KR20220118023A - 진생베리의 발효물을 포함하는 아토피성 피부염 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 진생베리의 발효물을 포함하는 아토피성 피부염 치료용 조성물에 관한 것으로 인삼열매(진생베리)를 착즙하는 단계; 상기 착즙액을 정제수로 추출하는 단계; 상기 추출물과 조분쇄된 쌀과 콩의 추출물을 여과하여 혼합한 후 Rhizopus Oligosporus를 이용하여 발효하는 단계; 및 상기 발효물을 다이아니온 에이취피-20(Diaion HP-20) 수지 컬럼 크로마토그래피에서 메탄올과 물의 혼합물 또는 아세톤으로 분리하여 분획물을 제조하고, 상기 분리물을 1 내지 100 ug/ml의 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는 아토피성 피부염 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 조성물은 림프절 T 세포에서 IL-2의 생산량을 감소시키지 않으면서도, IL-13을 억제하여 다른 부작용을 일으키지 않으며 아토피 피부염 치료에 효과적이다.

Description

진생베리의 발효물을 포함하는 아토피성 피부염 치료용 조성물{Composition comprising the fermentation product of a extract of Ginseng berry for treating atopic dermatitits}

본 발명은 진생베리의 발효물을 포함하는 아토피성 피부염 치료용 조성물에 관한 것이다.

인삼 부산물인 진생베리는 몇몇 진세노사이드의 함량이 뿌리보다 더 풍부하게 함유되어 있어 이를 이용하기 위한 연구가 활발히 이루어지고 있다. 또한 체내 흡수율을 높이기 위한 미생물 발효를 이용한 연구도 활발하다. 미생물을 이용한 생물학적 전환은 미생물의 β-glucosidase를 이용하여 비당부에 결합된 당을 떼어내 진세노사이드의 전환을 유도한다. 다른 연구에서 발효된 인삼농축액에는 일반 농축액에서 확인되지 않았던 Rh1, Rh2의 존재(생물전환)와 이로 인한 항염증과 항산화능 증가작용이 보고되었다. 또한 특정 균주의 발효를 통한 인삼추출물의 염증 사이토카인 생성이 억제되었다는 연구가 보고되었다. 하지만 인삼 부산물의 미생물 발효를 이용한 항염증 및 염증성 피부질환에 대한 연구는 현저히 적다.

본 발명자들은 진생베리 농축액 발효물이 T 세포의 활성에 미치는 영향을 규명하고 아토피 피부염 병인의 주역인 Th2형 사이토카인 IL-13만을 선택적으로 억제하여 아노피성 피부염에 효과가 있으며, 인체에 부작용을 일으키지 않는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명에서는 진생베리 발효 조성물을 이용한 아토피성 피부염 치료용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기한 목적을 위해서 본 발명의 제1의 형태는 인삼열매(진생베리)를 착즙하는 단계; 상기 착즙액을 정제수로 추출하는 단계; 상기 추출물과 조분쇄된 쌀과 콩의 추출물을 여과하여 혼합한 후 Rhizopus Oligosporus를 이용하여 발효하는 단계; 및 상기 발효물을 다이아니온 에이취피-20(Diaion HP-20) 수지 컬럼 크로마토그래피에서 메탄올과 물의 혼합물 또는 아세톤으로 분리하여 분획물을 제조하고, 상기 분리물을 1 내지 100 ug/ml의 농도를 포함하는 것을 특징으로 하는 아토피성 피부염 치료용 조성물을 제공한다.

상기 분리물의 농도가 1 ug/ml의 이하인 경우에는 아토피성 피부염 치료의 효과를 얻기 어렵고, 100 ug/ml 이상일 경우에는 세포독성이 있어서, 다른 부작용을 초래한다.

상기 다이아니온 에이취피-20(Diaion HP-20) 수지는 DIAION^TM HP20으로 판매되는 스티렌과 DVB(Divinyl benzene)의 공중합체인 다공성 합성흡착제(Synthetic Adsorbent)이다

바람직하게는, 상기 메탄올과 물의 혼합물의 농도비는 메탄올(Methanol) : 물(water)의 비율이 20 : 80 ~ 100 : 0인 것을 특징으로 하는 아토피성 피부염 치료용 조성물이고, 보다 더 바람직하게는 상기 크로마토그래피에서 메탄올의 농도가 30 내지 100%일 때의 분획물이다. 보다 더욱 더 바람직하게는 상기 메탄올의 농도가 69 내지 71%이다.

보다 더 바람직하게는 상기 메탄올의 농도가 69 내지 71%의 분획물을 에틸아세테이트로 추가 추출하여 에틸아세테이트 층에 수득하는 단계를 추가적으로 포함하여 아토피성 피부염 치료용 조성물을 제조할 수 있다.

본 발명에 따른 쌀 및 콩 추출물과 진생베리의 수추출물의 혼합물의 Rhizopus oligosporus 에 의한 발효물 조성물의 Dianion HP-20 컬럼을 통한 알코올 및 아세톤 추출물은 림프절 T 세포에서 IL-2의 생산량을 감소시키지 않으며, IL-13을 억제하는 효과가 있어 다른 부작용을 일으키지 않으며 아토피 피부염 치료에 효과적이다.

