KR20220084078A

KR20220084078A - 고순도 간엽계 줄기세포

Info

Publication number: KR20220084078A
Application number: KR1020227015011A
Authority: KR
Inventors: 유미 마츠자키; 다카시 스야마
Original assignee: 퓨렉 가부시키가이샤
Priority date: 2020-01-16
Filing date: 2020-04-06
Publication date: 2022-06-21
Also published as: WO2021144995A1; WO2021145002A1; US20230002735A1; JP7466218B2; CA3163517A1; IL293724A; EP4053266A4; CN114846134A; AU2020423706A1; JPWO2021145002A1; WO2021145002A8; JP2024089675A; EP4053266A1

Abstract

LNGFR (CD271) 이 양성, 또는 LNGFR (CD271) 및 Thy-1 (CD90) 이 공양성인 고속 증식성 간엽계 줄기세포 클론의 세포 집단으로서, 이하의 (a) 및 (b) 의 적어도 1 개의 특징을 만족하는, 상기 세포 집단.
(a) 플로 사이토메트리의 전방 산란광의 변동 계수가 35 ％ 이하이다.
(b) 평균 세포 사이즈가 20 ㎛ 이하이다.

Description

고순도 간엽계 줄기세포

본 발명은, 균일성을 가지며 증식이 빠른 인간 간엽계 줄기세포의 고순도 세포 집단에 관한 것이다.

간엽계 줄기세포 (Mesenchymal Stem Cells : MSC) 는, 세포 채취에 수반하는 윤리적 문제가 적고, 뼈·연골·지방 등으로의 다양한 분화능을 갖는 점에서, 조혈 줄기세포에 이어 임상 응용이 활발히 실시되고 있는 체성 줄기세포의 하나이다. MSC 는, 비교적 간단한 손재주에 의해 분리할 수 있는 점에서, 주로 시험관 내에서 연골이나 뼈 등으로 분화 유도 후에 국소에 이식하는 등, 바이오 머티리얼의 재료로서 널리 사용되고 있다.

그리고, 임상 응용을 진행할 때에는, 일정한 기능을 유지하는 세포를 필요량 제조할 수 있는 것이, 제품화의 필수 조건이 된다.

그러나, 출발 재료 (인간 골수액 등) 의 성질에 편차가 있는 경우, 즉 도너에게서 유래하는 성질에 차이가 있는 경우에는, 제품으로서의 세포 제제의 성질은 크게 영향을 받는다.

이 때문에, 편차가 적은 고순도의 간엽계 줄기세포를 얻는 것이 중요하다.

본 발명자들은, 골수액으로부터 LNGFR, Thy-1 공양성 (共陽性) 세포를 플로 사이토메트리에 의해 분리하여, 증식이 빠른 클론 (Rapidly Expanding Clone : REC) 을 얻고 있고, 도너에게서 유래하는 MSC 의 증식성의 차를 배제할 수 있는 정제 분리 방법을 확립하였다 (일본 특허 제6463029호, WO 2016/017795, Mabuchi Y.et al., Stem Cell Reports 1 (2) : 152-165, 2013). 이 방법에서는, 예를 들어 Ror2 의 발현을 지표로 하여 REC 를 분리 선별하고 있다.

또, 정제가 끝난 간엽계 줄기세포 조성물 및 간엽계 줄기세포 조성물을 정제하는 방법도 알려져 있고 (일본 특허 6025329호), 이 방법에서는, 직경이 150 ㎛ 이하인 간엽계 줄기세포가 정제되어 있다.

그러나, REC 의 클론에는 분화능이나 증식능에 있어서 여전히 편차가 관찰된다. 또, 증식성이 우수한 REC 라고 해도 계대 (繼代) 에 의한 열화는 피할 수 없어, 유효한 품질 관리 방법이 요구되고 있었다. 그리고, Ror2 의 발현을 지표로 한 경우에도 증식능과의 상관에는 개선의 여지가 있었다.

일본 특허 제6463029호 국제 공개 2016/017795호 팜플렛 일본 특허 제6025329호

Mabuchi Y Morikawa S, Harada S ; Niibe K, Suzuki S, Renault-Mihara F, Houlihan DD, Akazawa C, Okano H, Matsuzaki Y. LNGFR+ Thy-1+ Vcam-1hi+ cells reveal functionally distinct subpopulations in mesenchymal stem cells. Stem Cell Reports 1 (2) : 152-165, 2013.

