KR20220109877A - 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 및 전달체 시스템 - Google Patents

환원반응성 일산화질소 공여 화합물 및 전달체 시스템 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생체 내 환원 조건에서 선택적으로 일산화질소를 방출할 수 있는 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물에 관한 것이다.
본 발명의 환원반응성 일산화질소 공여 화합물은 암, 자가면역질환, 난치성 신경질환 또는 감염성질환 예방 또는 치료를 위해 유용하게 사용될 수 있다.

Description

환원반응성 일산화질소 공여 화합물 및 전달체 시스템{REDOX-RESPONSIVE NITRIC MONOXIDE DONATING COMPOUNDS AND DELIVERY SYSTEMS}
본 발명은 생체 내 환원 조건에서 선택적으로 일산화질소를 방출할 수 있는 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물에 관한 것이다.
본 발명의 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물은 암, 자가면역질환, 난치성 신경질환 또는 감염성질환 예방 또는 치료를 위해 유용하게 사용될 수 있다.
일산화질소는 생체 내 효소 및 대사작용에 의해서 합성되는 반응성 기체물질로써 세포분열, 세포사멸, 세포분화, 신경전달, 면역작용, 심혈관계 항상성 유지 등 생리학적 역할에 있어서 중요한 역할을 담당하고 있다.
1998년 일산화질소의 심혈관계 항상성 유지 기작을 밝힌 공로로 세명의 과학자가 노벨 생리의학상을 받은 이후로, 일산화질소의 생의학적인 응용 가능성을 향상시키고자 오랜 기간 일산화질소 공여체 및 전달체가 개발되어 왔다.
특히, 최근 5년간 일산화질소의 항암 작용에 대한 관심이 폭발적으로 증가하여 일산화질소 전달체의 개발 및 항암, 항박테리아제로의 적용을 포함한 다양한 질병분야로의 응용 가능성이 주목받고 있다.
하지만 일산화질소는 가스 형태로 존재하므로 효과적인 전달에 많은 제약이 있으며, 대다수의 기술들이 생체적용이 힘든 자외선 반응성에 의하여 방출되는 일산화질소 공여체 또는 자발적인 분해에 의해 방출되는 일산화질소 공여체를 이용하기에, 실질적인 임상 적용 및 상용화에 한계를 보여주고 있다. 또한, 상기 한계를 가진 공여체라도 질병 부위로 효과적 전달하기 위해서는 복잡한 합성법을 이용해야 하므로 기술의 상용화에 한계가 있다.
따라서, 일산화질소의 생의학적인 응용을 위해서는, 생체 내 특이적 환경에 선택적으로 반응하여 일산화질소를 방출하는 공여체 및 전달체의 개발이 필요한 실정이다.
본 발명자들은 자가-희생 링커를 이용한 환원반응성 일산화질소 방출 화합물이 생체 내 환원 조건에서 선택적으로 분해되어 일산화질소를 방출할 수 있고, 약물, 전달체 또는 약물을 함유하는 전달체에 간편히 부착될 수 있으며, 상기 화합물이 암, 자가면역질환, 난치성 신경질환 또는 감염성질환의 예방 또는 치료 효과를 가진다는 점을 입증하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure pat00001
여기서,
R1은 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C10 알킬렌이며,
R2는 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C10 알킬; 또는, 치환 또는 비치환된 2-싸이오피리딘(2-thiopyridine)이다.
본 발명은 상기 화학식 1에서 R1은 C2 알킬렌이며, R2는 2-싸이오피리딘인, 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물을 제공한다.
본 발명은 상기 환원반응성이 산화환원 반응에 의해 유발된 자가-희생 링커의 자가-희생적 단편화에 의한 것인, 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물을 제공한다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 하기 화학식 4로 표시되는, 약물, 전달체 또는 약물을 함유한 전달체가 접합된 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물을 제공한다.
[화학식 4]
Figure pat00002
여기서,
R1은 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C10 알킬렌이며,
상기 R3는 약물, 전달체 또는 약물을 함유한 전달체이다.
본 발명은 상기 약물이 단백질 약물, 화학적 약물 및 핵산으로부터 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 약물, 전달체 또는 약물을 함유한 전달체가 접합된 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물을 제공한다.
본 발명은 상기 전달체가 고분자, 유기 나노구조체, 무기 나노구조체, 유기 마이크로 구조체, 무기 마이크로구조체, 하이드로젤, 스캐폴드 및 코팅물질로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 약물, 전달체 또는 약물을 함유한 전달체가 접합된 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물을 제공한다.
본 발명은 상기 전달체가 알부민인, 약물, 전달체 또는 약물을 함유한 전달체가 접합된 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물을 제공한다.
본 발명은 상기 알부민이 접합된 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물은 직경이 10-20 nm인, 약물, 전달체 또는 약물을 함유한 전달체가 접합된 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물을 제공한다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물을 유효성분으로 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 상기 암이 전이성 암인, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 상기 약학적 조성물이 비경구 투여되는 것인, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 상기 약학적 조성물이 정맥, 피하, 복강 또는 종양 내 주사를 통해 투여되는 것인, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 상기 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물을 유효성분으로 포함하는, 자가면역질환, 난치성 신경질환 또는 감염성질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 하기 화학식 1의 화합물을 싸이올기를 함유하고 있는 약물, 전달체 또는 약물을 함유한 전달체와 반응시키는 단계를 포함하는 약물, 전달체 또는 약물을 함유한 전달체가 접합된 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물 제조방법을 제공한다.
[화학식 1]
Figure pat00003
여기서,
R1은 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C10 알킬렌이며,
R2는 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C10 알킬; 또는, 치환 또는 비치환된 2-싸이오피리딘(2-thiopyridine)이다.
본 발명은 상기 R1가 C2 알킬렌이며, R2는 2-싸이오피리딘인, 약물, 전달체 또는 약물을 함유한 전달체가 접합된 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물 제조방법을 제공한다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명의 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물을 인간을 포함하는 포유류에 투여하여 암, 자가면역질환, 난치성신경질환 또는 감염성질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 의약의 제조에 있어서, 본 발명의 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물의 용도를 제공한다.
이하 이를 구체적으로 설명한다. 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합은 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기의 구체적인 서술에 의해 본 발명 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure pat00004
여기서,
R1은 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C10 알킬렌이며,
R2는 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C10 알킬; 또는, 치환 또는 비치환된 2-싸이오피리딘(2-thiopyridine)이다.
본 발명에서 “Cx-Cy”여기서 x, y는 1 이상의 정수)는 탄소 개수를 의미한다. 예를 들면, C1-C10 알킬렌은 1 이상 10 이하의 탄소수를 가지는 알킬렌을 의미하며, C1-C10 알킬은 1 이상 10 이하의 탄소수를 가지는 알킬을 의미한다.
본 발명에서 “알킬”은 직쇄 또는 분지쇄 포화탄화수소기를 의미하는 것으로, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, sec-부틸, 이소부틸, tert-부틸, n-펜틸, n-헥실, n-헵틸, n-옥틸, n-노닐, n-디케닐 등을 포함한다.
본 발명에서 “알킬렌”은 상기 정의된 알킬로부터 유도된 2가의 작용기를 의미한다.
본 발명에서 “전구약물(prodrug)”는 불활성 화합물이 투여 후 생체 내에서 활성형인 목적하는 화합물로 변화하는 약물을 의미한다.
본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물은 하나 이상의 비대칭 탄소를 포함할 수 있으며, 이에 따라 라세미체, 라세믹 혼합물, 단일의 에난티오머, 부분 입체 이성질체 혼합물 또는 각각의 부분 입체이성체로서 존재할 수 있다.
상기 이성질체는 종래 이성질체를 분리하기 위한 기술, 예를 들면, 관 크로마토그래피 또는 HPLC 등에 의해 분리가 가능할 수 있다. 또한, 화합물 각각의 입체 이성질체는 공지된 광학적으로 순수한 출발 물질 및/또는 시약을 이용하여 입체 특이적으로 합성할 수 있다.
본 발명에서 “입체 이성질체”는 부분 입체 이성질체(diastereomer) 및 광학 이성질체(enantiomer)를 포함하는 것으로, 광학 이성질체는 거울상 이성질체뿐만 아니라 거울상 이성질체의 혼합물 및 라세미체를 포함한다.
본 발명의 화학식 1로 표시되는 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 및 전구약물은 하기 화학식 2로 표시되는, R1은 C2 알킬렌이며, R2는 2-싸이오피리딘인 화합물 또는 전구약물일 수 있다.
[화학식 2]
Figure pat00005
본 발명에서 “환원반응성”은 생체 내 특정 환원 조건 하에서 유발된 산화환원반응(redox)에 의해 화합물이 단편화(fragmentation)되어 일산화질소를 방출하는 화합물을 방출할 수 있는 특성을 의미한다.
본 발명의 화합물은 강력한 환원 조건 하에서 쉽게 절단될 수 있는 이황화결합을 포함하고 있다. 환원 조건 하에서 절단된 이황화결합으로 인해 유리된 싸이올기(-thiol, -SH)는 분자 내 친핵성 공격이 가능하며, 자가-희생 링커(self-immolative linker)는 분자 내 순환을 거쳐 5원 고리의 형성을 통해 카바메이트(carbamate)를 절단하여 일산화질소 공여자(NO donor)를 방출할 수 있다. 이에 따라 본 발명의 화합물은 자가-희생 링커 및 일산화질소 공여자를 포함하는 화합물로도 정의될 수도 있을 것이다.
본 발명에서 환원반응성은 산화환원 반응에 의해 유발된 자가-희생 링커의 자가-희생적 단편화에 의한 것일 수 있다.
본 발명에서 “자가-희생 링커(self-immolative linker)”는 특정 환원 조건 하에서 한번의 화학 반응이 연쇄반응을 통해 자가-희생적 단편화 과정(self-immolative fragmentation process)을 거쳐 자발적으로 분해되어 일산화질소 공여자를 방출할 수 있는 링커 부분을 의미한다.
본 발명의 실시예들에 따르면, 본 발명의 화합물에서 자가-희생 링커는 하기 화학식 3으로 표시되는 부분을 의미하는 것일 수 있다.
