KR20220088911A - 포유동물 세포로부터 단백질 생산성을 증가시키기 위한 바이러스 복제 기점 - Google Patents

Abstract

본 개시내용은 포유동물 세포에서 관심 단백질의 생산을 증가시키기 위한 단백질 발현 구축물에서의 엡스타인 바르 바이러스 복제 기점(oriP) 또는 그의 기능적 단편의 용도에 관한 것이다. 또한, 포유동물 세포에서 항체의 증가된 생산을 위한 단백질 발현 구축물 및 발현 구축물을 함유하는 포유동물 세포가 개시된다.

Description

포유동물 세포로부터 단백질 생산성을 증가시키기 위한 바이러스 복제 기점

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2019년 10월 30일에 출원된 미국 가출원 번호 62/927,833을 우선권 주장하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

분야

본 개시내용은 포유동물 세포에서 관심 단백질의 생산을 증가시키기 위한 단백질 발현 구축물에서의 바이러스 복제 기점(oriP)의 용도에 관한 것이다. 또한, 포유동물 세포에서 항체의 증가된 생산을 위한 단백질 발현 구축물 및 발현 구축물을 함유하는 포유동물 세포가 개시된다.

서론

인간 또는 동물 세포는 단백질을 생산하기 위해 학문 및 산업에서 통상적으로 사용된다. 단백질은 일시적 또는 안정한 단백질 발현을 통해 생산될 수 있다. 안정한 단백질 발현을 위해, 일반적으로 생산에 사용될 수 있는 세포의 안정한 풀이 먼저 생성되고/거나, 이러한 풀 내의 세포가 클로닝되어 우수한 생산자인 세포주를 식별한다. 어느 쪽이든, 과학자들은 세포의 생산성을 증가시켜 생산 비용을 줄이고자 한다.

안정적으로 발현하는 세포로부터 단백질 생산을 증가시키기 위해 여러 방식, 예컨대 관심 유전자의 코돈을 변형시키는 것, 프로모터를 변형시키는 것, 스캐폴드/매트릭스 부착 영역(S/MAR) 또는 편재성 염색질 개방 요소(Ubiquitous Chromatin Opening Element)(UCOE) 요소를 혼입시키는 것, 세포 배양 배지 및 공급물을 개선시키는 것, 고발현 세포를 보다 잘 선별하는 것이 사용된다. 안정한 풀 또는 세포주로부터 단백질 생산을 증가시키기 위한 다른 방법이 필요하다.

개요

본 발명자들은 발현 플라스미드 내의 EBV oriP 서열의 혼입이 심지어 EBV의 EBNA1 단백질의 부재 하에서도 선별된 CHO 풀 및 클론에서 단백질 생산을 증가시킬 수 있음을 입증하였다.

EBNA1 단백질 EBV oriP 시스템은 CHO-3E7 플랫폼의 일시적 형질감염에 사용되어 단백질 생산을 증가시켰다. 본 발명자들은 안정한 세포주에서 생산성을 증가시키기 위한 EBNA1 단백질 EBV oriP 시스템의 용도를 조사하였다. oriP 그 자체의 존재가 안정한 풀의 생산성을 증가시키는 것으로 밝혀졌고, 세포주에서의 EBNA1의 존재는 이러한 맥락에서 생산성을 증가시키지 않았다.

따라서, 본 개시내용의 한 측면은 관심 단백질의 발현을 위한 핵산 구축물이다. 본 개시내용의 핵산 구축물은 a) 프로모터 및 전사 종결 부위에 작동 가능하게 연결된, 관심 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 적어도 1개의 발현 카세트; b) 선별 가능한 마커; 및 c) 디아드(dyad) 대칭(DS) 영역 및 반복부 패밀리(FR) 절편을 포함하는 엡스타인 바르 바이러스(EBV) 복제 기점(oriP) 또는 그의 기능적 단편을 포함한다. 한 실시양태에서, oriP 또는 그의 기능적 단편은 서열식별번호(SEQ ID NO): 1 또는 서열식별번호: 2의 서열에 대해 적어도 90 % 동일성을 갖는다.

한 실시양태에서, 핵산 구축물은 스캐폴드 부착 영역(SAR)을 추가로 포함한다.

한 실시양태에서, 프로모터는 유도성 프로모터, 경우에 따라 테트라시클린 반응 요소(TRE), ponA-유도성 프로모터 또는 큐메이트-유도성 프로모터이다.

한 실시양태에서, 프로모터는 구성적 프로모터, 경우에 따라 인간 유비퀴틴 C(UBC) 프로모터, 인간 신장 인자 1 알파(EF1A) 프로모터, 인간 포스포글리세레이트 키나제 1(PGK) 프로모터, 원숭이 바이러스 40 초기 프로모터(SV40), 시토메갈로바이러스 극-초기 프로모터(CMV) 프로모터, CMV 초기 인핸서와 커플링된 닭 b-액틴 프로모터(CAG), 하이브리드 EF1-HTLV 프로모터 또는 차이니즈 햄스터 EF1 프로모터(CHEF)이다.

한 실시양태에서, 선별 가능한 마커는 네오마이신 저항성 유전자, 히그로마이신 저항성 유전자, 퓨로마이신 저항성 유전자, 블라스티시딘 저항성 유전자, 제오신 저항성 유전자 또는 경우에 따라 글루타민 신테타제(GS) 유전자이다.

한 실시양태에서, 발현 카세트는 항체 또는 항체 단편 또는 항체 중쇄 및/또는 항체 경쇄를 코딩한다.

일부 실시양태에서, 핵산 구축물은 2개의 발현 카세트를 포함한다. 한 실시양태에서, 1개의 발현 카세트는 항체 중쇄를 코딩하고 1개의 발현 카세트는 항체 경쇄를 코딩한다.

본 개시내용의 또 다른 측면은 a) 포유동물 세포 내로 본 개시내용의 핵산 구축물을 도입하는 단계; b) 선택압을 세포에 적용하여 선별 가능한 마커를 보유하는 세포를 선별하는 단계; 및 c) 관심 단백질의 생산을 위한 조건 하에서 세포를 배양하는 단계를 포함하는 관심 단백질의 생산 방법이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 2종의 상이한 핵산 구축물이 포유동물 세포 내로 도입된다.

한 실시양태에서, 핵산 구축물 또는 구축물들은 형질감염에 의해 세포 내로 도입된다. 일부 실시양태에서, 형질감염은 형질감염 시약, 예컨대 양이온성 지질, 비-리포솜성 시약 또는 양이온성 중합체에 의해 수행된다. 경우에 따라 양이온성 중합체는 폴리에틸렌이민(PEI)이다. 다른 실시양태에서, 형질감염은 인산칼슘 형질감염 또는 전기천공/뉴클레오펙션이다.

한 실시양태에서, 단백질 생산은 동일한 조건 하에서 배양되는 경우 oriP가 결여된 핵산 구축물로부터의 세포에서의 단백질 생산에 비해 적어도 5 %, 적어도 10 %, 적어도 20 %, 적어도 30 %, 적어도 40 %, 적어도 50 %, 적어도 60 %, 적어도 70 %, 적어도 80 %, 적어도 90 %, 적어도 100 %, 적어도 150 %, 적어도 200 % 또는 적어도 250 % 증가된다.

한 실시양태에서, 포유동물 세포는 SP2/0 세포, NS/0 세포, HT-1080 세포, PER.C6 세포, HKB-11 세포, CAP 세포, HUH-7 세포, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 인간 배아 신장 293(HEK293) 세포이다. 한 실시양태에서, 세포는 EBNA1을 발현하지 않는다.

한 실시양태에서, 선별 가능한 마커는 글루타민 신테타제(GS)이고, 적용되는 선택압은 성장 배지로부터의 글루타민의 회수이다. 또 다른 실시양태에서, 선별제는 글루타민 신테타제 과발현 세포의 메티오닌 술폭시민(MSX) 선별이다. 또 다른 실시양태에서, 선별 마커는 디히드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 발현 세포의 메토트렉세이트 선별이다.

