KR20220125027A - 부피바카인 리포좀 기반의 리포좀 약물전달체 제조방법 및 이에 의해 제조된 서방형 제제 - Google Patents

Abstract

본 발명은, (a) 유기 용매에 양친매성 지질과 음전하 지질과 콜레스테롤을 용해시켜 유기상을 형성하는 단계; (b) 수용액에 부피바카인-HCl 분말을 혼합하고 교반하여 부피바카인 함유 수상을 형성하는 단계; (c) 상기 (a) 단계에서 형성된 유기상에 상기 (b) 단계에서 형성된 부피바카인 염산용액을 첨가하고 균질기를 활용하여 유화시켜 w/o 에멀젼을 합성하는 단계; 및 (d) 상기 w/o 에멀젼에서 유기용매를 감압하에 회전 증발시켜 제거하고 최종 리포좀 수 용액을 형성하고, 유리된 약물을 제거하여 부피바카인이 캡슐화된 리포좀을 형성하는 단계를 포함하는 부피바카인 리포좀 기반의 리포좀 약물전달체 제조방법 및 이에 의해 제조된 서방형 제제를 제공한다.

Description

부피바카인 리포좀 기반의 리포좀 약물전달체 제조방법 및 이에 의해 제조된 서방형 제제{A manufacturing method for liposom drug delivery structure based on liposomal bupivacaine and slow release preparation}

본 발명은 리포좀 약물전달체에 관한 것으로, 보다 상세하게는 부피바카인을 리포좀에 성공적으로 캡슐화하여 체내 구조 안정성을 강화하고 지속적이고 안정적인 약물 방출에 따른 효과적인 진통제어 효과를 제공하는 리포좀 약물전달체 및 그 제조방법에 관한 것이다.

외과수술에 있어 최소침습수술은 거의 모든 분야에 걸쳐 적용되고 있고, 최소침습수술은 상처 절개 범위를 감소시켜, 환자의 통증과 스트레스를 줄이고 회복 속도를 빠르게 할 수 있다.

현재의 최소침습수술 기술 수준은 여전히 3~5cm 정도의 절개를 필요로 하기 때문에, 이로 인한 통증은 수술 수 환자가 호소하는 가장 주요한 불편 사항일 뿐만아니라 수술 후 스트레스의 주원인이 된다.

이에 수술 후 통증 관리는 임상의에게 중요한 문제이다. 왜냐하면, 제대로 통제되지 않은 수술후 통증은 약물로 인한 부작용과 만성 통증, 입원 및 재정적 비용의 발생을 증가시키고 환자 만족도를 감소시키는 것으로 알려져 있기 때문이다.

따라서, 수술 후 통증 조절을 위한 다양한 양식이 개발되고 수행되었다.

그러나, 수술을 받는 대부분의 환자들은 여전히 상당한 수술 후 통증을 경험하고 있으며 수술 후 통증의 메커니즘은 여전히 불분명하다.

현재, 더 나은 수술후 통증 관리를 위해 다양한 종류의 약물과 기술을 통한 복합 진통 요법이 권장되고, 수술 전후 통증 관리의 필수구성요소가 되었다.

사용되는 요법 중 수술 부위에 국소 마취제를 적용하는 것은 편리한 적용, 안전성 및 저렴한 비용으로 인해 널리 사용되고 점점 더 많이 사용되고 있다.

또한, 전신 마취제의 사용과 그 합병증, 입원, 환자 만족도를 높이는 이론적 이점이 있다.

부피바카인(bupivacaine)은 가장 일반적으로 사용되는 국소 마취제 중 하나이며, 전압 게이트(voltage-gated) 나트륨 채널과 NMDA 수용체를 억제하여 미국식품의약국(FDA)에서 승인한 국소 마취제 중에서 가장 오래 지속되는 작용을 한다.

그러나, 수술 후 통증은 부피바카인의 진통 기간(에피네프린(epinephrine) 없이 2-4 시간)을 넘어서 확장되며, 이는 임상 환경에서 수술 전후 통증 조절을위한 부피바카인 투여에 장애가 된다.

진통 기간을 연장하기 위해 덱사메타손(dexamethasone) 및 덱스메데토미딘(dexmedetomidine)과 같은 보조제를 적용하고 국소 마취제의 지속 방출과 같은 다양한 방법이 제안되고 시도되었다.

이 중 부피바카인을 캡슐화한 리포좀 이중층이 포함된 주사형 현탁액(suspension)인 Exparel은, 부피바카인의 작용 지속 시간을 연장하는 것으로 입증되어 미국식품의약국(FDA)에서 임상 사용 승인을 받았다.

하지만 Exparel은 복잡한 이중 유화 공정으로 생산되고, Exparel의 성공적인 형성을 위해서는 값비싼 중성 지질(예, triglyceride(트리글리세라이드))이 지질 성분에 포함되어야 한다.

따라서, 이러한 단점을 극복하기 위해 지질 기반의 장시간 작용하는 부피바카인을 개발하려면 더 간단하고 비용이 적은 공정이 요구된다.

대안으로, 우리는 오래 지속되는 마취제에 단층 리포좀을 쉽게 사용할 수 있으며, 리포좀 구조는 대량 생산에 적합하고, 간단하고 비용 효율적인 공정으로 쉽게 생산할 수 있다.

EXPAREL과 같은 일반적인 다방포성 리포좀보다 오래 지속되는 마취제를 개발할 수 있는 잠재력을 가지고 있는 다른 특성 (예 : 지질 조성, 약물 함량, 소포 크기, 구조적 형태)을 가진 개별 단층 리포좀도 개발하고, 후처리를 통해 추가로 조립할 수 있다.

또한, 단층 리포좀은 많은 양의 약물이 쉽게 로드될 수 있을 때 활성 약물의 국소 조직 노출을 증가시키는 데 매우 유용 할 수 있다.

그러나 현재까지 단층 리포좀에서 마취제 캡슐화에 대한 연구는 거의 없다.

그것은 우리가 복잡하게 제조된 다방포성 리포좀의 성능에 비교될 수 있는 성능의 부피바카인이 적재된 단층 리포좀을 개발할 필요가 있다.