[화학식 3]
Figure pat00006
R1은 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C10 알킬렌이다.
본 발명에서 “
Figure pat00007
”은 연결되는 부분을 표시한 것이다.
후술하는 실험예에 따르면, 본 발명의 자가-희생 링커는 환원 조건 하에서 분해되어 일산화질소 공여자를 방출할 수 있음을 구체적으로 입증하였으며, 나아가 세포 내 환경에서만 특이적으로 분해되어 일산화질소 공여자를 방출할 수 있다는 점을 확인하였다. 본 발명의 화합물이 자가-희생 링커의 분해에 의해 일산화질소 공여자를 방출하는 메커니즘은 도 1a에 나타내었다.
본 발명에서 “일산화질소 공여자(NO donor)”는 일산화질소를 방출할 수 있는 화합물을 의미하며, 본 발명의 실시예들에 따르면, 하기 화학식의 SIN-1으로 지칭되는 3-몰포리노시드노니민(3-morpholinosydnonimine)일 수 있다.
[SIN-1]
Figure pat00008
본 발명에서 “SISIN-1”은 상기 SIN-1 및 자가-희생 링커를 포함하는 화학식 1 또는 2의 화합물 또는 전구약물을 의미하거나, 또는, 약물, 전달체 또는 약물을 함유한 전달체가 접합된 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물에서 약물, 전달체 또는 약물을 함유한 전달체 외에 상기 SIN-1 및 자가-희생 링커가 결합된 부분을 의미하는 것일 수 있다.
예를 들어, 본 명세서에서 SISIN-1이 단독으로 표기된 경우는 화학식 1 또는 2로 나타낸 화합물 또는 전구약물을 의미할 수 있다. 또한, 약물, 전달체 또는 약물을 함유한 전달체가 접합된 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물은 “(약물, 전달체 또는 약물을 함유한 전달체)-SISIN-1”로 표기될 수 있으며, 구체적으로 알부민 및 SISIN-1이 반응하여 제조된 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물은 AL-SISIN-1로 표시될 수 있다.
본 발명의 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물 또는 전구약물은 약물, 전달체 또는 약물을 함유하는 전달체와 화학적 및 물리적 pi-pi결합, 물리적 소수성 결합 및/또는 물리적 수소 결합으로 결합될 수 있다.
본 발명의 실시예들에 따르면, 본 발명의 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물 또는 전구약물은 약물과 화학적 및 물리적 pi-pi결합, 물리적 소수성 결합 및/또는 물리적 수소 결합으로 결합된 것일 수 있다. 본 발명의 실시예들에 따르면, 본 발명의 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물 또는 전구약물은 전달체와 화학적 및 물리적 pi-pi결합, 물리적 소수성 결합 및/또는 물리적 수소 결합으로 결합된 것일 수 있다. 본 발명의 실시예들에 따르면, 본 발명의 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물 또는 전구약물은 화합물을 함유하고 있는 전달체와 화학적 및 물리적 pi-pi결합, 물리적 소수성 결합 및/또는 물리적 수소 결합으로 결합된 것일 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 하기 화학식 4로 표시되는, 약물, 전달체 또는 약물을 함유한 전달체가 접합된 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물을 제공한다.
[화학식 4]
Figure pat00009
여기서,
R1은 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C10 알킬렌이며,
상기 R3은 약물, 전달체 또는 약물을 함유한 전달체이다.
본 발명에서 “약물”은 치료효과가 밝혀진, 목적하는 치료 효과를 위해 대상체에 투여되는 치료제 물질을 의미한다. 상기 약물은 예를 들어, 화학약물, 유전자 치료제, 광열(Photothermal) 치료제 및 광역학(Photodynamic) 치료제, 항생제, 항바이러스제 또는 면역치료제일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며 종래 개발되어 있는 약물이라면 치료하고자 하는 목적에 따라 어느 것이든 사용할 수 있다.
본 발명의 실시예들에 따르면, 상기 약물은 단백질 약물, 화학적 약물 및 핵산으로부터 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 또한, 대상체는 인간 또는 비-인간 포유류를 포함한다.
본 발명에서 “전달체”는 치료를 위한 약물 등을 목표로 하는 타겟으로 전달함에 있어서 생체 내 안정성 및/또는 안전성을 증가시키거나, 타겟 특이성을 향상시킬 수 있는 물질을 의미한다. 상기 전달체는, 예를 들면, 고분자, 유기 나노구조체, 무기 나노구조체, 유기 마이크로 구조체, 무기 마이크로구조체, 하이드로젤, 스캐폴드 및 코팅물질로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 전달체는 추가적으로 약물을 함유한 것을 의미할 수 있다.
본 발명에서 전달체는 이의 유사체를 포함할 수 있다.
본 발명에서 “유사체”는 특정 유기 무기 또는 고분자 화합물 등을 모체로 하여 작용기 도입, 산화, 환원, 치환 등의 모체의 구조 또는 성질을 크게 변화시키지 않는 범위에 포함되는 화합물을 의미한다.
본 발명의 실시예들에 따르면, 전달체는 알부민, 실리카 나노입자(silica nanoparticle, SiNP) 또는 4-arm PEG(4-arm polyethylene glycol)일 수 있다.
후술하는 실험예에 따르면, 본 발명의 약물, 전달체 또는 약물을 함유한 전달체가 접합된 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물은 생체 내 환원 조건에서 특이적으로 분해되어 일산화질소 공여자를 방출할 수 있음을 구체적으로 확인하였으며, 림프절로의 특이적 배수 및 축적을 통해 전이성 암에 대한 예방 또는 치료 효과를 가진다는 점을 확인하였다.
본 발명에서 “알부민”은 간 세포에서 일차적으로 합성되는. 포유류의 혈장에서 가장 풍부한 단백질로서, 혈액 삼투압의 유지, 다양한 기질의 수송 등에 있어서 중요한 역할을 하는 다기능성 혈장 단백질을 의미한다. 알부민은 I, II 및 III의 3개의 도메인을 가지며, 각각의 도메인은 서브도메인 A 및 B로 구성되어 있다. 알부민은 3주의 혈장 반감기를 가지며, 상기 알부민의 긴 반감기는 FcRn(Neonatal Fc receptor)에 의한 알부민의 세포 내 분해와 연관되어 있으며, 알부민의 도메인 I 및 III가 FcRn에 대한 결합에 중요한 역할을 하는 것으로 보고되어 있다.
본 발명에서 “알부민 유사체”는 모(parent) 알부민 단백질 또는 폴리펩타이드로부터 유래된 것으로, 목적하는 특성을 제공하고 있는 부분을 포함하고 있어 모 알부민 단백질 또는 폴리펩타이드와 동일한 또는 유사한 특성을 나타내는 것을 의미한다.
본 발명에서 알부민 또는 이의 유사체는 임의의 종으로부터 유래될 수 있으며, 면역원성을 회피하기 위해 인간 혈청에서 유래된 인간 혈청 알부민(Human serum albumin, HSA)일 수 있다.
본 발명에서 전달체로서 알부민 또는 이의 유사체를 사용하는 경우, 기존 개발되어 있는 약물을 물리적으로 함유할 수 있고, 대량 생산 및 생체적합성 측면에서 질병 치료용 약물로 높은 상용화 가능하다.
본 발명에서 전달체가 접합된 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물의 크기는 치료하고자 하는 질환 또는 전달하고자 하는 조직기관에 따라 적절히 조절할 수 있다. 예를 들어, 특정 암조직으로의 전달을 위해서는 직경을 50-200 nm으로 조절할 수 있으며, 림프절로 전달을 위해서는 직경을 10-100 nm로 조절할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 실시예들에 따르면, 전달체로서 알부민이 접합된 환원반응성 일산화질소 공여 화합물은 직경이 10-100 nm일 수 있으며, 바람직하게는 10-20 nm 일 수 있다. 본 발명에서 화합물의 크기가 상기 범위 미만인 경우, 혈관으로 배수되어 목적하는 수준의 림프절로의 특이적 배수를 달성할 수 없을 수 있고, 상기 범위를 초과하는 경우, 피하 축적으로 인해 목적하는 수준의 림프절로의 특이적 배수를 달성할 수 없을 수 있다.
후술하는 실험예에 따르면, 직경이 10-20 nm인, 알부민이 접합된 환원반응성 일산화질소 공여 화합물이 크기 의존적으로 림프절로의 배수 및 축적된다는 것을 확인하였다.
본 발명의 화학식 4로 표시되는 화합물은 약물, 전달체 또는 약물을 함유한 전달체와 화학적 및 물리적 pi-pi결합, 물리적 소수성 결합 및/또는 물리적 수소 결합으로 결합될 수 있다.
본 발명의 실시예들에 따르면, 본 발명의 화학식 4로 표시되는 화합물은 약물과 화학적 및 물리적 pi-pi결합, 물리적 소수성 결합 및/또는 물리적 수소 결합으로 결합될 수 있다. 본 발명의 실시예들에 따르면, 본 발명의 화학식 4로 표시되는 화합물은 전달체와 화학적 및 물리적 pi-pi결합, 물리적 소수성 결합 및/또는 물리적 수소 결합으로 결합될 수 있다. 본 발명의 실시예들에 따르면, 본 발명의 화학식 4로 표시되는 화합물은 약물을 함유한 전달체와 화학적 및 물리적 pi-pi결합, 물리적 소수성 결합 및/또는 물리적 수소 결합으로 결합될 수 있다.
상기 화학식 4에서 R3가 약물 또는 약물을 함유한 전달체인 경우, 상기 화합물과 화학적 및 물리적 pi-pi결합, 물리적 소수성 결합 및/또는 물리적 수소 결합으로 결합될 약물 또는 약물을 포함하는 전달체의 약물은 본 발명의 화합물에 포함되어 있는 약물과 동일 또는 유사한 약효를 나타내는 약물일 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명의 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 상기 암은 바람직하게는 전이성 암일 수 있다.
