KR20220108680A - 단백질 고정화용 키토산 하이드로젤 캡슐 및 이의 제조방법 - Google Patents

단백질 고정화용 키토산 하이드로젤 캡슐 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 단백질 고정화용 키토산 하이드로젤 캡슐 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명의 제조방법으로 제조된 키토산 하이드로젤 캡슐, 키토산 하이드로젤 캡슐-폴리도파민 복합체 및 키토산 하이드로젤 비드-폴리도파민 복합체가 단백질 고정화 효율 및 단백질(효소)의 활성이 우수할 뿐만 아니라, 기계적 강도, 열안정성 및 장기 보관 안정성이 우수한 효과가 있다.

Description

단백질 고정화용 키토산 하이드로젤 캡슐 및 이의 제조방법{Chitosan hydrogel capsule for protein immobilization and preparing method thereof}
본 발명은 단백질 고정화용 키토산 하이드로젤 캡슐 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
생체촉매인 효소는 의약/식품/환경/대량합성 산업 등에 광범위하게 활용되고 있으나 안정성 결여, 높은 단가, 및 재사용의 어려움으로 효소를 유-무기 지지체에 고정화함으로써 위와 같은 문제를 상당 부분 해결할 수 있었고, 유기 지지체에 비해 화학적/기계적/생물학적 안정성 우위에 있는 다공성 구조를 갖는 실리카의 개발로 다양한 효소의 고정화 및 많은 양의 탑재가 가능해졌으나, 다단계 공정, 낮은 수율 및 높은 생산단가로 인해 대량생산이 어렵고, 독성이 있는 유화제의 사용, 다공 구조의 획일화 및 후처리의 복잡성 등의 문제점이 있다.
또한, 친환경적이고 생체적합성이 있는 전분, 셀룰로오스, 키토산(chitosan), 알긴산(alginate)과 같은 천연 고분자 하이드로젤(hydrogel)을 사용하여 효소 고정화용 담체를 제조하는 연구가 활발하게 진행되고 있으나, 이와 같은 기존의 천연고분자 하이드로젤은 기계적 강도가 약하고 부피를 많이 차지하여 응용분야에 제한이 있다. 그럼에도 불구하고, 기존의 식품공정용 효소 고정화 담체 제조법에서는 양이온 고분자인 키토산 비드 또는 음이온 고분자인 알긴산 비드를 주로 사용하고 있으나, (1)약한 기계적 강도, (2)약한 화학적 안정성, (3)낮은 부피 효율성, (4)낮은 효소 담지율 등의 문제점이 있다.
한편, 키토산 ((1-4)-2-아미노-데옥시-β-D-글루칸)의 전구체인 키틴은 주로 갑각류에서 생산되며 지구상에서 셀룰로오스 다음으로 두 번째로 풍부한 천연 다당류이다. 키토산은 키틴으로부터 다양한 정도의 N-탈아세틸화에 의해 생성된 N-아세틸-D-글루코사민(N-acetyl-D-glucosamine)과 D-글루코사민 (D-glucosamine)의 다중 양이온 선형 중합체이다. 키토산은 저렴하고 우수한 생체 적합성을 가지고 있으며 많은 수산화기와 아미노기를 포함하고 있는 무독성의 친환경적인 천연 생분해성 생체 고분자이다. 키토산은 키틴에 비해 용해성이 좋으며, 물에는 용해하지 않으나 아세트산(acetic acid), 개미산(formic acid), 젖산(lactic acid) 또는 아스코르브산(L-ascorbic acid) 등의 많은 유기산에 용해되어 점조한 용액을 얻을 수 있다. 특히, 탈아세틸화 정도에 따라 키토산에는 많은 단위당인 N-아세틸-D-글루코사민에 존재하는 아미노기가 양전하를 가진 아미노기(-NH3 +) 형태를 가지고 있어서, 인체 내에서 지방이나 콜레스테롤을 흡착하여 배설하고 강력한 항균작용을 나타낸다. 키토산은 많은 양전하를 가진 아미노기뿐만 아니라 다른 작용기도 있어서 표면이 친수성이고, 이들의 높은 화학적 반응성과 유연한 고분자 구조를 가진다. 또한 친환경, 생체적합성, 다양한 기능성의 특징을 가지고 있어서, 바이오, 의약, 식품, 환경 분야 등에 널리 사용되고 있다.
키토산은 식품공정용 효소 고정화 담체로 많이 사용되고 있으나, 구조적 안정성이 취약하여 효소와의 결합이 분리되는 단점 등은 여전히 해결되어야 할 과제로 남아 있다. 기존의 키토산 하이드로젤 비드 제조 방법은 젤화제로서 알칼리 용액을 사용하고 있는데, 이것은 산에 용해된 키토산 용액의 방울을 음이온성의 알칼리 용액에 떨어뜨림으로써 중화에 의한 겔화를 이용한 것이다. 그러나 떨어뜨리는 키토산 용액 방울 내부로 젤화 용액 속에 있는 수산화 음이온이 급속하게 침투하여 순간적으로 중화되기 때문에 최종 비드의 밀도 조절에 한계가 있다. 따라서 공극률이 매우 큰 수화 하이드로젤을 상업화하기에는 여러가지 문제를 야기하는 단점을 가지고 있다.
키토산 관련 효소 고정화 기술로 한국공개특허 제2008-0086977호에 소수성 개질된 고정화된 효소가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1297927호에 글루타알데하이드를 이용한 키토산 부직포에 트립신을 고정화하는 방법이 개시되어 있으나, 본 발명의 단백질 고정화용 키토산 하이드로젤 캡슐 및 이의 제조방법에 대해 개시된 바 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 단백질 고정화용 키토산 하이드로젤 캡슐 및 이의 제조방법을 제공하고, 본 발명의 제조방법으로 제조된 키토산 하이드로젤 캡슐이 단백질 고정화 효율 및 단백질(효소)의 활성이 우수할 뿐만 아니라, 기계적 강도, 열안정성 및 장기 보관 안정성이 우수하다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (1) 키토산을 유기산 용액에 첨가하여 키토산 용액을 제조하는 단계;
(2) 상기 단계 (1)에서 제조한 키토산 용액을 주사기에 넣은 후, 교반하고 있는 음이온성 계면활성제 용액에 방울방울 떨어뜨려 키토산과 음이온성 계면활성제의 이온성 상호작용으로 껍질(shell)이 형성된 키토산 하이드로젤 캡슐을 제조하는 단계;
(3) 상기 단계 (2) 이후에, 상기 키토산 하이드로젤 캡슐을 물로 세척하고, 수산화나트륨 용액에 첨가하여, 음이온성 계면활성제를 수산화 이온으로 치환하여 다공성의 키토산 하이드로젤 캡슐을 제조하는 단계; 및
(4) 상기 단계 (3) 이후에, 단백질을 포함하는 완충용액에 상기 제조한 다공성의 키토산 하이드로젤 캡슐을 첨가하고, 교반하여 단백질을 다공성의 키토산 하이드로젤 캡슐에 고정시키는 단계;를 포함하는 단백질이 고정된 다공성의 키토산 하이드로젤 캡슐의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 제조방법으로 제조한 단백질이 고정된 다공성의 키토산 하이드로젤 캡슐을 제공한다.
