KR20220082527A - Vhsv 당단백질을 발현하는 형질전환 미세조류를 유효성분으로 포함하는 vhs의 예방 또는 개선용 사료첨가제 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 VHSV (Viral hemorrhagic septicemia virus) 당단백질을 발현하는 형질전환 미세조류를 유효성분으로 포함하는 바이러스성출혈성패혈증(Viral hemorrhagic septicemia)의 예방 또는 개선용 사료첨가제 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명에 따른 조성물은 상용의 사료에 흡착시켜 어류에 제공할 수 있어, 먹이 섭취 과정을 통해 면역을 유도할 수 있으므로, 면역주사와 같은 고비용 또는 숙련된 노동력을 요구하지 않으면서 어류의 VHSV 감염에 의한 폐사를 효과적으로 감소시킬 수 있으므로, 양식 산업 분야에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

Description

VHSV 당단백질을 발현하는 형질전환 미세조류를 유효성분으로 포함하는 VHS의 예방 또는 개선용 사료첨가제 조성물 및 이의 용도{Feed additive composition for preventing or improving VHS comprising transgenic microalgae expressing VHSV G protein as effective component and uses thereof}

본 발명은 VHSV(Viral hemorrhagic septicemia virus) 당단백질(glycoprotein, G protein)을 발현하는 형질전환 미세조류를 유효성분으로 포함하는 바이러스성출혈성패혈증(Viral hemorrhagic septicemia; VHS)의 예방 또는 개선용 사료첨가제 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.

VHSV (Viral hemorrhagic septicemia virus)는 2001년 포항의 넙치 양식장에서 처음 분리된 후 양식 넙치뿐만 아니라 자연산 해수 어류에도 전파되었고, 넙치 주 생산지인 제주에서는 2007년 공식 확인되었으며, 현재 '수산생물질병관리법'에서 지정하고 있는 수산생물전염병이므로, VHSV에 대한 백신으로는 불활성화 백신을 국립수산과학원(한국등록특허 10-1322228)과 주식회사 녹십자(한국등록특허 10-1464310) 등에서 개발하였으나 아직까지 상용화되어 있지 않다.

또한, 현재까지 개발된 VHSV 백신은 주사를 이용하는 백신으로, 백신 처리과정에 필요한 일시적인 마취 등의 과정은 어류에 스트레스를 유도할 수 있다. 또한 백신 처리는 숙련된 전문가의 작업이 필요하여 비용이 많이 소요되며, 접종이 필요한 어린 물고기는 주사 과정에서 장기 손상 등이 발생할 수 있어 기술적으로 용이하지 않다. 따라서 백신 처리 과정에서 어류에 스트레스를 주지 않으며, 어린 물고기에도 적용이 가능한 저비용 고효율의 백신 개발이 필요하며, 이에 가장 적합한 백신은 사료와 혼합하여 투여할 수 있는 경구용 백신이나, 현재까지 VHSV에 대한 면역을 유도할 수 있는 경구용 백신은 개발되어 있지 않다.

재조합 단백질 시장은 2001년 이후 매년 35%의 성장을 이루었으며, 2013년에서 2018년까지는 매년 8.83%의 성장을 이루어 2017년에는 1,410억 달러에 달할 것으로 예측되었다. 현재 재조합 단백질은 39%가 대장균(Escherichia coli), 35%가 CHO (Chinese hamster ovary) 세포, 15%가 효모, 10% 정도가 기타 포유류 시스템을 이용하고 있으나, 최근 미국과 중국을 중심으로 형질전환 미세조류를 이용하여 다양한 치료용 단백질 및 백신 등의 생산에 관한 연구가 이루어지고 있으며, 미세조류의 여러 장점 때문에 앞으로 미세조류를 이용한 재조합 단백질의 생산이 늘어날 것으로 예상된다.

미세조류의 형질전환 기술은 클라미도모나스 레인하르티(Chlamydomonas reinhardtii)를 대표 모델로 하여 개발되고 있으나, 최근 클로렐라(Chlorella) 등 다양한 미세조류를 대상으로 한 형질전환 기술들이 보고되고 있다.

본 발명에서는 VHSV의 당단백질을 발현하는 형질전환 클로렐라를 제조하여 이를 통상의 사료에 첨가하여 어류의 면역 증진용 첨가제를 개발하였다.