또 다른 실시양태에서, 프로모터는 유도성 프로모터이고 관심 단백질의 생산을 위한 조건은 유도제의 첨가를 포함한다.

추가의 실시양태에서, 핵산은 포유동물 세포의 게놈 내로 통합된다.

한 실시양태에서, 방법은 관심 단백질을 함유하는 포유동물 세포 및/또는 세포 배지를 수집하고, 경우에 따라 수집된 세포 및/또는 세포 배지로부터 관심 단백질을 정제하는 단계를 추가로 포함한다.

일부 실시양태에서, 핵산은 항체 단편, 항체 중쇄 및/또는 항체 경쇄를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 관심 단백질은 항체 또는 항체 단편, 경우에 따라 세툭시맙 또는 그의 단편이다.

본 개시내용의 추가 측면은 본 개시내용의 1종 이상의 핵산 구축물을 포함하는, 관심 단백질의 증가된 생산을 위한 포유동물 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 각각 상이한 관심 단백질을 코딩하는 2종의 상이한 본 개시내용의 핵산 구축물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 관심 단백질은 항체 또는 항체 단편, 경우에 따라 세툭시맙 또는 그의 단편이다.

일부 실시양태에서, 핵산 구축물 또는 구축물들은 안정하게 형질감염되고, 경우에 따라 구축물 또는 구축물들은 포유동물 세포의 게놈 내로 통합된다.

일부 실시양태에서 포유동물 세포는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 인간 배아 신장 293(HEK293) 세포이다. 한 실시양태에서, 세포는 EBNA1을 발현하지 않는다.

상기 섹션은 단지 예로서 제공되며 본 개시내용 및 첨부된 청구범위의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 본 개시내용의 조성물 및 방법과 연관된 추가의 목적 및 이점은 본 발명의 청구범위, 설명 및 실시예에 비추어 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 인지될 것이다. 예를 들어, 본 개시내용의 다양한 측면 및 실시양태는 다수의 조합으로 이용될 수 있으며, 이들 모두는 본 설명에 의해 명백하게 고려된다. 이러한 추가의 이점, 목적 및 실시양태는 본 개시내용의 범위에 명백하게 포함된다. 본 개시내용의 배경을 밝히기 위해, 및 특정한 경우에, 실시에 관한 추가의 세부사항을 제공하기 위해 본원에 사용된 간행물 및 다른 자료는 참조로 포함되고, 편의상 첨부된 참조 섹션에 열거된다.

본 개시내용의 추가의 목적, 특징 및 이점은 본 개시내용의 예시적 실시양태를 나타내는 첨부 도면과 함께 하기 상세한 설명으로부터 명백해질 것이며, 여기서:
도 1A는 pTT109™ 플라스미드 맵을 나타내고, 도 1B는 pTT96™ 플라스미드 맵을 나타내고, 도 1C는 pTT75™ 플라스미드 맵을 나타내고, 도 1D는 pTT81™ 플라스미드 맵을 나타내고, 도 1E는 pTT153™ 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 2는 oriP를 함유하는 플라스미드로 생성된 안정한 풀이 EBNA1-음성 CHO 세포에서 증가된 mAb 생산성을 갖는다는 것을 나타낸다.
도 3은 oriP가 없는 플라스미드로 생성된 풀에 비해 oriP를 함유하는 플라스미드로 생성된 28개의 안정한 풀에서 단백질 역가의 퍼센트 증가를 나타낸다.
도 4는 EBV oriP를 함유하거나 함유하지 않는 플라스미드로 생성된 풀로부터 선별된 288개의 클론으로부터의 단백질 생산을 나타낸다.
도 5는 짧은(pTT109) 또는 긴(pTT153) oriP 서열을 함유하는 플라스미드로부터의 안정한 CHO 풀 생산성을 나타낸다.
도 6은 말단절단형(mini) oriP(서열식별번호: 1) 대 전장 oriP(서열식별번호: 2)의 서열 정렬을 나타낸다.

다양한 실시양태의 설명

하기는 본 개시내용을 실시하는데 있어서 관련 기술분야의 통상의 기술자를 돕기 위해 제공된 상세한 설명이다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시내용이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원의 설명에 사용된 용어는 단지 특정한 실시양태를 기재하기 위한 것이며, 본 개시내용을 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 도면 및 다른 참고문헌은 그 전문이 명백하게 참조로 포함된다.

Ⅰ. 정의

본원에 사용된 하기 용어는 달리 명시되지 않는 한 하기에서 그들에게 부여된 의미를 가질 수 있다. 그러나, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 공지되거나 이해되는 다른 의미가 또한 가능하며, 본 개시내용의 범위 내에 있다는 것이 이해되어야 한다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 다른 참고문헌은 그 전문이 참조로 포함된다. 상충되는 경우에, 정의를 포함한 본 명세서가 우선할 것이다. 또한, 물질, 방법 및 실시예는 단지 예시적이며 제한적인 것으로 의도되지 않는다.

값의 범위가 제공되는 경우에, 문맥이 달리 명백하게 지시하지 않는 한, 그 범위의 상한과 하한 사이의 하한의 단위의 1/10까지의 각각의 개재 값 및 그 언급된 범위 내의 임의의 다른 언급된 값 또는 개재 값이 설명 내에 포괄되는 것으로 이해된다. 임의의 하한 내지 임의의 상한의 범위가 고려된다. 더 작은 범위에 독립적으로 포함될 수 있는 이러한 더 작은 범위의 상한 및 하한은 또한, 언급된 범위에서 임의의 구체적으로 배제된 한계치를 조건으로 설명 내에 포괄된다. 언급된 범위가 한계치 중 1개 또는 둘 다를 포함하는 경우, 이러한 포함된 한계치 중 어느 하나를 제외한 범위가 또한 설명에 포함된다.

본원 및 첨부된 청구범위에 사용된 단수 형태는 문맥이 달리 명백하게 지시하지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다는 것을 주목해야 한다.

본원의 상세한 설명 및 청구범위 내의 모든 수치는 "약" 또는 "대략" 나타낸 값에 의해 변형되고, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 예상될 실험적 오차 및 변동을 고려한다.

명세서 및 청구범위에서 본원에 사용된 어구 "및/또는"은 이와 같이 결합된 요소 중 "어느 1개 또는 둘 다", 즉 일부 경우에는 결합하여 존재하고 다른 경우에는 분리되어 존재하는 요소를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. "및/또는"과 함께 열거된 다수의 요소는 동일한 방식, 즉 이와 같이 결합된 요소 중 "1개 이상"으로 해석되어야 한다. 구체적으로 확인된 요소와 관련되든 관련되지 않든, "및/또는" 절에 의해 구체적으로 확인된 요소 이외의 다른 요소가 경우에 따라 존재할 수 있다.

명세서 및 청구범위에서 본원에 사용된 "또는"은 상기 정의된 "및/또는"과 동일한 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 목록에서 항목을 분리할 때, "또는" 또는 "및/또는"은 포괄적인 것으로, 즉 다수의 요소 또는 요소의 목록 중 적어도 1개를 포함할 뿐만 아니라 1개 초과 및 경우에 따라 추가의 열거되지 않은 항목을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 명백하게 반대로 나타낸 용어, 예컨대 "중 오직 1개" 또는 "중 정확히 1개" 또는 청구범위에서 사용되는 경우, "로 이루어진"만이 다수의 요소 또는 요소의 목록 중 정확히 1개의 요소만을 포함하는 것을 지칭할 것이다. 일반적으로, 본원에 사용된 용어 "또는"은 배타성의 용어, 예컨대 "어느 1개", "중 1개", "중 오직 1개" 또는 "중 정확히 1개"가 선행될 때 배타적 대안(즉, "1개 또는 다른 1개이지만 둘 다는 아님")을 나타내는 것으로만 해석될 것이다.

