KR20220108045A - 공유 후보 항원 및 공유 항원-특이적 t 림프구 쌍을 확인 및 검증하기 위한 방법 및 시스템 - Google Patents

공유 후보 항원 및 공유 항원-특이적 t 림프구 쌍을 확인 및 검증하기 위한 방법 및 시스템 Download PDF

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KR20220108045A
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데이비드 마이클 엡스타인
레이몬드 리
수 쳉 웡
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내셔널 유니버시티 오브 싱가포르
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Abstract

본 발명은 한쌍의 항원 및 TCR 서열의 면역원성 활성을 검증하는데 유용한 후보 항원 및 이의 동족 항원-특이적 T 림프구의 쌍을 확인 및 검증하기 위한 방법 및 시스템에 관한 것이다. 본 발명은 또한 의학적 병태를 특성화 및/또는 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

공유 후보 항원 및 공유 항원-특이적 T 림프구 쌍을 확인 및 검증하기 위한 방법 및 시스템
본 발명은 한쌍의 항원 및 TCR 서열의 면역원성 활성을 검증하고 의학적 병태(medical condition)를 특성화 및/또는 치료하는데 유용한 후보 항원 및 이의 동족 항원-특이적 T 림프구의 쌍을 확인 및 검증하기 위한 방법 및 시스템에 관한 것이다.
면역요법은 최근 그 중요성이 크게 증가하고 있다. 면역요법은 알레르기와 같은 다른 의학적 병태와 관련하여 적용되지만 특히 암의 치료 또는 예방과 관련하여 적용된다.
수지상 세포 기반 프라이밍 및 T-세포 입양 전달과 같은 활성화 면역요법 및 T 림프구를 사용한 자가 면역 증강 요법을 포함한, 다양한 면역요법 기술이 알려져 있다.
면역요법의 개발에서 발생하는 문제는 기능적 표적 항원 및 이의 동족 T 세포 및/또는 T 세포 수용체 서열의 확인이다. 암 면역요법과 관련하여 일반적으로 채택되는 접근법 중 하나는 예를 들어 종양 DNA 또는 RNA의 심층 시퀀싱 (sequencing)을 통해 종양 세포의 체세포 돌연변이에서 유래된 후보 신생항원을 검색하는 것이다. 이 접근법의 한 가지 목표는 개별 환자의 돌연변이 특징에 고도로 조정된 신생항원 기반 암 백신을 개발하는 것이다. 암 면역요법에 대한 고도로 개별화된 접근법은 암 환자가 심층 시퀀싱을 위해 종양 DNA를 제공해야 하며, 그 후 암 치료에 사용할 개별 암 백신을 규정하는데 사용할 수 있는 후보 항원 펩타이드 서열을 확인하기 위해 인 실리코 분석을 완료해야 한다. 이 접근법은 느리고 번거롭고 비용이 많이 들고 후보 펩타이드의 항원성에 대한 최선의 추측에 좌우된다. 중요하게, 이 접근법은 동족 T 세포 및 TCR 서열의 신속하고 동시적인 확인을 제공하지 않는다. 또한, 이는 암 치료제 개발에 유용한 동족 T 세포 및 TCR 서열의 신속하고/거나 동시적인 기능 검증에 적합하지 않다. 이 접근법의 또 다른 문제는 암이 종종 발암성 돌연변이에 의해 유발되는 질병이지만 개별 환자의 유전 특성을 규정하는 돌연변이 패턴이 고유하고 대부분의 체세포 돌연변이의 항원성과 마찬가지로 대부분의 체세포 돌연변이의 발암성이 알려져 있지 않다는 것이다. 암 관련 체세포 돌연변이의 항원성에 대한 최근 연구에 따르면 미스센스 돌연변이에서 유래한 후보 항원 펩타이드 1,000개 중 1개 미만이 기능적 신생항원으로 이어지며, 더욱이 이 분석은 조정된 요법을 개발하기 위한 T 세포 또는 TCR 쌍의 확인으로 이어지지 않는 것으로 나타났다. 실제로 체세포 돌연변이는 개별 암 환자 수준에서 검사할 때 매우 드물며 일반적으로 종양 세포의 0.5% 미만에 존재한다. 따라서, 체세포 돌연변이로부터 발생하는 기능적 암 신생항원을 확인하는 것은 어려울 수 있다.
잠재적인 암 신생항원이, 암 관련 단백질에서의 미스센스 돌연변이를 확인하기위한 생검 조직의 엑손 시퀀싱에 의해 예측되는 현재 접근법의 추가적인 한계가 있다. 엑손 시퀀싱 데이터의 분석에 이어, 인실리코 HLA-펩타이드는 잠재적인 항원 펩타이드 서열의 우선순위를 정하도록 설계된 알고리즘을 사용하여 예측되며; 이러한 예측된 아미노산 서열은 환자 특이적 암 백신을 개발하기 위해 (다양한 펩타이드, RNA 또는 DNA 기반 접근법을 통해) 활용된다. 이 접근법에는 주요 제한 사항이 있다. 대부분의 DNA 돌연변이는 종양 유발 경우를 유발하지 않기 때문에 이러한 '개별 돌연변이'는 종양 진화 동안 선택되지 않으며 집단(population) 수준에서 볼 때 이러한 '개별 돌연변이'는 축적되거나 재발하지 않으므로 개별 환자 하위그룹으로 묶이지 않는다. 달리, 높은 정도의 재발을 나타내는 종양 유발 돌연변이의 수많은 예가 있다: 예를 들어 흑색종에서 BRAF-V600E, 폐암에서 EGFR 키나제 도메인 돌연변이, 유방암에서 HER2 증폭 및 돌연변이 또는 췌장암, 결장직장암 및 폐암에서 kRas 돌연변이. 앞서 언급한 발암성 돌연변이가 특히 면역원성이 아니며 표적화된 면역요법의 성공적인 개발로 이어지지 않았다는 관찰이 흥미롭다. 따라서, 암 환자 집단 전반에 걸쳐 공유되는 암 항원의 신속하고 효율적인 확인 및 검증을 가능하게 하는 방법 및 시스템을 개발할 필요가 있다. 또한, 펩타이드 항원 예측 알고리즘은 아시아에서 공통적인 것과 같은 특정 HLA 대립인자에 대한 펩타이드 결합을 예측하는데 적합하지 않을 수 있다. 이와 달리, 아시아인 특유의 HLA 대립인자에 결합할 것으로 예측되는 펩타이드 신생항원은 비아시아인 집단에 공통적인 HLA 대립인자에 대한 결합 상대로서, 적합하지 않을 수 있다. 따라서 항원-T 림프구 쌍에 대한 스크리닝이 모든 HLA 하위 유형을 사용하여 완료될 수 있도록 임의의 후보 항원-HLA 복합체를 평가할 수 있는 강력한 시스템 및 방법이 필요하다. 공유 항원을 제시하는 종양에 결합하여 이를 파괴하는 동족 항원-유도 T 세포 상대 및 T 세포 수용체의 신속하고 효율적인 확인 및 특성화를 제공하는 시스템 및 방법이 실질적으로 필요하다. 종합하면 공유 암 항원과 항원 특이적 T 림프구의 기능적 면역 조절 쌍을 신속하게 확인 및 검증할 수 있어야 할 필요가 있다.
또한 신생항원은 조절되지 않은 mRNA 스플라이싱(splicing) 현상으로부터 발생할 수 있다는 것이 이전에 제안되었다. 그러나, 이 접근법을 통한 암 면역요법의 개발은 여전히 난제이다. 예를 들어, 종양 특이적 mRNA 스플라이싱 현상을 확인하는데 어려움이 있으며, 이는 스플라이싱 유래 항원의 공급원으로 평가될 수 있는 암 관련 스플라이스 변이체 단백질 (splice variant protein; SVP)을 확인하는데 필수적인 단계이다. 질병과 정상 조직 모두에 존재하는 항원에 대한 면역요법으로 인해 발생하는 표적외 독성의 위험을 최소화하기 위해 RNA 스플라이싱에서 암 관련 변화를 강력하게 묘사하는 시스템을 개발하는 것이 또한 매우 중요하다. 또한 조절되지 않은 mRNA 스플라이싱 현상에서 유래된 단백질 변이체를 검출하는데 중요한 문제가 있으며, 그 이유는 낮은 존재량으로 존재하는 전사체에서 많은 대체 스플라이싱 현상이 발견되기 때문이다. 스플라이스 변이체가 단백질로 번역된다는 증거가 발견되더라도 전장 단백질에서 유래된 펩타이드가 면역원성 활성을 가질 것이라는 보장은 없다.
따라서, 상기 언급된 어려움 중 하나 이상을 극복하거나 개선하는 것이 일반적으로 바람직하다. 본 발명은 정밀 면역요법의 발견 및 개발에서 이러한 문제에 대한 해결책을 제공한다.
본 발명은 조절되지 않은 pre-mRNA 스플라이싱 현상이 환자 하위그룹 사이에서 공유되고, 단백질 스플라이스 형태로부터 유래된 펩타이드가 면역요법에서 신생-항원을 이용하는 한계를 다룬다는 인식에 기반한다. 본 명세서에 규정된 바와 같은 방법은 특정 의학적 병태 (예컨대, 암)를 갖는 환자의 하위그룹에 의해 공유되는 하나 이상의 후보 항원의 확인 및 검증을 교시한다. 이는 하나 이상의 검증된 공유 후보 항원(shared candidate antigen)을 기반으로 하는 이 하위 그룹의 환자에 대한 진단 시험 및 치료 옵션의 신속한 개발을 가능하게 할 수 있다. 본 명세서에 규정된 바와 같은 방법은 또한 조절되지 않은 mRNA 스플라이싱으로부터 유래된 하나 이상의 공유 항원에 결합하고 이를 인식하는 하나 이상의 동족 T 림프구 및 T-세포 수용체 (TCR)의 확인 및 검증을 교시한다: 본 방법은 추가로 공유 항원 및 이의 동족 T 림프구는 또한 특정 의학적 병태 (예컨대, 암)를 가진 환자의 하위 그룹에 의해 공유된다. 이는 또한 하나 이상의 검증된 공유 항원을 기반으로 하는 이 하위 그룹의 환자를 위한 T 세포 치료 옵션의 신속한 개발을 가능하게 할 수 있다. 본 명세서에 규정된 바와 같은 방법은 또한 항원 및 동족 T 림프구의 하나 이상의 쌍의 병렬 검증을 교시한다. 이 쌍은 또한 특정 의학적 병태 (예를 들어, 암)를 가진 환자의 하위 그룹에 의해 공유된다. 이는 또한 하나 이상의 검증된 면역요법 쌍을 기반으로 하는 이 하위 그룹의 환자를 위한 TCR 기반 치료 옵션의 신속한 개발을 가능하게 할 수 있다.
코딩 서열의 변화를 통해 단백질 서열의 암 관련 변화를 초래하는 비정상적인 mRNA 스플라이싱 현상이 또한 암 환자에서 항원 펩타이드의 제시로 이어질 수 있다는 것은 이전에 입증되지 않았다. 또한 암 환자의 종양 관련 스플라이싱 변화가 공유 암 항원의 발달로 이어질 것인지, 또는 이러한 후보 공유 항원 펩타이드가 종양 세포에 표시되는지, 및/또는 이러한 표면 디스플레이 HLA-펩타이드 항원이 공유 mRNA 스플라이싱 현상을 보유하는 종양 세포를 기능적으로 사멸시키는 동족 T 림프구에 결합하여 이를 활성화할 수 있는지는 이전에 결정된 바 없다.
본 명세서에서는 의학적 병태를 특성화 및/또는 치료하기 위한 하나 이상의 공유 후보 항원을 확인하는 방법이 개시되고, 공유 후보 항원은 의학적 병태를 갖는 환자의 서브세트(subset)에 공통이고, 본 방법은
(i) 의학적 병태를 가진 환자의 제1 코호트(cohort)로부터 시험 샘플에 대한 전사체 데이터(transcriptomic data)를 획득하는 단계;
(ii) 참조 샘플의 세트에 대한 참조 전사체 데이터를 획득하는 단계;
(iii) 전사체 데이터를 참조 전사체 데이터와 비교함으로써, 참조 샘플과 비교하여 시험 샘플의 서브세트의 각 샘플에서 더 많이 전사되는 하나 이상의 스플라이스 변이체를 결정하는 단계;
(iv) 각각의 상기 공유 스플라이스 변이체에 대해, 공유 스플라이스 변이체의 아미노산 번역에서 발생하지만, 참조 샘플에서 전사되는 동일한 유전자의 상응하는 스플라이스 변이체의 아미노산 번역에서는 발생하지 않는 하나 이상의 아미노산 서열을 결정하는 단계; 및
(v) 하나 이상의 공유 아미노산 서열 또는 이의 일부의 HLA 결합을 예측하여, 하나 이상의 공유 후보 항원으로서, 하나 이상의 공유 아미노산 서열을 확인하는 단계
를 포함한다.
본 명세서에서는 공유 항원-T 림프구 쌍을 확인하는 방법이 개시되고, 본 방법은
a) 본 명세서에 규정된 바와 같은 방법에 따라 공유 후보 항원을 확인하고; 표지(label), 및 공유 후보 항원을 포함하는 펩타이드를 포함하는 하나 이상의 각각의 표지된 생체분자(biomolecule)를 제공하는 단계;
b) 하나 이상의 표지된 생체분자를 의학적 병태를 갖는 환자로부터의 말초 혈액(peripheral blood)을 포함하는 하나 이상의 샘플과 접촉시키는 단계; 및
c) 하나 이상의 샘플로부터, 상기 표지된 생체분자에 결합된 T 림프구를 확인하여, 공유 항원-T 림프구 쌍을 확인하는 단계
를 포함한다.
본 명세서에서는 본 명세서에 규정된 바와 같은 방법에 따라 확인된 하나 이상의 공유 후보 항원에 특이적으로 결합하는 T 림프구를 확인하는 방법으로서,
a) 표지 및 각 후보 항원을 포함하는, 하나 이상의 각각의 표지된 생체 분자를 제공하는 단계;
b) 하나 이상의 표지된 생체분자를 의학적 병태를 갖는 각각의 환자로부터의 말초 혈액을 포함하는 하나 이상의 샘플과 접촉시키는 단계; 및
c) 하나 이상의 샘플로부터, 상기 표지된 생체분자에 결합된 T 림프구를 확인하는 단계
를 포함하는 방법이 개시된다.
본 명세서에서는 대상체(subject)의 의학적 병태를 특성화하는 방법이 개시되고, 본 방법은 본 명세서에 규정된 바와 같은 방법에 따라 확인된 하나 이상의 공유 항원의 수준을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 하나 이상의 공유 항원의 증가된 수준은 의학적 병태를 하나 이상의 공유 항원의 발현과 관련된 것으로 특성화한다.
본 명세서에 규정된 바와 같은 하나 이상의 공유 항원의 발현과 관련된 의학적 병태는 또한 의학적 병태가 적합한 면역요법으로의 치료에 반응성일 수 있음을 나타낸다.
본 명세서에서는 대상체의 의학적 병태를 치료하는 방법이 개시되고, 본 방법은 (a) 본 명세서에 규정된 바와 같은 방법에 따라 확인된 하나 이상의 공유 항원의 수준을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 하나 이상의 공유 항원의 증가된 수준은 대상체의 의학적 병태를 하나 이상의 공유 항원의 발현과 관련된 것으로 특성화하는 단계, 및 (b) 하나 이상의 공유 항원의 발현과 관련된 의학적 병태를 가진 것으로 밝혀진 대상체를 치료하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서는 대상체의 의학적 병태를 특성화하는 방법이 개시되고, 본 방법은 본 명세서에 규정된 바와 같은 방법에 따라 확인된 하나 이상의 공유 항원에 특이적으로 결합하는 T 림프구의 수준을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 T 림프구의 증가된 수준은 대상체의 의학적 병태를 하나 이상의 공유 항원의 발현과 관련된 것으로 특성화하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서는 대상체의 의학적 병태를 치료하는 방법이 개시되고, 본 방법은 a) 본 명세서에 규정된 바와 같은 방법에 따라 확인된 하나 이상의 공유 항원에 특이적으로 결합하는 T 림프구의 수준을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 T 림프구의 증가된 수준은 대상체의 의학적 병태를 하나 이상의 공유 항원의 발현과 관련된 것으로 특성화하는 단계; 및 b) 하나 이상의 공유 항원의 발현과 관련된 의학적 병태를 가진 것으로 밝혀진 대상체를 치료하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서는 대상체의 의학적 병태를 치료하는 방법이 개시되고, 본 방법은
(a) 본 명세서에 규정된 바와 같은 하나 이상의 공유 항원에 특이적으로 결합하는 T 림프구의 수준을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 T 림프구의 증가된 수준은 의학적 병태를 하나 이상의 공유 항원의 발현과 관련된 것으로 특성화하는 단계;
(b) 생체외에서 T 림프구의 집단을 단리 및 확장하는 단계; 및
(c) 하나 이상의 공유 항원의 발현과 관련된 것으로 나타난 의학적 병태를 치료하기 위해 대상체에게 T 림프구의 확장된 집단을 투여하는 단계
를 포함한다.
본 명세서에서는 대상체의 의학적 병태를 치료하는 방법이 개시되고, 본 방법은
(a) 의학적 병태를 앓고 있는 대상체에서, 본 명세서에 규정된 바와 같은 방법에 따라 확인된 하나 이상의 공유 항원에 특이적으로 결합하는 T 림프구의 집단을 단리하고, 생체외에서 T 림프구의 집단을 확장하는 단계; 및
(b) 대상체의 의학적 병태를 치료하기 위해 대상체에게 T 림프구의 확장된 집단을 투여하는 단계
를 포함한다.
본 명세서에서는 본 명세서에 규정된 바와 같은 방법에 따라 확인된 하나 이상의 공유 항원 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 면역조절 조성물(immunomodulatory composition)이 개시된다.
본 명세서에서는 대상체에서 면역 반응을 자극하는 방법이 개시되며, 본 방법은 대상체에서 면역 반응을 자극하는 조건 하에 충분한 시간 동안 본 명세서에 규정된 바와 같은 방법에 따른 면역조절 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서는 본 명세서에 규정된 바와 같은 방법에 따라 확인된 공유 항원-T 림프구 쌍이 개시되고, 공유 항원은 MARK3, NBPF9, PARD3, ZC3HAV1, YAF2, CAMKK1, LRR1, ZNG670, GRINA 또는 MZF1 스플라이스 변이체이고, HLA 하위유형(subtype)은 HLA-A11 또는 HLA-A24이고, T 림프구는 공유 항원에 결합한다.
일 실시양태에서, 본 명세서에 규정된 바와 같은 방법에 따라 확인된 공유 항원-T 림프구 쌍이 제공되고, 공유 항원은 MARK3 스플라이스 변이체이고, HLA 하위유형은 HLA-A11이고, T 림프구는 공유 MARK3 항원에 결합한다.
본 명세서에서는 공유 항원에 특이적으로 결합하는 T 림프구의 존재를 검출하거나 상기 T 림프구의 수준을 결정하는데 사용하기 위한, 공유 항원에 결합하는 HLA 분자를 포함하는, 표지된 생체분자가 개시된다.
본 명세서에서는 본 명세서에 규정된 바와 같은 방법에 따라 확인된 공유 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 개시되고, 상기 공유 항원은 HLA 분자에 결합한다.
본 명세서에서는 본 명세서에 규정된 바와 같은 방법에 따라 확인된 공유 항원에 결합하는 T-세포 수용체 (TCR)가 개시되며, 공유 항원은 HLA 분자에 결합한다.
본 명세서에서는 본 명세서에 규정된 바와 같은 T-세포 수용체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조작된 면역 세포(engineered immune cell)가 개시되고, 조작된 면역 세포는 공유 항원 또는 이의 단편에 특이적으로 결합할 수 있고, 상기 공유 항원 또는 이의 단편은 HLA 분자에 결합한다.
본 명세서에서는 대상체의 의학적 병태를 치료하는 방법이 개시되고, 본 방법은 대상체의 의학적 병태를 치료하는 조건 하에 충분한 시간 동안 본 명세서에 규정된 바와 같은 TCR 또는 본 명세서에 규정된 바와 같은 조작된 면역 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서는 항체를 생성하는 방법이 개시되고, 본 방법은
(a) 본 명세서에 규정된 바와 같은 방법에 따라 확인된 공유 항원으로 동물을 면역화하는 단계;
(b) 공유 항원에 특이적으로 결합하는 동물로부터의 B 세포를 확인 및/또는 단리하는 단계; 및
(c) B 세포에 의해 발현되는 항원 결합 분자를 생성하는 단계
를 포함한다.
본 명세서에 규정된 바와 같은 항체, 가용화된 TCR 또는 조작된 면역 세포, 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 개시된다.
본 명세서에서는 대상체의 의학적 병태를 치료하는 방법이 개시되고, 본 방법은 대상체의 의학적 병태를 치료하는 조건 하에 충분한 시간 동안 본 명세서에 규정된 바와 같은 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서는 공유 항원-T 림프구 쌍을 확인하는 방법이 개시되고, 본 방법은
(i) 의학적 병태를 가진 환자의 제1 코호트로부터 시험 샘플에 대한 전사체 데이터를 획득하는 단계로서, 코호트는 다수의 환자를 포함하는 단계;
(ii) 참조 샘플의 세트에 대한 참조 전사체 데이터를 획득하는 단계;
(iii) 전사체 데이터를 참조 전사체 데이터와 비교함으로써, 참조 샘플과 비교하여 시험 샘플의 서브세트의 각 샘플에서 더 많이 전사되는 하나 이상의 스플라이스 변이체를 결정하는 단계,
(iv) 각각의 상기 공유 스플라이스 변이체에 대해, 스플라이스 변이체의 아미노산 번역에서는 발생하지만, 참조 샘플에서 전사되는 동일한 유전자의 상응하는 스플라이스 변이체의 아미노산 번역에서는 발생하지 않는 하나 이상의 아미노산 서열을 결정하는 단계;
(v) 하나 이상의 공유 아미노산 서열 또는 이의 일부의 HLA 결합을 예측하여, 하나 이상의 공유 후보 항원으로서 하나 이상의 아미노산 서열을 확인하는 단계;
(vi) 표지, 및 공유 후보 항원을 포함하는 펩타이드를 포함하는 하나 이상의 표지된 생체분자를 제공하는 단계;
(vii) 하나 이상의 표지된 생체분자를 의학적 병태를 갖는 환자로부터의 말초 혈액을 포함하는 하나 이상의 샘플과 접촉시키는 단계; 및
(viii) 하나 이상의 샘플로부터, 상기 표지된 생체분자에 결합된 T 림프구를 확인하여, 공유 항원-T 림프구 쌍을 확인하는 단계
를 포함한다.
본 발명의 실시양태는 첨부 도면을 참조하여 비제한적인 예로서 이하에서 기재된다:
도 1(a)는 의학적 병태를 특성화 및/또는 치료하기 위한 후보 항원을 확인하기 위한 방법의 흐름도이다.
도 1(b)는 항원-특이적 T 림프구를 확인하기 위한 방법의 흐름도이다.
도 2는 의학적 병태를 특성화 및/또는 치료하기 위한 공유 후보 항원을 확인하기 위한 방법의 개략적인 작동 흐름도이다.
도 3은 정상 및 종양 샘플에서 PSI 값의 분포에 대한 능형 그래프의 예를 보여준다. 10개의 스플라이싱 현상에 대한 능형 그래프가 도시된다. 이러한 예 중 일부에서 "이상치"는 점선 상자에 표시된다. 이러한 "이상치"는 나머지 종양 샘플과 다른 PSI 값을 갖는 종양 샘플이다.
도 4는 종양 및 정상 샘플의 세트를 갖는 2명의 환자로부터의 사시미 그래프(sashimi plot)의 예를 도시한다. 사시미 그래프는 엑손 자체뿐만 아니라 엑손의 접합에 매핑되는 시퀀싱 판독결과의 밀도를 보여준다. 시퀀싱 판독결과 밀도를 기반으로 샘플에서 발현되는 스플라이스 변이체 이소형을 추론할 수 있다. 표시된 숫자는 스플라이스 접합 범위의 판독결과 수를 나타낸다. 이 예에서 사시미 그래프를 기반으로 정상 샘플 ('N'으로 끝나는 숫자)은 스키핑된 스플라이스 변이체 이소형의 발현 증가를 나타내고 종양 샘플 ('T'로 끝나는 숫자)은 중간 엑손이 포함된 스플라이스 변이체 이소형의 발현 증가를 보여준다.
도 5는 관찰되는 스플라이싱 현상의 유형 및 이의 상응하는 잠재적인 후보 항원 영역을 예시한다. 관찰되는 스플라이싱 현상에는 5가지 유형이 있다; 즉: SIE - 스키핑/포함 현상; MXE - 엑손 대체 사용; IRE - 인트론 보유 현상; A5E - 대체 5' 스플라이싱 현상; 및 A3E - 대체 3' 스플라이싱 현상. 이러한 각각의 스플라이싱 현상은 두 개의 스플라이스 이소형을 생성할 수 있으며 그 중 하나는 암과 관련될 가능성이 더 높다. 서열의 추가 (엑손, 또는 인트론 또는 그 일부의 구별 사용을 통함)는 번역 프레임의 변화로 이어질 수 있다 (도면의 오른쪽에 '로 표시됨, 예를 들어 a'). 이는 HLA 결합 펩타이드의 후속 예측에 사용되는 항원 영역 (이 도면에서 연회색 선으로 표시됨)에 영향을 미칠 수 있다.
도 6 (a)는 잠재적인 HLA 결합 펩타이드를 확인하기 위해, 스플라이싱 변이가 스플라이스 이소형 간에 상이한 아미노산 영역 및 단백질 서열의 변화를 초래하는지를 결정하는 방법의 개략도이다. 각 스플라이싱 현상에 대해 엑손 1에 대한 번역 프레임이 결정되고 코딩되지 않거나 코딩되지만 정지 코돈을 포함하는 경우 제거된다. 코딩될 경우 데이터베이스 (예를 들어, Ensembl)에 따라 상응하는 엑손에 대해 획득한 번역 프레임 또는 개시 코돈의 위치를 기준으로 엑손 1이 번역된다. 이는 두 이소형 (이소형 1 및 2)에 대해 수행된다. 항원 영역은 (i) 스플라이싱 패턴의 변화가 번역 프레임의 변화를 유발하는지와 (ii) 도 6 (b)에 자세히 표시된 두 이소형의 단백질 서열을 비교하여 결정된다. b)는 스플라이싱 현상의 잠재적인 후보 항원 영역의 아미노산 서열을 결정하는 방법을 설명하는 예이다. 각 스플라이싱 현상은 2개의 스플라이스 이소형 (종양-관련 [TA] 및 비-종양-관련 [N])을 생성하고 잠재적인 후보 항원 영역이 표시된다 (밑줄이 그어진 부분, 두 가지 구성요소: N 말단 및 C 말단으로 구성됨). 측접 영역 (a-h)의 길이와 스플라이스 부위 (J)의 접합 아미노산은 HLA 결합 펩타이드의 길이와 같다 (이 예에서는 9). 각 스플라이스 이소형의 스플라이스 부위의 N-말단 및 C-말단을 개별적으로 비교하여 N-말단 및 C-말단 측접 영역이 긴 아미노산 수를 결정한다. 스플라이싱 현상이 프레임의 변화를 야기하는 경우, C-말단 측접 영역은 마지막 엑손의 모든 아미노산 서열로 구성된다. 두 스플라이스 이소형의 밑줄 친 영역의 아미노산 서열이 반복적으로 비교된다 (접합 아미노산 JT 및 JN으로 개시하여 AT1 및 AN1 등으로 이어짐). 동일하다면 종양 관련 이소형 (ATX, X는 이 예에서 a에서 h로 개시하는 가장 바깥쪽 아미노산을 나타냄)의 측접 영역에서 아미노산이 제거되고; 그외에는 과정이 중지된다. 항원 영역은 스플라이싱 현상의 N-말단 및 C-말단 영역의 비교 결과를 결합하는 것으로 구성된다. 추가로, 스플라이싱 현상이 인트론 또는 엑손 또는 이의 일부를 포함함으로써 추가 서열을 포함하게 되는 경우, 잠재적인 후보 항원 영역은 이러한 서열의 번역으로부터 아미노산 서열을 포함할 것이다. 다음을 가정한다: (i) 9개 아미노산 길이의 잠재적인 HLA 결합 펩타이드; (ii) 엑손 스키핑된 이소형은 종양과 관련된 것으로 나타났고; (iii) 종양 관련 및 비종양 관련 스플라이스 이소형의 접합에 있는 아미노산이 동일하며 (JT = JN); 및 (iv) 스플라이싱 현상은 번역 프레임의 변화를 일으키지 않는다. 이 가정 세트의 잠재적인 후보 항원 영역은 종양 관련 엑손 스키핑 현상에 대한 하단 (최종 출력 예)에 표시된다. 이 예에서 잠재적인 후보 항원 영역은 초기 8개 아미노산 길이의 측접 영역의 양쪽 말단에서 하나의 측접 아미노산을 제거하는 단계를 포함한다.
도 7은 암 환자로부터 유래된 T 림프구의 특성화를 위한 HLA 사량체-스플라이스 변이체 후보 항원 복합체의 제조를 나타내는 개략도이다.
도 8은 의학적 병태를 특성화 및/또는 치료하기 위한 후보 항원을 확인하기 위한 예시적인 시스템의 블록도이고;
도 9는 도 8의 시스템의 항원 예측 장치의 예시적인 구조의 블록도이다.
도 10은 위암에서 스플라이싱으로부터 항원을 유도하기 위한 작용 흐름도를 보여주는 개략도이다. 간단히 말해서, 위암 (GC) 환자의 RNA-Seq 데이터는 MISO를 사용하여 스플라이싱 변이에 대해 분석되었다. 선택 기준 (상위 0.5% 스플라이싱 현상, 스플라이싱의 적어도 20% 변화 (△PSI), 20 초과의 베이즈 인자 (Bayes factor), 적어도 3명의 환자에서 발생)을 데이터에 적용하여 스플라이싱 현상 목록을 생성하였다. 그런 다음 본 발명자들은 단백질 서열의 변화를 초래하는 스플라이스 현상을 찾았다. 변이된 스플라이싱으로 인한 이러한 단백질 영역 (291개 단백질 영역)은 HLA A11(총 39,876개 펩타이드)에 결합할 수 있는 8 내지 11개 아미노산 길이의 펩타이드인 펩타이드를 예측하는데 사용되었다. NetMHCpan3은 HLA 결합을 예측하는데 사용되었으며 HLA A11에 대해 높은 친화도를 가진 153개의 펩타이드가 반환되었다 (순위 0.5% 이하). 이 목록은 유사한 펩타이드를 제거하여 77개의 펩타이드로 추가로 감소되었다.
도 11은 19명의 환자 코호트에서 확인된 GC 종양 관련 스플라이싱 변이의 요약을 보여주는 개략도 및 그래프이다: (a) 위암에서 관찰되는 스플라이싱 변이 유형의 요약. 특히, 조절되지 않은 5가지 유형의 스플라이싱 현상이 있는 것으로 밝혀졌다: 즉: 엑손 스킵/포함; 엑손의 대체 사용, 인트론 보유 및 대체 5' 및 대체 3' 스플라이스 부위. 이러한 현상의 대부분은 엑손의 스킵/포함이고; (b) GC-ASE의 분포: MARK3 스플라이싱 유래 펩타이드 항원의 발생률. GC에서 확인된 스플라이스 현상에 대한 발생 및 PSI의 히스토그램.
도 12는 (a) GC 환자에서 GC TA-ASE 데이터세트 CyTOF 스크리닝으로부터 MARK3 펩타이드의 확인을 보여주는 그래프이다. 환자 SC020이 MARK3의 비정상 스플라이싱에서 유래된 펩타이드와 반응하는 CTL을 가지고 있음을 보여주는 히스토그램. 왼쪽 하단 패널은 환자 SC020에서 MARK3 스플라이스 변이체 펩타이드 (SVP)에 의해 염색된 세포 클러스터(cluster)를 보여준다. 오른쪽 패널은 활성화, 노화 마커 및 소진 마커를 사용하여 MARK SVP를 인식하는 CTL의 표현형 및 (b) 형광 표지된 A11 MHC 사량체를 사용한 MARK3 펩타이드의 확인을 보여준다.
도 13은 GC TA-ASE 펩타이드 스크리닝에서 양성 대조군 펩타이드를 보여주는 그래프이다. CyTOF 스크리닝에 사용된 양성 대조군. 표시된 펩타이드는 엡스타인 바르 바이러스 (Epstein Barr virus) (EBV)에서 유래된다. 이러한 EBV 항원은 집단에서 흔히 볼 수 있다. 히스토그램은 GC 환자에서 스플라이싱 유래 항원을 스크리닝하는데 사용된 동일한 환자 코호트에서 이러한 CTL의 빈도를 보여준다.
도 14는 (a) MARK3 GC 종양 관련 스플라이싱 현상 중앙값 △PSI =-0.335, 발생 = 4/19 GC 환자를 보여주는 그래프, 개략도 및 사진 표시이다. 원래 GC RNA-Seq에서 MARK3의 비정상 스플라이싱에 대한 사시미 그래프. 이 그래프는 엑손에 매핑되는 시퀀싱 판독결과 수와 엑손 접합에 매핑되는 판독결과 및 각 샘플의 PSI 값을 보여준다. 정상 및 종양 샘플의 사시미 그래프가 표시된다: 정상 샘플에는 'N'으로 끝나는 숫자가 있고 종양 샘플에는 'T'로 끝나는 숫자가 있다. 이 4쌍 샘플에서 종양 샘플에 대체 엑손의 포함이 증가하였다. MARK3의 변이된 스플라이싱은 19명의 환자 중 4명에서 볼 수 있으며 대체 스플라이싱된 엑손의 약 35%를 포함하고; (b) 이소형 1 내지 4에 상응하는 다양한 MARK3 스플라이스 이소형을 보여주는 Ensembl GRCh37.p13에서 획득된 전사체가 여기에 표시되고; (c) GC 세포주에서 MARK3 비정상 스플라이싱의 RT-PCR 검증. 상단 패널은 MARK3에서 두 개의 대체 엑손의 도식을 보여준다 (엑손 24는 세로 줄무늬를 사용하여 표시되고 엑손 25는 사선 줄무늬를 사용하여 표시됨). 세로 줄무늬가 있는 엑손은 CyTOF 스크리닝에서 검출된 펩타이드 (아래에 표시됨)를 인코딩한다. 이 두 엑손의 대체 스플라이싱은 4개의 이소형 (1 내지 4)의 형성으로 이어지며, 이소형 1 및 3은 둘 모두 CyTOF 스크리닝에서 검출된 펩타이드를 포함한다. 하단 패널은 다른 세포주 (별표)와 비교하여 HFE145, SNU1, HS738T, HS746T 및 HGC27에서 MARK3 이소형 1/3의 증가된 발현을 보여주는 RT-PCR이고; (d)는 GC 세포주에서 MARK3 스플라이스 이소형 1 내지 4의 정량화를 나타내는 표이며, 전체 중 각 이소형의 백분율이 표시되어 있다. 모든 MARK3 이소형 중 MARK3 이소형 1 및 3의 백분율이 표시되며, 이소형 1 및 3의 발현이 증가된 GC 세포주는 밑줄이 그어져 있다. MARK3 이소형의 정량화는 TBE-PAGE 겔에서 PCR 산물을 실행한 후 DNA 밴드 강도의 농도 측정에 의해 수행되었으며; (e)는 위 FFPE 샘플에서 MARK3 비정상 스플라이싱의 검증을 사진으로 나타낸 것이다. 위암 환자 (1 내지 20) 및 비만 위 샘플 (21 내지 26)의 FFPE 샘플에서 MARK3 스플라이싱의 RT-PCR 검증. 각 레인 아래에 표시된 숫자는 모든 MARK3 이소형의 총 발현 중 이소형 1 및 3의 백분율을 나타낸다. 확인된 MARK3 스플라이스 변이체 항원을 인코딩하는 엑손을 포함하는 MARK 스플라이스 이소형의 발현 증가가 GC 환자 20명 중 7명에서 관찰되었다 (밑줄친 샘플).
도 15는 (a) MARK3 펩타이드에 의한 자극의 존재 또는 부재 하의 건강한 공여체로부터의 PBMC에서 IFN-γ에 대한 ELISPOT 분석 결과를 보여주는 사진 표시이다. CTL은 동족 항원을 인식할 때만 IFN-γ를 분비한다. 이 도면에서 IFN-γ 분비 CTL은 PBMC가 MARK3 펩타이드로 자극되었을 때만 관찰되었고; (b) MARK3 CTL에 의한 세포 사멸 분석 결과. MARK3 특이적 CTL은 투여량 의존적 방식으로 MARK3 스플라이스 변이체 항원 및 HLA-A11을 발현하는 HGC-27 세포주의 사멸을 매개할 수 있다.
도 16은 MARK3 특이적 CD8+ T 림프구의 단리 및 이러한 세포의 단일 세포 분류에 대한 FACS 데이터의 그래프이다. MARK3 펩타이드가 부가된 항원 제시 세포로 자극된 건강한 공여체의 정제된 CD8+ T 세포를 세포 분류 전에 항-CD3, 항-CD8 항체, HLA-A*11 MARK3 오량체 및 DAPI로 염색하였다. 세포는 전방 (FSC-A) 및 측접 (SSC-A) 확산 영역 매개변수를 사용하여 게이팅된 후 FSC-A 대 높이 (FSC-H)를 사용하여 단일 세포에 대해 게이팅되었다. MARK3 특이적 CD8+ T 림프구는 DAPI 음성 생존 세포에 대한 게이팅, CD8 및 CD3의 발현 및 HLA-A11 MARK3 오량체에 대한 결합에 의해 확인되었다. 그런 다음 이러한 MARK3 특이적 CD8+ T 림프구를 단일 세포로 분류하여 후속 TCR 확인을 위해 PCR 플레이트에 배치하였다.
도 17은 TCGA SpliceSeq 데이터베이스에서 두경부 편평 세포 암종 (Head and Neck Squamous Cell Carcinoma) (HNSC), 신장 투명 세포 암종 (Kidney Renal Clear Cell Carcinoma) (KIRC) 및 신장 신 유두 세포 암종 (Kidney Renal Papillary Cell Carcinoma) (KIRP)에서 MARK3 엑손 24(TCGA SpliceSeq의 엑손 17)의 대체 스플라이싱의 개략도 및 그래프이다. 정상 샘플은 줄무늬 상자로 표시되고 종양 샘플은 비채색 상자로 표시된다. 이 도면에서 종양 샘플은 엑손 24의 증가된 포함을 보여준다.
도 18은 CyTOF 스크리닝 (실시예 3)에서 확인된 MARK3 SVA를 포함하는 MARK3 이소형의 대체 스플라이스 이소형을 보여주는 사진 표시이다: (a) 두경부 편평 세포 암종 (HNSC) 유래 세포주에서 MARK3 비정상 스플라이싱의 RT-PCR이 여기에 표시된다. 도 14c에 도시된 이소형 1 내지 4에 상응하는 MARK3 이소형이 이 도면에 표시되어 있다. MARK 스플라이스 이소형 1 및 3(이 이소형은 CyTOF 스크리닝에서 확인된 MARK3 SVA 펩타이드를 포함함, 실시예 3)의 증가된 발현을 나타내는 HNSC 세포주는 별표로 표시되고; (b) MARK3 스플라이스 이소형 1 내지 4의 정량화를 보여주는 표, 이소형 1 및 3의 발현이 증가된 HNSC 세포주는 밑줄이 그어져 있다. MARK3 이소형의 정량화는 TBE-PAGE 겔에서 PCR 산물을 실행한 후 DNA 밴드의 강도의 밀도 측정에 의해 수행되었다.
도 19는 결장직장암에서 공유 후보 항원 및 이의 동족 T 세포의 확인 및 검증의 요약을 보여주는 개략도 및 그래프이다: (a)는 결장직장암에서 스플라이싱으로부터 항원을 유도하기 위한 작용 흐름도를 보여주는 개략도이다. 간단히 말해서, 37명의 결장직장암 (CRC) 환자의 RNA-Seq 데이터를 rMATS를 사용하여 스플라이싱 변이에 대해 분석하였다. 선택 기준 (스플라이싱의 적어도 20% 변화 (△PSI), 적어도 6명의 환자에서 발생 및 10 초과의 스플라이스 접합 수)을 데이터에 적용하여 스플라이싱 현상 목록을 생성하였다. 단백질 서열의 변화를 초래한 스플라이스 현상이 확인되었고 변이된 스플라이싱으로 인한 이러한 단백질 영역 (352개의 후보 항원 영역)을 사용하여 HLA A11에 결합할 수 있는 8 내지 11개 아미노산 길이의 펩타이드인 펩타이드를 예측하였다 (총 62,970개 펩타이드). NetMHCpan3 및 NetMHCpan4는 HLA 결합을 예측하는데 사용되었으며 HLA A11에 대해 높은 친화도를 가진 425개의 펩타이드를 반환하였다 (두 알고리즘에 대해 순위 0.5% 이하). 이 목록은 유사한 펩타이드를 제거하여 102개의 펩타이드로 추가 감소되었다. 항원 특이적 T 세포를 확인하기 위한 면역학적 스크리닝은 8명의 CRC 환자의 PBMC에서 수행되었다 (환자 면역학적 반응). 이는 펩타이드/HLA 사량체 및 CyTOF를 사용하여 수행되었으며 이에 의해 27개의 SVP에 대한 항원 특이적 T-세포가 확인되었다. 9개의 SVP의 발현은 암 세포주에서 RT-PCR에 의해 구별적으로 스플라이싱되는 것을 확인하였다. 항원 특이적 T-세포는 이러한 SVP 중 3개에 대해 건강한 공여체 PBMC에서 생성될 수 있으며, 이는 이러한 표적이 면역 관련됨을 나타낸다. (b) 37명의 CRC 환자에서 관찰된 스플라이싱 변이 유형의 요약. 특히, 조절되지 않은 4가지 상이한 유형의 스플라이싱 현상이 있는 것으로 밝혀졌다: 즉, 엑손 스킵/포함 (SIE); 인트론 보유 (IRE) 및 대체 5' (A5E) 및 대체 3' 스플라이스 부위 (A3E). 이러한 현상의 대부분은 엑손의 스킵/포함이다. 코딩 서열의 변화를 생성하는 스플라이스 현상의 수가 표시되고; (c) CRC-ASE의 분포와 스플라이스 현상의 유형이 표시된다. HLA-A11 펩타이드를 생성한 CRC에서 확인된 스플라이스 현상에 대한 발생 및 △PSI의 히스토그램이 표시된다.
도 20은 CRC HLA-A11 사량체/CyTOF 스크리닝에서 확인된 SVP 표적을 보여주는 2개의 표를 제공한다: (a) 8명의 CRC 환자에서 검출된 HLA-A11 결합 펩타이드의 요약. 이러한 표적에 결합하는 이러한 환자의 CD8 양성 T 림프구의 빈도는 제1 표에 표시되어 있다. 이러한 SVP를 발생시킨 발생, △PSI 및 스플라이스 현상의 유형이 또한 제1 표에 나와 있고; (b) SVP를 발생시킨 종양 관련 이소형뿐만 아니라, 서열 좌표의 요약. 이 좌표는 인간 GRCh37/hg19 조립을 기반으로 한다.
도 21은 결장직장암에서 확인된 종양-관련 스플라이싱의 그래프이다: (a) 종양-관련이고 단백질 코딩 서열의 변화를 야기하는 CRC에서 확인된 스플라이싱 변이. 각 열은 CRC 환자의 샘플을 나타내고 각 행은 단일 스플라이스 현상을 나타낸다. 각 샘플에 대한 PSI 값이 표시되며 종양 대 정상 샘플에 대한 PSI 값에 명확한 차이가 있다. 종양 대 정상 샘플 간의 PSI 값의 이러한 차이는 이러한 종양 관련 스플라이스 변이체가 CRC 환자의 치료에 활용될 수 있음을 보여주고; (b) 개별 CRC 환자에 존재하는 공유 종양 관련 스플라이스 변이체의 수를 보여주는 히스토그램. 평균적으로 대부분의 환자는 약 90개의 공유 종양 관련 스플라이스 변이체를 보여주며 이는 CRC 환자의 임의의 분자 하위 유형이나 미세부수체 상태에 제한되지 않는다. 이는 주로 MSI/CMS 1 CRC 환자에 존재하는 체세포 점 돌연변이에서 유래된 신생항원과 다르다. CMS = 공통 분자 하위유형; MSI = 미세부수체 불안정.
