KR20220088317A - 발효 프로폴리스를 포함하는 항노화 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 발효 프로폴리스 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 발효 프로폴리스 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 피부 주름 또는 피부 탄력 개선, 피부 미백, 피부 보습, 피부 항산화 또는 항염증 용도를 위해 다양하게 사용될 수 있고, 상기 조성물은 본 발명에 따른 제조방법에 의해 아르테필린 C의 함량이 증가되어 더욱 우수한 효과를 나타낼 수 있다.

Description

발효 프로폴리스를 포함하는 항노화 조성물{ANTI-AGING COMPOSITION COMPRISING FERMENTED PROPOLIS}
본 발명은 발효 프로폴리스 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
프로폴리스(propolis)는 러시안 페니실린 또는 천연페니실린 이라고도 불리는데 벌이 수목류로부터 생장점 보호물질, 진액 등의 수지(resin)를 수집하여 자신이 분비한 타액과 혼합하여 만든 천연 왁스상 혼합물질로서 식물성수지, 왁스, 정유, 화분, 플라보노이드 및 기타 유기물과 미네랄 등 300가지 이상의 물질로 구성되어 있다.
프로폴리스의 주요한 효능으로는 항염, 항산화, 항암 및 면역증강 등이 있다. 근래에는 프로폴리스 중에 포함된 성분인 플라보노이드(flavonoids)와 테르페노이드(terpenoids)가 나타내는 항산화작용에 기인한 다양한 약리작용에 대하여 많은 연구와 관심이 모아지고 있다. 특별히 피부, 점막 및 구강감염에 대한 치료효과는 프로폴리스에서 분리동정된 다양한 물질에 기인한 것으로 적어도 150여개의 테르펜(terpene)류나, 카페인산 에스테르(caffeic acid ester)류, 플라보노이드(flavonoids) 및 아미노산 등과 같은 페닐프로판(phenylpropane) 유도체들이 관여하는 것으로 연구되어 있으며, 이러한 염증성 질환 완화에 프로폴리 스를 사용하고자 하는 연구들이 점차 늘어남에 따라 프로폴리스를 활용한 다양한 제품들도 개발되고 있다.
이러한 프로폴리스는 지역별로 서식하고 있는 식물의 종류와 분포에 따라 활성성분, 색깔, 맛 등에서 차이가 나는데, 이는 일벌들이 나무 수종이나 수지를 수집해 오는 종류에 따라 성분이 달라지기 때문이다. 프로폴리스의 색은 다양한 종류가 있으며, 색의 차이에 따라 유효성분에서도 차이가 있다. 그린 프로폴리스, 레드프로폴리스, 브라운프로폴리스 등이 알려져 있다.
한편, 미생물은 종래 식품에 유용하게 사용되어 왔다. 최근에는 의약품 제조와 화장품 산업에서도 그 사용이 증가되고 있다.
유산균은 탄수화물을 혐기적으로 이용하여 유산을 생산하는 미생물이다. 이러한 유산균을 화장품 원료로 사용하고 있는데, 예컨대 스트렙토코커스 속(Streptococcus sp .), 페디오코커스 속(Pediococcus sp .), 류코노스톡 속(Leuconostoc sp .), 락토바실러스 속(Lactobacillus sp .), 스포로락토바실러스 속 (Sporolactobacilus sp .), 비피도박테리움 속(Bifidobacterium sp .) 등과 같은 유산균들을 배양하여 얻어지는 발효액들은 종래 미백이나 보습 등과 같은 효과가 있는 것으로 보고되고 있으나, 프로폴리스를 이러한 유산균 균주로 발효하여 피부 주름, 피부 탄력, 피부 미백, 피부 항산화, 피부 보습 및 피부 항염증 효과가 증진되는 효과를 개시한 문헌은 없었다.
한편, 프로폴리스 중에도 그린 프로폴리스는 다른 프로폴리스와 달리 아르테필린 C(Artepillin C)가 함유되어 있어 항산화, 항염 등에 뛰어난 효과가 있는 것으로 알려져 있다.
이러한 아르테필린 C는 일반적인 추출 방법으로 추출 시 극소량으로 추출되기 때문에 추출물 제조 시 아르테필린 C의 함량을 증진시킬 수 있는 제조방법에 대한 필요성이 요구되고 있다.
1: KR 10-2298533
본 발명의 목적은 발효 프로폴리스 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 개선, 탄력 개선, 미백, 항산화 또는 항염증용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 아르테필린 C의 함량이 증가된 발효 프로폴리스 추출물의 제조방법 및 이에 따라 제조된 발효 프로폴리스를 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명자들은 프로폴리스 내에 함유되어 있는 즉, 추출물 제조 시 추출물 내에 아르테필린 C(Artepillin C)의 함량이 증가시킬 수 있는 방법을 연구한 결과, 저온 추출(Cold Extraction), 초음파 추출(Ultrasonic Extraction), 발효 균주 접종 및 용매 추출을 통해 추출하면 아르테필린 C의 함량이 증가된 발효 프로폴리스 추출물을 획득할 수 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 발효 프로폴리스 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 상기 조성물은 아르테필린 C(Artepillin C)의 함량이 증가된 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 아르테필린 C(Artepillin C)의 분자식은 C19H24O3이고, 분자량은 300.40으로, 아래 화학식 1로 나타낼 수 있다.
[화학식 1]
Figure pat00001
본 발명에 있어서, 상기 프로폴리스는 그 종류에 제한되지 않으나, 그린 프로폴리스, 레드프로폴리스 및 브라운프로폴리스로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있고, 바람직하게는 그린 프로폴리스일 수 있다.
한편, 그린 프로폴리스 내에 다량 함유되어 있는 것으로 알려진 상기 아르테필린 C는 종래 미백, 항산화("Artepillin C and phenolic compounds responsible for antimicrobial and antioxidant activity of green propolis and Baccharis dracunculifolia DC", M.C. Marcucci 외, Journal of Applied Microbiology 122, 911--920), 항염증("Anti-inflammatory effects of a bioavailable compound, Artepillin C, in Brazilian propolis", Walter A. Bretz 외, European Journal of Pharmacology 587 (2008) 296-301), 보습 등의 효과가 있는 것으로 알려진 성분이다.
본 발명은 이러한 아르테필린 C의 함량이 증가된 발효 프로폴리스 추출물의 제조방법을 제공한다.
일 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 제조방법에 따라 제조된 발효 프로폴리스 추출물 내에 함유된 아르테필린 C의 함량은 35ppm으로, 일반적인 추출방법을 통해 수득된 프로폴리스 추출물 내에 함유된 아르테필린 C의 함량 6ppm 대비 약 5.8배 함량이 증가함을 확인하였다.
본 발명의 조성물은 저온 추출(Cold Extraction), 초음파 추출(Ultrasonic Extraction), 발효 균주 접종 및 용매 추출을 통해 프로폴리스 내에 함유되어 있는 아르테필린 C의 함량을 증가시킬 수 있고, 이를 통해 더욱 우수한 피부 주름 또는 피부 탄력 개선, 피부 미백, 피부 보습, 피부 항산화 및/또는 항염증 효과를 제공할 수 있다. 이러한 측면에서, 본 발명은 피부 주름 또는 피부 탄력 개선, 피부 미백, 피부 보습, 피부 항산화 및/또는 항염증용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 화장료 조성물, 약학적 조성물, 외용제 조성물, 의약외품 조성물 또는 식품 조성물 등으로 사용될 수 있으며, 상기 각 조성물은 사용 목적, 유효성분의 함량 등에 따라 카테고리를 달리하여 사용할 수 있다.
