KR20220132733A - 소포리코시드 함량이 증가된 괴각 추출물 및 이의 제조방법 - Google Patents
소포리코시드 함량이 증가된 괴각 추출물 및 이의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 소포리코시드(sophoricoside) 함량이 증가된 괴각 추출물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 소포리코시드 함량이 200mg/g 이상이며 향상된 생리학적 활성을 나타내는 괴각 추출물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명이 제공하는 괴각 추출물은 소포리코시드를 200mg/g 이상 포함하고 있어, 피부 보습, 염증성 질환, 에스트로겐 수용체 알파 매개성 암, 여성 갱년기 질환, 이상지질혈증, 심혈관계질환 및 비만 등에 매우 우수한 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명이 제공하는 괴각 추출물은 소포리코시드를 200mg/g 이상 포함하고 있어, 피부 보습, 염증성 질환, 에스트로겐 수용체 알파 매개성 암, 여성 갱년기 질환, 이상지질혈증, 심혈관계질환 및 비만 등에 매우 우수한 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있다.
Description
본 발명은 소포리코시드 함량이 증가된 괴각 추출물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 소포리코시드 함량이 200mg/g 이상이며 향상된 생리학적 활성을 나타내는 괴각 추출물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
이소플라본 중 특히 제니스테인과 다이드제인은 그들의 항암효과와 항산화 효과로 주목을 받아왔으며 여러 가지 암뿐 아니라 각종 성인병의 예방과 치료 효과에도 기대가 크다. 암세포의 증식에 관여하는 효소의 작용을 저해하는 것으로 밝혀졌으며, 특히 전립선암 억제 등 발암억제 가능성이 여러 측면에서 보고되었다. 또한 에스트로겐 수용체(estrogen receptor)와 약하게 결합하여 에스트로겐 활성을 필요로 하는 유방암 세포의 발생을 억제한다는 연구결과가 있다.
생리활성을 나타내는 비배당체 형태인 제니스테인은 괴각에 극소량 함유되어 있어 괴각 내 제니스테인의 배당체 형태를 체내에서 비배당체 제니스테인 형태로 전환되도록 하는 것이 필요한 실정이었으며, 체외에서 배당체를 비배당체로 전환시키는 기술은 비용과 시간이 많이 소요되어 배당체 자체를 섭취하여 체내에서 자연스럽게 전환흡수되도록 하는 기술이 요구되고 있었다.
일부 연구자들이 미생물을 이용하여 체외에서 소포리코시드를 비배당체 제니스테인으로 전환하는 기술을 개발하고 있었으나, 이러한 기술은 효모와 유산균을 이용하여 부가적인 공정을 거칠 필요가 있었다(World J Microbiol Biotechnol (2015) 31:187--197).
제니스테인의 배당체 형태는 섭취시 소장에서 약 10% 정도로 자연스럽게 제니스테인으로 전환되는 것으로 알려져 있으며, 나머지는 대장에서 미생물에 의하여 제니스테인으로 전환된다(Journal of Nutritional Biochemistry 17 (2006) 257-264).
또한, 비배당체 제니스테인은 소장에서 빠르게 흡수되지만 물에 대한 용해성이 낮아 생체이용률이 낮다. 따라서 제니스테인의 배당체를 섭취한 뒤 체내에서 전환되도록 하는 것이 생체이용률면에서 우수하다는 결과가 보고되어 있다(International Journal of Pharmaceutics 337 (2007) 148-154).
한편, 제니스테인의 배당체 중 하나인 소포리코시드는 회화나무의 여러 성분 중 하나로 알레르기반응에 중요한 역할을 하는 호산구 및 호염기구에 작용하여 인터루킨-5의 활성을 저해하고, 이로 인해 알레르기에 의한 염증반응을 치료할 수 있음이 밝혀진 바 있고, 다양한 기능성 확인되어 이를 기초로 식품, 의약품, 화장품 등에 항염증제로 개발되고 있다.
이와 같은 소포리코시드의 유용성에도 불구하고 회화나무로부터 소포리코시드를 고함량으로 포함하고 있는 추출물을 제조하는 방법은 보고된 바 없다.
한국등록특허 제2127712호에는 제니스테인의 배당체인 제니스테인 디글루코시드, 소포라비오시드, 및 소포리코시드를 일정 함량 이상으로 포함하면서, 이들이 일정 비율로 포함된 괴각 추출물 및 이의 용도가 개시되어 있으나, 상기 추출물에는 여전히 제니스테인의 배당체인 소포리코시드의 함량이 매우 낮다는 한계가 있다.
이에, 본 발명자는 생리학적으로 매우 유용한 활성을 나타내는 소포리코시드 함량이 현저히 높은 괴각 추출물을 제조하기 위해 예의 연구를 거듭한 결과, 괴각 추출물에 염석제를 투여하여 염석법을 수행할 경우 다른 폴리페놀류의 함량은 증가하지 않지만 소포리코시드의 함량이 현저히 증가된 괴각 추출물을 제조할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 (a) 괴각을 용매로 추출하는 단계; 및 (b) 상기 괴각 추출물에 염석제를 투여한 후 침전물을 수득하는 단계를 포함하는 방법에 따라 제조되고, 소포리코시드(Sophoricoside) 함량이 200mg/g 이상인 괴각 추출물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 괴각 추출물을 유효성분으로 포함하는, 피부 보습, 염증성 질환, 에스트로겐 수용체 알파 매개성 암, 여성 갱년기 질환, 이상지질혈증, 심혈관질환 및 비만으로 이루어진 군에서 선택되는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 괴각 추출물을 유효성분으로 포함하는, 피부 보습, 염증성 질환, 에스트로겐 수용체 알파 매개성 암, 여성 갱년기 질환, 이상지질혈증, 심혈관질환 및 비만으로 이루어진 군에서 선택되는 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 (a) 괴각을 용매로 추출하는 단계; 및 (b) 상기 괴각 추출물에 염석제를 투여한 후 침전물을 수득하는 단계를 포함하는, 소포리코시드(Sophoricoside) 함량이 200mg/g 이상인 괴각 추출물의 제조방법을 제공하는 것이다.