한편, 한국공개특허 제2014-0005001호에는 'FAB2 유전자를 과발현하는 형질전환 미세조류에서 총 지방산 함량 및 유용지방산 비율을 증가시키는 방법'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2014-0063085호에는 '형질전환 식물체를 이용한 어류 바이러스성 신경괴사증 예방 경구백신 제조방법과 그에 따른 식물체'가 개시되어 있으나, 본 발명의 'VHSV 당단백질을 발현하는 형질전환 미세조류를 유효성분으로 포함하는 바이러스성출혈성패혈증(Viral hemorrhagic septicemia)의 예방 또는 개선용 사료첨가제 조성물 및 이의 용도'에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 염(salt) 유도성 프로모터를 이용하여 VHSV의 당단백질을 발현하는 벡터를 제작하고 이를 이용하여 클로렐라를 형질전환시킨 후, 염소산염(KClO₃)을 이용하여 형질전환체를 선별하여 배양한 후, 염 처리를 통해 VHSV 당단백질의 발현을 유도하였다. 또한, 상기 VHSV 당단백질을 발현한 형질전환 클로렐라를 동결건조한 후 상용의 넙치 사료에 흡착시켜 넙치에 급이시킨 후, VHSV를 이용한 도전 감염을 실시한 결과, VHSV의 당단백질을 발현하는 클로렐라를 포함하는 사료를 급이한 실험군에서 VHSV 감염에 의한 폐사율이 현저히 감소되어, VHSV의 당단백질을 발현하는 형질전환 클로렐라가 어류의 면역을 유도하는데 유효함을 검증함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 VHSV (Viral hemorrhagic septicemia virus) 당단백질을 발현하는 형질전환 미세조류를 유효성분으로 포함하는 바이러스성출혈성패혈증(Viral hemorrhagic septicemia)의 예방 또는 개선용 사료첨가제 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 VHSV 유래 당단백질을 발현하는 형질전환 미세조류를 유효성분으로 포함하는 바이러스성출혈성패혈증의 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 사료첨가제 조성물을 배합한 어류용 사료조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 VHSV 당단백질을 발현하는 형질전환 클로렐라를 유효성분으로 포함하는 조성물은 상용의 사료에 흡착시켜 어류에 제공할 수 있어, 먹이 섭취 과정을 통해 VHSV에 대한 면역을 유도할 수 있으므로, 면역주사와 같은 고비용 또는 숙련된 노동력을 요구하지 않으면서 양식어의 VHSV 감염에 의한 폐사를 효과적으로 감소시킬 수 있으므로, 양식 산업 분야에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

도 1은 본 발명에서 사용된 재조합 벡터 CVnr(1KB)_SIP2_vGopti의 모식도이다.
도 2는 미세조류 형질전환용 벡터에 삽입된 VHSV 당단백질의 염기서열이다.
도 3은 VHSV 당단백질을 발현하는 형질전환 클로렐라를 흡착시킨 사료(alage feed)를 공급하는 일정에 대한 설명이다.
도 4는 VHSV 당단백질을 발현하는 형질전환 클로렐라를 흡착시킨 사료를 공급한 넙치에서 채취한 혈액 중의 VHSV 중화항체가를 측정한 그래프이다. mock; 상용의 넙치 사료 급이군, wild algae; 야생형 클로렐라를 흡착시킨 사료 급이군, G' algae; VHSV 당단백질을 발현하는 형질전환 클로렐라를 흡착시킨 사료 급이군.
도 5는 상용의 넙치 사료 급이군(mock), 야생형 클로렐라를 흡착시킨 사료 급이군(wild algae) 및 VHSV 당단백질을 발현하는 형질전환 클로렐라를 흡착시킨 사료 급이군(G' algae)에서 VHSV 도전 감염 후 폐사율을 분석한 그래프이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 VHSV (Viral hemorrhagic septicemia virus) 당단백질을 발현하는 형질전환 미세조류를 유효성분으로 포함하는 바이러스성출혈성패혈증(Viral hemorrhagic septicemia)의 예방 또는 개선용 사료첨가제 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 사료첨가제 조성물에 있어서, 상기 VHSV 당단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 사료첨가제 조성물에 있어서, 상기 VHSV 당단백질은 클로렐라 불가리스의 코돈에 최적화된 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에서, 상기 사료첨가제는 어류용일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 어류는 이에 한정되는 것은 아니나, 넙치, 우럭, 민어, 숭어, 능성어, 광어 또는 조피볼락일 수 있으며, 바람직하게는 넙치일 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에서, 상기 사료첨가제는 VHSV에 대한 어류의 면역활성을 증가키는 것일 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 사료첨가제 조성물에 있어서, 상기 미세조류는 클로렐라(Chlorella), 세네데스무스(Scenedesmus), 두날리엘라(Dunaliella), 스피룰리나(Spirulina), 난노클로롭시스(Nannochloropsis), 테트라셀미스(Tetraselmis), 케토세로스(Chaetoceros), 안키스트로데스무스(Ankistrodesmus) 및 헤마토코커스 플루비아리스(Heamatococcus pluvialis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 바람직하게는 클로렐라(Chlorella)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 클로렐라는 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris), 클로렐라 엘립소이데아(Chlorella ellipsoidea), 클로렐라 피레노이도사(Chlorella pyrenoidosa) 또는 클로렐라 레귤라리스(Chlorella regularis)일 수 있고, 바람직하게는 클로렐라 불가리스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에서, 상기 사료첨가제 조성물은 VHSV 당단백질을 발현하는 형질전환 미세조류 외에, 추가적으로 어류에 허용되는 담체를 함유할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 사료첨가제 조성물을 그대로 또는 공지의 담체, 안정제, 보조제(adjuvant) 등을 가할 수 있으며, 필요에 따라 비타민, 아미노산류, 미네랄 등의 각종 양분, 항산화제, 항생물질, 항균제 및 기타의 첨가제 등을 가할 수도 있으며, 그 형상으로서는 분체, 과립, 펠릿, 현탁액 등의 적당한 상태일 수 있다.

