JPH10113171A - 造血幹細胞様未分化細胞株 - Google Patents
造血幹細胞様未分化細胞株Info
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- JPH10113171A JPH10113171A JP9224611A JP22461197A JPH10113171A JP H10113171 A JPH10113171 A JP H10113171A JP 9224611 A JP9224611 A JP 9224611A JP 22461197 A JP22461197 A JP 22461197A JP H10113171 A JPH10113171 A JP H10113171A
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 温度感受性突然変異ＳＶ４０ラージＴ抗
原遺伝子導入哺乳動物の骨髄由来の骨髄間質細胞株との
相互作用を選択手段として、造血幹細胞様未分化細胞株
または不死化造血幹細胞様未分化細胞株が得られる。 【効果】 造血幹細胞様未分化細胞株または不死化造血
幹細胞様未分化細胞株が得られた。得られた細胞株か
ら、種々の因子や分化特異的抗原に対する抗体が得られ
る。
原遺伝子導入哺乳動物の骨髄由来の骨髄間質細胞株との
相互作用を選択手段として、造血幹細胞様未分化細胞株
または不死化造血幹細胞様未分化細胞株が得られる。 【効果】 造血幹細胞様未分化細胞株または不死化造血
幹細胞様未分化細胞株が得られた。得られた細胞株か
ら、種々の因子や分化特異的抗原に対する抗体が得られ
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明の造血幹細胞様未分化細胞
株、不死化造血幹細胞様未分化細胞株および温度感受性
突然変異ＳＶ４０ラージＴ抗原遺伝子を導入したトラン
スジェニックマウスの骨髄から樹立された造血幹細胞様
の未分化の血液細胞株ＴＨＳ１１９などは、次のような
産業上の利用分野がある。
株、不死化造血幹細胞様未分化細胞株および温度感受性
突然変異ＳＶ４０ラージＴ抗原遺伝子を導入したトラン
スジェニックマウスの骨髄から樹立された造血幹細胞様
の未分化の血液細胞株ＴＨＳ１１９などは、次のような
産業上の利用分野がある。
【０００２】これらの細胞株は、造血幹細胞の自己再生
を司る因子、分化誘導因子および分化抑制因子の生産に
利用できる。
を司る因子、分化誘導因子および分化抑制因子の生産に
利用できる。
【０００３】また、造血幹細胞特異的マーカーの作成
や、それに対する抗体の作成に有用である。得られた造
血幹細胞特異的マーカーに対するマウスなどの抗体を基
に、ヒトの抗体も通常の遺伝子操作技術で取得可能とな
る。この抗体は、骨髄移植等の際に、造血幹細胞の分
離、同定、定量等に必要となる。
や、それに対する抗体の作成に有用である。得られた造
血幹細胞特異的マーカーに対するマウスなどの抗体を基
に、ヒトの抗体も通常の遺伝子操作技術で取得可能とな
る。この抗体は、骨髄移植等の際に、造血幹細胞の分
離、同定、定量等に必要となる。
【０００４】骨髄移植および遺伝子治療に、本発明の細
胞株を利用できる。
胞株を利用できる。
【０００５】更に、本細胞株は造血幹細胞の分化の研究
に応用できる。血液細胞の分化の研究は進んでいるが、
まだ未解決の部分もあり、本発明で得られた細胞株を用
いて分子レベルでその分化の仕組みが理解できるように
なり、引いては、各種機能を有する因子が得られる。こ
れらの因子は、医薬品としての利用も考えられる。
に応用できる。血液細胞の分化の研究は進んでいるが、
まだ未解決の部分もあり、本発明で得られた細胞株を用
いて分子レベルでその分化の仕組みが理解できるように
なり、引いては、各種機能を有する因子が得られる。こ
れらの因子は、医薬品としての利用も考えられる。
【０００６】その他、本細胞株自身の生産する新しいサ
イトカインの生産およびそのクローニング等にも用いる
ことができ、また、様々な物質の薬理試験、毒性試験等
にも使用できる。
イトカインの生産およびそのクローニング等にも用いる
ことができ、また、様々な物質の薬理試験、毒性試験等
にも使用できる。
【０００７】
【従来の技術】造血幹細胞は１個の細胞から赤血球、白
血球、巨核球、血小板、ＴおよびＢリンパ球などあらゆ
る成熟血液細胞を作りだす能力、即ち多分化能を有する
と同時に、自己再生能を持つ細胞である。分化の進んだ
細胞の多くは分裂回数に限りがあるため、造血系を枯渇
することなく維持させるために、この幹細胞は自分自身
を複製する能力を持っている。自分自身を複製するに
は、何か因子が存在すると考えられているが、現在まだ
見いだされていない。
血球、巨核球、血小板、ＴおよびＢリンパ球などあらゆ