또한, 본 발명은 (1) 키토산을 유기산 용액에 첨가하여 키토산 용액을 제조하는 단계;
(2) 상기 단계 (1)에서 제조한 키토산 용액을 알칼리 용액과 혼합하여 키토산 하이드로젤 비드를 제조하는 단계;
(3) 상기 단계 (2) 이후에, 상기 제조된 키토산 하이드로젤 비드를 세척한 후, 염기성 용액에 첨가하고 교반하면서 도파민 용액을 주사기로 방울방울 떨어뜨려 비드 표면을 폴리도파민으로 코팅하는 단계; 및
(4) 단백질을 포함하는 완충용액에 상기 폴리도파민이 코팅된 키토산 하이드로젤 비드를 첨가하고 교반하여, 폴리도파민이 코팅된 키토산 하이드로젤 비드에 단백질을 고정시키는 단계;를 포함하는 단백질이 고정된 키토산 하이드로젤 비드-폴리도파민 복합체의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 제조방법으로 제조한 단백질이 고정된 키토산 하이드로젤 비드-폴리도파민 복합체를 제공한다.
본 발명은 단백질 고정화용 키토산 하이드로젤 캡슐 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 음이온 계면활성제 젤화와 순차적 알칼리 치환에 의해 제조된 키토산 하이드로젤 캡슐, 추가로 폴리도파민이 코팅된 키토산 하이드로젤 캡슐은 사용 목적에 적합하게 선택적으로 효소 고정화용 범용 지지체(또는 담체)로 활용될 수 있다. 따라서 이를 이용한 유용산물의 대량생산, 바이오센서 제조 공정 등에 효과적으로 이용될 있는 장점이 있다.
도 1은 종래 기술의 키토산 하이드로젤 비드와 본 발명의 키토산 하이드로젤 캡슐 제조의 차이점과 폴리도파민 코팅의 개념을 도시한 것이다.
도 2는 음이온 계면활성제인 SDS가 키토산과의 상호작용을 통해 키토산 하이드로젤 캡슐을 형성하고, 이어 SDS를 NaOH로 치환하여 키토산 하이드로젤 캡슐을 제조하는 방법을 도시한 것이다.
도 3은 제조예 1에 따라 제조된 키토산 하이드로젤 캡슐의 위상차 현미경 사진으로, (A)는 비교예로, 5g/ℓ SDS에서만 겔화하여 제조된 키토산 하이드로젤 캡슐(직경 1.52±0.13mm)의 위상차 현미경 사진이고, (B) 본 발명의 제조방법에 따른, 5g/ℓ SDS+0.05M NaOH에서, 순차적 겔화로 제조된 키토산 하이드로젤 캡슐(직경 1.49±0.08mm)의 위상차 현미경 사진이다.
도 4는 제조예 1에 따라 제조된 키토산 하이드로젤 캡슐의 SEM 사진이다. 하이드로젤 캡슐의 (A) 표면, (B) 횡단면 및 (C) 내부를 나타낸 사진이다.
도 5는 제조예 1에 따라 제조된 본 발명의 키토산 하이드로젤 캡슐에 고정화된 TeSADH 효소와 이의 유리(free) 효소의 NADPH 생산 활성 비교 분석결과이다. 키토산 하이드로젤 캡슐 A(5g/ℓ SDS 겔화+0.05M NaOH 치환) 및 키토산 하이드로젤 캡슐 B(20g/ℓ SDS 겔화+0.05M NaOH 치환)에 고정화된 (A) 이중 돌연변이 DM TeSADH 효소이고, (B) 삼중 돌연변이 (N245A) TeSADH 효소이다.
도 6은 제조예 1에 따라 제조된 키토산 하이드로젤 캡슐에 고정화된 N245A TeSADH 효소의 실제 사용예로 아세토페논의 비대칭 환원 반응을 유리 효소의 경우와 비교하여 GC로 분석한 결과이다. N245A 효소는 아세토페논을 (R)-1-페닐-1-에탄올로 전환한다(체류 시간=4.766-4.844분). 작동 조건은 오븐 온도: 150℃, 주입 온도: 200℃, 유속: 3.0㎖/min, 최종 온도: 180℃, 검출기 온도: 250℃로 설정하였다.
도 7은 제조예 1에 따라 제조된 키토산 하이드로젤 캡슐 A에 고정화된 TeSADH와 이의 유리 효소의 80℃에서 열안정성을 잔류 활성을 측정하여 나타낸 결과이다. (A) 이중 돌연변이 DM TeSADH 효소이고, (B) 삼중 돌연변이(N245A) TeSADH 효소이다.
도 8은 폴리도파민 코팅에 따른 고정화 DM TeSADH 효소의 활성을 비교하여 나타낸 결과이다. 각 캡슐 설명은 표 2를 참고한다.
도 9는 폴리도파민 코팅에 따른 키토산 하이드로젤 캡슐에 고정화된 DM TeSADH 효소의 75℃에서의 열안정성을 확인한 결과로, 모든 흡광도 값은 이중 실험 데이터의 평균이다.
도 10은 폴리도파민 코팅에 따른 키토산 하이드로젤 캡슐에 고정화된 DM TeSADH 효소의 60℃에서의 열안정성을 나타낸 결과로, 모든 흡광도 값은 삼중 실험 데이터의 평균이다.
도 11은 폴리도파민 코팅에 따른 키토산 하이드로젤 캡슐에 고정화된 DM TeSADH 효소의 25℃에서의 장기 보관 안정성을 나타낸 결과로, 모든 흡광도 값은 삼중 실험 데이터의 평균이다.
도 12는 폴리도파민 코팅에 따른 키토산 하이드로젤 캡슐과 비드에 고정화한TeSADH 효소의 활성 비교를 나타낸 결과이다.
본 발명은 (1) 키토산을 유기산 용액에 첨가하여 키토산 용액을 제조하는 단계;
(2) 상기 단계 (1)에서 제조한 키토산 용액을 주사기에 넣은 후, 교반하고 있는 음이온성 계면활성제 용액에 방울방울 떨어뜨려 키토산과 음이온성 계면활성제의 이온성 상호작용으로 껍질(shell)이 형성된 키토산 하이드로젤 캡슐을 제조하는 단계;
(3) 상기 단계 (2) 이후에, 상기 키토산 하이드로젤 캡슐을 물로 세척하고, 수산화나트륨 용액에 첨가하여, 음이온성 계면활성제를 수산화 이온으로 치환하여 다공성의 키토산 하이드로젤 캡슐을 제조하는 단계; 및
(4) 상기 단계 (3) 이후에, 단백질을 포함하는 완충용액에 상기 제조한 다공성의 키토산 하이드로젤 캡슐을 첨가하고, 교반하여 단백질을 다공성의 키토산 하이드로젤 캡슐에 고정시키는 단계;를 포함하는 단백질이 고정된 다공성의 키토산 하이드로젤 캡슐의 제조방법에 관한 것이다.
상기 유기산 용액은 아세트산, 뷰티르산, 옥살산, 타르타르산, 아스코르브산 및 벤조산 중에서 선택된 어느 하나인 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 아세트산이지만 이에 한정하지 않는다. 상기 음이온성 계면활성제는 소듐 도데실설페이트(sodium dodecyl sulfate:SDS)인 것이 바람직하지만 이에 한정하지 않는다.
상기 키토산 용액은 0.1~2.0%(w/v)의 키토산 용액인 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 0.5~1.0%(w/v)의 키토산 용액이지만 이에 한정하지 않는다.
