TW202140569A - 抗klk5抗體 - Google Patents

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塞普 弗蘭斯 羅曼 萊森
肖恩 梅森
大衛 詹姆士 麥克米蘭
吉莉安 克蕾兒 尼斯
妮科洛 彭戈
馬丁 安東尼 雷德
艾利森 透納
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Abstract

本發明係關於結合及抑制KLK5之抗體，及使用該抗體治療因KLK5不平衡引起之疾病的方法。詳言之，本發明係關於結合KLK5之抑制抗體及該等抗體在治療內瑟頓氏病(Netherton disease)、異位性皮膚炎及癌症中之用途。

Description

抗KLK5抗體
本發明係關於結合及抑制KLK5之抗體，及使用其治療由KLK5失調引起之疾病的方法。詳言之，本發明係關於抗KLK5抗體及其在治療內瑟頓氏病(Netherton disease)、諸如先天性魚鱗癬之魚鱗病、異位性皮膚炎及癌症中之用途。
胰舒血管素相關肽酶(稱為KLK)構成15種高度保守之胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶樣絲胺酸蛋白酶之單一家族，其由人類基因體中蛋白酶編碼基因之最大不間斷簇(染色體19q13.4)編碼(Sotiropoulou G.等人, 2009; JBC 284:48, 32989-94)。
KLK合成為非活性前原形式(pre-pro-form)，該非活性前原形式經蛋白分解加工而分泌非活性前形式。隨後此類原形式藉由其他KLK或內肽酶對其N端前肽之特異性蛋白水解移除或諸如針對胰舒血管素5 (KLK5)之自催化裂解而活化成成熟肽酶。
在若干組織中發現KLK5，但在皮膚中其表現最豐富。與KLK7一起，KLK5連同KLK7一起在皮膚之上部棘層及顆粒層中表現，其中角質細胞進行終末分化且在構建角質層之角層細胞中轉型。角質層充當外部環境之屏障，且經由不斷替換由脫落過程排出之角層細胞來維持。因為KLK5能夠活化KLK7及其他胰舒血管素，所以其在脫落中之作用係必需的。
在活化之後，由SPINK5 基因編碼之內源性抑制劑淋巴上皮Kazal型抑制劑(LEKTI)使成熟KLK5失活(Chavans P等人, 2005; Nat Genet 37, 56-65)。LEKTI含有與KLK5形成緊密複合物之15域絲胺酸蛋白酶抑制劑域。pH值之變化控制與酸性pH之緊密相互作用，自複合物釋放活性KLK5 (Deraison C等人 2007; Mol Biol Cell 18 3607-19)。
SPINK5 基因之功能損失型突變引起內瑟頓氏症候群，一種罕見的常染色體隱性皮膚病，特徵為魚鱗癬特徵與嚴重炎症、皮膚脫屑、IgE含量升高及持續過敏表現(Hovnanian A. 2013; Cell Tissue Res 351 289-300)。由表皮蛋白酶活性過高所致，LEKTI之缺乏引起由橋粒芯糖蛋白及橋粒上之KLK5活性所引起的角質層脫離，此又有利於多種過敏原高度滲透，引起異位性皮膚炎樣病變。KLK7上之KLK5活性亦促成缺陷性皮膚屏障，引起過敏原及微生物滲透及IL-1β產生。
SPINK5- /- 小鼠再現高度暗示內瑟頓氏症候群之表型，複製疾病之皮膚及發炎態樣(Yant T等人; 2004, Genes Dev 18 2354-58)。來自內瑟頓氏症候群患者之SPINK5- /- 表皮顯示無對手之KLK5及KLK7蛋白酶活性，其似乎維持包括KLK5-PAR2-TSLP (胸腺基質淋巴生成素)軸之促炎性及促信號傳導路徑之活化。
在SPINK5- /- 與KLK5- /- 小鼠中，KLK5基因敲除足夠糾正LEKTI基因敲除之此類皮膚表現，此說明KLK5在皮膚穩態中之關鍵作用。
近年來，若干研究報導異位性皮膚炎(AD)與表現LEKTI之異常變異體之LEKTI多態性之間的遺傳關聯(Hovnanian A. 2013; Cell Tissue Res 351 289-300)。
迄今，僅實行針對替換LEKTI之療法，包括藉助於SPINK5 慢病毒或腺病毒載體進行基因添加及基因校正患者角質細胞之自體移植物(Di WL.等人; 2011, Mol Ther 19 408-16)。
因此，仍需要抗KLK5療法，諸如旨在抑制KLK5之被動免疫療法，其可對與KLK5失調相關或由KLK5失調引起之疾病發揮治療作用。
本發明藉由提供根據以下實施例之抑制性抗KLK5抗體解決以上確認之需求。
實施例1：一種結合於胰舒血管素5 (KLK5)之抗體，其中該抗體包含可變輕鏈及可變重鏈，且其中： a.  該可變輕鏈包括包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 62或SEQ ID NO: 63之CDR-L1、包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；且 b.  該可變重鏈包括包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3。
實施例2：根據實施例1之抗體，其中： a.  該可變輕鏈包括包含SEQ ID NO: 1之CDR-L1、包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；且 b.  該可變重鏈包括包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3。
實施例3：一種結合於胰舒血管素5 (KLK5)之抗體，其中該抗體結合於人類KLK5的參考SEQ ID NO: 51包含胺基酸殘基Arg87、Ala107、Arg110、Lys111、Lys112、Val113、Val137、Lys138、Ser139、Ile140、Pro141、His142、Pro143、Tyr145、Ser146及His147之抗原決定基。
實施例4：根據實施例3之抗體，其中該抗原決定基係藉由X射線結晶學表徵。
實施例5：根據實施例1至4中任一項之抗體，其中該抗體抑制或降低KLK5之蛋白酶活性。
實施例6：根據實施例1至5中任一項之抗體，其中當KLK5結合於LEKTI或LEKTI之片段時該抗體結合於KLK5。
實施例7：根據實施例1至6中任一項之抗體，其中該抗體不與LEKTI或LEKTI之片段競爭結合KLK5。
實施例8：根據實施例1至7中任一項之抗體，其中該抗體與結合於LEKTI或LEKTI之片段的KLK5形成複合物。
實施例9：根據實施例6至8中任一項之抗體，其中該LEKTI之片段為包含SEQ ID NO: 54之胺基酸1至64之人類LEKTI域5或包含SEQ ID NO: 61之胺基酸1至71之LEKTI域8。
實施例10：根據前述實施例中任一項之抗體，其中該抗體結合人類KLK5，較佳地結合包含SEQ ID NO: 53之人類KLK5，且結合食蟹獼猴(cyno) KLK5，較佳地結合包含SEQ ID NO: 60之cyno KLK5。
實施例11：根據前述實施例中任一項之抗體，其中該抗體不結合人類或cyno胰舒血管素2 (KLK2)；或人類或cyno胰舒血管素4(KLK4)；或人類或cyno胰舒血管素7 (KLK7)。
實施例12：根據實施例3至11中任一項之抗體，其中該抗體包含可變輕鏈及可變重鏈，且其中： a.  該可變輕鏈包括包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 62或SEQ ID NO: 63之CDR-L1，較佳地包含SEQ ID NO: 1之CDR-L1，包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；且 b.  該可變重鏈包括包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3。
實施例13：根據前述實施例中任一項之抗體，其中該抗體為嵌合或人類化抗體。
實施例14：根據前述實施例中任一項之抗體，其中該抗體為全長抗體。
實施例15：根據實施例13之抗體，其中該全長抗體係選自IgG1、IgG4或IgG4P。
實施例16：根據實施例1至13中任一項之抗體，其中該抗體係選自Fab、Fab'、F(ab')2 、scFv、dAb或VHH 。
實施例17：根據實施例1至16中任一項之抗體，其中該抗體包含： a.  包含SEQ ID NO: 7或11或15或19或23之可變輕鏈；及/或 b.  包含SEQ ID NO: 9或27或31或35或39或43之可變重鏈。
實施例18：根據實施例1至15或17中任一項之抗體，其中該抗體包含： a.  包含SEQ ID NO: 13或17或21或25之輕鏈；及 b.  包含SEQ ID NO: 29或33或37或41或45之重鏈。
實施例19：根據實施例17或18之抗體，其中參考SEQ ID NO: 15或17在L-CDR1中位置24處之胺基酸殘基麩醯胺酸(Gln；Q)經精胺酸(Arg；R)或經離胺酸(Lys；K)置換。
實施例20：根據前述實施例中任一項之抗體，其中KLK5為包含SEQ ID NO: 51或52或53之人類KLK5或包含SEQ ID NO: 60之cyno KLK5。
實施例21：一種抗體，其： a.  與根據實施例1至20中任一項之抗體競爭結合KLK5；及/或 b.  交叉阻斷根據實施例1至20中任一項之抗體結合KLK5或由根據實施例1至20中任一項之抗體交叉阻斷結合KLK5；及/或 c.  與根據實施例1至20中任一項之抗體結合KLK5之相同抗原決定基；及/或 d.  包含與根據SEQ ID NO: 29或33或37或41或45之序列具有至少90%一致性或相似性的重鏈可變區；及/或 e.  包含與根據SEQ ID NO: 13或17或21或25之序列具有至少90%一致性或相似性的輕鏈可變區。
實施例22：一種經分離之聚核苷酸，其編碼根據實施例1至20中任一項之抗體。
實施例23：根據實施例22之經分離之聚核苷酸，其中該聚核苷酸編碼： a.  輕鏈可變區，其中該聚核苷酸： i.   與SEQ ID NO: 8 (或SEQ ID NO: 8之核苷酸1至330)或12 (或SEQ ID NO: 12之核苷酸1至330)或16或20或24或64或66至少90%一致；或 ii.  包含SEQ ID NO: 8 (或SEQ ID NO: 8之核苷酸1至330)或12 (或SEQ ID NO: 12之核苷酸1至330)或16或20或24或64或66；或 iii. 基本上由SEQ ID NO: 8 (或SEQ ID NO: 8之核苷酸1至330)或12 (或SEQ ID NO: 12之核苷酸1至330)或16或20或24或64或66組成；或 b.  重鏈可變區，其中該聚核苷酸： i.   與SEQ ID NO: 10或28或32或36或40或44至少90%一致；或 ii.  包含SEQ ID NO: 10或28或32或36或40或44；或 iii. 基本上由SEQ ID NO: 10或28或32或36或40或44組成；或 c.  輕鏈，其中該聚核苷酸： i.   與SEQ ID NO: 14或18或22或26或65或67或100或101或102或103或104至少90%一致；或 ii.  包含SEQ ID NO: 14或18或22或26或65或67或100或101或102或103或104；或 iii. 基本上由SEQ ID NO: 14或18或22或26或65或67或101或102或103或104組成；或 d.  重鏈，其中該聚核苷酸： i.   與SEQ ID NO: 30或34或38或42或46至少90%一致；或 ii.  包含SEQ ID NO: 30或34或38或42或46；或 iii. 基本上由SEQ ID NO: 30或34或38或42或46組成。
實施例24：一種選殖或表現載體，其包含一或多種根據實施例22至23中任一項之聚核苷酸。
實施例25：一種宿主細胞，其包含： a.  一或多種根據實施例22或23中任一項之聚核苷酸或 b.  一或多種根據實施例24之表現載體。
實施例26：一種用於產生根據實施例1至20中任一項之抗體之方法，其包含在適於產生該抗體之條件下培養根據實施例25之宿主細胞及分離由該宿主細胞產生之該抗體。
實施例27：一種醫藥組合物，其包含根據實施例1至20中任一項之抗體及一或多種醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或稀釋劑。
實施例28：根據實施例1至20中任一項之抗體或其抗原結合片段或根據實施例27之醫藥組合物，其用於療法。
實施例29：根據實施例1至20中任一項之抗體或根據實施例27之醫藥組合物，其用於治療特徵為KLK5失調或對KLK5之抑制失調之疾病。
實施例30：根據實施例29之供使用之抗體，其中該疾病係選自內瑟頓氏症候群(Netherton's Syndrome)、異位性皮膚炎、魚鱗病、紅斑痤瘡、氣喘或癌症(諸如卵巢癌或膀胱癌)或其組合。
實施例31：根據實施例30之供使用之抗體，其中該疾病為內瑟頓氏症候群。
實施例32：根據實施例30之供使用之抗體，其中該疾病為異位性皮膚炎。
實施例33：一種治療患者的特徵為KLK5失調或對KLK5之抑制失調之疾病的方法，其包含向該患者投與治療有效量之根據實施例1至20中任一項之抗體或根據實施例27之醫藥組合物。
實施例34：根據實施例33之方法，其中該疾病係選自內瑟頓氏症候群、異位性皮膚炎、魚鱗病、紅斑痤瘡、氣喘或癌症(諸如卵巢癌或膀胱癌)。
實施例35：根據實施例34之供使用之抗體，其中該疾病為內瑟頓氏症候群。
實施例36：根據實施例34之供使用之抗體，其中該疾病為異位性皮膚炎。
現將參照特定的非限制性態樣及其實施例且參考某些圖及實例描述本發明。
除非另外指示，否則技術術語係根據其常見含義使用。若向某些術語傳遞特定含義，則將在使用該等術語之上下文中給定術語之定義。
當術語「包含」用於本發明說明書及申請專利範圍時，不排除其他要素。出於本發明之目的，術語「由……組成(consisting of)」視為術語「包含(comprising of)」之較佳實施例。
在涉及單數名詞時，使用不定冠詞或定冠詞，例如「一(a/an)」或「該(the)」的情況下，除非特別陳述其他某物，否則此包括複數個所述名詞。
如本文所用，術語「治療(treatment)」、「治療(treating)」及其類似術語係指獲得所要的藥理學及/或生理學效果。該效果就完全或部分預防疾病或其症狀而言可具預防性，及/或就部分或完全治癒疾病及/或可歸因於該疾病之不良作用而言可具治療性。因此治療涵蓋哺乳動物、尤其人類之疾病的任何治療，且包括：(a)預防可能易患該疾病、但尚未診斷出患有該疾病之個體中出現該疾病；(b)抑制該疾病，亦即阻滯其發展；以及(c)緩解該疾病，亦即促使該疾病消退。
「治療有效量」係指KLK5抗體在向哺乳動物或其他個體投與以治療疾病時足以實現對疾病之該治療的量。治療有效量將視抗KLK5抗體、待治療個體之疾病及其嚴重程度及年齡、體重等而變化。
在本說明書通篇，術語「分離」意謂視具體情況而定，抗體或聚核苷酸存在於不同於其在自然界中所存在於之環境的物理環境中。
在本發明之第一態樣中，提供一種結合於胰舒血管素5 (KLK5)之抗體，其中該抗體包含可變輕鏈及可變重鏈，且其中： a.  該可變輕鏈包括包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 62或SEQ ID NO: 63之CDR-L1、包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；且 b.  該可變重鏈包括包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3。
較佳地，結合於胰舒血管素5 (KLK5)且包含可變輕鏈之抗體包括包含SEQ ID NO: 1之CDR-L1。
因此，在本發明之一個較佳實施例中，結合於胰舒血管素5 (KLK5)且包含可變輕鏈及可變重鏈之抗體的特徵在於包括包含SEQ ID NO: 1之CDR-L1、包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3的可變輕鏈；及包括包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3的可變重鏈。
胰舒血管素5 (KLK5、KLK-L2、SCTE或任何其他已知之同義詞)具有胰蛋白酶樣活性。其以前原形式表現且根據生物資訊學工具SignalP 5.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/index.php)包含29胺基酸信號肽，後面為37胺基酸前肽序列。前肽之裂解產生由237個胺基酸組成之活性成熟酶，其具有含絲胺酸蛋白酶典型之殘基催化三聯體的活性位點(Michael I.P等人, 2005; JBC 280:15, 14628-35)。
除非另外說明，否則術語KLK5係指任何天然原及前形式(亦即，包含信號序列及活化肽之未加工KLK5)、替代性剪接或天然變異體、突變體及來自其他物種(小鼠、食蟹獼猴等)之KLK5及活性KLK5(由自裂解或其他方式產生)。當指定人類KLK5時，人類KLK5包含SEQ ID NO: 53中所給出之序列(活性人類KLK5)。本文中提及之其他KLK5序列包含SEQ ID NO: 52 (缺乏信號序列之人類KLK5前形式)或SEQ ID NO: 51 (具有信號及前肽序列之全長人類KLK5)、與Uniprot Q9Y337對應之序列或在位置55及153處包含突變之天然變異體(參考SEQ ID NO: 51)。此等突變之實例包含根據SEQ ID NO: 51包含殘基23至293之具有在殘基55處Gly變為Arg(G55R)及/或在殘基153處Asp變為Asn (D153N)之突變的人類KLK5。
根據本發明之抗體包含互補決定區(CDR)，三個來自重鏈且三個來自輕鏈。一般而言，CDR位於一個構架中且一起形成可變區。按照慣例，抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區中之CDR稱為CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3且輕鏈可變區中之CDR稱為CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。其在自各鏈之N端至C端之方向上依序編號。
CDR係根據Kabat等人設計之系統常規編號。此系統闡述於Kabat等人, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA (下文「Kabat等人 (前述)」)中。除非其中另有說明，否則本說明書中使用此編號系統。
Kabat殘基名稱不總是直接與胺基酸殘基之線性編號對應。實際線性胺基酸序列含有比嚴格Kabat編號少或額外的胺基酸，對應於基本可變域結構的縮短或插入結構組分、是否為構架或互補決定區(CDR)。對於給定抗體，可藉由比對抗體序列與「標準」Kabat編號序列之同源殘基來確定殘基之正確Kabat編號。
根據Kabat編號系統，重鏈可變域之CDR位於殘基31-35 (CDR-H1)、殘基50-65 (CDR-H2)及殘基95-102 (CDR-H3)。然而，根據Chothia (Chothia, C.及Lesk, A.M. J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987))，等同於CDR-H1之環自殘基26延伸至殘基32。因此，除非另外指示，否則如本文所採用之「CDR-H1」意欲指如Kabat編號系統與Chothia拓樸環定義之組合所描述，殘基26至35。
根據Kabat編號系統，輕鏈可變域之CDR位於殘基24-34 (CDR-L1)、殘基50-56 (CDR-L2)及殘基89-97 (CDR-L3)。
除CDR環之外，在CDR-2 (CDR-L2或CDR-H2)與CDR-3 (CDR-L3或CDR-H3)之間存在第四個環，其由構架3 (FR3)形成。Kabat編號系統界定構架3為重鏈中之位置66-94及輕鏈中之位置57-88。
在一較佳實施例中，抗體包含：輕鏈可變區，其包括包含SEQ ID NO: 1之CDR-L1、包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；及重鏈可變區，其包括包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3。
在另一實施例中，抗體包含：輕鏈可變區，其包括包含SEQ ID NO: 62之CDR-L1、包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；及重鏈可變區，其包括包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3。
在另一實施例中，抗體包含：輕鏈可變區，其包括包含SEQ ID NO: 63之CDR-L1、包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；及重鏈可變區，其包括包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3。
包含此類CDR序列之抗體尤其具有發明性，因為其提供對KLK5 (較佳人類KLK5)具有高親和力、對KLK5生物功能高度抑制及對可製造性而言至關重要之高穩定性的抗體。例如，包含SEQ ID NO: 3 (QQGYT NS NIINT；)之CDR-L3中模體「NS」突變成「ND」(參考SEQ ID NO: 15)引起KLK5親和力顯著減少。
在本發明之第二態樣中，提供一種結合於胰舒血管素5 (KLK5)之抗體，其中該抗體結合於人類KLK5的參考SEQ ID NO: 51包含胺基酸殘基Arg87 (36)、Ala107 (56)、Arg110 (59)、Lys111 (60)、Lys112 (61)、Val113 (62)、Val137 (86)、Lys138 (87)、Ser139 (88)、Ile140 (89)、Pro141 (90)、His142 (91)、Pro143 (92)、Tyr145 (94)、Ser146 (95)及His147 (96)之抗原決定基。抗原決定基較佳藉由X射線結晶學表徵。圓括號中之數字與蛋白酶命名對應。
在較佳實施例中，結合於胰舒血管素5 (KLK5)之抗體，其中該抗體結合於人類KLK5的參考SEQ ID NO: 51包含胺基酸殘基Arg87、Ala107、Arg110、Lys111、Lys112、Val113、Val137、Lys138、Ser139、Ile140、Pro141、His142、Pro143、Tyr145、Ser146及His147之抗原決定基，且其中該抗體包含可變輕鏈及可變重鏈，且其中： a.  該可變輕鏈包括包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 62或SEQ ID NO: 63、較佳SEQ ID NO: 1之CDR-L1、包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；且 b.  該可變重鏈包括包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3。
在本發明內，術語「抗原決定基」可互換用於構形抗原決定基及線性抗原決定基兩者。構形抗原決定基由抗原之胺基酸一級序列之不連續部分構成，且線性抗原決定基由連續胺基酸所形成之序列形成。
抗原決定基可藉由此項技術中已知之任何適合之抗原決定基定位方法結合本發明所提供之抗體中之任一者鑑別。此類方法之實例包括針對結合於本發明之抗體或其片段，篩選衍生自全長KLK5之不同長度之肽，及鑑別可特異性結合於含有抗體識別之抗原決定基之序列的抗體的最小片段。KLK5肽可以合成方式或藉由蛋白分解消化KLK5產生。結合抗體之肽可藉由例如質譜分析來鑑別。諸如NMR光譜分析或X射線結晶學之方法可用於鑑別抗體所結合之抗原決定基。通常，在藉由X射線結晶學進行抗原決定基測定時，在CDR 4Å內之抗原的胺基酸殘基視為抗原決定基之胺基酸殘基部分。在鑑別後，抗原決定基可用於製備結合本發明之抗體之片段且必要時用作免疫原以獲得結合相同抗原決定基之額外抗體。
如描述本發明之態樣及實施例中所指示之抗原決定基較佳為由X射線結晶學表徵之抗原決定基。
如本發明之上下文中所用的術語『抗體』包括完整抗體及其功能活性片段，亦即含有特異性結合抗原之抗原結合域的分子，亦稱為抗原結合片段。除非上下文另外規定，否則本文關於抗體所描述之特徵亦適用於抗原結合片段。抗體可為(或衍生自)單株、多價、多特異性、雙特異性、完全人類、人類化或嵌合抗體。
全抗體，亦稱為「免疫球蛋白(Ig)」，一般係指完整或全長抗體，亦即包含藉由二硫鍵互連之兩條重鏈及兩條輕鏈之元件，其進行組裝而界定特徵性Y形三維結構。經典天然全抗體為單特異性的，因為其結合一種抗原類型，且為二價的，因為其具有兩個獨立抗原結合域。術語「完整抗體」、「全長抗體」及「全抗體」可互換使用，係指具有與天然抗體結構類似之結構的單特異性二價抗體，包括如本文所定義之Fc區。
各輕鏈包含輕鏈可變區(本文中縮寫為VL)及輕鏈恆定區(CL)。各重鏈包含重鏈可變區(本文中縮寫為VH)及由三個恆定域CH1、CH2及CH3構成之重鏈恆定區(CH)，或四個恆定域CH1、CH2、CH3及CH4，視Ig類別而定。Ig或抗體之「類別」係指恆定區的類型且包括IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且其中若干個可進一步劃分成子類，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。抗體恆定區可介導免疫球蛋白結合於宿主組織或因子，包括免疫系統之多種細胞(例如效應細胞)及經典補體系統之第一組分(Clq)。
如本文所用，術語「恆定區」或「恆定域」可互換使用，係指抗體之在可變區外部之域。恆定域在相同同型之所有抗體中相同，但在同型之間係不同的。通常，重鏈恆定區自N端至C端由包含三個或四個恆定域之CH1-鉸鏈-CH2-CH3-視情況CH4形成。
本發明之抗體分子之恆定區域若存在則可根據抗體之所提議功能及尤其是可能需要之效應功能選擇。舉例而言，恆定區域可為人類IgA、IgD、IgE、IgG或IgM域。特定言之，當抗體意圖用於治療用途且需要抗體效應功能時，可使用人類IgG恆定區域，尤其是IgG1及IgG3同型。或者，當抗體意圖用於達成治療目的且不需要抗體效應功能時可使用IgG2及IgG4同型。應瞭解亦可使用此等恆定區域之序列變異體。舉例而言，如Angal等人(Angal等人, 1993)中所述，位置241處之絲胺酸(根據Kabat編號系統編號)已變成脯胺酸的IgG4。可使用消除如在SDS-PAGE分析期間所觀測之嵌合小鼠/人類(IgG4)抗體之異質性的單個胺基酸取代(Mol Immunol 30, 105-108)。此在本文中稱為IgG4P。此單個胺基酸取代阻止IgG4分子之重鏈發生進行交換而產生嵌合分子的天然傾向。
「Fc區」、「Fc片段」或簡稱「Fc」可互換使用，係指包含抗體恆定區，不包括第一恆定區免疫球蛋白域的抗體C端區。因此，Fc係指IgA、IgD及IgG之最後兩個恆定區CH2及CH3，或IgE及IgM之最後三個恆定區，及此等域N端之可撓性鉸鏈。人類IgG1重鏈Fc區在本文中定義為包含殘基C226至其羧基端，其中編號係根據如Kabat中之EU索引。在人類IgG1之情形下，根據如Kabat中之EU索引，下部鉸鏈係指位置226-236，CH2域係指位置237-340且CH3域係指位置341-447。其他免疫球蛋白之相應Fc區可藉由序列比對來鑑別。
在本發明之上下文中，當存在時，恆定區或Fc區可為天然的，如上文所定義，或另外可以各種方式進行修飾，條件為其包含功能性FcR結合域，且較佳包含功能性FcRn結合域。較佳地，經修飾之恆定區或Fc區改善功能性及/或藥物動力學。修飾可包括Fc片段之某些部分之缺失。修飾可進一步包括能夠影響抗體之生物特性的多種胺基酸取代。亦可存在用於增加FcRn結合且因此增加活體內半衰期之突變。該等修飾可進一步包括抗體之糖基化概況之修飾。天然Fc片段在CH2域中糖基化，其中在兩條重鏈中之每一者上存在結合於位置297處之天冬醯胺殘基(Asn297)的N-聚糖。在本發明之上下文中，抗體可經糖基修飾，亦即經工程改造以具有特定糖基化概況，例如引起改善之特性，例如改善之效應功能或改善之血清半衰期。
抗體之抗原結合片段包括單鏈抗體(例如scFv及dsscFv)、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、單域抗體或奈米抗體(例如VH或VL，或VHH或VNAR)。用於本發明之其他抗體片段包括國際專利申請案WO2011/117648、WO2005/003169、WO2005/003170及WO2005/003171 (其皆以引用之方式併入本文中)中所述之Fab及Fab'片段。
用於產生及製造此等抗體片段之方法為此項技術中所熟知(參見例如Verma等人, 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181)。
如本文所用，典型的「Fab'片段」或「Fab'」包含重鏈及輕鏈對，其中重鏈包含可變區VH、恆定域CH1及天然或經修飾之鉸鏈區，且輕鏈包含可變區VL及恆定域CL。根據本發明之Fab'之二聚體產生F(ab')2，其中例如二聚可經由鉸鏈進行。
如本文所用，術語「單域抗體」係指由單一單體可變抗體域組成之抗體片段。單域抗體之實例包括VH或VL或VHH或V-NAR。
「Fv」係指兩個可變域，例如協作可變域，諸如同源對或親和力成熟可變域，亦即VH及VL對。
如本文所用之「單鏈可變片段」或「scFv」係指藉由VH與VL可變域之間的肽連接子穩定化的單鏈可變片段。
如本文所用之「二硫鍵穩定化之單鏈可變片段」或「dsscFv」係指藉由VH與VL可變域之間的肽連接子穩定化且亦包括VH與VL之間的域間二硫鍵的單鏈可變片段。(參見例如Weatherill等人, Protein Engineering, Design & Selection, 25 (321-329), 2012, WO2007109254。
可變域VH與VL之間的二硫鍵在以下所列之殘基中之兩者之間(除非上下文另外指示，否則在以下清單中均採用Kabat編號)(Protein Science 6, 781-788 Zhu等人(1997)；Weatherill等人, Protein Engineering, Design & Selection, 25 (321-329), 2012；J Biochem. 118, 825-831 Luo等人(1995)；FEBS Letters 377 135-139 Young等人(1995)；Proc. Natl. Acad. Sci. USA 第90卷 第7538-7542頁 Brinkmann等人(1993)；Proteins 19, 35-47 Jung等人(1994) Biochemistry 29 1362-1367；Glockshuber等人(1990)。在參考Kabat編號之任何地方，相關參考文獻為Kabat等人, 1991 (第5版, Bethesda, Md.), Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA。 •  VH37 + VL95C； •  VH44 + VL100； •  VH44 + VL105； •  VH45 + VL87； •  VH55 + VL101； •  VH100 + VL50； •  VH100b + VL4； •  VH98 + VL 46； •  VH101 + VL46； •  VH105 + VL43； •  VH106 + VL57； 及位於分子中之可變區對中的位置或與其對應的位置。
如本文所用，術語「抗體」亦涵蓋單價，亦即包含僅一個抗原結合域之抗體(例如包含全長重鏈及互連之全長輕鏈的單臂抗體(亦稱為「半抗體」)。
術語「抗體」亦涵蓋包含多種特異性之多價抗體，例如雙特異性或三特異性或多特異性抗體。
如本文所用之「多特異性」或「多特異性抗體」係指具有至少兩個結合域，亦即兩個或更多個結合域，例如兩個或三個結合域的如本文所述之抗體，其中該至少兩個結合域獨立地結合同一抗原上之兩個不同抗原或兩個不同抗原決定基(亦稱為多互補位)。多特異性抗體對於各特異性(抗原)而言通常為單價。本文所述之多特異性抗體涵蓋單價及多價，例如二價、三價、四價多特異性抗體。
如本文所用之「抗原結合域」係指抗體之一部分，其包含特異性地與目標抗原相互作用之一或多個可變域之一部分或整體，例如一對可變域VH及VL之一部分或整體。結合域可包含單域抗體。在一個實施例中，各結合域為單價的。較佳地，各結合域包含不超過一個VH及一個VL。
多種多特異性抗體格式係此項技術中已知的。已提出不同分類，但多特異性IgG抗體格式通常包括雙特異性IgG、附加IgG、多特異性(例如雙特異性)抗體片段、多特異性(例如雙特異性)融合蛋白及多特異性(例如雙特異性)抗體結合物，如例如Spiess等人, Mol Immunol. 67(2015):95-106中所描述。
用於製造雙特異性抗體之技術包括(但不限於) CrossMab技術(Klein等人, Methods 154 (2019) 21-31)、杵臼工程改造(例如WO1996027011、WO1998050431)、DuoBody技術(例如WO2011131746)、Azymetric技術(例如WO2012058768)。用於製造雙特異性抗體之其他技術已描述於例如Godar等人, 2018, Expert Opinion on Therapeutic Patents, 28:3, 251-276中。雙特異性抗體尤其包括CrossMab抗體、DAF (二合一)、DAF (四合一)、DutaMab、DT-lgG、杵臼常見LC、杵臼組合件、電荷對(Charge pair)、Fab臂交換、SEED體、三功能單抗、LUZ-Y、Fcab、κλ-體及正交Fab。
附加IgG通常包含藉由將額外抗原結合域或抗原結合片段附加至IgG之重鏈及/或輕鏈之N端及/或C端而工程改造之全長IgG。此類額外抗原結合片段之實例包括sdAb抗體(例如VH或VL)、Fv、scFv、dsscFv、Fab、scFav。附加IgG抗體格式尤其包括DVD-IgG、lgG(H)-scFv、scFv-(H)lgG、lgG(L)-scFv、scFv-(L)lgG、lgG(L,H)-Fv、lgG(H)-V、V(H)-lgG、lgC(L)-V、V(L)-lgG、KIH IgG-scFab、2scFv-lgG、lgG-2scFv、scFv4-lg、Zybody及DVI-IgG (四合一)，例如如Spiess等人, Alternative molecular formats and therapeutic applications for bispecific antibodies. Mol Immunol. 67(2015):95-106中所述。
多特異性抗體片段包括奈米抗體、奈米抗體-HAS、BiTE、雙功能抗體、DART、TandAb、sc雙功能抗體、sc-雙功能抗體-CH3、雙功能抗體-CH3、三功能抗體(Triple Body)、微型抗體(Miniantibody)；微型抗體(Minibody)、三聚體雙特異性微型抗體、scFv-CH3 KIH、Fab-scFv、scFv-CH-CL-scFv、F(ab')2、F(ab')2-scFv2、scFv-KIH、Fab-scFv-Fc、四價HCAb、sc雙功能抗體-Fc、雙功能抗體-Fc、串聯scFv-Fc；及胞內抗體，如例如Spiess等人, for bispecific antibodies. Mol Immunol. 67(2015):95-106中所描述。
多特異性融合蛋白包括鎖鑰結構、ImmTAC、HSAbody、sc雙功能抗體-HAS及串聯scFv-毒素。多特異性抗體結合物包括IgG-lgG；Cov-X-體；及scFv1-PEG-scFv2。
已於例如Brinkmann及Kontermann, mAbs, 9:2, 182-212 (2017)中，尤其在圖2中描述額外多特異性抗體格式，例如串聯scFv、三串聯抗體(triplebody)、Fab-VHH、taFv-Fc、scFv4-Ig、scFv2-Fcab、scFv4-IgG。雙功能抗體、三功能抗體及其產生方法揭示於例如WO99/37791中。
附加IgG及附加Fab分別包含全IgG或Fab片段，其藉由附加至少一個額外抗原結合域(例如兩個、三個或四個額外抗原結合域)，例如單域抗體(諸如VH或VL，或VHH)、scFv、dsscFv、dsFv至該IgG或Fab之重鏈及/或輕鏈之N端及/或C端而工程改造，例如如WO2009/040562、WO2010035012、WO2011/030107、WO2011/061492、WO2011/061246及WO2011/086091 (皆以引用的方式併入本文中)中所述。詳言之，Fab-Fv格式首先在WO2009/040562中揭示且其二硫化物穩定型式Fab-dsFv首先在WO2010/035012中揭示。單連接子Fab-dsFv首先在WO2014/096390 (以引用的方式併入本文中)中揭示，其中該dsFv經由Fv之VL或VH域與Fab之LC或HC之C端之間的單個連接子連接至Fab。包含全長IgG1之附加IgG藉由將dsFv附加至IgG之重鏈或輕鏈之C端而工程改造，其在WO2015/197789 (以引用的方式併入本文中)中首次揭示。
或者，另一多特異性格式包含連接至兩個scFv或dsscFv之Fab，各scFv或dsscFv結合相同或不同目標(例如一個scFv或dsscFv結合治療目標且一個scFv或dsscFv藉由結合例如白蛋白而增加半衰期)。此類抗體片段描述於WO2015/197772 (其以全文引用之方式併入本文中)中。另一格式包含連接至僅一個scFv或dsscFv之Fab，如例如WO2013/068571 (以引用的方式併入本文中)及Dave等人, Mabs, 8(7) 1319-1335 (2016)中所描述。
多特異性抗體之其他熟知格式包含：
如本文所用之雙功能抗體係指兩個Fv對，第一VH/VL對及另一VH/VL對，該等VH/VL對具有兩個Fv間連接子，使得第一Fv之VH連接至第二Fv之VL且第一Fv之VL連接至第二Fv之VH。
如本文所用之三功能抗體係指類似於雙功能抗體之包含三個Fvs及三個Fv間連接子之格式。
如本文所用之四功能抗體係指類似於雙功能抗體之包含四個Fvs及四個Fv間連接子之格式。
如本文所用之串聯scFv係指經由單個連接子連接，使得存在單個Fv間連接子之至少兩個scFv。
如本文所用之串聯scFv-Fc係指至少兩個串聯scFv，其中每一個例如經由鉸鏈附加至恆定區片段-CH2CH3之CH2域之N端。
如本文所用之Fab-Fv係指可變區附加至以下每一者之C端的Fv片段：重鏈之CH1及輕鏈之CL。該格式可呈其聚乙二醇化型式提供。
如本文所用之Fab'-Fv類似於FabFv，其中Fab部分經Fab'置換。該格式可呈其聚乙二醇化型式提供。
如本文所用之Fab-dsFv係指一種FabFv，其中Fv內二硫鍵使附加之C端可變區穩定。該格式可呈其聚乙二醇化型式提供。
如本文所用之Fab-scFv為scFv附加在輕鏈或重鏈之C端上之Fab分子。
如本文所用之Fab'-scFv為scFv附加在輕鏈或重鏈之C端上之Fab'分子。
如本文所用之DiFab係指經由重鏈之C端連接之兩個Fab分子。
如本文所用之DiFab'係指經由鉸鏈區中之一或多個二硫鍵連接的兩個Fab'分子。
如本文所用之sc雙功能抗體為一種雙功能抗體，其包含Fv內連接子，使得該分子包含三個連接子且形成正常scFv，VH及VL末端各自連接至另一Fv對之可變區中之一者。
如本文所用之sc雙功能抗體-Fc為兩個sc雙功能抗體，其中每一個例如經由鉸鏈附加至恆定區片段-CH2CH3之CH2域之N端。