그래서 본 발명에 있어서는, 고순도이며 균일성이 높은 REC 의 선별 방법, 및 세포 성능을 담보하는 지표를 확립할 것이 요구되고 있었다.

본 발명자는, 상기 과제를 해결하기 위해 검토를 실시한 결과, 인간 골수액으로부터 LNGFR 및 Thy-1 이 모두 양성인 세포를 얻어, 단일한 세포로부터 수 많은 REC 의 클론을 제조하여, 분화능 및 증식능의 측정을 반복하는 동안에, 세포의 크기와 균일성이, 각각의 클론의 분화능 및 증식능과 보다 강하게 상관하는 것을 알아내었다.

또 본 발명자는, 각 클론을 구성하는 세포의 크기와 그 편차를 플로 사이토메트리에 있어서의 전방 산란광 (FSC) 을 지표로 분석하여, 사이즈가 작고 FSC 의 CV 값이 작을수록, 증식능, 분화능이 우수한 것을 알아내어, 이 지표를 기초로 각 클론의 선발을 실시함으로써 일정한 범위 내의 기능을 갖는 세포를 제조할 수 있는 것을 알아내었다.

즉, 본 발명은 이하와 같다.

(1) LNGFR (CD271) 이 양성, 또는 LNGFR (CD271) 및 Thy-1 (CD90) 이 공양성인 고속 증식성 간엽계 줄기세포 클론의 세포 집단으로서, 이하의 (a) 및 (b) 의 적어도 1 개의 특징을 만족하는, 상기 세포 집단.

(a) 플로 사이토메트리의 전방 산란광의 변동 계수가 35 ％ 이하이다.

(b) 평균 세포 사이즈가 20 ㎛ 이하이다.

(2) 변동 계수가 30 ％ 이하인, (1) 에 기재된 세포 집단.

(3) 평균 세포 사이즈가 14 ㎛ ∼ 18 ㎛ 인, (1) 또는 (2) 에 기재된 세포 집단.

(4) LNGFR (CD271) 이 양성, 또는 LNGFR (CD271) 및 Thy-1 (CD90) 이 공양성인 고속 증식성 간엽계 줄기세포 클론의 세포 집단의 품질을 평가하는 방법으로서, 이하의 (a) 및 (b) 의 적어도 1 개의 특징을 만족하는 세포 집단을, 고품질이라고 판정하는, 상기 방법.

(b) 평균 세포 사이즈가 20 ㎛ 이하이다.

(5) 변동 계수가 30 ％ 이하인, (4) 에 기재된 방법.

(6) 평균 세포 사이즈가 14 ㎛ ∼ 18 ㎛ 인, (4) 또는 (5) 에 기재된 방법.

(7) LNGFR (CD271) 이 양성, 또는 LNGFR (CD271) 및 Thy-1 (CD90) 이 공양성인 고속 증식성 간엽계 줄기세포 클론의 세포 집단으로부터, 임상에 적용 가능한 세포 집단을 선발하는 방법으로서, 이하의 (a) 및 (b) 의 적어도 1 개의 특징을 만족하는 세포 집단을, 치료용 간엽계 줄기세포 집단으로서 선발하는, 상기 방법.

(b) 평균 세포 사이즈가 20 ㎛ 이하이다.

(8) 변동 계수가 30 ％ 이하인, (7) 에 기재된 방법.

(9) 평균 세포 사이즈가 14 ㎛ ∼ 18 ㎛ 인, (7) 또는 (8) 에 기재된 방법.

본 발명에 의해, 세포의 크기에 균일성을 갖고, 게다가 증식능, 분화능이 우수한 간엽계 줄기세포 집단을 선발할 수 있었다. 선발된 세포 집단은 임상에 적용할 수 있는 품질을 갖고 있으며, 심근경색, 뇌경색, 척수 손상, 뼈 또는 연골 형성 관련 질환, 이식편대 숙주병 (GVHD), 간경변, 표피 수포증, 하지허혈 등의 치료에 사용하는 것이 기대된다.

