EP2726107A1 - Nano vecteurs ou particules polymeres et leur utilisation comme medicament et/ou agent de diagnostic - Google Patents

Nano vecteurs ou particules polymeres et leur utilisation comme medicament et/ou agent de diagnostic

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EP2726107A1
EP2726107A1 EP12738551.6A EP12738551A EP2726107A1 EP 2726107 A1 EP2726107 A1 EP 2726107A1 EP 12738551 A EP12738551 A EP 12738551A EP 2726107 A1 EP2726107 A1 EP 2726107A1
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EP
European Patent Office
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formula
polymer
monomer units
group
nanovectors
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP12738551.6A
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German (de)
English (en)
Inventor
Philippe Bertrand
Régis DELATOUCHE
Valérie HEROGUEZ
Floraine Collette
Marc Gregoire
Christophe BLANQUART
Fabien GUEUGNON
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Universite de Poitiers
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Universite de Poitiers
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Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM, Universite de Poitiers filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid

Definitions

  • the present invention relates to nanovectors or polymer particles and their use as a medicament and / or diagnostic agent. BACKGROUND OF THE INVENTION The present invention relates to nanovectors or polymer particles and their use as a medicament and / or diagnostic agent.
  • Active targeting is based on a specific interaction between the agent and the cell, based in particular on the use of ligand-receptor or antigen-antibody pairs.
  • passive targeting is to increase the quantities of agents delivered by using the physiological properties of the targets.
  • the developed systems must have three essential properties: to be inactive the time of transport, to allow targeting to the desired treatment area and to have a vector that releases the drugs once this area is reached.
  • the treatment zone here is the cell and the guiding of the drug is based on differences between healthy and tumor cells, mainly by identifying proteins that are overexpressed on the surface of these cells.
  • Papot S. Tranoy 1., Tillequin F., Florent J.-C, Gesson J.-P., Curr Med Chem, Anti-Cancer Agents, 2002, 2, 155.
  • the most advanced compounds obtained on this principle are in phase I / II and Mylotarg® is one of the few examples used clinically (Wu A.M., Senter P.D., Nature Biotechnology, 2005, 23 (9), 1137-1146).
  • the molecule once internalized by the cell, the molecule must find its target that can be cytoplasmic or nuclear. In order to overcome these various disadvantages, the need for directed targeting followed by cellular penetration and ending with the release of the drug into the cell has emerged. In this new approach, the concept of guiding to tumor cells remains important and the possible spread to undesired areas should be avoided.
  • the passage of small molecules through the membranes is by natural diffusion.
  • the passage through this membrane of macro molecules is normally done by a mechanism called endocytosis.
  • the macromolecules interact with receptors on the surface of the cell, causing a membrane modification that encompasses the structure and produces by internal detachment an organelle usually called an endosome.
  • an organelle usually called an endosome.
  • these endosomes rapidly reach an internal pH of about 6. Through a maturation process, this pH is progressively lowered with a perinuclear displacement where the endosomes finally bind to the primary lysosomes, yielding a set called secondary pH lysosomes.
  • the membrane barrier can be altered by various processes, especially under the action of viruses.
  • Green and Lowenstein Green M., Loewenstein PM, Cell, 1988, 55, 1179
  • Frankel and Pabo Fekel AD, Pabo CO, Cell, 1988, 55, 1189
  • TAT protein A focus specific to the TAT protein has been published (Dowding SF, Wading JS, Advanced Drug Delivery Reviews, 2005, 57, 579) in parallel with a general review on cellular penetrating peptide (CPP) with a mechanistic model of this internalisation (Zorko M., Langke V., Advanced Drug Delivery Reviews, 2005, 57, 529).
  • CPP cellular penetrating peptide
  • TAT protein avoids lysosomal degradation but can be retained in endosomes (Caron NJ, Quenneville SP, JP JP Biochemical and Biophysical Research Communications, 2004, 319, 12).
  • vector polymers are developed that disrupt the stability of endosomes, or by causing the latter to burst (Bulmus V., Woodward M., Lin L., Murthy N., Stayton P., Hoffman A., Journal of Controled Release, 2003, 93,105), or by modifying the internal pH, as in the case of cationic polymers (rich in nitrogen) such as polylysines or polylysines modified with imidazoles (Putnam D., Oentry CA, DW Pack, Langer R., Proc Natl Acad Sci, 2001, 98 (3), 1200, Merdan T., Kopecek J., Kissel T., Advanced Drug Delivery Reviews, 2002, 54, 715). Used, for example, in the transport of DNA, these polymers also generate charge interactions which give compact complexes that are more stable with respect to possible damage.
  • Molecular objects have been designed of sufficient size to circulate slowly in the body and avoid renal elimination (size greater than 40 kDa) or trapping by the reticuloendothelial system (size greater than 200 kDa).
  • a ratio between the molecular weight of the system and its effective volume must be found.
  • Liposedoxorubicin (Ceh B., Winterhalter M., Frederik PM, Vallner, J., Lasie DD, Adv Drug, Dev., Reviews, 1997, 24, 165-177)).
  • One of the important aspects of these systems is their ability to greatly reduce the phenomena of resistance.
  • the application WO 2006/008387 describes stimulable polymer particles, especially in acidic medium, having reactive functions but which have the major disadvantage of not being able to comprise sensitive reactive functions by virtue of the process for obtaining said particles and secondly require the development of a specific synthesis for each reactive function to use.
  • One aspect of the invention is to provide nanovectors, in polymer or non-polymer form, comprising at least one active ingredient, in particular an epigenetic modulator, and / or at least one detection probe and / or a cell penetration peptide said nanovectors being capable of penetrating into a cell, in particular a cancer cell.
  • Another aspect of the invention is to use said nanovectors as a medicament, especially anticancer and / or as a diagnostic agent.
  • a third aspect of the invention is to provide pharmaceutical compositions comprising said nanovectors.
  • a final aspect of the invention is to provide methods for synthesizing said nanovectors which can be used irrespective of the epigenetic modulator or the detection probe present on the nanovector.
  • the present invention relates to nanovectors constituted by polymer chains Pi of general formula (I) below:
  • polymer P containing about 30 to 10,000 monomeric units, identical or different, derived from the polymerization of monocyclic alkenes whose number of carbon atoms constituting the ring is about 4 to 12, or polycyclic alkenes whose total number of constituent carbon atoms of the rings is about 6 to 20,
  • t 0 or 1
  • q is an integer of 1 to 10
  • u represents an integer of 0 to 10
  • n represents 0 or 1
  • X represents O, NH or S
  • n and p represent, independently of one another, an integer of 1 to 1000, in particular 50 to 340, in particular 70 to 200
  • r represents is an integer from 0 to 10, preferably 0 or 1, or,
  • R4 represents: a vinyl group, an ethyne group, an OR 'or SR "group, R' and R" represent, independently of one another, H, a C 1 -C 20 alkyl, a C3-C 20, and m being as defined above,
  • r represents is an integer from 0 to 10, preferably 0,
  • R 2 and R ' 2 represent independently of one another:
  • Ra and Rb are independently of each other H, a C 1 -C 20 alkyl, the alkyl being able to form a ring with the one or more carbons ortho of that bearing NRaRb, a C3-cycloalkyl; C20
  • Rc represents H, a C 1 -C 20 alkyl, a C 3 cycloalkyl
  • R 2 and R ' 2 represent 2 or 4-methoxyphenyl, 2 or 4-methylphenyl, phenyl, 2,4-dimethoxyphenyl,
  • NR and R are independently of each other H, a C 1 -C 20 alkyl, the alkyl being able to form a ring with carbon or 3 ', a C 3 -C 20 cycloalkyl, nitrogen atom having a positive charge associated with a monovalent anion,
  • R' is H, C 1 -C 20 alkyl, C 3 -C 20 cycloalkyl, C 1 -C 20 alkyl, C 3 -C 20 cycloalkyl,
  • R f and R g represent, independently of one another H, C 1 -C 20 alkyl which may form a ring with the carbon 1 or 3, a C3-C20 ,
  • Rc is H, C1-C20, cycloalkyl C3-C20, a substituted benzyl or not,
  • a " represents a monovalent anion
  • Y 1 and Y 2 represent independently of one another:
  • R' is H, C 1 -C 20 alkyl, C 3 -C 20 cycloalkyl, C 1 -C 20 alkyl, C 3 -C 20 cycloalkyl,
  • R h and R independently of one another H, C1-C20 alkyl which may form a ring with the carbon 1 or 3 in the case of Yi, and carbon 1 'or 3' in the case of Y 2 , a C3-C20 cycloalkyl, where N0 2 ,
  • Rc is H, C1-C20, cycloalkyl C3-C20, a substituted benzyl or not,
  • R 3 represents an active ingredient, in particular an epigenetic modulator, or a detection probe, in particular fluorescent or radio-transmitting, or a cell penetration peptide (PPC),
  • an active ingredient in particular an epigenetic modulator, or a detection probe, in particular fluorescent or radio-transmitting, or a cell penetration peptide (PPC)
  • polymer chain P it is necessary to understand a substance composed of a large number of small, identical or different, small mass molecular structures that bind together, in a chain or in a network, to create molecules having a high molecular weight
  • the polymer chain P contains monomeric units derived from monocyclic or polycyclic alkene polymerization. It can be of the polynorbornene type.
  • the polymer chain P contains from about 30 to 10,000 monomeric units, which are identical or different, in particular 340 units.
  • said monomer units are derived from the polymerization of monocyclic alkenes consisting of 4 to 12 carbons or polycyclic alkenes consisting of 6 to 20 carbons.
  • the chain can also correspond to, for example but not limited to, (N- (2-hydroxypropyl) methacrylamide) (HMPA), PEG, pluronic® (copolymer of ethylene oxide and propylene oxide). ), Dextran (branched polysaccharide consisting of several glucose molecules), polyamides,
  • the polymer chain P is present in the general formula (I) and there is therefore between 1 and 10 identical or different structures of formula (I) present on said polymer chain.
  • spherical particle refers to a structure that consists of several polymer chains P, especially from October 12 to October 16, especially from October 14 to October 15 P polymer chains each comprising the one or more molecule (s) of formula (I ) identical or different and which then form a spherical particle having a mean diameter of about 5 nm to about 100 ⁇ depending on the reasons present in RI, such as units (CH 2 -CH 2 0: (EO)), and the polymer chain P present in the molecule.
  • the particle diameter is from about 50 to 500 nm, in particular 300 nm to exploit the effect of tumor permeability.
  • Another advantage of the invention is to have particles of different sizes.
  • q is an integer from 1 to 10
  • q is an integer from 1 to 10
  • the polymer chain P can comprise up to 10 molecules of formula (Ia).
  • Said spherical particle can therefore be constituted:
  • each polymer chain comprising from one to 10 molecules of formula (Ia) identical and can be obtained by copolymerization of compounds of formula (Ia) identical (Ri representing a group of formula (III)) with a mono alkene or polycyclic, or of different polymer chains P 1, ranging from 1 to 10, for example P polymer chains comprising from 1 to 10 molecules of formula (Ia) carrying an active principle, and P2 polymer chain comprising from 1 to 10 molecules of formula (Ia) carrying a fluorophore and can be obtained by copolymerization of compounds of formula (Ia) different (Ri representing a group of formula (III)) with a mono or polycyclic alkene, - Chains R 'i comprising no detection probe, active ingredient, cell penetration peptide (PPC) and non-triazole which serve in particular to stabilize the particle.
  • PPC cell penetration peptide
  • polymer nanovector or nanovector also denotes: a spherical particle consisting of polymer chains Pi comprising:
  • n 0 or 1
  • n 0 or 1
  • C 1 -C 20 alkyl used in the definition of R 'and R "as well as throughout the description denotes a linear or branched alkyl group comprising 1 to 20 carbon atoms.
  • linear C 1 -C 20 alkyl group are meant: methyl, ethyl, propyl, butyl, pentyl, hexyl, heptyl, octyl, nonyl, decyl, undecyl, dodecyl, tridecyl, tetradecyl, pentadecyl, hexadecyl, heptadecyl, octadecyl, nonadecyl and eicosyl and all their isomers.
  • Cycloalkyl group, C 3 -C 2 o must include cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, cyclononyl, cyclodecyl, cycloundecyl, cyclododecyl, cyclotridisputedcyle, cyclotetradecyl, cyclopentadécyle, cyclohéxadécyle, cycloheptadécyle, cyclooctadecyl, cyclononadécyle and cycloeicosyle .
  • Such cycloalkyl groups may themselves be substituted by a linear or branched alkyl group as defined above.
  • active principle designates any pharmaceutical molecule that may have an efficacy in any pathology, in a mammal, in particular a man or a molecule detectable by any suitable method.
  • epidermatitis refers to a molecule capable of reactivating regulatory genes that have been repressed in mammalian tumor cells, especially human tumor cells, such as, for example, DNA methyl transferase inhibitors that inhibit DNA methylation. and reactivate silent genes inducing differentiation, apoptosis or antiproliferation, or histone deacetylase inhibitors (HDACI or HDI) to increase the level of acetylation of histones and thus leading to silent gene reexpression.
  • HDACI histone deacetylase inhibitors
  • detection probe designates a molecule detectable by any suitable method, such as a fluorescent molecule (or fluorophore), for example, fluorescein, rhodamine, or a radio-emitting molecule such as "Technetium, or contrast agents for medical imaging such as lanthanides.
  • a fluorescent molecule or fluorophore
  • fluorescein for example, fluorescein, rhodamine
  • radio-emitting molecule such as "Technetium, or contrast agents for medical imaging such as lanthanides.
  • cell penetration peptide refers to, but not limited to, peptides, such as polyarginines, polylysines, which may facilitate cellular uptake.
  • Said peptide is linked by its ⁇ -amino or carboxylic function or by the functions present on the side chain when they exist.
  • R 2 and R ' 2 may be the same or different. When R 2 and R ' 2 are identical, the carbon borne by these two substituents is achiral.
  • each enantiomer (R) or (S) may be pure or a mixture of the two enantiomers in the range of 0.01% (S) -99.9% (R) to 99.9% (S) -0.01% (R) provided that no other asymmetric carbon is present on the molecule of formula (I).
  • the molecule comprises one or more other asymmetric carbons, it may be in the same manner in the racemic form, or each pure enantiomer or a mixture of enantiomers and the molecule of general formula (I) then corresponds to a mixture of diastereoisomers.
  • R 2 and R ' 2 represent, independently of one another, a phenyl which may or may not be substituted by one or more substituents as defined above, the two R 2 and R ' 2 may then be identical or different, the cycle being of the following general formula (V) or (V):
  • the substituents are as defined above for Y 'of formula (Va) and the nitrogen is then in the form of N + tetravalent and is associated with a monovalent anion as a against ion, such as for example a halide, HC0 3 ", HSCV, PF 6", CF3SO3 ", CH3COO".
  • R 2 and R ' 2 represent:
  • the ring of formula (Vb), in particular the ring of formula (Vbb), and in this case n 1 and the molecule of formula (I) then has a group R 3 which represents an active principle, in particular an epigenetic modulator, or a cell penetration peptide but not a detection probe.
  • Ri itself linked to a polymer chain P, to a monocyclic or polycyclic alkene, or to a substituent R4, and on the other hand by a methylene or biphenylmethylene which is optionally bonded to an active ingredient, in particular an epigenetic modulator, to a fluorescence probe or to a cell penetration peptide, optionally via an XC spacer (O ).
  • R '1 which is then composed solely of PEO.
  • the compounds of formula (I) have a molecular weight ranging from 40 kDa to more than about 3200 kDa, in particular greater than about 200 kDa.
  • the inventors have surprisingly found that the presence of triazole, easily synthesized by bioconjugation (or "click” chemistry), allowed not only the easy obtention of the compounds of formula (I) whatever the R 3 group present on it. but still allowed the formation of a stable carbocation and thus the release of the active ingredient in acidic medium.
  • Another advantage of the invention is that the molecular weight of the compounds of formula (I) and (Ia) enables them to circulate for a long time in the blood vessels of a mammal, in particular a human, and in particular around 24 hours, avoiding and their elimination especially for compounds> 40kDa and allows them to be trapped by retention and increased permeability (Enhanced Permeability and Retention: EPR) then internalized by endocytosis in the cell and to be able to release the active ingredient or the detection probe by the endosomal / lysosome pathway in the reticuloendothelial system because of the acidic pH, by cleavage of the spacer E1, in particular for compounds of more than 200 kDa and in particular for compounds of more than 3200kDa, or by a route other for Acid-sensitive active ingredients that can penetrate the nucleus using the nuclear pore complex mechanism (NPC) based on nuc Nuclear Localization Signais (NLS).
  • NPC nuclear pore complex mechanism
  • the polymer chain P and components other than the active ingredient or the detection probe may be removed from the cell.
  • Yet another advantage of the invention is that since the cleavage of the active principle takes place at a pH of less than 7, the compound of formula (I) can circulate in the blood vessels without being degraded and thus enters the cell under its complete form.
  • the compounds of formula (I) being designed from PEG-based structures, they will also be invisible to macrophages, thus avoiding their elimination by said macrophages and thus allow EPR trapping.
  • the polymer chain P comprises more than 10 molecules of formula (Ia) identical or different or constituting a mixture of one or more identical molecules with one or more different molecules as defined above.
  • the invention relates to nanovectors of general formula (I) as defined above, in which the monomer units are derived from the polymerization of monocyclic alkenes, and have the following formula (ZI):
  • R 5 represents a hydrocarbon chain of 2 to 10 carbon atoms, saturated or unsaturated.
  • hydrocarbon chain is meant a C 2 to C 10 alkyl chain.
  • the invention relates to nanovectors of general formula (I) as defined above, in which the monocyclic alkenes from which the monomer units are derived are:
  • cyclooctapolyene in particular polymer-conducting cycloocta-1,5-diene comprising monomer units of the following formula (Zli)
  • the invention relates to nanovectors of general formula (I) as defined above, in which the monomer units are derived from the polymerization of polycyclic alkenes, and are:
  • W represents -CH 2 -, or a heteroatom, or a group -CHR 7 -, or a group -CHR 8 -
  • R 7 represents a chain comprising a polyethylene oxide of formula - (CH 2 -CH 2 -0) m , m being as defined above and Rs being a C1-C10 alkyl or alkoxy chain, .
  • Wi and W 2 independently of each other, represent H, or an R 7 chain, or a group Rs mentioned above, or form in combination with the carbon atoms which carry them a ring of 4 to 8 carbon atoms this cycle being optionally substituted by a chain R 7 or a group Rs mentioned above,
  • . a represents a single or double bond
  • W represents -CH 2 -, or a heteroatom, or a group -CHR 7 -, or a group -CHR 8 -, R 7 and R 8 being as defined above,
  • W'i and W ' 2 independently of each other, represent -CH 2 -, or a -C (O) group, or a -COR 7 group, or a -C-ORs, R 7 and R 8 being as defined above,
  • ni and n 2 independently of one another, represent 0 or 1
  • W "i and W” 2 independently of one another, represent a hydrocarbon chain of 0 to 10 carbon atoms
  • W 'and W is independently from each other, represent -CH 2 - or -CHR 7 group -, or -CHR 8 group -, R 7 and R 8 being as defined above -above,
  • W 'and W is independently from each other, represent -CH 2 - or -CHR 7 group -, or a group -CHR 8 -, R 7 and R 8 being as defined above -above.
  • the invention relates to nanovectors of general formula (I) as defined above, in which the polycyclic alkenes from which the monomer units are derived are:
  • the invention relates to nanovectors of general formula (I) as defined above, in which the mono or polycyclic alkenes from which the monomer units are derived are:
  • the invention relates to a compound of general formula (I) as defined above, in which the epigenetic modulator is chosen from:
  • nucleoside in particular cytidine, uridine, adenosine, guanosine, thymidine or inosine,
  • HDI histone deacetylase inhibitors
  • SAHA Zolinza ®
  • TSA trichostatin A
  • valproic acid MS-275 or CI-994
  • DNMTI DNA methyltransferase inhibitors
  • Nucleosides are glycosylamines consisting of a nucleobase (or base) linked to a ribose or deoxyribose via a glycosidic bond or a base bound to a ribose analog as in gemcitabine.
  • the biological activity of histone deacetylase inhibitors leads to an increase in the level of histone acetylation which allows the re-expression of tumor-regulating genes in tumor cells.
  • SAHA Zolinza ®
  • SAHA when it is present is connected either to the spacer X (CO) or to the carbon carrying R 2 and R ' 2 of the formula (I) by hydroxyl hydroxamic acid function.
  • TSA Trichostatin
  • TSA when it is present is connected either to the spacer X (CO) or to the carbon bearing R 2 and R ' 2 of the formula (I) by the hydroxyl hydroxyl acid function or by the ketone function close to the aromatic ring.
  • Valproic acid has the following structure:
  • Valproic acid when present, is attached to either the spacer X (CO) or the carbon carrying R 2 and R ' 2 of the formula (I) by hydroxyl of the acid function.
  • MS-275 has the following structure:
  • DNMT inhibitors DNA methyltransferase inhibitors
  • 5-Azacytidine has the following structure:
  • the 5-azacytidine is linked to the spacer X (CO) or to the carbon carrying R 2 and R ' 2 of the formula (I) by its primary alcohol function, secondary or by the amine.
  • 5-aza-2'-deoxycytidine (or decitabine) has the following structure:
  • 5-aza-2'-deoxycytidine is linked to the spacer X (CO) or to the carbon bearing R 2 and R ' 2 of the formula (I) by its primary, secondary or amine alcohol function.
  • Zebulin has the following structure:
  • Zebulainin is linked to the spacer X (CO) or to the carbon bearing R 2 and R ' 2 of the formula (I) by its primary or secondary alcohol function.
  • the nanovector comprises an epigenetic modulator which is a histone deacetylase inhibitor: SAHA and corresponds to the compound product referred to as (20e).
  • SAHA histone deacetylase inhibitor
  • the invention relates to nanovectors of general formula (I) as defined above, in which the detection probe is chosen from a fluorophore substance, in particular rhodamine B or fluorescein, coumarins, in particular 7-hydroxy-4-methylcoumarin, bodipy, texas red, cyanines, in particular CY3 or CY5, or a radio-emitting substance such as "Technetium in liganded form, or contrast agents for medical imaging such as lanthanides (gadolinium).
  • a fluorophore substance in particular rhodamine B or fluorescein
  • coumarins in particular 7-hydroxy-4-methylcoumarin
  • bodipy texas red
  • cyanines in particular CY3 or CY5
  • a radio-emitting substance such as "Technetium in liganded form
  • contrast agents for medical imaging such as lanthanides (gadolinium).
  • fluorophore substance refers to a chemical substance capable of emitting fluorescent light after excitation.
  • Rhodamine has a skeleton of the following structure:
  • Rhodamine B has the following structure:
  • Fluorescein has the following structure:
  • the 7-hydroxy-4-methylcoumarin has the following structure:
  • the OH function is then connected to the carbon carrying R 2 and R ' 2 of the formula (I) without spacer.
  • Bodipy correspond to the abbreviation of boron-dipyromethene, and represent a family of dyes that strongly absorb in the UV and have the property of emitting a narrow fluorescence with a significant quantum yield. They are all derived from 4,4-difluoro-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene below:
  • Texas red has the following formula:
  • the CY3 have the following formula:
  • R representing an alkyl, such as methyl, ethyl ...
  • the CY5s have the following formula:
  • R representing an alkyl, such as methyl, ethyl ...
  • the CY7s have the following formula:
  • R representing alkyl, such as methyl, ethyl ...
  • Technetium in liganded form may correspond to technetium-gluceptate or more conventionally diethylene triamine pentacetate complexes (DTP A) (Brain Research Protocols 8 (2001) 143-149, Non-invasive assessment of blood-brain barrier (BBB) permeability 99 using a gamma camera to detect technetium-gluceptate extravasation in rat brain.Ramela Esposito, Stanley Jacobson, Raymond Connolly, Daniela Gheorghe, Theoharis C. Theoharides, Use of sequential dtpa clearance and high resolution computerized tomography in interstitial lung disease in dermatomyositis C. Hell, E. Romas, B. Kikham, British Journal of Rheumatology 1996; 35: 164-166).
  • DTP A Conventionly diethylene triamine pentacetate complexes
  • a contrast agent is a compound that artificially increases the contrast to visualize an anatomical (eg, organ) or pathological (eg, tumor) structure with little or no contrast.
  • the principle of operation of the contrast product depends on the imaging technique used: in radiography, the ability of the product to absorb X-rays is exploited; in magnetic resonance imaging, the compounds used are chosen in function of their magnetic properties; in ultrasound, substances whose ultrasound echo is characteristic are used.
  • the invention relates to nanovectors of general formula (I) as defined above, in which the cellular penetration peptide is chosen from polylysines, polyarginines, imidazole polylysines, or mimetics of polyglycines with a chain carrying a nitrogen terminal group.
  • the COOH or NH 2 termination can be modified to carry an alkyne for click chemistry.
  • k is from 1 to 10.
  • R f represents an alkyl-C 2 o nitrogenous group carrier (NR a R b) or a cycloalkyl C 3 -C 2 o carrying a nitrogenous group (NR a R b) with a and b representing an alkyl in Ci-C 2 o cycloalkyl or C 3 -C 2 o.
  • NR a R b may also be in the ammonium form (NR a R b R c ) with a, b and c defined as above.
  • R f may optionally represent an alkyne among the i repetitions.
  • CPP cell penetration peptide
  • the nanovectors carrying CPP also carry one or more active principle (s) and optionally one or more detection probe (s).
  • the present invention relates to compounds of general formula (III) as precursor of the polymer chain P of formula (I).
  • the present invention relates to nanovectors as defined above for use as a medicament and / or diagnostic agent.
  • R 3 represents a detection probe
  • the spherical particles when they have been previously administered to a mammal and in particular a human, can be used as diagnostic agent after release of the probe in the cell after selective trapping of the compound by EPR. and internalization by endocytosis by a cell, in particular a tumor that makes it possible to diagnose and / or locate a pathology
  • This same detection probe also makes it possible to track cellular traffic.
  • the spherical particles when they have been previously administered to a mammal and in particular a human, and in which different polymer chains are present, and comprising for example at least one active principle and at least one detection probe, are also used. both as a drug and as a monitoring agent for the internalization of the active principle in the target cell, in particular a cancer cell, after release of the active ingredient and the detection probe in the cell after internalization of the spherical particles by endocytosis in the cell.
  • the nanovectors for use as a drug and / or diagnostic agent are nanovectors in which R 1 represents a group of formula (III).
  • the nanovectors for use as a medicament and / or diagnostic agent are nanovectors in which R 1 represents a group of formula (IV).
  • the present invention relates to nanovectors as defined above, for use as a medicament and / or diagnostic agent, in which the active ingredient, such as an epigenetic modulator, and / or the Detection probe is released into the cell after endocytosis by said cell at an acidic pH.
  • the active ingredient such as an epigenetic modulator, and / or the Detection probe is released into the cell after endocytosis by said cell at an acidic pH.
  • the compound of general formula (I) After penetration into the cell by endocytosis, the compound of general formula (I) is internalized in the endosome in which the pH is 6 allowing the beginning of the hydrolysis of the group (s) R 3 present (s) and whose maturation leads to the lysosome in which the pH is 5 allowing to complete hydrolysis of the R 3 group (s) and the release of the active principle (s) in the cytoplasm (FIG. 1).