전술한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 (a) 괴각을 용매로 추출하는 단계; 및 (b) 상기 괴각 추출물에 염석제를 투여한 후 침전물을 수득하는 단계를 포함하는 방법에 따라 제조되고, 소포리코시드(Sophoricoside) 함량이 200mg/g 이상인 괴각 추출물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 괴각 추출물을 유효성분으로 포함하는, 피부 보습, 염증성 질환, 에스트로겐 수용체 알파 매개성 암, 여성 갱년기 질환, 이상지질혈증, 심혈관질환 및 비만으로 이루어진 군에서 선택되는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 괴각 추출물을 유효성분으로 포함하는, 피부 보습, 염증성 질환, 에스트로겐 수용체 알파 매개성 암, 여성 갱년기 질환, 이상지질혈증, 심혈관질환 및 비만으로 이루어진 군에서 선택되는 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 괴각을 용매로 추출하는 단계; 및 (b) 상기 괴각 추출물에 염석제를 투여한 후 침전물을 수득하는 단계를 포함하는, 소포리코시드(Sophoricoside) 함량이 200mg/g 이상인 괴각 추출물의 제조방법을 제공한다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 (a) 괴각을 용매로 추출하는 단계; 및 (b) 상기 괴각 추출물에 염석제를 투여한 후 침전물을 수득하는 단계를 포함하는 방법에 따라 제조되고, 소포리코시드(Sophoricoside) 함량이 200mg/g 이상인 괴각 추출물을 제공한다.
괴각(Sophora japonica L.)은 회화나무 열매로서, 회화나무는 콩과 식물에 속하는 낙엽교목이다. 우리나라와 중국이 원산지로 전국 각지에 분포하고 있으며, 관상용, 공업용, 식용, 약용으로 이용된다. 괴각의 주성분은 9개의 플라보노이드(flavonoid)와 이소플라보노이드(isoflavonoid) 화합물이 함유되어 있는데, 여기에는 소포리코시드(sophoricoside), 라플라보노로지데지니스테인(sophoraflavonolosidegenistein), 소포라비오사이드(sophorabioside), 캠프레롤(kaemprerol), 루틴(rutin), 및 글루코사이드-C(glucoside-C) 등이 있으며, 어린 열매 속에 루틴의 함량이 1.76%에 달한다.
본 발명이 제공하는 상기 괴각 추출물은 소포리코시드 함량이 200mg/g 이상, 바람직하게는 300mg/g 이상, 더 바람직하게는 400mg/g 이상, 가장 바람직하게는 500mg/g 이상인 것을 특징으로 한다.
상기 소포리코시드는 바람직하게는 하기 화학식 1로 표시되는 것일 수 있다.
[화학식 1]
본 발명의 상기 괴각 추출물은, 추출물의 제조시 추출 효율을 증대시키기 위해 상기 원료에 대한 전처리 과정을 포함할 수 있으며, 예를 들어 괴각을 건조시킨 후 세절하여 사용할 수 있다.
상기 괴각 추출물은 공지의 천연물 추출법으로 추출될 수 있다. 예를 들어 냉침추출, 상온추출, 열수추출, 초음파추출, 환류냉각 추출, 가열 추출법으로 추출할 수 있으며, 1회 내지 10회 반복 추출할 수 있다.
본 발명의 상기 (a) 단계에서 용매는 물, 주정 및 탄소수 1~6의 유기용매로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것을 사용하여 추출되는 것일 수 있다. 본 발명에서 추출 용매는 식용 가능한 단수 또는 복수 종류의 용매일 수 있으나, 바람직하게는 물, 주정, 및 탄소수 1 내지 6의 알코올[메탄올(C1), 에탄올(C2), 프로판올(C3), 부탄올(C4), 펜탄올(C5), 헥산올(C6)]로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 것을 사용할 수 있다. 더 바람직한 실시 양태에서, 본 발명에서는 물, 주정 및 탄소수 1 내지 4의 알코올[메탄올(C1), 에탄올(C2), 프로판올(C3), 부탄올(C4)]로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 것을 추출용매로 이용하는 것일 수 있다.
더욱 바람직하게는 상기 용매는 주정일 수 있다. 상기 주정은 바람직하게는 1%(v/v) 내지 99%(v/v)의 농도를 가질 수 있으며, 더 바람직하게는 40%(v/v) 이상의 농도를 가질 수 있고, 가장 바람직하게는 50%(v/v) 내지 70%(v/v)의 농도를 가질 수 있다.
본 발명에서 상기 (a) 단계 이후에 괴각 추출물을 일정 수준 농축하는 단계가 추가로 포함될 수 있다.
본 발명에서 염석이란 염(예. 무기 염)의 존재 하에 바람직하게 수행되어 원하는 성분을 수층으로부터 새로운 유기층으로 이동시킨다는 사실로부터 기원한다. 상기 염의 목적은 두 층 사이의 분배계수를 변화시키는 것이며 상기 전이를 향상시키기 위해 염 이외의 임의의 다른 "상-전이"제를 사용하는 것 또한 본 발명의 상기 염석제의 범위 내에 속한다. 이러한 측면에서 바람직한 염석제는 무기산의 금속염이고, 특히 그 수용액 형태이다. 많은 금속염이 유용하나 알칼리 금속염(예. 나트륨으로부터의)이 바람직하다. 또한, 상기 (b) 단계에서의 염석제는 염의 포화 수용액의 형태로 사용되는 것이 특히 바람직할 수 있다.