도 22는 CAMKK1의 대체 스플라이싱을 보여주는 개략도, 그래프 및 사진 표시이다: (a) CRC 환자로부터의 정상 (Norm) 및 종양 (Tum) 샘플에서 CAMKK1의 PSI 값을 나타내는 점 그래프; (b) CRC 환자의 정상 샘플뿐만 아니라 종양에 존재하는 CAMKK1 스플라이스 이소형을 보여주는 사시미 그래프. 종양 샘플은 정상 샘플에 비해 증가된 엑손 스키핑을 나타낸다. 사시미 그래프는 정상 샘플 그룹과 이상치인 종양 샘플 그룹에 대해 충분한 접합 수가 있는 환자 샘플의 시퀀싱 판독결과 밀도를 보여준다. (c) 인간 GRCh37/hg19 조립에 존재하는 CAMKK1 전사체. 대체 스플라이싱된 엑손은 상자로 표시된다. 이 엑손의 대체 스플라이싱은 이전에 관찰된 적이 없다. RT-PRC에 의해 검출된 영역은 아래와 같으며 본 연구에서 확인된 엑손 외에 추가의 대체 스플라이싱된 엑손 (회색 상자)이 포함되어 있다. 이 두 가지 대체 엑손은 4개의 다른 스플라이스 이소형을 형성한다: 277 bp 및 163 bp 스플라이스 이소형 (둘 모두 TA로 표시됨)은 모두 본 연구에서 확인된 HLA-A11 결합 펩타이드를 포함한다. 163 bp 스플라이스 이소형 (TA 및 별표로 표시됨)은 본 연구에서 검출된 스플라이스 이소형에 상응하는 스플라이스 이소형이고 도 22(b)의 사시미 그래프에 표시되며; (d) CRC 세포주 및 환자 유래 생검 물질에서 CAMKK1 비정상 스플라이싱의 RT-PCR. CAMKK1 종양 관련 스플라이스 변이체의 발현 증가를 나타내는 샘플은 별표로 표시된다. 종양 관련 스플라이스 변이체에 상응하는 밴드는 TA로 표시된다. 더 작은 PCR 밴드 (163 bp)는 rMATS에 의해 확인된 종양 관련 스플라이스 변이체에 상응하고; (e) CAMKK1의 정상 관련 DNA 및 정상 단백질 서열이 표시된다 (서열번호 56 및 57). CAMKK1의 종양 관련 DNA 서열 및 종양 관련 단백질 서열이 제시되어 있다 (서열번호 58 및 59). 도 22(b)에 나타낸 스플라이스 이소형에 대한 DNA 및 아미노산 서열이 제시되어 있다 (종양 및 정상으로 표지됨). 확인된 CAMKK1의 엑손 스키핑 (Alt 엑손으로 표시)은 단백질 서열의 변화를 야기한다. 대체 스플라이싱된 엑손은 22개의 뉴클레오타이드를 포함하고 이 엑손의 스키핑에 의해 전사체의 단백질 번역 프레임이 변화된다. 이는 신규한 단백질 서열과 단백질의 조기 종결로 이어진다. 도 20에서 확인된 HLA-A11 결합 펩타이드는 밑줄이 그어져 있고; (f) HNSC 환자의 정상 및 종양 샘플에서 CAMKK1의 PSI 값을 보여주는 점 그래프; (g) HNSC 환자의 종양 및 정상 샘플에 존재하는 CAMKK1 스플라이스 이소형을 보여주는 사시미 그래프. 종양 샘플은 정상 샘플에 비해 증가된 엑손 스키핑을 나타낸다. 사시미 그래프는 정상 샘플 그룹과 이상치인 종양 샘플 그룹에 대해 충분한 접합 수가 있는 환자 샘플의 시퀀싱 판독결과 밀도를 보여주고; (h) HNSC 세포주에서 CAMKK1 비정상 스플라이싱의 RT-PCR. CAMKK1 종양 관련 스플라이스 변이체의 발현 증가를 나타내는 샘플은 별표로 표시된다. 종양 관련 스플라이스 변이체에 상응하는 PCR 밴드는 "TA"로 표시된다.
도 23은 LRR1의 대체 스플라이싱을 보여주는 개략도, 그래프 및 사진 표시이다: (a) CRC 환자로부터의 정상 및 종양 샘플에서 LRR1의 PSI 값을 나타내는 점 그래프. (b) CRC 환자의 정상 샘플뿐만 아니라 종양에 존재하는 LRR1 스플라이스 이소형을 보여주는 사시미 그래프. 종양 샘플은 정상 샘플에 비해 증가된 엑손 스키핑을 나타낸다. 사시미 그래프는 정상 샘플 그룹과 이상치인 종양 샘플 그룹에 대해 충분한 접합 수가 있는 환자 샘플의 시퀀싱 판독결과 밀도를 보여준다. (c) CRC 세포주 및 환자 유래 생검 물질에서 LRR1 비정상 스플라이싱의 RT-PCR. LRR1 종양 관련 스플라이스 변이체의 발현 증가를 나타내는 샘플은 별표로 표시된다. 종양 관련 스플라이스 변이체에 상응하는 PCR 밴드는 "TA"로 표시된다. (d) LRR1의 정상 관련 DNA 및 정상 단백질 서열이 표시된다 (서열번호 60 및 61). LRR1의 종양 관련 DNA 서열 및 종양 관련 단백질 서열이 제시되어 있다 (서열번호 62 및 63). LRR1 종양 관련 스플라이스 변이체에 존재하는 후보 항원 영역에 대한 DNA 및 아미노산 서열은 대체 스플라이싱된 엑손 (도표에 표시된 Alt 엑손)을 포함하는 스플라이스 변이체와 함께 표시된다. 대체 스플라이싱된 엑손의 부분 서열만 표시되고 (마침표로 표시됨) 이 엑손의 스키핑에 의해 하류 엑손에 대한 판독 프레임의 변화를 야기한다. LRR1에 대한 후보 항원 영역은 62개 아미노산 길이의 다른 C-말단으로 구성되며 두 개의 다른 HLA 대립인자 (각각 HLA-A11 및 HLA-24)에 결합될 수 있는 2개의 펩타이드 (각각 SLPRFGYRK 및 SYHSIPSLPRF, 서열번호 36 및 서열번호 51)를 생성한다. 이 두 펩타이드에 특이적인 항원 특이적 CD8+ T 세포가 CRC 환자에서 검출되었다. (e) HNSC 환자의 정상 및 종양 샘플에서 LRR1의 PSI 값을 보여주는 점 그래프. (f) HNSC 환자의 정상 샘플뿐만 아니라 종양에 존재하는 LRR1 스플라이스 이소형을 보여주는 사시미 그래프. 종양 샘플은 정상 샘플에 비해 증가된 엑손 스키핑을 나타낸다. 사시미 그래프는 정상 샘플 그룹과 이상치인 종양 샘플 그룹에 대해 충분한 접합 수가 있는 환자 샘플의 시퀀싱 판독결과 밀도를 보여준다. (g) HNSC 세포주에서 LRR1 비정상 스플라이싱의 RT-PCR. LRR1 종양 관련 스플라이스 변이체의 발현 증가를 나타내는 샘플은 별표로 표시된다. 종양 관련 스플라이스 변이체에 상응하는 PCR 밴드는 "TA"로 표시된다.
도 24는 ZNF670의 대체 스플라이싱을 보여주는 개략도, 그래프 및 사진 표시이다. (a) CRC 환자의 정상 및 종양 샘플에서 ZNF670의 PSI 값을 보여주는 점 그래프. (b) CRC 환자의 정상 샘플뿐만 아니라 종양에 존재하는 ZNF670 스플라이스 이소형을 보여주는 사시미 그래프. 종양 샘플은 정상 샘플에 비해 증가된 엑손 스키핑을 나타낸다. 사시미 그래프는 정상 샘플 그룹과 이상치인 종양 샘플 그룹에 대해 충분한 접합 수가 있는 환자 샘플의 시퀀싱 판독결과 밀도를 보여준다. (c) CRC 세포주 및 환자 유래 생검 물질에서 ZNF670 비정상 스플라이싱의 RT-PCR. ZNF670 종양 관련 스플라이스 변이체의 발현 증가를 나타내는 샘플은 별표로 표시된다. (d) 인간 GRCh37/hg19 조립에 존재하는 ZNF670 전사체. 대체 스플라이싱된 엑손은 상자로 표시된다. 이 엑손의 대체 스플라이싱은 이전에 관찰된 적이 없다. (e) ZNF670의 정상 관련 DNA 및 정상 단백질 서열이 표시된다 (서열번호 64 및 65). ZNF670의 종양 관련 DNA 서열 및 종양 관련 단백질 서열이 제시되어 있다 (서열번호 66 및 67). 확인된 ZNF670의 엑손 스키핑은 단백질 서열의 변화를 야기한다. 대체 스플라이싱된 엑손은 98개의 뉴클레오타이드를 포함하고 이 엑손의 스키핑에 의해 전사체의 단백질 번역 프레임이 변화된다. 이 비정상 스플라이싱 현상은 단백질의 C-말단의 변화를 포함하는 신규한 단백질 서열을 유도한다. 도 20에서 확인된 HLA-A11 결합 펩타이드는 밑줄이 그어져 있다.
도 25는 GRINA의 대체 스플라이싱을 보여주는 개략도, 그래프 및 사진 표시이다: (a) CRC 환자의 정상 및 종양 샘플에서 GRINA의 PSI 값을 나타내는 점 그래프. (b) CRC 환자의 정상 샘플뿐만 아니라 종양에 존재하는 GRINA 스플라이스 이소형을 보여주는 사시미 그래프. 종양 샘플은 정상 샘플에 비해 증가된 스키핑을 나타낸다. 사시미 그래프는 정상 샘플 그룹과 이상치인 종양 샘플 그룹에 대해 충분한 접합 수가 있는 환자 샘플의 시퀀싱 판독결과 밀도를 보여준다. (c) CRC 세포주 및 환자 유래 생검 물질에서 GRINA 비정상 스플라이싱의 RT-PCR. GRINA 종양 관련 스플라이스 변이체의 발현 증가를 나타내는 샘플은 별표로 표시된다. 종양 관련 스플라이스 변이체에 상응하는 PCR 밴드는 "TA"로 표시된다. (d) HNSC 환자의 정상 및 종양 샘플에서 GRINA의 PSI 값을 보여주는 점 그래프. (e) HNSC 환자의 정상 샘플뿐만 아니라 종양에 존재하는 GRINA 스플라이스 이소형을 보여주는 사시미 그래프. 종양 샘플은 정상 샘플에 비해 증가된 스키핑을 나타낸다. 사시미 그래프는 정상 샘플 그룹과 이상치인 종양 샘플 그룹에 대해 충분한 접합 수가 있는 환자 샘플의 시퀀싱 판독결과 밀도를 보여준다. (f) HNSC 세포주에서 GRINA 비정상 스플라이싱의 RT-PCR. GRINA 종양 관련 스플라이스 변이체의 발현 증가를 나타내는 샘플은 별표로 표시된다. 종양 관련 스플라이스 변이체에 상응하는 PCR 밴드는 "TA"로 표시된다.
도 26은 확인된 CRC HLA-A11 SVP에 대해 생성된 항원-특이적 CD8+ T-세포에 대한 FACS 데이터의 그래프이다. 건강한 공여체 (HSA27 및 HSA38)의 PBMC를 사용하여 moDC를 생성했으며, 이후 동일한 공여체의 CD8 양성 T 세포와 공동 배양에 사용하였다. HLA-A11에 결합하고 CRC HLA-A11/CyTOF 스크리닝에서 확인된 SVP (LRR1, GRINA 및 ZNF670) (도 20 참조)를 moDC/CD8+ T-세포 공동 배양 동안 추가하여 이러한 SVP에 대한 항원-특이적 T 세포의 확장을 자극하였다. 항원 특이적 CD8+ T 세포는 APC 및 PE로 표지된 SVP 사량체를 사용하여 검출되었다: 두 가지 형광 염료를 사용하여 이러한 항원 특이적 T 세포 검출의 특이성을 증가시켰다. 항원 특이적 T 세포는 CD8+ T 세포를 moDC로 자극한 후에만 관찰되었다 (하단 행). 이와 달리 이러한 항원 특이적 T 세포는 자극되지 않은 PBMC의 CD8 양성 T 세포에는 존재하지 않았다.
도 27은 CRC HLA-A24 사량체/CyTOF 스크리닝에서 확인된 SVA 표적을 보여주는 2개의 표를 제공한다: (a) 10명의 CRC 환자에서 검출된 HLA-A24 결합 펩타이드의 요약. ID가 '1466'인 환자에게 존재하는 항원 특이적 CD8 양성 T 림프구의 빈도는 표에 나와 있다. 이러한 SVA를 발생시킨 스플라이스 현상의 발생, △PSI 및 유형이 또한 표시되고; (b) SVA를 발생시킨 종양 관련 이소형뿐만 아니라, 서열 좌표의 요약. 이 좌표는 인간 GRCh37/hg19 조립를 기반으로 한다.
도 28은 MZF1의 대체 스플라이싱을 보여주는 개략도, 그래프 및 사진 표시이다: (a) CRC 환자로부터의 정상 및 종양 샘플에서 MZF1의 PSI 값을 나타내는 점 그래프; (b) CRC 환자의 정상 샘플뿐만 아니라 종양에 존재하는 MZF1 스플라이스 이소형을 보여주는 사시미 그래프. 종양 샘플은 정상 샘플에 비해 증가된 인트론 보유를 보여준다. 사시미 그래프는 정상 샘플 그룹과 이상치인 종양 샘플 그룹에 대해 충분한 접합 수가 있는 환자 샘플의 시퀀싱 판독결과 밀도를 보여준다. (c) CRC 세포주 및 환자 유래 생검 물질에서 MZF1 비정상 스플라이싱의 RT-PCR. MZF1 종양 관련 스플라이스 변이체의 발현이 증가한 샘플은 별표로 표시된다. 종양 관련 스플라이스 변이체에 상응하는 PCR 밴드는 "TA"로 표시된다.
도 29는 31명의 환자의 코호트에서 확인된 HNSC 종양 관련 스플라이싱 변이의 요약을 보여주는 그래프 및 개략도이다: (a) HNSC에서 관찰되는 스플라이싱 변이 유형의 요약. 특히, 조절되지 않은 네(4)가지 유형의 스플라이싱 현상이 있는 것으로 밝혀졌다: 즉: 엑손 스킵/포함 (SIE); 인트론 보유 (IRE); 대체 5' (A5E) 및 대체 3' 스플라이스 부위 (A3E). 이러한 현상의 대부분은 엑손의 스킵/포함이다. 코딩 서열의 변화를 생성하는 스플라이스 현상의 수가 표시되고; (b) HNSC에서 확인된 스플라이스 현상에 대한 PSI의 발생 및 변화는 히스토그램에 표시된다. HNSC-ASE의 분포와 스플라이스 현상의 유형이 표시되고; (c) HLA-A11, HLA-A02 및 HLA-A24와 같은 HLA 대립인자에 결합할 수 있는 8 내지 11개 아미노산 길이의 펩타이드를 생성하는 스플라이스 현상의 수 (집단의 25 내지 50%에 존재)가 표시된다.
도 30은 HNSC에 존재하는 종양 관련 스플라이스 변이체에 존재하는 CRC HLA-A11/HLA-A24 사량체/CyTOF 스크리닝 (실시예 13 및 실시예 21에 기재된 바와 같음)에서 확인된 SVP 표적을 보여주는 표이다. HNSC 환자에서 이러한 SVA를 발생시킨 스플라이스 현상의 발생, △PSI 및 유형이 표에 나와 있다.
본 발명의 실시양태는 일반적으로 T 림프구에 제시하기 위한 펩타이드-HLA (pHLA) 복합체를 형성할 수 있는 대체 스플라이싱 현상으로부터 발생하는 HLA-결합 펩타이드의 확인에 관한 것이다. 본 방법의 실시양태에 의해 확인된 펩타이드는 스플라이스 변이체 항원으로 지칭될 수 있다. 실시양태는 또한 본 명세서에서 항원-특이적 T 림프구로도 지칭되는 이러한 pHLA 복합체를 인식하는 T 림프구의 확인에 관한 것이다. 유리하게는, 현재 개시된 실시양태는 환자 특이적 항원을 확인하려고 하기 보다는 의학적 병태를 앓고 있는 1명 초과의 환자에 걸쳐 공유되는 스플라이스 변이체 항원을 확인한다.
암 환자로부터 유래된 스플라이스 변이체 항원의 단일 라이브러리를 제조하고 환자 하위 그룹 간에 공유되는 항원을 찾는 것이 가능하기 때문에, 질량 세포 계측법과 같은 방법을 사용하여, 항원 특이적 T 림프구에 대한 스크리닝이 크게 단순화된다. 또한 환자 간에 항원이 공유된다는 사실이 확인되면 이 하위 그룹에 속하는 환자를 확인하고 항원 특이적 T 림프구를 사용하여 적절한 면역요법을 개발하기 위한 스크리닝 시험을 개발하는 것이 가능해진다. 그런 다음 이러한 면역요법은 요법이 특정 암의 치료에 효과적일 수 있는 것으로 결정된 환자 하위 그룹에 투여될 수 있다.
후보 항원을 확인하는 방법
본 명세서에서는 의학적 병태를 특성화 및/또는 치료하기 위한 하나 이상의 공유 후보 항원을 확인하는 방법이 개시되고, 본 방법은
(i) 의학적 병태를 가진 환자의 제1 코호트로부터 시험 샘플에 대한 전사체 데이터를 획득하는 단계;
(ii) 참조 샘플의 세트에 대한 참조 전사체 데이터를 획득하는 단계;
(iii) 전사체 데이터를 참조 전사체 데이터와 비교함으로써, 참조 샘플과 비교하여 시험 샘플의 서브세트의 각 샘플에서 더 많이 전사되는 하나 이상의 스플라이스 변이체를 결정하는 단계;
(iv) 각각의 상기 공유 스플라이스 변이체에 대해, 공유 스플라이스 변이체의 아미노산 번역에서 발생하지만, 참조 샘플에서 전사되는 동일한 유전자의 상응하는 스플라이스 변이체의 아미노산 번역에서는 발생하지 않는 하나 이상의 아미노산 서열을 결정하는 단계; 및
(v) 하나 이상의 공유 아미노산 서열 또는 이의 일부의 HLA 결합을 예측하여, 하나 이상의 공유 후보 항원으로서, 하나 이상의 공유 아미노산 서열을 확인하는 단계
를 포함한다.
후보 항원/항원들
본 명세서에 규정된 바와 같은 방법은 의학적 병태를 특성화 및/또는 치료하기 위한 하나 이상의 공유 후보 항원을 확인하는 단계를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "후보 항원"은 동물에서 면역 반응을 유도할 수 있는 것으로 예측되는 폴리펩타이드, 또는 동물에서 면역 반응을 유도할 수 있는 폴리펩타이드를 인코딩하는 것으로 예측되는 핵산 (예를 들어, RNA 전사체 또는 mRNA)을 지칭한다. 후보 항원은 동물에서 면역 반응을 유도할 수 있는 폴리펩타이드를 인코딩하거나, 후보 항원 (즉, 동물에서 면역 반응을 유도할 수 있는 폴리펩타이드, 또는 RNA 전사체 또는 mRNA와 같은 핵산)을 항원으로 검증하는 CyTOF와 같은 다양한 기술을 사용하여 추가로 시험될 수 있다.
일부 실시양태에서, 후보 항원은 HLA 결합 펩타이드이다. 일부 실시양태에서, 후보 항원은 면역원성 HLA 결합 펩타이드이다.
일부 실시양태에서, 후보 항원은 스플라이스 변이체 또는 스플라이스 변이체 항원이다. 스플라이스 변이체 또는 스플라이스 변이체 항원은 HLA 결합 펩타이드일 수 있고, 면역원성일 수 있다.
일부 실시양태에서, 후보 항원은 의학적 병태를 앓고 있는 1명 초과의 환자에 걸쳐 공유되고 의학적 병태를 앓고 있는 환자의 하위 그룹을 규정한다. 따라서 후보 항원은 "공유 후보 항원"으로 지칭될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 명세서에 규정된 의학적 병태는 하나 이상의 후보 항원의 발현과 관련된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "스플라이스 변이체"는 초기 pre-mRNA 전사체 서열로부터 특정 엑손 또는 인트론 서열의 포함 또는 배제에 기반하여 유전자좌위로부터 전사된 동일한 초기 pre-mRNA 서열로부터의 구별적 스플라이싱의 결과인 상이한 mRNA 분자를 지칭할 수 있다. 각각의 분리된 스플라이스 변이체는 처리된 mRNA에 의해 인코딩된(encoded) 아미노산 서열을 기반으로 하는 특정 폴리펩타이드와 상관관계가 있을 수 있다.
용어 "스플라이스 변이체"는 유전자좌위로부터 전사된 mRNA의 스플라이스 변이체 (또한 소위 이소형)에 의해 인코딩된 폴리펩타이드를 또한 지칭할 수 있다. 따라서 단일 유전자좌위는 다중 단백질 (또는 폴리펩타이드) 스플라이스 변이체 (또는 이소형)를 인코딩할 수 있다.
스플라이스 변이체는 핵산 (예를 들어, RNA 전사체 또는 mRNA) 또는 폴리펩타이드일 수 있다. 스플라이스 변이체라는 용어는 또한 스플라이스 변이체 핵산 또는 폴리펩타이드의 단편을 지칭할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "대체 스플라이싱 현상"은 대체 스플라이싱에 의해 동일한 유전자 또는 동일한 pre-mRNA로부터 발생하는 2개의 폴리뉴클레오타이드 사이에 존재하는 임의의 서열 변이를 지정한다. 이 용어는 또한 상기 서열 변이를 포함하는 스플라이싱 이소형 또는 이의 단편을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 상기 서열 변이는 적어도 하나의 엑손 또는 엑손의 일부의 삽입 또는 결실을 특징으로 할 수 있다. 용어 "대체 스플라이싱 현상"은 또한 스키핑된 엑손 현상, 상호 배타적 현상 (또는 상호 배타적 엑손), 대체 3' 스플라이스 부위, 대체 5' 스플라이스 부위, 또는 인트론 보유 현상을 포함할 수 있다.
용어 "펩타이드", "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 상호 혼용되며 펩타이드 결합 또는 변형된 펩타이드 결합을 통해 연결된 아미노산의 임의의 중합체 (디펩타이드 이상)를 포함한다. 본 발명의 폴리펩타이드는 탄수화물 기와 같은 비펩타이드성 성분을 포함할 수 있다. 탄수화물 및 다른 비-펩타이드 치환기는 폴리펩타이드가 생성되는 세포에 의해 폴리펩타이드에 추가될 수 있으며 세포 유형에 따라 달라질 것이다. 폴리펩타이드는 아미노산 골격 구조의 관점에서 본 명세서에서 규정되며; 탄수화물 기와 같은 치환기는 일반적으로 지정되지 않지만 그럼에도 불구하고 존재할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "폴리뉴클레오타이드" 또는 "핵산"은 mRNA, RNA, cDNA 또는 DNA를 지정한다. 이 용어는 일반적으로 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시뉴클레오타이드 또는 두 유형의 뉴클레오타이드의 변형된 형태인 적어도 10개의 염기 길이의 뉴클레오타이드의 중합체 형태를 지칭한다. 이 용어에는 단일 및 이중 가닥 형태의 DNA가 포함된다.
암
본 명세서에 언급된 의학적 병태는 암일 수 있다. 용어 "암" 및 "암성"은 부분적으로 조절되지 않는 세포 성장을 특징으로 하는 포유류의 생리학적 병태를 지칭하거나 기재한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "암"은 초기 및 말기 암을 포함하는 비전이성 및 전이성 암을 지칭한다. "비전이성"은 1차 부위에 남아 있고 림프계 또는 혈관계 또는 1차 부위 이외의 조직으로 침투하지 않은 암을 의미한다. "전이성 암"이라는 용어는 신체의 한 부분에서 다른 부분으로 확산되었거나 확산될 수 있는 암을 지칭한다. 일반적으로, 비전이성 암은 0기, I기 또는 II기 암이고 때때로 III기 암인 모든 암이다. 반면에 전이성 암은 일반적으로 IV기 암이다.
"암"이라는 용어는 다음에 제한되는 것은 아니나, 유방암, 대장암, 폐암, 소세포 폐암, 위 (위장)암, 간암, 혈액암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안내 흑색종, 자궁 육종, 난소암, 직장 또는 결장직장암, 항문암, 결장암, 난관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암, 외음부암, 편평 세포 암종, 질암, 호지킨병, 비호지킨 림프종, 식도암, 소장암, 내분비암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직종양, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구성 림프종, 방광암, 신장암, 요관암, 신세포 암종, 신우 암종 (renal pelvic carcinoma), CNS 종양, 신경교종, 성상세포종, 다형성 교모세포종, 원발성 CNS 림프종, 골수 종양, 뇌간 신경교종, 뇌하수체 선종 (pituitary adenoma), 포도막 흑색종 (또한 소위 안구내 흑색종), 고환암, 구강암, 인두암 또는 이의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 암은 위암 (gastric cancer), 두경부암 (head and neck cancer), 결장직장암 (colorectal cancer) 또는 간세포암 (hepatocellular cancer)이다. 일부 실시양태에서, 암은 위암 또는 결장직장암이다.
일부 실시양태에서, 암은 위암이다. 일부 실시양태에서, 암은 두경부암이다. 일부 실시양태에서, 암은 결장직장암이다. 일부 실시양태에서, 암은 간세포암이다. 일부 실시양태에서, 암은 유방암이다.
일부 실시양태에서, 암은 하나 이상의 공유 항원의 발현을 특징으로 하는 암이다. 암은 신체의 임의의 위치에 존재할 수 있지만 하나 이상의 공유 항원의 발현으로 규정된다.
일부 실시양태에서, 암은 전이성 암이다. 전이성 암은 신체의 다른 위치에 존재할 수 있지만 하나 이상의 공유 항원의 발현을 특징으로 한다.
특정 암 유형 (예를 들어, 위암)에서 하나의 공유 항원을 확인하면 동일한 공유 항원의 발현과 관련된 다른 암 유형 (예를 들어, 두경부암 또는 결장암)을 특성화하는데 도움이 될 수 있다. 이는 공유 항원의 발현과 관련된 다양한 암 유형에 대한 진단 시험 또는 치료의 개발에 도움이 될 수 있다.
MAP/미세관 친화도-조절 키나제 3 (MARK3)
일부 실시양태에서, 의학적 병태는 암이고 의학적 병태를 특성화 및/또는 치료하기 위해 확인된 공유 후보 항원은 MARK3 스플라이스 변이체이다. 다시 말해서, 공유 후보 항원은 MARK3-특이적 암을 앓고 있는 암 환자의 하위그룹을 특성화 및/또는 치료하기 위해 확인될 수 있으며, MARK3-특이적 암은 MARK3 스플라이스 변이체의 발현과 관련된다. 암은 신체의 임의의 위치에 위치할 수 있지만 MARK3 스플라이스 변이체의 발현으로 규정된다.
일부 실시양태에서, MARK3 스플라이스 변이체는 RNMSFRFIK (서열번호 1)의 서열을 갖는 펩타이드를 포함하거나, RNMSFRFIK (서열번호 1)의 서열을 갖는 펩타이드를 인코딩한다.
일부 실시양태에서, MARK3 스플라이스 변이체는 서열번호 1에 대해 적어도 80% (또는 적어도 88%) 서열 동일성(sequence identity)을 갖는 펩타이드를 포함하고, 또는 서열번호 1에 대해 적어도 80% (또는 적어도 88%) 서열 동일성을 갖는 펩타이드를 인코딩한다.
MARK3 스플라이스 변이체는 실시예 4의 표 1에 제시된 하나 이상의 엑손을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, MARK3 스플라이스 변이체 (핵산)는 엑손 24를 포함한다. 일부 실시양태에서, MARK3 스플라이스 변이체는 엑손 23, 24, 25 및 26을 포함한다. 일부 실시양태에서, MARK3 스플라이스 변이체는 엑손 23, 24 및 26을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 방법은 MARK3의 이소형 1 (즉, ENST00000429436.2, ENST00000335102.5 또는 ENST00000554627.1)에 상응하는 스플라이스 변이체의 수준을 결정하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 방법은 MARK3의 이소형 3 (즉, ENST00000440884.3)에 상응하는 스플라이스 변이체의 수준을 결정하는 단계를 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이 단리된 용어는 자연 상태로부터 "인간의 손에 의해" 변이된 것을 의미하고; 즉, 자연에서 발생하는 경우 원래 환경에서 변화되거나 제거되었거나 두 경우 모두이다. 본 명세서에 개시된 MARK3 스플라이스 변이체는 단리된 MARK3 스플라이스 변이체일 수 있다.
신경모세포종 브레이크포인트 패밀리 구성원 9 (Neuroblastoma Breakpoint Family member; NBPF9)
일부 실시양태에서, 의학적 병태는 암이고 의학적 병태를 특성화하고/거나 치료하기 위해 확인된 공유 후보 항원은 NBPF9 스플라이스 변이체이다. 다시 말해서, 공유 후보 항원은 NBPF9-특이적 암을 앓고 있는 암 환자의 하위그룹을 특성화 및/또는 치료하기 위해 확인될 수 있으며, NBPF9-특이적 암은 NBPF9 스플라이스 변이체의 발현과 관련된다. 암은 신체의 임의의 위치에 위치할 수 있지만 NBPF9 스플라이스 변이체의 발현에 의해 규정된다.
NBPF9 스플라이스 변이체는 인트론 (Chr1: 144826287:144826932:+)을 보유하게 하여 엑손 (chr1:144826235:144827105:+)을 포함하는 전사체를 생성하는 인트론 보유 현상으로 인한 것일 수 있다.
일부 실시양태에서, NBPF9 스플라이스 변이체는 SSFYALEEK (서열번호 31)의 서열을 갖는 펩타이드를 포함하거나, SSFYALEEK (서열번호 31)의 서열을 갖는 펩타이드를 인코딩한다.
일부 실시양태에서, NBPF9 스플라이스 변이체는 서열번호 31에 대해 적어도 80% (또는 적어도 88%) 서열 동일성을 갖는 펩타이드를 포함하고, 또는 서열번호 31에 대해 적어도 80% (또는 적어도 88%) 서열 동일성을 갖는 펩타이드를 인코딩한다.
본 명세서에 개시된 바와 같은 NBPF9 스플라이스 변이체는 단리된 NBPF9 스플라이스 변이체일 수 있다.
Par-3 패밀리 세포 극성 조절인자 (PARD3)
일부 실시양태에서, 의학적 병태는 암이고 의학적 병태를 특성화하고/거나 치료하기 위해 확인된 공유 후보 항원은 PARD3 스플라이스 변이체이다. 다시 말해서, 공유 후보 항원은 PARD3-특이적 암을 앓고 있는 암 환자의 하위그룹을 특성화 및/또는 치료하기 위해 확인될 수 있으며, PARD3-특이적 암은 PARD3 스플라이스 변이체의 발현과 관련된다. 암은 신체의 임의의 위치에 위치할 수 있지만 PARD3 스플라이스 변이체의 발현에 의해 규정된다.
PARD3 스플라이스 변이체는 엑손 (chr10:34625127:34625171:- 및 chr10:34626206:34626354:-)을 포함하는 전사체를 생성하는 5' 스플라이스 부위의 대체 사용으로 인한 것일 수 있다.
일부 실시양태에서, PARD3 스플라이스 변이체는 SQLDFVKTRK (서열번호 32)의 서열을 갖는 펩타이드를 포함하거나, SQLDFVKTRK (서열번호 32)의 서열을 갖는 펩타이드를 인코딩한다.
일부 실시양태에서, PARD3 스플라이스 변이체는 서열번호 32에 대해 적어도 80% (또는 적어도 88%) 서열 동일성을 갖는 펩타이드를 포함하고, 또는 서열번호 32에 대해 적어도 80% (또는 적어도 88%) 서열 동일성을 갖는 펩타이드를 인코딩한다.
본 명세서에 개시된 바와 같은 PARD3 스플라이스 변이체는 단리된 PARD3 스플라이스 변이체일 수 있다.
아연 핑거(Zinc Finger) CCCH-유형 포함 항바이러스 1 (ZC3HAV1)
일부 실시양태에서, 의학적 병태는 암이고 의학적 병태를 특성화하고/거나 치료하기 위해 확인된 공유 후보 항원은 ZC3HAV1 스플라이스 변이체이다. 다시 말해서, 공유 후보 항원은 ZC3HAV1-특이적 암을 앓고 있는 암 환자의 하위그룹을 특성화 및/또는 치료하기 위해 확인될 수 있으며, ZC3HAV1-특이적 암은 ZC3HAV1 스플라이스 변이체의 발현과 관련된다. 암은 신체의 임의의 위치에 위치할 수 있지만 ZC3HAV1 스플라이스 변이체의 발현에 의해 규정된다.
ZC3HAV1 스플라이스 변이체는 엑손 (chr7:138763298:138763399:-, 및 chr7:138763850:138764989:-)을 포함하는 전사체를 생성하는 5' 스플라이스 부위의 대체 사용으로 인한 것일 수 있다.
일부 실시양태에서, ZC3HAV1 스플라이스 변이체는 LTMAVKAEK (서열번호 33)의 서열을 갖는 펩타이드를 포함하거나, LTMAVKAEK (서열번호 33)의 서열을 갖는 펩타이드를 인코딩한다.
일부 실시양태에서, ZC3HAV1 스플라이스 변이체는 서열번호 33에 대해 적어도 80% (또는 적어도 88%) 서열 동일성을 갖는 펩타이드를 포함하고, 또는 서열번호 33에 대해 적어도 80% (또는 적어도 88%) 서열 동일성을 갖는 펩타이드를 인코딩한다.
본 명세서에 개시된 바와 같은 ZC3HAV1 스플라이스 변이체는 단리된 ZC3HAV1 스플라이스 변이체일 수 있다.
YY1 관련 인자 2 (YAF2)
일부 실시양태에서, 의학적 병태는 암이고 의학적 병태를 특성화하고/거나 치료하기 위해 확인된 공유 후보 항원은 YAF2 스플라이스 변이체이다. 다시 말해서, 공유 후보 항원은 YAF2-특이적 암을 앓고 있는 암 환자의 하위그룹을 특성화 및/또는 치료하기 위해 확인될 수 있으며, YAF2-특이적 암은 YAF2 스플라이스 변이체의 발현과 관련된다. 암은 신체의 임의의 위치에 위치할 수 있지만 YAF2 스플라이스 변이체의 발현에 의해 규정된다.
YAF2 스플라이스 변이체는 엑손 (chr12:42604350:42604421:-, 및 chr12:42631401:42631526:-)을 포함하는 전사체를 생성하는 3' 스플라이스 부위의 대체 사용으로 인한 것일 수 있다.
일부 실시양태에서, YAF2 스플라이스 변이체는 VIVSASRTK (서열번호 34)의 서열을 갖는 펩타이드를 포함하거나, VIVSASRTK (서열번호 34)의 서열을 갖는 펩타이드를 인코딩한다.
일부 실시양태에서, YAF2 스플라이스 변이체는 서열번호 34에 대해 적어도 80% (또는 적어도 88%) 서열 동일성을 갖는 펩타이드를 포함하고, 또는 서열번호 34에 대해 적어도 80% (또는 적어도 88%) 서열 동일성을 갖는 펩타이드를 인코딩한다.
본 명세서에 개시된 바와 같은 YAF2 스플라이스 변이체는 단리된 YAF2 스플라이스 변이체일 수 있다.
칼슘/칼모듈린-의존적 단백질 키나제 키나제 1 (CAMKK1)
일부 실시양태에서, 의학적 병태는 암이고 의학적 병태를 특성화하고/거나 치료하기 위해 확인된 공유 후보 항원은 CAMKK1 스플라이스 변이체이다. 다시 말해서, 공유 후보 항원은 CAMKK1-특이적 암을 앓고 있는 암 환자의 하위그룹을 특성화 및/또는 치료하기 위해 확인될 수 있으며, CAMKK1-특이적 암은 CAMKK1 스플라이스 변이체의 발현과 관련된다. 암은 신체의 임의의 위치에 위치할 수 있지만 CAMKK1 스플라이스 변이체의 발현에 의해 규정된다.
CAMKK1 스플라이스 변이체는 엑손 (chr17:3784921-3784942:-)의 스키핑을 초래하여 엑손 (chr17:3785822-3785858:- 및 chr17:3783640-3783728:-)을 포함하는 전사체를 생성하는 엑손 스킵/포함 현상으로 인한 것일 수 있다.
일부 실시양태에서, CAMKK1 스플라이스 변이체는 VTSPSRRSK (서열번호 35)의 서열을 갖는 펩타이드를 포함하거나, VTSPSRRSK (서열번호 35)의 서열을 갖는 펩타이드를 인코딩한다.
일부 실시양태에서, CAMKK1 스플라이스 변이체는 서열번호 35에 대해 적어도 80% (또는 적어도 88%) 서열 동일성을 갖는 펩타이드를 포함하고, 또는 서열번호 35에 대해 적어도 80% (또는 적어도 88%) 서열 동일성을 갖는 펩타이드를 인코딩한다.
본 명세서에 개시된 바와 같은 CAMKK1 스플라이스 변이체는 단리된 CAMKK1 스플라이스 변이체일 수 있다.
류신-풍부 반복 단백질 1 (LRR1)
일부 실시양태에서, 의학적 병태는 암이고 의학적 병태를 특성화하고/거나 치료하기 위해 확인된 공유 후보 항원은 LRR1 스플라이스 변이체이다. 다시 말해서, 공유 후보 항원은 LRR1-특이적 암을 앓고 있는 암 환자의 하위그룹을 특성화 및/또는 치료하기 위해 확인될 수 있으며, LRR1-특이적 암은 LRR1 스플라이스 변이체의 발현과 관련된다. 암은 신체의 임의의 위치에 위치할 수 있지만 LRR1 스플라이스 변이체의 발현에 의해 규정된다.
LRR1 스플라이스 변이체는 엑손 (chr14:50074118-50074839:+ (서열번호 42))의 스키핑을 초래하여 엑손 (chr14:50069088-50069186:+ 및 chr14:50080974-50081389:+)을 포함하는 전사체를 생성하는 엑손 스킵/포함 현상으로 인한 것일 수 있다.
일부 실시양태에서, LRR1 스플라이스 변이체는 SLPRFGYRK (서열번호 36)의 서열을 갖는 펩타이드를 포함하거나, SLPRFGYRK (서열번호 36)의 서열을 갖는 펩타이드를 인코딩한다.
일부 실시양태에서, LRR1 스플라이스 변이체는 SLPRFGYRK (서열번호 36)에 대해 적어도 80% (또는 적어도 88%) 서열 동일성을 갖는 펩타이드를 포함하고, 또는 SLPRFGYRK (서열번호 36)에 대해 적어도 80% (또는 적어도 88%) 서열 동일성을 갖는 펩타이드를 인코딩한다.
일부 실시양태에서, LRR1 스플라이스 변이체는 SYHSIPSLPRF (서열번호 51)의 서열을 갖는 펩타이드를 포함하거나, SYHSIPSLPRF (서열번호 51)의 서열을 갖는 펩타이드를 인코딩한다.
일부 실시양태에서, LRR1 스플라이스 변이체는 SYHSIPSLPRF (서열번호 51)에 대해 적어도 80% (또는 적어도 88%) 서열 동일성을 갖는 펩타이드를 포함하고, 또는 SYHSIPSLPRF (서열번호 51)에 대해 적어도 80% (또는 적어도 88%) 서열 동일성을 갖는 펩타이드를 인코딩한다.
본 명세서에 개시된 바와 같은 LRR1 스플라이스 변이체는 단리된 LRR1 스플라이스 변이체일 수 있다.
아연 핑거 단백질 670 (ZNF670)
일부 실시양태에서, 의학적 병태는 암이고 의학적 병태를 특성화하고/거나 치료하기 위해 확인된 공유 후보 항원은 ZNF670 스플라이스 변이체이다. 다시 말해서, 공유 후보 항원은 ZNF670-특이적 암을 앓고 있는 암 환자의 하위그룹을 특성화 및/또는 치료하기 위해 확인될 수 있으며, ZNF670-특이적 암은 ZNF670 스플라이스 변이체의 발현과 관련된다. 암은 신체의 임의의 위치에 위치할 수 있지만 ZNF670 스플라이스 변이체의 발현에 의해 규정된다.
ZNF670 스플라이스 변이체는 엑손 (chr1:247130997-247131094:-(서열번호 45))의 스키핑을 초래하여 엑손 (chr1:247151423-247151557:- 및 chr1:247108849-247109129:-)을 포함하는 전사체를 생성하는 엑손 스킵/포함 현상으로 인한 것일 수 있다.
일부 실시양태에서, ZNF670 스플라이스 변이체는 SCVSPSSELK (서열번호 37)의 서열을 갖는 펩타이드를 포함하거나, SCVSPSSELK (서열번호 37)의 서열을 갖는 펩타이드를 인코딩한다.
일부 실시양태에서, ZNF670 스플라이스 변이체는 SCVSPSSELK (서열번호 37)에 대해 적어도 80% (또는 적어도 88%) 서열 동일성을 갖는 펩타이드를 포함하고, 또는 SCVSPSSELK (서열번호 37)에 대해 적어도 80% (또는 적어도 88%) 서열 동일성을 갖는 펩타이드를 인코딩한다.
본 명세서에 개시된 바와 같은 ZNF670 스플라이스 변이체는 단리된 ZNF670 스플라이스 변이체일 수 있다.
글루탐산 이온성 수용체 NMDA 유형 하위단위 관련 단백질 1 (GRINA)
일부 실시양태에서, 의학적 병태는 암이고 의학적 병태를 특성화하고/거나 치료하기 위해 확인된 공유 후보 항원은 GRINA 스플라이스 변이체이다. 다시 말해서, 공유 후보 항원은 GRINA-특이적 암을 앓고 있는 암 환자의 하위그룹을 특성화 및/또는 치료하기 위해 확인될 수 있으며, GRINA-특이적 암은 GRINA 스플라이스 변이체의 발현과 관련된다. 암은 신체의 임의의 위치에 위치할 수 있지만 GRINA 스플라이스 변이체의 발현에 의해 규정된다.
GRINA 스플라이스 변이체는 인트론 (chr8:145065973: 145066412:+)의 제거를 초래하여 인트론 (chr8:145065860-145065972:+@chr8:145066413-145066541:+)을 포함하지 않는 전사체를 생성하는 인트론 보유 현상으로 인한 것일 수 있다.
일부 실시양태에서, GRINA 스플라이스 변이체는 SIRQAFIRK (서열번호 38)의 서열을 갖는 펩타이드를 포함하거나, SIRQAFIRK (서열번호 38)의 서열을 갖는 펩타이드를 인코딩한다.
일부 실시양태에서, GRINA 스플라이스 변이체는 SIRQAFIRK (서열번호 38)에 대해 적어도 80% (또는 적어도 88%) 서열 동일성을 갖는 펩타이드를 포함하고, 또는 SIRQAFIRK (서열번호 38)에 대해 적어도 80% (또는 적어도 88%) 서열 동일성을 갖는 펩타이드를 인코딩한다.
본 명세서에 개시된 바와 같은 GRINA 스플라이스 변이체는 단리된 GRINA 스플라이스 변이체일 수 있다.
골수성 아연 핑거 1 (MZF1)
일부 실시양태에서, 의학적 병태는 암이고 의학적 병태를 특성화하고/거나 치료하기 위해 확인된 공유 후보 항원은 MZF1 스플라이스 변이체이다. 다시 말해서, 공유 후보 항원은 MZF1-특이적 암을 앓고 있는 암 환자의 하위그룹을 특성화 및/또는 치료하기 위해 확인될 수 있으며, MZF1-특이적 암은 MZF1 스플라이스 변이체의 발현과 관련된다. 암은 신체의 임의의 위치에 위치할 수 있지만 MZF1 스플라이스 변이체의 발현에 의해 규정된다.
MZF1 스플라이스 변이체는 인트론 (chr19:59,081,895-59,082,360:-)의 보유를 초래하여 인트론 보유 현상 (chr19:59081711-59082796:-)을 포함하는 전사체를 생성하는 인트론 보유 현상으로 인한 것일 수 있다.
일부 실시양태에서, MZF1 스플라이스 변이체는 KWPPATETL (서열번호 52)의 서열을 갖는 펩타이드를 포함하거나, KWPPATETL (서열번호 52)의 서열을 갖는 펩타이드를 인코딩한다.
일부 실시양태에서, MZF1 스플라이스 변이체는 KWPPATETL (서열번호 52)에 대해 적어도 80% (또는 적어도 88%) 서열 동일성을 갖는 펩타이드를 포함하고, 또는 KWPPATETL (서열번호 52)에 대해 적어도 80% (또는 적어도 88%) 서열 동일성을 갖는 펩타이드를 인코딩한다.
본 명세서에 개시된 바와 같은 MZF1 스플라이스 변이체는 단리된 MZF1 스플라이스 변이체일 수 있다.
참조
본 명세서에 언급된 "참조"는 의학적 병태를 가진 대상체로부터 채취한 의학적 병태가 발병하지 않은 하나 이상의 샘플 (예를 들어, 비암성 세포), 또는 다른 대상체로부터 채취한 하나 이상의 샘플 (예를 들어, 의학적 병태를 앓지 않는 건강한 대상체)일 수 있다. 참조는 또한 샘플에서 전사체의 발현 수준과 같은 샘플 측정의 소정의 값 또는 평균 값일 수 있다.
샘플
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "샘플" (또는 "시험 샘플")은 대상체로부터 단리된 조직, 세포, 체액 및 이의 단리물뿐만 아니라, 대상체 내에 존재하는 조직, 세포 및 체액 등 (즉, 샘플이 생체내에 있음)을 포함한다. 샘플의 예로는 전혈, 혈액 (예를 들어, 혈청 및 혈장), 림프액 및 낭성액, 가래, 분변, 눈물, 점액, 모발, 피부, 복수액, 낭성액, 소변, 유두 삼출물, 유두 흡인물, 조직 절편, 예컨대 생검 및 부검 샘플, 조직학적 목적으로 채취한 동결 절편, 저장 샘플, 이식편 및 환자 조직에서 유래한 1차 및/또는 형질전환된 세포 배양액 등을 포함한다.
샘플은 하나 이상의 시점에서 획득될 수 있다. 스플라이스 변이체의 발현 수준은 선택적으로 참조와 비교할 수 있다. 참조는 의학적 병태가 없는 개체에서 유래된 대조군 샘플일 수 있다. 하나 이상의 대조군 샘플이 사용될 수 있다.
이제 도 1(a)를 참조하면, 의학적 병태를 특성화 및/또는 치료하기 위한 하나 이상의 공유 후보 항원을 확인하는 방법 (100)은 의학적 병태를 가진 환자의 제1 코호트로부터 시험 샘플에 대한 전사체 데이터를 획득하는 단계 (102)를 포함한다. 통상적으로, 방법 (100)은 적어도 부분적으로, 일부 실시양태에서는 전체적으로, 하나 이상의 컴퓨터 장치의 적어도 하나의 프로세서에 의해 수행된다.