도 1은 진생베리 추출액 발효물의 Diaion HP-20 컬럼 크로마토그래피 및 에틸아세테이트 분획 (샘플 1-1 ~ 2-2) 과정을 보인다.
도 2는 진생베리 추출액 발효물의 에틸아세테이트 층으로부터 하위 분획물(샘플 3-1 ~ 5-3)의 분리 과정을 보인다.
도 3은 진생베리 추출액 발효물의 물 층으로부터 하위 분획물(샘플 6-1 ~ 7-3)의 분리과정을 보인다.
도 4는 C57BL/6의 표피 γδ T 세포의 순도 측정을 위한 FACS 분석을 보인다. A: FSC-H / SSC-H, 전체 세포 측정. B: FSC-H / FL3-H (PI 침투값)의 측정을 통한 생존 세포 측정. C: FL2-H / FL4-H (PE-γδ TCR 단일 클론 항체 / APC-CD3e 단일 클론 항체)의 측정을 통한 γδ T 세포 발현율(97.14%). D: Isotype-matched control antibody로 염색한 세포
도 5는 1차 진생베리 농축액 발효물 분획샘플을 처리한 활성화된 표피 γδ T 세포의 생존율 (A)과 IL-13 생산량 (B) 결과 비교 그래프를 보인다. A: 1차 샘플을 처리한 표피 γδ T 세포의 대조군 대비 세포 생존율 비교. 표피 γδ T 세포는 다양한 농도(10 ~ 100 ㎍/㎖)의 1차 샘플로 처리되었다. 세포생존율은 FACS를 사용하여 측정되었다. B: 1차 샘플을 처리한 표피 γδ T 세포의 대조군 대비 IL-13 생산량 비교. IL-13은 A에서 얻은 상등액과 ELISA kit를 사용하여 측정되었다. (결과의 유의성, * : p < 0.05, *** : p < 0.005, 대조군 대비).
도 6은 1차 진생베리 농축액 발효물 분획샘플을 처리한 활성화된 림프절 T 세포의 생존율 (A)과 IL-2 생산량 (B) 결과 비교 그래프를 보인다. A: 1차 샘플을 처리한 림프절 T 세포의 대조군 대비 세포 생존율 비교. 림프절 T 세포는 다양한 농도(0.1 ~ 100 ㎍/㎖)의 1차 샘플로 처리되었다. 세포생존율은 MTT assay를 사용하여 측정되었다. B: 1차 샘플을 처리한 림프절 T 세포의 대조군 대비 IL-2 생산량 비교. IL-2는 A에서 얻은 상등액과 ELISA kit를 사용하여 측정되었다. (결과의 유의성, * : p < 0.05, ** : P < 0.01, *** : p < 0.005, 대조군 대비)
도 7은 2차 진생베리 농축액 발효물 분획샘플을 처리한 활성화된 표피 γδ T 세포의 생존율 (A)과 IL-13 생산량 (B) 결과 비교 그래프를 보인다. A: 2차 샘플을 처리한 표피 γδ T 세포의 대조군 대비 세포 생존율 비교. 표피 γδ T 세포는 다양한 농도(10 ~ 100 ㎍/㎖)의 2차 샘플로 처리되었다. 세포생존율은 FACS를 사용하여 측정되었다. B: 2차 샘플을 처리한 표피 γδ T 세포의 대조군 대비 IL-13 생산량 비교. IL-13은 A에서 얻은 상등액과 ELISA kit를 사용하여 측정되었다. (결과의 유의성, ** : P < 0.01, *** : p < 0.005, 대조군 대비).
도 8은 2차 진생베리 농축액 발효물 분획샘플을 처리한 활성화된 림프절 T 세포의 생존율 (A)과 IL-2 생산량 (B) 결과 비교 그래프를 보인다. A: 2차 샘플을 처리한 림프절 T 세포의 대조군 대비 세포 생존율 비교. 림프절 T 세포는 다양한 농도(0.1 ~ 100 ㎍/㎖)의 2차 샘플로 처리되었다. 세포생존율은 MTT assay를 사용하여 측정되었다. B: 2차 샘플을 처리한 림프절 T 세포의 대조군 대비 IL-2 생산량 비교. IL-2는 A에서 얻은 상등액과 ELISA kit를 사용하여 측정되었다. (결과의 유의성, * : p < 0.05, *** : p < 0.005, 대조군 대비).
도 9는 3차 진생베리 농축액 발효물 분획샘플을 처리한 활성화된 표피 γδ T 세포의 생존율 (A, C)과 IL-13 생산량 (B, D) 결과 비교 그래프를 보인다. A, C: 3차 샘플을 처리한 표피 γδ T 세포의 대조군 대비 세포 생존율 비교. 표피 γδ T 세포는 다양한 농도(10 ~ 100 ㎍/㎖)의 3차 샘플로 처리되었다. 세포생존율은 FACS를 사용하여 측정되었다. B, D: 3차 샘플을 처리한 표피 γδ T 세포의 대조군 대비 IL-13 생산량 비교. IL-13은 A, C에서 얻은 상등액과 ELISA kit를 사용하여 측정되었다. (결과의 유의성, * : p < 0.05, ** : P < 0.01, *** : p < 0.005, 대조군 대비).
도 10은 3차 진생베리 농축액 발효물 분획샘플을 처리한 활성화된 림프절 T 세포의 생존율 (A, C, E)과 IL-2 생산량 (B, D, F) 결과 비교 그래프를 보인다. A, C, E: 3차 샘플을 처리한 림프절 T 세포의 대조군 대비 세포 생존율 비교. 림프절 T 세포는 다양한 농도(0.1 ~ 100 ㎍/㎖)의 3차 샘플로 처리되었다. 세포생존율은 MTT assay를 사용하여 측정되었다. B, D, F: 3차 샘플을 처리한 림프절 T 세포의 대조군 대비 IL-2 생산량 비교. IL-2는 A, C, E에서 얻은 상등액과 ELISA kit를 사용하여 측정되었다. (결과의 유의성, * : p < 0.05, ** : P < 0.01, *** : p < 0.005, 대조군 대비).
도 11은 4차 진생베리 농축액 발효물 분획샘플을 처리한 활성화된 표피 γδ T 세포의 생존율 (A)과 IL-13 생산량 (B) 결과 비교 그래프를 보인다. A: 4차 샘플을 처리한 표피 γδ T 세포의 대조군 대비 세포 생존율 비교. 표피 γδ T 세포는 다양한 농도 1 ~ 50 ㎍/㎖)의 4차 샘플로 처리되었다. 세포생존율은 FACS를 사용하여 측정되었다. B: 4차 샘플을 처리한 표피 γδ T 세포의 대조군 대비 IL-13 생산량 비교. IL-13은 A에서 얻은 상등액과 ELISA kit를 사용하여 측정되었다. (결과의 유의성, * : p < 0.05, *** : p < 0.005, 대조군 대비).
도 12는 4차 진생베리 농축액 발효물 분획샘플을 처리한 활성화된 림프절 T 세포의 생존율 (A, C)과 IL-2 생산량 (B, D) 결과 비교 그래프를 보인다. A, C: 4차 샘플을 처리한 림프절 T 세포의 대조군 대비 세포 생존율 비교. 림프절 T 세포는 다양한 농도(0.1 ~ 100 ㎍/㎖)의 4차 샘플로 처리되었다. 세포생존율은 MTT assay를 사용하여 측정되었다. B, D: 4차 샘플을 처리한 림프절 T 세포의 대조군 대비 IL-2 생산량 비교. IL-2는 A, C에서 얻은 상등액과 ELISA kit를 사용하여 측정되었다. (결과의 유의성, * : p < 0.05, ** : P < 0.01, *** : p < 0.005, 대조군 대비).
도 13은 5차 진생베리 농축액 발효물 분획샘플을 처리한 활성화된 표피 γδ T 세포의 생존율 (A)과 IL-13 생산량 (B) 결과 비교 그래프를 보인다. A: 5차 샘플을 처리한 표피 γδ T 세포의 대조군 대비 세포 생존율 비교. 표피 γδ T 세포는 다양한 농도(0.1 ~ 50 ㎍/㎖)의 5차 샘플로 처리되었다. 세포생존율은 FACS를 사용하여 측정되었다. B: 5차 샘플을 처리한 표피 γδ T 세포의 대조군 대비 IL-13 생산량 비교. IL-13은 A에서 얻은 상등액과 ELISA kit를 사용하여 측정되었다. (결과의 유의성, * : p < 0.05, ** : P < 0.01, *** : p < 0.005, 대조군 대비)
도 14는 5차 진생베리 농축액 발효물 분획샘플을 처리한 활성화된 림프절 T 세포의 생존율 (A)과 IL-2 생산량 (B) 결과 비교 그래프를 보인다. A: 5차 샘플을 처리한 림프절 T 세포의 대조군 대비 세포 생존율 비교. 림프절 T 세포는 다양한 농도(0.1 ~ 50 ㎍/㎖)의 5차 샘플로 처리되었다. 세포생존율은 MTT assay를 사용하여 측정되었다. B: 5차 샘플을 처리한 림프절 T 세포의 대조군 대비 IL-2 생산량 비교. IL-2는 A에서 얻은 상등액과 ELISA kit를 사용하여 측정되었다. (결과의 유의성, * : p < 0.05, ** : P < 0.01, *** : p < 0.005, 대조군 대비)
도 15는 6차 진생베리 농축액 발효물 분획샘플을 처리한 활성화된 표피 γδ T 세포의 생존율 (A, C)과 IL-13 생산량 (B, D) 결과 비교 그래프를 보인다. A, C: 6차 샘플을 처리한 표피 γδ T 세포의 대조군 대비 세포 생존율 비교. 표피 γδ T 세포는 다양한 농도(1 ~ 25 ㎍/㎖)의 6차 샘플로 처리되었다. 세포생존율은 FACS를 사용하여 측정되었다. B, D: 6차 샘플을 처리한 표피 γδ T 세포의 대조군 대비 IL-13 생산량 비교. IL-13은 A, C에서 얻은 상등액과 ELISA kit를 사용하여 측정되었다. (결과의 유의성, * : p < 0.05, ** : P < 0.01, *** : p < 0.005, 대조군 대비).
도 16은 6차 진생베리 농축액 발효물 분획샘플을 처리한 활성화된 림프절 T 세포의 생존율 (A, C)과 IL-2 생산량 (B, D) 결과 비교 그래프를 보인다. A, C: 6차 샘플을 처리한 림프절 T 세포의 대조군 대비 세포 생존율 비교. 림프절 T 세포는 다양한 농도(0.1 ~ 50 ㎍/㎖)의 6차 샘플로 처리되었다. 세포생존율은 MTT assay를 사용하여 측정되었다. B, D: 6차 샘플을 처리한 림프절 T 세포의 대조군 대비 IL-2 생산량 비교. IL-2는 A, C에서 얻은 상등액과 ELISA kit를 사용하여 측정되었다. (결과의 유의성, * : p < 0.05, ** : P < 0.01, *** : p < 0.005, 대조군 대비)
도 17은 7차 진생베리 농축액 발효물 분획샘플을 처리한 활성화된 표피 γδ T 세포의 생존율 (A)과 IL-13 생산량 (B) 결과 비교 그래프를 보인다. A: 7차 샘플을 처리한 표피 γδ T 세포의 대조군 대비 세포 생존율 비교. 표피 γδ T 세포는 다양한 농도(1 ~ 50 ㎍/㎖)의 7차 샘플로 처리되었다. 세포생존율은 FACS를 사용하여 측정되었다. B: 7차 샘플을 처리한 표피 γδ T 세포의 대조군 대비 IL-13 생산량 비교. IL-13은 A에서 얻은 상등액과 ELISA kit를 사용하여 측정되었다. (결과의 유의성, * : p < 0.05, ** : P < 0.01, *** : p < 0.005, 대조군 대비)
도18은 7차 진생베리 농축액 발효물 분획샘플을 처리한 활성화된 림프절 T 세포의 생존율 (A)과 IL-2 생산량 (B) 결과 비교 그래프를 보인다. A: 7차 샘플을 처리한 림프절 T 세포의 대조군 대비 세포 생존율 비교. 림프절 T 세포는 다양한 농도(1 ~ 50 ㎍/㎖)의 7차 샘플로 처리되었다. 세포생존율은 MTT assay를 사용하여 측정되었다. B: 7차 샘플을 처리한 림프절 T 세포의 대조군 대비 IL-2 생산량 비교. IL-2는 A에서 얻은 상등액과 ELISA kit를 사용하여 측정되었다. (결과의 유의성, * : p < 0.05, ** : P < 0.01, *** : p < 0.005, 대조군 대비).

이하, 본 발명을 실시예에 기초하여 보다 상세히 기술한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아님은 물론이다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다.

[실시예 1] 진생베리 농축발효액의 아토피 치료 효과 확인

I. 재료 및 방법

1. 실험동물

본 실험에서 사용한 실험동물은 C57BL/6 6주령 암컷 마우스이며, 오리엔트 바이오(Orient Bio Inc, Korea)에서 제공받았다. 마우스는 본 실험에 사용하기 전에 2일간 적정한 온도를 유지하고 먹이와 물을 주면서 안정화 시켰으며, 경추 탈골을 이용한 안락사를 시킨 뒤 피부 조직과 림프절 조직을 얻었다. 본 실험에 사용된 동물 실험 과정은 단국대학교 실험동물 윤리 위원회의 지침에 따랐다.

2. 실험 재료

2.1 진생베리 농축액 제조

본 실험에서 사용한 진생베리는 충남 금산에서 2019년 7월에 수확한 진생베리 착즙액을 구매하여 사용하였다. 진생베리 열수추출을 위해서 진생베리 착즙액 중량의 1.5배수의 정제수를 넣고 90 ℃에서 7시간 추출하였으며, 추출 후 남은 진생베리 대두박은 재차 동일한 조건하에서 추출공정을 수행하여 일차 진생베리 추출물과 혼합하여 사용하였다. 진생베리 1차 추출물과 대두박에서 추출한 추출물은 불순물을 제거 및 혼합한 후 농축기를 이용하여 최종 농축액 55°Brix가 될 때 까지 농축하여 실험에 사용하였다. 이 때 농축기의 공정 조건인 압력은 650mmHg, 온도는 65 ℃를 유지하였다.