따라서, 본 발명의 상기 (b) 단계에서 염석제는 당업자에게 알려진 물에 용해성이 좋은 염이면 종류에 특별한 제한은 없으며, 이의 비제한적인 예시로 염화나트륨(NaCl), 염화칼륨(KCl), 염화칼슘(CaCl2), 산화칼슘(CaO), 산화마그네슘(MgO), 황산나트륨(Na2SO4)가 포함될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 상기 (b) 단계에서 염석제는 염화나트륨(NaCl), 염화칼슘(CaCl2) 및 이의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 상기 (b) 단계에서 염석제가 포화 수용액의 형태로 상기 괴각 추출물에 투여될 경우, 상기 포화 수용액은 괴각 추출물에 1:0.5 내지 2의 부피비(괴각 추출물:염석제 포화 수용액)로 첨가될 수 있고, 바람직하게는 1:0.5 내지 1.5, 가장 바람직하게는 1:1의 부피비로 첨가될 수 있다.
본 발명의 상기 (b) 단계는 2 내지 8℃의 온도조건에서 1 내지 24시간 동안 수행될 수 있으며, 바람직하게는 2 내지 6℃의 온도조건에서 8 내지 24시간 동안 수행될 수 있다.
본 발명의 상기 괴각 추출물은 상기 (b) 단계 이후 원심분리하여 상등액을 제거하고 침전물을 수득하는 단계를 추가로 수행함으로써 수득될 수 있다.
본 발명에서 상기 괴각 추출물은 여과 및/또는 농축하여 액상으로 제조될 수 있고, 분무건조 또는 동결건조 등 통상의 건조 공정을 통하여 고형화하여 제조될 수도 있다. 상기 건조 공정에서는 분무건조 또는 동결건조 전 덱스트린 등을 혼합하여 건조할 수 있다.
본 발명은 또한 괴각 추출물을 유효성분으로 포함하는, 피부 보습, 염증성 질환, 에스트로겐 수용체 알파 매개성 암, 여성 갱년기 질환, 이상지질혈증, 심혈관질환 및 비만으로 이루어진 군에서 선택되는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 괴각 추출물은 자외선 조사에 의해 유발되는 MMP-1 및 MMP-2의 발현 증가를 억제하는 효능이 매우 뛰어난 것으로 확인되었다.
콜라겐 분해 효소(Matrix Metallo Proteinase, MMP)는 다형핵성호중구 (polymorphonuclear neutrophil), 대식세포 (Macrophage), 섬유아세포 (Fibroblast)등과 같은 세포로부터 분비되는 칼슘 및 아연 의존성 엔도펩티다제 (Endopeptidase)로 중성 pH에서 작용하며, 기질로서 여러 가지 세포의 기질을 이용한다. 주로 피부에서는 MMP-1, MMP-2, MMP-9 이외에 여러 가지 효소들이 작용을 하는데 콜라겐 분해와 관련되어 가장 근본적으로 작용하는 효소는 MMP-1이다. MMP(Matrix metalloproteinase)는 콜라겐, 프로테오글리칸 및 젤라틴과 같은 거대 생분자들을 분해시킬 수 있는 엔도펩티다아제류 효소로, 크게 콜라게나제, 젤라티나제, 스트로멜리신 및 막형 MMP로 분류된다. 나이가 들어가거나 지속적인 자외선 노출에 따라 피부 내 엘라스틴과 콜라겐이 이들 MMP에 의해 분해되어 피부 주름이 생성되고 노화가 촉진되기 때문에, MMP의 발현 또는 활성을 저해할 수 있는 물질은 피부 주름 및 보습과 노화 개선에 도움이 될 수 있음이 잘 알려져 있다.
따라서, MMP-1 및 MMP-2의 발현을 저해하는 활성이 매우 뛰어난 본 발명의 괴각 추출물은 피부 주름 및 보습 개선 또는 치료제 개발에 활용될 수 있다.
본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 상기 괴각 추출물은 NO(nitric oxide) 생성 억제능이 매우 우수한 것으로 확인되었다.
염증반응의 결과로서, iNOS(inducible nitric oxide synthase)에 의해 생성된 NO의 상기 생리학적인 농도(Supraphysiological concentrations)가 다양한 염증 질환의 병리생물학에 있어서 역할을 하고 있다고 알려져 있다. 염증반응의 유도물질들중에서 LPS(lipopolysaccharide)는 백혈구와 같은 면역세포와 상호 작용을 하며, 단핵세포의 식세포들에 있어서 iNOS 이소형태의 활성화에 의한 NO 농도의 증대에 의한 염증 반응에 있어서 중요한 역할을 하고 있기 때문에, 면역세포에서 NO 생성을 저해할 수 있는 물질은 염증성 질환의 예방 또는 치료에 효과를 나타낼 수 있다.
따라서, 면역세포에서 NO 생성을 저해하는 활성을 나타내는 본 발명의 괴각 추출물은 염증성 질환의 예방, 개선 또는 치료제 개발에 활용될 수 있다.
본 발명에서 상기 염증성 질환은 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어, 염증성 장 질환, 복막염, 골수염, 봉소염, 췌장염, 외상 유발 쇼크, 기관지 천식, 알러지성 비염, 낭포성 섬유증, 급성 기관지염, 만성 기관지염, 급성 세기과지염, 만성 세기관지염, 골관절염, 통풍, 척추관절병증, 강직성 척추염, 라이터 증후군, 건선성 관절병증, 장질환 척추염, 연소자성 관절병증, 연소자어 강직성 척추염, 반응성 관절병증, 감염성 관절염, 후-감염성 관절염, 임균성 관절염, 결핵성 관절염, 바이러스성 관절염, 진균성 관절염, 매독성 관절염, 라임 병, 혈관염 증후군과 관련된 관절염, 결절성 다발동맥염, 과민성 혈관염, 루게닉 육아종증, 류마티스성 다발성 근육통, 관절 세포 동맥염, 칼슘 결정 침착 관절병증, 가성 통풍, 비-관절 류마티즘, 점액낭염, 건초염, 상과염(테니스 엘보), 신경병증성 관절 질환(neuropathic joint disease), 출혈성 관절증(hemarthrosic), 헤노흐-쉐라인 자반병, 비후성 골관절병증, 다중심성 세망조직구종, 척추측만증(scoliosis), 혈색소증, 혈색소병증, 고지단백혈증, 저감마글로불린혈증, 가족성 지중해열, 베하트 병, 전신성 홍반성 루푸스, 재귀열, 다발성 경화증, 패혈증, 패혈성 쇼크, 급성 호흡곤란 증후군, 다발성 장기부전, 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 급성 폐손상(acute lung injury), 기관지 폐 형성장애(broncho-pulmonary dysplasia) 및 염증성 피부질환으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 상기 괴각 추출물은 에스트로겐 수용체 알파(ERα)의 발현 저해능이 매우 뛰어난 것으로 확인되었다.
