KR20220083661A - 생물학적 물질의 저장 방법 및 장치 - Google Patents

생물학적 물질의 저장 방법 및 장치 Download PDF

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토마스 퍼맨 알렌
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크라이오스타시스 인코포레이티드
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Abstract

본 방법 및 장치는 생물학적 물질, 가용성 분자, 유기 및 무기 화합물을 포함하지만 이에 국한되지 않는 물질에서 정지 애니메이션을 유도하기 위해, 물 및 수용액의 동결 및 용융 온도를 낮추기 위해 저온 및 승압을 사용한다. 이러한 물질을 압력 용기에 넣고 약 210MPa로 압력을 높이면 물, 생물학적 물질 및 수용액의 물질의 동결 및 용융 온도가 약 -22℃로 낮아진다. 고압 하에서 저온 보관은 대사 활동을 중단시키고 냉각정지를 유도한다. 본 방법 및 장치는 세포, 조직, 이식을 위한 인간 장기 및 전체 유기체를 포함하지만 이에 국한되지 않는 동결 또는 유리화 또는 달리 보존될 수 없는 생물학적 물질을 저온 저장하는 데 사용할 수 있다.

Description

생물학적 물질의 저장 방법 및 장치
관련 출원
본 출원은 2019년 7월 5일에 출원된 미국 출원 번호 16/501,918의 출원일의 이익을 주장하며, 그 내용은 그 전체가 참조로 본원에 포함된다.
본 발명의 분야는 동결에 의해 손상되는 민감한 물질의 장기간 보존 및 저장에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 -22℃만큼 낮은 온도에서 동결을 피하기 위해 증가된 압력을 가함으로써, 동결 온도 아래에서 수용액 및 생물학적 물질과 같은 민감한 물질의 장기간 보존 및 저장에 관한 것이다.
조직 또는 장기(organs)의 보존에서, 최신 기술은 체온 또는 4℃ 이상의 저체온 범위에서 관류 및 저장을 포함한다. 이러한 방법은 며칠에 걸쳐 장기의 보존 및 운송에 효과적이지만, 장기간(long-term) 바이오 뱅킹(즉, 몇 주, 몇 달, 몇 년)에는 적합하지 않다. 이식 가능한 장기에 대한 수요가 증가하고 있으며 매년 수많은 사람들이 장기 이식을 기다리다가 사망한다. 이러한 상황은 운송 중 장기 보존을 개선하여 부분적으로 개선할 수 있지만, 점진적으로 발전할 뿐이다. 이종이식을 위한 장기의 3D 프린팅, 성장 및 유전/면역학적 변형을 위한 재생 기술이 실현된다면, 이식 가능한 장기에 대한 필요성이 새로운 도전 과제를 제시할 것이다. 이러한 공급처의 장기는 이식에 필요할 때까지 보관해야 하는데, 이는 장기 제조시 사용되는 공정은 위급한 환자에는 사용할 수 없는 시간 간격이 관여하기 때문이다. 나아가, 개인은 자신의 장기/조직 세트를 생성하고 미래의 필요를 위해 보존하기를 원할 수도 있다.
주변 온도에서 압력이 분자, 세포 및 유기체에 미치는 영향에 대한 연구에서는 초고압에서도 생존이 가능하다는 결과가 나타났다. 일부 세포와 유기체는 절대 영도에 가까운 온도나 외부 공간에서 생존할 수 있다. 반세기 이상 동안, 연구자들은 장기간 보존 수단으로 장기를 냉동하거나 유리질화(vitrifying)하는 방법을 개발하려고 시도했다. 그러나, 모든 시도는 실패했다. 생물학적 물질 및 기타 수성-기반의 유기 및 무기 물질의 장기간 보존에 대한 필요성이 남아 있다.
본 발명의 한 측면은, 압력을 증가시킴으로써, 동결 온도, 즉 주변 압력에서의 용융하는 온도 이하의 온도에서의 저장/보존 방법에 관한 것으로서, 이는 물, 유기 및 무기 수계 물질/성분/매질, 수성 현탁액 중의 물질, 수용액, 수성 혼합물, 수성 콜로이드, 수계 물질, 생물학적 물질, 생물학, 및 생물학적 기원 물질을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 압력 용기에서 위의 물질 중 일부 또는 전체에 적용되는 압력을 높이면, 동결, 즉 용융 온도(점)가 낮아진다. 상기 물질이 동결 또는 유리화될 수 없는 저장 온도 범위는 -0.001℃에서 -21.985℃로 확장된다. 주위 압력에서 209.9MPa 또는 약 210MPa까지의 압력 범위에 걸친 압력에 의해 상기 물질의 융점, 즉 어는점이 강하한다. 이러한 생물학적 물질은 유기 분자, 분자 복합체, 핵산, 사카라이드, 아미노산, 펩티드, 단백질, 효소, 소기관, 오르가노이드, 세포, 조직, 기관 및 유기체를 포함할 수 있지만 이에 국한되지 않다.
다양한 구현예에서, 본 방법은 고체로의 상 전이를 방지하고 이를 안정한 액체 상태로 또는 준안정한 과냉각 액체 상태로 유지하기 위해 압력 하에 수계 물질을 저장하는 단계를 포함하며, 여기서
1 저장된 물질은 물, 또는 수용액에서 무기 용질을 함유하는 물에 있거나, 또는
2 저장된 물질은 수용액에서 유기 용질을 함유하는 물이거나, 또는
3 저장된 물질은 수용액에서 유기 및 무기 용질을 함유하는 물이거나, 또는
4 저장된 물질은 물과 유기 물질의 혼합물이거나, 또는
5 저장된 물질은 콜로이드(들)를 함유하는 물이거나, 또는
6 저장된 물질은 유기 및/또는 무기 물질 중 하나 또는 둘 모두와의 혼합물의 물이거나, 또는
7 저장된 물질은 생물학적 물질(들)과의 혼합물 중의 물이거나, 또는 저장된 물질은 생물학적 물질(들)이 존재하고/하거나 현탁액인 물이거나, 또는
8 저장된 물질은 생물학적 물질(들)이 존재하고/하거나 현탁액으로 존재하는 유기 및/또는 무기 용질을 함유하는 물이거나, 또는
9 저장된 물질은 생물학적 물질(들)이 존재하고/하거나 현탁액으로 존재하는 유기 및/또는 무기 용질 및 콜로이드(들)을 함유하는 물이거나, 또는
10 저장된 물질은 유기 및/또는 무기 화합물과의 혼합물, 및 생물학적 물질(들)이 존재하고/하거나 현탁액으로 존재하는 유기 및/또는 무기 용질 및 콜로이드(들)를 모두를 함유하는 물이다.
일 구현예에서, 본 발명은 물, 유기 및 무기 수계 물질/성분/매질, 수성 현탁액 중의 물질, 수용액, 수성 혼합물, 수성 콜로이드, 수계 물질, 생물학적 물질, 생물학, 및 생물학적 기원 물질을 포함하나 이에 제한되지 않는, 물질/성분에 가해지는 압력을 증가시키고, 주어진 압력에서 이들의 동결점/융점 이하의 온도로 냉각함으로써, 하기 물질들의 동결점, 즉 주변 압력에서의 용융하는 온도, 이하의 온도로 과냉각 온도(point)를 낮추는 방법을 제공한다. 따라서, 물질/성분들은 과냉각될 수 있으며, -0.001℃ ~ -92℃ 범위에서 준안정 액체 상태로 유지된다. 과냉각은 주변 압력에서 209.9MPa까지의 압력 범위에서 발생한다. 보관 중인 물질은 저장 온도가 물질의 압력-강하된(압력-결정된) 동결점/융점 미만인 경우 과냉각된다. 생물학적 물질은 유기 분자 및 분자 복합체, 핵산, 사카라이드, 아미노산, 펩티드, 단백질, 효소, 생물학, 소기관, 오르가노이드, 세포, 조직, 기관 및 유기체일 수 있지만 이에 국한되지 않다.
일 구현예에서, 본 발명은 저장 배지 및 저장되는 물질에 용질을 첨가하여 물질의 동결 온도를 더 강하하여 물질의 동결점을 낮추는 방법을 제공하되, 결과적으로, 첨가된 용질의 몰당 1.86℃; 또는 이의 분율 또는 승수만큼 동결점을 더 강하시키며, 여기서 동결점은 첨가된 용질의 1몰당 1.86℃만큼 또는 몰 분율당 1.86℃의 분율만큼 강하된다.
일 구현예에서, 본 발명은 용질의 몰 또는 용질의 몰 분율을 수용액, 혼합물, 콜로이드 또는 이들의 조합에 추가함으로써 집합적 특성을 조정함으로써 수성 매질의 동결 온도를 추가로 낮추는 것에 의해, 본원에 기재된 조건 하에서 수성 매질의 동결점을 낮추는 방법을 제공한다.
추가적인 동결점 강하는 부동 단백질, 부동 사카라이드, 얼음 결합 펩티드 및 얼음 억제 또는 얼음 결합을 통해 부가적인 동결점 강하를 제공하는 기타 비-속일성 제제(non-colligative agents)를 포함하지만 이에 국한되지 않는 비-속일성 물질을 첨가하고, 이에 따라 얼음 결정 성장을 방지, 억제, 제어 및/또는 격리함으로써 성취될 수 있다. 배지는 유기 분자 및 분자 복합체, 핵산, 사카라이드, 아미노산, 펩티드, 단백질, 효소, 생물학, 세포 소기관, 오르가노이드, 세포, 조직, 유기체를 포함하지만 이에 국한되지 않는 생물학적 물질을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 다양한 구현예에서, 부동 단백질은 예를 들어, 거저리 딱정벌레(Tenebrio molitor), 남극 물고기(유형 I, 유형 III), 또는 호밀풀(Lolium perenne)로부터 유래할 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 생물학적 물질을 저장하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 생물학적 물질을 압력 용기에 배치하는 단계; 압력 용기를 구동(drive) 액체로 채우는 단계; 압력 용기로부터 공기를 내보내고 압력 용기를 밀봉하는 단계; 압력 발생기를 사용하여 구동 액체에 대한 압력을 증가시키고, 압력 용기 내부의 온도를 0℃ 미만으로 낮추는 단계를 포함하고, 여기서 선택된 온도에서 압력 발생기를 사용하여 선택된 압력이 구동 액체에 가해지고, 이에 의해 압력 용기 내의 구동 액체가 안정적인 액체 상태로 유지되고; 상기 구동 액체에 선택된 압력을 가함으로써 0℃ 미만의 보관 온도에서 상기 생물학적 물질의 동결이 방지된다.
일 구현예에서, 상기 방법은 생물학적 물질을 보존 용액과 함께 샘플 백에 배치하는 단계; 샘플 백으로부터 공기를 배출하는 단계; 및 샘플 백을 밀봉하는 단계를 더 포함하되, 보존 용액 및 구동 액체가 안정한 액체 상태로 유지된다.
일 구현예에서, 상기 방법에서 온도를 감소시키고 압력을 증가시키는 것은 1,000psig/분(6.9MPa)에서 주위 조건으로부터 200psig(1.4MPa) 내지 약 30,000psig(210MPa)의 증분으로 압력을 증가시키는 것, 및 주위 조건으로부터 약 -22℃ 온도로 온도를 감소시키는 것을 포함한다.
일 구현예에서, 생물학적 물질은 유기 분자, 분자 복합체, 핵산, 사카라이드, 아미노산, 펩티드, 단백질, 효소, 소기관, 오르가노이드, 세포, 조직, 기관, 유기체 및 수용액 중 하나 이상을 포함한다.
일 구현예에서, 보존 용액은 물, 및 생물학적 물질, 가용성 분자, 유기 및/또는 무기 화합물, 수성 현탁액 중의 물질, 수용액, 수성 혼합물, 수성 콜로이드, 수계 물질, 및 생물학적 기원 물질 중 하나 이상을 포함한다.
한 구현예에서, 생물학적 물질은 세포, 조직, 기관, 또는 전체 유기체를 포함한다.
일 구현예에서, 저장 온도는 약 -22℃이다.
일 구현예에서, 저장 온도에서 적용되는 압력은 약 30,000psi(210MPa)이다.
일 구현예에서, 저장 온도 및 적용되는 압력은 세포를 준안정 과냉각 액체 상태로 유지함으로써 동결 및 세포 손상을 방지한다.
일 구현예에서 보존 용액은 용질을 포함한다. 용질은 부동 단백질, 얼음 결합 단백질, 부동 사카라이드, 얼음 결합 사카라이드, 얼음 결합 펩티드, 및 기타 비-속일성 제제 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 용질은 얼음 결정 성장을 방지, 억제, 제어 또는 격리하고/하거나 얼음의 핵 생성을 방지할 수 있다.
일 구현예에서, 구동 액체는 프로필렌 글리콜 또는 에틸렌 글리콜, 오일, 석유, 어유, 광유, 식물성 기름, 물, 해수, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다
일 구현예에서, 선택된 저장 온도는 약 -5℃ 내지 약 -22℃이다.