한국공개특허 10-2006-0012027호(2006.02.06. 공개) 한국등록특허 10-2168204호(2020.10.14. 등록)

본 발명은 전술한 바와 같은 요구를 반영한 것으로, 부피바카인을 리포좀에 성공적으로 캡슐화하여 체내 구조 안정성을 강화하고 지속적이고 안정적인 약물 방출에 따른 효과적인 진통제어 효과를 제공하는 리포좀 약물전달체 제조방법 및 이에 의해 제조된 서방형 제제에 관한 것이다.

이를 위해, 본 발명은, (a) 유기 용매에 양친매성 지질과 음전하 지질과 콜레스테롤을 용해시켜 유기상을 형성하는 단계; (b) 수용액에 부피바카인-HCl 분말을 혼합하고 교반하여 부피바카인 함유 수상을 형성하는 단계; (c) 상기 (a) 단계에서 형성된 유기상에 상기 (b) 단계에서 형성된 부피바카인 염산용액을 첨가하고 균질기를 활용하여 유화시켜 w/o 에멀젼을 합성하는 단계; 및 (d) 상기 w/o 에멀젼에서 유기용매를 감압하에 회전 증발시켜 제거하고 최종 리포좀 수 용액을 형성하고, 유리된 약물을 제거하여 부피바카인이 캡슐화된 리포좀을 형성하는 단계를 포함하는 부피바카인 리포좀 기반의 리포좀 약물전달체 제조방법 및 이에 의해 제조된 서방형 제제를 제공한다.

또한, 상기 (a) 단계에서, 상기 유기용매는 클로로포름, 에탄올, diethyl ether(디에틸에테르), ethyl acetate(에틸 아세테이트), ethyl ether(에틸 에테르), methanol(메탄올), isopropyl ether(이소프로필 에테르) 중의 어느 하나 또는 이들의 조합에서 선택될 수 있다.

또한, 상기 (a) 단계에서, 상기 양친매성 지질은 DOPC, phosphatidylcholine(포스파티딜콜린), Soy phosphatidylcholine, Egg phospholipid, synthetic phosphatidylcholine 중의 어느 하나가 선택될 수 있다.

또한, 상기 (a) 단계에서, 상기 음전하 지질은 DPPG, phosphatidylglycerol(포스파티딜 글리세롤), POPG(2-oleoyl-1-pamlitoyl-sn-glyecro-3-glycerol) 중의 어느 하나가 선택될 수 있다.

또한, 상기 (a) 단계에서, 첨가되는 양친매성 지질: 음전하 지질: 콜레스테롤은 각각 중량% 범위에서 5:1:5인 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 (b) 단계에서, PBS 수용액에 부피바카인-HCl 분말을 녹였으며, 이때 상기 PBS 수용액은 농도는 0.1X 이하 인것을 특징으로 한다.

또한, 상기 (c) 단계에서, 상기 w/o 에멀젼을 초음파 처리하여 균질한 분산액을 형성하는 단계를 더 포함할 수 있다.

또한, 상기 (d) 단계에서, 상기 부피바카인이 캡슐화된 리포좀에서, 상기 리포좀 내부와 외부의 삼투압 농도가 동일하도록 조절하는 단계를 더 포함할 수 있다.

또한, PBS의 이온 조성을 확인하고, 몰 수 계산을 통해 상기 리포좀 내부와 외부의 삼투압 농도가 같도록 상기 리포좀을 등장성 PBS에 재현탁하는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 (d) 단계에서, 상기 유리 약물의 제거는 원심 분리를 이용한 세척방법 또는 투석 백을 이용하는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 EXPAREL(15mg/ml)의 약물 농도보다 두 배 이상 높은 고농축 부피바카인 (30mg/ml)을 리포좀에 성공적으로 캡슐화하고 삼투압이 균형 잡힌 대형 단층 리포좀(직경 ~ 6μm)을 합성함으로써, 기존의 다소포 리포좀 기반의 진통제보다 향상된 지속적이고 안정적인 약물 방출이 가능하고, 이에 따른 효과적인 진통 제어 효과를 구현할 수 있게 한다.

이를 통해, 부피바카인 리포좀은 쥐 모델에서 진통 효과를 보였으며, 부피바카인 단독에 비해 진통 기간이 증가함을 확인할 수 있다.

가령, 수술 후 최대 24 시간까지 수술 후 통증을 감소시켰으며, 이는 240 분까지 진통 효과를 보여주는 부피바카인보다 더 길다는 것을 입증하였다.

또한, 부피바카인과 비교하여 부피바카인 리포좀은 수술 후 180분과 240분에 더 나은 진통 효과를 보였다.

또한, 무독성 알코올, 가령, 에탄올을 기반으로 한 본 발명의 역상 증발법은 부피바카인이 적재된 리포좀을 간단하고 생산공정과 이를 통한 비용 절감의 효과를 제공할 수 있게 한다.

또한, 삼투압이 쉽게 균형을 이루어 확장된 단일층 리포좀의 구조적 안정성과 유통 기한 연장 (> 1 개월)을 개선하였다.

가령, in vitro 릴리스(release) 프로파일은 부피바카인이 적재된 리포좀의 방출 기간(release duration)이 최대 6일까지 연장되었음을 확인하였다.

또한, in vivo(생체 내 연구)를 위해 수컷 Sprague-Dawley 쥐를 절개 통증 모델에 사용하여 수술 후 통증을 시뮬레이션하고 von Frey 필라멘트를 사용하여 기계적 금단 역치(MWT, mechanical withdrawal threshold))를 측정하였다.

이를 통해, 정상 식염수를 발바닥에 투여 한 대조군에 비해 리포좀 부피바카인 군은 초기 증가된 MWT가 24 시간까지 점진적으로 감소하는 것으로 나타났으며, 중요한 것은 부피바카인보다 본 발명에 따른 부피바카인 리포좀의 진통 효과가 6 배 더 오래 유지되었으며, 이것은 효과적이고 오래 지속되는 마취제의 잠재력을 입증하는 것이다.