  • the present invention relates to nanovectors as defined above, for use as a medicament and / or diagnostic agent, in particular for the treatment and / or diagnosis of pathologies selected from neurological diseases, inflammatory processes, cancer, blood diseases.
  • neurodegenerative diseases should be understood without being limited thereto, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, multiple sclerosis, neuropathy, polyneuritis, epilepsy, meningitis. .
  • inflammatory process includes, but is not limited to, arthritis, arteritis, colitis, conjunctivitis, cystitis, dermatitis, encephalitis, endocarditis, endometritis, gastritis, meningitis, myocarditis, myelitis, pancreatitis, peritonitis, sinusitis, tendonitis.
  • cancer includes, but is not limited to, hematopoietic cancers, leukemias, lymphomas, carcinomas, adenocarcinomas, sarcomas, melanoma, carcinoma of the head and neck, cancer of the esophagus, oral and pharyngeal cancer, laryngeal cancer, bladder cancer, colorectal cancer, ovarian cancer, uterine cancer, penile cancer, vulvar and vagina, cervical cancer, prostate cancer, kidney cancer, skin cancer, bone cancer, joint and articular cartilage cancer, testicular cancer, stomach cancer, gastrointestinal cancer, genitourinary cancer, lung cancer, thymoma, mesothelioma, teratoma, cancer of the brain, liver cancer, pancreatic cancer, glioma, glioblastoma, oligoastrocytoma, meningioma, pituitary adenoma, glioblastoma multiforme,
  • blood diseases refers to diseases that affect erythrocytes, leukocytes, and platelets, and includes, but is not limited to:
  • hemoglobinopathies in particular thalassemias, depranocytosis, hemoglobin C, methemoglobinemia,
  • enzyme deficiency such as deficiency of glucose-6-phosphate dehydrogenase (G 6 PD or G 6 PDH), pyruvate kinase deficiency,
  • lymphoma a malignant derived from myeloma
  • leukemia erythropoiesis
  • coagulopathies such as platelet abnormalities, primary haemostasis, protein abnormalities, thrombotic abnormalities.
  • the present invention relates to nanovectors as defined above, for use as a drug and / or diagnostic agent, especially for the combinatorial treatment of pathologies selected from neurological diseases, inflammatory processes, cancer, blood diseases.
  • combinatorial treatment it is necessary to include particles carrying at least two active principles for the treatment of different pathologies, and particles carrying at least two different active principles for the treatment of the same pathology.
  • the same particles may comprise an HDI and a DNMT inhibitor for the treatment of malignant pleural mesothelioma (MPM).
  • MPM malignant pleural mesothelioma
  • HDI and DNMT are anticancer drugs currently tested in clinical trials alone or in combination in the treatment of MPM.
  • significant side effects can be observed with these treatments mainly because of the non-selective action of these molecules.
  • an advantage of the particles of the invention comprising at least two different active ingredients, in particular an HDI and a DNMT inhibitor, is to be able to selectively target the cell, in particular the cancer cell.
  • the invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising, as active principle, nanovectors as defined above, in association with a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • composition a composition comprising one or more active principle (s) consisting of nanovectors and which can be administered to a patient for the treatment of a pathology as defined above.
  • pharmaceutically acceptable carrier any substance other than the active ingredient in a drug. Its addition is intended to confer physico-chemical and / or biochemical characteristics to promote the administration to the final product, preferably avoiding covalent chemical interactions with the active ingredients.
  • the pharmaceutical composition as defined above is in a form that can be administered intravenously at a unit dose of 5 mg to 500 mg.
  • compositions for intravenous administration may be sterile solutions or emulsions.
  • a solvent or vehicle water, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils, in particular olive oil, injectable organic esters, for example ethyl oleate, may be used.
  • These compositions may also contain adjuvants, in particular wetting agents, isotonic agents, emulsifiers, dispersants and stabilizers.
  • Administration at the above unit dose may be performed once per 24h or repeated depending on the pathology and the medical prescription.
  • the pharmaceutical composition as defined above is in a form that can be administered intravenously at a dose of from about 0.05 ⁇ g / kg to about 10 mg / kg.
  • the invention relates to nanovectors consisting of polymer chains of general formula (I) as defined above, comprising a step of ring opening metathesis polymerization and a bioconjugation step.
  • the ROMP step requires the contacting of a catalyst such as:
  • the bioconjugation step (or click chemistry) requires contacting an alkyne with an azide in the presence of Cu (I) to obtain the corresponding triazole.
  • Yet another advantage of the invention is to provide a method involving a key bioconjugation step between two compounds, one carrying an azide function and the other an easily accessible alkyne function, carried out under mild conditions allowing easy access to particles comprising active principles and / or detecting probes varied and / or sensitive and having other functionalities.
  • the present invention relates to a process for preparing nanovectors consisting of polymer chains of general formula (I) in which R 1 is a group of general formula (II) as defined above, characterized in that the step of ring opening metathesis polymerization is carried out prior to the bioconjugation step.
  • the present invention relates to a method for preparing nanovectors consisting of polymer chains of general formula (I) in which R 1 is a group of general formula (II) as defined above, in which step of ring opening metathesis polymerization is carried out prior to the bioconjugation step, as defined above, comprising the following steps:
  • n, m, R 2 , R ' 2 and R 3 are as defined above and s represents 0 or 1
  • s is an integer from 0 to 10, in particular 0 or 1,
  • the compound of formula VI-a may be prepared according to techniques well known to those skilled in the art.
  • step a the mono or polycyclic alkene methanol is reacted with ethylene oxide in the presence of a base, in particular diphenylmethyl potassium (Héroguez V, Breunig S, Gnanou Y, Fontanille M, Macromolecules 1996, 29, 4459 ) in an organic solvent such as THF, at room temperature to form an alkene-containing poly (ethylene oxide) derivative.
  • a base in particular diphenylmethyl potassium (Héroguez V, Breunig S, Gnanou Y, Fontanille M, Macromolecules 1996, 29, 4459 ) in an organic solvent such as THF, at room temperature to form an alkene-containing poly (ethylene oxide) derivative.
  • the compound of formula (VI-a) is then prepared by bioconjugation reaction of compound (VI) with a poly (ethylene) oxide comprising an alkyne function at one end and an alcohol function at the other by click chemistry, in a mixture of solvent such as dichloromethane-water in the presence of copper I, in particular CuBr, then functionalization of the primary alcohol function remaining free.
  • step b the reaction of ROMP is carried out, the compound (VI-a) comprising the mono or polycyclic alkene is reacted in the presence of a catalyst as defined above, in particular the of st generation Grubbs catalyst in a solvent such as a dichloromethane / ethanol mixture, at room temperature and stopping the reaction by adding a solvent such as vinylethyl ether to yield the compound (VII).
  • a catalyst as defined above, in particular the of st generation Grubbs catalyst in a solvent such as a dichloromethane / ethanol mixture, at room temperature and stopping the reaction by adding a solvent such as vinylethyl ether to yield the compound (VII).
  • the particles formed comprise only one type of polymer chains.
  • step c the derivative (VIII) bearing the precursor alkyne function of the triazole which will be formed by the key bioconjugation step is obtained by reaction of R 2 (CO) R ' 2 (R2 and R'2 being such that defined above and whose synthesis is well known to those skilled in the art) with a trimethylethynyl silane in the presence of a base, such as lithium butyl to give the corresponding alcohol derivative: which by bioconjugation reaction with, for example, a HO-CH 2 CH 2 -O- (CH 2 CH 2 0) p -CH 2 CH 2 N 3 group, makes it possible to obtain a group of formula (XI-1):
  • the compound of formula (XI-2) is then reacted, for example with a paranitrophenylcarbonate or carbonyl diimidazole and substituted with an alcohol, an amine, an acid ... and allows the compounds of general formula (VIII) to be obtained .
  • Step d involves the key bioconjugation reaction between the alkyne (VIII) and the azide (VII) in the presence of copper as described for step a. above to yield compounds of general formula (I) wherein R1 is a group of formula (II).
  • the present invention relates to a process for the preparation of nanovectors in which the bioconjugation stage is carried out prior to the optional step of ring opening metathesis polymerization as defined above, comprising the following steps:
  • n and m are as defined above and s is an integer from 0 to 10,
  • the compound of formula VI-a is prepared according to the method described above, some of which are indicated in the Examples section.
  • the compounds of formula VIII may be prepared as indicated above.
  • FIG. 1 shows the tracking of a nanovector (colloid, white sphere) of the invention comprising a CPP (white square), a fluorescent detection probe (gray square) and an active ingredient (black square), since its circulation in the blood vessels until the release of the active ingredient in the cytoplasm.
  • the nanovector previously administered to an intravenous mammal after circulation in the blood vessels for several hours, is trapped by EPR at the level of the endothelial cell and then internalized by endocytosis favored by the CPP peptide leading to the internalization of the nanovector in an endosome.
  • the active ingredient is partly released due to the pH of 6 existing in the endosome.
  • the maturation of this endosome results in a lysosome in which the pH of 4-5 finalizes the hydrolysis of the active ingredient and leads to the release of the active ingredient in the cytoplasm.
  • FIG. 2 presents the two possible alternatives for the synthesis of the compounds of the invention: Biojugation step (click) then cycle opening polymerization step (ROMP), or
  • FIGS. 3A and 3B show the acid hydrolysis curves obtained with compound 9d of Example 5 of the invention at pH 4.3; 5.3 and 7.3.
  • Figure 3A Black square (dotted line: pH 4.3, solid black circles (solid line): pH 5.3)
  • X axis time in minutes
  • Figure 3B Black square: pH 7.3.
  • FIGS. 4A to 4D show the particle size of the invention measured by dynamic light scattering (DLS) and transmission electron microscopy (TEM).
  • DLS dynamic light scattering
  • TEM transmission electron microscopy
  • FIG. 4A DLS: Size Distribution by Intensity
  • FIG. 4C compound TEM 16a (example 14 scheme IV-1)
  • the particles of compound 16a (example 14 scheme IV-1) have a size of about 300 nm and the particles of compound 16b (example 14 scheme IV-2) have a size of about 400 nm.
  • FIGS. 5A to 5C show the co-localization of the particles of the invention (compound 16a) of Example 14 (scheme IV) with the lysosomes after internalization in the cell of the detection probe.
  • FIG. 5A Particles (compound 16a) detected by fluorescence.
  • Figure 5B Acid lysosomal vesicles revealed by labeling with an anti-LAMP antibody
  • Figure 5C superposition of 5A and 5B showing the colocalization of particles with lysosomes.
  • Figures 6A-6D show the selective targeting of tumors (malignant peritoneal mesothelioma (AK7) cells) by the particles (compound 16a of the invention).
  • Figure 6A Mouse with a subcutaneous tumor (AK7) at the lower back, left. On the snapshot corresponding to the whole animal we can see a fluorescence only at the level of the tumor at 24 hours.
  • AK7 subcutaneous tumor
  • Figure 6B The picture corresponds to the isolated tumor and several dissected organs (spleen at the top right, the 2 kidneys at the bottom left and the liver at the bottom right) Fluorescence is observed only at the level of the tumor and not in the spleen or in the kidneys The very weak residual signal detected in the liver corresponds to a forced passage of nanovectors of the invention without retention effect.
  • Figure 6C One week after injection, fluorescence is observed in the dissected tumor (Tu), liver (Li), ovaries (Ov), brain (Br), spleen (Sp) and kidneys (Ki) as well as in the blood (Bl) one week after the injection.
  • Figure 6D Graphical representation of the fluorescence intensities measured in the various organs at the post-injection times indicated.
  • Y axis activity of the surface in cpm / mm 2 .
  • X axis (from left to right): Tumor, Liver, Ovary, Brain, Spleen, Kidney and Blood.
  • Figure 7 shows the NMR spectrum in CDCl 3 of the compound NB-PEO-OMs (12).
  • Figure 8 shows the NMR spectrum in CDCl 3 of the compound NB-PEO-N 3 (13).
  • Figure 9 shows the NMR spectrum in CDC1 3 of the compound NB-PEO-Rhodamine B
  • Figure 10 shows the NMR spectrum in CDCl 3 of the compound NB-PEO-Coumarin (15b).
  • Figure 11 shows the NMR spectrum in CDCl 3 of the compound NB-PEO-CI-994
  • FIGS. 12A to 12D show the cell penetration of the compounds of the invention (compound 16a of example 14, scheme IV) and the associated cell traffic.
  • Figure 12A kinetics of endocytosis of compound 16a by malignant pleural mesothelioma cells (MPM: Meso cell line 13) and lung adenocarcinoma (ADCA: cell line 153).
  • MPM malignant pleural mesothelioma cells
  • ADCA lung adenocarcinoma
  • Y-axis Particles internalized by endocytosis (g / 10 3 cells)
  • the amount of compound 16a internalized by amount of cells after 120 minutes of incubation is 0.042 ⁇ 0.028 ⁇ g / 1.10 3 cells for MPM and d 0.629 ⁇ 0.231 ⁇ g / 1.10 3 cells for ADCA, showing a capacity increased by one factor of ADCA cells compared to MPM cells to internalize compound 16a.
  • Figure 12B Electron microscopy of endocytosis of compound 16a by ADCA cells.
  • n and n + ⁇ represent the n layer and the n + 1 ⁇ layer.
  • Lanes 1, 2, 3 treatments at 37 ° C, 4 ° C and cytochalasin respectively.
  • the arrows indicate the location of compound 16a.
  • Figure 12C Electron microscopy of endocytosis of compound 16a by MPM cells.
  • n and n + ⁇ represent the n layer and the n + 1 ⁇ layer.
  • Lanes 1, 2, 3 treatments at 37 ° C, 4 ° C and cytochalasin respectively.
  • the arrows indicate the location of compound 16a.
  • Figure 12D co-localization with intracellular acid compartments (left column: ADCA and right column MPM)
  • FIGS. 12B and 12C columns n and n + 1 ⁇ show the presence of several points delimited by thin membrane labeling. These figures demonstrate that the internalization of compound 16a in cells at 37 ° C (lane 1). When the cells are incubated with ice (line 2) or with cytochalasin D (line 3) before adding compound 16a, compound 16a is mainly located on the membranes and not inside the cells. This suggests that the internalization of the compounds of the invention requires an active mechanism involving an actin network.
  • FIGS. 13A and 13B show the cellular toxicity of the particles of the invention (compound 19a, example 14, scheme IV-1) by determining the dose-response curves on MPM or ADCA cells.
  • FIG. 13A dose-response curve obtained with naked particles of the invention
  • Figure 13B dose-response toxicity obtained with the particles 16a.
  • Cells were incubated with increasing doses of nude particles or particles of the invention coupled to rhodamine for 72h. Cell growth was assessed with Uptiblue cell counting reagent (Interchim). The reduction of this compound by the cells leads to the formation of a quantized fluorescent compound by measuring the fluorescence at 595 nM after excitation at 532 nM using a Typhon apparatus (GE Healthcare). Cells were seeded in 96 well plates at a density of 5x10 3 cells / well in culture medium. After 24h, Uptiblue (5%, v / v) was added to the culture medium for 2 h 30 min at 37 ° C.
  • Uptiblue 5%, v / v
  • Fluorescence was measured and compared to the number of cells at day D 0.
  • the results are presented on average ⁇ the standard deviation of the determinations carried out on at least three cell lines different from MPM (Meso 4, Meso 13, Meso 34, Meso 56, Meso 76 or Meso 95B) or ADCA (ADCA 3, ADCA 72, ADCA 117 or ADCA 153).
  • the naked particles and rhodamine-coupled particles showed similar toxicity on all cell lines tested with an IC 50 of 0.34 mg / ml +/- 0.03 for nude particles and 0.031 mg / ml +/- 0.004 for the particles 16a.
  • the toxicity of the particles shows a very small variation depending on the cell lines. This suggests the involvement of a physical phenomenon to explain the toxicity on the cells and non-cell death-dependent pathways that would likely include intrinsic sensitivity of cell lines and then a variation in response.
  • the slight difference between naked particles and rhodamine particles (16a) may be due to the change in hydrophilicity at the surface of the particles.
  • FIGS. 14A and 14B show the potential for internalization of the particles by flow cytometry.
  • This method allows individual cell analysis by measuring light absorption (FSC) and light scattering (SSC).
  • FSC light absorption
  • SSC light scattering
  • ADCA 153 cells (FIG. 14A) and MMP cells (Meso 13, FIG. 14B) were incubated with 3.45 mg / ml of the nanoparticles of the invention, naked for 2 hours, with ice (0 ° C.) or at 37 ° C. VS).
  • Figures 14A and 14B clearly show that cell SSC was increased when cell incubation was performed at 37 ° C but not at 0 ° C.
  • the increase in SSC of cells treated with nanoparticles reflects an increase in cell size due to internalization of the particles and not to deposition of particles on the cell membranes as indicated by the results at 0 ° C.
  • the curve on the right corresponds to a temperature of 37 ° C.
  • the curve on the left corresponds to the temperature of 0 ° C superimposed on the control.
  • Figures 15A to 15D show the pharmacological characterization using BRET for free active ingredients (SAHA, CI-994), their derivatives 8 (c, d, e) and 9 (c, d, e) and the expected alcohols released 7 (c, d, e).
  • Figures 16A to 16D show the kinetics of restoration of HDAC inhibition as measured by BRET
  • Figure 16B CI 994 and compounds 9c, d, e
  • 16C from left to right: SAHA, 8d, e, c
  • 16D from left to right: CI 994, 9d, e, c
  • DCM dichloromethane
  • ACN acetonitrile
  • DMF dimethylformamide
  • THF tetrahydrofuran.
  • CDCI3 Deuterated chloroform
  • the oil obtained is purified (flash chromatography, silica gel, DCM / MeOH eluent) to give the expected ether 7c (0.774 g, 1.66 mmol, 57%) as a viscous oil.
  • a part of the diol 5c is converted into a diether 6c which is treated for 12 hours with a 1M ACN / KHSO 4 solution to give the monoether 7c completely.
  • the oil obtained is purified (flash chromatography, silica gel, DCM / MeOH eluent) to give the expected product 7d in the form of a viscous oil (1.276 g, 2.43 mmol, 71%).
  • Diether 6d also obtained is converted into monoether 7d by treatment with ACN / KHSO 4 1M.
  • the crude mixture is purified by flash: DCM / MeOH (0% to 5% MeOH).
  • R 3 is an epigenetic modulator: SAHA
  • R 3 is an epigenetic modulator: SAHA
  • Example 3.1 Preparation of N-phenyl-N '- [[1- [2- [2- [2- (2-prop-2-ynoxyethoxy) ethoxy] ethoxy] ethyl] triazol-4-yl] -bis (p) -tolyl) methoxy] octanediamide 8e.
  • the intermediate chloride obtained is diluted in a minimum of distilled ACN and added to a mixture of 44.00 mg of SAHA (0.17 mmol, 2 eq) in 2 ml of distilled ACN. Then add 47.00 ⁇ l of distilled EtsN (0.34 mmol, 4 eq) and let the mixture shake for 12 hours at room temperature.
  • the unreacted SAHA is filtered with ACN.
  • the mixture is evaporated under vacuum and then flash-purified using dry solvents (DCM / MeOH: 0% to 5% MeOH).
  • the starting alcohol (7g) is also recovered.
  • R 3 is an epigenetic modulator: CI-994
  • R 3 is an epigenetic modulator: CI-994
  • Toluene is evaporated under vacuum.
  • the intermediate chloride is diluted in 5 ml of THF. To this mixture is added 40.00 mg of phenol (0.43 mmol, 3 eq) followed by 80.00 ⁇ l of Et 3 N (0.57 mmol, 4 eq) and 5.00 mg of DMAP.
  • the mixture is purified by flash combination (use of dry solvents): DCM / MeOH from 0% to
  • NB-PEO means ⁇ -norbornenyl poly (ethylene oxide)
  • NB-PEO 11 The ⁇ -norbornenyl poly (ethylene oxide) macromonomer (NB-PEO) 11 was obtained by metathesis ring opening polymerization of ethylene oxide according to experimental protocols described in the literature (Heroguez, V .; Breunig, S. Gnanou, Y. Fontanille, M., Macromolecules 1996, 29, (13), 4459-4464).
  • the norbonene methanol (0.79 mL, 6.6 mmol), deprotonated with diphenylmethyl potassium (9.5 mL, 0.61 mol.L- 1 ), is used as an initiator to polymerize 0.37 mol of ethylene oxide (18.5 ml) After 48 hours, the polymerization is quenched with 3 ml of acidified methanol NB-PEO 11 is precipitated in diethyl ether and dried under vacuum (91% yield).
  • NB-PEO-OMs 12 0.64 g of NB-PEO-OMs 12 (0.21 mmol) and 70 equivalents of sodium azide (0.95 g, 14.6 mmol) are dissolved in 20 ml of DMF and then stirred at ambient temperature for 40 hours. 120 ml of dichloromethane are then added and the solution is washed five times with water (5 * 60 ml). The organic phase is dried over Na 2 SO 4 and filtered on sintered. After evaporation of the solvent by rotary evaporator, the residue is dissolved in 25 mL of THF, precipitated in 150 mL of diethyl ether and dried under vacuum (86% yield).
  • Example 7 Preparation of NB-PEO-Rhodamine B (15a)
  • R 3 is a detection probe: Rhodamine B
  • R 3 is a detection probe: Coumarin
  • R 3 is an epigenetic modulator: CI-994
  • R 3 is an epigenetic modulator: CI-994
  • This compound is synthesized in the same manner as in Example 9 by reacting compound 13 with compound 9d described above.
  • R 3 is an epigenetic modulator: SAHA
  • R 3 is an epigenetic modulator: SAHA
  • R 3 is an epigenetic modulator: SAHA
  • the copolymerization of NB with NB-PEO-N3 is carried out at ambient temperature in a 100 ml flask, with stirring and inert atmosphere.
  • 7 mg (8.5 10 "6 mol) of the st generation Grubbs catalyst are dissolved in 3.6 mL of a solution of dichloromethane / ethanol degassed (50/50% V / V).
  • the NB (0.28 g, 3 10 "3 mol) and the NB-PEO- N3 (13) (0, 15 g, 3027 g.mol” 1 5.1 10 "5 mol) were dissolved in 5 ml of a dichloromethane / ethanol solution degassed (35 / 65%) V / V) and added, under argon, to the catalyst solution.
  • the deactivation of the reaction medium is carried out by adding 0.1 mL of ethyl vinyl ether.
  • Colloidal characterization is obtained by dynamic light scattering and imaging (transmission electron microscopy).
  • the chemical characterization is obtained by nuclear magnetic resonance.
  • R coumarin, rhodaminoyl
  • Compounds 16a and 16b can also be prepared according to the following procedure: 0.85 equivalents (relative to the azide function) of Rhodamine B alkyne (28 mg, 0.13 mmol) and 2 equivalents of PMDETA (6 ⁇ l, 0.03 mmol) are dissolved in 1 mL of degassed (35/65%) V / V dichloromethane / ethanol solution and then placed under an inert atmosphere. 2 equivalents of CuBr are added to the solution. The solution is added to a dispersion of azide nanoparticles previously synthesized (Example 13). The dispersion is stirred at room temperature for 4 days to obtain compound 16a.
  • Colloidal characterization is obtained by dynamic light scattering and imaging (transmission electron microscopy).
  • the chemical characterization is obtained by nuclear magnetic resonance.
  • Example 16 Hydrolysis tests of the compound 9d of the invention at pH 4.3; 5.3 and 7.3 (physiological).
  • concentration of the samples is 1 mg / ml in the solution: 80% acetonitrile and 20% buffer solution.
  • the term stable defines a compound that does not show significant hydrolysis after several days, especially more than four days. In some cases the measurements were extended to 2 or 3 weeks, or even a month.
  • the result obtained with the compound (8e) is particularly interesting since the SAHA compound alone has a half-life of less than one hour.
  • the term table means that the product does not undergo hydrolysis for at least 1 month.
  • Human mesothelioma cell lines (Meso 4, Mesol 3, Meso 34, Meso 56, Meso 76 and Meso 95B) and lung adenocarcinomas (ADCA, ADCA 3, ADCA 72, ADCA 117 and ADCA 153) established at the laboratory Inserm U892 from of pleural fluids from patients punctuated at the University Hospital of France (Laennec Hospital, St Herblain).
  • Adherent cells growing in a monolayer on a plastic support (flasks) in sterile complete culture medium whose composition is as follows:
  • the cells are kept in an incubator at 37 ° C (5% CO 2) in a humid atmosphere. Passage of the cells (80% confluence):
  • treatment medium RPMI 10% S VF penicillin, streptomycin and L-glutamine
  • D3 Take the cells out of the incubator and wash the cells with 45 ⁇ l of PBS at room temperature.
  • the plate is read 5 times.
  • D0 Place coverglass coverslips in 12-well plate wells.
  • the cells are washed with 1 ml of PBS.
  • PKH67 (Sigma) according to the manufacturer's instructions.
  • the cells are fixed with 4% paraformaldehyde (Sigma) in the culture medium for 15 to 20 minutes at room temperature containing 1 ⁇ g / ml of Hoechst (Sigma).
  • Fixation a night in the dark.
  • J1 Incubate the cells with 21 ⁇ g / ml of rhodamine B nanoparticles in 1 ml of culture medium for 2.5 hours under cell culture conditions.
  • the cells are washed with 1 ml of PBS.
  • PKH67 (Sigma) according to the manufacturer's instructions.
  • the cells are fixed with 4% paraformaldehyde in the culture medium for 15 to 20 minutes at room temperature, protected from light (125 ⁇ l of the 32% stock solution).
  • Fixation a night in the dark.
  • FIGS. 5A to 5C show the results obtained with the particles 16a of the invention and show that the particles detected in the cell co-localize with the lysosomal vesicles and that they have therefore been internalized by endocytosis.
  • J0 Inoculate the cells in a 6-well plate at a density of 200,000 cells / well in RPMI 10% S VF penicillin medium (100U / ml), streptomycin (100 ⁇ g / ml) and L-glutamine (2mM).
  • J1 Incubate the cells with nanoparticles suspended in RPMI medium 10% FCS penicillin (100U / ml), streptomycin (100 ⁇ g / ml) and L-glutamine (2mM). (3.45 mg / mL) at 37 ° C or on ice for 2.5 hours.
  • FSC Forward SCatter
  • SSC Side SCatter
  • mice Female nude mice are injected with 3 million AK7 ( ⁇ ) subcutaneously on the left flank.
  • mice 3 weeks later, 0.02 mg / g of mouse ( ⁇ ) of solution of nanovectors labeled with rhodamine B are injected into one of the veins of the tail previously dilated in hot water. During this step, the mice are kept in contention. The animals are euthanized by elongation.
  • FIG. 6 shows that 24 hours after intravenous injection of the nano vectors (compounds 16a, scheme IV-1 of example 14), a predominantly localization is obtained at the level of the tumor and in a larger quantity. low in the liver.
  • the level detected in the spleen and brain is not significant compared to control.
  • the low half-life of the compounds of the invention in the blood (less than 6h) is correlated with their rapid accumulation in the tumor. This observation thus validates the compatibility of the nano vectors with targeting of the tumor by the EPR effect and suggests that the structural properties of the compounds of the invention allow a highly efficient dissemination of the tumor by EPR effect.

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Abstract

La présente invention concerne des nanovecteurs ou particules polymères et leur utilisation comme médicament et/ou agent de diagnostic.

