KR20220100547A

KR20220100547A - 골관절염 치료를 위한 건조된 세포 분비물 기반 치료제

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Publication number: KR20220100547A
Application number: KR1020220003589A
Authority: KR
Inventors: 황석연; 이윤우; 고희승; 박희정; 김정욱
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2021-01-08
Filing date: 2022-01-10
Publication date: 2022-07-15
Also published as: US20240066069A1; EP4275692A9; EP4275692A2; WO2022149937A2; WO2022149937A3

Abstract

본 발명은 PCA(Precipitation with Compressed Fluid Anti-solvent) 건조 공정을 이용한 배양액 유래성분 또는 결정화된 배양액의 제조방법, 상기 방법으로 제조된 배양액 유래성분 또는 결정화된 배양액을 이용하여 연골세포를 회복시키는 방법, 상기 배양액 유래성분 또는 결정화된 배양액을 이용한 연골세포를 회복시키는 방법을 이용하여 골관절염이 발병된 개체를 치료하는 방법, 상기 배양액 유래성분 또는 결정화된 배양액을 이용하여 골관절염이 발병된 개체를 치료하는 방법 및 골관절염 치료를 위한 배양액 유래성분 또는 결정화된 배양액의 용도에 관한 것이다. 본 발명에서 제공하는 배양액 유래성분은 염증성 환경 완화 및 이화작용 관련 유전자 발현 억제활성이 우수하고, 본 발명에서 제공하는 방법을 이용하면, 상기 배양액 유래성분을 보다 높은 수율로 제조할 수 있으므로, 골관절염의 치료제 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

골관절염 치료를 위한 건조된 세포 분비물 기반 치료제{Dried cell secretome for osteoarthritis treatment}

본 발명은 골관절염 치료를 위한 건조된 세포 분비물 기반 치료제에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 PCA(Precipitation with Compressed Fluid Anti-solvent) 건조 공정을 이용한 배양액 유래성분 또는 결정화된 배양액의 제조방법, 상기 방법으로 제조된 배양액 유래성분 또는 결정화된 배양액을 이용하여 연골세포를 회복시키는 방법, 상기 배양액 유래성분 또는 결정화된 배양액을 이용한 연골세포를 회복시키는 방법을 이용하여 골관절염이 발병된 개체를 치료하는 방법 및 상기 배양액 유래성분 또는 결정화된 배양액을 이용하여 골관절염이 발병된 개체를 치료하는 방법에 관한 것이다.

인체는 산화촉진물질과 산화억제물질이 균형을 이루고 있으나, 여러 가지 요인들로 인하여 이러한 균형 상태를 잃고 산화를 촉진하는 방향으로 기울게 되면, 생체 내에 산화적 스트레스(oxidative stress)가 유발되어 세포손상 및 병리적 질환을 유발하게 된다. 이러한 산화적 스트레스의 직접적 원인이 되는 활성 산소종(reactive oxygen species, ROS)은 화학적으로 불안정하고 반응성이 높아 DNA, 단백질, 지질 및 탄수화물과 같은 여러 생체물질과 쉽게 반응할 수 있으며, 생체내 고분자들을 공격하여 세포와 조직에 비가역적인 손상을 일으키거나 돌연변이, 세포독성 및 암 등을 초래하게 된다.

한편, 인체 내에서 대식세포는 병원체에 반응하여 종양 괴사 인자-α(tumor necrotic factor-α, TNF-α), 인터루킨-6(IL-6), 인터루킨-1β(IL-1β) 등과 같은 염증유발인자를 생성하고, 유도성 일산화질소 합성효소(inducible nitric oxide synthase, iNOS)와 사이클로옥시게나제-2(cyclooxygenase-2, COX-2)를 합성하여 일산화질소(NO) 및 프로스타글란딘(prostaglandin E2, PGE2)을 생성한다. 생리학적으로 NO는 세균과 종양을 제거하고 혈압을 조절하거나 신경 전달을 매개하는 등 다양한 역할을 한다. 그러나 염증 반응이 일어나게 되면 관련 세포들에서 iNOS의 발현이 증가하여 많은 양의 NO가 생성되고, 과도하게 생성된 NO는 조직의 손상, 유전자 변이, 신경 손상 등을 유발하며, 혈관 투과성을 증가시켜 부종 등의 염증 반응을 촉진시킨다. 이처럼 염증 반응이 촉진된 경우, 과도한 염증반응이 주요병변으로 나타나는 염증성 질환이 발병하게 되는데, 이같은 염증성 질환은 생체의 모든 부위에서 발생할 수 있다.

특히, 관절부위에 염증 및 통증이 나타나는 관절염은 골관절염(osteoarthritis), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 통풍, 건성 관절염 등으로 분류되며, 관절염 환자의 65%가 골관절염 환자인 것으로 알려져 있다. 보건복지부 통계자료에 따르면 우리나라 성인의 골관절염 유병률은 50세 이상에서 24.2%, 60세 이상에서 31%, 70세 이상에서는 약 42%다. 빠른 고령화 추세 때문에 골관절염 환자는 급속도로 증가할 것으로 예상되며, 주요 7개국(미국, 프랑스, 독일, 이탈리아, 스페인, 영국, 일본)에서의 골관절염 시장규모는 2017년 43억 달러에서 2024년 95억 달러로 증가할 것으로 전망되고 있다.

이에 따라, 골관절염 치료를 위한 다양한 연구가 수행되고 있다. 초기 골관절염의 경우에는, 보호(protection), 휴식(Rest), 얼음찜질(Ice), 압박(Compression) 및 들어올리기(Elevation) 등을 이용한 보존적 치료를 중심으로한 치료가 수행되고, 중기 골관절염의 경우에는, 글루코사민, 콘드로이틴 황산, 진통제, 비스테로이드성 항염제, 스테로이드 제제 등을 이용한 약물치료를 중심으로 한 치료가 수행되며, 말기 골관절염의 경우에는 주로 외과수술을 중심으로 한 치료가 수행되고 있다.

약물치료를 중심으로 한 중기 골관절염의 치료를 위한 다양한 치료제를 개발하기 위한 연구가 집중적으로 수행되고 있는데, 예를 들어, 한국등록특허 제0229343호에는 비스테로이드성 항염제의 일종인 세레콕시브를 유효성분으로 포함하는 골관절염 치료제가 개시되어 있고, 한국등록특허 제0494265호에는 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 골관절염 치료제가 개시되어 있다. 그러나, 비스테로이드 항염제의 경우에는 증상을 일시적으로 완화할 뿐, 골관절염의 진행을 지연하거나 골관절염으로 인해 손상된 연골을 회복시키지 못한다는 문제점이 있다. 또한, 줄기세포의 경우에는 줄기세포를 준비하고, 이를 시술하는 과정 동안 막대한 시간과 비용이 요구될 뿐만 아니라, 체내 주입 후 이른 세포 사멸로 인해 효능이 떨어지고, 감염의 우려 및 안전성 분제가 대두된다는 문제점이 있다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 골관절염의 원인이 되는 손상된 연골을 회복시키면서도, 비용과 시간을 절감시킬 수 있는 치료방법을 개발하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 연골세포의 배양상등액으로부터 유래된 성분을 유효성분으로 포함하는 제제를 사용할 경우, 효과적으로 손상된 연골을 회복시킬 수 있고, 이러한 연골세포 배양상등액 유래성분은 PCA(Precipitation with Compressed Fluid Anti-solvent) 건조 공정을 통해 치료효율을 증진시킬 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 주된 목적은 PCA(Precipitation with Compressed Fluid Anti-solvent) 건조 공정을 이용한 배양액 유래성분 또는 결정화된 배양액의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 제조된 연골배양액 유래성분 또는 결정화된 연골배양액을 유효성분으로 포함하는 골관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법으로 제조된 배양액 유래성분 또는 결정화된 배양액을 이용하여 연골세포를 회복시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 배양액 유래성분 또는 결정화된 배양액을 이용한 연골세포를 회복시키는 방법을 이용하여 골관절염이 발병된 개체를 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 배양액 유래성분 또는 결정화된 배양액을 이용하여 골관절염이 발병된 개체를 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 실시양태는 배양액 유래성분 또는 결정화된 배양액의 제조방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명의 배양액 유래성분 또는 결정화된 배양액의 제조방법은 (a) 배양액에 DMSO와 아세톤을 포함하는 공용매를 가하여, 혼합물을 수득하는 단계; (b) 상기 수득한 혼합물에 압축 반용매를 가하는 단계; 및 (c) 압력용기에서 상기 배양액 유래성분을 침전시키는 단계를 포함한다.