또한, 본 발명의 사료첨가제 조성물은 하나 이상의 효소 제제를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어 리파제와 같은 지방 분해효소, 피틴산(phytic acid)을 분해하여 인산염과 이노시톨인산염을 만드는 파이타제(phytase), 녹말과 글리코겐 등에 포함되어 있는 알파-1,4-글리코시드 결합(α-1,4-glycoside bond)을 가수분해하는 효소인 아밀라제, 유기인산에스테르를 가수분해하는 효소인 포스파타제(phosphatase), 말토오스를 두 분자의 글루코스로 가수분해하는 말타제 및 사카로스를 가수분해하여 글루코스-프룩토스 혼합물을 만드는 전환효소 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 사료첨가제 조성물은 어류에게 단독으로 투여되거나 식용 담체 중에서 다른 사료첨가제와 조합되어 투여될 수 있다. 통상적으로, 당업계에 잘 알려진 바와 같이 단독 일일 섭취량 또는 분할 일일 섭취량을 사용할 수 있다.

본 발명은 또한, VHSV (Viral hemorrhagic septicemia virus) 유래 당단백질을 발현하는 형질전환 미세조류를 유효성분으로 포함하는 바이러스성출혈성패혈증(Viral hemorrhagic septicemia)의 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어 "백신"은 생체에 면역을 주는 항원을 함유한 생물학적인 제제로서, 감염증의 예방을 위하여 사람이나 동물에 주사하거나 경구 투여함으로써 생체에 면역이 생기게 하는 면역원 또는 항원성 물질을 말한다.

본 발명에 따른 백신 조성물에 있어서, 상기 VHSV 당단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 백신 조성물에 있어서, 상기 VHSV 당단백질은 클로렐라 불가리스의 코돈에 최적화된 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명에 따른 백신 조성물에 있어서, 상기 미세조류는 클로렐라(Chlorella), 세네데스무스(Scenedesmus), 두날리엘라(Dunaliella), 스피룰리나(Spirulina), 난노클로롭시스(Nannochloropsis), 테트라셀미스(Tetraselmis), 케토세로스(Chaetoceros), 안키스트로데스무스(Ankistrodesmus) 및 헤마토코커스 플루비아리스(Heamatococcus pluvialis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 바람직하게는 클로렐라(Chlorella)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 클로렐라는 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris), 클로렐라 엘립소이데아(Chlorella ellipsoidea), 클로렐라 피레노이도사(Chlorella pyrenoidosa) 또는 클로렐라 레귤라리스(Chlorella regularis)일 수 있고, 바람직하게는 클로렐라 불가리스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 형질전환 미세조류는 염 유도성 프로모터에 의해 VHSV 당단백질의 발현이 조절되는 재조합 벡터(도 1 참고), 또는 상기 재조합 벡터를 주형으로 하고 NRF(59) 프라미머 (5'-ATGGACAAGACAGGGTTCGG-3', 서열번호 4) 및 NRR(59) 프라미머(5'-AATACAGGCGGAGCCCAAAC-3', 서열번호 5) 세트로 증폭한 DNA 산물로 형질전환된 것으로, 염 조건 즉, 염 처리에 의해 VHSV 당단백질의 발현이 유도되는 것이 특징이다.