る成熟血液細胞を作りだす能力、即ち多分化能を有する
と同時に、自己再生能を持つ細胞である。分化の進んだ
細胞の多くは分裂回数に限りがあるため、造血系を枯渇
することなく維持させるために、この幹細胞は自分自身
を複製する能力を持っている。自分自身を複製するに
は、何か因子が存在すると考えられているが、現在まだ
見いだされていない。
【０００８】この因子の発見も含めて造血幹細胞に関す
る情報は少なく、株化の報告も今までに無い。
る情報は少なく、株化の報告も今までに無い。
【０００９】株化されることがなかった故、造血幹細胞
はその存在が知られているにもかかわらずその本態は不
明のままとなっていた。
はその存在が知られているにもかかわらずその本態は不
明のままとなっていた。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、造血幹細胞
の株化の方法や造血幹細胞の機能を維持させたまま株化
した不死化造血幹細胞様分化細胞株などを提供し、更に
細胞株が得られたことにより以下に述べるものをも提供
する。
の株化の方法や造血幹細胞の機能を維持させたまま株化
した不死化造血幹細胞様分化細胞株などを提供し、更に
細胞株が得られたことにより以下に述べるものをも提供
する。
【００１１】本発明は、温度感受性突然変異ＳＶ４０ラ
ージＴ抗原遺伝子導入哺乳動物の骨髄由来の骨髄間質細
胞株を用いることを特徴とする、造血幹細胞様未分化細
胞株を得る方法に関する。
ージＴ抗原遺伝子導入哺乳動物の骨髄由来の骨髄間質細
胞株を用いることを特徴とする、造血幹細胞様未分化細
胞株を得る方法に関する。
【００１２】更に、温度感受性突然変異ＳＶ４０ラージ
Ｔ抗原遺伝子導入哺乳動物の骨髄由来の不死化骨髄間質
細胞株を用い、温度感受性突然変異ＳＶ４０ラージＴ抗
原遺伝子導入哺乳動物の骨髄から不死化造血幹細胞様未
分化細胞株の樹立方法に関する。
Ｔ抗原遺伝子導入哺乳動物の骨髄由来の不死化骨髄間質
細胞株を用い、温度感受性突然変異ＳＶ４０ラージＴ抗
原遺伝子導入哺乳動物の骨髄から不死化造血幹細胞様未
分化細胞株の樹立方法に関する。
【００１３】また、本発明は、温度感受性突然変異ＳＶ
４０ラージＴ抗原遺伝子導入哺乳動物の骨髄由来の骨髄
間質細胞株を用いることを特徴とする、細胞の分化マー
カーがＬｉｎ- 、Ｓｃａ−１+ およびｃ−Ｋｉｔ+ の造
血幹細胞様未分化細胞株を得る方法に関する。
４０ラージＴ抗原遺伝子導入哺乳動物の骨髄由来の骨髄
間質細胞株を用いることを特徴とする、細胞の分化マー
カーがＬｉｎ- 、Ｓｃａ−１+ およびｃ−Ｋｉｔ+ の造
血幹細胞様未分化細胞株を得る方法に関する。
【００１４】更に、温度感受性突然変異ＳＶ４０ラージ
Ｔ抗原遺伝子導入哺乳動物の骨髄由来の不死化骨髄間質
細胞株を用い、温度感受性突然変異ＳＶ４０ラージＴ抗
原遺伝子導入哺乳動物の骨髄から、細胞の分化マーカー
がＬｉｎ- 、Ｓｃａ−１+ およびｃ−Ｋｉｔ+ の不死化
造血幹細胞様未分化細胞株の樹立方法に関する。
Ｔ抗原遺伝子導入哺乳動物の骨髄由来の不死化骨髄間質
細胞株を用い、温度感受性突然変異ＳＶ４０ラージＴ抗
原遺伝子導入哺乳動物の骨髄から、細胞の分化マーカー
がＬｉｎ- 、Ｓｃａ−１+ およびｃ−Ｋｉｔ+ の不死化
造血幹細胞様未分化細胞株の樹立方法に関する。
【００１５】これらの方法は、温度感受性突然変異ＳＶ
４０ラージＴ抗原遺伝子導入哺乳動物が、温度感受性突
然変異ＳＶ４０ラージＴ抗原遺伝子導入マウスである方
法が好ましい。
４０ラージＴ抗原遺伝子導入哺乳動物が、温度感受性突
然変異ＳＶ４０ラージＴ抗原遺伝子導入マウスである方
法が好ましい。
【００１６】具体的には、温度感受性突然変異ＳＶ４０
ラージＴ抗原遺伝子導入マウスの骨髄由来の骨髄間質細
胞株ＴＢＲ５９との相互作用により選択することを特徴
とする、造血幹細胞様未分化細胞株を得る方法である。
ラージＴ抗原遺伝子導入マウスの骨髄由来の骨髄間質細
胞株ＴＢＲ５９との相互作用により選択することを特徴
とする、造血幹細胞様未分化細胞株を得る方法である。
【００１７】上記の方法で得た造血幹細胞様未分化細胞
株または不死化造血幹細胞様未分化細胞株は、本発明の
一態様では、細胞株ＴＨＳ１１９（受託番号：ＦＥＲＭ
ＢＰ−５６１３）である。
株または不死化造血幹細胞様未分化細胞株は、本発明の
一態様では、細胞株ＴＨＳ１１９（受託番号：ＦＥＲＭ
ＢＰ−５６１３）である。
【００１８】また、造血幹細胞様未分化細胞株または不
死化造血幹細胞様未分化細胞株を用いることを特徴とす
る治療方法に関する。
死化造血幹細胞様未分化細胞株を用いることを特徴とす
る治療方法に関する。
【００１９】上記方法で得られた造血幹細胞様未分化細
胞株または不死化造血幹細胞様未分化細胞株からは、細