2.2 진생베리 농축액의 발효 과정

본 실험에서 사용한 진생베리 추출액 발효물은 Rhizopus Oligosporus 배양을 이용하여 제조하였다. 3L의 물에 조분쇄된 쌀, 콩을 1:1의 비율로 350g 혼합하여 80 ℃에서 12시간 추출한 후 0.45 ㎛ 필터로 여과된 배지액에 진생베리 농축액(55°Brix)을 총 배지액의 5 %를 첨가하여 21 ℃에서 45 min 멸균하였다. 멸균된 배지액에 Rhizopus Oligosporus 균주를 접종하여 29 ℃, 0.2 기압에서 24시간 배양하여 발효액을 제조하였다.

2.3 진생베리 추출액 발효물의 분리분획

진생베리 추출액 발효물에 대한 세포의 생존율과 IL-2, IL-13 사이토카인의 발현 효과를 확인하고 아토피 피부염에 효과가 있는 성분을 발견하기 위해 분획물을 제조하여 실험하였다. 진생베리 추출액 발효물을 Diaion HP-20 컬럼 크로마토그래피(메탄올(Methanol) : 물(water)= 20 : 80 ~ 100 : 0, 100 % 아세톤(Acetone))를 사용하여 불순물을 제거하고 용매 극성에 따라 분리하여 4개의 분획물(샘플 1-1 ~ 1-4)을 얻었다. 샘플 1-2를 에틸아세테이트(Ethyl acetate, EA)로 용매 극성에 따라 분획하여 샘플 2-1(EA 층)와 2-2(물 층)를 얻었다 (도 1).

EA 층인 샘플 2-1을 ODS 컬럼 크로마토그래피(메탄올 : 물 = 20 : 80 ~ 100 : 0)로 분리하여 하위 분획물(샘플 3-1 ~ 3-8)을 얻었다. 하위 분획물 3-2를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름(Chloroform) 및 메탄올(30 : 1 ~ 0 : 100))로 분리하여 하위 분획물(샘플 4-1 ~ 4-5)을 얻었다. 마지막으로 하위 분획물 4-4를 Sephadex LH-20 컬럼 크로마토그래피(100 % 메탄올)로 분리하고 각각 Sep-pak 카트리지(메탄올 : 물 = 70 : 30 ~ 100 : 0) 및 High Pressure Liquid Chromatography (HPLC, C₁₈ 10

150 mm, 83 % 메탄올, 3 ml/min) 또는 HPLC (C₁₈ 10

150 mm, 45 % 아세토나이트릴(acetonitrile), 3 ml/min)로 분획하여 하위 분획물 샘플 5-1 (0.6 mg)과 5-2 (7.7 mg) 및 5-3 (4.9 mg)으로 산출했다 (도 2).

물 층인 샘플 2-2 ODS 컬럼 크로마토그래피(메탄올 : 물 = 20 : 80)와 Medium pressure liquid chromatography (MPLC, 메탄올 : 물 = 0 : 100 ~ 30 : 70)를 사용하여 용매 극성에 따라 분리하여 하위 분획물(샘플 6-1 ~ 6-7)을 얻었다. 하위 분획물 6-7을 Sephadex LH-20 컬럼 크로마토그래피(50 % 메탄올)로 분획하여 하위 분획물 샘플 7-3을 얻고, HPLC (C₁₈ 10

150 mm, 27 % 메탄올, 3 ml/min)로 분획하여 하위 분획물 샘플 7-1 및 7-2를 얻었다 (도 3). 모든 샘플은 전북대학교 생명공학부 윤봉식 교수님 연구실에서 제공받았다.

3. 실험 세포

3.1 표피 γδ T 세포 분리

표피 γδ T 세포를 분리하기 위해 2일 동안 휴식하여 안정화시킨 C57BL/6 마우스(Orient Bio Inc., Korea)를 경추 탈골 시킨 후 클리퍼를 이용해 털을 밀고 제모제(비트라세라젤크림 일반피부용 (치오글리콜산), (유)옥시레킷벤키저, 대한민국)를 사용하여 잔털까지 제거하였다. 피부를 벗겨내어 지방을 제거한 후 피부 조직을 적당한 크기로 잘라 Dispase Ⅱ 효소 (Roche, Switzerland)를 1.3 U/ml 농도로 포함한 RPMI 1640 배지(Gibco, USA)에 넣어서 4℃ 냉장고에 24시간 동안 반응시켰다. 효소 반응으로 인해 진피와 표피의 경계가 허물어졌을 때, 핀셋을 이용하여 표피 조직을 떼어냈으며 0.2 % Trypsin-GNK (Sigma, USA)를 첨가한 뒤 37 ℃ 항온 수조에서 15분간 반응시켰다. 효소 반응으로 인해 느슨해진 표피 조직을 볼텍싱하여 세포가 떨어져 나오도록 한 후 100 ㎛ cell strainer로 걸러 세포현탁액을 얻었으며, 원심분리기로 4 ℃, 400 G, 5분간 원심 분리한 후 가라앉은 pellet를 채취하여 살아 있는 표피 세포를 얻었다.

3.2 표피 γδ T 세포 배양

분리된 표피 세포 중 표피 γδ T 세포만 자극·분열하게 하기위해 항 CD3 단일 클론 항체(BD Biosciences, USA)가 10 ㎍/㎖ 농도로 코팅된 48 well 플랫 플레이트에 fetal bovine serum (FBS, Thermo, Germany), sodium pyruvate (Gibco, USA), penicilin-streptomycin (P/S, Gibco, USA), Hepes (Gibco, USA), NEAA (Gibco, USA), 2-mercaptoethanol (Sigma, USA)를 RPMI 1640 배지 (Gibco, USA)에 첨가하여 만든 RPMI 1640 완전배지와 IL-2 (Sigma, USA)가 100 U/ml 농도가 되도록 첨가하여 37 ℃, 5 % 이산화탄소를 제공하는 배양기에서 한 주간 배양하였다. 이 후 24 well 플랫 플레이트에 같은 조건으로 표피 세포를 옮겨주며 2 ~ 3주간 배양하였다. 실험에 사용할 세포 수가 만족되면 세포자동해석ㆍ분리장치 분석(Fluorescence activated cell sorter, FACS, BD Biosciences, San Jose, USA)을 통해 세포의 순도를 확인하고 진생베리 추출액 발효물 분획샘플을 가하여 FACS를 통한 세포 생존율 분석과 효소 면역 분석 실험(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)에 사용되었다.

3.3 림프절 T 세포 분리

림프절 T 세포를 추출하기 위해 2일 동안 휴식하여 안정화시킨 C57BL/6 마우스 (Orient Bio Inc.)의 액와, 서혜, 장에서 떼어낸 림프절을 RPMI 1640 배지(Invitrogen)에 담가 바늘로 찢었다. 찢은 림프절이 담긴 배지를 100 ㎛ cell strainer로 걸러 세포현탁액을 얻고 원심분리기로 4 ℃, 400 G, 5분간 원심 분리한 후 가라앉은 pellet를 채취하여 살아 있는 림프절 T 세포를 얻었다. 림프절 T 세포는 따로 배양하지 않고 분리한 즉시 바로 실험에 사용하였다.

4. 표피 γδ T 세포의 실험 방법

4.1 표피 γδ T 세포의 순도 측정

실험에 사용할 표피 γδ T 세포의 순도 측정을 위해 FACS를 사용하였다. 세포를 APC-CD3e 단일 클론 항체(Clone 145-2C11, BD Biosciences, USA), PE-γδ TCR 단일 클론 항체(Clone GL3, BD Biosciences, USA), propidium iodide 용액(PI, Sigma, USA)으로 염색하였으며, 대조군으로는 세포 표면 단백질과 상관없는 동종 항체(Isotype, BD Biosciences, USA)를 사용하였다. γδ T 세포는 FACS로 측정된 그래프의 SSC/FSC, FL2-H (PE, 항 γδ TCR), FL3-H (PI), FL4-H (APC, 항 CD3e) 부분의 점으로 표현되어 측정되었으며 CellQuest Pro (BD Biosciences, USA) 프로그램을 사용하였다.

4.2 표피 γδ T 세포 실험

표피 γδ T 세포의 순도 측정 후 80 % 이상일 시 실험에 사용되었다. 실험에 들어가기 전 플레이트를 살살 흔들어서 죽은 세포들이 위로 뜨게 하고 상등액을 걷어 냈다. 이후 7시간동안 CD3e 단일 클론 항체 및 IL-2의 자극 없이 RPMI 1640 배지(Gibco)로만 세포들을 휴지하였다. 휴지과정 후 상등액을 걷어 내어 살아있는 세포만 남기고 RPMI 1640 완전배지로 현탁하였다. 96 well 플랫 플레이트에 세포를 well 당 2.5 x 10⁵/ml로 깔고 IL-2 (Sigma)가 50 U/ml이 되도록 자극을 가한 후 진생베리 추출액 발효물 분획샘플을 여러 농도로 처리하여 37 ℃, 5 % 이산화탄소를 제공하는 배양기에서 6일간 배양하였다. 대조군은 샘플을 dimethyl sulfoxide (DMSO, Bioship®, Canada)로 녹였을 시 DMSO로 샘플과 동일한 농도로 처리하였으며, 증류수로 녹인 샘플은 PBS (Phosphate buffered saline, Gibco, USA)를 동일한 양으로 처리하였다.