상기 단계 (3)과 단계 (4) 사이에, 상기 제조된 다공성의 키토산 하이드로젤 캡슐을 염기성 용액에 첨가하고, 교반하면서 도파민 용액을 주사기로 방울방울 떨어뜨려 다공성의 키토산 하이드로젤 캡슐의 표면을 폴리도파민으로 코팅하는 단계; 더 포함할 수 있으며, 다공성의 키토산 하이드로젤 캡슐의 표면에 폴리도파민을 더 코팅하는 경우, 키토산 및 도파민은 1:10~30의 중량비로 도파민을 코팅하는 것이 바람직하지만 이에 한정하지 않으며, 상기 폴리도파민을 코팅한 후, 추가로 중금속 코팅 또는 표면 개질하는 단계;를 더 포함할 수 있다.
상기 단백질이 고정된 다공성의 키토산 하이드로젤 캡슐의 제조방법은 바람직하게는
(1) 키토산을 아세트산 용액에 첨가하여 키토산 용액을 제조하는 단계;
(2) 상기 단계 (1)에서 제조한 키토산 용액을 주사기에 넣은 후, 교반하고 있는 소듐 도데실설페이트 용액에 방울방울 떨어뜨려 키토산과 소듐 도데실설페이트의 이온성 상호작용으로 껍질(shell)이 형성된 키토산 하이드로젤 캡슐을 제조하는 단계;
(3) 상기 단계 (2) 이후에, 상기 키토산 하이드로젤 캡슐을 물로 세척하고, 수산화나트륨 용액에 첨가하여, 소듐 도데실설페이트를 수산화 이온으로 치환하여 다공성의 키토산 하이드로젤 캡슐을 제조하는 단계;
(4) 상기 단계 (3) 이후에, 상기 제조된 다공성의 키토산 하이드로젤 캡슐을 염기성 용액에 첨가하고, 교반하면서 도파민 용액을 주사기로 방울방울 떨어뜨려 캡슐의 표면을 폴리도파민으로 코팅하는 단계; 및
(5) 단백질을 포함하는 완충용액에 상기 제조한 다공성의 키토산 하이드로젤 캡슐을 첨가하고 교반하여, 다공성의 키토산 하이드로젤 캡슐에 단백질을 고정시키는 단계;를 포함하지만 이에 한정하지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 단백질 고정화용 다공성의 키토산 하이드로젤 캡슐에 관한 것이다.
상기 단백질은 효소, 수용체 단백질 또는 폴리펩티드인 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 효소지만 이에 한정하지 않으며, 상기 단백질은 흡착 또는 공유결합을 통해 고정화될 수 있다.
폴리도파민이 코팅된 경우, 중금속의 추가 코팅 또는 추가로 표면 개질하는 단계를 도입할 수 있으므로, 단백질 이외에 다양한 물질의 흡착 또는 부착을 위한 용도로도 활용할 수 있다.
또한, 본 발명은 (1) 키토산을 유기산 용액에 첨가하여 키토산 용액을 제조하는 단계;
(2) 상기 단계 (1)에서 제조한 키토산 용액을 알칼리 용액과 혼합하여 키토산 하이드로젤 비드를 제조하는 단계;
(3) 상기 단계 (2) 이후에, 상기 제조된 키토산 하이드로젤 비드를 세척한 후, 염기성 용액에 첨가하고 교반하면서 도파민 용액을 주사기로 방울방울 떨어뜨려 비드 표면을 폴리도파민으로 코팅하는 단계; 및
(4) 단백질을 포함하는 완충용액에 상기 폴리도파민이 코팅된 키토산 하이드로젤 비드를 첨가하고 교반하여, 폴리도파민이 코팅된 키토산 하이드로젤 비드에 단백질을 고정시키는 단계;를 포함하는 단백질이 고정된 키토산 하이드로젤 비드-폴리도파민 복합체의 제조방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 본 발명의 제조방법으로 제조한 단백질이 고정된 키토산 하이드로젤 비드-폴리도파민 복합체에 관한 것이다.
이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
제조예 1. 0.5%(w/v) 키토산 용액을 이용한 다공성의 키토산 하이드로젤 캡슐의 제조
본 발명에서 사용한 키토산(>85% 탈아세틸화) 및 SDS는 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)에서 구입하였으며, 다른 모든 화학 물질은 분석 등급을 사용하였다.
키토산 분말 0.5g을 5%(v/v) 아세트산 용액 20㎖에 첨가하고, 2시간 동안 용해시키고, 최종부피가 100㎖가 되도록 증류수를 첨가한 후, 30℃의 진탕 배양기에서 24시간 동안 150rpm으로 지속적으로 진탕하여 최종 1%(v/v) 아세트산 용액에 녹인 0.5%(w/v) 키토산 용액을 제조하였다. 이후 2.5M NaOH를 사용하여 상기 키토산 용액의 pH를 pH ~6으로 조정하였다.
상기 키토산 용액 10㎖(키토산 0.05g에 해당)을 주사기에 넣고 0.1㎖/min 정도의 유속으로(대략 방울 당 20㎕ 정도의 부피) 천천히 교반되고 있는 5g/ℓ 및 20g/ℓ의 음이온성 계면활성제인 SDS 용액 200㎖에 각각 적하한 후, 실온에서 3시간 동안 150rpm 정도로 교반하여 안쪽은 수상이고, 바깥쪽은 키토산이 껍질(shell)을 형성한 하이드로젤 캡슐을 제조하였다.
제조된 키토산 하이드로젤 캡슐을 거름종이로 여과하고 증류수로 3회 세척하여 키토산 하이드로젤 캡슐 표면에 남아있는 잔여 SDS를 제거한 후, 실온에서 상기 제조된 키토산 하이드로젤 캡슐을 0.05M의 NaOH 용액에서 3시간 동안 천천히 교반하며 키토산 하이드로젤 캡슐의 바깥쪽 껍질에서 키토산과 이온결합하고 있는 SDS를, 수산화 이온(OH-)으로 치환하였다. 이후, 거름종이에 여과하고 증류수로 수차례 세척하여, 잔여 수산화나트륨과 SDS를 제거하였다. 이 과정에서 SDS보다 크기 작은 수산화 이온으로 치환되면서 공간이 형성되어, 다공성의 키토산 하이드로젤 캡슐을 획득하였다(도 1 및 2).
상기 다공성의 키토산 하이드로젤 캡슐은 TeSADH 효소 고정화 담체로 사용하는 경우는 저장 완충용액에, 폴리도파민을 추가로 코팅하는 경우는 증류수에 넣어 각각 보관하였다.
제조예 2. 1%(w/v) 키토산 용액을 이용한 효소 고정화용 키토산 하이드로젤 캡슐의 제조
본 제조예 2는 하기 조건을 제외한 나머지는 제조예 1과 동일한 방법으로 제조하였다.
키토산 분말 1g을 5%(v/v) 아세트산 용액 40㎖에 첨가하여 1차적으로(약 2시간 정도) 용해시킨 후, 최종 부피가 100㎖가 되도록 증류수를 첨가한 후, 30℃ 진탕 배양기에서 24시간 동안 150rpm으로 진탕한 후 추가적으로 35℃에서 6시간 동안 더 진탕하여 최종 농도 2%(v/v) 아세트산 용액에 녹인 1%(w/v) 키토산 용액을 제조하였다.
본 제조예 2에서는 제조예 1과는 달리, 2.5M NaOH를 사용하여 상기 1%(w/v) 키토산 용액을 pH ~6으로 조정하는 단계를 생략하였다.
1%(w/v) 키토산 용액 10㎖(키토산 0.1g에 해당)을 주사기에 넣은 후, 0.1㎖/min 정도의 유속으로(대략 방울 당 20㎕ 정도의 부피) 천천히 교반되고 있는 5g/ℓ의 음이온성 계면활성제인 SDS 용액 200㎖에 각각 적하한 후, 실온에서 3시간 동안 150rpm 정도로 교반하여 키토산 하이드로젤 캡슐을 제조하였다.