胞自己再生因子、分化誘導因子および分化抑制因子など
が得られる。
胞株または不死化造血幹細胞様未分化細胞株からは、細
胞自己再生因子、分化誘導因子および分化抑制因子など
が得られる。
【００２０】更に、造血幹細胞様未分化細胞株または不
死化造血幹細胞様未分化細胞株の分化に特異的なマーカ
ー抗原で作成される抗体が得られ。これらより、１つ以
上の抗体からなる造血細胞分化段階の判定用キットが組
み立てられる。
死化造血幹細胞様未分化細胞株の分化に特異的なマーカ
ー抗原で作成される抗体が得られ。これらより、１つ以
上の抗体からなる造血細胞分化段階の判定用キットが組
み立てられる。
【００２１】
【課題を解決するための手段】本発明の造血幹細胞様未
分化細胞株は、造血幹細胞の多分化能をほとんど保持し
たまま株化した未分化の細胞を意味する。造血幹細胞様
未分化細胞株は、正常の組織からも得られ、更に種々の
変化や変異等によっても得られる。本発明の一態様でも
ある温度感受性突然変異ＳＶ４０ラージＴ抗原遺伝子導
入哺乳動物の骨髄から得る場合、その細胞株は不死化造
血幹細胞様未分化細胞株となり安定に保持できる。
分化細胞株は、造血幹細胞の多分化能をほとんど保持し
たまま株化した未分化の細胞を意味する。造血幹細胞様
未分化細胞株は、正常の組織からも得られ、更に種々の
変化や変異等によっても得られる。本発明の一態様でも
ある温度感受性突然変異ＳＶ４０ラージＴ抗原遺伝子導
入哺乳動物の骨髄から得る場合、その細胞株は不死化造
血幹細胞様未分化細胞株となり安定に保持できる。
【００２２】不死化細胞株の樹立方法は、特開平５−２
９２９５８号公報などで行なえる。造血幹細胞様未分化
細胞株を得るには、造血組織の間質細胞との相互作用を
指標として選択すればよい。つまり造血幹細胞をはじ
め、未分化な血球の増殖は造血組織の間質細胞に依存し
ている。造血幹細胞や未分化な血球は間質細胞との共培
養系で、間質細胞に潜り込むようにして敷石状のコロニ
ーを形成することが知られている。本発明の実施例で詳
述する方法では、様々な機能細胞株を樹立するのに有用
であることが分かっている温度感受性突然変異のＳＶ４
０ラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェニックマ
ウスの骨髄から、幹細胞を含む未分化な血球画分を取り
出し、株化させた。
９２９５８号公報などで行なえる。造血幹細胞様未分化
細胞株を得るには、造血組織の間質細胞との相互作用を
指標として選択すればよい。つまり造血幹細胞をはじ
め、未分化な血球の増殖は造血組織の間質細胞に依存し
ている。造血幹細胞や未分化な血球は間質細胞との共培
養系で、間質細胞に潜り込むようにして敷石状のコロニ
ーを形成することが知られている。本発明の実施例で詳
述する方法では、様々な機能細胞株を樹立するのに有用
であることが分かっている温度感受性突然変異のＳＶ４
０ラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェニックマ
ウスの骨髄から、幹細胞を含む未分化な血球画分を取り
出し、株化させた。
【００２３】つまり、細胞の増殖を促すＳＶ４０Ｔラー
ジ抗原遺伝子を導入したマウスの造血幹細胞を敷石状コ
ロニー形成能を指標に間質細胞と共培養し、造血幹細胞
または未分化血球の安定した培養系を作成し、細胞株を
樹立した。
ジ抗原遺伝子を導入したマウスの造血幹細胞を敷石状コ
ロニー形成能を指標に間質細胞と共培養し、造血幹細胞
または未分化血球の安定した培養系を作成し、細胞株を
樹立した。
【００２４】具体的には、温度感受性突然変異ＳＶ４０
ラージＴ抗原遺伝子導入マウスの骨髄より造血幹細胞を
含むＬｉｎ抗体（−）／Ｓｃａ−１抗体（＋）の細胞を
取り出し、骨髄間質細胞株ＴＢＲ５９（受託番号；ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−５６１２）と共培養した。この骨髄間質細
胞層の下に潜り込んだ細胞を選択的に継代すると、３カ
月程で間質細胞依存的に増殖する単一血球細胞集団とな
った。この細胞集団はＬｉｎ抗体（−）／Ｓｃａ−１抗
体（＋）のまま間質細胞層の下に潜り込んで増殖し、各
血球の分化マーカーは陰性の細胞集団であった。
ラージＴ抗原遺伝子導入マウスの骨髄より造血幹細胞を
含むＬｉｎ抗体（−）／Ｓｃａ−１抗体（＋）の細胞を
取り出し、骨髄間質細胞株ＴＢＲ５９（受託番号；ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−５６１２）と共培養した。この骨髄間質細
胞層の下に潜り込んだ細胞を選択的に継代すると、３カ
月程で間質細胞依存的に増殖する単一血球細胞集団とな
った。この細胞集団はＬｉｎ抗体（−）／Ｓｃａ−１抗
体（＋）のまま間質細胞層の下に潜り込んで増殖し、各