본 발명의 실시예들에 따르면, 알부민이 접합된 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물, 또는 약물을 함유한 전달체에 접합된 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물이 암, 바람직하게는 전이성 암을 예방 또는 치료하기 위해 사용할 수 있다.
본 발명에서 “전이성 암”은 암의 성질을 구분하는 용어로, 최초로 종양이 발생한 부위에서 혈관 또는 림프관을 통해 다른 분위로 전이하여 생긴 암종을 의미한다. 암의 근본적인 치료는 원발성 암의 치료와 함께 전이 부위에서의 암의 제어가 중요하다. 전이성 암은 예를 들어, 대장암, 전립선암, 부인과암, 위암, 다발성골수종, 간장암, 폐암, 췌장암, 갑상선암, 신장암, 담관암, 담낭암, 신경아세포종 및 호지킨 림프종 등을 들 수 있다. 또한 특히, 전립선암, 폐암, 대장암 및 부인과암의 일종인 유방암은 골 및 간 등에 전이를 초래하기 쉬운 암으로 알려져 있다. 본 발명에서 전이성 암은 상기 예들을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 전이하는 성질을 가진 암이라면 모두 포함할 수 있다.
본 발명에서 암의 치료는 예를 들면 치료 전 대비 종양의 성장을 약 10% 이상, 약 20% 이상, 약 40% 이상, 약 60% 이상, 또는 약 80% 이상 억제하는 것일 수 있다.
후술하는 실험예에 따르면, 본 발명의 환원반응성 일산화질소 공여 화합물은 종양 세포에 특이적인 세포독성 효과를 나타내었으며, 그 결과 종양 전이를 억제하여 마우스 생존율이 현저하게 연장되었음을 확인하여 본 발명의 화합물이 우수한 암의 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있음을 입증하였다.
또한, 본 발명의 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 자가면역질환, 난치성신경질환 또는 감염성질환 예방 또는 치료용으로 사용될 수 있다.
상기 자가면역질환은 예를 들어, 다발성 경화증, 루푸스, 류마티스관절염, 크론병, 1형 당뇨병 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 난치성신경질환은 원인이 불명하고 치료법이 확립되지 않은 신경 질환의 총칭으로, 예를 들어, 파킨슨병, 루게릭병, 근육병, 소뇌실조증 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 감염성질환은 예를 들어, B형 간염, C형 간염, 사람유두종바이러스(Human papillomavirus; HPV) 감염, 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus) 감염, 바이러스성 호흡기 감염 질환, 인플루엔자 감염 질환, 인간면역결핍 바이러스(human immunodeficiency virus, HIV) 감염 질환, 코로나 바이러스(예를 들어, COVID-19) 감염 질환 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 "치료"는 본 발명 조성물의 투여로 증상이 호전되거나 완치되는 모든 행위를 의미하며, "예방"은 본 발명 조성물의 투여로 증상을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화 할 수 있으며, 이들 제제는 당 분야에서 제제화에 사용되는 통상의 방법 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법으로 제조될 수 있고, 치료하고자 하는 각각의 질환 또는 포함되는 성분에 따라 다양한 제제로 제제화될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 치료학적으로 유효량의 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물이 대상체에 투여되도록 제형화될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 “치료학적으로 유효량”은 암, 자가면역질환, 난치성신경질환 또는 감염성질환을 예방 또는 치료에 유효한 본 발명의 화합물의 양을 나타내며, 치료 유효량 및 예방 유효량을 모두 포함한다.
본 발명에서 "치료 유효량"은 약물 또는 치료제가 단독으로 또는 다른 치료제와 조합되어 사용되는 경우에, 질환 증상의 중증도 감소, 질환 증상이 없는 기간의 빈도 및 지속기간의 증가, 또는 질환 고통으로 인한 손상 또는 장애의 방지를 나타낼 수 있는 약물의 임의의 양을 의미한다.
본 발명에서 "예방 유효량"은 질환 발생 위험이 있는 개체 또는 질환 재발로 인해 고통받을 위험이 있는 개체에서 질환의 발생 또는 재발을 억제하는 약물의 임의의 양을 의미한다. 유효량의 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소 등에 따라 결정될 수 있다.
본 발명에 따른 약학조성물에 포함되는 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물의 함량은 치료하고자 하는 질환의 증상, 증상의 진행 정도, 환자의 상태 등에 따라 적절히 조절 가능하다. 예를 들어, 전체 조성물 중량을 기준으로 0.0001 내지 99.9 중량%, 0.1 내지 90 중량%, 1 내지 80 중량%, 1 내지 70 중량%, 1 내지 60 중량%, 또는 1 내지 50 중량%로 포함될 수 있다.
본 발명에서 "투여"는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다양한 방법 및 전달 시스템 중 임의의 것을 사용하여 조성물을 개체에게 물리적으로 도입하는 것을 지칭한다.
본 발명의 약학적 조성물을 위한 투여 경로는 모든 투여 경로를 포함한다. 바람직하게는, 비경구 투여일 수 있으며, 예를 들어 정맥, 피하, 복강, 종양 내 주사 또는 다른 비경구 투여 경로를 포함하며, 바람직하게는 주사에 의한 투여 경로일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 조성물을 위한 투여 횟수는 예를 들어 1회, 복수 회, 및/또는 하나 이상의 연장된 기간에 걸쳐 수행될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 구체적으로 개체의 질환 발병 정도에 따라 본 발명의 조성물 또한, 그 투여량은 투여 경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이, 특히 환자가 갖는 질환의 발병 정도 등에 따라 증감될 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여되거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있다. 다른 치료제와 병용하여 투여되는 경우, 본 발명의 조성물과 다른 치료제는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다.
본 발명에서 병용 투여되는 다른 치료제는 종래 치료효과를 나타내는 치료제라면 제한없이 병용 투여될 수 있다. 암의 퇴행을 촉진하거나 또는 추가로 종양 성장을 방지하는 화합물, 단백질 등의 약물일 수 있으며, 방사선 치료 등 약물 요법 이외의 기타 항암 요법을 모두 포함한다. 또한, 자가면역질환, 난치성신경질환 또는 감염성질환을 치료하기 위한 약물일 수 있다.
본 발명의 화합물은 상기 치료제들과 병용투여 되어 종래 치료제의 치료 효과를 현저히 증가시키는 역할을 할 수 있다.
상기 병용 투여되는 치료제는 병용 투여의 경로, 투여시기, 및 투여용량은 질병의 종류, 환자의 질병 상태, 치료 또는 예방의 목적, 및 병용되는 다른 약물 혹은 생리학적 활성물질에 따라 결정될 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 하기 화학식 1의 화합물을 싸이올기를 함유하고 있는 약물, 전달체 또는 약물을 함유한 전달체와 반응시키는 단계를 포함하는 약물, 전달체 또는 약물을 함유한 전달체가 접합된 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물 제조방법을 제공한다.
[화학식 1]
Figure pat00010
여기서,
R1은 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C10 알킬렌이며,
R2는 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C10 알킬; 또는, 치환 또는 비치환된 2-싸이오피리딘(2-thiopyridine)이다.
본 발명의 화학식 1로 표시되는 환원반응성 일산화질소 공여 화합물은 하기 화학식 2로 표시되는, R1은 C2 알킬렌이며, R2는 2-싸이오피리딘인 화합물일 수 있다.
[화학식 2]
Figure pat00011
본 발명의 약물, 전달체 또는 약물을 함유한 전달체가 접합된 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물 제조방법에는 당업자에게 자명한 수준으로 변형된 제조방법도 이에 포함된다.
본 발명의 화학식 1 또는 2의 화합물은 산화환원-반응에 의한 일산화산소 방출능을 상실하지 않으면서도 유기 또는 무기 물질과 높은 수율로 접합이 가능하다.
본 발명의 실시예들에 따르면, 2-피리딜 디설파이드(2-pyridyl disulfide) 모이어티는 SISIN-1에 도입되어 싸이올 교환 반응을 통해 다양한 싸이올기를 가진 물질과의 접합할 수 있는 우수한 이탈기 역할을 할 수 있다.
후술하는 실험예에 따르면, 화학식 1 또는 2의 화합물 또는 전구약물은 일산화질소 공여자의 방출할 수 있는 화합물 구조에 영향을 주지 않으면서도, 싸이올(tiol)기를 가진 물질과 간단하고 손쉬운 방법을 통해 온화한 조건(under mild conditions)에서도 고효율로 쉽게 접합할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명의 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물을 인간을 포함하는 포유류에 투여하여 암, 자가면역질환, 난치성신경질환 또는 감염성질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 암, 자가면역질환, 난치성신경질환 또는 감염성질환을 예방 또는 치료하는 방법은 본 발명의 화합물 또는 전구약물을 투여함으로써, 징후의 발현 전에 질병 그 자체를 다룰 뿐만 아니라, 이의 징후를 저해하거나 피하는 것을 포함한다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 의약의 제조에 있어서, 본 발명의 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물의 용도를 제공한다.
의약의 제조를 위한 본 발명의 화합물은 허용가능한 보조제, 희석제, 담체 등을 혼합할 수 있으며, 기타 활성제제와 함께 복합 제제로 제조되어 활성 성분들의 상승 작용을 가질 수 있다.
본 발명의 화합물, 약학적 조성물, 치료방법 및 용도에서 언급된 사항은 서로 모순되지 않는 이상 동일하게 적용되며, 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위해 반복기재를 생략하였다.
본 발명의 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물은 생체 내 환원 조건에서 선택적으로 일산화질소를 방출하므로 질병 부위에 선택적인 약리 작용을 나타낼 수 있다. 또한, 본 발명의 화합물 또는 전구약물이 치료 표적 외에 다른 기관에 작용하여 의도하지 않은 유해효과가 나타나는 것을 방지할 수 있다.
본 발명의 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물은 암, 자가면역질환, 난치성 신경질환 또는 감염성질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서 유용하게 사용될 수 있으며, 연구용 시료로도 생산 및 판매가 가능하다.