4.3 표피 γδ T 세포 생존율 분석

과활성화 시킨 표피 γδ T 세포에 진생베리 추출액 발효물 분획샘플을 농도별로 첨가한 뒤 6일간 반응을 시켰다. 그 후 세포 생존율 분석을 하기 위하여 상등액을 분리하고 PI가 1 ㎍/㎖ 포함되어 있는 차가운 PBS (Gibco)에 현탁하여 FACS전용 튜브에 옮겨 FACS (BD Biosciences)로 표피 γδ T 세포 생존율을 측정하였다. 분리한 상등액은 사이토카인 분석 실험을 위해 -80 ℃ 초저온 냉동실에 보관하였다. FACS로 측정된 그래프의 SSC/FSC, FL3-H/FSC-H 부분의 점으로 표현되어 측정되었으며 CellQuest Pro (BD Biosciences) 프로그램을 사용하였다. 상대적 세포 생존율은 다음과 같이 계산하였다.

4.4 표피 γδ T 세포의 IL-13 사이토카인 측정

과활성화 시킨 표피 γδ T 세포가 진생베리 추출액 발효물 분획샘플과 반응 후 생성한 사이토카인의 양을 측정하기 위해 세포 생존율 분석 당시 분리해 놓았던 상등액을 사용하였다. Th2형 사이토카인 IL-13을 Mouse IL-13 ELISA Ready-Set-Go kit (eBioscience, USA)로 실험하고 흡광도 측정기 (SYNERGT MX, BioTek®, Korea)의 475nm 파장으로 측정하였으며 데이터 산출은 Gen5 프로그램 (BioTek®, Korea)을 이용하였다. 상대적 IL-13 생산량은 다음과 같이 계산하였다.

5. 림프절 T 세포의 실험 방법

5.1 림프절 T 세포 실험

림프절 T 세포는 림프절에서 분리 후 바로 실험에 사용하였다. 분리한 림프절 T 세포를 RPMI 1640 완전배지로 현탁하여 96well 라운드 플레이트에 well 당 1.5 x 10⁶/ml로 깔고 Concanavalin A (Sigma, USA) 4㎍/㎖ 농도로 가하여 활성화시켰다. 그 후 진생베리 추출액 발효물 분획샘플을 여러 농도로 처리하여 37 ℃, 5 % 이산화탄소를 제공하는 배양기에서 2일간 배양하였다. 대조군은 샘플을 DMSO (Bioship®)로 녹였을 시 DMSO로 샘플과 동일한 농도로 처리하였으며, 증류수로 녹인 샘플은 PBS (Gibco)를 동일한 양으로 처리하였다.

5.2 림프절 T 세포 생존율 분석

활성화 시킨 림프절 T 세포에 진생베리 추출액 발효물 분획샘플을 농도별로 처리한 뒤 2일간 반응을 시켰다. 그 후 세포 생존율 분석을 하기 위하여 상등액을 분리한 뒤, 5 mg/ml 농도의 Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (Sigma, USA)를 첨가한 후 37 ℃, 5 % 이산화탄소를 제공하는 배양기에서 4시간 동안 배양하였다. 분리한 상등액은 사이토카인 분석 실험을 위해 -80 ℃ 초저온 냉동실에 보관하였다. 노란색이었던 Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (Sigma, USA)시약이 보라색 포르마잔 결정으로 변하는 것을 확인하고 상등액을 제거한 뒤, 포르마잔 결정을 녹이기 위해 50 ㎕ DMSO를 사용하였다. 이후 흡광도를 측정하기 위해 흡광도 측정기(SYNERGT MX, BioTek®)로 570 nm, 670 nm 파장을 측정하였으며 데이터 산출은 Gen 5 프로그램(Biotek®)을 이용하였다. 상대적 세포 생존율은 다음과 같이 계산하였다.

5.3 림프절 T 세포의 IL-2 사이토카인 측정

활성화 시킨 림프절 T 세포가 진생베리 추출액 발효물 분획샘플과 반응 후 생성한 사이토카인의 양을 측정하기 위해 세포 생존율 분석 당시 분리해 놓았던 상등액을 사용하였다. Th1형 사이토카인 IL-2를 Mouse IL-2 ELISA Ready-Set-Go kit (eBioscience)로 실험하고 흡광도 측정기(SYNERGT MX, BioTek®)의 475nm 파장으로 측정하였으며 데이터 산출은 Gen5 프로그램(BioTek®)을 이용하였다. 상대적 IL-2 생산량은 다음과 같이 계산하였다.

6. 통계 분석

모든 실험의 통계적 분석을 위해 IBM SPSS Statistics for Windows, version 26 (IBM Corp., Armonk, N.Y., USA)의 Student’s T-test 방법을 사용하였고, p < 0.05 인 경우 통계적으로 의미 있는 차이를 보이는 것으로 간주하였다.

II. 결과

1. C57BL/6의 표피 γδ T 세포 순도 측정

아토피 피부염 병변의 특징인 γδ T 세포가 과하게 발현되어 있는 조건에 맞추기 위해 C57BL/6의 피부조직에서 표피 γδ T 세포만을 분리 배양하였다. 실험에 사용하기 전 γδ T 세포만 배양된 것을 증명하기 위하여 FACS를 이용하여 순도를 측정하였다. 소량의 세포를 분취 후 PI와 형광염색소가 붙어있는 CD3e 및 γδ T 세포 단일 클론 항체를 붙여 FACS의 그래프를 통해 세포의 순도를 확인하였다(도 4). 첫 번째로 FSC/SSC 척도를 기준하여 전체 세포 범위를 지정한 후 (도 4A) PI의 침투 정도에 의거하여 살아 있는 세포만을 선택하였다 (도 4B).

살아있는 세포들 중 APC-CD3e 단일 클론 항체와 PE-γδ TCR 단일 클론 항체의 염색 측정을 통해 80%이상이 γδ T 세포임을 증명할 수 있었다 (도 4C). γδ T 세포임을 증명된 세포들은 7시간동안 항 CD3 단일 클론 항체 및 IL-2 자극 없이 RPMI 1640 배지로만 휴지 과정을 거친 후 실험에 사용하였다.

2. 1차 진생베리 농축액 발효물 분획샘플이 과활성화된 표피 γδ T 세포 및 활성화된 림프절 T 세포에 미치는 영향 연구

진생베리 농축액 발효물을 Diaion HP-20 컬럼 크로마토그래피와 메탄올, 아세톤으로 분리한 1차 샘플(샘플 1-1 ~ 1-4)이 아토피성 피부염의 면역에 미치는 영향을 확인하기 위해 먼저 샘플들을 표피 γδ T 세포에 처리하여 FACS를 통해 세포독성을 확인하였다 (도 5A). 10, 50, 100 ㎍/㎖의 농도로 처리한 결과, 샘플 1-1은 100 ㎍/㎖ 농도에서 유의하게 세포독성을 나타냈으며 10 ㎍/㎖에서 유의하게 생존율이 증가하였다. 샘플 1-2는 50 ㎍/㎖에서 유의하게 세포독성을 나타냈다. 샘플 1-4도 50 ㎍/㎖에서 유의하게 세포독성이 나타났으며, 10 ㎍/㎖에서 유의하게 대조군보다 낮은 생존율을 보였다. 샘플 1-3은 10 ㎍/㎖에서 유의하게 세포독성이 나타났다. 이를 토대로 후행 연구의 시료 농도는 100 ㎍/㎖ 이하의 농도 범위에서 진행하였다.

다음은 FACS 실험에서 분취한 상등액으로 ELISA를 통해 Th2형 사이토카인 IL-13의 생산량을 측정하였다 (도 5B). 샘플 모두 100 ㎍/㎖ 이하의 농도에서 고농도로 갈수록 유의하게 IL-13 생산량이 감소하였다.

1차 진생베리 농축액 발효물 분획샘플이 전신 면역에 미치는 영향을 확인하기 위해 먼저 샘플들을 림프절 T 세포에 처리하여 MTT assay를 통해 세포독성을 확인하였다 (도 6A). 0.1, 1, 10, 100 ㎍/㎖의 농도로 처리한 결과, 샘플 1-1을 제외한 나머지 샘플 1-2, 1-3, 1-4는 100 ㎍/㎖에서 유의하게 세포독성이 나타났다. 또한 샘플 1-2는 1, 10 ㎍/㎖에서 유의하게 대조군보다 낮은 생존율을 보였다. 샘플 1-3은 1 ㎍/㎖이하의 농도에서, 샘플 1-4는 1, 10 ㎍/㎖에서 유의하게 생존율이 증가하였다. 이러한 결과를 토대로 후행 연구의 샘플 농도는 100 ㎍/㎖ 이하의 농도 범위에서 진행하였다.

다음은 MTT assay에서 분취한 상등액으로 ELISA를 통해 Th1형 사이토카인 IL-2의 생산량을 측정하였다 (도 6B). 샘플 1-1은 10 ㎍/㎖ 이하의 농도에서 유의하게 IL-2 생산량이 증가했으며 100 ㎍/㎖에서 더 높은 IL-2 생산량을 보였다. 샘플 1-2 및 1-4은 1, 10 ㎍/㎖에서 유의하게 농도의존적으로 IL-2 생산량이 증가하였으며 100 ㎍/㎖에서 감소하였다. 특히 샘플 1-4이 현저하게 IL-2 생산을 증가시켰다. 샘플 1-3은 100 ㎍/㎖ 이하의 농도에서 농도의존적으로 유의하게 감소하였다.