도 1은 지속적인 부피바카인 방출 및 이후의 장기간의 통증 완화를 위해 고도로 농축된 부피바카인(최대 30mg/mL)을 캡슐화한 삼투적으로 균형 잡힌 큰 단층 리포좀(직경 ~ 6μm)의 개략도이다.
도 2는 부피바카인이 적재된 리포좀의 특성화 및 시험관 내 약동학 연구를 나타낸 도면이다.
도 3은 부피바카인 및 부피바카인 리포좀의 진통 효과 평가를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 부피바카인 리포좀 기반의 리포좀 약물전달체의 제조방법 및 이에 의해 제조된 서방형 제제에 관한 것으로, 재료(소재)개발부터 실험자체(in vivo), 어플리케이션(응용) 개발, 실험 분석 과정(in vitro) 과정에서 전반적으로 살펴본다.

이하에서 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 부피바카인 리포좀 기반 리포좀 약물전달체 제조방법 및 이에 의해 제조된 서방형 제제에 대하여 자세히 설명한다.

도 1은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 고도로 농축된 부피바카인(최대 30mg/mL)을 캡슐화한 삼투적으로 균형 잡힌 큰 단층 리포좀(직경 ~ 6μm)의 개략도이고, 고도로 농축된 부피바카인 적재 단층 리포좀의 개발과 생체 내 효능을 보여준다.

도 1을 참조하면, 부피바카인은 전압 게이트(voltage-gated) 나트륨 채널에 결합하여 나트륨 유입을 차단하여 통증 신호의 전도를 방지한다.

또한, EXPAREL(15mg/mL)의 약물 농도보다 두 배 이상 높은 고농축 부피바카 인(30mg/mL)을 대형 단층 리포좀(직경 ~ 6μm)에 성공적으로 캡슐화했다.

특히, 중요한 것은 소포 내 삼투압과 소포 외 삼투압의 균형을 유지함으로써 부피바카인 적재된 리포좀의 안정성이 완전히 확보되어 부피바카인 적재된(loaded) 리포좀의 저장 수명이 크게 연장되었다(> 한 달).

그러나, 삼투압이 불균형해졌을(unbalanced), 리포좀 소포가 부피바카인을 방출하기 시작했고 약물 방출은 최대 6일까지 지속되었다.

EXPAREL의 생산은 중성 지질을 포함한 값 비싼 자원을 필요로하는 복잡한 2 단계 이중 에멀젼 공정에 의존한다. 반면에, 본 발명에서 안정적이고 큰 단층 리포좀은 중성 지질이 없는 1 단계 역상증발(reverse-phase evaporation) 방법으로 생산할 수 있어 더 나은 경제적 효율성을 보여줄 수 있다.

또한, 부피바카인의 지속적인 전달을 위한 안정성을 향상시키기 위해 삼투압을 정밀하게 조정한 고농도의 부피바카인을 포함하는 큰 단층 소포를 성공적으로 제조하였다.

또한, 생체 내 부피바카인 리포좀의 진통 기간을 평가하기 위해 수컷 Sprague-Dawley 쥐를 사용하여 von Frey 필라멘트로 기계적 금단 역치(MWT)를 측정하였다.

부피바카인이 적재된 리포좀의 특성화에 이어, 쥐에 적용한 후 시험관 내 방출 거동 및 생체 내 효능을 철저히 조사하고 부피 바카인만 함유한 용액과 비교하였다.

결과는 부피바카인의 지속 시간이 24 시간까지 상당히 연장된 반면 부피바카 인 용액의 지속 시간은 훨씬 더 빠르다는 것을 보여준다. 부연하면, 생체 내 연구에서, 고도로 농축된 부피바카인 적재된 단층 리포좀은 수술 후 최대 24 시간까지 진통 효과를 나타냈었고, 부피바카인만 있는 것과 비교했을 때, 리포좀 현탁액은 6 배 더 오래 지속되는 마취제가 될 수 있다.

따라서, 부피바카인 리포즘이 부피바카인보다 더 강화된 진통 효과를 보여 주었으며, 지속적인 부피바카인 방출 및 이후의 장기간의 통증 완화를 보여준다.

<재료 및 방법>

1.1 부피바카인 리포좀의 제조 및 특성화

1.1.1 재료

1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC), 콜레스테롤 및 부피 바카인 하이드로 클로라이드는 모두 Sigma (St Louis, MO, USA)에서 구입하였다.

1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포글리세롤(DPPG)은 Cayman (Ann Arbor, MI, USA)에서 구입하였다.

1.1.2 부피바카인 리포좀의 제조

본 발명에 따른 부피바카인 리포좀 기반 리포좀 약물전달체는, 약물로는 국소마취제 중 하나인 부피바카인이 사용되고, 부피바카인을 리포좀 기반의 다소포성 분자 구조체(muti-vesicle structure)로 합성한다.

이때, 리포좀은 Szoska 등에 의해 개발된 역상 증발 방법(reverse-phase evaporation method)을 기반으로 1회 유화공정(Emulsification process)를 이용하여 제조되었다.

먼저, 유기 용액은 다음과 같이 합성되었다. 즉, 100mg의 DOPC, 100mg의 콜레스테롤 및 20mg의 DPPG를 100ml 둥근 바닥 플라스크에 20ml의 클로로포름/에탄올(1:1, v/v)에 용해시켰다. 이때, 유기 용매는 클로로포름과 에탄올을 1:1 부피비로 혼합하였다. 여기서, 에탄올뿐만 아니라 diethyl ether(디에틸에테르), ethyl acetate(에틸 아세테이트), ethyl ether(에틸 에테르), methanol(메탄올), isopropyl ether(이소프로필 에테르), 그리고 위 물질들의 혼합물이 가능하며, 클로로포름과 에탄올의 부피비에 있어서도 1:1 범위에 한정되는 것이 아니라 적어도 에탄올은 50% 이상의 부피비를 가지는 것이 바람직하다.

상기 양친매성 지질로 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC)을 사용하였고, 음하전 지질은 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포글리세롤(DPPG)를 사용하였고, 양친매성 지질과 음하전 지질 혼합물에 추가적으로 콜레스테롤을 첨가하여 다소포성 분자 구조체의 안정성을 강화시킬 수 있다. 이때, 상기 양친매성 지질은 DOPC 뿐만 아니라 phosphatidylcholine(포스파티딜콜린)이면 모두 가능하다. 또한, Soy phosphatidylcholine, Egg phospholipid, 다양한 synthetic phosphatidylcholine도 가능하다.