본 발명에서 용어, "형질전환"이란 외래핵산 단편이 유기체의 내부로 이동하여 염색체의 인자로서 또는 염색체 통합 완성에 의해 복제 가능하게 되는 것으로 외래 핵산을 세포 내로 도입하여 인위적으로 유전적인 변화를 일으키는 현상을 말한다. 상기의 형질전환에 의해 목적 단백질을 코딩하는 외래 핵산 또는 이를 포함하는 재조합 벡터를 숙주로 도입함으로써 유용한 성분을 만들어 내는 형질전환체(transformant)를 획득할 수 있다.

또한, 본 발명의 상기 백신 조성물은 수의학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어 "수의학적으로 허용 가능한 담체"란 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항원 보강제, 안정제, 희석제, 보존제, 항균제 및 항진균제, 등장성 작용제, 흡착 지연제 등을 포함한다. 백신용 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제, 희석제로는 락토즈, 덱스트로스, 슈크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 전분, 글리세린, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다.

또한, 상기 백신용 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액 등의 경구형 제형 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명에 따른 상기 사료첨가제 조성물을 배합한 어류용 사료조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에서, 상기 사료첨가제 조성물은 VHSV 당단백질을 발현하는 형질전환 미세조류를 포함하는 것으로, 사료첨가제 조성물을 어류용 사료조성물 100 중량부에 대하여 0.01~10 중량부로 배합되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 2~8 중량부로 배합되는 것일 수 있으며, 더 바람직하게는 4~6 중량부로 배합되는 것일 수 있으나, 이제 제한되지 않는다.

상기 사료조성물에는 탄수화물, 단백질, 지방, 무기질, 비타민, 광물질 및 물과 같은 사료에 통상적으로 첨가되는 성분들이 포함될 수 있다. 이러한 각 성분의 종류에 있어서 특별히 제한되는 바가 없으며, 당 분야에서 통상적으로 사용되는 것은 모두 사용 가능하다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 형질전환 벡터의 구성

본 발명에서 미세조류 형질전환에 이용한 벡터는 박테리아 형질전환용 벡터인 pBluescript SK(+)를 기본으로 제작하였으며, 제작된 벡터의 개요도는 도 1에 나타내었다. 본 발명의 벡터는 미세조류 중 클로렐라(Chlorella)류의 형질전환에 이용하고자, 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris) PKVL7422의 질산환원효소(nitrate reductase, 이하 NR)의 DNA 단편을 삽입대상 유전자의 양쪽 말단에 배열하였으며, 삽입대상 유전자로는 어류의 출혈성 패혈증 바이러스(viral hemorrhagic septicemia virus, VHSV)의 당단백질(glycoprotein, G protein) 유전자를 사용하였으며, 상기 유전자의 발현에 필요한 클로렐라 불가리스 PKVL7422 유래 염유도성 프로모터(서열번호 3)와 클라미도모나스 레인하르티(Chlamydomonas reinhardtii)의 RbcS2(Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase) 코딩 유전자의 전사 터미네이터(transcription terminator)를 포함하고 있다.

발현하고자 하는 목적 단백질인 VHSV의 당단백질은 국내 감염 넙치에서 분리된 야생형 VHSV KJ2008의 염기서열을 기초로 클로렐라 불가리스 PKVL7422 균주에서의 발현을 극대화하기 위하여, 클로렐라 불가리스를 기준으로 코돈 최적화(codon optimization) 과정을 수행하였으며, 클로닝을 위해 양쪽 말단에 BamHI(GGATCC)와 NcoI(CCATGG) 제한효소 자리를 삽입하였고, 발현량 증가를 위한 Kozak sequence와 NcoI의 DNA를 포함하도록 (주)바이오니아에서 합성하였으며, 합성한 염기서열(서열번호 1)은 도 2에 제시되어 있다.