상기 명세서뿐만 아니라 청구범위에서, 모든 연결 어구, 예컨대 "구성하는", "포함하는", "운반하는", "갖는", "함유하는", "수반하는", "보유하는", "로 구성된" 등은 개방형인 것으로, 즉 포함하나 이에 제한되지는 않는 것을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 단지 연결 어구 "로 이루어진" 및 "로 본질적으로 이루어진"은 각각 폐쇄형 또는 반-폐쇄형 연결 어구일 것이다.

1개 이상의 요소의 목록과 관련하여 명세서 및 청구범위에서 본원에 사용된 어구 "적어도 1개"는 요소의 목록에서 요소 중 임의의 1개 이상으로부터 선택된 적어도 1개의 요소를 의미하지만, 요소의 목록 내에 구체적으로 열거된 각각의 및 모든 요소 중 적어도 1개를 반드시 포함하는 것은 아니며, 요소의 목록에서 요소의 임의의 조합을 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 이러한 정의는 또한, 구체적으로 확인된 그러한 요소와 관련되든 관련되지 않든, 어구 "적어도 1개"가 지칭하는 요소의 목록 내에서 구체적으로 확인된 요소 이외의 요소가 경우에 따라 존재할 수 있음을 허용한다.

본원에 사용된 용어 "약"은 언급되는 수의 플러스 또는 마이너스 10 %-15 %, 5-10 % 또는 경우에 따라 약 5 %를 의미한다.

또한, 1개 초과의 단계 또는 행위를 포함하는 본원에 기재된 특정 방법에서, 방법의 단계 또는 행위의 순서는 문맥이 달리 나타내지 않는 한 방법의 단계 또는 행위가 언급된 순서로 반드시 제한되지는 않는 것으로 이해되어야 한다.

Ⅱ. 물질의 조성

발현 플라스미드 내의 EBV oriP 서열의 혼입은 EBV의 EBNA1 단백질의 부재 하에 선별된 CHO 풀 및 클론에서 관심 단백질의 생산을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 관심 단백질의 증가된 발현에 유용한 핵산 구축물이 본원에 제공된다.

본원에 사용된 용어 "본 개시내용의 핵산 구축물"은 a) 프로모터 및 전사 종결 부위에 작동 가능하게 연결된, 관심 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 적어도 1개의 발현 카세트; b) 선별 가능한 마커; 및 c) 디아드 대칭(DS) 영역 및 반복부 패밀리(FR) 절편을 포함하는 EBV oriP 또는 그의 기능적 단편을 포함하는 핵산 구축물을 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "핵산 분자" 및 그의 파생어는 비변형된 DNA 또는 RNA 또는 변형된 DNA 또는 RNA를 포함하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 본 개시내용의 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드는 단일- 및 이중-가닥 DNA, 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물인 DNA, 단일- 및 이중-가닥 RNA 및 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물인 RNA, 단일-가닥 또는 보다 전형적으로 이중-가닥 또는 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물일 수 있는 DNA 및 RNA를 포함하는 하이브리드 분자로 구성될 수 있다. 또한, 핵산 분자는 RNA 또는 DNA 또는 RNA 및 DNA 둘 다를 포함하는 삼중-가닥 영역으로 구성될 수 있다. 본 개시내용의 핵산 분자는 또한 안정성 또는 다른 이유로 변형된 DNA 또는 RNA 백본 또는 1종 이상의 변형된 염기를 함유할 수 있다. "변형된" 염기는, 예를 들어 삼중수소화 염기 및 특이 염기, 예컨대 이노신을 포함한다. 다양한 변형이 DNA 및 RNA에 대해 이루어질 수 있고; 따라서 "핵산 분자"는 화학적으로, 효소적으로 또는 대사적으로 변형된 형태를 포함한다. 용어 "폴리뉴클레오티드"는 상응하는 의미를 가질 것이다.

본원에 사용된 용어 "작동 가능하게 연결된"은 2개의 성분이 의도된 방식으로 기능하도록 하는 이들 사이의 관계를 지칭한다. 예를 들어, 리포터 유전자가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 경우, 프로모터는 리포터 유전자의 발현을 작동시킨다.

용어 "프로모터" 또는 "프로모터 서열"은 일반적으로 RNA 중합효소에 의해 결합되어 하류(즉, 3') 서열의 전사를 개시하여 RNA를 생성할 수 있는 조절 DNA 서열을 지칭한다. 적합한 프로모터는 임의의 유기체로부터 유래될 수 있고, 임의의 RNA 중합효소에 의해 결합되거나 인식될 수 있다. 발현 카세트에 적합한 프로모터는 통상의 기술자에게 공지되어 있을 것이다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 유도성 프로모터이다. 유도성 프로모터의 예는, 비제한적으로, 테트라시클린 반응 요소(TRE)(예를 들어, Tet-ON 또는 Tet-OFF 시스템), ponA-유도성 발현 시스템(애질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies)) 또는 큐메이트-유도성 프로모터, 예컨대 CuO(시스템 바이오사이언시스(System Biosciences))를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 구성적 프로모터이다. 구성적 프로모터의 예는 인간 유비퀴틴 C(UBC) 프로모터, 인간 신장 인자 1 알파(EF1A) 프로모터, 인간 포스포글리세레이트 키나제 1(PGK) 프로모터, 원숭이 바이러스 40 초기 프로모터(SV40) 프로모터(진뱅크(GenBank) 수탁 번호 J02400.1), 시토메갈로바이러스 극-초기 프로모터(CMV), CMV 초기 인핸서와 커플링된 닭 b-액틴 프로모터(CAG), EF1-HTLV 하이브리드 프로모터 및 차이니즈 햄스터 EF1 프로모터(CHEF)를 포함한다.

본원에 사용된 용어 "전사 종결 부위"는 일반적으로 메신저 RNA(mRNA)의 전사를 종결시키는 폴리아데닐화 신호(pA)를 지칭한다. 적합한 pA는 임의의 유기체로부터 유래될 수 있고, 통상의 기술자에게 공지되어 있다. pA 신호의 예는, 비제한적으로, 토끼 베타-글로빈 pA(진뱅크 수탁 번호 K03256), SV40 후기 폴리A, hGH 폴리A 및 강한 소 성장 호르몬 pA(BGHpA)(진뱅크 수탁 번호 M57764.1)를 포함한다.

본원에 사용된 용어 "선별 가능한 마커"는 핵산 구축물을 보유하는 세포에 선별적 이점을 부여하는 핵산 구축물 내의 요소를 지칭한다. 예를 들어, 선별 가능한 마커는 발현되고 특정 약물에 대한 저항성을 부여하는 단백질을 코딩할 수 있다. 대안적으로, 선별 가능한 마커는 발현되고 특정 성장 조건 하의 세포 생존율에 필수적인 단백질을 코딩할 수 있다. 적합한 선별 가능한 마커는 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 적합한 약물-선별 가능한 마커의 예는, 비제한적으로, 네오마이신 저항성, 히그로마이신 저항성, 블라스티시딘 저항성, 제오신 저항성 또는 퓨로마이신 저항성을 부여하는 마커를 포함한다. 이러한 마커는 또한 저항성 유전자로 지칭된다. 특정 성장 조건 하에서의 성장에 요구되는 유전자의 예는, 비제한적으로, 글루타민 신테타제(GS)(진뱅크 수탁 번호 AY486122.1) 및 디히드로폴레이트 리덕타제(DHFR)를 포함한다.

본원에 사용된 용어 "oriP"는 디아드 대칭(DS) 영역 및 반복부 패밀리(FR) 절편 또는 그의 기능적 단편을 포함하는 엡스타인 바르 바이러스 에피솜 내에서 발견되는 바이러스 복제 기점을 지칭한다. 엡스타인 바르 바이러스(EBV) oriP는 복제가 개시되는 DS 영역 내의 4개뿐만 아니라 FR 절편 내의 20개 부위를 포함하는 24개의 EBNA1 결합 부위를 갖는다. 한 실시양태에서, EBV oriP 또는 그의 기능적 단편은 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2에 나타낸 서열 또는 그의 기능적 변이체를 포함한다.