또한, 음하전 지질은 DPPG 이외에도 마찬가지로 phosphatidylglycerol(포스파티딜 글리세롤) 종류면 어느 것이든 가능하며, POPG(2-oleoyl-1-pamlitoyl-sn-glyecro-3-glycerol) 등이 가능하다.

이어, 수용액은 부피바카인-HCl 분말을 첨가하고 교반하여 부피바카인 함유 수상을 형성한다. 즉, 부피바카인-HCl 용액(0.1X PBS, 30mg/ml 부피바카인-HCl)을 형성한다. 이때, 0.1X PBS(인산염 완충 식염수) 수용액에 부피바카인을 녹였으며, 이때 0.1X보다 더 묽은 PBS 용액에 녹여도 문제가 없다.

이때, PC: PG: cholesterol이 5:1:5 (무게비, wt%)가 가장 바람직하다. 또한, 총 지질(lipid)의 무게/수용액의 비율이 20mg/ml이상이 되기만 하면 상관없으며, 최적의 조건으로, 40mg/ml이 되도록 부피바카인 수용액의 부피를 정하였다.

여기서, 20ml의 유기용매(클로로포름/에탄올)에서, 지질/유기용매의 비율이 10mg/ml 이상이 되도록 하여야하므로, 최적의 비율이 11mg/ml로 설정하여 20ml의 유기용매를 사용하였다.

생성된 2상 시스템을 욕조형 초음파 처리기에서 5분 동안 간단히 초음파 처리하였다.

그 다음, 에탄올과 클로로포름을 감압하에 회전 증발시켜 40℃에서 제거하여 최종 리포좀 수 분산액(liposome aqueous dispersion)을 형성하였다.

유리 약물(free drug)을 소포(vesicles)로부터 분리하기 위해 리포좀을 0.94×PBS(phosphate-buffered saline)로 3회 세척하였고 2000×g에서 원심분리하여 획득하였다. 이때, 원심분리를 이용한 세척방법 뿐만아니라 투석 백(dialysis bag)을 이용하여 unencapsulated drug를 제거할 수 있다.

세척 후, 리포좀을 0.94×PBS의 4ml에 재현탁하여 대략 5mg/ml의 부피바카인 농도를 갖는 리포좀 현탁액(suspension)을 수득하였다. 이때, 리포좀 내부는 0.1X PBS, 30mg/ml 부피바카인, 리포좀 외부는　0.94X PBS을 갖는다. 또한, PBS의 이온 조성을 확인하고, 몰 수 계산을 통해 리포좀 내부와 외부의 osmolarity(삼투압 농도, 용액중의 삼투압 활성입자의 농도)가 같도록 맞추었다. 만약 30mg/ml 보다 고농도의 부피바카인을 encapsulation한다면 리포좀 내부의 osmolarity가 더욱 증가하였으므로 이에 맞추어 리포좀 외부 농도를 다시 계산하여 등장성 용액으로 만들어야 한다.

이처럼 리포좀 내/외부의 osmolarity를 같게 조절하여, 같게 조절하지 않았을 때보다 unilamellar 리포좀의 stability 및 shelf life를 대폭 강화시킬 수 있다.

1.1.3. 부피바카인 리포좀의 특성화

형태는 광학 현미경(Leica DM 4000M)으로 추정되었다.

입자 크기는 입자 크기 분석기(Malvern Zetasizer)로 측정되었다.

1.1.4. 캡슐화 효율 결정

약물 캡슐화 효율은 캡슐화된 부피바카인(Den)의 양과 제제(preparations) 내 부피바카인의 총량(Dtot)을 비교하여 결정되었다.

리포좀에서 부피바카인을 추출하기 위해 0.1mL의 리포좀 현탁액을 10mL 추출 용액 (0.2 % Triton X-100, 28% 에탄올, 71.8% 물, v/v)에 용해시켰다.

그 후, 현탁액 내 약물의 총 함량 (Dtot)을 HPLC로 정량하였다.

유리 약물(Dfree)을 원심 분리 (2000×g, 10분)에 의해 펠릿(pellet)으로부터 분리하고 HPLC로 정량하였다.

캡슐화 효율은 다음 방정식에 의해 추정(측정)되었다.

En(%) = (Dtot-Dfree)/Dtot × 100

1.1.5 체외 방출(In vitro release)

부피바카인-리포좀의 시험 관내 약물 방출은 투석 백(MW cutoff 10K)을 사용하여 결정되었다.

2ml의 리포좀 현탁액을 200ml 0.94X PBS를 포함하는 플라스크에 있는 투석 백으로 옮겼다.

플라스크를 일정한 교반하에 37℃에서 배양하였다.

각 시점 (3, 8, 24, 72, 120 및 144h)에서 샘플을 수집하고 HPLC 분석(assay)으로 분석했다.

1.2. 부피바카인 리포좀의 생체 내 적용(In vivo application of liposomal bupivacaine)

여기서, 실험 프로토콜은 중앙대학교 동물 관리 및 사용위원회(2020-00131)의 검토 및 승인을 받았다.

모든 실험은 국립 보건원에서 수립한 지침, 실험실 동물 사용에 대한 국제 통증 연구 협회의 정책 및 ARRIVE (동물 연구보고 In Vivo Experiments) 성명서의 권장 지침에 따라 수행되었다.

가령, 방법(methods)은, 수컷 Sprague-Dawley 쥐(250-300g)가 수술후 통증을 시뮬레이션하는 절개 통증 모델에 사용되었다. 또한, 수술 후 절개 부위에 생리 식염수, 부피바카인, 리포좀 부피바카인을 주입하였다. 기계적 금단역치(withdrawal threshold)는 폰 프레이 필라멘트(von Frey filament)로 측정되었다.