본 발명에서 제공하는 배양액 유래성분 또는 결정화된 배양액은 목적하는 세포를 배양한 다음, 이의 배양상등액을 수득하고, 수득한 배양상등액을 대상으로 PCA(Precipitation with Compressed Fluid Anti-solvent) 건조 공정을 수행함으로써, 최종적으로 얻어질 수 있다.

본 발명의 용어 "PCA(Precipitation with Compressed Fluid Anti-solvent) 건조 공정"이란, 압축된 액상 또는 초임계상의 반용매를 사용하여 목적하는 성분을 침전시켜서 결정화하는 기술로 정의되는데, 대략적으로, 용기에 제1용매 및 상기 제1용매에 녹아있는 타겟 물질을 포함하는 배양액을 공급하는 단계, 상기 용기에 제3용매를 공급하는 단계, 및 상기 용기에 제2 용매를 공급하는 단계를 포함하는데, 상기 제3용매는 제1용매와 제2용매의 두 상을 단일상으로 만드는 역할을 수행하고, 상기 단계를 수행함에 의하여, 제1용매에 녹아있는 타겟 물질이 침전된 후, 건조 또는 결정화된다. 이러한 PCA 건조공정은 당업계에 공지되어 있다(한국공개특허 제10-2020-0106779호, 한국등록특허 제10-2154923호).

본 발명에서 제공하는 배양액 유래성분 또는 결정화된 배양액의 제조방법을 공지된 PCA 건조공정과 비교하면, 배양 상등액은 제1용매에 해당하고, 공용매는 제3용매에 해당하며, 압축 반용매는 제2용매에 해당한다.

먼저, 본 발명에서 제공하는 배양액은 배양 상등액과 동일한 의미로 사용될 수 있는데, 대략적으로 배지에 세포를 접종하고 배양하여 배양물을 수득한 다음, 상기 배양물을 원심분리, 여과 등의 방법에 적용하여, 배양물로부터 세포가 제거된 상태의 액상성분을 의미한다.

상기 배양 상등액을 수득하기 위하여 배양을 수행하는 세포는 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 중간엽 줄기세포, 결합조직 유래 세포 등이 될 수 있고, 다른 예로서, 섬유성 결합조직 유래 세포가 될 수 있으며, 또 다른 예로서, 연골조직 유래 세포가 될 수 있고, 또 다른 예로서 연골세포가 될 수 있으며, 또 다른 예로서 적어도 3일 동안 배양된 연골세포가 될 수 있고, 또 다른 예로서 적어도 일주일 동안 배양된 연골세포가 될 수 있다.

아울러, 상기 세포를 배양하기 위한 배지는 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 성장 인자(Growth Factor), 세포외 기질(Extracellular Matrix; ECM), 세포외 소포(Extracellular Vesicle), 케모카인(Chemokines), 사이토가인(Cytokines) 등이 포함된 배지를 사용할 수 있다.

다음으로, 본 발명에서 제공하는 공용매 역시 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 에탄올, 에틸아세테이트, 부탄올, 이소프로필알코올, DMSO, 아세톤 등을 각각 개별적으로 또는 조합하여 사용할 수 있고, 다른 예로서, DMSO와 아세톤을 포함하는 혼합용매가 될 수 있고, 또 다른 예로서, DMSO와 아세톤을 2:1, 1.9:1, 1.8:1, 1.7:1, 1.6:1, 1.5:1, 1.4:1, 1.3:1, 1.2:1, 1.1:1 또는 1:1(v/v)의 비율로 포함하는 혼합용매가 될 수 있으며, 또 다른 예로서, DMSO와 아세톤을 1.5:1, 1.4:1, 1.3:1, 1.2:1, 1.1:1 또는 1:1(v/v)의 비율로 포함하는 혼합용매가 될 수 있다.

경우에 따라, 상기 DMSO와 아세톤을 포함하는 혼합용매를 공용매로 사용할 경우, 에탄올, 에틸아세테이트, 부탄올, 이소프로필알코올 등의 알코올 성분의 용매를 추가로 포함할 수도 있다. 이때, 추가되는 알코올 성분 용매의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4,9 또는 5%(v/v)가 될 수 있고, 다른 예로서, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9 또는 3%(v/v)가 될 수 있으며, 또 다른 예로서, 1%(v/v)가 될 수 있다.

끝으로, 본 발명에서 제공하는 압축 반용매 역시 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 이산화탄소, 디메틸에테르, N₂O 등이 될 수 있고, 다른 예로서, 이산화탄소가 될 수 있으며, 또 다른 예로서 초임계상의 이산화탄소가 될 수 있다.

한편, 상기 공용매는 배양액과 혼합하여 혼합물을 형성하는데, 상기 공용매와 배양액의 혼합비는 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 공용매와 배양액이 적어도 18:1(v/v)의 비율로 혼합될 수 있고, 다른 예로서, 공용매와 배양액이 25:1, 26:1, 27:1, 28:1, 29:1, 30:1, 31:1, 32:1, 33:1, 34:1, 35:1, 36:1 또는37:1(v/v)의 비율로 혼합될 수 있으며, 또 다른 예로서, 공용매와 배양액이 30:1, 31:1, 32:1, 33:1, 34:1 또는 35:1(v/v)의 비율로 혼합될 수 있다.

상기 공용매와 배양액의 혼합물에 압축 반용매를 가하여 일정 범위의 온도와 압력조건을 가하면, 배양액에 포함된 용매성분이 압축 반용매로 치환되는데, 치환된 압축 반용매는 배양액에 포함된 용매성분 이외의 성분에 대하여 용해도를 나타내지 않으므로, 상기 용매성분 이외의 성분은 석출되어 침전된다. 용매성분 이외의 성분이 침전된 후, 유지되었던 온도와 압력을 상온 및 상압조건으로 변화시키면, 반용매 성분이 용매의 특성을 상실하고 기체형태로 변화되기 때문에, 침전된 용매성분 이외의 성분을 건조된 형태로 수득할 수 있는데, 이처럼 수득한 건조물은 배양액 유래성분 또는 결정화된 배양액이라고 호칭될 수 있다.

상기 공용매와 배양액의 혼합물에 압축 반용매를 가하여 침전시킬 때, 온도조건은 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30℃가 될 수 있고, 다른 예로서, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25℃가 될 수 있으며, 또 다른 예로서, 20℃가 될 수 있다.