본 명세서에서 "주름 개선 효과"라 함은 피부에 주름이 생기는 것을 예방, 억제 또는 저해하거나, 이미 생성된 주름을 완화시키는 것을 말한다.
본 명세서에서 "탄력 개선 효과"라 함은 피부 탄력이 유지 또는 개선되는 것을 말한다.
본 명세서에서 "리프팅 개선 효과"라 함은 피부 탄력 개선 및 주름 개선 효과로 인해 피부 조직이 물리적으로 당겨 올라가는 효과를 일컫는다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 프로폴리스 추출물 및 프로폴리스 추출물을 발효 균주로 발효시킨 발효 프로폴리스 추출물을 인간 섬유아세포 배지에 처리했을 때, 발효 전인 프로폴리스 추출물 처리군에서는 세포활성 효능이 나타나지 않았으나, 발효 후인 발효 프로폴리스 추출물 처리군에서는 세포활성 효능이 나타남을 확인하였다.
본 발명의 다른 실시예에서, 프로폴리스 추출물의 눈가주름, 눈 밑주름, 팔자주름, 목주름에서의 개선 효과를 확인하였고(도 4 내지 7), 좌우측 볼의 나비존 부위, 입가, 눈가, 팔자 부위, 이중턱 부위 및 턱 부위에서 리프팅 개선 효과를 확인하였으며(도 8 내지 14), 피부 치밀도 및 피부 탄력 개선 효과를 확인하였고(도 15 및 16), 기미 면적 개선(도 17), 피부 광채 증가 효과(도 18), 피부 보습 개선 효과(도19 및 20)를 확인하였다.
상기 기술한 본 발명의 효과들은 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 발효 프로폴리스 추출물 내에 그 함량이 증가된 아르테필린 C에 의해 나타나는 것일 수 있다.
본 발명의 조성물은 발효 프로폴리스 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 또는 피부 탄력 개선용 조성물일 수 있다.
본 명세서에서 "미백 효과"라 함은 피부 톤을 밝게 할 뿐만 아니라, 자외선, 호르몬 또는 유전에 기인한 기미, 주근깨, 과색소 침착증을 완화 또는 개선하는 것을 말한다.
본 명세서에서 "광채 효과"라 함은 피부 보습으로 인해 피부가 수분을 함유하여 촉촉하고 미백 효과로 인해 맑은 피부 톤을 유지하는 상태를 일컫는다.
본 발명의 조성물은 발효 프로폴리스 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물일 수 있다.
본 발명에서 "보습"이라 함은 건조한 대기와 자극에 의해 건조하고 거칠며 각질이 일어나는 피부에 수분을 공급하고 수분의 증발을 차단하여 피부의 유연성을 유지하고 균일한 각질 탈락을 유도하여 매끈한 표면을 유지하게 하는 것이다.
상기 보습은 예컨대, 아토피 피부염, 건선, 피부 건조증, 습진 및 색소성 건피증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상에 대한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
따라서, 본 발명의 조성물은 발효 프로폴리스 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 보습용 조성물일 수 있다.
본 발명에서 "항산화 효과"라 함은 세포내 대사 또는 자외선의 영향으로 인한 산화적 스트레스에 따라 반응성이 높은 자유 라디칼(free radical) 또는 활성산소종(reactive oxygen species; ROS)에 의한 세포의 산화를 억제하는 것을 말하며, 자유 라디칼 또는 활성산소종을 제거하여 이로 인한 세포의 손상이 감소되는 것을 포함한다.
따라서, 본 발명의 조성물은 발효 프로폴리스 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 항산화용 조성물일 수 있다.
본 발명에서 "항염증 효과"라 함은 염증을 억제하는 것을 말하며, 상기 염증은 어떤 자극에 대한 생체조직의 방어 반응의 하나로, 조직 변질, 순환 장애와 삼출, 조직 증식의 세 가지를 병발하는 복잡한 병변을 말한다. 보다 구체적으로 염증은 선청성 면역의 일부이며 다른 동물에서처럼 인간의 선천성 면역은 병원체에 특이적으로 존재하는 세포 표면의 패턴을 인식한다. 식세포는 그런 표면을 가진 세포를 비자기로 인식하고 병원체를 공격한다. 병원균이 신체의 물리적 장벽을 개고 들어온다면 염증반응이 일어난다. 염증반응은 상처부위에 침입한 미생물들에 대한 적대 환경을 만드는 비특이적인 방어작용이다. 염증반응에서, 상처가 나거나 외부 감염체가 체내로 들어왔을 때, 초기단계 면역반능을 맡고 있는 백혈구들이 몰려들어 사이토카인을 발현한다. 따라서 세포내 사이토카인의 발현양이 염증반응 활성화의 지표가 된다. 염증과 관련된 피부질환의 예로는 아토피 피부염, 건선, 방사선, 화학물질, 화상 등에 의해 촉발되는 홍반성 질환, 산 화상, 수포성 피부병, 태선 모양 종류 질환, 알레르기에 기한 가려움증, 지루성 습진, 장미 여드름, 심상성 천포창, 다형 삼출성 홍반, 결절 홍반, 귀 두염, 음문염, 원형 탈모증과 같은 염증성 모발 손실, 피부 T-세포 림프종 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
따라서, 본 발명의 조성물은 발효 프로폴리스 추출물을 유효성분으로 포함하는 함염증용 조성물일 수 있다.
본 발명에서, 프로폴리스의 획득 방법을 특별히 한정하지 않으며 자연물로부터 추출 및/또는 정제, 당 업계에 공지된 방법으로 화학적으로 합성하거나, 시판되는 물질을 사용할 수 있다.
일 실시예에 따르면, 본 발명의 프로폴리스는 '봉교' 혹은 '원괴'로 알려진 물질로부터 유래한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 화장료 조성물, 약학적 조성물, 외용제 조성물, 의약외품 조성물 또는 식품 조성물에 있어서, 상기 발효 프로폴리스 추출물의 함량은 화장료 조성물, 약학적 조성물, 외용제 조성물, 의약외품 조성물 또는 식품 조성물 전체 중량 대비 0.01 내지 15중량% 일 수 있고, 바람직하게는 0.1 내지 10중량%일 수 있다.
본 발명의 용어 "추출물"은 프로폴리스의 추출처리에 의해 얻어지는 추출액, 상기 추출액의 희석액이나 농축액, 상기 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 상기 추출액의 조정제물이나 정제물, 또는 이들의 혼합물 등, 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함한다.
한편, 본 발명은 아르테필린 C(Artepillin C)의 함량이 증가된 발효 프로폴리스 추출물을 제조하는 방법은 프로폴리스 원괴를 저온 추출하여 프로폴리스 추출물을 제조하는 제 1단계;
제 1단계에서 추출된 프로폴리스 추출물을 초음파 추출하는 제 2단계;
제 2단계에서 획득한 추출물을 발효 균주로 발효시키는 제 3단계; 및
제 3단계에서 발효된 추출물에 1,3-부틸렌글라이콜(1,3-butylene glycol) 용매 추출하는 제 4단계를 포함하는 아르테필린 C(Artepillin C)의 함량이 증가된 발효 프로폴리스 추출물의 제조방법을 제공한다.