본 발명의 다른 양태는 생물학적 물질을 저장하기 위한 장치에 관한 것으로서, 상기 장치는 구동 액체를 수용하기 위한 저장소; 생물학적 물질을 수용하도록 구성된 내부 웰을 갖는 압력 용기로서, 저장소로부터 구동 액체를 수용하기 위해 저장소에 작동 가능하게 연결되어 있는 압력 용기; 압력 용기 및 저장소에 작동 가능하게 연결되어 구동 액체에 압력을 가하는 압력 발생기; 압력 용기 내의 구동 액체의 압력 표시를 제공하는 압력 변환기; 압력용기의 온도를 감지하는 온도센서; 및 약 0℃ 미만의 제어된 압력 용기 내부 온도를 제공하도록 구성된 냉각 장치를 포함하고, 여기서 약 0℃ 미만의 선택된 압력 용기 온도에서, 압력 발생기는 압력 용기 내의 구동 액체를 안정적인 액체 상태로 유지하기 위해 구동 액체에 선택된 압력을 인가한다.
일 구현예에서, 본 장치는 압력 변환기, 온도 센서, 압력 발생기, 및 냉각 장치 중 하나 이상으로부터 데이터를 획득하는 데이터 획득 시스템(DAQ)을 더 포함한다.
일 구현예에서, 본 장치는 압력 변환기, 온도 센서, 압력 발생기, 및 냉각 장치 중 하나 이상에 작동 가능하게 연결된 제어기를 더 포함하고; 여기서, 제어기는 선택된 내부 압력 용기 온도 및 압력 용기 내의 구동 액체에 대해 선택된 압력 중 적어도 하나를 모니터링하고 유지한다.
일 구현예에서, 압력 발생기는 자동화되고 제어기에 의해 기계적으로, 전기적으로, 공압적으로 또는 유압으로 구동된다.
일 구현예에서, 냉각 장치는 히터를 더 포함한다. 히터는 온도 센서 및 온도 제어기를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 냉각 장치는 비례-적분-미분(PID) 제어를 포함한다.
일 구현예에서, 본 장치는 증발기를 더 포함한다.
일 구현예에서, 본 장치는 닫힐 때 장치로부터 압력 용기의 분리 및 제거를 허용하는 적어도 하나의 밸브를 더 포함하고; 압력 용기는 장치로부터 제거될 때 구동 액체의 인가된 압력을 유지한다.
본 발명의 또 다른 측면은 생물학적 물질의 저장을 위한 압력 용기에 관한 것으로서, 제1 부분을 포함하는 공동, 및 생물학적 물질 및 구동 액체를 수용하는 샘플 웰을 갖는 하우징; 하우징의 외부로 개방된 오버플로우 채널을 포함하는 하우징의 제1 부분; 하우징의 제1 부분과 맞물리도록 구성된 제1 부분을 포함하는 덮개(lid)로서, 하우징 내의 덮개의 위치는 제1 위치에서 닫힘 위치까지의 범위에 걸쳐 조정 가능한 덮개; 하우징의 샘플 웰에 부분적으로 끼워지도록 구성된 제2 부분을 포함하는 덮개; 외부 장비와 결부(interface)되도록 구성된 포트를 포함하는 덮개의 제1 부분; 포트와 샘플 웰 사이의 덮개를 통해 구동 액체를 전도하도록 구성된 구동 액체 채널을 포함하는 덮개를 포함하고, 덮개를 닫힘 위치로 조정하면 포트 및 오버플로우 채널을 통해 샘플 웰로부터 과잉 구동 액체가 배출되고, 덮개의 제2 부분은 샘플 웰을 밀봉하며; 압력 용기는 적어도 약 30,000psi(210MPa)의 샘플 웰로 구동 액체의 내부 압력을 유지하도록 구성된다.
일 구현예에서, 압력은 포트를 통해 외부 장비에 의해 샘플 웰 내 액체를 구동하기 위해 가해진다.
일 구현예에서, 압력 용기는 포트와 외부 장비 사이에 배치된 적어도 하나의 밸브를 더 포함하고; 여기서, 닫힐 때, 적어도 하나의 밸브는 외부 장비로부터 압력 용기를 격리하고 샘플 웰의 내부 압력을 유지한다.
일 구현예에서, 오버플로우 채널은 온도 센서를 수용하도록 구성된다.
본 발명의 다른 측면은 동결 없이 0℃ 미만의 온도에서 생물학적 물질을 저장하기 위한 장치에 관한 것이다. 다양한 구현예에서, 본 장치는 압력 용기(들)를 포함하는 챔버에서 유체를 냉각 및/또는 가열하기 위한 냉각/히팅 시스템을 포함하거나, 압력 용기의 벽(들) 내의 일련의 회로를 통해 흐르거나, 가압 중 또는 가압 후 압력 용기(들) 외부에 부착되어 있다; 감압 동안 또는 감압 후에 압력 용기를 데우면서 유체를 데우고; 냉각기 및 히터는 수동으로, 전기적으로, 전자적으로 또는 컴퓨터에 의해 제어되는 하나의 구성요소로 통합된다; 냉각기는 가열을 위해 역순환을 사용하며 수동, 전기, 전자 또는 컴퓨터에 의해 제어된다; 냉각기 및/또는 히터는 피스톤 압축기, 증발기 및 응축기를 사용한다; 냉각기 및/또는 히터는 왕복 피스톤 압축기, 증발기 및 응축기를 사용하며 수동, 전기, 전자 또는 컴퓨터에 의해 제어된다; 냉각기/히터는 열전(thermoelectric)이며, 수동, 전기, 전자 또는 컴퓨터로 제어된다; 냉각기/히터는 스털링(sterling) 냉각기, 스털링 펄스 튜브 냉각기 및/또는 히터이고, 수동, 전기, 전자 또는 컴퓨터로 제어된다; 냉각기/히터는 음파 또는 초음파 장치이며 수동, 전기, 전자 또는 컴퓨터로 제어된다; 냉각기는 증발 냉각(예: 액체 질소, 드라이 아이스)을 통해 작동하며 수동, 전기, 전자 또는 컴퓨터로 제어된다. 가열 및 냉각은 복사(radiation)에 의해 이루어지며 수동, 전기, 전자 또는 컴퓨터에 의해 제어된다; 가열 및 냉각은 대류에 의해 이루어지며 수동, 전기, 전자 또는 컴퓨터로 제어된다; 가열 및 냉각은 유도에 의해 이루어지며 수동, 전기, 전자 또는 컴퓨터로 제어된다; 저항은 가열에 사용되며 수동, 전기, 전자 또는 컴퓨터를 통해 제어된다; 레이저 또는 메이저(maser)는 가열 및/또는 냉각에 사용되며 수동, 전기, 전자 또는 컴퓨터로 제어된다.
다양한 구현예에서, 본 장치는 그 작동을 개시 및/또는 유지 또는 정지하기 위한 제어(들), 제어 세트, 제어 시스템 또는 시스템들, 또는 제어기를 포함하고; 시스템 내 환경을 전체로서, 및 그 구성요소들을 설정 및/또는 조정한다. 다양한 구현예에서, 압력 용기 내부의 온도는 온도 제어기가 있는 냉각 시스템에 의해 냉각되거나 유지될 수 있고, 압력 용기 내부의 온도는 별도의 제어기를 사용하는 가열 시스템에 의해 가온되거나 유지될 수 있다. 다양한 구현예에서, 냉각을 위한 제어기와 가온을 위한 제어기가 동시에 작동될 수 있거나, 단일 온도 제어기가 냉각 및 가온 동안 온도를 제어하기 위해 사용될 수 있다; 냉각 동안 사용되는 온도 제어기는 온도 변화율을 제어할 수 있다; 가온 동안 사용되는 온도 제어기는 온도 변화율을 제어할 수 있다.
일 구현예에서, 단일 제어기는 냉각 및 가온 및 냉각 및 가온 속도를 제어하는 데 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 별도의 제어기가 가압 동안 가압 속도를 제어하거나 탄도적으로(ballistically) 가압하기 위해 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 제어기는 감압 동안 감압 속도를 제어하거나 탄도적으로 감압하기 위해 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 단일 제어기는 가압 및 감압 및 가압 및 감압의 속도를 제어하는 데 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 단일 제어기는 가온 및 냉각 동안의 온도와 그 속도를 제어하는 데 사용될 수 있다; 이는 또한 가압 및 감압 및 그 속도를 제어할 수 있다. 압력 및 온도에 대한, 또는 개별적으로 제어하기 위한, 전술한 제어 장치 중 일부 또는 전부는 기계, 전기, 전자 또는 컴퓨터일 수 있다. 그러한 제어 장치 중 어떤 것이나 모든 것은 온도와 압력 중 하나 또는 둘 모두에 대한 설정 포인트, 변화율 및/또는 설정 포인트에서의 지속 시간을 제어할 수 있다. 제어기에는 냉각기 및/또는 압력 용기 내부의 현재 온도를 제어기에 제공하는 온도 센서가 있을 수 있다. 제어기(들)에는 압력 용기, 배관 시스템 또는 그 부품 내부의 현재 압력을 제어기에 제공하는 압력 센서, 변환기 및/또는 게이지가 있을 수 있다.
일 구현예에서, 본 장치는 냉각기/히터 내부, 압력 용기 내부, 압력 용기 벽 내부, 또는 압력 용기 표면으로부터 온도를 실시간으로 판독 및/또는 기록함으로써 온도를 모니터링하는 장치를 제공한다. 아날로그 또는 디지털로 온도 판독은 간격을 두고 자동으로 측정되거나 간격을 두고 수동으로 측정될 수 있으며 판독값은 수동, 기계, 전기, 전자 또는 컴퓨터에 의해 기록될 수 있다. 온도 판독값은 온도계, 서미스터(thermistor), 저항 열 장치(RTD), 열전대(thermocouple), 적외선 센서, 적외선 카메라, 고온계(pyrometer), 스프링 온도계, 컬럼 온도계의 액체, 또는 기타 기계적, 화학적, 액정, 전기 또는 전자 센서와 같은 센서에서 제공된다. 상기 나열된 임의의 및/또는 모든 온도 센서로부터의 데이터는 위의 구현예에서 제어기(들) 및 제어(들)에 대한 입력 온도 정보로 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 본 장치는 압력 용기 내부, 및/또는 압력 발생기의 내부 또는 이로부터, 및/또는 배관 시스템의 부품(들) 또는 전체의 내부를 판독 및/또는 기록함으로써 압력을 모니터링하는 장치를 제공한다. 압력 판독값은 압력 변환기, 아날로그 압력 게이지에서 생성되고 아날로그 및/또는 디지털 게이지에 실시간으로 표시된다. 압력 게이지 또는 압력 변환기의 데이터는 기계적으로, 전기적으로, 전자적으로, 또는 컴퓨터를 사용하여 기록될 수 있다. 상기 나열된 임의의 및/또는 모든 압력 센서로부터의 데이터는 상기 구현예에서 제어기(들) 및 제어(들)에 대한 압력 정보로 사용될 수 있다.
본 발명을 더 잘 이해하고 본 발명이 어떻게 실행될 수 있는지 더 명확하게 보여주기 위해, 이제 예를 들어 첨부 도면이 참조될 것이다.
도 1은 물이 안정한 액체 형태에서의 최저 온도 및 상응하는 압력을 포함하여, 물이 안정한 액체 상태로 남아 있는 압력/온도 값을 나타내는 물의 상 다이어그램이다("A"로 지정됨).
도 2는 생물학적 물질의 보존을 위한 장치의 일 구현예를 도시한다.
도 3은 장기 보존 동안 생물학적 물질을 수용하기 위한 압력 용기의 일 구현예의 확대도를 도시한다.
도 4a 내지 도 4e는 일 구현예에 따른 압력 용기의 조립을 도시하는 개략도이다.
도 5a 및 도 5b는 일 구현예에 따른 생물학적 물질을 저장소 내 배치하고 생물학적 물질을 저장소로부터 회수하기 위한 압력 및 온도 곡선을 각각 나타내는 플롯이다.
정의
본원에 사용된 "정지(stasis)" 또는 "냉각정지(cryostasis)"은 정지된 대사 및 분자 활성의 상태를 설명하는 데 사용된다. 냉각정지는 보다 구체적으로 여기에 설명된 영하의 ℃ 온도 및 압력 범위와 관련이 있다.
"정지된 애니메이션"은 위에서 설명한 것과 유사한 비활성 상태와 관련이 있다.
"물질(material)", "성분(substance)", "물질(matter)"은 본 설명에서 상호 교환적으로 사용되는 용어이다. 이들은 장기간에 걸쳐 보존하기 어려운 생물학적 또는 무기 성분을 말한다.
"생물학적 물질"은 분자, 단백질, 세포, 소기관, 오르가노이드, 조직, 기관, 유기체를 포함하지만 이에 국한되지 않는, 탄소-함유, 살아있는 물질 또는 이전에 생존가능한 물질, 또는 이들의 구성성분을 지칭한다.
"수계 물질"은 물에 용해되거나 물에 현탁되거나 물을 포함하는 모든 유기 또는 무기 물질의 총칭이다.
"영하" 온도는 0℃ 미만의 모든 온도에서 저장할 때 사용된다.
"뱅킹" 또는 "바이오 뱅킹"은 생물학적 또는 무기 물질의 장기간 보존 및 저장에 적용된다.
"저장" 및 "보존"은 본 설명 전반에 걸쳐 상호교환적으로 사용되는 용어이며 냉각정지에서 물질의 보존 및 유지를 나타낸다.