상기 공용매와 배양액의 혼합물에 압축 반용매를 가하여 침전시킬 때, 압력조건은 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 또는 200 bar가 될 수 있고, 다른 예로서, 125 bar가 될 수 있으며, 또 다른 예로서, 200 bar가 될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 연골세포를 배양하여 수득한 배양상등액을 동결건조 방법 또는 PCA 건조 공정에 적용하여 각각의 건조물을 수득하고, 이들 각 건조물의 연골세포 회복효과를 측정한 결과, 동결건조 방법에 의해 얻어진 건조물 보다 PCA 건조 공정에 의해 얻어진 건조물이 현저히 높은 수준의 연골회복 효과를 나타냄을 확인하였다. 또한, 골관절염 모델동물에 상기 각각의 건조물을 투여한 결과, 동결건조 방법에 의해 얻어진 건조물 보다 PCA 건조 공정에 의해 얻어진 건조물이 현저히 높은 수준의 골관절염 치료효과를 나타냄을 확인하였다.

본 발명의 다른 실시양태는 상기 방법으로 제조된 배양액 유래성분 또는 결정화된 배양액을 유효성분으로 포함하는 골관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

앞서 설명한 바와 같이, 연골세포를 배양하여 수득한 배양상등액을 PCA 건조 공정에 적용하여 수득한 배양액 유래성분 또는 결정화된 배양액은 연골세포 회복효과를 나타낼 수 있고, 골관절염 치료효과를 나타낼 수 있으므로, 상기 배양액 유래성분 또는 결정화된 배양액은 골관절염의 예방 또는 치료를 위한 제제의 유효성분으로 사용될 수 있다.

본 발명의 용어 "골관절염"이란, 퇴행성 관절염이라고도 호칭되며, 관절부위에 존재하는 연골영역이 손상되어 염증, 부종 등을 나타내는 염증성 질환의 일종을 의미한다.

본 발명의 용어 "염증성 질환(Inflammatory disease)"이란, 염증유발인자 또는 방사선조사 등 유해한 자극으로 인해 인체 면역체계를 과도하게 항진시켜 대식세포와 같은 면역세포에서 분비되는 TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-1(interleukin-1), IL-6, 프로스타글란딘(prostagladin), 루코트리엔(luecotriene) 또는 산화질소(nitric oxide, NO)와 같은 염증유발물질(염증성 사이토카인)에 의해 유발되는 질환을 의미한다.

통상적으로, 골관절염에서 관절연골조직의 파괴는 기본적으로 관절연골조직의 항상성 소실에서부터 시작된다. 정상적인 관절에서는 ECM 물질의 합성과 항상성 유지에 관여하는 이화학적 또는 동화학적인 경로가 균형을 이루고 있어 연골세포는 아그레칸(sulfated proteoglycan; aggrecan)과 2형 콜라겐(type II collagen) 등의 연골 특이적 ECM 단백질을 합성한다. 그러나, 연골 ECM 합성 및 분해의 항상성은 퇴행성 관절염과 같은 질환의 연골조직에서는 우선 MMP(matrix metalloproteinase) 합성 및 활성화에 의해 파괴된다. 골관절염 조직에서 MMP-1(collagenase-1), MMP-2, MMP-3(stromelysin-1), MMP-8(neutrophil collagenase), MMP-9 (gelatinases), MMP-13 (collagenase-3), 광범위한 기질특이성을 가지는 MMP-7(matrilysin) 등의 발현 및 활성이 증가하며 이러한 현상은 IL-1β 및 tumor necrosis factor (TNF)α과 같은 염증성 사이토카인에 의해 유발된다. 연골조직의 보존은 2형 콜라겐, 프로테오글레칸 그리고 피브로넥틴(fibronectin)과 같은 부수 적인 단백질에 의하며 이러한 분자들은 연골세포에서 합성되어 조직을 이룬다. 특히, 아그레칸은 관절 내 프로테오글레칸 중에서 가장 중요한 역할을 하며, 아그레칸의 interglobular domain (IGD)이 활성화된 스트로멜라이신-1(stromelysin-1)에 특히 민감하며 아그레카네이즈(aggrecanase)의 기능을 가진 MMP-8과 MMP-13이 아그레칸의 IGD을 분해한다. ADAMTS(A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs) 중 ADAMTS4 과 ADAMTS5는 아그레카네이즈의 기능을 갖고 있다. 아그레칸의 분해가 연골조직의 파괴에 중요하지만 관절조직의 궁극적인 파괴는 연골 콜라겐의 소실에 의한다. 따라서, 2형 콜라겐의 나선형 도메인(helical domain)을 분해하는 MMP-1, type IX 와 type XI collagen 을 분해하는 스트로멜라이신(MMP-3) 등이 연골조직 파괴에 관여한다. 아울러, 연골세포와 활막세포에서 MMP들은 latent pro-enzyme으로 합성되어 OA 과정 중에 활성화 되는데, 따라서 연골조직의 퇴행을 제어하기 위해서는 MMP의 활성을 억제함으로서 관절 ECM의 분해를 억제할 수 있다.

본 발명의 용어 "예방"이란, 상기 약학 조성물의 투여로 골관절염을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 용어 "치료"란, 치료하고자 하는 개개인 또는 세포의 천연 과정을 변경시키기 위해 임상적으로 개입하는 모든 행위를 의미하는데, 임상 병리 상태가 진행되는 동안 또는 이를 예방하기 위해 수행할 수 있다. 목적하는 치료 효과에는 질병의 발생 또는 재발을 예방하고, 증상을 완화시키며, 질병에 따른 모든 직접 또는 간접적인 병리학적 결과를 저하시키며, 전이를 예방하고, 질병 진행 속도를 감소시키며, 질병 상태를 경감 또는 일시적 완화시키며, 차도시키거나 예후를 개선시키는 것이 포함된다. 본 발명의 목적상 상기 치료는 상기 약학 조성물의 투여로 골관절염의 증세가 호전되거나 완치되는 모든 행위를 포함하는 것으로 해석될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

상기 약학 조성물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 추가로 포함할 수 있는데, 상기 담체는 비자연적인 담체가 될 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

한편, 본 발명의 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제제화하여 사용될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 세모고랭이 추출물 또는 이의 분획물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.

본 발명의 상기 약학 조성물에 포함된 배양액 유래성분 또는 결정화된 배양액의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 최종 조성물 총 중량에 대하여 0.0001, 0.001, 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50 중량%로 포함할 수 있고, 바람직하게는 0.001, 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5 또는 10 중량%의 함량으로 포함할 수 있다.

상기 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본 발명의 용어 "약학적으로 유효한 양"이란, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.

본 발명의 약학 조성물의 투여량은 사용목적, 질환의 중독도, 환자의 연령, 체중, 성별, 기왕력, 또는 유효성분으로서 사용되는 물질의 종류 등을 고려하여 당업자가 결정할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물은 성인 1인당 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100 mg/kg, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 mg/kg로 투여할 수 있고, 본 발명의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 월 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시양태는 상기 배양액 유래성분 또는 결정화된 배양액을 이용하여 연골세포를 회복시키는 방법을 제공한다.

상술한 바와 같이, 상기 방법으로 제조된 배양액 유래성분 또는 결정화된 배양액은 동결건조 방법을 통해 얻어진 건조물 보다도 현저히 높은 수준의 연골회복 효과를 나타냄을 확인하였으므로, 상기 배양액 유래성분 또는 결정화된 배양액을 손상된 연골세포 또는 연골조직에 처리하면, 손상된 연골세포 또는 연골조직을 회복시킬 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시양태는 상기 배양액 유래성분 또는 결정화된 배양액을 이용한 연골세포를 회복시키는 방법을 이용하여 골관절염이 발병된 개체를 치료하는 방법을 제공한다.

다시 말해서, 본 발명은 상기 배양액 유래성분 또는 결정화된 배양액을 골관절염이 발병되거나 또는 발병될 가능성이 있는, 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 골관절염의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

이때, 상기 배양액 유래성분 또는 결정화된 배양액, 골관절염, 예방 및 치료의 정의는 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명의 용어 "개체"란, 상기 골관절염이 발병될 가능성이 있거나, 또는 발병된 조직을 포함하는 모든 동물을 의미하는데, 인간은 제외된다. 본 발명의 배양액 유래성분 또는 결정화된 배양액을 개체에 투여함으로써, 골관절염을 완화 또는 치료할 수 있다.