상기 저온 추출 온도는 5 내지 40℃ 혹은 5 내지 25℃의 범위일 수 있고, 바람직하게는 10 내지 20℃의 범위일 수 있으며, 추출 시간은 200 내지 400시간 혹은 230 내지 370시간 일 수 있고, 바람직하게는 250 내지 350시간 일 수 있다.
또한, 상기 저온 추출은 탄소수 1 내지 5의 알코올 용매 추출하는 것일 수 있으며, 예컨대, 에탄올, 프로필알코올, 부틸알코올 등 일 수 있으며, 바람직하게는 에탄올 일 수 있다.
만일, 상기 저온 추출 시 사용되는 용매가 탄소수 1 내지 5의 알코올 용매가 아닐 경우, 본 발명의 발효 프로폴리스 추출물 내 유효성분들이 유효량으로 추출되지 않을 수 있다.
상기 초음파 추출 시 파장은 10KHz 내지 40KHz일 수 있고, 온도는 10℃ 내지 40℃일 수 있으며, 처리 시간은 30분 내지 2시간 동안 이루어질 수 있다.
만일, 상기 초음파 추출 시 파장, 온도 및 처리 시간 조건을 충족하지 않을 경우 본 발명의 발효 프로폴리스 추출물 내 유효성분들이 유효량으로 추출되지 않을 수 있다.
본 발명에서, 프로폴리스 추출물은 초음파 추출 후 발효 균주를 통해 발효될 수 있다. 상기 발효 균주는 그 종류에 제한되지 않으나, 락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스　카제이(Lactobacilluscasei),　락토바실러스　불가리쿠스(Lactobacillus　bulgaricus),　락토바실러스　람노서스(Lactobacillusrhamnosus),　락토바실러스　플란타룸(Lactobacillusplantarum),　락토바실러스　루테리(Lactobacillusreuteri),　락토바실러스　컨퓨서스(Lactobacillusconfusus),　락토바실러스　퍼멘툼(Lactobacillusfermentum),　락토바실러스　브레비스(Lactobacillusbrevis), 및 테르무스 테르모모필루스(Thermus thermophillus)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있고, 발효 시간은 24 내지120시간 (1일 내지 5일)일 수 있으며, 바람직하게는 48 내지 96시간 (2일 내지 4일) 일 수 있다.
상기 발효 이후 수득된 추출물의 총 중량을 기준으로 20 내지 40중량% 혹은 23 내지 37중량%의 1,3-부틸렌글라이콜(1,3-butylene glycol)을 첨가하여 추출할 수 있고, 바람직하게는 25 내지 35중량%의 1,3-부틸렌글라이콜(1,3-butylene glycol)을 첨가하여 추출하여, 최종적으로 아르테필린 C의 함량이 증가된 발효 프로폴리스 추출물을 획득할 수 있다.
만일, 상기 1,3-부틸렌글라이콜이 상기 중량%를 충족하지 않거나, 1,3-부틸렌글라이콜이 아닌 다른 용매가 사용될 경우, 추출물의 용해도 안정성이 저하되어 석출될 가능성이 있고, 방부력이 저하되어 미생물이 증식할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 제조방법으로 획득된 발효 프로폴리스 추출물은 종래 알려진 프로폴리스 추출물에 비해 약 5.8배 가량의 아르테필린 C의 함량이 증가됨을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 발효 프로폴리스 추출물을 유효성분으로 포함하는 아르테필린 C의 함량이 증가된 조성물을 제공한다.
한편, 본 발명에 따른 조성물은 용액, 외용연고, 크림, 폼, 영양화장수, 유연화장수, 팩, 유연수, 유액, 메이크업베이스, 에센스, 비누, 세정제, 입욕제, 선스크린크림, 선오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패취 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형으로 제조할 수 있고, 바람직하게는 화장수, 에센스, 로션, 크림, 팩, 젤, 파우더, 파운데이션 또는 세정제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 화장료 조성물은 일반 피부 화장료에 배합되는 화장학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 통상의 성분으로 예를 들면 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급 알코올, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 항료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이제 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는, 담체 성분으로서 락토오스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 또는 이들의 혼합물이 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 용매, 용해화제, 또는 유탁화제가 이용되고 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일이 있으며, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브 오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리 옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 비누인 경우에는 담체 성분으로서 지방산의 알칼리 금속 염, 지방산 헤미에스테르 염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알코올, 식물성 유, 글리세롤, 당 등이 이용될 수 있다.
본 발명은 또한 발효 프로폴리스 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체의 피부에 도포하는 단계를 포함하는, 피부 주름 또는 피부 탄력 개선, 피부 미백, 피부 보습, 피부 항산화 또는 염증의 예방, 개선 또는 치료 방법을 제공한다. 상기 개체는, 인간, 가축, 쥐 등을 포함하는 포유류 동물을 제한 없이 포함한다.
본 발명의 일 측면에서, 본 발명은 발효 프로폴리스 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 또는 피부 탄력 개선, 피부 미백, 피부 보습, 피부 항산화 또는 항염증용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, "약학적 조성물"이란 용어는 '의약외품' 또는 '의약품'의 의미를 포함하는 개념으로 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있으나, 바람직하게는 비경구 제제일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 일 측면에서, 본 발명은 발효 프로폴리스 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 또는 피부 탄력 개선, 피부 미백, 피부 보습, 피부 항산화 또는 항염증용 외용제 조성물을 제공할 수 있다.
상기 발효 프로폴리스 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 피부 외용제의 제형으로 사용하는 경우, 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁액제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 길레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일(essential oil), 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 피부 외용제 조성물에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 피부 과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 또한 상기 성분들은 피부 과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.
상기 화학식 1의 화합물이 외용제 조성물로 제공될 경우, 연고, 패취, 겔, 크림 또는 분무제 제형을 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 외용제 조성물은 특히 바람직하게 비경구용 제제로 이용될 수 있으며, 예를 들어, 외용제 조성물은 바세린, 스테아릴알코올 등의 약학적으로 허용되는 적당한 기제; 폴리소르베이트, 소르비탄 세스퀴올레이트 등의 약학적으로 허용되는 적당한 계면활성제; 글리세린 등의 약제학적으로 허용되는 적당한 보습제; 약학적으로 허용되는 적당한 용제; 및 착향제, 착색제, 안정화제, 점성화제 등을 균질하게 혼합하는 통상의 피부 외용제 조성물의 제조방법에 의해서 제조될 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 측면에서, 본 발명은 발효 프로폴리스 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 또는 피부 탄력 개선, 피부 미백, 피부 보습, 피부 항산화 또는 항염증용 의약외품 조성물을 제공할 수 있다.