본 발명의 미세조류 형질전환은 전기천공에 의하여 벡터가 세포 안으로 들어간 후 PCR 산물의 양쪽 말단에 있는 NR 유전자 단편에 의하여 상동재조합 (homologous recombination)에 의하여 클로렐라의 염색체 DNA에 삽입된다. 이러한 목적으로 프로모터의 상류(upstream)에는 5' NR, 전사 터미테이터의 하류(downstream)에는 3' NR로 명기된 각각 988 bp와 1,000 bp의 DNA 절편을 포함하고 있다. 상기 NR 절편 염기서열은 한국등록특허 10-1985345에 개시되어 있다.

2. 클로렐라 불가리스( Chlorella vulgaris ) PKVL7422 배양

본 발명에서 사용한 클로렐라 불가리스 PKVL 7422로 명명되는 클로렐라 불가리스 균주는 빠른 성장과 쉬운 배양 및 암(dark) 조건에서 잘 자라는 특성을 가지고 있다. 클로렐라 불가리스 PKVL7422는 52 μmol photons/m²/s의 광원 및 BG-11 배지에서 20℃로 배양하였다.

3. 클로렐라 형질전환

클로렐라 불가리스 PKVL7422 균주를 BG-11 배지에서 약 15일간 배양하여 세포수가 1.0×10⁷ 세포/㎖이 되도록 한 후, 30 ㎖을 담아 2,700×g, 4℃, 45분간 원심분리하였다. 원심분리 후, 상층액을 제거하고 펠렛에 세포보존용액(0.2 M mannitol, 0.2 M sorbitol) 1㎖을 넣어 섞어준 뒤 1시간 동안 실온에서 배양하였다. 그 후, 3,300×g, 4℃, 10분간 원심분리하고 상층액을 제거한 후, 세포 펠렛에 전기천공(electrophoration) 용액(500 mM NaCl, 5 mM KCl, 5 mM CaCl₂, 20 mM Hepes, 200 mM mannitol, 200 mM sorbitol; pH 7.2) 1 ㎖을 넣어 섞어준 후, 도 1의 재조합 벡터, 또는 상기 재조합 벡터를 주형으로 하고 NRF(59) 프라미머 (5'-ATGGACAAGACAGGGTTCGG-3', 서열번호 4) 및 NRR(59) 프라미머(5'-AATACAGGCGGAGCCCAAAC-3', 서열번호 5) 세트로 증폭한 DNA 산물을 2~8 ㎍ 넣고 얼음에서 10분간 유지하였다. 벡터 DNA 또는 증폭 DNA를 혼합한 세포용액 1 ㎖을 전기천공용 큐벳에 옮긴 후 1.00kV, 400ohm의 조건에서 3~5초 동안 전기천공을 실시하였다. 전기천공된 세포용액 1 ㎖을 5 ㎖의 BG-11 배지와 섞은 후, 암 조건, 20℃에서 하루 저녁 배양하여 세포를 회복시켰다. 회복된 세포 용액 200 ㎕를 BG11의 변형 배지인 BGNK 고체배지 고르게 도말하고 빛이 들어가지 않게 알루미늄 포일 등으로 싼 후 20℃에서 15일간 배양하였다. 변형배지 BGNK는 표 2의 각 성분을 혼합하여 stock solution을 제작하여 고압증기멸균하여 사용하였다. 멸균된 stock solution을 1 L의 증류수에 1 ㎖식 넣은 후 NH₄Cl를 0.91 g, 클루코스를 5 g, KClO₃를 24.5 g 첨가하여 pH를 7.5로 조정한 뒤 고압증기멸균하였다. 멸균이 끝난 배지는 20℃ 이하로 배지가 식으면 사용하였으며, 고체배지를 제작하여 사용 시 한천(agar)의 함량은 0.7-1.0%로 조정하여 사용하였다.

4. 형질전환체의 확인

BGNK 배지에 자라난 콜로니를 선택 배지인 BGPK (BG-11, 0.5% Glucose, 150 mM KClO₃, 20 mM (NH₄)₂HPO₄) 액체배지 5 ㎖에 접종하고 20℃에서 일주일간 광 배양하였다.