도 1 은 본 발명에 있어서 REC 를 선별하는 수법의 개요를 나타내는 도면이다.
도 2 는 플로 사이토메트리에 의한 전방 산란광 (FSC) 의 CV 값의 측정 결과를 나타내는 도면이다.
도 3 은 세포 증식능 및 지방 분화능을 평가한 결과를 나타내는 도면이다.
도 4 는 REC 클론의 망라적 해석 결과를 나타내는 도면이다.
도 5 는 본 발명의 해석 결과의 정리를 나타내는 도면이다.
도 6 은, REC 클론의 망라적 해석 결과를 나타내는 도면이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

1. 개요

본 발명자는, 이전의 연구에 의해, LNGFR (CD271) 이 양성인 간엽계 줄기세포 (CD271+ 세포), 또는 LNGFR (CD271) 및 Thy-1 (CD90) 이 공양성인 간엽계 줄기세포 (CD271+CD90+ 세포) 중에서, 증식이 빠른 고속 증식성의 세포 클론 (Rapidly Expanding Clone : REC) 을 단리하는 것에 성공하였다.

이 REC 는, 96 웰 플레이트에 1 개씩 세포를 파종하여 배양했을 때에, 2 주 동안에 컨플루언트에 이를 수 있는 세포이고, 종래법으로 얻은 간엽계 줄기세포와 비교하여, 증식능, 분화능 및 유주능 (遊走能) 의 전부가 1000 배 이상의 능력을 갖는다. 그리고, 특히 유주능을 유지하고 있기 때문에, 경정맥 내 투여가 가능해져, 뼈·연골 형성 부전증 등의 위중한 전신성 질환으로의 응용을 기대할 수 있다.

그러나, 이와 같은 REC 클론이어도, 그 중에는, 분화능이나 증식능에 있어서 편차가 관찰되는 경우가 있다.

본 발명은, 이와 같은 편차가 적은 세포 클론, 및 당해 세포 클론의 선별 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 세포 클론을 포함하는 세포 집단은, LNGFR (CD271) 및 Thy-1 (CD90) 이 공양성이고, 또한, 증식이 빠른 간엽계 줄기세포 클론의 집단이며, 이하의 (a) 및 (b) 의 적어도 1 개의 특징을 만족한다.

(b) 평균 세포 사이즈가 20 ㎛ 이하이다.

2. 인간 간엽계 줄기세포 농축 방법

본 발명에 있어서, LNGFR (CD271) 이 양성, 또는 LNGFR (CD271) 및 Thy-1 (CD90) 이 공양성인 간엽계 줄기세포를 얻기 위해서는, 예를 들어 WO 2009/31678호에 기재된 방법에 따를 수 있다.

그 방법의 개요는 이하와 같다.

먼저, 인간 간엽계 줄기세포가 포함되는 세포 집단으로부터, LNGFR (CD271) 이 양성 (CD271+), 또는 CD271 및 CD90 이 공양성 (CD271+CD90+) 인 세포 분획을 선별함으로써, 간엽계 줄기세포를 고도로 농축한다. 또한, 인간 간엽계 줄기세포가 포함되는 세포 집단에 혈구계 세포가 포함되는 경우에는, 비혈구계의 세포를 선별하기 위해, CD45 및 CD235a 가 공음성 (共陰性) (CD45-CD235a-) 인 세포를 선별하는 공정을 추가해도 된다.

간엽계 줄기세포가 포함되는 세포 집단은, 플로 사이토메트리나 아피니티·크로마토그래피에 의해 조제할 수 있다.

이 세포 집단을 얻기 위한 재료는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 골수나 말초혈 (G-CSF 투여 후의 말초혈을 포함한다) 등을 들 수 있다. 또한, 골수는, 척추, 흉골, 장골 등의 골수를 사용하면 된다.

세포 조제시, 재료가 간엽계 줄기세포를 말려들게 한 세포 덩어리가 되어 있는 경우에는, 필요에 따라, 재료에 대해 피펫팅 등에 의한 물리적 처리나, 트립신, 콜라게나아제 등에 의한 효소 처리를 실시할 수 있다. 또, 재료에 적혈구가 혼입되어 있는 경우에는, 미리 적혈구를 용혈해 두는 것이 바람직하다.

상기와 같이 조제된 세포 집단을 사용하여, CD271+ 세포 또는 CD271+CD90+ 세포를 선별한다.