如本文所用之scFv-Fc-scFv係指四個scFv，其中每一個附加至-CH2CH3片段之重鏈及輕鏈之N端及C端。
如本文所用之sc雙功能抗體-CH3係指各例如經由鉸鏈連接至CH3域之兩個sc雙功能抗體分子。
如本文所用之IgG-scFv為在每個重鏈或每個輕鏈之C端上具有scFv的全長抗體。
如本文所用之scFv-IgG為在每個重鏈或每個輕鏈之N端上具有scFv的全長抗體。
如本文所用之V-IgG為在每個重鏈或每個輕鏈之N端上具有可變域的全長抗體。
如本文所用之IgG-V為在每個重鏈或每個輕鏈之C端上具有可變域的全長抗體。
DVD-Ig (亦稱為雙重V域IgG)為具有4個額外可變域，各重鏈及各輕鏈之N端上各一個之全長抗體。
在一較佳實施例中，結合於胰舒血管素5 (KLK5)之抗體，其中該抗體抑制或降低KLK5之蛋白酶活性且其中該抗體包含可變輕鏈及可變重鏈，且其中： a.  該可變輕鏈包括包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 62或SEQ ID NO: 63之CDR-L1、包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；且 b.  該可變重鏈包括包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3。
在本發明之另一實施例中，抗體結合於人類KLK5的參考SEQ ID NO: 51包含胺基酸殘基Arg87、Ala107、Arg110、Lys111、Lys112、Val113、Val137、Lys138、Ser139、Ile140、Pro141、His142、Pro143、Tyr145、Ser146及His147之抗原決定基，且抑制或降低KLK5之蛋白酶活性。
在本發明內，術語「抑制」(及其語法變化形式)指示根據本發明之抗體對KLK5生物活性之作用。較佳地，KLK5之生物活性為蛋白酶活性，較佳為絲胺酸蛋白酶活性。該作用完全或部分阻止KLK5之絲胺酸蛋白酶活性。
不希望受理論所束縛，咸信根據本發明之抗體結合於KLK5且： i)   抑制(例如完全或部分)或降低KLK5之蛋白酶活性(較佳絲胺酸蛋白酶活性)；及/或 ii)  當KLK5結合於LEKTI或LEKTI之片段時結合於KLK5及/或 iii) 不與LEKTI或LEKTI之片段競爭結合KLK5及/或 iv) 與結合於LEKTI或LEKTI之片段之KLK5形成複合物(亦即，形成包含本發明之抗體、KLK5及LEKTI或LEKTI之片段的複合物)。
在本發明內，術語「LEKTI」係指由15個域組成的淋巴上皮Kazal型相關抑制劑，且藉由諸如蛋白酶弗林蛋白酶(furin)之前蛋白轉化酶裂解為較小功能片段，產生由一或多個域構成的LEKTI片段。此等片段分泌至細胞外空間中，在細胞外空間中其可與諸如KLK5之蛋白酶形成抑制性複合物。LEKTI亦稱為絲胺酸蛋白酶抑制劑Kazal型5 (SPINK5)且為在人類中由SPINK5基因編碼之蛋白質。在人類中，產生LEKTI mRNA之三個剪接變異體，得到不同之處僅在於COOH-端區域之蛋白質之全長、長及短同功異型物。
SPINK5為位於染色體5q32上之編碼絲胺酸蛋白酶之抑制劑的基因家族簇之成員。此包括其他表皮蛋白SPINK6及LEKTI-2 (SPINK9)，該等表皮蛋白亦包括在本發明中之術語「LEKTI」內。
術語「形成複合物」(及其任何語法變化形式)意謂當KLK5已結合於諸如LEKTI之另一蛋白質或LEKTI之片段，或另一抗體或抗體片段，諸如Fab時根據本發明之抗體能夠結合KLK5。
與能夠結合KLK5且抑制KLK5生物(亦即蛋白酶)活性但不與LEKTI或LEKTI之片段競爭結合KLK5之抗體相關的優點使得能夠在使LEKTI自KLK5:LEKTI複合物解離之條件下，諸如在自表皮基層至角質層逐漸酸性環境下抑制KLK5活性。
與本發明之抗體「競爭」、「交叉阻斷(cross-block)」、「交叉阻斷(cross-blocked)」或「結合於人類KLK5上之相同抗原決定基」(及其任何語法變化形式)的抗體係指不能與結合於本發明之抗體之KLK5形成複合物的抗體。
在根據本發明之一個實施例中，LEKTI之片段為包含SEQ ID NO: 54之胺基酸1至64的人類LEKTI域5或包含SEQ ID NO: 61之胺基酸1至71的LEKTI域8。
因此，在一較佳實施例中，結合於胰舒血管素5 (KLK5)之抗體： i.   當KLK5結合於LEKTI或LEKTI之片段時結合於KLK5； ii.  不與LEKTI或LEKTI之片段競爭結合KLK5及/或 iii. 與結合於LEKTI或LEKTI之片段之KLK5形成複合物； 其中較佳地，該LEKTI之片段為包含SEQ ID NO: 54之胺基酸1至64的人類LEKTI域5或包含SEQ ID NO: 61之胺基酸1至71的LEKTI域8且其中該抗體包含可變輕鏈及可變重鏈，且其中： a.  該可變輕鏈包括包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 62或SEQ ID NO: 63之CDR-L1、包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；且 b.  該可變重鏈包括包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3。
在根據本發明之另一實施例中，抗體結合KLK5，較佳地人類KLK5，其中該抗體結合於人類KLK5的參考SEQ ID NO: 51包含胺基酸殘基Arg87、Ala107、Arg110、Lys111、Lys112、Val113、Val137、Lys138、Ser139、Ile140、Pro141、His142、Pro143、Tyr145、Ser146及His147之抗原決定基且： i.   當KLK5結合於LEKTI或LEKTI之片段時結合於KLK5； ii.  不與LEKTI或LEKTI之片段競爭結合KLK5及/或 iii. 與結合於LEKTI或LEKTI之片段之KLK5形成複合物； 其中較佳地該LEKTI之片段為包含SEQ ID NO: 54之胺基酸1至64之人類LEKTI域5或包含SEQ ID NO: 61之胺基酸1至71之LEKTI域8。
在另一實施例中，根據本發明之抗體結合較佳包含SEQ ID NO: 53之人類KLK5，且亦結合cyno KLK5，較佳地結合包含SEQ ID NO: 60之cyno KLK5。
在另一實施例中，根據本發明之抗體不結合人類或食蟹獼猴(cyno)胰舒血管素2 (KLK2)；或人類或cyno胰舒血管素4 (KLK4)；或人類或cyno胰舒血管素7 (KLK7)。換言之，抗體對KLK5具有特異性且對其他胰舒血管素無特異性。
如本文所用之「特異性」意欲指代抗體僅識別其特異性針對之抗原，或相比於與不特異性針對之抗原(諸如其他胰舒血管素)的結合，抗體對其特異性針對之抗原(例如KLK5)的結合親和力顯著更高，例如高至少5、6、7、8、9、10倍結合親和力。
在一個實施例中，根據本發明，抗體與KLK5之結合特徵在於約500 pM或更少、較佳約172 pM之解離常數(KD )。
如本文所用，術語「KD 」係指解離常數，其獲自Kd 與Ka 之比率(亦即kd /ka )且以莫耳濃度(M)表示。Kd 及Ka 分別係指特定抗原-抗體(或其抗原結合片段)相互作用之解離速率及締合速率。抗體之KD 值可使用此項技術中沿用已久之方法測定。一種用於測定抗體KD 之方法係藉由使用表面電漿子共振，諸如Biacore®系統，如本文實例中所述，使用重組KLK5或其適合融合蛋白/多肽。在一個實例中，親和力係如本文實例所述使用重組KLK5來量測。對於表面電漿子共振，目標分子係固定於固相上且在沿流槽延伸之移動相中暴露於配位體。若發生配位體結合至固定目標，則局部折射率改變，導致SPR角之變化，其可藉由偵測反射光強度之變化而進行即時監測。可分析SPR信號之變化速率以對於結合反應之締合及解離相產生表觀速率常數。此等值之比率產生表觀平衡常數(親和力)(參見例如Wolff等人, Cancer Res. 53:2560-65 (1993))。
在一個實施例中，根據本發明之抗體對人類KLK5之結合親和力高於對cyno或小鼠KLK5之結合親和力(亦即KD 較小)。術語「親和力」係指抗體與KLK5之間的相互作用之強度。
在一個實施例中，在如本文所述之活體外分析中，根據本發明之抗體阻斷KLK5蛋白酶活性之IC50 小於800 pM，較佳地，根據本發明之抗體阻斷KLK5蛋白酶活性之IC50 小於18 pM。
如本文所用之術語IC50 係指半最大抑制濃度，其係物質(諸如抗體)在抑制特定生物或生物化學功能，本發明中為KLK5之蛋白酶活性之效果的量度。IC50 係定量量度，其指示將指定生物過程或功能或活性抑制一半所需之特定物質量。
根據本發明之抗體可包含產生抗體之動物之構架區。舉例而言，若在兔中產生抗體，則其將包含如上所定義之CDR及兔抗體、諸如包含根據SEQ ID NO: 7之輕鏈可變區(核苷酸序列展示在SEQ ID NO: 8或SEQ ID NO: 8之核苷酸1至330中)及根據SEQ ID NO: 9之重鏈可變區(核苷酸序列展示在SEQ ID NO: 10中)的抗體之構架區。
在一個實施例中，抗體可為嵌合或人類化抗體。
嵌合抗體通常係使用重組DNA方法產生。DNA可藉由以人類L及H鏈恆定區之編碼序列取代對應的非人類(例如鼠類或兔) H及L恆定區來修飾(Morrison; PNAS 81, 6851 (1984))。
人類抗體包含重鏈或輕鏈可變區或全長重鏈或輕鏈，若抗體之可變區或全長鏈獲自使用人類生殖系免疫球蛋白基因之系統，則其為特定生殖系序列之「產物」或「來源於」特定生殖系序列。此類系統包括用所關注之抗原使攜帶人類免疫球蛋白基因之轉殖基因小鼠免疫或用所關注之抗原篩選呈現在噬菌體上之人類免疫球蛋白基因文庫。作為人類生殖系免疫球蛋白序列之「產物」或「來源於」人類生殖系免疫球蛋白序列之人類抗體或其片段可藉由將人類抗體之胺基酸序列與人類生殖系免疫球蛋白之胺基酸序列進行比較且選擇按序列最接近人類抗體序列(亦即最大一致性%)之人類生殖系免疫球蛋白序列來如此識別。作為特定人類生殖系免疫球蛋白序列「之產物」或「來源於」特定人類生殖系免疫球蛋白序列的人類抗體可含有與生殖系序列相比因例如天然存在之體細胞突變或有意引入定點突變所致的胺基酸差異。然而，所選人類抗體通常在胺基酸序列上與由人類生殖系免疫球蛋白基因編碼之胺基酸序列至少90%一致，且含有當與其他物種之生殖系免疫球蛋白胺基酸序列(例如鼠類生殖系序列)相比時將人類抗體鑑別為人類的胺基酸殘基。在某些情況中，人類抗體在胺基酸序列上可與由生殖系免疫球蛋白基因編碼之胺基酸序列至少60%、70%、80%、90%、或至少95%或甚至至少96%、97%、98%或99%一致。通常，來源於特定人類生殖系序列之人類抗體將呈現與由人類生殖系免疫球蛋白基因編碼之胺基酸序列不超過10個胺基酸差異。在某些情況下，人類抗體可呈現與由生殖系免疫球蛋白基因編碼之胺基酸序列不超過5個，或甚至不超過4、3、2或1個胺基酸差異。
人類抗體可藉由熟習此項技術者已知之多種方法產生。人類抗體可藉由融合瘤方法使用人類骨髓瘤或小鼠-人類融合骨髓瘤細胞株製得(Kozbor, J Immunol; (1984) 133:3001；Brodeur, Monoclonal Isolated Antibody Production Techniques and Applications, 第51-63頁, Marcel Dekker Inc, 1987)。替代方法包括使用噬菌體庫或轉殖基因小鼠，兩者均利用人類可變區庫(Winter G; (1994) Annu Rev Immunol 12:433-455, Green LL, (1999) J Immunol Methods 231 :1 1-23)。
在本發明之一個較佳實施例中，根據本發明之抗體經人類化。
根據本發明之抗體可使用此項技術中已知之任何適合方法獲得。KLK5，包括其融合蛋白，表現KLK5之細胞(以重組方式或天然)可用於產生特異性識別KLK5之抗體。可使用如本文所述之KLK5之多種形式。
在一個實施例中，所用抗原為活性KLK5，較佳如以下實例中所述產生。
用於免疫接種宿主之KLK5或其片段可藉由此項技術中熟知之方法，自包含表現系統之經基因工程改造之宿主細胞製備，或其可自天然生物來源回收。KLK5或其片段在一些情況下可為較大蛋白質(諸如融合蛋白，例如與親和標籤或類似物融合之融合蛋白)之一部分。
在需要對動物進行免疫接種的情況下，可使用熟知且常規的方案，參見例如Handbook of Experimental Immunology, D. M. Weir (編), 第4卷, Blackwell Scientific Publishers, Oxford, England, 1986，藉由向動物、較佳非人類動物投與KLK5來獲得根據本發明之針對KLK5產生的抗體。可對許多恆溫動物進行免疫，諸如兔、小鼠、大鼠、羊、牛、駱駝或豬。然而，小鼠、兔、豬及大鼠通常最適合。
單株抗體可藉由此項技術中已知之任何方法製備，諸如融合瘤技術(Kohler及Milstein, 1975, Nature, 256:495-497)、三源融合瘤(trioma)技術、人類B細胞融合瘤技術(Kozbor等人, 1983, Immunology Today, 4:72)及EBV融合瘤技術(Cole等人, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, 第77-96頁, Alan R Liss, Inc., 1985)。
用於本發明之抗體亦可使用單一淋巴球抗體方法，藉由選殖及表現免疫球蛋白可變區cDNA產生，該等免疫球蛋白可變區cDNA自選擇用於產生特異性抗體之單一淋巴球，藉由例如Babcook, J.等人, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(15):7843-7848l；WO92/02551；WO2004/051268及WO2004/106377描述之方法產生。
可使用量測與KLK5之結合的分析及/或量測KLK5生物活性、較佳KLK5蛋白酶活性之抑制的分析對抗體進行篩選。
在一較佳實施例中，結合於胰舒血管素5 (KLK5)之抗體，其中該抗體為嵌合或人類化抗體；較佳地人類化抗體；其中該抗體包含可變輕鏈及可變重鏈，且其中： a.  該可變輕鏈包括包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 62或SEQ ID NO: 63、較佳SEQ ID NO: 1之CDR-L1、包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；且 b.  該可變重鏈包括包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3。
在根據本發明之另一實施例中，結合於KLK5之抗體，其中該抗體結合於人類KLK5的參考SEQ ID NO: 51包含胺基酸殘基Arg87、Ala107、Arg110、Lys111、Lys112、Val113、Val137、Lys138、Ser139、Ile140、Pro141、His142、Pro143、Tyr145、Ser146及His147之抗原決定基；其中該抗體包含可變輕鏈及可變重鏈，且其中： a.  該輕鏈可變鏈包含： i.   包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 62或SEQ ID NO: 63、較佳SEQ ID NO: 1之CDR-L1； ii.  包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2及 iii. 包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；及 b.  重鏈可變區，其包含： iv. 包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1； v.  包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2及 vi. 包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3 其中該抗體為嵌合或人類化抗體；較佳地，抗體為人類化抗體。
在另一個較佳實施例中，結合於KLK5之人類化抗體包含可變輕鏈及可變重鏈且其中： a.  該輕鏈可變鏈包含： i.   包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 62或SEQ ID NO: 63、較佳SEQ ID NO: 1之CDR-L1； ii.  包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2及 iii. 包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；及 b.  重鏈可變區，其包含： iv. 包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1； v.  包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2及 vi. 包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3 其中該抗體抑制或降低KLK5之蛋白酶活性及/或當KLK5結合於LEKTI或LEKTI之片段時結合於KLK5；及/或不與LEKTI或LEKTI之片段競爭結合KLK5，及/或與結合於LEKTI或LEKTI之片段之KLK5形成複合物。
更佳地，人類化抗體結合於人類KLK5之包含以下的抗原決定基：參考SEQ ID NO: 51，Arg87、Ala107、Arg110、Lys111、Lys112、Val113、Val137、Lys138、Ser139、Ile140、Pro141、His142、Pro143、Tyr145、Ser146及His147；其中該抗體包含可變輕鏈及可變重鏈，且其中： a.  該輕鏈可變鏈包含： i.   包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 62或SEQ ID NO: 63、較佳SEQ ID NO: 1之CDR-L1； ii.  包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2及 iii. 包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；及 b.  重鏈可變區，其包含： i.   包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1； ii.  包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2及 iii. 包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3 其中該抗體抑制或降低KLK5之蛋白酶活性及/或當KLK5結合於LEKTI或LEKTI之片段時結合於KLK5；及/或不與LEKTI或LEKTI之片段競爭結合KLK5，及/或與結合於LEKTI或LEKTI之片段之KLK5形成複合物。
如本文所用，術語「人類化」抗體係指一種抗體，其中重鏈及/或輕鏈含有一或多個來自供體抗體(例如非人類抗體，諸如小鼠或兔單株抗體)之CDR (視需要包括一或多個經修飾之CDR)，該一或多個CDR移植於受體抗體(例如人類抗體)之重鏈及/或輕鏈可變區構架中。關於綜述，參見Vaughan等人, Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998。在一個實施例中，僅將來自上文所描述之CDR中之任一者的決定特異性的殘基中之一或多個轉移至人類抗體構架而非轉移整個CDR (參見例如Kashmiri等人, 2005, Methods, 36, 25-34)。在一個實施例中，僅將來自上文所描述之CDR中之一或多個的決定特異性的殘基轉移至人類抗體構架。在另一實施例中，僅將來自上文所描述之CDR中之各者的決定特異性的殘基轉移至人類抗體構架。
在移植CDR時，可使用適於CDR所源自之供體抗體之類別/類型的任何受體可變區構架序列，包括小鼠、靈長類動物及人類構架區。
較佳地，根據本發明之人類化抗體具有包含人類受體構架區以及一或多個本文中特定提供之CDR的可變域。因此，在一個實施例中，提供一種結合KLK5、較佳人類KLK5之阻斷人類化抗體，其中可變域包含人類受體構架區及非人類供體CDR。
可用於本發明之人類構架之實例為KOL、NEWM、REI、EU、TUR、TEI、LAY及POM (Kabat等人, 前述)。舉例而言，KOL及NEWM可用於重鏈，REI可用於輕鏈且EU、LAY及POM可用於重鏈及輕鏈二者。或者，可使用人類生殖系序列；此等人類生殖系序列可在http://www.imgt.org/處獲得。
在根據本發明之人類化抗體中，受體重鏈及輕鏈不一定需要來源於相同抗體且可視需要包含具有衍生自不同鏈之構架區的複合鏈。
根據本發明之人類化抗體之輕鏈的合適構架區來源於具有SEQ ID NO: 47且其核苷酸序列示於SEQ ID NO: 48中之人類生殖系IGKV1-6 JK4。
適於根據本發明之人類化抗體或其抗原結合片段之重鏈的構架區來源於具有如SEQ ID NO: 49中所示之序列且其核苷酸序列示於SEQ ID NO: 50中之人類生殖系IGHV4-4 JH4。
因此，在一個實施例中，提供一種結合於KLK5之人類化抗體，其中該抗體包含可變輕鏈及可變重鏈，且其中： a.  該輕鏈可變鏈包含： i.   包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 62或SEQ ID NO: 63、較佳SEQ ID NO: 1之CDR-L1；及 ii.  包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2及 iii. 包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；及 b.  重鏈可變區，其包含： i.   包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1；及 ii.  包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2及 iii. 包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3 其中該輕鏈構架區來源於包含SEQ ID NO: 47之人類生殖系IGKV1-6 JK4；且重鏈構架區來源於包含SEQ ID NO: 49之人類生殖系IGHV4-4 JH4。較佳地，該抗體抑制或降低KLK5之蛋白酶活性及/或當KLK5結合於LEKTI或LEKTI之片段時結合於KLK5；及/或不與LEKTI或LEKTI之片段競爭結合KLK5，及/或與結合於LEKTI或LEKTI之片段之KLK5形成複合物。
在另一實施例中，提供一種結合於KLK5之人類化抗體，其中該抗體結合於人類KLK5的參考SEQ ID NO: 51包含Arg87、Ala107、Arg110、Lys111、Lys112、Val113、Val137、Lys138、Ser139、Ile140、Pro141、His142、Pro143、Tyr145、Ser146及His147之抗原決定基；其中該抗體包含可變輕鏈及可變重鏈，且其中： a.  該輕鏈可變鏈包含： i.   包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 62或SEQ ID NO: 63、較佳SEQ ID NO: 1之CDR-L1；及 ii.  包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2及 iii. 包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；及 b.  重鏈可變區，其包含： i.   包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1；及 ii.  包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2及 iii. 包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3 其中該輕鏈構架區來源於包含SEQ ID NO: 47之人類生殖系IGKV1-6 JK4；且重鏈構架區來源於包含SEQ ID NO: 49之人類生殖系IGHV4-4 JH4。較佳地，該抗體抑制或降低KLK5之蛋白酶活性及/或當KLK5結合於LEKTI或LEKTI之片段時結合於KLK5；及/或不與LEKTI或LEKTI之片段競爭結合KLK5，及/或與結合於LEKTI或LEKTI之片段之KLK5形成複合物；及
在根據本發明之人類化抗體中，構架區可能不具有與受體抗體之序列相同的確切序列。舉例而言，可將不尋常殘基改為用於該受體鏈類別或類型的更常出現的殘基。或者，可改變受體構架區中所選擇之殘基以使其對應於在供體抗體中之相同位置出現的殘基(參見Reichmann等人, 1998, Nature, 332, 323-324)。此類改變應保持在恢復供體抗體之親和力所必需的最小程度。用於選擇受體構架區中可能需要改變之殘基的方案闡述於WO91/09967 (以引用的方式併入本文中)中。
因此，在一個實施例中，構架中之1、2、3、4、5、6、7或8個殘基經替代的胺基酸殘基置換。
因此，在一個實施例中，提供一種根據本發明之人類化抗體，其中可變輕鏈之位置2及/或3及/或63 (參考SEQ ID NO: 47或SEQ ID NO: 15)中之每一處的殘基為供體殘基。較佳地，可變輕鏈之位置2處的殘基為酪胺酸且可變輕鏈之位置3處的殘基為天冬胺酸。在一些實施例中，可變輕鏈之位置63處的殘基為離胺酸。
在另一實施例中，提供一種人類化抗體，其中至少可變重鏈之位置68、72、74、77及79 (參考SEQ ID NO: 49；或參考SEQ ID NO: 39，位置67、71、73、76及78)中之每一處的殘基為供體殘基。
較佳地，可變重鏈之位置72處之殘基為麩醯胺酸，位置74處之殘基為絲胺酸且位置79處之殘基為纈胺酸。在一些實施例中，可變重鏈之位置68處之殘基為苯丙胺酸，及/或位置77處之殘基為蘇胺酸。
在一較佳實施例中，人類化抗體結合於KLK5，其中該人類化抗體包含： -包含SEQ ID NO: 11或15或19或23之輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 27或31或35或39或43之重鏈可變區；或 -包含SEQ ID NO: 15之輕鏈可變區，其中位置24處之胺基酸殘基為精胺酸(Arg；R)或離胺酸(Lys；K)；及包含SEQ ID NO: 27或31或35或39或43之重鏈可變區。較佳地，該抗體抑制或降低KLK5之蛋白酶活性及/或當KLK5結合於LEKTI或LEKTI之片段時結合於KLK5；及/或不與LEKTI或LEKTI之片段競爭結合KLK5，及/或與結合於LEKTI或LEKTI之片段之KLK5形成複合物。
在另一實施例中，提供一種結合於KLK5之人類化抗體，其中該抗體結合於人類KLK5的參考SEQ ID NO: 51包含Arg87、Ala107、Arg110、Lys111、Lys112、Val113、Val137、Lys138、Ser139、Ile140、Pro141、His142、Pro143、Tyr145、Ser146及His147之抗原決定基；其中該抗體包含： -包含SEQ ID NO: 11或15或19或23之輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 27或31或35或39或43之重鏈可變區；或 -包含SEQ ID NO: 15之輕鏈可變區，其中位置24處之胺基酸殘基為精胺酸(Arg；R)或離胺酸(Lys；K)；及包含SEQ ID NO: 27或31或35或39或43之重鏈可變區。
較佳地，該抗體抑制或降低KLK5之蛋白酶活性及/或當KLK5結合於LEKTI或LEKTI之片段時結合於KLK5；及/或不與LEKTI或LEKTI之片段競爭結合KLK5，及/或與結合於LEKTI或LEKTI之片段之KLK5形成複合物。
在本發明之一個較佳實施例中，抗體包括包含SEQ ID NO: 15之輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 39之重鏈可變區。
更佳地，人類化抗體結合於人類KLK5的參考SEQ ID NO: 51包含胺基酸殘基Arg87、Ala107、Arg110、Lys111、Lys112、Val113、Val137、Lys138、Ser139、Ile140、Pro141、His142、Pro143、Tyr145、Ser146及His147之抗原決定基；其中該抗體包括包含SEQ ID NO: 15之輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 39之重鏈可變區。
甚至更佳地，該人類化抗體抑制或降低KLK5之蛋白酶活性及/或當KLK5結合於LEKTI或LEKTI之片段時結合於KLK5；及/或不與LEKTI或LEKTI之片段競爭結合KLK5，及/或與結合於LEKTI或LEKTI之片段之KLK5形成複合物。
在一個實施例中，本發明提供一種抗體，其包含之序列在部分或整個相關序列，例如可變域序列、CDR序列或除CDR外之可變域序列上與本文揭示之序列80%類似或一致，例如85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%類似或一致。在一個實施例中，相關序列係SEQ ID NO: 15。在一個實施例中，相關序列係SEQ ID NO: 39。
在一個實施例中，結合KLK5之抗體包含輕鏈及重鏈，其中該可變輕鏈包含與SEQ ID NO: 15中包含之序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性或相似性的序列，及/或該可變重鏈包含與SEQ ID NO: 39中包含之序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性或相似性的序列。
在一個實施例中，結合KLK5之抗體包含與SEQ ID NO: 15中給出之序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%類似或一致的輕鏈，但其中該抗體具有SEQ ID NO: 1 (或SEQ ID NO: 62或63)中包含之CDR-L1之序列、SEQ ID NO: 2中包含之CDR-L2之序列及SEQ ID NO: 3中包含之CDR-L3之序列。
如本文所用，「一致性」、「一致」或其語法變化形式指示在比對序列中之任何特定位置處，胺基酸殘基在序列之間均一致。如本文所用，「相似性」、「類似」或其語法變化形式指示在比對序列中之任何特定位置處，胺基酸殘基在序列之間屬於類似類型。舉例而言，可用白胺酸取代異白胺酸或纈胺酸。通常可彼此間取代的其他胺基酸包括但不限於： -苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸(具有芳族側鏈之胺基酸)； -離胺酸、精胺酸及組胺酸(具有鹼性側鏈之胺基酸)； -天冬胺酸及麩胺酸(具有酸性側鏈之胺基酸)； -天冬醯胺及麩醯胺酸(具有醯胺側鏈之胺基酸)；及 -半胱胺酸及甲硫胺酸(具有含硫側鏈之胺基酸)。
容易計算一致性及相似性程度(Computational Molecular Biology, Lesk, A.M.編, Oxford University Press, New York, 1988；Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith, D.W.編, Academic Press, New York, 1993；Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M.及Griffin, H.G.編, Humana Press, New Jersey, 1994；Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987, Sequence Analysis Primer, Gribskov, M.及Devereux, J.編, M Stockton Press, New York, 1991；BLAST™軟體，得自NCBI (Altschul, S.F.等人, 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410；Gish, W.及States, D.J. 1993, Nature Genet. 3:266-272. Madden, T.L.等人, 1996, Meth. Enzymol. 266:131-141；Altschul, S.F.等人, 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402；Zhang, J.及Madden, T.L. 1997, Genome Res. 7:649-656,)。
在一個實施例中，抗體係全長抗體，較佳選自IgG1及IgG4或IgG4P。
因此，本發明提供全長人類化抗體，其結合KLK5且包含： a.  輕鏈可變區，其包含： i.   包含SEQ ID NO: 1之CDR-L1； ii.  包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2及 iii  包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；及 b.  重鏈可變區，其包含： iv. 包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1； v.  包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2及 vi. 包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3。
較佳地，全長人類化抗體結合於人類KLK5的參考SEQ ID NO: 51包含胺基酸殘基Arg87、Ala107、Arg110、Lys111、Lys112、Val113、Val137、Lys138、Ser139、Ile140、Pro141、His142、Pro143、Tyr145、Ser146及His147之抗原決定基，且其中抗體為IgG4P同功異型物。
在另一實施例中提供一種全長人類化抗體，該抗體結合於人類KLK5的參考SEQ ID NO: 51包含胺基酸殘基Arg87、Ala107、Arg110、Lys111、Lys112、Val113、Val137、Lys138、Ser139、Ile140、Pro141、His142、Pro143、Tyr145、Ser146及His147之抗原決定基且其中抗體為IgG4P同功異型物。
熟習此項技術者亦瞭解抗體可進行多種轉譯後修飾。此等修飾之類型及程度常視用於表現抗體的宿主細胞株以及培養條件而定。此類修飾可包括糖基化變化、甲硫胺酸氧化、二酮哌𠯤形成、天冬胺酸鹽異構化及天冬醯胺去醯胺。常見修飾為由於羧基肽酶作用而喪失羧基端基礎殘基(諸如離胺酸或精胺酸)(如Harris, RJ. Journal of Chromatography 705:129-134, 1995中所述)。因此，可缺乏抗體重鏈之C端離胺酸。
在一個實施例中，抗體之C端胺基酸在轉譯後修飾期間裂解。
在一個實施例中，抗體之N端胺基酸在轉譯後修飾期間裂解。
在一較佳實施例中，結合於KLK5之抗體為包括包含SEQ ID NO: 15之輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 39之重鏈可變區的全長抗體。較佳地，抗體結合於人類KLK5的參考SEQ ID NO: 51包含胺基酸殘基Arg87、Ala107、Arg110、Lys111、Lys112、Val113、Val137、Lys138、Ser139、Ile140、Pro141、His142、Pro143、Tyr145、Ser146及His147之抗原決定基。
在另一實施例中，結合於KLK5之抗體為包括包含SEQ ID NO: 17之輕鏈及包含SEQ ID NO: 41之重鏈的全長IgG4抗體。較佳地，抗體結合於人類KLK5的參考SEQ ID NO: 51包含胺基酸殘基Arg87、Ala107、Arg110、Lys111、Lys112、Val113、Val137、Lys138、Ser139、Ile140、Pro141、His142、Pro143、Tyr145、Ser146及His147之抗原決定基。
在另一實施例中，抗體為包括包含SEQ ID NO: 15之輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 39之重鏈可變區的Fab'片段。
在另一實施例中，抗體包括包含SEQ ID NO: 15之輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 27或31或35或39或43之重鏈可變區。舉例而言，抗體為包括包含SEQ ID NO: 15之輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 27或31或35或39或43、較佳SEQ ID NO: 39之重鏈可變區的全長IgG4抗體。在一個實施例中，參考SEQ ID NO: 15胺基酸麩醯胺酸24 (Gln；Q)為精胺酸(Arg；R) Q24R或離胺酸(Lys；K) Q24K。
在另一實施例中，抗體為包括包含SEQ ID NO: 11之輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 27或31或35或39或43之重鏈可變區的全長IgG4抗體。在另一實施例中，抗體為包含根據SEQ ID NO: 11之輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 27或31或35或39或43之重鏈可變區的Fab'片段。
在另一實施例中，抗體為包含根據SEQ ID NO: 19之輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 27或SEQ ID NO: 31或35或39或43之重鏈可變區的全長IgG4抗體。在另一實施例中，抗體為包含根據SEQ ID NO: 19之輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 27或31或35或39或43之重鏈可變區的Fab'片段。
在另一實施例中，抗體為包含根據SEQ ID NO: 23之輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 27或31或35或39或43之重鏈可變區的全長IgG4抗體。
在另一實施例中，抗體為包含根據SEQ ID NO: 23之輕鏈可變區及包含SEQ ID NO: 27或31或35或39或43之重鏈可變區的Fab'片段。