본 명세서에서 사용된 용어 "~"는 대략적인 다음 숫자를 지칭하며 명시된 정확한 숫자에 제한되지 않는다.
단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 달리 명시되지 않는 한 복수 지시 대상을 포함한다.
"유체"는 명확하게 명시되지 않는 한 기체, 액체 또는 이들의 조합을 의미한다.
"과냉각(supercooled)" 또는 "과냉각(undercooled)"은 물의 녹는점인 0℃ 및 대기압 아래에서 물의 준안정 상태를 나타낸다.
물의 녹는(동결) 온도의 "속일적" 강하는 용액 내 분자 수로 정의된다. 물 1리터에 용질 1몰이 녹으면 녹는점이 1.86℃ 낮아진다.
얼음 결정 성장을 방지, 억제, 제어 및/또는 격리하는 얼음 억제제 또는 얼음 결합제를 통해 물의 녹는(동결) 온도를 "비-속일적"으로 낮추는 것이 가능하다.
본 발명과 관련된 "장기간"은 특별히 언급되지 않는 한 수일, 수주, 수월 및 수년의 임의의 기간을 의미한다.
"어는점 내림"(FPD; Freezing point depression)은 물의 녹는(동결) 온도를 0℃ 미만으로 낮추는 것을 의미한다. 이는 압력 증가, 과냉각, 및/또는 속일적 또는 비속일적 작용 물질의 추가를 통해 본원에 설명된 대로 달성될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 위스콘신 대학교 용액으로도 알려진 "UW® Solution"이라는 용어는 보존 용액을 의미한다(Southard, J.H. el al., Transplantation Reviews 7(4): 176-190, 1993).
구현예
동결손상 및/또는 동결에 민감한 수성 기반 물질 및 생물학적 물질의 보존은 딜레마였다. 일부 분자(예: DNA), 세포(예: 소 정자) 및 유기체(예: 완보동물, 염수 새우)는 수년간도 성공적으로 냉동 보관할 수 있다. 그러나, 대부분의 생물학적 물질(예: 포유동물의 장기)은 냉동 또는 장기간 저장시 살아남을 수 없다. 그 이유는 여러 가지이며 비교적 잘 알려져 있다. 예를 들어, 액체에서 고체(아이스 Ih)로 상이 변하는 동안 부피가 ~ 9% 증가하면, 막, 세포 및 분자 기계에 물리적 손상이 발생한다. 이 손상은 삼투압 불균형으로 인한 세포 탈수와 해동 과정에서 얼음의 재결정화로 인해 악화된다. 인간 장기와 같이 표면적보다 수치적으로(무차원) 더 큰 부피를 갖는 생물학적 물질에 대해 빠르고 균일한 동결 속도를 달성하는 것은 불가능하지는 않더라도 어렵다. 이 경우, 동결은 외부로부터 빠르게 시작되고, 나중에 내부가 동결되면 팽창하여 외부층을 파열시켜 물리적 손상을 유발한다. 본 명세서에 기술된 구현예들은 이를 방지함으로써 액체와 고체 사이의 상 변화에 따른 고유의 문제를 회피하는 것을 목적으로 한다. 본 명세서에 기술된 바와 같은 장치 및 방법은 상 변화를 방지하기 위해 고안되었으며, 물 및 수성-기반 물질은 증가된 압력에 의해 대기압에서 그 녹는점보다 낮은 온도에서 안정적인 액체 상태로 장기간 간격 이상으로 유지될 수 있다.
본 명세서에 기술된 구현예는 장기 및 기타 생물학적 물질의 장기간 저장 및 보존에 대한 필요성을 다룬다. 이는 또한 유기 분자, 단백질, 세포 소기관, 오르가노이드, 세포, 조직, 기관, 생물학, 의약품의 장기간 보존에 적합하지만 이에 국한되지 않으며, 초기 연구에 따르면 전체 유기체를 정지된 애니메이션 상태로(a state of suspended animation), 가능하게는 성간 여행도 할 수 있을 정도로 저장하는 데 사용할 수 있다. 일부 분자, 세포, 심지어 유기체는 극한의 환경 조건을 견딜 수 있는 것으로 기록되었다.
본 명세서에 기술된 구현예는 물 및/또는 수성 물질의 동결/용융 온도를 낮추기 위해 승압을 사용하여 저온에서 수계 물질을 보존하는 방법을 제공한다. 구현예에 따르면, 보존/저장에 사용되는 저온 범위에서 압력 발생기를 이용하여 수성 물질, 생물학적 물질 등에 압력을 가한다. 이식을 위한 인간 장기의 장기간 저장, 바이오 뱅킹 등에 초기 적용된다. 본 구현예는 본 명세서에 기술된 방법에 따른 생물학적 물질을 저장하기 위한 장치를 제공한다.
본 명세서에 기술된 구현예의 목적은 인간 장기와 같은 생물학적 물질의 장기간 보존 문제에 대한 해결책을 제공하는 것이다. 이 해결책은 동결(상 변화)을 피하고 가장 낮은 도달 온도에서 안정적인 액체 상태로 민감한(즉, 동결 불가능한) 물질을 유지하는 것이다. 이는 보존/저장에 사용되는 저온 범위에서 압력 발생기를 사용하여 수성 물질, 생물학적 물질 등에 압력을 가함으로써 달성된다. 본 명세서에 기술된 구현예는 인가된 상승된 압력을 통해 물, 생물학적 물질, 및 유기 및 무기 모두의 다른 수성 기반 물질의 동결 온도(즉, 용융 온도)를 낮추기 위해 분자/생리학적 "정지(stasis)" 상태를 유도한다. 본 발명과 관련된 "정지"는 이 상태를 유도하는 데 필요한 낮은 온도로 인해, 보다 정확한 용어인 "냉각정지(cryostasis)"로 정의된다. 본원에 설명된 구현예에서는 압력과 온도를 함께 사용하고, 냉각정지에서 장기간 보존(예를 들어, 몇 개월, 몇 년)을 촉진하며, 바이오 뱅킹 수단을 제공한다. 관련된 압력은 또한 수성 기반 물질의 장기간 보존에 사용될 수 있는 준안정, 과냉각 상태를 유도할 수 있다. 본 명세서에 기술된 구현예에서는 물의 물리화학적 특성, 및 이의 압력 및 온도와의 상호작용을 이용하여 수계 물질을 안정한 액체 상태로 유지한다. 일 구현예는 물이 동결 가능성이 없는 안정한 액체 상태인 최저 온도 및 상응 압력에서의 보존을 제공한다(도 1 참조). 동결/용융 온도 저하가 성취되는 압력에서, 분자 운동 및 대사가 억제되고, 냉각정지가 발생한다.
본 발명은 적어도 부분적으로 다음과 같은 가설에 기초한다: 생물학적 및 기타 수성 기반 물질은 동결 및 해동 없이(즉, 상전이 없이) 더 차갑게 저장될수록 사용가능한(기능적) 상태로 더 오래 유지된다(즉, 저장 온도가 낮을수록 생존 가능한 보관 기간이 길어진다). 따라서, 다음과 같은 질문이 제기된다. 냉각정지를 유도하기 위해 동결 없이 생물체의 온도를 충분히 낮출 수 있는가? 예를 들어, 포유동물의 세포, 조직, 기관 및 유기체는 약 300밀리몰의 용질이 용해된 수성 기반체이다. 속일적 특성에 기초하여, 이러한 300밀리몰의 용질은 포유동물 조직 내에서 용액의 0.55℃ 동결점 저하를 초래한다. -0.55℃의 저장 온도는 이식을 위한 장기의 사용 수명을 충분히 연장하기에는 충분히 낮지 않다(즉, 며칠이 아니라 몇 시간 정도). 세포, 조직, 기관 및 유기체를 몇 달 또는 몇 년 동안 보존할 수 있을 만큼 충분히 낮은 온도에서 저장하기 위해서는, 대체 방법이 필요하다. 이 방법론의 핵심은 온도와 압력의 관계에 있다.
본 구현예는 물 및 수용액의 동결점/융점을 낮추기 위해 상승된 압력(즉, 주변 대기압보다 높은 압력)을 사용한다. 순수한 물, 따라서 모든 수성 기반 및 생물학적 물질의 동결점은 ~9.5MPa당 ~1℃까지 낮아질 수 있다(Daucik, K. et al, The International Association for the Properties of Water and Steam, IAPWS R14 -08, 2011). 예를 들어, -210MPa의 압력은 물과 수용액의 어는점을 -22℃까지 낮춘다. 이러한 환경 조건에서, 분자 운동은 대사 기능이 억제될 정도로 감소하여 정지된 애니메이션 상태를 초래하며, 이를 본 명세서에서 "냉각정지(cryostasis)"라고 한다. 본 명세서에 기술된 바와 같이, 고압/저온 조건에서 수일에서 수주 내지 수개월 동안 보관된 세포, 조직, 기관 및 유기체는 악화, 세포자멸사 또는 괴사의 징후를 나타내지 않고 그 기능을 유지한다(표 1 참조). 최대 저장 간격의 한계는 생물학적 물질 및 기타 수성 기반 물질에 대한 이러한 기술된 환경 조건에서 아직 결정될 것이며, 가시적인 시간적 한계가 없을 수 있다.
광범위하게 말하면, 본 명세서에 기술된 구현예는 주위 압력보다 높은 압력을 가함으로써, 0℃ 미만에서 얼지 않은 생물학적 및 수성 기반 물질을 저장하는 것을 제공한다. ~210MPa의 압력과 ~-22℃ 이상의 온도에서 저장된 생물학적 및 수성 기반 물질은 압력이 증가함에 따라 물의 녹는점/어는점이 감소하기 때문에 안정적인 액체 상태를 유지한다. 도 1은 압력과 온도의 관계를 나타내는 물의 상 다이어그램, 및 물이 안정된 액체 상태로 유지되는 압력/온도 값에서 묘사된 융해곡선(고체-액체 경계)을 나타낸다. 일부 구현예는 물이 안정한 액체 형태로 존재하는 최저 온도 및 해당 압력에 초점을 맞춘다. 이 최저 온도와 해당 압력보다 낮은 온도에서, 물은 과냉각(하냉각)되거나 Ice III 또는 Ice Ih를 형성한다(도 1, "A" 참조). 마찬가지로, 안정적인 액체 물에 대한 최저 온도에 해당하는 압력 이상의 압력에서 물은 준안정성이고 Ice III 또는 Ice Ih를 형성할 수 있다. 압력 및 온도와 관련된 이러한 임계점 매개변수는 물, 생물학적 물질 및 수성 물질이 동결 가능성(상 변화) 없이 액체 상태로 남아 있을 수 있는 가장 차가운 조건을 정의한다. 본 구현예에 따르면, 생물학적 및 수성 물질에 가해지는 압력은, 액체 물의 상 변화 및 아이스 형성을 피하기 위해, 감소된 온도에 상응하여 증가된다. 본 명세서에 기술된 바와 같이, 세포, 조직, 소기관, 오르가노이드, 분자, 기관 및/또는 유기체와 같은 생물학적 물질을 상승된 압력(대기보다 높은) 및 대기압(지구 표면)에서 물의 빙점(즉, 용융 온도) 미만의 온도의 환경 조건에서 보존하는 것은 효소적 활성 및 전반적인 대사 활성을 억제한다. 온도가 감소하고 압력이 증가함에 따라, 이러한 억제는 거의 대사 활동이 없는 정지된 애니메이션 상태인 냉각정지 상태로 전환시킨다.
따라서, 본 발명의 한 측면은 정지된 애니메이션, 즉 냉각정지 상태에서 생물학적 및 기타 수성 기반 물질을 저장하는 것에 관한 것이다. 냉각정지 동안 대사(호기성 및 혐기성), 세포자멸사 및/또는 괴사의 정지는 유기 및 무기 수성 기반 물질의 장기 보존(즉, 뱅킹)을 제공한다. 저장 온도가 낮을수록 압력이 높을수록 정지 상태의 깊이는 커진다.
따라서, 본 구현예는 감압이 초기에 적용되고 온도가 감소되며 온도가 더 감소함에 따라 적용되는 압력의 추가 감소가 없는 방법을 사용하여 생물학적 물질의 보존 또는 저장을 달성한다고 알려진 종래의 접근 방식과 다르다. 이러한 종래의 접근법은 온도를 추가로 낮출 때 발생하는 관찰되는 압력 증가에 의존한다. 이러한 종래의 접근법에서 관찰된 압력 증가는 얼음 형성(상 변화)을 방지하여 생물학적 물질을 손상 없이 보관할 수 있다고 주장된다. 그러나, 본원에서는, 관찰된 압력 증가는 얼음이 형성되는 물의 상 변화를 통해서만 나타날 수 있고, 생물학적 물질에 해로운 영향을 미칠 수 있다고 제안된다. 대조적으로, 위에서 논의된 바와 같이, 여기에 설명된 구현예는 온도가 감소함에 따라 가해지는 압력을 계속 증가시킴으로써 얼음의 형성 및 상 변화를 피한다.