CD271+ 세포 또는 CD271+CD90+ 세포를 선별하는 방법으로는, 예를 들어, 항체를 사용하는 방법을 들 수 있다.

항체는, CD271+ 세포 또는 CD271+CD90+ 세포를 선별하는 것이 가능한, 항 CD271 항체 및/또는 항 CD90 항체이다. 선별에 플로 사이토메트리를 사용하는 경우에는, FITC, PE, APC 등의 상이한 형광 색소로 표지된 항 CD271 항체, 또는 항 CD271 항체와 항 CD90 항체를, 적절히 조합하여 사용함으로써, 생세포를 단시간에 선별하는 것이 가능해진다. 또, 플로 사이토메트리 이외에도, 자기 비드를 사용하는 방법이나 아피니티·크로마토그래피를 사용하는 방법에 의해, CD271+CD90+ 세포를 선별하는 것이 가능하다.

또한, 이들 방법을 사용하기 전에, 미리, 사 (死) 세포를 염색하는 형광 색소 (예를 들어, PI) 를 세포 집단과 반응시키고, 형광으로 염색된 세포를 제거함으로써, 사세포를 제거해도 된다.

3. REC 세포 농축

다음으로, 선별한 LNGFR 양성 세포, 또는 LNGFR 및 Thy1 공양성 세포를 단일 세포 (클론) 배양하여, 증식이 빠른 로트를 선택함으로써, 증식능·분화능·유주능 이 우수한 고순도 인간 간엽계 줄기세포 (REC : Rapidly Expanding Clone) 를 얻는다.

도 1 에 단클론 배양법에 의한 REC 분리 공정을 예시한다.

인간 골수 또는 지방·태반 융모막으로 단핵세포를 조제하고, 골수 단핵세포포를 항 LNGFR 단독, 또는 항 LNGFR 및 항 Thy1 로 염색한다. 다음으로, 플로 사이토메트리 (셀 소터) 를 사용하여, LNGFR 양성 세포, 또는 LNGFR 양성 및 Thy1 양성 세포를 96 구멍 배양 플레이트에 클론 소트한다. 즉, 1 웰에 세포 1 개씩 파종한다. 단일 세포 배양 2 주일 후에 배양 플레이트를 현미경하에서 촬영하고, 컨플루언트 또는 세미 컨플루언트가 된 웰을 선별하여, 당해 웰에 포함되는 세포를 REC 로 한다.

여기서,「증식이 빠르다」,「고속 증식성」이란, 96 구멍 배양 플레이트의 1 웰에 세포 1 개씩 파종하여 배양했을 때에, 배양 개시 2 주일 후 또는 그 이전에 배양 플레이트가 컨플루언트 또는 세미 컨플루언트가 될 정도의 증식 속도 (배가 시간 (더블링 타임) 이 26±1 시간) 를 갖는 것을 의미한다.

컨플루언트란, 배양 용기 표면 (배양면) 의 90 ％ 이상을 배양 세포가 덮고 있는 상태이다. 또, 세미 컨플루언트란, 배양 용기 표면 (배양면) 의 70 ∼ 90 ％ 를 배양 세포가 덮고 있는 상태이다. 사용하는 배양 기구의 사이즈 및 종류는, 세포의 증식 속도에 따라 적절히 변경 가능하다. 느리게 증식하고 있는 세포 (Moderately/Slowly Expanding Cells), 즉 단일 세포 배양 2 주 후가 되어도 세미 컨플루언트 또는 컨플루언트가 되지 않았던 세포는 파기한다. REC 로서 선별한 각 웰로부터 회수한 REC 를 각 웰마다 배양 플라스크에 이입하고, 추가로 컨플루언트가 될 때까지 배양한다 (확대 배양). 그 후, 확대 배양한 세포를 따로 따로 회수한다. 1 웰 유래의 REC 를 1 로트로 하고, 이것을 후술하는 선별에 사용한다.

여기서, 본 발명의 세포는, 1 웰에 세포 1 개씩 파종하는 클론 소트에 의해 얻어진 것이기 때문에, 증식된 세포끼리의 유전 형질은 모두 동일하다. 따라서, 본 발명에 있어서는 세포 집단 전체를「클론」이라고 하는 경우도 있고, 세포 집단을 구성하는 개개의 세포를「클론」이라고 하는 경우도 있다.