Description

ANO VECTEURS OU PARTICULES POLYMERES ET LEUR UTILISATION COMME MEDICAMENT ET/OU AGENT DE DIAGNOSTIC La présente invention concerne des nanovecteurs ou particules polymères et leur utilisation comme médicament et/ou agent de diagnostic.
Le ciblage d'agents thérapeutiques, quels que soient leurs domaines d'application, reste un challenge. L'administration directe d'une molécule active se heurte généralement à la possibilité d'une diffusion hors de la zone de traitement souhaitée.
Dans le cas de molécules devant agir au niveau de cellules tumorales se pose le problème de la distinction entre cellules saines et anormales. Des mécanismes de défenses contre les agents exogènes existent à l'intérieur des cellules qui peuvent provoquer l'évacuation de ces agents thérapeutiques et conduire aux phénomènes de résistances de certaines lignées cancéreuses. Ces problèmes de ciblages ont donné lieu à de nombreux travaux. Les différentes stratégies développées peuvent être résumées par deux approches: ciblage actif et ciblage passif. Le ciblage actif repose sur une interaction spécifique entre l'agent et la cellule, basée notamment sur l'utilisation des couples ligands-récepteurs ou antigène-anticorps. Le ciblage passif a pour objet l'augmentation des quantités d'agents délivrées en utilisant les propriétés physiologiques des cibles. Longtemps considérée comme devant donner des résultats moindres que le ciblage actif, cette approche a connu un récent développement suite à la nouvelle stratégie proposée par Maeda en 1986 (Maeda H., Matsumara Y., Cancer Res., 1986, 46, 6387-92) et reposant sur le concept de perméabilité et rétention accrue (EPR) propre aux tumeurs.
Les systèmes développés doivent avoir trois propriétés essentielles: être inactif le temps du transport, permettre le ciblage vers la zone de traitement souhaitée et avoir un vecteur qui libère les drogues une fois cette zone atteinte.
Dans le cas particulier des agents antitumoraux, la zone de traitement est ici la cellule et le guidage de la drogue se fait sur la base de différences existant entre les cellules saines et tumorales, principalement en identifiant des protéines qui sont surexprimées à la surface de ces dernières (Papot S., Tranoy 1., Tillequin F., Florent J.-C, Gesson J.-P., Curr. Med Chem., Anti-Cancer Agents, 2002, 2, 155). Les composés les plus avancés obtenus sur ce principe sont en phase I/II et le Mylotarg® est un des rares exemples utilisé en clinique (Wu A. M., Senter P. D., Nature Biotechnology, 2005, 23 (9), 1137-1146).
Cette approche présente quelques inconvénients. La reconnaissance basée sur des récepteurs de surfaces surexprimés dans les cellules tumorales n'est pas totalement sélective des tumeurs. La cinétique de libération de la drogue peut être lente et, une fois libérée, elle doit franchir la membrane cellulaire rapidement pour éviter d'être véhiculée hors du voisinage de la tumeur.
Par ailleurs, une fois internalisée par la cellule, la molécule doit trouver sa cible qui peut être cytoplasmique ou nucléaire. Afin de palier ces divers inconvénients, le besoin d'un ciblage dirigé, suivi de la pénétration cellulaire et se terminant avec la libération de la drogue dans la cellule est apparu. Dans cette nouvelle approche, le concept de guidage vers les cellules tumorales reste important et la diffusion possible vers des zones non souhaitées doit être évitée.
Aux nombreux travaux réalisés pour le ciblage actif des agents antitumoraux, s'ajoute la conception de systèmes destinés au ciblage passif, tirant parti des différences physiologiques entre cellules saines et tumorales.
Le développement anarchique des tumeurs induit une structure inhomogène possédant une vascularisation importante et très perméable due à un espacement plus important des cellules endothéliales. Par ailleurs, ne disposant pas de système de drainage efficace, les tumeurs accumulent plus facilement les éléments extérieurs. Ces deux caractères permettent entre autres une alimentation en nutriments plus importante nécessaire au développement rapide de ces cellules et favorisent également l'angiogénèse. Ce phénomène a été appelé perméabilité et rétention accrue (EPR: enhanced permability and rétention) et son exploitation a été proposée par Maeda et Matsumara.
Ceci conduit à une extravasion préférentielle et à la rétention de molécules de poids moléculaire élevé: plus celui-ci est élevé (>40 kDa) plus la circulation est lente et plus la molécule peut être piégée par EPR. Au contraire, les agents thérapeutiques de faible poids moléculaire peuvent être disséminés par circulation et diffusion (Fréchet J. M. J., Gillies E. R., Goodwin A. P., Bioconjugate Chem., 2004, 15, 1254 ; Patel V. F., Hardin J. N., Mastro J. M., Luw K. L., Zimmermann J. L., Ehlhardt W. J., Wood land J. M., Starling J. J., Bioconjugate Chem., 1996, 7(4), 497 ; Ulbrich K., Subr V., Adv. Drug Delivery Rev., 2004, 56, 1023).
Au niveau de la cellule eucaryote, le passage de petites molécules au travers des membranes se fait par diffusion naturelle. Le passage à travers cette membrane de macro molécules se fait normalement par un mécanisme appelé endocytose. Dans ce processus, les macromolécules interagissent avec des récepteurs à la surface de la cellule, provoquant une modification de la membrane qui englobe la structure et produit par détachement interne un organite généralement appelé endosome. Lors de leur formation au niveau de la membrane cellulaire, ces endosomes atteignent rapidement un pH interne voisin de 6. Par un processus de maturation, ce pH est progressivement abaissé avec un déplacement perinucléaire où les endosomes se lient finalement aux lysosomes primaires, donnant un ensemble appelé lysosomes secondaires de pH interne plus acide voisin de 4-5, réservoir 5 d'hydrolases et dont la fonction est de dégrader les molécules incorporées en leurs éléments les plus simples (acides aminés, nucléosides, etc.). Ces éléments sont alors libérés par des canaux spécifiques dans le cytoplasme où ils pourront être utilisés. Trois voies d'endocytose ont été jusqu'à présent décrites (Kirkham M., Parton R. O., Biochimica et Biophysica acta, 2005, 1745, 273-286).
o Parmi les systèmes proposés antérieurement dans la littérature pour libérer une molécule dans la cellule (V. F. Patel, J. N. Hardin, J. M. Mastro, K. L. Law, J. L. Zimmermann, W. J. Ehlhardt, J. M. Woodland, J. J. Starling, Bioconjugate Chem. 1996, 7, 497; E. Leikauf, F. Barnekow, H. Kôster, Tetrahedron 1995, 51, 3793), le motif trityle a été exploité. Il permet de préparer des prodrogues acido sensibles uniquement pour des substances actives possédant5 des alcools ou des aminés.
La barrière membranaire peut être altérée par différents processus, notamment sous l'action de virus. En 1988 deux équipes, celle de Green et Lowenstein (Green M., Loewenstein P. M., Cell, 1988, 55, 1179) et celle de Frankel et Pabo (Frankel A. D., Pabo C. O., Cell, 1988, 55, 1189) ont mis en évidence la capacité de la protéine TAT du HIV-1 à o traverser la membrane cellulaire. Cette observation a donné lieu à de nombreux travaux visant notamment à connaître la séquence minimum d'acides aminés nécessaires à ce passage ou à isoler d'autres protéines disposant des mêmes propriétés. Une mise au point propre à la protéine TAT a été publiée (Dowding S. F., Wading J.S., Avanced Drug Delivery Reviews, 2005, 57, 579) en parallèle avec une revue générale sur les peptides pénétrant cellulaires 5 (CPP: cellular penetrating peptide) avec un modèle mécanistique de cette internalisation (Zorko M., Langke V., Advanced Drug Delivery Reviews, 2005, 57, 529).
Des différents travaux présentés, il ressort que si l'internalisation par l'utilisation de ces peptides est effective et largement utilisée, son mécanisme n'est pas encore clairement établi. Un point commun semble être des interactions de surfaces avec des protéoglycanes qui0 amorcent le mécanisme. Selon les peptides ou la concentration à la surface de la cellule, cette internalisation peut être réalisée par endocytose classique, par endocytose activée par déplacement lipidique (Foerg C, Zieglr V., Fernandez-Carneado J., Giral E., Rennert R., Beck-Sickinger A. O., Merkle H. P., Biochemistry, 2005, 44, 72), ou par des voies n'utilisant pas l'endocytose et non encore déterminées (Thoren P. E. O., Persson D., Lincoln P. Norden B., Biophysical chemistry, 2005,114,169). L'étude de la protéine TAT a montré que celle-ci évite la dégradation lysosomale mais peut être retenue dans les endosomes (Caron N. J., Quenneville S. P., Tremblay J. P. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2004, 319, 12). Par ailleurs, des polymères vecteurs sont développés qui perturbent la stabilité des endosomes, soit en provoquant l'éclatement de ce dernier (Bulmus V., Woodward M., Lin L., Murthy N., Stayton P., Hoffman A., Journal of Controled Release, 2003, 93,105), soit en modifiant le pH interne, comme dans le cas de polymères cationiques (riches en azote) tels que des polylysines ou polylysines modifiées par des imidazoles (Putnam D., Oentry C. A., Pack D. W., Langer R., Proc. Natl. Acad. Sci., 2001, 98 (3), 1200; Merdan T., Kopecek J., Kissel T., Advanced Drug Delivery Reviews, 2002, 54, 715). Utilisés par exemple dans le transport de l'ADN, ces polymères génèrent également des interactions de charges qui donnent des complexes compacts plus stables vis-à-vis des dégradations possibles.
Des objets moléculaires ont ainsi été conçus de taille suffisante pour circuler lentement dans l'organisme et éviter l'élimination rénale (taille supérieure à 40 kDa) ou le piégeage par le système réticuloendothélial (taille supérieure à 200 kDa).
Un ratio entre la masse molaire du système et son volume effectif doit être trouvé. Deux types d'applications sont notamment développées: les polymères biocompatibles (Pluronic®) (Kabanov A. V., Batrakova E. V., Alakhov V. Y., Adv. Drug. Dev. Reviews, 2002, 54, 759-779) et les liposomes (Doxil® = Polyéthylèneglycol-lipsomesdoxorubicine (Ceh B., Winterhalter M., Frederik P. M., Vallner J. J., Lasie D. D., Adv. Drug. Dev. Reviews, 1997, 24, 165-177)). Un des aspects importants de ces systèmes est leur capacité à fortement diminuer les phénomènes de résistances.
Bien que le ciblage passif ait en soi démontré une amélioration thérapeutique pour les différentes molécules transportées (solubilité, toxicité), il est nécessaire de développer des systèmes dont le vecteur pourra être éliminé aisément avec les caractéristiques propres à l'endocytose et capables de libérer la drogue dans la cellule, et notamment dans les organites acides comme les endosomes (pH 6) ou les lysosomes (pH 5), en particulier dans la cellule cancéreuse, permettant ainsi d'éviter les effets secondaires importants observés en raison d'une action non sélective desdites molécules sur des cellules autres que cancéreuses.
Par ailleurs, la demande WO 2006/008387 décrit des particules polymères stimulables notamment en milieu acide, présentant des fonctions réactives mais qui présentent l'inconvénient majeur de ne pas pouvoir comporter des fonctions réactives sensibles de part le procédé d'obtention desdites particules et d'autre part nécessitent la mise au point d'une synthèse spécifique pour chaque fonction réactive à utiliser.
Un des aspects de l'invention est de fournir des nanovecteurs, sous forme de polymère ou non, comprenant au moins un principe actif, en particulier un modulateur épigénétique, et/ou au moins une sonde de détection et/ou un peptide de pénétration cellulaire, lesdits nanovecteurs étant susceptibles de pénétrer dans une cellule, notamment une cellule cancéreuse.
Un autre aspect de l'invention est d'utiliser lesdits nanovecteurs comme médicament, notamment anticancéreux et/ou comme agent de diagnostic.
Un troisième aspect de l'invention est de fournir des compositions pharmaceutiques comprenant lesdits nanovecteurs.
Un dernier aspect de l'invention est de fournir des procédés de synthèse desdits nanovecteurs utilisables quels que soient le modulateur épigénétique ou la sonde de détection présents sur le nanovecteur.
La présente invention concerne des nanovecteurs constitués par des chaînes polymères Pi de formule générale (I) suivante :
polymère P contenant environ 30 à 10000 unités monomères, identiques ou différentes, dérivées de la polymérisation d'alcènes monocycliques dont le nombre d'atomes de carbone constitutifs du cycle est d'environ 4 à 12, ou d'alcènes polycycliques dont le nombre total d'atomes de carbone constitutifs des cycles est d'environ 6 à 20,
- t représente 0 ou 1 ,
q est un entier compris de 1 à 10,
- u représente un entier de 0 à 10, - n représente 0 ou 1 ,
- ν représente 0 ou 1 ,
- X représente O, NH ou S,
Ri et R'i représentent indépendamment l'un de l'autre, lorsque t = 1, un groupe de formule (II) suivante :
où:
m et p représentent indépendamment l'un de l'autre un entier de 1 à 1000, en particulier 50 à 340, notamment 70 à 200
r représente est un entier compris de 0 à 10, préférentiellement 0 ou 1, ou,
Ri représente, lorsque t = 0 un groupe de formule (III) suivante relié à un alcène monocyclique ou un alcène polycyclique: dans laquelle le nombre d'atomes de carbone constitutifs du cycle de l'alcène monocyclique est d'environ 4 à 12, et le nombre total d'atomes de carbone constitutifs des cycles de l'alcène polycyclique est d'environ 6 à 20,
r, m et p étant tel que définis ci-dessus,
ou,
Ri représente lorsque t = 0, un groupe de formule (IV) suivante :
(IV) dans laquelle R4 représente : un groupe vinyle, un groupe éthyne, un groupe OR' ou SR", R' et R" représentant indépendamment l'un de l'autre, H, un alkyle en C1-C20, un cycloalkyle en C3-C20, et m étant tel que défini ci-dessus,
r représente est un entier compris de 0 à 10, préférentiellement 0,
R2 et R'2 représentent indépendamment l'un de l'autre :
H ou un phényle substitué ou non par au moins : o un alkyle en C1-C20, un cycloalkyle en C3-C20,
o un alkoxy en C1-C20,
o NRaRb où Ra et Rb représentent indépendamment l'un de l'autre H, un alkyle en C1-C20, l'alkyle pouvant former un cycle avec le ou les carbones en ortho de celui portant NRaRb, un cycloalkyle en C3-C20,
o N02,
o CO2RC, où Rc représente H, un alkyle en C1-C20, un cycloalkyle en C3-
C20, un benzyle substitué ou non,
o un acyle en C1-C20,
notamment R2 et R'2 représentent le 2 ou 4-méthoxyphényle, le 2 ou 4- méthylphényle, le phényle, le 2,4-diméthoxyphényle,
et lorsque n = 0 et v = 1 , R3 est alors lié directement au carbone portant R2 et
R'2,
ou alors,
R2 et R'2 représentent ensemble, si n = 0 et v = 0, le cycle de formule (Va) suivante:
dans laquelle Y' représente :
o O,
o NRjRe où Rj et Re représentent indépendamment l'un de l'autre H, un alkyle en C1-C20, l'alkyle pouvant former un cycle avec le carbone ou 3', un cycloalkyle en C3-C20, l'atome d'azote présentant une charge positive associée à un anion monovalent,
et Y représente
o OR', où R' représente H, un alkyle en C1-C20, un cycloalkyle en C3-C20, o un alkyle en C1-C20, un cycloalkyle en C3-C20,
o un alcoxy en C1-C20,
o NRfRg où Rf et Rg représentent indépendamment l'un de l'autre H, un alkyle en C1-C20 l'alkyle pouvant former un cycle avec le carbone 1 ou 3, un cycloalkyle en C3-C20,
o N02, o C02Rc, où Rc représente H, un alkyle en C1-C20, un cycloalkyle en C3-C20, un benzyle substitué ou non,
o un acyle en C1-C20, ou, si n = 0 et v = 0 le cycle de formule (Vaa) suivante:
dans laquelle A" représente un anion monovalent.
R2 et R'2 représentent ensemble le cycle de formule (Vb) suivante, n = 1 et v = 1 :
et Yi et Y 2 représentent indépendamment l'un de l'autre :
o OR', où R' représente H, un alkyle en C1-C20, un cycloalkyle en C3-C20, o un alkyle en C1-C20, un cycloalkyle en C3-C20,
o un alcoxy en C1-C20,
o NRhRi où Rh et Ri représentent indépendamment l'un de l'autre H, un alkyle en C1-C20, l'alkyle pouvant former un cycle avec le carbone 1 ou 3 dans la cas de Yi, et le carbone 1 ' ou 3' dans le cas de Y2, un cycloalkyle en C3-C20, o N02,
o C02Rc, où Rc représente H, un alkyle en C1-C20, un cycloalkyle en C3-C20, un benzyle substitué ou non,
o un acyle en C1-C20,
ou le cycle de formule (Vbb) suivante et n = 1 :
- R3 représente un principe actif, en particulier un modulateur épigénétique, ou une sonde de détection, notamment fluorescente ou radio émettrice, ou un peptide de pénétration cellulaire (PPC),
Par le terme « chaîne polymère P», il faut comprendre une substance composée d'un grand nombre de petites structures moléculaires de faible masse, identiques ou différentes, qui se lient entre elles, en chaîne ou en réseau, pour créer des molécules possédant une masse moléculaire élevée.
La chaîne polymère P contient des unités monomères dérivés de la polymérisation d'alcène monocycliques ou polycycliques. Elle peut être de type polynorbornène.
En particulier, la chaîne polymère P contient d'environ 30 à 10000 unités monomères, identiques ou différentes, notamment 340 unités.
En particulier, lesdites unités monomères sont dérivées de la polymérisation d'alcènes monocycliques constitués de 4 à 12 carbones ou d'alcènes polycycliques constitués de 6 à 20 carbones.
Par l'expression « t représente 0 ou 1 », il faut comprendre que la chaîne polymère P peut être présente ou non.
Lorsque t = 0, la chaîne polymère P n'est pas présente dans la formule générale (I).
Ladite formule générale (I) correspond donc à la formule (I-a) suivante :
qui forme un composé comprenant des chaînes en fonction des motifs présents dans RI, tels que des motifs d'oxyde d'éthylène (CH2-CH20). La chaîne peut également correspondre à, par exemple mais sans être limitée à ceux-ci, le (N- (2-hydroxypropyl)méthacrylamide) (HMPA), le PEG, le pluronic® (copolymère d'oxyde d'éthylène et de propylène), le Dextran (polysaccharide branché constitué de plusieurs molécules de glucose), des polyamides,
Lorsque t = 1, la chaîne polymère P est présente dans la formule générale (I) et il existe donc entre 1 et 10 structures identiques ou différentes de formule (I) présentes sur ladite chaîne polymère.
Le terme « particule sphérique» désigne une structure qui est constituée de plusieurs chaînes polymères P, notamment de 1012 à 1016, en particulier de 1014 à 1015 chaînes polymères P comprenant chacune la ou les molécule(s) de formule (I) identiques ou différentes et qui forment alors une particule sphérique ayant un diamètre moyen compris d'environ 5 nm à environ 100 μιη en fonction des motifs présents dans RI, tels que des motifs (CH2-CH20: (EO)), et de la chaîne polymère P présents dans la molécule.
Préférentiellement, le diamètre des particules est compris d'environ 50 à 500 nm, en particulier 300 nm pour exploiter l'effet de perméabilité des tumeurs.
Sur une particule, lorsque t= 1, il existe donc de 1012 à 1017 structures identiques ou différentes de formule (I-a), préférentiellement de 1015 à 1016.
Un autre avantage de l'invention est de pouvoir disposer de particules de tailles différentes.
L'expression « q est un entier compris de 1 à 10 » signifie qu'au moins une molécule de formule (I-a) est présente sur une chaîne polymère P et que la chaîne polymère P peut comporter jusqu'à 10 molécules de formule (I-a).
Ladite particule sphérique peut donc être constituée :
de chaînes polymères P identiques, chaque chaîne polymère comprenant de une à 10 molécules de formule (I-a) identiques et peut être obtenue par copolymérisation de composés de formule (I-a) identiques (Ri représentant un groupe de formule (III)) avec un alcène mono ou polycyclique, ou de chaînes polymères Pi différentes, i variant de 1 à 10, par exemple de chaînes polymères P comprenant de 1 à 10 molécules de formule (I-a) portant un principe actif, et de chaîne polymères P2 comprenant de 1 à 10 molécules de formule (I-a) portant un fluorophore et peut être obtenue par copolymérisation de composés de formule (I-a) différents (Ri représentant un groupe de formule (III)) avec un alcène mono ou polycyclique, - de chaînes R' i ne comprenant ni sonde de détection, ni principe actif, ni peptide de pénétration cellulaire (PPC) et ni triazole qui servent notamment à stabiliser la particule.
Le schéma A suivant dans le cas où l'alcène monocyclique est le norbornène résume différents cas :
-a) (l-a)
|F|uorarjhore| symbolise une chaîne PEO.
SCHEMA A Dans toute la description, le nanovecteur ou nanovecteur polymère désigne aussi bien : une particule sphérique constituée de chaînes polymères Pi comprenant :
- un composé de formule (I) (t = 1), ou
un composé ne comprenant pas de chaîne polymère P mais une molécule de formule (I-a) dans laquelle Ri correspond à la formule (III), ou
- une molécule de formule (I-a) dans laquelle Ri correspond à la formule (IV). La structure de formule « X(CO) » correspond à un espaceur El entre R3 et le carbone portant R2 et R'2.
L'expression « n représente 0 ou 1 » signifie que l'espaceur El formé par la structure de formule « X(CO) » est présent ou non dans le composé de formule (I).
Lorsque n = 0, deux cas peuvent se présenter :
soit v = 1 et R3 est alors relié directement au carbone portant R2 et R'2, et la formule (I-a) correspond donc à la formule générale (I-b) suivante :
soit v = 0 et dans ce cas, R2 et R'2 forment un cycle tel que défini ci-dessus, la formule (I-a) correspond donc à la formule générale (I-c) suivante :
( l - c)
Il est bien entendu que le composé de formule générale (I) ci-dessus définie peut représenter, lorsque t = 1 et q > 2, une particule ou nanovecteur sur laquelle sont greffées une ou plusieurs molécules de formule (I-a) et/ou une ou plusieurs molécules de formule (I-b) et/ou une ou plusieurs molécules de formule (I-c).
Lorsque t = 1, le groupe Ri peut correspondre, par exemple, à l'une des formules Il-a (lorsque r = 1) ou ΙΙ-b (lorsque r = 0) suivantes :
Lorsque t = 0, le groupe Ri peut correspondre, par exemple, à l'une des formules (Ill-a) (lorsque r = 1) ou (Ill-b) (lorsque r = 0) suivantes :
Alcène
Lorsque t = 0, Ri peut également correspondre à un composé de formule IV-a (lorsque ou (IV-b) (lorsque r = 0) suivantes :
(IV-a)
(IV-b)
Le terme alkyle en C1-C20 utilisé dans la définition de R' et R" ainsi que dans toute la description désigne un groupe alkyle linéaire ou ramifié comprenant 1 à 20 atomes de carbones.
Par groupe alkyle linéaire en Ci à C20 il faut entendre: un groupe méthyle, un éthyle, un propyle, un butyle, un pentyle, un héxyle, un heptyle, un octyle un nonyle, un décyle, un undécyle, un dodécyle, le tridécyle, tétradécyle, le pentadécyle, l'héxadécyle, l'heptadécyle, l'octadécyle, le nonadécyle et le eicosyle ainsi que tous leurs isomères.
Par groupe alkyle ramifié, il faut comprendre un groupe alkyle tel que défini ci-dessus comprenant des substituants choisis parmi la liste des groupes alkyles linéaires définie ci- dessus, lesdits groupe alkyles linéaires étant également susceptible d'être ramifiés.
Par groupe cycloalkyle en C3 à C2o il faut comprendre un groupe cyclopropyle, cyclobutyle, cyclopentyle, cyclohéxyle, cycloheptyle, cyclooctyle, cyclononyle, cyclodécyle, cycloundécyle, cyclododécyle, cyclotridécyle, cyclotétradécyle, cyclopentadécyle, cyclohéxadécyle, cycloheptadécyle, cyclooctadécyle, cyclononadécyle et cycloeicosyle.
De tels groupes cycloalkyles peuvent être eux-mêmes substitués par un groupe alkyle linéaire ou ramifié tel que défini ci-dessus.
L'expression « principe actif » désigne toute molécule pharmaceutique susceptible d'avoir une efficacité dans une pathologie quelle qu'elle soit, chez un mammifère, en particulier un homme ou une molécule détectable par toute méthode adaptée.
L'expression « modulateur épigénétique » désigne une molécule capable de réactiver des gènes régulateurs qui ont été réprimés dans les cellules tumorales de mammifère, notamment des cellules tumorales humaines, tels que par exemple les inhibiteurs d'ADN méthyle transférase qui inhibent la méthylation de 1ADN et réactivent des gènes silencieux induisant la différentiation, l'apoptose ou F antiprolifération, ou les inhibiteurs d'histone déacétylase (HDACI ou HDI) permettant d'augmenter le niveau d'acétylation des histones et conduisant ainsi à la réexpression de gène silencieux.
L'expression « sonde de détection » désigne une molécule détectable par toute méthode adaptée, telle qu'une molécule fluorescente (ou fluorophore), par exemple, la fluorescéine, la rhodamine, ou une molécule radio-émettrice telle que le "Technetium, ou des agents de contraste pour l'imagerie médicale tels que les lanthanides.
Ledit modulateur ou la dite sonde sont reliés au carbonyle de l'espaceur X(CO) de la formule générale (I) par une fonction OH, NH2 ou SH lorsque n = 1 ou au carbone portant R2 et R'2 lorsque n = 0 et que v =1,
L'expression « peptide de pénétration cellulaire » (CPP) désigne des peptides, tels que des polyarginines, polylysines, mais sans être limité à ceux-ci, susceptibles de faciliter la capture cellulaire.
Ledit peptide est relié par sa fonction α-aminée ou carboxylique ou par les fonctions présentes sur la chaîne latérale lorsqu'elles existent.
R2 et R'2 peuvent être identiques ou différents. Lorsque R2 et R'2 sont identiques, le carbone porté par ces deux substituants est achiral.
Par contre, lorsque R2 et R'2 sont différents, le carbone portant les deux substituants est chiral et la molécule de formule générale (I) peut être sous forme racémique, ou de chaque énantiomère (R) ou (S) pur ou d'un mélange des deux énantiomères compris dans la gamme de 0,01%(S)-99,9%(R) à 99,9%(S)-0,01%(R) à condition qu'aucun autre carbone asymétrique ne soit présent sur la molécule de formule (I).
Si la molécule comprend un ou plusieurs autres carbones asymétriques, elle peut être de la même manière sous forme de racémique, ou de chaque énantiomère pur ou d'un mélange des énantiomères et la molécule de formule générale (I) correspond alors à un mélange de diastéréoisomères .