상기 발효 프로폴리스 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물이 의약외품 조성물로 제공되는 경우, 상기 의약외품 조성물은 하이드록시신남산, 아이소아밀 아세테이트 및 베타인으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 것에 더하여, 필요에 따라 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더욱 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제는 본 발명의 효과를 해하지 않는 한 제한되지 않으며, 예를 들어 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제, 윤활제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 의약외품 조성물은 소독 청결제, 샤워폼, 연고액, 물티슈, 코팅제 등을 예시할 수 있으며, 바람직하게는 외용 연고, 로션 등과 같은 반고형 제제로 제조될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 의약외품의 제제화 방법, 용량, 이용방법, 구성성분 등은 기술분야에 공지된 통상의 기술로부터 적절히 선택될 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 측면에서, 본 발명은 발효 프로폴리스 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 또는 피부 탄력 개선, 피부 미백, 피부 보습, 피부 항산화 또는 항염증용 식품 조성물을 제공할 수 있다.
상기 발효 프로폴리스 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물이 식품 조성물로 제공되는 경우, 상기 조성물은 유효성분 이외에 식품학적으로 허용 가능한 식품보조첨가제를 포함할 수 있다.
상기 식품보조첨가제는 식품에 보존적으로 첨가될 수 있는 구성요소를 의미하며, 각 제형의 건강기능식품을 제조하는데 첨가되는 것으로서 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 식품보조첨가제의 예로는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착삭제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등이 포함되지만, 그 종류가 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 식품 조성물에는 건강기능식품이 포함될 수 있다. 본 발명에서 건강기능식품이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체조절 기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미한다. 일반식품에 비해 적극적인 건강유지나 증진 효과를 가지고, 건강 보조 식품(health supplement food)은 건강보조 목적의 식품을 의미한다. 경우에 따라, 기능성 식품, 건강 식품, 건강 보조 식품의 용어는 혼용된다.
구체적으로, 상기 건강기능식품은 본 발명의 조성물을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용이 없는 장점이 있다.
상기 식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 건강 기능 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
상기 조성물은 식품 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예들 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신(niacin), 비오틴(biotin), 폴레이트(folate), 판토텐산(panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu), 크륨(Cr) 등의 미네랄을 포함할 수 있다. 또한, 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다. 본 발명의 건강기능식품이 취할 수 있는 형태에는 제한이 없으며, 통상적인 의미의 식품을 모두 포함할 수 있고, 기능성 식품 등 당업계에 알려진 용어와 혼용 가능하다.
아울러 본 발명의 건강기능식품은 당업자의 선택에 따라 식품에 포함될 수 있는 적절한 기타 보조성분과 공지의 첨가제를 혼합하여 제조할 수 있다. 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 본 발명에 따른 추출물을 주성분으로 하여 제조한 즙, 차, 젤리 및 주스 등에 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 동물을 위한 사료로 이용되는 식품도 포함한다.
본 발명의 조성물은 당업계에 공지된 피부 주름 또는 피부 탄력 개선, 피부 미백, 피부 보습, 피부 항산화 또는 항염증 성분을 추가로 포함할 수 있다. 추가의 성분은 전체 조성물 중량에 대하여 0.0001 중량% 내지 10 중량%로 포함될 수 있으며, 상기 함량 범위는 피부 안전성, 제형화 시의 용이성 등의 요건에 따라 조절될 수 있다.
본 발명에서 "유효량"이라 함은, 피부 주름 또는 피부 탄력 개선, 피부 미백, 피부 보습, 피부 항산화 또는 항염증 효과를 충분히 나타낼 수 있는 추출물의 양을 의미한다.
이상 본 명세서에 기재된 수치 값은 달리 명시되어 있지 않은 한 균등범위까지 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
본 발명에 따른 발효 프로폴리스 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 피부 주름 또는 피부 탄력 개선, 피부 미백, 피부 보습, 피부 항산화 또는 항염증 용도를 위해 다양하게 사용될 수 있고, 상기 조성물은 본 발명에 따른 제조방법에 의해 C의 함량이 증가되어 더욱 우수한 효과를 나타내어, 항노화, 안티에이징 효과를 나타낼 수 있다.
도 1은 본 발명의 제조방법에 따라 발효되기 전의 프로폴리스 추출물이 세포활성에 있어서 효과가 없음을 보여준다.
도 2는 본 발명의 제조방법에 따라 발효된 후 프로폴리스 추출물이 세포활성이 음성 대조군 대비 증가한 것을 보여준다.
도 3은 본 발명의 발효 프로폴리스 추출물의 항산화 효과를 보여준다. 본 발명의 발효 프로폴리스 추출물이 2.91±0.12% 농도(IC50)에서 50%의 라디칼을 소거함을 알 수 있다.
도 4는 본 발명의 발효 프로폴리스 추출물의 주름개선 효과로서 눈가주름 개선 효과를 보여준다.
도 5는 본 발명의 발효 프로폴리스 추출물의 주름개선 효과로서 눈 밑주름 개선 효과를 보여준다.
도 6은 본 발명의 발효 프로폴리스 추출물의 주름개선 효과로서 팔자주름 개선 효과를 보여준다.
도 7은 본 발명의 발효 프로폴리스 추출물의 주름개선 효과로서 목주름 개선 효과를 보여준다.
도 8은 본 발명의 발효 프로폴리스 추출물의 나비존 부위 리프팅(좌측 볼) 개선 효과를 보여준다.
도 9는 본 발명의 발효 프로폴리스 추출물의 나비존 부위 리프팅(우측 볼) 개선 효과를 보여준다.
도 10은 본 발명의 발효 프로폴리스 추출물의 입가 리프팅 개선 효과를 보여준다.
도 11은 본 발명의 발효 프로폴리스 추출물의 눈가 리프팅 개선 효과를 보여준다.
도 12는 본 발명의 발효 프로폴리스 추출물의 팔자 부위 리프팅 개선 효과를 보여준다.
도 13은 본 발명의 발효 프로폴리스 추출물의 이중턱 부위 리프팅 개선 효과를 보여준다.
도 14는 본 발명의 발효 프로폴리스 추출물의 턱 리프팅 개선 효과를 보여준다.
도 15는 본 발명의 발효 프로폴리스 추출물의 피부 치밀도 개선 효과를 보여준다.
도 16은 본 발명의 발효 프로폴리스 추출물의 피부 탄력 개선 효과를 보여준다.
도 17은 본 발명의 발효 프로폴리스 추출물의 기미 면적 개선 효과를 보여준다.
도 18은 본 발명의 발효 프로폴리스 추출물의 피부 광채 개선 효과를 보여준다.
도 19는 본 발명의 발효 프로폴리스 추출물의 피부 보습 개선 효과를 보여준다.
도 20은 본 발명의 발효 프로폴리스 추출물의 피부 깊은 보습 개선 효과를 보여준다.
도 21은 본 발명의 발효 프로폴리스 추출물의 나비존 부위, 입가, 눈가 리프팅 각도 분석 예시를 보여준다.
도 22는 본 발명의 발효 프로폴리스 추출물의 턱 리프팅 각도 분석 예시를 보여준다.
도 23은 본 발명의 발효 프로폴리스 추출물이 종래 일반적인 프로폴리스 추출물보다 높은 항산화 효과를 나타냄을 보여주며, 본 발명의 발효 프로폴리스 추출물이 고온에서도 항산화 활성이 잘 유지됨을 보여준다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
제조예 1: 발효 그린 프로폴리스 추출물의 제조
하기 제조예에서는 프로폴리스 중 하나인 그린 프로폴리스를 이용하여 추출물을 제조하였으며, 그 제조예는 하기와 같다.