제조예 3. 효소 고정화용 키토산 하이드로젤 캡슐의 제조
제조예 2와 마찬가지로, 최종 농도 2%(v/v) 아세트산 용액에 녹인 1%(w/v) 키토산 용액을 제조한 후, 역시 pH ~6으로 조정하는 단계를 생략하였다. 이후, 제조예 1 방법에 따라 1%(w/v) 키토산 용액 10㎖ (키토산 0.1g에 해당)을 주사기에 넣어, 0.1㎖/min 정도의 유속으로(대략 방울 당 20㎕ 정도의 부피) 천천히 교반되고 있는 5g/ℓ의 SDS 용액 200㎖에 각각 적하한 후, 실온에서 3시간 동안 150rpm 정도로 교반하여 키토산 하이드로젤 캡슐을 제조하고, NaOH 용액에서 SDS를 수산화 이온으로 치환하였다.
본 제조예 3에서 제조한 키토산 하이드로젤 캡슐은 폴리도파민 코팅 단계를 추가로 진행하기 위하여 증류수에 넣어 보관하였다. 본 제조예 3은 키토산 하이드로젤 캡슐의 강도를 좀 더 증가시키기 위한 목적을 달성하기 위해서 일반적으로 키토산 하이드로젤 제조에 사용되는 1%(w/v) 키토산 용액을 사용하였다.
제조예 4. 알칼리성 겔화 용액을 이용한 알칼리 키토산 하이드로젤 비드의 제조
제조예 2와 마찬가지로 최종 농도 2%(v/v) 아세트산 용액에 녹인 1%(w/v) 키토산 용액을 제조한 후, 역시 pH ~6으로 조정하는 단계를 생략하였다.
제조예 2와 다르게 SDS 용액을 젤화제로 사용하는 대신에 알칼리성 겔화 용액을 사용하여 다음과 같이 진행하여 제조하였다. 상기 제조된 1%(w/v) 키토산 용액 10㎖ (키토산 0.1g에 해당)을 주사기에 넣고 0.1㎖/min 정도의 유속으로 수산화나트륨 10중량%, 메탄올 50중량%, 증류수 40중량%로 구성된 천천히 교반되고 있는 알칼리성 겔화 용액 200㎖에 떨어뜨려 키토산 입자를 제조하였다. 실온에서 3시간 동안 천천히 교반하며 방치한 이후 제조된 키토산 입자를 거름종이에 여과하고 증류수로 수차례 세척하여, 잔여 수산화나트륨과 메탄올을 제거하였다. 완성된 알칼리 키토산 비드는 폴리도파민 코팅 단계를 추가로 진행하기 위하여 증류수에 넣어 보관하였다.
제조예 5. 폴리도파민이 코팅된 효소 고정화용 키토산 하이드로젤 캡슐 및 비드의 제조
상기 제조예 1, 2 및 3의 방법에 따라 각각 제조한 키토산 하이드로젤 캡슐에 추가로 폴리도파민을 코팅하는 단계를 추가하였다.
키토산 용액 10㎖을 사용하여 상기 제조예 1(키토산 0.05g에 해당), 제조예 2(키토산 0.1g에 해당) 및 제조예 3(키토산 0.1g에 해당)에 따라 각각 제조한 키토산 하이드로젤 캡슐을 증류수가 담긴 비이커에 각각 넣고, 암모니아수를 이용하여 pH 8.5~9 정도로 만들어 준 후 실온에서 서서히 교반하였다.
여기에, 도파민 1g을 증류수 10㎖에 녹여, 주사기에 넣고 0.1㎖/min 정도의 유속으로 방울로 적하시키고, 4시간 정도 추가로 교반한 후, 24시간 정도 더 정체시켜 방치하여 폴리도파민이 코팅된 키토산 하이드로젤 캡슐을 제조하였다.
폴리도파민 코팅된 키토산 하이드로젤 캡슐을 꺼내어 잔여 도파민을 제거하고 pH 7이 되도록 증류수로 수차례 세척한 후, 효소 고정화 담체로 사용하기 위하여 저장 완충용액에 넣어 각각 보관하였다.
상기의 방법으로 제조된 폴리도파민 코팅 하이드로젤 캡슐을 각각 제조예 1-D1(중량비, 키토산:도파민=1:20), 제조예 2-D1(1:10), 제조예 3-D1(1:10)이라고 표기하였다.
상기 제조예 1의 방법에 따라 제조한 키토산 하이드로젤 캡슐의 경우, 추가적으로 0.5g 및 1.5g의 도파민을 증류수 10㎖에 각각 녹인 용액을 사용하여 폴리도파민 코팅을 상기의 방법으로 수행하여, 각각 제조예 1-D0.5(1:10) 및 제조예 1-D1.5(1:10)라고 표기하였다.
또한, 상기 제조예 4에 따라 제조한 알칼리 키토산 하이드로젤 비드(키토산 0.1g에 해당)의 경우는 상기의 제조예 3-D1 캡슐의 경우와 동일한 조건으로 폴리도파민 코팅을 하였다.
도파민 1g을 증류수 10㎖에 녹인 용액을 사용하여, 결과적으로 키토산:도파민의 중량비 1:10으로 알칼리 키토산 하이드로젤 비드에 폴리도파민 코팅을 상기의 방법으로 실시하였다.
실시예 1. 제조예 1 및 2의 방법에 따라 제조된 키토산 하이드로젤 캡슐의 구조적 특성 분석
제조예 1 방법에 따라 제조된 다공성의 키토산 하이드로젤 캡슐과 제조예 2 방법에 따른 5g/ℓ의 SDS 용액에서 제조된 키토산 하이드로젤 캡슐의 광학 현미경 사진을 위상차 현미경(Nikon Infinity I, Japan)을 사용하여 촬영하여 캡슐 사이의 형태학적 특성과 차이를 규명하였다.
그 결과, 5g/ℓ의 SDS 용액에서 제조된 키토산 하이드로젤 캡슐의 평균직경은 1.52±0.13mm이고, 제조예 1에 따른 다공성의 키토산 하이드로젤 캡슐의 평균직경은 1.49±0.08mm으로 확인되었다(도 3).
이후, 제조예 1에 따른 다공성의 키토산 하이드로젤 캡슐을 액체 질소로 동결 건조하여 JSM-6390 주사 전자 현미경(SEM) (미국 Oxford Instruments)으로 그 표면 및 내부 구조적 특성을 관찰하였다.
그 결과, 도 4에 개시한 바와 같이 TeSADH(Thermoanaerobacter ethanolicus secondary alcohol dehydrogenase) 효소의 적절한 흡착을 위한 다공성 표면이 확인되었다. 날카로운 면도날을 사용하여 캡슐을 절단하여 확인한 단면도(도 4B)는 제조된 하이드로젤의 다층 특성을 나타내고, 하이드로젤 캡슐의 단면 일부의 내부 형태를 나타낸 도 4C로부터 효소 포획 방법에 의한 효소 고정화에 사용할 경우 캡슐 내부 물질 전달 저항이 일어날 수 있는 내부 층을 확인하였다.