이를 통해 결과적으로, 기계적 금단역치(MWT, mechanical withdrawal threshold)는 부피바카인과 리포좀 부피바카인을 투여받은 그룹에서 유의하게 증가하였다. 또한, MWT는 대조군에 비해 리포좀 부피바카인 그룹에서 최대 24시간, 부피바카 인 그룹에서 최대 120분까지 감소하였다. 부피바카인 그룹과 비교하여, 리포좀 부피바카인 그룹의 경우 180분 및 240 분에 MWT의 상당한 증가가 관찰되었다.

1.2.1 동물 준비

250 ~ 300g의 성인 수컷 스프라그-돌리래트(Sprague-Dawley rats) (한국 서울 소재 Coretec Laboratories)를 사용하였다.

실험 연구 전에 쥐를 1주일 동안 집락 실(colony room)에서 습관화하고 12:12 시간의 명암 주기로 22 ± 0.5℃의 온도에서 각 케이지에 두 마리의 쥐를 수용하였고, 음식과 물은 자유롭게 사용할 수 있었다.

호르몬 변동이 통증 역치에 영향을 미칠 수 있기 때문에 암컷 쥐는 포함되지 않았으며, 그리고 이상을 보이는 쥐는 제외되었다.

1.2.2 그룹 할당 및 실명

부피바카인 리포좀과 부피바카인의 진통 효과를 평가하기 위해 쥐를 무작위로 각 그룹으로 나누었다.

랜덤 할당은 PASSTM 11 소프트웨어(NCSS, Kaysville, UT, USA)를 사용하여 Wei의 Urn 모델을 적용한 컴퓨터로 생성된 테이블을 기반으로 한다.

무작위화 코드는 연구에 달리 관여하지 않은 통계학자에 의해 생성되었다.

할당 은닉을 위해 이 연구에 참여하지 않은 다른 연구자는 실험용 연구 약물이 포함된 주사기를 준비하였다.

발바닥 내 적용(intra-plantar application)을 위해 0.2 mL의 생리 식염수 또는 연구 약물을 포함하는 1 mL 주사기를 준비했다.

주사기를 불투명 테이프로 덮고 각 실험의 무작위 목록에 따라 순차적으로 번호를 매겼다.

준비된 주사기는 수술 담당 연구원에게 전달되었고, 이 연구원은 수술에만 참여했고 그룹 과제에서는 블라인드(blind) 처리하였다.

1.2.3 수술 절차

모든 수술 절차는 무균 상태에서 수행되었고, 쥐는 마취를 위해 전신 마취를 받았다.

쥐가 움직이지 않을 때까지 밀봉된 투명한 플라스틱 챔버 내부의 100% 산소에서 6% 이소플루란(isoflurane)으로 전신 마취를 유도했다.

그런 다음 수술이 끝날 때까지 100% 산소에 1% ~ 3% 이소플루란을 사용하여 비 호흡 마취 회로 마스크에 유지하여 수술 과정에서 쥐가 고통받는 것을 방지했다.

Cefazolin (20mg/kg; 종근당 제약(주))은 절개 전에 피하 투여하였다.

각 쥐의 왼쪽 뒷발 발바닥 표면은 수술을 위해 무균적으로 준비되었다.

절개 통증 모델은 보고된 기술을 약간 수정하여 이전에 설명한대로 생성되었다.

간단히 말해서, 왼쪽 뒷발 발바닥 표면의 경골 관절에서 약 0.5cm 먼 지점에서 손가락으로 확장되는 1cm 길이의 피부 절개를 칼날로 만들었다.

족저근을 분리하고 약간 올린 다음 세로로 절개하였다.

준비된 주사기의 연구 약물을 건조된 부위의 절개 부위에 적용하였다.

절개는 5-0 나일론으로 된 두 개의 가로 매트리스 봉합사로 봉합되었다.

모든 쥐를 회복시키고 수술 후 3일째에 봉합사를 제거하였다.

1.2.4 샘플 크기 계산

측정된 주요 결과는 von Frey 필라멘트를 사용한 기계적 자극에 대한 철수 임계값(withdrawal threshold)이었다.

부피바카인과 부피바카인 리포좀의 항 통각 활성(antinociceptive)을 평가하는 연구를 위한 그룹 크기를 추정하기 위해 6마리의 절개 통증 모델 쥐(그룹 C)에서 MWT를 측정하기 위한 파일럿 연구를 수행하였다.

기본, 30분, 60분, 90분, 120분, 180분, 240분, 24시간, 48시간 및 수술 후 1주에서 자연로그 변환된 MWT의 평균은 4.68, 1.49, 2.05, 2.05, 2.04, 2.52, 2.49, 2.41 3.04 및 3.70 ln (mN) 이다.

자연로그 변환된 MWT의 표준 편차는 0.06 ~ 0.89 범위였으며, 동일한 개인에 대한 인접한 측정 간의 자기 상관은 0.7이었다.

검정력(power calculation) 계산을 위해 1차 자기 상관이 자기 상관 패턴을 적절하게 표현한다고 가정하였다.

그룹 간 차이를 비교하기 위해 ANOVA의 반복 측정에 대해 Geisser-Greenhouse Corrected F 검정을 사용할 계획이다.

우리는 그룹 C에 비해 그룹 B 및 LB에서 MWT의 50% 및 60% 증가를 감지하고자 하였다.

α가 0.05이고 검정력이 80%인 경우 그룹당 10 마리의 쥐가 필요하다고 결정되었다.

20% 추적 손실을 고려하여 본 발명에서는 총 36 마리의 쥐를 활용하였다.

1.2.5 통계 분석

Shapiro-Wilk 테스트는 변수의 정규성을 테스트하는 데 사용되었다.

MWT가 Shapiro-Wilk 테스트를 통과하지 못했기 때문에 자연 로그 변환이 수행되었고, 자연 로그 변환 변수가 Shapiro-Wilk 테스트를 통과하였다.

따라서, 우리는 모수 검정에 대한 정규 분포 가정이 위반되지 않는다고 가정하고 반복 측정 ANOVA를 적용하기로 결정하였다. 이때, 피험자 내 시간 계수 (기본, 30 분, 60 분, 90 분, 120 분, 180 분, 240 분, 24 시간, 48 시간 및 1 주 후) 및 그룹의 개체 간 요인(그룹 C, 그룹 B 및 그룹 LB)이 해당된다.