血球の分化マーカーは陰性の細胞集団であった。
【００２５】これは造血幹細胞の未分化細胞株であると
考えられる。不死化造血幹細胞様未分化細胞株ＴＨＳ１
１９は、工業技術院生命工学工業技術研究所、特許微生
物寄託センターに寄託した。受託番号はＦＥＲＭ ＢＰ
−５６１３である。
考えられる。不死化造血幹細胞様未分化細胞株ＴＨＳ１
１９は、工業技術院生命工学工業技術研究所、特許微生
物寄託センターに寄託した。受託番号はＦＥＲＭ ＢＰ
−５６１３である。
【００２６】造血組織の間質細胞との相互作用を選択指
標として、正常の組織からも造血幹細胞様未分化細胞株
または不死化造血幹細胞様未分化細胞株を得ることがで
きる。
標として、正常の組織からも造血幹細胞様未分化細胞株
または不死化造血幹細胞様未分化細胞株を得ることがで
きる。
【００２７】細胞株は、造血幹細胞の細胞表面の分化マ
ーカーによりその性質が同定できる。この分化マーカー
のうち、単球、Ｂ細胞、Ｔ細胞それぞれの分化抗原に対
する抗体（Ｍａｃ−１、Ｇｒ−１、Ｂ２２０、ＣＤ４、
ＣＤ８など）に陰性の細胞を系統特異的抗原陰性という
意味でＬｉｎ- という。また、Ｓｃａ−１抗体およびｃ
−Ｋｉｔ抗体は幹細胞特異的抗原を認識するものであ
る。
ーカーによりその性質が同定できる。この分化マーカー
のうち、単球、Ｂ細胞、Ｔ細胞それぞれの分化抗原に対
する抗体（Ｍａｃ−１、Ｇｒ−１、Ｂ２２０、ＣＤ４、
ＣＤ８など）に陰性の細胞を系統特異的抗原陰性という
意味でＬｉｎ- という。また、Ｓｃａ−１抗体およびｃ
−Ｋｉｔ抗体は幹細胞特異的抗原を認識するものであ
る。
【００２８】本発明の、造血幹細胞様未分化細胞株また
は不死化造血幹細胞様未分化細胞株を分化させるには、
脾コロニー形成法（Till J. E., McCulloch E. A., Ra
d. Res. 14, 213-222, 1961）、in vitroコロニー形成
法（三浦恭定、血液幹細胞、中外医学社、１９８３）お
よび長期骨髄再構築（Smith, L. G., Weissman, I. L.,
Heimfeld, S., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 278
8, 1991 ）などで行えばよい。分化させた後に、その分
化マーカーを決め、分化段階（ステージ）を判定すれば
よい。
は不死化造血幹細胞様未分化細胞株を分化させるには、
脾コロニー形成法（Till J. E., McCulloch E. A., Ra
d. Res. 14, 213-222, 1961）、in vitroコロニー形成
法（三浦恭定、血液幹細胞、中外医学社、１９８３）お
よび長期骨髄再構築（Smith, L. G., Weissman, I. L.,
Heimfeld, S., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 278
8, 1991 ）などで行えばよい。分化させた後に、その分
化マーカーを決め、分化段階（ステージ）を判定すれば
よい。
【００２９】得られた細胞株から、種々の因子を分離す
るには以下のようにすればよい。
るには以下のようにすればよい。
【００３０】休止期の状態にある細胞株に、ある種のコ
ンディションド培地(conditionedmedium)を添加し、細
胞が分裂を開始することがわかれば、その conditioned
medium 中に自己再生を司る因子が含まれていることに
なる。常法に従いこの因子の精製を行い、更に遺伝子操
作技術を用いれば、造血幹細胞の自己再生を司る因子が
取得できる。同様のやり方で分化誘導因子や分化抑制因
子の取得もできる。
ンディションド培地(conditionedmedium)を添加し、細
胞が分裂を開始することがわかれば、その conditioned
medium 中に自己再生を司る因子が含まれていることに
なる。常法に従いこの因子の精製を行い、更に遺伝子操
作技術を用いれば、造血幹細胞の自己再生を司る因子が
取得できる。同様のやり方で分化誘導因子や分化抑制因
子の取得もできる。
【００３１】また、これらの生物的基礎となる機構に関
与している因子は遺伝子レベルで保存されていると考え
られる。つまり、マウスの種々の因子がヒトで機能する
可能性も大いに考えられ、更に、マウスのものからその
ホモロジーなどを利用して、ヒトの因子を取得すること
ができる。ヒトの因子を用いることで、白血病、再生不
良性貧血、骨髄移植等の臨床応用ができる。
与している因子は遺伝子レベルで保存されていると考え
られる。つまり、マウスの種々の因子がヒトで機能する
可能性も大いに考えられ、更に、マウスのものからその
ホモロジーなどを利用して、ヒトの因子を取得すること
ができる。ヒトの因子を用いることで、白血病、再生不