본 발명의 용어, "완화"는 본 발명에 따른 배양액 유래성분 또는 결정화된 배양액의 투여로 골관절염이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 말한다.

본 발명의 용어 "치료"란, 본 발명에 따른 배양액 유래성분 또는 결정화된 배양액을 골관절염의 치료가 요구되는 개체에 투여하여 골관절염의 치료가 수행되거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미한다.

상기 본 발명의 배양액 유래성분 또는 결정화된 배양액 또는, 이들을 포함하는 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다.

본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 대상에게 본 발명의 배양액 유래성분 또는 결정화된 배양액 또는, 이들을 포함하는 약학 조성물을 도입하는 것을 말하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.

상기 배양액 유래성분 또는 결정화된 배양액 또는, 이들을 포함하는 약학 조성물은 목적 또는 필요에 따라 당업계에서 사용되는 통상적인 방법, 투여 경로, 투여량에 따라 적절하게 개체에 투여될 수 있다. 투여 경로의 예로는 경구, 비경구, 피하, 복강 내, 폐 내, 및 비강 내로 투여될 수 있으며, 비경구 주입에는 근육 내, 정맥 내, 동맥 내, 복강 내 또는 피하투여가 포함된다. 또한 당업계에 공지된 방법에 따라 적절한 투여량 및 투여 횟수가 선택될 수 있으며, 실제로 투여되는 본 발명의 배양액 유래성분 또는 결정화된 배양액 또는, 이들을 포함하는 약학 조성물의 양 및 투여 횟수는 치료하고자 하는 증상의 종류, 투여 경로, 성별, 건강 상태, 식이, 개체의 연령 및 체중, 및 질환의 중증도와 같은 다양한 인자에 의해 적절하게 결정될 수 있다.

본 발명에서의 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 용도에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 혈관 투과성 증가를 억제 또는 완화하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 배양액 유래성분 또는 결정화된 배양액 또는, 이들을 포함하는 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명에서 제공하는 배양액 유래성분은 염증성 환경 완화 및 이화작용 관련 유전자 발현 억제활성이 우수하고, 본 발명에서 제공하는 방법을 이용하면, 상기 배양액 유래성분을 보다 높은 수율로 제조할 수 있으므로, 골관절염의 치료제 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.

도 1a는 4종의 세포배양물(대조군, No Secretome, LYO 및 PCA)의 연골세포에서 발현된 염증관련 유전자(IL-1β, IL6 및 iNOS)의 발현수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 1b는 4종의 세포배양물(대조군, No Secretome, LYO 및 PCA)로부터 각각의 연골세포를 대상으로, iNOS 단백질의 발현수준을 확인하기 위한 면역형광염색 분석법을 수행한 결과를 나타내는 형광현미경 사진이다.
도 1c는 상기 형광현미경 사진에서 나타난 iNOS 단백질이 발현된 세포의 비율을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 1d는 4종의 세포배양물(대조군, No Secretome, LYO 및 PCA)로부터 얻어진 각각의 배양상등액에 포함된 NO의 농도를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2a는 4종의 세포배양물(대조군, No Secretome, LYO 및 PCA)의 연골세포에서 발현된 MMP 유전자(MMP13, MMP3 및 MMP1)의 발현수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2b는 4종의 세포배양물(대조군, No Secretome, LYO 및 PCA)의 연골세포에서 발현된 ADAMTS 유전자(ADAMTS4 및 ADAMTS5)의 발현수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2c는 4종의 세포배양물(대조군, No Secretome, LYO 및 PCA)로부터 각각의 연골세포를 대상으로, MMP13의 발현수준을 확인하기 위한 면역형광염색 분석법을 수행한 결과를 나타내는 형광현미경 사진 및 상기 형광현미경 사진에서 나타난 MMP13 단백질의 평균 형광강도의 비율을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3a는 4종의 관절부분(Normal, PBS, LYO 및 PCA)을 대상으로 조직염색을 수행한 결과를 나타내는 현미경 사진이다.
도 3b는 4종의 관절부분(Normal, PBS, LYO 및 PCA)을 대상으로 평가한 Modified Mankin's Score를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3c는 4종의 관절부분(Normal, PBS, LYO 및 PCA)을 대상으로 골관절염 관련 단백질(MMP13, NITEGE 및 iNOS)의 발현수준을 확인하기 위한 면역형광염색 분석법을 수행한 결과를 나타내는 형광현미경 사진이다.
도 3d는 상기 형광현미경 사진에서 MMP13이 발현된 세포의 비율을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3e는 상기 형광현미경 사진에서 NITEGE가 발현된 세포의 비율을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3f는 상기 형광현미경 사진에서 iNOS가 발현된 세포의 비율을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4a는 연골세포 배양액을 대상으로 PCA 건조공정을 수행함에 있어서, DMSO와 아세톤의 혼합비에 따른 연골세포 배양액 유래 성분의 수율변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4b는 연골세포 배양액을 대상으로 PCA 건조공정을 수행함에 있어서, DMSO와 아세톤의 혼합비가 1.5:1(v/v)인 공용매와 연골세포 배양액의 혼합비에 따른, 연골세포 배양액 유래 성분의 수율변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4c는 연골세포 배양액을 대상으로 PCA 건조공정을 수행함에 있어서, DMSO와 아세톤의 혼합비가 1:1(v/v)인 공용매와 연골세포 배양액의 혼합비에 따른, 연골세포 배양액 유래 성분의 수율변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4d는 연골세포 배양액을 대상으로 PCA 건조공정을 수행함에 있어서, DMSO와 아세톤의 혼합비가 1.5:1(v/v)인 공용매 사용시, 온도조건에 따른, 연골세포 배양액 유래 성분의 수율변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4e는 연골세포 배양액을 대상으로 PCA 건조공정을 수행함에 있어서, DMSO와 아세톤의 혼합비가 1:1(v/v)인 공용매 사용시, 온도조건에 따른, 연골세포 배양액 유래 성분의 수율변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4f는 연골세포 배양액을 대상으로 PCA 건조공정을 수행함에 있어서, DMSO와 아세톤의 혼합비가 1.5:1(v/v)인 공용매 사용시, 압력조건에 따른, 연골세포 배양액 유래 성분의 수율변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4g는 연골세포 배양액을 대상으로 PCA 건조공정을 수행함에 있어서, DMSO와 아세톤의 혼합비가 1.5:1(v/v)인 공용매 사용시, 압력조건에 따른, 연골세포 배양액 유래 성분의 수율변화를 로그스케일로 변화시켜 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 연골세포 배양액 유래 성분의 제조

실시예 1-1: 연골세포의 배양

연골조직을 파쇄하여 수득한 연골절편에 0.15% (w/v) type II collagenase (Worthington Biochemical) 용액을 처리하고, 37℃에서 18시간 동안 반응시킨 후, 70 μm cell strainer를 사용해서 잔류물이 제거된 세포용액을 수득한 다음, 상기 수득한 세포용액을 원심분리(1100 rpm, 5분)하여 침전된 연골세포를 수득하였다.