실험 결과, 샘플 1-1은 표피 γδ T 세포 실험의 50 ㎍/㎖이하의 농도에서 유의하게 세포독성 없이 농도의존적으로 IL-13 생산을 억제하였다. 그리고 림프절 T 세포 실험에서는 최고 농도인 100 ㎍/㎖에서 세포 독성 없이 IL-2 생산이 대조군보다 유의하게 증가하였다. 샘플 1-2와 1-4는 표피 γδ T 세포 실험의 10 ㎍/㎖에서 세포 독성 없이 IL-13 생산을 억제하였다. 그리고 림프절 T 세포실험의 10 ㎍/㎖ 이하의 농도에서 유의하게 세포 독성 없이 농도의존적으로 IL-2 생산이 증가하였다. 샘플 1-3은 표피 γδ T 세포 실험의 최저 농도인 10 ㎍/㎖에서도 세포 독성을 보여 분획 후보에서 제외하였다. 이 중 표피 γδ T 세포를 증가시키지 않고 IL-13을 억제하는 효과가 있는 1-2를 분획 후보로 선택하였다. 샘플 1-2는 에틸아세테이트를 이용하여 지용성 성분을 녹여낸 EA 층 샘플 2-1와 수용성 성분을 녹여낸 물 층 샘플 2-2으로 분획하였다.

3. 2차 진생베리 농축액 발효물 분획샘플이 과활성화된 표피 γδ T 세포 및 활성화된 림프절 T 세포에 미치는 영향 연구

샘플 1-2에서 분획한 2차 진생베리 농축액 발효물 분획샘플(샘플 2-1, 2-2)이 아토피성 피부염의 면역에 미치는 영향을 확인하기 위해 먼저 샘플들을 표피 γδ T 세포에 처리하여 FACS를 통해 세포독성을 확인하였다(도 7A). 10, 50, 100 ㎍/㎖의 농도로 처리한 결과, 샘플 2-2는 100 ㎍/㎖에서 유의하게 세포독성을 보였다. 샘플 2-1은 100 ㎍/㎖ 이하의 농도에서 농도의존적으로 유의하게 증가한 세포 생존율을 보여 표피 γδ T 세포가 증식하였음을 나타냈다.

다음은 FACS 실험에서 분취한 상등액으로 ELISA를 통해 IL-13의 생산량을 측정하였다(도 7B). 샘플 모두 100 ㎍/㎖ 이하의 농도에서 농도의존적으로 유의하게 생산량이 감소하였다.

2차 진생베리 농축액 발효물 분획샘플이 전신 면역에 미치는 영향을 확인하기 위해 먼저 샘플들을 림프절 T 세포에 처리하여 MTT assay를 통해 세포독성을 확인하였다 (도 8A). 0.1, 1, 10, 100 ㎍/㎖의 농도로 처리한 결과, 샘플 모두 10 ㎍/㎖ 이하의 농도에서 대조군보다 세포 생존율이 높아 림프절 T 세포가 증식하였음을 확인하였다. 또한 100 ㎍/㎖에서 유의하게 생존율이 감소하였다.

다음은 MTT assay에서 분취한 상등액으로 ELISA를 통해 IL-2의 생산량을 측정하였다(도 8B). 샘플 2-1은 10 ㎍/㎖ 이하의 농도에서 유의하게 감소하다가 100 ㎍/㎖의 농도에서 증가하였다. 샘플 2-2는 1 ㎍/㎖ 이하의 농도에서 농도의존적으로 유의하게 감소하였으며, 10 ㎍/㎖에서도 감소하는 경향을 보였지만 유의하진 않았다.

실험 결과, 표피 γδ T 세포 실험에서 샘플 2-1은 100 ㎍/㎖ 이하의 농도에서 생존율이 농도의존적으로 유의하게 증가하였으며, IL-13은 농도의존적으로 유의하게 감소하였다. 샘플 2-2은 50 ㎍/㎖ 이하의 농도에서 유의하게 세포 독성 없이 농도의존적으로 IL-13 생산을 억제하는 효과가 나타났다. 여기서 샘플 2-1이 표피 γδ T 세포가 증가하면서 IL-13을 억제하는 모습을 보여 샘플 2-2보다 IL-13 억제력이 강하다는 것을 알 수 있다. 또한 2차 샘플 모두 10 ㎍/㎖ 이하의 농도에서 유의하게 세포 독성 없이 IL-2 생산을 억제하는 모습을 보였다. 대조군보다 IL-2 생산량이 높은 이유는 실험을 하는 동안 배지를 갈아주지 않아 사이토카인이 계속 누적되기 때문이다. 이 후 다음 실험을 위해 IL-13 억제 효과가 있는 샘플 2-1 과 2-2를 둘 다 분리하였다. 샘플 2-1은 ODS 컬럼 크로마토그래피와 메탄올을 이용하여 3차 샘플(3-1 ~ 3-8)을 얻고, 샘플 2-2는 ODS 컬럼 크로마토그래피와 MPLC, 메탄올을 이용하여 6차 샘플(6-1 ~ 6-7)을 얻었다.

4. 3차 진생베리 농축액 발효물 분획샘플이 과활성화된 표피 γδ T 세포 및 활성화된 림프절 T 세포에 미치는 영향 연구

샘플 2-1에서 분획한 3차 진생베리 농축액 발효물 분획샘플(샘플 3-1 ~ 3-8)이 아토피 피부염의 면역에 미치는 영향을 확인하기 위해 먼저 샘플들을 표피 γδ T 세포에 처리하여 FACS를 통해 세포독성을 확인하였다 (도 9A, C). 10, 50, 100 ㎍/㎖의 농도로 처리한 결과, 샘플 3-3은 100 ㎍/㎖에서, 샘플 3-2는 50 ㎍/㎖에서, 샘플 3-4 ~ 3-8은 10 ㎍/㎖에서 각각 유의하게 세포독성을 나타냈다. 샘플 3-1은 50 ㎍/㎖ 이하의 농도에서 세포 생존율이 농도의존적으로 유의하게 증가하여 표피 γδ T 세포가 증식했음을 알 수 있다.

다음은 FACS 실험에서 분취한 상등액으로 ELISA를 통해 IL-13의 생산량을 측정하였다 (도 9B, D). 샘플 3-1은 50 ㎍/㎖ 이하의 농도에서 농도의존적으로 유의하게 IL-13 생산량이 증가하였다. 샘플 3-3은 50 ㎍/㎖ 이하의 농도에서 유의하게 높은 IL-13 생산량을 보이고, 100 ㎍/㎖에서 유의하지 않지만 감소하는 경향을 보였다. 나머지 샘플 3-2, 3-4, 3-5, 3-6, 3-7, 3-8은 100 ㎍/㎖ 이하의 농도에서 고농도로 갈수록 유의하게 IL-13 생산량이 감소하였다.

3차 진생베리 농축액 발효물 분획샘플이 전신 면역에 미치는 영향을 확인하기 위해 샘플들을 림프절 T 세포에 처리하여 MTT assay를 통해 세포독성을 확인하였다(도 10A, C, E). 0.1, 1, 10, 100 ㎍/㎖의 농도로 처리한 결과, 샘플 3-1, 3-2, 3-5, 3-6, 3-7, 3-8은 100 ㎍/㎖ 농도에서 유의하게 세포독성을 보였다. 샘플 3-1은 10 ㎍/㎖이하의 농도에서 생존율이 농도의존적으로 유의하게 증가하였다. 샘플 3-2와 3-3은 10 ㎍/㎖이하의 농도에서 세포 생존율이 농도의존적으로 유의하게 감소하였다. 샘플 3-4는 유의하진 않지만 100 ㎍/㎖ 이하의 농도에서 생존율이 약간 증가하는 경향을 보이며, 100 ㎍/㎖에서 유의하게 증가하였다. 샘플 3-5는 유의하지 않지만 10 ㎍/㎖ 이하의 농도에서 생존율이 증가하는 경향을 보였다. 샘플 3-6은 1 ㎍/㎖이하의 농도에서 유의하게 대조군보다 낮은 생존율을 보였지만 고농도로 갈수록 증가하였다. 샘플 3-7은 10 ㎍/㎖에서 생존율이 유의하게 증가하였으며, 샘플 3-8은 0.1 ㎍/㎖에서 생존율이 유의하게 감소하였다.

다음은 MTT assay에서 분취한 상등액으로 ELISA를 통해 IL-2의 생산량을 측정하였다(도 10B, D, F). 샘플 3-1은 100 ㎍/㎖ 이하의 농도에서 IL-2 생산량이 고농도로 갈수록 유의하게 증가하였다. 샘플 3-2는 IL-2 생산량이 유의하게 농도의존적으로 1 ㎍/㎖ 농도까지 증가하다가 10, 100 ㎍/㎖ 농도에서 감소하였다. 샘플 3-3은 100 ㎍/㎖ 이하의 농도에서 대조군에 비해 IL-2 생산량이 유의하게 증가하였다. 샘플 3-4는 10 ㎍/㎖ 이하의 농도에서 농도의존적으로 유의하게 감소하였다. 샘플 3-5, 3-6은 1 ㎍/㎖ 이하의 농도에서 농도의존적으로 유의하게 감소하였으며, 10 ㎍/㎖에서 유의하지 않지만 감소하는 경향을 보였다. 샘플 3-7은 10 ㎍/㎖ 이하의 농도에서 고농도로 갈수록 IL-2 생산량이 증가하였다. 샘플 3-8은 1, 10 ㎍/㎖에서 유의한 값을 나타내지 않았지만, 10 ㎍/㎖이하의 농도에서 IL-2 생산량이 농도의존적으로 증가하는 경향을 보였다. 또한 샘플 3-1, 3-5, 3-6, 3-8은 세포 독성이 나타난 100 ㎍/㎖ 농도에서 IL-2 생산량이 증가하는 모습을 나타냈다.