良性貧血、骨髄移植等の臨床応用ができる。
【００３２】更に、遺伝子レベルで保持されていること
から、本発明のマウスの造血幹細胞様未分化細胞株また
は不死化造血幹細胞様未分化細胞株を導入することによ
り、重症複合免疫不全症に代表される原発性免疫不全症
候群の治療に用いることができる。導入する方法として
は、骨髄移植によってもよいし、正常な遺伝子を数多
く、欠損遺伝子等を有する疾患細胞に導入するという遺
伝子治療によってもよい。
から、本発明のマウスの造血幹細胞様未分化細胞株また
は不死化造血幹細胞様未分化細胞株を導入することによ
り、重症複合免疫不全症に代表される原発性免疫不全症
候群の治療に用いることができる。導入する方法として
は、骨髄移植によってもよいし、正常な遺伝子を数多
く、欠損遺伝子等を有する疾患細胞に導入するという遺
伝子治療によってもよい。
【００３３】以下に実施例を挙げ、具体的に本発明を説
明する。
明する。
【００３４】
［実施例１］骨髄間質細胞株 骨髄間質細胞株ＴＢＲ５９は、温度感受性突然変異ＳＶ
４０ラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェニック
マウスの骨髄間質細胞から樹立された前脂肪細胞で、造
血を長期間維持できる細胞株である。（Kameoka, j., Y
aniai, N., and Obinata, M., J Cell Physiol, 164, 5
5-64, 1995、 Okuyama, R., Koguma, M., Yanai, N., an
d Obinata, M., Blood, 86, 2590, 1995、 Okuyama, R.,
Yanai, N., and Obinata, M., Exp. Cell Res., 218,
424, 1995) 。
４０ラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェニック
マウスの骨髄間質細胞から樹立された前脂肪細胞で、造
血を長期間維持できる細胞株である。（Kameoka, j., Y
aniai, N., and Obinata, M., J Cell Physiol, 164, 5
5-64, 1995、 Okuyama, R., Koguma, M., Yanai, N., an
d Obinata, M., Blood, 86, 2590, 1995、 Okuyama, R.,
Yanai, N., and Obinata, M., Exp. Cell Res., 218,
424, 1995) 。
【００３５】細胞の維持は２％牛胎児血清、１０μｇ／
ｍｌトランスフェリン、１０μｇ／ｍｌ上皮増殖因子
（エピダーマルグロースファクター）、１μｇ／ｍｌイ
ンスリンを加えたＲＩＴＣ８０−７培地（極東製薬工業
製）を用い、３３℃で培養を行った。
ｍｌトランスフェリン、１０μｇ／ｍｌ上皮増殖因子
（エピダーマルグロースファクター）、１μｇ／ｍｌイ
ンスリンを加えたＲＩＴＣ８０−７培地（極東製薬工業
製）を用い、３３℃で培養を行った。
【００３６】［実施例２］温度感受性突然変異ＳＶ４０
ラージＴ抗原遺伝子導入マウス大腿骨からのＬｉｎ抗体
（−）／Ｓｃａ−１抗体（＋）細胞の採取と培養 大腿骨から得た骨髄のＬｉｎ抗体（−）／Ｓｃａ−１抗
体（＋）の細胞を未分化血球とした。
ラージＴ抗原遺伝子導入マウス大腿骨からのＬｉｎ抗体
（−）／Ｓｃａ−１抗体（＋）細胞の採取と培養 大腿骨から得た骨髄のＬｉｎ抗体（−）／Ｓｃａ−１抗
体（＋）の細胞を未分化血球とした。
【００３７】使用した各Ｌｉｎ抗体とその抗体濃度は以
下の如くである。
下の如くである。
【００３８】 ＴＥＲ１１９抗体 １ mg/mlを、 ２μl ／１×１０6 細胞 Ｇｒ−１抗体 ０．０４ mg/mlを、 ２μl ／１×１０6 細胞 Ｂ２２０抗体 ０．１２ mg/mlを、 ２μl ／１×１０6 細胞 Ｍａｃ−１抗体 ０．２ mg/mlを、 ２μl ／１×１０6 細胞 ＣＤ４抗体 ０．０２５ mg/mlを、１μl ／１×１０6 細胞 ＣＤ８抗体 ０．０２５ mg/mlを、１μl ／１×１０6 細胞 および、 Ｓｃａ−１抗体 ０．４ mg/mlを、 １０μl ／２×１０5 細胞 温度感受性突然変異ＳＶ４０ラージＴ抗原遺伝子導入マ
ウス大腿骨の骨髄から細胞を取り出し、１０％血清を加
えたＥＲＤＦ培地（極東Ｅ−ＲＤＦ培地、極東製薬工業
製）で１〜２時間３７℃で培養し、接着性の細胞が基質
に接着した時点で、浮遊している血球細胞を回収した。
ウス大腿骨の骨髄から細胞を取り出し、１０％血清を加
えたＥＲＤＦ培地（極東Ｅ−ＲＤＦ培地、極東製薬工業
製）で１〜２時間３７℃で培養し、接着性の細胞が基質
に接着した時点で、浮遊している血球細胞を回収した。