많은 암 세포는 에스트로겐 수용체(ER)를 발현하고, 에스트로겐에 의해 조절되는 증식 특성을 갖고 있다. ER을 표적으로 하는 다수의 유방암 약물 요법이 개발되어 왔다. 많은 경우에, 약물은 ER에 대하여 작용 및/또는 길항 효과를 나타내는 선택적 에스트로겐 수용체 조절제(SERM)이다. 예를 들어, ERα에 대하여 길항 효과를 나타내는 풀베스트란트(fulvestrant)는 전이성 유방암의 치료에 사용되는 약물이다. 이와 같이, ERα는 유방암을 비롯하여 자궁내막암, 난소암 및 자궁경부암 세포의 증식을 유발하는 것으로 알려져 있기 때문에, ERα에 길항 효과를 나타내는 물질은 ERα 매개성 암의 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있다.
따라서, ERα의 발현 저해능이 매우 뛰어난 본 발명의 괴각 추출물은 ERα 매개성 암, 구체적으로는 유방암, 자궁내막암, 난소암 및 자궁경부암에 대한 예방, 개선 또는 치료 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 상기 괴각 추출물은 pS2 유전자 발현을 증가시켜 에스트로겐 수용체 신호전달 활성을 나타내는 것으로 확인되었다.
pS2는 에스트로겐 수용체에 의해 발현이 증가되는 에스트로겐-반응 유전자(estrogen-responsive gene)로서 에스트로겐 유사물질 민감성을 파악할 수 있는 지표이다. pS2 유전자의 발현을 증가시키는 물질은 여성 갱년기 질환의 개선 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다.
따라서, pS2 유전자 발현을 증가시키는 효과를 나타내는 본 발명의 상기 괴각 추출물은 여성 갱년기 질환, 구체적으로는 안면홍조, 질 건조증, 발한, 피부건조, 질위축, 하부 요도 위축, 질염, 방광염, 배뇨통, 급뇨, 집중장애, 단기 기억장애, 불안, 신경과민, 기억력 감퇴, 근육통, 관절통 및 골다공증에 대하여 예방, 개선 또는 치료 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 상기 괴각 추출물은 PPAR (peroxisome proliferator-activated receptor)-알파의 유전자 및 단백질 발현을 증가시키는 효과를 나타내는 것으로 확인되었다.
퍼옥시좀(Peroxisome)은 대사기능 이상의 원인이 되는 세포 내 소기관 중 하나로서, 산소, 포도당, 지질 및 호르몬의 대사에 있어 중요한 역할을 하며, 세포 증식 및 분화의 조절, 염증 매개체들의 조절에도 폭 넓게 영향을 미친다. 또한 퍼옥시좀은 지질대사와 포도당대사를 통하여 인슐린 감수성뿐만 아니라 세포막과 비만세포의 형성에 영향을 주고, 산화적 스트레스에 영향을 주어 노화 및 종양 발생(tumorigenesis)에 있어서 중요한 역할을 한다. PPAR는 리간드(ligand) 결합에 의해 유전자 발현을 조절하는 핵 수용체(nuclear receptors) 중 하나로서, 여러 가지 지방산이 내인성 리간드(endogenous ligand)로 작용한다. 현재 밝혀진 PPAR는 PPARα, PPARβ/δ 및 PPARγ의 세 가지이다. 이 중 PPARα는 주로 혈관벽, 간, 심장, 근육, 신장 및 갈색 지방조직 등에서 발견되며, 작용제(agonist)인 피브레이트(fibrate)류와 함께 이상지질혈증, 심혈관질환(동맥경화증, 고혈압, 협심증, 뇌졸중, 심근경색 등)을 예방하거나 발병을 지연시키고 지방 산화 촉진을 통한 항비만 작용을 하는 것으로 알려져 있다.
따라서, PPARα의 유전자 및 단백질 발현 및 활성을 증가시키는 본 발명의 괴각 추출물은 이상지질혈증, 심혈관질환 및 비만에 예방, 개선 또는 치료 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 괴각 추출물을 단독으로 함유하거나 또는 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다.
약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
본 발명의 약학적 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 약학적 조성물은 경구투여될 수 있다. 예컨대, 본 발명의 약학적 조성물을 주사형 제형으로 제조하여 이를 30 게이지의 가는 주사 바늘로 피부를 가볍게 단자(prick)하는 방법, 또는 피부에 직접적으로 도포하는 방법으로 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.
경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042, Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기재되어 있다.
본 발명의 약학적 조성물이 피부외용 약학적 조성물로 사용될 경우 탈모 방지, 발모 촉진 및 두피 개선 효과를 갖는 피부외용제로서 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제의 피부 외용제 형태의 약학조성물로 제조하여 사용할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 조성물의 전체 용량은 1일당 환자 체중 1 ㎏ 당 약 0.01ug 내지 1,000 mg, 가장 바람직하게는 0.1 ug 내지 100 mg일 수 있다. 그러나 상기 용량은 약학적 조성물의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 본 발명의 약학적 조성물을 약학적 제제로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.
본 발명은 또한 상기 괴각 추출물을 유효성분으로 포함하는, 피부 보습, 염증성 질환, 에스트로겐 수용체 알파 매개성 암, 여성 갱년기 질환, 이상지질혈증, 심혈관질환 및 비만으로 이루어진 군에서 선택되는 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
이러한 식품 조성물은 유효성분인 괴각 추출물을 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨,소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 향미제는 천연 향미제 (타우마틴), 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 상기 약학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화 되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛,식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등이 있다.