다음으로, 연골세포 배양용 배지에 상기 수득한 연골세포를 10,000~40,000 cells/cm2의 농도로 접종하고, 37℃ 및 5% CO2 조건에서, 3일마다 배지를 교체하는 방식으로 배양하였다. 이때, 사용된 연골세포 배양용 배지의 조성은 다음과 같다: 10% (v/v) fetal bovine serum (FBS; Corning), 1% (v/v) penicillin/streptomycin (Gibco), 1% (v/v) non-essential amino acids (NEAA, Gibco), 1% (v/v) 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES, Gibco), 8 μg/mL L-proline (Sigma) and 20 μg/mL L-ascorbic acid (Sigma)

상기 연골세포의 포화도가 100%가 될 때 까지 배양한 다음, 배지를 제거하고, 인산염 완충액으로 연골세포를 2회 세척한 다음, 상기 연골세포에 FBS가 제거된 연골세포 배양용 배지를 다시 가하여 7일 동안 배양하고, 이로부터 배양상등액을 수득하였다.

실시예 1-2: 동결건조를 이용한 연골세포 배양액 유래 성분의 제조

상기 실시예 1-1에서 수득한 배양상등액을 -80℃ 냉동고에서 1일 동안 동결시킨 후, 동결건조기 (Labconco, cat # 7670540)을 이용해서 -40℃, 0.08mBar 조건에서 3일 동안 동결건조하여, 동결건조를 이용하여 제조된 연골세포 배양액 유래 성분을 수득하였다.

실시예 1-3: PCA 건조를 이용한 연골세포 배양액 유래 성분의 제조

먼저, 온도와 압력이 20℃, 200bar로 유지되는 PCA 공정의 반응기에 과냉각된 액상상태의 이산화탄소를 100mL/min의 유량으로 공급하였다.

다음으로, 상기 반응기에 DMSO와 Acetone이 1.5 : 1의 부피비로 혼합된 공용매(cosolvent)와 상기 실시예 1-1에서 수득한 배양상등액을 30:1(v/v)로 혼합한 용액을 1mL/min의 유량으로 분사하여, 반응기 내부에서 물, 이산화탄소 및 Acetone/DMSO를 포함하는 다성분계 혼합물을 생성시키고, 이로부터 연골세포 배양액 유래 성분을 석출시켰다.

끝으로, 상기 성분이 석출된 다음, 1시간 동안 추가적으로 이산화탄소를 공급하여, 잔류하는 배양상등액 성분과 공용매를 제거하고, 반응기를 감압하여 이산화탄소를 기화시켰다. 이후, 석출된 연골세포 배양액 유래 성분을 필터를 통해 수득하였다.

실시예 2: 연골세포 배양액 유래 성분의 효능 분석

실시예 2-1: in vitro 분석

실시예 2-1-1: 시료의 준비

상기 실시예 1-1의 방법으로 배양된 연골세포에 IL-1β를 처리하고 24시간 동안 배양하여 염증반응이 유도된 연골세포를 제작하였다. 이때, 대조군으로는 IL-1β를 처리하지 않고 배양한 연골세포를 사용하였다.

상기 제작한 염증반응이 유도된 연골세포를 3종의 배지에서 3일 동안 배양하여 각각의 세포배양물을 수득하였는데, 상기 3종의 배지로는 연골세포 배양액 유래 성분이 포함되지 않은 배지(No Secretome); 실시예 1-2에서 제조된 동결건조를 이용한 연골세포 배양액 유래 성분이 1mg/mL로 포함된 배지(LYO) 및 실시예 1-3에서 제조된 PCA 건조를 이용한 연골세포 배양액 유래 성분이 1mg/mL로 포함된 배지(PCA)를 각각 사용하였다.

실시예 2-1-2: 염증반응 관련 유전자의 발현수준 분석

상기 실시예 2-1-1에서 준비된 4종의 세포배양물(대조군, No Secretome, LYO 및 PCA)로부터 각각의 연골세포를 수득하고, 이들 수득한 각 연골세포에서 발현된 염증관련 유전자(IL-1β, IL6 및 iNOS)의 발현수준을 비교하였다(도 1a).

도 1a는 4종의 세포배양물(대조군, No Secretome, LYO 및 PCA)의 연골세포에서 발현된 염증관련 유전자(IL-1β, IL6 및 iNOS)의 발현수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 1a에서 보듯이, 3종의 염증관련 유전자(IL-1β, IL6 및 iNOS)는 모두 대조군에 비하여 염증반응이 유도된 연골세포(No Secretome)에서 발현수준이 증가되었으나, 연골세포 배양액 유래 성분이 포함된 배지에서 배양된 연골세포(LYO 및 PCA)에서는 염증반응이 유도된 연골세포(No Secretome) 보다 감소됨을 확인하였다.

상기 결과를 검증하기 위하여, 4종의 세포배양물(대조군, No Secretome, LYO 및 PCA)로부터 각각의 연골세포를 대상으로, iNOS의 발현수준을 확인하기 위한 면역형광염색 분석법을 수행하였다(도 1b 및 1c).

도 1b는 4종의 세포배양물(대조군, No Secretome, LYO 및 PCA)로부터 각각의 연골세포를 대상으로, iNOS 단백질의 발현수준을 확인하기 위한 면역형광염색 분석법을 수행한 결과를 나타내는 형광현미경 사진이고, 도 1c는 상기 형광현미경 사진에서 나타난 iNOS 단백질이 발현된 세포의 비율을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 1b 및 1c에서 보듯이, iNOS 단백질은 대조군에 비하여 염증반응이 유도된 연골세포(No Secretome)에서 발현수준이 증가되었으나, 연골세포 배양액 유래 성분이 포함된 배지에서 배양된 연골세포(LYO 및 PCA)에서는 염증반응이 유도된 연골세포(No Secretome) 보다 감소됨을 다시한번 확인하였다.

실시예 2-1-3: 연골세포로부터 생성된 NO 수준의 분석

염증반응이 유도된 연골세포의 NO 생성 수준을 확인하고자 griess assay를 수행하였다.

대략적으로, 상기 실시예 2-1-1에서 준비된 4종의 세포배양물(대조군, No Secretome, LYO 및 PCA)로부터 각각의 배양상등액을 Griess Assay Kit (Sigma, cat # MAK367)에 적용하였다. 즉, 96웰 플레이트의 각 웰에 상기 각각의 배양상등액을 10배 희석한 희석액 100 ㎕, Griess Reagent I 10 ㎕, Griess Reagent II 10 ㎕ 및 Nitrite Assay Buffer 80 ㎕를 가하고, 상온에서 10분 동안 반응시킨 다음, 540 nm 에서 흡광도 (A540)를 측정하였다.

아울러, Known NO concentration 용액을 대상으로 griess assay를 수행하여, 표준곡선을 제작한 다음, 상기 측정된 흡광도 값을 적용하여, 각 배양상등액에 포함된 NO의 농도를 산출하였다(도 1d).

도 1d는 4종의 세포배양물(대조군, No Secretome, LYO 및 PCA)로부터 얻어진 각각의 배양상등액에 포함된 NO의 농도를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 1d에서 보듯이, 각 연골세포의 배양상등액에 포함된 NO의 농도는 대조군에 비하여 염증반응이 유도된 연골세포(No Secretome)에서 현저히 높은 수준을 나타내었으나, 연골세포 배양액 유래 성분이 포함된 배지에서 배양된 연골세포(LYO 및 PCA)에서는 염증반응이 유도된 연골세포(No Secretome) 보다 감소됨을 다시한번 확인하였다.

또한, 상기 연골세포 배양액 유래 성분이 포함된 배지 중, 동결건조 성분이 포함된 배지에서 배양된 연골세포(LYO) 보다는, PCA 건조 성분이 포함된 배지에서 배양된 연골세포(PCA)에서 NO 농도가 상대적으로 낮은 수준을 나타냄을 확인하였다.