실시예 2. 제조예 1 방법에 따른 다공성의 키토산 하이드로젤 캡슐에 TeSADH 효소 고정화 및 효소의 탑재 효율 분석
돌연변이 TeSADH 효소는 E. coli DH5α 세포에서 발현시킨 후 정제하여 사용하였다. 이중 돌연변이(C295A/I86A; DM TeSADH)) 및 삼중 돌연변이 (N245A/C295A/I86A; N245A TeSADH), 이렇게 두 종류의 TeSADH 돌연변이 효소를 모델 효소로 사용하여 제조예 1에 따라 제조한 키토산 하이드로젤 캡슐에 고정시켰다. 효소 흡착 과정은 저장 완충용액(10μM ZnCl2가 포함된 50mM Tris-HCl 완충용액, 60℃, pH 8.9) 4㎖이 들어있는 15㎖의 튜브에, 제조예 1에서 제조한 다공성의 키토산 하이드로젤 캡슐 20개를 넣고, 200㎕의 효소(1.2~2mg)를 첨가하여 30℃, 120rpm에서 4시간 동안 서서히 진탕하였다. 효소를 고정한 다공성의 키토산 하이드로젤 캡슐을 저장 완충용액으로 7번 정도 세척한 후 저장 완충용액에 보관하였다.
결합 및 결합되지 않은 효소의 양은 소 혈청 알부민(BSA)을 표준으로 사용하는 Bio-Rad 단백질 분석으로 확인하였으며, 다공성의 키토산 하이드로젤 캡슐에 대한 효소의 탑재 효율을 (식 1)을 이용하여 계산하였다.
[식 1]
탑재 효율(Loading efficiency)(%)=[결합된 효소의 양/효소의 총량]×100
그 결과, 표 1에 나타난 바와 같이, 키토산 하이드로젤 캡슐 A(5g/ℓ SDS 젤화+0.05M NaOH 치환하여 제조한 키토산 하이드로젤 캡슐) 및 하이드로젤 캡슐 B(20g/ℓ SDS 젤화+0.05M NaOH 치환하여 제조한 키토산 하이드로젤 캡슐)에 대한 TeSADH 효소의 탑재 효율은 이중 돌연변이 효소 DM의 경우 각각 78.3%와 66.9%, 삼중 돌연변이 효소 N245A의 경우 각각 70.1%와 53.8%로 나타났다.
키토산 하이드로젤 A 및 하이드로젤 B의 고정화 효율(제조예 1 방법에 따라서 제조)
키토산 하이드로젤 캡슐 TeSADH 탑재효율(%)
A DM 78.3
N245A 70.1
B DM 66.9
N245A 53.8
키토산 하이드로젤 A는 5g/ℓ SDS 겔화+0.05M NaOH 치환 제형이고, 키토산 하이드로젤 B는 20g/ℓ SDS 겔화+0.05M NaOH 치환 제형이다. 모든 측정에 대한 표준 편차는 평균±2%이다.
상기 결과로부터, SDS 젤화 용액 농도가 증가함에 따라 하이드로젤 층 두께가 증가하여 견고해지기는 하나, NaOH 대체 처리에 의한 SDS 제거가 쉽지 않아 캡슐 표면에 형성된 공간 형성이 상대적으로 덜되어, 낮은 수준의 다공성을 가진 키토산 하이드로젤 B의 효소 흡착 정도가 상대적으로 낮아지는 것으로 판단되었다.
실시예 3. 제조예 1 방법에 따라 고정화된 TeSADH 효소와 이의 유리 효소의 활성 비교 분석
유리(free) 및 고정화 TeSADH 효소의 활성은 340nm(ε340=6.2mM-1cm-1)에서 NADPH 생산의 분광 광도를 측정하였다. 반응 혼합물은 총 1.2㎖의 50mM Tris-HCl (60℃에서 pH8.9)에 0.5mM NADP+, 10μM ZnCl2, 3.0mM DTT 및 반응 기질인 4.0mM 이소프로판올을 포함한다.
각각 2개의 키토산 하이드로젤 캡슐을 활성 분석을 위해 사용하였고 60℃에서 흡광도를 2분 동안 측정하여 직선의 기울기를 구하였다. 흡광도 값은 삼중 실험 데이터의 평균으로 나타냈고, 효소 활성은 표준 조건에서 1분 당 1 μmol의 NADP+를 감소시키는 데 필요한 효소의 양으로 정의하였다.
반응 기질인 이소프로판올의 산화에 따른 NADP+ 감소 효소 활성을 60℃에서 90분 동안 측정하여 제조예 1의 방법에 따라서 제조한 키토산 하이드로젤 캡슐에 고정화된 이중 및 삼중 돌연변이 TeSADH 효소를 각각의 유리 효소와 비교하였다.
그 결과, 도 5A에 나타난 바와 같이, 유리 및 고정화된 이중 돌연변이 효소는 NADPH 생산에서 최소 120분까지 계속 증가하였다. 이것은 TeSADH 효소가 실제로 캡슐 표면에 고정화되어 있다는 것으로, 키토산 하이드로젤 A 캡슐에 고정화된 이중 및 삼중 돌연변이 효소의 상대적 활성은 유리 효소에 비해 88~95% 정도를 나타냈다.
도 5B에서, N245A 삼중 돌연변이 TeSADH 효소에 대해 유사한 쌍곡선 양상을 보였는데, NADPH 생산은 효소의 높은 결합 친화성으로 인하여 60분 후에도 일정하게 유지되는 것으로 판단하였다. 키토산 하이드로젤 B(20g/ℓ SDS 젤화+0.05M NaOH의 치환)에 고정화된 효소는 유리 효소에 대해 ≤ 60%의 상대적으로 낮은 활성을 나타냈다. 키토산 하이드로젤 캡슐 A에 대한 고정화 효소의 활성은 키토산 하이드로젤 캡슐 B보다 약 28~35% 높았다. 하이드로젤 A와 하이드로젤 B 캡슐에 고정화된 효소의 활성 차이는 DM TeSADH에 대한 전자(78.3%)와 비교하여 후자(66.9%)가 효소 흡착 능력이 더 낮기 때문일 수 있다 (표 1).
이러한 결과는 SDS 농도를 높이면 키토산 하이드로젤의 외피가 고형화되어 효소와 염료 및 금속이온 등과 같은 물질이 흡착하기 더 어려워진다는 것을 의미하는 것으로 판단하였다.
실시예 4. 제조예 1 방법에 따라서 제조된 키토산 하이드로젤 캡슐에 고정화된 효소의 실제 사용 검증: 아세토페논의 비대칭 환원
제조예 1에 따라 제조한, 키토산 하이드로젤 캡슐에 고정화된 TeSADH 효소와 유리 효소를 각각 사용하여 아세토페논(acetophenone)의 비대칭 2상 환원 반응을 본 발명자 그룹이 발표한 다른 문헌에 기술한 방법(Dwamena et al. 2019)을 일부 수정하여 실시하였다.
반응 혼합물 (1㎖)은 1㎎ NADPH, 1㎎ DTT, 기질로서 0.21mM 아세토페논과 10μM ZnCl2를 함유하는 50mM Tris-HCl 완충용액(25℃, pH 8.0) 300㎕에 NADPH 재생을 위한 공동 기질로서 200㎕의 2-프로판올과 유기용매 헥산 500㎕를 포함시켰다. 이 반응 혼합물에 12~15개의 고정화된 캡슐을 넣어 50℃ 항온 수조에서 48시간 동안 120rpm으로 왕복 진탕하며 반응을 실시하였다.
유리 효소를 이용한 비대칭 환원 반응에서는 초기 활성 연구를 기반으로 유사한 효소 농도를 유지하기 위해서 희석된 유리 효소 용액 200㎕를 반응 혼합물에 첨가하였다. 생성물은 디에틸 에테르(diethyl ether) 2.5㎖ 씩을 사용하여 3회 추출하고 Na2SO4로 건조한 후 진공 원심 분리기(Ecospin 3180C, Biotron)를 사용하여 농축하였다. 수율은 supelco β-Dex 120 키랄 모세관 컬럼이 장착된 가스 크로마토그래프 (Younglin Instruments; Acme 6000E GC)로 측정하였다.