실험 결과, 샘플 3-4 ~ 3-8은 표피 γδ T 세포 실험의 최저 농도 10 ㎍/㎖에서도 세포 독성을 보였기 때문에 분획 후보에서 제외하였다. 샘플 3-3은 100 ㎍/㎖에서 IL-13을 억제하는 효과가 나타나는 듯 보이지만 이는 생존율 감소로 인한 자연스러운 현상으로 분획 후보에서 제외하였다. 샘플 3-1은 표피 γδ T 세포 실험의 50 ㎍/㎖ 이하의 농도에서 생존율이 유의하게 증가하였다가 100 ㎍/㎖에서 감소하였다. IL-13 생산량은 50 ㎍/㎖ 이하의 농도에서 대조군과 차이가 없다가 100 ㎍/㎖에서 감소하였다. 샘플 3-2는 표피 γδ T 세포 실험의 10 ㎍/㎖에서 생존율이 유의하게 증가하고 50 ㎍/㎖ 이상의 농도에서 농도의존적으로 크게 감소하여 세포 독성을 보였다. IL-13 생산량은 10 ㎍/㎖에서 대조군과 차이가 없었지만 50 ㎍/㎖ 이상의 농도에서 농도의존적으로 크게 감소하였다. 이 역시 생존율 감소로 인한 자연스러운 현상이지만 그래프의 전체적인 모습을 봤을 때 샘플 3-2가 샘플 3-1보다 낮은 농도(10 ㎍/㎖와 50 ㎍/㎖ 사이)에서 세포독성이 약하고 IL-13 억제력이 강력하게 나타날 것으로 예측하여 이를 분획후보로 선택하였다. 따라서 샘플 3-2를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피와 클로로포름 및 메탄올을 이용하여 4차 샘플(4-1 ~ 4-5)를 얻었다. 또한 표피 γδ T 세포실험에서 3차 샘플 대다수가 100 ㎍/㎖에서 세포독성을 보였기 때문에 4차 샘플의 표피 γδ T 세포실험의 최고농도를 50 ㎍/㎖로 낮추어 설정하였다.

5. 4차 진생베리 농축액 발효물 분획샘플이 과활성화된 표피 γδ T 세포 및 활성화된 림프절 T 세포에 미치는 영향 연구

샘플 3-2에서 분획한 4차 진생베리 농축액 발효물 분획샘플(샘플 4-1 ~ 4-5)이 아토피 피부염의 면역에 미치는 영향을 확인하기 위해 샘플들을 표피 γδ T 세포에 처리하여 FACS를 통해 세포독성을 확인하였다 (도 11A). 1, 10, 50 ㎍/㎖의 농도로 처리한 결과, 샘플 4-3, 4-5는 50 ㎍/㎖ 농도에서, 샘플 4-1, 4-2, 4-4는 10 ㎍/㎖ 농도에서 유의하게 세포독성을 나타냈다. 또한 샘플 4-1과 4-4는 1 ㎍/㎖에서 생존율이 유의하게 감소했다.

다음은 FACS 실험에서 분취한 상등액으로 ELISA를 통해 IL-13의 생산량을 측정하였다 (도 11B). 샘플 4-5는 10 ㎍/㎖에서 유의하게 IL-13 생산량이 증가하였다. 나머지 샘플 4-1, 4-2, 4-3, 4-4는 50 ㎍/㎖ 농도 이하에서 IL-13 생산량이 유의하게 감소하는 경향을 보였다.

4차 진생베리 농축액 발효물 분획샘플이 전신 면역에 미치는 영향을 확인하기 위해 먼저 샘플들을 림프절 T 세포에 처리하여 MTT assay를 통해 세포독성을 확인하였다 (도 12A, C). 0.1, 1, 10, 100 ㎍/㎖의 농도로 처리한 결과, 샘플 4-1, 4-2, 4-3, 4-5는 100 ㎍/㎖ 농도에서, 샘플 4-4는 10 ㎍/㎖ 농도에서 유의하게 세포 독성을 보였다. 또한 샘플 4-1, 4-2, 4-3은 10 ㎍/㎖에서 유의하게 생존율이 감소하였다.

다음은 MTT assay에서 분취한 상등액으로 ELISA를 통해 IL-2의 생산량을 측정하였다 (도 12B, D). 샘플 4-1과 4-5는 10 ㎍/㎖ 이하의 농도에서, 샘플 4-4는 1 ㎍/㎖ 이하의 농도에서 유의하게 매우 높은 IL-2 생산량을 나타내었다. 샘플 4-2는 10 ㎍/㎖ 이하의 농도에서 대조군과 IL-2 생산량 차이가 없었으며, 샘플 4-3은 10 ㎍/㎖ 이하의 농도에서 유의하진 않지만 증가하는 경향을 보였다. 또한 4차 샘플 모두 세포독성이 있는 100 ㎍/㎖에서 IL-2 생산량이 매우 낮았다.

실험 결과, 샘플 4-5는 표피 γδ T 세포 실험의 IL-13 생산을 증가시켰기 때문에 분획 후보에서 제외하였다. 샘플 4-3은 표피 γδ T 세포 실험의 10 ㎍/㎖이하의 농도에서 IL-13 생산을 농도의존적으로 유의하게 억제하였다. 샘플 4-1, 4-2, 4-4가 1 ㎍/㎖에서 IL-13 생산을 농도의존적으로 유의하게 억제하였다. 하지만 샘플 4-1은 10 ㎍/㎖에서 약간의 세포독성을 보였음에도 IL-13의 생산을 아예 하지 않았기 때문에 분획 후보에서 제외하였다. 남은 샘플 4-2, 4-3, 4-4 중 림프절 T 세포 실험의 1 ㎍/㎖이하의 농도에서 IL-2 생산을 유의하고 크게 증가시킨 4-4를 선택하여 분리하였다. 샘플 4-4는 LH 20 컬럼 크로마토그래피와 메탄올, Sep-pak 카트리지, HPLC 등을 이용하여 5차 샘플(5-1 ~ 5-3)을 얻었다.

6. 5차 진생베리 농축액 발효물 분획샘플이 과활성화된 표피 γδ T 세포 및 활성화된 림프절 T 세포에 미치는 영향 연구

샘플 4-2에서 분획한 5차 진생베리 농축액 발효물 분획샘플(샘플 5-1, 5-2, 5-3)이 아토피성 피부염의 면역에 미치는 영향을 확인하기 위해 먼저 샘플들을 표피 γδ T 세포에 처리하여 FACS를 통해 세포독성을 확인하였다 (도 13A). 0.1, 1, 10, 50 ㎍/㎖의 농도로 처리한 결과, 샘플 5-3은 50 ㎍/㎖에서 유의하게 세포독성을 보이고, 10 ㎍/㎖에서 세포 생존율이 유의하게 감소하였다. 샘플 5-1 및 5-2는 10 ㎍/㎖에서 유의하게 세포독성을 보였으며, 1 ㎍/㎖에서 생존율이 유의하게 감소하였다.

다음은 FACS 실험에서 분취한 상등액으로 ELISA를 통해 IL-13의 생산량을 측정하였다 (도 13B). 샘플 5-1은 IL-13 생산량이 유의하게 농도의존적으로 1 ㎍/㎖ 농도까지 증가했다가 10, 50 ㎍/㎖에서 농도의존적으로 감소하였다. 샘플 5-2 및 5-3은 50 ㎍/㎖ 이하의 농도에서 농도의존적으로 유의하게 감소하였다.

5차 진생베리 농축액 발효물 분획샘플이 전신면역에 미치는 영향을 확인하기 위해 샘플들을 림프절 T 세포에 처리하여 MTT assay를 통해 세포독성을 확인하였다 (도 14A). 0.1, 1, 10, 100 ㎍/㎖의 농도로 처리한 결과, 샘플 5-3은 유의하게 50 ㎍/㎖에서 세포독성을 보이고 25 ㎍/㎖ 농도에서 감소하였다. 샘플 5-1, 5-2는 10 ㎍/㎖ 농도에서 유의하게 세포독성을 보였다.

다음은 MTT assay에서 분취한 상등액으로 ELISA를 통해 IL-2의 생산량을 측정하였다 (도 14B). 샘플 5-1은 50 ㎍/㎖ 이하의 농도에서 농도의존적으로 유의하게 IL-2 생산량이 감소하였다. 샘플 5-2은 유의하진 않지만 1 ㎍/㎖ 농도까지 IL-2 생산량이 감소하는 경향을 보이다가 10 ㎍/㎖ 농도에서 유의하게 급증하여 다시 감소하는 경향을 보였다. 샘플 5-3는 1, 50 ㎍/㎖에서 유의하게 IL-2 생산량이 감소하였다.

실험 결과, 샘플 5-2는 표피 γδ T 세포 실험의 1 ㎍/㎖ 이하 농도에서 유의하고 세포 독성 없이 IL-13 생산을 억제하는 효과를 나타냈다. 샘플 5-3은 10 ㎍/㎖ 이하의 농도에서 유의하고 세포 독성 없이 IL-13 생산을 억제하는 효과를 나타냈다. 하지만 5차 샘플을 모두 구조 동정한 결과, 새로운 화합물이 아닌 기존에 알려진 물질인 진세노사이드 Rh3, Rh16, Rh2임을 밝혀냈다. 다음은 물 층에서 분획한 6차 샘플을 실험하였으며, 표피 γδ T 세포로 실험한 5차 샘플 대부분이 50 ㎍/㎖에서 큰 세포독성을 보였기에 최고농도를 25 ㎍/㎖로 설정하였다.