Lorsque R2 et R'2 forment un cycle, R2 et R'2 représentent indépendamment l'un de l'autre un phényle substitué ou non par un ou plusieurs substituants tels que définis ci-dessus, les deux R2 et R'2 pouvant être alors identiques ou différents, le cycle étant de formule générale (V) ou (V) suivante :
Lorsque le cycle de formule (V) est substitué par un azote, les substituants sont tels que définis ci-dessus pour Y' de la formule (Va) et l'azote est alors sous forme N+ tétravalent et est associé à un anion monovalent en guise de contre ion, tel que par exemple un halogénure, HC03 ", HSCV, PF6 ", CF3SO3", CH3COO".
Préférentiellement R2 et R'2 représentent :
le cycle de formule (Va) ci-dessus, et en particulier le cycle de formule (Vaa) et dans ce cas, n=0 et v=0, c'est-à-dire qu'il n'y a pas de groupe R3 présent sur la molécule de formule (I) et le cycle (Va) forme alors le fluorophore, ou
le cycle de formule (Vb), en particulier le cycle de formule (Vbb), et dans ce cas n=l et la molécule de formule (I) présente alors un groupement R3 qui représente un principe actif en particulier un modulateur épigénétique, ou un peptide de pénétration cellulaire mais pas une sonde de détection.
Le composé de formule (I), lorsque q=l et t=l, est donc constitué d'un triazole substitué :
d'une part par Ri lui-même lié à une chaîne polymère P, à un alcène monocyclique ou polycyclique, ou à un substituant R4, et d'autre part par un méthylène ou biphénylméthylène qui est lié le cas échéant à un principe actif en particulier un modulateur épigénétique, à une sonde de fluorescence ou à un peptide de pénétration cellulaire, optionnellement par l'intermédiaire d'un espaceur XC(O).
Il peut comprendre également R' 1 qui est alors constitué uniquement de PEO.
Les composés de formule (I) ont un poids moléculaire compris de 40kDa à plus de d'environ 3200kDa, notamment plus d'environ 200kDa
Les inventeurs ont de façon surprenante trouvé que la présence du triazole, synthétisé aisément par bioconjugaison (ou chimie « click ») permettait non seulement l'obtention aisée des composés de formule (I) quel que soit le groupe R3 présent sur celui-ci mais permettait toujours la formation d'un carbocation stable et donc la libération du principe actif en milieu acide.
Un autre avantage de l'invention est que le poids moléculaire des composés de formule (I) et (la) leur permet de circuler longtemps dans les vaisseaux sanguins d'un mammifère, en particulier d'un homme, et notamment environ 24h, évitant ainsi leur élimination notamment pour les composés > 40kDa et leur permet d'être piégés par rétention et perméabilité accrue (Enhanced Permeability and Rétention : EPR) puis internalisés par endocytose dans la cellule et de pouvoir libérer le principe actif ou la sonde de détection par la voie endosome/lysosome dans le système réticulo endothélial en raison du pH acide, par clivage de l'espaceur El, notamment pour les composés de plus de 200 kDa et en particulier pour les composés de plus de 3200kDa, ou par une voie autre pour les principes actifs sensibles au milieu acide qui peuvent pénétrer le noyau à l'aide du mécanisme de complexes de pores nucléaires (Nuclear Pore Complexes : NPC) basé sur les signaux de localisation nucléaires (Nuclear Localization Signais :NLS).
Une fois le principe actif libéré et/ou la sonde de détection libérée, la chaîne polymère P et les constituants autres que le principe actif ou la sonde de détection pourront être éliminés de la cellule.
Encore un autre avantage de l'invention est que le clivage du principe actif n'ayant lieu qu'à pH inférieur à 7, le composé de formule (I) peut circuler dans les vaisseaux sanguins sans être dégradé et pénètre donc dans la cellule sous sa forme complète.
Encore un autre avantage de l'invention est que les composés de formule (I) étant conçus à partir de structures à base de PEG, ils vont être également invisible aux macrophages, évitant ainsi leur élimination par lesdits macrophages et permettre ainsi le piégeage par EPR. Dans un mode de réalisation avantageux, la chaîne polymère P comprend plus de 10 molécules de formule (I-a) identiques ou différentes ou constituant un mélange d'une ou plusieurs molécules identiques avec une ou plusieurs molécules différentes tel que défini ci- dessus.
Dans un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne des nanovecteurs de formule générale (I) telles que définies ci-dessus, dans lesquelles les unités monomères sont dérivées de la polymérisation d'alcènes monocycliques, et sont de formule (ZI) suivante
[CH-R5-CH] (ZI) dans laquelle R5 représente une chaîne hydrocarbonée de 2 à 10 atomes de carbone, saturée ou non.
Par « chaîne hydrocarbonée », il faut comprendre une chaîne alkyle en C2 à C10. Dans un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne des nanovecteurs de formule générale (I) telles que définies ci-dessus, dans lesquelles les alcènes monocycliques dont sont issues les unités monomères sont :
- le cyclo butène conduisant à un polymère comprenant des unités monomères de formule (ZI a) suivante :
Zla
- le cyclopentène conduisant à un polymère comprenant des unités monomères de formule (Zlb) suivante :
- le cyclopentadiène conduisant à un polymère comprenant des unités monomères de formule Zlc) suivante
Zlc
- le cyclohexène conduisant à un polymère comprenant des unités monomères de formule (Zld) suivante
Zld
- le cyclohexadiène conduisant à un polymère comprenant des unités monomères de formule (Zle) suivante
Zle
- le cycloheptène conduisant à un polymère comprenant des unités monomères de formule Zlf) suivante
Zlf
- le cyclooctène conduisant à un polymère comprenant des unités monomères de formule (ZI h) suivante
Zlh
- le cyclooctapolyène, notamment le cycloocta-l,5-diene conduisant polymère comprenant des unités monomères de formule (Zli) suivante
Zli - le cyclononène conduisant à un polymère comprenant des unités monomères de formule (Zlj) suivante
Zlk
- le cyclodécène conduisant à un polymère comprenant des unités monomères de formule (Zll) suivante
Zll
- le cyclodéca-l,5-diène conduisant à un polymère comprenant des unités monomères de formule (ZI m) suivante
- le cyclododécène conduisant à un polymère comprenant des unités monomères de formule (Zln) suivante
Zln - ou encore l'acétate du 2,3,4,5-tétrahydrooxepin-2-yl, le cyclopentadécène, le paracyclophane, le ferrocenophane.
Dans un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne des nanovecteurs de formule générale (I) telles que définies ci-dessus, dans lesquelles les unités monomères sont dérivées de la polymérisation d'alcènes poly cycliques, et sont :
- de formule (Z2) suivante
dans laquelle Re représente :
* un cycle de formule dans laquelle :
. W représente -CH2-, ou un hétéroatome, ou un groupe -CHR7-, ou un groupe -CHR8-, R7 représentant une chaîne comprenant un polyoxyde d'éthylène de formule -(CH2-CH2-0)m , m étant tel que défini ci-dessus et Rs représentant une chaîne alkyle ou alcoxy en Ci à Cio, . Wi et W2, indépendamment l'un de l'autre, représentent H, ou une chaîne R7, ou un groupe Rs susmentionnés, ou forment en association avec les atomes de carbone qui les portent un cycle de 4 à 8 atomes de carbone, ce cycle étant le cas échéant substitué par une chaîne R7 ou un groupe Rs susmentionnés,
. a représente une simple ou double liaison,
* ou un cycle de formule
dans laquelle :
. W représente -CH2-, ou un hétéroatome, ou un groupe -CHR7-, ou un groupe -CHR8-, R7 et R8 étant tels que définis ci-dessus,
. W'i et W'2, indépendamment l'un de l'autre, représentent -CH2-, ou un groupe -C(O), ou un groupe -COR7, ou un groupe -C-ORs, R7 et R8 étant tels que définis ci-dessus,
- de formule (Z3) suivante
dans laquelle R9 représente :
* un cycle de
dans laquelle : n2
. ni et n2, indépendamment l'un de l'autre, représentent 0 ou 1 , . W" représente -CH2-, ou un groupe -CHR7-, ou un groupe -CHR8-, R7 et R8 étant tels que définis ci-dessus,
. W"i et W"2, indépendamment l'un de l'autre, représentent une chaîne hydrocarbonée de 0 à 10 atomes de carbone,
* ou un cycle de formule dans laquelle W" et W"a, indépendamment l'un de l'autre, représentent -CH2-, ou un groupe -CHR7-, ou un groupe -CHR8-, R7 et R8 étant tels que définis ci-dessus,
* ou un c cle de formule
dans laquelle W" et W"a, indépendamment l'un de l'autre, représentent -CH2-, ou un groupe -CHR7-, ou un groupe -CHR8-, R7 et R8 étant tels que définis ci-dessus.
Dans un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne des nanovecteurs de formule générale (I) telles que définies ci-dessus, dans lesquelles les alcènes polycycliques dont sont issues les unités monomères sont :
- les monomères contenant un cycle cyclobutène conduisant à un polymère comprenant des unités monomères de formule (Z2a) suivante :
- les monomères contenant un cycle cyclopentène conduisant à un polymère comprenant des unités monomères de formule (Z2b) suivante :
(Z2b)
- le norbornène (bicyclo[2,2,l]hept-2-ène) conduisant à un polymère comprenant des unités monomères de formule Z2c suivante :
(Z2c)
- le norbomadiène conduisant à un polymère comprenant des unités monomères de formule (Z2d) suivante :
(Z2d)
- le 7-oxanorbornène conduisant à un polymère comprenant des unités monomères de formule (Z2e) suivante :
(Z2e)
- le 7-oxanorbornadiène conduisant à un polymère comprenant des unités monomères de formule (Z2f) suivante :
(Z2f)
- le dimère du norbomadiène conduisant à un polymère comprenant des unités monomères de formule (Z3a) suivante :
(Z3a)
- le dicyclopentadiène conduisant à un polymère comprenant des unités monomères de formule (Z3b) suivan
- le tetracyclododécadiène conduisant à un polymère comprenant des unités monomères de formule (Z3c) suivante :
(23c)
- ou le bicyclo[5,l,0]oct-2-ène, le bicyclo[6,l,0]non-4-ène.
Dans un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne des nanovecteurs de formule générale (I) telles que définies ci-dessus, dans lesquelles les alcènes mono ou polycycliques dont sont issues les unités monomères sont :
- le norbornène (bicyclo[2,2,l]hept-2-ène) conduisant à un polymère comprenant des unités monomères de formule (Z2c),
- le tetracyclododécadiène conduisant à un polymère comprenant des unités monomères de formule (Z3c),
- le dicyclopentadiène conduisant à un polymère comprenant des unités monomères de formule (Z3b),
- le dimère du norbornadiène conduisant à un polymère comprenant des unités monomères de formule (Z3a),
- le cycloocta-l,5-diène conduisant à un polymère comprenant des unités monomères de formule (Zli).
Dans un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne un composé de formule générale (I) telles que définies ci-dessus, dans lesquelles le modulateur épigénétique est choisi parmi :
- un nucléoside, en particulier la cytidine, l'uridine, l'adénosine, la guanosine, la thymidine ou l'inosine,
les inhibiteurs d'histones déacétylase (HDI), en particulier le Zolinza® (SAHA), la trichostatine A (TSA), l'acide valproïque, MS-275 ou CI-994, ou les inhibiteurs d'ADN méthyltransférases (DNMTI), en particulier la 5- azacytidine, la 5 -aza-2'-deoxy cytidine et la zébularine.
Les nucléosides sont des glycosylamines constitués d'une nucléobase (ou base) liée à un ribose ou un désoxyribose via une liaison glycosidique ou une base liée à un analogue de ribose comme dans la gemcitabine. L'activité biologique des inhibiteurs d' histones déacétylase (HDI ou inhibiteurs d'HDAC) conduit à une augmentation du niveau d'acétylation des histones qui permet la réexpression de gènes régulateurs de tumeurs silencieux dans les cellules tumorales.
Le Zolinza® (SAHA) possède la structure suivante :
SAHA lorsqu'il est présent est relié soit à l'espaceur X(CO) soit au carbone portant R2 et R'2 de la formule (I) par Phydroxyle de la fonction acide hydroxamique.
La trichostatine (TSA) possède la structure suivante
TSA lorsqu'il est présent est relié soit à l'espaceur X(CO) soit au carbone portant R2 et R'2 de la formule (I) par Phydroxyle de la fonction acide hydroxamique ou par la fonction cétone voisine du cycle aromatique.
L'acide valproïque possède la structure suivante :
L'acide valproïque lorsqu'il est présent est relié soit à l'espaceur X(CO), soit au carbone portant R2 et R'2 de la formule (I) par Phydroxyle de la fonction acide.
MS-275 ossède la structure suivante :
MS-275 lorsqu'il est présent est relié soit à l'espaceur X(CO) soit au carbone portant R2 et R'2 de la formule (I) par la fonction aminé de la partie aniline. CI-994 possède la structure suivante
CI-994 lorsqu'il est présent est relié soit à l'espaceur X(CO) soit au carbone portant R2 et R'2 de la formule (I) par la fonction aminé de la partie aniline.
L'hyperméthylation des régions de l'ADN appelées îlots CpG est responsable de la mauvaise activation des gènes promoteurs impliqués dans la régulation de la transcription. L'action des inhibiteurs d'ADN méthyltransférases (inhibiteurs de DNMT) résulte en un blocage de cette méthylation anormale.
La 5-azacytidine possède la structure suivante:
La 5-azacytidine est liée à l'espaceur X(CO) ou au carbone portant R2 et R'2 de la formule (I) par sa fonction alcool primaire, secondaires ou par l'aminé.
La 5-aza-2'-deoxycytidine (ou décitabine) possède la structure suivante:
La 5-aza-2'-deoxycytidine est liée à l'espaceur X(CO) ou au carbone portant R2 et R'2 de la formule (I) par sa fonction alcool primaire, secondaire ou aminé.
La zébularine possède la structure suivante:
La zébularine est liée à l'espaceur X(CO) ou au carbone portant R2 et R'2 de la formule (I) par sa fonction alcool primaire ou secondaire.
Dans un mode de réalisation avantageux, le nanovecteur comprend un modulateur épigénétique qui est inhibiteur d'histones déacétylase : SAHA et correspond au produit composé dénommé (20e).
Dans un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne des nanovecteurs de formule générale (I) telles que définies ci-dessus, dans lesquelles la sonde de détection est choisie parmi une substance fluorophore, notamment la rhodamine B ou la fluorescéine, les coumarines, en particulier la 7-hydroxy-4-methylcoumarine, les bodipy, le texas red, les cyanines, en particulier les CY3 ou les CY5, ou une substance radio émettrice comme le "Technétium sous forme ligandée, ou des agents de contraste pour l'imagerie médicale comme les lanthanides (gadolinium).
L'expression « substance fluorophore » désigne une substance chimique capable d'émettre de la lumière de fluorescence après excitation.
La rhodamine présente un squelette de structure suivante:
La fonction C02H correspond alors à l'espaceur El .
La rhodamine B présente la structure suivante :
La fonction C02H correspond alors à l'espaceur El .
La fiuorescéine présente la structure suivante:
La fonction C02H correspond alors à l'espaceur El .
La 7-hydroxy-4-methylcoumarine présente la structure suivante:
La fonction OH est alors reliée au carbone portant R2 et R'2 de la formule (I) sans espaceur.
Les Bodipy correspondent à l'abréviation de bore-dipyrométhene, et représentent une famille de colorants qui absorbent fortement dans l'UV et qui ont la propriété d'émettre une fluorescence étroite avec un rendement quantique important. Ils dérivent tous du 4,4-difluoro- 4-bora-3a,4a-diaza-s-indacène ci-dessous:
Le texas red présente la formule suivante :
Les CY3 présentent la formule suivante :
R représentant un alkyle, tel que méthyle, éthyle...
Les CY5 présentent la formule suivante :
R représentant un alkyle, tel que méthyle, éthyle...
Les CY7 présentent la formule suivante :
R représentant un alkyle, tel que méthyle, éthyle... ( Synthesis and In Vivo Fate of Zwitterionic Near-Infrared Fluorophores. Hak Soo Choi, Khaled Nasr, Sergey Alyabyev, Dina Feith, Jeong Heon Lee, Soon Hee Kim, Yoshitomo Ashitate, Hoon Hyun, Gabor Patonay, Lucjan Strekowski, Maged Henary, John V. Frangioni. Angew. Chem. Int. Ed. 2011, 50, 6258 -6263)
Le "Technétium sous forme ligandée peut correspondre au technetium-gluceptate ou plus classiquement des complexes de type diethylene triamine pentacetate (DTP A) (Brain Research Protocols 8 (2001) 143-149, Non-invasive assessment of blood-brain barrier (BBB) permeability 99 using a gamma caméra to detect technetium-gluceptate extravasation in rat brain. Pamela Esposito , Stanley Jacobson , Raymond Connolly , Daniela Gheorghe, Theoharis C. Theoharides ; Use of sequential dtpa clearance and high resolution computerized tomography in monitoring interstitial lung disease in dermatomyositis. C. Hell, E. Romas, B. Kikham. British Journal of Rheumatology 1996;35 : 164- 166)
Un agent de contraste est un composé qui augmente artificiellement le contraste permettant de visualiser une structure anatomique (par exemple, un organe) ou pathologique (par exemple, une tumeur) naturellement peu ou pas contrastée.
Le principe de fonctionnement du produit de contraste dépend de la technique d'imagerie utilisée : en radiographie, la capacité du produit à absorber les rayons X est exploitée; en imagerie par résonance magnétique, les composés utilisés sont choisis en fonction de leurs propriétés magnétiques; en échographie, des substances dont l'écho aux ultrasons est caractéristique sont utilisées.
Dans un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne des nanovecteurs de formule générale (I) telles que définies ci-dessus, dans lesquelles le peptide de pénétration cellulaire est choisi parmi les polylysines, les polyarginines, les polylysines imidazolées, ou des mimétiques de polyglycines avec une chaîne porteuse d'un groupe terminal azoté.
Dans les deux cas, la terminaison COOH ou NH2 peut être modifiée pour porter un alcyne pour la chimie click.
Les différents composés cités sont représentés ci-dessous :
polylysine imidazolée polyarginines
et dérivés
Dans les uelles k est compris de 1 à 10.
mimétiques de polyglycines
dans laquelle i varie de 2 à 10 et Rf représentent un alkyle en Ci-C2o porteur de groupement azoté (NRaRb) ou un cycloalkyle en C3-C2o porteur d'un groupement azoté (NRaRb), avec a et b représentant un alkyle en Ci-C2o ou un cycloalkyle en C3-C2o. (NRaRb) peut aussi être sous la forme d'ammonium (NRaRbRc) avec a, b et c définis comme précédemment. Rg et R représentent un alcyne, ou un hydrogène ou un alkyle en Ci-C2o ou un cycloalkyle en C3-C2o. Rf peut éventuellement représenter un alcyne parmi les i répétitions.
La présence d'un peptide de pénétration cellulaire (CPP) permet de faciliter la capture du composé de formule (I) par une cellule. Pour les molécules qui sont des bases faibles avec une accumulation possible dans le lysosome ou qui ne supportent pas l'activité d'hydrolyse du lysosome (tels que les nucléotides, les peptides, l'ADN), le contoumement de la voie par endocytose au niveau de l'endosome est très important. Les polymères cationiques riches en azote tels que les polyarginines, les polylysines ou les polylysines modifiées par des imidazoles (polylysines imidazolées) permettent de déstabiliser les endosomes par modification du pH conduisant à la rupture de la membrane de l'endosome.
Par conséquent, les nanovecteurs porteurs de CPP sont également porteurs d'un ou plusieurs principe(s) actif(s) et optionnellement d'une ou plusieurs sonde(s) de détection.
Selon un autre aspect, la présente invention concerne des composés de formule générale (III) comme précurseur de la chaîne polymère P de formule (I).
Selon un autre aspect, la présente invention concerne des nanovecteurs telles que définies ci-dessus, pour une utilisation en tant que médicament et/ou agent diagnostic.
Les particules sphériques, lorsqu'elles ont été préalablement administrées à un mammifère et notamment un homme, et dans lesquelles q = 1 et R3 représente un principe actif, sont utilisées comme médicament après libération du principe actif dans la cellule après internalisation par endocytose dans la cellule.
Lorsque R3 représente une sonde de détection, les particules sphériques, lorsque qu'elles ont été préalablement administrées à un mammifère et notamment un homme, peuvent être utilisées comme agent diagnostic après libération de la sonde dans la cellule après piégeage sélectif du composé par EPR et internalisation par endocytose par une cellule, en particulier tumorale permettant de diagnostiquer et/ou localiser une pathologie
Cette même sonde de détection permet également de suivre le trafic cellulaire.
Les particules sphériques, lorsque qu'elles ont été préalablement administrées à un mammifère et notamment un homme, et dans lesquelles des chaînes polymères différentes sont présentes, et comprenant par exemple au moins un principe actif et au moins une sonde de détection, sont utilisées aussi bien comme médicament que comme agent de suivi de l'internalisation du principe actif dans la cellule cible, notamment une cellule cancéreuse, après libération du principe actif et de la sonde de détection dans la cellule après internalisation des particules sphériques par endocytose dans la cellule.
Dans un mode de réalisation avantageux, les nanovecteurs pour une utilisation en tant que médicament et/ou agent diagnostic sont des nanovecteurs dans lesquelles Ri représente un groupe de formule (III).
Encore un autre avantage de l'invention est que le composé de formule (I) qu'il soit sous forme de polymère (t = 1) ou sous forme d'alcène monocyclique ou polycyclique ( t = 0) peut toujours être piégé par EPR dans la cellule et ensuite subir l'endocytose et être utilisé ainsi en tant que médicament et/ou agent diagnostic. Dans un mode de réalisation avantageux, les nanovecteurs pour une utilisation en tant que médicament et/ou agent diagnostic sont des nanovecteurs dans lequel Ri représente un groupe de formule (IV).
Encore un autre avantage de l'invention est que les nanovecteurs peuvent aussi être dépourvues de polymère (t = 0) ou d'alcène monocyclique ou polycyclique (t = 0 et RI est de formule IV) tout en permettant l'endocytose et étant utilisé également en tant que médicament et/ou agent diagnostic.
Dans un mode de réalisation avantageux, la présente invention concerne des nanovecteurs telles que définies ci-dessus, pour une utilisation en tant que médicament et/ou agent diagnostic, dans lequel le principe actif, tel qu'un modulateur épigénétique, et/ou la sonde de détection est libéré dans la cellule après endocytose par ladite cellule à un pH acide.
Après pénétration dans la cellule par endocytose, le composé de formule générale (I) est internalisé dans l'endosome dans lequel le pH est de 6 permettant le commencement de l'hydrolyse du ou des groupe(s) R3 présent(s) et dont la maturation conduit au lysosome dans lequel le pH est de 5 permettant d'aboutir à l'hydrolyse complète du ou des groupes R3 et la libération du ou des principes actifs dans le cytoplasme (figure 1).
Dans un mode de réalisation avantageux, la présente invention concerne des nanovecteurs telles que définies ci-dessus, pour une utilisation en tant que médicament et/ou agent diagnostic, notamment pour le traitement et/ou le diagnostic de pathologies choisies parmi les maladies neurologiques, les processus inflammatoires, le cancer, les maladies du sang.
Par l'expression « maladies neurologiques », il faut comprendre sans être limité à celles-ci, la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson, la sclérose en plaques, la neuropathie, la polynévrite, l'épilepsie, la méningite...
L'expression « processus inflammatoire » désigne, sans être limité à celles-ci, l'arthrite, l'artérite, la colite, la conjonctivite, la cystite, la dermatite, l'encéphalite, l'endocardite, l'endométrite, la gastrite, la méningite, la myocardite, la myélite, la pancréatite, la péritonite, la sinusite, la tendinite.
L'expression « le cancer » désigne, sans être limité à celles-ci, les cancers hématopoïétiques, les leucémies, les lymphomes, les carcinomes, les adénocarcinomes, les sarcomes, le mélanome, le carcinome de la tête et du cou, le cancer de l'œsophage, le cancer buccal et du pharynx, le cancer du larynx, le cancer de la vessie, le cancer colorectal, le cancer ovarien, le cancer de l'utérus, le cancer du pénis, le cancer de la vulve et du vagin, le cancer cervical, le cancer de la prostate, le cancer rénal, le cancer de la peau, le cancer de l'os, le cancer des articulations et des cartilages articulaires, le cancer des testicules, le cancer de l'estomac, le cancer gastro-intestinal, le cancer génito-urinaire, le cancer du poumon, le thymome, le mésothéliome, le tératome, le cancer du cerveau, le cancer du foie, le cancer du pancréas, le gliome, le glioblastome, l'oligoastrocytome, le méningiome, l'adénome de l'hypophyse, le glioblastome multiforme, le médulloblastome, l'épendymome, l'astrocytome anaplasique, l'oligodendrogliome, le cancer de la thyroïde, le cancer anaplasique de la thyroïde, l'hémangiosarcome, le sarcome de Kaposi, le lymphangiosarcome, les lymphomes malins ganglionnaires et extra-ganglionnaires, le lymphome de Hodgkin, les lymphomes non hodgkiniens indolents, le rétinoblastome.
L'expression « les maladies du sang » concerne les maladies qui touchent les érythrocytes, les leucocytes, et les plaquettes, et désigne, sans être limité à celles-ci :
- les hémoglobinopathies, en particulier les thalassémies, la dépranocytose, l'hémoglobine C, la méthémoglobinémie,
- les déficits enzymatiques, tels que la déficience en glucose-6-phosphate déshydrogénase (G6PD ou G6PDH), le déficit en pyruvate kinase,
- la baisse des numérations de cellules, telles que l'aplasie, les anémies, les leucopénies, les thrombocytopénies
- l'augmentation des numérations cellulaires, telles que la leucocytose, la thrombocytose,
- les hémopathies malignes telles que les lymphomes, les myélomes, la leucémie, l'érythropoiese,
- les coagulopathies telles que les anomalies des plaquettes, l'hémostase primaire, les anomalies de protéines, les anomalies thrombotiques.
Dans un mode de réalisation avantageux, la présente invention concerne des nanovecteurs telles que définies ci-dessus, pour une utilisation en tant que médicament et/ou agent diagnostic, notamment pour le traitement combinatoire de pathologies choisies parmi les maladies neurologiques, les processus inflammatoires, le cancer, les maladies du sang.
Par « traitement combinatoire », il faut comprendre aussi bien des particules portant au moins deux principes actifs pour le traitement de pathologies différentes que des particules portant au moins deux principes actifs différents pour le traitement de la même pathologie.
Par exemple, les mêmes particules peuvent comprendre un HDI et un inhibiteur de DNMT pour le traitement du mésothéliome pleural malin (MPM).
Les HDI et DNMT sont des anticancéreux actuellement testés dans des essais cliniques seuls ou en association dans le traitement de MPM. Cependant, des effets secondaires importants peuvent être observés avec ces traitements principalement en raison de l'action non sélective de ces molécules.
Par conséquent, un avantage des particules de l'invention comprenant au moins deux principes actifs différents, en particulier un HDI et un inhibiteur de DNMT est de pouvoir cibler sélectivement la cellule, en particulier la cellule cancéreuse.
Selon un autre aspect, l'invention concerne une composition pharmaceutique comprenant comme principe actif des nanovecteurs telles que définies ci-dessus, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Par « composition pharmaceutique », on entend une composition comprenant un ou plusieurs principe(s) actif(s) constitué de nanovecteurs et qui peut être administrée à un patient pour le traitement d'une pathologie telle que définie ci-dessus.