본 발명의 화학식 1로 표시되는 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물은 환원반응성에 의한 일산화질소 공여능을 잃지 않으면서도 약물, 전달체 또는 약물을 함유하고 있는 전달체에 손쉽게 높은 수율로 접합이 가능하며, 이로 인해 종래의 치료 약물 및 SISIN-1의 약리 효과를 높일 수 있어 암, 자가면역질환, 난치성 신경질환 또는 감염성질환 예방 또는 치료용으로 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 화학식 1로 표시되는 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물은 일산화질소 공여자로서 SIN-1을 포함하고 있는 종래의 일산화질소 공여체와 달리 자발적으로 분해되지 않으므로 보관 및 운반이 용이하다.
도 1은 산화환원으로 유발된 자가-희생에 의한 환원반응성 일산화질소 공여 화합물(prodrug) 및 전달 시스템에 관한 것이다.
구체적으로 도 1a는 본 발명의 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물(SISIN-1) 및 응용(전달체와의 접합)에 대한 개략도 및 산화환원으로 유발된 자가-희생에 의한 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물의 단편화되는 메커니즘을 나타낸 것이다.
도 1b는 전이성 암 치료를 위한 본 발명의 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물의 림프 전달 및 치료 과정을 도식화한 것이다.
도 2는 본 발명의 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물인 SISIN-1의 합성경로를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물인 SISIN-1 합성의 각 단계에서 수득된 화합물의 1H NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물인 SISIN-1의 산화환원 반응에 의해 유발된 자가-희생 단편화에 대한 1H NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물인 SISIN-1의 산화환원 반응에 의해 유발된 자가-희생 단편화에 대한 질량 스펙트럼(ESI+)을 나타낸 것이다. 171.08 및 275.08 m/z의 주요 피크는 각 물질의 전체 분자를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물인 SISIN-1의 산화환원 반응에 의해 유발된 NO 방출능을 나타낸 것이다.
구체적으로 도 6a는 SISIN-1의 산화환원 반응에 의해 유발된 NO 방출에 대한 UV-Vis 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 6b는 Griess 분석에 의해 NO 방출을 정량화한 것이다.
도 7은 본 발명의 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물인 AL-SISIN-1의 제조방법 및 특성을 나타낸 것이다.
구체적으로 도 7a는 AL-SISIN-1의 제조방법을 나타낸 것이다.
도 7b는 AL-SISIN-1의 TEM 이미지를 나타낸 것이다.
도 7c는 동적광산란광도계(DLS)에 의해 결정된 평균 유체 역학적 크기 및 표면전하를 나타낸 것이다. 수득된 AL-SISIN-1은 크기가 10.6±0.5 nm로 균일하게 분포되어 있음을 확인할 수 있다.
도 7d는 알부민, 유리 SISIN-1 및 AL-SISIN-1의 UV/Vis 흡광도 스펙트럼을 나타낸다. 빨간색 화살표는 SISIN-1(310nm)의 특성 흡광도를 나타낸다.
도 7e 및 7f는 각각 사중극-비행시간차 질량분석법(ESI-Q-TOF MS) 의해 획득된 고분해능 질량스팩트럼(ESI+) 및 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 질량분석법(MALDI-TOF MS)에 의한 질량스펙트럼을 나타낸 것으로 AL-SISIN-1의 접합 효율을 정량적으로 나타낸 것이다. 본 질량분석법들을 통해 AL-SISIN-1이 알부민에 비해 273 g/mol 만큼 질량이 증가함을 확인하고, 알부민 1개당 1개의 SISIN-1이 접합됨을 확인하였다(접합된 SISIN-1의 이론적 값, 272.3 g/mol).
도 7g는 GSH 처리 후 AL-SISIN-1의 UV/Vis 흡광도 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 7h는 Griess assay로 분석한 다양한 생리적 조건에서의 AL-SISIN-1의 누적 NO 방출 프로파일을 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물인 SiNP-SISIN-1의 제조방법 및 특성을 나타낸 것으로, 무기 전달체와의 응용 가능성을 보여준다.
구체적으로 도 8a는 SiNP-SISIN-1의 제조방법을 나타낸 것이다.
도 8b는 SiNP-SISIN-1의 대표적인 TEM 이미지를 나타낸 것이다.
도 8c는 SiNP-SISIN-1의 에너지분산형 X선 분광법(EDS)을 통한 성분 분석을 나타낸 이미지이다. 파란색, 분홍색, 빨간색 및 녹색은 각각 실리콘, 황, 산소 및 질소를 나타낸다.
도 8d는 KBr 펠릿에서 SiNP-SH 및 SiNP-SISIN-1의 FT-IR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 8e는 열중량분석(Thermogravimetric analysis, TGA) 곡선을 나타낸 것이다. SISIN-1은 전체의 3.2 질량%를 차지한다.
도 8f는 Griess assay로 분석한 다양한 생리적 조건에서의 SiNP-SISIN-1의 누적 NO 방출 프로파일을 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물인 4-arm PEG-SISIN-1의 특성을 나타낸 것으로, 유기 및 고분자 기반 전달체와의 응용 가능성을 보여준다.
구체적으로 도 9a는 4-arm PEG-SISIN-1의 합성 경로를 나타낸 것이다.
도 9b는 4-arm PEG-SISIN-1의 1H NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물인 4-arm PEG-SISIN-1의 특성을 나타낸 것이다.
구체적으로 도 10a는 4-arm PEG-SH 및 4-arm PEG-SISIN-1의 MALDI-TOF 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 10b는 4-arm PEG-SH 및 4-arm PEG-SISIN-1의 GPC 프로파일을 나타낸다. 상대 분자량은 용리액 시스템으로 THF를 사용하는 폴리스티렌 스탠다드(polystyrene standards)와 비교하여 결정하였다.
도 10c는 KBr 펠릿에서 SiNP-SH 및 SiNP-SISIN-1의 FT-IR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 10d는 Griess assay로 분석한 다양한 생리적 조건에서의 4-arm PEG-SISIN-1의 누적 NO 방출 프로파일을 나타낸 것이다.
도 11은 SISIN-1-OH의 제조방법 및 특성을 나타낸 것이다.
구체적으로, 도 11a는 SISIN-1-OH의 제조방법을 나타낸 것이다.
도 11b는 SISIN-1-OH의 1H NMR 데이터를 나타낸 것이다.
도 12는 Griess assay로 분석한 다양한 생리적 조건에서의 SISIN-1-OH의 누적 NO 방출 프로파일을 나타낸 것이다.
도 13은 생체 내 이미징 시스템(IVIS)을 통해 확인한 화합물의 크기에 따른 림프 배수(lymphatic-drainage) 및 NO 공여능을 DAF-2 DA을 사용한 배수 림프절의 ex vivo 이미지를 나타낸 것이다.
도 14는 AL-SISIN-1의 림프 배수, 생체 분포 및 NO 공여능을 나타낸 것이다.
구체적으로 도 14a는 크기에 따른 본 발명의 화합물의 림프 배수 및 축적의 개략도를 나타낸 것이다.
도 14b는 AF647가 표지된 AL-SISIN-1(AF647-AL-SISIN-1)에 대한 시간 경과에 따른 림프 축적 및 생체 분포의 생체 내 이미징 시스템(IVIS) 형광 이미지를 나타낸 것이다.
도 14c는 AF647-AL-SISIN-1의 시료 처리 4시간 및 24시간 후 림프절, 심장, 폐, 간, 비장, 신장 및 장을 포함한 적출된 주요 기관의 형광 이미지를 나타낸 것이다. 도면에 표시된 원은 배수 림프절을 나타낸다.
도 14c는 Nitrite/Nitrate Assay Kit를 이용한 혈청 내 NOx 수준의 정량화한 것을 나타낸 것이다.
도 14e는 마우스 발 조직에 샘플을 피하투여 후, 림프절로의 배수를 나타낸 것이다.
도 15는 AF647-AL-SISIN-1의 시간 경과에 따른 림프에의 축적 및 생체 분포를 나타낸 생체 내 형광 이미지이다.
도 16은 용혈 분석(hemolysis assay)를 이용하여 본 발명의 화합물의 혈액 적합성을 확인한 것이다.
도 17a는 샘플처리 후 8주령 BALB/c 암컷 마우스로부터 적출된 비장 사진을 나타낸 것이다.
도 17b는 비장/체중 비율을 정량화한 것을 나타낸 것이다.
도 18은 8주령 BALB/c 암컷 마우스에 AL-SISIN-1 투여 3일 후 주요 기관 조직의 절편을 수집 후 유의한 형태학적 변화 여부를 확인한 것이다.
도 19a는 알부민, SISIN-1-OH 및 AL-SISIN-1 처리 후 B16-F10 전이성 암 세포주의 공 초점 현미경 이미지를 나타낸 것이다. 세포 내 NO 및 핵은 각각 DAF-2 DA(녹색) 및 DAPI(파란색)로 염색되었으며, 스케일 바는 100 μm이다.
도 19b는 B16-F10에서 유리 SIN-1, SISIN-1-OH, 알부민 및 AL-SISIN-1의 용량 의존적 항암 효과를 나타낸 것이다.
도 19c는 MTS 분석에 의한 AL-SISIN-1 처리 48 시간 후 다양한 배양 세포에서의 상대 세포 생존율(%)을 나타낸 것이다.
도 20은 전이성 암 모델에서 항-전이 효과 확인한 것을 나타낸 것이다.
구체적으로 도 20a는 전체 실험의 타임라인을 나타낸 것이다.
도 20b는 샘플 처리 후 생존율(morbidity-free survival) 확인한 것이다.
도 20c는 샘플 처리 후 마우스로부터 적출된 종양 배수 림프절(TDLN)의 사진을 나타낸 것이다.
도 20d는 림프절 비대의 정량화 결과(TDLN/체중)를 나타낸 것이다.
도 20e는 H&E 염색을 사용한 조직학적 분석을 통해 본 발명의 화합물이 전이성 암에 대해 항-전이성을 갖는다는 점을 확인한 것이다.
도 20f는 본 발명의 화합물을 처리한 전이성 암 모델에서의 TDLN과 암 모델이 아닌 일반 마우스에서 적출한 림프절을 비교한 것이다.
도 20g는 H&E 염색을 사용한 조직학적 분석을 통해 폐조직으로의 전이를 평가한 것을 나타낸 것이다.