실시예 2-1-4: 이화반응 관련 유전자의 발현수준 분석

상기 실시예 2-1-1에서 준비된 4종의 세포배양물(대조군, No Secretome, LYO 및 PCA)로부터 각각의 연골세포를 수득하고, 이들 수득한 각 연골세포에서 발현된 이화반응과 관련된 MMP 유전자(MMP13, MMP3 및 MMP1)와 ADAMTS 유전자(ADAMTS4 및 ADAMTS5)의 발현수준을 비교하였다(도 2a 및 2b).

도 2a는 4종의 세포배양물(대조군, No Secretome, LYO 및 PCA)의 연골세포에서 발현된 MMP 유전자(MMP13, MMP3 및 MMP1)의 발현수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 2a에서 보듯이, 3종의 MMP 유전자(MMP13, MMP3 및 MMP1)는 모두 대조군에 비하여 염증반응이 유도된 연골세포(No Secretome)에서 발현수준이 증가되었으나, 연골세포 배양액 유래 성분이 포함된 배지에서 배양된 연골세포(LYO 및 PCA)에서는 염증반응이 유도된 연골세포(No Secretome) 보다 감소됨을 확인하였다. 또한, 3종의 MMP 유전자는 상기 연골세포 배양액 유래 성분이 포함된 배지 중, 동결건조 성분이 포함된 배지에서 배양된 연골세포(LYO)에서는 대조군과 유사하거나 다소 높은 수준으로 발현되었으나, PCA 건조 성분이 포함된 배지에서 배양된 연골세포(PCA)에서는 대조군보다 낮은 수준으로 발현됨을 확인하였다.

도 2b는 4종의 세포배양물(대조군, No Secretome, LYO 및 PCA)의 연골세포에서 발현된 ADAMTS 유전자(ADAMTS4 및 ADAMTS5)의 발현수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 2b에서 보듯이, 2종의 ADAMTS 유전자(ADAMTS4 및 ADAMTS5)는 모두 대조군에 비하여 염증반응이 유도된 연골세포(No Secretome)에서 발현수준이 증가되었으나, 연골세포 배양액 유래 성분이 포함된 배지에서 배양된 연골세포(LYO 및 PCA)에서는 염증반응이 유도된 연골세포(No Secretome) 보다 감소됨을 확인하였다. 또한, 2종의 ADAMTS 유전자는 상기 연골세포 배양액 유래 성분이 포함된 배지 중, 동결건조 성분이 포함된 배지에서 배양된 연골세포(LYO) 보다는, PCA 건조 성분이 포함된 배지에서 배양된 연골세포(PCA)에서 상대적으로 낮은 수준으로 발현됨을 확인하였다.

상기 결과를 검증하기 위하여, 4종의 세포배양물(대조군, No Secretome, LYO 및 PCA)로부터 각각의 연골세포를 대상으로, MMP13의 발현수준을 확인하기 위한 면역형광염색 분석법을 수행하였다(도 2c).

도 2c는 4종의 세포배양물(대조군, No Secretome, LYO 및 PCA)로부터 각각의 연골세포를 대상으로, MMP13의 발현수준을 확인하기 위한 면역형광염색 분석법을 수행한 결과를 나타내는 형광현미경 사진 및 상기 형광현미경 사진에서 나타난 MMP13 단백질의 평균 형광강도의 비율을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 2c에서 보듯이, MMP13 단백질은 대조군에 비하여 염증반응이 유도된 연골세포(No Secretome)에서 발현수준이 증가되었으나, 연골세포 배양액 유래 성분이 포함된 배지에서 배양된 연골세포(LYO 및 PCA)에서는 염증반응이 유도된 연골세포(No Secretome) 보다 감소됨을 다시한번 확인하였다.

실시예 2-2: in vivo 분석

실시예 2-2-1: 골관절염 유도 및 유효성분의 투여

래트의 관절을 절개하고, 관절 내 반월상연골을 절단 및 제거하여, 골관절염을 유도하였다. 수술이 완료된 후, 4주 동안 사육한 다음, 골관절염이 발병된 개체를 선발하고, 선발된 개체에 연골세포 배양액 유래 성분을 관절 당 50 ㎕씩 1회 주사하였다. 이때, 대조군으로는 골관절염이 유도되지 않은 래트(Normal)를 사용하고, 상기 연골세포 배양액 유래 성분으로는 연골세포 배양액 유래 성분이 포함되지 않은 PBS(PBS); 실시예 1-2에서 제조된 동결건조를 이용한 연골세포 배양액 유래 성분이 10mg/mL로 용해된 PBS(LYO); 및 실시예 1-3에서 제조된 PCA 건조를 이용한 연골세포 배양액 유래 성분이 10mg/mL로 용해된 PBS(PCA)를 각각 사용하였다.

연골세포 배양액 유래 성분을 주사한 후, 4주 동안 각 래트를 사육하고, 사육한 랫트를 희생시켜서 각각의 래트로부터 관절부분을 적출한 다음, 이후 실험에 사용하였다.

실시예 2-2-2: 골관절염 진행수준 평가

상기 실시예 2-2-1에서 적출한 각각의 관절부위를 대상으로, Safranin-O를 이용한 조직염색을 수행하였다(도 3a).

도 3a는 4종의 관절부분(Normal, PBS, LYO 및 PCA)을 대상으로 조직염색을 수행한 결과를 나타내는 현미경 사진이다.

도 3a에서 보듯이, 골관절염이 유발되지 않은 관절(Normal)에 비하여, 골관절염 유발 후 연골세포 배양액 유래 성분을 투여하지 않은 관절(PBS)에는 연골조직이 소실되었으나, 골관절염 유발후에 연골세포 배양액 유래 성분을 투여한 관절(LYO 및 PCA)에서는 골관절염에 의해 소실된 연골조직이 보충됨을 확인하였다.

상기 조직염색결과를 바탕으로, 골관절염의 진행수준을 평가하기 위하여, Modified Mankin's Score를 평가하였다(도 3b). 상기 Mankin's Score는 연골 구조, 세포성, 프로테오글리칸 고갈 및 타이드마크 무결성을 포함한 4가지 매개변수를 평가하여 관절 연골의 손상수준을 평가하는 지표로서 사용된다.

도 3b는 4종의 관절부분(Normal, PBS, LYO 및 PCA)을 대상으로 평가한 Modified Mankin's Score를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 3b에서 보듯이, Modified Mankin's Score는 골관절염이 유발되지 않은 관절(Normal)에 비하여 골관절염 유발 후 연골세포 배양액 유래 성분을 투여하지 않은 관절(PBS)에서 높은 수준을 나타내었으나, 골관절염 유발후에 연골세포 배양액 유래 성분을 투여한 관절(LYO 및 PCA)에서는 상대적으로 저하됨을 확인하였다. 또한, 연골세포 배양액 유래 성분을 투여한 관절 중에서는 동결건조 성분을 투여한 관절(LYO) 보다는 PCA 건조 성분을 투여한 관절(PCA)에서 현저히 낮은 값을 나타냄을 확인하였다.

실시예 2-2-3: 골관절염 관련 단백질 발현수준 평가

상기 실시예 2-2-1에서 적출한 각각의 관절부위를 대상으로, 골관절염 관련 단배질(MMP13, NITEGE 및 iNOS)의 발현수준을 비교하기 위하여, 면역형광염색을 수행하였다(도 3c, 3d, 3e 및 3f).