또한, 본 구현예는 저장 구획에서 고압을 생성하기 위해 액체에서 얼음으로의 물의 상 변화에 부분적으로 또는 전적으로 의존하는 이전의 접근 방식과 다르다. 이러한 종래의 접근 방식은 저장 구획 내부의 압력이 제어되는 것을 허용하지 않으며 저장 구획 내부에서 손상을 주는 얼음을 생성한다. 대조적으로, 본원에 설명된 구현예는 압력 용기를 가압하기 위해 압력 발생기 및 구동 액체를 사용하여, 압력 용기 내부의 압력을 정밀하게 제어할 수 있게 하고, 구동 액체에 충분한 압력을 가함으로써 구동 액체(물일 수 있음)의 동결을 방지한다. 물을 구동 액체로 사용하는 구현예가 물에 서식하는 유기체(예: 담수, 염수 등)와 같은 생물학적 물질을 그 자연 매질에 저장하는 데 편리하게 사용될 수 있다.
동결되지 않은 상태의 수계 물질의 보존은 동결(용융)점을 ~ -22℃로 낮추기 위해 위에서 설명한 압력 사용을 넘어 확장될 수 있다. 추가의 동결점 강하(FPD)를 달성하는 세 가지 방법이 있다.
1) 과냉각(supercooling): 수계 물질은 준안정 액체 상태가 적어도 -92℃로 유지될 수 있는 압력 하에서 과냉각될 수 있다.
2) 속일적 동결점 강하: 물에 용해성 물질 추가하면 ~210MPa에서 ~ -22℃ 이하로 용액의 빙점을 더욱 낮출 수 있다. 추가 FDP는 속일적으로 작용하는 용질 몰당 1.86℃와 같다.
3) 비-속일적 동결점 강하: 비-속일적 제제는 얼음 억제제 또는 얼음 결합제에 의한 추가적인 동결점 강하를 제공하고, 따라서 얼음 결정 성장을 방지, 억제, 제어 및/또는 격리한다.
위에서 설명한 세 가지 방법을 개별적으로 또는 함께 사용하여 동결되지 않은 물질의 저장 온도를 ~ 210MPa 하에서 ~ -22℃ 미만으로 낮출 수 있다. 다양한 구현예에서, 저장 온도는 약 0℃ 내지 약 -22℃, 약 -5℃ 내지 약 -22℃, 약 -10℃ 내지 약 -22℃, 또는 약 -15℃ ~ 약 -22℃일 수 있다. 이러한 기술을 사용하면 냉각정지가 필요한 물질의 보존 기간이 연장된다.
~ 210MPa 또는 그 부근의 압력 및 ~ -22℃ 또는 그 부근의 온도에서 저장하기 위한 환경 조건은 압력 용기, 및 압력 용기를 가압 및 감압하기 위한 압력을 생성할 수 있는 장치가 필요하다. 이러한 압력을 완벽하게 수용할 수 있는 용기는 강철, 스테인리스강, 티타늄 또는 기타 적절한 재료로 만들 수 있다. 용기는 저장된 물질을 적재 및 제거하는 방법과 압력 발생기를 용기에 연결하는 방법이 필요하다. 압력 발생기(유압식, 공압식, 단, 이들 중 하나에 국한되지 않음)는 수동으로 작동할 수 있으며, 선택적으로 타이머나 제어기를 사용하여 가압 및 감압 속도를 제어할 수 있다. 대안적으로, 압력 발생기는 기계, 공압 또는 유압 또는 기타 수단에 의해 자동화 및 가동될 수 있으며 전기, 전자, 컴퓨터 또는 기계 아날로그 또는 기타 제어기에 의해 제어된다. 일 구현예는 유압 발생기를 포함한다.
유압 발생기는 구동 액체를 전도하는 파이프, 밸브, 접합부, 피팅, 압력 게이지(들) 등의 시스템을 통해 압력 용기에 연결될 수 있다. 그러한 구현예에서, 구동 액체 저장소는 구동 액체를 유지하기 위해 사용될 수 있다. 구동 액체의 예는 프로필렌 글리콜(PEG), 에틸렌 글리콜(EG), 오일, 석유, 어유, 광유, 식물성 오일, 물, 해수, 및 이들의 임의의 조합을 포함하지만 이에 제한되지는 않다.
온도를 낮추거나 높이기 위해, 압력 용기는 열 전달 매체를 포함하는, 제어된 냉각 및 가열 장치, 시스템 등에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 열 전달 매체는 유체 또는 고체일 수 있다. 예를 들어, 유체를 열 전달 수단으로 사용하는 냉각/가열 시스템의 경우, 냉각기/히터 중 어느 하나와 함께 공급되는 매질을 포함하는 컨테이너가 필요하다. 히터는 자체 온도 센서 및 온도 제어기를 사용하여 냉각기와 분리되거나 통합될 수 있다.
온도 제어기는 열 전달 매체에 담그거나 압력 용기에 삽입된 온도 센서에 의해 제공되는 온도 데이터를 기반으로 냉각기/히터를 제어하는 데 사용될 수 있다. 온도 제어기는 컴퓨터 소프트웨어, 독립 실행형 제어기, 마이크로프로세서 또는 기타 유형의 제어기가 될 수 있다. 센서는 열전대, 서미스터, RTD(Resistance Thermal Device) 또는 기타 적절한 장치가 될 수 있다.
유체를 열 전달 매질로 사용하는 냉각/가열 시스템에는 전달 매질의 일정한 혼합을 제공하기 위해 혼합 장치 또는 일부 다른 장치가 필요하다. 혼합은 효율적이고 더 잘 제어된 열 전달 방법을 위해 중요하며, 유체 인클로저 전체에 균일한 온도를 가능하게 하고 열약층을 방지한다. 압력계 또는 기타 측정/모니터링 장치는 압력을 모니터링하는 데 사용된다. 이는 디스플레이에 연결된 아날로그 또는 디지털 게이지 또는 압력 변환기이거나 압력, 제어기 등을 표시하고 기록하는 컴퓨터에 연결된 데이터 수집 시스템(DAQ; data acquisition system)일 수 있지만 이에 국한되지 않는다. 압력 용기의 및 인클로저 내 유체(예: 공기)의 내부 또는 그 부근에서의 온도는 온도 센서(열전대, 온도계, 서미스터, RTD 또는 기타 적절한 장치)로 모니터링되며, 데이터 문자열이 DAQ 및 컴퓨터 시스템 또는 기타 시스템을 사용하여 표시 및/또는 기록될 수 있다. 온도계 또는 기타 온도 센서는 온도를 모니터링하기 위해 인클로저 내 유체에 담그거나 부분적으로 담글 수 있다. 압력 용기는 냉각 및 가온 중에, 및 평형 기간 동안 유체 내에 유지된다.
시스템의 냉각/가열 및 압력은 온도 및 압력 센서를 사용하는 단일 제어기에 의해 통합되고 제어될 수 있다. 대안적으로, 온도 시스템은 하나 이상의 온도 센서를 사용하는 단일 제어기에 의해 냉각/가온 중에 제어될 수 있고, 반면 압력 발생기는 자체 제어기와 센서를 사용하여 별도로 작동할 수 있다. 냉각기/히터 및 압력 발생기는 각각 자체 센서와 제어기를 사용할 수 있다. 일 구현예에서는 히터, 냉각기, 압력 발생기의 세 가지 구성요소를 모두 단일 제어, 모니터링 및 기록 장치로 통합한다. 전체 고압/저온 시스템 제어 및 모니터링 장치는 다양한 장비 및 방법론을 사용하는 다양한 제어 기술을 사용하여 자동화될 수 있다.
일 구현예(도 2 참조)에서, 유체(예를 들어, 공기)가 열 전달 매체로서 사용된다. 이 장치는 고장 없이 적어도 276MPa까지의 압력을 수용할 수 있는 압력 용기(13)(도 3); 철, 스테인리스스틸, 티타늄 또는 기타 적절한 재료로 만들어지며 제거 가능한 상단(21) 및 압력 발생기(2)를 압력 용기(13)에 연결하기 위한 포트(27)가 있다. 유체 구동식 압력 발생기(2)는 수동으로 작동될 수 있으며, 선택적으로 별도의 타이머를 사용하여 가압 및 감압 속도를 제어할 수 있다. 대안적으로, 압력 발생기는 기계식, 공압식 또는 유압식 등으로 작동될 수 있고, 전기, 전자, 컴퓨터 또는 기계적 아날로그 제어기에 의해 제어될 수 있다. 예를 들어, 압력 발생기는 기계적으로 구동되고 컴퓨터로 제어될 수 있다.
압력 발생기는 파이프, 밸브, 접합부, 피팅, 압력 게이지 및 유압 유체 저장소의 시스템에 의해 압력 용기에 연결될 수 있다(도 2 및 3 참조). 압력 용기(13)의 온도를 감소 또는 증가시키기 위해, 제어된 냉각 및 가열 시스템이 사용될 수 있다. 유체(예: 공기)를 열전달 매질로 사용하는 냉각/가열 시스템의 경우 냉/열 싱크(sink)를 수용하기 위해 단열 컨테이너(10)가 필요하다. 압축기와 열 제거 장치는 냉각/가온 장치 외부의 동일한 컨테이너에 보관하거나 별도의 인클로저에 넣고 절연 파이프를 통해 냉각 장치에 연결할 수 있다.
기계식 냉동 시스템의 일 구현예는, 선택적으로 시동 중 전력 서지가 없는 원통형 왕복 압축기를 사용하고 PID(비례-적분-미분; Proportional-Integral-Derivative) 제어를 활용한다. 히터는 자체 온도 센서 및 온도 제어기가 있는 증발기와 분리되거나 증발기와 통합되어, 동일한 제어를 공유할 수 있다. PID를 활용한 온도 제어기는 열전달 매체(유체)에 담그거나 압력 용기에 삽입된 온도 센서에서 제공하는 온도 데이터를 기반으로 냉각기/히터를 제어한다. 일 구현예는 온도 안정성을 위해 PID 제어를 사용하고 정확성과 정밀도를 위해 RTD(저항 열 장치; Resistance Thermal Device) 센서를 사용한다.
일 구현예에서, 열 전달 매체로서 유체를 사용하는 냉각 시스템은 압력 용기의 저장 영역의 선형 부피만큼 키가 큰 증발기, 및 저장 구획의 내부 전체에 균일한 온도를 제공하기 위한 혼합기를 갖는다. 일 구현예에서, 접근은 제거 가능한 절연 상부(8)에 의해 위에서부터 이루어지며, 따라서 콜드 웰을 생성한다. 압력 용기는 냉각 및 가열, 가압 및 감압 중에 저장 구획 내에 있다.
압력 게이지와 압력 변환기를 사용하여 압력을 모니터링할 수 있다. 일 구현예에서, 압력 변환기는 압력을 표시하고 기록하는 컴퓨터에 연결된 데이터 수집 시스템(DAQ)에 연결되었다. 서미스터(12)를 콜드 웰에 담그고 두 번째 서미스터(14)를 압력 용기(13)에 삽입하였다. 이 온도 센서의 데이터는 컴퓨터(위와 같이 DAQ를 통해)로 전송되어, 표시 및 기록된다.
조직 샘플 또는 장기는 부검, 관류, 백에 포장, 및 밀봉 직후에 얻을 수 있다(실시예 2 참조). 관류 및 저장 용액의 예로는 UW® Solution(Bridge to Life), CoStorSol®, Celsior®, Custodiol® HTK, Perfadex®, MACS® Tissue Storage Solution(Miltenyi Biotec), FW(Frodin-Wolgast), Sack', WMo-II 및 Lifeport Liver transporter solution이 있다. 체온은 미리 영하의 온도로 냉각된 용액으로 백에 담긴 샘플을 담가서 제거할 수 있다. 그 다음, 조직 및/또는 장기를 구동 액체가 채워진 미리 냉각된 압력 용기에 삽입하고, 압력 용기를 닫고, 공기를 제거하고, 압력 발생기를 사용하여 내용물을 가압하고 냉각할 수 있다(실시예 3 및 도 5 참조). 미리 정해진 기간 또는 필요할 때까지 냉각정지 상태로 유지될 수 있다. 압력 용기를 가온한 후 감압하여 회수할 수 있다(실시예 4 및 도 6 참조). 저장될 다양한 유형 및 크기의 물질(예: 용액, 세포, 기관, 유기체 등)은 초기 저장 및 이후 회수 동안, 상이한 저장 온도 및 압력뿐만 아니라 상이한 압력 및 온도 변화 속도를 요구할 수 있음을 이해해야 한다. 표 2 및 3은 상이한 저장 온도 및 압력뿐만 아니라 초기 저장 및 이후 회수 모두 동안의 압력 및 온도 변화 속도의 비제한적인 예를 제공한다. 예를 들어, 도 5A 및 5B는 각각 생물학적 물질(돼지 신피질 및 수질)을 저장고에 넣고 생물학적 물질을 저장에서 회수하기 위한 압력 및 온도 곡선을 보여주는 플롯이다. 도 5b에서, "온도 P"는 냉각 장치 내부인, 압력 용기가 위치된 냉각 저장 구획의 온도를 나타내고, "온도 V"는 압력 용기의 온도를 나타낸다.
