, 폴리뉴클레오타이드는
    i. 서열번호 14 또는 18 또는 22 또는 26 또는 65 또는 67 또는 100 또는 101 또는 102 또는 103 또는 104와 적어도 90% 동일하거나,
    ii. 서열번호 14 또는 18 또는 22 또는 26 또는 65 또는 67 또는 100 또는 101 또는 102 또는 103 또는 104를 포함하거나,
    iii. 본질적으로 서열번호 14 또는 18 또는 22 또는 26 또는 65 또는 67 또는 100 또는 101 또는 102 또는 103 또는 104로 이루어지거나; 또는
    d. 폴리뉴클레오타이드가 중쇄를 코딩하며, 폴리뉴클레오타이드는
    i. 서열번호 30 또는 34 또는 38 또는 42 또는 46과 적어도 90% 동일하거나,
    ii. 서열번호 30 또는 34 또는 38 또는 42 또는 46을 포함하거나,
    iii. 본질적으로 서열번호 30 또는 34 또는 38 또는 42 또는 46으로 이루어지는 단리된 폴리뉴클레오타이드.
  24. 제22항 또는 제23항에 따른 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 클로닝 또는 발현 벡터.
  25. a. 제22항 또는 제23항에 따른 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드, 또는
    b. 제24항에 따른 하나 이상의 발현 벡터
    를 포함하는 숙주 세포.
  26. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 항체의 제조 방법으로서, 항체를 생성하기에 적합한 조건 하에서 제25항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 상기 숙주 세포에 의해 생성된 항체를 단리하는 단계를 포함하는 제조 방법.
  27. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 항체 및 1종 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물.
  28. 제1항 내지 제20항 및 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 치료에 사용하기 위한 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 약학 조성물.
  29. 제1항 내지 제20항 및 제27항 중 어느 한 항에 있어서, KLK5의 조절이상 또는 KLK5 억제의 조절이상을 특징으로 하는 질환의 치료에 사용하기 위한 항체 또는 약학 조성물.
  30. 제29항에 있어서, 질환이 네더톤(Netherton) 증후군, 아토피성 피부염, 어린선, 주사비, 천식 또는 암, 예컨대, 난소암 또는 방광암, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 항체.
  31. 제30항에 있어서, 질환이 네더톤 증후군인 항체.
  32. 제30항에 있어서, 질환이 아토피성 피부염인 항체.
  33. 환자에서 KLK5의 조절이상 또는 KLK5 억제의 조절이상을 특징으로 하는 질환을 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 제27항에 따른 약학 조성물의 치료 유효량을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  34. 제33항에 있어서, 질환이 네더톤 증후군, 아토피성 피부염, 어린선, 주사비, 천식 또는 암, 예컨대, 난소암 또는 방광암으로부터 선택되는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 질환이 네더톤 증후군인 항체.
  36. 제34항에 있어서, 질환이 아토피성 피부염인 항체.
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