1. 1차 추출: 그린프로폴리스 원괴(Green propolis wax)를 에탄올을 용매로 하여 10℃에서 300시간 저온 추출(Cold Extraction)을 한다.
2. 2차 추출: 1차 추출에서 얻어진 추출물을 상온에서 20KHz 초음파를 처리하여 다시 한 번 1시간 초음파 추출(Ultrasonic Extraction)을 한다.
3. 2차로 얻어진 결과물을 여과(Filtration), 농축(Evaporation), 살균(Autoclave)한다.
4. 이렇게 얻어진 그린프로폴리스 추출물에 유산균(Lactobacillus acidophilus)을 배양액 상태로 접종하여 72시간 발효(배양)시킨다.
5. 살균, 여과 후 1,3-부틸렌글라이콜(1,3-Butylene glycol)을 30%가 되도록 첨가한 후 한번 더 여과하여 발효 그린프로폴리스 추출물을 완성한다.
비교예 1: 그린 프로폴리스 추출물의 제조
1. 그린프로폴리스 원괴를 1,3-부틸렌글라이콜: 증류수를 50:50 비율로 섞은 용액을 용매로 하여 60도에서 중탕하여 1시간 동안 교반하며 열추출한다.
2. 얻어진 결과물을 1차 여과(Filteration)한 후 3일간 방냉한다.
3. 3일 후 2차 여과(Filteration)한다.
4. 방부목적으로 1,2-Haxandiol을 2% 중량비가 되도록 첨가하고 한 번 더 여과(Filteration)하여 그린 프로폴리스 추출물을 완성한다.
제조예 2: 발효 그린 프로폴리스 추출물을 포함하는 조성물의 제조
상기 제조 과정을 통해 제조된 발효 그린 프로폴리스 추출물을 포함하는 조성물의 제조는 하기 실시예(표 1) 및 비교예(표 2)로 나타내었다.
구분(중량%) 실시예
1 2 3 4
발효 그린 프로폴리스 추출물 1 4 9 15
부틸렌글라이콜 1 1 1 1
글리세린 5 5 5 5
카보머 0.2 0.2 0.2 0.2
알지닌 0.2 0.2 0.2 0.2
향 0.1 0.1 0.1 0.1
정제수 잔량 잔량 잔량 잔량
구분(중량%) 실시예 3 비교예 2
그린 프로폴리스 추출물 - 9
발효 그린 프로폴리스 추출물 9 -
부틸렌글라이콜 1 1
글리세린 5 5
카보머 0.2 0.2
알지닌 0.2 0.2
향 0.1 0.1
정제수 잔량 잔량
실험예 1: 아르테필린 C 함량 분석 비교
액체 크로마토그래피(LIQUID CHROMATOGRAPHY)를 이용하여 그린프로폴리스의 지표성분인 Artepillin C (강력한 항산화 효능 성분)의 함량을 분석하였다.
아르테필린(Artepillin) C (ppm)
제조예 1 35
비교예 1 6
- 제조예 1: 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 발효 그린 프로폴리스 추출물
- 비교예 1: 일반적인 그린 프로폴리스 추출물
아르테필린 C의 함량을 분석한 결과, 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 발효 그린 프로폴리스 추출물에서 약 5.8배 가량의 아르테필린 C가 검출되었다.
실험예 2: 그린 프로폴리스 추출물의 발효 전 후의 세포활성 비교( in vitro )
인간 섬유아세포 배양액(Human fibroblast culture)에서 상기 시료의 세포활성 효과를 평가하였다.
시료를 희석하여 농도별로 48시간 처리한 후, CCK-8 kit를 사용하여 세포활성을 확인하였다.
시료의 세포활성은 음성대조군(serum 0% 함유 DMEM) 대비 증가비율을 계산하였다.
그 결과, 발효 전 그린프로폴리스 추출물(비교예 1)은 세포활성 효능 없으며, 배지 전체 조성물 대비 발효 후 그린프로폴리스 추출물 0.01중량%를 처리했을 때, 음성대조군 대비 세포활성이 14% 증가하였다(도 1 및 도 2).
실험예 3: 발효 그린 프로폴리스 추출물의 항산화 효과( in vitro )
상기 제조예 1에서 제조된 발효 그린 프로폴리스 추출물의 항산화 효과를 확인하기 위하여, DPPH(2,2-Diphenyl 1-picrylhydrazyl radical)에 존재하는 라디칼이 소거될 때 DPPH가 보라색에서 노란색으로 변화하는 것을 이용한 라디칼 소거능 테스트(DPPH 테스트)를 통해 항산화 효과를 평가하였다.
DPPH는 시그마사(Sigma co., Ltd, 미국)에서 구입하여 사용하였다.
우선, 제조예 1의 발효 그린 프로폴리스 추출물을 DMSO에 녹인 후 라디칼 소거능 테스트를 수행하였고, 0.15 mM DPPH 용액과 상기 발효 그린 프로폴리스 추출물을 동일한 양 (100㎕) 씩 혼합하여 상온에서 30분 반응시킨 후, DPPH의 색 변화를 540nm에서 흡광도(A540)를 측정하였다. 측정된 A540 값을 통해 IC50 값을 구하여 라디칼 소거능을 비교 평가하였다.
IC50는 라디칼을 50% 소거하기 위해 필요한 발효 그린 프로폴리스 추출물 또는 비타민 C의 농도를 의미한다.
평가 결과, 도 3과 같이 대표적인 강력한 항산화 물질인 비타민 C(아스크로브산)에 비해 그 활성은 낮으나, 항산화 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
실험예 4: 발효 그린 프로폴리스 추출물의 주름 개선 효과
상기 실시예 3과 같이 발효 그린 프로폴리스를 9 중량% 함유하는 앰플 제형의 화장품을 이용하여, 총 23명의 피험자를 대상으로 총 4주간 제품의 눈가주름, 눈 밑주름, 팔자주름 및 목주름 개선 효능 시험을 실시하였다.
-시험 제품의 사용
시험 순서는 사용 전, 사용 후 1주, 사용 후 2주 및 4주 후로 나누어 측정하였는데, 사용 전 첫 테스트는 방문일 12시간 전부터 기초제품의 사용을 금지하였다. 또한 인체적용 시험기간 중 시험제품 이외 에 시험결과에 영향을 미칠 수 있는 활성성분이 들어간 화장품 예: 미백, 주름개선 등의 기능성 화장품의 사용을 일체 금하였다. 4 주 아침 저녁 1 일 2 회 사용을 기준으로 하였다.