특정 실시양태에서, 환자의 제1 코호트는 하나 이상의 임상 매개변수에 따라 선택될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 임상 매개변수는 의학적 병태 (예를 들어, 질병 하위유형, 예를 들어 종양 유형, 또는 질병 진행 상태) 또는 HLA 하위유형과 관련된 매개변수를 포함할 수 있다.
예를 들어, 전사체 데이터는 전체 전사체 산탄 시퀀싱 (WTSS) 데이터 (또한 소위 RNA-Seq 데이터)와 같은 시퀀싱 데이터일 수 있다. 특정 실시양태는 WTSS 데이터를 참조하여 기재되지만, 엑손 마이크로어레이 (exon microarray), 스플라이스 접합 마이크로어레이 또는 타일링 어레이 (tiling array)와 같은 측정 플랫폼으로부터의 프로브 수준 또는 프로브 세포 데이터와 같은 다른 전사체 데이터 형태가 본 방법의 다른 실시양태에 사용될 수 있음이 이해될 것이다.
전사체 데이터는 환자의 제1 코호트로부터 샘플을 시퀀싱함으로써, 또는 환자의 제1 코호트로부터 이전에 생성된 전사체 데이터를 검색함으로써 획득될 수 있다. 예를 들어, 전사체 데이터는 컴퓨터 판독 가능 매체에 저장되고 로컬 버스 (local bus) 또는 통신 링크를 통해 검색될 수 있다.
전사체 데이터는 미가공 서열 판독결과일 수 있거나 미가공 서열 판독결과에 대해 수행된 적어도 하나의 작업에 의해 생성된 데이터일 수 있다. 예를 들어, 적어도 하나의 작업은 저특질 판독결과를 제거하기 위한 전처리 작업을 포함할 수 있다. 적어도 하나의 작업은 또한 서열 판독결과를 참조 게놈과 같은 하나 이상의 참조 서열에 정렬하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 도 2의 작업 흐름도에 표시된 대로 서열 판독결과는 예컨대 STAR (문헌[A. Dobin et al (2013) Bioinformatics 29, pages 15-21]) 또는 Bowtie (문헌[B. Langmead et al (2009) Genome Biology 10:R25]) 또는 임의의 서열 정렬 툴과 같은 서열 정렬기를 사용하여 정렬될 수 있다. 서열 정렬은 예를 들어 SAM 또는 BAM과 같은 파일 형식으로 출력될 수 있다.
일부 실시양태에서, 서열 판독결과는 스플라이스-접합 서열로 정렬될 수 있다. 스플라이스-접합 서열은, 확인되거나 예측된 엑손-인트론 경계에 기반하여 획득될 수 있고/거나 참조 게놈에 대한 스플라이싱된 정렬에 의해 결정될 수 있다.
본 방법 (100)은 또한 참조 샘플의 세트에 대한 참조 전사체 데이터를 획득하는 단계 (104)를 포함한다. 참조 샘플은 예를 들어, 의학적 병태를 가진 환자로부터 채취된 의학적 병태가 발병하지 않은 하나 이상의 샘플 (예를 들어, 비암성, 정상, 건강한 세포) 또는 의학적 병태가 발병하지 않은 하나 이상의 다른 대상체로부터 채취된 하나 이상의 샘플일 수 있다.
시험 샘플의 전사체 데이터와 같이, 전사체 데이터는 참조 샘플의 시퀀싱을 통해 또는 참조 샘플에서 이전에 생성된 전사체 데이터를 검색하여 획득될 수 있다. 시험 샘플의 전사체 데이터에 대해 수행되는 것과 유사한 전처리 작업 (특질 제어 및 서열 판독 정렬 포함)이 참조 샘플의 전사체 데이터에 대해 수행될 수 있다.
일부 실시양태에서, 단계 (102) 및/또는 단계 (104)의 전사체 데이터는 데이터베이스 또는 기존 데이터세트로부터 획득될 수 있다. 여기에는 예를 들어 GTEx, TCGA 등과 같이 공개적으로 사용 가능한 데이터베이스가 포함된다.
본 방법 (100)은 또한 전사체 데이터를 참조 전사체 데이터와 비교함으로써, 시험 샘플과 참조 샘플 사이에 구별적으로 스플라이싱되는 하나 이상의 제1 스플라이스 변이체를 결정하는 단계 (106)를 포함한다. 이는 하나 이상의 스플라이스 변이체가 참조 샘플과 비교하여 시험 샘플의 서브세트의 각 샘플에서 더 많이 전사되는지를 결정함으로써 수행될 수 있고;
예를 들어, 구별적 스플라이싱을 결정하기 위한 다수의 다른 툴이 사용될 수 있음이 이해될 것이나 도 2의 작업 흐름도에서 볼 수 있는 것처럼 구별적 스플라이싱 분석은 MISO (문헌[Y. Katz et al (2010) Nature Methods 7(12), pages 1009-1015]) 또는 rMATS (문헌[S.　Shen et al (2014) Proc Nat Acad Sci 111(51) E5593-E5601])와 같은 툴을 사용하여 수행될 수 있다.
현재 RNA-Seq를 사용한 구별적 스플라이싱 분석은 시퀀싱 판독결과 밀도를 사용하여 세포에서 발현되거나 활용되는 이소형 (이소형 수준), 엑손 (엑손 수준) 또는 스플라이스 접합 (접합 수준)을 결정한다. 이소형 수준에서 하나의 유전자에 매핑되는 모든 시퀀싱 판독결과는 세포에서 발현되는 이소형의 엑손 조성을 결정하는데 사용된다. 그런 다음 이는 종양과 정상 샘플 간의 구별적 발현을 결정하기 위해 참조와 비교할 수 있다. 이는 각 유전자에 대해 다수의 이소형이 있을 수 있고 각 세포에서 다른 이소형이 동시에 발현될 수 있기 때문에 매우 어려울 수 있다. 엑손 수준에서, 스플라이싱 분석은 특정 서열 (인트론[IRE], 엑손[SIE, MXE) 또는 엑손의 일부[A5E, A3E])의 포함 또는 스키핑이 있는지를 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 이는 포함 또는 배제가 있는지를 결정하기 위해 엑손 및 상응하는 접합 주변의 시퀀싱 판독결과 밀도를 사용한다. 구별적 스플라이싱 분석은 종양 샘플과 정상 샘플을 비교하여 수행된다. 접합 수준에서 스플라이싱 분석은 서열이 함께 결합되는 방법을 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 스플라이스 접합에 매핑되는 시퀀싱 판독결과만이 고려된다. 그런 다음 이는 종양과 정상 샘플 사이의 스플라이스 접합의 구별적 사용을 결정하기 위해 참조와 비교할 수 있다.
본 명세서에 개시된 방법에서 구별적 스플라이싱 분석은 엑손 수준에서 수행되며, 구별적 스플라이싱 분석은 스플라이스 변이체 엑손에 매핑되는 서열 판독결과의 밀도로부터 각 스플라이스 변이체에 대한 "스플라이싱된 백분율" (PSI 또는 Ψ) 점수를 결정하는 단계를 포함할 수 있다.
예를 들어, 추가 엑손을 포함하는 스플라이스 변이체의 경우 PSI는
Figure pct00001
을 사용하여 스플라이스 변이체에 대해 예측될 수 있고, IR은 포함 판독결과 (추가 엑손뿐만 아니라, 인접한 엑손과의 스플라이스 접합에 매핑되는 판독결과)의 수이고, ER은 배제 판독결과 (인접한 엑손 사이의 스플라이스 접합으로 매핑되는 판독결과)의 수이다. IR 및 ER은 당업계에 공지된 방법에 따라 정규화될 수 있다. 이는 시험 샘플과 참조 샘플 모두에 대해 수행되며, 구별적 스플라이싱은 예를 들어 두 Ψ 값 사이의 차이 △Ψ를 계산하고 그 차이를 임계값과 비교하고/거나, 베이즈 인자의 계산 (예를 들어, MISO에서와 같이 새비지-디키 밀도비 (Savage-Dickey density ratio)를 사용) 및 베이즈 인자를 임계값과 비교하는 것과 같은 다른 기술을 사용하여 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서 스플라이스 변이체는 |△Ψ| 임계값을 초과하고 베이즈 인자가 다른 임계값을 초과하고, 예를 들어, |△Ψ|>0.2 및 베이즈 인수가 20보다 큰 경우, 구별적으로 스플라이싱된 것으로 언급될 수 있다.
일부 실시양태에서, PSI 점수 대신에, "스플라이싱된 퍼센트" 점수와 같은 구별적 스플라이싱의 대체 측정이 결정될 수 있다. 예를 들어, 스플라이싱된 퍼센트 점수는 (1-Ψ) = ER/(IR+ER)에 따라 결정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 추가 필터링 작업 (108)이 구별적으로 스플라이싱되는 것으로 언급되는 스플라이스 변이체 세트에 적용될 수 있다. 예를 들어, 특질 제어 작업은 참조 서열 (들)에 대한 판독결과 매핑의 사시미 그래프 (https://www.biorxiv.org/content/10.1101/002576v1)를 검사하고 소정의 기준을 충족하지 않는 스플라이스 변이체를 제거하여 수행할 수 있다.
예를 들어, 특질 제어 작업은 구별적 스플라이싱 현상을 확인하기 위해 시험 샘플 (예를 들어, 종양 샘플)의 스플라이싱 현상에서 PSI의 분포를 분석하는 단계를 포함할 수 있다. 임의의 구별적 스플라이싱 현상은 또한 예를 들어 엑손 스키핑 또는 포함 현상인지를 결정하기 위해 추가로 검사될 수 있다.
일반적으로, 의학적 병태가 발병하지 않은 샘플로부터의 스플라이싱 현상은 비교적 좁은 PSI 분포를 나타낼 것이다. 종양 샘플의 이질성으로 인해 종양 샘플의 스플라이싱 현상도 참조 (정상) 샘플의 것과 유사한 PSI 값을 가질 수 있지만 종양 샘플은 추가로 참조 샘플과 다른 스플라이싱 현상을 나타낼 수 있다. 따라서 암의 경우 종양 샘플을 분석하여 참조 샘플과 다른 PSI 값을 갖는지를 확인할 수 있다. 이를 '이상치'라고 한다 (도 3).
모든 샘플 (시험/종양 및 참조/정상 둘 모두)의 PSI 값의 분포가 비교된다. 스플라이스 현상은 1) 정상 샘플과 다른 PSI 값을 갖는 종양 샘플 및 2) 정상 환자와 다른 엑손 스키핑 또는 포함 현상과 같은 스플라이싱을 나타내는 충분한 수의 종양 샘플의 두 가지 기준을 기반으로 하여 선택된다. 이 마지막 기준을 통해 공유 종양 관련 스플라이싱 현상을 확인할 수 있다.
일 예에서, 필터링 작업 (108)의 일부로서, 사시미 그래프가 접합에 매핑되는 시퀀싱 판독결과를 검사하기 위해 사용될 수 있다 (도 4). 예를 들어, 전사체 중간에 존재하는 엑손 (엑손 포함을 위한 2개의 접합 및 스키핑된 엑손에 대한 1개의 접합)의 대체 사용이 있는 경우 RNA-Seq 데이터에 대해 두 접합이 유사한 갯수를 나타낼 것으로 예상된다. 엑손 포함에서 단 하나의 접합에 대해 매우 편중된 갯수가 있는 경우 스플라이스 현상이 실제로 발생했는지가 의심된다. 특정 실시양태에서, 필터링 작업 (108)은 스플라이싱의 관점에서 차이가 있다는 것을 확신하기 위해 스플라이스 접합에서 임계값 수(threshold number)의 갯수 (예를 들어, 5개 초과의 갯수)를 요구하는 단계를 포함할 수 있다.
다른 예에서, 필터링 작업은 참조 샘플보다 시험 샘플에서 더 자주 발견되는 스플라이스 변이체를 선택하는 단계를 포함할 수 있다. 추가 예에서, 필터링 작업은 시험 샘플의 적어도 임계값 수 (예를 들어, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 또는 적어도 5) 또는 적어도 임계값 비율 (예를 들어, 시험 샘플의 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 또는 적어도 20%)에 존재하는 스플라이스 변이체를 선택하는 단계를 포함할 수 있다. 이는 스플라이스 변이체가 시험 샘플의 서브세트에서 공유됨을 의미한다. 또 다른 예에서, 필터링 작업은 시험 샘플에 존재하지만 참조 샘플에는 존재하지 않는 스플라이스 변이체를 선택하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 서브세트는 시험 샘플의 임계값 수 초과 또는 임계값 백분율 초과를 포함한다.
일부 실시양태에서, 필터링 작업 (108)은 판독 프레임의 변화가 나타난 스플라이스 변이체를 확인하는 단계를 포함할 수 있다. 유리하게는, 이러한 스플라이스 변이체는 신규 단백질 서열을 제시하고/거나 더 긴 코딩 서열을 생성하고, 따라서 더 많은 수의 후보 펩타이드를 유도한다.
일부 실시양태에서, 본 방법은 단계 (iv) 이전에 각각의 상기 스플라이스 변이체에 대해 하나 이상의 동일한 유전자의 상응하는 스플라이스 변이체에 비해 제1 스플라이스 변이체의 판독 프레임에 변화가 있는지를 결정하는 단계를 더 포함한다.
본 방법 (100)은 각각의 스플라이스 변이체에 대해, 스플라이스 변이체의 아미노산 번역에서는 발생하지만, 참조 샘플에서 전사되는 동일한 유전자의 상응하는 스플라이스 변이체의 아미노산 번역에서는 발생하지 않는 하나 이상의 아미노산 서열을 결정하는 단계 (110)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 단계 (iv)는 스플라이스 변이체 및 동일한 유전자의 상응하는 스플라이스 변이체 간의 비-중첩 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 단계를 포함한다.
이러한 서열은 HLA-결합 펩타이드를 포함하는지를 결정하는데 사용될 수 있는 잠재적인 후보 항원 영역을 나타낸다.
상이한 유형의 대체 스플라이싱 현상에 대한 후보 항원 영역의 예는 도 5에 제시되어 있다. 상이한 유형의 후보 항원 영역은 프레임 이동이 발생하는지에 따라 생성될 수 있다. 도 5의 각 예에서 밑줄 친 부분은 잠재적인 후보 항원 영역을 구성한다.
예를 들어, 프레임 이동이 없는 엑손 스킵 현상의 경우 (도 5(a)에서와 같음), 후보 항원 영역은 접합의 양쪽에 측접하는 엑손 사이의 접합 범위의 서열 (2개의 엑손의 일부 밑줄 친 부분으로 표시됨)을 포함할 수 있다. 한편, 엑손 스킵 현상이 프레임 이동을 유발하는 경우 (도 5(a')에서와 같음), 후보 항원 영역은 3' 측접 엑손 전체를 포함하는 추가 서열을 포함할 수 있다.
다른 예에서, 도 5(i)에 나타낸 바와 같이, 대체 스플라이싱 현상은 대체 3' 스플라이스 부위의 존재일 수 있고, 프레임 이동 없이 후보 항원 영역은 각 엑손의 일부의 범위이며, 대체 3' 스플라이스 부위로 인해 전사되는 추가 서열 범위의 추가 부분이 존재한다. 도 5(i')에서와 같이 프레임 이동이 존재하는 경우, 후보 항원 영역은 예를 들어 3' 엑손 전체의 범위일 수 있다.
따라서, 프레임 이동을 야기하는 대체 스플라이싱 현상을 선택하는 것이 유리하다는 것을 알 수 있으며, 왜냐하면 이는 신규 단백질 서열을 제시하고/거나 더 긴 후보 항원 영역을 생성할 수 있고 동시에 환자의 하위 세트 사이에서 공유된 잠재적인 HLA-결합 펩타이드를 위치시킬 수 있는 기회가 더 크기 때문이다.
스플라이싱 현상이 잠재적인 항원 영역을 생성할 수 있는 변이된 아미노산 서열을 초래하는지를 결정하기 위한 수단은 도 6 (a)에 개략적으로 도시되어 있다. 단계 (110)은 다음을 포함할 수 있다:
스플라이스 현상이 코딩되는지 안되는지를 결정하는 단계;
엑손 1의 개방 판독 프레임을 결정하는 단계 (이는 예를 들어, 개시 코돈이 있는지를 결정하는 단계를 포함할 수 있음);
프레임에 대한 임의의 변화가 있는지를 번역 및 결정하는 단계 (이는 IRE, SIE, MXE, A5E 및 A3E 스플라이싱 현상 각각에 적용됨); 및
스플라이스 이소형을 비교하고 잠재적인 후보 항원 영역을 결정하는 단계.
잠재적인 후보 항원 영역은 스플라이스 현상의 측접 영역으로 구성되고 서열의 포함 (예를 들어, SIE 현상에서 중간 엑손의 포함)을 포함할 수 있다. 각 스플라이싱 현상에 대해 N 말단과 C 말단의 두 가지 측접 영역이 있다. 측접 영역의 길이는 예측되는 HLA 결합 펩타이드의 길이에 의해 영향을 받는다. 측접 영역의 최대 길이는 HLA 결합 펩타이드의 길이에서 1을 뺀 값이다. 또한, C-말단 측접 영역은 스플라이싱 변이로 인해 번역 프레임이 변화되는 경우 엑손의 전체 서열을 포함할 수 있다. 스플라이싱 현상의 잠재적인 후보 항원 영역의 아미노산 서열을 결정하는 수단은 도 6 (b)에 나와 있다.
도 6 (b)에 도시된 바와 같이, 각각의 스플라이싱 현상에 대해, 스플라이스 이소형을 비교하고 잠재적인 후보 항원 영역을 결정하는 방법은 다음을 포함할 수 있다:
측접 영역의 아미노산 조성을 결정하는 단계;
스플라이싱 현상이 서열의 포함을 유도하는지를 결정하고 이러한 아미노산 서열을 잠재적인 후보 항원 영역에 포함시키는 단계; 및
이러한 모든 아미노산 서열을 함께 연결하여 잠재적인 후보 항원 영역을 획득하는 단계.
방법 (100)의 단계 (112)는 NetMHCPan과 같은 결합 예측 툴을 사용하여 후보 항원 영역의 아미노산 번역으로부터 하나 이상의 후보 HLA 결합 펩타이드를 예측하는 단계를 포함할 수 있다(문헌[V. Jurtz et al (2017) J Immunol 199 (9):3360-3368). 199 (9):3360-3368]). 펩타이드 HLA 결합의 NetMHCpan 예측은 HLA에 결합된 실험적으로 결정된 펩타이드와 서열을 비교하여 확인되지 않은 펩타이드의 예측된 친화도의 순위를 정하는 알고리즘을 기반으로 한다. NetMHCpan에 대한 예시적인 매개변수 및 컷오프는 다음과 같다: HLA 결합을 예측하는데 사용되는 8 내지 11개 아미노산 펩타이드; 및 HLA에 대한 높은 친화도 결합 (상위 0.5% 순위 기준).
일부 실시양태에서, 방법 (100)은 펩타이드 후보 세트에서 중복성을 감소시키기 위해 서로 유사한 펩타이드를 필터링하는 단계 (114)를 포함할 수 있다.
예를 들어, HLA의 모티프가 9aa 펩타이드의 위치 7에 있는 Arg 고정 잔기인 경우, 이 HLA 분자에 모두 결합할 수 있는 길이 8 내지 11aa의 펩타이드가 있을 수 있으며 다른 결합 친화도를 가질 것이다. 펩타이드의 필터링은 이러한 "관련" 펩타이드 (단백질의 유사한 영역)를 검사하고 가장 높은 예상 결합 친화도를 갖는 것을 유지함으로써 수행할 수 있다.
단계 (116)에서, 필터링 작업 (114) 후에 남아 있는 후보 항원 (HLA 결합 펩타이드)이 출력된다. 예를 들어, 후보 항원 목록은 텍스트 파일 또는 유사한 형식으로 출력될 수 있다. 일부 실시양태에서, 단계 (116)은 HLA 분자에 대한 예측된 제시에 기반하여 모든 나머지 펩타이드의 순위를 정하는 단계 및 항원-특이적 T 림프구의 확인에 사용될 후보 항원 세트를 선택하기 위해 이 순위를 사용하는 단계를 포함할 수 있다.
본 명세서에 규정된 바와 같은 방법은 하나 이상의 공유 아미노산 서열의 HLA 결합을 검증하거나 시험하여 공유 후보 항원으로서, 하나 이상의 공유 아미노산 서열을 확인하는 단계를 포함할 수 있다. 본 명세서에 규정된 바와 같은 방법은 예측된 HLA-결합 펩타이드가 HLA 분자에 결합할 수 있는지 또는 HLA 분자에 결합되는지를 확인하거나 시험하는 단계를 포함할 수 있다. 이는 HLA-펩타이드 결합 분석 또는 HLA 펩타이드 용출 실험을 사용하여 수행할 수 있다. 이러한 분석은 당업자에게 잘 알려져 있다.
본 명세서에 규정된 바와 같은 방법은 예측된 HLA-결합 펩타이드가 T 림프구에 결합하는지를 확인하거나 시험함으로써 공유 항원의 면역원성을 결정하는 추가 단계를 포함할 수 있다. 이는 1) HLA에 결합할 것으로 예측되는 하나 이상의 공유 후보 항원에 특이적으로 결합하는 T 림프구를 확인하고, 2) T 림프구의 기능적 특성화, 예를 들어 IFN-γ 분비의 검출에 의해 수행될 수 있다. 이러한 분석은 당업자에게 잘 알려져 있으며 예측된 HLA-결합 펩타이드가 면역원성이고 T 림프구에 의해 인식될 수 있다는 검증을 제공한다. 이러한 추가 시험은 하나 이상의 공유 후보 항원을 공유 항원으로 확인하는데 도움이 될 수 있다.
항원-특이적 T-림프구 및 공유 항원-T 림프구 쌍
본 명세서에서는 공유 항원-T 림프구 쌍을 확인하는 방법이 개시되고, 본 방법은
a) 본 명세서에 규정된 바와 같은 방법에 따라 공유 후보 항원을 확인하고; 표지, 및 공유 후보 항원을 포함하는 펩타이드를 포함하는 하나 이상의 각각의 표지된 생체분자를 제공하는 단계;
b) 하나 이상의 표지된 생체분자를 의학적 병태를 갖는 환자로부터의 말초 혈액을 포함하는 하나 이상의 샘플과 접촉시키는 단계; 및
c) 하나 이상의 샘플로부터, 상기 표지된 생체분자에 결합된 T 림프구를 확인하여 공유 항원-T 림프구 쌍을 확인하는 단계
를 포함한다.
공유 항원-T 림프구 쌍의 확인은 공유 후보 항원을 공유 항원으로서 확인한다.
본 명세서에서는 본 명세서에 규정된 바와 같은 방법에 따라 확인된 공유 항원-T 림프구 쌍이 제공된다.
본 명세서에서는 본 명세서에 규정된 바와 같은 방법에 따라 확인된 공유 항원-T 림프구 쌍이 제공되고, 공유 항원은 MARK3 스플라이스 변이체이고, HLA 하위유형은 HLA-A11이고, T 림프구는 공유 MARK3 항원에 결합한다.
본 명세서에서는 본 명세서에 규정된 바와 같은 방법에 따라 확인된 공유 항원-T 림프구 쌍이 제공되고, 공유 항원은 NBPF9 스플라이스 변이체이고, HLA 하위유형은 HLA-A11이고, T 림프구는 공유 NBPF9 항원에 결합한다.
본 명세서에서는 본 명세서에 규정된 바와 같은 방법에 따라 확인된 공유 항원-T 림프구 쌍이 제공되고, 공유 항원은 PARD3 스플라이스 변이체이고, HLA 하위유형은 HLA-A11이고, T 림프구는 공유 PARD3 항원에 결합한다.
본 명세서에서는 본 명세서에 규정된 바와 같은 방법에 따라 확인된 공유 항원-T 림프구 쌍이 제공되고, 공유 항원은 ZC3HAV1 스플라이스 변이체이고, HLA 하위유형은 HLA-A11이고, T 림프구는 공유 ZC3HAV1 항원에 결합한다.
본 명세서에서는 본 명세서에 규정된 바와 같은 방법에 따라 확인된 공유 항원-T 림프구 쌍이 제공되고, 공유 항원은 YAF2 스플라이스 변이체이고, HLA 하위유형은 HLA-A11이고, T 림프구는 공유 YAF2 항원에 결합한다.
본 명세서에서는 본 명세서에 규정된 바와 같은 방법에 따라 확인된 공유 항원-T 림프구 쌍이 제공되고, 공유 항원은 CAMKK1 스플라이스 변이체이고, HLA 하위유형은 HLA-A11이고, T 림프구는 공유 CAMKK1 항원에 결합한다.
본 명세서에서는 본 명세서에 규정된 바와 같은 방법에 따라 확인된 공유 항원-T 림프구 쌍이 제공되고, 공유 항원은 LRR1 스플라이스 변이체이고, HLA 하위유형은 HLA-A11 또는 HLA-A24이고, T 림프구는 공유 LRR1 항원에 결합한다.
본 명세서에서는 본 명세서에 규정된 바와 같은 방법에 따라 확인된 공유 항원-T 림프구 쌍이 제공되고, 공유 항원은 ZNF670 스플라이스 변이체이고, HLA 하위유형은 HLA-A11이고, T 림프구는 공유 ZNF670 항원에 결합한다.
본 명세서에서는 본 명세서에 규정된 바와 같은 방법에 따라 확인된 공유 항원-T 림프구 쌍이 제공되고, 공유 항원은 GRINA 스플라이스 변이체이고, HLA 하위유형은 HLA-A11이고, T 림프구는 공유 GRINA 항원에 결합한다.
본 명세서에서는 본 명세서에 규정된 바와 같은 방법에 따라 확인된 공유 항원-T 림프구 쌍이 제공되고, 공유 항원은 MZF1 스플라이스 변이체이고, HLA 하위유형은 HLA-A24이고, T 림프구는 공유 MZF1 항원에 결합한다.
본 명세서에서는 본 명세서에 확인된 하나 이상의 공유 후보 항원에 특이적으로 결합하는 T 림프구를 확인하는 방법으로서,
(a) 표지 및 각 후보 항원을 포함하는, 하나 이상의 각각의 표지된 생체 분자를 제공하는 단계;
(b) 하나 이상의 표지된 생체분자를 의학적 병태를 갖는 각각의 환자로부터의 말초 혈액을 포함하는 하나 이상의 샘플과 접촉시키는 단계; 및
(c) 하나 이상의 샘플로부터, 상기 표지된 생체분자에 결합된 T 림프구를 확인하는 단계
를 포함하는 방법이 개시된다.
이제 도 1(b)를 참조하여, 항원-특이적 T 림프구를 확인하기 위한 방법 (150)이 기재될 것이다. 도 1(a)를 참조하여 위에서 기재된 항원 확인 방법은 환자의 제1 코호트로부터 전사체 데이터 및 참조 전사체 데이터가 획득되면 필수적으로 완전히 인 실리코 과정라는 것을 이해할 것이다. 다른 한편으로, 도 1(b)의 방법 (150)은 환자의 제2 코호트에서 항원-특이적 T 림프구를 확인하기 위해 인실리코 과정 (100)의 출력을 사용하는 시험관내 과정이다.
방법 (150)의 단계 (152)에서, 각각이 타간트 (taggant) 및 각각의 후보 항원을 포함하는 하나 이상의 각각의 표지된 생체분자가 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표지된 생체분자는 예를 들어 하나 이상의 HLA 다량체를 포함할 수 있다. 통상적으로, HLA 다량체는 이량체 내지 십량체일 수 있다. 표지는 생체분자에 결합된 T 림프구가 확인 및/또는 단리될 수 있도록 한다 (예를 들어, FACS와 같은 공지된 유세포 분석 기술에 의함).
본 명세서에서는 본 명세서에 규정된 바와 같은 방법에 따라 확인된 하나 이상의 공유 후보 항원에 특이적으로 결합하는 T 림프구를 확인 및 특성화하는 방법으로서,
(a) 표지 및 각각의 공유 후보 항원을 포함하는, 하나 이상의 각각의 표지된 생체분자를 제공하는 단계;
(b) 하나 이상의 표지된 생체분자를, 의학적 병태를 갖는 환자의 제2 코호트 각각으로부터의 말초 혈액을 포함하는 하나 이상의 샘플과 접촉시키는 단계;
(c) T 림프구에 결합되는 표지된 생체분자를, 하나 이상의 샘플로부터, 단리하는 단계;
(d) 각각의 공유 항원-T 림프구 쌍의 발생 빈도를 결정하고 쌍을 환자 서브세트로 분류하는 단계;
(e) 말초 혈액 세포를 포함하는 샘플로부터, T 림프구 분획을 확장함으로써 공유 항원-유도 T 림프구를 단리하는 단계; 및
(f) 공유 항원-유도 T 림프구가 환자의 제1 코호트에서 확인된 공유 스플라이스 변이체 전사체를 포함하는 종양 세포를 인식하여 사멸시킬 수 있음을 입증하는 단계
를 포함하는 방법이 제공된다.
일부 실시양태에서, 확장된 T 림프구 분획은 환자의 제1, 제2 또는 임의의 코호트로부터 유래된 말초 혈액 세포를 포함하는 샘플로부터 단리된다.
후보 항원 펩타이드에 결합된 HLA 분자를 포함하는 표지된 생체분자가 본 명세서에서 제공된다. HLA 분자는 비오틴화되어 스트렙타비딘 분자에 결합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표지된 생체분자는 1개의 스트렙타비딘 분자에 결합되는 4개의 비오틴화된 HLA 분자를 포함한다.
타간트 (또는 표지)는 당업자에게 잘 알려진 다양한 검출 방법을 사용하여 검출을 가능하게 하는 모이어티이다. 다른 검출 방법은 다른 타간트 모이어티를 사용할 수 있고; 예를 들어, 타간트는 형광단, DNA 바코드(barcode) 또는 중금속을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 타간트는 이러한 모이어티의 단일 단위를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표지는 형광단 또는 중금속의 다중 단위의 조합일 수 있다. 다른 실시양태에서, 표지는 형광단, DNA 바코드 및 중금속의 조합일 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 타간트는 예를 들어 상이한 원자량을 갖는 란타나이드 (lanthanide)와 같은 상이한 중금속의 조합으로 이루어진 중금속 바코드이다. 타간트는 CyTOF 기기와 같은 장치에 의해 T 림프구에 결합된 표지된 생체분자의 검출을 가능하게 한다.
CyTOF(또는 질량 세포측정법)는 금속 태그 항체 또는 HLA 다량체를 검출하기 위해 비행 시간 질량 분석기를 사용한다. HLA 멀티머 염색에 이 기술을 사용하는 주요 이점은 중금속 바코드를 사용하여 제한된 샘플에서 다수의 현상을 동시에 검출할 수 있다는 것이다.
일부 실시양태에서, 공유 항원에 특이적으로 결합하는 T 림프구의 검출에 사용하기 위한 본 명세서에 규정된 바와 같은 공유 항원에 결합된 HLA 분자를 포함하는 표지된 생체분자가 제공된다.
일부 실시양태에서, 본 명세서에 규정된 바와 같은 표지된 생체분자가 제공되고, 공유 항원은 서열번호 1에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 펩타이드이거나, 서열번호 1에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 펩타이드를 인코딩하는 핵산이고, HLA는 HLA-A11이다.
각각이 후보 항원 중 하나를 포함하는 표지된 생체분자의 라이브러리를 제공하는 것이 유리하다. 이를 위해, 각각의 태깅된 생체분자의 표지는 각각의 표지된 생체분자를 고유하게 확인하는 역할을 하는 바코드, 예를 들어 중금속 바코드를 포함할 수 있다. 따라서, 라이브러리를 포함하는 샘플은 모든 후보 항원의 결합이 단일 단계에서 효율적으로 스크리닝될 수 있도록 단계 (154)에서 PBMC와 접촉될 수 있다.
단계 (154)에서 표지된 생체분자가 접촉되는 PBMC는 후보 항원 확인 방법 (100)에 대해 전사체 데이터가 획득된 환자의 제1 코호트의 일부가 아닌 의학적 병태를 가진 환자로부터 유리하게 획득된다. T 림프구 스크리닝 과정 (150)에 대한 독립적인 환자의 그룹을 사용하여, 확인된 T 림프구가 실제로 공유되는 후보 항원에 결합한다는 더 큰 확신이 있을 수 있다.
단계 (156)에서, 본 방법은 T 림프구에 결합되는 표지된 생체분자를 확인하는 단계를 포함한다. 하나 이상의 표지된 생체분자에 결합된 이러한 T 림프구는 하나 이상의 특정 스플라이스 변이체 항원에 특이적인 T 림프구의 하나 이상의 서브세트를 포함할 수 있다.
하나의 특정 예에서, 도 7에 개략적으로 도시된 바와 같이, 방법 (150)은 UV 절단가능한 펩타이드가 부가된 바이오틴 태깅된 HLA를 박테리아로 발현시키고 정제함으로써 HLA 사량체를 제조하는 단계를 포함하는 말초 혈액의 HLA 사량체 염색을 포함할 수 있다. 그런 다음 개별 공유 후보 항원이 UV 매개 펩타이드 교체에 의해 HLA 분자에 부가된다. 중금속 바코딩된 스트렙타비딘의 추가는 공유 후보 항원을 포함하는 사량체의 형성을 유발한다. 의학적 병태를 가진 하나 이상의 환자 코호트의 말초 혈액 (예를 들어, PBMC)을 HLA 사량체 풀로 염색한 다음 CyTOF를 사용하여 분석을 수행한다.
단계 (156)에서, 본 방법은 표지된 생체분자에 의해 확인된 항원 특이적 T 림프구의 면역 특성화를 추가로 포함할 수 있다. 표지된 항체는 이러한 T 림프구의 표현형을 밝히는데 사용된다. 예를 들어, T 림프구가 PD1과 같은 소진 마커에 대한 표지된 항체에 결합한다면, T 림프구가 이전에 항원에 의해 활성화되었고 소진될 때까지 만성적으로 자극되었음을 의미한다.
일부 실시양태에서, CMV, 독감 또는 EBV와 같은 일반적으로 접하는 바이러스 항원에 특이적인 T 림프구와 유사한 면역 표현형을 나타내는 항원 특이적 T 림프구를 확인하는 것이 유리할 수 있다. 대부분의 인간에서 이러한 바이러스 특이적 T 림프구는 이러한 병원체로부터 보호한다. 예를 들어, 이러한 바이러스 항원 특이적 T 림프구는 바이러스 항원을 다시 접했을 때 세포가 빠르게 많은 수로 확장되도록 하는 중심 기억 표현형을 자주 나타낸다. 바이러스 특이적 T 림프구와 유사한 면역 표현형을 나타내는 항원 특이적 T 림프구를 찾는 것은 항원 특이적 T 림프구가 동족 항원을 발현하는 종양을 제거하는 활성을 갖는다는 것을 나타낼 수 있다. 또한, 이는 이러한 항원 특이적 T 림프구의 우선 순위를 지정할 수 있다.
단계 (156)에서, 본 방법은 또한 공유 스플라이스 변이체 항원 (들)을 인식하는 TCR을 확인하기 위해, 표지된 생체분자에 의해 확인된 이러한 항원-특이적 T 림프구의 단리를 포함할 수 있다.
단계 (152)는 단일 후보 항원을 포함하는 단일 표지된 생체분자를 제공하는 단계를 포함할 수 있고, 이어서 표지된 생체분자의 샘플은 암 환자에서 항원의 존재를 검출하기 위해 본 방법의 단계 (154)에서 의학적 병태를 갖는 하나 이상의 환자로부터의 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)와 접촉될 수 있다. 존재한다면, 환자는 상기 항원을 표적화하는 면역요법에 반응성일 수 있다.
본 방법은 T 림프구의 생물학적 기능을 시험하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 본 방법은 시험관내 분석에서 T 림프구의 생물학적 기능을 시험하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 분석은 당업자에게 잘 알려져 있으며 하나 이상의 후보 항원의 발현과 관련된 세포에 대한 T 림프구의 세포 사멸 활성을 시험하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 방법은 T 림프구를 특성화하여 이것이 세포독성인지를 결정하고/거나, 공유 후보 항원이 면역원성인지를 시험하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 방법은 후보 항원 및 후보 항원에 결합하는 것으로 확인된 T 림프구의 생물학적 기능을 시험하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. T 림프구의 생물학적 기능을 시험하기 위한 분석은 당업자에게 잘 알려져 있으며 ELISPOT 분석 및/또는 세포 사멸 분석을 포함할 수 있다. 이는 예를 들어, 암세포를 제거하는데 도움이 되는 기능을 수행함으로써 다음과 같은 추가 검증을 제공한다: 1) 항원 (들)이 표적 세포 (예를 들어, 암세포)의 표면에 제시되거나; 2) T 림프구는 항원을 인식하고 표적화할 수 있거나; 3) 이 항원을 표적화하는 T 림프구 (들)는 기능적이다.
본 명세서에 규정된 바와 같은 방법은 의학적 병태를 갖는 환자의 2개의 상이한 코호트에서 HLA-결합 펩타이드의 공유 성질을 검증하는 추가 단계를 포함할 수 있다. 의학적 병태를 가진 환자의 제1 코호트는 후보 항원을 확인하는데 사용되는 "발견 코호트"이다. 의학적 병태를 가진 환자의 제2 코호트는 예측된 HLA 결합 펩타이드가 T 림프구에 결합하는지 확인하거나 시험하는데 사용되는 "검증 코호트"이다. 이는 확인된 항원(들)이 실제로 공유된다는 더 큰 확신이 있을 수 있기 때문에 유리하다.
후보 항원을 확인하기 위한 시스템
도 8을 참조하면, 공유 후보 항원을 확인하기 위한 시스템 (400)의 실시양태는 항원 예측 장치 (410)를 포함한다. 시스템 (400)은 또한 네트워크 (418)을 통해 항원 예측 장치 (410)와 통신하는 하나 이상의 시퀀싱 플랫폼 (420, 422, 424)을 포함할 수 있다.
항원 예측 장치 (410)는 방법 (100)을 적어도 부분적으로 수행하는데 적합하고, 특히 네트워크 (418)를 통해 시퀀싱 플랫폼 (420, 422, 424) 중 하나 이상으로부터 전사체 데이터에 대한 분석을 획득 및 수행할 수 있고/거나, 하나 이상의 컴퓨터 판독 가능 매체로부터 하나 이상의 후보 HLA-결합 펩타이드의 예측을 생성할 수 있다.
도 9는 시스템 (400)의 항원 예측 장치를 구현할 수 있는 예시적인 컴퓨팅 장치 (410)를 도시한다. 일부 실시양태에서, 다중 컴퓨팅 장치 (410)는 단일 애플리케이션 서버인 것으로 고려될 수 있다.
컴퓨팅 장치 (410)의 구성요소는 다양한 방식으로 구성될 수 있다. 구성요소는 네트워크를 통해 통신할 수 있는 다양한 위치에 분산된 하나의 하드웨어 단위 또는 다른 컴퓨터 하드웨어 단위을 포함할 수 있는 표준 컴퓨터 서버 하드웨어에서 실행될 소프트웨어에 의해 완전하게 구현될 수 있다. 구성요소 또는 그 부분의 일부는 또한 특정 용도 집적 회로 (ASIC) 또는 현장 프로그램 가능 게이트 어레이 (field programmable gate array)에 의해 구현될 수 있다.
도 9에 도시된 예에서, 컴퓨팅 장치 (410)는 32비트 또는 64비트 Intel 구조를 기반으로 하는 상업적으로 이용 가능한 서버 컴퓨터 시스템이고, 컴퓨팅 장치 (410)에 의해 실행되거나 수행되는 프로세스 및/또는 방법은 컴퓨팅 장치 (410)와 관련된 비휘발성 (예를 들어, 하드 디스크) 컴퓨터 판독 가능 저장소 (524)에 저장된 하나 이상의 소프트웨어 구성요소 또는 모듈 (522)의 프로그램 명령의 형태로 구현된다. 소프트웨어 모듈 (522)의 적어도 일부는 대안적으로 특정 용도 집적 회로 (ASIC) 및/또는 현장 프로그램 가능 게이트 어레이 (FPGA)와 같은 하나 이상의 전용 하드웨어 구성요소로 구현될 수 있다.
컴퓨팅 장치 (410)는 버스 (bus) (535)에 의해 모두 상호 연결된 다음 표준 상업적으로 이용 가능한 컴퓨터 구성요소 중 적어도 하나 이상을 포함한다:
(a) 랜덤 액세스 메모리 (random access memory) (RAM) (526);
(b) 적어도 하나의 컴퓨터 프로세서 (528), 및
(c) 외부 컴퓨터 인터페이스 (interface) (530):
(i) 범용 직렬 버스 (universal serial bus) (USB) 인터페이스 (530a) (이 중 적어도 하나는 키보드, 포인팅 장치 (예를 들어, 마우스 (532) 또는 터치패드 (touchpad))와 같은 하나 이상의 사용자 인터페이스 장치에 연결됨),
(ii) 컴퓨터 장치 (410)를 데이터 통신 네트워크 및/또는 외부 장치에 연결하는 네트워크 인터페이스 커넥터 (NIC) (530b); 및
(iii) 액정 디스플레이 (LCD) 패널 장치와 같은 디스플레이 장치 (534)에 연결된 디스플레이 어댑터 (display adapter) (530c).
컴퓨팅 장치 (410)는 다음을 포함하는 복수의 표준 소프트웨어 모듈을 포함한다:
(a) 작업 시스템 (OS) (536) (예를 들어, Linux 또는 Microsoft Windows); 및
(b) 입력 전사체 데이터 및/또는 출력 후보 HLA-결합 펩타이드와 같은 데이터를 가능하게 하는 구조화된 쿼리 언어 (SQL) 모듈 (542) (예를 들어, MySQL, http://www.mysql.com에서 입수 가능), SQL 데이터베이스 (516)에 저장되고 검색/액세스된다.
유리하게는, 데이터베이스 (516)는 컴퓨터 판독가능 데이터 저장소 (524)의 일부를 형성한다. 대안적으로, 데이터베이스 (516)는 도 8에 도시된 서버 (410)로부터 원위에 위치한다.
소프트웨어 모듈 (522)에서 모듈과 구성요소 사이의 경계는 예시적이며, 대안적 실시양태는 모듈을 병합하거나 모듈의 기능의 대체 분해를 부과할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에서 논의된 모듈은 다중 컴퓨터 프로세스로서, 선택적으로 다중 컴퓨터에서 실행될 서브모듈로 분해될 수 있다. 더욱이, 대안적 실시양태는 특정 모듈 또는 서브모듈의 다중 인스턴스를 결합할 수 있다. 더욱이, 작업은 결합될 수 있거나 작업의 기능은 본 발명에 따른 추가 작업들로 분산될 수 있다. 대안적으로, 이러한 작업은 복합 명령 집단 컴퓨터 (CISC)의 마이크로코드 (microcode), 프로그램 가능 또는 소거 가능/프로그램 가능한 장치로 프로그램된 펌웨어 (firmware), 현장 프로그램 가능 게이트 어레이 (FPGA), 게이트 어레이 또는 완전 주문형 특정 용도 집적 회로 (ASIC)의 설계 등과 같은 기능을 구현하는 회로 구조로 구현될 수 있다.
항원 예측 장치 (410)에 의해 수행되는 과정 (100)의 흐름도의 블록 각각은 모듈 (소프트웨어 모듈 (522)) 또는 모듈의 일부에 의해 실행될 수 있다. 이 과정은 본 방법을 실행하도록 컴퓨터 시스템을 구성하기 위한 비일시적 기기 판독가능 및/또는 컴퓨터 판독가능 매체로 구현될 수 있다. 소프트웨어 모듈은 모듈의 기능을 수행하도록 컴퓨터 시스템을 구성하기 위해 컴퓨터 시스템 메모리 내에 저장 및/또는 컴퓨터 시스템 메모리로 전송될 수 있다.
예를 들어, 도 9에 도시된 바와 같이, 모듈 (522)은 다음을 포함할 수 있다:
·시험 샘플과 참조 샘플 (예를 들어, MISO (412a) 및/또는 rMATS (412b)) 사이에 구별적으로 스플라이싱되는 스플라이스 변이체 세트를 확인하기 위해 하나 이상의 구별적 스플라이싱 알고리즘을 구현하는 구별적 스플라이싱 모듈 (412);
·세트 내의 각각의 스플라이스 변이체에 대해, 스플라이스 변이체와 동일한 유전자의 상응하는 제2 스플라이스 변이체 사이의 비중첩(non-overlapping) 서열을 결정하는 서열 확인 모듈 (414); 및
·비중첩 서열의 하나 이상의 아미노산 번역으로부터 하나 이상의 후보 HLA-결합 펩타이드를 예측하는 펩타이드 결합 모듈 (416) (예를 들어, NetMHCPan 또는 다른 유사한 예측 방법 사용).
컴퓨팅 장치 (410)는 일반적으로 프로그램 (특정 응용 프로그램 및/또는 작업 시스템과 같은 내부에 저장된 명령어 목록)에 따라 정보를 처리하고 입력/출력 (I/O) 장치 (530)를 통해 결과적인 출력 정보를 생성한다. 컴퓨터 프로세스는 일반적으로 실행 (구동) 프로그램 또는 프로그램의 일부, 현재 프로그램 값 및 상태 정보, 작업 시스템에서 프로세스 실행을 관리하는데 사용하는 리소스를 포함한다. 상위 프로세스는 상위 프로세스의 전체 기능을 수행하는데 도움이 되는 다른 하위 프로세스를 생성할 수 있다. 상위 프로세스는 상위 프로세스의 전체 기능 중 일부를 수행하기 위해 하위 프로세스를 구체적으로 생성하기 때문에 하위 프로세스 (및 하위 이하 프로세스 등)가 수행하는 기능은 때때로 상위 프로세스에 의해 수행되는 것으로 기재될 수 있다.