고체배지에서 자라난 집락을 5 ㎖의 BGPK 배지에 접종하여 7일간 배양하고 배양액 1 ㎖을 취하여 5min plant DNA extraction kit (Biofactories)을 이용하여 DNA를 추출하였다. 삽입 유전자의 유무를 확인하기 위하여 VHSV 당단백질 유전자에 특이적인 GF 프라이머(5'-GCACCACATCACAGATCACC-3'; 서열번호 6)와 GR 프라이머(5'-ACTTCCGCGAGTAGAGGTCA-3'; 서열번호 7)로 PCR을 수행한 후, 염 유도 프로모터와 당단백질 유전자를 함께 증폭할 수 있는 Salt2 (5'-GTAAGGCTGTCGTTTGTCGC-3'; 서열번호 8) 프라이머와 GR+605 (5'-TTGTGCAAACGCCCTCAATG-3'; 서열번호 9) 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다.

PCR을 위한 DNA는 형질전환된 클로렐라 및 대조군(야생형 클로렐라)으로부터 (주)바이오니아의 유전자 추출시약을 이용하여 추출하였다. 약 1.0×10⁷ 세포/㎖의 농도로 자란 클로렐라 배양액 1 ㎖을 3,300×g로 10분간 원심분리한 후 상등액을 제거한 후 얻어진 세포 펠렛을 DNA 추출에 사용하였다. 추출된 DNA는 나노드롭을 이용하여 정량한 후 -20℃에서 보관하였다. PCR은 Geneall (한국)의 AmpONE HS taq premix 키트를 사용하여 실시하였다. Premix 10 ㎕가 들어 있는 튜브에 해당 프라이머를 각각 1 ㎕, 추출한 DNA 1 ㎕, 증류수 7 ㎕를 첨가한 후 PCR을 수행하였다. PCR 증폭 반응은 94℃에서 4분간 전변성시킨 후, 94℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 1분 30초로 이루어진 반응을 30회 실시하고, 74℃에서 10분간 반응시켜 수행하였고, PCR 산물은 1% 아가로스 겔에 전기영동하여 검사하였다.

5. Western blot을 통한 발현량 측정

형질전환 클로렐라가 5×10⁷ 세포/㎖로 성장하였을때 염을 최종 농도 300 mM로 처리하여 5일간 배양하여 5×10⁸ 세포/㎖로 성장시킨 뒤 단백질을 추출하여 발현과 발현량의 증대를 확인하였다. 농축한 세포 중 0.1 g을 취하여, 단백질 추출 완충액 [RIRA buffer (ELPIS BIOTECH) 800 ㎕, protease inhibitor cocktail 200 ㎕]을 1 ㎖ 넣고 얼음에서 30분간 반응 후 초음파 분쇄기(JY92-IIN, Korea Bio Tech, Korea)를 사용하여 400W, 2초 반응, 2초 휴식의 조건으로 5분간 초음파 분쇄를 진행하였고, Coomassie Plus(Bradford) Assay 키트 (Thermo, USA)를 이용하여 단백질 농도를 측정하였고, 총 단백질 농도는 1,500 ㎍/㎖였다. 5X SDS sample loading buffer를 넣은 뒤 총 단백질의 농도가 400 ㎍/㎖이 되도록 설정하고, 90℃에서 10분간 끓인 후 얼음 위에서 5분간 유지한 단백질을 10% SDS PAGE 겔에 로딩하고, Bio-Rad powerpac-HC를 이용하여 전기영동한 후 분리된 단백질들을 BIO-RAD사의 Immun-Blot^® PVDF 멤브레인으로 트랜스퍼 한 후, 블로킹, 1차 항체(자체제작, ABFrontier, Korea), 2차 항체(Goat anti-Rabbit IgG(H+L)-HRP conjugate, BIORAD, USA)를 처리하여 반응시키고, iBrightCL1000 (Invitrogen)을 이용하여 분석하였다.

6. 면역 유도를 위한 사료 첨가제의 생산

10 L의 BGPK가 들어간 바이오리엑터에 5×10⁸ 세포/㎖의 세포 배양액 100 ㎖넣어 초기 세포의 양이 5×10⁶ 세포/㎖이 되게 하여 2일간 배양하였다. 5×10⁷ 세포/㎖로 성장한 세포에 최종 농도 300 mM의 염을 처리한 후 5-7일간 배양하여 5×10⁸ 세포/㎖로 최종 성장시키고, 성장이 완료된 세포를 원심분리기를 이용하여 세포를 농축하여 세포의 무게와 동량의 PBS를 첨가하여 케이티사의 JY92-IIN 초음파분쇄기를 이용하여 400W에서 2초 처리 후, 2초 정지의 싸이클로 10분간 반복하여 초음파분쇄 하였다. 파쇄된 세포는 -80℃에서 1일간 동결 후 동결건조기를 이용하여 3일간 건조한 후 제품 개발에 이용하였다.