본원에 사용된 용어 "기능적 변이체"는 실질적으로 동일한 방식으로 본원에 개시된 핵산 분자와 실질적으로 동일한 기능을 수행하는 본원에 개시된 핵산 서열의 변형을 포함한다.

한 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 oriP의 핵산 서열에 대한 기능적 변이체를 포함한다. 기능적 변이체는 적어도 중간 정도의 엄격한 혼성화 조건 하에서, 경우에 따라 엄격한 혼성화 조건 하에서 상기 제시된 핵산 서열에 혼성화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

"적어도 중간 정도의 엄격한 혼성화 조건"은 용액에서 2개의 상보적 핵산 분자 사이의 선택적 혼성화를 촉진하는 조건이 선택됨을 의미한다. 용어 "적어도 중간 정도의 엄격한 혼성화 조건"은 엄격한 혼성화 조건 및 중간 정도의 엄격한 혼성화 조건을 포괄한다. 혼성화는 핵산 서열 분자의 전부 또는 일부에 대해 일어날 수 있다. 혼성화 부분은 전형적으로 적어도 15개(예를 들어 20, 25, 30, 40 또는 50개)의 뉴클레오티드 길이이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 핵산 이중나선 또는 하이브리드의 안정성이 나트륨 함유 완충제에서 나트륨 이온 농도 및 온도의 함수인 Tm(Tm = 81.5 ℃ - 16.6(Log10[Na+]) + 0.41(%(G+C) - 600/l) 또는 유사한 방정식)에 의해 결정된다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 하이브리드 안정성을 결정하는 세척 조건에서의 파라미터는 나트륨 이온 농도 및 온도이다. 공지된 핵산 분자와 유사하지만 동일하지는 않은 분자를 확인하기 위해, 1 % 미스매치가 Tm에서 약 1 ℃ 감소를 유발하는 것으로 가정될 수 있고, 예를 들어 핵산 분자가 > 95 % 동일성을 갖는 것으로 추구되는 경우에, 최종 세척 온도는 약 5 ℃만큼 감소될 것이다. 이러한 고려사항을 기초로 하여, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 적절한 혼성화 조건을 쉽게 선택할 수 있을 것이다. 일부 실시양태에서, 엄격한 혼성화 조건이 선택된다. 예로서, 엄격한 혼성화를 달성하기 위해 하기 조건이 사용될 수 있다: 상기 방정식을 기초로 하여 Tm -5 ℃에서 5x 염화나트륨/시트르산나트륨(SSC)/5x 덴하르트(Denhardt) 용액/1.0 % SDS에서의 혼성화, 이어서 60 ℃에서 0.2x SSC/0.1 % SDS의 세척. 중간 정도의 엄격한 혼성화 조건은 42 ℃에서 3x SSC에서의 세척 단계를 포함한다. 그러나, 대안적 완충제, 염 및 온도를 사용하여 동등한 엄격도가 달성될 수 있는 것으로 이해된다. 혼성화 조건에 관한 추가의 지침은 하기에서 찾아볼 수 있다: [Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y., 2002, and in: Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001].

또 다른 실시양태에서, oriP의 기능적 변이체 핵산 서열은 본원에 개시된 서열식별번호: 1 및/또는 서열식별번호: 2의 oriP에 대해 적어도 50 % 또는 적어도 60 % 또는 적어도 70 % 또는 적어도 80 % 또는 적어도 90 %, 적어도 95 %, 적어도 99 % 또는 100 % 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.

본원에 사용된 용어 "서열 동일성"은 2개의 아미노산 서열 또는 2개의 핵산 서열 사이의 서열 동일성의 백분율을 지칭한다. 2개의 아미노산 서열 또는 2개의 핵산 서열의 퍼센트 동일성을 결정하기 위해, 서열은 최적 비교 목적을 위해 정렬된다(예를 들어, 제2 아미노산 또는 핵산 서열과의 최적 정렬을 위해 핵산 서열 또는 제1 아미노산의 서열에 갭이 도입될 수 있다). 이어서, 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치에서의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드가 비교된다. 제1 서열에서의 위치가 제2 서열에서의 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드에 의해 점유되는 경우에, 분자는 그 위치에서 동일하다. 2개의 서열 사이의 퍼센트 동일성은 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다(즉, % 동일성 = 동일한 중첩 위치의 수/위치의 총 수 × 100 %). 한 실시양태에서, 2개의 서열은 동일한 길이이다. 2개의 서열 사이의 퍼센트 동일성의 결정은 또한 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다. 2개의 서열의 비교를 위해 이용되는 수학적 알고리즘의 한 비-제한적 예는 문헌[Karlin and Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873-5877]에서와 같이 변형된 문헌[Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:2264-2268]의 알고리즘이다. 이러한 알고리즘은 문헌[Altschul et al., 1990]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램에 포함된다. BLAST 뉴클레오티드 검색은 본 개시내용의 핵산 분자에 상동인 뉴클레오티드 서열을 수득하기 위해 NBLAST 뉴클레오티드 프로그램 파라미터 세트, 예를 들어 스코어 = 100, 워드길이 = 12를 사용하여 수행될 수 있다. BLAST 단백질 검색은 본 개시내용의 단백질 분자와 상동인 아미노산 서열을 수득하기 위해 XBLAST 프로그램 파라미터 세트, 예를 들어 스코어 - 50, 워드길이 = 3을 사용하여 수행될 수 있다. 비교 목적을 위해 갭이 있는 정렬을 수득하기 위해, 갭드(Gapped) BLAST는 문헌[Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402]에 기재된 바와 같이 이용될 수 있다. 대안적으로, 분자 사이의 먼 관계를 검출하는 반복 검색을 수행하기 위해 PSI-BLAST가 사용될 수 있다. BLAST, 갭드 BLAST 및 PSI-Blast 프로그램을 이용하는 경우, 각각의 프로그램(예를 들어 XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터가 사용될 수 있다(예를 들어, NCBI 웹사이트 참조). 서열의 비교에 이용되는 수학적 알고리즘의 또 다른 비-제한적 예는 문헌[Myers and Miller, 1988, CABIOS 4:11-17]의 알고리즘이다. 이러한 알고리즘은 GCG 서열 정렬 소프트웨어 패키지의 일부인 ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 포함된다. 아미노산 서열을 비교하기 위해 ALIGN 프로그램을 이용하는 경우, PAM120 가중치 잔기 표, 갭 길이 페널티 12 및 갭 페널티 4가 사용될 수 있다. 2개의 서열 사이의 퍼센트 동일성은 갭을 허용하거나 허용하지 않으면서 상기 기재된 것과 유사한 기술을 사용하여 결정될 수 있다. 퍼센트 동일성을 계산하는데 있어서, 전형적으로 단지 정확한 매치만이 계수된다.

일부 실시양태에서, 핵산 구축물은 A/T 풍부 서열인 스캐폴드 부착 영역(SAR) 또는 스캐폴드/매트릭스 부착 영역(S/MAR)을 추가로 포함한다. SAR은 임의의 유기체로부터 유래될 수 있고, 통상의 기술자에게 공지되어 있을 것이다. 일부 실시양태에서, SAR은 인간 인터페론 알파2 상류 스캐폴드 연관 영역 3, 핵산 서열 위치 1000 내지 1751로부터의 750개 뉴클레오티드(진뱅크 수탁 번호 U82705.1)를 함유한다. 다른 실시양태에서, 핵산 구축물은 G/C 풍부 서열인 편재성 염색질 개방 요소(UCOE)를 추가로 포함한다.