유용한 화합물의 생산을 위한 고정화 효소의 실제 사용을 규명하기 위해, 유리 및 고정화 삼중 돌연변이 N245A TeSADH 효소에 의한 아세토페논의 비대칭 환원 반응을 통한 (R)-1-페닐 에탄올 ((R)-1-phenylethanol) 생산을 공동 기질로서 2-프로판올과 유기용매로서 헥산을 사용하여 24시간 및 48시간 동안 수행하였다.
그 결과, 도 6에 개시한 바와 같이 48시간 반응 후 고정화 효소는 유리 효소보다 68% 더 많은 (R)-1-페닐 에탄올을 생성하였다. 이러한 결과는 효소 고정화가 효소의 유기용매 저항성을 증가시켜 특히 소수성 케톤을 키랄 알코올로 환원시키는 데 TeSADH 효소를 장기간 적용할 때 생산성을 높이는 이상적인 방법임을 확인하였다.
실시예 5. 제조예 1에 따라 제조된 키토산 하이드로젤 캡슐에 고정화된 TeSADH 효소의 안정성 확인
제조예 1에 따라 제조한, 키토산 하이드로젤 캡슐(키토산 하이드로젤 A)에 고정화된 TeSADH 효소와 이에 해당하는 유리 효소(이중 돌연변이 및 삼중 돌연변이 TeSADH에 대한 온도의 영향은 80℃ 항온 수조에서 120~150분 동안 정체하면서 30분 마다 TeSADH 활성을 측정하여 확인하였다.
유리 효소는 30분 후, 71~79%의 상대적 활성을 잃었고 60~90분 후에 대부분의 활성이 소실되는 반면에, 고정화 효소는 30분 후에 50~68%의 초기 활성을 유지하였고 120분 후에도 25-30%의 활성이 유지되는 것으로 부터 본 발명에서 제시하는 효소 고정화 방법이 효소의 열 안정성도 증대시키는 것을 확인하였다(도 7).
높은 정체 온도에도 불구하고 하이드로젤 캡슐의 팽창은 관찰되지 않았고, 하이드로젤 캡슐을 저장 완충용액에 넣어 6개월 동안 보관하며 관찰한 결과, 육안으로는 제조된 하이드로젤의 팽윤 현상이 관찰되지 않았다.
실시예 6. 키토산 하이드로젤 캡슐에 폴리도파민 코팅에 따른 효소 고정화 효율 비교
상기 제조예 1, 2 및 3에 따라 각각 제조한 키토산 하이드로젤 캡슐과 1g의 도파민을 사용하여 코팅하여 제조한 키토산 하이드로젤 캡슐(제조예 1-D1, 제조예 2-D1 및 제조예 3-D1) 및 제조예 1 캡슐에 각각 0.5 및 1.5 g의 도파민을 사용하여 코팅하여 제조한 키토산 하이드로젤 캡슐(제조예 1-D0.5 및 제조예 1-D1.5)에 이중 돌연변이인 DM TeSADH 효소를 아래의 조건만을 변경하여 실시예 2 방법을 따라서 고정화하였다. 효소 흡착 과정은 10μM ZnCl2를 함유하는 50mM Tris-HCl 완충용액 (25℃에서 pH 8.0)에서 25℃, 100rpm에서 24시간 동안 서서히 진탕하며 수행하였다.
유리 및 고정화 TeSADH 효소의 활성 측정은 실시예 3에 서술한 방법과 유사한 방법으로 실시하였다. 측정한 효소의 활성을 기준으로 식 2를 이용하여 효소 고정화 효율을 계산하였고, 식 3을 이용하여 고정화를 통한 효소 활성 복구율(%)을 계산하여 각각 표 2에 나타내었다.
[식 2]
효소 고정화 효율(%)=[(유리(free)효소 활성-결합하지 않은 효소의 활성)/유리효소 활성]×100
[식 3]
효소 활성 복구율(%)=[결합한 효소의 활성/(유리효소 활성-결합하지 않은 효소의 활성)]×100
폴리도파민 코팅에 따른 하이드로젤 캡슐의 효소 고정화 효율 비교
제조예 1(M1) 제조예 2(M2) 제조예 3(M3) 제조예 1-D1(M1-D1) 제조예 2-D1(M2-D1) 제조예 3-D1(M3-D1) 제조예 1-D1.5(M1-D1.5) 제조예 1-D0.5(M1-D0.5) Free
Enzyme
Bound activity
(μmin-1)		 0.818 0.035 1.515 1.513 0.042 0.476 1.492 2.364 2.754
Unbound activity
(μmin-1)		 0.650 0.745 0.727 0.195 0.568 0.750 0.519 0.066
Immobilization
Efficiency (%)		 76.4 72.9 73.6 92.9 79.4 72.8 81.1 97.6
Enzyme activity
Recovery (%)		 29.7 1.3 18.7 54.9 1.5 17.3 54.2 85.8
0.5%(w/v) 키토산 용액을 사용하여 음이온 계면활성제인 SDS(5g/ℓ)와 NaOH (0.05M)를 젤화 용액으로 순차적으로 대체하여 제조한 다공성의 키토산 하이드로젤 캡슐인 제조예 1의 경우, 폴리도파민 코팅에 의해 그 효율이 크게 개선됨을 확인하였다(76.4%에서 97.6%로 상승).
하지만 도파민의 함량이 가장 낮은 제조예 1-D0.5에서 고정화 효율이 가장 높은 97.6%으로 나타났다. 즉, 도파민의 함량이 증가할수록 그 효율이 폴리도파민 코팅을 하지 않은 경우의 값과 유사한 수준으로 떨어짐을 확인하였다. 본 발명의 조건에서는 0.5~1g의 도파민 함량(키토산 대 도파민의 중량비 =1:10~20)으로 코팅한 경우가 효율적임을 확인하였다.
고정화를 통한 효소 활성의 복구율도 제조예 1 캡슐의 경우 키토산 대 도파민의 중량비 1:20(제조예 1-D0.5)에서 최고 수치를 보였고(85.8%), 고정화 효율의 경향과는 달리 첨가한 도파민의 함량이 증가하여도 효소 활성의 복구율이 폴리도파민 코팅을 하지 않은 경우의 값보다는 1.8배 이상 더 증가된 수치를 나타내었다.
비교 실험예로 진행한 음이온 계면활성제인 SDS로만 젤화시켜 제조한 키토산 하드로젤 캡슐인 제조예 2의 경우는 일반적인 키토산 하이드로젤 비드 보다 구조적으로 기계적 강도가 개선이 되었지만, 다공성의 특성도 없을 뿐만 아니라, 표면에 키토산과 SDS의 응집체가 존재하므로 흡착된 효소를 불활성화 시켜서 효소 고정화에 부적합 것으로 확인하였다.
또한, 도 8에 개시한 바와 같이, 폴리도파민 코팅에 따른 고정화 TeSADH 효소의 활성을 비교하였다. 제조예 1 캡슐의 경우, 표 2에 나타낸 고정화를 통한 효소 활성의 복구율 양상과 유사하게 폴리도파민 코팅에 의해 고정화 TeSADH 효소의 활성이 증가하였고, 역시 키토산 대 도파민의 중량비 1:20에서 최고 수치를 나타내었다. 제조예 3 캡슐의 경우도 폴리도파민 코팅에 의해 고정화 TeSADH 효소의 활성이 개선되었다.