특성화 및/또는 치료 방법
본 명세서에서는 대상체의 의학적 병태를 특성화하는 방법이 개시되고, 본 방법은 본 명세서에 규정된 바와 같은 방법에 따라 확인된 하나 이상의 공유 항원의 수준 (또는 존재)을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 하나 이상의 공유 항원의 증가된 수준은 의학적 병태를 하나 이상의 공유 항원의 발현과 관련된 것으로 특성화하는 단계를 포함한다.
용어 "참조와 비교하여 하나 이상의 공유 항원의 증가된 수준"은 참조와 비교하여 하나 이상의 공유 항원의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 90%, 적어도 100% 또는 적어도 200% 이상의 증가를 지칭할 수 있다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 공유 항원은 HLA 분자에 결합하고, 하나 이상의 세포의 표면 상에 제시된다. 대상체는 하나 이상의 공유 항원을 인식하는 적합한 면역요법으로 추가로 치료될 수 있다.
본 명세서에서는 대상체의 의학적 병태를 특성화하는 방법이 개시되고, 본 방법은 본 명세서에 규정된 바와 같은 방법에 따라 확인된 하나 이상의 공유 항원의 수준 (또는 존재)을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 하나 이상의 공유 항원의 증가된 수준 (또는 하나 이상의 공유 항원의 존재)은 적합한 면역요법으로의 치료에 반응성일 수 있는 것으로 의학적 병태를 특성화하는 단계를 포함한다.
적합한 면역요법은 예를 들어, 자기 유래 세포 요법; T-세포 수용체-기반 요법; 항체-기반 요법 및 면역조절 화합물 예컨대, 예를 들어, 백신을 포함한다.
일부 실시양태에서, 의학적 병태는 암이다.
본 명세서에서는 대상체의 의학적 병태를 치료하는 방법이 개시되고, 본 방법은 (a) 본 명세서에 규정된 바와 같은 방법에 따라 확인된 하나 이상의 공유 항원의 수준 (또는 존재)을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 하나 이상의 공유 항원의 증가된 수준 (또는 하나 이상의 공유 항원의 존재)은 의학적 병태를 하나 이상의 공유 항원의 발현과 관련된 것으로 특성화하는 단계, 및 (b) 하나 이상의 공유 항원의 발현과 관련된 의학적 병태를 갖는 것으로 밝혀진 대상체를 치료하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서는 대상체의 의학적 병태를 치료하는 방법이 개시되고, 본 방법은 (a) 본 명세서에 규정된 바와 같은 방법에 따라 확인된 하나 이상의 공유 항원의 수준을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 하나 이상의 공유 항원의 증가된 수준 (또는 하나 이상의 공유 항원의 존재)은 적합한 면역요법으로의 치료에 반응성일 수 있는 것으로 의학적 병태를 특성화하는 단계, 및 (b) 적합한 면역요법으로의 치료에 반응성일 수 있는 의학적 병태가 있는 것으로 밝혀진 대상체를 치료하는 단계.
샘플에서 공유 항원 (예를 들어, HLA 결합 펩타이드 또는 스플라이스 변이체)을 검출하는 방법은 공유 항원을 인코딩하는 스플라이스 변이체를 검출하기 위해 PCR을 사용하는 단계를 포함할 수 있다. PCR은 스플라이스 변이체 핵산에 특이적으로 결합하는 한 쌍의 프라이머 및 환자 샘플에서 유래된 조성물을 사용하여 수행된다. 공유 항원의 검출은 PCR 산물의 크기 결정을 기반으로 할 수 있다. 대안적으로, 검출은 TaqMan 실시간 PCR과 같은 PCR 동안 특정 스플라이스 이소형에 대한 표지된 프로브의 결합을 검출하는 것에 기반할 수 있다.
다른 접근법에서, 공유 항원은 스플라이스 이소형에 대해 선택적인 프로브의 혼성화를 사용하여 검출될 수 있다. 환자 샘플에서 유래한 조성물은 스플라이스 이소형에 대해 선택적인 프로브의 혼성화에 사용될 수 있다. 프로브는 스플라이스 부위 접합에 존재하는 서열 또는 스플라이스 이소형에 존재하는 다른 서열에 결합할 수 있다 (예를 들어, 인트론[IRE], 엑손[SIE,MXE] 또는 엑손의 일부[A5E, A3E] 포함).
또 다른 접근법에서, 공유 항원은 항체를 사용하여 검출될 수 있다. 환자 샘플에서 유래된 조성물은 항체와 접촉될 수 있으며 면역조직화학 및 웨스턴 블롯은 공유 항원을 검출하는데 사용할 수 있다.
대안적으로, RNA-Seq 데이터는 공유 항원을 검출하기 위해 사용될 수 있다.
상기 방법은 모두 당업자에게 잘 알려져 있다.
또한 본 명세서에서는 대상체의 암을 특성화하는 방법이 개시되고, 본 방법은 대상체에서 획득된 샘플에서 MAP/미세관 친화도-조절 키나제 3(MARK3) 스플라이스 변이체의 수준을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 MARK3 스플라이스 변이체의 증가된 수준은 MARK3 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 것으로 암을 특성화하는 단계를 포함한다.
또한 본 명세서에서는 대상체의 암을 특성화하는 방법이 개시되고, 본 방법은 대상체로부터 획득된 샘플 중 MAP/미세관 친화도-조절 키나제 3(MARK3) 스플라이스 변이체의 수준 (또는 존재)을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 MARK3 스플라이스 변이체의 증가된 수준 (또는 MARK3 스플라이스 변이체의 존재)은 적합한 면역요법으로의 치료에 반응성일 수 있는 것으로 암을 특성화하는 단계를 포함한다.
또한 본 명세서에서는 대상체의 암을 치료하는 방법이 개시되고, 본 방법은 (a) 대상체로부터 획득된 샘플 중 MARK3 스플라이스 변이체의 수준 (또는 존재)을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 MARK3 스플라이스 변이체의 증가된 수준 (또는 MARK3 스플라이스 변이체의 존재) MARK3 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 것으로 암을 특성화하는 단계, 및 (b) MARK3 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 암을 가진 것으로 밝혀진 대상체를 치료하는 단계를 포함한다.
또한 본 명세서에서는 대상체의 암을 치료하는 방법이 개시되고, 본 방법은 (a) 대상체로부터 획득된 샘플 중 MARK3 스플라이스 변이체의 수준 (또는 존재)을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 MARK3 스플라이스 변이체의 증가된 수준 (또는 MARK3 스플라이스 변이체의 존재)은 적합한 면역요법으로의 치료에 반응성일 수 있는 것으로 암을 특성화하고, (b) 적합한 면역요법으로의 치료에 반응성일 수 있는 것으로 밝혀진 대상체를 치료하는 단계를 포함한다.
또한 본 명세서에서는 대상체의 암을 특성화하는 방법이 개시되고, 본 방법은 대상체로부터 획득된 샘플에서 NBPF9 스플라이스 변이체의 수준을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 NBPF9 스플라이스 변이체의 증가된 수준은 NBPF9 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 것으로 암을 특성화하는 단계를 포함한다.
또한 본 명세서에서는 대상체의 암을 특성화하는 방법이 개시되고, 본 방법은 대상체로부터 획득된 샘플 중 NBPF9 스플라이스 변이체의 수준 (또는 존재)을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 NBPF9 스플라이스 변이체의 증가된 수준 (또는 NBPF9 스플라이스 변이체의 존재)은 적합한 면역요법으로의 치료에 반응성일 수 있는 것으로 암을 특성화하는 단계를 포함한다.
또한 본 명세서에서는 대상체의 암을 치료하는 방법이 개시되고, 본 방법은 (a) 대상체로부터 획득된 샘플 중 NBPF9 스플라이스 변이체의 수준 (또는 존재)을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 NBPF9 스플라이스 변이체의 증가된 수준 (또는 NBPF9 스플라이스 변이체의 존재) NBPF9 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 것으로 암을 특성화하는 단계, 및 (b) NBPF9 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 암을 가진 것으로 밝혀진 대상체를 치료하는 단계를 포함한다.
또한 본 명세서에서는 대상체의 암을 치료하는 방법이 개시되고, 본 방법은 (a) 대상체로부터 획득된 샘플 중 NBPF9 스플라이스 변이체의 수준 (또는 존재)을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 NBPF9 스플라이스 변이체의 증가된 수준 (또는 NBPF9 스플라이스 변이체의 존재)은 적합한 면역요법으로의 치료에 반응성일 수 있는 것으로 암을 특성화하고, (b) 적합한 면역요법으로의 치료에 반응성일 수 있는 것으로 밝혀진 대상체를 치료하는 단계를 포함한다.
또한 본 명세서에서는 대상체의 암을 특성화하는 방법이 개시되고, 본 방법은 대상체로부터 획득된 샘플에서 PARD3 스플라이스 변이체의 수준을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 PARD3 스플라이스 변이체의 증가된 수준은 PARD3 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 것으로 암을 특성화하는 단계를 포함한다.
또한 본 명세서에서는 대상체의 암을 특성화하는 방법이 개시되고, 본 방법은 대상체로부터 획득된 샘플 중 PARD3 스플라이스 변이체의 수준 (또는 존재)을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 PARD3 스플라이스 변이체의 증가된 수준 (또는 PARD3 스플라이스 변이체의 존재)은 적합한 면역요법으로의 치료에 반응성일 수 있는 것으로 암을 특성화하는 단계를 포함한다.
또한 본 명세서에서는 대상체의 암을 치료하는 방법이 개시되고, 본 방법은 (a) 대상체로부터 획득된 샘플 중 PARD3 스플라이스 변이체의 수준 (또는 존재)을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 PARD3 스플라이스 변이체의 증가된 수준 (또는 PARD3 스플라이스 변이체의 존재) PARD3 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 것으로 암을 특성화하는 단계, 및 (b) PARD3 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 암을 가진 것으로 밝혀진 대상체를 치료하는 단계를 포함한다.
또한 본 명세서에서는 대상체의 암을 치료하는 방법이 개시되고, 본 방법은 (a) 대상체로부터 획득된 샘플 중 PARD3 스플라이스 변이체의 수준 (또는 존재)을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 PARD3 스플라이스 변이체의 증가된 수준 (또는 PARD3 스플라이스 변이체의 존재)은 적합한 면역요법으로의 치료에 반응성일 수 있는 것으로 암을 특성화하고, (b) 적합한 면역요법으로의 치료에 반응성일 수 있는 것으로 밝혀진 대상체를 치료하는 단계를 포함한다.
또한 본 명세서에서는 대상체의 암을 특성화하는 방법이 개시되고, 본 방법은 대상체로부터 획득된 샘플에서 ZC3HAV1 스플라이스 변이체의 수준을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 ZC3HAV1 스플라이스 변이체의 증가된 수준은 ZC3HAV1 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 것으로 암을 특성화하는 단계를 포함한다.
또한 본 명세서에서는 대상체의 암을 특성화하는 방법이 개시되고, 본 방법은 대상체로부터 획득된 샘플 중 ZC3HAV1 스플라이스 변이체의 수준 (또는 존재)을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 ZC3HAV1 스플라이스 변이체의 증가된 수준 (또는 ZC3HAV1 스플라이스 변이체의 존재)은 적합한 면역요법으로의 치료에 반응성일 수 있는 것으로 암을 특성화하는 단계를 포함한다.
또한 본 명세서에서는 대상체의 암을 치료하는 방법이 개시되고, 본 방법은 (a) 대상체로부터 획득된 샘플 중 ZC3HAV1 스플라이스 변이체의 수준 (또는 존재)을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 ZC3HAV1 스플라이스 변이체의 증가된 수준 (또는 ZC3HAV1 스플라이스 변이체의 존재) ZC3HAV1 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 것으로 암을 특성화하는 단계, 및 (b) ZC3HAV1 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 암을 가진 것으로 밝혀진 대상체를 치료하는 단계를 포함한다.
또한 본 명세서에서는 대상체의 암을 치료하는 방법이 개시되고, 본 방법은 (a) 대상체로부터 획득된 샘플 중 ZC3HAV1 스플라이스 변이체의 수준 (또는 존재)을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 ZC3HAV1 스플라이스 변이체의 증가된 수준 (또는 ZC3HAV1 스플라이스 변이체의 존재)은 적합한 면역요법으로의 치료에 반응성일 수 있는 것으로 암을 특성화하고, (b) 적합한 면역요법으로의 치료에 반응성일 수 있는 것으로 밝혀진 대상체를 치료하는 단계를 포함한다.
또한 본 명세서에서는 대상체의 암을 특성화하는 방법이 개시되고, 본 방법은 대상체로부터 획득된 샘플에서 YAF2 스플라이스 변이체의 수준을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 YAF2 스플라이스 변이체의 증가된 수준은 YAF2 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 것으로 암을 특성화하는 단계를 포함한다.
또한 본 명세서에서는 대상체의 암을 특성화하는 방법이 개시되고, 본 방법은 대상체로부터 획득된 샘플 중 YAF2 스플라이스 변이체의 수준 (또는 존재)을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 YAF2 스플라이스 변이체의 증가된 수준 (또는 YAF2 스플라이스 변이체의 존재)은 적합한 면역요법으로의 치료에 반응성일 수 있는 것으로 암을 특성화하는 단계를 포함한다.
또한 본 명세서에서는 대상체의 암을 치료하는 방법이 개시되고, 본 방법은 (a) 대상체로부터 획득된 샘플 중 YAF2 스플라이스 변이체의 수준 (또는 존재)을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 YAF2 스플라이스 변이체의 증가된 수준 (또는 YAF2 스플라이스 변이체의 존재) YAF2 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 것으로 암을 특성화하는 단계, 및 (b) YAF2 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 암을 가진 것으로 밝혀진 대상체를 치료하는 단계를 포함한다.
또한 본 명세서에서는 대상체의 암을 치료하는 방법이 개시되고, 본 방법은 (a) 대상체로부터 획득된 샘플 중 YAF2 스플라이스 변이체의 수준 (또는 존재)을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 YAF2 스플라이스 변이체의 증가된 수준 (또는 YAF2 스플라이스 변이체의 존재)은 적합한 면역요법으로의 치료에 반응성일 수 있는 것으로 암을 특성화하고, (b) 적합한 면역요법으로의 치료에 반응성일 수 있는 것으로 밝혀진 대상체를 치료하는 단계를 포함한다.
또한 본 명세서에서는 대상체의 암을 특성화하는 방법이 개시되고, 본 방법은 대상체로부터 획득된 샘플에서 CAMKK1 스플라이스 변이체의 수준을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 CAMKK1 스플라이스 변이체의 증가된 수준은 CAMKK1 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 것으로 암을 특성화하는 단계를 포함한다.
또한 본 명세서에서는 대상체의 암을 특성화하는 방법이 개시되고, 본 방법은 대상체로부터 획득된 샘플 중 CAMKK1 스플라이스 변이체의 수준 (또는 존재)을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 CAMKK1 스플라이스 변이체의 증가된 수준 (또는 CAMKK1 스플라이스 변이체의 존재)은 적합한 면역요법으로의 치료에 반응성일 수 있는 것으로 암을 특성화하는 단계를 포함한다.
또한 본 명세서에서는 대상체의 암을 치료하는 방법이 개시되고, 본 방법은 (a) 대상체로부터 획득된 샘플 중 CAMKK1 스플라이스 변이체의 수준 (또는 존재)을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 CAMKK1 스플라이스 변이체의 증가된 수준 (또는 CAMKK1 스플라이스 변이체의 존재) CAMKK1 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 것으로 암을 특성화하는 단계, 및 (b) CAMKK1 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 암을 가진 것으로 밝혀진 대상체를 치료하는 단계를 포함한다.
또한 본 명세서에서는 대상체의 암을 치료하는 방법이 개시되고, 본 방법은 (a) 대상체로부터 획득된 샘플 중 CAMKK1 스플라이스 변이체의 수준 (또는 존재)을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 CAMKK1 스플라이스 변이체의 증가된 수준 (또는 CAMKK1 스플라이스 변이체의 존재)은 적합한 면역요법으로의 치료에 반응성일 수 있는 것으로 암을 특성화하고, (b) 적합한 면역요법으로의 치료에 반응성일 수 있는 것으로 밝혀진 대상체를 치료하는 단계를 포함한다.
또한 본 명세서에서는 대상체의 암을 특성화하는 방법이 개시되고, 본 방법은 대상체로부터 획득된 샘플에서 LRR1 스플라이스 변이체의 수준을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 LRR1 스플라이스 변이체의 증가된 수준은 LRR1 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 것으로 암을 특성화하는 단계를 포함한다.
또한 본 명세서에서는 대상체의 암을 특성화하는 방법이 개시되고, 본 방법은 대상체로부터 획득된 샘플 중 LRR1 스플라이스 변이체의 수준 (또는 존재)을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 LRR1 스플라이스 변이체의 증가된 수준 (또는 LRR1 스플라이스 변이체의 존재)은 적합한 면역요법으로의 치료에 반응성일 수 있는 것으로 암을 특성화하는 단계를 포함한다.
또한 본 명세서에서는 대상체의 암을 치료하는 방법이 개시되고, 본 방법은 (a) 대상체로부터 획득된 샘플 중 LRR1 스플라이스 변이체의 수준 (또는 존재)을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 LRR1 스플라이스 변이체의 증가된 수준 (또는 LRR1 스플라이스 변이체의 존재) LRR1 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 것으로 암을 특성화하는 단계, 및 (b) LRR1 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 암을 가진 것으로 밝혀진 대상체를 치료하는 단계를 포함한다.
또한 본 명세서에서는 대상체의 암을 치료하는 방법이 개시되고, 본 방법은 (a) 대상체로부터 획득된 샘플 중 LRR1 스플라이스 변이체의 수준 (또는 존재)을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 LRR1 스플라이스 변이체의 증가된 수준 (또는 LRR1 스플라이스 변이체의 존재)은 적합한 면역요법으로의 치료에 반응성일 수 있는 것으로 암을 특성화하고, (b) 적합한 면역요법으로의 치료에 반응성일 수 있는 것으로 밝혀진 대상체를 치료하는 단계를 포함한다.
또한 본 명세서에서는 대상체의 암을 특성화하는 방법이 개시되고, 본 방법은 대상체로부터 획득된 샘플에서 ZNF670 스플라이스 변이체의 수준을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 ZNF670 스플라이스 변이체의 증가된 수준은 ZNF670 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 것으로 암을 특성화하는 단계를 포함한다.
또한 본 명세서에서는 대상체의 암을 특성화하는 방법이 개시되고, 본 방법은 대상체로부터 획득된 샘플 중 ZNF670 스플라이스 변이체의 수준 (또는 존재)을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 ZNF670 스플라이스 변이체의 증가된 수준 (또는 ZNF670 스플라이스 변이체의 존재)은 적합한 면역요법으로의 치료에 반응성일 수 있는 것으로 암을 특성화하는 단계를 포함한다.
또한 본 명세서에서는 대상체의 암을 치료하는 방법이 개시되고, 본 방법은 (a) 대상체로부터 획득된 샘플 중 ZNF670 스플라이스 변이체의 수준 (또는 존재)을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 ZNF670 스플라이스 변이체의 증가된 수준 (또는 ZNF670 스플라이스 변이체의 존재) ZNF670 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 것으로 암을 특성화하는 단계, 및 (b) ZNF670 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 암을 가진 것으로 밝혀진 대상체를 치료하는 단계를 포함한다.
또한 본 명세서에서는 대상체의 암을 치료하는 방법이 개시되고, 본 방법은 (a) 대상체로부터 획득된 샘플 중 ZNF670 스플라이스 변이체의 수준 (또는 존재)을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 ZNF670 스플라이스 변이체의 증가된 수준 (또는 ZNF670 스플라이스 변이체의 존재)은 적합한 면역요법으로의 치료에 반응성일 수 있는 것으로 암을 특성화하고, (b) 적합한 면역요법으로의 치료에 반응성일 수 있는 것으로 밝혀진 대상체를 치료하는 단계를 포함한다.
또한 본 명세서에서는 대상체의 암을 특성화하는 방법이 개시되고, 본 방법은 대상체로부터 획득된 샘플에서 GRINA 스플라이스 변이체의 수준을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 GRINA 스플라이스 변이체의 증가된 수준은 GRINA 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 것으로 암을 특성화하는 단계를 포함한다.
또한 본 명세서에서는 대상체의 암을 특성화하는 방법이 개시되고, 본 방법은 대상체로부터 획득된 샘플 중 GRINA 스플라이스 변이체의 수준 (또는 존재)을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 GRINA 스플라이스 변이체의 증가된 수준 (또는 GRINA 스플라이스 변이체의 존재)은 적합한 면역요법으로의 치료에 반응성일 수 있는 것으로 암을 특성화하는 단계를 포함한다.
또한 본 명세서에서는 대상체의 암을 치료하는 방법이 개시되고, 본 방법은 (a) 대상체로부터 획득된 샘플 중 GRINA 스플라이스 변이체의 수준 (또는 존재)을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 GRINA 스플라이스 변이체의 증가된 수준 (또는 GRINA 스플라이스 변이체의 존재) GRINA 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 것으로 암을 특성화하는 단계, 및 (b) GRINA 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 암을 가진 것으로 밝혀진 대상체를 치료하는 단계를 포함한다.
또한 본 명세서에서는 대상체의 암을 치료하는 방법이 개시되고, 본 방법은 (a) 대상체로부터 획득된 샘플 중 GRINA 스플라이스 변이체의 수준 (또는 존재)을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 GRINA 스플라이스 변이체의 증가된 수준 (또는 GRINA 스플라이스 변이체의 존재)은 적합한 면역요법으로의 치료에 반응성일 수 있는 것으로 암을 특성화하고, (b) 적합한 면역요법으로의 치료에 반응성일 수 있는 것으로 밝혀진 대상체를 치료하는 단계를 포함한다.
또한 본 명세서에서는 대상체의 암을 특성화하는 방법이 개시되고, 본 방법은 대상체로부터 획득된 샘플에서 MZF1 스플라이스 변이체의 수준을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 MZF1 스플라이스 변이체의 증가된 수준은 MZF1 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 것으로 암을 특성화하는 단계를 포함한다.
또한 본 명세서에서는 대상체의 암을 특성화하는 방법이 개시되고, 본 방법은 대상체로부터 획득된 샘플 중 MZF1 스플라이스 변이체의 수준 (또는 존재)을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 MZF1 스플라이스 변이체의 증가된 수준 (또는 MZF1 스플라이스 변이체의 존재)은 적합한 면역요법으로의 치료에 반응성일 수 있는 것으로 암을 특성화하는 단계를 포함한다.
또한 본 명세서에서는 대상체의 암을 치료하는 방법이 개시되고, 본 방법은 (a) 대상체로부터 획득된 샘플 중 MZF1 스플라이스 변이체의 수준 (또는 존재)을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 MZF1 스플라이스 변이체의 증가된 수준 (또는 MZF1 스플라이스 변이체의 존재) MZF1 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 것으로 암을 특성화하는 단계, 및 (b) MZF1 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 암을 가진 것으로 밝혀진 대상체를 치료하는 단계를 포함한다.
또한 본 명세서에서는 대상체의 암을 치료하는 방법이 개시되고, 본 방법은 (a) 대상체로부터 획득된 샘플 중 MZF1 스플라이스 변이체의 수준 (또는 존재)을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 MZF1 스플라이스 변이체의 증가된 수준 (또는 MZF1 스플라이스 변이체의 존재)은 적합한 면역요법으로의 치료에 반응성일 수 있는 것으로 암을 특성화하고, (b) 적합한 면역요법으로의 치료에 반응성일 수 있는 것으로 밝혀진 대상체를 치료하는 단계를 포함한다.
조성물
조성물은 암 환자의 특징적인 cDNA 발현 특성을 갖는 샘플 cDNA 및 cDNA 분자에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있으며, 샘플 cDNA는 공유 항원에 상응하는 cDNA 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 샘플 cDNA는 조직 또는 타액 샘플 cDNA이다. 프라이머 또는 프로브는 표지에 부착될 수 있다. 본 조성물은 DNA 중합효소를 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 공유 항원은 MARK3, NBPF9, PARD3, ZC3HAV1, YAF2, CAMKK1, LRR1, ZNF670, GRINA 또는 MZF1 스플라이스 변이체이다.
본 조성물은 또한 암 환자의 특징인 RNA 발현 특성을 갖는 샘플 RNA를 포함할 수 있다. 본 조성물은 RNA 분자에 결합하는 적어도 하나의 프라이머 (예를 들어, 올리고-dT 프라이머) 또는 프로브를 포함할 수 있다. 본 조성물은 cDNA 분자를 생성하기 위한 역전사효소를 추가로 포함할 수 있다.
본 조성물은 또한 환자 생검 샘플로부터 추출된, 조직 절편 또는 단백질 용해물을 포함할 수 있으며, 본 조성물은 공유 항원의 존재를 확인하기 위해 프로브 또는 항체와 반응될 수 있다.
PCR
용어 "중합효소 연쇄 반응" 또는 "PCR"은 핵산 분자의 상보적 가닥의 동시 프라이머 연장에 의한 특정 핵산 서열의 시험관내 증폭 반응을 의미한다. 다시 말해서, PCR은 프라이머 부위에 측접한 표적 핵산의 다중 카피 또는 복제물을 제조하는 반응이며, 이러한 반응은 (i) 표적 핵산 변성, (ii) 프라이머 부위로의 프라이머 어닐링 단계 및 (iii) 뉴클레오시드 트리포스페이트의 존재 하에 핵산 중합효소에 의한 프라이머 연장 중 하나 이상을 반복하는 단계를 포함한다. 일반적으로 반응은 열 순환기 기기의 각 단계에 최적화된 다양한 온도를 통해 순환된다. 특정 온도, 각 단계에서의 지속 시간 및 단계 간의 변화 속도는 당업자에게 잘 알려진 많은 요인에 따라 다르다. 용어 "PCR"은 다음에 제한되는 것은 아니나, 역전사-PCR, 실시간 PCR, 내포된 PCR, 정량적 PCR, 다중복합 PCR 등을 포함하는 반응의 유도 형태를 포함한다.
프라이머
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "프라이머"는 프라이머 연장 산물의 합성이 개시되는 조건, 즉, 적절한 완충액 ("완충액"에는 pH, 이온 강도, 보조인자 등이 포함됨) 및 적절한 온도에서 4개의 다른 뉴클레오타이드 트리포스페이트 및 중합효소의 존재 하에 핵산 주형으로 어닐링될 때 DNA 합성의 개시 시점으로서 작용할 수 있다.
본 발명의 증폭 단계에서 사용되는 프라이머는 표적 서열에 완전히 상보적이거나 실질적으로 상보적일 수 있다.
일반적으로, 프라이머는 12개 내지 100개 뉴클레오타이드, 더욱 바람직하게는 10개 내지 80개 뉴클레오타이드; 더욱 바람직하게는 15 내지 30개의 뉴클레오타이드; 및 더욱 바람직하게는 15 내지 25개의 뉴클레오타이드일 것이다.
본 명세서에 개시된 바와 같은 방법은 공유 항원 핵산에 특이적으로 결합하는 한 쌍의 프라이머로 공유 항원을 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 하나 이상의 프라이머는 형광단과 같은 검출 가능한 물질에 결합하여 표지될 수 있다.
예를 들어, 프라이머, 항체 또는 프로브와 관련하여 "표지된"이라는 용어는 검출 가능한 물질을 프로브에 연결 (즉, 물리적으로 연결)함에 의한 프로브의 직접 표지뿐만 아니라, 직접 표지된 다른 시약과의 반응성에 의한 프로브의 간접 표지를 포함하는 것으로 의도된다. 간접 표지의 예는 형광 표지된 2차 항체를 사용한 1차 항체의 검출 및 형광 표지된 스트렙타비딘으로 검출될 수 있도록 비오틴으로의 DNA 프로브의 말단 표지를 포함한다.
프로브
용어 "프로브"는 특이적으로 의도된 표적 분자, 예를 들어 뉴클레오타이드 전사체 또는 폴리펩타이드에 선택적으로 결합할 수 있는 임의의 분자를 지칭한다. 프로브는 당업자에 의해 합성되거나 적절한 생물학적 제제로부터 유래될 수 있다. 표적 분자의 검출을 위해 프로브는 표지되도록 특별히 설계될 수 있다. 프로브로 사용될 수 있는 분자의 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, RNA, DNA, 단백질, 항체, 및 유기 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브는 표면 고정될 수 있다. 핵산 (예를 들어, 올리고뉴클레오타이드)이 사용되는 경우 이는 핵산의 다른 가닥에 염기 특이적 방식으로 결합할 수 있다. 혼성화는 상보적 핵산 가닥 사이 또는 미스매치의 소수 영역을 포함하는 핵산 가닥 사이에서 발생할 수 있다. 이러한 프로브는 펩타이드 핵산, 및 당업계에 공지된 다른 핵산 유사체 및 핵산 모방체를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "혼성화"는 상보적 염기 쌍으로 인해 2개의 단일 가닥 핵산에 의한 이중체 구조의 형성을 지칭한다. 혼성화는 상보적 핵산 가닥 사이 또는 미스매치의 소수 영역을 포함하는 핵산 가닥 사이에서 발생할 수 있다. 용융 온도 또는 "Tm"은 핵산 이중체의 안정성을 측정한다. Tm은 염기쌍의 50%가 해리되는 온도 (규정된 이온 강도 및 pH)이다. 핵산 기술의 당업자는 예를 들어, 핵산의 길이, 염기 조성 및 서열, 이온 강도, 및 미스매칭된 염기쌍의 발생을 포함하는 다수의 변수를 고려하여 이중체 안정성을 경험적으로 결정할 수 있다.
항체
본 명세서에 개시된 바와 같은 방법은 공유 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 공유 항원 (예를 들어, 스플라이스 변이체 및/또는 스플라이스 변이체 항원)을 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 항체는 형광단 또는 효소와 같은 검출 가능한 물질에 결합함으로써 표지될 수 있다.
키트
본 개시내용은 샘플 중 본 명세서에 규정된 바와 같은 공유 항원 (예를 들어, 스플라이스 변이체 및/또는 스플라이스 변이체 항원)의 수준을 검출하거나 측정하기 위한 시약 (예를 들어, 항체, 프로브 또는 프라이머)을 포함하는 키트의 개발 및 사용을 제공할 수 있다. 키트는 또한 분석 시약 및 적절한 완충액을 포함할 수 있다.
치료
본 방법은 하나 이상의 공유 항원을 발현하는 암이 있는 것으로 밝혀진 대상체에게 항암 요법 또는 제제를 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 항암 요법 또는 제제는 화학요법, 방사선 요법, 표적화된 요법, 면역요법, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 암 항원 또는 표적의 존재를 검출하여 어떤 환자가 항암 요법 또는 제제를 투여하기에 적합한 후보일 수 있는지 확인하는 단계를 포함할 수 있다.
항원-특이적 T 림프구의 존재의 결정
본 명세서에서는 대상체의 의학적 병태를 특성화하는 방법이 개시되고, 본 방법은 본 명세서에 규정된 바와 같은 방법에 따라 확인된 하나 이상의 공유 항원에 특이적으로 결합하는 T 림프구의 수준 (또는 존재)을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 T 림프구의 증가된 수준 (또는 하나 이상의 공유 항원에 특이적으로 결합하는 T 림프구의 존재)은 하나 이상의 공유 항원의 발현과 관련된 것으로서 의학적 병태를 특성화하는 단계를 포함한다.
본 방법은 (a) 본 명세서에 규정된 바와 같은 방법에 따라 확인된 하나 이상의 공유 항원에 특이적으로 결합하는 T 림프구의 수준 (또는 존재) 및 (b) 대상체로부터 획득된 샘플 중 하나 이상의 공유 항원의 수준 (또는 존재)을 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 유일하게 본 명세서에 규정된 바와 같은 방법에 따라 확인된 하나 이상의 공유 항원에 특이적으로 결합하는 T 림프구의 수준 (또는 존재)을 결정하는 단계만을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 방법은 (a) 본 명세서에 규정된 바와 같은 방법에 따라 확인된 하나 이상의 공유 항원에 특이적으로 결합하는 T 림프구의 수준 (또는 존재) 및 (b) 이러한 항원-특이적 T 림프구의 표현형을 결정하는 단계만을 포함할 수 있다.
본 명세서에서는 대상체의 의학적 병태를 치료하는 방법이 개시되고, 본 방법은 a) 본 명세서에 규정된 바와 같은 방법에 따라 확인된 하나 이상의 공유 항원에 특이적으로 결합하는 T 림프구의 수준 (또는 존재)을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 T 림프구의 증가된 수준 (또는 하나 이상의 공유 항원에 특이적으로 결합하는 T 림프구의 존재)은 하나 이상의 공유 항원의 발현과 관련된 것으로 의학적 병태를 특성화하는 단계; 및 b) 하나 이상의 공유 항원의 발현과 관련된 의학적 병태를 가진 것으로 밝혀진 대상체를 치료하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 공유 항원에 특이적으로 결합하는 T 림프구의 존재를 검출하거나 상기 T 림프구의 수준을 결정하는데 사용하기 위한 공유 항원에 결합하는 HLA 분자를 포함하는 표지된 생체분자가 제공된다.
용어 "T 림프구" (또한 소위 T 세포)는 CD4+ T 림프구 (예컨대 미성숙 CD4+ T 림프구 또는 성숙 CD4+ 헬퍼 T 림프구)를 지칭할 수 있다. 용어 "T 림프구"는 또한 CD8+ T 림프구 (예컨대 미성숙 CD8+ T 림프구 또는 성숙 CD8+ 세포독성 T 림프구)를 지칭할 수 있다. 용어 "T 림프구"는 또한 CD4+ T 림프구뿐만 아니라, CD8+ T 림프구의 혼합물을 지칭할 수 있다.
일부 실시양태에서, T 림프구는 비-나이브 T-림프구이다. 일부 실시양태에서, T 림프구는 나이브 T-림프구이다. 일부 실시양태에서, T 림프구는 또한 항원 경험 T 림프구를 지칭할 수 있다.
일부 실시양태에서, T 림프구는 세포독성 T 림프구이다. 세포독성 T 림프구 (또한 소위 세포독성 T 세포, Tc, CTL, T-킬러 세포, 세포용해 T 세포, CD8+ T-세포 또는 킬러 T 세포)는 암 세포, 감염 세포 또는 다른 방식으로 손상된 세포를 사멸시키는 T 림프구이다.
일부 실시양태에서, T 림프구는 헬퍼 T 림프구이다. 헬퍼 T 림프구는 면역 반응을 조절하기 위해 T 세포 사이토카인을 방출함으로써, 다른 면역 세포의 활성을 지원하는 T 림프구이다.
일부 실시양태에서, 공유 항원 또는 이의 단편은 항원-제시 세포 (예를 들어 전문 항원-제시 세포 또는 암 세포)의 표면 상에 제시된다. 공유 항원 또는 이의 단편은 HLA 분자에 결합될 수 있고, 항원-제시 세포 또는 암 세포의 표면에 제시될 수 있다.
본 명세서에서 언급되는 HLA는 MHC 클래스 I 또는 MHC 클래스 II로부터의 HLA를 지칭할 수 있다.
일 실시양태에서, HLA 분자는 HLA-A11, HLA-A02 및/또는 HLA-A24로 이루어진 군으로부터 선택되는 MHC 클래스 I 분자이다.
본 명세서에서는 대상체의 암을 특성화하는 방법이 개시되고, 본 방법은 대상체에서 MARK3 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 T 림프구의 수준 (또는 존재)을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 T 림프구의 증가된 수준 (또는 T 림프구의 존재)은 MARK3 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 것으로 암을 특성화하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서는 대상체의 암을 특성화하는 방법이 개시되고, 본 방법은 대상체에서 NBPF9 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 T 림프구의 수준 (또는 존재)을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 T 림프구의 증가된 수준 (또는 T 림프구의 존재)은 NBPF9 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 것으로 암을 특성화하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서는 대상체의 암을 특성화하는 방법이 개시되고, 본 방법은 대상체에서 PARD3 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 T 림프구의 수준 (또는 존재)을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 T 림프구의 증가된 수준 (또는 T 림프구의 존재)은 PARD3 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 것으로 암을 특성화하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서는 대상체의 암을 특성화하는 방법이 개시되고, 본 방법은 대상체에서 ZC3HAV1 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 T 림프구의 수준 (또는 존재)을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 T 림프구의 증가된 수준 (또는 T 림프구의 존재)은 ZC3HAV1 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 것으로 암을 특성화하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서는 대상체의 암을 특성화하는 방법이 개시되고, 본 방법은 대상체에서 YAF2 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 T 림프구의 수준 (또는 존재)을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 T 림프구의 증가된 수준 (또는 T 림프구의 존재)은 YAF2 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 것으로 암을 특성화하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서는 대상체의 암을 특성화하는 방법이 개시되고, 본 방법은 대상체에서 CAMKK1 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 T 림프구의 수준 (또는 존재)을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 T 림프구의 증가된 수준 (또는 T 림프구의 존재)은 CAMKK1 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 것으로 암을 특성화하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서는 대상체의 암을 특성화하는 방법이 개시되고, 본 방법은 대상체에서 LRR1 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 T 림프구의 수준 (또는 존재)을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 T 림프구의 증가된 수준 (또는 T 림프구의 존재)은 LRR1 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 것으로 암을 특성화하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서는 대상체의 암을 특성화하는 방법이 개시되고, 본 방법은 대상체에서 ZNF670 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 T 림프구의 수준 (또는 존재)을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 T 림프구의 증가된 수준 (또는 T 림프구의 존재)은 ZNF670 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 것으로 암을 특성화하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서는 대상체의 암을 특성화하는 방법이 개시되고, 본 방법은 대상체에서 GRINA 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 T 림프구의 수준 (또는 존재)을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 T 림프구의 증가된 수준 (또는 T 림프구의 존재)은 GRINA 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 것으로 암을 특성화하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서는 대상체의 암을 특성화하는 방법이 개시되고, 본 방법은 대상체에서 MZF1 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 T 림프구의 수준 (또는 존재)을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 T 림프구의 증가된 수준 (또는 T 림프구의 존재)은 MZF1 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 것으로 암을 특성화하는 단계를 포함한다.
세포 요법
본 명세서에서는 대상체의 의학적 병태를 치료하는 방법이 개시되고, 본 방법은 (a) 본 명세서에 규정된 바와 같은 방법에 따라 확인된 하나 이상의 공유 항원에 특이적으로 결합하는 T 림프구의 수준 (또는 존재)을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 T 림프구의 증가된 수준 (또는 T 림프구의 존재)은 대상체의 의학적 병태를 하나 이상의 공유 항원의 발현과 관련된 것으로 특성화하는 단계; (b) 생체외에서 T 림프구의 집단을 단리 및 확장하는 단계; 및 (c) 하나 이상의 공유 항원의 발현과 관련된 것으로 나타난 의학적 병태를 치료하기 위해 대상체에게 T 림프구의 확장된 집단을 투여하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서는 대상체의 의학적 병태를 치료하는 방법이 개시되고, 본 방법은 (a) 본 명세서에 규정된 바와 같은 방법에 따라 확인된 하나 이상의 공유 항원에 특이적으로 결합하는 T 림프구의 수준 (또는 존재)을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 T 림프구의 증가된 수준 (또는 T 림프구의 존재)은 대상체가 적합한 면역요법으로의 치료에 반응성일 수 있음을 나타내는 단계; (b) 생체외에서 T 림프구의 집단을 단리 및 확장하는 단계; 및 (c) 대상체의 의학적 병태를 치료하기 위해 대상체에게 T 림프구의 확장된 집단을 투여하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서는 대상체의 의학적 병태를 치료하는 방법이 개시되고, 본 방법은 (a) 의학적 병태를 앓고 있는 대상체에서, 본 명세서에 규정된 바와 같은 방법에 따라 확인된 하나 이상의 공유 항원에 특이적으로 결합하는 T 림프구의 집단을 단리하고, 생체외에서 T 림프구의 집단을 확장하는 단계; 및 (b) 대상체의 의학적 병태를 치료하기 위해 대상체에게 T 림프구의 확장된 집단을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서 의학적 병태는 암이다.
본 방법은 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)의 집단을 획득하는 단계를 포함할 수 있다. PBMC는 공유 항원을 인식하는 T 림프구의 확장을 자극하기 위해 공유 항원으로 자극될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 공유 항원을 인식하는 T 림프구의 확장을 자극하기 위해 수지상 세포로의 분화를 위해 단핵구를 단리하기 위해 PBMC를 획득하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 공유 항원을 인식하는 T 림프구의 확장을 위한 EBV-형질전환된 B 세포의 생성을 위한 PBMC를 획득하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 수지상 세포 및 EBV-형질전환된 B 세포의 조합이 공유 항원을 인식하는 T 림프구의 확장을 위해 사용될 수 있다.
"투여하는"이라는 용어는 의학적 병태를 앓고 있는 대상체에게 적절한 요법을 접촉, 적용 또는 제공하는 것을 지칭한다. 의학적 병태는 암일 수 있고 적절한 요법은 수많은 항암 면역요법 중 하나일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "치료하는"은 (1) 장애의 하나 이상의 증상의 출현을 예방하거나 지연시키는 것, (2) 장애 또는 장애의 하나 이상의 증상의 발병을 억제하는 것, (3) 장애의 완화, 즉 장애 또는 장애의 적어도 하나의 증상의 퇴행을 유발하는 것; 및/또는 (4) 장애의 하나 이상의 증상의 중증도를 감소시키는 것을 지칭할 수 있다.
본 명세서에서 상호 혼용되는 용어 "환자", "대상체", "숙주" 또는 "개체"는 치료 또는 예방이 필요한 임의의 대상체, 특히 척추동물 대상체, 훨씬 더 특히 포유류 대상체를 지칭한다. 본 발명의 범위에 속하는 적합한 척추 동물은 다음에 제한되는 것은 아니나, 영장류 (예를 들어, 인간, 원숭이 및 유인원)를 포함하는 척삭문의 임의의 구성원을 포함하며, 마카카 속으로부터의 원숭이 종 (예를 들어, 사이노몰구스), 예컨대 마카카 파시쿨라리스 (Macaca fascicularis) 및/또는 붉은털 원숭이 (마카카 물라타 (Macaca mulatta)) 및 개코원숭이 (파피오 우르시누스 (Papio ursinus))뿐만 아니라, 마모셋 (칼리트릭스 (Callithrix) 속의 종), 다람쥐 원숭이 (사이미리 (Saimiri) 속의 종) 및 타마린 (tamarins) (사구이누스 (Saguinus) 속의 종)뿐만 아니라, 침팬지 (판 트로글로다이테스 (Pan troglodytes))와 같은 유인원 종, 설치류 (예를 들어, 마우스 랫트, 기니피그), 토끼목 (예를 들어, 토끼, 산토끼), 소과 동물 (예를 들어, 소), 양과 동물 (예를 들어, 양)), 염소과 동물 (예를 들어, 염소), 돼지과 동물 (예를 들어, 돼지), 말과 동물 (예를 들어, 말), 개과 동물 (예를 들어, 개), 고양이과 동물 (예를 들어, 고양이), 조류 (예를 들어, 닭, 칠면조, 오리, 거위, 반려 조류, 예컨대 카나리아, 잉꼬 등), 해양 포유류 (예를 들어, 돌고래, 고래), 파충류 (뱀, 개구리, 도마뱀 등), 어류를 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
본 명세서에서는 대상체의 암을 특성화하는 방법이 개시되고, 본 방법은 대상체에서 MARK3 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 T 림프구의 수준을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 T 림프구의 증가된 수준은 MARK3 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 것으로 암을 특성화하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서는 대상체의 암을 치료하는 방법이 개시되고, 본 방법은
(a) 대상체에서 MARK3 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 T 림프구의 수준을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 T 림프구의 증가된 수준은 MARK3 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 것으로 암을 특성화하는 단계;
(b) 생체외에서 T 림프구의 집단을 단리 및 확장하는 단계;
(c) 대상체의 암을 치료하기 위해 대상체에게 T 림프구의 확장된 집단을 투여하는 단계
를 포함한다.
본 명세서에서는 대상체의 암을 치료하는 방법이 개시되고, 본 방법은
(a) 암을 앓고 있는 대상체로부터의 MARK3 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 T 림프구의 집단을 단리하고, 생체외에서 T 림프구의 집단을 확장하는 단계; 및
(b) 대상체의 암을 치료하기 위해 대상체에게 T 림프구의 확장된 집단을 투여하는 단계
를 포함한다.
본 명세서에서는 대상체의 암을 특성화하는 방법이 개시되고, 본 방법은 대상체에서 NBPF9 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 T 림프구의 수준을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 T 림프구의 증가된 수준은 NBPF9 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 것으로 암을 특성화하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서는 대상체의 암을 치료하는 방법이 개시되고, 본 방법은
(a) 대상체에서 NBPF9 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 T 림프구의 수준을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 T 림프구의 증가된 수준은 NBPF9 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 것으로 암을 특성화하는 단계;
(b) 생체외에서 T 림프구의 집단을 단리 및 확장하는 단계;
(c) 대상체의 암을 치료하기 위해 대상체에게 T 림프구의 확장된 집단을 투여하는 단계
를 포함한다.
본 명세서에서는 대상체의 암을 치료하는 방법이 개시되고, 본 방법은
(a) 암을 앓고 있는 대상체로부터의 NBPF9 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 T 림프구의 집단을 단리하고, 생체외에서 T 림프구의 집단을 확장하는 단계; 및
(b) 대상체의 암을 치료하기 위해 대상체에게 T 림프구의 확장된 집단을 투여하는 단계
를 포함한다.