또, 본 발명에 있어서, 선별에 사용하기 위한 REC 는, REC 마커 (항 Ror2) 에 의해 미리 평가해 둘 수도 있다. 예를 들어, 상기 확대 배양 후, 전체 로트로부터 부착 증식된 세포를 회수하여, 각 로트의 일부 (1 ∼ 3 × 10⁵ 개 정도) 의 세포를 나누고, 항 Ror2 에 대한 모노클로날 항체로 단일 염색을 실시한다. 항 Ror2 에 대한 모노클로날 항체로 단일 염색을 실시하는 수법은 공지이다 (WO 2016/17795). 요약하면, REC 마커를 사용한 플로 사이토메트리 해석에 의해, 회수 세포에 있어서의 REC 마커 양성 세포의 비율을 구한다. 비율은, 정량적 PCR 을 사용하여 Ror2 의 mRNA 발현을 정량해도 되고, 현미경에 의해 동 비율을 매뉴얼에 의해 구해도 된다. 상기 양성 비율이 일정값 (예를 들어 65 ％) 이상의 로트 (세포 집단) 를 합격으로 하고, 이것을 후술하는 선별에 사용할 수도 있다.

4. 본 발명의 줄기세포 집단의 선별

본 발명에 있어서는, 개개의 로트의 REC 클론에 대해, 세포의 증식능, 지방 분화능, REC 특이적 마커 발현량, 세포 사이즈의 균일성을 조사하고, 각각의 상관성을 해석함으로써, 고순도이며 보다 세포 성능이 높은 REC 를 선별하는 것이 가능해졌다.

본 발명에 있어서는, 전방 산란광의 변동 계수 (Coefficient of Variation : CV 값) 및 세포의 평균 사이즈를 선별의 지표로 한다.

전방 산란광 (Forward Scatter) 이란, 레이저광의 축에 대해 앞방향의 작은 각도로 산란하는 광이다. 전방 산란광은, 세포 표면에서 발생하는 레이저광의 산란광, 회절광 및 굴절광으로 이루어지고, 샘플의 크기에 관한 정보가 얻어진다.

변동 계수 (Coefficient of Variation : CV) 는, 표준 편차를 평균값으로 나눈 값으로, 단위가 상이한 데이터의 편차나, 평균값에 대한 데이터와 편차의 관계를 상대적으로 평가할 때에 사용하는 수치이다.

본 발명에 있어서는, 상기 CV 값이 35 ％ 이하인 것을 선별한다. CV 값이 35 ％ 이하인 세포 집단은, 크기가 균일한 세포에 의해 구성되어 있는 세포 집단이다. 바람직하게는, CV 값은 30 ％ 이하, 25 ％ 이하, 또는 20 ％ 이하이다.

또, 본 발명에 의해 선별된 세포 집단에 있어서의 세포의 평균 사이즈는, 20 ㎛ 이하이다. 바람직하게는 18 ㎛ 이하이고, 14 ㎛ ∼ 18 ㎛ 의 범위의 크기이다.

본 발명은, LNGFR 양성 세포, 또는 LNGFR (CD271) 및 Thy-1 (CD90) 이 공양성인 고속 증식성 간엽계 줄기세포 클론의 세포 집단의 품질을 평가하는 방법도 제공한다. 본 발명에 있어서는, 이하의 (a) 및 (b) 의 적어도 1 개의 특징, 바람직하게는 양방의 특징을 만족하는 세포 집단을, 고품질이라고 판정한다.

(b) 평균 세포 사이즈가 20 ㎛ 이하이다.

이와 같이 하여 평가 및 선별된 세포 집단은, 당해 집단을 구성하는 세포 클론의 수가 한정되는 것은 아니고, 예를 들어 1 ml 의 용액에 0.8 × 10⁷ ∼ 1.2 × 10⁷ 개 정도의 세포를 갖는다.

또, 당해 세포 집단은, 치료용 간엽계 줄기세포 집단으로서, 예를 들어 이하의 질환의 치료 목적으로 한 임상에 적용하는 것이 가능하다. 단, 질환은 이것들에 한정되는 것은 아니다.