Mauchly의 구형도 검정은 MWT 검정 (χ2 (44) = 179.32, P <0.001, Mauchly의 W = 0.002)에서 구형도 가정을 위반했음을 나타내었기 때문에, 일원 Wilk의 분산 다변량 분석(MANOVA)을 사용하였다. 이때, 각 그룹 (그룹 C, 그룹 B 및 그룹 LB) 및 각 시점 (기본, 30 분, 60 분, 90 분, 120 분, 180 분, 240 분, 24 시간, 48 시간 및 1 주 후) 독립적 (수술 후 기준, 30 분, 60 분, 90 분, 120 분, 180 분, 240 분, 24 시간, 48 시간 및 1 주 후) 각 시점에서의 인자 및 MWT에 해당된다.

각 시점에서 MWT를 비교하기 위해 Bonferroni 보정 (α = 0.05 / 10 = 0.005)과 함께 분산의 일 변량 분석 (ANOVA)을 사용하였다.

또한, Ln (MWT)에 대한 그룹 간 차이는 선형 혼합 효과 모델(LMEM)을 사용하여 분석되었으며, 이는 시간 (기본, 30 분, 60 분, 90 분, 120 분, 180 분, 240 분, 수술 후 24 시간, 48 시간 및 1 주) 및 그룹을 독립적인 고정 인자로, 개별 환자를 무작위 효과로 사용한다.

개별 측정은 평균 ± 표준 오차로 표현되고 SPSS 23.0 (IBM Corp., Armonk, NY, USA)으로 분석되었다. 0.05 이하의 P- 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.

<결과>

2.1 부피바카인 리포좀의 제조 및 특성화

역상 증발 기술을 사용하여 우리는 부피바카인이 로드된 리포좀을 고효율로 성공적으로 준비하였다.

박막 수화 대신 약물 로딩의 효율성을 높이기 위해 역상 증발을 사용했으며, 리포좀 제조에 일반적으로 사용되는 디에틸 에테르 대신에 이 생체 적합성 용매의 잔류물이 생성되기 때문에 유기 용매로 에탄올을 선택하였다. 이때, 리포좀은 인체 건강에 가능한 위험을 유발하지 않는다.

구체적으로, 부피바카인 함유 수상과 지질에 용해된 유기상을 혼합하여 2상 시스템을 준비하였다.

다음으로 혼합물을 초음파 처리하여 균질한 분산액을 형성하고, 유기 용매를 천천히 증발시킨 후 리포좀 함유 수성 현탁액을 남겼다.

포획되지 않은 부피바카인은 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척할 수 있으며, 부피바카인이 적재된 리포좀은 원심 분리에 의해 수확되었다.

제형화된 소포의 안정성과 저장 수명을 개선하기 위해 삼투압의 균형을 맞추는 것이 매우 중요하므로 세척된 리포좀을 등장성 PBS에 재현탁하였다.

리포좀 현탁액의 최종 부피바카인 함량은 약 5mg/ml였으며, 이는 상업적 부피바카인 약물과 유사한 농도이다.

우리는 체외 약물 방출 프로파일을 이후에 조사한 부피바카인 로드된 리포좀을 특성화하였다.

도 2는 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 부피바카인이 적재된 리포좀의 특성화 및 시험관 내 약동학 연구를 나타낸 도면이다.

도 2(A)는 500X 배율에서 부피바카인이 로딩된 리포좀의 광학 현미경 이미지이며, 스케일 바 = 5μm이다. 도 2(A)를 참조하면, 유사한 크기 분포를 가진 구형인 준비된 리포좀의 형태를 보여준다..

도 2(B)는 부피바카인 로딩된 리포좀 현탁액의 입자 크기 분포를 나타낸 그래프이다. 도 2(B)에서, 광학 현미경 관찰과 유사하게, 동적 광산란 측정은 리포좀의 크기가 서로 유사하다는 것을 확인하여 5560nm의 평균 입자 크기를 중심으로 한 단일 좁은 피크를 산출하였다.

도 2(C)는 캡슐화 효율을 추정하기위한 유리 부피바카인(파란색) 및 총 부피 바카인(빨간색)의 크로마토그램으로, 부피바카인은 262nm에서 UV 검출기를 사용하여 모니터링되었다.

도 2(C)에서 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 약물 캡슐화 효율을 계산하였다. 우리는 포획되지 않은 부피바카인(파란색)과 총 부피바카인(적색)의 양을 정량화했으며, 표 1은 세 가지 다른 배치에서 부피바카인 적재된 리포좀의 캡슐화 효율(Entrapment Efficiency)을 나타낸 것으로 최대 캡슐화 효율은 25.8%로 결정되었다.

배치 넘버(Batch Number)	최대 캡슐화 효율(%)
1	25.8
2	24.2
3	20.1

도 2(D)는 부피바카인 로딩된 리포좀의 시험 관내 방출 프로파일을 나타낸 그래프이다.

도 2(D)에서 약물 로딩된 리포좀에서 부피바카인의 체외 방출 프로파일을 나낸 것으로, 도 2(D)를 참조하면, 24 시간 이내에 87.9%의 부피바카인이 리포좀에서 방출되는 것으로 감지되었으며, 평형에 도달하기 전에 부피바카인이 적재된 리포좀의 방출 기간이 최대 6일까지 연장되었다.

2.2. 부피바카인 리포좀의 생체 내 적용

모든 쥐가 본 연구를 완료하였으며, 실험 기간 동안 쥐는 몸단장을 잘 유지하고 정상적인 양의 음식과 물을 섭취하는 것으로 나타났다.

절개 부위의 체중 부하가 손상된 것을 제외하고는 보행은 영향을 받지 않은 것처럼 보였으며, 어떤 쥐도 수술 상처의 합병증이 없었다.

도 3은 부피바카인 및 부피바카인 리포좀의 진통 효과 평가를 나타낸 그래프이다. 이때, 도 3의 그래프는 von Frey 필라멘트를 사용한 로그 변환 MWT의 평균 ± 표준 오차로 표시된다. 또한, 베이스는 베이스 라인, MWT는 기계적 철수 임계값을 나타내며, * 대조군과 비교하여 P <0.05, † 부피 바카 인 그룹과 비교하여 P <0.05 이다.