【００３９】血球細胞をリン酸緩衝生理食塩液（ダルベ
ッコＰＢＳ）で洗い、５ｍＭエチレンジアミン四酢酸２
ナトリウム（ＥＤＴＡ）と１％牛血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）を含むＰＢＳ（Washing Buffer）に懸濁後、上述の
Ｌｉｎ抗体を加え、３０分間氷上に保持した。細胞を W
ashing Buffer で２回洗った後、ＭＡＣＳ（磁性体ビー
ズ結合抗ラット１ｇＧ；１０μl ／１×１０6 cells）
を加え、さらに３０分間氷上に保持してから Washing B
uffer で２回洗った。
ッコＰＢＳ）で洗い、５ｍＭエチレンジアミン四酢酸２
ナトリウム（ＥＤＴＡ）と１％牛血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）を含むＰＢＳ（Washing Buffer）に懸濁後、上述の
Ｌｉｎ抗体を加え、３０分間氷上に保持した。細胞を W
ashing Buffer で２回洗った後、ＭＡＣＳ（磁性体ビー
ズ結合抗ラット１ｇＧ；１０μl ／１×１０6 cells）
を加え、さらに３０分間氷上に保持してから Washing B
uffer で２回洗った。
【００４０】マグネット（Miltenyi Biotec)でＬｉｎ抗
体（＋）細胞をカラムでトラップし、Ｌｉｎ抗体（−）
細胞を透過させ回収し、Washing Bufferで１回洗った
後、Ｓｃａ−１抗体を加え、３０分間氷上に保持した。
Washing Bufferで２回洗ってからさらに、ＭＡＣＳビー
ズを加え、３０分間氷上に保持してからWashing Buffer
で２回洗い、マグネットでＳｃａ−１抗体（＋）細胞を
カラムにトラップし、Ｓｃａ−１抗体（−）細胞は透過
させて捨てた。
体（＋）細胞をカラムでトラップし、Ｌｉｎ抗体（−）
細胞を透過させ回収し、Washing Bufferで１回洗った
後、Ｓｃａ−１抗体を加え、３０分間氷上に保持した。
Washing Bufferで２回洗ってからさらに、ＭＡＣＳビー
ズを加え、３０分間氷上に保持してからWashing Buffer
で２回洗い、マグネットでＳｃａ−１抗体（＋）細胞を
カラムにトラップし、Ｓｃａ−１抗体（−）細胞は透過
させて捨てた。
【００４１】カラムにトラップしたＳｃａ−１抗体
（＋）細胞を回収し、飽和して単層になったＴＢＲ５９
と共培養した。培地は５％牛胎児血清と５０μＭのベー
タメルカプトエタノールを加えたＥＲＤＦ培地を用い、
３３℃で培養した。培地は２日ごとに交換し、１０日ご
とに継代した。
（＋）細胞を回収し、飽和して単層になったＴＢＲ５９
と共培養した。培地は５％牛胎児血清と５０μＭのベー
タメルカプトエタノールを加えたＥＲＤＦ培地を用い、
３３℃で培養した。培地は２日ごとに交換し、１０日ご
とに継代した。
【００４２】［実施例３］継代 Ｌｉｎ抗体（−）／Ｓｃａ−１抗体（＋）細胞はＴＢＲ
５９との共培養で、浮遊して増殖するもの、接着して増
殖するものおよびＴＢＲ５９細胞の下に潜り込んで増殖
するものが出現するが、このうち潜り込んで増殖するも
の選んだ。
５９との共培養で、浮遊して増殖するもの、接着して増
殖するものおよびＴＢＲ５９細胞の下に潜り込んで増殖
するものが出現するが、このうち潜り込んで増殖するも
の選んだ。
【００４３】共培養を０．１％コラゲナーゼ（和光純薬
の細胞分散用をＤＭＥＭに０．１％となるよう溶解した
もの）で２０分から３０分処理し、培養全体を穏やかな
ピペッティングによって細胞懸濁液とした。ナイロンメ
ッシュを通した後、接着性の細胞であるＴＢＲ５９と血
球細胞を分離するために、５％牛胎児血清と５０μＭの
ベータメルカプトエタノールを加えたＥＲＤＦ培地を用
い、３７℃で１時間培養した。穏やかなピペッティング
を加え、血球細胞のみを新しい単層のＴＢＲ５９と共培
養した。
の細胞分散用をＤＭＥＭに０．１％となるよう溶解した
もの）で２０分から３０分処理し、培養全体を穏やかな
ピペッティングによって細胞懸濁液とした。ナイロンメ
ッシュを通した後、接着性の細胞であるＴＢＲ５９と血
球細胞を分離するために、５％牛胎児血清と５０μＭの
ベータメルカプトエタノールを加えたＥＲＤＦ培地を用
い、３７℃で１時間培養した。穏やかなピペッティング
を加え、血球細胞のみを新しい単層のＴＢＲ５９と共培
養した。
【００４４】１０日に一回の継代を行うと、４から５回
目の継代から、ＴＢＲ５９細胞層全体にわたって潜り込
んで増殖する細胞集団となり、７から８回目にはほぼ均
一な細胞集団となり、以後、安定して継代できるように
なる。１０回目の継代時に、血球細胞の性状を調べ、こ
の細胞をＴＨＳ１１９とした。
目の継代から、ＴＢＲ５９細胞層全体にわたって潜り込
んで増殖する細胞集団となり、７から８回目にはほぼ均