유전자 질환 (표피 수포증, 저포스파타아제증 등)

뼈관절 질환 (무릎 연골 결손, 변형성 슬관절증, 추간판 헤르니아 등)

심질환 (심근경색, 허혈성 심부전 등)

간장 질환 (간경변, 비알코올성 지방성 간염 등)

실시예

이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 단, 본 발명의 범위는 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

1. 플로 사이토메트리에 의한 전방 산란광 (FSC) 의 CV 값 측정

공지 방법 (WO 2016/17795) 및 도 1 에 나타내는 스킴에 의해 미리 조제해 둔 REC 클론 (클론 번호 : 1 ∼ 45) 을, 플로 사이토메트리에 의한 전방 산란광의 CV 값 측정에 사용하였다.

플로 사이토메트리에 있어서의 FSC 는 세포의 표면적 또는 크기에 비례한다. 본 실시예에서는, FSC 의 CV 값을 지표로 하여 세포 사이즈의 편차를 평가하였다. 도 2 에, 플로 사이토메트리에 의한 전방 산란광의 CV 값 측정 결과를 나타낸다.

(a) 개개의 REC 클론에 대해 PI 염색을 실시하고, PI 음성의 생세포 집단에 게이트를 설정하여, 사세포를 해석의 대상으로부터 제외하였다.

(b) PI 음성의 생세포 집단을 FSC/SSC 의 사이토그램으로 전개하고, 메인의 세포 집단에 게이트 (P1) 를 설정하여, 먼지나 노이즈를 해석의 대상으로부터 제외하였다.

(c) P1 게이트 내의 세포 집단을 FSC 의 히스토그램으로 전개하고, 마커 (M1) 를 설정하여, CV 값을 계측하였다.

2. 세포 증식능 및 지방 분화능의 평가 (도 3)

(1) 세포 증식능의 평가 방법

1 ×10⁵ 개의 REC 세포를 100 ㎜ 배양 접시에 파종하고, 37 ℃, 5 ％ CO₂ 환경하에서 5 일간 배양하고, 그 후, 셀 카운터를 사용하여 세포수 및 평균 세포 사이즈를 계측하였다. 또한, 배양액은, FBS, 염기성 FGF (basic FGF), Hepes, 페니실린-스트렙토마이신 (Penicillin-Streptomycin) 을 첨가한 DMEM 배지 (후지 필름 와코 순약사) 를 사용하였다.

(2) 지방 분화능의 평가 방법

5 × 10⁴ 개의 REC 세포를 24 구멍 플레이트에 파종하여, 37 ℃, 5 ％ CO₂ 환경하에서 2 일간 배양하고, 그 후, 지방 분화 유도 배지로 치환하고, 추가로 14일간 배양하였다. 배양 14 일 후에 오일 레드 0 염색을 실시하고, 화상 해석에 의해 지방 방울 면적을 산출하였다. 또한, 지방 분화 유도 배지는, (1) 의 배양 배지에 덱사메타손 (Dexamethasone), 인도메타신 (Indomethacin), IBMX 를 첨가한 배지를 사용하였다.

3. 망라적 해석

1 회의 소팅으로 얻어진 REC, 45 클론에 대해 망라적 해석을 실시하였다 (도 4).

각각의 REC 클론에 대해, FSC 의 CV 값, 세포 증식율 (증식능), 평균 세포 사이즈, 지방 분화능을 조사한 결과, FSC 의 CV 값이 낮은 REC 클론 (#3, #5, #15, #16, #17) 은 증식능, 분화능이 모두 높고, 평균 세포 사이즈가 작은 것을 알 수 있었다.

한편으로, FSC 의 CV 값이 높은 REC 클론 (#7, #32, #39, #40, #44) 은, 증식능, 분화능이 모두 낮고, 평균 세포 사이즈가 큰 것을 알 수 있었다.

CV 값 30 ％ ∼ 35 ％ 의 클론의 평균 증식율은 6.4 이고, CV 값 25 ％ ∼ 30 ％ 의 클론의 평균 증식율은 9.2, CV 값 25 ％ 이하의 클론의 평균 증식율은 15.1 이었다. 또 평균 세포 사이즈가 18 ㎛ ∼ 20 ㎛ 인 클론의 평균 증식율은 7.0 이고, 평균 세포 사이즈가 16 ㎛ ∼ 18 ㎛ 인 클론의 평균 증식율은 12.7, 평균 세포 사이즈가 16 ㎛ 이하인 클론의 평균 증식율은 21.3 이었다.