본 명세서에서는 대상체의 암을 특성화하는 방법이 개시되고, 본 방법은 대상체에서 PARD3 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 T 림프구의 수준을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 T 림프구의 증가된 수준은 PARD3 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 것으로 암을 특성화하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서는 대상체의 암을 치료하는 방법이 개시되고, 본 방법은
(a) 대상체에서 PARD3 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 T 림프구의 수준을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 T 림프구의 증가된 수준은 PARD3 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 것으로 암을 특성화하는 단계;
(b) 생체외에서 T 림프구의 집단을 단리 및 확장하는 단계;
(c) 대상체의 암을 치료하기 위해 대상체에게 T 림프구의 확장된 집단을 투여하는 단계
를 포함한다.
본 명세서에서는 대상체의 암을 치료하는 방법이 개시되고, 본 방법은
(a) 암을 앓고 있는 대상체로부터의 PARD3 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 T 림프구의 집단을 단리하고, 생체외에서 T 림프구의 집단을 확장하는 단계; 및
(b) 대상체의 암을 치료하기 위해 대상체에게 T 림프구의 확장된 집단을 투여하는 단계
를 포함한다.
본 명세서에서는 대상체의 암을 특성화하는 방법이 개시되고, 본 방법은 대상체에서 ZC3HAV1 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 T 림프구의 수준을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 T 림프구의 증가된 수준은 ZC3HAV1 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 것으로 암을 특성화하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서는 대상체의 암을 치료하는 방법이 개시되고, 본 방법은
(a) 대상체에서 ZC3HAV1 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 T 림프구의 수준을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 T 림프구의 증가된 수준은 ZC3HAV1 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 것으로 암을 특성화하는 단계;
(b) 생체외에서 T 림프구의 집단을 단리 및 확장하는 단계;
(c) 대상체의 암을 치료하기 위해 대상체에게 T 림프구의 확장된 집단을 투여하는 단계
를 포함한다.
본 명세서에서는 대상체의 암을 치료하는 방법이 개시되고, 본 방법은
(a) 암을 앓고 있는 대상체로부터의 ZC3HAV1 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 T 림프구의 집단을 단리하고, 생체외에서 T 림프구의 집단을 확장하는 단계; 및
(b) 대상체의 암을 치료하기 위해 대상체에게 T 림프구의 확장된 집단을 투여하는 단계
를 포함한다.
본 명세서에서는 대상체의 암을 특성화하는 방법이 개시되고, 본 방법은 대상체에서 YAF2 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 T 림프구의 수준을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 T 림프구의 증가된 수준은 YAF2 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 것으로 암을 특성화하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서는 대상체의 암을 치료하는 방법이 개시되고, 본 방법은
(a) 대상체에서 YAF2 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 T 림프구의 수준을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 T 림프구의 증가된 수준은 YAF2 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 것으로 암을 특성화하는 단계;
(b) 생체외에서 T 림프구의 집단을 단리 및 확장하는 단계;
(c) 대상체의 암을 치료하기 위해 대상체에게 T 림프구의 확장된 집단을 투여하는 단계
를 포함한다.
본 명세서에서는 대상체의 암을 치료하는 방법이 개시되고, 본 방법은
(a) 암을 앓고 있는 대상체로부터의 YAF2 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 T 림프구의 집단을 단리하고, 생체외에서 T 림프구의 집단을 확장하는 단계; 및
(b) 대상체의 암을 치료하기 위해 대상체에게 T 림프구의 확장된 집단을 투여하는 단계
를 포함한다.
본 명세서에서는 대상체의 암을 특성화하는 방법이 개시되고, 본 방법은 대상체에서 CAMKK1 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 T 림프구의 수준을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 T 림프구의 증가된 수준은 CAMKK1 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 것으로 암을 특성화하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서는 대상체의 암을 치료하는 방법이 개시되고, 본 방법은
(a) 대상체에서 CAMKK1 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 T 림프구의 수준을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 T 림프구의 증가된 수준은 CAMKK1 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 것으로 암을 특성화하는 단계;
(b) 생체외에서 T 림프구의 집단을 단리 및 확장하는 단계;
(c) 대상체의 암을 치료하기 위해 대상체에게 T 림프구의 확장된 집단을 투여하는 단계
를 포함한다.
본 명세서에서는 대상체의 암을 치료하는 방법이 개시되고, 본 방법은
(a) 암을 앓고 있는 대상체로부터의 CAMKK1 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 T 림프구의 집단을 단리하고, 생체외에서 T 림프구의 집단을 확장하는 단계; 및
(b) 대상체의 암을 치료하기 위해 대상체에게 T 림프구의 확장된 집단을 투여하는 단계
를 포함한다.
본 명세서에서는 대상체의 암을 특성화하는 방법이 개시되고, 본 방법은 대상체에서 LRR1 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 T 림프구의 수준을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 T 림프구의 증가된 수준은 LRR1 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 것으로 암을 특성화하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서는 대상체의 암을 치료하는 방법이 개시되고, 본 방법은
(a) 대상체에서 LRR1 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 T 림프구의 수준을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 T 림프구의 증가된 수준은 LRR1 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 것으로 암을 특성화하는 단계;
(b) 생체외에서 T 림프구의 집단을 단리 및 확장하는 단계;
(c) 대상체의 암을 치료하기 위해 대상체에게 T 림프구의 확장된 집단을 투여하는 단계
를 포함한다.
본 명세서에서는 대상체의 암을 치료하는 방법이 개시되고, 본 방법은
(a) 암을 앓고 있는 대상체로부터의 LRR1 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 T 림프구의 집단을 단리하고, 생체외에서 T 림프구의 집단을 확장하는 단계; 및
(b) 대상체의 암을 치료하기 위해 대상체에게 T 림프구의 확장된 집단을 투여하는 단계
를 포함한다.
본 명세서에서는 대상체의 암을 특성화하는 방법이 개시되고, 본 방법은 대상체에서 ZNF670 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 T 림프구의 수준을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 T 림프구의 증가된 수준은 ZNF670 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 것으로 암을 특성화하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서는 대상체의 암을 치료하는 방법이 개시되고, 본 방법은
(a) 대상체에서 ZNF670 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 T 림프구의 수준을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 T 림프구의 증가된 수준은 ZNF670 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 것으로 암을 특성화하는 단계;
(b) 생체외에서 T 림프구의 집단을 단리 및 확장하는 단계;
(c) 대상체의 암을 치료하기 위해 대상체에게 T 림프구의 확장된 집단을 투여하는 단계
를 포함한다.
본 명세서에서는 대상체의 암을 치료하는 방법이 개시되고, 본 방법은
(a) 암을 앓고 있는 대상체로부터의 ZNF670 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 T 림프구의 집단을 단리하고, 생체외에서 T 림프구의 집단을 확장하는 단계; 및
(b) 대상체의 암을 치료하기 위해 대상체에게 T 림프구의 확장된 집단을 투여하는 단계
를 포함한다.
본 명세서에서는 대상체의 암을 특성화하는 방법이 개시되고, 본 방법은 대상체에서 GRINA 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 T 림프구의 수준을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 T 림프구의 증가된 수준은 GRINA 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 것으로 암을 특성화하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서는 대상체의 암을 치료하는 방법이 개시되고, 본 방법은
(a) 대상체에서 GRINA 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 T 림프구의 수준을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 T 림프구의 증가된 수준은 GRINA 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 것으로 암을 특성화하는 단계;
(b) 생체외에서 T 림프구의 집단을 단리 및 확장하는 단계;
(c) 대상체의 암을 치료하기 위해 대상체에게 T 림프구의 확장된 집단을 투여하는 단계
를 포함한다.
본 명세서에서는 대상체의 암을 치료하는 방법이 개시되고, 본 방법은
(a) 암을 앓고 있는 대상체로부터의 GRINA 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 T 림프구의 집단을 단리하고, 생체외에서 T 림프구의 집단을 확장하는 단계; 및
(b) 대상체의 암을 치료하기 위해 대상체에게 T 림프구의 확장된 집단을 투여하는 단계
를 포함한다.
본 명세서에서는 대상체의 암을 특성화하는 방법이 개시되고, 본 방법은 대상체에서 MZF1 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 T 림프구의 수준을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 T 림프구의 증가된 수준은 MZF1 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 것으로 암을 특성화하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서는 대상체의 암을 치료하는 방법이 개시되고, 본 방법은
(a) 대상체에서 MZF1 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 T 림프구의 수준을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 T 림프구의 증가된 수준은 MZF1 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 것으로 암을 특성화하는 단계;
(b) 생체외에서 T 림프구의 집단을 단리 및 확장하는 단계;
(c) 대상체의 암을 치료하기 위해 대상체에게 T 림프구의 확장된 집단을 투여하는 단계
를 포함한다.
본 명세서에서는 대상체의 암을 치료하는 방법이 개시되고, 본 방법은
(a) 암을 앓고 있는 대상체로부터의 MZF1 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 T 림프구의 집단을 단리하고, 생체외에서 T 림프구의 집단을 확장하는 단계; 및
(b) 대상체의 암을 치료하기 위해 대상체에게 T 림프구의 확장된 집단을 투여하는 단계
를 포함한다.
치료를 위해 면역 세포를 조작하기 위한 TCR 서열
"TCR"은 HLA 분자에 결합되고 항원 제시 세포 또는 표적 세포의 표면에 제시될 수 있는 항원 단백질 또는 이의 단편에 대한 결합 친화도를 갖는 분자를 의미한다. 이 용어는 TRA 및 TRB 사슬의 이종이량체 또는 TRG 및 TRD 사슬의 이종이량체로 확장되는 것으로 이해될 것이다.
TCR은 International Immunogenetics (IMGT) TCR 명명법을 사용하여 기재되고 TCR 서열의 IMGT 공개 데이터베이스에 연결된다. 천연 알파-베타 이종이량체 TCR에는 알파 사슬과 베타 사슬이 있다. 일반적으로 각 사슬은 가변, 연결 및 불변 영역을 포함하고, 베타 사슬은 일반적으로 가변 영역과 연결 영역 사이에 짧은 다양성 영역을 포함하지만 이 다양성 영역은 종종 연결 영역의 일부로 고려된다. 각 가변 영역은 프레임워크 서열에 내포된 3개의 CDR (상보성 결정 영역)을 포함하며, 하나는 CDR3으로 명명된 초가변 영역이다. 프레임워크, CDR1 및 CDR2 서열, 및 부분적으로 규정된 CDR3 서열에 의해 구별되는 다수의 유형의 알파 사슬 가변 (Vα) 영역 및 다수의 유형의 베타 사슬 가변 (Vβ) 영역이 있다. Vα 유형은 IMGT 명명법에서 고유한 TRAV 번호로 지칭된다. 따라서 "TRAV21"은 TCR마다 보존되지만 TCR마다 다양한 아미노산 서열을 또한 포함하는 아미노산 서열에 의해 부분적으로 규정되는 고유한 프레임워크 및 CDR1 및 CDR2 서열 및 CDR3 서열을 갖는 TCR Vα 영역을 규정한다. 동일한 방식으로, "TRBV5-1"은 고유한 프레임워크 및 CDR1 및 CDR2 서열을 갖지만 부분적으로만 규정된 CDR3 서열을 갖는 TCR Vβ 영역을 규정한다.
TCR의 결합 영역은 고유한 IMGT TRAJ 및 TRBJ 명명법에 의해 유사하게 규정되고 불변 영역은 IMGT TRAC 및 TRBC 명명법에 의해 규정된다. 베타 사슬 다양성 영역은 IMGT 명명법에서 약어 TRBD로 지칭되며, 언급된 바와 같이 연결된 TRBD/TRBJ 영역은 종종 결합 영역으로 함께 고려된다. αβ TCR의 α 및 β 사슬은 일반적으로 각각 2개의 "도메인", 즉 가변 및 불변 도메인을 갖는 것으로 고려된다. 가변 도메인은 가변 영역과 결합 영역의 연결로 구성된다. 따라서, 본 명세서 및 청구범위에서 용어 "TCR 알파 가변 도메인"은 TRAV 및 TRAJ 영역의 연결을 지칭하고, 용어 TCR 알파 불변 도메인은 세포외 TRAC 영역 또는 C-말단 절단된 TRAC 서열을 지칭한다. 마찬가지로 용어 "TCR 베타 가변 도메인"은 TRBV 및 TRBD/TRBJ 영역의 연결을 지칭하고, TCR 베타 불변 도메인이라는 용어는 세포외 TRBC 영역 또는 C-말단 절단된 TRBC 서열을 지칭한다.
IMGT 명명법에 의해 규정된 고유한 서열은 널리 알려져 있고 TCR 분야의 당업자에게 접근 가능하다. 예를 들어, 이는 IMGT 공개 데이터베이스에서 찾을 수 있다. 문헌["T cell Receptor Factsbook", (2001) LeFranc and LeFranc, Academic Press, ISBN 0-1 2-441 352-8]은 또한 IMGT 명명법에 의해 규정된 서열을 개시하지만, 이의 출판일과 이에 따른 시간 차로 인해, 상기 내의 정보는 때때로 IMGT 데이터베이스를 참조하여 확인해야 한다.
당업자에게 명백한 바와 같이 TCRα 사슬 서열 및/또는 TCRβ 사슬 서열의 돌연변이 (들)는 치환 (들), 결실 (들) 또는 삽입 (들) 중 하나 이상일 수 있다. 이러한 돌연변이는 다음에 제한되는 것은 아니나, 중합효소 연쇄 반응 (PCR), 제한 효소 기반 클로닝 또는 결찰 비의존적 클로닝 (LIC) 절차를 기반으로 하는 단계를 포함하는 임의의 적절한 방법을 사용하여 수행할 수 있다.
본 발명의 TCR은 αβ 이종이량체일 수 있거나 단일 사슬 형태일 수 있다. 단일 사슬 형식은 Vα-L-Vβ, Vβ-L-Vα, Vα-Cα-L-Vβ 또는 Vα-L-Vβ-Cβ 유형의 αβ TCR 폴리펩타이드를 포함하고, Vα 및 Vβ는 각각 TCR a 및 β 가변 영역이고, Cα 및 Cβ는 각각 TCR a 및 β 불변 영역이고, L은 링커 서열이다. 항원 제시 세포에 치료제를 전달하기 위한 표적화제로 사용하기 위해 TCR은 가용성 형태 (즉, 막관통 또는 세포질 도메인이 없음)일 수 있다. 안정성을 위해, 가용성 αβ 이종이량체 TCR은 바람직하게는 예를 들어 WO 03/020763에 기재된 바와 같이 각각의 불변 도메인의 잔기 사이에 도입된 이황화 결합을 갖는다. 본 발명의 αβ 이종이량체에 존재하는 불변 도메인 중 하나 또는 둘 모두는 C 말단 또는 C 말단들에서, 예를 들어 최대 15개, 또는 최대 10개 또는 최대 8개 이하의 아미노산으로 절단될 수 있다. 입양 요법에 사용하기 위해, αβ 이종이량체 TCR은 예를 들어 세포질 및 막관통 도메인을 모두 갖는 전장 사슬로서, 형질감염될 수 있다. 입양 요법에 사용하기 위한 TCR은 각각의 알파 및 베타 불변 도메인 사이에서 자연에 존재하는 것과 상응하는 이황화 결합을 포함할 수 있으며, 추가로 또는 대안적으로 비천연 이황화 결합이 존재할 수 있다.
당업자에게 명백한 바와 같이, TCR의 결합 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않으면서 이의 C-말단 및/또는 N-말단에 제공된 서열을 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 잔기로 절단하는 것이 가능할 수 있다. 이러한 모든 사소한 변이체는 본 발명에 포함된다.
본 발명의 알파-베타 이종이량체 TCR은 일반적으로 알파 사슬 TRAC 불변 도메인 서열 및 베타 사슬 TRBC1 또는 TRBC2 불변 도메인 서열을 포함한다. 알파 및 베타 사슬 불변 도메인 서열은 TRAC의 엑손 2의 Cys4와 TRBC1 또는 TRBC2의 엑손 2의 Cys2 사이의 천연 이황화 결합을 결실시키기 위해 절단 또는 치환에 의해 변형될 수 있다. 알파 및 베타 사슬 불변 도메인 서열은 또한 TRAC의 Thr 48 및 TRBC1 또는 TRBC2의 Ser 57에 대한 시스테인 잔기의 치환에 의해 변형될 수 있으며, 상기 시스테인은 TCR의 알파 및 베타 불변 도메인 사이에 이황화 결합을 형성한다.
일부 실시양태에서, TCR을 생성하는 방법이 제공되며; 본 방법은 1) HLA 분자에 결합되는 공유 항원 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 환자 또는 공여체로부터 T 림프구 확인 및 단리; 및 또는 2) 이러한 T 림프구에 의해 발현되는 항원 결합 분자의 서열의 추가 확인을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, TCR을 생성하는 방법이 제공되며; 본 방법은 1) 환자 또는 대응하는(matched) 건강한 공여체로부터 PBMC의 단리; 2) 항원 제시 세포 및 T 림프구의 단리; 3) 본 명세서에 규정된 방법에 따라 확인된 공유 항원을 사용한 T 림프구의 자극; 4) HLA 분자에 결합되는 공유 항원 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 T 림프구의 확인 및 단리; 5) 이러한 T 림프구에 의해 발현되는 TCR의 서열의 추가 확인을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 확인된 하나 이상의 공유 항원에 특이적으로 결합하는 TCR 서열을 확인하는 방법은 다음 단계 중 하나 이상을 포함할 수 있다:
a) 항원-특이적 T 림프구의 단리;
b) 항원-특이적 T 림프구의 개별 세포로의 분리;
c) 항원-특이적 T 림프구로부터 핵산의 제조; 및
d) 항원-특이적인 TCR 서열을 획득하기 위한 시퀀싱.
항원-특이적 T 림프구의 단리는 1) 하나 이상의 표지된 생체분자를 의학적 병태를 가진 각 환자 또는 공여체의 말초 혈액을 포함하는 하나 이상의 샘플과 접촉시키고, 2) 하나 이상의 샘플로부터, 표지된 생체 분자에 결합된 T 림프구를 단리함으로써 수행된다. 일부 실시양태에서, 표지된 생체분자는 HLA 다량체일 수 있고 결합은 항원 특이성을 나타낼 것이다. 일부 실시양태에서, 표지된 생체분자는 항원 인식 시 T 림프구의 활성화를 나타내는 항체일 수 있다. 예를 들어, EBV-특이적 T 림프구가 EBV-감염 세포를 대면하면 활성화되어 CD107의 표면 발현을 유도하거나 IFN-γ를 분비할 것이다. 일부 실시양태에서, 표지된 생체분자는 단일 또는 다중 HLA 다량체 및 항체의 조합일 수 있다. 일부 실시양태에서, 이는 후속 단계를 위해 더 많은 물질을 획득하는 것을 용이하게 하기 위해 이러한 항원 특이적 세포의 확장을 포함할 수 있다. 단리된 항원 특이적 T 림프구는 다중 TCR을 발현하는 T 림프구의 다클론 집단으로 구성될 수 있다 (각각의 T 림프구는 다른 형태의 TRA 및 TRB를 발현함).
개별 TCR의 서열이 확인될 수 있도록 항원-특이적 T 림프구를 개별 세포로 분리하는 것은 당업자에게 잘 알려진 다수의 방법에 의해 달성될 수 있다. 이러한 방법에는 예를 들어 FAC 분류기를 사용하여 항원 특이적 T 림프구의 집단을 개별 세포로 분류하는 단계; 미세 유체 공학을 사용하는 단계; 액적 에멀젼 을 사용하는 단계를 포함하거나; 분리는 개별 T 림프구 클론의 확인 및 항원 특이적 T 림프구의 후속 풀링을 용이하게 하는 바코드 서열의 추가를 포함할 수 있다.
TCR 서열의 단리를 위한 항원-특이적 T 림프구로부터 핵산의 제조는 마찬가지로 당업자에게 잘 알려진 다수의 방법에 의해 달성될 수 있다. RNA 또는 DNA를 출발 핵산 물질로 사용할 수 있다. 핵산은 TCR 서열을 단리하기에 충분한 물질을 획득하기 위해 PCR에 의해 증폭된다. TCR 서열은 또한 항원-특이적 T 림프구로부터의 핵산으로부터 직접 증폭될 수 있다. TCR 서열의 증폭은 TCR 서열의 우선순위화 또는 순위화를 가능하게 하기 위해 항원-특이적 T 림프구의 유전자 발현 특성을 생성하는 단계를 포함할 수 있다.
시퀀싱은 다음에 제한되는 것은 아니나, 예를 들어, TCR 서열을 획득하기 위한 Sanger 시퀀싱 또는 차세대 시퀀싱을 포함하는 임의의 수의 시퀀싱 방식에 의해 수행될 수 있다.
T-세포 수용체의 시퀀싱은 방법 150의 단계 (156)에 따라 항원-특이적 T 림프구의 확인 후에 수행될 수 있다 (도 1(b)).
대안적으로, TCR 서열은 표면에 TCR을 발현하는 효모 또는 박테리오파지의 라이브러리를 스크리닝함으로써 확인될 수 있다. 이는 어떤 TCR 서열이 HLA 분자에 결합되는 공유 항원 또는 이의 단편에 결합할 수 있는지 확인하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서는 T-세포 수용체를 인코딩하는 핵산이 개시되고, 핵산에 의해 인코딩되는 T-세포 수용체는 공유 항원 또는 이의 단편에 특이적으로 결합할 수 있고, 공유 항원 또는 이의 단편은 HLA 분자에 결합한다.
본 명세서에서는 또한 본 명세서에 규정된 바와 같은 핵산에 의해 인코딩되는 단리된 T 세포 수용체가 제공된다. 일부 실시양태에서, 공유 항원에 특이적으로 결합하는 T-세포 수용체 (TCR)가 제공되고, 상기 공유 항원은 HLA 분자에 결합한다. 공유 항원은 항원 제시 세포 또는 암 세포의 표면 상에 제시될 수 있다.
본 명세서에 규정된 방법에 따라 확인된 공유 항원에 대한 항원-특이적 TCR이 획득되면, 이러한 TCR은 의학적 병태의 치료에 사용하기 위해 당업자에게 잘 알려진 방법에 따라 면역 세포 내로 조작된다.
본 명세서에서는 T-세포 수용체를 인코딩하는 핵산이 개시되고, 핵산에 의해 인코딩되는 T-세포 수용체는 MARK3 스플라이스 변이체 또는 이의 단편에 특이적으로 결합할 수 있고, MARK3 스플라이스 변이체 또는 이의 단편은 HLA 분자에 결합한다.
본 명세서에서는 또한 본 명세서에 규정된 바와 같은 핵산에 의해 인코딩되는 단리된 T 세포 수용체가 제공된다. 일부 실시양태에서, MARK3 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 T-세포 수용체 (TCR)가 제공되고, MARK3 스플라이스 변이체는 HLA 분자에 결합한다. MARK3 스플라이스 변이체는 항원 제시 세포 또는 암 세포의 표면 상에 제시될 수 있다.
일 실시양태에서, 공유 항원은 서열번호 1에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 펩타이드, 또는 서열번호 1에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 펩타이드를 인코딩하는 핵산을 포함한다.
일 실시양태에서, 공유 항원은 서열번호 1에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 펩타이드, 또는 서열번호 1에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 펩타이드를 인코딩하는 핵산이다.
본 명세서에서는 T-세포 수용체를 인코딩하는 핵산이 개시되고, 핵산에 의해 인코딩되는 T-세포 수용체는 NBPF9 스플라이스 변이체 또는 이의 단편에 특이적으로 결합할 수 있고, NBPF9 스플라이스 변이체 또는 이의 단편은 HLA 분자에 결합한다.
본 명세서에서는 또한 본 명세서에 규정된 바와 같은 핵산에 의해 인코딩되는 단리된 T 세포 수용체가 제공된다. 일부 실시양태에서, NBPF9 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 T-세포 수용체 (TCR)가 제공되고, NBPF9 스플라이스 변이체는 HLA 분자에 결합한다. NBPF9 스플라이스 변이체는 항원 제시 세포 또는 암 세포의 표면 상에 제시될 수 있다.
일 실시양태에서, 공유 항원은 서열번호 31에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 펩타이드, 또는 서열번호 31에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 펩타이드를 인코딩하는 핵산이다.
본 명세서에서는 T-세포 수용체를 인코딩하는 핵산이 개시되고, 핵산에 의해 인코딩되는 T-세포 수용체는 PARD3 스플라이스 변이체 또는 이의 단편에 특이적으로 결합할 수 있고, PARD3 스플라이스 변이체 또는 이의 단편은 HLA 분자에 결합한다.
본 명세서에서는 또한 본 명세서에 규정된 바와 같은 핵산에 의해 인코딩되는 단리된 T 세포 수용체가 제공된다. 일부 실시양태에서, PARD3 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 T-세포 수용체 (TCR)가 제공되고, PARD3 스플라이스 변이체는 HLA 분자에 결합한다. PARD3 스플라이스 변이체는 항원 제시 세포 또는 암 세포의 표면 상에 제시될 수 있다.
일 실시양태에서, 공유 항원은 서열번호 32에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 펩타이드, 또는 서열번호 32에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 펩타이드를 인코딩하는 핵산이다.
본 명세서에서는 T-세포 수용체를 인코딩하는 핵산이 개시되고, 핵산에 의해 인코딩되는 T-세포 수용체는 ZC3HAV1 스플라이스 변이체 또는 이의 단편에 특이적으로 결합할 수 있고, ZC3HAV1 스플라이스 변이체 또는 이의 단편은 HLA 분자에 결합한다.
본 명세서에서는 또한 본 명세서에 규정된 바와 같은 핵산에 의해 인코딩되는 단리된 T 세포 수용체가 제공된다. 일부 실시양태에서, ZC3HAV1 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 T-세포 수용체 (TCR)가 제공되고, ZC3HAV1 스플라이스 변이체는 HLA 분자에 결합한다. ZC3HAV1 스플라이스 변이체는 항원 제시 세포 또는 암 세포의 표면 상에 제시될 수 있다.
일 실시양태에서, 공유 항원은 서열번호 33에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 펩타이드, 또는 서열번호 33에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 펩타이드를 인코딩하는 핵산이다.
본 명세서에서는 T-세포 수용체를 인코딩하는 핵산이 개시되고, 핵산에 의해 인코딩되는 T-세포 수용체는 YAF2 스플라이스 변이체 또는 이의 단편에 특이적으로 결합할 수 있고, YAF2 스플라이스 변이체 또는 이의 단편은 HLA 분자에 결합한다.
본 명세서에서는 또한 본 명세서에 규정된 바와 같은 핵산에 의해 인코딩되는 단리된 T 세포 수용체가 제공된다. 일부 실시양태에서, YAF2 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 T-세포 수용체 (TCR)가 제공되고, YAF2 스플라이스 변이체는 HLA 분자에 결합한다. YAF2 스플라이스 변이체는 항원 제시 세포 또는 암 세포의 표면 상에 제시될 수 있다.
일 실시양태에서, 공유 항원은 서열번호 34에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 펩타이드, 또는 서열번호 34에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 펩타이드를 인코딩하는 핵산이다.
본 명세서에서는 T-세포 수용체를 인코딩하는 핵산이 개시되고, 핵산에 의해 인코딩되는 T-세포 수용체는 CAMKK1 스플라이스 변이체 또는 이의 단편에 특이적으로 결합할 수 있고, CAMKK1 스플라이스 변이체 또는 이의 단편은 HLA 분자에 결합한다.
본 명세서에서는 또한 본 명세서에 규정된 바와 같은 핵산에 의해 인코딩되는 단리된 T 세포 수용체가 제공된다. 일부 실시양태에서, CAMKK1 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 T-세포 수용체 (TCR)가 제공되고, CAMKK1 스플라이스 변이체는 HLA 분자에 결합한다. CAMKK1 스플라이스 변이체는 항원 제시 세포 또는 암 세포의 표면 상에 제시될 수 있다.
일 실시양태에서, 공유 항원은 서열번호 35에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 펩타이드, 또는 서열번호 35에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 펩타이드를 인코딩하는 핵산이다.
본 명세서에서는 T-세포 수용체를 인코딩하는 핵산이 개시되고, 핵산에 의해 인코딩되는 T-세포 수용체는 LRR1 스플라이스 변이체 또는 이의 단편에 특이적으로 결합할 수 있고, LRR1 스플라이스 변이체 또는 이의 단편은 HLA 분자에 결합한다.
본 명세서에서는 또한 본 명세서에 규정된 바와 같은 핵산에 의해 인코딩되는 단리된 T 세포 수용체가 제공된다. 일부 실시양태에서, LRR1 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 T-세포 수용체 (TCR)가 제공되고, LRR1 스플라이스 변이체는 HLA 분자에 결합한다. LRR1 스플라이스 변이체는 항원 제시 세포 또는 암 세포의 표면 상에 제시될 수 있다.
일 실시양태에서, 공유 항원은 서열번호 36 또는 서열번호 51에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 펩타이드, 또는 서열번호 36 또는 서열번호 51에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 펩타이드를 인코딩하는 핵산이다.
본 명세서에서는 T-세포 수용체를 인코딩하는 핵산이 개시되고, 핵산에 의해 인코딩되는 T-세포 수용체는 ZNF670 스플라이스 변이체 또는 이의 단편에 특이적으로 결합할 수 있고, ZNF670 스플라이스 변이체 또는 이의 단편은 HLA 분자에 결합한다.
본 명세서에서는 또한 본 명세서에 규정된 바와 같은 핵산에 의해 인코딩되는 단리된 T 세포 수용체가 제공된다. 일부 실시양태에서, ZNF670 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 T-세포 수용체 (TCR)가 제공되고, ZNF670 스플라이스 변이체는 HLA 분자에 결합한다. ZNF670 스플라이스 변이체는 항원 제시 세포 또는 암 세포의 표면 상에 제시될 수 있다.
일 실시양태에서, 공유 항원은 서열번호 37에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 펩타이드, 또는 서열번호 37에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 펩타이드를 인코딩하는 핵산이다.
본 명세서에서는 T-세포 수용체를 인코딩하는 핵산이 개시되고, 핵산에 의해 인코딩되는 T-세포 수용체는 GRINA 스플라이스 변이체 또는 이의 단편에 특이적으로 결합할 수 있고, GRINA 스플라이스 변이체 또는 이의 단편은 HLA 분자에 결합한다.
본 명세서에서는 또한 본 명세서에 규정된 바와 같은 핵산에 의해 인코딩되는 단리된 T 세포 수용체가 제공된다. 일부 실시양태에서, GRINA 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 T-세포 수용체 (TCR)가 제공되고, GRINA 스플라이스 변이체는 HLA 분자에 결합한다. GRINA 스플라이스 변이체는 항원 제시 세포 또는 암 세포의 표면 상에 제시될 수 있다.
일 실시양태에서, 공유 항원은 서열번호 38에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 펩타이드, 또는 서열번호 38에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 펩타이드를 인코딩하는 핵산이다.
본 명세서에서는 T-세포 수용체를 인코딩하는 핵산이 개시되고, 핵산에 의해 인코딩되는 T-세포 수용체는 MZF1 스플라이스 변이체 또는 이의 단편에 특이적으로 결합할 수 있고, MZF1 스플라이스 변이체 또는 이의 단편은 HLA 분자에 결합한다.
본 명세서에서는 또한 본 명세서에 규정된 바와 같은 핵산에 의해 인코딩되는 단리된 T 세포 수용체가 제공된다. 일부 실시양태에서, MZF1 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 T-세포 수용체 (TCR)가 제공되고, MZF1 스플라이스 변이체는 HLA 분자에 결합한다. MZF1 스플라이스 변이체는 항원 제시 세포 또는 암 세포의 표면 상에 제시될 수 있다.
일 실시양태에서, 공유 항원은 서열번호 52에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 펩타이드, 또는 서열번호 52에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 펩타이드를 인코딩하는 핵산이다.
일부 실시양태에서, TCR은 TRAV6*01 아미노산 서열, TRAJ9*01 아미노산 서열 및/또는 서열번호 20의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 CDR3을 포함하는 TCRα 사슬 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, TCR은 TRBV7-9*01 아미노산 서열, TRBJ1-2*01 아미노산 서열 및/또는 서열번호 28의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 CDR3을 포함하는 TCRβ 사슬 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, TCR은 a) TRAV6*01 아미노산 서열, TRAJ9*01 아미노산 서열, 및/또는 서열번호 20의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 CDR3을 포함하는 TCRα 사슬 도메인; 및 b) TRBV7-9*01 아미노산 서열, TRBJ1-2*01 아미노산 서열 및/또는 서열번호 28의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 CDR3을 포함하는 TCRβ 사슬 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, TCR은 a) 서열번호 15에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 서열번호 16에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 및 서열번호 20에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산을 포함하는 TCRα 사슬 도메인; 및 b) 서열번호 23에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 서열번호 24에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 및 서열번호 28에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산을 포함하는 TCRβ 사슬 도메인을 포함한다.
TCR은 a) i) 서열번호 17의 CDR1 서열, ii) 서열번호 18의 CDR2 서열 및/또는 iii) 서열번호 20의 CDR3을 포함하는 TCRα 사슬 도메인을 포함할 수 있다. TCR은 b) i) 서열번호 25의 CDR1 서열, ii) 서열번호 26의 CDR2 서열 및/또는 iii) 서열번호 28의 CDR3 서열을 포함하는 TCRβ 사슬 도메인을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, a) 서열번호 21에 대해 적어도 70% (또는 80%, 90%, 95% 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 TCRα 사슬 가변 도메인, 및 b) 서열번호 29에 대해 적어도 70% (또는 80%, 90%, 95% 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 TCRβ 사슬 가변 도메인을 포함하는 TCR이 제공된다.
일부 실시양태에서, a) 서열번호 22에 대해 적어도 70% (또는 80%, 90%, 95% 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 TCRα 사슬 도메인, 및 b) 서열번호 30에 대해 적어도 70% (또는 80%, 90%, 95% 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 TCRβ 사슬 도메인을 포함하는 TCR이 제공된다.
본 발명은 또한 TCR 발현 벡터를 보유하는 세포를 제공한다. 벡터는 단일 오픈 판독 프레임, 또는 2개의 별개의 오픈 판독 프레임, 각각 알파 사슬 및 베타 사슬을 인코딩하는 본 발명의 핵산을 포함할 수 있다.
또한, 본 명세서에 규정된 바와 같은 TCR의 알파 사슬을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제1 발현 벡터, 및 본 명세서에 규정된 바와 같은 TCR의 베타 사슬을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제2 발현 벡터를 보유하는 세포가 제공된다.
면역요법을 위한 가용성 TCR
확인된 TCR 서열은 TCR 사슬의 막관통 영역 및 세포질 꼬리의 제거에 의해 가용화될 수 있다. 가용성 TCR의 사슬간 안정성은 TCR 사슬의 서열 변형에 의해 안정화될 수 있고; 예를 들어, TRA 및 TRB 사슬의 잔기는 두 사슬 사이에 이황화 결합이 형성되도록 하는 시스테인으로 대체될 수 있다. 이러한 가용성 TCR은 치료 효능을 향상시키는 추가 기능; 예를 들어, CD3 T 세포의 집단을 가능하게 하는 항-CD3 단일 사슬 가변 단편에 대한 융합을 갖도록 추가로 변형될 수 있다. 이러한 방법은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어 문헌[Walseng et al Plos One 2015 and Damato et al Cancers (Basel) 2019]에서 찾을 수 있다.
대안적으로, 확인된 TCR 서열은 숙주 세포 (예를 들어 포유류 중국 햄스터 난소 세포)에서 TCR의 가변 영역을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 발현함으로써 재조합적으로 생성될 수 있다. 발현 벡터의 도움으로, 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산이 형질감염되고, 가용성 TCR의 생성에 적합한 숙주 세포에서 발현될 수 있다.
본 명세서에서는 본 명세서에 규정된 바와 같은 공유 항원에 특이적으로 결합하는 가용화된 TCR이 제공되고, 상기 공유 항원은 HLA 분자에 결합되고, 선택적으로 항원-제시 세포의 표면에 제시된다.
본 명세서에서는 MARK3 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 가용화된 TCR이 제공되고, MARK3 스플라이스 변이체는 HLA 분자에 결합되고, 선택적으로 암 세포의 표면에 제시된다.
본 명세서에서는 MARK3 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 가용화된 TCR이 제공되고, MARK3 스플라이스 변이체는 HLA 분자에 결합되고, 선택적으로 암 세포의 표면에 제시되고, TCR은 a) 서열번호 21에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 TCRα 사슬 가변 도메인, 및 b) 서열번호 29에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 TCRβ 사슬 가변 도메인을 포함한다.
일 실시양태에서, 가용화된 TCR은 a) i) 서열번호 17의 CDR1 서열, ii) 서열번호 18의 CDR2 서열 및 iii) 서열번호 20의 CDR3을 포함하는 TCRα 사슬 도메인; 및 b) i) 서열번호 25의 CDR1 서열, ii) 서열번호 26의 CDR2 서열 및/또는 iii) 서열번호 28의 CDR3 서열을 포함하는 TCRβ 사슬 도메인을 포함한다.
본 명세서에서는 NBPF9 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 가용화된 TCR이 제공되고, NBPF9 스플라이스 변이체는 HLA 분자에 결합되고, 선택적으로 암 세포의 표면에 제시된다.
본 명세서에서는 PARD3 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 가용화된 TCR이 제공되고, PARD3 스플라이스 변이체는 HLA 분자에 결합되고, 선택적으로 암 세포의 표면에 제시된다.
본 명세서에서는 ZC3HAV1 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 가용화된 TCR이 제공되고, ZC3HAV1 스플라이스 변이체는 HLA 분자에 결합되고, 선택적으로 암 세포의 표면에 제시된다.
본 명세서에서는 YAF2 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 가용화된 TCR이 제공되고, YAF2 스플라이스 변이체는 HLA 분자에 결합되고, 선택적으로 암 세포의 표면에 제시된다.
본 명세서에서는 CAMKK1 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 가용화된 TCR이 제공되고, CAMKK1 스플라이스 변이체는 HLA 분자에 결합되고, 선택적으로 암 세포의 표면에 제시된다.
본 명세서에서는 LRR1 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 가용화된 TCR이 제공되고, LRR1 스플라이스 변이체는 HLA 분자에 결합되고, 선택적으로 암 세포의 표면에 제시된다.
본 명세서에서는 ZNF670 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 가용화된 TCR이 제공되고, ZNF670 스플라이스 변이체는 HLA 분자에 결합되고, 선택적으로 암 세포의 표면에 제시된다.
본 명세서에서는 GRINA 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 가용화된 TCR이 제공되고, GRINA 스플라이스 변이체는 HLA 분자에 결합되고, 선택적으로 암 세포의 표면에 제시된다.
본 명세서에서는 MZF1 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 가용화된 TCR이 제공되고, MZF1 스플라이스 변이체는 HLA 분자에 결합되고, 선택적으로 암 세포의 표면에 제시된다.
일부 실시양태에서, 항체 예컨대 단일 사슬 가변 단편에 융합된 가용화된 TCR이 제공된다. 일부 실시양태에서, 단일 사슬 가변 단편은 항-CD3 단일 사슬 가변 단편이다.
본 발명의 가용화된 TCR은 또한 검출가능한 표지 (예를 들어, 형광 표지, 방사성 표지, 효소, 핵산 프로브) 또는 치료제 (예를 들어, 면역조절, 방사성 동위원소, 독소, 효소 또는 세포독성제)에 부착될 수 있다.
본 명세서에 규정된 가용화된 TCR은 글리코실화될 수 있다. 글리코실화 정도는 예를 들어 특정 세포주를 사용하여 생체내에서 또는 화학적 변형에 의해 시험관내에서 제어될 수 있다. 글리코실화가 약동학을 개선하고 면역원성을 감소시키며 천연 인간 단백질을 보다 밀접하게 유사할 수 있기 때문에 이러한 변형이 바람직하다.
조작된 면역 세포
본 명세서에서는 본 명세서에 규정된 바와 같은 T-세포 수용체를 인코딩하는 핵산 또는 발현 벡터를 포함하는 조작된 면역 세포가 제공되고, 조작된 면역 세포는 공유 항원 또는 이의 단편에 특이적으로 결합할 수 있고, 공유 항원 또는 이의 단편은 HLA 분자에 결합되고, 선택적으로 항원 제시 세포 또는 암 세포의 표면 상에 제시된다. 조작된 면역 세포는 T 세포 또는 NK 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 조작된 면역 세포는 T 림프구의 혼합물일 수 있다. 또 다른 실시양태에서 조작된 세포는 치료되는 환자에 적합한 동종이계 세포이다.
치료
본 명세서에서는 의학적 병태를 치료하는 방법이 개시되고, 본 방법은 대상체에서 의학적 병태를 치료하기 위해, 본 명세서에 규정된 바와 같은 방법에 따라 확인된 공유 항원을 표적화하는, 본 명세서에 규정된 바와 같은 가용화된 TCR 또는 T-세포 수용체 (TCR)를 발현하는 조작된 면역 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 공유 항원은 HLA 분자에 결합한다. 또한 의학적 병태의 치료에 사용하기 위한 가용화된 TCR 또는 조작된 면역 세포가 제공된다. 또한 의학적 병태의 치료를 위한 약제의 제조에서 본 명세서에 규정된 바와 같은 가용화된 TCR 또는 조작된 면역 세포의 용도가 제공된다.
본 명세서에서는 MARK3 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 암을 치료하는 방법이 개시되고, 본 방법은 본 방법은 대상체의 암을 치료하기 위해 본 명세서에 규정된 바와 같은 가용화된 TCR 또는 T-세포 수용체 (TCR)를 발현하는 조작된 면역 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서는 MARK3 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 암을 치료하는 방법이 개시되고, 본 방법은 MARK3 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 가용화된 TCR 또는 HLA 분자에 결합되는 MARK3 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 T-세포 수용체 (TCR)를 발현하는 조작된 면역 세포를 투여하는 단계를 포함하고, 가용화된 TCR 또는 TCR은 a) 서열번호 21에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 TCRα 사슬 가변 도메인, 및 b) 서열번호 29에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 TCRβ 사슬 가변 도메인을 포함한다.
일 실시양태에서, 공유 항원은 서열번호 1에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 펩타이드, 또는 서열번호 1에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 펩타이드를 인코딩하는 핵산이다.
본 명세서에서는 MARK3 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 암을 치료하는 방법이 개시되고, 본 방법은 MARK3 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 가용화된 TCR 또는 HLA 분자에 결합되는 MARK3 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 T-세포 수용체 (TCR)를 발현하는 조작된 면역 세포를 투여하는 단계를 포함하고, 가용화된 TCR 또는 TCR은 a) 서열번호 22에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 TCRα 사슬 도메인, 및 b) 서열번호 30에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 TCRβ 사슬 도메인을 포함한다.
본 명세서에서는 MARK3 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 암의 치료에 사용하기 위한 조작된 면역 세포가 제공되고, 면역 세포는 대상체의 암을 치료하기 위해 대상체에 본 명세서에 규정된 바와 같은 T-세포 수용체 (TCR)를 발현한다.
또한 MARK3 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 암의 치료에 사용하기 위한 조작된 면역 세포가 제공되고, 상기 면역 세포는 HLA 분자에 결합되는 MARK3 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 T-세포 수용체 (TCR)를 발현하고, TCR은 a) 서열번호 21에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 TCRα 사슬 가변 도메인, 및 b) 서열번호 29에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 TCRβ 사슬 가변 도메인을 포함한다.
본 명세서에서는 MARK3 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 암의 치료를 위한 약제의 제조에서 조작된 면역 세포의 용도가 제공되고, 면역 세포는 대상체의 암을 치료하기 위해 대상체에 본 명세서에 규정된 바와 같은 T-세포 수용체 (TCR)를 발현한다.
또한 의학적 병태의 치료를 위한 약제의 제조에서 조작된 면역 세포의 용도가 제공되고; 상기 면역 세포는 HLA 분자에 결합되는 MARK3 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 T-세포 수용체 (TCR)를 발현하고, TCR은 a) 서열번호 21에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 TCRα 사슬 가변 도메인, 및 b) 서열번호 29에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 TCRβ 사슬 가변 도메인을 포함한다.
본 명세서에서는 NBPF9 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 암을 치료하는 방법이 개시되고, 본 방법은 대상체의 암을 치료하기 위해 본 명세서에 규정된 바와 같은 가용화된 TCR 또는 본 명세서에 규정된 바와 같은 T-세포 수용체 (TCR)를 발현하는 조작된 면역 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서는 NBPF9 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 암의 치료에 사용하기 위한 본 명세서에 규정된 바와 같은 가용화된 TCR 또는 조작된 면역 세포가 제공된다.
본 명세서에서는 NBPF9 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 암의 치료를 위한 약제의 제조에서 본 명세서에 규정된 바와 같은 가용화된 TCR 또는 조작된 면역 세포의 용도가 제공된다.
본 명세서에서는 PARD3 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 암을 치료하는 방법이 개시되고, 본 방법은 본 방법은 대상체의 암을 치료하기 위해 본 명세서에 규정된 바와 같은 가용화된 TCR 또는 T-세포 수용체 (TCR)를 발현하는 조작된 면역 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서는 PARD3 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 암의 치료에 사용하기 위한 가용화된 TCR 또는 조작된 면역 세포가 제공된다.
본 명세서에서는 PARD3 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 암의 치료를 위한 약제의 제조에서 가용화된 TCR 또는 조작된 면역 세포의 용도가 제공된다.
본 명세서에서는 ZC3HAV1 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 암을 치료하는 방법이 개시되고, 본 방법은 대상체의 암을 치료하기 위해 본 명세서에 규정된 바와 같은 가용화된 TCR 또는 T-세포 수용체 (TCR)를 발현하는 조작된 면역 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서는 ZC3HAV1 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 암의 치료에 사용하기 위한 가용화된 TCR 또는 조작된 면역 세포가 제공된다.