在另一實施例中，結合於KLK5之抗體為全長IgG4抗體，其包含： 1.  包含SEQ ID NO: 13之輕鏈及包含SEQ ID NO: 29或33或37或41或45之重鏈；或 2.  包含SEQ ID NO: 17之輕鏈及包含SEQ ID NO: 29或33或37或41或45之重鏈；或 3.  包含SEQ ID NO: 17之輕鏈，其中麩醯胺酸24 (Gln；Q)為精胺酸(Arg；R)Q24R或離胺酸(Lys；K)Q24K，及包含SEQ ID NO: 29或33或37或41或45之重鏈；或 4.  包含SEQ ID NO: 21之輕鏈及包含SEQ ID NO: 29或33或37或41或45之重鏈；或 5.  包含SEQ ID NO: 25之輕鏈及包含SEQ ID NO: 29或33或37或41或45之重鏈。
較佳地，抗體結合於人類KLK5的參考SEQ ID NO: 51包含胺基酸殘基Arg87、Ala107、Arg110、Lys111、Lys112、Val113、Val137、Lys138、Ser139、Ile140、Pro141、His142、Pro143、Tyr145、Ser146及His147之抗原決定基。
在一較佳實施例中，結合於KLK5之抗體為包括包含SEQ ID NO: 17之輕鏈及包含SEQ ID NO: 41之重鏈的全長IgG4抗體；其中該抗體結合於人類KLK5的參考SEQ ID NO: 51包含胺基酸殘基Arg87、Ala107、Arg110、Lys111、Lys112、Val113、Val137、Lys138、Ser139、Ile140、Pro141、His142、Pro143、Tyr145、Ser146及His147之抗原決定基。
本發明亦提供如上文所述之抗體，其與結合於另一抗體之KLK5、較佳人類KLK5形成複合物，其中該另一抗體包含： 1.  可變輕鏈，其包括包含SEQ ID NO: 68之CDR-L1、包含SEQ ID NO: 69之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 70之CDR-L3；及可變重鏈，其包括包含SEQ ID NO: 71之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 72之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 73之CDR-H3；及/或 2.  包含SEQ ID NO: 74之可變輕鏈及包含SEQ ID NO: 76之可變重鏈；及/或 3.  由包含SEQ ID NO: 75之核苷酸編碼之可變輕鏈及由包含SEQ ID NO: 77之核苷酸編碼之可變重鏈。
在一個實施例中，抗體結合KLK5，其中該抗體較佳結合於人類KLK5的參考SEQ ID NO: 51包含胺基酸殘基Arg87、Ala107、Arg110、Lys111、Lys112、Val113、Val137、Lys138、Ser139、Ile140、Pro141、His142、Pro143、Tyr145、Ser146及His147之抗原決定基且其中該抗體包含： 1.  可變輕鏈及可變重鏈，且其中該可變輕鏈包括包含SEQ ID NO: 1之CDR-L1、包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；且該可變重鏈包括包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3；或 2.  包含SEQ ID NO: 7或11或15或19或23之可變輕鏈；及包含SEQ ID NO: 9或27或31或35或39或43之可變重鏈； 其中該抗體與結合於另一抗體之KLK5、較佳人類KLK5形成複合物，該另一抗體包含： 1.  可變輕鏈，其包括包含SEQ ID NO: 68之CDR-L1、包含SEQ ID NO: 69之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 70之CDR-L3；及可變重鏈，其包括包含SEQ ID NO: 71之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 72之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 73之CDR-H3；及/或 2.  包含SEQ ID NO: 74之可變輕鏈及包含SEQ ID NO: 76之可變重鏈；及/或 3.  由包含SEQ ID NO: 75之核苷酸編碼之可變輕鏈及由包含SEQ ID NO: 77之核苷酸編碼之可變重鏈。
因此，本發明亦提供結合KLK5、較佳人類KLK5之抗體，其包含： 1.  可變輕鏈，其包括包含SEQ ID NO: 68之CDR-L1、包含SEQ ID NO: 69之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 70之CDR-L3；及可變重鏈，其包括包含SEQ ID NO: 71之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 72之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 73之CDR-H3；其中該抗體視情況人類化；及/或 2.  包含SEQ ID NO: 74之可變輕鏈及包含SEQ ID NO: 76之可變重鏈；及/或 3.  由包含SEQ ID NO: 75之核苷酸編碼之可變輕鏈及由包含SEQ ID NO: 77之核苷酸編碼之可變重鏈。
此外，本發明亦包含KLK5-抗體複合物，其包含： a.  KLK5、較佳人類KLK5；及 b.  結合KLK5之抗體，其中該抗體較佳結合於人類KLK5的參考SEQ ID NO: 51包含胺基酸殘基Arg87、Ala107、Arg110、Lys111、Lys112、Val113、Val137、Lys138、Ser139、Ile140、Pro141、His142、Pro143、Tyr145、Ser146及His147之抗原決定基且其中該抗體包含： 1.  可變輕鏈及可變重鏈，且其中該可變輕鏈包括包含SEQ ID NO: 1之CDR-L1、包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；且該可變重鏈包括包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3；或 2.  包含SEQ ID NO: 7或11或15或19或23之可變輕鏈；及包含SEQ ID NO: 9或27或31或35或39或43之可變重鏈；及 c.  另一抗體，其包含： 1.  可變輕鏈，其包括包含SEQ ID NO: 68之CDR-L1、包含SEQ ID NO: 69之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 70之CDR-L3；及可變重鏈，其包括包含SEQ ID NO: 71之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 72之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 73之CDR-H3；其中該抗體視情況人類化；及/或 2.  包含SEQ ID NO: 74之可變輕鏈及包含SEQ ID NO: 76之可變重鏈；及/或 3.  由包含SEQ ID NO: 75之核苷酸編碼之可變輕鏈及由包含SEQ ID NO: 77之核苷酸編碼之可變重鏈。
應瞭解，所謂的「另一抗體」結合KLK5、較佳人類KLK5之本文所述之抗原決定基不同且不重疊的抗原決定基(且參考SEQ ID NO: 51包含胺基酸殘基Arg87、Ala107、Arg110、Lys111、Lys112、Val113、Val137、Lys138、Ser139、Ile140、Pro141、His142、Pro143、Tyr145、Ser146及His147)，如以下實例所示。就此而言，此類抗體不彼此競爭。
此外，本發明亦提供一種抗體，其藉由交叉阻斷結合於人類KLK5的參考SEQ ID NO: 51包含胺基酸殘基Arg87、Ala107、Arg110、Lys111、Lys112、Val113、Val137、Lys138、Ser139、Ile140、Pro141、His142、Pro143、Tyr145、Ser146及His147之抗原決定基的抗體或由該抗體交叉阻斷而競爭結合KLK5、較佳人類KLK5，且該抗體包含： 1.  可變輕鏈及可變重鏈，且其中該可變輕鏈包括包含SEQ ID NO: 1之CDR-L1、包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；且該可變重鏈包括包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3；或 2.  可變輕鏈及可變重鏈，且其中該可變輕鏈包括包含SEQ ID NO: 62之CDR-L1、包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；且該可變重鏈包括包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3；或 3.  可變輕鏈及可變重鏈，且其中該可變輕鏈包括包含SEQ ID NO: 63之CDR-L1、包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；且該可變重鏈包括包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3；或 4.  包含SEQ ID NO: 7或11或15或19或23之可變輕鏈；及包含SEQ ID NO: 9或27或31或35或39或43之可變重鏈；或 5.  包含SEQ ID NO: 15之可變輕鏈，其中參考SEQ ID NO: 15之胺基酸殘基麩醯胺酸24 (Gln；Q)為精胺酸(Arg；R)或離胺酸(Lys；K)；及包含SEQ ID NO: 9或27或31或35或39或43之可變重鏈；或 6.  包含SEQ ID NO: 13或17或21或25之輕鏈及包含SEQ ID NO: 29或33或37或41或45之重鏈。
在一個實施例中，此類競爭抗體具有與包含SEQ ID NO: 29或33或37或41或45之序列具有至少80%一致性或相似性之重鏈可變區；及/或具有與包含SEQ ID NO: 13或17或21或25或30之序列具有至少80%一致性或相似性之輕鏈可變區。
競爭抗體可使用此項技術中之任何適合方法，例如藉由使用競爭ELISA或BIAcore分析鑑別，其中交叉阻斷競爭抗體與KLK5之結合或該結合經交叉阻斷防止本發明之抗體之結合或反之亦然。此類競爭分析可使用經分離之天然或重組KLK5或其適合之融合蛋白/多肽。在一個實例中，使用重組人類活性KLK5 (諸如包含SEQ ID NO: 53)來量測競爭。
生物分子，諸如抗體或片段，含有酸性及/或鹼性官能基，由此給予分子淨正電荷或負電荷。總體上「觀測到」的電荷之量將視實體之絕對胺基酸序列、3D結構中帶電基團之局部環境及分子之環境條件而定。等電點(pI)係特定分子或其溶劑可及表面不攜帶淨電荷時的pH值。在一個實例中，結合KLK5，結合於人類KLK5的參考SEQ ID NO: 51包含胺基酸殘基Arg87、Ala107、Arg110、Lys111、Lys112、Val113、Val137、Lys138、Ser139、Ile140、Pro141、His142、Pro143、Tyr145、Ser146及His147之抗原決定基的抗體可經工程改造以具有適當等電點。此可能產生具有更穩固特性，尤其適合溶解性及/或穩定性概況及/或改善之純化特徵的抗體。
因此，在一個態樣中，本發明提供結合KLK5，較佳結合於人類KLK5的參考SEQ ID NO: 51包含胺基酸殘基Arg87、Ala107、Arg110、Lys111、Lys112、Val113、Val137、Lys138、Ser139、Ile140、Pro141、His142、Pro143、Tyr145、Ser146及His147之抗原決定基的抗體，其中該抗體包含： a.  包含SEQ ID NO: 7或11或15或19或23之可變輕鏈；及包含SEQ ID NO: 9或27或31或35或39或43之可變重鏈；或 b.  包含SEQ ID NO: 13或17或21或25之輕鏈；及包含SEQ ID NO: 29或33或37或41或45之重鏈。
其經工程改造以具有不同於最初鑑別之抗體之等電點的等電點。
抗體可例如藉由置換胺基酸殘基，諸如用一或多個鹼性胺基酸殘基置換酸性胺基酸殘基進行改造。或者，可引入鹼性胺基酸殘基或可移除酸性胺基酸殘基。或者，若分子具有不可接受地高的pI值，則可視需要引入酸性殘基以降低pI。重要的是，當調控pI時必須注意保持抗體或片段之所期望的活性。因此，在一個實施例中，經工程改造之抗體具有與「未經修飾」之抗體或片段相同或實質上相同的活性。
可使用諸如** ExPASY http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html及http://www.iut-arles.up.univ-mrs.fr/w3bb/d_abim/compo-p.html之程式預測抗體之等電點。
應瞭解，本發明提供之抗體之親和力可使用此項技術中已知之任何適合方法改變。因此，本發明亦關於抗體之變異體，其對KLK5、尤其人類KLK5具有改善之親和力。此類變異體可藉由多種親和力成熟方案獲得，包括使CDR發生突變(Yang等人, J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995)、鏈改組(Marks等人, Bio/Technology, 10, 779-783, 1992)、使用大腸桿菌突變菌株(Low等人, J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996)、DNA改組(Patten等人, Curr. Opin Biotechnol., 8, 724-733, 1997)、噬菌體呈現(Thompson等人, J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996)及性PCR (Crameri等人, Nature, 391, 288-291, 1998)。
必要時根據本發明之抗體可結合於一或多個效應分子。應瞭解效應分子可包含單個效應分子或兩個或更多個連接形成可連接至本發明抗體之單一部分的分子。在需要獲得連接於效應分子之抗體片段下，此可藉由將抗體片段直接或經由偶合劑連接於效應分子之標準化學或重組DNA程序來製備。用於此類效應分子結合於抗體之技術為此項技術中所熟知(參見Hellstrom等人, Controlled Drug Delivery, 第2版, Robinson等人編, 1987, 第623-53頁；Thorpe等人, 1982, Immunol. Rev., 62:119-58及Dubowchik等人, 1999, Pharmacology and Therapeutics, 83, 67-123)。特定化學程序包括例如WO 93/06231、WO 92/22583、WO 89/00195、WO 89/01476及WO 03/031581中描述之程序。或者，在效應分子為蛋白質或多肽之情況下，連接可使用重組DNA程序，例如如WO 86/01533及EP0392745中所述來實現。
如本文所用，術語效應分子包括例如抗腫瘤劑、藥物、毒素、生物活性蛋白質(例如酶)、其他抗體或抗體片段、合成或天然存在之聚合物、核酸及其片段(例如DNA、RNA及其片段)、放射性核素、尤其放射性碘、放射性同位素、螯合金屬、奈米粒子及報導基團，諸如螢光化合物或可藉由NMR或ESR光譜分析偵測到之化合物。
效應分子之實例可包括細胞毒素或細胞毒性劑，包括任何對細胞不利(例如殺死)之試劑。實例包括康普瑞汀(combrestatin)、海兔毒素(dolastatin)、埃博黴素(epothilone)、星形孢菌素(staurosporin)、類美登素(maytansinoid)、海綿素(spongistatin)、根瘤菌素(rhizoxin)、軟海綿素(halichondrin)、桿孢菌素(roridin)、海米斯林(hemiasterlin)、紫杉醇(taxol)、細胞遲緩素B (cytochalasin B)、短桿菌素D (gramicidin D)、溴化乙錠(ethidium bromide)、吐根素(emetine)、絲裂黴素(mitomycin)、依託泊苷(etoposide)、特諾波賽(tenoposide)、長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、秋水仙鹼(colchicin)、小紅莓(doxorubicin)、道諾比星(daunorubicin)、二羥基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光神黴素(mithramycin)、放線菌素D (actinomycin D)、1-去氫睪固酮、糖皮質激素、普魯卡因(procaine)、四卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛爾(propranolol)及嘌呤黴素(puromycin)及其類似物或同源物。
效應分子亦包括(但不限於)抗代謝物(例如甲胺喋呤(methotrexate)、6-巰基嘌呤(6-mercaptopurine)、6-硫代鳥嘌呤(6-thioguanine)、阿糖胞苷(cytarabine)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、達卡巴嗪(decarbazine))、烷基化劑(例如甲氮芥(mechlorethamine)、噻替派(thioepa)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、美法侖(melphalan)、卡莫司汀(carmustine，BSNU)及洛莫司汀(lomustine，CCNU)、環硫磷醯胺(cyclothosphamide)、白消安(busulfan)、二溴甘露醇(dibromomannitol)、鏈佐黴素(streptozotocin)、絲裂黴素C及順式-二氯二胺鉑(II)(DDP)、順鉑(cisplatin))、蒽環黴素(anthracycline)(例如道諾比星(以前為道諾黴素(daunomycin))及小紅莓(doxorubicin))、抗生素(例如放線菌素d (以前為放射菌素)、博萊黴素(bleomycin)、光神黴素、安麴黴素(anthramycin，AMC)、卡奇黴素(calicheamicin)或倍癌黴素(duocarmycin))及抗有絲分裂劑(例如長春新鹼及長春鹼)。
其他效應分子可包括螯合放射性核素，諸如111In及90Y、Lu177、鉍213、鐦252、銥192及鎢188/錸188；或藥物，諸如(但不限於)烷基磷酸膽鹼、拓樸異構酶I抑制劑、類紫杉醇及蘇拉明(suramin)。
其他效應分子包括蛋白質、肽及酶。相關酶包括但不限於蛋白水解酶、水解酶、裂解酶、異構酶、轉移酶。相關蛋白質、多肽及肽包括(但不限於)免疫球蛋白、毒素(諸如相思子毒素、蓖麻毒素A、綠膿桿菌外毒素或白喉毒素)、蛋白質(諸如胰島素、腫瘤壞死因子、α-干擾素、β-干擾素、神經生長因子、血小板衍生生長因子或組織纖維蛋白溶酶原活化因子)、血栓溶解劑或抗血管生成劑(例如血管生長抑素或內皮生長抑素)或生物反應調節劑(諸如淋巴激素、介白素-1 (IL-1)、介白素-2 (IL-2)、顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)、粒細胞群落刺激因子(G-CSF)、神經生長因子(NGF)或其他生長因子及免疫球蛋白)。
其他效應分子可包括適用於例如診斷之可偵測物質。可偵測物質之實例包括各種酶、輔基、螢光物質、發光物質、生物發光物質、放射性核素、正電子發射金屬(用於正電子發射斷層攝影法)及非放射性順磁性金屬離子。關於可結合於抗體用於診斷學之金屬離子，一般參見美國專利第4,741,900號。適合酶包括辣根過氧化酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶；適合輔基包括抗生蛋白鏈菌素、抗生物素蛋白及生物素；適合螢光物質包括傘酮、螢光素、異硫氰酸螢光素、若丹明、二氯三嗪基胺螢光素、丹磺醯氯及藻紅素；適合發光材料包括魯米諾(luminol)；適合生物發光材料包括螢光素酶、螢光素及水母素；且適合放射性核素包括125I、131I、111In及99Tc。
在另一實例中，效應分子可延長抗體之活體內半衰期，及/或降低抗體之免疫原性及/或增強抗體跨越上皮屏障至免疫系統之遞送。此類型之適合效應分子之實例包括聚合物、白蛋白、白蛋白結合蛋白或白蛋白結合化合物，諸如WO05/117984中描述之彼等化合物。
在效應分子為聚合物之情況下，其一般可為合成或天然存在之聚合物，例如視情況經取代之直鏈或分支鏈聚伸烷基、聚伸烯基或聚氧化烯聚合物或分支鏈或未分支多醣(例如均多醣或雜多醣)。
可存在於上述合成聚合物上的視情況存在之特定取代基包括一或多個羥基、甲基或甲氧基。
合成聚合物之特定實例包括視情況經取代之直鏈或分支鏈聚(乙二醇)、聚(丙二醇)、聚(乙烯醇)或其衍生物，尤其視情況經取代之聚(乙二醇)，諸如甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物。
特定天然存在之聚合物包括乳糖、直鏈澱粉、聚葡萄糖、肝糖或其衍生物。
在一個實施例中，聚合物為白蛋白或其片段，諸如人類血清白蛋白或其片段。
如本文所用，「衍生物」意欲包括反應性衍生物，例如硫醇選擇性反應基，諸如順丁烯二醯亞胺及其類似物。反應性基團可直接或經由連接子區段連接於聚合物。應瞭解此類基團之殘基在一些情況下將作為抗體片段與聚合物之間的鍵聯基團形成產物之一部分。
聚合物之尺寸可按需要變化，但一般將在500Da至50000Da、例如5000至40000Da，諸如20000至40000Da之平均分子量範圍內。聚合物尺寸可尤其基於產物之意欲用途，例如定位至某些組織，諸如腫瘤或延長循環半衰期之能力而選擇(評述參見Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 531-545)。因此，舉例而言，在產物意欲離開循環且滲透組織，例如用於治療腫瘤之情況下，宜使用例如分子量為大約5000Da之小分子量聚合物。對於產物仍然在循環中之應用，宜使用較高分子量聚合物，例如分子量在20000Da至40000Da範圍內
適合聚合物包括聚伸烷基聚合物，諸如聚(乙二醇)或尤其甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物，且尤其分子量在約15000Da至約40000Da範圍內。
在一個實例中，根據本發明之抗體附接於聚(乙二醇) (PEG)部分。在一個特定實施例中，根據本發明之抗體及PEG分子可經由定位於抗體片段中之任何可用胺基酸側鏈或末端胺基酸官能基(例如任何游離胺基、亞胺基、巰基、羥基或羧基)附接。此類胺基酸可天然存在於抗體片段中或可使用重組DNA方法經工程改造至抗體中(參見例如US 5,219,996；US 5,667,425；WO98/25971、WO2008/038024)。在一個實例中，本發明之抗體係經修飾之Fab片段，其中該修飾係將一或多個胺基酸添加至其重鏈之C末端以允許附接效應分子。適合地，附加的胺基酸形成含有效應分子可連接之一或多個半胱胺酸殘基的經修飾鉸鏈區。可使用多個位點連接兩個或更多個PEG分子。
PEG分子宜經由位於抗體片段中的至少一個半胱胺酸殘基之巰基共價連接。連接至經修飾抗體片段之各聚合物分子可共價連接於位於片段中的半胱胺酸殘基之硫原子。共價鍵一般為二硫鍵或尤其硫-碳鍵。在巰基用作連接點的情況下，可使用經適當活化之效應分子，例如巰基選擇性衍生物，諸如順丁烯二醯亞胺及半胱胺酸衍生物。在如上所述之經聚合物修飾的抗體片段之製備中，可使用活化聚合物作為起始物質。活化聚合物可為含有硫醇反應性基團之任何聚合物，諸如α-鹵基羧酸或酯，例如碘乙醯胺、醯亞胺(例如順丁烯二醯亞胺)、乙烯基碸或二硫化物。此類起始物質可商購(例如購自Nektar，以前為Shearwater Polymers Inc., Huntsville, AL, USA)或可使用習知化學程序由可商購的起始物質製備。特定PEG分子包括20K甲氧基-PEG-胺(可獲自Nektar，以前為Shearwater；Rapp Polymere；以及SunBio)及M-PEG-SPA (可獲自Nektar，以前為Shearwater)。
在一個實施例中，抗體為經修飾之Fab片段、Fab'片段或diFab，其例如根據EP 0948544或EP1090037中揭示之方法聚乙二醇化，亦即PEG (聚(乙二醇))共價附接於其(亦參見「Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications」, 1992, J. Milton Harris (編), Plenum Press, New York, 「Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications」, 1997, J. Milton Harris及S. Zalipsky (編), American Chemical Society, Washington DC及「Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences」, 1998, M. Aslam及A. Dent, Grove Publishers, New York; Chapman, A. 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 2002, 54:531-545)。在一個實例中，PEG連接於鉸鏈區中之半胱胺酸。在一個實例中，經PEG修飾之Fab片段具有共價連接於經修飾之鉸鏈區中單一巰基的順丁烯二醯亞胺基團。離胺酸殘基可共價連接於順丁烯二醯亞胺基且離胺酸殘基上之各胺基可附接分子量為大約20,000Da之甲氧基聚(乙二醇)聚合物。因此附接於Fab片段之PEG的總分子量可為大約40,000Da。
特定PEG分子包括經N,N'-雙(甲氧基聚(乙二醇) MW 20,000)修飾之離胺酸的2-[3-(N-順丁烯二醯亞胺基)丙醯胺基]乙基醯胺，亦稱為PEG2MAL40K (可獲自Nektar，以前為Shearwater)。
PEG連接子之替代來源包括NOF，其供應GL2-400MA3 (其中以下結構中之m為5)及GL2-400MA (其中m為2)且n大約為450：
Figure 02_image001
。
因此，在一個實施例中，PEG為2,3-雙(甲基聚氧乙烯-氧基)-1-{[3-(6-順丁烯二醯亞胺基-1-側氧基己基)胺基]丙基氧基}己烷(2臂分支鏈PEG，-CH2) 3NHCO(CH2)5-MAL，Mw 40,000，稱為SUNBRIGHT GL2-400MA3。
以下類型之其他替代PEG效應分子：
Figure 02_image003
可獲自Dr Reddy、NOF及Jenkem。
在一個實施例中，根據本發明之Fab或Fab'結合於PEG分子。
在一個實施例中，本發明提供一種Fab'PEG分子，其包含一或多個PEG聚合物，例如1或2個聚合物，諸如40kDa聚合物。
根據本發明之Fab'-PEG分子尤其有利，因為其具有與Fc片段無關之半衰期。在一個實施例中，提供結合於諸如PEG分子、澱粉分子或白蛋白分子之聚合物之Fab'。在一個實施例中，提供結合於諸如PEG分子、澱粉分子或白蛋白分子之聚合物之scFv。在一個實施例中，根據本發明之Fab或Fab'結合於人類血清白蛋白。在一個實施例中，抗體或片段結合於澱粉分子，例如以增加半衰期。澱粉結合於蛋白質之方法如US 8,017,739中所述，以引用的方式併入本文中。
本發明亦提供編碼根據本發明之抗體的經分離之聚核苷酸。根據本發明之經分離之聚核苷酸可包含合成DNA，其例如藉由化學處理、cDNA、基因體DNA或其任何組合製備。
可使用分子生物學之標準技術製備編碼本發明之抗體分子的DNA序列。所需DNA序列可使用寡核苷酸合成技術完全或部分合成。適當時可使用定點突變誘發及聚合酶鏈反應(PCR)技術。
在一個實施例中，根據本發明之經分離之聚核苷酸編碼： a.  輕鏈可變區，其中該聚核苷酸： i.   與SEQ ID NO: 8 (或SEQ ID NO: 8之核苷酸1至330)或12 (或SEQ ID NO: 12之核苷酸1至330)或16或20或24或64或66至少90%一致；或 ii.  包含SEQ ID NO: 8 (或SEQ ID NO: 8之核苷酸1至330)或12 (或SEQ ID NO: 12之核苷酸1至330)或16或20或24或64或66；或 iii. 基本上由SEQ ID NO: 8 (或SEQ ID NO: 8之核苷酸1至330)或12 (或SEQ ID NO: 12之核苷酸1至330)或16或20或24或64或66組成； b.  重鏈可變區，其中該聚核苷酸： i.   與SEQ ID NO: 10或28或32或36或40或44至少90%一致；或 ii.  包含SEQ ID NO: 10或28或32或36或40或44；或 iii. 基本上由SEQ ID NO: 10或28或32或36或40或44組成； c.  輕鏈，其中該聚核苷酸： i.   與SEQ ID NO: 14或18或22或26或65或67或100或101或102或103或104至少90%一致；或 ii.  包含SEQ ID NO: 14或18或22或26或65或67或100或101或102或103或104；或 iii. 基本上由SEQ ID NO: 14或18或22或26或65或67或100或101或102或103或104組成； d.  重鏈，其中該聚核苷酸： i.   與SEQ ID NO: 30或34或38或42或46至少90%一致；或 ii.  包含SEQ ID NO: 30或34或38或42或46；或 iii. 基本上由SEQ ID NO: 30或34或38或42或46組成。
在一個實施例中，本發明提供一種經分離之聚核苷酸，其編碼本發明之抗體Fab'片段或IgG1或IgG4抗體的重鏈，包含SEQ ID NO: 10或28或32或36或40或44中給出之序列。亦提供一種經分離之聚核苷酸，其編碼本發明之抗體Fab'片段或IgG1或IgG4抗體的輕鏈，包含SEQ ID NO: 8 (或SEQ ID NO: 8之核苷酸1至330)或12 (或SEQ ID NO: 12之核苷酸1至330)或16或20或24或64或66中給出之序列。
在另一實施例中，本發明提供一種經分離之聚核苷酸，其編碼本發明之IgG4(P)抗體之重鏈及輕鏈，其中編碼重鏈之聚核苷酸包含SEQ ID NO: 30或34或38或42或46中給出之序列且編碼輕鏈之聚核苷酸包含SEQ ID NO: 14或18或22或26或65或67或100或101或102或103或104中給出之序列。
本發明亦提供選殖或表現載體，其包含一或多種本文中所述之聚核苷酸。在一個實例中，根據本發明之選殖或表現載體包含一或多種經分離之聚核苷酸，其包含選自SEQ ID NO: 14或18或22或26或65或67或100或101或102或103或104或30或34或38或42或46之序列。
構築載體之通用方法、轉染方法及培養方法為熟習此項技術者所熟知。就此而言，參考「Current Protocols in Molecular Biology」, 1999, F. M. Ausubel (編), Wiley Interscience, New York及由Cold Spring Harbor Publishing出版之Maniatis Manual。
本發明亦提供一種宿主細胞，其包含根據本發明之一或多種經分離之聚核苷酸序列或包含編碼本發明之抗體之一或多種經分離之聚核苷酸序列的一或多種選殖或表現載體。任何適合之宿主細胞/載體系統可用於表現編碼本發明之抗體的聚核苷酸序列。可使用細菌，例如大腸桿菌及其他微生物系統，或亦可使用真核(例如哺乳動物)宿主細胞表現系統。適合哺乳動物宿主細胞包括CHO、骨髓瘤或融合瘤細胞。
用於本發明之中國倉鼠卵巢(CHO細胞)的適合類型可包括CHO及CHO-K1細胞，包括dhfr- CHO細胞，諸如可與DHFR可選標記物一起使用之CHO-DG44細胞及CHO-DXB11細胞或可與麩醯胺酸合成酶可選標記物一起使用之CHOK1-SV細胞。用於表現抗體之其他細胞類型包括淋巴球性細胞株，例如NSO骨髓瘤細胞及SP2細胞、COS細胞。宿主細胞可用根據本發明之經分離之聚核苷酸序列或表現載體穩定轉型或轉染。
在一個實施例中，根據本發明之宿主細胞為經表現載體穩定轉染之CHO-DG44細胞，該表現載體包含本發明之經分離之聚核苷酸序列，較佳包括包含SEQ ID NO: 8 (或SEQ ID NO: 8之核苷酸1至330)、10、12 (或SEQ ID NO: 12之核苷酸1至330)、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、64、65、66、67、100、101、102、103或104的經分離之聚核苷酸序列。
本發明亦提供一種用於產生根據本發明之結合KLK5之抗體的方法，其包含在適合於產生抗體之條件下培養根據本發明之宿主細胞且分離由此產生之抗體。
抗體可僅包含重鏈或輕鏈，在此情況下僅重鏈或輕鏈聚核苷酸序列需要用於轉染宿主細胞。為產生包含重鏈及輕鏈之抗體，細胞株可經兩種載體轉染，第一載體編碼輕鏈且第二載體編碼重鏈。或者，可使用單一載體，該載體包含編碼輕鏈及重鏈之聚核苷酸序列。
因此，提供一種培養宿主細胞且表現抗體，分離後者且視情況純化其以提供分離之抗體或片段的方法。因此，在一個實施例中，提供一種經分離之結合KLK5、較佳人類KLK5之抗體，諸如人類化抗體，尤其根據本發明之抗體，其基本上經純化、尤其不含或實質上不含內毒素及/或宿主細胞蛋白質或DNA，其中該抗體包含： 1.  可變輕鏈及可變重鏈，且其中該可變輕鏈包括包含SEQ ID NO: 1之CDR-L1、包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；且該可變重鏈包括包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3；或 2.  可變輕鏈及可變重鏈，且其中該可變輕鏈包括包含SEQ ID NO: 62之CDR-L1、包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；且該可變重鏈包括包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3；或 3.  可變輕鏈及可變重鏈，且其中該可變輕鏈包括包含SEQ ID NO: 63之CDR-L1、包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；且該可變重鏈包括包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3；或 4.  包含SEQ ID NO: 7或11或15或19或23之可變輕鏈；及包含SEQ ID NO: 9或27或31或35或39或43之可變重鏈；或 5.  包含SEQ ID NO: 15之可變輕鏈，其中參考SEQ ID NO: 15之胺基酸殘基麩醯胺酸24 (Gln；Q)為精胺酸(Arg；R)或離胺酸(Lys；K)；及包含SEQ ID NO: 9或27或31或35或39或43之可變重鏈；或 6.  包含SEQ ID NO: 13或17或21或25之輕鏈及包含SEQ ID NO: 29或33或37或41或45之重鏈。
在另一實施例中，提供一種經分離之結合KLK5、較佳人類KLK5之抗體，諸如人類化抗體，尤其根據本發明之抗體，其基本上經純化、尤其不含或實質上不含內毒素及/或宿主細胞蛋白質或DNA，其中該抗體結合於人類KLK5的參考SEQ ID NO: 51包含胺基酸殘基Arg87、Ala107、Arg110、Lys111、Lys112、Val113、Val137、Lys138、Ser139、Ile140、Pro141、His142、Pro143、Tyr145、Ser146及His147之抗原決定基且其中該抗體包含： 1.  可變輕鏈及可變重鏈，且其中該可變輕鏈包括包含SEQ ID NO: 1之CDR-L1、包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；且該可變重鏈包括包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3；或 2.  可變輕鏈及可變重鏈，且其中該可變輕鏈包括包含SEQ ID NO: 62之CDR-L1、包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；且該可變重鏈包括包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3；或 3.  可變輕鏈及可變重鏈，且其中該可變輕鏈包括包含SEQ ID NO: 63之CDR-L1、包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；且該可變重鏈包括包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3；或 4.  包含SEQ ID NO: 7或11或15或19或23之可變輕鏈；及包含SEQ ID NO: 9或27或31或35或39或43之可變重鏈；或 5.  包含SEQ ID NO: 15之可變輕鏈，其中參考SEQ ID NO: 15之胺基酸殘基麩醯胺酸24 (Gln；Q)為精胺酸(Arg；R)或離胺酸(Lys；K)；及包含SEQ ID NO: 9或27或31或35或39或43之可變重鏈；或 6.  包含SEQ ID NO: 13或17或21或25之輕鏈及包含SEQ ID NO: 29或33或37或41或45之重鏈。
實質上不含內毒素一般意指每毫克抗體產物內毒素含量為1 EU或更低，諸如每毫克產物0.5或0.1 EU。
實質上不含宿主細胞蛋白質或DNA一般意指每毫克抗體產物400 µg宿主細胞蛋白質及/或DNA含量或更低，諸如每毫克100 µg或更低，尤其適當時每毫克20 µg。
因為本發明之抗體適用於治療、診斷及/或預防病理性病狀，所以本發明亦提供一種醫藥或診斷組合物，其包含根據本發明之抗體與一或多種醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載體組合。
較佳地，該醫藥或診斷組合物包含結合KLK5、較佳人類KLK5之抗體，其中該抗體包含： 1.  可變輕鏈及可變重鏈，且其中該可變輕鏈包括包含SEQ ID NO: 1之CDR-L1、包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；且該可變重鏈包括包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3；或 2.  可變輕鏈及可變重鏈，且其中該可變輕鏈包括包含SEQ ID NO: 62之CDR-L1、包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；且該可變重鏈包括包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3；或 3.  可變輕鏈及可變重鏈，且其中該可變輕鏈包括包含SEQ ID NO: 63之CDR-L1、包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；且該可變重鏈包括包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3；或 4.  包含SEQ ID NO: 7或11或15或19或23之可變輕鏈；及包含SEQ ID NO: 9或27或31或35或39或43之可變重鏈；或 5.  包含SEQ ID NO: 15之可變輕鏈，其中參考SEQ ID NO: 15之胺基酸殘基麩醯胺酸24 (Gln；Q)為精胺酸(Arg；R)或離胺酸(Lys；K)；及包含SEQ ID NO: 9或27或31或35或39或43之可變重鏈；或 6.  包含SEQ ID NO: 13或17或21或25之輕鏈及包含SEQ ID NO: 29或33或37或41或45之重鏈。