방법론의 효율성을 검증하고 생물학적 물질에 해롭지 않은 냉각 및 가온, 가압 및 감압 속도를 결정하기 위해 실험실 프로토타입이 사용되었다. 벤치탑 장치는 절연된 인클로저의 수직 벽의 냉각을 제어하기 위해 PID 제어 냉각 시스템을 사용한다. 인클로저는 상단이 열려 있고 작동 중에는 상단이 단열재로 덮여 있다. 냉각 시스템과 제어기는 모두 동일한 인클로저에 있다. 표 1은 사용된 저장 간격과 저장-후 상태를 포함하여 저장된 일부 물질들을 나열한다.
실험실 벤치탑 프로토타입 장치는 행성 간 또는 성간 우주 여행을 위해 인간과 같은 전체 유기체를 수용할 수 있도록 쉽게 확장할 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니지만, 신장, 심장, 심장-폐 또는 폐, 간, 췌장 또는 기타 인간 또는 포유동물의 장기를 개별적으로 또는 다양한 조합으로 포함할 수 있을 만큼 충분히 큰 압력 용기의 무게로 인해 유기체의 저장을 위해 일부 추가 장비가 필요할 수 있다. 오버헤드 윈치, 크레인 및/또는 지게차 또는 기타 중량-취급 수단이 ~ 22℃의 낮은 온도를 유지할 수 있는 용기 및 대형, 높은 안정성, 워크인 또는 드라이브인 냉각기를 이동하는 데 필요할 수 있다.
하기 작동 실시예는 본 발명을 추가로 예시하며 어떠한 면에서도 본 발명의 제한을 의도하는 것은 아니다.
작동 실시예
물질: UW® 용액에 포장 및 밀봉된 신장 피질 섹션(실시예 1 참조), 276MPa의 덮개가 있는 압력 용기(내경 1", 내부 웰 깊이 6", 외부 15")로, 압력 발생기 수동식 휠(High Pressure Equipment Co.에서 구입 가능 ("Hip") Erie, PA, USA) - 210MPa의 유압을 생산할 수 있음, 고압 배관 시스템(HIP에서 구매 가능), 밸브(HIP에서 구매 가능), 게이지(HIP에서 구매 가능), 압력 변환기(Omega Engineering에서 구매 가능, Eustache QC, Canada), 구동 액체 저장소, 프로필렌 글리콜 및 물(1:1) 용액 - 이는 본원에서 구동 액체로 지칭됨, 온도-램핑 초고안정성 Ultrahigh Stability Low Temperature Refrigerated POD 110VAC (본원에서 "Work POD"로 지칭)(냉각기는 미국 플로리다 주피터에 있는 Engel Coolers에서 구매할 수 있음), Work POD는 Auber Proportional-Integral-Derivative (PID) control로 변형되었다(Omega Engineering RTD, Eustache QC, Canada에서 구매 가능), 및 저항 열 장치(RTD) 센서, 데이터 수집 및 기록 모듈(DAQ)이 있는 서미스터 온도 센서(Vernier Inc., Beaverton, OR, USA에서 구매가능), Work POD를 덮을 수 있는 크기의 2인치 폐쇄 셀 폼 단열 시트, 컴퓨터, 아날로그 타이머(GraLab Corporation, Centerville, OH, USA에서 구매 가능), 30cm Halstead Forceps, 덮개 닫힘 막대, 5/8인치 개방말단형 렌치, PID 제어 기능이 있는 등온 Ultrahigh Stability Low Temperature Refrigerated POD 110VAC(이하 "Storage POD"): -25℃까지 작동 가능, 압력 용기용 크래들 포함.
Work POD의 온도 램핑 프로그래밍은 SYL-2352P Ramp 및 Soak PID 온도 제어기, 버전 1.4(2017년 2월)라는 제목의 미국 조지아주 알파레타의 Auber Instruments 지침 매뉴얼을 사용하여 수행되었다. 돼지 신장, 300mM 식염수(NaCl + H2O), 플라스틱 백 0.002인치(Mil) 두께의 벽 X 1L 부피, H2O 6L 중 NaCl 3M, 덮개가 있는 플라스틱 용기 각각 3.5L, Ultrahigh Stability Refrigerated 12VDC POD: -5℃로 설정됨, Ultrahigh Stability Refrigerated POD 110VAC POD: -2℃로 설정됨, UW® 용액, 주사기 60mL - 20게이지 생검 바늘 장착, 집게(4개), 란셋, 메스(Scalpel), 토메 블레이드, 저울(0,1 그램), 디지털 온도계(해상도 0.1℃), 6X6 cm 2Mil 저밀도 폴리에틸렌 플라스틱 백(International Plastics, Greenville, SC, USA에서 구입 가능), 열 밀봉기.
실시예 1 - 생물학적 물질의 보존을 위한 장치
도 2를 참조하면, 압력 파이프를 통해 함께 작동 가능하게 연결된 여러 구성요소를 포함하는 압력-온도 장치의 일 실시예가 도시되어 있다. 도 2에서, 좌측에서 시작하여, 구동 액체를 저장하는 구동 액체 저장소(4)는 구동 액체가 배관 내로 흐를 수 있게 하는 개방 위치 또는 구동 액체가 흐르는 것이 방지되는 닫힘 위치에 있을 수 있는 구동 액체 차단 밸브(3)에 연결된다. 라인의 이 지점에는 액추에이터(이 경우 수동 휠(1))를 포함하는 압력 발생기(2)로부터 연결되는 파이프가 연결되는 T-접합부가 있다. 압력 발생기(2)는 작동 가능하게 연결되고, 수동 휠(1)을 적절한 방향으로 회전시킴으로써 파이프로부터 압력을 추가하거나 제거할 수 있다. 다른 실시예에서, 액츄에이터는 모터, 서보, 또는 제어 신호를 수신할 수 있고(예를 들어, 마이크로프로세서, 컴퓨터 등과 같은 제어기로부터) 압력 발생기에 의해 제공되는 압력을 제어 신호에 따라 조정하여 압력을 부분적으로 또는 완전히 자동화할 수 있는 다른 장치를 포함할 수 있다. 이 T-접합을 따라, 라인이 계속되고 압력 판독값을 표시하는 압력 게이지(5)(예: 디지털 또는 아날로그일 수 있음)가 있다. 부분적으로 또는 완전히 자동화된 압력 제어를 구현한 실시예에서는, 압력 게이지에는 제어기에 압력 신호를 제공하는 압력 변환기가 포함되어 있다. 그 다음 구성요소는 라인의 압력-유도 업스트림 부분이 이 지점에서 다운스트림 부분으로부터 차단되도록 하는 압력 발생기 차단 밸브(7)이다. 일부 실시예는 이 라인의 압력을 감지하고 압력을 제어기, 마이크로프로세서, 컴퓨터 등으로 전송할 수 있는 압력 신호로 변환하는 압력 변환기(6)를 포함한다. 그 다음, 라인은 단열 덮개(8)가 있는 냉각 구획(10)으로 들어간다. 냉각 구획(10)은 선택적으로 제어기에 작동 가능하게 연결되어 구획 내의 온도의 완전히 또는 부분적으로 자동화된 제어를 제공할 수 있다. 그 다음 라인은 압력 용기 차단 밸브(9)로 이어져, 압력 용기(13)가 파이프 라인으로부터 닫히도록 한다. 그 다음, 라인은 보존할 재료와 구동 액체를 수용하는 압력 용기(13)에 연결된다. 냉각 구획(10)의 다른 구성요소는 예를 들어, 디지털-아날로그 변환기(DAC)를 포함하는 인터페이스를 선택적으로 갖는 냉각기/히터(11)를 포함하여 히터/쿨러(11)의 작동이 제어기, 냉각 제어용 온도 센서(12), 압력 용기 내부 모니터링용 온도 센서(14), 순환 팬 또는 교반기(15)를 사용하여 부분적으로 또는 완전히 자동화될 수 있다. 냉각 제어용 온도 센서(12) 및 압력 용기 내부 모니터링용 온도 센서(14)는 예를 들어 서미스터로 구현될 수 있으며 대응하는 온도 신호를 생성한다. 온도 신호는 온도를 모니터링 및/또는 기록하기 위해, 그리고 선택적으로 본 장치를 부분적으로 또는 완전히 자동화하는 데 사용하기 위해, 제어기, 마이크로프로세서, 컴퓨터 등에 보내질 수 있다.
따라서, 일 실시예는 온도 센서, 냉각 구획, 압력 변환기(또는 압력 게이지), 압력 발생기의 액츄에이터, 및 히터/쿨러 중 하나 이상에 작동 가능하게 연결된 제어기를 포함하여, 본 장치의 작동이 부분적으로 또는 완전히 자동화될 수 있다. 예를 들어, 제어기는 본 시스템 장치의 냉각/가열 및 압력을 제어할 수 있다. 대안적으로, 온도 시스템은 하나 이상의 온도 센서를 사용하는 단일 제어기에 의해 냉각/가온 중에 제어될 수 있는 반면, 압력 발생기는 자체 제어기와 센서를 사용하여 별도로 작동한다. 일 실시예에 따르면, 가열, 냉각 및 압력 발생기를 압력 및 온도를 모니터링, 기록 및 조절하는 단일 제어기와 통합한다.
도 3을 참조하면, 압력 용기(13)의 일 구현예의 확대도가 도시되어 있으며, 이는 압력 용기 상부(21), 유지 링(22), O-링 밀봉부(23), 압력 용기 본체(24), 오버플로우 채널 및 서미스터 웰(25)을 포함한다.
도 4a 내지 도 4e는 압력 용기(13)의 조립, 및 오버플로우 채널 및 서미스터 웰(25)에서의 구동 액체의 오버플로우를 포함하는 용기 상부(21)를 연속적으로 도시한다. 완전히 조립되면(도. 4e), 오버플로우 채널 및 서미스터 웰(25)은 압력 용기(13) 내부의 샘플 웰(26)로부터 밀봉되고, 하우징의 온도를 측정하기 위해 서미스터(14)를 수용한다. 서미스터(14)는 생물학적 물질 및 구동 액체를 수용하는 샘플 웰 근처에 위치한 오버플로우 채널 및 서미스터 웰(25) 내에 배치된다. 샘플 웰에 더 가깝게 배치하려면 압력 용기의 가압 공동 근처 또는 내부에 구멍이 필요하다. 이러한 구멍은 가압 시 압력 용기의 고장을 유발할 수 있다. 샘플 웰에서 서미스터를 분리하는 거리는 스테인리스강의 열전도율이 좋지 않아 생물학적 물질의 실제 온도가 서미스터로 측정한 온도보다 뒤쳐질 수 있지만 냉각 속도가 낮기 때문에 이 지연은 허용되는 것으로 입증되었다.
도 5a 및 5b는 생물학적 물질(이 경우, 돼지의 신피질 및 수질)을 저장소에 넣고 생물학적 물질을 저장소로부터 회수하기 위한 예시적인 압력 및 온도 곡선을 각각 나타내는 플롯이다. 도 5b에서, "온도 P"는 압력 용기가 배치된 냉각 구획 내부의 온도를 의미하고, "온도 V"는 오버플로우 채널에 배치된 서미스터와 압력 용기의 서미스터 웰에 의해 구한 압력 용기의 온도를 의미한다. 물론, 저장할 물질(예: 용액, 세포, 기관, 유기체 등)의 유형과 크기가 다르면 초기 저장과 나중에 회수하는 동안 압력과 온도 변화의 속도가 다를 뿐만 아니라 저장 온도 및 압력도 다 다를 수 있다.
실시예 2 - 보존용 돼지 신장 피질 생검 섹션의 제조
돼지 신장 획득 및 제조
돼지 신장은 가능한 한 사후 즉시 캐나다 식품 검사청(CFIA) 승인 도살장에서 입수했다. 검사된 신장은 CFIA 검사관에 의해 절개되었다. 수령 시, 신장을 분리하고, 300mM 식염수로 헹구고, UW® 용액으로 관류하고, UW® 용액으로 헹구고, 1L 플라스틱 백에 넣고 밀봉했다. 신장 백과 UW® 용액을 -5℃의 3M 식염수에 담궜다(플런지 용액). 플런지 용액은 12VDC POD에 위치한 3.5L 플라스틱 통에 보관되었다. 각 통은 최대 3개의 150g 신장을 -1℃(냉매의 부피 및 온도에 대한 열 질량 한계)로 냉각했다. 통 덮개를 플라스틱 백의 끝 부분에 끼우고 제자리에 고정했다. 신장은 -5℃ 플런지 용액에 45분에서 1시간 동안 유지되었다. 하나의 6x6 cm 2 Mil 플라스틱 백에 표본(신장) 번호를 표시하였다. 60cc 주사기에 20 게이지 생검 바늘을 장착하고 -1℃에서 50mL의 UW® 용액을 채우고 필요할 때까지 인큐베이터에 보관했다.
신장의 일부를 취하기
플런지 용액에서 신장을 제거하고 생검 섹션을 개별적으로 준비했다. 백에 든 신장을 플런지 용액에서 꺼내고 백에서 신장을 꺼냈다. 디지털 온도계의 프로브를 사용하여 신장의 내부 온도를 측정하고 값을 기록했다. 남아있는 지방이나 막을 제거하고 신장의 무게를 측정하고 기록했다. 메스 또는 톰 블레이드를 사용하여 세로로 절개하고 피질의 일부를 제거했다. 피질 부분의 길이는 2-3cm, 너비는 1-1.5츠였다. 피질 부분은 수질을 포함하지 않아야 하며 절개된 면이 하나만 있어야 한다.