본원에 기재된 핵산 구축물은 동일한 핵산 구축물로부터 2종의 관심 단백질의 발현을 허용하는 2개의 발현 카세트를 포함할 수 있다. 추가의 발현 카세트는 동일하거나 상이한 프로모터 및/또는 동일하거나 상이한 pA 신호를 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 핵산 구축물은 항체 단편, 항체 중쇄 및/또는 항체 경쇄를 코딩한다. 항체 단편, 항체 중쇄 및/또는 항체 경쇄는 별개의 핵산 구축물 상에서 코딩될 수 있거나 또는 동일한 핵산 구축물 상의 2개의 발현 카세트에 의해 코딩될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "항체"는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메라 및 인간화 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 본원에 사용된 용어 "항체 단편"은, 비제한적으로, Fab, Fab', F(ab')2, scFv, dsFv, ds-scFv, Fc-융합 단백질, 그의 이량체, 미니바디, 디아바디 및 다량체, 다중특이적 항체 단편 및 도메인 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 항체는 통상적인 기술을 사용하여 단편화될 수 있다. 예를 들어, F(ab')2 단편은 항체를 펩신으로 처리함으로써 생성될 수 있다. 생성된 F(ab')2 단편은 처리되어 디술피드 가교를 환원시킴으로써 Fab' 단편을 생산할 수 있다. 파파인 소화는 Fab 단편의 형성으로 이어질 수 있다. Fab, Fab' 및 F(ab')2, scFv, dsFv, ds-scFv, Fc-융합 단백질, 이량체, 미니바디, 디아바디, 이중특이적 항체 단편 및 다른 단편이 또한 재조합 기술에 의해 합성될 수 있다.

기본 항체 구조 단위는 폴리펩티드 쇄의 2개의 동일한 쌍으로 구성된 사량체를 포함하는 것으로 공지되어 있으며, 각각의 쌍은 1개의 경쇄("L")(약 25 kDa) 및 1개의 중쇄("H")(약 50-70 kDa)를 갖는다. 경쇄의 아미노-말단 부분은 경쇄 가변 도메인(VL)을 형성하고, 중쇄의 아미노-말단 부분은 중쇄 가변 도메인(VH)을 형성한다. 함께, VH 및 VL 도메인은 주로 항원 인식/결합을 담당하는 항체 가변 영역(Fv)을 형성한다. 중쇄 및 경쇄의 카르복시-말단 부분은 주로 이펙터 기능을 담당하는 불변 영역을 함께 형성한다.

달리 명시되지 않는 한, 본원에 사용된 "1종의" 특이적 경쇄 또는 "1종의" 특이적 중쇄를 단수로 포함하는 것으로 지칭된 항체는 둘 다의 경쇄 또는 둘 다의 중쇄가 각각 동일한 항체를 지칭한다.

일부 실시양태에서, 생산되는 항체는 세툭시맙, 팔리비주맙, 리툭시맙, 트라스투주맙 또는 그의 단편이다.

또한, 본원에 기재된 핵산 구축물 중 1종 이상을 포함하는 관심 단백질의 증가된 생산에 유용한 포유동물 세포가 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 세포는 각각 상이한 관심 단백질을 코딩하는 본원에 기재된 2종의 핵산 구축물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 관심 단백질은 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 항체 단편, 경우에 따라 세툭시맙 또는 그의 단편이다.

한 실시양태에서, 핵산 구축물 또는 구축물들은 포유동물 세포 내로 안정하게 형질감염된다. 또 다른 실시양태에서, 구축물 또는 구축물들은 포유동물 세포의 게놈 내로 통합된다.

포유동물 세포는 임의의 포유동물 세포일 수 있다. 적합한 세포는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 비제한적으로, SP2/0, NS/0, HT-1080 세포, PER.C6, HKB-11, CAP 및 HuH-7 인간 세포주, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포 및 인간 배아 신장 293(HEK293) 세포를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 세포는 CHO 세포, 경우에 따라 CHO^55E1 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 포유동물 세포는 인간 배아 신장 293(HEK293) 세포이다.

엡스타인-바르 핵 항원 1(EBNA1)은 바이러스 프로모터의 양성 및 음성 조절을 통한 유전자 조절, 염색체외 복제 및 EBV 에피솜 게놈의 유지를 포함하는 많은 EBV 기능에 필수적이다. EBNA1은 바이러스 에피솜 내의 EBV 바이러스 복제 기점(oriP)의 서열-특이적 부위에 결합한다. EBNA1의 특이적 결합 능력, 뿐만 아니라 EBV DNA를 염색체 DNA에 테더링하는 그의 능력은 EBNA1이 숙주 세포의 분열 동안 에피솜의 분할 및 복제를 매개하도록 한다. 본 발명자들은 oriP의 존재 하에 포유동물 세포로부터의 단백질의 증가된 생산이 EBNA1 유전자가 존재하였는지 여부와 무관하게 발생하였음을 발견하였다. 따라서, 한 실시양태에서, 세포는 EBNA1을 발현하지 않는다.

Ⅲ. 방법

본원에 기재된 핵산은 그 안에 코딩된 관심 단백질의 증가된 생산에 사용될 수 있다. 따라서, 본 개시내용의 한 측면은 a) 세포 내로 본 개시내용의 핵산 구축물을 도입하는 단계; b) 선택압을 세포에 적용하여 선별 가능한 마커를 보유하는 세포를 선별하는 단계; 및 c) 관심 단백질의 생산을 위한 조건 하에서 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 관심 단백질의 증가된 생산의 방법이다.

본원에 사용된 증가된 생산은 동일한 조건 하에서 oriP가 결여된 핵산 구축물로부터 발현되는 단백질과 비교하여 단백질 생산의 적어도 5 %, 적어도 10 %, 적어도 20 %, 적어도 30 %, 적어도 40 %, 적어도 50 %, 적어도 60 %, 적어도 70 %, 적어도 80 %, 적어도 90 %, 적어도 100 %, 적어도 150 %, 적어도 200 % 또는 적어도 250 %의 증가를 지칭한다.

핵산 구축물은 관련 기술분야에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 세포 내로 도입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산 구축물은 인산칼슘 형질감염 및 전기천공/뉴클레오펙션을 포함하는 형질감염에 의해 세포 내로 도입된다. 적합한 형질감염 시약은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 비제한적으로, 양이온성 중합체, 예컨대 폴리에틸렌이민(PEI), 양이온성 지질, 예컨대 리포펙타민 및 관련 시약(인비트로젠(Invitrogen)) 및 비-리포솜성 시약, 예컨데 퓨젠(Fugene) 및 관련 시약(프로메가(Promega))을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산 구축물은 PEI를 사용한 형질감염에 의해 세포 내로 도입된다.

다양한 세포가 관심 단백질의 생산을 위한 방법에 사용될 수 있다. 적합한 세포는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 비제한적으로, SP2/0, NS/0, HT-1080 세포, PER.C6, HKB-11, CAP 및 HuH-7 인간 세포, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포 및 인간 배아 신장 293(HEK 293) 세포를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 CHO 세포, 경우에 따라 CHO^55E1 세포이다.

엡스타인-바르 핵 항원 1(EBNA1)은 바이러스 프로모터의 양성 및 음성 조절을 통한 유전자 조절, 염색체외 복제 및 EBV 에피솜 게놈의 유지를 포함하는 많은 EBV 기능에 필수적이다. EBNA1은 바이러스 에피솜 내의 EBV 바이러스 복제 기점(oriP)의 서열-특이적 부위에 결합한다. EBNA1의 특이적 결합 능력, 뿐만 아니라 EBV DNA를 염색체 DNA에 테더링하는 그의 능력은 EBNA1이 숙주 세포의 분열 동안 에피솜의 분할 및 복제를 매개하도록 한다. EBNA1은 염색체외 DNA를 복제할 수 있을 뿐, 염색체-통합된 DNA는 그렇지 않은 것으로 나타났다. EBNA1은 형질감염된 주형으로부터 전사를 활성화(전사활성화(transactive))시키는 것으로 나타났다. 본원에서 입증된 바와 같이, EBNA1 단백질의 발현은 본 개시내용의 oriP 서열의 존재 하에 증진된 단백질 생산을 위해 요구되지 않는다. 따라서, 일부 실시양태에서, 방법은 EBNA1 단백질을 발현하지 않는 세포에서 수행된다.