도 3c는 4종의 관절부분(Normal, PBS, LYO 및 PCA)을 대상으로, 골관절염 관련 단백질(MMP13, NITEGE 및 iNOS)의 발현수준을 확인하기 위한 면역형광염색 분석법을 수행한 결과를 나타내는 형광현미경 사진이고, 도 3d는 상기 형광현미경 사진에서 MMP13이 발현된 세포의 비율을 측정한 결과를 나타내는 그래프이며, 도 3e는 상기 형광현미경 사진에서 NITEGE가 발현된 세포의 비율을 측정한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 3f는 상기 형광현미경 사진에서 iNOS가 발현된 세포의 비율을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 3c, 3d, 3e 및 3f에서 보듯이, 3종의 골관절염 관련 단백질(MMP13, NITEGE 및 iNOS)은 모두 골관절염이 유발되지 않은 관절(Normal)에 비하여 골관절염 유발 후 연골세포 배양액 유래 성분을 투여하지 않은 관절(PBS)에서 발현수준이 증가되었으나, 골관절염 유발후에 연골세포 배양액 유래 성분을 투여한 관절(LYO 및 PCA)에서는 연골세포 배양액 유래 성분을 투여하지 않은 관절(PBS) 보다 감소됨을 확인하였다. 또한, 상기 골관절염 유발후에 연골세포 배양액 유래 성분을 투여한 관절 중, 동결건조 성분을 투여한 관절(LYO) 보다는 PCA 건조 성분을 투여한 관절(PCA) 상대적으로 낮은 수준으로 발현됨을 확인하였다.

상기 in vitro 분석 및 in vivo 분석 결과를 종합하면, 연골세포 배양액 유래 성분이 연골세포 손상에 의해 유발되는 골관절염을 치료하는 효과를 나타내고, 상기 연골세포 배양액 유래 성분 중에서는 동결건조 방식으로 얻어진 연골세포 배양액 유래 성분 보다는 PCA 건조방식으로 얻어진 연골세포 배양액 유래 성분이 상대적으로 높은 수준의 골관절염 치료효과를 나타냄을 알 수 있었다.

실시예 3: PCA 건조공정 최적화

상기 실시예 2의 결과로부터, 동결건조 방식으로 얻어진 연골세포 배양액 유래 성분 보다는 PCA 건조방식으로 얻어진 연골세포 배양액 유래 성분이 상대적으로 높은 수준의 골관절염 치료효과를 나타냄을 확인하였으므로, PCA 건조공정을 수행하여 연골세포 배양액 유래 성분을 수득할 경우, 연골세포 배양액 유래 성분의 생산수율을 최대화 할 수 있는 PCA 건조 조건을 확립하고자 하였다.

본 발명자들은 연골세포 배양액 유래 성분의 생산수율을 최대화 할 수 있는 PCA 건조 조건으로서, 공용매를 구성하는 각 용매의 혼합비, 공용매와 연골세포 배양액의 혼합비, 온도 조건 및 압력조건을 설정하고자 하였다.

실시예 3-1: 공용매를 구성하는 용매의 혼합비

상기 실시예 1-3에서 수행한 PCA 건조시, 사용된 공용매는 DMSO와 아세톤의 혼합용매이므로, 상기 DMSO와 아세톤의 혼합비에 따라 연골세포 배양액 유래 성분의 수율이 변화되는지 확인하고자 하였다.

대략적으로, DMSO와 아세톤을 2:1, 1.5:1 또는 1:1(v/v)의 비율로 혼합한 각각의 공용매를 제조하고, 상기 제조한 각각의 공용매와 연골세포 배양액을 30:1(v/v)로 혼합한 다음, 20℃ 및 200 bar의 조건으로 PCA 건조공정을 수행하였다(도 4a 및 표 1).

도 4a는 연골세포 배양액을 대상으로 PCA 건조공정을 수행함에 있어서, DMSO와 아세톤의 혼합비에 따른 연골세포 배양액 유래 성분의 수율변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.

DMSO:아세톤 비율(v/v)	공용매:시료 비율 (v/v)	온도(℃)	압력(bar)	수율(%)
2:1	30:1	20	200	69.4
1.5:1				92.5
1:1				92.4

상기 도 4a 및 표 1에서 보듯이, DMSO의 함량이 과도한 경우에는 연골세포 배양액 유래 성분의 수율이 저하됨을 확인하였다. 특히, 아세톤의 함량이 과도한 경우에는 연골세포 배양액 성분이 침전응고반응을 나타내어 변성될 수 있음을 확인하였다.

따라서, DMSO와 아세톤의 혼합비는 2:1 내지 1:1(v/v)이 바람직함을 알 수 있었다.

실시예 3-2: 공용매와 연골세포 배양액의 혼합비

상기 실시예 1-3에서 수행한 PCA 건조시, 사용된 공용매와 연골세포 배양액을 혼합한 혼합물을 사용하므로, 상기 공용매와 연골세포 배양액의 혼합비에 따라 연골세포 배양액 유래 성분의 수율이 변화되는지 확인하고자 하였다.

먼저, DMSO와 아세톤의 비율이 1.5:1(v/v)인 공용매와 연골세포 배양액을 20:1 내지 50:1(v/v)로 혼합한 다음, 20℃ 및 200 bar의 조건으로 PCA 건조공정을 수행하였다(도 4b 및 표 2).

도 4b는 연골세포 배양액을 대상으로 PCA 건조공정을 수행함에 있어서, DMSO와 아세톤의 혼합비가 1.5:1(v/v)인 공용매와 연골세포 배양액의 혼합비에 따른, 연골세포 배양액 유래 성분의 수율변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.

DMSO:아세톤 비율(v/v)	공용매:시료 비율 (v/v)	온도(℃)	압력(bar)	수율(%)
1.5:1	20:1	20	200	49.1
	22:1			65.9
	25:1			77.0
	30:1			91.8
	35:1			82.2
	37:1			77.4
	40:1			65.4
	50:1			57.6

상기 도 4b 및 표 2에서 보듯이, DMSO와 아세톤의 비율이 1.5:1(v/v)인 공용매를 사용할 경우, 공용매의 함량이 과도하게 적거나 또는 많은 경우에는 연골세포 배양액 유래 성분의 수율이 저하되고, 25:1 내지 37:1(v/v)의 혼합비에서 70% 이상의 수율이 나타나고, 30:1(v/v)의 혼합비에서 최대수율을 나타냄을 확인하였다.

다음으로, DMSO와 아세톤의 비율이 1:1(v/v)인 공용매와 연골세포 배양액을 20:1 내지 50:1(v/v)로 혼합한 다음, 20℃ 및 200 bar의 조건으로 PCA 건조공정을 수행하였다(도 4c 및 표 3).

도 4c는 연골세포 배양액을 대상으로 PCA 건조공정을 수행함에 있어서, DMSO와 아세톤의 혼합비가 1:1(v/v)인 공용매와 연골세포 배양액의 혼합비에 따른, 연골세포 배양액 유래 성분의 수율변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.

DMSO:아세톤 비율(v/v)	공용매:시료 비율 (v/v)	온도(℃)	압력(bar)	수율(%)
1:1	20:1	20	200	43.9
	22:1			52.9
	25:1			74.6
	30:1			92.4
	35:1			79.0
	37:1			71.3
	40:1			67.5
	50:1			64.8

상기 도 4c 및 표 3에서 보듯이, DMSO와 아세톤의 비율이 1:1(v/v)인 공용매를 사용할 경우에도, 공용매의 함량이 과도하게 적거나 또는 많은 경우에는 연골세포 배양액 유래 성분의 수율이 저하되고, 25:1 내지 37:1(v/v)의 혼합비에서 70% 이상의 수율이 나타나고, 30:1(v/v)의 혼합비에서 최대수율을 나타냄을 확인하였다.

상기 결과를 종합하면, 상기 실시예 3-1에서 설정한 DMSO와 아세톤의 혼합비의 범위에 있어서, 공용매와 연골세포 배양액의 혼합비는 25:1 내지 37:1(v/v)이 바람직하고, 30:1(v/v)의 혼합비가 가장 바람직함을 알 수 있었다.

실시예 3-3: 온도조건

상기 실시예 1-3에서 수행한 PCA 건조시, 온도조건에 따라 연골세포 배양액 유래 성분의 수율이 변화되는지 확인하고자 하였다.