7. 6차 진생베리 농축액 발효물 분획샘플이 과활성화된 표피 γδ T 세포 및 활성화된 림프절 T 세포에 미치는 영향 연구

샘플 2-2에서 분획한 6차 진생베리 농축액 발효물 분획샘플(샘플 6-1 ~ 6-7)이 아토피 피부염의 면역에 미치는 영향을 확인하기 위해 먼저 샘플들을 표피 γδ T 세포에 처리하여 FACS를 통해 세포독성을 확인하였다 (도 15A, C). 1, 10, 25 ㎍/㎖의 농도로 처리한 결과, 샘플 6-1은 유의하지 않지만 10 ㎍/㎖까지 생존율이 증가하는 경향을 보였으며 25 ㎍/㎖에서 유의하게 증가하였다. 샘플 6-2는 1, 25 ㎍/㎖에서 생존율이 유의하게 감소하였다. 샘플 6-3와 6-5는 유의하지않지만 25 ㎍/㎖이하의 농도에서 생존율이 증가하는 경향을 보였다. 샘플 6-4는 10 ㎍/㎖에서 유의하게 생존율이 증가하였으며, 샘플 6-6은 10 ㎍/㎖이하의 농도에서 생존율이 대조군보다 유의하게 낮은 값을 보였지만 농도의존적으로 증가하였다. 또한 25 ㎍/㎖에서 유의하지 않지만 증가하는 경향을 보였다. 샘플 6-7은 25 ㎍/㎖에서 유의하게 감소한 생존율을 보였다.

다음은 FACS 실험에서 분취한 상등액으로 ELISA를 통해 IL-13의 생산량을 측정하였다 (도 15B, D). 샘플 6-1, 6-3, 6-5, 6-7은 25 ㎍/㎖이하의 농도에서 IL-13 생산량이 고농도로 갈수록 유의하게 감소하였다. 샘플 6-2는 10 ㎍/㎖이하의 농도에서 IL-13 생산량이 고농도로 갈수록 유의하게 감소하였다. 샘플 6-4도 10 ㎍/㎖이하의 농도에서 유의하게 감소하였으며, 25 ㎍/㎖에서 유의하지 않지만 감소하는 경향을 보였다. 샘플 6-6은 IL-2 생산량이 25 ㎍/㎖이하의 농도에서 유의하게 대조군보다 낮은 값을 나타냈지만 농도의존적으로 증가하였다.

6차 진생베리 농축액 발효물 분획샘플이 전신면역에 미치는 영향을 확인하기 위해 샘플들을 림프절 T 세포에 처리하여 MTT assay를 통해 세포독성을 확인하였다 (도 16A, C). 0.1, 1, 10, 50 ㎍/㎖의 농도로 처리한 결과, 샘플 6-4만 50 ㎍/㎖에서 유의하게 세포독성을 보였다. 샘플 6-1, 6-2는 유의하진 않으나 고농도로 갈수록 생존율이 증가하는 경향을 보였다. 샘플 6-3은 10 ㎍/㎖ 이하의 농도에서 대조군보다 유의하게 높은 생존율을 나타내다가 50 ㎍/㎖에서 유의하게 감소하였다. 샘플 6-5는 1 ㎍/㎖에서 유의하게 높은 생존율을 나타냈다. 샘플 6-6은 50 ㎍/㎖이하의 노도에서 대조군보다 유의하게 높은 생존율을 나타내고 농도의존적으로 감소하였다.

다음은 MTT assay에서 분취한 상등액으로 ELISA를 통해 IL-2의 생산량을 측정하였다 (도 16B, D). 샘플 6-1, 6-2는 10, 50 ㎍/㎖에서 농도의존적으로 유의하게 IL-2 생산량이 증가하였다. 샘플 6-3과 대조군과 별 차이를 보이지 않았다. 샘플 6-4는 10 ㎍/㎖ 이하의 농도에서 유의하게 낮은 IL-2 생산량을 보였다. 샘플 6-5는 10 ㎍/㎖이하의 농도에서 대조군보다 유의하게 낮은 IL-2 생산량을 보였으며 농도의존적으로 증가하였다. 샘플 6-6은 0.1 ㎍/㎖에서 유의하게 낮은 IL-2 생산량을 보였다. 샘플 6-7은 10 ㎍/㎖ 이하의 농도에서 대조군보다 유의하게 낮은 IL-2 생산량을 보였으며 50 ㎍/㎖에서 유의하게 증가하였다.

8. 7차 진생베리 농축액 발효물 분획샘플이 과활성화된 표피 γδ T 세포 및 활성화된 림프절 T 세포에 미치는 영향 연구

샘플 6-3에서 분획한 7차 진생베리 농축액 발효물 분획샘플(샘플 7-1 ~ 7-3)이 아토피성 피부염의 면역에 미치는 영향을 확인하기 위해 먼저 샘플들을 표피 γδ T 세포에 처리하여 FACS를 통해 세포독성을 확인하였다 (도 16A). 1, 10, 25, 50 ㎍/㎖의 농도로 처리한 결과, 샘플 7-2와 7-3은 1 ㎍/㎖에서 생존율이 유의하게 감소하였다. 또한 샘플 모두 유의하진 않지만 1, 10 ㎍/㎖에서 세포 생존율이 증가하는 경향을 보이며 25 ㎍/㎖ 이상 농도에서 유의하게 증가하였다.

다음은 FACS 실험에서 분취한 상등액으로 ELISA를 통해 IL-13의 생산량을 측정하였다 (도 16B). 샘플 7-2는 50 ㎍/㎖이하의 농도에서 IL-13의 생산량이 농도의존적으로 유의하게 증가하였다. 샘플 7-3은 1, 10 ㎍/㎖에서 유의하게 낮은 IL-13 생산량을 보였으며, 25, 50 ㎍/㎖에서 유의하지 않지만 농도 의존적으로 증가하는 경향을 보였다.

7차 진생베리 농축액 발효물 분획샘플이 전신 면역에 미치는 영향을 확인하기 위해 샘플들을 림프절 T 세포에 처리하여 MTT assay를 통해 세포독성을 확인하였다(도 17A). 1, 10, 25, 50 ㎍/㎖의 농도로 처리한 결과, 샘플 7-1은 25 ㎍/㎖이하의 농도에서 유의하지 않지만 세포 생존율이 농도의존적으로 증가하는 경향을 보였으며 50 ㎍/㎖에서는 유의하게 증가하였다. 샘플 7-2는 50 ㎍/㎖에서 유의하게 생존율이 증가하였다. 샘플 7-3은 10 ㎍/㎖ 이하의 농도에서 유의하게 대조군보다 낮은 생존율을 보였으며, 25, 50 ㎍/㎖에서 유의하지 않지만 생존율이 증가하는 경향을 보였다.

다음은 MTT assay에서 분취한 상등액으로 ELISA를 통해 IL-2의 생산량을 측정하였다(도 18B). 샘플 7-1은 25 ㎍/㎖ 이하의 농도에서 IL-2 생산량이 유의하게 농도의존적으로 감소하였다. 샘플 7-2은 25, 50 ㎍/㎖에서 유의하게 농도의존적으로 IL-2 생산량이 농도의존적으로 증가하였다. 샘플 7-3은 10 ㎍/㎖에서 유의하게 IL-2 생산량이 증가하고, 유의하진 않지만 고농도로 갈수록 IL-2 생산량이 감소하였다.

실험 결과, 상위 분획물인 샘플 6-3과 달리 7차 샘플 모두 IL-13 생산이 억제되는 효과가 나타나지 않았다.

결과 정리

진생베리 농축액 발효물을 Diaion HP-20 컬럼 크로마토그래피로 각 30%, 70%, 100% 메탄올과 100% 아세톤으로 분리한 것을 1차 샘플이라 하였다. 1차 샘플 실험 결과, 표피 γδ T 세포를 증가시키지 않고 IL-13을 억제하는 효과가 있는 1-2를 분획 후보로 선택하였다. 샘플 1-2는 EA를 이용하여 EA 층 샘플 2-1와 물 층 샘플 2-2으로 분획하였다. 샘플 2-2보다 샘플 2-1에 더 상대적으로 소수성인 물질이 녹아있을 것으로 예상하였다.

2차 샘플 실험 결과, 표피 γδ T 세포 실험에서 샘플 2-1은 100 ㎍/㎖ 이하의 농도에서 생존율이 농도의존적으로 유의하게 증가하였으며, IL-13은 농도의존적으로 유의하게 감소하였다. 샘플 2-2은 50 ㎍/㎖ 이하의 농도에서 유의하게 세포 독성 없이 농도의존적으로 IL-13 생산을 억제하는 효과가 나타났다. 여기서 샘플 2-1이 표피 γδ T 세포가 증가하면서 IL-13을 억제하는 모습을 보여 샘플 2-2보다 IL-13 억제력이 강하다는 것을 알 수 있다. 또한 2차 샘플 모두 10 ㎍/㎖ 이하의 농도에서 유의하게 세포 독성 없이 IL-2 생산을 억제하는 모습을 보였다. 대조군보다 IL-2 생산량이 높은 이유는 실험을 하는 동안 배지를 갈아주지 않아 사이토카인이 계속 누적되기 때문이다. 이 후 다음 실험을 위해 IL-13 억제 효과가 있는 샘플 2-1 과 2-2를 둘 다 분리하였다. 샘플 2-1은 ODS 컬럼 크로마토그래피와 메탄올을 이용하여 3차 샘플(3-1 ~ 3-8)을 얻고, 샘플 2-2는 ODS 컬럼 크로마토그래피와 MPLC, 메탄올을 이용하여 6차 샘플(6-1 ~ 6-7)을 얻었다. 3차가 6차 샘플보다 상대적으로 더 소수성인 물질이 분포되어 있을 것이라 예상하였다.