較佳地，抗體結合於人類KLK5的參考SEQ ID NO: 51包含胺基酸殘基Arg87、Ala107、Arg110、Lys111、Lys112、Val113、Val137、Lys138、Ser139、Ile140、Pro141、His142、Pro143、Tyr145、Ser146及His147之抗原決定基。
在一個實施例中，根據本發明之抗體為唯一活性成分。在另一實施例中，根據本發明之抗體與一或多種額外活性成分組合。或者，醫藥組合物包含根據本發明之抗體，其係唯一活性成分且其可與其他治療性、診斷性或緩解性試劑組合(例如同時、依序或分開)單獨地向患者投與。
在另一實施例中，醫藥組合物包含結合KLK5、較佳人類KLK5之抗體，其中該抗體包含： 1.  可變輕鏈及可變重鏈，且其中該可變輕鏈包括包含SEQ ID NO: 1之CDR-L1、包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；且該可變重鏈包括包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3；或 2.  可變輕鏈及可變重鏈，且其中該可變輕鏈包括包含SEQ ID NO: 62之CDR-L1、包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；且該可變重鏈包括包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3；或 3.  可變輕鏈及可變重鏈，且其中該可變輕鏈包括包含SEQ ID NO: 63之CDR-L1、包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；且該可變重鏈包括包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3；或 4.  包含SEQ ID NO: 7或11或15或19或23之可變輕鏈；及包含SEQ ID NO: 9或27或31或35或39或43之可變重鏈；或 5.  包含SEQ ID NO: 15之可變輕鏈，其中參考SEQ ID NO: 15之胺基酸殘基麩醯胺酸24 (Gln；Q)為精胺酸(Arg；R)或離胺酸(Lys；K)；及包含SEQ ID NO: 9或27或31或35或39或43之可變重鏈；或 6.  包含SEQ ID NO: 13或17或21或25之輕鏈及包含SEQ ID NO: 29或33或37或41或45之重鏈； 及一或多種醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或稀釋劑。
較佳地，包含結合KLK5之抗體之醫藥組合物結合於人類KLK5的參考SEQ ID NO: 51包含胺基酸殘基Arg87、Ala107、Arg110、Lys111、Lys112、Val113、Val137、Lys138、Ser139、Ile140、Pro141、His142、Pro143、Tyr145、Ser146及His147之抗原決定基。更佳地，醫藥組合物包含結合KLK5之抗體，其中該抗體結合於人類KLK5的參考SEQ ID NO: 51包含胺基酸殘基Arg87、Ala107、Arg110、Lys111、Lys112、Val113、Val137、Lys138、Ser139、Ile140、Pro141、His142、Pro143、Tyr145、Ser146及His147之抗原決定基，且該抗體包含SEQ ID NO: 15之輕鏈可變區及SEQ ID NO: 39之重鏈可變區。
根據本發明之醫藥組合物可適當地向患者投與以鑑別所需之治療有效量。如本文所用，術語「治療有效量」係指治療、改善或預防靶向疾病或病狀或展現可偵測之治療或預防效果所需要的治療劑之量。關於任何抗體，治療有效量可最初在細胞培養分析中或在動物模型中，通常在嚙齒動物、兔、狗、豬或靈長類中估算。動物模型亦可用於確定投與之適當濃度範圍及途徑。此類資訊可隨後用於確定適用於在人體內投與之劑量及途徑。
用於人類個體之精確治療有效量將視疾病狀態之嚴重程度、個體之整體健康狀況、個體之年齡、體重及性別、飲食、投與之時間及頻率、藥物組合、反應敏感性及對療法之耐受性/反應而定。一般而言，治療有效量為0.01 mg/kg至500 mg/kg，例如0.1 mg/kg至200 mg/kg，諸如100 mg/Kg。醫藥組合物宜以每劑含有預定量之本發明之活性劑的單位劑型呈現。
治療組合物中醫藥學上可接受之載劑可另外含有液體，諸如水、生理食鹽水、甘油及乙醇。另外，諸如濕潤劑或乳化劑或pH緩衝物質之輔助物質可存在於該等組合物中。此類載劑使得醫藥組合物能夠調配成錠劑、丸劑、糖衣藥丸、膠囊、液體、凝膠、糖漿、漿液及懸浮液，以便患者攝入。
適合之投藥形式包括適用於非經腸投藥之形式，例如藉由注射或輸注，例如藉由推注注射或連續輸注、靜脈內、可吸入或皮下形式。在產品用於注射或輸注的情況下，其可採用於油性或水性媒劑中之懸浮液、溶液或乳液的形式且其可含有調配劑，諸如懸浮劑、防腐劑、穩定劑及/或分散劑。或者，根據本發明之抗體可呈乾燥形式，在使用之前用適當無菌液體復原。亦可製備適合於在注射前溶解或懸浮於液體媒劑中之固體形式。
一旦調配，本發明之組合物可向個體直接投與。因此，本文提供根據本發明之抗體在藥劑製造中之用途。
較佳地，根據本發明之醫藥組合物適用於向人類個體投與。
因此，在另一態樣中，本發明提供結合KLK5之抗體，其中該抗體或包含該抗體之醫藥組合物用於療法中，其中該抗體包含： 1.  可變輕鏈及可變重鏈，且其中該可變輕鏈包括包含SEQ ID NO: 1之CDR-L1、包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；且該可變重鏈包括包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3；或 2.  可變輕鏈及可變重鏈，且其中該可變輕鏈包括包含SEQ ID NO: 62之CDR-L1、包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；且該可變重鏈包括包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3；或 3.  可變輕鏈及可變重鏈，且其中該可變輕鏈包括包含SEQ ID NO: 63之CDR-L1、包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；且該可變重鏈包括包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3；或 4.  包含SEQ ID NO: 7或11或15或19或23之可變輕鏈；及包含SEQ ID NO: 9或27或31或35或39或43之可變重鏈；或 5.  包含SEQ ID NO: 15之可變輕鏈，其中參考SEQ ID NO: 15之胺基酸殘基麩醯胺酸24 (Gln；Q)為精胺酸(Arg；R)或離胺酸(Lys；K)；及包含SEQ ID NO: 9或27或31或35或39或43之可變重鏈；或 6.  包含SEQ ID NO: 13或17或21或25之輕鏈及包含SEQ ID NO: 29或33或37或41或45之重鏈。
較佳地，抗體結合於人類KLK5的參考SEQ ID NO: 51包含胺基酸殘基Arg87、Ala107、Arg110、Lys111、Lys112、Val113、Val137、Lys138、Ser139、Ile140、Pro141、His142、Pro143、Tyr145、Ser146及His147之抗原決定基。
在一較佳實施例中，結合KLK5之抗體或包含該抗體之醫藥組合物，用於療法中，其中該抗體包含： 1.  可變輕鏈及可變重鏈，且其中該可變輕鏈包括包含SEQ ID NO: 1之CDR-L1、包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；且該可變重鏈包括包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3；或 2.  包含SEQ ID NO: 15之可變輕鏈；及包含SEQ ID NO: 39之可變重鏈；或 3.  包含SEQ ID NO: 17之輕鏈及包含SEQ ID NO: 41之重鏈。
較佳地，抗體結合於人類KLK5的參考SEQ ID NO: 51包含胺基酸殘基Arg87、Ala107、Arg110、Lys111、Lys112、Val113、Val137、Lys138、Ser139、Ile140、Pro141、His142、Pro143、Tyr145、Ser146及His147之抗原決定基。
在另一較佳實施例中，結合KLK5之抗體或包含該抗體之醫藥組合物，其用於療法中，其中該抗體結合於人類KLK5的參考SEQ ID NO: 51包含胺基酸殘基Arg87、Ala107、Arg110、Lys111、Lys112、Val113、Val137、Lys138、Ser139、Ile140、Pro141、His142、Pro143、Tyr145、Ser146及His147之抗原決定基，且其中該抗體包含可變輕鏈及可變重鏈，其中該抗體包含： 1.  可變輕鏈及可變重鏈，且其中該可變輕鏈包括包含SEQ ID NO: 1之CDR-L1、包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；且該可變重鏈包括包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3；或 2.  包含SEQ ID NO: 15之可變輕鏈；及包含SEQ ID NO: 39之可變重鏈；或 3.  包含SEQ ID NO: 17之輕鏈及包含SEQ ID NO: 41之重鏈。
詳言之，在療法中之用途包含治療特徵為KLK5失調或對KLK5之抑制失調之一或多種疾病的用途。
在另一態樣中，本發明提供治療患者之特徵為KLK5失調或對KLK5之抑制失調之一或多種疾病的方法，其包含向該患者投與治療有效量之結合KLK5之抗體或包含該抗體之醫藥組合物，其中該抗體包含： 1.  可變輕鏈及可變重鏈，且其中該可變輕鏈包括包含SEQ ID NO: 1之CDR-L1、包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；且該可變重鏈包括包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3；或 2.  可變輕鏈及可變重鏈，且其中該可變輕鏈包括包含SEQ ID NO: 62之CDR-L1、包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；且該可變重鏈包括包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3；或 3.  可變輕鏈及可變重鏈，且其中該可變輕鏈包括包含SEQ ID NO: 63之CDR-L1、包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；且該可變重鏈包括包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3；或 4.  包含SEQ ID NO: 7或11或15或19或23之可變輕鏈；及包含SEQ ID NO: 9或27或31或35或39或43之可變重鏈；或 5.  包含SEQ ID NO: 15之可變輕鏈，其中參考SEQ ID NO: 15之胺基酸殘基麩醯胺酸24 (Gln；Q)為精胺酸(Arg；R)或離胺酸(Lys；K)；及包含SEQ ID NO: 9或27或31或35或39或43之可變重鏈；或 6.  包含SEQ ID NO: 13或17或21或25之輕鏈及包含SEQ ID NO: 29或33或37或41或45之重鏈。
較佳地，抗體結合於人類KLK5的參考SEQ ID NO: 51包含胺基酸殘基Arg87、Ala107、Arg110、Lys111、Lys112、Val113、Val137、Lys138、Ser139、Ile140、Pro141、His142、Pro143、Tyr145、Ser146及His147之抗原決定基。
在另一較佳實施例中，本發明提供治療患者之特徵為KLK5失調或對KLK5之抑制失調之一或多種疾病的方法，其包含向該患者投與治療有效量之抗體或包含該抗體之醫藥組合物，其中該抗體包含： 1.  可變輕鏈及可變重鏈，且其中該可變輕鏈包括包含SEQ ID NO: 1之CDR-L1、包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；且該可變重鏈包括包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3；或 2.  包含SEQ ID NO: 15之可變輕鏈；及包含SEQ ID NO: 39之可變重鏈；或 3.  包含SEQ ID NO: 17之輕鏈及包含SEQ ID NO: 41之重鏈。
較佳地，抗體結合於人類KLK5的參考SEQ ID NO: 51包含胺基酸殘基Arg87、Ala107、Arg110、Lys111、Lys112、Val113、Val137、Lys138、Ser139、Ile140、Pro141、His142、Pro143、Tyr145、Ser146及His147之抗原決定基。
在另一態樣中，結合KLK5之抗體或包含該抗體之醫藥組合物，其中該抗體用於治療特徵為KLK5失調或對KLK5之抑制失調的一或多種疾病，其中該抗體包含： 1.  可變輕鏈及可變重鏈，且其中該可變輕鏈包括包含SEQ ID NO: 1之CDR-L1、包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；且該可變重鏈包括包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3；或 2.  可變輕鏈及可變重鏈，且其中該可變輕鏈包括包含SEQ ID NO: 62之CDR-L1、包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；且該可變重鏈包括包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3；或 3.  可變輕鏈及可變重鏈，且其中該可變輕鏈包括包含SEQ ID NO: 63之CDR-L1、包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；且該可變重鏈包括包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3；或 4.  包含SEQ ID NO: 7或11或15或19或23之可變輕鏈；及包含SEQ ID NO: 9或27或31或35或39或43之可變重鏈；或 5.  包含SEQ ID NO: 15之可變輕鏈，其中參考SEQ ID NO: 15之胺基酸殘基麩醯胺酸24 (Gln；Q)為精胺酸(Arg；R)或離胺酸(Lys；K)；及包含SEQ ID NO: 9或27或31或35或39或43之可變重鏈；或 6.  包含SEQ ID NO: 13或17或21或25之輕鏈及包含SEQ ID NO: 29或33或37或41或45之重鏈。
較佳地，抗體結合於人類KLK5的參考SEQ ID NO: 51包含胺基酸殘基Arg87、Ala107、Arg110、Lys111、Lys112、Val113、Val137、Lys138、Ser139、Ile140、Pro141、His142、Pro143、Tyr145、Ser146及His147之抗原決定基。
在另一較佳實施例中，結合KLK5之抗體或包含該抗體之醫藥組合物，其中該抗體用於治療特徵為KLK5之失調或對KLK5之抑制失調的一或多種疾病，其中該抗體包含： 1.  可變輕鏈及可變重鏈，且其中該可變輕鏈包括包含SEQ ID NO: 1之CDR-L1、包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；且該可變重鏈包括包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3；或 2.  包含SEQ ID NO: 15之可變輕鏈；及包含SEQ ID NO: 39之可變重鏈；或 3.  包含SEQ ID NO: 17之輕鏈及包含SEQ ID NO: 41之重鏈。
較佳地，抗體結合於人類KLK5的參考SEQ ID NO: 51包含胺基酸殘基Arg87、Ala107、Arg110、Lys111、Lys112、Val113、Val137、Lys138、Ser139、Ile140、Pro141、His142、Pro143、Tyr145、Ser146及His147之抗原決定基。
較佳地，特徵為KLK5失調或對KLK5之抑制失調的一或多種疾病係選自內瑟頓氏症候群、異位性皮膚炎、魚鱗病、紅斑痤瘡、氣喘或癌症(諸如卵巢癌或膀胱癌)或其組合。
因此，本發明提供一種治療患者之內瑟頓氏症候群、異位性皮膚炎、魚鱗病、紅斑痤瘡、氣喘或癌症(諸如卵巢癌或膀胱癌)或其組合之方法，其包含向該患者投與治療有效量之結合KLK5之抗體或包含該抗體之醫藥組合物，其中該抗體包含： 1.  可變輕鏈及可變重鏈，且其中該可變輕鏈包括包含SEQ ID NO: 1之CDR-L1、包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；且該可變重鏈包括包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3；或 2.  可變輕鏈及可變重鏈，且其中該可變輕鏈包括包含SEQ ID NO: 62之CDR-L1、包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；且該可變重鏈包括包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3；或 3.  可變輕鏈及可變重鏈，且其中該可變輕鏈包括包含SEQ ID NO: 63之CDR-L1、包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；且該可變重鏈包括包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3；或 4.  包含SEQ ID NO: 7或11或15或19或23之可變輕鏈；及包含SEQ ID NO: 9或27或31或35或39或43之可變重鏈；或 5.  包含SEQ ID NO: 15之可變輕鏈，其中參考SEQ ID NO: 15之胺基酸殘基麩醯胺酸24 (Gln；Q)為精胺酸(Arg；R)或離胺酸(Lys；K)；及包含SEQ ID NO: 9或27或31或35或39或43之可變重鏈；或 6.  包含SEQ ID NO: 13或17或21或25之輕鏈及包含SEQ ID NO: 29或33或37或41或45之重鏈。
較佳地，抗體結合於人類KLK5的參考SEQ ID NO: 51包含胺基酸殘基Arg87、Ala107、Arg110、Lys111、Lys112、Val113、Val137、Lys138、Ser139、Ile140、Pro141、His142、Pro143、Tyr145、Ser146及His147之抗原決定基。
更佳地，該方法用於治療內瑟頓氏症候群及/或異位性皮膚炎。
在另一態樣中，提供一種結合KLK5之抗體或包含該抗體之醫藥組合物，其中該抗體用於治療內瑟頓氏症候群、異位性皮膚炎、魚鱗病、紅斑痤瘡、氣喘或癌症(諸如卵巢癌或膀胱癌)或其組合，且其中該抗體包含： 1.  可變輕鏈及可變重鏈，且其中該可變輕鏈包括包含SEQ ID NO: 1之CDR-L1、包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；且該可變重鏈包括包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3；或 2.  可變輕鏈及可變重鏈，且其中該可變輕鏈包括包含SEQ ID NO: 62之CDR-L1、包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；且該可變重鏈包括包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3；或 3.  可變輕鏈及可變重鏈，且其中該可變輕鏈包括包含SEQ ID NO: 63之CDR-L1、包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；且該可變重鏈包括包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3；或 4.  包含SEQ ID NO: 7或11或15或19或23之可變輕鏈；及包含SEQ ID NO: 9或27或31或35或39或43之可變重鏈；或 5.  包含SEQ ID NO: 15之可變輕鏈，其中參考SEQ ID NO: 15之胺基酸殘基麩醯胺酸24 (Gln；Q)為精胺酸(Arg；R)或離胺酸(Lys；K)；及包含SEQ ID NO: 9或27或31或35或39或43之可變重鏈；或 6.  包含SEQ ID NO: 13或17或21或25之輕鏈及包含SEQ ID NO: 29或33或37或41或45之重鏈。
較佳地，抗體結合於人類KLK5的參考SEQ ID NO: 51包含胺基酸殘基Arg87、Ala107、Arg110、Lys111、Lys112、Val113、Val137、Lys138、Ser139、Ile140、Pro141、His142、Pro143、Tyr145、Ser146及His147之抗原決定基。
更佳地，該抗體用於治療內瑟頓氏症候群及/或異位性皮膚炎。
在另一較佳實施例中，提供本發明提供一種治療患者之內瑟頓氏症候群、異位性皮膚炎、魚鱗病、紅斑痤瘡、氣喘或癌症(諸如卵巢癌或膀胱癌)或其組合之方法，其包含向該患者投與治療有效量之結合KLK5之抗體或包含該抗體之醫藥組合物，其中該抗體包含： 1.  可變輕鏈及可變重鏈，且其中該可變輕鏈包括包含SEQ ID NO: 1之CDR-L1、包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；且該可變重鏈包括包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3；或 2.  包含SEQ ID NO: 15之可變輕鏈；及包含SEQ ID NO: 39之可變重鏈；或 3.  包含SEQ ID NO: 17之輕鏈及包含SEQ ID NO: 41之重鏈。
較佳地，抗體結合於人類KLK5的參考SEQ ID NO: 51包含胺基酸殘基Arg87、Ala107、Arg110、Lys111、Lys112、Val113、Val137、Lys138、Ser139、Ile140、Pro141、His142、Pro143、Tyr145、Ser146及His147之抗原決定基。
更佳地，該方法用於治療內瑟頓氏症候群及/或異位性皮膚炎。
在另一較佳實施例中，結合KLK5之抗體或包含該抗體之醫藥組合物用於治療內瑟頓氏症候群、異位性皮膚炎、魚鱗病、紅斑痤瘡、氣喘或癌症(諸如卵巢癌或膀胱癌)或其組合，且其中該抗體包含： 1.  可變輕鏈及可變重鏈，且其中該可變輕鏈包括包含SEQ ID NO: 1之CDR-L1、包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；且該可變重鏈包括包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3；或 2.  包含SEQ ID NO: 15之可變輕鏈；及包含SEQ ID NO: 39之可變重鏈；或 3.  包含SEQ ID NO: 17之輕鏈及包含SEQ ID NO: 41之重鏈。
較佳地，抗體結合於人類KLK5的參考SEQ ID NO: 51包含胺基酸殘基Arg87、Ala107、Arg110、Lys111、Lys112、Val113、Val137、Lys138、Ser139、Ile140、Pro141、His142、Pro143、Tyr145、Ser146及His147之抗原決定基。
更佳地，該抗體用於治療內瑟頓氏症候群及/或異位性皮膚炎。
本發明亦提供結合KLK5之抗體或包含該抗體之醫藥組合物，其中該抗體用於治療內瑟頓氏症候群、異位性皮膚炎、魚鱗病、紅斑痤瘡、氣喘或癌症(諸如卵巢癌或膀胱癌)或其組合，且其中該抗體結合於人類KLK5的參考SEQ ID NO: 51包含胺基酸殘基Arg87、Ala107、Arg110、Lys111、Lys112、Val113、Val137、Lys138、Ser139、Ile140、Pro141、His142、Pro143、Tyr145、Ser146及His147之抗原決定基。
本發明亦提供治療患者之內瑟頓氏症候群、異位性皮膚炎、魚鱗病、紅斑痤瘡、氣喘或癌症(諸如卵巢癌或膀胱癌)或其組合之方法，其包含向該患者投與治療有效量之結合KLK5之抗體或包含該抗體之醫藥組合物，其中該抗體結合於人類KLK5的參考SEQ ID NO: 51包含胺基酸殘基Arg87、Ala107、Arg110、Lys111、Lys112、Val113、Val137、Lys138、Ser139、Ile140、Pro141、His142、Pro143、Tyr145、Ser146及His147之抗原決定基。
本發明亦提供結合KLK5之抗體或包含該抗體之醫藥組合物的用途，其用於製造供治療特徵為KLK5失調或對KLK5之抑制失調的一或多種疾病用之藥劑，其中該抗體結合於人類KLK5的參考SEQ ID NO: 51包含胺基酸殘基Arg87、Ala107、Arg110、Lys111、Lys112、Val113、Val137、Lys138、Ser139、Ile140、Pro141、His142、Pro143、Tyr145、Ser146及His147之抗原決定基，其中此類失調較佳為內瑟頓氏症候群、異位性皮膚炎、魚鱗病、紅斑痤瘡、氣喘或癌症(諸如卵巢癌或膀胱癌)或其組合，更佳地內瑟頓氏症候群及/或異位性皮膚炎。
詳言之，本發明亦提供結合KLK5之抗體或包含該抗體之醫藥組合物的用途，其用於製造供治療特徵為KLK5失調或對KLK5之抑制失調的一或多種疾病用之藥劑，其中該抗體較佳結合於人類KLK5的參考SEQ ID NO: 51包含胺基酸殘基Arg87、Ala107、Arg110、Lys111、Lys112、Val113、Val137、Lys138、Ser139、Ile140、Pro141、His142、Pro143、Tyr145、Ser146及His147之抗原決定基，其中此類失調較佳為內瑟頓氏症候群、異位性皮膚炎、魚鱗病、紅斑痤瘡、氣喘或癌症(諸如卵巢癌或膀胱癌)或其組合，更佳地內瑟頓氏症候群及/或異位性皮膚炎，其中該抗體包含： 1.  可變輕鏈及可變重鏈，且其中該可變輕鏈包括包含SEQ ID NO: 1之CDR-L1、包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；且該可變重鏈包括包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3；或 2.  可變輕鏈及可變重鏈，且其中該可變輕鏈包括包含SEQ ID NO: 62之CDR-L1、包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；且該可變重鏈包括包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3；或 3.  可變輕鏈及可變重鏈，且其中該可變輕鏈包括包含SEQ ID NO: 63之CDR-L1、包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；且該可變重鏈包括包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3；或 4.  包含SEQ ID NO: 7或11或15或19或23之可變輕鏈；及包含SEQ ID NO: 9或27或31或35或39或43之可變重鏈；或 5.  包含SEQ ID NO: 15之可變輕鏈，其中參考SEQ ID NO: 15之胺基酸殘基麩醯胺酸24 (Gln；Q)為精胺酸(Arg；R)或離胺酸(Lys；K)；及包含SEQ ID NO: 9或27或31或35或39或43之可變重鏈；或 6.  包含SEQ ID NO: 13或17或21或25之輕鏈及包含SEQ ID NO: 29或33或37或41或45之重鏈。
本發明亦提供結合KLK5之抗體之用途，其用作診斷活性劑或用於診斷分析中，例如用於診斷內瑟頓氏症候群、異位性皮膚炎、魚鱗病、紅斑痤瘡、氣喘或癌症(諸如卵巢癌或膀胱癌)，且其中該抗體結合於人類KLK5的參考SEQ ID NO: 51包含胺基酸殘基Arg87、Ala107、Arg110、Lys111、Lys112、Val113、Val137、Lys138、Ser139、Ile140、Pro141、His142、Pro143、Tyr145、Ser146及His147之抗原決定基。
更佳地，該抗體包含： 1.  可變輕鏈及可變重鏈，且其中該可變輕鏈包括包含SEQ ID NO: 1之CDR-L1、包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；且該可變重鏈包括包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3；或 2.  可變輕鏈及可變重鏈，且其中該可變輕鏈包括包含SEQ ID NO: 62之CDR-L1、包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；且該可變重鏈包括包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3；或 3.  可變輕鏈及可變重鏈，且其中該可變輕鏈包括包含SEQ ID NO: 63之CDR-L1、包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；且該可變重鏈包括包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3；或 4.  包含SEQ ID NO: 7或11或15或19或23之可變輕鏈；及包含SEQ ID NO: 9或27或31或35或39或43之可變重鏈；或 5.  包含SEQ ID NO: 15之可變輕鏈，其中參考SEQ ID NO: 15之胺基酸殘基麩醯胺酸24 (Gln；Q)為精胺酸(Arg；R)或離胺酸(Lys；K)；及包含SEQ ID NO: 9或27或31或35或39或43之可變重鏈；或 6.  包含SEQ ID NO: 13或17或21或25之輕鏈及包含SEQ ID NO: 29或33或37或41或45之重鏈。
診斷較佳可針對生物樣品進行。「生物樣品」涵蓋獲自個體之多種樣品類型且可用於診斷或監測分析。該定義涵蓋血液，諸如血漿及血清，及生物來源之其他液體樣品(諸如尿液及唾液、腦脊髓液)、固體組織樣品(諸如生檢試樣，諸如皮膚生檢或自其及其子代衍生之組織培養物或細胞)。該定義亦包括在獲取之後已以任何方式操控的樣品，諸如藉由試劑處理、增溶，或富集某些組分，諸如聚核苷酸。
診斷測試較佳可針對不與人類或動物身體接觸的生物樣品進行。此類診斷測試亦稱為活體外測試。活體外診斷測試可依賴於偵測自個體獲得之生物樣品中之KLK5的活體外方法，其包含以下步驟：i)使該生物樣品與如本文所述之抗體接觸；及ii)偵測抗體與KLK5之結合。藉由與適合對照組比較偵測到之KLK5程度或KLK5之特定轉譯後修飾形式(包括任何前形式)之存在，可鑑別特徵為KLK5失調或對KLK5之抑制失調之一或多種疾病。因此，此類偵測方法可用於判定個體(包括胚胎或胎兒)是否患有特徵為KLK5失調或對KLK5之抑制失調之疾病或處於患病風險下。
因此，本發明提供結合KLK5之抗體，其中該抗體較佳結合於人類KLK5的參考SEQ ID NO: 51包含胺基酸殘基Arg87、Ala107、Arg110、Lys111、Lys112、Val113、Val137、Lys138、Ser139、Ile140、Pro141、His142、Pro143、Tyr145、Ser146及His147之抗原決定基，其中該抗體用於診斷特徵為KLK5失調或對KLK5之抑制失調之一或多種疾病，較佳用於診斷內瑟頓氏症候群、異位性皮膚炎、魚鱗病、紅斑痤瘡、氣喘或癌症(諸如卵巢癌或膀胱癌)，其中該抗體包含： 1.  可變輕鏈及可變重鏈，且其中該可變輕鏈包括包含SEQ ID NO: 1之CDR-L1、包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；且該可變重鏈包括包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3；或 2.  可變輕鏈及可變重鏈，且其中該可變輕鏈包括包含SEQ ID NO: 62之CDR-L1、包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；且該可變重鏈包括包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3；或 3.  可變輕鏈及可變重鏈，且其中該可變輕鏈包括包含SEQ ID NO: 63之CDR-L1、包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；且該可變重鏈包括包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3；或 4.  包含SEQ ID NO: 7或11或15或19或23之可變輕鏈；及包含SEQ ID NO: 9或27或31或35或39或43之可變重鏈；或 5.  包含SEQ ID NO: 15之可變輕鏈，其中參考SEQ ID NO: 15之胺基酸殘基麩醯胺酸24 (Gln；Q)為精胺酸(Arg；R)或離胺酸(Lys；K)；及包含SEQ ID NO: 9或27或31或35或39或43之可變重鏈；或 6.  包含SEQ ID NO: 13或17或21或25之輕鏈及包含SEQ ID NO: 29或33或37或41或45之重鏈。
本發明因此係關於以下實施例：
實施例1：一種結合於胰舒血管素5 (KLK5)之抗體，其中該抗體包含可變輕鏈及可變重鏈，且其中： a.  該可變輕鏈包括包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 62或SEQ ID NO: 63之CDR-L1、包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；且 b.  該可變重鏈包括包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3。
實施例2：根據實施例1之抗體，其中： a.  該可變輕鏈包括包含SEQ ID NO: 1之CDR-L1、包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；且 b.  該可變重鏈包括包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3。
實施例3：一種結合於胰舒血管素5 (KLK5)之抗體，其中該抗體結合於人類KLK5的參考SEQ ID NO: 51包含胺基酸殘基Arg87、Ala107、Arg110、Lys111、Lys112、Val113、Val137、Lys138、Ser139、Ile140、Pro141、His142、Pro143、Tyr145、Ser146及His147之抗原決定基。
實施例4：根據實施例3之抗體，其中該抗原決定基係藉由X射線結晶學表徵。
實施例5：根據實施例1至4中任一項之抗體，其中該抗體抑制或降低KLK5之蛋白酶活性。
實施例6：根據實施例1至5中任一項之抗體，其中當KLK5結合於LEKTI或LEKTI之片段時該抗體結合於KLK5。
實施例7：根據實施例1至6中任一項之抗體，其中該抗體不與LEKTI或LEKTI之片段競爭結合KLK5。
實施例8：根據實施例1至7中任一項之抗體，其中該抗體與結合於LEKTI或LEKTI之片段的KLK5形成複合物。
實施例9：根據實施例6至8中任一項之抗體，其中該LEKTI之片段為包含SEQ ID NO: 54之胺基酸1至64之人類LEKTI域5或包含SEQ ID NO: 61之胺基酸1至71之LEKTI域8。
實施例10：根據前述實施例中任一項之抗體，其中該抗體結合人類KLK5，較佳地結合包含SEQ ID NO: 53之人類KLK5，且結合食蟹獼猴(cyno) KLK5，較佳地結合包含SEQ ID NO: 60之cyno KLK5。
實施例11：根據前述實施例中任一項之抗體，其中該抗體不結合人類或cyno胰舒血管素2 (KLK2)；或人類或cyno胰舒血管素4(KLK4)；或人類或cyno胰舒血管素7 (KLK7)。
實施例12：根據實施例3至11中任一項之抗體，其中該抗體包含可變輕鏈及可變重鏈，且其中： a.  該可變輕鏈包括包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 62或SEQ ID NO: 63之CDR-L1，較佳地包含SEQ ID NO: 1之CDR-L1，包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；且 b.  該可變重鏈包括包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3。
實施例13：根據前述實施例中任一項之抗體，其中該抗體為嵌合或人類化抗體。
實施例14：根據前述實施例中任一項之抗體，其中該抗體為全長抗體。
實施例15：根據實施例13之抗體，其中該全長抗體係選自IgG1、IgG4或IgG4P。
實施例16：根據實施例1至13中任一項之抗體，其中該抗體係選自Fab、Fab'、F(ab')2 、scFv、dAb或VHH 。
實施例17：根據實施例1至16中任一項之抗體，其中該抗體包含： a.  包含SEQ ID NO: 7或11或15或19或23之可變輕鏈；及/或 b.  包含SEQ ID NO: 9或27或31或35或39或43之可變重鏈。
實施例18：根據實施例1至15或17中任一項之抗體，其中該抗體包含： a.  包含SEQ ID NO: 13或17或21或25之輕鏈；及 b.  包含SEQ ID NO: 29或33或37或41或45之重鏈。
實施例19：根據實施例17或18之抗體，其中參考SEQ ID NO: 15或17在L-CDR1中位置24處之胺基酸殘基麩醯胺酸(Gln；Q)經精胺酸(Arg；R)或經離胺酸(Lys；K)置換。
實施例20：根據前述實施例中任一項之抗體，其中KLK5為包含SEQ ID NO: 51或52或53之人類KLK5或包含SEQ ID NO: 60之cyno KLK5。