본 명세서에서는 ZC3HAV1 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 암의 치료를 위한 약제의 제조에서 가용화된 TCR 또는 조작된 면역 세포의 용도가 제공된다.
본 명세서에서는 YAF2 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 암을 치료하는 방법이 개시되고, 본 방법은 본 방법은 대상체의 암을 치료하기 위해 본 명세서에 규정된 바와 같은 가용화된 TCR 또는 T-세포 수용체 (TCR)를 발현하는 조작된 면역 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서는 YAF2 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 암의 치료에 사용하기 위한 가용화된 TCR 또는 조작된 면역 세포가 제공된다.
본 명세서에서는 YAF2 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 암의 치료를 위한 약제의 제조에서 가용화된 TCR 또는 조작된 면역 세포의 용도가 제공된다.
본 명세서에서는 CAMKK1 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 암을 치료하는 방법이 개시되고, 본 방법은 본 방법은 대상체의 암을 치료하기 위해 본 명세서에 규정된 바와 같은 가용화된 TCR 또는 T-세포 수용체 (TCR)를 발현하는 조작된 면역 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서는 CAMKK1 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 암의 치료에 사용하기 위한 가용화된 TCR 또는 조작된 면역 세포가 제공된다.
본 명세서에서는 CAMKK1 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 암의 치료를 위한 약제의 제조에서 가용화된 TCR 또는 조작된 면역 세포의 용도가 제공된다.
본 명세서에서는 LRR1 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 암을 치료하는 방법이 개시되고, 본 방법은 본 방법은 대상체의 암을 치료하기 위해 본 명세서에 규정된 바와 같은 가용화된 TCR 또는 T-세포 수용체 (TCR)를 발현하는 조작된 면역 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서는 LRR1 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 암의 치료에 사용하기 위한 가용화된 TCR 또는 조작된 면역 세포가 제공된다.
본 명세서에서는 LRR1 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 암의 치료를 위한 약제의 제조에서 가용화된 TCR 또는 조작된 면역 세포의 용도가 제공된다.
본 명세서에서는 ZNF670 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 암을 치료하는 방법이 개시되고, 본 방법은 본 방법은 대상체의 암을 치료하기 위해 본 명세서에 규정된 바와 같은 가용화된 TCR 또는 T-세포 수용체 (TCR)를 발현하는 조작된 면역 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서는 ZNF670 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 암의 치료에 사용하기 위한 가용화된 TCR 또는 조작된 면역 세포가 제공된다.
본 명세서에서는 ZNF670 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 암의 치료를 위한 약제의 제조에서 가용화된 TCR 또는 조작된 면역 세포의 용도가 제공된다.
본 명세서에서는 GRINA 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 암을 치료하는 방법이 개시되고, 본 방법은 본 방법은 대상체의 암을 치료하기 위해 본 명세서에 규정된 바와 같은 가용화된 TCR 또는 T-세포 수용체 (TCR)를 발현하는 조작된 면역 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서는 GRINA 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 암의 치료에 사용하기 위한 가용화된 TCR 또는 조작된 면역 세포가 제공된다.
본 명세서에서는 GRINA 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 암의 치료를 위한 약제의 제조에서 가용화된 TCR 또는 조작된 면역 세포의 용도가 제공된다.
본 명세서에서는 MZF1 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 암을 치료하는 방법이 개시되고, 본 방법은 본 방법은 대상체의 암을 치료하기 위해 본 명세서에 규정된 바와 같은 가용화된 TCR 또는 T-세포 수용체 (TCR)를 발현하는 조작된 면역 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서는 MZF1 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 암의 치료에 사용하기 위한 가용화된 TCR 또는 조작된 면역 세포가 제공된다.
본 명세서에서는 MZF1 스플라이스 변이체의 발현과 관련된 암의 치료를 위한 약제의 제조에서 가용화된 TCR 또는 조작된 면역 세포의 용도가 제공된다.
약제학적 조성물
본 명세서에 규정된 바와 같은 항체, 가용화된 TCR, T-세포 수용체 (TCR)를 발현하는 조작된 면역 세포 (예를 들어, T 세포 또는 NK 세포) 또는 확장된 면역 세포 (예를 들어, T 세포 또는 NK 세포) 집단을 포함하는 약제학적 조성물이 본 명세서에 제공된다. 본 명세서에 규정된 바와 같은 항체, 가용화된 TCR, 조작된 면역 세포 또는 확장된 면역 세포 집단은 바람직하게는 이러한 약제학적 조성물에서 허용 가능한 담체 또는 담체 물질과 혼합된 투여량으로 사용되어 질병이 치료되거나 적어도 완화될 수 있다. 이러한 조성물은 (활성 성분 및 담체에) 충전 물질, 염, 완충액, 안정화제, 가용화제 및 최신 기술 상태에 공지된 다른 물질을 포함한다. 본 약제학적 조성물은 예를 들어 주사 가능한 조성물일 수 있다.
"약제학적으로 허용 가능한"이라는 용어는 활성 성분의 생물학적 활성의 유효성을 방해하지 않는 무독성 물질을 규정한다. 담체의 선택은 적용에 따라 다르다.
본 약제학적 조성물은 활성 성분의 활성을 향상시키거나 치료를 보충하는 추가 성분을 포함할 수 있다. 이러한 추가 성분 및/또는 인자는 상승 효과를 달성하거나 불리하거나 부적절한 효과를 최소화하기 위해 약제학적 조성물의 일부를 이룰 수 있다.
본 발명의 활성 성분의 제형화 또는 제조 및 적용/약제를 위한 기술은 문헌["Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA, latest edition]에 공개되어 있다. 적절한 적용은 비경구 적용, 예를 들어 근육내, 피하, 골수내 주사뿐만 아니라, 척수강내, 직접 뇌실내, 정맥내, 결절내, 복강내 또는 종양내 주사이다. 정맥 주사는 환자가 선호하는 치료이다.
일부 실시양태에서, 본 약제학적 조성물은 주입 또는 주사이다.　
주사 가능한 조성물은 적어도 하나의 활성 성분, 예를 들어, TCR을 발현하는 확장된 면역 세포 집단 (예를 들어, 치료될 환자에 대한 자기유래 또는 동종)을 포함하는 약제학적으로 허용 가능한 유체 조성물이다. 활성 성분은 일반적으로 생리학적으로 허용 가능한 담체에 용해되거나 현탁되며, 조성물은 유화제, 보존제 및 pH 완충제 등과 같은 소량의 하나 이상의 무독성 보조 물질을 추가로 포함할 수 있다. 본 개시내용의 융합 단백질과 함께 사용하기에 유용한 이러한 주사가능한 조성물은 통상적이고; 적절한 제형은 당업자에게 잘 알려져 있다.
통상적으로, 본 약제학적 조성물은 적어도 하나의 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다.
면역요법을 위한 항체
공유 항원 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 생성하는 방법이 본 명세서에서 제공된다. 공유 항원 또는 이의 단편은 HLA 분자에 결합될 수 있고 선택적으로 항원-제시 세포 또는 암 세포의 표면 상에 제시될 수 있다.
"항체"는 표적 항원 (공유 항원)에 대한 결합 친화도를 갖는 분자를 의미한다. 이 용어는 항원-결합 활성을 나타내는 면역글로불린, 면역글로불린 단편 및 비-면역글로불린 유래 단백질 프레임워크로 확장되는 것으로 이해될 것이다. 본 발명의 실시에 유용한 대표적인 항원 결합 분자는 다클론 및 단일클론 항체뿐만 아니라, 이의 단편 (예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단일 사슬 (scFv) 및 도메인 항체 (예를 들어, 상어 및 낙타류 항체 포함), 및 항체를 포함하는 융합 단백질, 및 항원 결합/인식 부위를 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 입체배열을 포함한다. 항체는 IgG, IgA, 또는 IgM (또는 이의 하위클래스)과 같은 임의의 클래스의 항체를 포함하고, 항체는 임의의 특정 클래스일 필요는 없다. 중쇄의 불변 영역의 항체 아미노산 서열에 따라 면역글로불린은 다른 클래스로 분류될 수 있다. 면역글로불린에는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 5가지 주요 클래스가 있으며, 이 중 일부는 하위 클래스 (이소타입(isotype)), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 분류될 수 있다. 면역글로불린의 다른 클래스에 상응하는 중쇄 불변 영역을 각각 α, δ, ε, γ 및 μ라고 한다. 상이한 클래스의 면역글로불린의 하위단위 구조 및 3차원 입체배열은 잘 알려져 있다. 항원-결합 분자는 또한 이량체 항체뿐만 아니라, 다가 형태의 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 분자는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 클래스 또는 하위클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 키메라 항체이고, 나머지 사슬 (들)은 적절한 생물학적 활성을 나타내는 한, 다른 종에서 유래하거나 다른 항체 클래스 또는 하위클래스에 속하는 항체뿐만 아니라, 이러한 항체의 단편의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이다 (예를 들어, 미국 특허 제 4,816,567호 및 문헌[Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855] 참조). 또한 비인간 (예를 들어, 설치류, 바람직하게는 마우스) 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄 가변 사슬로부터 인간 가변 도메인으로 상보성 결정 영역 (CDR)을 전달함으로써 생성되는 인간화 항체가 고려된다. 인간 항체의 통상적인 잔기는 비인간 대응물의 프레임워크 영역에서 치환된다. 인간화 항체로부터 유래된 항체 성분의 사용은 비인간 불변 영역의 면역원성과 관련된 잠재적인 문제를 제거한다. 비인간, 특히 뮤린 면역글로불린 가변 도메인을 클로닝하기 위한 일반적인 기술은 예를 들어 문헌[Orlandi et al. (1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3833). Techniques for producing humanized monoclonal antibodies are described, for example, by Jones et al. (1986, Nature 321:522), Carter et al. (1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285), Sandhu (1992, Crit. Rev. Biotech. 12: 437), Singer et al. (1993, J. Immun. 150: 2844), Sudhir (ed., Antibody Engineering Protocols, Humana Press, Inc. 1995), Kelley ("Engineering Therapeutic Antibodies," in Protein Engineering: Principles and Practice Cleland et al. (eds.), pages 399-434(John Wiley & Sons, Inc. 1996), and by Queen et al.] 및 미국 특허 제 5,693,762호 (1997)에 기재되어 있다. 인간화 항체는 항체의 항원 결합 영역이 마카크 원숭이를 대상 항원으로 면역화함으로써 생성된 항체로부터 유래된 "영장류화된" 항체를 포함한다. 항원 결합 분자로서, 인간화 항체가 또한 고려된다.
일부 실시양태에서, 항체를 생성하는 방법이 개시되고, 본 방법은 1) 본 명세서에 규정된 바와 같은 방법에 따라 확인된 공유 항원 또는 이의 단편으로 동물을 면역화하는 단계; 2) 공유 항원에 특이적으로 결합하는 동물로부터의 B 세포를 확인 및/또는 단리하는 단계 또는 이의 단편; 및 3) 상기 B 세포에 의해 발현되는 항체를 생성하는 단계를 포함한다. 공유 항원 또는 이의 단편은 HLA 분자에 결합될 수 있고/거나, 항원 제시 세포 또는 암 세포의 표면 상에 제시될 수 있다. 본 명세서에서는 또한 본 명세서에 규정된 바와 같은 방법에 따라 획득된 항체가 개시된다.
일부 실시양태에서, 항체를 생성하는 방법이 개시되고, 본 방법은 1) MARK3 스플라이스 변이체 펩타이드로 동물을 면역화하는 단계; 2) MARK3 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 동물로부터의 B 세포를 확인 및/또는 단리하는 단계; 및 3) 상기 B 세포에 의해 발현되는 항체를 생성하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체를 생성하는 방법이 개시되고, 본 방법은 1) NBPF9 스플라이스 변이체 펩타이드로 동물을 면역화하는 단계; 2) NBPF9 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 동물로부터의 B 세포를 확인 및/또는 단리하는 단계; 및 3) 상기 B 세포에 의해 발현되는 항체를 생성하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체를 생성하는 방법이 개시되고, 본 방법은 1) PARD3 스플라이스 변이체 펩타이드로 동물을 면역화하는 단계; 2) PARD3 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 동물로부터의 B 세포를 확인 및/또는 단리하는 단계; 및 3) 상기 B 세포에 의해 발현되는 항체를 생성하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체를 생성하는 방법이 개시되고, 본 방법은 1) ZC3HAV1 스플라이스 변이체 펩타이드로 동물을 면역화하는 단계; 2) ZC3HAV1 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 동물로부터의 B 세포를 확인 및/또는 단리하는 단계; 및 3) 상기 B 세포에 의해 발현되는 항체를 생성하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체를 생성하는 방법이 개시되고, 본 방법은 1) YAF2 스플라이스 변이체 펩타이드로 동물을 면역화하는 단계; 2) YAF2 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 동물로부터의 B 세포를 확인 및/또는 단리하는 단계; 및 3) 상기 B 세포에 의해 발현되는 항체를 생성하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체를 생성하는 방법이 개시되고, 본 방법은 1) CAMKK1 스플라이스 변이체 펩타이드로 동물을 면역화하는 단계; 2) CAMKK1 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 동물로부터의 B 세포를 확인 및/또는 단리하는 단계; 및 3) 상기 B 세포에 의해 발현되는 항체를 생성하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체를 생성하는 방법이 개시되고, 본 방법은 1) LRR1 스플라이스 변이체 펩타이드로 동물을 면역화하는 단계; 2) LRR1 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 동물로부터의 B 세포를 확인 및/또는 단리하는 단계; 및 3) 상기 B 세포에 의해 발현되는 항체를 생성하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체를 생성하는 방법이 개시되고, 본 방법은 1) ZNF670 스플라이스 변이체 펩타이드로 동물을 면역화하는 단계; 2) ZNF670 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 동물로부터의 B 세포를 확인 및/또는 단리하는 단계; 및 3) 상기 B 세포에 의해 발현되는 항체를 생성하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체를 생성하는 방법이 개시되고, 본 방법은 1) GRINA 스플라이스 변이체 펩타이드로 동물을 면역화하는 단계; 2) GRINA 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 동물로부터의 B 세포를 확인 및/또는 단리하는 단계; 및 3) 상기 B 세포에 의해 발현되는 항체를 생성하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체를 생성하는 방법이 개시되고, 본 방법은 1) MZF1 스플라이스 변이체 펩타이드로 동물을 면역화하는 단계; 2) MZF1 스플라이스 변이체에 특이적으로 결합하는 동물로부터의 B 세포를 확인 및/또는 단리하는 단계; 및 3) 상기 B 세포에 의해 발현되는 항체를 생성하는 단계를 포함한다.
항체를 생성하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 이러한 방법 중 하나는 B 세포의 집단을 스크리닝하여, 상기 공유 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 B 세포가 풍부한 B 세포 라이브러리를 생성하는 단계; B 세포 라이브러리 내의 단일 B 세포 또는 복수의 B 세포에서 발현된 mRNA로부터 획득된 cDNA를 증폭하여 Vh 및 V1 도메인을 포함하는 면역글로불린 라이브러리를 제조하는 단계; 면역글로불린 라이브러리를 발현 벡터로 클로닝하여 Vh 및 V1 도메인을 발현할 수 있는 발현 벡터의 라이브러리를 형성함으로써 Vh 및 V1 도메인이 자연적으로 쌍을 이루는 단계; 발현 벡터의 라이브러리를 사용하여 발현 시스템에서 Vh 및 V1 도메인을 발현시켜 항체 라이브러리를 형성하는 단계로서, 항체는 자연적으로 쌍을 이루는 Vh 및 V1 도메인을 포함하는 단계; 및 HLA-결합 펩타이드에 대한 결합에 대해 항체 라이브러리를 스크리닝하는 단계를 포함한다.
대안적으로, HLA 분자에 결합되는 공유 항원 또는 이의 단편에 결합하는 항체 서열은, 표면에서 항체를 발현하는 효모 또는 박테리오파지의 라이브러리를 스크리닝함으로써 확인될 수 있다. 이는, 효모 또는 박테리오파지의 개별 클론에 의해 발현되는, 어떠한 항체 서열이 HLA 분자에 결합되는 공유 항원 또는 이의 단편에 결합할 수 있는지 확인하는 단계를 포함한다. 항체 서열의 확인은 스트렙타비딘 코팅된 자기 비드에 의해 포획된 특정 클론 및 공유 항원이 부가된 비오틴화된 HLA 분자와 함께 박테리오파지 라이브러리를 인큐베이션하여 수행할 수 있다. 이러한 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 이는 또한 HLA 분자에 결합되는 공유 항원 또는 이의 단편에 결합할 수 있는 더 높은 특이성 및/또는 친화도를 갖는 항체를 획득하기 위해 항체 서열에 돌연변이를 유발하는 단계를 포함할 수 있다. HLA 분자에 결합되는 공유 항원 또는 이의 단편에 결합할 수 있는 가장 이상적인 특성을 갖는 항체 서열을 선택하기 위해 다회의 돌연변이유발 및/또는 항체 서열 확인이 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 공유 항원 또는 이의 단편에 결합하는 항체를 확인하는 방법이 제공되며, 본 방법은 1) 공유 항원 또는 이의 단편을 항체 파지 디스플레이 또는 효모 디스플레이 라이브러리와 접촉시키는 단계로서, 공유 항원 또는 이의 단편은 HLA 분자에 결합되는 단계, 2) 상기 공유 항원 또는 이의 단편에 결합되는 파지 분자 또는 효모 세포를 선택하는 단계; 및 3) 파지 분자 또는 효모 세포에 제시된 항체의 DNA 서열을 획득하는 단계를 포함한다. 본 방법은 당해 분야에 널리 공지된 친화도 성숙화 방법에 의해 공유 항원 또는 이의 단편에 대한 항체의 결합 친화도를 개선하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
항체는 숙주 세포 (예를 들어, 포유류 중국 햄스터 난소 세포)에서 단일클론 항체의 가변 영역을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 발현함으로써 재조합적으로 생성될 수 있다. 발현 벡터의 도움으로, 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산은 생성에 적합한 숙주 세포에서 형질감염되어 발현될 수 있다. 따라서, 대상체에서 의학적 병태를 치료하는 항체 기반 방법은 다클론 또는 단일클론 항체의 사용을 포함할 수 있다.
일 예에서, 항체 또는 이의 항체 단편을 발현하기 위해, 표준 분자 생물학 기술에 의해 획득된 일부 또는 전장 경쇄 및 중쇄를 인코딩하는 DNA를 발현 벡터에 삽입하여 유전자가 전사 및 번역 제어 서열에 작동가능하게 연결되도록 한다. 이와 관련하여, "작동가능하게 연결된"이라는 용어는 벡터 내의 전사 및 번역 제어 서열이 항체 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 의도된 기능을 제공하도록 항체 유전자가 벡터에 결찰됨을 의미하는 것으로 의도된다. 발현 벡터 및 발현 조절 서열은 사용된 발현 숙주 세포와 상호 적합한 것으로 선택된다. 항체 경쇄 유전자 및 항체 중쇄 유전자는 별도의 벡터에 삽입될 수 있거나, 더 일반적으로 두 유전자 모두 동일한 발현 벡터에 삽입될 수 있다. 항체 유전자는 표준 방법 (예를 들어, 항체 유전자 단편 및 벡터 상의 상보적 제한 부위의 결찰, 또는 제한 부위가 존재하지 않는 경우 평활 말단 결찰)에 의해 발현 벡터에 삽입된다. 본 명세서에 기재된 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 사용하여 Vh 절편은 벡터 내의 Ch 절편 (들)에 작동 가능하게 연결되고 V1 절편은 벡터 내의 Cl 절편에 작동 가능하게 연결되도록 적절한 이소타입의 중쇄 불변 및 경쇄 불변 영역을 이미 인코딩하는 발현 벡터에 삽입함으로써, 임의의 항체 이소타입의 전장 항체 유전자를 생성할 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 재조합 발현 벡터는 숙주 세포로부터 항체 사슬의 분비를 촉진하는 신호 펩타이드를 인코딩할 수 있다. 항체 사슬 유전자는 신호 펩타이드가 항체 사슬 유전자의 아미노 말단에 프레임 내 연결되도록 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 신호 펩타이드는 면역글로불린 신호 펩타이드 또는 이종 신호 펩타이드 (즉, 비-면역글로불린 단백질로부터의 신호 펩타이드)일 수 있다.
항체는 치료 효능을 향상시키는 추가 기능을 갖도록 추가로 변형될 수 있다. 예를 들어, CD3 T 세포의 집단을 가능하게 하는 항-CD3 단일 사슬 가변 단편에 대한 항체의 융합.
일부 실시양태에서, HLA-결합 펩타이드 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체는 의학적 병태의 치료를 위한 면역 세포에서 발현될 수 있다. 항체는 세포막에 내포되도록 조작되었으며 면역 세포를 활성화할 수 있는 도메인을 포함하는 세포질 꼬리를 가지고 있다. 예를 들어, 세포질 꼬리는 예를 들어 문헌[Zhang et al Sci Rep 2014]에 기재된 바와 같이 CD28 및 4-1BB와 같은 공자극 단백질의 세포내 신호전달 도메인 또는 CD3 제타 도메인의 신호전달 도메인으로 구성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조작된 면역 세포는 T 세포 또는 NK 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 조작된 면역 세포는 T 림프구의 혼합물일 수 있다. 또 다른 실시양태에서 조작된 세포는 치료되는 환자에 적합한 동종이계 세포일 수 있다.
본 명세서에서는 본 명세서에 규정된 바와 같은 방법에 따라 확인된 공유 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 개시된다.
일 실시양태에서, 공유 항원은 서열번호 1에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 펩타이드이거나, 서열번호 1에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 펩타이드를 인코딩하는 핵산이다.
또한 본 명세서에서는 본 명세서에 개시된 바와 같은 MARK3 스플라이스 변이체 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체가 개시된다.
일 실시양태에서, 공유 항원은 서열번호 31에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 펩타이드이거나, 서열번호 31에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 펩타이드를 인코딩하는 핵산이다.
또한 본 명세서에서는 본 명세서에 개시된 바와 같은 NBPF9 스플라이스 변이체 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체가 개시된다.
일 실시양태에서, 공유 항원은 서열번호 32에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 펩타이드이거나, 서열번호 32에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 펩타이드를 인코딩하는 핵산이다.
또한 본 명세서에서는 본 명세서에 개시된 바와 같은 PARD3 스플라이스 변이체 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체가 개시된다.
일 실시양태에서, 공유 항원은 서열번호 33에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 펩타이드이거나, 서열번호 33에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 펩타이드를 인코딩하는 핵산이다.
또한 본 명세서에서는 본 명세서에 개시된 바와 같은 ZC3HAV1 스플라이스 변이체 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체가 개시된다.
일 실시양태에서, 공유 항원은 서열번호 34에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 펩타이드이거나, 서열번호 34에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 펩타이드를 인코딩하는 핵산이다.
또한 본 명세서에서는 본 명세서에 개시된 바와 같은 YAF2 스플라이스 변이체 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체가 개시된다.
일 실시양태에서, 공유 항원은 서열번호 35에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 펩타이드이거나, 서열번호 35에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 펩타이드를 인코딩하는 핵산이다.
또한 본 명세서에서는 본 명세서에 개시된 바와 같은 CAMKK1 스플라이스 변이체 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체가 개시된다.
일 실시양태에서, 공유 항원은 서열번호 36 또는 서열번호 51에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 펩타이드이거나, 서열번호 36 또는 서열번호 51에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 펩타이드를 인코딩하는 핵산이다.
또한 본 명세서에서는 본 명세서에 개시된 바와 같은 LRR1 스플라이스 변이체 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체가 개시된다.
일 실시양태에서, 공유 항원은 서열번호 37에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 펩타이드이거나, 서열번호 37에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 펩타이드를 인코딩하는 핵산이다.
또한 본 명세서에서는 본 명세서에 개시된 바와 같은 ZNF670 스플라이스 변이체 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체가 개시된다.
일 실시양태에서, 공유 항원은 서열번호 38에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 펩타이드이거나, 서열번호 38에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 펩타이드를 인코딩하는 핵산이다.
또한 본 명세서에서는 본 명세서에 개시된 바와 같은 GRINA 스플라이스 변이체 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체가 개시된다.
일 실시양태에서, 공유 항원은 서열번호 52에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 펩타이드이거나, 서열번호 52에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 펩타이드를 인코딩하는 핵산이다.
또한 본 명세서에서는 본 명세서에 개시된 바와 같은 MZF1 스플라이스 변이체 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체가 개시된다.
본 명세서에서는 본 명세서에 규정된 바와 같은 방법에 따라 확인된 공유 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 개시되고, 상기 공유 항원은 HLA 분자에 결합되고, 선택적으로 항원 제시 세포 또는 암 세포의 표면 상에 제시된다.
또한 본 명세서에서는 본 명세서에 개시된 바와 같은 MARK3 스플라이스 변이체 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체가 개시되고, MARK3 스플라이스 변이체 펩타이드는 HLA 분자에 결합되고, 선택적으로 항원 제시 세포 또는 암 세포의 표면 상에 제시된다.
또한 본 명세서에서는 본 명세서에 개시된 바와 같은 NBPF9 스플라이스 변이체 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체가 개시되고, NBPF9 스플라이스 변이체 펩타이드는 HLA 분자에 결합되고, 선택적으로 항원 제시 세포 또는 암 세포의 표면 상에 제시된다.
또한 본 명세서에서는 본 명세서에 개시된 바와 같은 PARD3 스플라이스 변이체 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체가 개시되고, PARD3 스플라이스 변이체 펩타이드는 HLA 분자에 결합되고, 선택적으로 항원 제시 세포 또는 암 세포의 표면 상에 제시된다.
또한 본 명세서에서는 본 명세서에 개시된 바와 같은 ZC3HAV1 스플라이스 변이체 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체가 개시되고, ZC3HAV1 스플라이스 변이체 펩타이드는 HLA 분자에 결합되고, 선택적으로 항원 제시 세포 또는 암 세포의 표면 상에 제시된다.
또한 본 명세서에서는 본 명세서에 개시된 바와 같은 YAF2 스플라이스 변이체 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체가 개시되고, YAF2 스플라이스 변이체 펩타이드는 HLA 분자에 결합되고, 선택적으로 항원 제시 세포 또는 암 세포의 표면 상에 제시된다.
또한 본 명세서에서는 본 명세서에 개시된 바와 같은 CAMKK1 스플라이스 변이체 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체가 개시되고, CAMKK1 스플라이스 변이체 펩타이드는 HLA 분자에 결합되고, 선택적으로 항원 제시 세포 또는 암 세포의 표면 상에 제시된다.
또한 본 명세서에서는 본 명세서에 개시된 바와 같은 LRR1 스플라이스 변이체 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체가 개시되고, LRR1 스플라이스 변이체 펩타이드는 HLA 분자에 결합되고, 선택적으로 항원 제시 세포 또는 암 세포의 표면 상에 제시된다.
또한 본 명세서에서는 본 명세서에 개시된 바와 같은 ZNF670 스플라이스 변이체 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체가 개시되고, ZNF670 스플라이스 변이체 펩타이드는 HLA 분자에 결합되고, 선택적으로 항원 제시 세포 또는 암 세포의 표면 상에 제시된다.
또한 본 명세서에서는 본 명세서에 개시된 바와 같은 GRINA 스플라이스 변이체 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체가 개시되고, GRINA 스플라이스 변이체 펩타이드는 HLA 분자에 결합되고, 선택적으로 항원 제시 세포 또는 암 세포의 표면 상에 제시된다.
또한 본 명세서에서는 본 명세서에 개시된 바와 같은 MZF1 스플라이스 변이체 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체가 개시되고, MZF1 스플라이스 변이체 펩타이드는 HLA 분자에 결합되고, 선택적으로 항원 제시 세포 또는 암 세포의 표면 상에 제시된다.
또한, 본 명세서에 규정된 바와 같은 항체 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 본 명세서에 개시된다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 유기체에 심각한 자극을 일으키지 않고 투여된 약제학적 조성물의 생물학적 활성 및 특성을 제거하지 않는 담체 또는 희석제일 수 있다. 이 어구 하에 애주번트가 포함된다. 약제학적으로 허용 가능한 담체에 포함된 성분 중 하나는 예를 들어 유기 및 수성 매질 모두에서 광범위한 용해도를 갖는 생체적합성 중합체인 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)일 수 있다.
또한 본 명세서에서는 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 대상체에서 암을 치료하는 조건 하에 충분한 시간 동안 대상체에게 본 명세서에 규정된 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
본 명세서에서는 대상체의 암의 치료에 사용하기 위한 본 명세서에 규정된 바와 같은 약제학적 조성물이 제공된다.
본 명세서에서는 대상체의 암의 치료를 위한 약제의 제조에서 본 명세서에 규정된 바와 같은 약제학적 조성물의 용도가 제공된다.
면역조절 조성물
본 명세서에서는 본 명세서에 규정된 바와 같은 방법에 따라 확인된 하나 이상의 공유 항원 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 면역조절 조성물이 개시된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "면역조절 조성물"은 동물의 면역계를 조절할 수 있는 조성물을 지칭할 수 있다. "면역조절 조성물"은 당업자에게 친숙한 단백질/핵산 서열의 변형 및/또는 접합 기술을 통해 추가로 향상되는 면역자극 특성을 가질 수 있다. 면역조절 조성물은 T 림프구의 확장을 자극하고/거나 하나 이상의 공유 항원에 대한 항체를 생성할 수 있는 하나 이상의 공유 항원을 포함할 수 있으며, 상기 공유 항원은 HLA 분자에 결합한다.
또한 본 명세서에서는 MARK3 스플라이스 변이체 펩타이드 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 면역조절 조성물이 개시된다.
일 실시양태에서, MARK3 스플라이스 변이체는 서열번호 1에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 펩타이드이거나, 서열번호 1에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 펩타이드를 인코딩하는 핵산이다.
또한 본 명세서에서는 NBPF9 스플라이스 변이체 펩타이드 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 면역조절 조성물이 개시된다.
일 실시양태에서, NBPF9 스플라이스 변이체는 서열번호 31에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 펩타이드이거나, 서열번호 31에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 펩타이드를 인코딩하는 핵산이다.
또한 본 명세서에서는 PARD3 스플라이스 변이체 펩타이드 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 면역조절 조성물이 개시된다.
일 실시양태에서, PARD3 스플라이스 변이체는 서열번호 32에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 펩타이드이거나, 서열번호 32에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 펩타이드를 인코딩하는 핵산이다.
또한 본 명세서에서는 ZC3HAV1 스플라이스 변이체 펩타이드 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 면역조절 조성물이 개시된다.
일 실시양태에서, ZC3HAV1 스플라이스 변이체는 서열번호 33에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 펩타이드이거나, 서열번호 33에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 펩타이드를 인코딩하는 핵산이다.
또한 본 명세서에서는 YAF2 스플라이스 변이체 펩타이드 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 면역조절 조성물이 개시된다.
일 실시양태에서, YAF2 스플라이스 변이체는 서열번호 34에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 펩타이드이거나, 서열번호 34에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 펩타이드를 인코딩하는 핵산이다.
또한 본 명세서에서는 CAMKK1 스플라이스 변이체 펩타이드 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 면역조절 조성물이 개시된다.
일 실시양태에서, CAMKK1 스플라이스 변이체는 서열번호 35에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 펩타이드이거나, 서열번호 35에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 펩타이드를 인코딩하는 핵산이다.
또한 본 명세서에서는 LRR1 스플라이스 변이체 펩타이드 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 면역조절 조성물이 개시된다.
일 실시양태에서, LRR1 스플라이스 변이체는 서열번호 36 또는 서열번호 51에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 펩타이드이거나, 서열번호 36 또는 서열번호 51에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 펩타이드를 인코딩하는 핵산이다.
또한 본 명세서에서는 ZNF670 스플라이스 변이체 펩타이드 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 면역조절 조성물이 개시된다.
일 실시양태에서, ZNF670 스플라이스 변이체는 서열번호 37에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 펩타이드이거나, 서열번호 37에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 펩타이드를 인코딩하는 핵산이다.
또한 본 명세서에서는 GRINA 스플라이스 변이체 펩타이드 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 면역조절 조성물이 개시된다.
일 실시양태에서, GRINA 스플라이스 변이체는 서열번호 38에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 펩타이드이거나, 서열번호 38에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 펩타이드를 인코딩하는 핵산이다.
또한 본 명세서에서는 MZF1 스플라이스 변이체 펩타이드 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 면역조절 조성물이 개시된다.
일 실시양태에서, MZF1 스플라이스 변이체는 서열번호 52에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 펩타이드이거나, 서열번호 52에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 펩타이드를 인코딩하는 핵산이다.
본 명세서에서는 대상체에서 면역 반응을 자극하는 방법이 개시되고, 본 방법은 본 명세서에 규정된 바와 같은 면역조절 조성물의 유효량을 대상체에서 면역 반응을 자극하는 조건 하에 충분한 시간 동안 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 명세서에 규정된 면역조절 조성물은 애주번트를 포함한다. 애주번트는 백신에 대한 대상체의 면역학적 반응을 증가시키는 물질이다. 적합한 애주번트는 다음에 제한되는 것은 아니나, 수산화알루미늄 (명반), 면역자극 복합체 (ISCOMS), 비이온성 블록 중합체 또는 공중합체, 사이토카인 (예를 들어, IL-1, IL-2, IL-7, IFN-α, IFN-β, IFN-γ 등), 사포닌, 모노포스포릴 지질 A (MLA), 무라밀 디펩타이드 (MDP) 등을 포함한다. 다른 적합한 애주번트는 예를 들어 알루미늄 칼륨 술페이트, 에세리키아 콜라이 (Escherichia coli)로부터 단리된 열에 불안정하거나 열에 안정한 장독소, 콜레라 독소 또는 이의 B 하위단위, 디프테리아 독소, 파상풍 독소, 백일해 독소, 프로인트 불완전 또는 완전 애주번트 등을 포함한다. 디프테리아 독소, 파상풍 독소 및 백일해 독소와 같은 독소 기반 애주번트는 예를 들어 포름알데히드 처리에 의해 사용 전에 불활성화될 수 있다.
일부 실시양태에서, 면역조절 조성물은 DNA 또는 RNA 백신을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 명세서에 규정된 바와 같은 면역조절 조성물은 항원-제시 세포 및 하나 이상의 공유 항원을 포함한다. 예를 들어, 의학적 병태를 가진 대상체로부터 수지상 세포가 단리될 수 있고 하나 이상의 공유 항원이 생체외 수지상 세포의 표면에 제시될 수 있다. 하나 이상의 공유 항원이 부가된 이러한 수지상 세포는 면역 반응을 유도하기 위해 의학적 병태를 가진 대상체에게 투여될 수 있다.
대상체에서 면역 반응을 자극하는데 사용하기 위한 본 명세서에 규정된 바와 같은 면역조절 조성물이 본 명세서에 제공된다.
본 명세서에서는 대상체에서 면역 반응을 자극하기 위한 약제의 제조에서 본 명세서에 규정된 바와 같은 면역조절 조성물의 용도를 제공한다.
본 명세서에서는 대상체의 암을 치료 또는 예방하는 방법이 제공되고, 본 방법은 대상체의 암을 치료 또는 예방하기 위해 본 명세서에 규정된 바와 같은 면역조절 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
대상체에서 암을 예방 또는 치료하는데 사용하기 위한 본 명세서에 규정된 바와 같은 면역조절 조성물이 본 명세서에 제공된다.
대상체에서 암을 예방 또는 치료하기 위한 약제의 제조에서 본 명세서에 규정된 바와 같은 면역조절 조성물의 용도가 본 명세서에 제공된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "및/또는"은 대안 (또는)으로 해석될 때 조합의 부재뿐만 아니라, 관련된 나열 항목 중 하나 이상의 모든 가능한 조합을 지칭하고 포함한다.
본 출원에서 사용되는 바와 같이, 단수형 ("a", "an" 및 "the")는 문맥상 달리 명시하지 않는 한 복수 대상을 포함한다. 예를 들어, 용어 "제제"는 이의 혼합물을 포함한 복수의 제제를 포함한다.
문맥상 달리 요구하지 않는 한, 본 명세서 및 이어지는 진술 전반에 걸쳐, "~를 포함하다"라는 어구 및 "~를 포함한다" 및 "~를 포함하는"과 같은 변용례는 언급된 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹을 포함하지만 임의의 다른 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹을 배제하지 않는 것으로 이해될 것이다.
본 명세서에서 임의의 이전 간행물 (또는 그로부터 유래된 정보), 또는 공지된 임의의 문헌에 대한 언급은 이러한 이전 간행물 (또는 그로부터 유래된 정보), 또는 공지된 문헌이 본 명세서와 관련된 연구 분야에서 일반적인 일반 지식의 일부를 형성한다는 승인 또는 인정 또는 임의의 형태의 제안이 아니며, 이와 같이 적용되어서는 안된다.
당업자는 본 명세서에 기재된 발명이 구체적으로 기재된 것 이외의 변형 및 수정이 가능하다는 것을 이해할 것이다. 본 발명은 사상 및 범위 내에 속하는 모든 이러한 변형 및 수정을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명은 또한 개별적으로 또는 집단적으로 본 명세서에서 언급되거나 표시된 모든 단계, 특징, 조성물 및 화합물, 및 상기 단계 또는 특징 중 임의의 2개 이상의 임의의 모든 조합을 포함한다.
실시예
실시예 1
위암에서 공유 대체 스플라이싱된 변이체의 확인
19명의 환자 (발견 코호트)로부터 위 선암종 종양 샘플 및 임상 정보를 싱가포르 보건 서비스 및 국립 대학 병원 시스템 조직 저장소에서 입수하였다. 종양에 인접한 비악성 점막에서 대응하는 정상 샘플을 채취하였다. 이 19개의 GC 환자 샘플에 대해 MISO를 사용한 심층 RNA 시퀀싱 (200M 판독결과) 및 mRNA 스플라이싱 분석을 수행하였다. MISO 분석을 수행하여 종양과 정상 조직 사이의 구별적 스플라이싱 현상에 대한 RNA-Seq 데이터를 분석하였다. 선택 기준 (상위 0.5% 스플라이싱 현상, 스플라이싱의 적어도 20% 변화 (△PSI), 베이즈 인자 20 초과, 적어도 3명의 환자에서 발생)을 GC 환자 하위 집단에서 공유될 수 있는 후보 항원 영역의 확인으로 이어질 수 있는 361개의 종양 관련 대체 스플라이싱 현상 목록을 생성한 데이터에 적용하였다 (도 10). 위암에서 관찰된 스플라이싱 변이의 요약은 도 11(a)에 나와 있다.
개별 참조 및 종양 샘플의 PSI 값을 비교하고 참조 샘플과 상당히 다른 다수의 종양 샘플이 있는 스플라이스 변이체 (도 3의 이상치)를 확인함으로써 공유 스플라이스 변이체를 확인한다. 이는 인간 집단에서 관찰되지 않는 스플라이스 변이체 항원이 확인되고 따라서 진정으로 신규한 항원이라는 잠재적인 이점을 제공한다. 위암 환자에서 공유 대체 스플라이싱된 변이체 확인을 위한 분석에서는 19명의 환자 중 적어도 3명의 환자에게 존재하는 스플라이스 변이체를 선택하였다. 이러한 스플라이스 변이체의 선택에 대한 추가 기준은 이러한 이상치 샘플의 중앙값이 참조 샘플과 비교하여 PSI 값에서 적어도 20% 차이를 보였다는 것이다.
실시예 2
위암에서 대체 스플라이싱으로부터 유래된 공유 HLA-A11 결합 펩타이드의 예측
그 후 361개의 종양 관련 대체 스플라이싱 현상의 목록은 단백질 서열 (즉, 코딩 영역만)의 차이를 초래하는 스플라이싱 현상을 선택함으로써 291개의 종양 관련 폴리펩타이드의 목록으로 감소되었다. 그런 다음 이 291개의 단백질 영역을 사용하여 HLA-A11에 결합할 수 있는 8 내지 11개 아미노산 길이의 펩타이드 (총 39,876개의 펩타이드)를 예측하였다. HLA-A11 대립인자는 GC 환자 코호트의 약 40%에 존재하였다. NetMHCpan3을 사용하여 HLA 결합 펩타이드를 예측하였으며 이는 HLA A11에 대해 높은 친화도를 가진 153개의 펩타이드를 반환시켰다 (순위 0.5% 이하). 이 목록은 유사한 펩타이드를 제거하여 77개의 펩타이드로 추가로 감소되었다 (도 10). 이 77개의 펩타이드는 65개의 유전자에 상응한다.
실시예 3
위암에서 MARK3 스플라이스 변이체 항원의 검증 및 공유 MARK3 스플라이스 변이체-특이적 CD8+ T 세포의 확인
GC 환자가 실시예 2에서 확인된 77개의 펩타이드 중 임의의 것을 표적화하는 CD8+ T 세포를 갖고 있는지 결정하기 위해, 말초 혈액의 MHC 사량체 염색을 사용하여 GC 환자의 새로운 코호트 (검증 코호트)에 대해 CyTOF 스크리닝을 수행하였다. CyTOF 스크리닝을 문헌[Leong and Newell (2015)]에 기재된 대로 수행하였다. 화학적으로 합성된 펩타이드는 Mimotopes에 의해 공급되었으며 이를 -20℃에서 건조 분말로 저장하였다. 이러한 펩타이드를 UV 매개 교체에 의해 비오틴화된 HLA-A11에 부가하였다. 3개의 중금속 바코드로 표지된 스트렙타비딘을 HLA-A11이 부가된 펩타이드에 결합시켜 말초 혈액 염색에 사용되는 HLA-사량체를 제조하였다 (도 7). 7명의 위암 환자 유래 PBMC의 HLA-A11 사량체 염색을 수행하고 (도 12(a)) 엡스타인 바르 바이러스 (EBV) 바이러스 항원에 대한 대조군 펩타이드를 양성 대조군으로 포함시켰다 (도 13). 이 7개의 샘플 중 환자 중 하나인 SC020은 발견 코호트의 RNA-Seq 데이터세트에서 확인된 펩타이드 항원을 인식할 수 있는 CD8+ T-세포의 발현에 대해 양성인 것으로 밝혀졌다 (도 12a). 이 항원을 실시예 2에서 확인된 MARK3 유전자의 대체 스플라이싱 현상에서 생성하였다 (도 11(b)). CyTOF 연구에 사용된 MARK3 스플라이스 변이체 항원의 서열은 RNMSFRIK (서열번호 1)이고 EBV 펩타이드 서열은 SSCSSCPLSK (서열번호 2)였다. CyTOF 데이터를 분석하면 이러한 MARK3 특이적 CD8+ T 세포와 다른 면역표현형 및/또는 계통 마커 (CCR7, CD45RA, CD8a, CD38, CD127, CD57, KLRG1, TIGIT, CD39 및 PD-1)는 이러한 T 세포가 나이브가 아니고, 종양에 반응하는 세포독성 CD8+ T 림프구 (CTL)를 나타낼 수 있다. 환자 SC020은 또한 EBV의 양성 대조군 펩타이드와 반응한 T 세포에 대해 양성이었다 (도 13). 위암 환자 SC020의 새로운 PBMC 단리물에서 MARK3 스플라이스 변이체 항원의 존재를 형광 표지된 MARK3-A11-RNMSFRIK 펩타이드 사량체를 사용한 FACS 분석에 의해 추가로 확인하였다 (도 12(b)). MARK3 특이적 CD8 T 세포의 빈도는 CyTOF와 FACS 분석 사이에 높은 일치도를 보여준다.
실시예 4
GC 환자들 사이에서 공유되는 MARK3 스플라이스 변이체 항원의 인실리코 확인
77개의 펩타이드에 상응하는 종양 관련 대체 스플라이싱 현상을 분석하여 GC 환자 하위집단 중 대체 스플라이싱되고 공유된 고 빈도를 나타내는 현상을 결정하였다 (도 11(b), 가장 높은 빈도는 185회 발생임). 공유 대체 스플라이싱 현상의 발생은 19명의 GC 환자 중 3명 내지 12명으로 다양하였다. MARK3 스플라이스 변이체는 19명의 GC 환자 중 4명에서 발생하는 것으로 밝혀졌다 (도 11(b)의 화살표). CyTOF 스크리닝에서 획득된 7개 샘플 중 단일 양성 적중률 (14%)은 발견 코호트에서 MARK3 스플라이스 변이체에 대해 관찰된 빈도와 일치하여 (4/19명의 환자) 이는 GC 환자 하위 집단에 의해 공유된 스플라이스 변이체 항원임을 확인하였다. MARK3의 비정상 스플라이싱이 관찰된 4명의 환자에서 정상 샘플의 PSI 값은 0.05, 0.05, 0.04 및 0.06이고 종양 샘플의 PSI 값은 0.67, 0.50, 0.26 및 0.28이었다 (도 14a). 중앙값 PSI 변화는 -0.335이고; 이는 종양 샘플에서 전사체의 33.5%가 CyTOF 스크리닝에서 확인된 MARK3 펩타이드의 일부를 인코딩하는 엑손 (표 1의 엑손 24)을 포함한다는 것을 나타낸다.
이 MARK3 스플라이스 이소형의 존재를 실험적으로 확인하기 위해, Ensembl 데이터베이스를 확인하여 MARK3의 스플라이스 변이체를 확인하였다 (도 14b). 이는 엑손 24를 포함하는 많은 MARK3 스플라이스 이소형이 있음을 보여준다 (도 14(b) 및 도 14(c)). 프라이머 (MARK3F: TCCCATGAAGCCACACCATTG (서열번호 3) 및 MARK3R: AGCGTAGGGATCGAGGCTTTG (서열번호 4)를 어느 MARK3 스플라이스 이소형이 발현되는지 확인하기 위해 측접 영역에 설계하였다.