一な細胞集団となり、以後、安定して継代できるように
なる。１０回目の継代時に、血球細胞の性状を調べ、こ
の細胞をＴＨＳ１１９とした。
【００４５】
【発明の効果】図１に示されるように、骨髄からＬｉｎ
抗体（−）／Ｓｃａ−１抗体（＋）細胞を取り出し、Ｔ
ＢＲ５９と共培養した。この初代培養の特徴としては、
写真に示すような潜り込んで増殖する細胞が培養できる
ことで、潜り込んだ細胞だけを継代することによっての
み、未分化な血球集団とすることができた。
抗体（−）／Ｓｃａ−１抗体（＋）細胞を取り出し、Ｔ
ＢＲ５９と共培養した。この初代培養の特徴としては、
写真に示すような潜り込んで増殖する細胞が培養できる
ことで、潜り込んだ細胞だけを継代することによっての
み、未分化な血球集団とすることができた。
【００４６】この未分化な血液集団は、図２に示される
ように、ギムザ染色ではこの細胞は大小二種類の細胞か
らなることが分かる。小型の細胞は細胞質の割合が少な
く、核の変形も少ないことから、未分化な血球の形態を
示した。トルイジンブルーに染まる顆粒はない。大型の
細胞はエステラーゼを持っていることが分かるので、分
化した血球と考えられた。小型の細胞は、細胞の突起を
染色しやすいアルカリ性フォスファターゼに染色される
ものがあることから未分化な顆粒球細胞の性状を示して
いた。
ように、ギムザ染色ではこの細胞は大小二種類の細胞か
らなることが分かる。小型の細胞は細胞質の割合が少な
く、核の変形も少ないことから、未分化な血球の形態を
示した。トルイジンブルーに染まる顆粒はない。大型の
細胞はエステラーゼを持っていることが分かるので、分
化した血球と考えられた。小型の細胞は、細胞の突起を
染色しやすいアルカリ性フォスファターゼに染色される
ものがあることから未分化な顆粒球細胞の性状を示して
いた。
【００４７】図３に表面抗原の解析結果を示す。得られ
た細胞株ＴＨＳ１１９は血球の分化マーカー判定用とし
て用いたＧｒ−１抗体、Ｍａｃ−１抗体、ＴＥＲ１１９
抗体およびＣＤ３抗体すべてに陰性であった。幹細胞の
性状であるＳｃａ−１抗体およびｃ−Ｋｉｔ抗体は陽性
であった。
た細胞株ＴＨＳ１１９は血球の分化マーカー判定用とし
て用いたＧｒ−１抗体、Ｍａｃ−１抗体、ＴＥＲ１１９
抗体およびＣＤ３抗体すべてに陰性であった。幹細胞の
性状であるＳｃａ−１抗体およびｃ−Ｋｉｔ抗体は陽性
であった。
【００４８】よって、細胞株ＴＨＳ１１９は不死化造血
幹細胞様未分化細胞株である。
幹細胞様未分化細胞株である。
【００４９】本発明により、造血幹細胞様未分化細胞株
または不死化造血幹細胞様未分化細胞株が提供できる。
提供された細胞株より、細胞自己再生因子、分化誘導因
子または分化抑制因子が得られる。また、分化に特異的
なマーカー抗原も得られ、それより抗体も作成できる。
または不死化造血幹細胞様未分化細胞株が提供できる。
提供された細胞株より、細胞自己再生因子、分化誘導因
子または分化抑制因子が得られる。また、分化に特異的
なマーカー抗原も得られ、それより抗体も作成できる。
【図１】 培養系の説明の図である。
【図２】 ＴＨＳ１１９の染色像の図である。
【図３】 ＴＨＳ１１９の表面抗原の解析図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 48/00 ＡＤＶ Ｃ０７Ｋ 14/52 Ｃ０７Ｋ 14/52 16/24 16/24 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｋ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ａ６１Ｋ 37/43 // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (14)
- 【請求項１】 温度感受性突然変異ＳＶ４０ラージＴ抗
原遺伝子導入哺乳動物の骨髄由来の骨髄間質細胞株を用
いることを特徴とする、造血幹細胞様未分化細胞株を得
る方法。 - 【請求項２】 温度感受性突然変異ＳＶ４０ラージＴ抗
原遺伝子導入哺乳動物の骨髄由来の不死化骨髄間質細胞
株を用い、温度感受性突然変異ＳＶ４０ラージＴ抗原遺
伝子導入哺乳動物の骨髄から不死化造血幹細胞様未分化
細胞株の樹立方法。 - 【請求項３】 温度感受性突然変異ＳＶ４０ラージＴ抗
原遺伝子導入哺乳動物の骨髄由来の骨髄間質細胞株を用
いることを特徴とする、細胞の分化マーカーがＬｉｎ
- 、Ｓｃａ−１+ およびｃ−Ｋｉｔ+ である造血幹細胞
様未分化細胞株を得る方法。 - 【請求項４】 温度感受性突然変異ＳＶ４０ラージＴ抗
原遺伝子導入哺乳動物の骨髄由来の不死化骨髄間質細胞
株を用い、温度感受性突然変異ＳＶ４０ラージＴ抗原遺
伝子導入哺乳動物の骨髄から、細胞の分化マーカーがＬ