또한 상기 식품 조성물은 유효성분인 괴각 추출물 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
본 발명의 유효성분인 괴각 추출물은 천연물질로서 독성 및 부작용은 거의 없으므로 다양한 질환의 개선 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.
본 발명의 상기 식품 조성물은 괴각 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 보습, 염증성 질환, 에스트로겐 수용체 알파 매개성 암, 여성 갱년기 질환, 이상지질혈증, 심혈관질환 및 비만으로 이루어진 군에서 선택되는 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품일 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.
본 발명에서 “건강기능식품”이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
본 발명의 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 “식품 첨가물 공전”에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다. 예를 들어, 정제 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 콜라겐 가수분해물을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도있다.
캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분인 콜라겐 가수분해물을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 콜라겐 가수분해물을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.
환 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 괴각 추출물과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다.
과립 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 괴각 추출물과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.
상기 건강기능식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등일 수 있다.
본 발명은 또한 (a) 괴각을 용매로 추출하는 단계; 및 (b) 상기 괴각 추출물에 염석제를 투여한 후 침전물을 수득하는 단계를 포함하는, 소포리코시드(Sophoricoside) 함량이 200mg/g 이상인 괴각 추출물의 제조방법을 제공한다.
상기 각 단계에 대해서는 전술한 바를 참고할 수 있다.
본 발명이 제공하는 괴각 추출물은 소포리코시드를 200mg/g 이상 포함하고 있어, 피부 보습, 염증성 질환, 에스트로겐 수용체 알파 매개성 암, 여성 갱년기 질환, 이상지질혈증, 심혈관계질환 및 비만 등에 매우 우수한 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있다.
도 1은 괴각 주정 추출물과 괴각 주정 추출물에 염석법을 수행한 고함량 괴각 주정 추출물의 성분을 HPLC로 분석한 결과이다.
도 2는 자외선을 조사한 피부세포에 괴각 주정 추출물과 고함량 괴각 주정 추출물을 각각 처리한 후 MMP-2의 발현량 변화를 웨스턴 블로팅으로 확인한 결과이다.
도 3은 자외선을 조사한 피부세포에 괴각 주정 추출물과 고함량 괴각 주정 추출물을 각각 처리한 후 Pro-MMP-1의 발현량 변화를 웨스턴 블로팅으로 확인한 후 이를 정량화하여 나타낸 결과이다.
도 4는 대식세포에 괴각 주정 추출물(A)과 고함량 괴각 주정 추출물(B)를 처리하고 1시간 반응시킨 후 LPS를 처리했을 때 생성되는 NO 생성량을 측정한 결과이다.
도 5는 에스트로겐 수용체를 발현하는 MCF-7 세포주에 에스트라디올(E2), 괴각 주정 추출물(NRA) 또는 고함량 괴각 주정 추출물(NRB)을 각각 처리한 후 ERα 유전자의 발현 수준을 분석한 결과이다.
도 6은 MCF-7 세포주에 17β-에스트라디올(E2), 괴각 주정 추출물(NRA) 또는 고함량 괴각 주정 추출물(NRB)을 각각 처리한 후 pS2 유전자의 발현 수준을 분석한 결과이다.
도 7은 HEK293T 세포주에 표시된 각각의 실험물질을 처리한 후 루시퍼라제 어세이를 통해 PPAR-alpha의 활성을 평가한 결과이다.
도 8은 HEK293T 세포주에 표시된 각각의 실험물질을 처리한 후 웨스턴 블로팅을 통해 PPAR-alpha 단백질의 발현량을 평가한 결과이다.
도 2는 자외선을 조사한 피부세포에 괴각 주정 추출물과 고함량 괴각 주정 추출물을 각각 처리한 후 MMP-2의 발현량 변화를 웨스턴 블로팅으로 확인한 결과이다.
도 3은 자외선을 조사한 피부세포에 괴각 주정 추출물과 고함량 괴각 주정 추출물을 각각 처리한 후 Pro-MMP-1의 발현량 변화를 웨스턴 블로팅으로 확인한 후 이를 정량화하여 나타낸 결과이다.
도 4는 대식세포에 괴각 주정 추출물(A)과 고함량 괴각 주정 추출물(B)를 처리하고 1시간 반응시킨 후 LPS를 처리했을 때 생성되는 NO 생성량을 측정한 결과이다.
도 5는 에스트로겐 수용체를 발현하는 MCF-7 세포주에 에스트라디올(E2), 괴각 주정 추출물(NRA) 또는 고함량 괴각 주정 추출물(NRB)을 각각 처리한 후 ERα 유전자의 발현 수준을 분석한 결과이다.
도 6은 MCF-7 세포주에 17β-에스트라디올(E2), 괴각 주정 추출물(NRA) 또는 고함량 괴각 주정 추출물(NRB)을 각각 처리한 후 pS2 유전자의 발현 수준을 분석한 결과이다.
도 7은 HEK293T 세포주에 표시된 각각의 실험물질을 처리한 후 루시퍼라제 어세이를 통해 PPAR-alpha의 활성을 평가한 결과이다.
도 8은 HEK293T 세포주에 표시된 각각의 실험물질을 처리한 후 웨스턴 블로팅을 통해 PPAR-alpha 단백질의 발현량을 평가한 결과이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 괴각 추출물의 제조
회화나무열매(괴각)는 한국, 중국에서 구매하여 사용하였다. 회화나무열매(괴각)에 50% 주정을 첨가한 후 (괴각:용매 중량비=1:9) 95~105℃에서 2시간동안 환류 추출하였다. 해당 용액을 냉각시킨 후 100 mesh의 여과 필터를 이용하여, 침전물을 제거하고 여과액을 수득하였다. 상기 여과액을 65℃에서 감압 농축하여 40 brix 이상으로 맞추고, 농축액에 동량의 포화 NaCl을 1:1(v/v)로 첨가하여, 4℃에서 12시간 이상 침전시킨 후 원심분리하여 침전물을 수득했다. 침전물에 D.W.를 첨가하여 10분간 교반하고, 원심분리하여 상등액을 제거하고, 침전물에 잔류되어 있는 NaCl을 모두 녹여 제거했다. 침전물을 동결건조 하여 분말의 형태로 (수율 : 4 % 이상)제조했다.