실시예 7. 키토산 하이드로젤 캡슐에 폴리도파민 코팅에 따른 고정화 TeSADH 효소의 열안정성 및 장기 보관 안정성
폴리도파민 코팅에 따른 키토산 하이드로젤 캡슐에 고정화된 TeSADH 효소의 열안정성 분석은 두 가지 다른 온도에서 수행하였으며, TeSADH 활성을 측정하여 초기 값에 상대적인 잔류 효소 활성을 확인하였다.
첫 번째 방법은 75℃ 항온 수조에 150분 동안 정체하면서 30분 마다 서로 다른 세 개씩의 하이드로젤 캡슐을 취하여 실시예 3에 기술한 방법에 따라 60℃에서 TeSADH 효소 활성을 측정하였다(도 9).
폴리도파민 코팅을 하지 않은 제조예 3 캡슐의 경우가 매우 우수한 열안정성을 보여 75℃에서 1시간까지 93% 정도, 150분까지 68%의 상대 역가를 유지하였다. 폴리도파민 코팅을 하지 않은 제조예 1 캡슐의 경우도 150분까지 50%의 상대 역가를 유지하였다. 그러나 두 가지 캡슐 모두 폴리도파민 코팅을 수행한 경우 폴리도파민 코팅을 하지 않은 경우보다 오히려 열 안정성이 감소함을 확인하였다. 폴리도파민 코팅된 캡슐이 시간이 지남에 따라 특히 초기 1시간 동안 암갈색에서 밝은 갈색으로 색이 조금씩 바래지는 것이 관찰되는 것과 잔류 효소 활성 프로파일을 종합해 보면, 높은 온도에서는 폴리도파민 코팅이 서서히 탈착되지만, 초기 1시간 정도까지만 대부분의 탈착이 진행되고, 그 이후에는 높은 온도에서도 안정적으로 유도되고 있음을 확인할 수 있다. 다만 시간이 지남에 따라 모든 캡슐의 크기가 줄어들었는데, 특히 제조예 1 계열의 캡슐 모두가 크기가 더 많이 감소하였다.
두 번째 열안정성 실시예에서는 본 발명에서 모델 효소로 적용한 호열성인 TeSADH 효소의 활성 측정 및 생산 반응 온도인 60℃에서 하이드로젤 캡슐에 고정화된 효소의 열안정성을 확인하였다. 하이드로젤 캡슐 종류별로 초기부터 세 개씩의 캡슐을 넣고 60℃ 항온 수조에 120분 동안 정체하면서, 측정할 때 마다 세 개의 캡슐을 모두 꺼내어 실시예 3에 기술한 방법에 따라 60℃에서 TeSADH 효소의 잔류 활성을 측정하였다(도 10).
기본적으로 잔류 효소 활성 프로파일, 캡슐의 크기 감소, 캡슐의 색깔 변화 등의 양상이 상기의 75℃에서 수행한 하이드로젤 캡슐에 고정화된 효소의 열안정성 양상과 유사함을 확인하였다. 가장 낮은 잔류 효소 활성을 보인 폴리도파민 코팅을 적용한 제조예 1-D0.5 캡슐의 경우도 1시간 이후에는 40% 정도로 안정되게 유지되었다. 대부분의 효소의 생산 반응 공정에 적용되는 온도가 60℃ 이하임을 감안하면, 폴리도파민 코팅을 적용한 제조예 1-D0.5 캡슐의 경우도 유용하게 활용될 수 있을 것으로 판단된다.
폴리도파민 코팅에 따른 키토산 하이드로젤 캡슐에 고정화된 TeSADH 효소의 장기 보관 안정성 분석은 25℃에서 16일 동안 수행하였으며 TeSADH 활성을 측정하여 초기 값에 상대적인 잔류 효소 활성을 확인하였다. 하이드로젤 캡슐 종류별로 초기부터 세 개씩의 캡슐을 넣고 25℃ 항온 수조에 16일 동안 정체하면서, 측정할 때 마다 세 개의 캡슐을 모두 꺼내어 실시예 3에 기술한 방법에 따라 25℃에서 TeSADH 효소 활성을 측정하여 수행하였다(도 11).
상기 75℃에서 수행한 열안정성과 유사한 결과를 나타내었고, 특히 폴리도파민 코팅을 하지 않은 제조예 3 캡슐의 경우가 매우 안정하여 16일 보관 후에도 93% 정도의 상대 역가를 유지하였다. 키토산 대 도파민의 중량비 1:20으로 폴리도파민 코팅을 수행한 제조예 1 캡슐의 경우가 가장 낮은 수치를 보였지만 16일 후 43%의 잔류 활성을 나타내었다. 폴리도파민 코팅된 캡슐은 시간이 지남에 따라 색이 조금씩 바래지지만 가열된 샘플에서 관찰되는 것보다는 훨씬 적었다.
실시예 8. 폴리도파민 코팅에 따른 키토산 하이드로젤 캡슐과 비드에 고정화한 TeSADH 효소의 활성 비교
상기 제조예 3 방법에 따라 제조한 키토산 하이드로젤 제조예 3 캡슐 (키토산 0.1g에 해당)과 상기 제조예 4에 따라 제조한 알칼리 키토산 하이드로젤 비드 (키토산 0.1g에 해당), 이에 각각 상기 제조예 5에 따라 폴리도파민 코팅을 수행하여 얻은 제조예 3 캡슐/폴리도파민(제조예 3-D1)과 비드/폴리도파민, 이렇게 4가지 형태의 키토산 하이드로젤에 고정화한 TeSADH 효소의 활성을 비교하는 실험을 아래와 같이 수행하였다.
결과적으로 동일한 키토산 대 도파민의 중량비 1:10으로 제조한 키토산 하이드로젤 제조예 3 캡슐과 알칼리 키토산 하이드로젤 비드에 대하여 이들의 폴리도파민 코팅에 따른 고정화 TeSADH 효소의 활성을 비교하고자 본 실시예 8을 실시하였다.
세 가지 종류의 키토산 하이드로젤 캡슐과 이들의 폴리도파민 코팅에 따른 고정화 TeSADH 효소의 활성을 비교한 실시예 6의 결과를 나타낸 표 2와 도 8에서 확인할 수 있듯이, 제조예 3과 제조예 3-D1 캡슐은 제조예 1 계열의 캡슐, 특히 제조예 1-D0.5 보다 낮은 효소 고정화 효율과 낮은 효소 활성을 보였다.
하지만 실시예 7의 결과 도 9 내지 11에 개시한 바와 같이, 제조예 3과 제조예 3-D1 캡슐의 경우가 고정화 TeSADH 효소의 열안정성 및 장기 보관 안정성이 월등하게 우수한 결과를 보여서, 이들을 선택하여 알칼리 키토산 하이드로젤 비드의 경우와 비교하였다.
효소 흡착 과정은 실시예 2 방법을 다음과 같이 일부 변형하여 수행하였다. 10μM ZnCl2를 함유하는 50mM Tris-HCl 완충용액 (60℃에서 pH 8.9)에서 25℃, 120 rpm에서 5시간 동안 서서히 진탕하며 수행하였다. 고정화 TeSADH 효소의 활성 측정은 각각 2 개의 하이드로젤을 사용하여 실시예 2에 서술한 방법에 따라 실시하였다.
그 결과, 제조예 3 캡슐과 알칼리 키토산 비드 모두 폴리도파민 코팅 추가 과정의 도입으로 인하여 고정화 효소의 활성이 증가하였다(도 12). 결과적으로 제조예 3 캡슐의 경우가 더 우수한 것으로 보인다.