세포에 적용되는 선택압은 핵산 구축물에 존재하는 선별 마커에 따라 달라질 것이다. 본원에 사용된 용어 "선택압"은 선별 가능한 마커를 보유하는 세포에 대해 세포 생존율에서 선별적 이점을 제공하는 세포의 성장 조건을 지칭한다. 선별적 성장 조건은, 비제한적으로, 약물의 첨가 또는 성장에 필수적인 성분의 회수를 포함할 수 있다. 예를 들어, 선별 가능한 마커가 항생제 저항성 유전자인 경우, 선택압은 항생제의 첨가에 의해 적용된다. 또 다른 예로서, 선별 가능한 마커가 글루타민 신테타제인 경우, 선택압은 성장 배지로부터의 글루타민의 회수에 의해 적용된다. 또 다른 예에서, 선별제는 글루타민 신테타제 과발현 세포의 선별을 위한 메티오닌 술폭시민(MSX)이다. 또 다른 실시양태에서, 선별 마커는 디히드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 발현 세포의 선별을 위한 메토트렉세이트이다.

본원에 기재된 바와 같이, 핵산 구축물의 발현 카세트는 유도성 프로모터를 포함할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 관심 단백질의 생산을 위한 조건은 유도제의 첨가를 포함한다. 예를 들어, 유도성 프로모터가 큐메이트-유도성 프로모터인 경우, 관심 단백질의 생산을 위한 조건은 성장 배지에의 큐메이트의 첨가를 포함한다.

본원에서 입증된 바와 같이, 생산되는 단백질은 항체일 수 있다. 항체 중쇄 및 항체 경쇄는 별개의 핵산 구축물 상에서 코딩될 수 있거나 또는 동일한 핵산 구축물 상의 2개의 발현 카세트에 의해 코딩될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 세툭시맙이다.

일부 실시양태에서, 방법은 관심 단백질을 함유하는 세포 및/또는 세포 배지를 수집하고, 경우에 따라 수집된 세포 및/또는 세포 배지로부터 관심 단백질을 정제하는 단계를 추가로 포함한다. 정제 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 정제되는 단백질에 따라 달라질 것이다.

하기 비-제한적 실시예는 본 개시내용을 예시한다:

Ⅳ. 실시예

실시예 1. 엡스타인 바르 바이러스 oriP 서열의 사용에 의한 세포로부터의 증가된 안정한 단백질 생산

예를 들어, 단일 쇄 단백질 또는 항체를 발현하는 안정한 풀 또는 안정한 세포주를 생산하기 위해, 관심 유전자를 4종의 상이한 발현 플라스미드 중 하나에 클로닝하였다(표 1).

표 1

단일 쇄 단백질과 관련하여, 유전자를 pTT75™ 또는 pTT81™에 클로닝하였다.

항체와 관련하여, 2가지 접근법을 사용하였다:

a) 중쇄 및 경쇄 유전자를 별개의 pTT75™ 또는 pTT81™ 플라스미드 상에 클로닝하고 세포 내로 공동-형질감염시켰다.

b) 중쇄 및 경쇄 유전자를 pTT96™ 또는 pTT109™ 플라스미드에서 각각 CR5 프로모터에 의해 제어되는 단일 벡터에 클로닝하였다. 단일 플라스미드의 사용은 이 경우에 형질감염에 충분하였다.

이러한 플라스미드는 토끼 베타-글로빈 폴리아데닐화 신호(pA)(진뱅크 수탁 번호 K03256)와 조합된 CR5 큐메이트-유도성 프로모터(캐나다 국립 연구소(National Research Council of Canada) 소유)를 함유한다[1]. 모두 pTT™ 발현 벡터로부터 유래된[2], 이러한 플라스미드를 강한 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호(BGHpA)(진뱅크 수탁 번호 M57764.1)와 조합된, 구성적 SV40 프로모터(진뱅크 수탁 번호 J02400.1)의 제어 하에 증폭 가능한 포유동물 선별 가능한 마커로서 HEK293-6E 세포(EBNA1을 발현하는 인간 배아 신장 293 세포 클론 6E)로부터 유래된 글루타민 신테타제 유전자(진뱅크 수탁 번호 AY486122.1)로 조작하였다[3]. 글루타민 신테타제 유전자(GS)를 코딩하는 cDNA를 써모스크립트™(ThermoScript™) RT-PCR 시스템 & 플래티넘®(Platinum®) Taq DNA 중합효소 키트(인비트로젠, 미국)를 사용하여 역전사/증폭에 의해 합성하고, mRNA를 마이크로 패스트트랙™(Micro FastTrack™) mRNA 단리 키트(인비트로젠, 미국)를 사용하여 HEK293-6E 세포로부터 단리하였다. 증진되고 지속적인 트랜스진 발현을 부여하는 스캐폴드 부착 영역(SAR)을 SV40 프로모터의 상류에 삽입하였다[4]. 진아트™ 진 신테시스 서비스(GeneArt™ Gene Synthesis Service)에 의해 합성된 SAR 서열은 인간 인터페론 알파2 상류 스캐폴드 연관 영역 3, 핵산 서열 위치 1000 내지 1751로부터의 750개 뉴클레오티드(진뱅크 수탁 번호 U82705.1)를 함유한다. pMB1 ori 및 암피실린 서열은 pcDNA3.1 벡터(써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific), 미국)로부터 유래된다.

EBNA1은 바이러스 프로모터의 양성 및 음성 조절을 통한 유전자 조절, 염색체외 복제 및 EBV 에피솜 게놈의 유지를 포함하는 많은 EBV 기능에 필수적이다. 연구는 EBNA1 상의 10개의 특이적 부위의 인산화가 이러한 기능을 조절함을 나타낸다. 인산화가 발생하지 않을 때, 단백질의 복제 및 전사 활성은 유의하게 감소된다. EBNA1은 바이러스 에피솜 내의 바이러스 복제 기점(oriP)의 서열-특이적 부위에 결합한다. oriP는 복제가 개시되는 디아드 대칭 영역(DS로 불린다) 내의 4개뿐만 아니라 반복부 패밀리 절편(FR로 불린다) 내의 20개 부위를 포함하는 24개의 EBNA1 결합 부위를 갖는다. EBNA1의 특이적 결합 능력, 뿐만 아니라 EBV DNA를 염색체 DNA에 테더링하는 그의 능력은 EBNA1이 숙주 세포의 분열 동안 에피솜의 분할 및 복제를 매개하도록 한다. EBNA1은 또한 여러 메커니즘을 통해 일부 바이러스 프로모터와 상호작용하여, EBNA1 자체뿐만 아니라 다른 EBNA(2 및 3) 및 EBV 잠재성 막 단백질 1(LMP1)의 전사 조절에 추가로 기여한다. EBNA1은 염색체외 DNA를 복제할 수 있을 뿐, 염색체-통합된 DNA는 그렇지 않은 것으로 나타났다.

일시적 CHO-3E7 단백질 생산 시스템은 코돈-최적화되고 말단절단형 버전의 EBNA1 단백질을 발현하는 CHO 세포에 의존한다[5]. 엡스타인-바르 핵 항원 1(EBNA1)은 형질감염된 주형으로부터 전사를 활성화(전사활성화)시키는 것으로 밝혀졌지만, 염색체-통합된 주형으로부터 전사를 활성화시키는 그의 능력은 논쟁의 여지가 있다[6]. EBNA1이 CHO 세포에서 통합된 oriP-함유 플라스미드 DNA의 영역을 전사활성화할 수 있는지 조사하기 위해, EBV oriP를 함유하거나 함유하지 않는 플라스미드로부터 세툭시맙의 안정한 발현과 함께, EBNA1을 안정하게 발현하는 안정한 CHO^55E1 세포주를 생성하였다. 2개의 기능적 성분, 디아드 대칭(DS) 요소 및 엡스타인-바르 바이러스(EBV)로부터 유래된 반복부 패밀리(FR)를 포함하는 oriP(진뱅크 수탁 번호 V01555.2)[7]를 항체 발현 카세트(CR5 프로모터)의 하류 및 암피실린 저항성 유전자 전에 도입하였다. pTT109™ 플라스미드의 지도를 도 1A에 나타내었다. 세포 배양, 형질감염, 선별, 단백질 발현 유도 및 정제를 위한 방법은 본질적으로 [3] 및 [8]에 기재된 바와 같았다.