Par « véhicule pharmaceutiquement acceptable », il faut comprendre toute substance autre que le principe actif dans un médicament. Son addition est destinée à conférer des caractéristiques physico-chimiques et/ou biochimiques pour favoriser l'administration au produit final, en évitant de préférence les interactions chimiques covalentes avec les principes actifs.
Dans un mode de réalisation avantageux, la composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, est sous une forme susceptible d'être administrée par voie intraveineuse à une dose unitaire 5 mg à 500 mg.
Les compositions pour administration par voie intraveineuse, peuvent être des solutions stériles ou des émulsions. Comme solvant ou véhicule, on peut employer l'eau, le propylène glycol, un polyéthylène glycol, des huiles végétales, en particulier l'huile d'olive, des esters organiques injectables, par exemple l'oléate d'éthyle. Ces compositions peuvent également contenir des adjuvants, en particulier des agents mouillants, isotonisants, émulsifïants, dispersants et stabilisants.
L'administration à la dose unitaire ci-dessus peut être effectuée une seule fois par 24h ou répétée en fonction de la pathologie et de la prescription médicale.
Dans un mode de réalisation avantageux, la composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, est sous une forme susceptible d'être administrée par voie intraveineuse à une dose comprise d'environ 0,05 μg/kg à environ 10 mg/kg.
Selon un autre aspect, l'invention concerne des nanovecteurs constitués de chaînes polymères de formule générale (I) telles que définies ci-dessus, comprenant une étape de polymérisation par métathèse d'ouverture de cycle et une étape de bioconjugaison.
Il est possible de synthétiser les nanovecteurs de l'invention suivant deux approches : - soit effectuer tout d'abord une étape de polymérisation par métathèse d'ouverture de cycle (ROMP) puis une étape clé de bioconjugaison (chimie click),
- soit effectuer tout d'abord une étape clé de bio conjugaison (chimie click) puis une étape de polymérisation par métathèse d'ouverture de cycle (ROMP) (figure 2).
L'étape de ROMP, bien connue de l'homme du métier, nécessite la mise en contact d'un catalyseur tel que :
le Bis(tricyclohexylphosphine)benzylidine ruthénium (IV) dichloride (PCy3)2Cl2Ru=CHPh): complexe de Grubbs de première génération (Grubbs et al, J. Am. Chem. Soc, 1996, 118, 100-110),
le tricyclohexylphosphine[ 1 ,3-bis(2,4,6-trimethyl-phenyl)-4,5-dihydro- imidazol-2-ylidene][benzylidene] ruthenium(IV) dichloride
(H2Imes)(PCy3)Cl2Ru=CHPh): complexe de Grubbs de seconde génération (Grubbs et al, Organic Letters, 1999, 1(6), 953-956),
ou des catalyseurs tels que Schrok (J.J. Murphy, T. Kawasaki, M. Fujiki, K. Nomura. Macromolecules 2005, 38, 1075-83.) ou à base d'autres métaux (a) S. Hayano, Y. Takeyama, Y. Tsunogae, I. Igarashi Macromolecules, 2006, 39, 4663-70. b) Y. Zou, D. Wang, K. Wurst, C. Kuhnel, I. Reinhardt, U. Decker, V. Gurram, S. Camadanli, M. R. Buchmeiser. Chem. Eur. J. 2011, 17, 13832 - 13846),
avec un alcène mono ou polycyclique (Chemtob A., Gnanou Y., Heroguez V., Macromolecules, 2002, 35(25), 9262-9269) pour former le polymère.
L'étape de bioconjugaison (ou chimie click) nécessite la mise en contact d'un alcyne avec un azoture en présence de Cu(I) pour obtenir le triazole correspondant.
Encore un avantage de l'invention est de fournir un procédé faisant intervenir une étape clé de bioconjugaison entre deux composés l'un portant une fonction azoture et l'autre une fonction alcyne aisément accessibles, effectuée dans des conditions douces permettant un accès aisé à des particules comprenant des principes actifs et/ou sondes de détections variés et/ou sensibles et présentant d'autres fonctionnalités.
Dans un mode de réalisation avantageux, la présente invention concerne un procédé de préparation de nanovecteurs constitués de chaîne polymères de formule générale (I) dans laquelle Ri est un groupe de formule générale (II) tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce que l'étape de polymérisation par métathèse d'ouverture de cycle est effectuée préalablement à l'étape de bioconjugaison. Dans un mode de réalisation avantageux, la présente invention concerne un procédé de préparation de nanovecteurs constitués de chaîne polymères de formule générale (I) dans laquelle Ri est un groupe de formule générale (II) tel que défini ci-dessus, dans lequel l'étape de polymérisation par métathèse d'ouverture de cycle est effectuée préalablement à l'étape de bioconjugaison, tel que défini ci-dessus, comprenant les étapes suivantes :
a. Préparation d'un composé de formule générale (Vl-a) suivante comprenant un alcène monocyclique ou polycyclique et une fonction azoture :
Alcène
monocyclique
ou polycyclique
(Vl-a) p et r étant tel que défini précédemment,
b. Mise en œuvre de l'étape de polymérisation par métathèse d'ouverture de cycle en présence d'un catalyseur pour former un composé de formule (VII) comprenant des fonctions azotures en surface d'un polymère:
(VII) m, r, p et q étant tel que définis précédemment,
c. Préparation d'un composé de formule générale (VIII) comprenant une fonction alcyne :
dans laquelle dans laquelle n, m, R2, R'2 et R3 sont tels que définis précédemment et s représente 0 ou 1 ,
s est un entier compris de 0 à 10, en particulier 0 ou 1,
d. Mise en œuvre de l'étape de bioconjugaison par mise en contact dudit composé de formule (VII) avec le composé de formule (VIII) en présence de cuivre pour obtenir des nanovecteurs constitués de chaîne polymérique de formule (I) dans laquelle Ri est un groupe de formule (II). et R' I est présent ou non.
Le composé de formule Vl-a peut être préparé selon des techniques bien connues de l'homme du métier.
En règle générale, dans l'étape a. l'alcène mono ou polycyclique méthanol est mis en réaction avec de l'oxyde d'éthylène en présence d'une base, en particulier le diphényleméthyle potassium (Héroguez V, Breunig S, Gnanou Y, Fontanille M, Macromolecules 1996, 29, 4459) dans un solvant organique tel que le THF, à température ambiante pour former un dérivé de poly(éthylène)oxyde contenant un alcène.
Après fonctionnalisation de la fonction alcool primaire libre du poly(éthylène)oxyde comprenant une fonction alcène, par exemple par un groupe paratoluène sulfonyle ou un groupe méthane sulfonyle, la réaction avec l'azoture de sodium conduit au composé (VI).
(VI)
Le composé de formule (Vl-a) est alors préparé par réaction de bioconjugaison du composé (VI) avec un poly(éthylène)oxyde comprenant une fonction alcyne à une extrémité et une fonction alcool à l'autre par chimie click, dans un mélange de solvant tel que dichlorométhane-eau en présence de cuivre I, en particulier CuBr, puis fonctionnalisation de la fonction alcool primaire restée libre. La réaction avec l'azoture de sodium conduit alors au composé (Vl-a) dans lequel r = 1.
La répétition de cette dernière étape permet l'obtention de composés (Vl-a) dans lesquels r est compris de 2 à 10.
Dans l'étape b., la réaction de ROMP est mise en œuvre, le composé (Vl-a) comprenant l'alcène mono ou polycyclique est mis à réagir en présence d'un catalyseur tel que défini ci-dessus, en particulier le catalyseur de Grubbs de lere génération dans un solvant tel qu'un mélange dichlorométhane/éthanol, à température ambiante et arrêt de la réaction par ajout d'un solvant tel que l'éther de vinyléthyle pour conduire au composé (VII).
Si le composé (Vl-a) ne comprend que des chaînes polymères P identiques, alors les particules formées ne comprennent qu'un seul type de chaînes polymères.
Si le composé (Vl-a) comprend des chaînes polymères différentes (P, P2, P3...), alors les particules formées comprennent plusieurs chaînes polymères différentes (P, P2, P3...) sans pour autant modifier le nombre total de chaînes polymères sur les particules. Dans l'étape c, le dérivé (VIII) portant la fonction alcyne précurseur du triazole qui sera formé par l'étape clé de bioconjugaison est obtenu par réaction de R2(CO)R'2 (R2 et R'2 étant tels que définis ci-dessus et dont la synthèse est bien connue de l'homme du métier) avec un triméthyléthynyle silane en présence d'une base, telle que le butyle lithium pour conduire au dérivé alcool correspondant: qui par réaction de bioconjugaison avec par exemple un groupe HO-CH2CH2-0- (CH2CH20)p-CH2CH2N3 permet l'obtention d'un groupe de formule (XI- 1) :
Le groupe de formule (XI- 1) est ensuite mis à réagir avec une base, par exemple NaH et un halogénure de propargyle, par exemple le bromure de propargyle pour former le composé de formule générale (XI-2) :
Le composé de formule (XI-2) est ensuite mis à réagir par exemple avec un paranitrophénylcarbonate ou le carbonyle diimidazole et substitué par un alcool, une aminé, un acide... et permet l'obtention des composés de formule générale (VIII).
L'étape d. fait intervenir la réaction de bioconjugaison clé entre Γ alcyne (VIII) et l'azoture (VII) en présence de cuivre tel que décrite pour l'étape a. ci-dessus pour conduire aux composés de formule générale (I) dans lesquels Ri est un groupe de formule (II).
Dans un mode de réalisation avantageux, la présente invention concerne un procédé de préparation de nanovecteurs constitués de chaîne polymères de formule générale (I) dans laquelle Ri est un groupe de formule générale (II) et t = 1 , ou de formule générale (III) et t = 0, tel que défini ci-dessus, dans lequel l'étape de bioconjugaison est effectuée préalablement à l'étape optionnelle de polymérisation par métathèse d'ouverture de cycle.
Dans un mode de réalisation avantageux, la présente invention concerne un procédé de préparation de nanovecteurs dans lequel l'étape de bioconjugaison est effectuée préalablement à l'étape optionnelle de polymérisation par métathèse d'ouverture de cycle tel que défini ci-dessus, comprenant les étapes suivantes :
a. Préparation d'un composé de formule générale (Vl-a) suivante comprenant un alcène monocyclique ou polycyclique et une fonction azoture :
Alcène
monocyclique
ou polycyclique
(Vl-a) m, r et p étant tels que définis précédemment,
b. Préparation d'un composé de formule générale (VIII) comprenant une fonction alcyne :
dans laquelle n et m sont tel que définis précédemment et s est un entier compris de 0 à 10,
Pv2, R'2 et R3 sont els que définis ci-dessus,
c. Mise en œuvre de l'étape de bioconjugaison par mise en contact dudit composé de formule (Vl-a) avec le composé de formule (VIII) en présence de cuivre pour obtenir les composés de formule générale (I) dans laquelle t = 0 et Ri représente un groupe de formule (III). d. Optionnellement, mise en œuvre de l'étape de polymérisation par métathèse d'ouverture de cycle en présence d'un catalyseur pour former des nanovecteurs constitués de chaîne polymères de formule générale (I) dans laquelle Ri est un groupe de formule générale (II) et t = 1.
Dans ce mode de réalisation, la mise en œuvre de l'étape de polymérisation par ROMP conduit au composé de formule générale (I) dans lequel Ri est un groupe de formule générale (II). Si l'étape de polymérisation par ROMP n'est pas mise en oeuvre, le composé de formule générale (III) et t = 0 est alors obtenu.
Le composé de formule Vl-a est préparé selon la méthode décrite ci-dessus dont certaines sont indiquées dans la partie exemples. Les composés de formule VIII peuvent être préparés comme indiqué précédemment.
Les composés de formule VIII dans lesquels s = 0 (VIII-a) portant la fonction alcyne précurseur du triazole formé par l'étape de bio conjugaison sont obtenus par réaction de R2(CO)R'2 avec un triméthyléthynyle silane en présence d'une base, telle que le butyle lithium pour conduire au dérivé alcool correspondant (VIII-b):
qui par réaction avec par exemple un paramtrophénylcarbonate ou le carbonyle diimidazole et substitution par un alcool, une aminé, un acide... permet l'obtention des composés de formule générale (VIII-a) :
L'invention est illustrée par les figures et les exemples qui suivent.
DESCRIPTION DES FIGURES
La figure 1 présente le suivi d'un nanovecteur (colloïde, sphère blanche) de l'invention comprenant un CPP (carré blanc), une sonde de détection fluorescente (carré gris) et un principe actif (carré noir), depuis sa circulation dans les vaisseaux sanguins jusqu'à la libération du principe actif dans le cytoplasme.
Brièvement, le nanovecteur préalablement administrée à un mammifère par voie intraveineuse, après circulation dans les vaisseaux sanguins plusieurs heures est piégée par EPR au niveau de la cellule endothéliale puis internalisée par endocytose favorisée par le peptide CPP conduisant à l'intemalisation du nanovecteur dans un endosome où le principe actif est en partie libéré en raison du pH de 6 existant dans l'endosome. La maturation de cet endosome aboutit à un lysosome dans lequel le pH de 4-5 finalise l'hydrolyse du principe actif et conduit à la libération du principe actif dans le cytoplasme.
Une sortie précoce de l'endosome peut avoir lieu pour les composés sensibles au milieu acide qui peuvent pénétrer le noyau à l'aide du mécanisme de complexes de pores nucléaires (NPC) basé sur les signaux de localisation nucléaire (NLS).
La figure 2 présente les deux alternatives possibles pour la synthèse des composés de l'invention : Etape de biojugaison (click) puis étape de polymérisation par ouverture de cycle (ROMP), ou
Etape de polymérisation par ouverture de cycle (ROMP) puis étape de biojugaison (click).
Les figures 3A et 3B présentent les courbes d'hydrolyse en milieu acide obtenues avec le composé 9d de l'exemple 5 de l'invention à pH 4,3 ; 5,3 et 7,3.
Figure 3A: Carré noir (ligne pointillée: pH 4,3 ; Cercles plein noirs (ligne pleine): pH5,3. Axe des abscisses : temps en minutes
Axe des ordonnées : % d'hydrolyse
Figure 3B : Carré noir : pH 7,3.
Axe des abscisses : temps en heures
Axe des ordonnées : % d'hydrolyse
Les figures 4A à 4D présentent la taille des particules de l'invention mesurée par diffusion dynamique de la lumière (DLS) et microscopie électronique en transmission (TEM).
Figure 4A : DLS : Distribution de taille par intensité
ligne pleine : composé 16a (exemple 14 schéma IV- 1)
ligne pointillée : composé 16b (exemple 14 schéma IV-2)
Figure 4B: TEM composé 16b (exemple 14 schéma IV-2)
Figure 4C: TEM composé 16a (exemple 14 schéma IV- 1)
Figure 4D: TEM composé 16a (exemple 14 schéma IV- 1)
Axe des abscisses : taille (diamètre en nm)
Axe des ordonnées : Intensité (%)
Les particules de composé 16a (exemple 14 schéma IV- 1) ont une taille d'environ 300 nm et les particules de composé 16b (exemple 14 schéma IV-2) ont une taille d'environ 400 nm.
Les figures 5A à 5C présentent la co-localisation des particules de l'invention (composé 16a) de l'exemple 14 (schéma IV) avec les lysosomes après internalisation dans la cellule de la sonde de détection.
Figure 5 A : Particules (composé 16a) détectées par fluorescence.
Figure 5B : Vésicules lysosomiales acides révélées par marquage avec un anticorps anti-LAMP
Figure 5C : superposition de 5A et 5B montrant la colocalisation des particules avec les lysosomes. Les figures 6A à 6D présentent le ciblage sélectif de tumeurs (cellules de mésothéliome péritonéal malin (AK7)) par les particules (composé 16a de l'invention).
Figure 6A : Souris porteuse d'une tumeur sous cutanée (AK7) au niveau du bas du dos, à gauche. Sur le cliché correspondant à l'animal entier on peut voir une fluorescence seulement au niveau de la tumeur à 24h.
Figure 6B : La photo correspond à la tumeur isolée et à plusieurs organes disséqués (rate en haut à droite, les 2 reins en bas à gauche et le foie en bas à droite. La fluorescence n'est observée qu'au niveau de la tumeur et pas dans la rate ni dans les reins. Le très faible signal résiduel détecté dans le foie correspond à un passage obligé des nanovecteurs de l'invention sans effet de rétention.
Figure 6C : Une semaine après l'injection, la fluorescence est observée au niveau de la tumeur disséquée (Tu), le foie (Li), les ovaires (Ov), le cerveau (Br), la rate (Sp) et les reins (Ki) ainsi que dans le sang (Bl) une semaine après l'injection.
Figure 6D : représentation graphique des intensités de fluorescence mesurée dans les différents organes aux temps post-injection indiqués. Axe des ordonnées : activité de la surface en cpm/mm2.
Axe des abscisses (de gauche à droite) : Tumeur, Foie, Ovaire, Cerveau, Rate, Rein et sang.
La figure 7 présente le spectre RMN dans CDC13 du composé NB-PEO-OMs (12) . La figure 8 présente le spectre RMN dans CDC13 du composé NB-PEO-N3 (13).
La figure 9 présente le spectre RMN dans CDC13 du composé NB-PEO-Rhodamine B
(15a).
La figure 10 présente le spectre RMN dans CDC13 du composé NB-PEO-Coumarine (15b).
La figure 11 présente le spectre RMN dans CDC13 du composé NB-PEO-CI-994
(17c).
Les figures 12A à 12D présentent la pénétration cellulaire des composés de l'invention (composé 16a de l'exemple 14, schéma IV) et le trafic cellulaire associé.
Figure 12A : cinétique d'endocytose du composé 16a par des cellules de mésothéliome pleural malin (MPM : lignée cellulaire Meso 13) et d'adénocarcinome de poumon (ADCA : lignée cellulaire 153).
1.103 cellules de MPM ou d'adénocarcinome de poumon sont incubées avec 0,43 μg de composé 16a à différents temps. La fluorescence a été utilisée pour mesurer l'intemalisation en utilisant un fluorimètre. Les résultats sont exprimés en moyenne ± l'écart type des résultats obtenus sur trois lignées cellulaires différentes de MPM ou ADCA de poumon.
* p<0,05 et ** p<0,01.
Axe des ordonnées : Particules internalisées par endocytose ^g/103 cellules)
Axe des abscisses : temps (min)
Basée sur la fluorescence, la quantité de composé 16a internalisée par quantité de cellules après 120 minutes d'incubation est de 0,042 ± 0,028 μg/1.103 cellules pour MPM et d de 0,629 ± 0,231 μg/1.103 cellules pour ADCA , montrant une capacité augmenté d'un facteur 15 des cellules ADCA par rapport aux cellules MPM pour internaliser le composé 16a.
Après 300 minutes, ce rapport est réduit à un facteur 7 (MPM : 0,125 ± 0,016 μg/1.103 cellules et ADCA : 0,881 ± 0,226 μg/1.103 cellules)
Figure 12B : Microscopie électronique de l'endocytose du composé 16a par les cellules ADCA.
Les colonnes n et n + ΙμΜ représentent la couche n et la couche n + 1 μ.
Les lignes 1, 2, 3 : traitements à 37°C, 4°C et cytochalasine respectivement.
Les flèches indiquent la localisation du composé 16a.
Figure 12C : Microscopie électronique de l'endocytose du composé 16a par les cellules MPM.
Les colonnes n et n + ΙμΜ représentent la couche n et la couche n + 1 μ.
Les lignes 1, 2, 3 : traitements à 37°C, 4°C et cytochalasine respectivement.
Les flèches indiquent la localisation du composé 16a.
Figure 12D : co-localisation avec les compartiments acides intracellulaires (colonne gauche : ADCA et colonne droite MPM)
lignes 1, 2et 3 : fluorescence du composé 16a, marquage par Lamp-1 et fusion des lignes 1 et 2 respectivement.
Les figures 12B et 12C, colonnes n et n+1 μΜ montrent la présence de plusieurs points délimités par un marquage membranaire fin. Ces figures démontrent que l'intemalisation du composé 16a dans les cellules à 37°C (ligne 1). Quand les cellules sont incubées avec de la glace, (ligne 2) ou avec de la cytochalasine D (ligne 3) avant addition du composé 16a, le composé 16a est principalement localisé sur les membranes et pas à l'intérieur des cellules. Ceci suggère que l'intemalisation des composés de l'invention nécessite un mécanisme actif impliquant un réseau d'actine. Les figures 13 A et 13B présentent la toxicité cellulaire des particules de l'invention (composé 19a, exemple 14, schéma IV- 1) par détermination des courbes doses-réponses sur des cellules MPM ou ADCA.
Figure 13A : courbe dose-réponse obtenue avec des particules de l'invention nues
(sans rhodamine)
Figure 13B : toxicité dose-réponse obtenue avec les particules 16a.
Toutes les cellules ont été maintenues en milieu RPMI (Invitrogen) enrichi en L- glutamine (2 mM), pénicilline (100 IU/ml), Streptomycine (0,1 mg/ml) et 10% de sérum foetal de veau inactivé à la chaleur (FCS) (Eurobio).
Les cellules ont été incubées avec des doses croissantes de particules nues ou de particules de l'invention couplées à la rhodamine pendant 72h. La croissance cellulaire a été évaluée avec un réactif de comptage de cellules Uptiblue (Interchim). La réduction de ce composé par les cellules conduit à la formation d'un composé fluorescent quantifié par mesure de la fluorescence à 595 nM après excitation à 532 nM en utilisant un appareil Typhon (GE Healthcare). Les cellules ont été ensemencées dans des plaques 96 puits à une densité de 5xl03 cellules/puit dans un milieu de culture. Après 24h, Uptiblue (5%, v/v) a été ajouté au milieu de culture pendant 2h30 à 37°C.
La fluorescence a été mesurée et rapportée au nombre de cellules au jour J=0. Le milieu de culture contenant Uptiblue a été remplacé par un milieu contenant ou non des particules de l'invention pendant 72h. Uptiblue a été ajouté au milieu de culture pendant 2h30 à 37°C. La fluorescence a été mesurée comme décrit ci-dessus et rapporté au nombre de cellules au jour 3. la croissance cellulaire a été définie comme étnt le rapport de l'intensité de fluorescence au jour J=0 sur l'intensité de fluorescence au jour J = 3.
Les résultats sont présentés en moyenne ± l'écart type des déterminations effectuées sur au moins trois lignées cellulaires différentes de MPM (Meso 4, Meso 13, Meso 34, Meso56, Meso 76 ou Meso 95B) ou ADCA (ADCA 3, ADCA 72, ADCA 117 ou ADCA 153).
Les particules nues et les particules couplées à la rhodamine montrent une toxicité similaire sur toutes les lignées cellulaires testées avec une CI50 de 0,34 mg/ml +/- 0,03 pour les particules nues et de 0,031 mg/ml +/- 0,004 pour les particules 16a.
La toxicité des particules montre une très faible variation en fonction des lignées cellulaires. Ceci suggère l'implication d'un phénomène physique pour expliquer la toxicité sur les cellules et non de voies dépendante de la mort cellulaire qui inclurait probablement une sensibilité intrinsèque des lignées cellulaires et ensuite une variation dans la réponse.
La légère différence entre les particules nues et les particules avec rhodamine (16a) peut être due à la modification de l'hydrophilie à la surface des particules.
Les figures 14A et 14B présentent le potentiel d'internalisation des particules par cytométrie de flux.
Cette méthode permet l'analyse individuelle des cellules par mesure de l'absorption de lumière (FSC) et de la diffusion de lumière (SSC). L'augmentation de la granulométrie cellulaire modifie les propriétés de diffusion de la lumière des celllules et augmente les valeurs de SSC.
Des cellules ADCA 153 (figure 14 A) et MMP (Meso 13, figure 14B) ont été incubées avec 3,45 mg/ml de nanoparticules de l'invention nues pendant 2h avec de la glace (0°C) ou à 37°C).
Les figures 14A et 14B montrent clairement que la SSC des cellules a été augmentée lorsque l'incubation des cellules a été effectuée à 37°C mais pas à 0°C. L'augmentation de la SSC des cellules traitées avec des nanoparticules reflète une augmentation de la granulométrie cellulaire due à l'internalisation des particules et non à un dépôt de particules sur les membranes cellulaires comme indiqué par les résultats à 0°C.
La présence d'une internalisation des particules à 37°C uniquement démontre l'implication d'un mécanisme actif d'endocytose.
Dans les deux figures :
La courbe de droite correspond à une température de 37°C.
La courbe de gauche correspond à la température de 0°C superposée au contrôle.
Les figures 15A à 15D présentent la caractérisation pharmaco logique en utilisant le BRET pour les principes actifs libres (SAHA, CI-994), leurs dérivés 8 (c, d, e) et 9(c, d, e) et les alcools attendus relargués 7 (c, d, e).
Les résultats sont la moyenne ± l'écart type de trois expérimentations indépendantes.
Les EC50 (μΜ) obtenues sont les suivantes :
SAHA seul : 0,42 ± 1,14
9c : 7,17 ± 1,11
9d : 0,59 ± 1,17
9e : 0,42 ± 1,14 CI-9947c : 0,86 ± 1,14
9c : 6,20 ± 1,15
9d : 8,88 ± 1,19
9e : 0,68 ± 1,13
Ces résultats montrent que les iHDAC sont relargués, les prodrugs en elle-même n'inhibant pas HDAC.
Figure 15A : SAHA et CI 994
Figure 15B : composés 7c, d, e
Figure 15C : composés 8c, d, e
Figure 15D : composés 9c, d, e
Les figures 16A à 16D présentent les cinétiques de restauration de l'inhibition de HDAC mesuré par BRET
Evaluation de la cinétique de l'induction de l'acétylation des histones en utilisant BRET : Figure 16A : SAHA et composés 8c, d, e
Figure 16B : CI 994 et composés 9c, d, e
Figure 16C et 16D : Maximum de BRET induit en fonction des différents composés :
16C : de gauche à droite : SAHA, 8d, e, c
16D : de gauche à droite : CI 994, 9d, e, c
EXEMPLES
PARTIE CHIMIQUE
DCM: dichlorométhane; ACN: acétonitrile; DMF: diméthylformamide; THF: tétrahydrofurane.
CDCI3 : Chloroforme deutéré
A) Synthèse des motifs à cliquer
Exemple 1 : Préparation des bras acido sensibles : Composé 7c et 7d
Les composés 7c (R2 et R'2 = Ph) et 7d (R2 et R'2 = 4-OMe), 7e (R2 et R'2 = 4-Me), 7f (R2 et R'2 = 2,4-diOMe), 7g (R2 et R'2 = 4-F), 7h (R2 et R'2 = 4-C1), sont préparés selon le schéma I suivant (dans toute la partie expérimentales, les lettres c à h ont la même signification) :
SCHEMA I
1.1 : Préparation de 2-(2-(2-(2-azidoéthoxy)éthoxy)éthoxy)éthanol (3)
HO/N/°N/XO/N/°N/ N3
A une solution de 2 (1,0 g; 2,89 mmol; 1 eq.) dans 20 mL de DMF est ajouté NaN3, (0,938 g; 14,43 mmol; 5 eq.) à température ambiante. La solution est agitée 2 jours et diluée avec du DCM et lavée à l'eau puis avec une solution saturée de NaCl. La phase organique est séchée avec MgS04, filtrée et concentre sous vide. Le résidu est purifié (chromato graphie flash, silice, éluant DCM/MeOH) pour donner l'azoture 3 sous forme d'huile visqueuse incolore (0,501 g; 2,29 mmol; 79%).