Claims (10)

  1. (1) 키토산을 유기산 용액에 첨가하여 키토산 용액을 제조하는 단계;
    (2) 상기 단계 (1)에서 제조한 키토산 용액을 주사기에 넣은 후, 교반하고 있는 음이온성 계면활성제 용액에 방울방울 떨어뜨려 키토산과 음이온성 계면활성제의 이온성 상호작용으로 껍질(shell)이 형성된 키토산 하이드로젤 캡슐을 제조하는 단계;
    (3) 상기 단계 (2) 이후에, 상기 키토산 하이드로젤 캡슐을 물로 세척하고, 수산화나트륨 용액에 첨가하여, 음이온성 계면활성제를 수산화 이온으로 치환하여 다공성의 키토산 하이드로젤 캡슐을 제조하는 단계; 및
    (4) 상기 단계 (3) 이후에, 단백질을 포함하는 완충용액에 상기 제조한 다공성의 키토산 하이드로젤 캡슐을 첨가하고, 교반하여 단백질을 다공성의 키토산 하이드로젤 캡슐에 고정시키는 단계;를 포함하는 단백질이 고정된 다공성의 키토산 하이드로젤 캡슐의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 유기산 용액은 아세트산, 뷰티르산, 옥살산, 타르타르산, 아스코르브산 및 벤조산 중에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 단백질이 고정된 다공성의 키토산 하이드로젤 캡슐의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 음이온성 계면활성제는 소듐 도데실설페이트(sodium dodecyl sulfate:SDS)인 것을 특징으로 하는 단백질이 고정된 다공성의 키토산 하이드로젤 캡슐의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (3)과 단계 (4) 사이에, 상기 제조된 다공성의 키토산 하이드로젤 캡슐을 염기성 용액에 첨가하고, 교반하면서 도파민 용액을 주사기로 방울방울 떨어뜨려 다공성의 키토산 하이드로젤 캡슐의 표면을 폴리도파민으로 코팅하는 단계;를 더 포함하는 단백질이 고정된 다공성의 키토산 하이드로젤 캡슐의 제조방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 폴리도파민을 코팅한 후, 추가로 중금속 코팅 또는 표면 개질하는 단계;를 더 포함하는 단백질이 고정된 다공성의 키토산 하이드로젤 캡슐의 제조방법.
  6. 제1항에 있어서,
    (1) 키토산을 아세트산 용액에 첨가하여 키토산 용액을 제조하는 단계;
    (2) 상기 단계 (1)에서 제조한 키토산 용액을 주사기에 넣은 후, 교반하고 있는 소듐 도데실설페이트 용액에 방울방울 떨어뜨려 키토산과 소듐 도데실설페이트의 이온성 상호작용으로 껍질(shell)이 형성된 키토산 하이드로젤 캡슐을 제조하는 단계;
    (3) 상기 단계 (2) 이후에, 상기 키토산 하이드로젤 캡슐을 물로 세척하고, 수산화나트륨 용액에 첨가하여, 소듐 도데실설페이트를 수산화 이온으로 치환하여 다공성의 키토산 하이드로젤 캡슐을 제조하는 단계;
    (4) 상기 단계 (3) 이후에, 상기 제조된 다공성의 키토산 하이드로젤 캡슐을 염기성 용액에 첨가하고, 교반하면서 도파민 용액을 주사기로 방울방울 떨어뜨려 캡슐의 표면을 폴리도파민으로 코팅하는 단계; 및
    (5) 단백질을 포함하는 완충용액에 상기 폴리도파민이 코팅된 다공성의 키토산 하이드로젤 캡슐을 첨가하고 교반하여, 다공성의 키토산 하이드로젤 캡슐에 단백질을 고정시키는 단계;를 포함하는 단백질이 고정된 다공성의 키토산 하이드로젤 캡슐의 제조방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 제조방법으로 제조한 단백질이 고정된 다공성의 키토산 하이드로젤 캡슐.
  8. 제7항에 있어서, 상기 단백질은 효소, 수용체 단백질 또는 펩티드인 것을 특징으로 하는 단백질이 고정된 다공성의 키토산 하이드로젤 캡슐.
  9. (1) 키토산을 유기산 용액에 첨가하여 키토산 용액을 제조하는 단계;
    (2) 상기 단계 (1)에서 제조한 키토산 용액을 알칼리 용액과 혼합하여 키토산 하이드로젤 비드를 제조하는 단계;
    (3) 상기 단계 (2) 이후에, 상기 제조된 키토산 하이드로젤 비드를 세척한 후, 염기성 용액에 첨가하고 교반하면서 도파민 용액을 주사기로 방울방울 떨어뜨려 비드 표면을 폴리도파민으로 코팅하는 단계; 및
    (4) 단백질을 포함하는 완충용액에 상기 폴리도파민이 코팅된 키토산 하이드로젤 비드를 첨가하고 교반하여, 폴리도파민이 코팅된 키토산 하이드로젤 비드에 단백질을 고정시키는 단계;를 포함하는 단백질이 고정된 키토산 하이드로젤 비드-폴리도파민 복합체의 제조방법.
  10. 제9항의 제조방법으로 제조한 단백질이 고정된 키토산 하이드로젤 비드-폴리도파민 복합체.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115572739A (zh) * 2022-10-31 2023-01-06 天津科技大学 一种发酵菌体为原料制备水凝胶的方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20010061109A (ko) * 1999-12-28 2001-07-07 조 정 래 키토산을 이용한 불용성 하이드로젤의 제조방법
KR20160092652A (ko) * 2015-01-28 2016-08-05 고려대학교 산학협력단 키토산 코팅된 효소-다공성물질 복합체 및 이의 제조방법
KR20160121131A (ko) * 2015-04-10 2016-10-19 한밭대학교 산학협력단 다층막으로 된 하이드로젤 캡슐 및 이의 제조방법
KR20180042989A (ko) * 2016-10-19 2018-04-27 한밭대학교 산학협력단 흡착용 에어로젤 입자 및 이의 제조 방법
KR20200039318A (ko) * 2018-10-05 2020-04-16 한국전력공사 미생물 생체광물형성 극대화를 위한 고기능성 하이드로젤 비드 담체 및 이의 제조 방법

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20010061109A (ko) * 1999-12-28 2001-07-07 조 정 래 키토산을 이용한 불용성 하이드로젤의 제조방법
KR20160092652A (ko) * 2015-01-28 2016-08-05 고려대학교 산학협력단 키토산 코팅된 효소-다공성물질 복합체 및 이의 제조방법
KR20160121131A (ko) * 2015-04-10 2016-10-19 한밭대학교 산학협력단 다층막으로 된 하이드로젤 캡슐 및 이의 제조방법
KR20180042989A (ko) * 2016-10-19 2018-04-27 한밭대학교 산학협력단 흡착용 에어로젤 입자 및 이의 제조 방법
KR20200039318A (ko) * 2018-10-05 2020-04-16 한국전력공사 미생물 생체광물형성 극대화를 위한 고기능성 하이드로젤 비드 담체 및 이의 제조 방법

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Bioresource Technology.,101:3853-3858(2010.2.2.)* *
Biotechnology and Bioprocess Engineering.,22:89-94(2017.)* *
Lab on a Chip.,20:1-12(2020.8.20)* *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115572739A (zh) * 2022-10-31 2023-01-06 天津科技大学 一种发酵菌体为原料制备水凝胶的方法

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