도 21은 본 발명의 화합물이 림프절로의 전이를 억제할 수 있는지 여부를 확인한 이미지이다. 빨간색 화살표는 확대된 종양 배수 림프절을 나타낸다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 명세서에서 특별히 정의되지 않은 용어들에 대해서는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것으로 이해되어야 할 것이다.
본 명세서에 기재되어 있는 모든 실험은 3회 이상 반복 수행되었으며, 각 조건은 3회 이상 분석하였다. 통계학적 분석은 Prism 소프트웨어 패키지로 수행되었으며, 결과는 평균±표준편차(SD) 또는 평균±평균 표준오차(SEM)로 표시되었다. 단방향 또는 양방향 ANOVA 테스트는 표시되지 않는 한 다중 비교에 대한 통계적 차이를 얻기 위해 사용되었다. 표적샘플은 #으로 표시되고 대조군과 비교되었으며, 두 집단의 차이 분석을 위해 Student's t-test를 사용하였다(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001; n.s. 유의미한 차이가 나타나지 않음).
실시예 1. SISIN -1의 합성
(1) SISIN -1의 합성
SISIN-1의 합성의 각 단계는 하기와 같으며, 화합물의 합성경로는 도 2에 나타내었다. 또한, 각 단계에서 수득된 화합물의 1H NMR 스펙트럼은 도 3에 나타내었다.
단계 1: 화합물 1의 합성
2,2'-디싸이오디피리딘(2,2'dithiodipyridine)(4000 mg, 18.16 mmol)을 50 mL 메탄올에 용해시킨 용액에 210 μL의 빙초산을 첨가하고 교반하였다. 그 다음 교반된 용액에 2-머캅토에탄올(2-mercaptoethanol)(848.9 μL, 12.10 mmol)을 적가하고, 실온에서 밤새도록 격렬히 교반하였다.
이후, 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography, TLC)로 반응이 완료된 것을 확인하고, 과량의 유기용매를 감압 하에 증발시킨 후, 실리카겔 크로마토그래피(용리액은 에틸 아세테이트(EA):헥산(hexane)=80:20)를 통해 정제하여, 담황색 오일의 화합물 1을 수득하였다(1772 mg, 수율: 78.2%).
[화합물 1]
Figure pat00012
1H NMR(500 MHz, CDCl3, 25℃, δ8.51(ddd, J = 5.0, 1.7, 0.9 Hz, 1H), 7.58(ddd, J = 8.0, 7.4, 1.8 Hz, 1H), 7.40(dt, J = 8.1, 1.0 Hz, 1H), 7.16(ddd, J = 7.4, 5.0, 1.0 Hz, 1H), 5.71(t, J = 7.1 Hz, 1H), 3.81(td, J = 7.0, 5.2 Hz, 2H), 3.00 - 2.91(m, 2H).
단계 2: 화합물 2의 합성
상기 단계 1에서 수득한 화합물 1(1.50 g, 8.00 mmol) 및 DMAP(4-dimethylaminopyridine)(1.96 g, 16.0 mmol)을 50 mL의 무수 디클로로메탄(dichloromethane, DCM)에 용해시킨 냉각된(ice bath) 용액에 4-니트로페닐 클로로포메이트(4-nitrophenyl chloroformate)(3.23 g, 16.0 mmol)를 첨가하였다. 그리고 질소 분위기 하에서 밤새도록 반응을 수행하여 서서히 실온에 도달하도록 하였다.
이후, 박층 크로마토그래피로 반응이 완료된 것을 확인하고, 과량의 유기용매를 감압 하에 증발시킨 후, 실리카겔 크로마토그래피(용리액은 DCM)를 통해 정제하여, 담황색 액체의 화합물 2를 수득하였다(2507 mg, 수율: 88.8%).
[화합물 2]
Figure pat00013
1H NMR(500 MHz, CDCl3, 25℃, δ8.51 - 8.48(m, 1H), 8.31 - 8.26(m, 1H), 7.70 - 7.62(m, 1H), 7.41 - 7.36(m, 1H), 7.12(ddd, J = 6.7, 4.8, 1.8 Hz, 1H), 4.57(t, J = 6.4 Hz, 1H), 3.16(t, J = 6.4 Hz, 1H).
단계 3: SISIN-1의 합성 및 특성 확인
3-몰포리노시드노니민 하이드로클로라이드(3-morpholinosydnonimine hydrochloride, SIN-1)(300 mg, 1.45 mmol) 및 중탄산 나트륨(150 mg, 1.78 mmol)을 2.5 mL의 수성 시스템에서 혼합하였다. 그리고 화합물 2(394 mg, 1.12 mmol)를 5 mL 테트라하이드로퓨란(THF)에 용해시킨 용액에 상기 제조된 혼합물을 첨가한 후, 실온에서 4 시간 동안 격렬하게 교반 하였다.
이후, 박층 크로마토그래피로 반응이 완료된 것을 확인하고, THF를 증발시키고 남은 수성상(aqueous phase)을 DCM으로 추출, 건조, 여과 및 회전 증발시켰다.
이후, 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(정지상: neutral aluminum oxide, 용리액 시스템: 1% methanol in DCM)를 통해 정제하여 아이보리 점착성(sticky) 액체 SISIN-1를 수득하였다(377 mg, 수율: 88.1%).
[SISIN-1]
Figure pat00014
1H NMR(600 MHz, CDCl3, 25℃, δ8.47(d, J = 4.6 Hz, 1H), 7.77(d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.74(s, 1H), 7.67(dd, J = 7.6, 1.6 Hz, 1H), 7.09(dd, J = 7.3, 4.9 Hz, 1H), 4.39(t, J = 6.6 Hz, 2H), 4.02 - 3.96(m, 4H), 3.59 - 3.52(m, 4H), 3.12(t, J = 6.6 Hz, 2H).
(2) SISIN -1의 산화환원에 의해 유발된 단편화 확인
상기 제조된 SISIN-1의 환원 조건 하에서 산화환원 반응에 의해 유발된 자가-희생 링커에 의한 단편화는 1H NMR 및 질량분석(ESI+)를 통해 확인하였다.
구체적으로 2 당량의 dithiothreitol(DTT, 환원제)을 CDCl3에서 SISIN-1로 처리하고 실온에서 밤새 배양한 후, 1H NMR을 통해 SISIN-1의 자가-희생 링커에 의한 단편화 확인하였으며, 1H NMR 스펙트럼은 도 4에 나타내었다.
또한, 5 당량의 dithiothreitol(DTT, 환원제)를 아세토니트릴에서 SISIN-1에 처리하고 배양한 후 반응을 모니터링하였으며, 질량분석(ESI+) 스펙트럼은 도 5에 나타내었다.
상기 결과에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 SISIN-1는 환원 조건 하에서 자가-희생 링커의 자발적인 분자 내 반응을 통해 단편화가 가능하며 이를 통해 일산화질소 공여자를 방출할 수 있다는 점을 확인하였다.
(3) NO 방출능 확인
SISIN-1의 환원 조건 하에서 산화환원에 의해 유발된 NO 방출능은 UV-Vis 분광분석법을 통해 확인하였다.
구체적으로 2 mM GSH를 SISIN-1에 처리하고 37℃에서 2시간 동안 5% DMSO를 포함한 증류수에서 2mM GSH와 함께 배양하였다. 이후 UV-Vis 분광광도계를 통해 흡광도를 측정하였으며, 그 결과는 도 6a에 나타내었다.
또한, NO 방출량은 Griess 분석법에 의해 정량적으로 결정되었다. 37℃에서 다양한 생리적 조건(50 g/L 혈청, 세포 외(20 μM, GSH) 및 세포 내(2 mM, GSH))의 DMEM(50 μM, 1.5 mL)에 SISIN-1(50 μM) 접종하고, 밤새도록 배양한 후, 96-웰 플레이트로 옮기고 -70℃에 보관하였다. 각 용액에서 NO의 누적량은 548 nm에서 흡광도를 NaNO2로 표시된 표준 곡선과 비교하여 정량화하였으며, SISIN-1의 누적 NO 방출 프로파일은 도 6b에 나타내었다.
상기 결과에서 확인할 수 있는 바와 같이, 환원 조건 하에서 SISIN-1 분해되었으며, 세포 내(2 mM, GSH) 조건에서 훨씬 더 많은 양의 NO를 방출하였다. 또한, 혈청(50 g/L) 또는 세포 외(20 μM, GSH) 조건에서는 무시할 수 있는 정도의 NO 방출량을 나타내었다. 이는 혈액과 피부를 포함한 전신 조직의 세포 외 환경에서 유리 싸이올 함유 생체 분자의 잠재적인 간섭을 고려할 때, SISIN-1은 투여 후 적절한 안정성을 가질 수 있음을 나타낸 것이며, 세포 내에서 특이적으로 NO를 방출할 수 있음을 확인한 것이다.
실시예 2. AL-SISIN-1의 합성 및 특성 확인
(1) AL-SISIN-1의 합성
AL-SISIN-1의 제조과정은 하기와 같으며, 본 발명의 SISIN-1을 이용한 AL-SISIN-1의 제조방법, 상기 제조된 AL-SISIN-1의 TEM 이미지, 동적광산란광도계(DLS)에 의해 결정된 평균 유체 역학적 크기 및 표면전하, UV/Vis 흡광도 스펙트럼, 사중극-비행시간차 질량분석법(ESI-Q-TOF MS)에 의해 획득된 고분해능 질량스팩트럼(ESI+) 및 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 질량분석법(MALDI-TOF MS)에 의한 결과는 도 7에 나타내었다.
투석 전 알부민(648 mg, 9.76 μmol)을 15 mL 포스페이트 완충액(0.1 M, pH 7.5)에 용해시킨 용액에 실시예 1에서 제조된 SISIN-1(4.86 mg, 12.7 μmol)을 용해시키고, 실온에서 밤새도록 격렬하게 교반하였다.