보존을 위해 제거된 피질 생검 섹션
-1℃에서 7~10mL의 UW® 용액을 6x6cm 2 Mil 플라스틱 백에 주입했다. 절개면이 UW® 용액의 경계층에 대해 백의 벽과 접촉하도록 피질 섹션을 백에 배치했다. 필요에 따라 -1℃에서 추가 UW® 용액을 백에 주입하여 피질 부분을 덮었다. 백을 닫고 압축하여 모든 공기를 제거했다. 백을 히트 실러로 밀봉하였고 여분의 플라스틱은 잘라 냈다. 저장용 모든 피질 섹션이 준비될 때까지 백을 -2℃로 냉각된 POD에 넣었다.
실시예 3 : -18℃ 및 193MPa에서 생물학적 물질을 저장하기 위한 저장 공정
설정
도 2에 도시되고 실시예 1에 기술된 장치를 사용하여 생물학적 샘플을 저장하기 하루 전에 다음 단계를 수행하였다. Storage POD를 -18℃로 설정하고 유지했다. 비어 있는 압력 용기(13)(도 2 참조)를 Work POD(10)에 넣었다. Work POD의 온도 제어기는 -2℃로 설정되었고 압력 용기의 내부 온도는 6시간 동안 -2℃로 상승했다. -2℃에서 일단, 압력 용기(13)를 8시간 동안 안정화시켰다. Auber PID를 프로그래밍하였다. 압력 용기(13)를 배관 시스템에 연결하였다. 두 겹의 2인치 폐쇄 폼 단열재를 Work POD 상단에 놓았다. 첫 번째 서미스터(14)를 압력 용기(13) 내 오버플로우 채널/서미스터 웰(25)(도 3 참조)에 삽입하였다. 두 번째 서미스터(12)는 Work POD 내부의 압력 용기(13) 옆에 위치시켰다. 컴퓨터의 전원을 켜고 데이터 수집 시스템(DAQ)에 연결하고, Vernier Lab View 소프트웨어가 5,000분 동안 10초마다 판독치를 기록하도록 구성하고 기록을 시작했다.
샘플을 Work POD에 넣고 -18℃ 및 193MPa에서 안정화
샘플 수집 당일에 다음 단계를 수행했다. 실시예 2에 기재된 바와 같이 돼지 신장 피질 생검 샘플을 제조하고 -2℃에서 유지하였다. 두 폐쇄 폼 단열재 시트를 Work POD 상단에서 제거하였다. 첫 번째 서미스터(14)는 25에서 제거하였고 압력 용기(13)도 배관 시스템에서 분리하였다. 압력 용기(13)를 Work POD에서 제거하고 Work POD의 스탠드에 위치시켰다. 압력 용기 덮개(21)는 나사산을 풀어 제거하였다. Halstead 집게(0cm)를 사용하여 2개의 백에 들어 밀봉된 샘플의 첫 번째 세트를 압력 용기의 샘플 웰(26)에 나란히 넣은 다음, 2개의 백에 들어 밀봉된 샘플의 두 번째 세트를 첫 번째 세트 위에 배치하였다. 덮개(21)가 샘플과 접촉하지 않고 압력 용기(13)에 맞도록 충분한 공간을 남겨두는 데 주의가 필요했다. 구동 액체가 압력 용기로 들어가고 압력 용기 차단 밸브(9)가 열린 상태에서 덮개(21)를 압력 용기(13)에 끼워서 닫는 동안, 초과 구동 액체는 압력 용기(13) 측면의 오버플로우 채널/서미스터 웰(25)을 통해 배출되었다(참조: 도 4a-4e). 오버플로우 채널 및 서미스터 웰(25)은 구동 액체가 기포 없이 자유롭게 흘러 나올 때까지 관찰되었다. 덮개(21)가 오버플로우 채널을 막았으면, 기포가 관찰되지 않을 때까지 구동 액체를 압력 용기 차단 밸브(9)의 상단으로부터 배출했다. 스트랩 렌치 및 덮개 닫힘 바를 사용하여 꼭 맞을 때까지 덮개(21)를 압력 용기(13) 상에 조였다. 압력 용기(13)를 Work POD로 옮겨 배관 시스템에 연결하였다. 손으로 조여 압력 용기를 배관 시스템에 연결하여 맞추었다. 압력 발생기(2)의 상류에 위치한 구동 액체 차단 밸브(3)를 열었다. 압력 발생기(2)로부터 다운스트림에 위치한 압력 발생기 차단 밸브(7)도 개방하였다. 배관 시스템을 압력 용기(13)에 연결하는 파이프 피팅의 피팅 칼라를 점검하고 조였다. 파이프 피팅을 압력 용기(13)에 삽입하고 나사산을 한 바퀴 돌려 조였다. 압력 용기 차단 밸브(9)를 배관 시스템(40ft/lbs)에 연결하여 피팅이 꼭 맞을 때까지 조였다. 구동 액체 저장소 차단 밸브(3)를 닫았고, 압력 발생기 차단 밸브(7) 및 압력 용기 차단 밸브(9)가 완전히 한 바퀴 열려 있는지 확인하기 위해 검사를 수행했다. 첫 번째 서미스터(14)는 오버플로우 채널과 서미스터 웰(25)에서 교체되었다.
압력 용기 내부의 압력이 증가하고 온도가 점차 감소하도록 프로그래밍되었다(예: 표 2 참조). Work POD의 제어기는 일정한 속도로 -2℃에서 -18℃까지 램프하도록 프로그래밍되었다. 조직은 압력 용기 재료(예: 스테인리스 스틸)를 가로지르는 열 전달 계수로 인해 Work POD보다 훨씬 느리게 냉각된다. 카운트다운 Gra-Lab 타이머를 20분으로 설정하였고, 가압 속도를 제어하는 데 사용되었다. 압력 발생기(1)를 사용하여, 압력 용기(13)를 1,000psig/분(6.9MPa)의 속도로 12초마다 200psig(1.4MPa)씩 증분하여 30,000psig(210MPa)까지 가압하였다. 시스템을 12시간 동안 램프 및 담그도록 하였다. 냉각으로 인해 2,000psig(13.8MPa)의 손실이 발생한 것으로 기록되었다. 온도 및 압력을 12시간 동안 안정화시켰다. 그 때, 압력은 28,000psig(193MPa)로 조정되었고 시스템은 추가로 6시간 동안 안정화되었다.
-18℃ 및 193MPa에서 저장된, Work POD에서 Storage POD로 이동,
일단 압력 용기가 Work POD에서 -18℃ 및 193MPa에서 안정화되면 -18℃에서 등온인 Storage POD에 저장하기 위해 이동할 준비가 되었다. 압력 용기 차단 밸브(9)를 닫았다. 구동 액체 저장소 차단 밸브(3)를 열어 배관 시스템과 압력 발생기의 압력이 대기압으로 떨어졌다. 5/8” 개방형 엔드 렌치를 사용하여, 압력 용기 차단 밸브(9)에서 파이프 피팅을 분리했다. 구동 액체 저장소 차단 밸브(3)를 닫았다. 온도 및 압력의 기록을 중단하고 데이터를 컴퓨터에 저장했다. 온도 센서(14)를 압력 용기(13)로부터 제거하였다. Storage POD의 상단을 열었다. 압력 용기(13)를 Work POD에서 들어 올려 -18℃에서 등온인 Storage POD 내부의 크래들로 옮겼다. Storage POD의 상단을 닫았다. 압력 용기의 샘플을 -18℃에서 10일 동안 담가두었다(참고: 저장 간격은 다를 수 있음).
실시예 4 : -18℃ 및 193MPa에서 주변 온도 및 압력으로 Storage POD로부터 생물학적 물질 회수
샘플은 Storage POD에서 -18℃ 및 193MPa로 있었다. 저장된 샘플의 회수가 필요한 경우 하기 단계들을 따랐다.
하기 단계들은 회수 6시간 전에 수행되었다. Work POD를 가동하고 제어기는 Work POD 온도를 -18℃로 설정하도록 셋팅되었다. 두 겹의 2인치 두께의 폐쇄형 폼 단열재를 Work POD 위에 위치하도록 했다. 컴퓨터를 가동하고 프로그램(예: Vernier, Beaverton, OR, USA에서 입수 가능한 Graphical Analysis™ 4)을 온도와 압력을 기록하기 위해 시작하였다(예: 1샘플/10초).
상기 단계 후 6시간 후에 다음 복구 프로토콜을 수행했다. 온도 데이터 기록에서, Work POD가 -18℃에서 4시간 이상 등온임을 확인했다. 압력 발생기 차단 밸브(7)를 열었다. 구동 액체 저장소 차단 밸브(3)를 닫았다. Storage POD의 덮개를 열고 압력 용기 어셈블리를 제거하고 Work POD로 옮겼다. 압력 용기의 바닥은 Work POD의 바닥에 있는 스탠드에 놓였다. 배관 시스템을 압력 용기 차단 밸브(9)에 연결하고 피팅을 1바퀴 돌렸다. 구동 액체 저장소 차단 밸브(3)를 열었다. 15초 동안 기포가 나타나지 않을 때까지 압력 용기 차단 밸브 내 블리드 홀이 관찰되었다. 압력 용기 차단 밸브(9)를 배관 시스템에 연결하는 피팅을 단단히 조였다. 구동 액체 저장소 차단 밸브(3)를 닫았다. 압력 발생기(1)를 사용하여, 배관 시스템을 193MPa(28,000psig)로 가압했다. 압축 열을 10분 동안 소산시켰다. 압력은 193MPa(28,000psig)로 조정되었다. 압력 용기 차단 밸브(9)를 열었다. 171.1MPa(24,908 psig) 미만의 압력 감소는 동결 및 시편 생존의 손실을 초래할 수 있으므로 시스템 압력의 감소를 방지하였다.
Work POD를 0.05℃/min(3.0℃/시간, 16℃ ΔT의 경우 총 5.5시간)의 속도로 -18℃에서 -2℃로 상승시켰다. 가온하는 동안, 내부 압력이 209MPa(약 30,000psig)로 증가되는 것으로 관찰되었다. Work POD를 1시간(최소) 동안 담가두었다. 압력 발생기 수동식 휠(1)을 사용하여, 압력 용기를 주변 압력에 도달할 때까지 30분 동안 12초마다 200psig(1.4MPa)씩의 증분으로 1,000psig/분(6.9MPa)로 감압했다.
압력 용기(13)를 압력 용기 차단 밸브(9)에 대한 피팅을 느슨하게 하여 배관 시스템에서 분리하였다. -2℃의 압력 용기(13)를 상부(21)의 나사를 풀어 개방하고 상부를 용기로부터 제거하였다. 4개의 샘플 각각을 30cm 지혈기를 사용하여 용기 내부에서 제거했다.
샘플을 DAPI/PI를 사용하여 염색하고(전체 이름은 표 1 참조) 생존 가능성에 대해 분석했다. 결과는 표 1에 나와 있다. 저장된 신장 생검 섹션의 사용되지 않은 부분은 후속 카스파제/아데노신 삼인산(ATP) 분석을 위해 동결되었다.
승압에서 영하 ℃ 저장을 사용하여 얼지 않고 보존된 물질.
　저장된 물질
(N) 		　저장 기간
(용액) 		저장 온도 및 압력 　저장 후 상태 사용된 분석 　비고
　물
(N=33)		 　 -20℃
30,000psi
207MPa		 　
얼지 않음		 　
얼음 핵생성		 이론적으로 물은 얼지 않은 상태로 무기한 저장할 수 있음.
-20℃ 및 30,000psi
　돼지 신장 생검(N=48) 　
2주
(UW)		 -18℃
30,000psi
207MPa		 평균 세포 생존력
= 94　+ 3% SD		 PI/DAPI
카스파제
시각화		 저장 후 세포 사멸의 증가 없음
괴사 또는 악화 없음
　돼지 신장 생검(N=12) 　
4주
(UW)		 -18℃
30,000psi
207MPa		 평균 세포 생존력
= 94　+　3% SD		 　
I/DAPI
시각화		 괴사 또는 악화가 없으며,
저장 후 변색 없음
　돼지 심장
(N=1)		 8일
(인산염 완충액)		 -8℃
18,000psi
124MPa
　		 　
100% 세포 사망률		 　
PI/FDA
시각화		 장기를 받았을 때 생존할 수 없음, 절개 개방
　토끼 심장
(N=3)		 6주
(인산염 완충액)		 -18℃
30,000psi
207MPa		 　
~90% 세포 생존율		 PI/FDA/DAPI
시각화		 괴사 또는 악화가 없으며,
저장 후 변색 없음
　토끼 심장
(N=16)		 　
7일
(인산염 완충액)		 -18℃
30,000psi
207MPa		 　
~90% 세포 생존율		 PI/FDA/DAPI
시각화		 괴사 또는 악화가 없으며,
저장 후 변색 없음
　토끼 신장
(N=12)		 　
10일
(냉각정지)		 -18℃
30,000psi
207MPa		 　
~90% 세포 생존율		 PI/FDA/DAPI
시각화		 괴사 또는 악화가 없으며,
저장 후 변색 없음
쥐 심장(N=2) 7 일
(냉각정지)		 -18℃
30,000psi
207MPa		 　
~90% 세포 생존율		 PI/FDA
시각화
랑겐도르프		 좋은 조건
괴사 없음
변색 없음
쥐 신장(N=4) 8일
(냉각정지)		 -20℃
30,000psi
207MPa		 　
~90% 세포 생존율		 PI/FDA
시각화
형태		 장기는 온전, 저장 전과 비교하여 변화 없음
소 정자
(N=3x300,000)		 7 일
(Tolga)		 -18℃
30,000psi
207MPa		 　
30% 세포 생존율		 PI/FDA/DAPI
MTT 분석
운동성		 기포 문제
　
굴 유충
(N=6 코호트)		 23일
(해수)
　		 -18℃
30,000psi
207MPa		 5-20% 생존율 PI/FDA
형태학적
운동성		 생존은 연령에 따라 달라짐.　