상기 방법에 따라 제조된 괴각 추출물을 이하 "고함량 괴각주정 추출물"이라 한다.
한편, 본 발명에서 대조군으로 사용할 괴각 추출물은 한국 등록특허 제2127712호에 기재된 방법에 따라 65% 주정으로 추출된 괴각 추출물을 제조하였다. 상기 대조군의 괴각 추출물을 이하 "괴각 주정 추출물"이라 한다.
실시예 2: 괴각 추출물의 성분 분석
분말형태로 제조한 고함량 괴각 주정 추출물과 괴각 주정 추출물 분말 5 mg을 취하여 100% 메탄올 1 mL에 완전히 용해시킨 후 100배 희석한 후 필터(syringe filter, 0.45 μm, Waters Korea)를 이용하여 여과한 다음 여액 1 ml을 취하여 HPLC 분석용 시료로 사용하였다. HPLC 분석시 컬럼은 C18 (250Х4.6 mm, 5 μm, OSAKA SODA, Japan)를 사용하였으며, 이동상으로는 0.1% 아세트산이 첨가되어 있는 물, 0.1% 아세트산이 첨가되어 있는 아세토니트릴을 사용하였다. 온도는 35℃에서 유속 1.0 mL/min으로 분석을 수행하였으며, 흡광도는 260 nm에서 측정하였다.
이에 대한 결과를 하기 표 1 및 도 1에 나타내었다.
상기 표 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, 괴각 주정 추출물은 sophoricoside 함량이 119.9691 mg/g 이었으나, 고함량 괴각 주정 추출물은 560.8466 mg/g 으로 약 4.6배 함량이 높은 것을 확인 할 수 있었다. 또한 이소플라본의 배당체(genistein, genistin, daidzein, daidzin, glycitein, glycitin) 의 함량 분석 시 괴각 주정 추출물은 14.20 mg/g 이었으나, 고함량 괴각 주정 추출물의 경우 0.29 mg/g으로 괴각 주정 추출물이 49배 높은 것으로 나타났다.
고함량 괴각 주정 추출물에서는 sophoricoside의 함량이 증가할수록 이소플라본 및 이소플라본 배당체가 증가하는 경향이 아닌, sophoricoside의 함량만 증가하고, 이소플라본 및 이소플라본 배당체의 함량은 감소하는 것으로 나타났다.
실시예 3: 포화 용액 종류별 괴각 주정 추출물 내 sophoricoside 함량 비교 분석
포화용액 종류별(무첨가, NaCl, KCl, CaCl2, CaO, MgO)로 제조하여, 분말 형태의 고함량 괴각 주정 추출물을 제조한 후 수율과 sophoricoside 함량을 분석하여 표 2에 나타내었다.
이 결과는 고함량 괴각 주정 추출물의 제조시 수율 및 sophoricoside 함량 측면에서, NaCl 포화용액 또는 CaCl2 포화용액을 이용하는 것이 바람직할 수 있음을 의미한다.
실시예 4: 피부주름 및 보습 개선효과
피부의 염증반응은 여러 가지 복합적인 유전자들에 의해 조절되며, 주요한 유전자인 matrix metallopeptidease(MMP)에 의해 조절된다고 알려져 있다. MMP는 피부의 각질 형성세포와, 섬유아세포(fibroblasts)를 비롯한 많은 세포들로부터 분비된 세포외 기질과 기저막을 구성하는 주요단백질 구성요소들을 가수분해함으로서 피부탄력을 유지하는 결합조직을 파괴하여 주름, 탄력저하 및 피부처짐의 원인을 일으키는 것으로 알려져 있다.
그 중 특히 MMP-2는 아연에 의존적인 펩티드 중간분해 효소이며 타입², Ⅳ?콜라겐, 엘라스틴과 같은 세포외 기질의 단백질을 가수분해하여 피부 노화에 중요한 역할을 한다. 한편, MMP-1은 콜라겐에 특이적으로 작용하는 단백질분해효소(proteinase)로, 유전자 발현은 자외선, mitogenic growth factor, proinflammatory cytokine 등에 의해서 촉진되는 것으로 알려져 있다. 또한 이들은 세포내 신호전달 경로를 통해 MMP-1 유전자 발현을 증가시켜 피부에서 교원질의 결핍을 초래시킨다. MMP-1의 활성을 억제하면 콜라겐의 분해를 감소시키며, 피부조직의 탄력을 유지하고, 주름 생성을 예방 및 보습효과를 나타낼 수 있다.
본 실험에서는 피부세포를 1x105 cell/well의 농도로 분주하여 12시간 이상 세포를 부착시켰다. 부착된 세포에 UVB를 조사한 후 괴각 주정 추출물과 고함량 괴각 주정 추출물을 농도별로 처리한 뒤 세포를 떼내어 공지된 방법에 따라 세포 내 MMP-2 및 MMP-1의 발현량을 웨스턴 블롯을 통해 확인하였다. 양성대조군으로 루틴(rutin)과 히알루론산을 사용하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이 고함량 괴각 주정 추출물이 농도 의존적으로 MMP-2를 저해하는 효과가 가장 우수한 것으로 나타났다.
또한, 도 3에 나타낸 바와 같이 UVB를 조사한 그룹에서는 MMP-1이 증가하였으나, 고함량 괴각 주정 추출물을 처리한 결과, 농도 의존적으로 Pro-MMP-1의 발현이 억제되는 것으로 확인되었다. 반면, 괴각 주정 추출물에서는 유의적인 효능을 확인할 수 없었다.
모든 시험군간의 비교는 ANOVA 테스트를 이용하였으며, 통계 처리한 후 신뢰구간(p valued)이 0.05보다 작은 (P<0.05) 통계적인 의의가 있다는 것으로 판정하였다.