實施例21：根據前述實施例中任一項之抗體，其中該抗體與結合於另一抗體之KLK5、較佳人類KLK5形成複合物，該另一抗體包含： a.  可變輕鏈，其包括包含SEQ ID NO: 68之CDR-L1、包含SEQ ID NO: 69之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 70之CDR-L3；及可變重鏈，其包括包含SEQ ID NO: 71之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 72之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 73之CDR-H3；及/或 b.  包含SEQ ID NO: 74之可變輕鏈及包含SEQ ID NO: 76之可變重鏈；及/或 c.  由包含SEQ ID NO: 75之核苷酸編碼之可變輕鏈及由包含SEQ ID NO: 77之核苷酸編碼之可變重鏈。
實施例22：一種結合KLK5、較佳人類KLK5之抗體，其中該抗體包含： a.  可變輕鏈，其包括包含SEQ ID NO: 68之CDR-L1、包含SEQ ID NO: 69之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 70之CDR-L3；及可變重鏈，其包括包含SEQ ID NO: 71之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 72之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 73之CDR-H3；及/或 b.  包含SEQ ID NO: 74之可變輕鏈及包含SEQ ID NO: 76之可變重鏈；及/或 c.  由包含SEQ ID NO: 75之核苷酸編碼之可變輕鏈及由包含SEQ ID NO: 77之核苷酸編碼之可變重鏈。
實施例23：一種KLK5-抗體複合物，該複合物包含： a.  KLK5，較佳人類KLK5 b.  根據實施例1至18中任一項之抗體及 c.  根據實施例19或實施例20之抗體。
實施例24：一種抗體，其 a.  與根據實施例1至20中任一項之抗體競爭結合KLK5；及/或 b.  交叉阻斷根據實施例1至20中任一項之抗體結合KLK5或由根據實施例1至20中任一項之抗體交叉阻斷結合KLK5；及/或 c.  與根據實施例1至20中任一項之抗體結合KLK5之相同抗原決定基；及/或 d.  包含與根據SEQ ID NO: 29或33或37或41或45之序列具有至少90%一致性或相似性的重鏈可變區；及/或 e.  包含與根據SEQ ID NO: 13或17或21或25之序列具有至少90%一致性或相似性的輕鏈可變區。
實施例25：一種經分離之聚核苷酸，其編碼根據實施例1至20中任一項之抗體。
實施例26：根據實施例25之經分離之聚核苷酸，其中該聚核苷酸編碼： a.  輕鏈可變區，其中該聚核苷酸： i.   與SEQ ID NO: 8 (或SEQ ID NO: 8之核苷酸1至330)或12 (或SEQ ID NO: 12之核苷酸1至330)或16或20或24或64或66至少90%一致；或 ii.  包含SEQ ID NO: 8 (或SEQ ID NO: 8之核苷酸1至330)或12 (或SEQ ID NO: 12之核苷酸1至330)或16或20或24或64或66；或 iii. 基本上由SEQ ID NO: 8 (或SEQ ID NO: 8之核苷酸1至330)或12 (或SEQ ID NO: 12之核苷酸1至330)或16或20或24或64或66組成；或 b.  重鏈可變區，其中該聚核苷酸： i.   與SEQ ID NO: 10或28或32或36或40或44至少90%一致；或 ii.  包含SEQ ID NO: 10或28或32或36或40或44；或 iii. 基本上由SEQ ID NO: 10或28或32或36或40或44組成；或 c.  輕鏈，其中該聚核苷酸： i.   與SEQ ID NO: 14或18或22或26或65或67或100或101或102或103或104至少90%一致；或 ii.  包含SEQ ID NO: 14或18或22或26或65或67或100或101或102或103或104；或 iii. 基本上由SEQ ID NO: 14或18或22或26或65或67或100或101或102或103或104組成；或 d.  重鏈，其中該聚核苷酸： i.與SEQ ID NO: 30或34或38或42或46至少90%一致；或 ii.  包含SEQ ID NO: 30或34或38或42或46；或 iii. 基本上由SEQ ID NO: 30或34或38或42或46組成。
實施例27：一種選殖或表現載體，其包含一或多種根據實施例25或26中任一項之聚核苷酸。
實施例28：一種宿主細胞，其包含： a.  一或多種根據實施例25或26中任一項之聚核苷酸或 b.  一或多種根據實施例27之表現載體。
實施例29：一種用於產生根據實施例1至20中任一項之抗體之方法，其包含在適於產生該抗體之條件下培養根據實施例28之宿主細胞及分離由該宿主細胞產生之該抗體。
實施例30：一種醫藥組合物，其包含根據實施例1至20中任一項之抗體及一或多種醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或稀釋劑。
實施例31：根據實施例1至20中任一項之抗體或其抗原結合片段或根據實施例30之醫藥組合物，其用於療法。
實施例32：根據實施例1至20中任一項之抗體或根據實施例30之醫藥組合物，其用於治療特徵為KLK5失調或對KLK5之抑制失調之疾病。
實施例33：根據實施例32之抗體，其中該疾病係選自內瑟頓氏症候群、異位性皮膚炎、魚鱗病、紅斑痤瘡、氣喘或癌症(諸如卵巢癌或膀胱癌)或其組合。
實施例34：根據實施例33之抗體，其中該疾病為內瑟頓氏症候群。
實施例35：根據實施例33之抗體，其中該疾病為異位性皮膚炎。
實施例36：一種治療患者的特徵為KLK5失調或對KLK5之抑制失調之疾病的方法，其包含向該患者投與治療有效量之根據實施例1至20中任一項之抗體或根據實施例30之醫藥組合物。
實施例37：根據實施例34之方法，其中該疾病係選自內瑟頓氏症候群、異位性皮膚炎、魚鱗病、紅斑痤瘡、氣喘或癌症(諸如卵巢癌或膀胱癌)。
實施例38：根據實施例35之供使用之抗體，其中該疾病為內瑟頓氏症候群。
實施例39：根據實施例35之供使用之抗體，其中該疾病為異位性皮膚炎。
實施例40：根據實施例1至20中任一項之抗體或根據實施例30之醫藥組合物，其用於製造供治療特徵為KLK5失調或對KLK5之抑制失調之一或多種疾病用的藥劑。
實施例41：根據實施例40之用於製造之抗體，其中該疾病係選自內瑟頓氏症候群、異位性皮膚炎、魚鱗病、紅斑痤瘡、哮喘或癌症(諸如卵巢癌或膀胱癌)或其組合。
實施例42：根據實施例40之用於製造之抗體，其中該疾病係選自內瑟頓氏症候群或異位性皮膚炎或其組合。
實施例43：根據實施例1至20中任一項之抗體，其用作診斷劑或用於診斷分析或診斷套組中，用於診斷特徵為KLK5失調或對KLK5之抑制失調之一或多種疾病。
實施例44：根據實施例43之抗體，其中該疾病係選自內瑟頓氏症候群、異位性皮膚炎、魚鱗病、紅斑痤瘡、氣喘或癌症(諸如卵巢癌或膀胱癌)或其組合。
本發明中所包括之序列展示於表1中：表 1
名稱 SEQ ID NO: 序列
CDR-L1 1 QASQSISSWLA
CDR-L2 2 LASTLAS
CDR-L3 3 QQGYTNSNIINT
CDR-H1 4 GFPLSNYAMS
CDR-H2 5 DIYPSDIIDYASWAKG
CDR-H3 6 DNNDYGLDI
兔 VL 7 AYDMTQTPASVEVAVGGTVTIKCQASQSISSWLAWYQQKPGQPPKLLIYLASTLASGVSSRFKGSGSGTQFTLTISGVECADAATYYCQQGYTNSNIINTFGGGTEVVVK
兔 VL 核苷酸 8 gcctatgatatgacccagactccagcctctgtggaggtagctgtgggaggcacagtcaccatcaagtgccaggccagtcagagcattagcagttggttagcctggtatcagcagaaaccaggtcagcctcccaagctcctgatctatctggcatccactctggcatctggggtctcatcgcggttcaaaggcagtggatctgggacacagttcactctcaccatcagcggcgtggagtgtgccgatgctgccacttactactgtcaacagggttatactaatagtaatattattaatactttcggcggagggaccgaggtggtggtcaaacgtacg
兔 VH 9 QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFPLSNYAMSWVRQAPGKGLEWIGDIYPSDIIDYASWAKGRFTISQTSTTVELKITGPTTEDTATYFCARDNNDYGLDIWGPGTLVTVSS
兔 VH 核苷酸 10 cagtcggtggaggagtccgggggtcgcctggtcacgcctgggacacccctgacactcacctgcaccgtctctgggttccccctcagtaattatgcaatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggaatggatcggagacatttatcctagtgatatcatagactacgcgagctgggcgaaaggccgattcaccatctcccaaacctcgaccacggtggagctgaaaatcacgggtccgacaaccgaggacacggccacctatttctgtgccagagacaacaatgactatggtctggacatctggggcccaggcaccctggtcaccgtctcgagt
10236 gL5 VL 11 AYDMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYLASTLASGVPSRFKGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGYTNSNIINTFGGGTKVEIK
10236 gL5 VL 核苷酸 12 gcctacgacatgactcagtccccatcctccctgtccgcatccgtgggggatagagtcaccatcacctgtcaagccagccagtcaattagctcgtggctggcctggtatcagcagaagccgggaaaggctcccaagttgctgatctacctggcctcaacgctcgcgtcgggagtgcctagccgctttaagggttccggatctggcaccgacttcactctcaccatttcgagccttcaaccggaggacttcgccacttactactgccagcagggttacaccaactccaacatcatcaacaccttcggcggagggaccaaagtggaaatcaagcgtacg
10236 gL5 輕鏈 13 AYDMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYLASTLASGVPSRFKGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGYTNSNIINTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
10236 gL5 輕鏈 核苷酸 14 gcctacgacatgactcagtccccatcctccctgtccgcatccgtgggggatagagtcaccatcacctgtcaagccagccagtcaattagctcgtggctggcctggtatcagcagaagccgggaaaggctcccaagttgctgatctacctggcctcaacgctcgcgtcgggagtgcctagccgctttaagggttccggatctggcaccgacttcactctcaccatttcgagccttcaaccggaggacttcgccacttactactgccagcagggttacaccaactccaacatcatcaacaccttcggcggagggaccaaagtggaaatcaagcgtacgcgtacggtggccgctccctccgtgttcatcttcccaccctccgacgagcagctgaagtccggcaccgcctccgtcgtgtgcctgctgaacaacttctacccccgcgaggccaaggtgcagtggaaggtggacaacgccctgcagtccggcaactcccaggaatccgtcaccgagcaggactccaaggacagcacctactccctgtcctccaccctgaccctgtccaaggccgactacgagaagcacaaggtgtacgcctgcgaagtgacccaccagggcctgtccagccccgtgaccaagtccttcaaccggggcgagtgc
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人類 IGKV1-6 JK4 受體框架 47 AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQDYNYPLTFGGGTKVEIK
人類 IGKV1-6 JK4 受體框架 核苷酸 48 gccatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggcaagtcagggcattagaaatgatttaggctggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaagctcctgatctatgctgcatccagtttacaaagtggggtcccatcaaggttcagcggcagtggatctggcacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctgaagattttgcaacttattactgtctacaagattacaattaccctctcactttcggcggagggaccaaggtggagatcaaa
人類 IGHV4-4 JH4 受體框架 49 QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCAVSGGSISSSNWWSWVRQPPGKGLEWIGEIYHSGSTNYNPSLKSRVTISVDKSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARYFDYWGQGTLVTVSS   
人類 IGHV4-4 JH4 受體框架 核苷酸 50 caggtgcagctgcaggagtcgggcccaggactggtgaagccttcggggaccctgtccctcacctgcgctgtctctggtggctccatcagcagtagtaactggtggagttgggtccgccagcccccagggaaggggctggagtggattggggaaatctatcatagtgggagcaccaactacaacccgtccctcaagagtcgagtcaccatatcagtagacaagtccaagaaccagttctccctgaagctgagctctgtgaccgccgcggacacggccgtgtattactgtgcgagatactttgactactggggccaaggaaccctggtcaccgtctcctca
人類 KLK5 ( 全長，具有信號序列 ) 51 MATARPPWMWVLCALITALLLGVTEHVLANNDVSCDHPSNTVPSGSNQDLGAGAGEDARSDDSSSRIINGSDCDMHTQPWQAALLLRPNQLYCGAVLVHPQWLLTAAHCRKKVFRVRLGHYSLSPVYESGQQMFQGVKSIPHPGYSHPGHSNDLMLIKLNRRIRPTKDVRPINVSSHCPSAGTKCLVSGWGTTKSPQVHFPKVLQCLNISVLSQKRCEDAYPRQIDDTMFCAGDKAGRDSCQGDSGGPVVCNGSLQGLVSWGDYPCARPNRPGVYTNLCKFTKWIQETIQANS   
人類 KLK5 前形式 52 VTEHVLANNDVSCDHPSNTVPSGSNQDLGAGAGEDARSDDSSSRIINGSDCDMHTQPWQAALLLRPNQLYCGAVLVHPQWLLTAAHCRKKVFRVRLGHYSLSPVYESGQQMFQGVKSIPHPGYSHPGHSNDLMLIKLNRRIRPTKDVRPINVSSHCPSAGTKCLVSGWGTTKSPQVHFPKVLQCLNISVLSQKRCEDAYPRQIDDTMFCAGDKAGRDSCQGDSGGPVVCNGSLQGLVSWGDYPCARPNRPGVYTNLCKFTKWIQETIQANS
活性人類 KLK5 53 IINGSDCDMHTQPWQAALLLRPNQLYCGAVLVHPQWLLTAAHCRKKVFRVRLGHYSLSPVYESGQQMFQGVKSIPHPGYSHPGHSNDLMLIKLNRRIRPTKDVRPINVSSHCPSAGTKCLVSGWGTTKSPQVHFPKVLQCLNISVLSQKRCEDAYPRQIDDTMFCAGDKAGRDSCQGDSGGPVVCNGSLQGLVSWGDYPCARPNRPGVYTNLCKFTKWIQETIQANS 
人類 LEKTI D5 兔 Fc 54 EIVKLCSQYQNQAKNGILFCTRENDPIRGPDGKMHGNLCSMCQAYFQAENEEKKKAEARARNLEKTVAPSTCSKPTCPPPELLGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPAVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK
人類 KLK7 前形式 55 EEAQGDKIIDGAPCARGSHPWQVALLSGNQLHCGGVLVNERWVLTAAHCKMNEYTVHLGSDTLGDRRAQRIKASKSFRHPGYSTQTHVNDLMLVKLNSQARLSSMVKKVRLPSRCEPPGTTCTVSGWGTTTSPDVTFPSDLMCVDVKLISPQDCTKVYKDLLENSMLCAGIPDSKKNACNGDSGGPLVCRGTLQGLVSWGTFPCGQPNDPGVYTQVCKFTKWINDTMKKHR
活性人類 KLK7 56 IIDGAPCARGSHPWQVALLSGNQLHCGGVLVNERWVLTAAHCKMNEYTVHLGSDTLGDRRAQRIKASKSFRHPGYSTQTHVNDLMLVKLNSQARLSSMVKKVRLPSRCEPPGTTCTVSGWGTTTSPDVTFPSDLMCVDVKLISPQDCTKVYKDLLENSMLCAGIPDSKKNACNGDSGGPLVCRGTLQGLVSWGTFPCGQPNDPGVYTQVCKFTKWINDTMKKHR
Cyno KLK7 前形式 57 GQEAQGDKIIDGAPCTRGSHPWQVALLSGNQLHCGGVLVNERWVLTAAHCKMNDYIVHLGSDTLGDRKAQRIKASRSFRHPGYSTQTHVNDLMLVKLNSPARLSSTVKKVRLPSRCEPPGTTCTVSGWGTTTSPDVTFPSDLMCVDVKLISSQDCTKVYKDMLGNSMLCAGIPNSKKNACNGDSGGPLVCRGTLQGLVSWGTFPCGQPNDPGVYTQVCKFTKWINDTIKKHR
活性 Cyno KLK7 58 IIDGAPCTRGSHPWQVALLSGNQLHCGGVLVNERWVLTAAHCKMNDYIVHLGSDTLGDRKAQRIKASRSFRHPGYSTQTHVNDLMLVKLNSPARLSSTVKKVRLPSRCEPPGTTCTVSGWGTTTSPDVTFPSDLMCVDVKLISSQDCTKVYKDMLGNSMLCAGIPNSKKNACNGDSGGPLVCRGTLQGLVSWGTFPCGQPNDPGVYTQVCKFTKWINDTIKKHR
活性小鼠 KLK5 59 IVNGSDCQKDAQPWQGALLLGPNKLYCGAVLISPQWLLTAAHCRKPVFRIRLGHHSMSPVYESGQQMFQGIKSIPHPGYSHPGHSNDLMLIKMNRKIRDSHSVKPVEIACDCATEGTRCMVSGWGTTSSSHNNFPKVLQCLNITVLSEERCKNSYPGQIDKTMFCAGDEEGRDSCQGDSGGPVVCNGKLQGLVSWGDFPCAQRNRPGVYTNLCEFVKWIKDTMNSN
活性 cyno KLK5 60 IINGSDCDEHTQPWQAALLLGPNQLYCGGVLVHPQWLLTAAHCRKKVFRVRLGHYSLSPVYESGQQMFQGIKSIPHPGYSHPGHSNDLMLIKLNRRIHSTKDVRPINVSSHCPSAGTKCLVSGWGTTRSPQVHFPKVLQCLNISVLSQKRCEDAYPRQIDDTMFCAGDEAGRDSCQGDSGGPVVCNGSLQGLVSWGDYPCAKPNRPGVYTNLCKFTKWIQETIQANS
人類 LEKTI D8 兔 Fc 61 EAAKEICSEFRDQVRNGTLICTREHNPVRGPDGKMHGNKCAMCASVFKLEEEEKKNDKEEKGKVEAEKVLEKTVAPSTCSKPTCPPPELLGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPAVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK
CDR-L1 Q24R 62 RASQSISSWLA   
CDR-L1 Q24K 63 KASQSISSWLA   
10236 gL6 VL 核苷酸 Q24R 64 gcgtatgacatgactcagagcccgtccagcctgtccgcgtccgtgggagatcgcgtgactatcacgtgtcgggcctcacaatccattagctcctggctggcctggtaccagcagaagccagggaaggctccgaagctgctgatctacctggcctccacccttgcctccggcgtgccttcacggttttctggatccggctcgggaaccgacttcaccctcaccatctcgtcgctccaacccgaggacttcgcaacctactactgccaacaggggtataccaacagcaacatcatcaacaccttcggtggcggaactaaggtcgaaatcaag
10236 gL6 輕鏈核苷酸 Q24R 65 gcgtatgacatgactcagagcccgtccagcctgtccgcgtccgtgggagatcgcgtgactatcacgtgtcgggcctcacaatccattagctcctggctggcctggtaccagcagaagccagggaaggctccgaagctgctgatctacctggcctccacccttgcctccggcgtgccttcacggttttctggatccggctcgggaaccgacttcaccctcaccatctcgtcgctccaacccgaggacttcgcaacctactactgccaacaggggtataccaacagcaacatcatcaacaccttcggtggcggaactaaggtcgaaatcaaggtggccgctccctccgtgttcatcttcccaccctccgacgagcagctgaagtccggcaccgcctccgtcgtgtgcctgctgaacaacttctacccccgcgaggccaaggtgcagtggaaggtggacaacgccctgcagtccggcaactcccaggaatccgtcaccgagcaggactccaaggacagcacctactccctgtcctccaccctgaccctgtccaaggccgactacgagaagcacaaggtgtacgcctgcgaagtgacccaccagggcctgtccagccccgtgaccaagtccttcaaccggggcgagtgc
10236 gL6 VL 核苷酸 Q24K 66 gcgtatgacatgactcagagcccgtccagcctgtccgcgtccgtgggagatcgcgtgactatcacgtgtaaggcctcacaatccattagctcctggctggcctggtaccagcagaagccagggaaggctccgaagctgctgatctacctggcctccacccttgcctccggcgtgccttcacggttttctggatccggctcgggaaccgacttcaccctcaccatctcgtcgctccaacccgaggacttcgcaacctactactgccaacaggggtataccaacagcaacatcatcaacaccttcggtggcggaactaaggtcgaaatcaag
10236 gL6 輕鏈核苷酸 Q24K 67 gcgtatgacatgactcagagcccgtccagcctgtccgcgtccgtgggagatcgcgtgactatcacgtgtaaggcctcacaatccattagctcctggctggcctggtaccagcagaagccagggaaggctccgaagctgctgatctacctggcctccacccttgcctccggcgtgccttcacggttttctggatccggctcgggaaccgacttcaccctcaccatctcgtcgctccaacccgaggacttcgcaacctactactgccaacaggggtataccaacagcaacatcatcaacaccttcggtggcggaactaaggtcgaaatcaaggtggccgctccctccgtgttcatcttcccaccctccgacgagcagctgaagtccggcaccgcctccgtcgtgtgcctgctgaacaacttctacccccgcgaggccaaggtgcagtggaaggtggacaacgccctgcagtccggcaactcccaggaatccgtcaccgagcaggactccaaggacagcacctactccctgtcctccaccctgaccctgtccaaggccgactacgagaagcacaaggtgtacgcctgcgaagtgacccaccagggcctgtccagccccgtgaccaagtccttcaaccggggcgagtgc
10273 CDR-L1 68 QSSQSVYNNNDLA
10273 CDR-L2 69 RASTLAS
10273 CDR-L3 70 LGGYDDDVDTYT
10273 CDR-H1 71 GFSLSSYGMS
10273 CDR-H2 72 IISSSGSTYYASWAKG
10273 CDR-H3 73 DHIYRYDDYGDYPTYYGMXP
10273 兔 VL 74 AVVLTQTPSPMSAAVGGTVTISCQSSQSVYNNNDLAWYQQKPGQPPKLLIYRASTLASGVPSRFSGSGSGTQFTLTISGVQCDDAATYYCLGGYDDDVDTYTFGGGTEVVVK
10273 兔 VL 核苷酸 75 gcagtcgtgctgactcagacaccatcacccatgtctgcagctgtgggaggcacagtcaccatcagttgccagtccagtcagagtgtttataataataacgacttagcctggtatcagcagaaaccagggcagcctcctaagctcctgatctacagggcatccactctggcatctggggtcccgtcgcggttcagcggcagtggatctgggacacagttcactctcaccatcagcggcgtgcagtgtgacgatgctgccacttactactgtctaggcggttatgatgatgatgttgatacgtatactttcggcggagggaccgaggtggtggtcaaa
10273 兔 VH 76 QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSSYGMSWVRQAPGKGLEWIGIISSSGSTYYASWAKGRFTISKTSTTVDLKIASPTTEDTATYFCARDHIYRYDDYGDYPTYYGMDPWGPGTLVTVSS
10273 兔 VH 核苷酸 77 cagtcggtggaggagtccgggggtcgcctggtcacgcctgggacacccctgacactcacctgcacagtctctggattctccctcagtagctatggaatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggaatggatcggaattattagtagtagtggtagcacatactacgcgagctgggcgaaaggccgattcaccatctccaagacctcgaccacggtggatctgaaaatcgccagtccgacaaccgaggacacggccacctatttctgtgccagagatcacatttataggtacgatgactatggtgattaccctacctactacggcatggacccctggggcccaggcaccctggtcaccgtctcgagc
兔 10273 mIgG 輕鏈 78 AVVLTQTPSP MSAAVGGTVT ISCQSSQSVY NNNDLAWYQQ KPGQPPKLLI YRASTLASGV PSRFSGSGSG TQFTLTISGV QCDDAATYYC LGGYDDDVDT YTFGGGTEVV VKRTDAAPTV SIFPPSSEQL TSGGASVVCF LNNFYPKDIN VKWKIDGSER QNGVLNSWTD QDSKDCTYSM SSTLTLTKDE YERHNSYTCE ATHKTSTSPI VKSFNRNEC
兔 10273 mIgG 重鏈 79 QSVEESGGRL VTPGTPLTLT CTVSGFSLSS YGMSWVRQAP GKGLEWIGII SSSGSTYYAS WAKGRFTISK TSTTVDLKIA SPTTEDTATY FCARDHIYRY DDYGDYPTYY GMDPWGPGTL VTVSSAKTTP PSVYPLAPGS AAQTNSMVTL GCLVKGYFPE PVTVTWNSGS LSSGVHTFPA VLQSDLYTLS SSVTVPSSTW PSETVTCNVA HPASSTKVDK KIVPRDCGCK PCICTVPEVS SVFIFPPKPK DVLTITLTPK VTCVVVDISK DDPEVQFSWF VDDVEVHTAQ TQPREEQFNS TFRSVSELPI MHQDWLNGKE FKCRVNSAAF PAPIEKTISK TKGRPKAPQV YTIPPPKEQM AKDKVSLTCM ITDFFPEDIT VEWQWNGQPA ENYKNTQPIM DTDGSYFVYS KLNVQKSNWE AGNTFTCSVL HEGLHNHHTE KSLSHSPGK
兔 10273 mIgG 輕鏈核苷酸 80 gcagtcgtgctgactcagacaccatcacccatgtctgcagctgtgggaggcacagtcaccatcagttgccagtccagtcagagtgtttataataataacgacttagcctggtatcagcagaaaccagggcagcctcctaagctcctgatctacagggcatccactctggcatctggggtcccgtcgcggttcagcggcagtggatctgggacacagttcactctcaccatcagcggcgtgcagtgtgacgatgctgccacttactactgtctaggcggttatgatgatgatgttgatacgtatactttcggcggagggaccgaggtggtggtcaaacgtacggatgctgcaccaactgtatccatcttcccaccatccagtgagcagttaacatctggaggtgcctcagtcgtgtgcttcttgaacaacttctaccccaaagacatcaatgtcaagtggaagattgatggcagtgaacgacaaaatggcgtcctgaacagttggactgatcaggacagcaaagactgcacctacagcatgagcagcaccctcacgttgaccaaggacgagtatgaacgacataacagctatacctgtgaggccactcacaagacatcaacttcacccattgtcaagagcttcaacaggaatgagtgt
兔 10273 mIgG 重鏈核苷酸 81 cagtcggtggaggagtccgggggtcgcctggtcacgcctgggacacccctgacactcacctgcacagtctctggattctccctcagtagctatggaatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggaatggatcggaattattagtagtagtggtagcacatactacgcgagctgggcgaaaggccgattcaccatctccaagacctcgaccacggtggatctgaaaatcgccagtccgacaaccgaggacacggccacctatttctgtgccagagatcacatttataggtacgatgactatggtgattaccctacctactacggcatggacccctggggcccaggcaccctggtcaccgtctcgagtgccaaaacgacacccccatctgtctatccactggcccctggatctgctgcccaaactaactccatggtgaccctgggatgcctggtcaagggctatttccctgagccagtgacagtgacctggaactctggatccctgtccagcggtgtgcacaccttcccagctgtcctgcagtctgacctctacactctgagcagctcagtgactgtcccctccagcacctggcccagcgagaccgtcacctgcaacgttgcccacccggccagcagcaccaaggtggacaagaaaattgtgcccagggattgtggttgtaagccttgcatatgtacagtcccagaagtatcatctgtcttcatcttccccccaaagcccaaggatgtgctcaccattactctgactcctaaggtcacgtgtgttgtggtagacatcagcaaggatgatcccgaggtccagttcagctggtttgtagatgatgtggaggtgcacacagctcagacgcaaccccgggaggagcagttcaacagcactttccgctcagtcagtgaacttcccatcatgcaccaggactggctcaatggcaaggagttcaaatgcagggtcaacagtgcagctttccctgcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaaggcagaccgaaggctccacaggtgtacaccattccacctcccaaggagcagatggccaaggataaagtcagtctgacctgcatgataacagacttcttccctgaagacattactgtggagtggcagtggaatgggcagccagcggagaactacaagaacactcagcccatcatggacacagatggctcttacttcgtctacagcaagctcaatgtgcagaagagcaactgggaggcaggaaatactttcacctgctctgtgttacatgagggcctgcacaaccaccatactgagaagagcctctcccactctcctggtaaa
兔 10236 mIgG 輕鏈 82 AYDMTQTPAS VEVAVGGTVT IKCQASQSIS SWLAWYQQKP GQPPKLLIYL ASTLASGVSS RFKGSGSGTQ FTLTISGVEC ADAATYYCQQ GYTNSNIINT FGGGTEVVVK RTDAAPTVSI FPPSSEQLTS GGASVVCFLN NFYPKDINVK WKIDGSERQN GVLNSWTDQD SKDCTYSMSS TLTLTKDEYE RHNSYTCEAT HKTSTSPIVK SFNRNEC
兔 10236 mIgG 重鏈 83 QSVEESGGRL VTPGTPLTLT CTVSGFPLSN YAMSWVRQAP GKGLEWIGDI YPSDIIDYAS WAKGRFTISQ TSTTVELKIT GPTTEDTATY FCARDNNDYG LDIWGPGTLV TVSSAKTTPP SVYPLAPGSA AQTNSMVTLG CLVKGYFPEP VTVTWNSGSL SSGVHTFPAV LQSDLYTLSS SVTVPSSTWP SETVTCNVAH PASSTKVDKK IVPRDCGCKP CICTVPEVSS VFIFPPKPKD VLTITLTPKV TCVVVDISKD DPEVQFSWFV DDVEVHTAQT QPREEQFNST FRSVSELPIM HQDWLNGKEF KCRVNSAAFP APIEKTISKT KGRPKAPQVY TIPPPKEQMA KDKVSLTCMI TDFFPEDITV EWQWNGQPAE NYKNTQPIMD TDGSYFVYSK LNVQKSNWEA GNTFTCSVLH EGLHNHHTEK SLSHSPGK
兔 10236 mIgG 輕鏈核苷酸 84 gcctatgatatgacccagactccagcctctgtggaggtagctgtgggaggcacagtcaccatcaagtgccaggccagtcagagcattagcagttggttagcctggtatcagcagaaaccaggtcagcctcccaagctcctgatctatctggcatccactctggcatctggggtctcatcgcggttcaaaggcagtggatctgggacacagttcactctcaccatcagcggcgtggagtgtgccgatgctgccacttactactgtcaacagggttatactaatagtaatattattaatactttcggcggagggaccgaggtggtggtcaaacgtacggatgctgcaccaactgtatccatcttcccaccatccagtgagcagttaacatctggaggtgcctcagtcgtgtgcttcttgaacaacttctaccccaaagacatcaatgtcaagtggaagattgatggcagtgaacgacaaaatggcgtcctgaacagttggactgatcaggacagcaaagactgcacctacagcatgagcagcaccctcacgttgaccaaggacgagtatgaacgacataacagctatacctgtgaggccactcacaagacatcaacttcacccattgtcaagagcttcaacaggaatgagtgt