이들 결과로부터, FSC 의 CV 값 및 평균 세포 사이즈를 지표로 하여, 증식능, 분화능이 모두 높은, 고품질인 REC 클론의 선별이 가능해졌다.

4. 전형적 해석예의 정리 (도 5)

FSC 의 CV 값이 낮고, 평균 세포 사이즈가 작은 클론 A 는, 지방 분화능, 증식능이 모두 높은, 고품질인 REC 클론이다.

FSC 의 CV 값이 높고, 평균 세포 사이즈가 큰 클론 B 는, 지방 분화능, 증식능이 모두 낮은, 규격 외인 REC 클론이다.

[실시예 2]

2 종의 골수액 로트 (# 18TL158166 과 # 8F5040) 를 2 개의 방법 (CD271 과 CD90 공양성 및 CD271 단독) 으로 소트하고, 얻어지는 Colony, REC, MEC, SEC 의 비율을 비교하였다 (도 6).

도 6 에 있어서, 좌패널은 셀 소팅의 결과를 나타낸다. 프레임으로 둘러싼 부분의 세포를 96-well 의 플레이트에 파종하여, 얻어지는 콜로니의 비율을 오른쪽 표의 "Colony" 에 나타냈다. 얻어진 콜로니 중, 증식이 빠른 콜로니 (REC), 중간 정도의 콜로니 (MEC), 증식이 늦은 콜로니 (SEC) 의 비율을 표 중에 나타냈다.

LNGFR, CD90 공양성을 지표에 소트한 경우와 비교하여, LNGFR 단독으로 소트한 경우, 콜로니가 얻어지는 비율은 많았지만, REC 가 얻어지는 비율은 낮았다.

그러나, LNGFR 양성 단독으로 소트해도, REC 를 분리할 수 있는 것을 알 수 있었다.

Claims

LNGFR (CD271) 이 양성, 또는 LNGFR (CD271) 및 Thy-1 (CD90) 이 공양성인 고속 증식성 간엽계 줄기세포 클론의 세포 집단으로서, 이하의 (a) 및 (b) 의 적어도 1 개의 특징을 만족하는, 상기 세포 집단.
(a) 플로 사이토메트리의 전방 산란광의 변동 계수가 35 ％ 이하이다.
(b) 평균 세포 사이즈가 20 ㎛ 이하이다.
제 1 항에 있어서,
변동 계수가 30 ％ 이하인, 세포 집단.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
평균 세포 사이즈가 14 ㎛ ∼ 18 ㎛ 인, 세포 집단.
LNGFR (CD271) 이 양성, 또는 LNGFR (CD271) 및 Thy-1 (CD90) 이 공양성인 고속 증식성 간엽계 줄기세포 클론의 세포 집단의 품질을 평가하는 방법으로서, 이하의 (a) 및 (b) 의 적어도 1 개의 특징을 만족하는 세포 집단을, 고품질이라고 판정하는, 상기 방법.
(a) 플로 사이토메트리의 전방 산란광의 변동 계수가 35 ％ 이하이다.
(b) 평균 세포 사이즈가 20 ㎛ 이하이다.
제 4 항에 있어서,
변동 계수가 30 ％ 이하인, 평가 방법.
제 4 항 또는 제 5 항에 있어서,
평균 세포 사이즈가 14 ㎛ ∼ 18 ㎛ 인, 평가 방법.
LNGFR (CD271) 이 양성, 또는 LNGFR (CD271) 및 Thy-1 (CD90) 이 공양성인 고속 증식성 간엽계 줄기세포 클론의 세포 집단으로부터, 임상에 적용 가능한 세포 집단을 선발하는 방법으로서, 이하의 (a) 및 (b) 의 적어도 1 개의 특징을 만족하는 세포 집단을, 치료용 간엽계 줄기세포 집단으로서 선발하는, 상기 방법.
(a) 플로 사이토메트리의 전방 산란광의 변동 계수가 35 ％ 이하이다.
(b) 평균 세포 사이즈가 20 ㎛ 이하이다.
제 7 항에 있어서,
변동 계수가 30 ％ 이하인, 선발 방법.
제 7 항 또는 제 8 항에 있어서,
평균 세포 사이즈가 14 ㎛ ∼ 18 ㎛ 인, 선발 방법.