도 3을 참조하면, 수술 후 기본, 30분, 60분, 90분, 120분, 180분, 240분, 24 시간, 48 시간 및 1 주에서 측정된 Ln (MWT)의 변화를 보여준다.

MANOVA의 결과는 그룹 간에 통계적으로 유의한 차이를 나타냈다.(F [20.00, 48.00] = 4.282, P <0.001 : Wilk 's lamda = 0.129, 부분 η2 = 0.641).

Base의 MWT는 그룹간에 크게 다르지 않았다.

그룹 LB의 30, 60, 90, 120, 180, 240분 및 24 시간에서의 MWT와 그룹 B의 30, 60, 90 및 120 분에서의 MWT는 그룹 C에 비해 현저하게 증가하였다.

그룹 B에 비해 MWT의 상당한 증가가 그룹 LB의 180 분 및 240 분에서 관찰되었다.

LMEM은 군간에 유의한 차이를 보였다(F [2, 236.51] = 20.90, P <0.001).

그룹 C와 비교하여 그룹 B와 LB에서 유의한 차이가 있었다(평균 (MD) 0.25 [0.11 ~ 0.39] 및 p <0.001; 0.45 [0.31 ~ 0.59], p <0.001).

2. 3. 토의

이상에서 살펴본 바와 같이, 부피바카인 리포좀이 수술 후 최대 24 시간까지 수술 후 통증을 감소시켰으며, 이는 240 분까지 진통 효과를 보여주는 부피바카인보다 더 길다는 것을 입증하였다.

또한, 부피바카인과 비교하여 부피바카인 리포좀은 수술 후 180분과 240분에 더 나은 진통 효과를 보였다.

행동 검사 및 관찰 기간 동안 국소 마취 독성이나 사망과 관련된 합병증은 관찰되지 않았다.

수술로 인한 피부 절개 및 조직 손상은 중추 신경 흥분성을 유발하여 말초 및 중추 감작으로 이어져 만성 수술 후 통증으로 발전할 수 있다.

그리고 수술 후 통증 조절은 여전히 오피오이드의 사용에 의존하는데, 이는 수술 후 메스꺼움과 구토, 호흡 억제 및 소변 정체를 포함한 부작용으로 인해 제한적으로 사용되었다.

따라서, 수술 후 통증의 예방 및 치료를 위해 여러 가지 전략이 조사되었다.

그러나 수술을 받는 대부분의 환자는 여전히 수술 후 상당한 통증을 경험한다.

국소 마취제를 사용하여 신경 차단 및 수술 부위에 직접 적용하는 것은 편리한 적용, 안전성 및 저렴한 비용으로 인해 널리 사용되고 점점 더 많이 사용되고 있다.

그들은 또한 뇌로의 통증 신호 전달을 방해하여 통각 과민 및 이질통의 가능성을 감소시킨다. 그러나 전통적인 장기 작용 국소 마취제의 진통 기간이 충분하지 않아 이러한 이점이 제한된다.

또한, 고용량 국소 마취제는 인체에 유지될 때 때때로 심혈관 및 중추 신경계의 독성을 유발한다.

부피바카인 리포좀 제제 중 하나, 즉 EXPAREL(부피바카인이 서방성을 위해 다방포성 리포좀에 캡슐화 됨)은 2011년 수술에서 주사로 사용하도록 승인되었으며 최대 72 시간까지 확장된 수술 후 진통을 제공하도록 제안되었다.

여러 연구에서 상처 침윤 및 필드 및 신경 차단에 대한 부피바카인 리포좀의 효능과 안전성이 입증되었다. 그러나, 진통제 효능에 대한 논란이 있다.

많은 연구에서 특히 수술 후 24 시간에 부피바카인 리포좀과 기존 장기(long-term) 국소 마취제 간의 진통 효과의 차이를 발견하지 못했다.

따라서, 본 발명은 개발된 부피바카인 리포좀의 진통 효과를 자세히 조사하고자 한다.

에탄올을 사용한 변형된 역상 증발을 통해 고농도의 부피바카인을 함유하는 안정한 단층 리포좀을 제조하였다.

이 연구는 형태, 약물 농도 및 삼투압이 잘 설계된 경우 단순한 단층 리포좀조차도 장기간 전달을 위한 충분한 약물 운반체 역할을 할 수 있음을 보여준다.

체외 연구에서 부피바카인이 적재된 리포좀의 방출 기간이 최대 6 일까지 연장되었다.

생체 내 연구에서, 우리는 부피바카인 리포좀이 수술 후 최대 24 시간 동안 수술 후 통증을 감소시키는 것으로 나타났으며, 그 중 진통 효과가 최대 240 분까지 유지된 단독 부피바카인의 경우보다 더 길었다.

더욱이 부피바카인 리포좀은 부피바카인보다 수술 후 180 분 및 240 분에 더 나은 진통 효과를 보였다.

행동 검사 및 관찰 기간 동안 국소 마취 독성이나 사망과 관련된 합병증은 관찰되지 않았다.

이 강화된 진통 효과는 주로 부피바카인 리포좀의 잘 설계된 특성 때문이다.

단층 리포좀(직경 ~ 6μm)의 큰 크기는 림프 또는 모세 혈관 네트워크로의 흡수를 피할 수 있게 하였고, 고농도의 캡슐화된 약물(30mg / mL)은 다량의 활성 부피바카인을 국소 투여 부위로 전달하게 했다.

삼투적으로 균형 잡힌 완충액 조건은 또한 리포좀 약물의 안정성과 반감기를 개선하는 데 도움이 될 수 있다.

생체 내 연구에서는 인간의 수술 후 상태를 반영하고 시뮬레이션하기 위해 개발된 절개 통증 쥐 모델이 사용되었으며, 피크 시간, 강도 및 통증 지속 시간은 인간 수술 후 통증의 경우와 유사하였다.

외과적 절개와 수술 중 손상은 중추 신경 세포의 흥분성을 강조하여 말초 및 중추 감작을 유발하고 마지막으로 만성 수술 후 통증을 유발할 수 있다.