ｉｎ- 、Ｓｃａ−１+ およびｃ−Ｋｉｔ+ の不死化造血
幹細胞様未分化細胞株の樹立方法。 - 【請求項５】 請求項１から４のいずれか１項に記載の
温度感受性突然変異ＳＶ４０ラージＴ抗原遺伝子導入哺
乳動物が、温度感受性突然変異ＳＶ４０ラージＴ抗原遺
伝子導入マウスである方法。 - 【請求項６】 温度感受性突然変異ＳＶ４０ラージＴ抗
原遺伝子導入マウスの骨髄由来の骨髄間質細胞株ＴＢＲ
５９との相互作用により選択することを特徴とする、造
血幹細胞様未分化細胞株を得る方法。 - 【請求項７】 請求項１から６のいずれか１項に記載の
方法で得られた造血幹細胞様未分化細胞株または不死化
造血幹細胞様未分化細胞株。 - 【請求項８】 細胞株ＴＨＳ１１９（受託番号：ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−５６１３） - 【請求項９】 請求項７または８に記載の造血幹細胞様
未分化細胞株または不死化造血幹細胞様未分化細胞株を
用いることを特徴とする治療方法。 - 【請求項１０】 請求項７または８に記載の造血幹細胞
様未分化細胞株または不死化造血幹細胞様未分化細胞株
から得られる細胞自己再生因子。 - 【請求項１１】 請求項７または８に記載の造血幹細胞
様未分化細胞株または不死化造血幹細胞様未分化細胞株
から得られる分化誘導因子。 - 【請求項１２】 請求項７または８に記載の造血幹細胞
様未分化細胞株または不死化造血幹細胞様未分化細胞株
から得られる分化抑制因子。 - 【請求項１３】 請求項７または８に記載の造血幹細胞
様未分化細胞株または不死化造血幹細胞様未分化細胞株
の分化に特異的なマーカー抗原で作成される抗体。 - 【請求項１４】 請求項１３に記載の１つ以上の抗体か
らなる造血細胞分化段階の判定用キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9224611A JPH10113171A (ja) | 1996-08-23 | 1997-08-21 | 造血幹細胞様未分化細胞株 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22251196 | 1996-08-23 | ||
| JP8-222511 | 1996-08-23 | ||
| JP9224611A JPH10113171A (ja) | 1996-08-23 | 1997-08-21 | 造血幹細胞様未分化細胞株 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10113171A true JPH10113171A (ja) | 1998-05-06 |
Family
ID=26524922
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9224611A Pending JPH10113171A (ja) | 1996-08-23 | 1997-08-21 | 造血幹細胞様未分化細胞株 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH10113171A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004085632A1 (ja) * | 2003-03-25 | 2004-10-07 | Japan Science And Technology Agency | 幹細胞の分化誘導および分化能の制御 |
-
1997
- 1997-08-21 JP JP9224611A patent/JPH10113171A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004085632A1 (ja) * | 2003-03-25 | 2004-10-07 | Japan Science And Technology Agency | 幹細胞の分化誘導および分化能の制御 |
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|---|---|---|---|
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Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050823 |
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| A02 | Decision of refusal |
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