GC 세포주에서 MARK3 스플라이스 변이체의 존재를 RT-PCR을 사용하여 확인하였다 (도 14(c)). PCR 산물을 TBE-PAGE 겔에서 크기별로 분리하고 시각화하였다. 16개 GC 세포주 중 6개 (별표로 표시된 세포주)는 이전에 CyTOF 스크리닝에서 확인된 펩타이드를 보유하는 MARK3 유전자의 스플라이스 이소형을 주로 발현했으며, 이는 GC 환자 하위 집단이 공유하는 특징 항원임을 추가로 보여준다. GC 세포주에서 MARK3 이소형의 발현 정량화를 PCR 산물의 강도의 농도 측정을 사용하여 수행하였으며 이는 도 14(d)에 나와 있다. 증가된 수준의 MARK3 이소형 1 및 3을 발현하는 GC 세포주는 HFE 145, SNU1, GES1, HS738T, HS746T 및 HGC-27을 포함한다 (이 세포주에서 MARK3 이소형 1 및 3은 각각 모든 이소형의 71.0%, 68.7%, 30.1%, 96.1%, 44.7% 및 49.1%를 포함함). 대부분의 다른 위 세포주는 MARK3 이소형 1 및 3의 10% 이하를 발현한다. 또한, MARK3 이소형 1 및 3의 발현은 비-GC 세포주에서 최소이거나 나타나지 않았다.
Figure pct00002
실시예 5
검출 (진단) 목적을 위한 공유 스플라이스 변이체 항원의 사용
MARK3과 같은 공유 스플라이싱된 변이체 항원은 검출 (진단) 목적으로 사용될 수 있다. MARK3의 경우, FFPE 샘플에서 RNA를 추출하고 유전자 특이적 프라이머 (MARK3R, 서열번호 4)를 사용하여 cDNA로 전환하였다. MARK3 스플라이스 변이체를 RT-PCR (MARK3F (서열번호 3) 및 MARK3R (서열번호 4)을 사용하여 검출하였다. DNA 겔 전기영동을 사용하여 어떤 MARK3 이소형이 존재하는지 확인하고 또한 이 샘플의 모든 MARK3 이소형 중 MARK3 이소형 1과 3의 백분율을 정량화하였다 (도 14(e)). 샘플은 비만 환자 (비암성)의 비만 위 조직 또는 GC 종양의 FFPE 샘플로 구성된다. MARK3 이소형의 정량화를 PCR 산물 강도의 농도 측정을 사용하여 수행하였다. 비만 위 FFPE 샘플은 5% 미만의 낮은 수준의 이러한 이소형을 포함하고, 20개의 GC FFPE 샘플 중 7개는 이러한 이소형의 10% 초과를 포함한다 (도 14(e)에서 밑줄친 샘플).
다른 공유 스플라이싱된 변이체 항원 (예컨대 NBPF9, PARD3, ZC3HAV1, YAF2, CAMKK1, LRR1, ZNF670, GRINA 또는 MZF1)을 전술한 방법을 사용하여 검출 (진단) 목적으로 유사하게 사용할 수 있다.
실시예 6
공유 항원-유도 T 세포의 확장
MARK3과 같은 공유 스플라이스 변이체 항원을 갖는 T 세포를 생체외에서 확장할 수 있다. MARK3의 경우 건강한 공여체로부터 PBMC를 획득하였다. 이러한 PBMC의 분취량을 수지상 세포로의 후속 분화 (ImmunoCult 수지상 세포 배양 키트, STEMCELL Technologies)를 위해 단핵구를 단리 (인간 단핵구 단리 키트, STEMCELL Technologies)하는데 사용하였다. 이러한 단핵구 유래 수지상 세포를 미토마이신 C (30 μg/ml)로 처리하여 이러한 세포의 성장을 방지하였다. 그런 다음 이 수지상 세포에 MARK3 펩타이드를 부가하고 항원 제시 세포로 사용하였다. CD8+ T 세포를 PBMC의 다른 분취량으로부터 단리하고 (EasySep 인간 CD8+ T 세포 단리 키트, STEMCELL Technologies), 이 세포를 MARK3 특이적 T 세포의 확장을 자극하기 위해 항원 제시 세포와 공동 배양하였다. 기능적 특성화 또는 TCR 확인을 위한 충분한 수의 MARK3-특이적 T 세포를 생성하기 위해, MARK3 펩타이드 부가된 단핵구 유래 수지상 세포 또는 인공 항원 제시 세포를 사용하여 MARK3 특이적 T 세포의 확장을 추가로 자극할 수 있다. 상기 방법을 사용한 MARK3 특이적 T 세포의 확장을 환자의 치료에 사용할 수 있다.
다른 공유 스플라이스 변이체 항원 (예컨대 NBPF9, PARD3, ZC3HAV1, YAF2, CAMKK1, LRR1, ZNF670, GRINA 또는 MZF1)을 갖는 T 세포는 유사하게 상기 방법을 사용하여 단리되고 확장될 수 있다.
실시예 7
GC에서 상기 공유 MARK3 스플라이스 변이체 항원에 반응성인 CD8+ T 림프구의 기능적 유의도
MARK3 항원 및 CD8+ T 림프구의 특성화를 MARK3 특이적 CTL이 건강한 공여체 PBMC에서 확장될 수 있는지를 먼저 결정함으로써 수행하였다 (실시예 6에 나타낸 바와 같음). 도 15(a)는 MARK3 펩타이드에 의한 자극의 존재 또는 부재 하의 건강한 공여체의 PBMC에서 IFN-γ에 대한 ELISPOT 분석 결과를 보여준다. CTL은 동족 항원을 인식할 때만 IFN-γ를 분비한다. 이 도면에서 IFN-γ-분비 CTL은 PBMC가 MARK3 펩타이드로 자극되었을 때만 관찰되었다. 이는 MARK3 스플라이스 변이체 항원이 항원성이고 MARK3 특이적 CTL의 확장을 자극할 수 있음을 보여준다.
종양 세포가 MARK3 항원을 발현하고 MARK3-특이적 CTL이 이러한 종양 세포를 표적화할 수 있음을 보여주기 위해, MARK3 스플라이스 변이체 항원을 발현하는 MARK3-특이적 CTL을 사용하여 GC 세포주 (HGC-27, 실시예 4에서 확인됨)를 사멸시키는 능력을 시험하였다 (MARK3 이소형의 49.1%는 이소형 1과 3을 포함, 도 14(d)). 원래의 HGC-27 세포주 (Riken 세포 뱅크: RCB0500)는 HLA-A11을 발현하지 않지만, HLA-A11을 발현하는 안정적인 HCG-27 세포주를 렌티바이러스 형질도입을 이용하여 생성하였다. HLA-A11 대립 인자와 MARK3-SV mRNA 전사체를 모두 가지고 있는 종양 세포만이 MARK3-SVP 자극 CTL에 의해 사멸되었다. 이와 달리, MARK3-SV mRNA 전사체를 발현하지만 HLA-A11 MHC 대립인자는 발현하지 않는 종양 세포는 MARK3-SVP 자극된 CTL에 의해 사멸되지 않았다 (도 15(b)).
실시예 8
MARK3 공유 항원-유도 T 세포의 단리
MARK3-특이적 T 세포를 단리하기 위해, MARK3 펩타이드 부가된 수지상 세포 (실시예 6에 나타낸 바와 같음)와 공동-배양된 CD8+ T 세포를 먼저 MARK3 오량체-PE (맞춤 제조 오량체, PROIMMUNE)로 염색한 다음, 항-CD3-FITC 및 항-CD8a-APC. BD로 염색하였다. 도 16은 FACSAria III를 사용하여 MARK3-특이적 CD8+ T 세포를 단리하기 위한 세포 분류 절차의 게이팅 전략을 보여준다. 단일 세포를 1.5 μl 용해 완충액 (5 단위 RNase 억제제, 0.2% Triton X-100, 0.5 mM dNTP 믹스, 0.1 μM TRAC 프라이머: GACCAGCTTGACATCACAG (서열번호 9), 및 0.1 μM TRBC 프라이머: CTCAGGCAGTATCTGGAGTCATTG (서열번호 10))를 포함하는 PCR 플레이트에 분류하였다. 이후에 단일 세포 분류 MARK3-특이적 T 세포의 용해물을 사용하여 2.5 μl 반응 (SuperScript III 역전사효소, Thermo Fisher Scientific)에서 역전사시켜 cDNA를 제조하였다.
실시예 9
MARK3-특이적 TCR (TRA 및 TRB 사슬)의 증폭 및 시퀀싱
TRA 및 TRB 사슬 서열을 내포된 PCR (PCR1 및 PCR2)에 의해 획득하였다. 2회의 PCR에 사용되는 TRAV 및 TRBV 프라이머는 문헌[Wang et al (2012) Sci. Transl Med (표 S1, PCR1에 사용되는 외부 프라이머 및 PCR2에 사용되는 내부 프라이머)]에 기재되어 있다. 두 PCR에 사용되는 TRAC 및 TRBC 프라이머는 다음과 같다:
TRAC PCR1: TGCTGTTGTTGAAGGCGTTTG (서열번호 11);
TRAC PCR2: TGTTGCTCTTGAAGTCCATAG (서열번호 12);
TRBC PCR1: CCCACTGTGCACCTCCTTC (서열번호 13); 및
TRBC PCR2: TTCTGATGGCTCAAACACAG (서열번호 14).
단일 세포 분류된 MARK3-특이적 T 세포로부터 제조된 cDNA를 사용하고 TRAV 및 TRBV (각각 0.1 μM), TRAC PCR1 (0.4 μM) 및 TRBC PCR1 (0.4 μM)에 대한 외부 프라이머를 조합하여 제1 PCR을 수행하였다. 그런 다음 PCR1을 TRA 및 TRB PCR 산물을 생성하기 위한 두 개의 개별 PCR 반응에서 제2 PCR의 주형으로 사용하였다. TRAV (각각 0.1 μM) 및 TRAC PCR2 (0.4 μM)용 내부 프라이머를 사용하여 TRA 서열을 획득하고, TRBV (각각 0.1 μM) 및 TRBC PCR2 (0.4 μM)에 대한 내부 프라이머를 사용하여 TRB 서열을 획득하였다.
제2 PCR 후 TRA 및 TRB에 대한 PCR 산물을 겔 전기영동으로 분석하여 TRA 및 TRB 둘 모두가 성공적으로 증폭된 클론을 확인하였다 (도 17). 이러한 TRA 및 TRB PCR 산물을 각각 TRAC PCR2 및 TRBC PCR2 프라이머를 사용하여 Sanger 시퀀싱 (BigDye Terminator v3.1, Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 시퀀싱하였다.
V, J 및 CDR3 영역을 확인하기 위해 IMGT 데이터베이스를 사용하여 TRA 및 TRB 서열을 분석하였다. 이 분석으로부터, 하나의 클론에서 TRAV6*03, TRAJ9*01 및 아미노산 "CAPYTGGFKTIF" (서열번호 20)을 포함하는 CDR3, 및 TRBV7-9*01, TRBJ1-2*01로 구성된 TRB 서열 및 아미노산 "CASSSPRVGYGYTF" (서열번호 28)을 포함하는 CDR3을 포함하는 TRA 서열을 확인하였다 (하기 참조).
MARK3 TRA 사슬
TRAV6*01 AA 서열:
MESFLGGVLLILWLQVDWVKSQKIEQNSEALNIQEGKTATLTCNYTNYSPAYLQWYRQDPGRGPVFLLLIRENEKEKRKERLKVTFDTTLKQSLFHITASQPADSATYL (서열번호 15)
TRAJ9*01 AA 서열:
GAGTRLFVKAN (서열번호 16)
CDR1 AA 서열
NYSPAY (서열번호 17)
CDR2 AA 서열
IRENEKE (서열번호 18)
CDR3 뉴클레오타이드 서열:
TGTGCTCCGTATACTGGAGGCTTCAAAACTATCTTT (서열번호 19)
CDR3 AA 서열:
CAPYTGGFKTIF (서열번호 20)
MARK3 TRA 가변 영역 AA 서열
MESFLGGVLLILWLQVDWVKSQKIEQNSEALNIQEGKTATLTCNYTNYSPAYLQWYRQDPGRGPVFLLLIRENEKEKRKERLKVTFDTTLKQSLFHITASQPADSATYLCAPYTGGFKTIFGAGTRLFVKAN (서열번호 21)
MARK3 TRA AA 서열
MESFLGGVLLILWLQVDWVKSQKIEQNSEALNIQEGKTATLTCNYTNYSPAYLQWYRQDPGRGPVFLLLIRENEKEKRKERLKVTFDTTLKQSLFHITASQPADSATYLCAPYTGGFKTIFGAGTRLFVKANIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS (서열번호 22)
MARK3 TRB 사슬
TRBV7-9*01 AA 서열:
MGTSLLCWMALCLLGADHADTGVSQNPRHKITKRGQNVTFRCDPISEHNRLYWYRQTLGQGPEFLTYFQNEAQLEKSRLLSDRFSAERPKGSFSTLEIQRTEQGDSAMYL (서열번호 23)
TRAJ1-2*01 AA 서열:
GSGTRLTVV (서열번호 24)
CDR1 AA 서열
SEHNR (서열번호 25)
CDR2 AA 서열
FQNEA (서열번호 26)
CDR3 뉴클레오타이드 서열:
TGTGCCAGCAGCTCCCCCCGGGTTGGCTATGGCTACACCTTC (서열번호 27)
CDR3 AA 서열:
CASSSPRVGYGYTF (서열번호 28)
MARK3 TRB 가변 영역 AA 서열
MGTSLLCWMALCLLGADHADTGVSQNPRHKITKRGQNVTFRCDPISEHNRLYWYRQTLGQGPEFLTYFQNEAQLEKSRLLSDRFSAERPKGSFSTLEIQRTEQGDSAMYLCASSSPRVGYGYTFGSGTRLTVV (서열번호 29)
MARK3 TRB AA 서열
MGTSLLCWMALCLLGADHADTGVSQNPRHKITKRGQNVTFRCDPISEHNRLYWYRQTLGQGPEFLTYFQNEAQLEKSRLLSDRFSAERPKGSFSTLEIQRTEQGDSAMYLCASSSPRVGYGYTFGSGTRLTVVEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG (서열번호 30)
실시예 10
MARK3 스플라이스 변이체를 발현하는 집단 내 암 환자의 치료를 위한 MARK3 스플라이스 변이체 특이적 T 림프구의 검출
MARK3 펩타이드가 부가된 HLA-A11 사량체를 사용하여 GC 환자가 MARK3-특이적 T 림프구를 갖고 있는지를 결정하였다. 도 12(a)의 히스토그램은 7명의 GC 환자 (환자 SC020) 중 한 명이 MARK3 SVA를 인식하는 T 림프구를 가지고 있음을 보여준다. 환자 SC020의 이러한 MARK3 특이적 T 림프구는 특징적인 MARK3 SVA를 보유하는 위암 치료를 위해 추가로 확장될 수 있다. 다른 MARK3-스플라이스 변이체 발현-양성 환자에 존재하는 MARK3-특이적 T 림프구의 확장은 실시예 6에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
실시예 11
HNSC에서 MARK3 스플라이스 현상의 확인
MARK3 SVA의 존재를 GC에서 확인된 후 다른 암 유형에서 확인하였다. 이를 TCGA SpliceSeq: (https://bioinformatics.mdanderson.org/TCGASpliceSeq/singlegene.jsp)와 같은 대체 스플라이싱을 분석한 공개적으로 사용 가능한 데이터베이스를 상호 참조하여 수행하였다.
이 분석을 통해 MARK3 또한 HNSC 및 KIRC에서 비정상적으로 스플라이싱된 것으로 밝혀졌다 (도 17). HNSC 환자로부터 유래된 세포주에서 MARK3 스플라이스-변이체 전사체 발현의 존재를 실시예 4에 기재된 프라이머를 사용하여 RT-PCR (도 18)을 사용하여 확인하였다. 도 18(a)는 21개 HNSC 세포주 중 7개 (별표 표시)는 제1 GC 환자 코호트에서 확인된 대체 스플라이싱된 이소형을 주로 발현하여 또한 상응하는 MARK3 항원 펩타이드가 HNSC에서 잠재적인 공유 항원임을 보여준다. MARK3 이소형의 정량화는 도 18b에 나와 있다.
실시예 12
결장직장암종에서 대체 스플라이싱된 변이체의 확인 및 HLA-A11 결합 펩타이드의 예측
결장직장 암종 (CRC) 종양 샘플 (37) 및 대응하는 정상 샘플 (10)을 종양에 인접한 비악성 조직에서 채취하고 이러한 샘플로 발견 코호트를 구성하였다. 임상 정보와 함께 이 샘플을 Singapore Health Services 조직 저장소에서 획득하였다. rMATS를 사용한 심층 RNA 시퀀싱 (1억개의 쌍 말단 판독결과) 및 mRNA 스플라이싱 분석을 이러한 샘플에서 수행하여 종양 관련 대체 스플라이싱 현상을 확인하였다. 선택 기준 (스플라이싱의 적어도 20% 변화 (△PSI), 적어도 6명의 환자에서 발생, 포함/스키핑을 위한 접합 수는 10 초과이어야 함)을 적용하였으고, 576 종양-관련 대체 스플라이싱 현상 목록을 생성하였으며, 이중 352개에서 단백질 서열 변화가 초래되었다 (도 19(a) 및 도 19(b)).
이러한 종양 관련 대체 스플라이싱 현상을 HLA-결합 펩타이드를 검색함으로써 CRC 환자 하위 집단 또는 하위 그룹에서 공유될 수 있는 후보 항원 영역의 확인에 사용하였다. NetMHCpan 3 및 4를 CRC 환자 코호트의 약 50%에 존재하는 HLA 대립인자인 HLA-A11에 결합할 수 있는 8 내지 11개 아미노산 길이의 펩타이드를 예측하는데 사용하였다. NetMHCpan의 두 형태를 스크리닝에 사용된 펩타이드를 추가로 포함하는데 사용하였다. 공유 펩타이드 항원 (102)을 선택 기준 (NetMHCPan 3 또는 NetMHCPan 4에서 순위 0.5 이하)에 따라 선택한 다음 유사한 펩타이드를 제거하였다. 후속 HLA-A11 CyTOF 스크리닝에서 이러한 102개의 펩타이드 항원은 76개의 스플라이스 현상에 상응하였다. 도 19(c)는 △PSI와 CRC 스플라이스 변이체 항원 하위 그룹을 규정하는 102개의 펩타이드 서열을 생성한 스플라이싱 변이의 동시 발생을 요약한다.
실시예 13
CRC 환자에서 공유 HLA-A11 스플라이스 변이체 항원의 검증 및 스플라이스 변이체-특이적 CD8+ T 세포의 확인
CRC 환자가 실시예 12에서 확인된 102개의 펩타이드 중 임의의 것을 표적화하는 CD8+ T 세포를 갖고 있는지 결정하기 위해, PBMC의 MHC 사량체 염색을 사용하여 8명의 CRC 환자 (검증 코호트)의 신규한 코호트에서 CyTOF 스크리닝을 수행하였다 (도 19(a)). 이 CRC 환자는 모두 HLA-A11에 양성이다.
102개의 펩타이드를 Mimotopes에 의해 화학적으로 합성하였다. 이러한 펩타이드를 UV 매개 교체에 의해 비오틴화된 HLA-A11에 부가하였다. 3개의 중금속 바코드로 표지된 스트렙타비딘을 펩타이드가 부가된 HLA-A11에 결합시켜 PBMC 염색에 사용되는 HLA-사량체를 제조하였다.
항원-특이적 T 세포 검출의 감도를 증가시키기 위해, 각각의 펩타이드에 대해 2개의 상이한 세트의 중금속 바코드를 사용하였다. 각 환자의 PBMC를 이 두 세트의 펩타이드가 부가된 HLA 사량체로 염색하였다. 빈도 공동 일치도를 드문 현상에 대한 특이적 염색의 표시로 사용하였다.
전체적으로 본 발명자들은 27개의 스플라이스 변이체 펩타이드를 표적화하는 항원 특이적 CD8+ T 세포를 확인하였다 (도 19(a)). 이러한 SVA 중 8개는 도 20(a)에 나와 있으며 한 명 이상의 CRC 환자에서 확인할 수 있었다. 이러한 SVA는 다음 펩타이드 서열: SSFYALEEK (서열번호 31), SQLDFVKTRK (서열번호 32), LTMAVKAEK (서열번호 33), VIVSASRTK (서열번호 34), VTSPSRRSK (서열번호 35), SLPRFGYRK (서열번호 36), SCVSPSSELK (서열번호 37), 및 SIRQAFIRK (서열번호 38)에 의한 NBPF9, PARD3, ZC3HAV1, YAF2, CAMKK1, LRR1, ZNF670 및 GRINA의 비정상 스플라이싱에서 유래되었다. 이러한 SVA 중 2개, NBPF9 및 ZNF670은 2명의 환자에서 검출될 수 있으며, 이는 추가로 이러한 SVA가 환자 간에 공유되고 면역원성을 나타낸다는 것을 시사한다. 이러한 SVA를 발생시킨 스플라이스 현상의 발생, △PSI 및 유형은 도 20(a)에 나와 있다. 이러한 4가지 SVA는 모두 CRC 환자의 2가지 다른 코호트 (발견 및 검증 코호트)에서 검출되었다.
비정상적으로 스플라이싱된 엑손 또는 인트론 및 종양 관련 이소형의 좌표는 도 20(b)에 나와 있다. NBPF9 SVA를 발생시킨 스플라이스 현상의 경우, 이는 인트론 (chr1:144826287:144826932:+)의 보유를 초래하는 인트론 보유 현상이다. 이는 인트론 (chr1:144826235:144827105:+)을 포함하는 전사체를 생성시킨다. PARD3 SVA를 발생시킨 스플라이스 현상의 경우, 이는 엑손 (chr10:34625127:34625171:- 및 chr10:34626206:34626354:-)을 포함하는 전사체를 생성하는 5' 스플라이스 부위의 대체 사용이다. ZC3HAV1 SVA를 발생시킨 스플라이스 현상의 경우, 이는 또한 엑손 (chr7:138763298:138763399:-, 및 chr7:138763850:138764989:-)을 포함하는 전사체를 생성하는 5' 스플라이스 부위의 대체 사용이다. YAF2 SVA를 발생시킨 스플라이스 현상의 경우, 이는 엑손 (chr12:42604350:42604421:-, 및 chr12:42631401:42631526:-)을 포함하는 전사체를 생성하는 3' 스플라이스 부위의 대체 사용이다. CAMKK1 SVA를 발생시킨 스플라이스 현상의 경우, 이는 엑손 (chr17:3784921-3784942:-(서열번호 39))의 스키핑을 초래하는 엑손 스킵/포함 현상이다. 이는 엑손 (chr17:3785822-3785858:- 및 chr17:3783640-3783728:-)을 포함하는 전사체를 생성시킨다. LRR1 SVA를 발생시킨 스플라이스 현상의 경우, 이는 엑손 (chr14:50074118-50074839:+ (서열번호 42))의 스키핑을 초래하는 엑손 스킵/포함 현상이다. 이는 엑손 (chr14:50069088-50069186:+ 및 chr14:50080974-50081389:+)을 포함하는 전사체를 생성시킨다. ZNF670 SVA를 발생시킨 스플라이스 현상의 경우, 이는 엑손 (chr1:247130997-247131094:-(서열번호 45))의 스키핑을 초래하는 엑손 스킵/포함 현상이다. 이는 엑손 (chr1:247151423-247151557:- 및 chr1:247108849-247109129:-)을 포함하는 전사체를 생성시킨다. GRINA SVA를 발생시킨 스플라이스 현상의 경우, 이는 인트론 (chr8:145065973: 145066412:+)의 제거를 초래하는 인트론 보유 현상이다. 이는 인트론 (chr8:145065860-145065972:+@chr8:145066413-145066541:+)을 포함하지 않는 전사체를 생성한다. 위에서 기재한 모든 좌표는 GRCh37/hg19 게놈 조립을 기반으로 한다.
실시예 14
결장직장암에서 공유 후보 항원 및 이의 동족 T 세포의 확인 및 검증
도 19a는 결장직장암에서 공유 후보 항원 및 이의 동족 항원 특이적 T 세포를 확인 및 검증하기 위한 작업 흐름도를 보여준다. HLA-A11 결합 펩타이드를 생성하는 비정상 스플라이싱으로부터 공유 후보 항원을 실시예 12에 기재된 바와 같이 확인하였다. 이러한 HLA-A11 결합 펩타이드를 사용한 면역학적 스크리닝을 사용하여 CRC 환자가 이러한 후보 항원에 대한 임의의 면역학적 반응을 갖는지를 결정하였다 (실시예 13에 제공된 바와 같음). 이 면역학적 스크리닝에서 CRC 환자는 27개의 스플라이스 변이체 펩타이드에 대한 항원 특이적 T 세포를 가지고 있음이 밝혀졌다. 스플라이스 변이체 펩타이드를 생성한 스플라이스 변이체의 발현은 결장직장암 세포주에서 RT-PCR을 수행하여 이러한 표적 중 9개에 대해 확인되었다. 또한 일부 암세포주는 이러한 9개 표적에 대해 정상 조직과 비교하여 종양 관련 스플라이스 변이체의 발현이 증가되는 것으로 밝혀졌다. 또한, 이러한 표적 중 4개는 CRC 환자의 인접한 정상 조직 샘플과 비교하여 종양 조직 샘플에서 종양 관련 스플라이스 변이체의 발현 증가를 나타낸다. 건강한 공여체의 CD8+ T 세포를 사용한 시험관내 실험을 사용하여 이러한 표적의 면역원성을 추가로 시험했으며 항원 특이적 T 세포가 이러한 표적 중 3개에 대해 생성될 수 있음을 발견하였다. 따라서, 이 접근법은 공유 후보 항원과 동족 T 세포를 신속하고 동시에 확인할 수 있게 하여 T 세포 치료 옵션의 신속한 개발을 가능하게 한다.
실시예 15
확인된 종양-관련 스플라이스 변이체가 CRC 환자의 다중 분자 하위유형에 존재한다
실시예 12에 나타낸 바와 같이 확인된 종양 관련 스플라이스 변이체는 도 21(a)에 나타낸 바와 같이 다수의 환자에 존재한다. 이러한 종양 관련 스플라이스 변이체는 아미노산의 단순한 추가 또는 누락을 통해 또는 단백질 판독 프레임의 변화를 통해 신규한 단백질 서열을 생성함으로써 단백질 서열의 변화를 유발한다 (도 5). 체세포 점 돌연변이에서 유래된 신생항원은 주로 미세부수체 불안정 (MSI) CRC 환자에 존재한다 (주로 공통 분자 하위유형 (CMS) 1). 이와 달리, 본 발명의 종양 관련 스플라이스 변이체의 경우 (다중 CRC 환자에 존재하는 것 외), 개별 환자는 미세부수체 또는 CMS 상태에 관계없이 유사한 수의 종양 관련 스플라이스 변이체가 존재한다 (도 21(b)).
실시예 16
CRC에서 CAMKK1 스플라이스 변이체 항원의 검증
HLA-A11 (서열번호 35)에 결합하는 CAMKK1 스플라이스 변이체 펩타이드를 실시예 12 및 13에 나타낸 바와 같이 확인하였다. CAMKK1의 비정상 스플라이싱을 37명의 CRC 환자 중 9명에서 관찰하였으며 중앙값 PSI 변화는 발견 코호트에서 종양 샘플과 정상 샘플 사이에 0.473이었다 (도 20(a)).
CRC 환자의 개별 정상 (Norm) 및 종양 (Tum) 샘플에 대한 PSI 값은 도 22(a)에 나와 있다. 이 도면에는 접합 수가 충분한 샘플만 표시되어 있다. 도 22(b)는 정상 및 종양 이상치 샘플에 대한 사시미 그래프를 보여주며 (실시예 1에서도 기재된 바와 같음); 각 사시미 그래프는 이러한 샘플의 평균 판독결과 밀도를 보여준다. 종양 샘플에 대한 사시미 그래프는 엑손 스키핑이 증가했음을 보여준다. 확인된 CAMKK1에 대한 종양 관련 스플라이스 현상은 엑손의 스키핑으로 구성된다 (chr17:3784921-3784942:-, 서열번호 39).
CRC에서 CAMKK1 스플라이스 이소형의 존재를 실험적으로 확인하기 위해, 3명의 CRC 환자의 세포주 및 조직 샘플 (대응하는 종양 및 인접 정상 샘플)에서 RT-PCR을 수행하였다 (도 22(c)). 프라이머 (CAMKK1F: GAAGCTGGACCACGTGAATGTG (서열번호 40) 및 CAMKK1R: AGTACTCGAGGCCCAGGATGAC (서열번호 41))를 어느 CAMKK1 스플라이스 이소형이 발현되는지 확인하기 위해 측접 영역에 설계하였다. 이러한 프라이머는 확인된 대체 스플라이싱된 엑손에 측접하는 서열에 결합한다. GRCh37/hg19 게놈 조립을 기반으로 또 다른 엑손이 또한 대체 스플라이싱된다. 본 명세서에서 확인된 두 개의 스플라이스 이소형 외에 두 개의 추가 스플라이스 이소형이 이 두 개의 대체 스플라이싱된 엑손의 구별적 스플라이싱으로부터 생성될 수 있다 (도 22(c)). 종양 관련 스플라이스 변이체에 대한 PCR 산물의 크기는 277 bp 및 163 bp이다.
163 bp CAMKK1 종양 관련 스플라이스 변이체가 정상 결장 조직과 비교하여 다수의 CRC 세포주 (HCT15, HCT116 및 SW480)에서 더 많이 발현되는 것으로 확인되었다 (도 22(d)). 3명의 다른 CRC 환자로부터 대응하는 인접한 정상 및 종양 조직에서 단리된 RNA를 사용하여 cDNA를 제조하고 CAMKK1 스플라이스 이소형을 검출하기 위한 RT-PCR에 사용하였다. 이 CRC 환자 중 2명은 CAMKK1 종양 관련 스플라이스 이소형의 발현 증가를 보여준다 (도 22(d)). 실시예 5에 기재된 바와 같이, 이 RT-PCR은 검출 또는 진단 목적으로 사용될 수 있다.
확인된 CAMKK1 종양 관련 스플라이스 변이체는 22개 뉴클레오타이드 (서열번호 39)의 엑손의 스키핑을 포함한다. 이 엑손의 대체 스플라이싱은 현재 유전자 주석 (Gencode 버전 34 또는 RefSeq)을 기반으로 이전에 관찰되지 않았으며 신규한 스플라이스 이소형을 나타낸다. 도 22(c)에 나타낸 바와 같이, 이 엑손의 스키핑에 의해 하류 엑손에 대한 판독 프레임의 변화를 야기하고, 이는 도 20(a)에서 확인된 HLA-A11 결합 펩타이드의 형성으로 이어진다.
실시예 17
CRC에서 LRR1 스플라이스 변이체 항원의 검증
HLA-A11 (서열번호 36)에 결합하는 LRR1 스플라이스 변이체 펩타이드를 실시예 12 및 13에 기재된 바와 같이 확인하였다. LRR1의 비정상 스플라이싱은 37명의 CRC 환자 중 6명에서 관찰되었으며 중앙값 PSI 변화는 발견 코호트에서 종양 샘플과 정상 샘플 사이에 0.249이었다 (도 20(a)).
CRC 환자의 개별 정상 및 종양 샘플에 대한 PSI 값은 도 23(a)에 나와 있다. 이 도면에는 접합 수가 충분한 샘플만 표시되어 있다. 도 23(b)는 정상 및 종양 이상치 샘플 (실시예 1에 기재된 바와 같음)에 대한 사시미 그래프를 보여주고, 각 사시미 그래프는 이러한 샘플의 평균 판독 밀도를 나타낸다. 종양 샘플에 대한 사시미 그래프는 엑손 스키핑이 증가했음을 보여준다. 확인된 LRR1에 대한 종양 관련 스플라이스 현상은 엑손 (chr14:50074118-50074839:+, 서열번호 42)의 스키핑으로 구성된다.
CRC에서 LRR1 스플라이스 이소형의 존재를 실험적으로 확인하기 위해, 3명의 CRC 환자로부터의 세포주 및 조직 샘플 (대응하는 종양 및 인접 정상 샘플)에서 RT-PCR을 수행하였다 (도 23(c)). 프라이머 (LRR1F: TGAGGGGAAAGCCACTGTTC (서열번호 43) 및 LRR1R: TTCAGACAGAATCTTCCACAAACAC (서열번호 44)를 어느 LRR1 스플라이스 이소형이 발현되는지 확인하기 위해 측접 영역에 설계하였다. 이러한 프라이머는 확인된 LRR1 대체 스플라이싱된 엑손에 측접하는 서열에 결합하고, 종양-관련 스플라이스 변이체는 148bp이다.
LRR1 종양-관련 스플라이스 변이체의 존재는 정상 결장 조직과 비교하여 다수의 CRC 세포주 (Colo-205, DLD-1, HCT15, HCT116, HT29, RKO 및 SW480)에서 더욱 많이 발현되는 것으로 확인되었다 (도 23(c)). 3명의 다른 CRC 환자로부터 대응하는 인접 정상 및 종양 조직으로부터 단리된 RNA를 사용하여, cDNA를 제조하고, LRR1 스플라이스 이소형을 검출하기 위한 RT-PCR에 사용하였다. 이 CRC 환자 중 2명은 LRR1 종양-관련 스플라이스 이소형의 발현 증가를 보여준다 (도 23(c)). 다시, 실시예 5에 기재된 바와 같이, 이 RT-PCR은 검출 또는 진단 목적으로 사용될 수 있다.
실시예 18
CRC에서 ZNF670 스플라이스 변이체 항원의 검증
HLA-A11(서열번호 37)에 결합하는 ZNF670 스플라이스 변이체 펩타이드를 실시예 12 및 13에 기재된 바와 같이 확인하였다. ZNF670의 비정상 스플라이싱은 37명의 CRC 환자 중 8명에서 관찰되었으며 중앙값 PSI 변화는 발견 코호트에서 종양 샘플과 정상 샘플 사이에 0.362이었다 (도 20 (a)).
CRC 환자로부터의 개별 정상 및 종양 샘플의 PSI 값은 도 24(a)에 나와 있다. 이 도면에는 접합 수가 충분한 샘플만 표시되어 있다. 도 24(b)는 정상 및 종양 이상치 샘플 (실시예 1에 기재된 바와 같음)에 대한 사시미 그래프를 보여주고, 각각의 사시미 그래프는 이러한 샘플의 평균 판독 밀도를 나타낸다. 종양 샘플에 대한 사시미 그래프는 엑손 스키핑이 증가했음을 보여준다. 확인된 ZNF670에 대한 종양 관련 스플라이스 현상은 엑손 (chr1:247130997-247131094:-, 서열번호 45)의 스키핑으로 구성된다.
CRC에서 ZNF670 스플라이스 이소형의 존재를 실험적으로 검증하기 위해, 3명의 CRC 환자로부터의 세포주 및 조직 샘플 (대응하는 종양 및 인접 정상 샘플)에서 RT-PCR을 수행하였다 (도 24(c)). 프라이머 (ZNF670F: TTCATTCCAAAAAGTGATGCTGAG (서열번호 46) 및 ZNF670R: CAACATGGAAGAACAATCTTCCTTTC (서열번호 47))를 어느 ZNF670 스플라이스 이소형이 발현되는지 확인하기 위해 측접 영역에 설계하였다. 이러한 프라이머는 확인된 ZNF670 대체 스플라이싱된 엑손에 측접하는 서열에 결합하고, 종양-관련 스플라이스 변이체는 283bp이다.
ZNF670 종양-관련 스플라이스 변이체의 존재는 정상 결장 조직과 비교하여 다수의 CRC 세포주 (DLD-1, HCT15, 및 HCT116)에서 더욱 많이 발현되는 것으로 확인되었다 (도 24(c)). 3명의 다른 CRC 환자로부터 대응하는 인접 정상 및 종양 조직으로부터 단리된 RNA를 사용하여, cDNA를 제조하고, ZNF670 스플라이스 이소형을 검출하기 위한 RT-PCR에 사용하였다. 이 CRC 환자 중 2명은 ZNF670 종양-관련 스플라이스 이소형의 발현 증가를 보여준다 (도 24(c)). 실시예 5에 기재된 바와 같이, 이 RT-PCR은 검출 또는 진단 목적으로 사용될 수 있다.
확인된 ZNF670 종양-관련 스플라이스 변이체는 98개 뉴클레오타이드 (서열번호 45)의 엑손의 스키핑을 포함한다. 이 엑손의 대체 스플라이싱은 이전에 현재의 유전자 주석 (Gencode 버전 34 또는 RefSeq)에 기반하여 관찰되지 않았고 신규한 스플라이스 이소형을 나타낸다 (도 24(d)). 도 24(d)에 제시된 바와 같이, 이 엑손의 스키핑은 하류 엑손의 판독 프레임의 변화를 유발하고, 도 20 (a)에서 확인된 HLA-A11 결합 펩타이드의 형성을 초래한다.
실시예 19
CRC에서 GRINA 스플라이스 변이체 항원의 검증
HLA-A11(서열번호 38)에 결합하는 GRINA 스플라이스 변이체 펩타이드를 실시예 12 및 13에 기재된 바와 같이 확인하였다. GRINA의 비정상 스플라이싱은 37명의 CRC 환자 중 10명에서 관찰되었으며 중앙값 PSI 변화는 발견 코호트에서 종양 샘플과 정상 샘플 사이에 0.248이었다 (도 20 (a)).
CRC 환자로부터의 개별 정상 및 종양 샘플의 PSI 값은 도 25(a)에 나와 있다. 이 도면에는 접합 수가 충분한 샘플만 표시된다. 도 25(b)는 정상 및 종양 이상치 샘플 (실시예 1에 기재된 바와 같음)에 대한 사시미 그래프를 보여주고; 각각의 사시미 그래프는 이러한 샘플의 평균 판독 밀도를 나타낸다. 종양 샘플에 대한 사시미 그래프는 인트론의 절제가 증가했음을 보여준다. 확인된 GRINA에 대한 종양 관련 스플라이스 현상은 인트론 (chr8:145,065,973-145,066,412:+, 서열번호 48)의 절제로 구성된다.
CRC에서 GRINA 스플라이스 이소형의 존재를 실험적으로 검증하기 위해, 3명의 CRC 환자로부터의 세포주 및 조직 샘플 (대응하는 종양 및 인접 정상 샘플)에서 RT-PCR을 수행하였다 (도 25(c)). 프라이머 (GRINAF: GGTCCCCCATCCTACTATGACAAC (서열번호 49) 및 GRINAR: GAATGGCGAAGATGAAGAGCAC (서열번호 50))를 어느 GRINA 스플라이스 이소형이 발현되는지 확인하기 위해 측접 영역에 설계하였다. 이러한 프라이머는 확인된 GRINA 비정상적 스플라이싱 현상에 측접하는 서열에 결합하고, 종양-관련 스플라이스 변이체는 286bp이다.
GRINA 종양-관련 스플라이스 변이체의 존재는 정상 결장 조직과 비교하여 하나의 CRC 세포주 (HCT116)에서 발현되는 것으로 확인되었다 (도 25(c)). 3명의 다른 CRC 환자로부터 대응하는 인접 정상 및 종양 조직으로부터 단리된 RNA를 사용하여, cDNA를 제조하고, GRINA 스플라이스 이소형을 검출하기 위한 RT-PCR에 사용하였다. 이 CRC 환자 중 2명은 GRINA 종양-관련 스플라이스 이소형의 발현 증가를 보여준다 (도 25(c)). 다시, 실시예 5에 기재된 바와 같이, 이 RT-PCR은 검출 또는 진단 목적으로 사용될 수 있다.
실시예 20
확인된 CRC HLA-A11 SVP의 면역원성
LRR1, GRINA 및 ZNF670에 대한 항원 특이적 T-세포를 처음에 SVP/HLA-A11 사량체 CyTOF 스크리닝에서 확인하였다 (실시예 13에 기재된 바와 같음). HLA-A11 양성인 건강한 공여체의 PBMC에서 항원 특이적 T 세포가 확장될 수 있는지를 시험함으로써 이러한 표적의 면역원성을 추가로 평가하였다. PBMC를 건강한 공여체로부터 획득하였고 분취량을 수지상 세포로의 후속 분화를 위해 단핵구 (CD14 양성 선택 키트, STEM세포 Technologies)를 단리하는데 사용하였다. 간단히 말해서, 단핵구의 수지상 세포로의 분화를 단리된 CD14 세포를 IL4 (10 ng/ml) 및 GM-CSF(800 IU/ml)로 3일 동안 배양하고 수지상 세포를 IL4(10 ng/ml), GM-CSF (800IU/ml), LPS (10 ng/ml), IFN-(100IU/ml), 및 LRR1, GRINA 및 ZNF670 HLA-A11 SVP (2.5 μM)으로 밤새 성숙시켜 수행하였다. 그런 다음, 이 단핵구 유래 수지상 세포를 EasySep CD8 T 세포 단리 키트, STEM세포 Technologies를 사용하여 동일한 공여체로부터의 PBMC의 다른 분취량으로부터 단리한 CD8+ T 세포와 배양하였다. 10일의 공동 배양 후, 항원 특이적 T 세포의 확장을 LRR1, GRINA 및 ZNF670 HLA-A11 SVP가 부가된 사량체 (PE 및 APC로 표지됨)로 염색하여 검출하였다. 도 26은 LRR1, GRINA 및 ZNF670에 대한 항원-특이적 T-세포에 대한 FACS 분석 결과를 보여주며; 이러한 항원 특이적 T 세포는 PE 및 APC에 대해 이중 양성인 것으로 예상된다. 이러한 SVP에 대한 항원 특이적 T 세포는 건강한 공여체의 자극되지 않은 PBMC에서 CD8+ T 세포에서 관찰되지 않고, SVP 특이적 T 세포는 SVP가 부가된 단핵구 유래 수지상 세포와 공동 배양하였을 때 관찰될 수 있다. 요약하면, LRR1, GRINA 및 ZNF670에 대한 항원 특이적 CD8 T 세포는 건강한 공여체에서 생성될 수 있었고, 이는 이러한 SVP가 면역원성임을 보여준다.
실시예 21
결장직장암 환자에서 공유 대체 스플라이싱된 변이체로부터의 HLA-A24 결합 펩타이드의 예측 및 스플라이스 변이체-특이적 CD8+ T 세포의 확인
HLA-A24에 결합할 수 있는 공유 대체 스플라이스 변이체로부터 유래된 펩타이드를 실시예 12에 기재된 바와 같이 확인하였다. 이 분석으로부터, HLA-A24에 결합할 수 있는 75개의 SVP를 확인하였다. 이러한 SVP는 환자 하위 그룹 간에 공유되는 55개의 스플라이스 현상에서 유래되었다.
CRC 환자가 HLA-A24에 결합하는 75개의 SVP 중 임의의 것을 표적화하는 CD8+ T 세포를 갖고 있는지를 결정하기 위해, PBMC의 MHC 사량체 염색을 사용하여 10명의 HLA-A24 양성 CRC 환자 (검증 코호트)의 새로운 코호트에서 CyTOF 스크리닝을 수행하였다 (이 스크리닝을 수행하기 위한 절차는 실시예 13에 기재된 것과 유사함). 총 8개의 스플라이스 변이체 펩타이드를 표적화하는 항원 특이적 CD8+ T 세포를 이 스크리닝에서 확인하였다. 도 27(a)는 이러한 SVA 표적 중 2개에 대한 펩타이드 서열, 항원 특이적 CD8+ T 세포의 빈도, 중앙값 PSI 변화, 엑손의 발생 및 좌표의 요약을 보여준다.
이러한 SVA는 하기 펩타이드 서열: SYHSIPSLPRF (서열번호 51) 및 KWPPATETL (서열번호 52)의 LRR1 및 MZF1의 비정상적 스플라이싱으로부터 유래되었다. 이러한 SVA는 모두 CRC 환자의 2가지 다른 코호트 (발견 및 검증 코호트)에서 검출되었다.
비정상적으로 스플라이싱된 엑손 또는 인트론 및 종양 관련 이소형의 좌표는 도 27(b)에 나와 있다. LRR1 SVA를 발생시킨 스플라이스 현상의 경우, 이는 엑손 (chr14:50074118-50074839:+ (서열번호 42))의 스키핑을 초래하는 엑손 스킵/포함 현상이다. 이는 엑손 (chr14:50069088-50069186:+@chr14:50080974-50081389:+)이 스키핑된 전사체를 생성시켰다. MZF1 SVA를 발생시킨 스플라이스 현상의 경우, 이는 인트론 (chr19:59,081,895-59,082,360:-(서열번호 53))의 보유를 초래하는 인트론 보유 현상이다. 이는 인트론 보유 현상 (chr19:59081711-59082796:-)을 포함하는 전사체를 생성시킨다. 위에서 기재한 모든 좌표는 GRCh37/hg19 게놈 조립을 기반으로 한다.
실시예 22
후보 항원 영역은 다른 HLA-대립인자에 결합하는 펩타이드를 생성할 수 있다.
LRR1 후보 항원 영역은 스플라이싱의 변화에 의해 유발된 프레임의 변화로 인해 상대적으로 크다 (실시예 1에 기재되고 도 5에 도시됨). LRR1 후보 항원 영역은 HLA-A11 및 HLA-A24에 결합하는 2개의 펩타이드 (서열번호 36 및 서열번호 51)를 생성한다 (도 23(d)). 동일한 스플라이스 현상의 이 두 SVP에 대한 항원 특이적 T 세포가 다른 CRC 환자에서 검출되었다 (도 20 및 도 27). 이는 또한 이 SVA가 다른 HLA 유형뿐만 아니라 환자 간에 공유되고 면역원성을 나타낸다.