먼저, DMSO와 아세톤의 비율이 1.5:1(v/v)인 공용매와 연골세포 배양액을 30:1(v/v)로 혼합한 다음, 5 내지 35℃ 및 200 bar의 조건으로 PCA 건조공정을 수행하였다(도 4d 및 표 4).

도 4d는 연골세포 배양액을 대상으로 PCA 건조공정을 수행함에 있어서, DMSO와 아세톤의 혼합비가 1.5:1(v/v)인 공용매 사용시, 온도조건에 따른, 연골세포 배양액 유래 성분의 수율변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.

DMSO:아세톤 비율(v/v)	공용매:시료 비율 (v/v)	온도(℃)	압력(bar)	수율(%)
1.5:1	30:1	5	200	0(N/A)
		10		9.8
		15		77.4
		20		91.8
		25		81.2
		30		67.9
		35		65.3

상기 도 4d 및 표 4에서 보듯이, DMSO와 아세톤의 비율이 1.5:1(v/v)인 공용매를 사용할 경우, 온도가 너무 높거나 또는 낮은 경우에는 연골세포 배양액 유래 성분의 수율이 저하되고, 15 내지 30℃에서 60% 후반대 이상의 수율이 나타나고, 20℃에서 최대수율을 나타냄을 확인하였다.

다음으로, DMSO와 아세톤의 비율이 1:1(v/v)인 공용매와 연골세포 배양액을 28:1(v/v)로 혼합한 다음, 5 내지 35℃ 및 150 bar의 조건으로 PCA 건조공정을 수행하였다(도 4e 및 표 5). 이때, DMSO와 아세톤 비율, 공용매와 연골세포 배양액 혼합비, 압력 등 온도 외 공정조건은 도 4d 및 표 4 와는 다르게 설정하여서 다른 공정조건을 변경하여도 온도조건에서 유사한 경향성을 보이는 지의 여부를 확인하고자 하였다.

도 4e는 연골세포 배양액을 대상으로 PCA 건조공정을 수행함에 있어서, DMSO와 아세톤의 혼합비가 1:1(v/v)인 공용매 사용시, 온도조건에 따른, 연골세포 배양액 유래 성분의 수율변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.

DMSO:아세톤 비율(v/v)	공용매:시료 비율 (v/v)	온도(℃)	압력(bar)	수율(%)
1:1	28:1	5	150	57.7
		10		66.7
		15		77
		20		85.5
		25		81
		30		73
		35		63

상기 도 4e 및 표 5에서 보듯이, DMSO와 아세톤의 비율이 1:1(v/v)인 공용매를 사용할 경우에도, 온도가 너무 높거나 또는 낮은 경우에는 연골세포 배양액 유래 성분의 수율이 저하되고, 15 내지 30℃에서 70% 이상의 수율이 나타나고, 20℃에서 최대수율을 나타냄을 확인하였다.

상기 결과를 종합하면, 상기 실시예 3-1에서 설정한 DMSO와 아세톤의 혼합비의 범위에 있어서, 온도조건은 15 내지 30℃가 바람직하고, 20℃가 가장 바람직함을 알 수 있었다.

실시예 3-4: 압력조건

상기 실시예 1-3에서 수행한 PCA 건조시, 압력조건에 따라 연골세포 배양액 유래 성분의 수율이 변화되는지 확인하고자 하였다.

대략적으로, DMSO와 아세톤의 비율이 1.5:1(v/v)인 공용매와 연골세포 배양액을 30:1(v/v)로 혼합한 다음, 20℃ 및 70 내지 200 bar의 조건으로 PCA 건조공정을 수행하였다(도 4f, 4g 및 표 6).

도 4f는 연골세포 배양액을 대상으로 PCA 건조공정을 수행함에 있어서, DMSO와 아세톤의 혼합비가 1.5:1(v/v)인 공용매 사용시, 압력조건에 따른, 연골세포 배양액 유래 성분의 수율변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 4g는 상기 결과를 로그스케일로 변화시켜 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.

DMSO:아세톤 비율(v/v)	공용매:시료 비율 (v/v)	온도(℃)	압력(bar)	수율(%)
1.5:1	30:1	20	70	75.3
			80	79.4
			100	81.2
			150	85.0
			200	91.8

상기 도 4f, 4g 및 표 6에서 보듯이, DMSO와 아세톤의 비율이 1.5:1(v/v)인 공용매를 사용할 경우, 압력이 증가할 수록 연골세포 배양액 유래 성분의 수율이 향상되어, 200 bar에서 최대수율을 나타냄을 확인하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

(a) 배양액에 DMSO와 아세톤을 포함하는 공용매를 가하여, 혼합물을 수득하는 단계
(b) 상기 수득한 혼합물에 압축 반용매를 가하는 단계 및
(c) 압력용기에서 상기 배양액 유래성분을 침전시키는 단계를 포함하는,
높은 수준의 생물학적 안정성 또는 활성을 나타내는 배양액 유래성분 또는 결정화된 배양액의 제조방법
제1항에 있어서,
상기 공용매는 DMSO와 아세톤을 2:1 내지 1:1의 비율로 포함하는 것인, 방법.
제1항에 있어서,
상기 공용매는 DMSO와 아세톤을 1.5:1 내지 1:1의 비율로 포함하는 것인, 방법.
제1항에 있어서,
상기 공용매는 알코올 성분의 용매를 추가로 포함하는 것인, 방법.
제1항에 있어서,
상기 혼합물은 공용매와 배양액을 25:1 내지 37:1의 비율로 포함하는 것인, 방법.
제1항에 있어서,
상기 혼합물은 공용매와 배양액을 30:1 내지 35:1의 비율로 포함하는 것인, 방법.
제1항에 있어서,
상기 압력용기의 온도는 15 내지 30℃인 것인, 방법.
제1항에 있어서,
상기 압력용기의 온도는 20 내지 25℃인 것인, 방법.
제1항에 있어서,
상기 압력용기의 압력은 70 내지 200 bar인 것인, 방법.
제1항에 있어서,
상기 압력용기의 압력은 200 bar인 것인, 방법.
제1항에 있어서,
상기 압축 반용매는 이산화탄소, 디메틸에테르 및 N₂O로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 것인, 방법.
제1항에 있어서,
상기 압축 반용매는 이산화탄소를 포함하는 것인, 방법.
제1항에 있어서,
상기 배양액은 배지에서 연골세포를 배양하고, 상기 배지를 수집하여 수득하는 것인, 방법.
제1항에 있어서,
상기 배양액은 성장인자, 세포외 기질, 세포외 소포, 케모카인 및 사이토카인을 포함하는 것인, 방법.
제1항에 있어서,
상기 침전은 결정화를 포함하는 것인, 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 배양액 유래성분 또는 결정화된 배양액을 유효성분으로 포함하는, 골관절염 예방 또는 치료용 약학조성물.
제16항에 있어서,
상기 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 것인, 약학조성물.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 배양액 유래성분 또는 결정화된 배양액을 연골세포에 처리하는 단계를 포함하는, 연골세포를 회복시키는 방법
제18항에 있어서,
상기 방법은 연골세포의 염증성 환경을 완화시키는 것인, 방법.
제18항에 있어서,
상기 방법은 연골세포의 이화반응 관련 유전자의 발현을 억제하는 것인, 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 배양액 유래성분 또는 결정화된 배양액을 골관절염이 발병된 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 골관절염이 발병된 개체를 치료하는 방법.
제21항에 있어서,
상기 투여는 상기 개체의 골관절염이 발병된 부위에 상기 배양액 유래성분을 주사하는 단계를 포함하는 것인, 방법.