兔 10236 mIgG 重鏈核苷酸 85 cagtcggtggaggagtccgggggtcgcctggtcacgcctgggacacccctgacactcacctgcaccgtctctgggttccccctcagtaattatgcaatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggaatggatcggagacatttatcctagtgatatcatagactacgcgagctgggcgaaaggccgattcaccatctcccaaacctcgaccacggtggagctgaaaatcacgggtccgacaaccgaggacacggccacctatttctgtgccagagacaacaatgactatggtctggacatctggggcccaggcaccctggtcaccgtctcgagtgccaaaacgacacccccatctgtctatccactggcccctggatctgctgcccaaactaactccatggtgaccctgggatgcctggtcaagggctatttccctgagccagtgacagtgacctggaactctggatccctgtccagcggtgtgcacaccttcccagctgtcctgcagtctgacctctacactctgagcagctcagtgactgtcccctccagcacctggcccagcgagaccgtcacctgcaacgttgcccacccggccagcagcaccaaggtggacaagaaaattgtgcccagggattgtggttgtaagccttgcatatgtacagtcccagaagtatcatctgtcttcatcttccccccaaagcccaaggatgtgctcaccattactctgactcctaaggtcacgtgtgttgtggtagacatcagcaaggatgatcccgaggtccagttcagctggtttgtagatgatgtggaggtgcacacagctcagacgcaaccccgggaggagcagttcaacagcactttccgctcagtcagtgaacttcccatcatgcaccaggactggctcaatggcaaggagttcaaatgcagggtcaacagtgcagctttccctgcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaaggcagaccgaaggctccacaggtgtacaccattccacctcccaaggagcagatggccaaggataaagtcagtctgacctgcatgataacagacttcttccctgaagacattactgtggagtggcagtggaatgggcagccagcggagaactacaagaacactcagcccatcatggacacagatggctcttacttcgtctacagcaagctcaatgtgcagaagagcaactgggaggcaggaaatactttcacctgctctgtgttacatgagggcctgcacaaccaccatactgagaagagcctctcccactctcctggtaaatgatcccagtgtccttggagccctctggtcctacaggactctgacacctacctccacccctccctgtataaa
10236 輕鏈 Fab 86 AYDMTQTPASVEVAVGGTVTIKCQASQSISSWLAWYQQKPGQPPKLLIYLASTLASGVSSRFKGSGSGTQFTLTISGVECADAATYYCQQGYTNSNIINTFGGGTEVVVKRTPVAPTVLIFPPAADQVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFNRGDC
10236 輕鏈 Fab 核苷酸 87 gcctatgatatgacccagactccagcctctgtggaggtagctgtgggaggcacagtcaccatcaagtgccaggccagtcagagcattagcagttggttagcctggtatcagcagaaaccaggtcagcctcccaagctcctgatctatctggcatccactctggcatctggggtctcatcgcggttcaaaggcagtggatctgggacacagttcactctcaccatcagcggcgtggagtgtgccgatgctgccacttactactgtcaacagggttatactaatagtaatattattaatactttcggcggagggaccgaggtggtggtcaaacgtacgccagttgcacctactgtcctcatcttcccaccagctgctgatcaggtggcaactggaacagtcaccatcgtgtgtgtggcgaataaatactttcccgatgtcaccgtcacctgggaggtggatggcaccacccaaacaactggcatcgagaacagtaaaacaccgcagaattctgcagattgtacctacaacctcagcagcactctgacactgaccagcacacagtacaacagccacaaagagtacacctgcaaggtgacccagggcacgacctcagtcgtccagagcttcaataggggtgactgt
10236 重鏈 Fab 88 QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFPLSNYAMSWVRQAPGKGLEWIGDIYPSDIIDYASWAKGRFTISQTSTTVELKITGPTTEDTATYFCARDNNDYGLDIWGPGTLVTVSSGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKP
10236 重鏈 Fab 核苷酸 89 cagtcggtggaggagtccgggggtcgcctggtcacgcctgggacacccctgacactcacctgcaccgtctctgggttccccctcagtaattatgcaatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggaatggatcggagacatttatcctagtgatatcatagactacgcgagctgggcgaaaggccgattcaccatctcccaaacctcgaccacggtggagctgaaaatcacgggtccgacaaccgaggacacggccacctatttctgtgccagagacaacaatgactatggtctggacatctggggcccaggcaccctggtcaccgtctcgagtgggcaacctaaggctccatcagtcttcccactggccccctgctgcggggacacacccagctccacggtgaccctgggctgcctggtcaaaggctacctcccggagccagtgaccgtgacctggaactcgggcaccctcaccaatggggtacgcaccttcccgtccgtccggcagtcctcaggcctctactcgctgagcagcgtggtgagcgtgacctcaagcagccagcccgtcacctgcaacgtggcccacccagccaccaacaccaaagtggacaagaccgttgcgccctcgacatgcagcaagccc
10273 輕鏈 Fab 90 AVVLTQTPSPMSAAVGGTVTISCQSSQSVYNNNDLAWYQQKPGQPPKLLIYRASTLASGVPSRFSGSGSGTQFTLTISGVQCDDAATYYCLGGYDDDVDTYTFGGGTEVVVKRTPVAPTVLIFPPAADQVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFNRGDC
10273 輕鏈 Fab 核苷酸 91 gcagtcgtgctgactcagacaccatcacccatgtctgcagctgtgggaggcacagtcaccatcagttgccagtccagtcagagtgtttataataataacgacttagcctggtatcagcagaaaccagggcagcctcctaagctcctgatctacagggcatccactctggcatctggggtcccgtcgcggttcagcggcagtggatctgggacacagttcactctcaccatcagcggcgtgcagtgtgacgatgctgccacttactactgtctaggcggttatgatgatgatgttgatacgtatactttcggcggagggaccgaggtggtggtcaaacgtacgccagttgcacctactgtcctcatcttcccaccagctgctgatcaggtggcaactggaacagtcaccatcgtgtgtgtggcgaataaatactttcccgatgtcaccgtcacctgggaggtggatggcaccacccaaacaactggcatcgagaacagtaaaacaccgcagaattctgcagattgtacctacaacctcagcagcactctgacactgaccagcacacagtacaacagccacaaagagtacacctgcaaggtgacccagggcacgacctcagtcgtccagagcttcaataggggtgactgt
10273 重鏈 Fab 92 QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSSYGMSWVRQAPGKGLEWIGIISSSGSTYYASWAKGRFTISKTSTTVDLKIASPTTEDTATYFCARDHIYRYDDYGDYPTYYGMDPWGPGTLVTVSSGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKP
10273 重鏈 Fab 核苷酸 93 cagtcggtggaggagtccgggggtcgcctggtcacgcctgggacacccctgacactcacctgcacagtctctggattctccctcagtagctatggaatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggaatggatcggaattattagtagtagtggtagcacatactacgcgagctgggcgaaaggccgattcaccatctccaagacctcgaccacggtggatctgaaaatcgccagtccgacaaccgaggacacggccacctatttctgtgccagagatcacatttataggtacgatgactatggtgattaccctacctactacggcatggacccctggggcccaggcaccctggtcaccgtctcgagtgggcaacctaaggctccatcagtcttcccactggccccctgctgcggggacacacccagctccacggtgaccctgggctgcctggtcaaaggctacctcccggagccagtgaccgtgacctggaactcgggcaccctcaccaatggggtacgcaccttcccgtccgtccggcagtcctcaggcctctactcgctgagcagcgtggtgagcgtgacctcaagcagccagcccgtcacctgcaacgtggcccacccagccaccaacaccaaagtggacaagaccgttgcgccctcgacatgcagcaagccc
人類 LEKTI D5 Fab H 鏈 94 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSNYAINWVRQAPGKGLEWIGIIWASGTTFYATWAKGRFTISRDNSGGGGSGGGGSREIVKLCSQYQNQAKNGILFCTRENDPIRGPDGKMHGNLCSMCQAYFQAENEEKKKAEARARSGGGGGGGGSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARTVPGYSTAPYFDLWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCHHHHHHHHHH
人類 LEKTI D5 Fab L 鏈 95 DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCQSSPSVWSNFLSWYQQKPGKAPKLLIYEASKLTSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCGGGYSSISDTTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
兔 / 人類嵌合輕鏈 (hCK S171C) 10236 96 AYDMTQTPASVEVAVGGTVTIKCQASQSISSWLAWYQQKPGQPPKLLIYLASTLASGVSSRFKGSGSGTQFTLTISGVECADAATYYCQQGYTNSNIINTFGGGTEVVVKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDCTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
兔 / 人類嵌合重鏈 10236 97 QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFPLSNYAMSWVRQAPGKGLEWIGDIYPSDIIDYASWAKGRFTISQTSTTVELKITGPTTEDTATYFCARDNNDYGLDIWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK      
LEKTI-D5-Fc TEV 98 EIVKLCSQYQNQAKNGILFCTRENDPIRGPDGKMHGNLCSMCQAYFQAENEEKKKAEARARNLEENLYFQGVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
LEKTI-D8-Fc TEV 99 EAAKEICSEFRDQVRNGTLICTREHNPVRGPDGKMHGNKCAMCASVFKLEEEEKKNDKEEKGKVEAEKVLEENLYFQGVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
10236 gL5 輕鏈 核苷酸減 RS 100 gcgtatgacatgactcagagcccgtccagcctgtccgcgtccgtgggagatcgcgtgactatcacgtgtcaggcctcacaatccattagctcctggctggcctggtaccagcagaagccagggaaggctccgaagctgctgatctacctggcctccacccttgcctccggcgtgccttcacggtttaaaggatccggctcgggaaccgacttcaccctcaccatctcgtcgctccaacccgaggacttcgcaacctactactgccaacaggggtataccaacagcaacatcatcaacaccttcggtggcggaactaaggtcgaaatcaagcgtacggtggccgctccctccgtgttcatcttcccaccctccgacgagcagctgaagtccggcaccgcctccgtcgtgtgcctgctgaacaacttctacccccgcgaggccaaggtgcagtggaaggtggacaacgccctgcagtccggcaactcccaggaatccgtcaccgagcaggactccaaggacagcacctactccctgtcctccaccctgaccctgtccaaggccgactacgagaagcacaaggtgtacgcctgcgaagtgacccaccagggcctgtccagccccgtgaccaagtccttcaaccggggcgagtgc
10236 gL7 輕鏈 核苷酸加 RS 101 gcgatcgacatgactcagagcccgtccagcctgtccgcgtccgtgggagatcgcgtgactatcacgtgtcaggcctcacaatccattagctcctggctggcctggtaccagcagaagccagggaaggctccgaagctgctgatctacctggcctccacccttgcctccggcgtgccttcacggttttctggatccggctcgggaaccgacttcaccctcaccatctcgtcgctccaacccgaggacttcgcaacctactactgccaacaggggtataccaacagcaacatcatcaacaccttcggtggcggaactaaggtcgaaatcaagcgtacggtggccgctccctccgtgttcatcttcccaccctccgacgagcagctgaagtccggcaccgcctccgtcgtgtgcctgctgaacaacttctacccccgcgaggccaaggtgcagtggaaggtggacaacgccctgcagtccggcaactcccaggaatccgtcaccgagcaggactccaaggacagcacctactccctgtcctccaccctgaccctgtccaaggccgactacgagaagcacaaggtgtacgcctgcgaagtgacccaccagggcctgtccagccccgtgaccaagtccttcaaccggggcgagtgc
10236 gL8 輕鏈 核苷酸加 RS 102 gcgtatcagatgactcagagcccgtccagcctgtccgcgtccgtgggagatcgcgtgactatcacgtgtcaggcctcacaatccattagctcctggctggcctggtaccagcagaagccagggaaggctccgaagctgctgatctacctggcctccacccttgcctccggcgtgccttcacggttttctggatccggctcgggaaccgacttcaccctcaccatctcgtcgctccaacccgaggacttcgcaacctactactgccaacaggggtataccaacagcaacatcatcaacaccttcggtggcggaactaaggtcgaaatcaagcgtacggtggccgctccctccgtgttcatcttcccaccctccgacgagcagctgaagtccggcaccgcctccgtcgtgtgcctgctgaacaacttctacccccgcgaggccaaggtgcagtggaaggtggacaacgccctgcagtccggcaactcccaggaatccgtcaccgagcaggactccaaggacagcacctactccctgtcctccaccctgaccctgtccaaggccgactacgagaagcacaaggtgtacgcctgcgaagtgacccaccagggcctgtccagccccgtgaccaagtccttcaaccggggcgagtgc
10236 gL6 輕鏈核苷酸 Q24R 加 RS 103 gcgtatgacatgactcagagcccgtccagcctgtccgcgtccgtgggagatcgcgtgactatcacgtgtcgggcctcacaatccattagctcctggctggcctggtaccagcagaagccagggaaggctccgaagctgctgatctacctggcctccacccttgcctccggcgtgccttcacggttttctggatccggctcgggaaccgacttcaccctcaccatctcgtcgctccaacccgaggacttcgcaacctactactgccaacaggggtataccaacagcaacatcatcaacaccttcggtggcggaactaaggtcgaaatcaagcgtacggtggccgctccctccgtgttcatcttcccaccctccgacgagcagctgaagtccggcaccgcctccgtcgtgtgcctgctgaacaacttctacccccgcgaggccaaggtgcagtggaaggtggacaacgccctgcagtccggcaactcccaggaatccgtcaccgagcaggactccaaggacagcacctactccctgtcctccaccctgaccctgtccaaggccgactacgagaagcacaaggtgtacgcctgcgaagtgacccaccagggcctgtccagccccgtgaccaagtccttcaaccggggcgagtgc
10236 gL6 輕鏈核苷酸 Q24K 加 RS 104 gcgtatgacatgactcagagcccgtccagcctgtccgcgtccgtgggagatcgcgtgactatcacgtgtaaggcctcacaatccattagctcctggctggcctggtaccagcagaagccagggaaggctccgaagctgctgatctacctggcctccacccttgcctccggcgtgccttcacggttttctggatccggctcgggaaccgacttcaccctcaccatctcgtcgctccaacccgaggacttcgcaacctactactgccaacaggggtataccaacagcaacatcatcaacaccttcggtggcggaactaaggtcgaaatcaagcgtacggtggccgctccctccgtgttcatcttcccaccctccgacgagcagctgaagtccggcaccgcctccgtcgtgtgcctgctgaacaacttctacccccgcgaggccaaggtgcagtggaaggtggacaacgccctgcagtccggcaactcccaggaatccgtcaccgagcaggactccaaggacagcacctactccctgtcctccaccctgaccctgtccaaggccgactacgagaagcacaaggtgtacgcctgcgaagtgacccaccagggcctgtccagccccgtgaccaagtccttcaaccggggcgagtgc
現將參照附圖中示出的實施例，藉助於實例進一步描述本發明。實例 實例 1 ： 胰舒血管素蛋白質及 LEKTI 域之選殖、表現及純化
使用HindIII/EcoRI位點將編碼根據SEQ ID NO: 51之蛋白質之優化核苷酸序列選殖至內部哺乳動物表現載體中，產生編碼無標籤之人類KLK5蛋白質之載體。
類似地選殖小鼠及食蟹獼猴(cyno) KLK5序列以使得能夠產生包含SEQ ID NO: 59及60之蛋白質的活性形式。
選殖人類LEKTI (Uniprot Q9NQ38)之分別包含殘基292-353及490-558 (根據Uniprot中之編號)之域5 (D5)及域8 (D8)，且表現，以用作活體外分析中之參考蛋白。
使用HindIII/XhoI位點將針對在哺乳動物細胞中表現進行優化之人類LEKTI域5及域8核苷酸序列分開選殖至編碼兔Fc標籤之內部哺乳動物表現載體中，產生編碼具有C端兔Fc標籤之LEKTI域5序列( SEQ ID NO: 54)或具有C端兔Fc標籤之LEKTI域8序列( SEQ ID NO: 61)的載體。編碼蛋白將分別稱作LEKTI D5兔Fc及LEKTI D8兔Fc。
KLK5、LEKTI域5及LEKTI域8兔Fc融合蛋白藉由根據製造商之方案使用Expi293™表現系統(Life TechnologiesTM )進行短暫轉染來表現。在表現期間，KLK5自活化，在上清液中得到活性KLK5 (包含SEQ ID NO: 53或SEQ ID NO: 51之殘基I67-S293)。在轉染之後5天收集細胞且上清液立即用於純化。將包含人類(或小鼠或cyno)活性KLK5之上清液用緩衝液A (50 mM Tris pH 7.0、50 mM NaCl)稀釋4倍且負載至HiTrap SP HP陽離子交換管柱上。使用緩衝液A (50 mM Tris pH 7.0、50 mM NaCl)及緩衝液B (50 mM Tris pH 7.0、1M NaCl)在共10管柱體積上所產生之鹽梯度洗脫經結合蛋白。將含有純化之人類(或小鼠或cyno)活性KLK5之洗脫份彙集，濃縮且進一步藉由尺寸排阻層析法在S200 26/60管柱上純化，該管柱已用由20 mM Tris、150 mM NaCl、5%甘油pH 7.2構成之緩衝液平衡。SDS-PAGE分析指示在表現期間蛋白質經歷糖基化。藉由質譜法之分析產生預期分子量。包含人類LEKTI D5兔Fc融合蛋白(根據SEQ ID NO: 54)之上清液首先經受蛋白A親和層析法。將上清液負載至5 ml HitrapTM 蛋白A管柱上。用1M檸檬酸緩衝液pH 2.0洗脫經結合蛋白且洗脫份經2M Tris-HCl pH8.5中和。將含有LEKTI D5兔Fc融合蛋白之洗脫份彙集，濃縮且藉由尺寸排阻層析使用經PBS平衡之S200 26/60管柱進一步純化。接著將含有純化之人類LEKTI D5兔Fc融合蛋白之洗脫份彙集且濃縮。類似地自轉染細胞培養上清液純化LEKTI D8兔Fc融合蛋白(根據SEQ ID NO: 61)。
表現LEKTI D5 Fab融合分子(根據SEQ ID NO: 94及95)且藉由陽離子交換層析法來純化。將在5'及3'端側接編碼Gly4 Ser連接子之序列的LEKTI域5核苷酸序列整合至對白蛋白具有特異性之Fab之重鏈序列的構架3中(如以引用的方式併入本文中之WO2020011868中所述)；編碼10x His序列之標籤亦置放於Fab H鏈之3'末端處。針對在哺乳動物細胞中表現來優化LEKTI D5 Fab融合物重鏈序列，選殖至內部表現載體中且與適當輕鏈共轉染，亦針對在CHO SXE細胞中之哺乳動物表現進行優化。將經轉染之細胞在排氣燒瓶(vented flask)中在32℃下培養13天。收集上清液，濃縮且緩衝液更換為20 mM Tris、50 mM NaCl pH 7.0，然後負載至SP瓊脂糖凝膠HP管柱上。使用緩衝液A (50 mM Tris pH 7.0、50 mM NaCl)及緩衝液B (50 mM Tris pH 7.0、1M NaCl)在共10管柱體積上所產生之鹽梯度洗脫經結合蛋白。將含有LEKTI D5 Fab融合蛋白之洗脫份彙集且藉由尺寸排阻層析法使用經PBS pH 7.4平衡之S200管柱進一步純化。將相關洗脫份彙集。
編碼全長KLK7蛋白之人類及cyno核苷酸序列以類似於人類KLK5之方式表現，產生前KLK7 (分別包含SEQ ID NO: 55及57)。不同於KLK5，KLK7在表現期間不自活化，因此使用嗜熱菌蛋白酶使前肽序列自對應的經純化之蛋白質裂解而產生人類及cyno KLK7之活性形式(分別SEQ ID NO: 56、58)。將人類及cyno前KLK7蛋白(包含SEQ ID NO: 55及57)用活化緩衝液(50 mM Tris pH 7.5、10 mM CaCl2 、150 mM NaCl、0.05% Brij 35)稀釋至1 mg/ml。使來自SigmaTM 之嗜熱菌蛋白酶(25 mg)再懸浮於25 ml消化緩衝液(50 mM Tris pH 8.0、0.5 mM CaCl2 )中，在37℃下以1:10之比率添加至前KLK7蛋白，歷時45分鐘，接著與陰離子交換DEAE樹脂(GE Life SciencesTM )混合以結合及移除嗜熱菌蛋白酶。收集流經液係為活性(人類或cyno)KLK7，緩衝液更換為50 mM Tris pH7.5、150 mM NaCl、5%甘油、1 mM EDTA且濃縮至大約3.2 mg/ml。類似地產生小鼠前KLK7且裂解，產生活性酶。
呈活性蛋白質之人類KLK2來源於R&D SystemsTM (目錄號4104-SE-010)。
呈前形式之人類KLK4來源於R&D SystemsTM (目錄號1719-SE)且如下活化。將人類前KLK4在50 mM Tris、10 mM CaCl2 、150 mM NaCl pH 7.5中稀釋至200 µg/mL。細菌嗜熱菌蛋白酶來源於R&D SystemsTM (目錄號3097-ZN)且在相同緩衝液中稀釋至2 µg/mL。將相同體積之前人類KLK4與嗜熱菌蛋白酶組合且在室溫下培育10分鐘以允許活化。用EDTA使反應停止，最終濃度為10 mM。實例 2 ： 藉由用 KLK5 進行免疫接種來產生抗體
雌性紐西蘭白兔(＞2 kg)接受與等體積完全弗氏佐劑(complete Freund's adjuvant，SigmaTM )混合之100 µg 0.4 mg/mL人類活性KLK5及人類活性KLK7 (根據實例1表現)的皮下免疫接種。在21天之時間間隔下動物接受加強注射，加強注射包含混合在等體積不完全弗氏佐劑(SigmaTM )中之100 µg相同免疫原。在最後加打14天後終止，屆時製備脾、骨髓及周邊血液單核細胞之單細胞懸浮液並於-80℃下冷凍於含胎牛血清(FCS)之10%二甲亞碸(DMSO)中。
B細胞培養物係使用類似於Tickle等人, 2015. J Biomol Screen: 20 (4), 492-497所描述之方法的方法製備。簡言之，將來自經免疫接種之動物的淋巴結細胞、脾細胞或周邊血液單核細胞(PBMC)於帶條形碼之96孔組織培養盤中以每孔2000個細胞之密度培養，該培養盤具有補充有10% FCS (Sigma AldrichTM )、2% HEPES溶液(Sigma AldrichTM )、2% L-麩醯胺酸溶液(GibcoTM )、1%青黴素/鏈黴素溶液(GibcoTM )、0.2% Normocin (InvivogenTM )、0.1% β-巰基乙醇(GibcoTM )且使用表現CD40L及IL-2之餵養細胞(feeder cell)的在B細胞刺激上清液(BSS)存在或不存在下的200微升/孔RPMI 1640培養基(GibcoTM )。藉由在促有絲分裂劑佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸鹽(PMA)及植物血球凝集素-L (PHA-L)存在下培養PBMC 6天，然後收集上清液來產生BSS。將培養盤在37℃及5% CO2 下培育六天。使用來自所有經免疫接種之動物的B細胞建立培養物，且總共篩選大約1×109 個B細胞。
在六天之後，藉由多路均相基於螢光之結合分析，使用塗有作為目標抗原來源之生物素化人類KLK5之Sol-R2抗生蛋白鏈菌素珠粒(TTP LabtechTM )及塗有相關KLK7之Sol-R4抗生蛋白鏈菌素珠粒(TTP LabtechTM )進行計數篩選來針對結合於人類KLK5 (如實例1中產生)篩選上清液。使用Lightning-Link快速生物素B型(ExpedeonTM )將蛋白質進行生物素標記，與提供者之方案相比，使用5倍莫耳過量之蛋白質，以避免所有離胺酸殘基之完全修飾。使用Agilent Bravo液體處置器將來自帶條形碼之96孔組織培養盤的總共10 µL上清液轉移至含有如上生物素化之KLK塗佈之Sol-R珠粒及FITC結合之山羊抗兔Fc片段特異性(Jackson ImmunoResearchTM )的帶條形碼之384孔黑壁分析盤中。培育1小時之後，在mirror-ball儀器(TTP-LabtechTM )上讀取培養盤。
在初次篩選之後，使用Beckman Coulter BiomekNXPTM 隨機挑選(hit-picking)機器人將KLK5結合陽性之上清液固結在96孔帶條形碼之主培養盤上且細胞培養盤中之B細胞冷凍在-80℃下。首先，再次對固結之上清液進行篩選以藉由螢光微孔分析技術(Fluorometric Microvolume Assay Technology，FMAT)證實結合於人類KLK5。簡言之，將10 µL上清液轉移至帶條形碼之黑色Greiner培養盤。50微升/盤之10 µm superavidin(Bangs BeadsTM )塗有人類生物素化KLK5，與Alexa-647TM 山羊抗兔IgG Fc片段特異性(Jackson ImmunoResearchTM )混合。接著添加上清液且在Applied BiosystemsTM 細胞偵測系統8200上讀取培養盤。
選擇大量抗體用於結合於KLK5且隨後研究其特異性地抑制KLK5之能力及相比於其他胰舒血管素其對KLK5之特異性。實例 3 ： KLK5 抑制抗體之鑑別
為鑑別複合B細胞上清液中存在之蛋白酶及蛋白酶抑制劑中能夠特異性抑制KLK5活性的抗體，研發一種篩選檢定。Nunc Maxisorp黑色384 (Sigma AldrichTM )塗有於碳酸鹽緩衝液中10 µg/mL之F(ab')₂片段山羊抗兔IgG Fc片段特異性(Jackson ImmunoResearchTM )且置於4℃下隔夜。將培養盤在BiotekTM 盤式洗滌器上用PBS/0.1% Tween-20洗滌3次且在室溫下用20微升/孔PBS/1% BSA阻斷1小時。將B細胞上清液添加至培養盤，其中25 μl 1 nM LEKTI D5兔Fc融合蛋白添加至對照孔，作為抑制之陽性對照，且分析緩衝液A (50 mM Tris、150 mM NaCl、0.05 % (v/v) Tween-20 pH 7.6)添加至另一組對照孔，作為抑制之陰性對照。在室溫下培育培養盤隔夜，且接著在BiotekTM 盤式洗滌器上用PBS/0.1% Tenen-20洗滌三次。將10 µL於分析緩衝液A中之250 pM人類KLK5添加至各孔且在室溫下培育培養盤隔夜以允許完全締合。將分析緩衝液A中之Boc-VPR-AMC受質(Cambridge Research BiochemicalsTM )添加至孔中，最終濃度為600 µM，且在4小時之後使用PHERAStar FSX (BMG LabtechTM )盤式讀取器測定螢光(λex 380 nm λem 430 nm)。
分析資料以使用以下等式確定KLK5活性之抑制百分比：
Figure 02_image005
其中測試 為測試抗體之螢光值，陽性 為抑制孔之陽性對照之螢光值的平均值，且陰性 為抑制孔之陰性對照之平均螢光值。
顯示＞40%抑制之上清液視為命中。此佔所有篩選上清液之約4%。選擇此等抗體用於回收可變區。
為鑑別分泌特異性抗體之細胞以允許自活化B細胞之異質群體回收抗體可變區基因，必須進行去卷積步驟。使用螢光焦點方法(Clargo等人, 2014)。簡言之，將分泌抗體之細胞在37℃下在塗有生物素化人類KLK5之抗生蛋白鏈菌素珠粒(New England BiolabsTM )及山羊抗兔Fc片段特異性FITC結合物(Jackson ImmunoResearchTM )存在下靜態培育1小時。接著自周圍之螢光光環鑑別分泌抗原特異性抗體之細胞。接著利用EppendorfTM 微操作器挑選多個使用Olympus顯微鏡鑑別之此等個別B細胞純系且沈積至PCR管中。藉由標準RT-PCR獲得來自單細胞之cDNA且使用免疫球蛋白基因特異性引子進行重鏈及輕鏈之可變免疫球蛋白序列之後續PCR，接著進行併入重疊載體位點之巢式PCR，允許將可變區直接選殖至兔IgG (VH)或兔κ (VL)哺乳動物表現載體中。使用ExpiFectamineTM (Life TechnologiesTM )將重鏈及輕鏈構築體共轉染至ExpiHEK-293細胞中且在125 ml ErlenmeyerTM 瓶中以30 ml體積表現重組抗體。在培養5-7天之後，收集上清液，且藉由使用AKTA純層析系統進行蛋白A親和力捕捉來純化抗體。1 ml蛋白A HiTrap MabSelectTM SuReTM 管柱(GE Healthcare)附接至該系統且管柱在PBS pH 7.4中平衡，接著將細胞培養上清液以0.25 ml/min之流速加至管柱。接著將管柱用PBS pH 7.4洗滌，用檸檬酸鈉pH 3.4洗脫結合之物質且用適當體積之2M Tris-HCl pH 8.5中和。將洗脫份之緩衝液更換為PBS (Sigma) pH 7.4且通過0.22 μm過濾器。藉由A280掃描SE-UPLC (BEH200方法)分析最終純化材料，且使用Endosafe® PTSTM 系統分析內毒素。
自此分析，兔抗體10236及10273顯示有效抑制且經選擇用於進一步表徵。實例 4 ： KLK5 特異性抑制抗體之鑑別
接著藉由使用一組其他人類序列胰舒血管素家族成員，包括KLK2、KLK4及KLK7，以及鼠類及cyno KLK5及KLK7，篩選經純化之兔抗體10236及10273以證實其對KLK5之抑制活性且確定對KLK5之特異性。針對各抗體，製備600 nM至20 pM範圍內的10點半對數稀釋數列，且使用Beckman Coulter FXTM 及Multidrop系統將5 uL轉移至黑色384孔分析盤(CorningTM ，目錄號3575)。將15 µL活性重組人類胰舒血管素蛋白添加至相關孔中，實現分析緩衝液A (50 mM Tris、150 mM NaCl、200 µM EDTA、0.05 % (v/v) Tween-20，pH 7.6)中以下最終分析濃度：60 pM KLK5、250 pM KLK7、500 pM KLK2、30 pM KLK4、30 pM cynoKLK5、500 pM cyno KLK7、30 pM小鼠KLK5或10 nM小鼠KLK7。作為對照，將20 µL僅分析緩衝液A (無KLK蛋白)添加至孔中，活性為0%。LEKTI D5兔Fc用作抑制陽性對照(在與抗體相同濃度範圍內測試)，同時將15 µL對應的活性人類胰舒血管素蛋白添加至5 µL分析緩衝液A中，100%活性參考。將培養盤在室溫下培育隔夜，接著使用multidrop裝置添加以下肽受質：針對人類KLK5 (300 µM)、人類KLK2 (30 µM)、鼠類KLK5 (300 µM)及cyno KLK5 (450 µM)之Boc-VPR-AMC (Cambridge Research Biochemicals™)；針對人類及cyno KLK7 (分別90 µM及150 µM)之KHLF-AMC (Cambridge Research Biochemicals™)；針對人類KLK4 (200 µM)之PFR-AMC (R&D SystemsTM )及針對鼠類KLK7 (150 µM)之Mca-RPKPVE-Nval-WRK(Dnp)-NH2 (R&D SystemsTM )。將樣品培育4小時且在Pherastar FSX盤式讀取器(BMG LabtechTM )上針對Boc-VPR-AMC、PFR-AMC及KHLF-AMC在λex 380 nm及λem 430 nm下以及針對Mca-RPKPVE-Nval-WRK(Dnp)-NH2在λex 320 nm及λem 400 nm下讀取。如實例3中所述分析資料以確定抑制百分比。將資料相對於測試抗體濃度繪圖且擬合4參數S形曲線以確定IC50 (Genedata ScreenerTM )。
除兔抗體10236外，為進行此量測，將抗體10236及10273之兔可變區之聚核苷酸序列選殖在包含S171C突變之小鼠Cκ載體之經修飾型式上，以重建小鼠恆定區中不存在的在兔VK輕鏈中發現之額外二硫鍵(兔抗體10273 mIgG為SEQ ID NO: 80及81，且兔抗體10236 mIgG為SEQ ID NO: 84及85 (或SEQ ID NO: 85之核苷酸1-1314))。此產生針對兔抗體10236 mIgG之包含SEQ ID NO: 82及83之抗體及針對兔抗體10273 mIgG之包含SEQ ID NO: 78及79之抗體。
兔抗體10236及10237 mIgG顯示相對於其他測試之人類家族成員(人類KLK2、4及7)人類KLK5之有效抑制，無活性(亦即，按照實例2中之選擇標準，低於40%閾值)。亦證明cyno KLK5之有效抑制，但cyno KLK7未有效抑制。對小鼠KLK5或KLK7無明顯抑制活性。兔抗體10236、10273及LEKTI D5兔Fc之IC50 結果顯示於表2中。表 2
   Hu KLK5 Hu KLK2 Hu KLK4 Hu KLK7 Cyno KLK5 Cyno KLK7 小鼠 KLK5 小鼠 KLK7
抗體描述詞 IC50 (M)
10236 mIgG 2.40E-10 NI NI NI 3.30E-11 NI NI NI