CHO-3E7 세포에서 관찰된 상황과 대조적으로, CHO^55E1 세포 내의 EBNA1의 존재는 (비-oriP 플라스미드에 비해)oriP-함유 플라스미드를 사용한 경우 세툭시맙 생산을 유의하게 증가시키지 않았고, 이는 EBNA1이 CHO^55E1 세포에서 통합된 oriP-함유 플라스미드 DNA를 효율적으로 전사활성화시키지 않음을 시사한다. 또한, oriP-함유 플라스미드로 생성된 2개의 풀은 비-EBNA1 CHO^55E1 세포에서 비-oriP 플라스미드 생성 풀에 비해 유의하게 증가된 세툭시맙 생산성을 가졌다(도 2).

이를 추가로 조사하여, CR5-기반 발현 플라스미드에서 관심 유전자를 코딩하는 영역 이후의 엡스타인 바르 바이러스로부터의 oriP 서열의 통합은 거의 항상 증가된 생산성을 갖는 안정한 세포 풀을 생성하는 것으로 밝혀졌다. oriP를 함유하는 플라스미드로 생성된 풀 중 93 %(28개 중 26개)는 oriP를 함유하지 않는 플라스미드로 생성된 대조군 풀에 비해 동등하거나 증가된 생산성을 가졌다(도 3 참조). 28회 실험 내내, 생산성은 52의 표준 편차로 평균 55 %(중앙값 53 %) 증가하였다. 단일 프로모터 접근법(pTT81™ 대 pTT75™) 또는 이중 프로모터 접근법(pTT109™ 대 pTT96™)을 사용하는 경우 oriP의 존재로부터의 개선은 유사하였다. 또한, 1개는 oriP-함유 플라스미드의 형질감염을 통해 생성되고(군 1), 다른 것은 oriP가 없는 플라스미드의 형질감염을 통해 생성된(군 2), 항체를 발현하는 2개의 풀 상에서 단일 세포 클로닝을 수행할 때, oriP 풀(군 1)로부터의 클론은 증가된 생산성을 가졌다(도 4). 288개의 군 1 클론은 288개의 군 2 클론에 대한 608 mg/L에 비해 1067 mg/L의 평균 생산성을 가졌다(76 % 증가). 전형적인 클로닝 프로젝트에서, 상위 96개의 생산자만이 다음 라운드를 위해 유지되기 때문에, 군 1에 대한 상위 96개 생산자는 군 2에 대한 1006 mg/L에 비해 1566 mg/L의 평균 생산성을 가졌다(56 % 증가).

이러한 효과가 EBV로부터의 원래의 전장 oriP 서열에서 또한 발견되었는지를 평가하기 위해, 전장 oriP 서열을 함유하는 또 다른 플라스미드(pTT153, 도 1E에 나타냄)를 생성하고 2가지 상이한 공급 요법(R1 및 R2)을 사용하여 항체에 대한 안정한 풀 생산성을 비교하였다. R1의 경우, 상업적 세포 배양 공급물을 유도-후 0, 3, 5, 7, 10, 12, 14일에 각각 배양 부피의 1.5, 5, 5, 7.5, 5, 5 및 7.5 %로 첨가하였다. R2의 경우, 또 다른 상업적 세포 배양 공급물을 유도-후 0, 3, 5, 7, 10, 12, 14일에 각각 배양 부피의 5, 5, 10, 15, 10, 10 및 7.5 %로 첨가하였다. 전장 서열 또는 oriP를 함유하는 플라스미드 pTT153은 oriP 서열을 함유하지 않는 pTT96에 비해 안정한 풀 생산성을 증가시켰다(도 5). pTT153을 사용한 생산성의 증가는 짧은 oriP 서열(pTT109, 도 1A에 나타냄)을 사용해 수득한 것과 유사한 것으로 밝혀졌다.

전체적으로, 데이터는 oriP를 함유하는 2종의 플라스미드, 예컨대 pTT81™ 및 pTT109™ 플라스미드를 사용하는 항체의 경우 증가된 풀 생산성을 부여하며, 이는 개선된 생산성을 갖는 클론을 선별할 증가된 가능성으로 해석된다. 이러한 증가된 생산성은 또한 EBV의 oriP의 전장 서열을 사용할 때 관찰된다.

표 2: 서열

참고문헌:

SEQUENCE LISTING <110> National Research Council of Canada <120> VIRAL ORIGIN OF REPLICATION TO INCREASE PROTEIN PRODUCTIVITY FROM MAMMALIAN CELLS <130> 2018-077-01 <150> US 62/927,833 <151> 2019-10-30 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 688 <212> DNA <213> Epstein-Barr Virus <400> 1 accctaaacg ggtagcatat gcttcccggg tagtagtata tactatccag actaacccta 60 attcaatagc atatgttacc caacgggaag catatgctat cgaattaggg ttagtaaaag 120 ggtcctaagg aacagcgatg taggtgggcg ggccaagata ggggcgcgat tgctgcgatc 180 tggaggacaa attacacaca cttgcgcctg agcgccaagc acagggttgt tggtcctcat 240 attcacgagg tcgctgagag cacggtgggc taatgttgcc atgggtagca tatactaccc 300 aaatatctgg atagcatatg ctatcctaat ctatatctgg gtagcatagg ctatcctaat 360 ctatatctgg gtagcatatg ctatcctaat ctatatctgg gtagtatatg ctatcctaat 420 ttatatctgg gtagcatagg ctatcctaat ctatatctgg gtagcatatg ctatcctaat 480 ctatatctgg gtagtatatg ctatcctaat ctgtatccgg gtagcatatg ctatcctaat 540 agagattagg gtagtatatg ctatcctaat ttatatctgg gtagcatata ctacccaaat 600 atctggatag catatgctat cctaatctat atctgggtag catatgctat cctaatctat 660 atctgggtag cataggctat cctaatct 688 <210> 2 <211> 1753 <212> DNA <213> Epstein-Barr Virus <400> 2 gtagctaccg ataagcggac cctcaagagg gcattagcaa tagtgtttat aaggccccct 60 tgttaaccct aaacgggtag catatgcttc ccgggtagta gtatatacta tccagactaa 120 ccctaattca atagcatatg ttacccaacg ggaagcatat gctatcgaat tagggttagt 180 aaaagggtcc taaggaacag cgatatctcc caccccatga gctgtcacgg ttttatttac 240 atggggtcag gattccacga gggtagtgaa ccattttagt cacaagggca gtggctgaag 300 atcaaggagc gggcagtgaa ctctcctgaa tcttcgcctg cttcttcatt ctccttcgtt 360 tagctaatag aataactgct gagttgtgaa cagtaaggtg tatgtgaggt gctcgaaaac 420 aaggtttcag gtgacgcccc cagaataaaa tttggacggg gggttcagtg gtggcattgt 480 gctatgacac caatataacc ctcacaaacc ccttgggcaa taaatactag tgtaggaatg 540 aaacattctg aatatcttta acaatagaaa tccatggggt ggggacaagc cgtaaagact 600 ggatgtccat ctcacacgaa tttatggcta tgggcaacac ataatcctag tgcaatatga 660 tactggggtt attaagatgt gtcccaggca gggaccaaga caggtgaacc atgttgttac 720 actctatttg taacaagggg aaagagagtg gacgccgaca gcagcggact ccactggttg 780 tctctaacac ccccgaaaat taaacggggc tccacgccaa tggggcccat aaacaaagac 840 aagtggccac tctttttttt gaaattgtgg agtgggggca cgcgtcagcc cccacacgcc 900 gccctgcggt tttggactgt aaaataaggg tgtaataact tggctgattg taaccccgct 960 aaccactgcg gtcaaaccac ttgcccacaa aaccactaat ggcaccccgg ggaatacctg 1020 cataagtagg tgggcgggcc aagatagggg cgcgattgct gcgatctgga ggacaaatta 1080 cacacacttg cgcctgagcg ccaagcacag ggttgttggt cctcatattc acgaggtcgc 1140 tgagagcacg gtgggctaat gttgccatgg gtagcatata ctacccaaat atctggatag 1200 catatgctat cctaatctat atctgggtag cataggctat cctaatctat atctgggtag 1260 catatgctat cctaatctat atctgggtag tatatgctat cctaatttat atctgggtag 1320 cataggctat cctaatctat atctgggtag catatgctat cctaatctat atctgggtag 1380 tatatgctat cctaatctgt atccgggtag catatgctat cctaatagag attagggtag 1440 tatatgctat cctaatttat atctgggtag catatactac ccaaatatct ggatagcata 1500 tgctatccta atctatatct gggtagcata tgctatccta atctatatct gggtagcata 1560 ggctatccta atctatatct gggtagcata tgctatccta atctatatct gggtagtata 1620 tgctatccta atttatatct gggtagcata ggctatccta atctatatct gggtagcata 1680 tgctatccta atctatatct gggtagtata tgctatccta atctgtatcc gggtagcata 1740 tgctatcctc acg 1753