3주된 벨리거 유충에서 최상
머드 미노
(N=7)		 7일
(물)		 -18℃
30,000psi
207MPa		 생존 없지만 변화도 없음 시각화
형태학적
생리학적		 Fish 온전, 손상 없음
수족관으로 이동시 기능하지 않음
HEK293 세포
(N=3x100,000)		 12시간
(DMEM)		 20℃
15,000psi
104MPa
　		 5% 세포 생존율 PI/FDA
MTT 분석		 20℃ 및 고압에서 열악한 생존
미토콘드리아
(다양한 기원)		 1일 ~ 1개월
(다양한 매질)		 -18℃
30,000psi
207MPa		 항상 온전함(always intact)
일부 시험에서 기능 확인됨		 DAPI
MTT 분석		 모든 연구에서 온전함
일부 연구에서 기능 확인
카탈라아제
(N=2)		 3일
(물)		 -18℃
30,000psi
207MPa		 기능 확인됨 H2O2 효소에 대한 고압영향 시험
PEG(N=100+) 1일 ~ 1개월 -18℃
30,000psi
207MPa		 변화 없음 삼투압 측정
FPD 변화없음
　
EG(N=12) 1일 ~ 1개월 -18℃
30,000psi
207MPa		 변화 없음 삼투압 측정
FPD 변화없음
　
인산염 완충액
(N=16)		 1일 ~ 1개월 -18℃
30,000psi
207MPa		 변화 없음 세포 생존 세포 생존함
DMEM(N=3) 12시간(DMEM) 20℃
15,000psi
104MPa		 변화 없음 세포 생존 세포 생존함
U. of Wisconsin Solution
(UW®)(N=60)		 1일 ~ 1개월 -18℃
30,000psi
207MPa		 변화 없음
세포 생존
　
세포 생존함
　
CryoStasis 용액
(N=22)		 1일 ~ 1개월 -18℃
30,000psi
207MPa		 변화 없음 삼투압 측정 FPD 변화없음
AFP 활동 변화없음
부동 단백질
(N=4)		 3일(냉각정지) -18℃
30,000psi
207MPa		 변화 없음 삼투압 측정 FPD 변화없음
　
박테리아 및 조류
(N=6)		 23일
(해수)		 -18℃
30,000psi
207MPa		 세포가 손상되지 않고 운동성 현미경 세포가 손상되지 않고 운동성
해수
(N=6)		 23일
　		 -18℃
30,000psi
207MPa		 변화 없음 삼투압 측정
애벌레 생존		 FPD 변화없음
　
약어: PI(요오드화 프로피듐); FDA(플루오레세인 디아세테이트); DAPI(4',6-디아미디노-2-페닐인돌); DMEM(Dulbecco Modified Eagle Medium; 둘베코 변형 이글 배지); PEG(프로필렌 글리콜); EG(에틸렌 글리콜); FPD(동결점 강하).
"CryoStasis" 및 "Tolga"는 수성 기반 용액을 참조한다. UW®(Southard, J.H. et al., Transplantation Reviews 7(4): 176-190, 1993).
다양한 물질에 대한 온도 변화 및 해당 압력.　
저장된 물질 압력 프로토콜(psi) 온도 프로토콜(℃)
　
　
물
(N=33)		 1) 0 ~ 5,000
5,000 ~ 10,000;
10,000 ~ 15,000;　
15,000 ~ 20,000;　
20,000~25,000;　
25,000 ~ 30,000;
2)　0 ~ 10,000;
10,000 ~ 20,000;　
20,000 ~ 30,000;
가온동안 반대,
모두 6시간 담금,
램프 속도:
5,000psi/분
3,000psi/분
1,000psi/분
500/psi/분		 1)　　0℃ ~ -2.5℃;
-2.5℃ ~ -6.0℃;
-6.0℃ ~ -9.2℃;
-9.2℃ ~ -12.5℃;
-16.5℃ ~ -20.0℃
　
2)　　0℃ ~ -6.0℃;
-6.0℃ ~ 12.5℃;
-12.5℃ ~ -20.0℃
　
돼지 신장 생검
(N=48)		 0 ~ 30,000, -18℃에서 압력이 27,800psi로 강하; 저장을 위해 28,000으로 재설정.
가온동안 반대, 12시간 동안 담금,
램프 속도: 1,000psi/min		 -2℃ ~ -18℃
28,000psi = -19.3℃
　
돼지 신장 생검
(N=12)		 0 ~ 30,000, -18℃에서 압력이 27,800psi로 강하;　저장을 위해 28,000으로 재설정.
가온동안 반대, 12시간 동안 담금,
램프 속도: 1,000psi/min;		 -2℃ ~ -18℃
28,000psi = -19.3℃
　돼지 심장
(N=1)		 0 ~ 15,000
15,000 ~ 30,000
가온동안 반대, 4시간 담금,
램프 속도: 500psi/min		 -2℃ ~ -9.0℃;
-9.0℃ ~ -20℃
　토끼 심장
(N=3)		 0 ~ 5,000
5,000 ~ 10,000;
10,000 ~ 15,000;
15,000 ~ 20,000;
20,000~25,000
25,000 ~ 30,000
가온동안 반대,
모두 6시간 담금
램프 속도 250psi/min		 0℃ ~ -2.5℃;
-2.5℃ ~ -6.0℃;
-6.0℃ ~ -9.2℃;
-9.2℃ ~ -12.5℃;
-12.5℃ ~ -16.5℃;
-16.5℃ ~ -20.0℃
　
　토끼 심장
(N=16)		 0 ~ 5,000
5,000 ~ 10,000;
10,000 ~ 15,000;
15,000 ~ 20,000;
20,000~25,000
25,000 ~ 30,000
가온동안 반대,
모두 6시간 동안 담금,
램프 속도 250psi/min		 0℃ ~ -2.5℃;
-2.5℃ ~ -6.0℃;
-6.0℃ ~ -9.2℃;
-9.2℃ ~ -12.5℃;
-12.5℃ ~ -16.5℃;
-16.5℃ ~ -20.0℃
　
　토끼 신장
(N=12)		 0 ~ 5,000
5,000 ~ 10,000;
10,000 ~ 15,000;
15,000 20,000;
20,000~25,000
25,000 ~ 30,000
가온동안 반대,
모두 6시간 동안 담금,
램프 속도 1,000/분　		 0℃ ~ -2.5℃;
-2.5℃ ~ -6.0℃;
-6.0℃ ~ -9.2℃;
-9.2℃ ~ -12.5℃;
-12.5℃ ~ -16.5℃;
-16.5℃ ~ -20.0℃
　
쥐 심장
(N=2)		 0 ~ 15,000
15,000 ~ 30,000
램프 속도 500psi/min
가온동안 반대,
4시간 동안 담금.		 2℃ ~ -9.0℃;
-9.0℃ ~ -20℃
쥐 신장
(N=4)		 0 ~ 15,000
15,000 ~ 30,000
가온동안 반대,
4시간 동안 담금,
램프 속도 500psi/min		 2℃ ~ -9.0℃;
-9.0℃ ~ -18℃
소 정자
(N=3x300,000)		 0 ~ 5,000
5,000 ~ 10,000;
10,000 ~ 15,000;
15,000 ~ 20,000;
20,000~25,000
25,000 ~ 30,000
가온동안 반대;　200psi/min, 2시간 담금, Tolga Tris 비동결 소 증량제
　		 0℃ ~ -2.5℃;
-2.5℃ ~ -6.0℃;
-6.0℃ ~ -9.2℃;
-9.2℃ ~ -12.5℃;
-12.5℃ ~ -16.5℃;
-16.5℃ ~ -20.0℃
　
굴 유충
(N=6 코호트)		 0 ~ 5,000
5,000 ~ 10,000;
10,000 ~ 15,000;
15,000 ~ 20,000;
20,000~25,000
25,000 ~ 30,000
가온동안 반대;　100psi/min,
2시간 담금, 해수
　		 0℃ ~ -2.5℃;
-2.5℃ ~ -6.0℃;
-6.0℃ ~ -9.2℃;
-9.2℃ ~ -12.5℃;
-12.5℃ ~ -16.5℃;
-16.5℃ ~ -20.0℃
　
머드 미노
(N=7)		 0 ~ 5,000
5,000 ~ 10,000;
10,000 ~ 15,000;
15,000 ~ 20,000;
20,000~25,000
25,000 ~ 30,000
가온동안 반대;　100psi/min,
2시간 담금, 연못 물
　		 0℃ ~ -2.5℃;
-2.5℃ ~ -6.0℃;
-6.0℃ ~ -9.2℃;
-9.2℃ ~ -12.5℃;
-12.5℃ ~ -16.5℃;
-16.5℃ ~ -20.0℃
　
HEK293 세포
(N=3x100,000)		 0 ~ 5,000
5,000 ~ 10,000;
10,000 ~ 15,000;
15,000 ~ 20,000;
20,000~25,000
25,000 ~ 30,000
가온동안 반대;　200psi/min,
2시간 담금, DMEM		 0℃ ~ -2.5℃;
-2.5℃ ~ -6.0℃;
-6.0℃ ~ -9.2℃;
-9.2℃ ~ -12.5℃;
-12.5℃ ~ -16.5℃;
-16.5℃ ~ -20.0℃
　
미토콘드리아
(다양한 기원)		 다양한 프로토콜 다양한 프로토콜
카탈라아제
(N=2)		 0 ~ 30,000psi
가온동안 반대;　
15,000/분
회수 후 H2O2와 반응		 -2℃ ~ -20℃
다양한 용액에 대한 온도 변화 및 해당 압력.