이후, UV-Vis 분광분석법을 통해 흡광도를 측정하여 반응완료를 확인하고, 반응 혼합물을 30 kDa 분자량 차단 Amicon®ultra centrifugal filter로 옮기고 4,000 rpm, 25℃에서 20분 동안 원심분리하였다. 그리고 상층액을 증류수로 3회 세척, 수집 및 동결건조하여 AL-SISIN-1(510 mg, 수율: 78.2%)을 수득하였다.
(2) 자가-희생 링커에 의한 단편화 및 NO 방출능 확인
AL-SISIN-1의 환원 조건 하에서 산화환원 반응에 의해 유발된 NO 방출능은 UV-Vis 분광분석법을 통해 확인하였다.
구체적으로 AL-SISIN-1을 37℃에서 2시간 동안 GSH와 함께 배양 후 UV/Vis 흡광도 스펙트럼을 조사하였으며, 결과는 도 7g에 나타내었다.
상기 도 7g에서 확인할 수 있는 바와 같이, 310 nm의 특정적인 피크가 감소되는 것을 확인하여 산화환원 반응으로 유발된 자가-희생 링커의 단편화에 의한 일산화질소 공여자의 방출을 확인하였다.
또한, NO 방출량은 Griess 분석법에 의해 정량적으로 결정되었다. 37℃에서 다양한 생리적 조건(50 g/L 혈청, 세포 외(20 μM, GSH) 및 세포 내(2 mM, GSH))의 DMEM(50 μM, 1.5 mL)에 AL-SISIN-1(50 μM) 접종하고 기-정해진 시간 경과 후 96-웰 플레이트로 옮기고 -70℃에 보관하였다. 각 용액에서 NO의 누적량은 548 nm에서 흡광도를 NaNO2로 표시된 표준 곡선과 비교하여 정량화하였으며, AL-SISIN-1의 누적 NO 방출 프로파일은 도 7h에 나타내었다.
상기 도 7h에서 확인할 수 있는 바와 같이, 환원 조건 하에서 AL-SISIN-1이 분해되었으며, 세포 내(2 mM, GSH) 조건에서 훨씬 더 많은 양의 NO를 방출하였다. 또한, 혈청(50 g/L) 또는 세포 외(20 μM, GSH) 조건에서는 무시할 수 있는 정도의 NO 방출량을 나타내었다. 이는 혈액과 피부를 포함한 전신 조직의 세포 외 환경에서 유리 싸이올 함유 생체 분자의 잠재적인 간섭을 고려할 때, AL-SISIN-1은 투여 후 적절한 안정성을 가질 수 있음을 나타낸 것이며, 세포 내에서 특이적으로 NO를 방출할 수 있음을 확인한 것이다.
실시예 3. SiNP-SISIN-1의 합성 및 특성 확인
(1) SiNP-SISIN-1의 합성
SiNP-SISIN-1는 싸이올화된 실리카 나노입자(Thiolated silica nanoparticle, SiNP-SH)를 사용하여 하기와 같이 원스텝(one-step)으로 제조하였으며, 제조방법, TEM 이미지, EDS 매핑 이미지, FT-IR 스펙트럼 및 TGA(Thermogravimetric analysis) 분석 결과는 도 8에 나타내었다.
마지막으로 SiNP-SH 1 mg/mL 및 SISIN-1 0.1 mg/mL를 0.2%(v/v) 빙초산과 함께 메탄올에서 혼합하였다. 어두운 조건에서 24 시간 동안 용액을 교반한 후 증류수로 4,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 SISIN-1이 접합된 실리카 나노입자(SiNP-SISIN-1) 수득하였다.
(2) 자가-희생 링커에 의한 단편화 및 NO 방출능 확인
SiNP-SISIN-1의 NO 방출능의 확인은 Griess 분석법에 의해 정량적으로 결정되었다. 37℃에서 다양한 생리적 조건(50 g/L 혈청, 세포 외(20 μM, GSH) 및 세포 내(2 mM, GSH))의 DMEM(50 μM, 1.5 mL)에 SiNP-SISIN-1(2.5 mg/mL) 접종하고 하룻밤동안 배양한 후, 96-웰 플레이트로 옮기고 -70℃에 보관하였다.
각 용액에서 NO의 누적량은 548 nm에서 흡광도를 NaNO2로 표시된 표준 곡선과 비교하여 정량화하였으며, SiNP-SISIN-1의 누적 NO 방출 프로파일은 도 8f에 나타내었다.
상기 도 8f에서 확인할 수 있는 바와 같이, 환원 조건 하에서의 SiNP-SISIN-1는 분해되었으며, 세포 내(2 mM, GSH) 조건에서 훨씬 더 많은 양의 NO를 방출하였다. 또한, 혈청(50 g/L) 또는 세포 외(20 μM, GSH) 조건에서는 무시할 수 있는 정도의 NO 방출량을 나타내었다. 이는 SiNP-SISIN-1은 투여 후 적절한 안정성을 가질 수 있음을 나타낸 것이며, 세포 내에서 특이적으로 NO를 방출할 수 있음을 확인한 것이다. 결론적으로, 도 8는 SISIN-1이 사이올기를 함유한 무기 기반 약물전달체에 손쉽게 개질화 될 수 있음을 보여준다.
실시예 4. 4-arm PEG-SISIN-1의 합성 및 특성 확인
(1) 4-arm PEG-SISIN-1의 합성
4-arm PEG-SISIN-1의 제조과정 및 합성된 화합물의 1H NMR 스펙트럼은 도 9에 나타내었으며, MALDI-TOF 질량스펙트럼, GPC 프로파일, FT-IR 스펙트럼은 도 10에 나타내었다.
SISIN-1이 접합된 4-arm PEG(4-arm PEG-SISIN-1)의 제조는 수성 조건에서 수행되었다. 구체적으로, 0.1 mL DMSO에 녹인 SISIN-1(23.0 mg, 0.06 mmol)을 5 mL 증류수에 녹인 4-arm PEG-SH(100 mg, 0.01 mmol)에 첨가하였다. 용액에 5.0 μL 빙초산을 첨가한 후, 상온에서 밤새 격렬하게 교반하면서 반응시켰다. 이후 수득된 용액을 정제를 위해 분자 컷오프(cutoff)가 2 kDa인 투석막으로 옮겼다. 4-arm PEG-SISIN-1은 증류수에 대해 연속 2일 투석하였으며, 동결건조 되었다.
(2) 자가-희생 링커에 의한 단편화 및 NO 방출능 확인
4-arm PEG-SISIN-1의 NO 방출능의 확인은 Griess 분석법에 의해 정량적으로 결정되었다. 37℃에서 다양한 생리적 조건(50 g/L 혈청, 세포 외(20 μM, GSH) 및 세포 내(2 mM, GSH))의 DMEM(50 μM, 1.5 mL)에 4-arm PEG-SISIN-1(50 μM)을 접종하고 하룻밤동안 배양한 후, 96-웰 플레이트로 옮기고 -70℃에 보관하였다. 각 용액에서 NO의 누적량은 548 nm에서 흡광도를 NaNO2로 표시된 표준 곡선과 비교하여 정량화하였으며, 4-arm PEG-SISIN-1의 누적 NO 방출 프로파일은 도 10d에 나타내었다.
상기 도 10d에서 확인할 수 있는 바와 같이, 환원 조건 하에서의 4-arm PEG-SISIN-1는 분해되었으며, 세포 내 (2 mM, GSH) 조건에서 훨씬 더 많은 양의 NO를 방출하였다. 또한, 혈청(50 g/L) 또는 세포 외(20 μM, GSH) 조건에서는 무시할 수 있는 정도의 NO 방출량을 나타내었다. 이는 4-arm PEG-SISIN-1은 투여 후 적절한 안정성을 가질 수 있음을 나타낸 것이며, 세포 내에서 특이적으로 NO를 방출할 수 있음을 확인한 것이다. 결론적으로, 도 9 및 도 10은 SISIN-1이 싸이올기를 함유한 유기 및 고분자 기반 약물전달체에 손쉽게 개질화 될 수 있음을 보여준다.
실시예 5. SISIN-1-OH의 합성 및 특성 확인
SISIN-1-OH는 하기 방법을 통해 제조하였으며, SISIN-1-OH의 제조방법 및 1H NMR 데이터는 도 11에 나타내었다.
질소 대기 하에 SISIN-1(30 mg, 78 μmol)을 5 mL 메탄올에 용해시킨 용액에 1.4 μL의 빙초산을 첨가 후 교반하였다. 교반된 용액에 2-머캅토에탄올(2-mercaptoethanol)(8.5 μL, 1.2 μmol)을 적가하고, 실온에서 밤새도록 격렬하게 교반하였다.
이후, 박층 크로마토그래피로 반응이 완료된 것을 확인하고, 과량의 유기용매를 감압 하에 증발시킨 후, 실리카겔 크로마토그래피(용리액: 1% methanol in DCM)를 통해 정제하여, 노란색 끈적한 액체 상태의 SISIN-1-OH를 수득하였다(26.9mg, 수율: 98.3%).
1H NMR (500 MHz, CDCl3, 25℃, δ 7.72 (s, 1H), 4.37 (t, J = 6.7 Hz, 1H), 3.99 - 3.95 (m, 1H), 3.02 (t, J = 6.6 Hz, 1H), 2.95 (t, J = 6.1 Hz, 1H), 2.89 (t, J = 5.7 Hz, 1H).
(2) 자가-희생 링커에 의한 단편화 및 NO 방출능 확인
SISIN-1-OH의 NO 방출능의 확인은 Griess 분석법에 의해 정량적으로 결정되었다. 37℃에서 다양한 생리적 조건(50 g/L 혈청, 세포 외(20 μM, GSH) 및 세포 내(2mM, GSH))의 DMEM(50 μM, 1.5 mL)에 SISIN-1-OH(50 μM)을 접종하고 하룻밤 동안 배양한 후, 96-웰 플레이트로 옮기고 -70℃에 보관하였다. 각 용액에서 NO의 누적량은 548 nm에서 흡광도를 NaNO2로 표시된 표준 곡선과 비교하여 정량화하였으며, SISIN-1-OH의 누적 NO 방출 프로파일은 도 11에 나타내었다.