兔 10236 IgG 1.74E-10 NI NI NI 2.76E-11 NI NI NI
10273 mIgG 3.48E-11 NI NI NI 3.01E-10 NI NI NI
LEKTI D5 Fc 1.03E-10 n/a n/a n/a n/a n/a n/a n/a
NI = 無抑制；Hu = 人類；Cy = cyno；Mu = 小鼠；n/a = 不可獲得實例 5 ： KLK5 特異性 Ab 之親和力之測定
在25℃下藉由表面電漿子共振(Biacore T200，(GE Life SciencesTM )評估鼠類IgG分子結合於人類KLK5之動力學。
經由胺偶合化學，使山羊抗小鼠IgG Fc特異性抗體(Jackson ImmunoResearch)固定在CM5感測器晶片上，達到大約7000RU之程度。各分析週期由以下組成：抗KLK5 IgG分子捕捉至抗Fc表面、以30 µl/min注射KLK5分析物(內部製備) 300秒，接著解離600秒。在各週期結束時，以10 μL/min之流動速率，使用50 mM HCl之60秒注射，接著5 mM NaOH之30秒注射及最終50 mM HCl之60秒注射，使表面再生。在補充有最終濃度為300 mM之NaCl之HBS-EP+操作緩衝液(GE Healthcare)中將人類KLK5自20 nM滴定至0.25 nM(4×3倍連續稀釋)。包括緩衝液空白注射液以減除儀器雜訊及漂移。
使用1:1結合模型，使用Biacore T200評估軟體來測定動力學參數。
兔抗體10236及10273之親和力顯示於表3中。表 3
兔 / 小鼠抗體 ka (Ms^-1) kd (s^-1) KD (pM)
10236 3.00E+06 5.17E-04 172.3
10273 1.14E+06 1.84E-04 160.0
實例 6 ：抗體 10236 之表徵 在抗體 10236 存在下 LEKTI 與 KLK5 之結合
進行表面電漿子共振(SPR)實驗以確定抗體10236是否與LEKTI D5蛋白競爭結合於人類KLK5。此等分析使得能夠比較LEKTI D5 Fab融合物對單獨KLK5蛋白之親和力與其對與抗體10236複合之人類KLK5的親和力。
使用Biacore T200 (GE Life SciencesTM )獲得LEKTI D5 Fab融合蛋白與人類KLK5之結合的動力學量測。為製備表面，首先將CM5晶片(GE Life SciencesTM )藉由以下來活化：注射(30 µL min-1 ) EDC/NHS之混合物(GE Life SciencesTM ) 5分鐘，接著注射100 µg mL-1 於乙酸鹽緩衝液pH 5.0 (GE Life SciencesTM )中之LEKTI D5 Fab融合物(UCB)，以實現晶片表面上80 RU固定之LEKTI D5 Fab融合物。最終，注射1 M乙醇胺鹽酸鹽-NaOH pH 8.5以使表面失活。接著以單循環動力學模式注射HBS-EP緩衝液(GE Life SciencesTM )中濃度自0.32 nM遞增至32 nM之人類KLK5。自針對注射KLK5所獲得之值減去由僅注射緩衝液產生之值，且在BIAcore評估軟體(GE Life SciencesTM )中藉由擬合成1:1結合模型來測定動力學。
為確定在兔抗體10236結合人類KLK5時人類LEKTI是否能夠結合人類KLK5，使用如實例4中所述捕捉之山羊抗兔Fc多株及Ab 10236製備抗體捕捉表面。接著注射20 nM人類KLK5，直至表面達到飽和。接著以介於30 pM與100 nM之間的濃度注射LEKTI D5 Fab融合蛋白(如實例1中所述產生)。首先自用分析物獲得之值減去由僅注射緩衝液產生之值，接著在BiacoreTM 評估軟體(GE Life SciencesTM )中擬合成1:1結合動力學模型。
作為參考，將LEKTI D5 Fab融合蛋白固定至晶片表面，然後監測與人類KLK5之相互作用。當人類KLK5以120 nM之親和力與兔抗體10236形成複合物時，人類LEKTI D5 Fab融合蛋白能夠結合於人類KLK5 (表4A)。儘管在無兔抗體10236存在下人類LEKTI與人類KLK5之親和力較高(40 pM)，但此分析表明，藉由在人類LEKTI存在或不存在下結合人類KLK5，兔抗體10236可向人類KLK5提供額外抑制活性。表 4A
ka (Ms^-1) kd (s^-1) KD (M)
僅人類KLK5 5.70E+05 2.30E-05 4.00E-11
10236 + 人類KLK5 5.90E+04 7.30E-03 1.20E-07
LEKTI-KLK5- 抗體 10236 複合物之形成
KLK5在HEK293細胞中呈具有N端TEV可裂解之8xHis-標籤的分泌蛋白產生。首先藉由Ni2+ 親和層析法自條件培養基純化蛋白質。將來自含有KLK5之Ni2+ 管柱之洗脫份彙集且用TEV蛋白酶消化以移除His標籤，接著進行第二Ni親和力步驟以移除TEV蛋白酶，使裂解之KKL5流過管柱。濃縮來自第二Ni2+ 管柱之流過洗脫份且在尺寸排阻管柱上在50 mM Tris pH 7、50 mM NaCl、1 mM EDTA、5%甘油中操作。將來自SEC之KLK5洗脫份彙集且濃縮至大約10 mg/ml且儲存在-80℃下。
根據SEQ ID NO: 98之LEKTI域5 (LEKTI D5 Fc)及根據SEQ ID NO: 99之LEKTI域8 (LEKTI D8 Fc)在HEK293細胞中呈具有C端TEV可裂解之Fc標籤的分泌蛋白產生。此等蛋白質藉由使條件培養基通過蛋白A珠粒來純化。用0.1 M檸檬酸pH 2.0洗脫經結合蛋白且藉由添加2M Tris-HCl pH 8.5中和洗脫份。將來自蛋白A管柱之含有LEKTI域5或域8之洗脫份彙集且用TEV蛋白酶移除Fc標籤，得到LEKTI D5或LEKTI D8。將裂解之蛋白質濃縮至約15 mg/ml，用於尺寸排阻層析。SEC在PBS pH 7.2中進行。將含有LEKTI之洗脫份彙集且濃縮至約10 mg/ml且冷凍儲存在-80℃下。
兔Fab抗體10236在HEK293細胞中呈分泌蛋白表現。將包含SEQ ID NO: 87及89之表現構築體以1:1莫耳比共轉染。藉由使條件培養基通過蛋白G珠粒來純化所分泌之Fab (包含SEQ ID NO: 86及88)，且用0.1M甘胺酸pH 2.7洗脫。藉由添加2M Tris-HCl pH 8.5中和洗脫份。蛋白質滲析至PBS pH 7.2中，接著濃縮至約10 mg/ml且冷凍儲存在-80℃下。
藉由首先在冰上培育25 µM KLK5與25 µM LEKTI D5或LEKTI D8 60分鐘，隨後在冰上添加25 µM兔Fab抗體10236且再在冰上繼續培育60分鐘來形成KLK5、LEKTI D5或LEKTI D8與兔Fab抗體10236之複合物。將混合物注射至經PBS pH 7.2平衡之Superdex 200®尺寸排阻管柱上，該管柱串聯連接至HPLC。收集峰洗脫份以藉由SDS-PAGE進行分析。圖1A及1B展示單獨人類KLK5 (實心跡線，最右側)、單獨兔Fab抗體10236 (點跡線)、人類KLK + LEKTI D5或D8之二元複合物(分別圖1A或1B，長虛線)及KLK5 + LEKTI D5或D8 + 兔Fab抗體10236 (分別圖3A或3B，短虛線，最左側)之SEC層析圖。
藉由SDS-PAGE證實各峰之組分之分子量(MW)，如圖2中所示。
總體而言，KLK5、LEKTI D5或LEKTI D8與兔Fab抗體10236之間的複合物在以1:1:1比率混合時藉由將人類KLK5與各LEKTI片段個別地混合，隨後培育與兔Fab抗體10236之二元複合物而容易形成。在SEC上且藉由峰洗脫份之SDS-PAGE觀測到二元及三元複合物，此表明其穩定且適合於自其他物種分離/純化。
實例 7 ： KLK5/Fab 抗體 10236 複合物之結晶 人類KLK5藉由在添加5 mM最終濃度之基夫鹼(Sigma®)下遵循製造商之方案使用Expi293™表現系統(Life TechnologiesTM )短暫轉染來表現。基夫鹼為甘露糖苷酶I酶之強力抑制劑且主要用於細胞培養中以製備高甘露糖之糖蛋白。
在表現KLK5期間，蛋白質自活化，在上清液中得到活性KLK5蛋白(SEQ ID NO: 53之殘基I67-S293 (UniProt Q9Y337編號))。在轉染之後5天收集細胞且上清液立即用於純化。將包含人類活性KLK5之上清液用緩衝液A (50 mM Tris pH 7.0、50 mM NaCl)稀釋4倍且負載至HiTrap SP HP陽離子交換管柱上。使用緩衝液A (50 mM Tris pH 7.0、50 mM NaCl)及緩衝液B (50 mM Tris pH 7.0、1M NaCl)在共10管柱體積上所產生之鹽梯度洗脫經結合蛋白。將含有經純化之人類活性KLK5之洗脫份彙集，濃縮且藉由尺寸排阻層析在經20 mM Tris、150 mM NaCl平衡在pH 7.2下的S200 26/60管柱上進一步純化。
KLK5由SDS-PAGE表徵且遷移至凝膠上與高甘露糖糖基化蛋白質約35-38 kDa之預期分子量(MW)一致之位置(圖3)。
接著將人類KLK5蛋白用1:100比率之內切糖苷酶H (Endo H)蛋白處理且在4℃下培育隔夜以形成均質去糖基化之KLK5蛋白以用於結構研究。內切糖苷酶H (Endo H)為自灰色鏈黴菌選殖且在大腸桿菌中過度表現之重組糖苷酶。Endo H使高甘露糖之殼二糖核心及有限數目之雜混寡醣自N-連接糖蛋白裂解。其不使複合聚醣裂解。在寡醣之二乙醯殼二糖核心中之兩個N-乙醯基葡糖胺殘基之間發生酶促裂解，在天冬醯胺上留下一個N-乙醯基葡糖胺殘基。進行此步驟以確保均質人類KLK5可用於晶體學研究。KLK5由SDS-PAGE表徵(圖3)且遷移至凝膠上與去糖基化蛋白約25 kDa之預期分子量(MW)一致之位置。
兔Fab抗體10236如實例6中所述表現。兔Fab抗體10236 (包含SEQ ID NO: 86及88)如實例6中所述表現。簡而言之，將包含SEQ ID NO: 87及89之表現構築體以1:1莫耳比共轉染。藉由使條件培養基通過蛋白G珠粒來純化兔Fab抗體10236，且用0.1M甘胺酸pH 2.7洗脫。藉由添加2M Tris-HCl pH 8.5中和洗脫份。對應的個別蛋白質滲析至PBS pH 7.2中，濃縮至約10 mg/ml且冷凍儲存在-80℃下。
製得1.5:1莫耳比人類KLK5/兔Fab抗體10236混合物，在4℃下培育隔夜且藉由尺寸排阻層析(20 mM Tris、150 mM NaCl pH 7.2洗脫緩衝液)純化。分離所形成之複合物，且濃縮至約10.0 mg/ml，接著結晶。
使用若干市售結晶篩鑑別人類KLK5/兔Fab抗體10236複合物之結晶條件。此等以沉滴格式進行，使用Swissci 96孔2滴MRC結晶盤(來源於Molecular Dimensions，目錄號MD11-00-100)。首先，使用Microlab STAR液體處置系統(Hamilton)將貯存器填充篩中之75 µL各結晶溶液。接著，使用Mosquito液體處置器(TTP LabTech)將300 nL人類KLK5/兔Fab抗體10236複合物及300 nL貯存器溶液分配於結晶盤之孔中。在ProComplex套件(Qiagen)之條件88 (孔H4)中獲得單晶體。此條件含有1.4 M丙二酸鈉。將晶體短暫轉移至含有1.4 M丙二酸鈉及25%甘油之液滴中。將晶體在液氮中速凍且在光束線I03 (Diamond Light Source, UK)下收集繞射資料。使用XDS (Kabsch, W. XDS. Acta Cryst. D66, 125-132 (2010))將資料索引化及積分，接著使用AIMLESS (Evans PR, Murshudov GN. How good are my data and what is the resolution? Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2013;69(Pt 7):1204-1214)規模化。藉由在Phenix軟體套件(Adams PD, Afonine PV, Bunkóczi G等人, The Phenix software for automated determination of macromolecular structures. Methods. 2011;55(1):94-106)中使用移相器(McCoy, A.J., Grosse-Kunstleve, R.W., Adams, P.D., Winn, M.D., Storoni, L.C., 及Read, R.J. Phaser crystallographic software. J. Appl. Cryst. (2007). 40, 658-674)進行分子置換來解析人類KLK5/兔Fab抗體10236複合物結構。在此程序中，在KLK5與兔Fab抗體10273及10236之複合物之晶體結構中觀測到的KLK5及兔Fab抗體10236之結構用作分子置換模型。在手動模型完成及精修之以下週期中使用Coot (P. Emsley; B. Lohkamp; W.G. Scott; Cowtan (2010). 「Features and Development of Coot」. Acta Crystallographica. D66: 486-501)及phenix.refine (Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. P.V. Afonine, R.W. Grosse-Kunstleve, N. Echols, J.J. Headd, N.W. Moriarty, M. Mustyakimov, T.C. Terwilliger, A. Urzhumtsev, P.H. Zwart, 及P.D. Adams. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 68, 352-67 (2012))。表4B展示第一次描述本發明時之精修統計資料。表 4B
資料收集   
分辨率(Å) 123.01-2.70 (2.83-2.70)
空間群 I 2 3
晶胞參數   
a = b = c (Å) 137.96
α = β = γ (°) 90.00
Rmerge (%) 5.70 (75.4)
Rmeas (%) 5.80 (77.4)
Rpim 1.30 (16.7)
平均I/σ(I) 48.5 (6.6)
完整度(%) 100.0 (100.0)
獨特反射之數目 24174 (3190)
多重性 40.8 (41.5)
威爾遜B因子(Wilson B-factor)(Å2 ) 77.528
  
精修統計資料   
蛋白質/溶劑原子數目 4826/12
Rwork/free(%) 21.19/25.8
『free』設定中之反射數目 3302
與理想值之R.m.s.偏差   
鍵(Å) 0.004
角度(°) 0.764
平均蛋白B因子(Å2 ) 89.06
在不對稱晶體單元中觀測到單個人類KLK5/兔Fab抗體10236複合物。圖4B展示抗體與KLK5之結合位點不同於受質結合位點。CCP4軟體套件中之NCONT用於界定KLK5上由Fab10236分子識別之抗原決定基。KLK5胺基酸編號係基於UnitProtKB登錄Q9Y337，其中標準蛋白酶編號基於括號中之胰凝乳蛋白酶原。
在4Å接觸距離下由兔Fab抗體10236結合之人類KLK5抗原決定基由參考SEQ ID NO: 51殘基Arg87 (36)、Ala107 (56)、Arg110 (59)、Lys111 (60)、Lys112 (61)、Val113 (62)、Val137 (86)、Lys138 (87)、Ser139 (88)、Ile140 (89)、Pro141 (90)、His142 (91)、Pro143 (92)、Tyr145 (94)、Ser146 (95)、His147 (96)構成，同時圓括號中之數字與蛋白酶命名對應。結合位點更詳細地展示在圖4A中。
為使Fab10236之結合位點相對於KLK5之活性位點形象化，製作本文中呈現之KLK5-Fab10236結構與抗纖維蛋白溶酶肽結合在活性位點中之KLK5之公開結構(2PSX)的結構重疊圖(圖4B)。重疊圖展示，Fab10236不在活性位點之核心(如抗纖維蛋白溶酶肽之位置所指示)結合KLK5 (圖4B)，然而，Fab10236之輕鏈與99環形成接觸，此使KLK5上活性位點間隙之一部分成形。比較本文中所呈現之KLK5-Fab10236結構與先前公開之KLK5結構，諸如揭示為PDB ID 2PSX及2PSY之彼等結構。晶體結構2PSX展示KLK5在其活性位點中結合於肽蛋白酶抑制劑抗纖維蛋白溶酶肽，而晶體結構2PSY展示KLK5結合於抗纖維蛋白溶酶肽以及與活性位點相鄰之鋅離子。已知鋅以非競爭性方式抑制KLK5。比較結構2PSX與2PSY顯示，鋅藉由誘發99環之主鏈構形移位，伴隨His147(96)及His150(99)之側鏈的位置發生顯著變化而影響蛋白酶活性。結構重疊圖(圖4C，白色無鋅且黑色加鋅)中展示主鏈99環移動，以及組胺酸側鏈移動，尤其His147 (99)自不存在鋅下之向外位置移位至結合鋅時之向內位置(圖4C，虛線箭頭指示組胺酸側鏈移動)。
KLK5-Fab10236結構與無鋅之KLK抗纖維蛋白溶酶肽結構(2PSX)的結構重疊圖突出顯示99環之主鏈移動及His147(96)及His150(99)之側鏈移動(圖4D，詳細展示99環及組胺酸側鏈-黑色為KLK5-Fab10236結構且白色為KLK5-抗纖維蛋白溶酶肽無鋅結構)。
在Fab10236結合於KLK5時，位於99環中之His147(96)不可採用先前在晶體結構2PSX中觀測到之構形，因為此將引起在空間上與Fab輕鏈衝突(虛線正方形，圖4D)。為使Fab10236結合，99環採用不同構形，其中His147 (96)自向外位置擺動至向內位置(類似於鋅結合時所觀測；圖4D，虛線箭頭指示His147(96)之移動)。同時，His150(99)之側鏈進行位置改變，其移向S2袋形物，在S2袋形物中其可阻斷受質結合。如圖4D中所示，S2袋形物由模型化之抗纖維蛋白溶酶肽佔據且His150 (99)側鏈與抗纖維蛋白溶酶肽之間的衝突由白色虛線環突出顯示。實例 8 ： KLK5/Fab 抗體 10236/Fab 抗體 10273 複合物之結晶
人類KLK5如實例7中表現，例外為一旦上清液裝載至HiTrap SP HP陽離子交換管柱上，用超過10管柱體積之緩衝液B (50 mM Tris pH 7.0，1M NaCl)梯度洗脫經結合蛋白。進一步純化、內切糖苷酶處理及分析表徵如實例7中進行。
兔Fab抗體10236如實例6中表現。如關於兔Fab抗體10236所述選殖兔Fab抗體10273 (包含SEQ ID NO: 90及92)。簡而言之，將包含SEQ ID NO: 91及93之表現構築體以1:1莫耳比共轉型。藉由使條件培養基通過蛋白G珠粒來純化所分泌之蛋白質，且用0.1M甘胺酸pH 2.7洗脫。藉由添加2M Tris-HCl pH 8.5中和洗脫份。蛋白質滲析至PBS pH 7.2中，接著濃縮至約10 mg/ml且冷凍儲存在-80℃下。
製得1:1.5:1.5之人類KLK5/兔Fab抗體10273/兔Fab抗體10236混合物，在4℃下培育隔夜且藉由尺寸排阻層析(20 mM Tris、150 mM NaCl pH 7.2洗脫緩衝液)純化。在結晶之前，將含有複合物之單峰濃縮至約10.8 mg/ml。
使用若干市售結晶篩鑑別人類KLK5/兔Fab抗體10273/兔Fab抗體10236複合物之結晶條件。此等以沉滴格式進行，使用Swissci 96孔2滴MRC結晶盤(來源於Molecular Dimensions，目錄號MD11-00-100)。首先，使用Microlab STAR液體處置系統(Hamilton)將貯存器填充篩中之75 µL各結晶溶液。接著，使用Mosquito液體處置器(TTP LabTech)將300 nL人類KLK5/兔Fab抗體10273/兔Fab抗體10236複合物及300 nL貯存器溶液分配於結晶盤之孔中。在MIDAS+ HT-96篩(Molecular Dimensions，目錄號MD1-107)之條件16 (孔B4)中獲得單晶。此條件含有45% v/v季戊四醇丙氧基化物(5/4)、0.2 M NaCl及0.1 M MES單水合物，pH 6.0。將晶體在液氮中速凍且在光束線I03 (Diamond Light Source, UK)下收集繞射資料。使用XDS (Kabsch, W. XDS. Acta Cryst. D66, 125-132 (2010))將資料索引化及積分，接著使用AIMLESS (2.   Evans PR, Murshudov GN. How good are my data and what is the resolution? Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2013;69(Pt 7):1204-1214)規模化。藉由在Phenix軟體套件(Adams PD, Afonine PV, Bunkóczi G等人, The Phenix software for automated determination of macromolecular structures. Methods. 2011;55(1):94-106)中使用移相器(McCoy, A.J., Grosse-Kunstleve, R.W., Adams, P.D., Winn, M.D., Storoni, L.C., 及Read, R.J. Phaser crystallographic software. J. Appl. Cryst. (2007). 40, 658-674)進行分子置換來解析人類KLK5/兔Fab抗體10273/兔Fab抗體10236複合物結構。在此程序中，KLK5結構2PSX (Debela M, Goettig P, Magdolen V, Huber R, Schechter NM, Bode W. Structural basis of the zinc inhibition of human tissue kallikrein 5. J Mol Biol. 2007年11月2日;373(4):1017-31)及專屬Fab模型用作分子置換模板。在手動模型完成及精修之以下週期中使用Coot (P. Emsley; B. Lohkamp; W.G. Scott; Cowtan (2010). 「Features and Development of Coot」. Acta Crystallographica. D66: 486-501)及phenix.refine (Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. P.V. Afonine, R.W. Grosse-Kunstleve, N. Echols, J.J. Headd, N.W. Moriarty, M. Mustyakimov, T.C. Terwilliger, A. Urzhumtsev, P.H. Zwart, 及P.D. Adams. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 68, 352-67 (2012))直至獲得可接受之Rwork、Rfree及拉馬錢德蘭統計資料(如藉由Molprobity分析(Williams等人 (2018) MolProbity: More and better reference data for improved all-atom structure validation. Protein Science 27: 293-315))。
在晶體不對稱單元中觀測到人類KLK5/兔Fab抗體10273/兔Fab抗體10236複合物。CCP4軟體套件中之NCONT用於界定KLK5上由Fab10273及Fab10236分子識別之抗原決定基。KLK5胺基酸編號係基於UnitProtKB登錄Q9Y337，其中標準蛋白酶編號基於括號中之胰凝乳蛋白酶原。表4C展示第一次描述本發明時之精修統計資料。表 4C
資料收集   
分辨率(Å) 87.77-2.45 (2.51-2.45)
空間群 I 1 2 1
晶胞參數   
a, b, c (Å) 76.97, 93.19, 261.27
β (°) 91.00
Rmerge (%) 4.10 (52.9)
Rmeas (%) 5.70 (72.4)
Rpim 4.00 (49.2)
平均I/σ(I) 13.3 (1.9)
完整度 99.3 (99.9)
獨特反射之數目 67522 (4551)
多重性 3.5 (3.4)
威爾遜B因子(Å2 ) 62.535
  
精修統計資料   
蛋白質/溶劑原子數目 7924/84
Rwork/free (%) 22.89/27.68
『free』設定中之反射數目 3302
與理想值之R.m.s.偏差   
鍵(Å) 0.011
角度(°) 1.158
平均蛋白B因子(Å2 ) 69.33
在4Å接觸距離下由兔Fab抗體10236結合之人類KLK5抗原決定基由參考SEQ ID NO: 51殘基Arg87 (36)、Ala107 (56)、Arg110 (59)、Lys111 (60)、Lys112 (61)、Val113 (62)、Val137 (86)、Lys138 (87)、Ser139 (88)、Ile140 (89)、Pro141 (90)、His142 (91)、Pro143 (92)、Tyr145 (94)、Ser146 (95)及His147 (96)構成，同時圓括號中之數字與蛋白酶命名對應。結合位點更詳細地展示在圖4D中。
如圖5中所示，抗體10236及10273具有極其相異的非重疊結合位點且結合人類KLK5上之不同抗原決定基。實例 8 ： 抗體 10236 人類化及表徵 Ab 10236 之人類化
藉由將來自兔V區的CDR移植至人類生殖系抗體V區構架上以使兔抗體10236人類化。為恢復抗體活性，來自兔V區之許多構架殘基亦保留在人類化序列中。使用Adair等人(1991) (Humanised antibodies. WO91/09967)概述之方案選擇此等殘基。兔抗體(供體) V區序列與人類生殖系(受體) V區序列之比對以及所設計之人類化序列顯示於圖6及圖7中。自供體移植至受體序列之CDR如Kabat (Kabat等人, 1987)所定義，CDR-H1除外，其中使用組合之Chothia/Kabat定義(參見Adair等人, 1991 Humanised antibodies. WO91/09967)。
對於抗體10236，選擇人類V區IGKV1-6加JK4 J區(IMGT，http://www.imgt.org/)作為輕鏈CDR之受體。10236輕鏈之人類化移植物中之構架殘基皆來自人類生殖系基因，例外為來自包含殘基2、3及63之群的一或多個殘基，其中分別保留相對於SEQ ID NO: 15之供體殘基酪胺酸(Y2)、天冬胺酸(D3)及離胺酸(K63) (圖6)。供體殘基Y2及D3之保留對於與人類KLK-5結合之最高親和力而言係不可或缺的。
選擇人類V區IGHV4-4加JH4 J區(IMGT，http://www.imgt.org/)作為抗體10236之重鏈CDR的受體。與許多兔抗體相同，抗體10236之VH基因比所選人類受體短。當與人類受體序列比對時，抗體10236之VH區之構架1缺乏N端殘基，人類化抗體中保留該N端殘基(圖7)。10236兔VH區中之構架3亦缺乏位於β片狀股D與E之間之環中的兩個殘基(75及76)：在人類化移植物中，間隙填充有來自所選人類受體序列之對應殘基(離胺酸75，K75；天冬醯胺76，N76) (圖7)，或者離胺酸及蘇胺酸(離胺酸75，K75；蘇胺酸76，T76)。10236重鏈之人類化移植物中之構架殘基皆源於人類生殖系基因序列，例外為來自包含殘基67、71、73及78之群的一或多個殘基，其中分別保留相對於SEQ ID NO: 39之供體殘基苯丙胺酸(F67)、麩醯胺酸(Q71)、絲胺酸(S73)及纈胺酸(V78)。供體殘基Q71、S73及V78之保留對於與人類KLK-5結合之最高親和力而言係不可或缺的。人類構架位置1之麩醯胺酸殘基經麩胺酸(E1)置換，提供均質產物之表現及純化：廣泛報導在抗體及抗體片段之N端麩醯胺酸轉化成焦麩胺酸鹽。人類化10236抗體之理論pI為約6.3至6.6。為促進在下游處理期間藉由離子交換層析移除雜質，藉由將移植物gL6之CDRL1中之殘基24自麩醯胺酸(Q)突變為精胺酸(R)或離胺酸(K)殘基而增加pI。
用兔/人類抗體10236測試人類化移植物以評估其親和力是否受人類化程序影響。將兔/人類抗體10236選殖在包含S171C突變之人類C κ載體之經修飾型式上，以重建在人類恆定區中不存在之在兔VK輕鏈中發現的額外二硫鍵，產生根據SEQ ID NO: 96及97之兔/人類抗體10236。 Ab 10236 人類化移植物之親和力量測
經由胺偶合化學，使山羊抗人類IgG Fc特異性抗體(Jackson ImmunoResearch)固定在CM5感測器晶片上，達到大約6000RU之程度。各分析週期由以下組成：抗KLK5 IgG自上清液捕捉至抗Fc表面、以30 µl/min注射KLK5分析物(內部製備) 180秒，接著解離600秒。在各週期結束時，以10 μL/min之流動速率，使用50 mM HCl之60秒注射，接著5 mM NaOH之30秒注射及最終50 mM HCl之60秒注射，使表面再生。對於上清液，在補充有最終濃度為300 mM之NaCl之HBS-EP+操作緩衝液(GE Healthcare®)中將人類KLK5自20 nM滴定至0.08 nM(5×3倍連續稀釋)。包括緩衝液空白注射液以減除儀器雜訊及漂移。使用1:1結合模型，使用Biacore T200評估軟體(3.0版)來測定動力學參數。實驗在25℃下進行。
在分析開始及結束時分析兔/人類嵌合體抗體且顯示良好精確度。產生所有樣品之高品質資料，如表5中所概述。表 5
抗體 10236 輕鏈供體殘基 輕鏈突變 重鏈供體殘基 ka (1/Ms) kd (1/s) KD (pM)
嵌合體兔/人類10236 -    - 2.69E+06 4.51E-04 167.9
嵌合體兔/人類10236 -    - 2.70E+06 44.09E-04 151.7
嵌合體兔/小鼠10236*          3.00E+06 5.17E-04 172.3
gL5 gH9 Y2, D3, K63    Q71, S73, T76, V78 1.92E+06 9.29E-04 484.5
gL5 gH10 Y2, D3, K63    S73, T76, V78 1.97E+06 1.07E-03 545.6
gL5 gH11 Y2, D3, K63    Q71, T76, V78 1.69E+06 8.11E-04 480.6
gL5 gH12 Y2, D3, K63    Q71, S73, V78 2.03E+06 6.69E-04 330.6
gL6 gH9 Y2, D3    Q71, S73, T76, V78 1.91E+06 9.10E-04 475.2
gL6 gH10 Y2, D3    S73, T76, V78 1.93E+06 1.05E-03 541.5
gL6 gH11 Y2, D3    Q71, T76, V78 1.69E+06 8.02E-04 475.4
gL6 gH12 Y2, D3    Q71, S73, V78 2.04E+06 6.60E-04 323.9
gL6 gH12
Figure 02_image007
 Y2, D3    Q71, S73, V78       299
gL6 Q24R gH12 Y2, D3 Q24R Q71, S73, V78 2.01E+06 6.69E-04 333.4
gL6 Q24K gH12 Y2, D3 Q24K Q71, S73, V78 2.04E+06 6.87E-04 336.5
* 如實例4及表3中所述；
Figure 02_image007
：2次操作之平均值(表15)。 如表5中所示，有或無Q24R/K突變之移植物10236gL6gH12保留對人類KLK5之高親和力。 人類化抗體之概況分析 KLK5 選擇性
進行一系列研究以確保兔抗體10236之人類化不改變相比於其他胰舒血管素對KLK5之選擇性，不降低親和力或抑制活性。
接著根據實例4中描述之方法對純化抗體進行篩選以證實其針對KLK5之抑制活性。在600 nM至20 pM範圍內之10點半對數稀釋系列上測試抗體。使用Beckman Coulter FXTM 及Multidrop系統，將5 μL各抗體轉移至黑色384孔分析盤(CorningTM ，目錄號3575)且將15µL含所選活性重組胰舒血管素酶之分析緩衝液A (150 mM NaCl、50 mM Tris、200 μM EDTA、0.05% (v/v) Tween-20，pH 7.6)添加至適當孔中以實現以下最終分析濃度：60 pM人類KLK5 (UCB)、250 pM KLK7 (UCB)、500 pM KLK2 (R&D SystemsTM )、30 pM KLK4 (UCB)、30 pM cyno KLK5 (UCB)、500 pM cyno KLK7、30 pM小鼠KLK5 (UCB)及5 nM小鼠KLK7 (UCB)。在UCB製備之酶以括號指示且如上文在實例1中所述製備。市售酶之來源以括號指示。
對於0%活性，將20 µL分析緩衝液A單獨添加至孔中。LEKTI D5兔Fc(如上文所描述，UCB製備)用作抑制活性之參考；將5 µl具有用於10236抗體之相同濃度範圍的LEKTI D5兔Fc添加至15 µl胰舒血管素酶中。添加至5 µL分析緩衝液A中之15 µL人類KLK5用作100%活性參考。
將抗體及胰舒血管素在室溫下培育隔夜。使用multidrop添加以下肽受質：針對人類KLK5 (300 µM)、人類KLK2 (30 µM)、鼠類KLK5 (300 µM)及cyno KLK5 (450 µM)之Boc-VPR-AMC (Cambridge Research Biochemicals™)；針對人類及cyno KLK7 (分別為90 µM及150 µM)之KHLF-AMC (Cambridge Research Biochemicals™)；針對人類KLK4 (200 µM)之PFR-AMC (R&D SystemsTM )；及針對鼠類KLK7 (150 µM)之Mca-RPKPVE-Nval-WRK(Dnp)-NH2 (R&D SystemsTM )。將樣品培育4小時且在Pherastar FSX盤式讀取器(BMG LabtechTM )上針對Boc-VPR-AMC、PFR-AMC及KHLF-AMC在λex 380 nm及λem 430 nm下以及針對Mca-RPKPVE-Nval-WRK(Dnp)-NH2在λex 320 nm及λem 400 nm下讀取。如實例3中所述分析資料以確定抑制百分比。將資料相對於測試抗體濃度繪圖且擬合4參數S形以確定IC50 (Genedata ScreenerTM )。
Ab 10236之人類化移植物保留對KLK5之特異性抑制活性且展示對所測試之其他KLK家族成員之極小抑制或無抑制。Ab 10236 gL6gH12為人類及cyno KLK5之強力抑制劑(表6，各值為個別量測值)，保留與親本非人類化抗體類似之效力。顯而易見，對人類KLK2、4及7、cyno KLK7、小鼠KLK5或小鼠KLK7無活性(亦即，根據實例2中之選擇標準低於40%閾值) (圖8)。表 6
Hu KLK5 IC50 Cyno KLK5 IC50
Ab10236gL6gH12 7.65E-10 1.42E-10 6.63E-10 5.86E-10 1.05E-10 4.77E-10 1.30E-10 8.24E-11
LEKTI D5 兔 Fc 1.03E-10 7.44E-11 n/a
n/a=不可用 在人類化抗體 10236 存在下 LEKTI 與 KLK5 之結合
進行如實例5中所述之表面電漿子共振(SPR)實驗以確定LEKTI對KLK5與人類化抗體10236 gL6gH12複合物之親和力，如對於親本兔抗體10236所進行。
使用實例5中所描述之實驗條件，例外在於製備抗人類Fc晶片表面，且結果報導於表6中。
與親本兔10236抗體類似，LEKTI D5 Fab融合蛋白能夠結合於已與抗體10236 gL6gH12複合之KLK5，但親和力低於單獨人類KLK5 (表7，540 nM相對於40 pM)。表 7
ka (Ms^-1) kd (s^-1) KD (M)
僅人類KLK5 5.70E+05 2.30E-05 4.00E-11
10236 gL6gH12 + 人類KLK5 2.90E+04 1.60E-03 5.40E-07
KLK5-PAR2 細胞分析
已顯示KLK5活化角質細胞表面之蛋白酶活化受體-2 (PAR2)受體(K. Oikonomopoulou等人 Kallikrein-mediated cell signaling: targeting proteinase-activated receptors (PARs). Biol Chem, 387 (2006), 第817-824頁)。此引起NFkB驅動之發炎級聯及相關細胞介素(諸如TSLP)之釋放。
因為PAR2為Gq偶合之G蛋白偶合受體(GPCR)，所以活化引起磷脂酶信號傳導及肌醇單磷酸酯(IP-1)之產生。藉由使用來自Cisbio之分析套組偵測IP1來監測在HaCat角質細胞上表現之內源性PAR2藉由暴露於KLK5之活化。
收集匯合HaCat細胞且以10,000個細胞/孔塗鋪於384 Fluoblock盤(CorningTM )中，且在37℃、5% CO2 下在DMEM培養基 + 10% FBS + 2 mM L-麩醯胺酸 + Pen/Strep (Life TechnologiesTM )中培養隔夜，之後根據IP-One Gq分析方案(CisbioTM )處理。將待測試之抗體(抗體10236 gL6gH12及陰性人類IgG4 A33)在1×刺激緩衝液B (IP-One Gq分析套組，CisbioTM )中自2 µM之最高濃度連續稀釋且在37℃下在200 nM人類KLK5存在下培育1小時。將抗體/KLK5混合物添加至HaCat細胞中，且根據IP-One Gq分析方案偵測肌醇一磷酸酯(IP1)，同時在Synergy Neo盤式讀取器上在665 nM及620 nM下讀取螢光。
抗體10236 gL6gH12幾乎能夠完全抑制IP1自經KLK5處理之HaCat細胞釋放(圖9)，此表明IP1釋放之最大抑制與LEKTI D5兔Fc蛋白類似。 抗體 10236 作用機制
進行實驗以確定抑制抗體之作用機制。非競爭性酶抑制劑降低酶之活性，但在受質存在或不存在下能夠同等良好地結合酶。抑制劑及受質二者能夠同時結合酶，但無法形成產物，引起酶-受質-抑制劑複合物僅能夠解析為酶-受質或酶-抑制劑複合物。在非競爭性抑制劑下，抑制速率將不受提高受質濃度影響。
在分析緩衝液(150 mM NaCl、50 mM Tris、200 µM EDTA、0.05 % (v/v) Tween-20，pH 7.6)中以針對人類KLK5之IC50的300、30或3倍製備抗體10236 gL6gH12或LEKTI D5兔Fc蛋白。將10 µL抗體10236 gL6gH12添加至Corning低結合黑色低凸緣384孔分析盤(Corning®)。將30 mM-300 µM Boc-VPR-AMC (Cambridge Research Biochemicals™)之10 µL 5點連續稀釋液添加至培養盤。經由注射10 µL 1.8 nM人類KLK5 (Boc-VPR-AMC ＜ 1 mM)或180 pM KLK5 (Boc-VPR-AMC ＞ 1 mM)，使用Pherastar FSX盤式讀取器(BMG LabtechTM)同時起始反應，且每30秒監測螢光(λex380 nm λem430 nm)。最終反應條件含有在所確定之針對人類KLK5之IC50的100、10或1倍下的抗體10236 gL6gH12或LEKTI D5兔Fc蛋白、10 mM與100 µM之間的Boc-VPR-AMC之連續稀釋液及60或600 pM人類KLK5。用分析緩衝液置換抗體以設定未抑制之對照且用緩衝液置換酶以設定背景對照。