저장된 물질 압력 프로토콜(psi) 온도 프로토콜(℃)
　
PEG(N=100+) 0 ~ 5,000
5,000 ~ 10,000;　
10,000 ~ 15,000;　
15,000 ~ 20,000;　
20,000 ~ 25,000;　
25,000 ~ 30,000;
0 ~ 10,000;
10,000 ~ 20,000;　
20,000 ~ 30,000;
가온동안 반대,
모두 6시간 담금,
램프 속도:
5,000psi/분
3,000psi/분
1,000psi/분
500/psi/분		 0℃ ~ -2.5℃;
-2.5℃ ~ -6.0℃;
-6.0℃ ~ -9.2℃;
-9.2℃ ~ -12.5℃;
-12.5℃ ~ -16.5℃;
-16.5℃ ~ -20.0℃
0℃ ~ -6.0℃;
-6.0℃ ~ -12.5℃;
-12.5℃ ~ -20.0℃
EG(N=12) 0 ~ 5,000;
5,000 ~ 10,000;　
10,000 ~ 15,000;　
15,000 ~ 20,000;　
20,000 ~ 25,000;　
25,000 ~ 30,000
0 ~ 10,000;
10,000 ~ 20,000;　
20,000 ~ 30,000;
가온동안 반대,
모두 6시간 담금,
램프 속도:
5,000psi/분
3,000psi/분
1,000psi/분
500/psi/분		 0℃ ~ -2.5℃;
-2.5℃ ~ -6.0℃;
-6.0℃ ~ -9.2℃;
-9.2℃ ~ -12.5℃;
-12.5℃ ~ -16.5℃;
-16.5℃ ~ -20.0℃
0℃ ~ -6.0℃;
-6.0℃ ~ -12.5℃;
-12.5℃ ~ -20.0℃
인산염 완충액
(N=16)		 0 ~ 5,000
5,000 ~ 10,000;　
10,000 ~ 15,000;　
15,000 ~ 20,000;　
20,000 ~ 25,000;　
25,000 ~ 30,000;
0 ~ 10,000;
10,000 ~ 20,000;　
20,000 ~ 30,000;
가온동안 반대,
모두 6시간 담금,
램프 속도:
5,000psi/분
3,000psi/분
1,000psi/분
500/psi/분		 0℃ ~ -2.5℃;
-2.5℃ ~ -6.0℃;
-6.0℃ ~ -9.2℃;
-9.2℃ ~ -12.5℃;
-12.5℃ ~ -16.5℃;
-16.5℃ ~ -20.0℃
0℃ ~ -6.0℃;
-6.0℃ ~ -12.5℃;
-12.5℃ ~ -20.0℃
DMEM(N=3) 0 ~ 5,000;
5,000 ~ 10,000;
10,000 ~ 15,000;
15,000 ~ 20,000;
20,000 ~ 25,000;
25,000 ~ 30,000;
0 ~ 10,000;
10,000 ~ 20,000;
20,000 ~ 30,000;
가온동안 반대,
모두 6시간 담금,
램프 속도:
5,000psi/분
3,000psi/분
1,000psi/분
500/psi/분		 0℃ ~ -2.5℃;
-2.5℃ ~ -6.0℃;
-6.0℃ ~ -9.2℃;
-9.2℃ ~ -12.5℃;
-12.5℃ ~ -16.5℃;
-16.5℃ ~ -20.0℃
0℃ ~ -6.0℃;
-6.0℃ ~ -12.5℃;
-12.5℃ ~ -20.0℃
University of Wisconsin Solution(N=60) 0 ~ 5,000;
5,000 ~ 10,000;
10,000 ~ 15,000;
15,000 ~ 20,000;
20,000 ~ 25,000;
25,000 ~ 30,000;
0 ~ 10,000;
10,000 ~ 20,000;
20,000 ~ 30,000;
가온동안 반대,
모두 6시간 담금,
램프 속도:
5,000psi/분
3,000psi/분
1,000psi/분
500/psi/분		 0℃ ~ -2.5℃;
-2.5℃ ~ -6.0℃;
-6.0℃ ~ -9.2℃;
-9.2℃ ~ -12.5℃;
-12.5℃ ~ -16.5℃;
-16.5℃ ~ -20.0℃
0℃ ~ -6.0℃;
-6.0℃ ~ -12.5℃;
-12.5℃ ~ -20.0℃
CryoStasis 용액(N=22) 0 ~ 5,000;
5,000 ~ 10,000;
10,000 ~ 15,000;
15,000 ~ 20,000;
20,000 ~ 25,000;
25,000 ~ 30,000;
0 ~ 10,000;
10,000 ~ 20,000;
20,000 ~ 30,000;
가온동안 반대,
모두 6시간 담금,
램프 속도:
5,000psi/분
3,000psi/분
1,000psi/분
500/psi/분		 0℃ ~ -2.5℃;
-2.5℃ ~ -6.0℃;
-6.0℃ ~ -9.2℃;
-9.2℃ ~ -12.5℃;
-12.5℃ ~ -16.5℃;
-16.5℃ ~ -20.0℃
0℃ ~ -6.0℃;
-6.0℃ ~ -12.5℃;
-12.5℃ ~ -20.0℃
부동 단백질(N=4) 0 ~ 5,000;
5,000 ~ 10,000;
10,000 ~ 15,000;
15,000 ~ 20,000;
20,000 ~ 25,000;
25,000 ~ 30,000;
0 ~ 10,000;
10,000 ~ 20,000;
20,000 ~ 30,000;
가온동안 반대,
모두 6시간 담금,
램프 속도:
5,000psi/분
3,000psi/분
1,000psi/분
500/psi/분		 0℃ ~ -2.5℃;
-2.5℃ ~ -6.0℃;
-6.0℃ ~ -9.2℃;
-9.2℃ ~ -12.5℃;
-12.5℃ ~ -16.5℃;
-16.5℃ ~ -20.0℃
0℃ ~ -6.0℃;
-6.0℃ ~ -12.5℃;
-12.5℃ ~ -20.0℃
박테리아 및 조류(N=6) 0 ~ 5,000;
5,000 ~ 10,000;
10,000 ~ 15,000;
15,000 ~ 20,000;
20,000 ~ 25,000;
25,000 ~ 30,000;
0 ~ 10,000;
10,000 ~ 20,000;
20,000 ~ 30,000;
가온동안 반대,
모두 6시간 담금,
램프 속도:
5,000psi/분
3,000psi/분
1,000psi/분
500/psi/분		 0℃ ~ -2.5℃;
-2.5℃ ~ -6.0℃;
-6.0℃ ~ -9.2℃;
-9.2℃ ~ -12.5℃;
-12.5℃ ~ -16.5℃;
-16.5℃ ~ -20.0℃
0℃ ~ -6.0℃;
-6.0℃ ~ -12.5℃;
-12.5℃ ~ -20.0℃
해수(N=6) 0 ~ 5,000;
5,000 ~ 10,000;
10,000 ~ 15,000;
15,000 ~ 20,000;
20,000 ~ 25,000;
25,000 ~ 30,000;
0 ~ 10,000;
10,000 ~ 20,000;
20,000 ~ 30,000;
가온동안 반대,
모두 6시간 담금,
램프 속도:
5,000psi/분
3,000psi/분
1,000psi/분
500/psi/분		 0℃ ~ -2.5℃;
-2.5℃ ~ -6.0℃;
-6.0℃ ~ -9.2℃;
-9.2℃ ~ -12.5℃;
12.5℃ ~ -16.5℃;
-16.5℃ ~ -20.0℃
0℃ ~ -6.0℃;
-6.0℃ ~ -12.5℃;
-12.5℃ ~ -20.0℃
참고문헌의 삽입
인용된 모든 간행물의 내용은 전체가 참고로 본원에 포함된다.
균등론
본원의 설명이 특정 실시예를 참조하여 이루어졌지만, 본 발명의 사상 및 범위 내에 속하는 본 발명의 원리를 사용하여 다른 실시예들을 실행하는 것이 가능함을 통상의 기술자는 이해할 것이다.
1: 수동 휠; 2: 압력 발생기; 3: 구동 액체 차단 밸브
4: 구동 액체 저장소; 5: 압력 게이지; 6: 압력 변환기
7: 압력 발생기 차단 밸브; 8: 단열 덮개; 9: 압력 용기 차단 밸브
10: 냉각 구획; 11: 냉각기/히터; 12: 냉각 제어용 온도 센서
13: 압력 용기; 14: 압력 용기 내부 모니터링용 온도 센서; 15: 순환 팬 또는 교반기
21: 상단; 27: 포트

Claims (30)

  1. 압력 용기에 생물학적 물질을 두는 단계;
    압력 용기를 구동 액체로 채우는 단계;
    압력 용기로부터 공기를 이동시키고 압력 용기를 밀봉하는 단계; 및
    압력 발생기를 사용하여 구동 액체에 대한 압력을 증가시키고 압력 용기 내부의 온도를 0℃ 미만으로 낮추는 단계
    를 포함하는, 생물학적 물질의 저장 방법으로서,
    선택된 온도에서, 압력 발생기를 사용하여 선택된 압력이 구동 액체에 가해지고, 이에 의해 압력 용기 내의 구동 액체가 안정적인 액체 상태로 유지되며,
    상기 구동 액체에 선택된 압력을 가함으로써 0℃ 미만의 보관 온도에서 상기 생물학적 물질의 동결이 방지되는,
    생물학적 물질의 저장 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    생물학적 물질을 보존 용액과 함께 샘플 백에 두는 단계;
    샘플 백에서 공기를 빼내는 단계; 및
    샘플 백을 밀봉하는 단계
    를 더 포함하고,
    보존 용액 및 구동 액체는 안정한 액체 상태로 유지되는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 온도를 낮추고 압력을 증가시키는 단계는 1,000psig/분(6.9MPa)로 200psig(1.4MPa)씩 증분하여 주변 조건에서 약 30,000psig(210MPa)으로 압력을 증가시키고, 주변 조건에서 약 -22℃로 온도를 감소시키는 것을 포함하는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 물질이 유기 분자, 분자 복합체, 핵산, 사카라이드, 아미노산, 펩티드, 단백질, 효소, 소기관, 오르가노이드, 세포, 조직, 기관, 유기체 및 수용액 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 보존 용액이
    물, 및
    생물학적 물질, 가용성 분자, 유기 및/또는 무기 화합물, 수성 현탁액 중의 물질, 수용액, 수성 혼합물, 수성 콜로이드, 수계 물질, 및 생물학적 기원의 물질 중 하나 이상
    을 포함하는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 물질이 세포, 조직, 기관 또는 전체 유기체를 포함하는, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 저장 온도가 약 -22℃인, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 저장 온도에서 적용된 압력은 약 30,000psi(210MPa)인, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 저장 온도 및 적용된 압력은 세포를 준안정 과냉각 액체 상태로 유지함으로써 동결 및 세포 손상을 방지하는 것인, 방법.
  10. 제2항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 보존 용액은 용질을 포함하는, 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 용질은 부동 단백질, 얼음 결합 단백질, 부동 사카라이드, 얼음 결합 사카라이드, 얼음 결합 펩티드, 및 기타 비-속일적 제제 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 용질이 얼음 결정 성장을 방지, 억제, 제어 또는 격리하고/하거나 얼음의 핵 형성을 방지하는, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 구동 액체가 프로필렌 글리콜 또는 에틸렌 글리콜, 오일, 석유, 어유, 광유, 식물성 오일, 물, 해수, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 선택된 저장 온도가 약 -5℃ 내지 약 -22℃인, 방법.
  15. 구동 액체를 수용하기 위한 저장소;
    생물학적 물질을 수용하기에 적합한 내부 웰을 갖는 압력 용기로서, 저장소로부터 구동 액체를 수용하기 위해 저장소에 작동 가능하게 연결된 압력 용기;
    압력 용기 및 저장소에 작동 가능하게 연결되어 구동 액체에 압력을 가하는 압력 발생기;
    압력 용기에서 구동 액체의 압력 표시를 제공하는 압력 변환기;
    압력용기의 온도를 감지하는 온도센서; 및
    약 0℃ 미만의 제어된 압력 용기 내부 온도를 제공하도록 구성된 냉각 장치
    를 포함하고,
    약 0℃ 미만의 선택된 압력 용기 온도에서, 압력 발생기는 압력 용기 내의 구동 액체를 안정적인 액체 상태로 유지하기 위해 구동 액체에 선택된 압력을 인가하는,
    생물학적 물질 저장 장치.
  16. 제15항에 있어서, 압력 변환기, 온도 센서, 압력 발생기, 및 냉각 장치 중 하나 이상으로부터 데이터를 획득하는 데이터 획득 시스템(DAQ)을 더 포함하는, 장치.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 압력 변환기, 온도 센서, 압력 발생기, 및 냉각 장치 중 하나 이상에 작동 가능하게 연결된 제어기를 더 포함하고;
    상기 제어기는 압력 용기 내의 선택된 내부 압력 용기 온도 및 구동 액체에 대한 선택된 압력 중 적어도 하나를 모니터링하고 유지하는, 장치.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 압력 게이지를 더 포함하는 장치.
  19. 제17항에 있어서, 압력 발생기는 자동화되고 제어기에 의해 기계적으로, 전기적으로, 공압적으로 또는 유압적으로 구동되는, 장치.
  20. 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 냉각 장치는 히터를 더 포함하는, 장치.
  21. 제20항에 있어서, 히터는 온도 센서 및 온도 제어기를 포함하는, 장치.
  22. 제15항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 냉각 장치는 PID(proportional-integral-derivative) 제어기를 포함하는, 장치.
  23. 제15항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 증발기를 더 포함하는, 장치.
  24. 제15항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 닫힐 때, 장치로부터 압력 용기의 분리 및 제거를 허용하는 적어도 하나의 밸브를 더 포함하고,
    압력 용기는 장치로부터 제거될 때 구동 액체의 인가된 압력을 유지하는, 장치.
  25. 제15항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 압력 용기는 스틸, 스테인리스 스틸, 및 티타늄으로부터 선택된 재료로 제조되는, 장치.
  26. 제15항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 압력 용기는 적어도 약 30,000 psig(210MPa)의 내부 압력을 견디도록 구성되는, 장치.
  27. 제1 부분을 포함하는 공동, 및 생물학적 물질 및 구동 액체를 수용하는 샘플 웰을 포함하는 하우징으로서, 상기 제1 부분은 하우징의 외부로 개방된 오버플로우 채널을 포함하는 하우징의 제1 부분인, 하우징; 및
    덮개로서,
    하우징의 제1 부분과 맞물리도록 구성된 제1 부분을 포함하고, 이로써, 하우징 내의 덮개의 위치는 제1 위치에서 닫힘 위치까지의 범위에 걸쳐 조정 가능하고,
    상기 덮개는 하우징의 샘플 웰에 부분적으로 끼워지도록 구성된 제2 부분을 포함하며,
    상기 덮개의 제1 부분은 외부 장비와 결부되도록 구성된 포트를 포함하고,
    상기 덮개는 상기 포트와 샘플 웰 사이의 덮개를 통해 구동 액체를 전도하도록 구성된 구동 액체 채널을 포함하는, 덮개
    를 포함하고,
    상기 덮개를 닫힘 위치로 조정하면 포트 및 오버플로우 채널을 통해 샘플 웰로부터 과잉 구동 액체가 배출되고, 덮개의 제2 부분은 샘플 웰을 밀봉하며;
    상기 압력 용기는 샘플 웰 내 구동 액체의 내부 압력을 적어도 약 30,000psi(210MPa)로 유지하도록 구성되는,
    생물학적 물질을 저장하기 위한 압력 용기.
  28. 제27항에 있어서, 압력은 포트를 통해 외부 장비에 의해 샘플 웰 내의 구동 액체 가해지는, 압력 용기.
  29. 제28항에 있어서, 포트와 외부 장비 사이에 배치된 적어도 하나의 밸브를 더 포함하고;
    닫힐 때, 적어도 하나의 밸브는 외부 장비로부터 압력 용기를 격리하고, 샘플 웰의 내부 압력을 유지하는, 압력 용기.
  30. 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 오버플로우 채널은 온도 센서를 수용하도록 구성된, 압력 용기.
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