실시예 5: 일산화탄소(NO) 생성 저해능
Raw264.7 세포를 96-well plate에 8Х104 cells/well을 seeding한 후 세포가 부착될 때까지 안정화한 후 새로운 무혈청 배지 100 μL로 교체하였다. 이후 50-200 μg/mL의 농도로 각각의 시험물질을 처치하고 1시간 반응시킨 후 LPS를 1 μg/mL로 처치하여 염증을 유발하였다. 37℃, 5% CO2 조건에서 20시간 반응한 후 배양 상등액 50 μL를 취하여 동량의 Griess reagent(Sigma-Aldrich)를 반응시키고 540 nm에서 흡광도를 측정하였으며, Nitrite standard(Promega, WI, USA)를 사용하여 작성한 검량선을 토대로 Raw264.7 세포로부터 생성되는 일산화질소를 정량하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 LPS에 의해 세포는 급격히 증가된 NO 생성을 나타냈으며, 이에 대해 50-200 μg/mL의 농도 범위로 처치한 괴각 주정 추출물(NRA), 고함량 괴각 주정 추출물(NRB)가 유의적인 일산화질소 생성 감소를 보여 항염증 활성이 있는 것으로 확인되었다. 이와 같은 효과는 고함량 괴각 주정 추출물에서 괴각 주정 추출물과 비교해 현저한 것으로 확인되었다.
실시예 6: 에스트로겐 수용체 알파 발현 저해능 평가
에스트로겐 수용체는 알파(ERα)와 베타의 2가지 형태로 나누어진다. ERα는 6번 염색체의 ESR1 유전자에 ERβ는 14번 염색체의 ESR2 유전자에 인코딩(encoding)되어 있다. 이들은 여러 다양한 조직과 세포에 발현되지만 ERα는 주로 뼈, 남성의 생식기, 전립선 등에서 주로 나타나며 ERβ는 방광, 난소, 결장, 면역계 등에서 관찰된다. ERα와 ERβ의 에스트로겐에 의해서 활성화되어서 세포에 다양한 영향을 끼치는 것으로 알려져 있으며, 최근에 사람의 건강에서 이들의 폭 넓은 역할이 규명되면서 여러 약물이나 치료법의 이상적인 표적으로 기대를 모으고 있다.
한편, 에스트로겐 수용체 알파(ERα) 길항작용이 에스트로겐 의존성 유방암 환자에 매우 효과적인 것으로 보고되어 있다.
본 실험에서는 에스트로겐 수용체를 발현하는 인간 유래 세포주(MCF-7)를 사용하였다. 세포는 10% 우태아혈청을 포함하는 DMEM:F12 배지를 1:1로 혼합하여 배양하였고 12-well plate에 세포를 90% 수준(1.5Х106cells/well)으로 시딩한 후 세포가 모두 부착할 때까지 안정화를 하였다. 이 후 새로운 무혈청 배지로 교체한 후 E2(estradiol) 및 시험 물질을 250 μg/mL씩 처치하여 37℃, 5% CO2조건 하에서 24시간 배양한 후 유전자를 추출하여 에스트로겐 수용체 알파의 유전자 수준을 비교 분석하였다. 유전자 분석에 사용한 프라이머의 서열정보를 아래 표 3에 나타내었다.
이에 대한 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, MCF-7 세포에 괴각 주정 추출물 및 고함량 괴각 주정 추출물를 처리하였을 때 E2 처리군에 비해 ERα 발현 수준이 저하되었으며, 특히 고함량 괴각 주정 추출물(NRB)의 효능이 괴각 주정 추출물(NRA)과 비교해 현저한 것으로 확인되었다. 이를 통해, 고함량 괴각 주정 추출물이 호르몬의존성 유방암 억제에 매우 효과적일 것으로 판단할 수 있었다.
실시예 7: 여성 갱년기 증상 개선 활성 평가
MCF7 세포주를 10% 소태아혈청(FBS, fetal bovine serum, Hyclone, UT, USA)이 포함된 Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 (Hyclone)에 100 U/mL의 페니실린과 100 μg/mL의 스트렙토마이신(Thermo Scientific, RO, USA)을 첨가하여 37℃, 5% CO2로 조정된 배양기에서 배양하였다. MCF-7 세포를 12-well plate에 5Х105cells/well로 seeding하였으며 이를 12시간동안 안정화시킨 후 새로운 무혈청 배지로 교체하고 2 uM의 E2 (17β-estradiol, Sigma-Aldrich, MO, USA)와 각각의 시험물질을 200 μg/mL의 농도로 처리하였다. 20시간 반응 후 TRIzol법으로 total RNA를 추출하였다. 즉, TRIzol 용액 1 mL를 첨가하여 세포를 용해시키고 실온에서 5분 반응 후 chloroform 200 ul를 첨가하여 13,500 rpm에서 15분 동안 원심분리 하여 용해하여 실험에 사용하였다.
이에 대한 결과를 도 6에 나타내었다. 정량적인 유전자 발현 분석 결과 고함량 괴각 주정 추출물(NRB) 처리군에서 양성 대조군으로 사용한 E2와 마찬가지로 pS2 유전자 발현을 증가시켜 에스트로겐 수용체를 활성화시키는 것으로 확인되었다.
실시예 8: PPAR-알파 활성화능
인간 유래 세포주(HEK293T)를 10% 우태아혈청을 포함하는 DMEM배지를 사용하여 세포를 배양하였고, 96-well plate에 세포를 90%수준으로 분주한 후 모두 부착할 때까지 안정화한 뒤 시험 물질을 분주 하였다. 그 후 Luciferase plasmid를 trans 하기 위하여 세포를 떼어 낸 뒤 용해(lysis)했다. Luciferase assay reagent를 준비하여, 용해된 세포액 10 ul에 Luciferas assay reagent를 50 ul 분주했다. Firefly luciferase+D-luciferin은 640 nm에서, Renila luciferase + Coelenterazine은 525 nm에서 발광을 확인하여 측정하였다. 양성대조군으로 PPARα 활성화제인 WY41643을 사용하였다.