-눈가/눈밑/팔자/목주름 측정 및 분석방법
눈가/눈밑/팔자/목주름 측정은 3D 피부 촬영 장치인 Antera 3D CS(Miravex Ltd., Ireland)를 이용하여 시험제품 사용 전후에 시험대상자의 동일한 좌측 눈가, 좌측 눈밑 좌측 팔자 중앙 목 부위를 촬영하였다. 저장된 이미지를 Wrinkles Medium mode 로 변환하였고 눈가 주름 분석은 지름 10.7㎜의 원(Cricle), 눈밑주름/팔자주름 분석은 선(Line), 목주름 분석은 지름 24.0 ㎜ 의 원(Circle)을 이용하여 해당 부위를 포함한 분석 범위를 지정하였다. 눈가주름/목주름은 범위 내 주름의 평균 거칠기(Ra)를 나타내는 Indentation index 값을 분석하였고 단위는 A.U. 이며 눈밑주름/팔자주름은 범위 내 주름의 평균 깊이를 나타내는 Depth 값을 분석하였고 단위는 ㎜이다. 각 Indentation index(A.U.), Depth(㎜) 값이 감소할 수록 눈가/눈밑/팔자/목주름 개선에 효과가 있음을 의미한다.
-시험 결과
도 4 내지 7에 나타난 바와 같이, 시험 부위의 주름 개선율은 사용 1주 후 눈가주름: 4.504%%, 눈 밑주름 7.627%, 팔자주름 9.821% 및 목주름 4.943% 개선, 사용 2주 후 눈가주름: 8.831%, 눈 밑주름: 11.017%, 팔자주름: 13.393% 및 8.062% 개선, 사용 4주 후 눈가주름: 11.413%, 눈 밑주름: 18.644%, 팔자주름: 19.643%, 목주름: 9.920% 개선됨을 확인하였다.
결론적으로, 사용 1주차부터 통계적으로 유의한 수준의 주름 개선 효과를 보였다.
실험예 5: 발효 그린 프로폴리스 추출물의 리프팅 개선 효과
화장품 소재로서의 유효성 평가를 위해, 상기 실시예 3과 같이 발효 그린 프로폴리스를 9 중량% 함유하는 앰플 제형의 화장품을 이용하여, 총 23명의 피험자를 대상으로 총 4주간 제품의 나비존 부위, 입가, 눈가, 턱, 팔자 부위, 이중턱 리프팅 효능 시험을 실시하였다.
-시험 제품의 사용
시험 순서는 사용 전, 사용 후 1주, 사용 후 2주 및 4주 후로 나누어 측정하였는데, 사용 전 첫 테스트는 방문일 12시간 전부터 기초제품의 사용을 금지하였다. 또한 인체적용 시험기간 중 시험제품 이외 에 시험결과에 영향을 미칠 수 있는 활성성분이 들어간 화장품 예: 미백, 주름개선 등의 기능성 화장품의 사용을 일체 금하였다. 4 주 아침 저녁 1 일 2 회 사용을 기준으로 하였다.
-나비존 부위, 입가, 눈가, 턱 리프팅 측정 및 분석방법
나비존 부위, 입가, 눈가, 턱 리프팅 측정은 피부의 모습을 등고선으로 표현해 주는 기기인 F-ray(BEYOUNG Co., Ltd, Korea) 를 이용하여 시험제품 사용 전후에 시험대상자의 동일한 얼굴을 촬영하였고, 시험 부위 근처에 형성된 곡선을 기준으로 측정하였다. 나비존 부위 리프팅은 30° 측면에서 촬영한 이미지에서 양 볼 부위를 Image-pro®plus (Media Cybernetics, USA)로 분석하였다. 광대뼈 근처에 형성된 원의 정중앙에서 아래 방향으로 직선을 긋고 아래 등고선과 만나는 시작점으로부터 등고선 사진에 그려진 가로줄무늬를 따라 오른쪽 방향 3 칸 이동한 곳에서 시작원과 반대 색상인 무늬와 접하는 안쪽 경계지점으로 직선을 그린 후, 두 직선 사이의 각도각도(°)를 재어 평가하였으며, 두 직선 간의 각도(°)가 감소할수록 나비존 부위 리프팅 개선에 효과가 있음을 의미한다.
턱 리프팅은 45° 측면에서 촬영한 이미지에서 Image-pro ® plus (Media Cybernet ics, USA)로 분석하였고, 입가에서 턱까지 직선을 긋고 눈가에서 턱까지 직선을 그어 두 점을 연결시킨 다음 턱 부위 각도를 재어 평가하였으며, 각도가 감소할수록 처진 턱 리프팅 개선에 효과가 있음을 의미한다.
- 팔자 부위 리프팅 측정 및 분석방법
팔자 부위 리프팅 측정은 3D 피부 촬영 장치인 Antera 3D CS(Miravex Ltd., Ireland) 를 이용하여 시험제품 사용 전후에 시험대상자의 동일한 좌측 팔자 부위를 촬영하였다. 저장된 이미지를 Depressions-Medium mode 로 변환하여 선(Lin)을 이용하여 해당 부위를 포함한 분석 범위를 지정하였고 범위 내 꺼진 부피 ㎣ 값을 분석하였다. 꺼진 부피(㎣) 값이 감소 할수록 팔자 부위 리프팅 개선에 효과가 있음을 의미한다.
-이중턱 부위 리프팅 측정 및 분석방법
이중턱 부위 리프팅 측정은 3D 이미지로 피부 부피를 측정할 수 있는 Vectra XT(Canfield Imaging Systems, USA)를 이용하여 시험제품 사용 전후에 시험대상자의 동일한 이중턱 부위를 촬영한 이미지를 분석하여 평가하였고 저장된 이미지의 이중턱 부위 부피(㎖) 값을 분석하였다. 부피(㎖) 값이 감소할수록 이중턱 부위 리프팅 개선 에 효과가 있음을 의미한다.
-시험 결과
도 8 내지 14에 나타난 바와 같이, 시험 부위의 리프팅 개선율은 사용 1주 후 나비존(좌측): 1.770%, 나비존(우측): 1.560%, 입가: 0.789%, 눈가: 0.928%, 팔자: 14.105%, 이중턱: 6.217% 턱: 0.634% 개선, 사용 2주 후 나비존(좌측): 3.619%, 나비존(우측): 3.135%, 입가: 1.664%, 눈가: 1.722%, 팔자: 19.995%, 이중턱: 9.625% 턱: 1.421% 개선, 사용 4주 후 나비존(좌측): 5.845%, 나비존(우측): 5.477%, 입가: 2.679%, 눈가: 2.605%, 팔자: 31.986%, 이중턱: 14.877% 턱: 2.243% 개선됨을 확인하였다.
결론적으로, 사용 1주차부터 통계적으로 유의한 수준의 리프팅 개선 효과를 보였다.
실험예 6: 발효 그린 프로폴리스 추출물의 탄력 개선 효과
화장품 소재로써의 유효성을 평가하기 위해 상기 실시예 3과 같이 발효 그린 프로폴리스를 9 중량% 함유하는 앰플 제형의 화장품을 이용하여, 총 23명의 피험자를 대상으로 총 4주간 제품의 피부 치밀도, 탄력 개선 효능 시험을 실시하였다.
-시험 제품의 사용
시험 순서는 사용 전, 사용 후 1주, 사용 후 2주 및 4주 후로 나누어 측정하였는데, 사용 전 첫 테스트는 방문일 12시간 전부터 기초제품의 사용을 금지하였다. 또한 인체적용 시험기간 중 시험제품 이외 에 시험결과에 영향을 미칠 수 있는 활성성분이 들어간 화장품 예: 미백, 주름개선 등의 기능성 화장품의 사용을 일체 금하였다. 4 주 아침 저녁 1 일 2 회 사용을 기준으로 하였다.