3차 샘플 실험 결과, 그래프의 전체적인 모습을 봤을 때 샘플 3-2가 샘플 3-1보다 낮은 농도(10 ㎍/㎖와 50 ㎍/㎖ 사이)에서 세포독성이 약하고 IL-13 억제력이 강력하게 나타날 것으로 예측하여 이를 분획후보로 선택하였다. 따라서 샘플 3-2를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피와 클로로포름 및 메탄올을 이용하여 4차 샘플(4-1 ~ 4-5)를 얻었다. 또한 표피 γδ T 세포실험에서 3차 샘플 대다수가 100 ㎍/㎖에서 세포독성을 보였기 때문에 4차 샘플의 표피 γδ T 세포실험의 최고농도를 50 ㎍/㎖로 낮추어 설정하였다.

4차 샘플 실험 결과, 샘플 4-1, 4-2, 4-4가 1 ㎍/㎖에서 IL-13 생산을 농도의존적으로 유의하게 억제하였다. 하지만 샘플 4-1은 10 ㎍/㎖에서 약간의 세포독성을 보였음에도 IL-13의 생산을 아예 하지 않았기 때문에 분획 후보에서 제외하였다. 남은 샘플 4-2, 4-4 중 림프절 T 세포 실험의 1 ㎍/㎖이하의 농도에서 IL-2 생산을 유의하고 크게 증가시킨 4-4를 선택하여 분리하였다. 샘플 4-4는 LH 20 컬럼 크로마토그래피와 메탄올, Sep-pak 카트리지, HPLC 등을 이용하여 5차 샘플(5-1 ~ 5-3)을 얻었다.

5차 샘플 실험 결과, 샘플 5-2는 표피 γδ T 세포 실험의 1 ㎍/㎖ 이하 농도에서 유의하고 세포 독성 없이 IL-13 생산을 억제하는 효과를 나타냈다. 샘플 5-3은 10 ㎍/㎖ 이하의 농도에서 유의하고 세포 독성 없이 IL-13 생산을 억제하는 효과를 나타냈다. 하지만 5차 샘플을 모두 구조 동정한 결과, 새로운 화합물이 아닌 기존에 알려진 물질인 진세노사이드 Rh₃, Rh₁₆, Rh₂임을 밝혀냈다. Rh₂는 대표적인 소수성 진세노사이드로 물질의 극성에 관해 예상이 일부 적중했다는 것을 알 수 있다. 다음은 물 층에서 분획한 6차 샘플을 실험하였으며, 표피 γδ T 세포로 실험한 5차 샘플 대부분이 50 ㎍/㎖에서 큰 세포독성을 보였기에 최고농도를 25 ㎍/㎖로 설정하였다.

6차 샘플 실험 결과, 샘플 6-1, 6-3, 6-4, 6-5, 6-6, 6-7이 표피 γδ T 세포 실험의 25 ㎍/㎖ 이하 농도에서 세포 독성 없이 유의하게 IL-13 생산을 억제하는 효과를 나타냈다. 이 중 IL-13 억제력이 가장 강한 샘플 6-7를 ODS 컬럼 크로마토그래피와 메탄올, MPLC로 분리하여 7차 샘플(7-1 ~ 7-3)을 얻었다. 표피 γδ T 세포실험 중 25 ㎍/㎖ 농도에서 대부분의 6차 샘플이 세포 독성을 보이지 않았기 때문에 후행 실험의 최고농도를 50 ㎍/㎖로 설정하였다. 7차 샘플에 상대적으로 소수성 물질이 포함되어 있을 것이라 예상하였다.

7차 샘플 실험 결과, 상위 분획물과 달리 7차 샘플 모두 IL-13 생산이 억제되는 효과가 나타나지 않았다.

본 연구 수행 결과, 진생베리 농축액 발효물로부터 분리된 수 종의 분획프랙션들이 표피 γδ T 세포에 작용하여 사이토카인 생성조절에 관여할 수 있다는 것을 확인하였다. 아토피 피부염과 같은 알러지성 피부 질병은 Th1 세포와 Th2 세포의 사이토카인 불균형, 특히 Th2 세포와 IL-13의 과발현으로 인해 발병된다고 알려져 있다 (11). Th1형 사이토카인인 IL-2는 T 세포의 증식과 이펙터 및 기억 세포의 생성에 필수적인 T 세포 성장 인자인 것으로 밝혀졌으며, Th2형 사이토카인인 IL-13은 T 세포 증식에 대해선 관여하지 않지만 IL-4와 함께 IgE 알레르기 반응에 대해 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다 (22, 23). 아토피 피부염을 효과적으로 치료하기 위해서는 후천면역을 담당하는 T 세포의 성장인자 IL-2에 영향을 끼치지 않으면서 IgE 알레르기의 주요 원인인 IL-13만을 억제하는 것이 중요하다. 실제로 최근에 개발되어 아토피 피부염 치료에 큰 효과를 보고 있는 아토피 피부염의 첫 생물학적 치료제제 두필루맙은 IL-4와 IL-13만을 억제한다 (28). 에틸아세테이트로 분획한 2차 샘플(2-1, 2-2)은 표피 γδ T 세포에 처리했을 때, 50 ㎍/㎖ 이하의 농도에서 세포독성이 보이지 않았으며 IL-13을 강력하고 유의하게 억제하는 효과가 나타나 신체에 대한 안전성 및 항염증 효능을 확인하였다. 배당체 기반의 또한 림프절 T 세포에 처리했을 때, 100 ㎍/㎖에서도 세포독성을 보이지 않았으며 10 ㎍/㎖ 이하의 농도에서 유의하게 IL-2 생산을 억제하여 전신 면역을 억제하는 효능도 관찰할 수 있었다. 하지만 최종 하위 분획물들의 결과는 실험 목적에 부합되지 않았다. 5차 샘플은 IL-13 억제 효과가 있었지만 기존에 있는 진세노사이드 중 일부로 밝혀졌으며, 7차 샘플에서는 IL-13 생산 억제효과가 나타나지 않았다. IL-13 억제 효과가 나타나지 않은 이유는 분획하는 과정 중 IL-13을 억제하는 성분이 제거되었거나 억제시너지 효과를 내는 여러 성분 중 일부가 제거되어 효과가 나타나지 않을 수 있다고 추정된다. 친수성기를 가진 물질들은 분리 정제하는 방법이 까다롭기 때문에 7차 이상의 후행 연구는 어렵다고 판단되었다. 하지만 여러 연구에서 발효균의 종류에 따라 인삼의 특정 성분을 다르게 증가시켰거나 발효식품으로 개발했다고 보고하였다 (62, 63). 따라서 IL-13만을 억제하는 화합물을 찾는 후행 연구에는 다른 균주를 이용한 발효가 필요할 것으로 생각된다.

결론적으로 진생베리 농축액 발효물로부터 아토피 피부염 완화에 도움이 될 수 있는 아직 알려지지 않은 신규 화합물을 순수 분리·동정하는 데는 이르지 못하였으나, 표피 및 림프절 T 세포에 대해 세포독성이 낮은 농도범위에서 IL-13의 생산을 유의하게 억제하는 수종의 분획 프랙션들을 발견하였다. 기존의 사이클로스포린과 같은 범 T 세포 활성화 사이토카인 IL-2을 억제하는 면역억제제는 전신부작용이 크다 (66). 그러나 본 연구에서 찾아낸 진생베리 농축액 발효물의 분획 프랙션은 표피 γδ T 세포에 작용하여 아토피 피부염의 주병인 중 하나인 Th2형 사이토카인 IL-13만을 선택적으로 억제한다. 따라서 전신적 T 세포 면역 반응 억제 부작용이 적은 아토피 피부염 치료 약물 후보 물질로 활용될 수 있는 잠재력이 있다고 판단된다.

Claims (6)

1. 인삼열매(진생베리)를 착즙하는 단계;
   상기 착즙액을 정제수로 추출하는 단계;
   상기 추출물과 조분쇄된 쌀과 콩의 추출물을 여과하여 혼합한 후 Rhizopus Oligosporus를 이용하여 발효하는 단계; 및
   상기 발효물을 다이아니온 에이취피-20(Diaion HP-20) 수지 컬럼 크로마토그래피에서 메탄올과 물의 혼합물 또는 아세톤으로 분리하여 분획물을 제조하고,
   상기 분리물을 1 내지 100 ug/ml의 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는 아토피성 피부염 치료용 조성물.
2. 제 1 항에 있어서 상기 메탄올과 물의 혼합물의 농도비는 메탄올(Methanol) : 물(water)의 비율이 20 : 80 ~ 100 : 0인 것을 특징으로 하는 아토피성 피부염 치료용 조성물.
3. 제 2 항에 있어서, 상기 크로마토그래피에서 메탄올의 농도가 30 내지 100%일 때의 분획물인 것을 특징으로 하는 아토피성 피부염 치료용 조성물.
4. 제 3 항에 있어서, 상기 메탄올의 농도가 69 내지 71%일 때의 분획물인 것을 특징으로 하는 아토피성 피부염 치료용 조성물.
5. 제 3 항에 있어서, 상기 메탄올의 농도가 69 내지 71%의 분획물을 에틸아세테이트로 추가 추출하여 에틸아세테이트 층에 수득하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 아토피성 피부염 치료용 조성물.
6. 제 1 항에 있어서, 상기 분획물은 100% 아세톤에 의한 분획물인 것을 특징으로 하는 아토피성 피부염 치료용 조성물.

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