도 7에 나타낸 바와 같이, PPARα Luciferase activity를 확인한 결과, 고함량 괴각 주정 추출물 100 ug/mL 처리군에서 Luciferase activity가 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
그 다름으로, 인간 유래 세포주(HepG2)를 사용하여 PPARα의 단백질 발현을 평가하였다. 6-well plate에 세포를 90%수준으로 분주한 후 모두 부착할 때까지 안정화한 뒤 시험 물질을 처리하였다. 시험물질을 처리한지 6시간 후 세포를 떼어낸 뒤 용해(lysis)하여 분석하였다. 단백질을 일정하게 정량한 다음 전기영동을 이용하여 단백질을 크기별로 분리하였다. 1차 항체를 부착시킨 다음 2차 항체를 부착 시킨뒤 발광시켜 필름으로 인화하여, 단백질 발현양을 확인했다. 양성대조군으로 녹차 추출물을 이용하였다.
웨스턴 블롯을 이용하여 단백질 발현양을 확인한 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이 고함량 괴각 주정 추출물 처리군에서 PPARα의 단백질 발현양이 CON군 대비 1.4배 증가하는 것으로 확인되었다.
본 발명이 제공하는 괴각 추출물은 소포리코시드를 200mg/g 이상 포함하고 있어, 피부 보습, 염증성 질환, 에스트로겐 수용체 알파 매개성 암, 여성 갱년기 질환, 이상지질혈증, 심혈관계질환 및 비만 등에 매우 우수한 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있어 산업상 이용가능성이 매우 높다.
Claims (13)
- (a) 괴각을 용매로 추출하는 단계; 및
(b) 상기 괴각 추출물에 염석제를 투여한 후 침전물을 수득하는 단계를 포함하는 방법에 따라 제조되고, 소포리코시드(Sophoricoside) 함량이 200mg/g 이상인 괴각 추출물.
- 제1항에 있어서, 상기 용매는 물, 주정, 탄소수 1 내지 6의 알코올 및 이의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 괴각 추출물.
- 제1항에 있어서, 상기 염석제는 염화나트륨(NaCl), 염화칼슘(CaCl2) 및 이의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 괴각 추출물.
- 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 염석제 포화 수용액을 상기 괴각 추출물에 1:0.5 내지 2의 부피비(괴각 추출물:염석제 포화 수용액)로 첨가하는 것을 특징으로 하는 괴각 추출물.
- 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계 이후에 괴각 추출물을 농축하는 단계를 추가로 수행하는 것을 특징으로 하는 괴각 추출물.
- 제1항에 있어서, 상기 추출물은 소포리코시드 함량이 500mg/g 이상인 것을 특징으로 하는 괴각 추출물.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 괴각 추출물을 유효성분으로 포함하는, 피부 보습, 염증성 질환, 에스트로겐 수용체 알파 매개성 암, 여성 갱년기 질환, 이상지질혈증, 심혈관질환 및 비만으로 이루어진 군에서 선택되는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제7항에 있어서, 상기 염증성 질환은 염증성 장 질환, 복막염, 골수염, 봉소염, 췌장염, 외상 유발 쇼크, 기관지 천식, 알러지성 비염, 낭포성 섬유증, 급성 기관지염, 만성 기관지염, 급성 세기과지염, 만성 세기관지염, 골관절염, 통풍, 척추관절병증, 강직성 척추염, 라이터 증후군, 건선성 관절병증, 장질환 척추염, 연소자성 관절병증, 연소자어 강직성 척추염, 반응성 관절병증, 감염성 관절염, 후-감염성 관절염, 임균성 관절염, 결핵성 관절염, 바이러스성 관절염, 진균성 관절염, 매독성 관절염, 라임 병, 혈관염 증후군과 관련된 관절염, 결절성 다발동맥염, 과민성 혈관염, 루게닉 육아종증, 류마티스성 다발성 근육통, 관절 세포 동맥염, 칼슘 결정 침착 관절병증, 가성 통풍, 비-관절 류마티즘, 점액낭염, 건초염, 상과염(테니스 엘보), 신경병증성 관절 질환(neuropathic joint disease), 출혈성 관절증(hemarthrosic), 헤노흐-쉐라인 자반병, 비후성 골관절병증, 다중심성 세망조직구종, 척추측만증(scoliosis), 혈색소증, 혈색소병증, 고지단백혈증, 저감마글로불린혈증, 가족성 지중해열, 베하트 병, 전신성 홍반성 루푸스, 재귀열, 다발성 경화증, 패혈증, 패혈성 쇼크, 급성 호흡곤란 증후군, 다발성 장기부전, 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 급성 폐손상(acute lung injury), 기관지 폐 형성장애(broncho-pulmonary dysplasia) 및 염증성 피부질환으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
- 제7항에 있어서, 상기 에스트로겐 수용체 알파 매개성 암은 유방암, 자궁내막암, 난소암 및 자궁경부암으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
- 제7항에 있어서, 상기 여성 갱년기 질환은 안면홍조, 질 건조증, 발한, 피부건조, 질위축, 하부 요도 위축, 질염, 방광염, 배뇨통, 급뇨, 집중장애, 단기 기억장애, 불안, 신경과민, 기억력 감퇴, 근육통, 관절통 및 골다공증으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 괴각 추출물을 유효성분으로 포함하는, 피부 보습, 염증성 질환, 에스트로겐 수용체 알파 매개성 암, 여성 갱년기 질환, 이상지질혈증, 심혈관질환 및 비만으로 이루어진 군에서 선택되는 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
- (a) 괴각을 용매로 추출하는 단계; 및
(b) 상기 괴각 추출물에 염석제를 투여한 후 침전물을 수득하는 단계를 포함하는, 소포리코시드(Sophoricoside) 함량이 200mg/g 이상인 괴각 추출물의 제조방법.
- 제12항에 있어서, 상기 괴각 추출물은 소포리코시드 함량이 500mg/g 이상인 것을 특징으로 하는 제조방법.
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