Rf (Si02, DCM/MeOH (95/5)):0,33,
1H NMR (CDC13, 400 MHz): δ = 3,75 (t, 2H, J=4,l Hz), 3,70 (m, 10H), 3,64 (dd, 2H, J=3,8 Hz, J= 5,1 Hz), 3,42 (t, 2H, J=5,0 Hz), 2,61 (bs, 1H).
1.2 : Préparation de 2-(2-(2-(2-(4-(hydroxydiphénylméthyl)-lH-l,2,3-triazol-l-yl)éthoxy) éthoxy)éthoxy)éthanol (5c)
Dans 100 mL de mélange DCM/H20 (1/1) sont ajoutés 3 (2,015 g; 9,19 mmol; 1 eq.), 4c préparé selon Cadierno, V.; Francos, J.; Gimeno, J. Tet. Lett. 2009, 50, 4773. (1,914 g; 9,19 mmol; 1 eq.) et CuBr (0,264 g; 1,838 mmol; 0,2 eq.). La solution est agitée vigoureusement pendant 20 h puis extraite avec le DCM et lavée avec une solution saturée de NH4C1. La phase organique est séchée sur MgS04, filtrée et concentre sous vide. Le produit brut est purifié (chromatographie flash, gel de silice, éluant DCM/MeOH) pour donner 5c sous forme d'huile (3,317 g; 7,76 mmol; 84%).
Rf (Si02, DCM/MeOH (95/5)):0,19,
1H-NMR (acétone-dg, 400 MHz): δ = 7,73 (s, 1H), 7,47-7,44 (m, 4H), 7,31-7,26 (m, 4H), 7,25-7,20 (m, 2H), 5,34 (s, 1H), 4,56 (t, 2H, J=5,21 Hz), 3,89 (t, 2H, J=4,20 Hz), 3,60-3,56 (m, 5H), 3,54-3,50 (m, 6H), 3,49-3,46 (m, 2H).
13C-NMR (acétone-dg, 100 MHz): δ = 154,75, 148,12, 128,41, 128,16, 127,69, 124,38, 77,19, 73,47, 71,21, 71,17, 71,09, 70,17, 61,98, 50,68,
1.3 : Préparation de 2-(2-(2-(2-(4-(hydroxybis(4-méthoxyphényl)méthyl)-lH-l,2,3- triazol-l-yl)éthoxy)éthoxy)éthoxy)éthanol (5d)
Dans 100 mL de mélange DCM/H20 (1/1) sont ajoutés 3 (1,988 g; 9,07 mmol; 1 eq.), 4d préparé selon Gabbutt, C. D.; Héron, B. M.; Instone, A. C; Thomas, D. A. Partington, S. M.; Hursthouse, M. B.; Gelbrich, T. Eur. j. Org. Chem. 2003, 7, 1220; (2,379 g; 9,07 mmol; 1 eq.) et CuBr (0,260 g; 1,814 mmol; 0,2 eq.). La solution est agitée vigoureusement pendant 20 h et extraite avec le DCM et lavée avec une solution saturée de NH4CI. La phase organique est séchée (MgS04), filtrée et concentre sous vide. Le produit brut est purifié (chromatographie flash, gel de silice, éluant DCM/MeOH) pour donner 5d sous forme d'huile (3,463 g; 7,19 mmol; 79%).
Rf (Si02, DCM/MeOH (95/5)):0,15, 1.4: Préparation de 2-(2-(2-(2-(4-(hydroxybis(4-fluorophényl)-lH-l,2,3-triazol-l- yl)éthoxy) éthoxy)éthoxy)éthanol (5g) :
- Préparation du composé (4g) :
Dans un mélange de 1.50ml de triméthylsilyle acétylène (10.31mmol ; 1.5 éq.) dans 30ml de THF anhydre, ajouter progressivement, à -10°C, 6.45ml de BuLi (1.6M) (10.31mmol ; 1.5 éq.). Laisser agiter le mélange à -10°C pendant une heure. Ensuite, en gardant la même température, ajouter un mélange de 1.50g de difluorobenzophénone (6.87mmol ; léq.) dilué dans 10ml de THF anhydre. Laisser agiter pendant 5h à -10°C.
Laisser remonter la température à 0°C, ensuite ajouter une solution de 0.58g de KOH diluée dans 6ml de méthanol distillé. Le mélange est laissé sous agitation à température ambiante pendant 12h.
Ajouter au mélange une solution d'acide acétique jusqu'à pH=7. Verser le mélange dans une solution de NaCl (150ml). Extraire les phases organiques 3x100ml d'acétate d'éthyle. Les phases organiques sont ensuite séchées avec du MgS04, filtrées puis évaporées sous vide. Le mélange est purifié par chromatographie flash : EP/AcOEt (de 0% à 10% d'AcOEt).
On obtient 1.66g du produit (4g) sous forme d'une huile jaune.
- Rendement : 98%
- Rf (EP/AcOEt : 80/20): 0.58
1H NMR (CDC13 , 400 MHz) δ (ppm): 2.90 (s, 1H) ; 7.00 (t, 4H, J=8Hz) ; 7.54 (dd, 4H, J=8Hz)
13C NMR (ACETONE D6, 75.4MHz) δ (ppm): 73.4 ; 76.8 ; 87.5 ; 115.4 ; 115.6 ; 128.8 ; 142.8 ; 142.9 ; 161.6 ; 164.1
19F NMR (ACETONE D6 , 400 MHz) δ (ppm): -117.6 - Préparation du composé (5 g) :
A température ambiante, ajouter 0.36g de l'azide 3 (1.63mmol ; léq.) sur un mélange de 0.40g de composé (4g) dans 30ml de DCM/H20(1/1). Ajouter ensuite 46.00mg de bromure de cuivre (0.33mmol ; 0.2 éq.). Laisser agiter le mélange pendant 12h à température ambiante.
Ajouter au mélange 20ml de H20. Extraire les phases organiques 3x50ml de DCM. Laver les phases organiques avec une solution saturée de NH4C1. Ensuite, la phase organique est séchée, filtrée puis évaporée.
On obtient 0.75g du produit de composé (5g) sans purification.
- Rendement : Quantitatif. - Rf (DCM/MeOH : 90/10) : 0.45
1H NMR (ACETONE D6 , 400 MHz) δ (ppm): 3.48 (m, 12H) ; 3.88 (t, 2H, J=8Hz) ; 4.55 (t, 2H, J=8Hz) ; 5.55 (s, 1H) ; 7.01(t, 4H, J=8Hz) ; 7.46(dd, 4H, J=8Hz) ; 7.80 (s, 1H)
13C NMR (ACETONE D6, 75.4MHz) δ (ppm): 61.9 ; 71.0 ; 71.1 ; 71.2 ; 73.4 ; 114.9 ; 115.2 ; 130.1
19F NMR (ACETONE D6 , 400 MHz) δ (ppm): -117.6
1.5: Préparation de 2-(2-(2-(2-(4-(hydroxybis(4-chlorophényl)-lH-l,2,3-triazol-l- yl)éthoxy) éthoxy)éthoxy)éthanol (5h) :
- Préparation du composé (4h) :
Pour la synthèse du (4h), on suit la même procédure de la synthèse du composé (4g).
3.53g du dichlorobenzophénone (14.05mmol ; léq.) ; 13.17ml de BuLi (1.6M) (21.08mmol ; 1.5éq.) ; 3.00ml de TMSA (21.08mmol ; 1.5éq.) ; 1.18g de KOH (21.08mmol ; 1.5éq.) dans 12ml de méthanol sec ; 2x60ml de THF anhydre.
On obtient 2.50g du produit 4h sous forme d'une huile transparente.
- Rendement : 64%
- Rf (EP/AcOEt : 95/5) : 0.25
1H NMR (ACETONE D6 , 400 MHz) δ (ppm): 3.46 (s, 1H) ; 6.00 (s, 1H) ; 7.36 (d, 4H, J=8Hz) ; 7.61 (d, 4H, J=8Hz)
13C NMR (ACETONE D6, 75.4MHz) δ (ppm): 73.4 ; 77.1 ; 86.9 ; 128.5 ; 128.9 ; 133.7 ; 145.4
- Préparation du composé (5h) :
Même procédure pour la synthèse du composé (5 g).
0.93g de (4g) (3.34mmol ; 1 éq.) ; 0.73g de l'azide 3 (3.34mmol ; léq.) ; 95.00mg de CuBr
(0.67mmol ; 0.2éq.) ; 50ml DCM/H20(1/1).
On obtient 1.56g du produit (5 h) sous forme d'une huile jaune.
- Rendement : 95%
- Rf (DCM/MeOH : 90/10): 0.33
1H NMR (ACETONE D6 , 400 MHz) δ (ppm): 3.52 (m, 12H) ; 3.88 (t, 2H, J=8Hz) ; 4.55 (t,
2H, J=8Hz) ; 5.68 (s, 1H) ; 7.33 (d, 4H, J=8Hz) ; 7.46 (d, 4H, J=8Hz) ; 7.83 (s, 1H)
13C NMR (ACETONE D6, 75.4MHz) δ (ppm): 61.9 ; 70.0 ; 70.1 ; 73.4 ; 128.55 ; 129.86 1.6 : Préparation de (l-(3,6,9,12-tetraoxapentadec-14-ynyl)-lH-l,2,3-triazol-4- yl)diphényl méthano
Dans 100 mL de THF sec contenant 5c (1,240 g; 2,90 mmol; 1 eq.) est ajouté à 0°C NaH (0,232 g; 5,8 mmol; 2 eq. ; 60% masse dans l'huile). La réaction est agitée pendant 2 heures et le bromure de propargyle (0,313 mL; 2,90 mmol; 1 eq.) dans le toluène (80%> masse) est ajouté lentement. La réaction est laissée sous agitation 2 jours en laissant remonter la température. La réaction est stoppée par ajout à 0°C de solution saturée de NaCl et extraite avec du DCM. La phase organique est séchée (MgS04), filtrée et concentrée sous vide. L'huile obtenue est purifiée (chromatographie flash, gel de silice, éluant DCM/MeOH) pour donner l'éther attendu 7c (0,774 g; 1,66 mmol; 57%) sous forme d'huile visqueuse. Une partie du diol 5c est convertie sous forme de diéther 6c qui traité pendant 12h par une solution ACN/KHSO4 1M donne totalement le monoéther 7c.
Rf (Si02, DCM/MeOH 95:5): 0,53
1H-NMR (acétone-dg, 400 MHz): δ = 7,72 (s, 1H), 7,48-7,44 (m, 4H), 7,31-7,27 (m, 4H), 7,25-7,21 (m, 2H), 5,27 (s, 1H), 4,56 (t, 2H, J= 5,2 Hz), 4,15 (d, 2H, J= 2,4 Hz), 3,90 (t, 2H, J= 5,2 Hz), 3,61-3,56 (m, 6H), 3,54-3,50 (m, 6H), 2,92 (t, 1H, J= 2,4 Hz).
13C-NMR (acétone-dg, 100 MHz): δ = 154,73, 148,12, 128,41, 128,16, 127,70, 124,34, 80,95, 77,20, 75,75, 71,22, 71,21, 71,19, 71,10, 70,97, 70,17, 69,81, 58,57, 50,70,
1.7 : Préparation de (l-(3,6,9,12-tetraoxapentadec-14-ynyl)-lH-l,2,3-triazol-4-yl)bis(4- methoxyphenyl) méthanol (7d)
Dans 100 mL de THF sec contenant 5d (1,674 g; 3,43 mmol; 1 eq.) est ajouté à 0°C NaH (0,274 g; 6,46 mmol; 2 eq.; 60% masse dans l'huile). La réaction est agitée 2 heures et le bromure de propargyle (0,370 mL; 3,43 mmol; 1 eq.) dans le toluène (80% masse) est ajouté lentement. La réaction est agitée 2 jours en laissant remonter la température. La réaction est stoppée à 0°C par ajout de solution saturée de NaCl puis extraite avec du DCM. La phase organique est séchée (MgS04), filtrée et concentre sous vide. L'huile obtenue est purifiée (chromatographie flash, gel de silice, éluant DCM/MeOH) pour donner le produit attendu 7d sous forme d'huile visqueuse (1,276 g; 2,43 mmol; 71%). Le diéther 6d également obtenu est converti en monoéther 7d par traitement avec ACN/KHSO4 1M.
Rf (Si02, DCM/MeOH 95:5): 0,28
1H-NMR (acétone-dg, 400 MHz): δ = 7,68 (s, 1H), 7,33-7,31 (m, 4H), 6,85-6,82 (m, 4H), 5,09 (s, 1H), 4,54 (t, 2H, J= 5,2 Hz), 4,15 (d, 2H, J= 2,4 Hz), 3,88 (t, 2H, J= 5,2 Hz), 3,76 (s, 6H), 3,60-3,55 (m, 6H), 3,54-3,51 (m, 6H), 2,93 (t, 1H, J= 2,4 Hz).
13C-NMR (acétone-dg, 100 MHz): δ = 159,53, 155,34, 140,54, 129,38, 124,11, 113,64, 80,97, 76,65, 75,81, 71,22, 71,19, 71,10, 70,96, 70,18, 69,81, 58,59, 55,51, 50,66,
1.8 Préparation de (l-(3,6,9,12-tetraoxapentadec-14-ynyl)-lH-l,2,3-triazol-4-yl)bis(4- paramethylphenyl) méthanol (7e)
Même procédure que pour la synthèse du composé (7d).
huile jaune (1.51 g, 3.04 mmol, 82%). TLC MeOH/DCM 5/95 Rf = 0.23; 1H NMR (400 MHz, Acetone-D6): δ = 2.29 (s, 6H), 2.93 (t, 1H, J= 2.4 Hz), 3.49-3.61 (m, 12H), 3.87 (t, 2H, J= 5.3 Hz), 4.15 (d, 2H, J= 2.4 Hz), 4.53 (t, 2H, J= 5.1 Hz), 5.14 (br s, 1H), 7.09 (d, 4H, J= 8.5 Hz), 7.32 (d, 4H, J= 8.5 Hz), 7.68 (s, 1H); 13C NMR (100 MHz, Acetone-D6): δ = 154.9, 145.3 (2C), 136.9 (2C), 128.9 (4C),128.0 (4C), 124.2, 80.9, 76.9 (2C), 75.8, 71.9, 71.1, 71.1, 71.0, 70.1, 69.7, 58.5, 50.6, 21.0 (2C); HRESI-MS: m/z 516.2473 (calcd. for C28H35N305Na 516.24744 [M+Na]+)
1.9: Préparation de (l-(3,6,9,12-tetraoxapentadec-14-ynyl)-lH-l,2,3-triazol-4-yl)bis(4- fluorophenyl) méthanol (7g)
Dans un mélange de 0.76g du produit (5g) (1.55mmol ; léq.) dans 50ml de THF anhydre, ajouter progressivement, à 0°C, 0.12g de NaH (60%>) (3.1 lmmol ; 2éq.). Le mélange est laissé sous agitation, en gardant la même température, pendant 2h. Ensuite ajouter 1.38ml de bromure de propargyle (80%) (1.55mmol, léq.). Laisser agiter le mélange à température ambiante pendant 24h.
A 0°C, ajouter au mélange 50ml d'une solution saturée de NaCl. La phase organique est extraite lxl 00ml de DCM. La phase organique est ensuite séchée, filtrée puis évaporée sous vide.
Ajouter au mélange brut 100ml d'une solution de KHS04(1M)/ACN et laisser sous agitation à température ambiante pendant 12h. Extraire lxl 00ml de DCM. La phase organique est ensuite séchée, filtrée puis évaporée sous vide.
Le mélange brut est purifié par combi flash : DCM/MeOH (de 0% à 5% de MeOH).
On obtient 0.302g du produit (7g) sous forme d'une huile jaune.
- Rendement : 39%
- Rf (DCM/MeOH : 95/5) : 0.36
1H NMR (ACETONE D6 , 400 MHz) δ (ppm): 2.92 (s, 1H) ; 3.54 (m, 12H) ; 3.89 (t, 2H, J=8Hz) ; 4.15 (s, 2H) ; 4.55 (t, 2H, J=8Hz) ; 5.49 (s, 1H) ; 7.04 (t, 4H, J=8Hz) ; 7.45 (dd, 4H, J=8Hz) 7.79 (s, 1H)
13C NMR (ACETONE D6, 75.4MHz) δ (ppm): 50.6 ; 58.5 ; 69.7 ; 70.0 ; 70.9 ; 71.0 ; 71.1 ; 75.7 ; 76.4 ; 80.8 ; 114.8 ; 115.1 ; 124.2 ; 129.9 ; 130.1 ; 143.9 ; 144.0 ; 154.4 ; 161.4 ; 163.8 19F NMR (ACETONE D6 , 400 MHz) δ (ppm): -117.6
1.10: Préparation de (l-(3,6,9,12-tetraoxapentadec-14-ynyl)-lH-l,2,3-triazol-4-yl)bis(4- chlororophenyl) méthanol (7h)
Même procédure que pour la synthèse du composé (7g).
0.21g de FE015-C1 (0.42mmol ; léq.) ; 33.57mg de NaH (60%) (0.82mmol ; 2éq.) ; 45.00ul de bromure de propargyle (80%>) (0.42mmol ; léq.) ; 10ml de THF anhydre.
On obtient 0.1 lg de composé (7h) sous forme d'une huile jaune.
- Rendement : 49%
-Rf (DCM/MeOH : 95/5) : 0.48
1H NMR (ACETONE D6 , 400 MHz) δ (ppm): 2.92 (s, 1H) ; 3.53 (m, 12H) ; 3.88 (t, 2H, J=8Hz) ; 4.15 (s, 2H) ; 4.55 (t, 2H, J=8Hz) ; 7.32 (d, 4H, J=8Hz) ; 7.45 (d, 4H, J=8Hz) ; 7.82 (s, 1H)
13C NMR (ACETONE D6, 75.4MHz) δ (ppm): 50.7 ; 58.5 ; 69.7 ; 69.9 ; 70.8 ; 70.9 ; 71.0 ; 71.1 ; 75.7 ; 76.4 ; 80.9 ; 124.5 ; 128.5 ; 129.8 ; 133.3 ; 146.5 ; 153.8.
B) Préparation des composés de formule I dans lesquels Ri représente un groupe de formule (IV)
Exemple 2 : Préparation de N1-((l-(3,6,9,12-tetraoxapentadec-14-ynyl)-lH-l,2,3-triazol- 4-yl)diphénylméthoxy)-N8-phényloctanediamide (8c)
Dans cet exemple, R3 est un modulateur épigénétique : SAHA
Dans 5 mL de DCM sec sous atmosphère d'azote sont ajoutés 7c (0,20 g ; 0,43 mmol ; 1 eq.) et une solution 2M de HC1 dans l'éther (0,43 mL ; 0,86 mmol, 2 eq.). La solution est mise à reflux 2 heures puis le solvant co-évaporé avec du toluène pour donner le chlorure intermédiaire sous forme d'huile. A une solution de SAHA (0,340 g; 0,129 mmol, 3 eq.) dans NEt3 sec (0,24 mL, 1,72 mmol, 4 eq.) dans 5 mL de ACN est ajouté à température ambiante le chlorure précédent dissous dans un minimum de ACN. La solution est agitée 12 heures à température ambiante. La solution est alors filtrée et lavée avec ACN pour récupérer le SAHA restant et le filtrat est concentré sous vide. Une purification du concentrât (chromatographie flash automatique, gel de silice, éluant DCM/EtOH/Et3N) donne la prodrogue 8c sous forme d'huile incolore (0,052 g ; 0,073 mmol ; 17%). L'alcool 7c restant est également récupéré.
Rf (DCM/EtOH/Et3N 94:5: 1)= 0,33
1H-NMR (acétone-dg, 400 MHz) : δ = 9,75 (s, 1H), 9,08 (s, 1H), 7,69-7,65 (m, 3H), 7,46- 7,41 (m, 4H), 7,34-7,25 (m, 8H), 7,04-7,00 (m, 1H), 4,57 (t, 2H, J= 5,1 Hz), 4,16 (d, 2H, J= 2,4 Hz), 3,88 (t, 2H, J= 5,2 Hz), 3,62-3,55 (m, 6H), 3,53-3,49 (m, 6H), 2,93 (t, 2H, J= 2,4 Hz), 2,31 (t, 2H, J= 7,5 Hz), 1,93 (t, 2H, J= 7,2 Hz), 1,60 (m, 2H), 1,39 (m, 2H), 1,25 (m, 2H), 1,12 (m, 2H).
Exemple 3 : Préparation de N1-((l-(3,6,9,12-tetraoxapentadec-14-ynyl)-lH-l,2,3-triazol- 4-yl)bis(4-methoxyphenyl)methoxy)-N8-phenyloctanediamide (8d)
Dans cet exemple, R3 est un modulateur épigénétique : SAHA
Dans 5 mL de DCM sec sous atmosphère d'azote sont ajoutés 7d 0,20 g (0,38 mmol ; 1 eq.) et une solution 2M de HC1 dans l'éther (0,38 mL ; 0,76 mmol ; 2 eq.). La solution devient rouge et est portée à reflux 2 heures. La solution est ensuite co-évaporée avec du toluène pour donner le chlorure intermédiaire sous forme d'huile rouge. A une solution de SAHA (0,302 g ; 1,14 mmol ; 3 eq.) et de NEt3 sec (0,21 mL ; 1,52 mmol ; 4 eq.) dans 5 mL de ACN sec est ajouté à température ambiante le chlorure précédent dissous dans un minimum de ACN. La couleur rouge disparaît après quelques minutes et la solution agitée 12 heures. La solution est filtrée et lavée avec CAN pour récupérer le SAHA restant et le filtrat concentré sous vide. Le concentrât est purifié (chromatographie flash automatique, gel de silice, éluant DCM/EtOH/Et3N) pour donner la prodrogue 8d sous forme d'huile visqueuse (0,054 g ; 0,070 mmol ; 18%). L'alcool 7d restant est également récupéré.
Rf (DCM/EtOH/Et3N 94:5: 1)=0,29
1H-NMR (aceétone-dg, 400 MHz): δ = 9,75 (s, 1H), 9,08 (s, 1H), 7,68-7,67 (m, 3H), 7,32- 7,25 (m, 6H), 7,04-7,00 (m, 1H), 6,87-7,85 (m, 4H), 4,57 (t, 2H, J= 5,1 Hz), 4,16 (d, 2H, J= 2,4 Hz), 3,88 (t, 2H, J= 5,2 Hz), 3,79 (s, 6H), 3,62-3,56 (m, 6H), 3,54-3,50 (m, 6H), 2,93 (t, 1H, J= 2,4 Hz), 2,31 (t, 2H, J= 7,5 Hz), 1,93 (t, 2H, J= 7,2 Hz), 1,60 (m, 2H), 1,39 (m, 2H), 1,25 (m, 2H), 1,12 (m, 2H).
Exemple 3.1 : préparation de N-phenyl-N'-[[l-[2-[2-[2-(2-prop-2-ynoxyethoxy) ethoxy] ethoxy] ethyl] triazol-4-yl]-bis(p-tolyl)methoxy] octanediamide 8e.
même méthode que pour 8d. solide blanc (26 mg, 0.04 mmol, 15%). TLC MeOH/DCM 5/95 Rf = 0.2; 1H NMR (400 MHz, DMSO-D6)□ = 10.16 (s, 1H), 9.83 (s, 1H), 7.78 (s, 1H), 7.57 (d, 2H, J = 8.0 Hz), 7.25 (t, 2H, J = 8. 0 Hz), 7.10 (dd, 8H, J = 8.0 Hz), 6.99 (t, 1H, J = 8.0 Hz), 4.48 (t, 2H, J = 4.0 Hz), 4.12 (s, 2H), 3.77 (t, 2H, J = 4.0 Hz), 3.48 (m, 13H), 2.28 (s, 6H), 1.79 (t, 2H, J= 8.0 Hz), 1.23 (t, 2H, J= 8.0 Hz), 1.17 (m, 4H), 1.02 (q, 4H, J= 8.0 Hz); 13C NMR (100 MHz, DMSO- D6) □ = 171.2, 170.0, 148.5, 139.3, 136.6, 128.6, 128.1, 128.0, 125.7, 122.8, 118.9, 86.8, 80.3, 77.1, 69.7, 69.6, 69.5, 69.4, 68.7, 68.5, 57.4, 49.2, 36.3, 32.1, 28.2, 24.7, 20.6; HRESI-MS: calcd. for [M+Na]+ (C42H53N507Na): 762.38372, found: 762.3837.
Exemple 3.2: Préparation de N1-((l-(3,6,9,12-tetraoxapentadec-14-ynyl)-lH-l,2,3-triazol- 4-yl)bis(4-fluorophenyl)methoxy)-N8-phenyloctanediamide (8g)
Dans un mélange de 42.00mg de composé (7g) (0.08mmol ; léq.) dans 0.50ml de toluène, ajouter, à température ambiante, 30.00ul de chlorure d'acétyle (0.42mmol ; 5éq.). Laisser agiter le mélange à reflux (100°C) pendant 2h.
Ensuite, évaporer sous vide le toluène dans le mélange.
Le chlorure intermédiaire obtenu est dilué dans un minimum d'ACN distillé et ajouté sur un mélange de 44.00 mg de SAHA (0.17mmol ; 2éq.) dans 2ml d'ACN distillé. Ajouter ensuite 47.00ul de EtsN distillée (0.34mmol ; 4éq.) et laisser le mélange agiter pendant 12h à température ambiante.
Le SAHA non réagit est filtré avec de l'ACN. Le mélange est évaporé sous vide et ensuite purifié par combi flash en utilisant des solvants secs (DCM/MeOH : de 0% à 5% en MeOH).
On obtient 24.00mg du produit (8g) sous forme d'un solide jaune.
L'alcool de départ (7g) est également récupéré.
- Rendement : 38%
-Rf (DCM/MeOH :95/5): 0.41
-MP : 132.FC
1H NMR (ACETONE D6 , 400 MHz) δ (ppm): 1.25 (m, 6H) ; 1.61 (t, 2H, J=8Hz) ; 1.94 (t, 2H, J=8Hz) ; 2.31 (t, 2H, J=8Hz) ; 2.93 (s, 1H) ; 3.52 (m, 12H) ; 3.89 (t, 2H, J=8Hz) ; 4.15 (s, 2H) ; 4.57 (t, 2H , J=8Hz) ; 7.02 (t, 3H, J=8Hz) ; 7.11 (t, 3H, J=8Hz) ; 7.45 (m, 4H) ; 7.65 (d, 2H, J=8Hz) ; 7.79 (s, 1H); 9.08 (s, 1H) ; 9.74 (s, 1H).