상기 도 11에서 확인할 수 있는 바와 같이, 환원 조건 하에서의 SISIN-1-OH는 분해되었으며, 세포 내(2 mM, GSH) 조건에서 훨씬 더 많은 양의 NO를 방출하였다. 또한, 혈청(50 g/L) 또는 세포 외(20 μM, GSH) 조건에서는 무시할 수 있는 정도의 NO 방출량을 나타내었다. 이는 SISIN-1-OH은 투여 후 적절한 안정성을 가질 수 있음을 나타낸 것이며, 세포 내에서 특이적으로 NO를 방출할 수 있음을 확인한 것이다.
실험예 1. 크기에 따른 림프 배수 확인
본 발명 화합물의 크기-의존적 림프 배수(lymphatic-drainage) 및 NO 공여능은 생체 내 이미징 시스템(in vivo imaging system, IVIS)을 통해 확인하였다.
구체적으로, 실시예에서 제조된 AL-SISIN-1 및 SISIN-1-OH을 피하 주사(2 mM, 10 μL)하고, 2시간 후, 8주령 암컷 BALB/c-nu/nu 마우스를 희생시켰다. 그리고 배수 림프절(draining lymph nodes)을 적출하여 수집 후 NO가 전달된 양을 평가하였다. 이미징을 위해 DAF-2DA(diaminofluorescein-2 diacetate) 5 μM 및 1% 염화 수은(II)의 1:1 용액 5 μL를 주입하였다. 이후 림프절은 FITC 채널을 사용하여 즉시 이미지화 하였으며, 결과는 도 13에 나타내었다.
도 13에서 확인할 수 있는 바와 같이, AL-SISIN-1은 일산화질소에 비례하여 형광물질이 생성되었으며, 특히, SISIN-1-OH 처리한 대조군 대비 AL-SISIN-1를 처리한 경우에 배수 림프절에서 더 강한 형광 신호를 관찰하여 크기-의존적인 림프절 배수를 확인하였다.
실험예 2. 크기에 따른 따른 림프 배수, 생체 분포 및 NO 공여능 확인
(1) 시간 경과에 따른 림프 배수 및 생체 분포 확인
본 발명 화합물의 크기에 따른 시간-의존적 림프 배수 및 축적은 AF647가 표지 AL-SISIN-1(AF647-AL-SISIN-1)를 사용하여 생체 내 이미징 시스템(in vivo imaging system, IVIS)을 통해 확인하였다.
구체적으로, AL-SISIN-1의 시간 의존적 림프 유도 배수 및 축적을 추적하기 위한 AF647-AL-SISIN-1은 SISIN-1(0.08 mg, 0.20 μmol) 및 BSA-AF(BSA, Alexa FluorTM 647 접합체)(10 mg, 0.15 μmol)를 2 mL 인산염 완충 용액(0.1 M, pH 7.5)에서 실온에서 하룻밤 동안 반응시켜 제조하였으며, 이후 Amicon® ultra centrifugal filter로 여과 및 동결건조하였다.
상기 여과 및 동결건조된 AF647-AL-SISIN-1(2 mM, 10 μL)을 8주령 암컷 BALB/c-nu/nu 마우스의 발 조직에 피하 주사하였으며, AL-SISIN-1의 시간-의존적 림프 배수 및 축적은 IVIS(excitation/emission peak at 640/710 nm)에 의해 시각화되었으며, 결과는 도 14b, 14c 및 도 15에 나타내었다.
상기 결과에서 확인할 수 있는 바와 같이, 피하 투여된 AF647-AL-SISIN-1은 2분 이내에 림프로 배수되고 축적되기 시작했으며, 24시간 이상 지속되는 것을 확인하였다.
(2) 시간 경과에 따른 림프-유도성 NO 공여능의 확인
시간경과에 따른 림프-유도성 NO 공여를 특성화하기 위해 실시예에서 제조된 AL-SISIN-1 및 SISIN-1-OH(각각 2 mM, 30 μL)를 8주령 암컷 BALB/c 마우스의 발 조직에 피하 주사하였다. 미리 정해진 기간(2 시간, 6 시간 및 18 시간) 후, 샘플 처리된 마우스를 희생하여 혈청 및 장기 조직액을 수집하였다. 응고된 혈액 표본(clotted blood specimen)을 Amicon® ultra centrifugal filter에서 4℃, 13,000 rpm에서 10분 동안 원심 분리하여 혈청을 준비하였다. 기관 조직액은 4℃, 13,000 rpm에서 10분 동안 200 μL의 차가운 DPBS에서 기관 조직 균질물(organ tissue homogenate)을 원심 분리하여 준비하였다. 이후, 제조업체의 프로토콜에 따라 Nitrite/Nitrate Assay Kit를 사용하여 혈청 및 배액 림프절 모두에서 NOx 수준을 정량화하였으며, 결과는 도 14d 및 14e에 나타내었다.
상기 도 14d 및 도 14e에서 확인할 수 있는 바와 같이, AL-SISIN-1은 대조군인 SISIN-1-OH 대비 많은 양의 NO를 림프절에 공여할 수 있음을 확인하였으며, AL-SISIN-1의 림프-유도성 NO 공여능을 확인하였다.
실험예 3. 혈액 적합성 확인
본 발명의 화합물의 혈액 적합성을 확인하기 위해 적혈구에서 방출된 헤모글로빈을 측정하여 용혈 분석(hemolysis assay)를 수행하였다.
구체적으로 헤파린 튜브에 준비된 신선한 마우스 혈액을 원심 분리(4℃, 15분, 2,000 rpm)한 후, 생성된 상청액을 폐기하였다. 그리고 DPBS에서 혈액 세포를 10배 희석한 후, 각 샘플을 처리하여 최종 농도가 1 mM이되도록 처리하였다. 그 다음 혈액 세포를 37℃에서 3 시간 동안 배양하고, 생성된 현탁액을 원심분리하였다(4℃15분, 2,000 rpm). 헤모글로빈 방출을 정량화하기 위해 상층액의 흡광도를 541 nm에서 측정하였다. DPBS 및 1x 용해 완충액은 각각 음성 대조군(0% 용혈) 및 양성 대조군(100% 용혈)으로 사용하였다.
결과는 도 16에 나타내었으며, 상기 도 16에서 확인할 수 있는 바와 같이, 용혈 분석 결과 혈청에서 헤모글로빈 방출이 무시할 수 있는 정도로 나타나 본 발명의 화합물이 우수한 혈액 적합성을 보유하고 있음을 확인하였다.
실험예 4. 안전성 확인
본 발명의 화합물의 전신독성 확인은 8주령 BALB/c 암컷 마우스 샘플처리 후 3일 후 비장을 적출 후 관찰하여 확인하였으며, 결과는 도 17에 나타내었다.
상기 도 17에서 확인할 수 있는 바와 같이, 샘플 처리 3일 후에 염증 관련된 비장의 비대가 관찰되지 않아 본 발명의 화합물이 안전성을 가진다는 점을 확인하였다.
또한, 8주령 BALB/c 암컷 마우스에 AL-SISIN-1 투여 3일 후 주요 기관 조직의 절편을 수집 후 유의한 형태학적 변화 여부를 확인하였으며, 결과는 도 18에 나타내었다. 상기 도 18에서 확인할 수 있는 바와 같이, AL-SISIN-1 투여 후 심장, 폐, 신장, 간, 비장 및 배액 림프절을 포함한 주요 기관 조직에서 유의미한 변화가 관찰되지 않아 본 발명의 조성물은 안전성이 우수함을 확인하였다.
실험예 5. 종양세포 내에서 NO 방출능 확인
종양 세포 특이적인 세포독성을 평가하기 위해 전이성 암 세포주인 B16-F10에서 본 발명의 화합물의 NO 방출 및 축적에 대해 공초점 현미경(Confocal microscopy)을 사용하여 B16-F10 세포 내 NO 수준을 DAF-2 DA의 형광 신호 평가하여 확인하였다.
구체적으로, 세포를 1x105 cells/well의 밀도로 6-웰 플레이트에 놓인 커버 글라스에 접종(seed)하고 10% FBS, 100 U/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신과 함께 37℃에서 DMEM 배지 하에 배양하였다. 밤새 배양한 후, 오래된 배지를 5 μM의 DAF-2 DA를 포함하는 신선한 배지로 교체하고, 다시 40분 동안 배양하였다. 그 후, 세포를 DPBS로 세척하고 각 샘플(50 μM에 해당하는 SISIN-1 농도)을 신선한 배지로 처리하였다. 샘플과 함께 3시간 동안 배양한 후, 세포를 DPBS로 세척하고, 실온의 어두운 조건에서 10% 중성 완충 포르말린(NBF)으로 처리하였다. 30분 후, 커버 글래스를 DAPI가 있는 안티페이드 장착 매체(antifade mounting medium)에 장착하고 공초점 현미경(confocal microscopy)으로 관찰하였으며, 결과는 도 19a에 나타내었다.
도 19a에서 확인할 수 있는 바와 같이, AL-SISIN-1 또는 SISIN-1-OH로 처리한 후 B16-10 세포에서 높은 형광 강도가 관찰되었는데, 이는 본 발명의 화합물이 B16-F10 세포에 유입되어 세포 내 GSH 반응 행동에 따라 NO를 방출함으로 인해 세포 내 NO 농도가 크게 증가하였음을 나타낸다.
실험예 6. 암세포에 대한 세포독성 효과 확인
(1) 암세포에 대한 용량-의존적 세포독성 확인
용량-의존성 세포독성은 SIN-1, SISIN-1-OH, 알부민 및 AL-SISIN-1을 포함한 샘플을 처리한 후, MTT 분석을 사용하여 평가하였다.
구체적으로 B16-F10 세포를 96-웰 플레이트에 5x103 cells/well의 초기 밀도로 접종하고, 10% FBS, 100 U/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신과 함께 37℃ DMEM 배지에서 배양하였다. 24시간 동안 배양한 후, 오래된 배지를 신선한 배지의 샘플로 교체하고 세포를 다시 48시간 동안 배양하였다. 그 후, 세포를 세척하고 0.5 mg/mL의 MTT 용액이 포함된 배지로 4시간 동안 배양하였다. 마지막으로, 배지를 200 μL DMSO로 교체하고 570 nm에서 해당 흡광도를 측정하여 상대적 세포 생존력을 조사하였으며, 결과는 도 19b에 나타내었다.