건조한 형질전환 클로렐라는 건조 전 클로렐라의 무게를 기준으로 상용의 넙치 사료무게의 5%(w/w)에 해당하도록 흡착시켰다. 흡착은 건조된 클로렐라 무게의 10배에 해당하는 PBS를 첨가한 후 넙치 사료(넵튠원 광어사료, 4호)와 20분간 잘 흡착되도록 섞어준 후 통풍이 잘 되는 그늘에서 2일간 건조시켜 수행하였다. 대조군으로는 형질전환하지 않은 야생형 클로렐라 불가리스 PKVL7422을 동일한 방법으로 상용의 넙치 사료에 흡착시킨 그룹과, 클로렐라 흡착 없이 상용의 사료만을 공급한 그룹을 이용하였다. 넙치는 거제에 위치하는 클로랜드 종묘장에서 구입하였으며 평균 체장 10.78 cm, 평균 체중 10.31 g 크기를 이용하였다. 구입 후 4주간 14-17℃에서 순치하며 먹이붙임 후 실험에 사용하였다.

7. 클로렐라 흡착사료 공급 및 바이러스 도전 감염

상용의 사료, 야생형 클로렐라 흡착사료, 형질전환 클로렐라 흡착사료 급이에 대하여 각각 15마리를 1반복으로 하는 3반복의 실험을 실시하였다. 사료는 넙치 체중의 5%에 해당하는 각각의 사료를 하루 2회로 나누어 공급하였으며, 흡착사료는 도 3에 표시한 바와 같이 1주일 간격으로 5일간 흡착사료를 공급하고 5주차에 VHSV 도전 감염을 실시하였다. 흡착사료를 공급하지 않는 동안에는 일반 사료를 공급하였으며, 도전 감염은 5.5×10⁵ PFU (Plaque Forming Unit)의 바이러스를 근육접종하였다. 접종한 넙치는 13~14℃에서 사육하면서 폐사율을 조사하였다.

8. 중화 항체 생성 조사

상용의 사료, 야생형 클로렐라 흡착사료, 형질전환 클로렐라 흡착사료 각 실험구에서 분리한 혈청을 중화항체시험을 통해 분석하여, VHSV 당 단백질에 대한 항체 생성 및 바이러스의 방어 능력을 확인하고자 하였다. 사료 공급 후 5주차에 바이러스 도전 감염을 진행하기 전, 각 그룹에서 5미 씩 무작위로 개체를 선정하여 혈액을 채취하고 혈청을 분리하였다.

EPC (Epithelioma Papulosum Cyprini) 세포를 96-웰 플레이트에 1×10⁵ 세포/well로 계수하여 Leibovitz medium (L-15, Sigma)에 10% FBS (fetal bovine serum, Biological Industries), Antibiotic Antimycotic 용액(Welgene)을 포함하는 배지로 28℃ 배양기에서 하루 배양한 뒤 25℃ 배양기와 20℃ 배양기에서 각각 하루씩 순치 후 실험에 사용하였다. 각 그룹에서 분리한 각 개체의 혈청은 56℃에 30분간 열-불활성화 한 뒤에 배지를 이용하여 1/2로 희석하여 사용하였고, 신선한 혈청(아무 처리를 하지 않은 넙치의 혈청)은 열처리하지 않고 배지를 이용하여 1/10로 희석하여 사용하였다. 각 개체의 혈청과 신선한 혈청을 1:1로 섞은 뒤, 배지를 이용하여 2^-1 ~ 2^-8으로 단계희석하였다. 단계희석 한 혈청에 1×10¹ PFU의 VHSV를 혈청과 동량인 60 ㎕씩 섞어 15℃에서 24시간 반응하였다. 15℃에서 24시간 반응 후, 20℃에 순치된 EPC 세포의 배지를 제거하고 혈청과 바이러스 반응액을 100 ㎕씩 접종한 뒤 15℃ 배양기에서 배양하면서 세포의 CPE (Cytopathic effect) 생성 유무를 관찰하였다.