13C NMR (ACETONE D6, 75.4MHz) δ (ppm): 25.9 ; 33.3 ; 37.6 ; 50.8 ; 58.5 ; 69.7 ; 69.9 ; 70.9 ; 71.0 ; 71.1 ; 71.2 ; 71.3 ; 75.8 ; 80.8 ; 115.1 ; 115.3 ; 119.9 ; 123.8 ; 126.6 ; 129.4 ; 131.4 ; 131.5 ; 139.5 ; 140.6 ; 162.0 ; 171.9
19F NMR (ACETONE D6 , 400 MHz) δ (ppm): -116.1 Exemple 3.3: Préparation de N1-((l-(3,6,9,12-tetraoxapentadec-14-ynyl)-lH-l,2,3-triazol- 4-yl)bis(4-chlororophenyl)methoxy)-N8-phenyloctanediamide (8h)
Même procédure que pour la synthèse du composé (8g). 57.00mg de composé (7h) (0.1 lmmol ; léq.) ; 40.00ul de chlorure d'acétyle (0.53mmol ; 2éq.) ; 0.60 ml de Toluène ; 56.50mg de SAHA (0.2 lmmol ; 2éq.) ; 60.00ul de Et3N
(0.43mmol ; 4éq.) ; 3.00ml d'ACN.
On obtient 20mg du produit (8h) sous forme d'un solide jaune.
- Rendement : 24%
- Rf (DCM/MeOH : 95/5) : 0.34
- MP : 107.7°C
1H NMR (ACETONE D6 , 400 MHz) δ (ppm): 1.24 (m, 6H) ; 1.57 (t, 2H, J=8Hz) ; 1.92 (t, 2H, J=8Hz) ; 2.30 (t, 2H, J=8Hz) ; 2.93 (s, 1H) ; 3.53 (m, 12H) ; 3.87 (t, 2H, J=8Hz) ; 4.15 (s, 2H) ; 4.56 (t, 2H , J=8Hz) ; 7.00 (t, 1H, J=8Hz) ; 7.25 (t, 3H, J=8Hz) ; 7.45 (m, 6H) ; 7.64 (d, 2H, J=8Hz) ; 7.83 (s, 1H); 9.08 (s, 1H) ; 9.75 (s, 1H).
13C NMR (ACETONE D6, 75.4MHz) δ (ppm): 26.0 ; 37.6 ; 50.9 ; 58.6 ; 69.8 ; 70.0 ; 70.9 ; 71.0 ; 71.1 ; 71.2 ; 71.3 ;75.8 ; 80.8 ; 119.9 ; 123.8 ; 128.7 ; 129.4 ; 129.8 ; 131.1 ; 134.3 ; 140.6 ; 171.9
Exemple 4 : Préparation de N-(2-((l-(3,6,9,12-tétraoxapentadec-14-ynyl)-lH-l,2,3- triazol-4-yl)diphénylmethylamino)phényl)-4-acétamidobenzamide (9c)
Dans cet exemple, R3 est un modulateur épigénétique : CI-994
Dans 5 mL DCM sec sous atmosphère d'azote sont additionnés 7c (0,20 g; 0,43 mmol; 1 eq.) et une solution 2M de HCl dans l'éther (0,43 mL; 0,85 mmol; 2 eq.). La solution est portée à reflux 2 heures. La solution est ensuite co-évaporée avec du toluène pour donner le chlorure intermédiaire sous forme d'huile. A une solution de CI-994 (0,231 g ; 0,90 mmol ; 2 eq.) et Et3N sec (0,24 mL ; 1,72 mmol ; 4 eq.) dans 5 mL de CAN sec est ajouté sous azote à température ambiante le chlorure précédent dissous dans quelques mL de ACN. La solution est agitée 12h à température ambiante. Le solvant est évaporé sous vide. Le CI-994 n'ayant pas réagit est récupérer par précipitation d'une solution d'acétone et le résidu purifié (chromatographie flash, gel de silice, éluant DCM/MeOH/Et3N) pour donner le compose attendu 9c (0,142 mg; 0,17 mmol, 39%). L'alcool 7c n'ayant pas réagit est récupéré lors de la purification. 1H-NMR (acétone d6, 400 MHz): δ = 9,44 (bs, 2Η), 8,02 (d, 2H, J= 8,6 Hz), 7,82 (s, 1H), 7,77 (d, 2H, J= 8,7 Hz), 7,65 (m, 4H), 7,24 (m, 5H), 7,18 (m, 2H), 6,70 (dt, 1H, J= 1,6 Hz, J= 8,1 Hz), 6,61 (dt, 1H, J= 1,3 Hz, J= 7,5 Hz), 6,17 (dd, 1H, J= 1,1 Hz, J= 8,2 Hz), 6,12 (s, 1H), 4,50 (t, 2H, J= 5,2 Hz), 4,14 (d, 2H, J= 2,4 Hz), 3,79 (t, 2H, j= 4,9 Hz), 3,59 (m, 2H) , 3,55 (m, 2H), 3,48 (m, 4H), 3,43 (m, 4H), 2,92 (t, 1H, J= 2,4 Hz), 2,12 (s, 3H).
13C-NMR (acéetone-de, 100 MHz): δ = 169,31, 152,91, 146,48, 143,54, 141,89, 129,90, 129,46, 128,94, 128,80, 127,69, 127,45, 126,82, 126,50, 125,92, 119,22, 118,61, 118,08, 80,95, 75,79, 71,21, 71,17, 70,97, 70,24, 69,80, 65,74, 58,58, 50,89, 24,41, 22,93, 15,20, Exemple 5 : Préparation de N-(2-((l-(3,6,9,12-tétraoxapentadec-14-ynyl)-lH-l,2,3- triazol-4-yl)bis(4-méthoxyphényl)méthylamino)phényl)-4-acétamidobenzamide (9d)
Dans cet exemple, R3 est un modulateur épigénétique : CI-994
Dans 5 mL de DCM sec sous atmosphère d'azote sont ajoutés 7d (0,20 g; 0,38 mmol; 1 eq.) et une solution 2M de HC1 dans l'éther (0,38 mL; 0,76 mmol; 2 eq.). La solution devenue rouge est agitée 2 heures. Le mélange est co-évaporé sous vide pour donner le chlorure sous forme d'huile rouge. A une solution de 5 mL de CAN sec contenant le CI-994 (0,205 g ; 0,76 mmol ; 2 eq.) et Et3N sec (0,21 mL ; 1,52 mmol ; 4 eq.) le chlorure précédent dissous dans quelques mL de ACN est ajoutée à température ambiante. La couleur rouge disparaît en quelques minutes et la solution est agitée 12h à température ambiante. Après concentration sous vide, le résidu est repris à l'acétone et le CI-994 restant est précipité. La solution obtenue est concentrée et purifiée (chromatographie flash automatisée, gel de silice, éluant DCM/EtOH/Et3N) pour donner 9d (0,087 g ; 0,112 mmol ; 29%) sous forme d'huile rosée. L'alcool 7d n'ayant pas régit est aussi récupéré.
Rf (DCM/EtOH/Et3N 97:2: 1): 0,24
1H-NMR (acetone-dg, 400 MHz) J: δ = 9,47 (s, 1H), 9,42 (s, 1H), 8,02 (d, 2H), 7,78 (m, 3H), 7,51 (m, 4H), 7,24 (d, 1H), 6,79 (m, 4H), 6,73 (t, 1H), 6,62 (t, 1H), 6,19 (d, 1H), 5,99 (s, 1H), 4,49 (t, 2H), 4,14 (d, 2H), 3,80 (t, 2H), 3,73 (s, 6H), 3,59 (m, 2H), 3,55 (m, 2H), 3,48 (m, 4H), 3,43 (m, 4H), 2,92 (t, 1H), 2,12 (s, 3H). 13C-NMR (acetone-dg, 100 MHz): δ = 158,2, 152,4, 142,4, 140,9, 137,384, 129,0, 128,8, 128,3, 126,3, 125,6, 125,4, 124,5, 118,1, 117,6, 116,8, 116,6, 112,8, 79,8, 74,7, 70,1, 70,0, 69,8, 69,1, 68,7, 63,8, 57,5, 54,3, 49,7, 23,3,
Exemple 6: Préparation de N1-((l-(3,6,9,12-tetraoxapentadec-14-ynyl)-lH-l,2,3-triazol- 4-yl)bis(4-fluorophenyl)methoxy)phényl (21g)
Dans un mélange de 71.00mg de composé (7g) (0.14mmol ; léq.) dans 0.70ml de toluène, ajouter 50.30ul de chlorure d'acétyle (0.71mmol ; 5éq.). Porter ce mélange à reflux pendant 2h.
Le toluène est évaporé sous vide.
Le chlorure intermédiaire est dilué dans 5ml de THF. On ajoute à ce mélange 40.00mg de phénol (0.43mmol ; 3éq.) suivi de 80.00ul de Et3N (0.57mmol ; 4éq.) et de 5.00mg de DMAP
(0.04mmol ; 0.3éq.). Porter le mélange à reflux (63°C) et sous agitation pendant 12h.
Ajouter au mélange 20ml de DCM. La phase organique est lavée 3x10ml de H20, séchée, filtrée puis évaporée sous vide.
Le mélange est purifié par combi flash (Utilisation de solvants secs) : DCM/MeOH de 0% à
4% en méthanol.
On obtient 28mg du produit (10g) sous forme d'une huile transparente.
- Rendement : 34%
- Rf (DCM/MeOH : 95/5) : 0.46
1H NMR (ACETONE D6 , 400 MHz) δ (ppm): 2.92 (s, 1H) ; 3.45 (m, 12H) ; 3.79 (t, 2H,
J=8Hz) ; 4.15 (s, 2H) ; 4.52 (t, 2H , J=8Hz) ; 6.80 (m, 3H) ; 7.05 (m, 6H) ; 7.70 (m, 4H) ; 7.75 (s, 1H).
13C NMR (ACETONE D6, 75.4 MHz) δ (ppm): 50.8 ; 58.5 ; 69.7 ; 70.0 ; 70.9 ; 71.0 ; 71.1 ; 75.7 ; 80.8 ; 83.8 ; 115.3 ; 115.4 ; 120.8 ; 122.3 ; 126.4 ; 129.41 ; 130.3 ; 141.6 ; 150.2 ; 156.2 ; 161.4 ; 163.8
19F NMR (ACETONE D6, 400MHz) δ (ppm): -116.8
C) Préparation des composés de formule I dans lesquels RI représente un groupe de formule (III)
Exemple 6 : Préparation de l'azoture α-norbornenyl poly(oxyde d'éthylène) NB-PEO-N3 (13) (Schéma II)
Dans toute la description, NB-PEO signifie α-norbornenyl poly(oxyde d'éthylène)
SCHEMA II 6.1 : Préparation de NB-PEO (11)
Le macromonomère α-norbornenyl poly(oxyde d'éthylène) (NB-PEO) 11 a été obtenu par polymérisation par ouverture de cycle en métathèse de l'oxyde d'éthylène selon des protocoles expérimentaux décrits dans la littérature (Heroguez, V.; Breunig, S.; Gnanou, Y.; Fontanille, M., Macromolecules 1996, 29, (13), 4459-4464).
Le norbonène méthanol 10 (0,79 mL, 6,6 mmol), déprotoné avec du potassium de diphénylméthyl (9,5 mL, 0,61 mol.L"1), est utilisé comme amorceur pour polymériser 0,37 mol d'oxyde d'éthylène (18,5 mL). Après 48h, la polymérisation est désactivée par 3 mL de méthanol acidifié. Le NB-PEO 11 est précipité dans du diéthyl éther et séché sous vide (rendement 91 %) .
1H-NMR (ppm, CDC13, 400 MHz,) (relative intégral): δ=3.6 (262H, m), 4.3 (2H, m), 5.9-6.1 (2H, m).
6.2 : Préparation de NB-PEO-OMs (12)
3,68 g de NB-PEO lyophilisé 11 (1,22 mmol) sont dissous dans 40 mL de THF anhydre puis 4 équivalents de TEA (0,68 mL, 4,9 mmol) sont ajoutés. 3,5 équivalents de chlorure de méthanesulfonyl (0,33 mL, 4,3 mmol) sont additionnés sous courant d'azote. La solution est agitée à température ambiante pendant une nuit et filtrée sur fritté. Le macromonomère α-norbornenyl poly(oxyde d'éthylène) mésylé NB-PEO-OMs 12 obtenu est précipité dans 200mL de diéthyl éther, filtré sur fritté et séché sous vide (rendement 82%). 1H-NMR (ppm, CDCI3, 400 MHz,) (relative intégral): δ=3.0-3.1 (3H, s), 3.6 (262H, m), 4.3 (2H, m), 5.9-6.1 (2H, m).
6.3 Préparation de NB-PEO-N3 (13)
0,64g de NB-PEO-OMs 12 (0,21 mmol) et 70 équivalents d'azoture de sodium (0,95 g, 14,6 mmol) sont dissous dans 20mL de DMF puis agité à température ambiante pendant 40 h. 120 mL de dichlorométhane sont ensuite ajoutés et la solution est lavée cinq fois avec de l'eau (5*60 mL). La phase organique est séchée sur Na2S04 et filtrée sur fritté. Après évaporation du solvant par évaporateur rotatif, le résidu est dissous dans 25 mL de THF, précipité dans 150 mL de diéthyl éther et séché sous vide (rendement 86%).
1H-NMR (ppm, CDCI3, 400 MHz,) (relative intégral): δ=3.3 (2H, t), 3.6 (262H, m), 5.9-6.1 (2H, m).
Les composés de formule I dans lesquels Ri représente un groupe de formule (III) sont préparés selon le schéma III
SCHEMA III
Exemple 7 : Préparation de NB-PEO— Rhodamine B (15a) Dans cet exemple, R3 est une sonde de détection : Rhodamine B
1 équivalent de NB-PEO-N3 13 (333,4 mg, 0,110 mmol), 1,5 équivalents d'alcyne de Rhodamine B 14a (85 mg, 0,165 mmol) et 2 équivalents de PMDETA (46 pL, 0,286 mmol) sont dissous dans 10 mL d'une solution dégazée de dichlorométhane/éthanol (35/65% V/V) et placés sous atmosphère inerte. 2 équivalents de CuBr sont ajoutés à la solution. La solution est agitée à température ambiante durant 6 jours. Après 6 jours, le solvant est évaporé et le polymère est dissous dans lOmL de dichlorométhane. La phase organique est lavée 10 fois avec de l'eau puis séchée avec Na2S04, Le dichlorométhane est évaporé et le résidu est dissous dans 15 mL de THF, précipité dans lOOmL de diéthyl éther puis séché sous vide pour conduire au produit 15a.
Exemple 8 : Préparation de NB-PEO-Coumarine (15b)
Dans cet exem le, R3 est une sonde de détection : Coumarine
1 équivalent de NB-PEO-N3 13 (61,5 mg, 0,143 mmol), 2 équivalents d'alcyne de coumarine 14b (61 mg, 0,286 mmol) et 2 équivalents de PMDETA (0,06 mL, 0,286 mmol) sont dissous dans 10 mL d'une solution dégazée de dichlorométhane/éthanol (35/65%) V/V) et placés sous atmosphère inerte. 2 équivalents de CuBr sont ajoutés à la solution. La solution est agitée à température ambiante durant 6 jours. Après 6 jours, le solvant est évaporé et le polymère est dissous dans 20mL de dichlorométhane. La phase organique est lavée 10 fois avec de l'eau puis séchée avec Na2S04, Le dichlorométhane est évaporé et le résidu est dissous dans 15 mL de THF, précipité dans lOOmL de diéthyl éther puis séché sous vide pour conduire au composé 15b.
Exemple 9 : Préparation de NB-PEO-CI-994 (17c)
Dans cet exemple, R3 est un modulateur épigénétique : CI-994
1 équivalent de NB-PEO-N3 13 (523 mg, 0.133 mmol), 1.5 équivalents de 9c (exemple 4) (140 mg, 0.195 mmol) et 2 équivalents de PMDETA (54 μί, 0.26 mmol) sont dissous dans 5 mL de DMF dégazé et placés sous atmosphère inerte. 2 équivalents de CuBr sont ajoutés à la solution. . La solution est agitée à température ambiante durant 4 jours. Après 4 jours, le solvant est évaporé et le polymère est dissous dans 30mL de dichlorométhane. La phase organique est lavée 10 fois avec de l'eau puis séchée avec Na2S04. Le dichlorométhane est évaporé et le polymère est dissous dans 20 mL de THF, précipité dans lOOmL de diéthyl éther puis séché sous vide.
Exemple 10 : Préparation de NB-PEO-CI-994 (17d)
Dans cet exemple, R3 est un modulateur épigénétique : CI-994
Ce composé est synthétisé de la même manière que dans l'exemple 9 en faisant réagir le composé 13 avec le composé 9d ci-dessus décrit
Exemple 11 : Préparation de NB-PEO-SAHA (18c)
Dans cet exemple, R3 est un modulateur épigénétique : SAHA
Ce composé est synthétisé de la même manière que dans l'exemple 9. Exemple 12a : Préparation de NB-PEO-SAHA (18d)
Dans cet exemple, R3 est un modulateur épigénétique : SAHA
Ce composé est synthétisé de la même manière que dans l'exemple 9.
Exemple 12b : Préparation de NB-PEO-SAHA (18e)
Dans cet exemple, R3 est un modulateur épigénétique : SAHA
Ce composé est synthétisé de la même manière que dans l'exemple 9.
D) Préparation de composés de formule I dans lesquels Ri représente un groupe de formule (II) : composés de formule VII ou particules fonctionnelles avec sonde de détection (Rhodamine B 16a, coumarine 16b) ou modulateur épigénétique (CI-994 19c et 19d, SAHA 20c, 20d, 20e) Exemple 13 : Préparation des composés de formule VII
La copolymérisation de NB avec NB-PEO-N3 est effectuée à température ambiante dans un ballon de 100 mL, sous agitation et atmosphère inerte. Typiquement, 7 mg (8.5 10"6 mol) du catalyseur de Grubbs de lere génération sont dissous dans 3.6 mL d'une solution de dichlorométhane/éthanol dégazée (50/50% V/V). Le NB (0.28 g, 3 10"3 mol) et le NB-PEO- N3 (13) (0, 15 g, 3027 g.mol"1, 5.1 10"5 mol) sont dissous dans 5 mL d'une solution de dichlorométhane/éthanol dégazée (35/65%) V/V) et additionnés, sous argon, à la solution de catalyseur. La désactivation du milieu réactionnel est effectuée par ajout de 0.1 mL d'éthyl vinyl éther.
Les composés de formule VII sont ainsi obtenus.
La caractérisation colloïdale est obtenue par diffusion dynamique de la lumière et par imagerie (microscopie électronique à transmission). La caractérisation chimique est obtenue par résonnance magnétique nucléaire.
Exemple 14 : Préparation des composés 16a et 16b
Les composés sont réparés comme dans l'exemple 13 selon le schéma IV suivant :
16a,b
R = coumarine, rhodaminoyle
SCHEMA IV
Les composés 16a et 16b peuvent également être préparés selon le mode opératoire suivant : 0.85 équivalents (par rapport à la fonction azoture) d'alcyne de Rhodamine B (28 mg, 0.13 mmol) et 2 équivalents de PMDETA (6 μί, 0.03 mmol) sont dissous dans 1 mL de solution de dichlorométhane/éthanol dégazée (35/65%) V/V) puis placés sous atmosphère inerte. 2 équivalents de CuBr sont ajoutés à la solution. La solution est ajoutée à une dispersion de nanoparticules azotures précédemment synthétisée (exemple 13). La dispersion est placée sous agitation à température ambiante pendant 4 jours pour obtenir le composé 16a.
A titre d'exemple, le composé 16a suivant est préparé selon le schéma IV -1 suivant :
i— = of
o = 80 , p = 80, q = 470
iv : EtOH :CH2C12, 65 :35 v/v, CuBr 2 eq, PMDETA 2eq, 9c : 2eq v : Grubbs I catalyst, CH2C12/EtOH 65/65, température ambiante, 24h
Schéma IV-1
A titre d'exemple, le composé 16b suivant est préparé selon le même procédé
schéma IV -2
Exemple 15 : Préparation des composés 19c, 19d, 20c, 20d et 20e
Les composés sont préparés comme dans l'exemple 13 selon le schéma V suivant :
SCHEMA V Les composés 19c,d et 20c, d,e sont obtenus de la même manière a partir de NB-PEO- CI-994 (17c,d) ou NB-PEO-SAHA (18c,d,e) respectivement.
La caractérisation colloïdale est obtenue par diffusion dynamique de la lumière et par imagerie (microscopie électronique à transmission). La caractérisation chimique est obtenue par résonnance magnétique nucléaire.
A titre d'exem le, le composé 19c suivant est préparé selon le schéma VI :
PARTIE BIOLOGIQUE :
Exemple 16 : Tests d'hydrolyse du composé 9d de l'invention à pH 4,3 ; 5,3 et 7,3 (physiologique).
Le composé est placé en milieu acide (tampon citrate pour pH 4.3 et trisma pour pH 7.3) et la libération de CI-994 est suivie par HPLC.
Les résultats sont présentés dans les figures 3 A et 3B et montrent que les composés de l'invention sont hydrolysés rapidement à pH 4,3 et 5,3 (figure 3) et beaucoup plus lentement à pH physiologique.
Exemple 16.1 :
L'hydrolyse des composés de l'invention a été effectuée dans des solutions tampons (tampon citrate pour pH 4,3 et trisma pour pH 7.3) à pH=4,3 et à pH=7,3. La concentration des échantillons est à lmg/ml dans la solution : Acétonitrile à 80% et solution tampon à 20%.
Les différents résultats sont présentés ci-après.
Le terme stable défini un composé qui ne montre pas d'hydrolyse significative après plusieurs jours, notamment plus de quatre jours. Dans certains cas les mesures ont été allongées à 2 ou 3 semaines, voire un mois.
Le résultat obtenu avec le composé (8e) est particulièrement intéressant puisque le composé SAHA seul possède une demi- vie de moins d'une heure. Les particules de l'invention, en particulier comprenant SAHA, possèdent donc une demi-vie beaucoup plus importante à pH physiologique permettant une amélioration pour l'administration de cette molécule.
Dans le cas du produit 21g, le termes table signifie que le produit ne subit pas d'hydrolyse durant au moins 1 mois.
Exemple 17 : Viabilité cellulaire en présence des composés de l'invention
17.1 Culture cellulaire
Matériel biologique :
Lignées cellulaires humaines de mésothéliomes (Meso 4, Mesol3, Meso 34, Meso 56, Meso 76 et Meso 95B) et d'adénocarcinomes pulmonaires (ADCA ; ADCA 3, ADCA 72, ADCA 117 et ADCA 153) établies au laboratoire Inserm U892 à partir de liquides pleuraux de patients ponctionnés au CHU de Nantes (Hôpital Laënnec, St-Herblain).
Conditions de cultures :
Cellules adhérentes poussant en monocouche sur support plastique (flasques) dans du milieu de culture complet stérile dont la composition est la suivante:
RPMI 1640 (Gibco)
+ 10% Sérum de vœu fœtal préalablement traité par choc thermique (30 minutes à 56°C) + glutamine (2mM)
+ pénicilline (100 IU/mL) / streptomycine (100μg/mL)
Les cellules sont maintenues en incubateur à 37°C (5% de C02) sous atmosphère humide. Passage des cellules (80% de confluence) :
Rinçage des cellules du RPMI 1640 seul
Incubation à 37°C pendant 3-4 min avec de la trypsine/EDTA (2mL)
Neutralisation de la trypsine par ajout de lOmL de milieu complet
Comptage des cellules sur lame de Malassez
Ensemencement à la densité voulue pour les différentes applications.
17.2 Expériences de viabilité cellulaire
J0_: Le matin, aspirer le milieu de culture. Laver avec 2ml de PBS.
Ajouter 2,5ml de trypsine/EDTA. Laisser 3-4 minutes à 37°C.
Ajouter 10 ml de RPMI 10% SVF pénicilline (100U/ml), streptomycine (ΙΟΟμ^ηύ) et L- glutamine (2mM).
Dissocier les cellules par aspiration-refoulement.
Compter les cellules sur cellule de Malassez.
Ensemencer 5000 cellules par puit de plaque 96 puits dans 180μ1 de RPMI 10%> SVF pénicilline/streptomycine et Glutamine.
Il : Ajouter ΙΟμΙ d'Uptiblue (Interchim). Laisser 2h à 37°C
Lire au Typhoon (GE Healthcare).
Préparer les milieux de traitement des cellules : Composés à tester dans du RPMI 10%> SVF pénicilline/streptomycine et Glutamine.
Aspirer le milieu puis ajouter les milieux de traitement (180μ1). J4: Faire 2 lavages avec 180μ1 de RPMI 10% SVF pénicilline/streptomycine et Glutamine. Ajouter ΙΟμΙ d'Uptiblue. Laisser 2h à 37°C
Lire au Typhoon.
Utilisation du Typhoon :
Acquisition mode : Fluorescence
Set-up - Filtre 580 BP et PMT 350
Définition : 200μΜ
Plan focal : + 3mm Ces expériences permettent d'évaluer la toxicité des différents composés formant les nanoparticules fonctionnalisées ainsi que la libération des inhibiteurs HDAC (iHD) dans les cellules par mesure de la viabilité cellulaire. Les résultats sont notamment une diminution de la viabilité cellulaire en présence d'iHDAC libres. Ces expériences permettent également de définir la gamme de toxicité éventuelle des nanoparticules.
Exemple 18 : Internalisation des composés de l'invention
18.1 : BRET
Modèle cellulaire : Cellules Met-5 A (ATCC)
J0 : Le matin, aspirer le milieu de culture des cellules Met-5 A. Laver avec 2ml de PBS.
Ajouter 2,5ml de trypsine/EDTA. Laisser 3-4 minutes à 37°C.
Ajouter 10 ml de RPMI 10% S VF pénicilline (100U/ml), streptomycine (ΙΟΟμ^ηύ) et L- glutamine (2mM).
Dissocier les cellules par aspiration-refoulement.
Compter les cellules sur cellule de Malassez.
Ensemencer 200000 cellules par puits de plaque 6 puits dans 2ml de RPMI 10%> S VF pénicilline/streptomycine et Glutamine.
Jl : Transfection : phRluc-Cl BrD + pEYFP-Cl histone H3
Pour un puit de plaque 6 puits dans un eppendorf de 1 ,5ml :
- 600ng de phRluc-Cl BrD + 1500ng de pEYFP-Cl histone H3 dans ΙΟΟμΙ de RPMI brut.
- 600ng de phRluc-Cl BrD dans ΙΟΟμΙ de RPMI brut.
Ajouter 3μ1 d'attracten (Qiagen) directement dans le liquide. Homogénéiser en tapotant le tube avec le doigt.
Laisser 20 minutes à température ambiante. Pendant ce temps, changer le milieu des cellules ensemencées à J0 par 2ml de RPMI 10% SVF pénicilline/streptomycine et Glutamine.
Ajouter le mélange ADN/attracten (ΙΟΟμΙ) sur les cellules.
Laisser 24h à 37°c sous 5%> C02 et en atmosphère humide.
J2 : Laver le puit avec 1ml de PBS puis décrocher les cellules avec 300μ1 de trypsine/EDTA. Laisser 3-4 minutes à 37°C.
Ajouter 2 ml de RPMI 10% SVF pénicilline (100U/ml), streptomycine (100μg/ml) et L- glutamine (2mM). Dissocier les cellules par aspiration-refoulement.
Répartir 180μ1 de suspension cellulaire dans des puits de plaque 96 puits blanches (Optiplate, Berthold).
Après 6h à 37°c, commencer les traitements en ajoutant 20μ1 de milieu de traitements (RPMI 10% S VF pénicilline, streptomycine et L-glutamine) comprenant les composés à tester dix fois concentrés.