절개 통증의 쥐 모델은 절개 후 간단한 절차를 포함하고 여러 실험에서 재현성과 신뢰성을 보여주기 때문에 이 연구에 적용하기 쉽다.

따라서 통증 연구 분야에서 널리 사용되고 받아 들여지고 있다.

위에서 언급한 결과에도 불구하고 이 연구에는 몇 가지 한계가 있다.

이 연구는 짧은 기간 동안만 부피바카인 리포좀의 효과를 평가하였다.

만성 통증에 대한 부피바카인 리포좀의 효과를 평가하려면 더 긴 기간의 MWT 평가가 필요하다.

동물 연구에서 혈장 부피 바카인 농도는 모니터링되지 않았다. 이것은 부피바카인 리포좀의 생체 내 약동학 및 약력학을 명확히 하는 데 도움이 될 수 있다.

제조된 부피바카인 리포좀의 성능은 추가적인 구조 공학을 통해 더욱 향상될 수 있을 것으로 예상된다.

단층 리포좀이 후처리를 통해 조립될 수 있는 경우 약물을 포함하는 수많은 수성 챔버의 상호 연결된 구조가 생성되어 EXPAREL과 같은 다방포성(multivesicular) 리포좀과 유사한 형태학적 구조가 생성된다.

이러한 쉽게 형성되고 밀집된 비동심성 소포는 장기간 약물 저장소로 투여 부위에 머무름으로써 서방성 약물 전달에 대한 새로운 접근 방식을 제공할 것이다.

이 연구는 크고 안정적인 단층 리포좀을 사용하여 지속적으로 부피바카인 방출을 성공적으로 입증하였다.

리포좀 구조의 삼투 균형은 고농축 부피바카인(최대 30mg/mL)을 확대된 단층 리포좀으로 캡슐화할 수 있게 했으며, 유통 기한은 한 달 이상 늘어났다.

발바닥 내 투여는 24 시간에 걸쳐 부피바카인의 지속적인 방출을 가능하게 했다.

진통 효과는 쥐 모델에서 성공적으로 검증되었으며, 진통 기간은 부피 바카 인 만 사용했을 때 보다 6 배 더 늘어난 장점이 있다.

Claims (11)

1. (a) 유기 용매에 양친매성 지질과 음전하 지질과 콜레스테롤을 용해시켜 유기상을 형성하는 단계;
   (b) 수용액에 부피바카인-HCl 분말을 혼합하고 교반하여 부피바카인 함유 수상을 형성하는 단계;
   (c) 상기 (a) 단계에서 형성된 유기상에 상기 (b) 단계에서 형성된 부피바카인 염산용액을 첨가하고 균질기를 활용하여 유화시켜 w/o 에멀젼을 합성하는 단계; 및
   (d) 상기 w/o 에멀젼에서 유기용매를 감압하에 회전 증발시켜 제거하고 최종 리포좀 수 용액을 형성하고, 유리된 약물을 제거하여 부피바카인이 캡슐화된 리포좀을 형성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 부피바카인 리포좀 기반의 리포좀 약물전달체 제조방법.
2. 제1항에 있어서,
   상기 (a) 단계에서,
   상기 유기용매는 클로로포름, 에탄올, diethyl ether(디에틸에테르), ethyl acetate(에틸 아세테이트), ethyl ether(에틸 에테르), methanol(메탄올), isopropyl ether(이소프로필 에테르) 중의 어느 하나 또는 이들의 조합에서 선택되는 것을 특징으로 하는 부피바카인 리포좀 기반의 리포좀 약물전달체 제조방법.
3. 제1항에 있어서,
   상기 (a) 단계에서,
   상기 양친매성 지질은 DOPC, phosphatidylcholine(포스파티딜콜린), Soy phosphatidylcholine, Egg phospholipid, synthetic phosphatidylcholine 중의 어느 하나가 선택되는 것을 특징으로 하는 부피바카인 리포좀 기반의 리포좀 약물전달체 제조방법.
4. 제1항에 있어서,
   상기 (a) 단계에서, 상기 음전하 지질은 DPPG, phosphatidylglycerol(포스파티딜 글리세롤), POPG(2-oleoyl-1-pamlitoyl-sn-glyecro-3-glycerol) 중의 어느 하나가 선택되는 것을 특징으로 하는 부피바카인 리포좀 기반의 리포좀 약물전달체 제조방법.
5. 제1항에 있어서,
   상기 (a) 단계에서, 첨가되는 양친매성 지질: 음전하 지질: 콜레스테롤은 각각 중량% 범위에서 5:1:5인 것을 특징으로 하는 부피바카인 리포좀 기반의 리포좀 약물전달체 제조방법.
6. 제1항에 있어서,
   상기 (b) 단계에서, PBS 수용액에 부피바카인-HCl 분말을 녹였으며, 이때 상기 PBS 수용액은 농도는 0.1X 이하인 것을 특징으로 하는 부피바카인 리포좀 기반의 리포좀 약물전달체 제조방법.
7. 제1항에 있어서,
   상기 (c) 단계에서,
   상기 w/o 에멀젼을 초음파 처리하여 균질한 분산액을 형성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 부피바카인 리포좀 기반의 리포좀 약물전달체 제조방법.
8. 제1항에 있어서,
   상기 (d) 단계에서,
   상기 부피바카인이 캡슐화된 리포좀에서, 상기 리포좀 내부와 외부의 삼투압 농도가 동일하도록 조절하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 부피바카인 리포좀 기반의 리포좀 약물전달체 제조방법.
9. 제8항에 있어서,
   PBS의 이온 조성을 확인하고, 몰 수 계산을 통해 상기 리포좀 내부와 외부의 삼투압 농도가 같도록 상기 리포좀을 등장성 PBS에 재현탁하는 것을 특징으로 하는 부피바카인 리포좀 기반의 리포좀 약물전달체 제조방법.
10. 제1항에 있어서,
    상기 (d) 단계에서,
    상기 유리 약물의 제거는 원심 분리를 이용한 세척방법 또는 투석 백을 이용하는 것을 특징으로 하는 부피바카인 리포좀 기반의 리포좀 약물전달체 제조방법.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 하나에 따른 제조방법으로 제조된 리포좀 약물전달체.

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