Claims (35)

1. a) 프로모터 및 전사 종결 부위에 작동 가능하게 연결된, 관심 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 적어도 1개의 발현 카세트;
   b) 선별 가능한 마커; 및
   c) 디아드 대칭(DS) 영역 및 반복부 패밀리(FR) 절편을 포함하는 엡스타인 바르 바이러스(EBV) oriP 또는 그의 기능적 단편
   을 포함하는 핵산 구축물.
2. 제1항에 있어서, oriP 기능적 단편은 서열식별번호: 1에 제시된 서열에 대해 적어도 90 % 동일성, 적어도 95 % 동일성, 적어도 99 % 동일성 또는 100 % 동일성 핵산 서열을 포함하는 것인, 핵산 구축물.
3. 제1항에 있어서, oriP 또는 기능적 단편은 서열식별번호: 2에 제시된 서열에 대해 적어도 90 % 동일성, 적어도 95 % 동일성, 적어도 99 % 동일성 또는 100 % 동일성 핵산 서열을 포함하는 것인, 핵산 구축물.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 스캐폴드 부착 영역(SAR)을 추가로 포함하는, 핵산 구축물.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터는 유도성 프로모터인, 핵산 구축물.
6. 제5항에 있어서, 유도성 프로모터는 테트라시클린 반응 요소(TRE), ponA-유도성 프로모터 또는 큐메이트-유도성 프로모터인, 핵산 구축물.
7. 제6항에 있어서, 유도성 프로모터는 큐메이트-유도성 프로모터인, 핵산 구축물.
8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터는 구성적 프로모터인, 핵산 구축물.
9. 제8항에 있어서, 구성적 프로모터는 인간 유비퀴틴 C(UBC) 프로모터, 인간 신장 인자 1 알파(EF1A) 프로모터, 인간 포스포글리세레이트 키나제 1(PGK) 프로모터, 원숭이 바이러스 40 초기 프로모터(SV40), 시토메갈로바이러스 극-초기 프로모터(CMV), CMV 초기 인핸서와 커플링된 닭 b-액틴 프로모터(CAG), 하이브리드 EF1-HTLV 프로모터 또는 차이니즈 햄스터 EF1(CHEF) 프로모터인, 핵산 구축물.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 선별 가능한 마커는 네오마이신 저항성 유전자, 히그로마이신 저항성 유전자, 퓨로마이신 저항성 유전자, 블라스티시딘 저항성 유전자, 제오신 저항성 유전자 또는 글루타민 신테타제(GS) 유전자인, 핵산 구축물.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 카세트는 항체 단편, 항체 중쇄 및/또는 항체 경쇄를 코딩하는 것인, 핵산 구축물.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 2개의 발현 카세트를 포함하는 것인, 핵산 구축물.
13. 제12항에 있어서, 1개의 발현 카세트는 항체 중쇄를 코딩하고, 1개의 발현 카세트는 항체 경쇄를 코딩하는 것인, 핵산 구축물.
14. a) 포유동물 세포 내로 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 1종 이상의 핵산 구축물을 도입하는 단계;
    b) 선택압을 세포에 적용하여 선별 가능한 마커를 보유하는 세포를 선별하는 단계; 및
    c) 관심 단백질의 생산을 위한 조건 하에서 세포를 배양하는 단계
    를 포함하는, 포유동물 세포에서 관심 단백질을 생산하는 방법.
15. 제14항에 있어서, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 2종의 상이한 핵산 구축물을 세포 내로 도입하는 것인, 방법.
16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 1종 이상의 핵산 구축물이 형질감염에 의해 세포 내로 도입되는 것인, 방법.
17. 제16항에 있어서, 형질감염은 형질감염 시약을 사용하여 수행되며, 여기서 형질감염 시약은 양이온성 지질, 비-리포솜성 시약 또는 양이온성 중합체, 경우에 따라 폴리에틸렌이민(PEI)인, 방법.
18. 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 생산은 동일한 조건 하에서 배양되는 경우 oriP가 결여된 핵산 구축물로부터의 세포에서의 단백질 생산에 비해 적어도 5 %, 적어도 10 %, 적어도 20 %, 적어도 30 %, 적어도 40 %, 적어도 50 %, 적어도 60 %, 적어도 70 %, 적어도 80 %, 적어도 90 %, 적어도 100 %, 적어도 150 %, 적어도 200 % 또는 적어도 250 % 증가되는 것인, 방법.
19. 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물 세포는 SP2/0 세포, NS/0 세포, HT-1080 세포, PER.C6 세포, HKB-11 세포, CAP 세포, HuH-7 세포, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 인간 배아 신장 293(HEK293) 세포인, 방법.
20. 제19항에 있어서, 세포는 CHO 세포인 방법.
21. 제14항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 EBNA1을 발현하지 않는 것인, 방법.
22. 제14항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 구축물의 선별 가능한 마커는 글루타민 신테타제(GS)이고, 적용되는 선택압은 성장 배지로부터의 글루타민의 회수인, 방법.
23. 제14항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터는 유도성 프로모터이고, 관심 단백질의 생산을 위한 조건은 유도제의 첨가를 포함하는 것인, 방법.
24. 제14항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 구축물은 포유동물 세포의 게놈 내로 통합되는 것인, 방법.
25. 제14항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 단백질을 함유하는 포유동물 세포 및/또는 세포 배지를 수집하고, 경우에 따라 수집된 세포 및/또는 세포 배지로부터 관심 단백질을 정제하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
26. 제14항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 단백질은 항체 또는 항체 단편인, 방법.
27. 제14항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 구축물은 항체 중쇄 및/또는 항체 경쇄를 코딩하고, 생산되는 단백질은 항체이고, 경우에 따라 항체는 세툭시맙인, 방법.
28. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 1종 이상의 핵산 구축물을 포함하는, 관심 단백질의 증가된 생산을 위한, 포유동물 세포.
29. 제28항에 있어서, 각각의 구축물은 상이한 관심 단백질을 코딩하는, 2종의 핵산 구축물을 포함하는, 포유동물 세포.
30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 핵산 구축물 또는 구축물들로 안정하게 형질감염된, 포유동물 세포.
31. 제30항에 있어서, 핵산 구축물 또는 구축물들은 게놈 내에 통합되는 것인, 포유동물 세포.
32. 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항체 단편을 발현하는, 포유동물 세포.
33. 제32항에 있어서, 항체는 세툭시맙, 팔리비주맙, 리툭시맙 또는 트라스투주맙인, 포유동물 세포.
34. 제28항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, SP2/0 세포, NS/0 세포, HT-1080 세포, PER.C6 세포, HKB-11 세포, CAP 세포, HuH-7 세포, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 인간 배아 신장 293(HEK293) 세포인, 포유동물 세포.
35. 제28항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 EBNA1을 발현하지 않는 것인, 포유동물 세포.
    

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