상기 도 19b에서 확인할 수 있는 바와 같이, 화합물의 처리 용량이 높아질수록 높은 세포독성 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있다. 또한, 유리 SIN-1의 경우, 세포질 선택적 SISIN-1-OH 및 AL-SISIN-1에 비해 현저히 낮은 세포독성을 나타냈는데, 이는 SIN-1의 비특이적 방출 후 NO가 무해한 이온으로 빠르게 분해되는 것으로 여겨진다. 이는 선택적인 세포 내 NO 방출이 세포독성에 중요한 영향을 미칠 수 있음을 나타낸다.
(2) 암세포 특이적 세포독성 확인
본 발명 화합물의 암세포 특이적 세포독성은 배양된 B16-F10 세포주, 림프구 및 비장 세포의 세포 생존력(cellular viability)을 MTS 세포 증식 분석(MTS cell proliferation assay)을 사용하여 확인하였다.
구체적으로 림프구 및 비장 세포는 8주령 암컷 BALB/c 마우스로부터 세포 스트레이너(cell strainer)(Falcon, New Jersey, USA)를 사용하여 분리하였다. 분리된 세포를 4℃, 300 g에서 5분 동안 원심분리하고 1 mL ACK 용해 완충액(on ice)에 재현탁하였다. 2분 동안 인큐베이션 후, 9 mL의 RPMI 1640 배지를 첨가하고 세포를 다시 4℃, 300 g에서 5분 동안 원심분리하였다. 분리된 세포를 96-웰 플레이트에 5x103 cells/well의 초기밀도로 접종(seed)하고, 10% FBS, 100 U/mL 페니실린 및 100 μg/mL의 스트렙토마이신을 포함하는 RPMI 1640 배지 하에서 37℃에서 배양하였다. 이후 AL-SISIN-1(50 μM)을 처리한 후, 세포를 48시간 동안 배양하고 제조업체의 프로토콜에 따라 MTS 세포 증식 분석(cell proliferation assay)으로 세포 생존력(cellular viability)을 평가하였으며, 결과는 도 19c에 나타내었다.
상기 도 19c에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 화합물 처리 후 암세포인 B16-F10 세포주는 약 50%의 세포생존율을 나타낸 반면, 림프구 및 비장 세포를 포함한 정상세포에서는 약 80% 이상의 세포생존율을 나타내어 본 발명의 화합물이 암세포에 특이적으로 세포독성을 나타낼 수 있음을 확인하였다.
실험예 7. 전이성 암 모델에서 항-전이 효과 확인
본 발명의 화합물의 항전이 효과는 전이성 암 모델 마우스에서 평가하였다.
구체적으로, B16-F10 전이성 암 세포주를 8주령 암컷 BALB/c-nu/nu 마우스(3×106 cell/mouse)의 오른쪽 앞발에 접종하였다. 접종 5일 후 마우스를 무작위로 3 개 그룹(그룹 당 7마리)으로 나누고, 3개 그룹의 마우스에 각각 식염수, SISIN-1-OH 및 AL-SISIN-1(각각 2 mM, 10 μL)을 2회(5일 및 7일) 피하 주사하였다. 각 그룹의 생존율(morbidity-free survival)을 모니터링하고 30일에는 모든 마우스를 희생시켰다(도 20a).
(1) 생존율(morbidity-free survival) 확인
생존율 확인을 위해 수 림프절(tumor-draining lymph node) 부피가 2500 mm3에 도달하면 생쥐를 생명 윤리적으로 허용된 한계에 따라 마우스를 희생시켰으며, 이에 따른 결과는 도 20b에 나타내었다.
상기 결과에서 확인할 수 있는 바와 같이, AL-SISIN-1을 피하 주사한 종양 접종 마우스의 생존 시간이 연장되었음을 확인하여, 본 발명의 화합물이 전이성 종양 확산 억제 효과를 가진다는 점을 확인하였다.
(2) 림프 전이에 의한 림프절 비대 억제 평가 1
본 발명의 화합물이 림프절로의 전이를 억제할 수 있는지 여부를 마지막 샘플 주입 14일 후의 마우스의 종양 배수 림프절의 확대 여부를 확인하여 평가하였으며, 결과는 도 21에 나타내었다.
도 21에서 확인할 수 있는 바와 같이, AL-SISIN-1을 투여한 마우스에서는 유의미한 림프절 비대를 나타내지 않아, 본 발명의 화합물이 림프절로의 전이를 효과적으로 억제할 수 있다는 점을 확인하였다.
(3) 림프 전이에 의한 림프절 비대 억제 평가 2
림프 전이에 의한 림프절 비대 억제를 평가하기 위해 종양 보유 마우스가 사망 한 시점에서 해당 마우스의 종양-배수 림프절(tumor-draining lymph node, TDLN)을 절제 후 관찰하였으며, TDLN의 사진은 도 20c에 나타내었고, 림프절 비대의 정량화 결과(TDLN/체중)는 도 20d에 나타내었다.
상기 도 20c 및 20d에서 확인할 수 있는 바와 같이, TDLN의 부피는 SISIN-1-OH를 접종한 마우스에서는 큰 변화가 없었으나, AL-SISIN-1를 접종한 마우스에서는 유의미한 퇴행을 나타내었다. 이는 본 발명의 화합물이 전이성 암에서 항-전이성 효과를 가진다는 점을 나타낸다.
(4) 조직학적 분석
AL-SISIN-1의 항전이 효과를 확인하기 위해 조직학적 분석을 통해 TDLN에서 림프 전이의 존재 및 폐조직으로의 전이를 평가하였다.
구체적으로, 주요 기관을 헤마톡실린 및 에오신(hematoxylin and eosin, H&E)으로 염색하였으며, Nikon Eclipse 80i (Tokyo, Japan)를 조직학적 분석 이미지에 사용하였다.
1) 림프 전이의 평가
도 20e에서 확인할 수 있는 바와 같이, AL-SISIN-1을 투여한 군에서는 림프절에 침윤된 전이성 종양 세포(도면 내 빨간색 부분)가 식염수 및 SISIN-1-OH을 투여한 군 대비 매우 적음을 확인하여 본 발명의 화합물이 전이성 암에 대해 항-전이성을 갖는다는 점을 확인하였다.
또한, 도 20f에서 확인할 수 있는 바와 같이, AL-SISIN-1을 투여한 군은 비-종양 마우스의 림프절과 비교하여 보존된 TDLN 부피를 갖는 것으로 확인하였다.
2) 폐 조직의 종양결절의 평가
TDLN의 전이성 종양은 일반적으로 치명적인 폐 전이로 알려진 폐 조직으로 퍼져 암 환자의 빠른 사망을 초래한다. 따라서, 폐 조직의 종양 결절은 H&E 염색 후 조직학적 분석으로 평가하였으며, 결과는 도 20g 및 도 20h에 나타내었다.
상기 도 20g 및 도 20h에 나타낸 바와 같이, AL-SISIN-1에 의한 림프 전이 억제 결과, AL-SISIN-1을 투여한 군에서는 체중 변화없이 폐 종양 결절 형성이 발견되지 않아 본 발명의 화합물이 항-전이성을 갖는다는 점을 확인하였다.

Claims (15)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물:
    [화학식 1]
    Figure pat00015

    여기서,
    R1은 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C10 알킬렌이며,
    R2는 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C10 알킬; 또는, 치환 또는 비치환된 2-싸이오피리딘(2-thiopyridine)이다.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 R1은 C2 알킬렌이며,
    R2는 2-싸이오피리딘인, 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 환원반응성은 산화환원 반응에 의해 유발된 자가-희생 링커의 자가-희생적 단편화에 의한 것인, 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물.
  4. 하기 화학식 4로 표시되는, 약물, 전달체 또는 약물을 함유한 전달체가 접합된 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물:
    [화학식 4]
    Figure pat00016

    여기서,
    R1은 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C10 알킬렌이며,
    상기 R3은 약물, 전달체 또는 약물을 함유한 전달체이다.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 약물은 단백질 약물, 화학적 약물 및 핵산으로부터 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 약물, 전달체 또는 약물을 함유한 전달체가 접합된 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 전달체는 고분자, 유기 나노구조체, 무기 나노구조체, 유기 마이크로 구조체, 무기 마이크로구조체, 하이드로젤, 스캐폴드 및 코팅물질로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 약물, 전달체 또는 약물을 함유한 전달체가 접합된 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물.
  7. 제4항에 있어서,
    상기 전달체는 알부민인, 약물, 전달체 또는 약물을 함유한 전달체가 접합된 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 알부민이 접합된 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물은 직경이 10-20 nm인 약물, 전달체 또는 약물을 함유한 전달체가 접합된 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물.
  9. 제1항 내지 제8항의 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물을 유효성분으로 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 암은 전이성 암인, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 비경구 투여되는 것인, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 정맥, 피하, 복강 또는 종양 내 주사를 통해 투여되는 것인, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  13. 제1항 내지 제8항의 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물을 유효성분으로 포함하는, 자가면역질환, 난치성 신경질환 또는 감염성질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  14. 하기 화학식 1의 화합물을 싸이올기를 함유하고 있는 약물, 전달체 또는 약물을 함유한 전달체와 반응시키는 단계를 포함하는 약물, 전달체 또는 약물을 함유한 전달체가 접합된 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물 제조방법:
    [화학식 1]
    Figure pat00017

    여기서,
    R1은 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C10 알킬렌이며,
    R2는 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C10 알킬; 또는, 치환 또는 비치환된 2-싸이오피리딘(2-thiopyridine)이다.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 R1은 C2 알킬렌이며,
    R2는 2-싸이오피리딘인, 약물, 전달체 또는 약물을 함유한 전달체가 접합된 환원반응성 일산화질소 공여 화합물 또는 전구약물 제조방법.
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