藉由在各時間點減去背景螢光且相對於時間繪製螢光來分析資料。將資料擬合至以下等式(GraphPad Prism®，GraphPad Software)：
Figure 02_image009
此使得能夠確定kobs ，亦即所觀測到之時間依賴性抑制速率，其中vi 為初始反應速度且vs 為最終速度。相對於受質濃度繪製kobs 值以確定抑制機制。
抗體10236 gL6gH12 (圖10A)及兔抗體10236 (圖10B)對人類KLK5之抑制速率不隨著受質濃度增加而變，此證明抗體10236 gL6gH12為人類KLK5之非競爭性抑制劑。相比之下，LEKTI D5兔Fc蛋白展示抑制速率隨著受質濃度增加而減少，此表明其為人類KLK5之競爭性抑制劑。實例 9 ： 活體外皮膚系統研究
使用人類活體外全層皮膚系統EpiDermFT (MatTekTM corporation; Morizane, Shin等人 「Kallikrein expression and cathelicidin processing are independently controlled in keratinocytes by calcium, vitamin D(3), and retinoic acid.」 The Journal of investigative dermatology 第130卷,5 (2010): 1297-306. doi:10.1038/jid.2009.435)證明抗體10236 gL6gH12 IgG4P對人類KLK5之功能作用。
MC903為一種維生素D3類似物，其用於處理活體外皮膚系統，因為其在活體內誘發異位性皮膚炎樣表型(Naidoo, Karmella等人 「Eosinophils Determine Dermal Thickening and Water Loss in an MC903 Model of Atopic Dermatitis.」The Journal of investigative dermatology 第138卷,12 (2018): 2606-2616. doi:10.1016/j.jid.2018.06.168)。
EpiDermFT™全層復原皮膚組織在EFT-400-ASY分析培養基(MatTek CorporationTM )中在37℃、5% CO2 下平衡隔夜。第0天，自孔中移除培養基且置換成2.5 ml EFT-400-ASY培養基。用25 μl以下各物局部處理組織；單獨培養基；在EFT-400-ASY培養基中稀釋之MC903 (Tocris Bioscience®)，得到2 nmol最終濃度；在培養基中稀釋之MC903 (2 nmol)加10 µg/ml抗體10236 gL6gH12 IgG4P或hIgG4P同型對照(內部產生)。將盤在37℃、5% CO2 下培育。每天置換基礎培養基且每天施用局部處理。在第4天停止實驗。
自跨孔(transwell)(Costar Snapwell™)移除組織，使用刮刀在無菌皮氏培養皿上等分，且將其置放於OCT組織包埋基質(Cellpath™)中以準備用於組織學分析。切割6 µm之切片且使用蘇木精及伊紅染色以評估結構完整性，藉由免疫螢光法偵測KLK5且經由原位酶譜分析評估蛋白酶活性。
對於KLK5免疫螢光染色，將切片在室溫下空氣乾燥10分鐘，在含0.1% Tween 20之PBS中洗滌3次，且在PBS中洗滌一次。隨後在含5% BSA之PBS中阻斷切片10分鐘。使用PAP筆將切片劃圓圈且與10 μg/ml小鼠抗huKLK5抗體(Abcam®)一起在潮濕腔室中在37℃下培育1小時。在抗體培育之後，將切片再次洗滌且固定於4% PFA中10分鐘。隨後將切片與二級山羊抗小鼠IgG Alexa 546 (Life Technologies®)一起在潮濕腔室中在37℃下培育1小時。洗滌切片且使用含有DAPI (Vector Labs™)之封固培養基封固。在Zeiss Axio Scan上以20×放大率獲取螢光影像。
對於原位酶譜法，將切片在室溫下空氣乾燥10分鐘，在含2% tween之PBS中洗滌一次，且在PBS中洗滌3次。隨後將切片與10 μg/ml酪蛋白-BODIPY-FL螢光受質(Invitrogen®)一起在潮濕腔室中在37℃下培育3小時。將切片在PBS中洗滌3次且使用含有DAPI (Vector Labs™)之封固培養基封固。立即在Zeiss Axio Scan上以20×放大率獲取螢光影像。
在使用及不使用抗體10236 gL6gH12 IgG4P進行MC903處理之後的組織結構之比較表明KLK抑制可預防人類皮膚模型中之角質層破壞(圖11)。
此外，儘管在用抗體10236 gL6gH12 IgG4P處理之皮膚系統中KLK5表現未改變，但絲胺酸蛋白酶活性降低(資料未展示)。實例 10 ： 異位性皮膚炎樣品中之原位酶譜法
測試來自中度至重度異位性皮膚炎患者之皮膚打孔切片(National Bioservice Russia)，以評估抗KLK5抗體之抑制作用。將切片(4 mm)包埋於OCT組織包埋基質(Cellpath™)中且儲存於-80℃下。切割組織切片(6 μm)且如先前實例9中描述，使用20 μm最終分析濃度之螢光猝滅受質[5-FAM]-FVNRSYPP-Lys(Dabcyl)-醯胺代替酪蛋白-BODIPY-FL，用於原位酶譜分析。組織切片中之受質之裂解產生螢光，其在Zeiss Axio ScanTM 上在20×放大率下偵測為螢光影像。
如藉由角質層(表皮最上層)及顆粒層(緊靠角質層下方)中之白色染色實質上減少所示，資料展示與未用抑制劑處理之切片相比，異位性皮膚炎組織切片與抗體10236 gL6gH12 IgG4P一起預培育可降低絲胺酸蛋白酶活性水準(圖12)。實例 11 ： 人類化抗體之生物物理學表徵
測定10236 gL6gH12 (作為IgG4P及IgG1同型)之生物物理學特性以評估可發展性。此包括熱穩定性(Tm)、實驗pI、表觀疏水性、溶解性(PEG沈澱分析)及藉由AC-SINS評估自身相互作用(聚集傾向)。
另外，測試抗體10236 gL6N94D gH12突變體以評估化學穩定性，亦即，輕鏈CDR3中Asn(94) Ser模體(參考SEQ ID NO: 15)之去醯胺傾向(表8)。表 8
IgG4P 描述詞
10236 gL6gH12
10236 gL6-N94DgH12
IgG1 10236 gL6gH12
藉由質譜分析進行表徵
藉由LC-MS，使用Waters ACQUITY UPLC系統，利用Xevo® G2 Q-ToF質譜儀，量測重鏈及輕鏈之完整質量來證實抗體10236 IgG1及IgG4P之身分。在37℃下用含5 mM參(2-羧基乙基)膦(TCEP)之150 mM乙酸銨還原樣品(約5 µg) 40分鐘。LC管柱為Waters BioResolveTM RP mAb聚苯基，450 Å，2.7 µm，保持在80℃下，經95%溶劑A (水/0.02%三氟乙酸(TFA)/0.08%甲酸)及5%溶劑B (95%乙腈/5%水/0.02% TFA/0.08%甲酸)平衡，流速為0.6毫升/分鐘。將蛋白質用經8.8分鐘自5%至50%溶劑B之梯度洗脫，接著95%溶劑B洗滌及再平衡。UV資料在280 nm下獲取。MS條件如下：離子模式：ESI正離子，解析模式，質量範圍：400-5000m/z及用NaI外部校準。使用Waters MassLynxTM 及MaxEnt軟體分析資料。
如藉由完整質譜分析所判斷，預期與觀測到之分子量之間的未觀測到差異(表9)。表 9
抗體描述 輕鏈(Da) 重鏈(Da)
預期 觀測 Δ 預期 觀測 Δ
hIgG4P 10236gL6gH12 23476.1 23475.4 -0.7 49792.7 49793.6 0.9
hIgG1 10236gL6gH12 23474.6 23476.1 -1.5 49947.2 49948 -0.8
熱穩定性 (Tm) 量測
使用Thermal Shift分析來測定解鏈溫度(Tm)或去摺疊中點時的溫度。
對於此分析，使用螢光染料SYPRO®橙，根據對隨著溫度升高而暴露之疏水區域的結合來監測蛋白質去摺疊過程。反應混合物含有5 µL 30x SYPRO®橙蛋白凝膠染色劑(Thermofisher scientific，S6651)，用測試緩衝液自5000x濃縮物稀釋。將45 µL於PBS pH 7.4或50 mM乙酸鈉、125 mM氯化鈉pH 5.0中0.2 mg/mL之樣品添加至染料中且混合(為常見預調配緩衝液)。將10 µL此溶液一式四份地分配至384 PCR光學孔盤中且在QuantStudio 7實時PCR系統(Thermofisher™)上操作。PCR系統加熱裝置設定在20℃下且以1.1℃/min之速率升高至99℃。電荷耦合裝置監測孔中之螢光變化。繪製螢光強度增加，斜率之反曲點用於產生表觀中點溫度(Tm)。資料展示於表10中。
對10236gL6gH12 (IgG4P)觀測到兩次去摺疊轉變。第一次可歸因於CH2域且第二次可歸因於Fab去摺疊域及CH3域之Tm的平均值。對於IgG1分子，歸因於CH2及Fab域之Tm的平均值，觀測到一個去摺疊域。此係根據以下文獻(Garber E. Demerest SJ. Biochem Biophys Res Commun. 2007年4月;355(3):751-7)。表 10
抗體描述 PBS pH 7.4
Fab域Tm (℃) SD CH2域Tm (℃) SD CH3域Tm(℃)
hIgG4P 10236 gL6gH12 74 0.0 66.3 0.1 未量測
hIgG1 10236 gL6gH12 71.5 0.9 與Fab域重疊    未量測
實驗等電點 (pI) 量測
使用iCE3TM 全柱成像毛細管等電聚焦(cIEF)系統(ProteinSimple)以實驗方式測定pI。藉由混合以下各物來製備樣品：30 µL樣品(自HPLC級水中1 mg/mL儲備液)、35 µL 1%甲基纖維素溶液(ProteinSimple，101876)、4 µL pH 3-10 pharmalytes (ProteinSimple，042-848)、0.5 µL 4.65、0.5 µl 9.77合成pI標記物(ProteinSimple，102223及102219)及12.5 µL 8 M尿素溶液(Sigma Aldrich®)。使用HPLC級水將最終體積補足至100 μl。將樣品在1.5 kV下聚焦1分鐘，隨後在3 kV下5分鐘，使用Protein Simple軟體獲取毛細管之280 nm影像。所得電泳圖首先使用iCE3軟體分析且賦值pI值(pI標記物之間的線性關係)。資料概述於表11中。
發現10236gL6gH12 (hIgG4P)之pI低於對應IgG1分子。將設想，任一分子將不存在可發展性/製造問題，且pI高於一般用於調配之緩衝液(約pH 5)。表 11
抗體描述 pI
IgG4P 10236 gL6gH12 6.7
IgG1 10236 gL6gH12 7.5
疏水相互作用層析 (HIC)
疏水相互作用層析(HIC)按疏水性遞增之順序分離分子。分子在高濃度極性鹽存在下結合於疏水性固定相且隨著鹽濃度降低而解吸附於移動相中。滯留時間愈長，等於疏水性愈大。
將2 mg/mL 10236 gL6gH12之兩種同型(IgG4P及IgG1)用1.6 M硫酸銨及PBS (pH 7.4) 1:2稀釋。將10 µg (10 µL)樣品注射至與具有螢光偵測器之Agilent 1200二元HPLC串聯連接的Dionex ProPac™ HIC-10管柱(100 mm × 4.6 mm)上。藉由內源螢光(激發及發射波長分別為280 nm及340 nm)監測分離。使用緩衝液A (0.8 M硫酸銨、100 mM磷酸鹽pH 7.4)及緩衝液B (100 mM磷酸鹽pH 7.4)，使用如下梯度洗脫分析樣品：(i)在0% B下保持2分鐘；(ii) 30分鐘內0至100% B之線性梯度(0.8毫升/分鐘)；(iii)管柱用100% B洗滌2分鐘且在0% B中重新平衡10分鐘，之後進行下一次樣品注射。管柱溫度維持在20℃下。滯留時間(以分鐘為單位)展示在表12中。表 12
抗體描述 主峰滯留時間(分鐘)
IgG4P 10236gL6gH12 12.8
IgG1 10236 gL6gH12 11.0
兩種分子之間的滯留時間差異較小，其中10236 gL6gH12 (IgG4P)顯示比相應IgG1格式略微更大的表觀疏水性。基於其他市售抗體之結果，預期兩種分子均具有平均聚集傾向。(Jain等人 「Biophysical properties of the clinical-stage antibody landscape」 Proc Natl Acad Sci U S A. 2017年1月31;114(5):944-949. doi: 10.1073/pnas.1616408114. Epub 2017年1月17日)。 使用聚乙二醇 (PEG) 量測進行溶解度量測
對膠體穩定性(溶解度)之瞭解可來源於檢查聚乙二醇(PEG)沈澱之作用。藉由提高PEG之濃度(w/v)且量測溶液中剩餘之蛋白質量，使用PEG以數量上可定義之方式降低蛋白質溶解度。此分析用以在不使用習知濃度方法下模仿高濃度溶解度之作用。
在以下中製備儲備液40% PEG 3350 (Merck，202444)溶液(w/v)：PBS pH 7.4；50 mM乙酸鈉、125 mM氯化鈉pH 5.0 (常用預調配儲存緩衝液)及50 mM組胺酸、250 mM脯胺酸pH 5.5 (常用調配緩衝液)。藉由Assist Plus液體搬運機器人(INTEGRA，4505)進行連續滴定，產生40%至15.4%範圍內PEG 3350。為將非平衡沈澱降至最少，樣品製劑由以1:1體積比混合之蛋白質及PEG溶液組成。藉由液體搬運機器人將35 µL PEG 3350儲備溶液添加至96孔v形底PCR盤(A1至H1)中。將35 µL 2 mg/mL樣品溶液添加至PEG儲備溶液中，產生1 mg/mL測試濃度。此溶液藉由自動化緩慢重複移液而混合且在37℃下培育0.5小時以再溶解任何非平衡聚集體。隨後在20℃下培育樣品24小時。隨後在4000×g下在20℃下使樣品盤離心1小時。將50 µL上清液分配至UV-Star®半區96孔μClear®微定量盤(Greiner，675801)中。藉由在280 nm下使用FLUOstar ®Omega多偵測微定量盤式讀取器(BMG LABTECH)進行UV分光光度法來測定蛋白質濃度。使用Graphpad prism 7.04版繪製所得值，自S形劑量反應(可變斜率)擬合之中點處衍生PEG中點(PEGmdpnt)評分。
資料展示在表13中。PEG中點愈高(%)；高濃度穩定性/溶解性之概率愈大。
在兩種同型之間觀測到差異，視緩衝液條件而定。在PBS pH 7.4中，10236gL6gH12 (IgG4P)展示出比10236gL6gH12 (IgG1)大之溶解度；而在50 mM乙酸鈉、125 mM氯化鈉pH 5中，觀測到相反情況。10236gL6gH12 (IgG4P)之溶解度可藉由使用50 mM組胺酸、250 mM脯胺酸pH 5.5之更典型調配緩衝液來提高。表 13
抗體描述 PEG中點(%)
PBS pH 7.4 50 mM乙酸鈉、125 mM氯化鈉pH 5 50 mM組胺酸、250 mM脯胺酸pH 5.5
IgG4P 10236gL6gH12 10.5 10.4 11.5
IgG1 10236gL6gH12 9.9 11.3 未進行
使用 AC-SINS 評估自身相互作用 ( 親和力捕捉自身相互作用奈米粒子光譜分析 )
使用AC-SINS分析(Liu Y . MAbs. 2014年3月-4月;6(2):483-92)，藉由測定自身相互作用傾向及因此告知可能聚集穩定性來評估10236gL6gH12之可發展性。此在PBS pH 7.4中進行。
將山羊抗人類Fcγ特異性捕捉抗體(Jackson ImmunoResearch)緩衝交換成20 mM乙酸鈉pH 4.3，稀釋至0.4 mg/mL，且50 µL添加至450 µL檸檬酸鹽穩定之20 nm金奈米粒子(TedPella, USA)中，且在室溫下靜置隔夜。用55 µL PEG-硫醇阻斷結合之奈米粒子1小時，在21,000×g下離心6分鐘，移除上清液且使其再懸浮於20 mM乙酸鈉pH 4.3至150 L之最終體積中。
將10236gL6gH12 (IgG4P及IgG1)在PBS pH 7.4 (200µL)中稀釋至22 µg/mL且添加至相同體積之非特異性全IgG (Jackson ImmunoResearch)，短暫渦動  且將72 µL添加至96孔盤。將8 µL奈米粒子添加至各孔(n=4)。在BMG盤式讀取器上自500-600 nm讀取吸光度，擬合於Lorenzian曲線(RShiny)且自樣品減去僅PBS以得到Δλmax。資料概述於表14中。
作為IgG4P及IgG1同型之10236gL6gH12均顯示低λmax及Δλmax (相對於PBS背景)，此表明自身相互作用之傾向低及在PBS pH 7.4中聚集之風險低。表 14
抗體描述 λmax Δλmax
IgG4P 10236 gL6gH12 531.37 1.88
IgG1 10236 gL6gH12 530.27 1.17
用於評估 Asn(94) ( 輕鏈 CDR3) 處 之去醯胺傾向的加速應力研究
去醯胺模體Asn(94)Ser存在於10236gL6gH12之輕鏈CDR3上。無法預測去醯胺之傾向/速率，因為其視一級序列及3D結構以及溶液特性而定(R. C. Stephenson及S. Clarke (1989)；K. Diepold等人(2012)；Jasmin F. Sydow等人(2014)；N.E Robinson等人(2004)。因此，建立加速應力研究以測定Asn (94)處10236 gL6gH12之去醯胺傾向。此僅針對10236gL6gH12 (IgG4P)進行；假定去醯胺速率與IgG1相同，因為去醯胺模體存在於可變區中。
亦量測基礎去醯胺水準(受應力樣品)；低水準指示對去醯胺之低敏感性，但此等可因不同製造批次/條件而變化。
抗體10236 gL6gH12 (IgG4P)緩衝液更換為(i)已知促進Asn (N)殘基去醯胺之條件(在37℃下Tris pH 8.0/125 mM NaCl)及(ii)對照緩衝液(在37℃下乙酸鹽，pH 5.0/125 mM NaCl)。每種緩衝液中之樣品之最終濃度為pH 8.0下5.9 mg/mL及pH 5.0下6.6 mg/mL，且隨後分成兩個等分試樣，其中一個儲存於4℃下且另一個儲存於37℃下，長達2週。立即(T0)及在第2週移除等分試樣且儲存於-20℃下。
基礎去醯胺藉由分析已在PBS pH 7.4中在-20℃下儲存之儲備樣品獲得。
將所有樣品解凍且藉由使用以下方法利用質譜分析(MS)進行肽定位來分析：
受應力蛋白質之樣品經TCEP還原且在含有0.1% w/v RapigestTM 清潔劑之Tris-HCL緩衝液pH 8.0中經氯乙酸烷基化。添加胰蛋白酶/LysC混合物(1:50 w/w)且樣品在37℃下消化1小時，接著添加胰凝乳蛋白酶(1:50 w/w)且消化在室溫下繼續隔夜。藉由添加甲酸直至1% v/v使蛋白水解停止且將樣品稀釋至0.5 mg/ml，之後離心以移除沈澱的RapigestTM 。將所得肽池分開且在與Thermo Fusion質譜儀接合之Waters BEH C18管柱上分析，該質譜儀執行利用CID斷裂之正離子型資料依賴性軌道阱-軌道阱方法。使用Thermo XcaliburTM 及PepfinderTM 軟體分析LC-MS資料。
KLK5 10236 L-CDR3中在Asn94處去醯胺之基礎水準為0.7% (使用PepfinderTM 計算)。對於在37℃下在Tris pH 8.0中培育2週之樣品，此增加至最多10% (圖13)。
去醯胺傾向較低且可藉由將製造、儲存及調配期間高pH緩衝液之使用減至最少來控制。 完全去醯胺產物之親和力量測： 10236 gL6-N94DgH12 ( 輕鏈 CDR3 上 NS 至 DS 突變 )
使10236gL6gH12之輕鏈突變以用Asp置換Asn 94 (Asn94Asp)，以產生10236gL6gH12之完全去醯胺產物的替代分子。
在25℃下藉由表面電漿子共振(Biacore T200，GE Life SciencesTM )評估兩種抗體10236gL6gH12及10236gL6-N94DgH12與人類KLK5之結合動力學以評估100%去醯胺之影響。
經由胺偶合化學，使山羊抗人類IgG Fc特異性抗體(Jackson ImmunoResearch)固定在CM5感測器晶片上，達到大約6000RU之程度。各分析週期由以下組成：抗KLK5 IgG分子捕捉至抗Fc表面、以30 µl/min注射KLK5分析物(內部製備) 300秒，接著解離600秒。在各週期結束時，以10 μL/min之流動速率，使用50 mM HCl之60秒注射，接著5 mM NaOH之30秒注射及最終50 mM HCl之60秒注射，使表面再生。在補充有最終濃度為300 mM之NaCl之HBS-EP+操作緩衝液(GE Healthcare)中將人類KLK5自20 nM滴定至0.03 nM(6×3倍連續稀釋)。包括緩衝液空白注射液以減除儀器雜訊及漂移。使用1:1結合模型，使用Biacore T200評估軟體(3.0版)來測定動力學參數。資料概述於表15中。
包括10236gL6gH12之兩個複本以展示實驗再現性。輕鏈CDR3中之Asn94Asp突變使對KLK5之親和力降低4.5倍。
因此，若不監測及控制製造、儲存及調配條件，則廣泛去醯胺可影響10236gL6gH12之功效。加速應力實驗指示Asn94殘基處之去醯胺傾向較低且因此去除該分子之風險。 表15
抗體描述 ka (1/Ms) kd (1/s) KD (pM)
10236gL6gH12操作1
Figure 02_image007
 2.26E+06 7.11E-04 314.3
10236gL6gH12操作2
Figure 02_image007
 2.33E+06 6.58E-04 283.0
10236gL6N94DgH12 3.89E+06 4.86E-03 1249.2
Figure 02_image007
操作1及操作2之平均值 = 299 pM 抗體 10236 gL6gH12 在不同濃度下之黏度評估 (hIgG4P)
高抗體濃度下之低黏度對於治療分子之皮下投與而言至關重要。量測常用預調配緩衝液(50 mM組胺酸/250 mM脯胺酸pH 5.5)中抗體10236 gL6gH12在遞增濃度下之黏度以研究其黏度行為。
研究藉由(i)初始濃度之樣品及(ii)如下詳述之黏度量測來進行。 (i)濃度
將總共23 mL抗體10236 gL6gH12 (hIgG4P)使用Vivaspin® 20  MWCO 30kD)離心過濾器(Z14637，Sigma-Aldrich)在4000×g下在20℃下旋轉濃縮以濃縮抗體直至滯留物體積為約950 μL。回收滯留物溶液且使用280 nm下之UV吸光度量測及1.46 mL/(mg cm)之消光係數，使用NanoDropTM 1000儀器測定抗體10236 gL6gH12 (hIgG4P)之最終濃度。測得濃縮樣品為185 mg/mL(一式三份之平均值)，獲得理論濃度之84%回收率。此方法之損耗在預期範圍內。
接著使用50 mM組胺酸、250 mM脯胺酸pH 5.5稀釋抗體樣品，得到適合於黏度量測之一系列濃度。藉由在280 nm下之UV吸光度量測確認經稀釋之樣品濃度為159.8 mg/mL、63.6 mg/mL及33.2 mg/mL。 (ii)黏度量測
各濃度下之黏度係使用Discovery Hybrid Rheometer-1 (DHR-1，TA Instruments)，利用帕耳帖盤(Peltier plate)及液體冷卻系統進行溫度控制及20 mm不鏽鋼平行盤幾何結構進行量測來量測。將不同濃度(33.2 mg/mL、63.6 mg/mL及159.8 mg/mL)下之樣品(80 μL)置放於帕耳帖盤之中心，且使用設定於20℃下之利用自2.87918變化至287.918 s-1 之剪切速率的穩態流掃描程序量測黏度(以mPa·s或cP為單位)。當各剪切速率點處之值恆定(SD±5%)時，求量測之黏度之平均值。不同濃度下10236 gL6gH12 (IgG4P)之黏度概述於表16中。
觀測到抗體10236 gL6gH12 (hIgG4P)在濃度與黏度係數之間的趨勢增加。在33.2 mg/mL至159.8 mg/ml之濃度範圍內，黏度自2.8 cP增加至6.4 cP。所有此等樣品在不同剪切速率下展示恆定黏度係數(變化率小於5%)。研究顯示，抗體10236 gL6gH12 (hIgG4P)在50 mM組胺酸/250 mM脯胺酸pH 5.5中在高濃度(約150 mg/mL)下展現低黏度，且因此可設想其適合於皮下投與。表 16
濃度 (mg/mL) 平均黏度 (cP) SD (cP) %RSD
33.2 2.8 0.08 2.99
63.6 3.6 0.08 2.29
159.8 6.4 0.16 2.54
圖 1 .尺寸排阻層析(SEC)。圖A及B展示單獨人類KLK5 (實心跡線，最右側)、單獨兔Fab抗體10236 (點跡線)、人類KLK5 + LEKTI D5 (長虛跡線，圖A)或人類KLK5 + LEKTI D8 (長虛跡線，圖B)及人類KLK5 + LEKTI D5 + 兔Fab抗體10236 (短虛跡線，最左側，圖A)或人類KLK5 + LEKTI D8 + 兔Fab抗體10236 (短虛跡線，最左側，圖B)之洗脫概況。
圖 2 . 來自圖1A及1B中所示之SEC之峰洗脫份的SDS-PAGE。泳道1，MW標記物。泳道2，二元複合物人類KLK5 + LEKTI D5之峰洗脫份。泳道3，三元複合物KLK5 + LEKTI D5 + 兔Fab抗體10236之峰洗脫份。泳道4，二元複合物KLK5 + LEKTI D8之峰洗脫份。泳道5，三元複合物KLK5 + LEKTI D8 + 兔Fab抗體10236之峰洗脫份。
圖 3 .產生用於X射線結晶學研究之KLK5之SDS-PAGE。泳道M，MW標記物。泳道1，自在基夫鹼(kifunensine，kif)存在下生長之培養物純化的人類KLK5。泳道2，自基夫鹼培養物純化且用內切糖苷酶H(Endo H)處理之人類KLK5。
圖 4 .在與兔Fab抗體10236之複合物中人類KLK5抗原決定基之示意圖。A) Fab重鏈(深灰色)及輕鏈(淺灰色)展示於草圖及透明表面中。KLK5展示為黑色條帶。作為人類KLK5上由抗體10236所結合之抗原決定基之一部分的KLK5殘基描繪為黑棒。B)在結合於兔Fab10236之KLK5 (表面呈現)之晶體結構(條帶)中模型化的抗纖維蛋白溶酶肽(表面及棒)。Fab10236接觸KLK5上之99環。C)晶體結構2PSX (白色，無鋅)及2PSY (灰色，有鋅)之重疊，突出顯示在鋅存在下KLK5上99環及His147及His150之側鏈位置的移動。抗纖維蛋白溶酶肽以白色表面及棒展示。D)在與Fab10236之複合物中KLK5之晶體結構上晶體結構2PSX (KLK5結合於抗纖維蛋白溶酶肽)之重疊。突出顯示在比較兩種結構時99環及His147及His150之側鏈位置的移動。晶體結構2PSX及結合於KLK5之Fab10236之晶體結構中環及His殘基之構形分別以白色及黑色展示。在His147周圍之白色虛線矩形(晶體結構2PSX)指示此構形將撞擊Fab10236 (灰色表面)。在KLK5-Fab10236結構中His147呈不同構形。在His150 (黑色，如在KLK5與Fab10236之複合物中所觀測到)周圍之白色虛線環指示其指向諸如抗纖維蛋白溶酶肽之受質將結合之KLK5活性位點之S2袋形物。來自晶體結構2PSX之抗纖維蛋白溶酶肽(灰色表面及棒)展示預期受質結合在KLK5活性位點。
圖 5 . 在與兔Fab抗體10236及10273之複合物中人類KLK5之晶體結構的兩種取向。人類KLK5展示為條帶表示，兔Fab抗體10236及10273展示為實心表面。
圖 6 . 抗體10236之兔可變輕鏈序列之人類化。移植物10236gL5、gL6、gL7及gL8為使用IGKV1-6人類生殖系作為受體構架的抗體10236之兔可變輕鏈之人類化移植物。供體殘基以粗體/斜體展示且加灰色陰影：Y2、D3及K63。CDR以粗體/下劃線展示。CDRL1中增加pI之突變以粗體/下劃線展示且突出顯示：Q24R或Q24K。
圖 7 . 抗體10236之兔可變重鏈序列之人類化。移植物10236gH9、gH10、gH11、gH12及gH14為使用IGHV4-4人類生殖系作為受體構架的抗體10236之兔可變重鏈之人類化移植物。CDR以粗體/帶下劃線顯示。供體殘基以粗體/斜體顯示且加灰色陰影：F67、Q71、S73、T76及V78。
圖 8 . 對抗胰舒血管素組之抗體10236 gL6gH12及對抗人類及cyno KLK5之LEKTI D5兔Fc的抑制活性。
圖 9 .Ab 10236 gL6gH12對IP-1自HaCat細胞之釋放的抑制。藉由添加KLK5至HaCat細胞刺激IP-1釋放。抗體10236 gL6gH12實現IP-1之幾乎完全抑制，程度相當於參考LEKTI D5兔Fc蛋白。A33 Hu IgG4為同型對照。
圖 10 .抗體10236 gL6gH12 (A)及親本兔抗體(B)之作用機制。相對於抗體10236及LEKTI D5兔Fc蛋白之受質濃度繪製Kobs 值(後者僅在(A)中)。所示資料為10 nM抗體10236及2 nM LEKTI D5兔Fc。斜率顯示抗體10236為非競爭性抑制劑，而LEKTI蛋白質為競爭性抑制劑。
圖 11 .蘇木精及曙紅染色展示復原人類皮膚表皮模型中之皮膚結構及角質層完整性。培養基、存在及不存在抗體10236 gL6gH12 IgG4P (Ab 10236)或同型對照(hIgG4P)下之MC903的作用。
圖 12 . 展示用對照緩衝液(A)或抗體10236 gL6gH12 IgGP4 (B)處理之異位性皮膚炎皮膚部分中之絲胺酸蛋白酶活性的原位酶譜分析。
圖 13 . 抗體10236 gL6gH12 IgG4P (命名為10236gL6gH12)之應力研究以評估輕鏈CDR3上之Asn(94) Ser模體處之去醯胺傾向。
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Claims (36)

  1. 一種結合於胰舒血管素5 (kallikrein 5；KLK5)之抗體，其中該抗體包含可變輕鏈及可變重鏈，且其中： a.  該可變輕鏈包括包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 62或SEQ ID NO: 63之CDR-L1、包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；且 b.  該可變重鏈包括包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3。
  2. 如請求項1之抗體，其中： a.  該可變輕鏈包括包含SEQ ID NO: 1之CDR-L1、包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；且 b.  該可變重鏈包括包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3。
  3. 一種結合於胰舒血管素5 (KLK5)之抗體，其中該抗體結合於參考SEQ ID NO: 51之人類KLK5的包含胺基酸殘基Arg87、Ala107、Arg110、Lys111、Lys112、Val113、Val137、Lys138、Ser139、Ile140、Pro141、His142、Pro143、Tyr145、Ser146及His147之抗原決定基。
  4. 如請求項3之抗體，其中該抗原決定基係藉由X射線結晶學表徵。
  5. 如請求項1至4中任一項之抗體，其中該抗體抑制或降低KLK5之蛋白酶活性。
  6. 如請求項1至5中任一項之抗體，其中當KLK5結合於LEKTI或LEKTI之片段時，該抗體結合於KLK5。
  7. 如請求項1至6中任一項之抗體，其中該抗體不與LEKTI或LEKTI之片段競爭結合KLK5。
  8. 如請求項1至7中任一項之抗體，其中該抗體與結合於LEKTI或LEKTI之片段的KLK5形成複合物。
  9. 如請求項6至8中任一項之抗體，其中該LEKTI之片段為包含SEQ ID NO: 54之胺基酸1至64之人類LEKTI域5或包含SEQ ID NO: 61之胺基酸1至71之LEKTI域8。
  10. 如前述請求項中任一項之抗體，其中該抗體結合人類KLK5，較佳地結合包含SEQ ID NO: 53之人類KLK5，及結合食蟹獼猴(cyno) KLK5，較佳地結合包含SEQ ID NO: 60之cyno KLK5。
  11. 如前述請求項中任一項之抗體，其中該抗體不結合人類或cyno胰舒血管素2 (KLK2)；或人類或cyno胰舒血管素4(KLK4)；或人類或cyno胰舒血管素7 (KLK7)。
  12. 如請求項3至11中任一項之抗體，其中該抗體包含可變輕鏈及可變重鏈，且其中： a.  該可變輕鏈包括包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 62或SEQ ID NO: 63之CDR-L1，較佳地包含SEQ ID NO: 1之CDR-L1，包含SEQ ID NO: 2之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 3之CDR-L3；且 b.  該可變重鏈包括包含SEQ ID NO: 4之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 5之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 6之CDR-H3。
  13. 如前述請求項中任一項之抗體，其中該抗體為嵌合或人類化抗體。
  14. 如前述請求項中任一項之抗體，其中該抗體係全長抗體。
  15. 如請求項14之抗體，其中該全長抗體係選自IgG1、IgG4或IgG4P。
  16. 如請求項1至13中任一項之抗體，其中該抗體係選自Fab、Fab'、F(ab')2 、scFv、dAb或VHH 。
  17. 如請求項1至16中任一項之抗體，其中該抗體包含： a.  包含SEQ ID NO: 7或11或15或19或23之可變輕鏈；及/或 b.  包含SEQ ID NO: 9或27或31或35或39或43之可變重鏈。
  18. 如請求項1至15或17中任一項之抗體，其中該抗體包含： a.  包含SEQ ID NO: 13或17或21或25之輕鏈；及 b.  包含SEQ ID NO: 29或33或37或41或45之重鏈。
  19. 如請求項17或18之抗體，其中參考SEQ ID NO: 15或17在L-CDR1中位置24處之胺基酸殘基麩醯胺酸(Gln；Q)經精胺酸(Arg；R)或經離胺酸(Lys；K)置換。
  20. 如前述請求項中任一項之抗體，其中KLK5為包含SEQ ID NO: 51或52或53之人類KLK5或包含SEQ ID NO: 60之cyno KLK5。
  21. 一種抗體，其： a.  與如請求項1至20中任一項之抗體競爭結合KLK5；及/或 b.  交叉阻斷如請求項1至20中任一項之抗體結合KLK5或由如請求項1至20中任一項之抗體交叉阻斷結合KLK5；及/或 c.  與如請求項1至20中任一項之抗體結合KLK5之相同抗原決定基；及/或 d.  包含與根據SEQ ID NO: 29或33或37或41或45之序列具有至少90%一致性或相似性的重鏈可變區；及/或 e.  包含與根據SEQ ID NO: 13或17或21或25之序列具有至少90%一致性或相似性的輕鏈可變區。
  22. 一種經分離之聚核苷酸，其編碼如請求項1至20中任一項之抗體。
  23. 如請求項22之經分離之聚核苷酸，其中該聚核苷酸編碼： a.  輕鏈可變區，其中該聚核苷酸： i.  與SEQ ID NO: 8 (或SEQ ID NO: 8之核苷酸1至330)或12 (或SEQ ID NO: 12之核苷酸1至330)或16或20或24或64或66至少90%一致；或 ii. 包含SEQ ID NO: 8 (或SEQ ID NO: 8之核苷酸1至330)或12 (或SEQ ID NO: 12之核苷酸1至330)或16或20或24或64或66；或 iii. 基本上由SEQ ID NO: 8 (或SEQ ID NO: 8之核苷酸1至330)或12 (或SEQ ID NO: 12之核苷酸1至330)或16或20或24或64或66組成；或 b.  重鏈可變區，其中該聚核苷酸： i.  與SEQ ID NO: 10或28或32或36或40或44至少90%一致；或 ii. 包含SEQ ID NO: 10或28或32或36或40或44；或 iii. 基本上由SEQ ID NO: 10或28或32或36或40或44組成；或 c.  輕鏈，其中該聚核苷酸： i.  與SEQ ID NO: 14或18或22或26或65或67或100或101或102或103或104至少90%一致；或 ii. 包含SEQ ID NO: 14或18或22或26或65或67或100或101或102或103或104；或 iii. 基本上由SEQ ID NO: 14或18或22或26或65或67或100或101或102或103或104組成；或 d.  重鏈，其中該聚核苷酸： i.  與SEQ ID NO: 30或34或38或42或46至少90%一致；或 ii. 包含SEQ ID NO: 30或34或38或42或46；或 iii. 基本上由SEQ ID NO: 30或34或38或42或46組成。
  24. 一種選殖或表現載體，其包含一或多種如請求項22或23中任一項之聚核苷酸。
  25. 一種宿主細胞，其包含： a.  一或多種如請求項22或23中任一項之聚核苷酸或 b.  一或多種如請求項24之表現載體。
  26. 一種用於產生如請求項1至20中任一項之抗體之方法，其包含在適於產生該抗體之條件下培養如請求項25之宿主細胞及分離由該宿主細胞產生之該抗體。
  27. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至20中任一項之抗體及一或多種醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或稀釋劑。
  28. 如請求項1至20中任一項之抗體或其抗原結合片段或如請求項27之醫藥組合物，其用於療法中。
  29. 如請求項1至20中任一項之抗體或如請求項27之醫藥組合物，其用於治療特徵為KLK5失調或對KLK5之抑制失調之疾病。
  30. 如請求項29之抗體，其中該疾病係選自內瑟頓氏症候群(Netherton's Syndrome)、異位性皮膚炎、魚鱗病、紅斑痤瘡、氣喘或癌症(諸如卵巢癌或膀胱癌)或其組合。
  31. 如請求項30之抗體，其中該疾病為內瑟頓氏症候群。
  32. 如請求項30之抗體，其中該疾病為異位性皮膚炎。
  33. 一種治療患者中特徵為KLK5失調或對KLK5之抑制失調之疾病的方法，其包含向該患者投與治療有效量之如請求項1至20中任一項之抗體或如請求項27之醫藥組合物。
  34. 如請求項33之方法，其中該疾病係選自內瑟頓氏症候群、異位性皮膚炎、魚鱗病、紅斑痤瘡、氣喘或癌症(諸如卵巢癌或膀胱癌)。
  35. 如請求項34之抗體，其中該疾病為內瑟頓氏症候群。
  36. 如請求項34之抗體，其中該疾病為異位性皮膚炎。
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