-피부 치밀도 측정 및 분석방법
피부 치밀도 측정은 Skin Scanner DUB-USB(TPM taberna pro-medicum, Germany)를 이용하여 시험 제품 사용 전후에 시험대상자의 동일한 좌측 눈가 부위를 측정한 화상을 통해 피부 치밀도를 분석하였다. 피부 치밀도의 측정 파라미터는 Density이며, 단위는 %이다. 측정 값이 증가할수록 피부 치밀도 개선에 효과가 있음을 의미한다.
- 피부 탄력 측정 및 분석방법
피부 탄력 측정은 Cutometer MPA580(Courage+Khazaka electronic GmbH, Germany)을 이용하여 시험제품 사용 전후에 시험대상자의 동일한 우측 볼 부위를 측정하였다. 피부의 탄력 정도 (elasticity)를 측정하였으며, 피부에 수직으로 밀착시킨 probe 내부에 일정한 음압을 가해 피부가 당겨지는 정도와 복원되는 정도를 측정하였다. 3 회 실시하여 그 평균 값을 피부 탄력 평가 자료로 사용하였으며, 분석 파라미터인 R2(피부의 재변형력) 값은 총체적인 탄성으로 1 에 가까운 값일수록 피부가 더욱 탄력적임을 의미한다.
- 시험 결과
도 15 내지 16에 나타난 바와 같이, 시험 부위의 피부탄력 개선율은 사용 1주 후 피부 치밀도: 1.443%, 탄력: 3.434% 개선, 사용 2주 후 피부 치밀도: 9.869%, 탄력: 7.475% 개선, 사용 4주 후 피부 치밀도: 16.139%, 탄력: 10.505% 개선됨을 확인하였다.
결론적으로, 사용 2주차부터 통계적으로 유의한 수준의 탄력 개선 효과를 보였다.
실험예 7: 발효 그린 프로폴리스 추출물의 기미 개선 및 피부 광채 개선 효과
화장품 소재로써의 유효성을 평가하기 위해 상기 실시예 3과 같이 발효 그린 프로폴리스를 9 중량% 함유하는 앰플 제형의 화장품을 이용하여, 총 23명의 피험자를 대상으로 총 4주간 제품의 기미 개선 효능 시험을 실시하였고, 1회 사용으로 피부광채 효능 시험을 실시하였다.
-시험 제품의 사용
기미 개선 시험 순서는 사용 전, 사용 후 1주, 사용 후 2주 및 4주 후로 나누어 측정하였는데, 사용 전 첫 테스트는 방문일 12시간 전부터 기초제품의 사용을 금지하였다. 또한 인체적용 시험기간 중 시험제품 이외 에 시험결과에 영향을 미칠 수 있는 활성성분이 들어간 화장품 예 : 미백, 주름개선 등의 기능성 화장품의 사용을 일체 금하였다. 4 주 아침 저녁 1 일 2 회 사용을 기준으로 하였다. 광채 평가의 경우 1회 사용 후 피부 광채를 측정하였다.
- 피부 기미 면적 측정/ 피부 광채 측정 및 분석방법
기미면적 측정은 3D 피부 촬영 장치인 Antera 3D CS(Miravex Ltd., Ireland) 를 이용하여 시험제품 사용 전후에 시험대상자의 동일한 좌측 볼 부위의 동일한 피부 기미 부위를 촬영하였다. 이미지를 Melanin mode 로 변환하여 분석 범위 (d=44.8㎜) 를 지정하고 범위 내 기미 면적(㎟)을 분석하였다. 값이 줄어들수록 기미 면적 개선에 효과가 있음을 의미한다.
피부 광채 측정은 VISIA-CR(Canfield Imaging Systems, USA) 을 이용하여 시험제품 사용전후에 시험대상자의 동일한 얼굴을 촬영하였다 평행편(Parallel mode) 이미지를 통해 Image-pro® plus(Media Cybernetics, USA)로 분석하였고 볼 부위 에 특정 영역을 지정한 다음, 명도(Intensity) 값을 분석하였다. 명도(Intensity) 값이 증가할수록 피부 광채 개선에 효과가 있음을 의미한다.
-시험 결과
도 17 내지 18에 나타난 바와 같이, 시험 부위의 기미 면적 개선율은 사용 1주 후 16.179% 개선, 사용 2주 후 21.14% 개선, 사용 4주 후 26.302% 개선됨을 확인하였고, 피부 광채의 경우 1회 사용 후 광채가 2.909% 개선됨을 확인하였다.
결론적으로, 사용 1주차부터 통계적으로 유의한 수준의 기미 개선 효과를 보였으며 사용 직후 피부 광재 개선 효과를 보였다.
실험예 8: 발효 그린 프로폴리스 추출물의 보습 개선 효과
화장품 소재로써의 유효성을 평가하기 위해 상기 실시예 3과 같이 발효 그린 프로폴리스를 9 중량% 함유하는 앰플 제형의 화장품을 이용하여, 총 23명의 피험자를 대상으로 총 4주간 제품의 피부 보습 효능 시험을 실시하였다.
-시험 제품의 사용
시험 순서는 사용 전, 사용 후 1주, 사용 후 2주 및 4주 후로 나누어 측정하였는데, 사용 전 첫 테스트는 방문일 12시간 전부터 기초제품의 사용을 금지하였다. 또한 인체적용 시험기간 중 시험제품 이외 에 시험결과에 영향을 미칠 수 있는 활성성분이 들어간 화장품 예: 미백, 주름개선 등의 기능성 화장품의 사용을 일체 금하였다. 4 주 아침 저녁 1 일 2 회 사용을 기준으로 하였다.
-피부 보습 측정 및 분석방법
피부보습 측정은 Corneometer CM825(Courage Khazaka eletronic GmbH, Germany)를 이용하여 시험제품 사용 전후에 시험대상자의 동일한 우측 볼 부위를 측정하였고, 측정 시 Corneometer probe를 피부에 접촉시켜 Sensor를 통해 3 회 실시하여 그 평균값을 피부수분량 평가 자료로 사용하였다. Corneometer 는 피부를 기본적으로 부도체로 보고 수분이 많이 함유될수록 전기가 잘 통하는 성질을 응용한 장비로, 탐침이 접촉하는 곳의 정전용량 (capacitance)을 측정한다. 따라서 수분함량과 정전용량은 서로 비례하며, 측정값이 높을수록 수분함량이 높다고 볼 수 있다. 단위는 단위상수인 arbitrary unit(A.U.)이다.
- 깊은 보습 측정 및 분석방법
깊은 보습 측정은 MoistureMeter D(Delfin Technologies Ltd, Finland)의 Probe 중 XS5(0.5㎜)를 이용하여 시험제품 사용 전후에 시험대상자의 동일한 우측 볼 부위를 측정하였다. 평가 값은 EM wave를 이용하여 측정되고 단위는 단위상수인 arbitrary unit(A.U.)이며, 측정값이 증가할수록 깊은 보습 개선에 효과가 있음을 의미한다.
- 시험 결과
도 19 내지 20에 나타난 바와 같이, 시험 부위의 피부 보습 개선율은 사용 1주 후 보습: 6.245%, 깊은 보습: 3.199% 개선, 사용 2주 후 보습: 8.266%, 깊은 보습: 4.116% 개선, 사용 4주 후 보습: 12.993%%, 깊은 보습: 4.157% 개선됨을 확인하였다.