J3 : Sortir les cellules de l'incubateur et laver les cellules avec 45 μΐ de PBS à température ambiante.
Aspirer le PBS puis ajouter 45 μΐ de PBS.
Ajouter 5μ1 par puits de coelentérazine h (Interchim) à 25 μΜ.
Attendre 10 minutes à température ambiante.
Lire la plaque sur le Mithras (Berthold)
Logiciel : Microwin 2000
Programme : BRET
Paramètres : Lecture à 485nm pendant 1 seconde puis lecture à 530nm pendant 1 seconde.
La plaque est lue 5 fois.
Les 5 valeurs obtenues pour un puit sont moyennées.
Calcul du BRET :
((valeur 530nm phRluc-Cl BrD + pEYFP-Cl histone H3/valeur 480nm phRluc-Cl BrD + pEYFP-Cl histone H3)-(valeur 530nm phRluc-Cl BrD/valeur 480nm phRluc-Cl BrD)) x 1000
Unité : milli BRET unit (mBu)
Ces expériences permettent d'évaluer la libération des inhibiteurs HDAC (HDI) dans les cellules vivantes. Les résultats sont une augmentation du signal de BRET en présence d'HDI libres.
18.2 : Microscopie de fluorescence: Internalisation des nanoparticules
J0 : Mettre des lamelles coverglass dans des puits de plaque 12 puits.
Incuber les lamelles dans éthanol 100% (2mL/puits) pendant lh, éliminer et laisser évaporer sous la hotte (environ 15 à 30 min).
Rincer une fois au PBS : lmL de PBS par puits.
Mettre à sécher les lamelles sous la hotte (de 15 à 30 min). Aspirer le milieu de culture des cellules. Laver avec 2ml de PBS.
Ajouter 2,5ml de trypsine/EDTA. Laisser 3-4 minutes à 37°C.
Ajouter 10 ml de RPMI 10% S VF pénicilline (100U/ml), streptomycine (ΙΟΟμ^ηύ) et L- glutamine (2mM).
Dissocier les cellules par aspiration-refoulement.
Compter les cellules sur cellule de Malassez.
Ensemencer 50000 cellules par lamelles dans 1ml de RPMI 10% SVF pénicilline/streptomycine et Glutamine. Jl : Incuber les cellules avec 21 ^g/ml de nanoparticules rhodamine B dans 1ml de milieu de culture pendant 2h30 dans les conditions de culture cellulaire.
Les cellules sont lavées avec 1ml de PBS.
Les membranes des cellules sont marquées au PKH67 (Sigma) selon les instructions du fabricant.
Les cellules sont fixées au paraformaldéhyde 4%> (Sigma) dans le milieu de culture pendant 15 à 20 minutes à température ambiante contenant 1 μg/mL Hoechst (Sigma).
Rinçage avec 1ml de PBS par puits, 3 fois.
Rincer les lamelles dans l'eau puis montage dans solution de montage.
Montage des lamelles :
Mettre 5μΙ^ de ProLong® Gold (Molecular Probes) par lamelle sur la lame
A l'aide d'une aiguille et d'une pince, retirer la lamelle du puits, la plonger brièvement dans de l'eau stérile.
Faire attention au sens de dépôt de la lamelle de façon à ce que les cellules se trouvent entre lame et lamelle.
Fixation : une nuit à l'obscurité.
Ces expériences doivent permettre d'observer la présence de points rouges (nanoparticules couplés à la rhodamine B) à l'intérieure d'un liseré vert (membrane plasmique). Ceci confirmera l'internalisation des nanoparticules par les cellules. 18.3 :Microscopie de fluorescence : Colocalisation Nanoparticules et compartiments intracellulaires acides
J0 : Mettre des lamelles coverglass dans des puits de plaque 12 puits. Incuber les lamelles dans éthanol 100% (2mL/puits) pendant lh, éliminer et laisser évaporer sous la hotte (environ 15 à 30 min).
Rincer une fois au PBS : lmL de PBS par puits.
Mettre à sécher les lamelles sous la hotte (de 15 à 30 min).
Aspirer le milieu de culture des cellules. Laver avec 2ml de PBS.
Ajouter 2,5ml de trypsine/EDTA. Laisser 3-4 minutes à 37°C.
Ajouter 10 ml de RPMI 10% S VF pénicilline (100U/ml), streptomycine (ΙΟΟμ^ηύ) et L- glutamine (2mM).
Dissocier les cellules par aspiration-refoulement.
Compter les cellules sur cellule de Malassez.
Ensemencer 50000 cellules par lamelles dans 1ml de RPMI 10% SVF pénicilline/streptomycine et Glutamine.
Jl : Incuber les cellules avec 21^g/ml de nanoparticules rhodamine B dans 1ml de milieu de culture pendant 2h30 dans les conditions de culture cellulaire.
Les cellules sont lavées avec 1ml de PBS.
Les membranes des cellules sont marquées au PKH67 (Sigma) selon les instructions du fabricant.
Les cellules sont fixées au paraformaldéhyde 4%> dans le milieu de culture pendant 15 à 20 minutes à température ambiante à l'abri de la lumière (125μί de la solution mère à 32%
(Sigma) dans 1ml de milieu de culture) contenant 1 μg/mL Hoechst (Sigma).
Rinçage avec 1ml de PBS par puits, 3 fois.
Perméabilisation pendant 5 minutes à T°C ambiante: 800μί par puits de PBS IX Triton XI 00 0,05% Tween 0,05%.
Rinçage avec lmL de PBS par puits, 3 fois (1 rapide et 2 de 5min)
Saturation pendant 10 à 20mn dans 800μί de PBS+BSA 1%> (sans faire de rinçage)
Incubation avec l'anticorps primaire anti-LamPl (^g/ml) dilué dans 600μί de PBS pendant 90 mn à température ambiante.
Rinçage avec lmL de PBS par puits, 3 fois (1 rapide et 2 de 5min)
Incubation avec l'anticorps secondaire fluorescent (Cy5 souris (Jackson) au 1/200) dilué dans 600μί de PBS+ pendant 60mn à température ambiante et à l'obscurité.
Rinçage avec lmL de PBS par puits, 3 fois (1 rapide et 2 de 5min)
Rincer les lamelles dans l'eau puis montage dans solution de montage. Montage des lamelles :
Mettre 5μί de ProLong® Gold (Molecular Probes) par lamelle sur la lame
A l'aide d'une aiguille et d'une pince, retirer la lamelle du puits, la plonger brièvement dans de l'eau stérile.
Faire attention au sens de dépôt de la lamelle de façon à ce que les cellules se trouvent entre lame et lamelle.
Fixation : une nuit à l'obscurité.
Les figures 5A à 5C présentent les résultats obtenus avec les particules 16a de l'invention et montrent que les particules détectées dans la cellule co-localisent avec les vésicules lysosomiales et que par conséquent elles ont été internalisées par endocytose.
18.4 :Cytométrie en Flux (FACS)
J0 : Ensemencer les cellules en plaque 6 puits à la densité de 200000 cellules/puits dans du milieu RPMI 10% S VF pénicilline (100U/ml), streptomycine (100μg/ml) et L-glutamine (2mM).
Jl : Incuber les cellules avec des nanoparticules en suspension dans du milieu RPMI 10% SVF pénicilline (100U/ml), streptomycine (100μg/ml) et L-glutamine (2mM). (3,45 mg/mL) à 37°C ou sur glace pendant 2h30.
Récupérer les cellules dans le surnageant et les cellules adhérentes par trypsination
Culotter les cellules par centrifugation et faire 2 lavages avec du PBS froid pour éliminer toute trace de nanoparticules en suspension
Transférer les cellules dans des petits tubes FACS pour l'analyse en cytométrie en flux (cytomètre FACSCalibur/logiciel CellQuest Pro, BD Biosciences)
Mesurer la taille et la granulométrie des cellules à l'aide des canaux FSC (« Forward SCatter ») et SSC (« Side SCatter »)
Analyser les données obtenues à l'aide du logiciel FlowJo (Tree Star).
Exemple 19 : Biodistribution des nanovecteurs
Des souris nude femelles sont injectées avec 3 millions d'AK7 (ΙΟΟμΙ) en sous-cutanée sur le flanc gauche.
3 semaines après, 0,02 mg/g de souris (ΙΟΟμΙ) de solution de nanovecteurs marqués à la rhodamine B sont injectées dans une des veines de la queue préalablement dilatée dans de l'eau chaude. Pendant cette étape, les souris sont maintenues en contention. Les animaux sont euthanasiés par élongation.
la biodistribution des nano vecteurs est observée par imagerie de fluorescence entre lh et 1 semaine (Biospace Lab, Excitation : 580nm et Emission : 630nm).
Les images sont analysées avec le logiciel Photo vision + 1.3 (Biospace Lab).
Les résultats sont présentés dans la figure 6.
La figure 6 montre que 24h après l'injection, par voie intra- veineuse, des nano vecteurs (composés 16a, schéma IV-1 de l'exemple 14), on obtient une localisation très majoritairement au niveau de la tumeur et en quantité plus faible dans le foie.
Des études cinétiques de biodistribution montrent une concentration plasmatique initiale élevée, qui décroît rapidement après 1 heure. La même observation peut être faite dans les reins mais avec une quantité plus faible de composé 16a et encore plus faible dans les ovaires.
Le niveau détecté dans la rate et le cerveau n'est pas significatif comparé au contrôle.
Une plus grande quantité est détectée dans le foie mais le résultat principal est la très grande sélectivité pour la tumeur.
La décroissance rapide dans le sang comparée à l'accumulation progressive dans les tumeurs peut être expliquée par la distribution corporelle totale à des faibles niveaux dans les souris, presque tout le composé 16a étant finalement accumulé dans les tumeurs.
Ces résultats montrent que le composé 16a n'est pas éliminé par la rate, les reins ou le foie qui représentent les principales barrières biologiques pour la diffusion des nanoparticules.
La faible demi-vie des composés de l'invention dans le sang (moins de 6h) est corrélée à leur rapide accumulation dans la tumeur. Cette observation valide ainsi la compatibilité des nano vecteurs avec un ciblage de la tumeur par l'effet EPR et suggère que les propriétés structurales des composés de l'invention permet une dissémination hautement efficace de la tumeur par effet EPR.

Claims

REVENDICATIONS
1. Nanovecteurs constitués par des chaînes polymères Pi de formule générale (I) suivante :
dans laquelle: représente une chaîne polymère P, notamment une chaîne polymère P contenant environ 30 à 10000 unités monomères, identiques ou différentes, dérivées de la polymérisation d'alcènes monocycliques dont le nombre d'atomes de carbone constitutifs du cycle est d'environ 4 à 12, ou d'alcènes polycycliques dont le nombre total d'atomes de carbone constitutifs des cycles est d'environ 6 à 20,
- t représente 0 ou 1 ,
q est un entier compris de 1 à 10,
- u est un entier compris de 0 à 10,
- n représente 0 ou 1 ,
- v représente 0 ou 1 ,
- X représente O, NH ou S,
Ri et R'i représentent indépendamment l'un de l'autre, lorsque t = 1 , un groupe de formule (II) suivante :
où:
m et p représentent indépendamment l'un de l'autre un entier de 1 à 1000, en particulier 50 à 340, notamment 70 à 200
r représente est un entier compris de 0 à 10, préférentiellement 0 ou 1, ou,
Ri représente, lorsque t = 0 un groupe de formule (III) suivante relié à un alcène monocyclique ou un alcène polycyclique: dans laquelle le nombre d'atomes de carbone constitutifs du cycle de l'alcène monocyclique est d'environ 4 à 12, et le nombre total d'atomes de carbone constitutifs des cycles de l'alcène polycyclique est d'environ 6 à 20,
r, m et p étant tels que définis ci-dessus,
ou,
Ri représente lorsque t = 0, un groupe de formule (IV) suivante :
(IV) dans laquelle R4 représente : un groupe vinyle, un groupe éthyne, un groupe OR' ou SR", R' et R" représentant indépendamment l'un de l'autre, H, un alkyle en C1 -C20, un cycloalkyle en C3-C20, et m étant tel que défini ci-dessus,
r représente est un entier compris de 0 à 10, préférentiellement 0,
R2 et R'2 représentent indépendamment l'un de l'autre :
H ou un phényle substitué ou non par au moins :
o un alkyle en C1 -C20, un cycloalkyle en C3-C20,
o un alkoxy en C1 -C20,
o NRaRb où Ra et Rb représentent indépendamment l'un de l'autre H, un alkyle en C1 -C20, l'alkyle pouvant former un cycle avec le carbone en ortho de celui portant N, un cycloalkyle en C3-C20,
o N02,
o C02Rc, où Rc représente H, un alkyle en C1 -C20, un cycloalkyle en C3-
C2o, un benzyle substitué ou non,
o un acyle en C1 -C20,
notamment R2 et R'2 représentent le 2 ou 4-méthoxyphényle, le 2 ou 4- methylphényle, le phényle, le 2,4-diméthoxyphényle, et lorsque n = 0 et v = 1 , R3 est alors lié directement au carbone portant R2 et
R'2,
ou alors,
R2 et R'2 représentent ensemble, si n = 0 et v = 0, le cycle de formule (Va) suivante:
dans laquelle Y' représente :
o O,
o NRjRe où Rj et Re représentent indépendamment l'un de l'autre H, un alkyle en Ci-C2o, l'alkyle pouvant former un cycle avec le carbone ou 3', un cycloalkyle en C3-C2o, l'atome d'azote présentant une charge positive associée à un anion monovalent,
et Y représente
o OR', où R' représente H, un alkyle en Ci-C2o, un cycloalkyle en C3-C2o, o un alkyle en Ci-C2o, un cycloalkyle en C3-C2o,
o un alcoxy en Ci-C2o,
o NRfRg où Rf et Rg représentent indépendamment l'un de l'autre H, un alkyle en Ci-C2o l'alkyle pouvant former un cycle avec le carbone 1 ou 3, un cycloalkyle en C3-C2o,
o N02,
o C02Rc, où Rc représente H, un alkyle en Ci-C2o, un cycloalkyle en C3-C2o, un benzyle substitué ou non,
o un acyle en Ci-C2o,
dans laquelle A" représente un anion monovalent. R2 et R'2 représentent ensemble le cycle de formule (Vb) suivante, n = 1 et v = 1 :
et Yi et Y 2 représentent indépendamment l'un de l'autre :
o OR', où R' représente H, un alkyle en Ci-C2o, un cycloalkyle en C3-C2o, o un alkyle en Ci-C2o, un cycloalkyle en C3-C2o,
o un alcoxy en Ci-C2o,
o NRhRi où Rh et Ri représentent indépendamment l'un de l'autre H, un alkyle en Ci-C2o, Palkyle pouvant former un cycle avec le carbone 1 ou 3 dans la cas de Yi, et le carbone 1 ' ou 3' dans le cas de Y2, un cycloalkyle en C3-C2o, o N02,
o C02Rc, où Rc représente H, un alkyle en Ci-C2o, un cycloalkyle en C3-C2o, un benzyle substitué ou non,
o un acyle en Ci-C2o,
ou le cycle de formule (Vbb) suivante et n = 1 :
- R3 représente un principe actif, en particulier un modulateur épigénétique, une sonde de détection, notamment fluorescente ou radio émettrice, ou un peptide de pénétration cellulaire (PPC),
2. Nanovecteurs selon la revendication 1, dans lesquels les unités monomères sont dérivées de la polymérisation d'alcènes monocycliques, et sont de formule (ZI) suivante [CH-R5-CH] (ZI) dans laquelle R5 représente une chaîne hydrocarbonée de 2 à 10 atomes de carbone, saturée ou non.
3. Nanovecteurs selon la revendication 1 ou 2, dans lesquels les alcènes monocycliques dont sont issues les unités monomères sont :
- le cyclobutène conduisant à un polymère comprenant des unités monomères de formule (ZI a) suivante :
Zla
- le cyclopentène conduisant à un polymère comprenant des unités monomères de formule (Zlb) suivante :
- le cyclopentadiène conduisant à un polymère comprenant des unités monomères de formule Zlc) suivante
Zlc
- le cyclohexène conduisant à un polymère comprenant des unités monomères de formule (Zld) suivante
Zld
- le cyclohexadiène conduisant à un polymère comprenant des unités monomères de formule (Zle) suivante Zle
- le cycloheptène conduisant à un polymère comprenant des unités monomères de formule Zlf) suivante
Zlf
- le cyclooctène conduisant à un polymère comprenant des unités monomères de formule (ZI h) suivante
Zlh
- le cyclooctapolyène, notamment le cycloocta-l,5-diene conduisant à un polymère comprenant des unités monomères de formule (Zli) suivante
Zli
- le cyclononène conduisant à un polymère comprenant des unités monomères de formule (ZI j) suivante
Zlj - le cyclononadiène conduisant à un polymère comprenant des unités monomères de formule (Zlk) suivante
Zlk
- le cyclodécène conduisant à un polymère comprenant des unités monomères de formule (Zll) suivante
Zll
- le cyclodéca-l,5-diène conduisant à un polymère comprenant des unités monomères de formule (ZI m) suivante
Zlm
- le cyclododécène conduisant à un polymère comprenant des unités monomères de formule (Zln) suivante Zln
- ou encore l'acétate du 2,3,4,5-tétrahydrooxepin-2-yl, le cyclopentadécène, le paracyclophane, le ferrocenophane.
4. Nanovecteurs selon la revendication 1, dans lesquels les unités monomères sont dérivées de la polymérisation d'alcènes poly cycliques, et sont :
- de formule (Z2) suivante
■CH]= (Z2) dans laquelle ¾ représente
* un cycle de formule
dans laquelle :
. W représente -CH2-, ou un hétéroatome, ou un groupe -CHR7-, ou un groupe -CHR8-, R7 représentant une chaîne comprenant un polyoxyde d'éthylène de formule -(CH2-CH2-0)m , m étant tel que défini ci-dessus et Rs représentant une chaîne alkyle ou alcoxy en Ci à Cio,
. Wi et W2, indépendamment l'un de l'autre, représentent H, ou une chaîne R7, ou un groupe Rs susmentionnés, ou forment en association avec les atomes de carbone qui les portent un cycle de 4 à 8 atomes de carbone, ce cycle étant le cas échéant substitué par une chaîne R7 ou un groupe Rs susmentionnés,
. a représente une simple ou double liaison,
* ou un cycle de formule
W1 W2 dans laquelle :
. W représente -CH2-, ou un hétéroatome, ou un groupe -CHR7-, ou un groupe -CHR8-, R7 et R8 étant tels que définis ci-dessus,
. W' i et W'2, indépendamment l'un de l'autre, représentent -CH2-, ou un groupe -C(O), ou un groupe -COR7, ou un groupe -C-OR8, R7 et R8 étant tels que définis ci-dessus,
- de formule (Z3) suivante
dans laquelle R9 représente :
* un cycle de formule
W"
(W"1 ) (W"2)
ru \ Π2 dans laquelle :
. ni et n2, indépendamment l'un de l'autre, représentent 0 ou 1,
. W" représente -CH2-, ou un groupe -CHR7-, ou un groupe -CHR8-,
R7 et R8 étant tels que définis ci-dessus,
. W"i et W"2, indépendamment l'un de l'autre, représentent une chaîne hydrocarbonée de 0 à 10 atomes de carbone,
* ou un cycle de formule dans laquelle W" et W"a, indépendamment l'un de l'autre, représentent -CH2-, ou un groupe -CHR7-, ou un groupe -CHR8-, R7 et R8 étant tels que définis ci-dessus,
* ou un cycle de formule
dans laquelle W" et W"a, indépendamment l'un de l'autre, représentent -CH2-, ou un groupe -CHR7-, ou un groupe -CHR8-, R7 et R8 étant tels que définis ci-dessus.
5. Nanovecteurs selon la revendication 1 ou 4, dans lesquels les alcènes polycycliques dont sont issues les unités monomères sont :
- les monomères contenant un cycle cyclobutène conduisant à un polymère comprenant des unités monomères de formule (Z2a) suivante :
- les monomères contenant un cycle cyclopentène conduisant à un polymère comprenant des unités monomères de formule (Z2b) suivante : (Z2b)
- le norbornène (bicyclo[2,2,l]hept-2-ène) conduisant à un polymère mprenant des unités monomères de formule (Z2c) suivante :
(Z2c)
- le norbomadiène conduisant à un polymère comprenant des unités monomères de formule Z2d suivante :
(Z2d)
- le 7-oxanorbornène conduisant à un polymère comprenant des unités monomères de formule (Z2e) suivante :
(Z2e)
- le 7-oxanorbornadiène conduisant à un polymère comprenant des unités monomères de formule (Z2f) suivante :
(Z2f)
- le dimère du norbomadiène conduisant à un polymère comprenant des unités monomères de formule (Z3a) suivante : (Z3a)
- le dicyclopentadiène conduisant à un polymère comprenant des unités monomères de formule (Z3b) suivante :
(Z3b)
- le tetracyclododécadiene conduisant à un polymère comprenant des unités monomères de formule (Z3c) suivante :
(23c)
- ou le bicyclo[5,l,0]oct-2-ène, le bicyclo[6,l,0]non-4-ène.
6. Nanovecteurs selon l'une des revendications 1 à 5, dans lesquels les alcènes mono ou polycycliques dont sont issues les unités monomères sont :
- le norbornène (bicyclo[2,2,l]hept-2-ène) conduisant à un polymère comprenant des unités monomères de formule (Z2c),
- le tetracyclododécadiene conduisant à un polymère comprenant des unités monomères de formule (Z3c),
- le dicyclopentadiène conduisant à un polymère comprenant des unités monomères de formule (Z3b),
- le dimère du norbornadiène conduisant à un polymère comprenant des unités monomères de formule (Z3a),
- le cycloocta-l,5-diene conduisant à un polymère comprenant des unités monomères de formule (Zli).
7. Nanovecteurs selon l'une des revendications 1 à 6, dans lesquels le modulateur épigénétique est choisi parmi :
- un nucléoside, en particulier la cytidine, l'uridine, l'adénosine, la guanosine, la thymidine ou l'inosine,
les inhibiteurs d'histones déacétylase (HDI), en particulier le Zolinza® (SAHA), la trichostatine A (TSA), l'acide valproïque, MS-275 ou CI-994, ou les inhibiteurs d'ADN méthyltransférases (DNMTI), en particulier la 5- azacytidine, la 5 -aza-2'-deoxy cytidine et la zébularine.
8. Nanovecteurs selon l'une des revendications 1 à 6, dans lesquels la sonde de détection est choisie parmi une substance fluorophore, notamment la rhodamine B ou la fluorescéine, les coumarines, en particulier la 7-hydroxy-4- methylcoumarine, les bodipy, le texas red, les cyanines, en particulier le CY3 ou le CY5, ou une substance radio émettrice comme le "Technétium sous forme ligandée, ou des agents de contraste pour l'imagerie médicale comme les lanthanides (gadolinium).
9. Nanovecteurs selon l'une des revendications 1 à 6, dans lesquels le peptide de pénétration cellulaire est choisi parmi les polylysines, les polyarginines, les polylysines imidazolées, ou des mimétiques de poly glycines avec une chaîne porteuse d'un groupe terminal azoté 10. Nanovecteurs tels que définis dans l'une des revendications 1 à 9, pour une utilisation en tant que médicament et/ou agent diagnostic.
11. Nanovecteurs selon la revendication 10, pour leur utilisation dans le traitement et/ou le diagnostic de pathologies choisies parmi les maladies neurologiques, les processus inflammatoires, le cancer, les maladies du sang
12. Nanovecteurs selon la revendication 10, pour leur utilisation dans le traitement combinatoire de pathologies choisies parmi les maladies neurologiques, les processus inflammatoires, le cancer, les maladies du sang.
13. Composition pharmaceutique comprenant comme principe actif des nanovecteurs telles que défini dans l'une des revendications 1 à 9, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
14. Composition pharmaceutique selon la revendication 13, sous une forme susceptible d'être administrée par voie intraveineuse à une dose unitaire 5 mg à 500 mg.
15. Procédé de préparation de nanovecteurs constitués de chaîne polymères de formule générale (I) telles que définies dans l'une des revendications 1 à 9, comprenant une étape de polymérisation par métathèse d'ouverture de cycle et une étape de bioconjugaison.
16. Procédé de préparation de nanovecteurs constitués de chaîne polymères de formule générale (I) dans laquelle Ri est un groupe de formule générale (II) selon la revendication 15, caractérisé en ce que l'étape de polymérisation par métathèse d'ouverture de cycle est effectuée préalablement à l'étape de bioconjugaison.
17. Procédé de préparation de nanovecteurs selon la revendication 15 ou 16, dans lequel l'étape de polymérisation par métathèse d'ouverture de cycle est effectuée préalablement à l'étape de bioconjugaison, comprenant les étapes suivantes : a. Préparation d'un composé de formule générale (Vl-a) suivante comprenant un alcène monocyclique ou polycyclique et une fonction azoture :
Alcène
monocyclique
ou polycyclique
(Vl-a) m, r et p étant tels que définis dans la revendication 1 ,
b. Mise en œuvre de l'étape de polymérisation par métathèse d'ouverture de cycle en présence d'un catalyseur pour former un composé de formule (VII) comprenant des fonctions azotures en surface d'un polymère:
(VII) m, r, p et q étant tels que définis dans la revendication 1 ,
c. Préparation d'un composé de formule générale (VIII) comprenant une fonction alcyne :
dans laquelle n, m, R2, R'2 et R3 sont tel que définis dans la revendication 1 et s est un entier compris de 0 à 10, en particulier 0 ou 1 ,
d. Mise en œuvre de l'étape de bioconjugaison par mise en contact dudit composé de formule (VII) avec le composé de formule (VIII) en présence de cuivre pour obtenir des nanovecteurs constitués de chaîne polymérique de formule (I) dans laquelle Ri est un groupe de formule (II).
Procédé de préparation de nanovecteurs constitués de chaîne polymères de formule générale (I) dans laquelle Ri est un groupe de formule générale (II) et t = 1 , ou de formule générale (III) et t = 0, selon la revendication 15, dans lequel l'étape de bioconjugaison est effectuée préalablement à l'étape optionnelle de polymérisation par métathèse d'ouverture de cycle.
19. Procédé de préparation selon la revendication 18, comprenant les étapes suivantes :
a. Préparation d'un composé de formule générale (Vl-a) suivante comprenant un alcène monocyclique ou polycyclique et une fonction azoture :
Alcène
monocyclique
ou polycyclique
(Vl-a) m, r et p étant tel que défini dans la revendication 1 ,
Préparation d'un composé de formule générale (VIII) comprenant fonction alcyne :
dans laquelle n, m, R2, R'2 et R3 sont tels que définis dans la revendication 1 et s est un entier compris de 0 à 10,
c. Mise en œuvre de l'étape de bioconjugaison par mise en contact dudit composé de formule (Vl-a) avec le composé de formule (VIII) en présence de cuivre pour obtenir les composés de formule générale (I) dans laquelle t = 0 et Ri représente un groupe de formule (III). d. Optionnellement, mise en œuvre de l'étape de polymérisation par métathèse d'ouverture de cycle en présence d'un catalyseur pour former des nanovecteurs constitués de chaîne polymères de formule générale (I) dans laquelle Ri est un groupe de formule générale (II) et t
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