실시예 23
CRC에서 MZF1 스플라이스 변이체 항원의 검증
HLA-A24(서열번호 52)에 결합하는 MZF1 스플라이스 변이체 펩타이드를 실시예 12 및 13에 기재된 바와 같이 확인하였다. MZF1의 비정상 스플라이싱은 37명의 CRC 환자 중 6명에서 관찰되었으며 중앙값 PSI 변화는 발견 코호트에서 종양 샘플과 정상 샘플 사이에 -0.228이었다 (도 27 (a)).
CRC 환자로부터의 개별 정상 및 종양 샘플의 PSI 값은 도 28 (a)에 나와 있다. 이 도면에는 접합 수가 충분한 샘플만 표시되어 있다. 도 28 (b)는 정상 및 종양 이상치 샘플 (실시예 1에 기재된 바와 같음)에 대한 사시미 그래프를 보여주고; 각각의 사시미 그래프는 이러한 샘플의 평균 판독 밀도를 나타낸다. 종양 샘플에 대한 사시미 그래프는 엑손 스키핑이 증가했음을 보여준다. 확인된 MZF1에 대한 종양 관련 스플라이스 현상은 인트론 (chr19: 59081895-59082360:-, 서열번호 53)의 보유를 보여준다.
CRC에서 MZF1 스플라이스 이소형의 존재를 실험적으로 검증하기 위해, 3명의 CRC 환자로부터의 세포주 및 조직 샘플 (대응하는 종양 및 인접 정상 샘플)에서 RT-PCR을 수행하였다 (도 28 (c)). 프라이머 (MZF1F: GCACTGCCCCCTGAGATCCAG (서열번호 54) 및 MZF1R: CTTTCACCTGCAGGCCCAGTG (서열번호 55))를 어느 MZF1 스플라이스 이소형이 발현되는지 확인하기 위해 측접 영역에 설계하였다. 이러한 프라이머는 MZF1 대체 스플라이싱 현상에 측접하는 서열에 결합하고, 종양-관련 스플라이스 변이체는 737bp이다.
MZF1 종양-관련 스플라이스 변이체의 존재는 정상 결장 조직과 비교하여 다수의 CRC 세포주 (HCT15, HCT116, HT29, 및 SW480)에서 더욱 많이 발현되는 것으로 확인되었다 (도 28 (c)). 3명의 다른 CRC 환자로부터 대응하는 인접 정상 및 종양 조직으로부터 단리된 RNA를 사용하여, cDNA를 제조하고, MZF1 스플라이스 이소형을 검출하기 위한 RT-PCR에 사용하였다. 이러한 CRC 환자 중 한 명은 MZF1 종양-관련 스플라이스 이소형의 증가된 발현을 나타낸다 (도 28 (c)). 실시예 5에 기재된 바와 같이, 이 RT-PCR은 검출 또는 진단 목적으로 사용될 수 있다.
실시예 24
두경부 편평 세포 암종에서 공유 후보 항원 및 이의 동족 T 세포의 확인
두경부 편평 세포 암종 (HNSC) 1차 종양 샘플 (31) 및 대응하는 정상 샘플 (16)을 종양에 인접한 비악성 조직에서 채취하였고 이러한 샘플로 발견 코호트를 구성하였다. 심층 RNA 시퀀싱 (1억 쌍의 말단 판독결과) 및 rMAT를 사용한 mRNA 스플라이싱 분석 (스플라이스 접합에 매핑된 시퀀싱 판독결과만 분석에 사용됨)을 이러한 샘플에서 수행하여 종양 관련 대체 스플라이싱 현상을 확인하였다. 선택 기준 (적어도 20%의 스플라이스 변화 (△PSI), 적어도 5명의 환자 발생 및 포함/스키핑에 대한 접합 수는 5 초과이어야 함)을 적용하여, 단백질 코딩 변화를 초래한 1418개의 스플라이스 현상 목록을 생성하였다.
HNSC 환자 하위 집단 또는 하위 그룹에서 공유되는 이러한 종양 관련 스플라이스 변이체를 후보 항원 영역의 확인에 사용하였다 (도 29(a) 및 도 29(b)). 그런 다음 이러한 종양 관련 스플라이스 변이체의 후보 항원 영역을 사용하여 공통 HLA 대립인자: HLA-A02; HLA-A11 and; HLA-A24에 결합할 수 있는 8 내지 11개 아미노산 길이의 펩타이드를 확인하였다 (도 29(c)). NetMHCpan 3 및 4를 이러한 8 내지 11개 아미노산 길이 펩타이드의 확인을 위해 사용하였다 (실시예 12에 기재됨). 이러한 종양 관련 스플라이스 현상 중 일부는 다른 HLA 대립인자에 결합하는 하나 이상의 펩타이드를 포함한다. 이는 CRC SVP/사량체 CyTOF 스크리닝 (실시예 22에 기재된 바와 같음)에서 확인된 LRR1 SVA에 대해 유사하게 관찰되며, 이는 후보 항원 영역을 확인하는 유용성을 강조한다.
실시예 25
결장직장암에서 확인된 공유 항원은 또한 두경부 편평 세포 암종에도 존재한다
HNSC에 존재하는 종양 관련 스플라이스 변이체를 상호-참조하면 초기에 CRC SVP/사량체 CyTOF 스크리닝에서 확인된 CAMKK1, LRR1 및 GRINA SVP (서열번호 35, 서열번호 36, 서열번호 51 및 서열번호 38) (실시예 13 및 실시예 21에 기재된 바와 같음)는 HNSC에도 존재한다. HNSC 환자에서 이러한 SVA에 대한 PSI의 발생 및 변화는 도 30에 나와 있다.
HNSC 환자의 개별 정상 및 종양 샘플에 대한 PSI 값 및 HNSC 환자의 CAMKK1에 대한 사시미 그래프는 도 22(f) 및 도 22(g)에 나와 있다. CAMKK1에 대한 종양 관련 스플라이스 변이체를 HNSC 환자로부터 유래된 세포주에서도 검출할 수 있었다 (도 22(h)). HNSC 환자의 개별 정상 및 종양 샘플에 대한 PSI 값과 HNSC 환자의 LRR1에 대한 사시미 그래프는 도 23(e) 및 도 23(f)에 나와 있다. LRR1에 대한 종양 관련 스플라이스 변이체를 HNSC 환자로부터 유래된 세포주에서도 검출할 수 있었다 (도 23(g)). HNSC 환자의 개별 정상 및 종양 샘플에 대한 PSI 값과 HNSC 환자의 GRINA에 대한 사시미 그래프는 도 25(d) 및 도 25(e)에 나와 있다. GRINA에 대한 종양 관련 스플라이스 변이체를 HNSC 환자로부터 유래된 세포주에서도 검출할 수 있었다 (도 25(f)). 이 세 가지 SVA를 모두 두 가지 다른 암 유형에서 검출하였다.
실시예 26
환자에서 스플라이스 변이체 항원 (SVA) 양성 암의 특성화 및/또는 치료.
재발성/난치성 또는 전이성 암이 있는 환자는 MARK3과 같은 스플라이스 변이체 항원을 발현할 수 있다. 예를 들어, 암 조직의 샘플을 MARK3의 발현에 대해 시험할 수 있다. 이를 실시예 5에 기재된 바와 같이 RT-PCR에 의해 수행할 수 있다. 환자를 또한 HLA (예를 들어, HLA-A11)의 발현에 대해 시험할 수 있다.
환자의 치료를 실시예 6에 기재된 바와 같이 환자로부터 스플라이스 변이체 항원-특이적 T 림프구 (예를 들어, MARK3-특이적 T 림프구)의 확장 및 이러한 확장된 T 림프구를 환자에게 다시 투여함으로써 수행할 수 있다.
이러한 T 림프구를 투여하기 전에, 환자를 사이클로포스포사미드 및 플루다라빈으로 치료할 수 있다.
다른 스플라이스 변이체 항원 (예컨대 NBPF9, PARD3, ZC3HAV1, YAF2, CAMKK1, LRR1, ZNF670, GRINA 또는 MZF1)을 발현하는 재발성/난치성 또는 전이성 암이 있는 환자를 유사하게 특성화하고/거나 치료할 수 있다.
참조문헌
Figure pct00003
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Phe Thr Asp Phe Asp 145 150 155 160 Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr 165 170 175 Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser 180 185 190 Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe 195 200 205 Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser 210 215 220 Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn 225 230 235 240 Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu 245 250 255 Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser 260 265 270 <210> 23 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TRBV7-9*01 AA sequence <400> 23 Met Gly Thr Ser Leu Leu Cys Trp Met Ala Leu Cys Leu Leu Gly Ala 1 5 10 15 Asp His Ala Asp Thr Gly Val Ser Gln Asn Pro Arg His Lys Ile Thr 20 25 30 Lys Arg Gly Gln Asn Val Thr Phe Arg Cys Asp Pro Ile Ser Glu His 35 40 45 Asn Arg Leu Tyr Trp Tyr Arg Gln Thr Leu Gly Gln Gly Pro Glu Phe 50 55 60 Leu Thr Tyr Phe Gln Asn Glu Ala Gln Leu Glu Lys Ser Arg Leu Leu 65 70 75 80 Ser Asp Arg Phe Ser Ala Glu Arg Pro Lys Gly Ser Phe Ser Thr Leu 85 90 95 Glu Ile Gln Arg Thr Glu Gln Gly Asp Ser Ala Met Tyr Leu 100 105 110 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TRAJ1-2*01 AA sequence <400> 24 Gly Ser Gly Thr Arg Leu Thr Val Val 1 5 <210> 25 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 AA sequence <400> 25 Ser Glu His Asn Arg 1 5 <210> 26 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 AA sequence <400> 26 Phe Gln Asn Glu Ala 1 5 <210> 27 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 nucleotide sequence <400> 27 tgtgccagca gctccccccg ggttggctat ggctacacct tc 42 <210> 28 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 AA sequence <400> 28 Cys Ala Ser Ser Ser Pro Arg Val Gly Tyr Gly Tyr Thr Phe 1 5 10 <210> 29 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MARK3 TRB variable region AA sequence <400> 29 Met Gly Thr Ser Leu Leu Cys Trp Met Ala Leu Cys Leu Leu Gly Ala 1 5 10 15 Asp His Ala Asp Thr Gly Val Ser Gln Asn Pro Arg His Lys Ile Thr 20 25 30 Lys Arg Gly Gln Asn Val Thr Phe Arg Cys Asp Pro Ile Ser Glu His 35 40 45 Asn Arg Leu Tyr Trp Tyr Arg Gln Thr Leu Gly Gln Gly Pro Glu Phe 50 55 60 Leu Thr Tyr Phe Gln Asn Glu Ala Gln Leu Glu Lys Ser Arg Leu Leu 65 70 75 80 Ser Asp Arg Phe Ser Ala Glu Arg Pro Lys Gly Ser Phe Ser Thr Leu 85 90 95 Glu Ile Gln Arg Thr Glu Gln Gly Asp Ser Ala Met Tyr Leu Cys Ala 100 105 110 Ser Ser Ser Pro Arg Val Gly Tyr Gly Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr 115 120 125 Arg Leu Thr Val Val 130 <210> 30 <211> 312 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MARK3 TRB AA sequence <400> 30 Met Gly Thr Ser Leu Leu Cys Trp Met Ala Leu Cys Leu Leu Gly Ala 1 5 10 15 Asp His Ala Asp Thr Gly Val Ser Gln Asn Pro Arg His Lys Ile Thr 20 25 30 Lys Arg Gly Gln Asn Val Thr Phe Arg Cys Asp Pro Ile Ser Glu His 35 40 45 Asn Arg Leu Tyr Trp Tyr Arg Gln Thr Leu Gly Gln Gly Pro Glu Phe 50 55 60 Leu Thr Tyr Phe Gln Asn Glu Ala Gln Leu Glu Lys Ser Arg Leu Leu 65 70 75 80 Ser Asp Arg Phe Ser Ala Glu Arg Pro Lys Gly Ser Phe Ser Thr Leu 85 90 95 Glu Ile Gln Arg Thr Glu Gln Gly Asp Ser Ala Met Tyr Leu Cys Ala 100 105 110 Ser Ser Ser Pro Arg Val Gly Tyr Gly Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr 115 120 125 Arg Leu Thr Val Val Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu Val 130 135 140 Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala 145 150 155 160 Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu 165 170 175 Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp 180 185 190 Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys 195 200 205 Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg 210 215 220 Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp 225 230 235 240 Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala 245 250 255 Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser Tyr Gln 260 265 270 Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys 275 280 285 Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met 290 295 300 Val Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly 305 310 <210> 31 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NBPF9 splice variant antigen <400> 31 Ser Ser Phe Tyr Ala Leu Glu Glu Lys 1 5 <210> 32 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PARD3 splice variant antigen <400> 32 Ser Gln Leu Asp Phe Val Lys Thr Arg Lys 1 5 10 <210> 33 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ZC3HAV splice variant antigen <400> 33 Leu Thr Met Ala Val Lys Ala Glu Lys 1 5 <210> 34 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> YAF2 splice variant antigen <400> 34 Val Ile Val Ser Ala Ser Arg Thr Lys 1 5 <210> 35 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CAMKK1 splice variant antigen <400> 35 Val Thr Ser Pro Ser Arg Arg Ser Lys 1 5 <210> 36 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LRR1 splice variant antigen <400> 36 Ser Leu Pro Arg Phe Gly Tyr Arg Lys 1 5 <210> 37 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ZNF670 splice variant antigen <400> 37 Ser Cys Val Ser Pro Ser Ser Glu Leu Lys 1 5 10 <210> 38 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GRINA splice variant antigen <400> 38 Ser Ile Arg Gln Ala Phe Ile Arg Lys 1 5 <210> 39 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAMKK1 skipped exon <400> 39 tgtttgacct cctgagaaag gg 22 <210> 40 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAMKK1F <400> 40 gaagctggac cacgtgaatg tg 22 <210> 41 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAMKK1R <400> 41 agtactcgag gcccaggatg ac 22 <210> 42 <211> 722 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LRR1 skipped exon <400> 42 gccatttcca gcagtttaaa aggtttcctt tcagctatga gactggctca tagaggctgt 60 aatgttgata caccagtttc aacgctcaca ccagtgaaga cttcagaatt tgaaaacttt 120 aaaactaaaa tggttatcac atccaaaaaa gactatcctc taagtaagaa ttttccatat 180 tccttggaac atcttcagac ttcttactgt gggcttgtcc gagttgatat gcgtatgctt 240 tgcttaaaaa gccttaggaa attagacttg agtcacaacc atataaaaaa gcttccagct 300 acaattggag acctcataca ccttcaagaa cttaacctga atgacaatca cttggagtca 360 tttagtgtag ccttgtgtca ttctacactc cagaagtcac ttcggagttt ggacctcagc 420 aagaacaaaa tcaaggcact ccctgtgcag ttttgccagc tccaggaact taagaattta 480 aaacttgacg ataatgaatt gattcaattt ccttgcaaga taggacaact aataaacctt 540 cgctttttgt cagcagctcg aaataagctt ccatttttgc ctagtgaatt tagaaattta 600 tcccttgaat acttggatct ttttggaaat acttttgaac aaccaaaagt ccttccagta 660 ataaagctgc aagcaccatt aactttattg gaatcttctg cacgaaccat attacataat 720 ag 722 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LRR1F <400> 43 tgaggggaaa gccactgttc 20 <210> 44 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LRR1R <400> 44 ttcagacaga atcttccaca aacac 25 <210> 45 <211> 98 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ZNF670 skipped exon <400> 45 ccatgtgaag atgtgcttgc ttcccctttg ccttctgcca tgattctaag tttcctgagg 60 cctccccaga agcagaagca tgtaaagccc acagaacc 98 <210> 46 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ZNF670F <400> 46 ttcattccaa aaagtgatgc tgag 24 <210> 47 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ZNF670R <400> 47 caacatggaa gaacaatctt cctttc 26 <210> 48 <211> 440 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GRINA1 skipped exon <400> 48 gtgggtaggg gcatctccaa ggcggtgggg gctgtggctc ccagcggatg actctgagcg 60 gctccttccc caggtgttcc tagtgctgac cttgcagctg tcggtgaccc tgtccacggt 120 gtctgtgttc acttttgttg cggaggtgaa gggctttgtc cgggagaatg tctggaccta 180 ctatgtctcc tatgctgtct tcttcatctc tctcatcgtc ctcagctgtt gtggggactt 240 ccggcgaaag cacccctgga accttgttgc actggtaacc cccaaacctg agcctctgtg 300 cctgggtccg gccatgcagt cccacacgcc cactcttccg ggcctggtca ccgtggttct 360 ccttgtgctc atgaggcagg ggccggcagg ggtggcatgg gggcacacac ccaaggtcag 420 cctgtgtctc ccaactgcag 440 <210> 49 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GRINAF <400> 49 ggtcccccat cctactatga caac 24 <210> 50 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GRINAR <400> 50 gaatggcgaa gatgaagagc ac 22 <210> 51 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LRR1 splice variant antigen <400> 51 Ser Tyr His Ser Ile Pro Ser Leu Pro Arg Phe 1 5 10 <210> 52 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MZF1 spliced variant antigen <400> 52 Lys Trp Pro Pro Ala Thr Glu Thr Leu 1 5 <210> 53 <211> 466 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MZF1 splice variant antigen <400> 53 gtgagtgagt gtccacgagt ggggttcagg actggagcat catccagctc ggcctcaccc 60 tgggcagcac cacgctttgc cagacacacg ttctcccttg tggtacagaa gtggccacct 120 gcaacagaga ccctgtgcaa ggctgcccag ggcagaggga ttccagggcc agactcccca 180 gcccattcct gcatcacctg cagtcacgtg gacataggag ctgcaggcta ggggaatatg 240 gggaaggtac tggaaggcca cgatgtcaga gcaggggagg gactgcaggt ggtcccttca 300 ttctttgctc agggcctagg ggaggtaggt ccttggagga cctagtcagt aggtatttac 360 aaggcaggcc cctgggatcc tacagtggga tgggcaccca caaaccccag gttgcggcca 420 gccttactct ctggtaggac ttctgatggt gggggcacct ccccag 466 <210> 54 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MZF1F <400> 54 gcactgcccc ctgagatcca g 21 <210> 55 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MZF1R <400> 55 ctttcacctg caggcccagt g 21 <210> 56 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Normal associated DNA sequence of CAMKK1 <400> 56 gtcctggatg acccagctga ggacaacctc tatttggtgt ttgacctcct gagaaagggg 60 cccgtcatgg aagtgccctg tgacaagccc ttctcggagg agcaagctcg cctctacctg 120 cgggacgtca tcctgggcct cgagtacttg cactgccaga agatcgtcca cagggacatc 180 aagccatcca acctgctcct gggggatgat gggcacgtga agatcgccga ctttggcgtc 240 agcaaccagt ttgaggggaa cgacgctcag ctgtccagca cggcgggaac cccagcattc 300 atggcccccg aggccatttc tgattccggc cagagcttca gtgggaag 348 <210> 57 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Normal protein sequence of CAMKK1 <400> 57 Val Leu Asp Asp Pro Ala Glu Asp Asn Leu Tyr Leu Val Phe Asp Leu 1 5 10 15 Leu Arg Lys Gly Pro Val Met Glu Val Pro Cys Asp Lys Pro Phe Ser 20 25 30 Glu Glu Gln Ala Arg Leu Tyr Leu Arg Asp Val Ile Leu Gly Leu Glu 35 40 45 Tyr Leu His Cys Gln Lys Ile Val His Arg Asp Ile Lys Pro Ser Asn 50 55 60 Leu Leu Leu Gly Asp Asp Gly His Val Lys Ile Ala Asp Phe Gly Val 65 70 75 80 Ser Asn Gln Phe Glu Gly Asn Asp Ala Gln Leu Ser Ser Thr Ala Gly 85 90 95 Thr Pro Ala Phe Met Ala Pro Glu Ala Ile Ser Asp Ser Gly Gln Ser 100 105 110 Phe Ser Gly Lys 115 <210> 58 <211> 326 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tumour associated DNA sequence of CAMKK1 <400> 58 gtcctggatg acccagctga ggacaacctc tatttgggcc cgtcatggaa gtgccctgtg 60 acaagccctt ctcggaggag caagctcgcc tctacctgcg ggacgtcatc ctgggcctcg 120 agtacttgca ctgccagaag atcgtccaca gggacatcaa gccatccaac ctgctcctgg 180 gggatgatgg gcacgtgaag atcgccgact ttggcgtcag caaccagttt gaggggaacg 240 acgctcagct gtccagcacg gcgggaaccc cagcattcat ggcccccgag gccatttctg 300 attccggcca gagcttcagt gggaag 326 <210> 59 <211> 65 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tumour associated protein sequence of CAMKK1 <400> 59 Val Leu Asp Asp Pro Ala Glu Asp Asn Leu Tyr Leu Gly Pro Ser Trp 1 5 10 15 Lys Cys Pro Val Thr Ser Pro Ser Arg Arg Ser Lys Leu Ala Ser Thr 20 25 30 Cys Gly Thr Ser Ser Trp Ala Ser Ser Thr Cys Thr Ala Arg Arg Ser 35 40 45 Ser Thr Gly Thr Ser Ser His Pro Thr Cys Ser Trp Gly Met Met Gly 50 55 60 Thr 65 <210> 60 <211> 993 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Normal associated DNA sequence of LRR1 <400> 60 gagcctcctg tggatatctg tctaagtaag gccatttcca gcagtttaaa aggtttcctt 60 tcagctatga gactggctca tagaggctgt aatgttgata caccagtttc aacgctcaca 120 ccagtgaaga cttcagaatt tgaaaacttt aaaactaaaa tggttatcac atccaaaaaa 180 gactatcctc taagtaagaa ttttccatat tccttggaac atcttcagac ttcttactgt 240 gggcttgtcc gagttgatat gcgtatgctt tgcttaaaaa gccttaggaa attagacttg 300 agtcacaacc atataaaaaa gcttccagct acaattggag acctcataca ccttcaagaa 360 cttaacctga atgacaatca cttggagtca tttagtgtag ccttgtgtca ttctacactc 420 cagaagtcac ttcggagttt ggacctcagc aagaacaaaa tcaaggcact ccctgtgcag 480 ttttgccagc tccaggaact taagaattta aaacttgacg ataatgaatt gattcaattt 540 ccttgcaaga taggacaact aataaacctt cgctttttgt cagcagctcg aaataagctt 600 ccatttttgc ctagtgaatt tagaaattta tcccttgaat acttggatct ttttggaaat 660 acttttgaac aaccaaaagt ccttccagta ataaagctgc aagcaccatt aactttattg 720 gaatcttctg cacgaaccat attacataat aggattccat atggctctca tatcattcca 780 ttccatctct gccaagattt ggataccgca aaaatttgtg tttgtggaag attctgtctg 840 aactctttca ttcaaggaac tactaccatg aatctgcatt ctgttgccca cactgtggtc 900 ttagtagata atttgggtgg tactgaagca cctattatct cttatttctg ttctctaggc 960 tgttatgtta attcctctga tatgttaaag taa 993 <210> 61 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Normal protein sequence of LRR1 <400> 61 Glu Pro Pro Val Asp Ile Cys Leu Ser Lys Ala Ile Ser Ser Ser Leu 1 5 10 15 Lys Gly Phe Leu Ser Ala Met Arg Leu Ala His Arg Gly Cys Asn Val 20 25 30 Asp Thr Pro Val Ser Thr Leu Thr Pro Val Lys Thr Ser Glu Phe Glu 35 40 45 Asn Phe Lys Thr Lys Met Val Ile Thr Ser Lys Lys Asp Tyr Pro Leu 50 55 60 Ser Lys Asn Phe Pro Tyr Ser Leu Glu His Leu Gln Thr Ser Tyr Cys 65 70 75 80 Gly Leu Val Arg Val Asp Met Arg Met Leu Cys Leu Lys Ser Leu Arg 85 90 95 Lys Leu Asp Leu Ser His Asn His Ile Lys Lys Leu Pro Ala Thr Ile 100 105 110 Gly Asp Leu Ile His Leu Gln Glu Leu Asn Leu Asn Asp Asn His Leu 115 120 125 Glu Ser Phe Ser Val Ala Leu Cys His Ser Thr Leu Gln Lys Ser Leu 130 135 140 Arg Ser Leu Asp Leu Ser Lys Asn Lys Ile Lys Ala Leu Pro Val Gln 145 150 155 160 Phe Cys Gln Leu Gln Glu Leu Lys Asn Leu Lys Leu Asp Asp Asn Glu 165 170 175 Leu Ile Gln Phe Pro Cys Lys Ile Gly Gln Leu Ile Asn Leu Arg Phe 180 185 190 Leu Ser Ala Ala Arg Asn Lys Leu Pro Phe Leu Pro Ser Glu Phe Arg 195 200 205 Asn Leu Ser Leu Glu Tyr Leu Asp Leu Phe Gly Asn Thr Phe Glu Gln 210 215 220 Pro Lys Val Leu Pro Val Ile Lys Leu Gln Ala Pro Leu Thr Leu Leu 225 230 235 240 Glu Ser Ser Ala Arg Thr Ile Leu His Asn Arg Ile Pro Tyr Gly Ser 245 250 255 His Ile Ile Pro Phe His Leu Cys Gln Asp Leu Asp Thr Ala Lys Ile 260 265 270 Cys Val Cys Gly Arg Phe Cys Leu Asn Ser Phe Ile Gln Gly Thr Thr 275 280 285 Thr Met Asn Leu His Ser Val Ala His Thr Val Val Leu Val Asp Asn 290 295 300 Leu Gly Gly Thr Glu Ala Pro Ile Ile Ser Tyr Phe Cys Ser Leu Gly 305 310 315 320 Cys Tyr Val Asn Ser Ser Asp Met Leu Lys 325 330 <210> 62 <211> 271 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tumour associated DNA sequence of LRR1 <400> 62 gagcctcctg tggatatctg tctaagtaag gattccatat ggctctcata tcattccatt 60 ccatctctgc caagatttgg ataccgcaaa aatttgtgtt tgtggaagat tctgtctgaa 120 ctctttcatt caaggaacta ctaccatgaa tctgcattct gttgcccaca ctgtggtctt 180 agtagataat ttgggtggta ctgaagcacc tattatctct tatttctgtt ctctaggctg 240 ttatgttaat tcctctgata tgttaaagta a 271 <210> 63 <211> 62 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tumour associated protein sequence of LRR1 <400> 63 Glu Pro Pro Val Asp Ile Cys Leu Ser Lys Asp Ser Ile Trp Leu Ser 1 5 10 15 Tyr His Ser Ile Pro Ser Leu Pro Arg Phe Gly Tyr Arg Lys Asn Leu 20 25 30 Cys Leu Trp Lys Ile Leu Ser Glu Leu Phe His Ser Arg Asn Tyr Tyr 35 40 45 His Glu Ser Ala Phe Cys Cys Pro His Cys Gly Leu Ser Arg 50 55 60 <210> 64 <211> 515 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Normal associated DNA sequence of ZNF670 <400> 64 ttttgtcttc ttatcttact gaagacattt tgccagagca gggcctgcaa gtttcattcc 60 aaaaagtgat gctgagaaga tatgaaagat gttgtcttga gaaattacgc ttaaggaatg 120 actgggaaat tgtggccatg tgaagatgtg cttgcttccc ctttgccttc tgccatgatt 180 ctaagtttcc tgaggcctcc ccagaagcag aagcatgtaa agcccacaga accggtccag 240 tcgtcgacca tcgagctgct ttgaagaccc tgcggaggtt ccgtcgctgc ttgaacacag 300 tgcctggact ccctgctccg tgaggcgaat ttacaccggg tccagctgcg tcagcccgag 360 ttctgaatta aaacatgcct cccacagaat ctatttctga tgaatatgaa aggaagattg 420 ttcttccatg ttggttttta ttgagatatc tctttttttc ccttttcatt tggttgtcct 480 aactccatga atagaaaaga aaatgtatta attca 515 <210> 65 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Normal protein sequence of ZNF670 <400> 65 Leu Ser Ser Tyr Leu Thr Glu Asp Ile Leu Pro Glu Gln Gly Leu Gln 1 5 10 15 Val Ser Phe Gln Lys Val Met Leu Arg Arg Tyr Glu Arg Cys Cys Leu 20 25 30 Glu Lys Leu Arg Leu Arg Asn Asp Trp Glu Ile Val Ala Met 35 40 45 <210> 66 <211> 417 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tumour associated DNA sequence of ZNF670 <400> 66 ttttgtcttc ttatcttact gaagacattt tgccagagca gggcctgcaa gtttcattcc 60 aaaaagtgat gctgagaaga tatgaaagat gttgtcttga gaaattacgc ttaaggaatg 120 actgggaaat tgtggggtcc agtcgtcgac catcgagctg ctttgaagac cctgcggagg 180 ttccgtcgct gcttgaacac agtgcctgga ctccctgctc cgtgaggcga atttacaccg 240 ggtccagctg cgtcagcccg agttctgaat taaaacatgc ctcccacaga atctatttct 300 gatgaatatg aaaggaagat tgttcttcca tgttggtttt tattgagata tctctttttt 360 tcccttttca tttggttgtc ctaactccat gaatagaaaa gaaaatgtat taattca 417 <210> 67 <211> 99 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tumour associated protein sequence of ZNF670 <400> 67 Leu Ser Ser Tyr Leu Thr Glu Asp Ile Leu Pro Glu Gln Gly Leu Gln 1 5 10 15 Val Ser Phe Gln Lys Val Met Leu Arg Arg Tyr Glu Arg Cys Cys Leu 20 25 30 Glu Lys Leu Arg Leu Arg Asn Asp Trp Glu Ile Val Gly Ser Ser Arg 35 40 45 Arg Pro Ser Ser Cys Phe Glu Asp Pro Ala Glu Val Pro Ser Leu Leu 50 55 60 Glu His Ser Ala Trp Thr Pro Cys Ser Val Arg Arg Ile Tyr Thr Gly 65 70 75 80 Ser Ser Cys Val Ser Pro Ser Ser Glu Leu Lys His Ala Ser His Arg 85 90 95 Ile Tyr Phe

Claims (50)

  1. 의학적 병태(medical condition)를 특성화 및/또는 치료하기 위한 하나 이상의 공유 후보 항원(shared candidate antigen)을 확인하는 방법으로서, 본 방법은
    (i) 의학적 병태를 가진 환자의 제1 코호트(cohort)로부터 시험 샘플에 대한 전사체 데이터(transcriptomic data)를 획득하는 단계;
    (ii) 참조 샘플의 세트에 대한 참조 전사체 데이터를 획득하는 단계;
    (iii) 전사체 데이터를 참조 전사체 데이터와 비교함으로써, 참조 샘플과 비교하여 시험 샘플의 서브세트(subset)의 각 샘플에서 더 많이 전사되는 하나 이상의 스플라이스 변이체(splice variant)를 결정하는 단계;
    (iv) 각각의 상기 공유 스플라이스 변이체에 대해, 공유 스플라이스 변이체의 아미노산 번역에서 발생하지만, 참조 샘플에서 전사되는 동일한 유전자의 상응하는 스플라이스 변이체의 아미노산 번역에서는 발생하지 않는 하나 이상의 아미노산 서열을 결정하는 단계; 및
    (v) 하나 이상의 공유 아미노산 서열 또는 이의 일부의 HLA 결합을 예측하여, 하나 이상의 공유 후보 항원으로서, 하나 이상의 공유 아미노산 서열을 확인하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 각각의 상기 공유 스플라이스 변이체에 대해, 단계 (iv) 이전에, 동일한 유전자의 하나 이상의 상응하는 스플라이스 변이체에 대한 제1 공유 스플라이스 변이체의 판독 프레임에 변화가 있는지를 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 (iv)는 공유 스플라이스 변이체와 동일한 유전자의 상응하는 스플라이스 변이체 사이의 비중첩(non-overlapping) 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 공유 스플라이스 변이체를 포함하는 서브세트는 임계값 수(threshold number)를 초과하거나 임계값 백분율을 초과하는 시험 샘플을 포함하는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 소정의 비율을 초과하는 제1 코호트의 환자에서 발생하는 하나 이상의 공통 HLA 대립인자를 결정하는 단계로서, 단계 (v)는 하나 이상의 아미노산 서열로부터 다수의 후보 펩타이드를 생성하는 단계; 및 하나 이상의 공통 HLA 대립인자에 의해 인코딩된(encoded) 단백질에 대한 다수의 공유 후보 펩타이드의 결합을 예측하는 단계를 포함하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 참조 샘플의 세트는 환자의 제1 코호트로부터의 대응하는(matched) 정상 샘플을 포함하는, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 참조 샘플의 세트는 의학적 병태가 없는 대상체 코호트로부터의 샘플을 포함하는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 의학적 병태는 암인, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 의학적 병태는 위암 (gastric cancer), 두경부암 (head and neck cancer), 결장직장암 (colorectal cancer) 또는 간세포암 (hepatocellular cancer)인, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 환자의 제1 코호트는 특정 HLA 하위유형(subtype)인, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 의학적 병태는 환자의 그룹에 공통인, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 공유 후보 항원은 MARK3, NBPF9, PARD3, ZC3HAV1, YAF2, CAMKK1, LRR1, ZNG670, GRINA 또는 MZF1 스플라이스 변이체이고, HLA 대립인자는 HLA-A11 또는 HLA-A24인, 방법.
  13. 제12항에 있어서, 스플라이스 변이체는 서열번호 1, 31 내지 38, 51 또는 52 중 어느 하나에 대해 적어도 80% 서열 동일성(sequence identity)을 갖는 펩타이드, 또는 서열번호 1, 31 내지 38, 51 또는 52 중 어느 하나에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 펩타이드를 인코딩하는 핵산을 포함하는, 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 본 방법은 하나 이상의 공유 아미노산 서열의 HLA 결합을 검증하거나 시험하여 공유 후보 항원으로서, 하나 이상의 공유 아미노산 서열을 확인하는 단계를 포함하는, 방법.
  15. 공유 항원-T 림프구 쌍을 확인하는 방법으로서, 본 방법은
    a) 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 공유 후보 항원을 확인하는 단계;
    표지(label), 및 공유 후보 항원을 포함하는 펩타이드를 포함하는 하나 이상의 각각의 표지된 생체분자(biomolecule)를 제공하는 단계;
    b) 하나 이상의 표지된 생체분자를 의학적 병태를 갖는 환자로부터의 말초 혈액(peripheral blood)을 포함하는 하나 이상의 샘플과 접촉시키는 단계; 및
    c) 하나 이상의 샘플로부터, 상기 표지된 생체분자에 결합된 T 림프구를 확인하여 공유 항원-T 림프구 쌍을 확인하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  16. 제15항에 있어서, 표지된 생체분자는 HLA 다량체를 포함하는, 방법.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 각각의 공유 후보 항원을 포함하는 표지된 생체분자는 상이한 각각의 바코드(barcode)로 표지되는, 방법.
  18. 제17항에 있어서, 바코드는 중금속 바코드인, 방법.
  19. 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 의학적 병태를 갖는 각각의 환자는 환자의 제1 코호트와 중첩되지 않는 환자의 제2 코호트의 일부인, 방법.
  20. 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 본 방법은 T 림프구의 생물학적 기능을 시험하는 단계를 포함하는, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 본 방법은 T 림프구를 특성화하여 이것이 세포독성인지를 결정하고/거나 공유 항원이 면역원성인지를 시험하는 단계를 포함하는, 방법.
  22. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따라 확인된 하나 이상의 공유 후보 항원에 특이적으로 결합하는 T 림프구를 확인하는 방법으로서,
    (i) 표지 및 각각의 공유 후보 항원을 포함하는 하나 이상의 각각의 표지된 생체분자를 제공하는 단계;
    (ii) 하나 이상의 표지된 생체분자를 의학적 병태를 갖는 각각의 환자로부터의 말초 혈액을 포함하는 하나 이상의 샘플과 접촉시키는 단계; 및
    (iii) 하나 이상의 샘플로부터, 상기 표지된 생체분자에 결합된 T 림프구를 확인하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 표지된 생체분자에 결합된 T 림프구의 확인은 각각의 환자가 하나 이상의 공유 항원의 발현과 관련된 의학적 병태를 갖는 것으로 특성화하는, 방법.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 본 방법은 T 림프구의 생물학적 기능을 시험하는 단계를 포함하는, 방법.
  25. 제24항에 있어서, 본 방법은 T 림프구를 특성화하여 이것이 세포독성인지를 결정하고/거나 공유 항원이 면역원성인지를 시험하는 단계를 포함하는, 방법.
  26. 대상체의 의학적 병태를 특성화하는 방법으로서, 본 방법은 제15항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따라 확인된 하나 이상의 공유 항원의 수준을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 하나 이상의 공유 항원의 증가된 수준이 의학적 병태를 하나 이상의 공유 항원의 발현과 관련된 것으로 특성화하는 단계를 포함하는, 방법.
  27. 대상체(subject)의 의학적 병태를 치료하는 방법으로서, 본 방법은
    (a) 제15항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따라 확인된 하나 이상의 공유 항원의 수준을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 하나 이상의 공유 항원의 증가된 수준은 대상체의 의학적 병태를 하나 이상의 공유 항원의 발현과 관련된 것으로 특성화하는 단계, 및
    (b) 하나 이상의 공유 항원의 발현과 관련된 의학적 병태를 갖는 것으로 밝혀진 대상체를 치료하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  28. 대상체의 의학적 병태를 특성화하는 방법으로서, 본 방법은 제15항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따라 확인된 하나 이상의 공유 항원에 특이적으로 결합하는 T 림프구의 수준을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 T 림프구의 증가된 수준은 의학적 병태를 하나 이상의 공유 항원의 발현과 관련된 것으로 특성화하는 단계를 포함하는, 방법.
  29. 대상체의 의학적 병태를 치료하는 방법으로서, 본 방법은 a) 제15항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따라 확인된 하나 이상의 공유 항원에 특이적으로 결합하는 T 림프구의 수준을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 T 림프구의 증가된 수준은 의학적 병태를 하나 이상의 공유 항원의 발현과 관련된 것으로 특성화하는 단계; 및 b) 하나 이상의 공유 항원의 발현과 관련된 의학적 병태를 갖는 것으로 밝혀진 대상체를 치료하는 단계를 포함하는, 방법.
  30. 대상체의 의학적 병태를 치료하는 방법으로서, 본 방법은
    (a) 제15항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따라 확인된 하나 이상의 공유 항원에 특이적으로 결합하는 T 림프구의 수준을 결정하는 단계로서, 참조와 비교하여 T 림프구의 증가된 수준은 의학적 병태를 하나 이상의 공유 항원을 발현하는 것으로 특성화하는 단계;
    (b) 생체외에서 T 림프구의 집단(population)을 단리 및 확장하는 단계; 및
    (c) 하나 이상의 공유 항원을 발현하는 것으로 밝혀진 대상체의 의학적 병태를 치료하기 위해 대상체에게 T 림프구의 확장된 집단을 투여하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  31. 대상체의 의학적 병태를 치료하는 방법으로서, 본 방법은
    (a) 의학적 병태를 앓고 있는 대상체에서 제15항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따라 확인된 하나 이상의 공유 항원에 특이적으로 결합하는 T 림프구의 집단을 단리하고, 생체외에서 T 림프구의 집단을 확장하는 단계; 및
    (b) 대상체의 의학적 병태를 치료하기 위해 대상체에게 T 림프구의 확장된 집단을 투여하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  32. 제15항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따라 확인된 하나 이상의 공유 항원 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 면역조절 조성물(immunomodulatory composition).
  33. 제32항에 있어서, 공유 항원은 서열번호 1, 31 내지 38, 51 또는 52 중 어느 하나에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 펩타이드이고, 서열번호 1, 31 내지 38, 51 또는 52 중 어느 하나에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 펩타이드를 인코딩하는 핵산인, 조성물.
  34. 대상체에서 면역 반응을 자극하는 방법으로서, 본 방법은 대상체에서 면역 반응을 자극하기에 충분한 조건 하에 충분한 시간 동안 제32항 또는 제33항에 따른 면역조절 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  35. 제15항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따라 확인된 공유 항원-T 림프구 쌍으로서, 공유 항원은 MARK3, NBPF9, PARD3, ZC3HAV1, YAF2, CAMKK1, LRR1, ZNG670, GRINA 또는 MZF1 스플라이스 변이체이고, HLA 하위유형은 HLA-A11 또는 HLA-A24이고, T 림프구는 공유 항원에 결합하는, 공유 항원-T 림프구 쌍.
  36. 공유 항원에 특이적으로 결합하는 T 림프구의 존재를 검출하거나 상기 T 림프구의 수준을 결정하는데 사용하기 위한, 제15항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따라 확인된 공유 항원에 결합된 HLA 분자를 포함하는 표지된 생체분자.
  37. 제36항에 있어서, 공유 항원은 서열번호 1, 31 내지 38, 51 또는 52 중 어느 하나에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 펩타이드이고, 서열번호 1, 31 내지 38, 51 또는 52 중 어느 하나에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 펩타이드를 인코딩하는 핵산이고, HLA는 HLA-A11 또는 HLA-A24인, 표지된 생체분자.
  38. 제15항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따라 확인된 공유 항원에 특이적으로 결합하는 항체로서, 상기 공유 항원은 HLA 분자에 결합되는, 항체.
  39. 제38항에 있어서, 공유 항원은 서열번호 1, 31 내지 38, 51 또는 52 중 어느 하나에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 펩타이드이고, 서열번호 1, 31 내지 38, 51 또는 52 중 어느 하나에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 펩타이드를 인코딩하는 핵산인, 항체.
  40. 제15항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 공유 항원에 결합하는 T-세포 수용체 (TCR)로서, 상기 공유 항원은 HLA 분자에 결합되는, T-세포 수용체 (TCR).
  41. 제40항에 있어서, 공유 항원은 서열번호 1, 31 내지 38, 51 또는 52 중 어느 하나에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 펩타이드, 또는 서열번호 1, 31 내지 38, 51 또는 52 중 어느 하나에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 펩타이드를 인코딩하는 핵산인, TCR.
  42. 제40항 또는 제41항에 있어서, TCR은 a) 서열번호 21에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 TCRα 사슬 가변 도메인, 및 b) 서열번호 29에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 TCRβ 사슬 가변 도메인을 포함하는, TCR.
  43. 제40항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, TCR은 a) i) 서열번호 17의 CDR1 서열, ii) 서열번호 18의 CDR2 서열 및 iii) 서열번호 20의 CDR3 서열을 포함하는 TCRα 사슬 도메인; 및 b) i) 서열번호 25의 CDR1 서열, ii) 서열번호 26의 CDR2 서열 및/또는 iii) 서열번호 28의 CDR3 서열을 포함하는 TCRβ 사슬 도메인을 포함하는, TCR.
  44. 제40항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, TCR은 가용화된 TCR인, TCR.
  45. 제40항 내지 제43항 중 어느 한 항의 T-세포 수용체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조작된 면역 세포(engineered immune cell)로서, 조작된 면역 세포는 공유 항원 또는 이의 단편에 특이적으로 결합할 수 있고, 공유 항원 또는 이의 단편은 HLA 분자에 결합되는, 조작된 면역 세포.
  46. 대상체의 의학적 병태를 치료하는 방법으로서, 본 방법은 제44항의 가용화된 TCR 또는 제45항의 조작된 면역 세포를 대상체에서 의학적 병태를 치료하는 조건 하에 충분한 시간 동안 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  47. 항체를 생성하는 방법으로서, 본 방법은
    (a) 제15항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따라 확인된 공유 항원으로 동물을 면역화하는 단계;
    (b) 항원에 특이적으로 결합하는, B 세포를 동물로부터 확인 및/또는 단리하는 단계; 및
    (c) 상기 B 세포에 의해 발현되는 항체를 생성하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  48. 제38항 또는 제39항의 항체 또는 제44항의 가용성 TCR, 또는 제45항의 조작된 면역 세포, 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
  49. 대상체의 의학적 병태를 치료하는 방법으로서, 본 방법은 제48항의 약제학적 조성물을 대상체에서 의학적 병태를 치료하는 조건 하에 충분한 시간 동안 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  50. 공유 항원-T 림프구 쌍을 확인하는 방법으로서, 본 방법은
    (i) 의학적 병태를 갖는 환자의 제1 코호트로부터 시험 샘플에 대한 전사체 데이터를 획득하는 단계로서, 이 코호트는 다수의 환자를 포함하는 단계;
    (ii) 참조 샘플의 세트에 대한 참조 전사체 데이터를 획득하는 단계;
    (iii) 전사체 데이터를 참조 전사체 데이터와 비교함으로써, 참조 샘플과 비교하여 시험 샘플의 서브세트의 각 샘플에서 더 많이 전사되는 하나 이상의 스플라이스 변이체를 결정하는 단계,
    (iv) 각각의 상기 공유 스플라이스 변이체에 대해, 스플라이스 변이체의 아미노산 번역에서 발생하지만 참조 샘플에서 전사되는 동일한 유전자의 상응하는 스플라이스 변이체의 아미노산 번역에서는 발생하지 않는 하나 이상의 아미노산 서열을 결정하는 단계;
    (v) 하나 이상의 공유 아미노산 서열 또는 이의 일부의 HLA 결합을 예측하여, 하나 이상의 공유 후보 항원으로서, 하나 이상의 아미노산 서열을 확인하는 단계;
    (vi) 표지, 및 공유 후보 항원을 포함하는 펩타이드를 포함하는 하나 이상의 표지된 생체분자를 제공하는 단계;
    (vii) 하나 이상의 표지된 생체분자를 의학적 병태를 갖는 환자로부터의 말초 혈액을 포함하는 하나 이상의 샘플과 접촉시키는 단계; 및
    (viii) 하나 이상의 샘플로부터, 상기 표지된 생체분자에 결합된 T 림프구를 확인하여 공유 항원-T 림프구 쌍을 확인하는 단계
    를 포함하는, 방법.
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