결론적으로, 사용 1주차부터 통계적으로 유의한 수준의 피부 보습 개선 효과를 보였다.
실험예 9: 발효 그린 프로폴리스 추출물의 항산화 증진 효과
앞서 실험예 3 및 도 3의 결과를 통해 본 발명의 발효 그린 프로폴리스 추출물이 항산화 효과를 나타냄을 확인하였다. 한편, 본 발명의 발효 그린 프로폴리스 추출물(실시예 3)과 종래 일반적인 그린 프로폴리스 추출물(비교예 2)의 항산화 활성 효과를 비교하고자 하였다.
- 재료
실험에 사용된 DPPH는 Sigma aldrich에서 구입하여 사용하였다.
- 시료의 처리 방법
그린 프로폴리스 앰플 및 발효 그린프로폴리스 앰플은 고온에서 0시간, 100시간 동안 넣어둔 뒤 각 시간별로 최종농도가 0.08, 0.16, 0.31, 0.63, 1.25, 2.50, 5.00 %가 되도록 메탄올(methanol)로 희석하여 사용하였다.
- 항산화 활성(DPPH 라디칼 소거 활성) 측정
각 시료 추출물의 항산화 활성은 측정은Blois 방법에 의한 DPPH 자유 라디칼 소거법에 따라 측정하였다 (Blois, 1958). 각 시료를 MeOH로 희석하여 여러 농도로 준비한 뒤, 마이크로 튜브에 500㎕씩 분주하고, 메탄올에 녹인300uM DPPH를 동량첨가한 뒤, 37℃에서 30분간 방치하였다. 상층액을 96 well plate에 200 ㎕씩 분주하고, ELISA Reader를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성대조군으로 L-아스코르브산(ascorbic acid, Asc.A)를 0.0005%로 조제하여 흡광도를 측정하고 시료와 비교하였다. 반응 혼합물의 흡광도가 낮을수록 높은 자유 라디칼 소거 활성을 나타낸다. DPPH 자유 라디칼 소거활성은 다음 식으로부터 산출하여 전자공여능(EDA %)에 의한 환원력으로 항산화능을 표시하였다. 각 시료별로 3회 반복실험 후 평균값을 구하였다.
DPPH 자유 라디칼 소거활성(%) = {(대조군흡광도-시료흡광도)/대조군흡광도}×100
시료흡광도= 시료를 첨가한 반응액의 흡광도
대조군흡광도= 시료대신 메탄올을 첨가한 반응액의 흡광도
- 통계분석
자료는 평균값±표준편차로 표시하였으며, 표시된 실험결과는 3회 이상의 독립적인 실험결과이며 통계적인 유의성은 Independent t-test로 p<0.05 유의수준에서 검증하였다.
- 결과
실험 결과, 발효 그린 프로폴리스 추출물을 9%를 함유한 앰플의 항산화 효과가 일반적인 그린 프로폴리스 추출물 9%를 함유한 앰플의 항산화 효과보다 훨씬 뛰어났으며, 고온 100시간 방치 시 항산화 활성이 줄어드는 기존 앰플 즉 그린 프로폴리스 추출물에 비해, 발효 그린 프로폴리스 9% 적용 앰플의 IC50값은 0시간에서 0.44%, 100시간에서 0.43%로 나타나 항산화 활성이 고온에서도 잘 유지되는 것을 확인하였다.

Claims (14)

  1. 발효 프로폴리스 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 또는 피부 탄력 개선용 화장료 조성물.
  2. 발효 프로폴리스 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물.
  3. 발효 프로폴리스 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 항산화용 화장료 조성물.
  4. 발효 프로폴리스 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증용 화장료 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 발효 프로폴리스 추출물은 아르테필린 C(Artepillin C)의 함량이 증가된 것인, 화장료 조성물.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 프로폴리스는 그린 프로폴리스, 레드프로폴리스 및 브라운프로폴리스로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인, 화장료 조성물.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 발효 프로폴리스 추출물은 화장료 조성물 총 중량 대비 0.01 내지 15중량%로 포함되는 것인, 화장료 조성물.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 발효는 락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스　카제이(Lactobacilluscasei),　락토바실러스　불가리쿠스(Lactobacillus　bulgaricus),　락토바실러스　람노서스(Lactobacillusrhamnosus),　락토바실러스　플란타룸(Lactobacillusplantarum),　락토바실러스　루테리(Lactobacillusreuteri),　락토바실러스　컨퓨서스(Lactobacillusconfusus),　락토바실러스　퍼멘툼(Lactobacillusfermentum),　락토바실러스　브레비스(Lactobacillusbrevis), 및 테르무스 테르모모필루스(Thermus thermophillus)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 균주에 의한 것인, 화장료 조성물.
  9. 프로폴리스 원괴(propolis wax)를 5℃ 내지 40℃ 온도에서 저온 추출(Cold Extraction)하여 프로폴리스 추출물을 제조하는 제 1단계;
    제 1단계에서 추출된 프로폴리스 추출물을 초음파 추출(Ultrasonic Extraction)하는 제 2단계;
    제 2단계에서 획득한 추출물을 발효 균주로 발효시키는 제 3단계; 및
    제 3단계에서 발효된 추출물 총 중량을 기준으로 20 내지 40중량%의 1,3-부틸렌글라이콜(1,3-butylene glycol) 용매 추출하는 제 4단계를 포함하는
    아르테필린 C(Artepillin C)의 함량이 증가된 발효 프로폴리스 추출물의 제조방법.
  10. 제9항에 있어서,
    저온 추출은 탄소수 1 내지 5의 알코올 용매 추출하는 것인, 아르테필린 C(Artepillin C)의 함량이 증가된 발효 프로폴리스 추출물의 제조방법.
  11. 제9항에 있어서,
    제 2단계의 초음파 추출은 10KHz 내지 40KHz의 파장 및 10℃ 내지 40℃의 온도에서 이루어지는 것인, 아르테필린 C(Artepillin C)의 함량이 증가된 발효 프로폴리스 추출물의 제조방법.
  12. 제9항에 있어서,
    제 3단계의 발효 균주는 락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스　카제이(Lactobacilluscasei),　락토바실러스　불가리쿠스(Lactobacillus　bulgaricus),　락토바실러스　람노서스(Lactobacillusrhamnosus),　락토바실러스　플란타룸(Lactobacillusplantarum),　락토바실러스　루테리(Lactobacillusreuteri),　락토바실러스　컨퓨서스(Lactobacillusconfusus),　락토바실러스　퍼멘툼(Lactobacillusfermentum),　락토바실러스　브레비스(Lactobacillusbrevis), 및 테르무스 테르모모필루스(Thermus thermophillus)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 아르테필린 C(Artepillin C)의 함량이 증가된 발효 프로폴리스 추출물의 제조방법.
  13. 제9항에 있어서,
    제 3단계의 발효는 65 내지 80 시간 동안 배양되는 것인, 아르테필린 C(Artepillin C)의 함량이 증가된 발효 프로폴리스 추출물의 제조방법.
  14. 제9항에 따른 제조방법에 의해 제조된 발효 프로폴리스 추출물.
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