실시예 1. 발현 단백질의 정량

농축 세포 0.1 g으로부터 총단백질이 1,500 ㎍ 추출되었고, 그 중 당단백질의 함량은 35.59 ㎍이였다. 즉, 농축 세포 1 g에 포함되어있는 당단백질은 355.9 ㎍으로 계산되었다. 10 L로 대량배양시 100 g의 세포를 획득할 수 있으며, 이 중 당단백질의 농도는 35.59 mg이다. 동결건조시 세포는 1/3로 무게가 감소함으로 동결건조 1 g 당 106.77 mg의 당단백질이 함유되어 있을 것으로 산출되었다.

실시예 2. 중화항체의 생성

도 4는 VHSV 당단백질을 발현하는 형질전환 클로렐라가 흡착된 사료를 공급한 넙치와 상용의 사료나 형질전환 시키지 않은 야생형의 클로렐라를 흡착시킨 사료를 공급한 넙치 개체에서 얻은 VHSV에 대한 중화항체 값을 보여준다. VHSV 당단백질을 발현하는 형질전환 클로렐라가 흡착된 사료를 공급한 넙치의 경우 다른 두 처리군과 비교하여 현저히 높은 항체가를 나타내었다. 이는 VHSV 당단백질을 발현하는 형질전환 클로렐라가 흡착된 사료를 공급함으로써 넙치의 체내에 VHSV에 대한 항체의 형성을 유도한다는 것을 제시한다.

실시예 3. 사료 첨가제에 의한 VHSV 감염 억제

도 5에 제시된 바와 같이 상용의 사료나 형질전환 시키지 않은 야생형 클로렐라를 흡착시킨 사료를 공급하고 VHSV를 도전 감염한 넙치의 경우 접종 5일후부터 폐사가 나타나 14일 후에는 60%의 폐사율을 보여주었다. 반면, VHSV의 당단백질을 발현하는 형질전환 클로렐라를 흡착시킨 사료를 먹인 후 VHSV를 도전 감염한 넙치의 경우 접종 11일째에 폐사가 나타나기 시작하였고, 접종 후 14일까지도 폐사율이 20%에 지나지 않았다. 상기 결과는 중화항체 형성 결과와 더불어 VHSV 당단백질을 발현하는 형질전환 클로렐라를 포함하는 사료를 공급하는 경우 VHSV에 대한 면역을 유도하여 이후의 VHSV 도전 감염에 대하여 넙치의 폐사를 감소시킬 수 있다는 것을 시사하였다.

<110> Pukyong National University Industry-University Cooperation Foundation <120> Feed additive composition for preventing or improving VHS comprising transgenic microalgae expressing VHSV G protein as effective component and uses thereof <130> PN20376 <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1524 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized VHSV G protein <400> 1 atggagtgga acaccttctt cctggtgatc ctggtgatca ttatcaagag caccacatca 60 cagatcacgc agcgcccacc ggtcgagaac atcagcacgt accacgtcga ctgggacacg 120 ccactgtaca ctcacccctc taactgcagg aagaactcct tcgttccgat tcggcctgat 180 cagctccgct gccctcacga gttcgaggac accaacaagg gcctggtcag cgtgcccgcc 240 cagattatcc acctgccgct gtccgtgacc agcgtctcgg cggtggcgaa cggccactac 300 ctgcaccggg tgacctaccg ggtcacgtgc tcgaccaatt tttttggggg ccagaccatt 360 gagaagacca tcctggaggc aaagctgtcc cgccaggagg ccatcaacga ggctggcaag 420 gatcatgagt acccgttctt ccccgagccc tcctgcatct ggatgaagga caacgtccac 480 aaggacatca cccactacta taagaccccc aagacagtga 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355 360 365 Tyr Asn Ser Ala Gln Tyr Lys Thr Val Asn Asn Ile Trp Lys Ser Trp 370 375 380 Asn Arg Ile Asp Asn Asn Thr Asp Gly Tyr Asp Gly Met Ile Phe Gly 385 390 395 400 Asp Lys Leu Ile Ile Pro Asp Ile Glu Lys Tyr Gln Ser Ile Tyr Asp 405 410 415 Ser Gly Met Leu Val Gln Arg Asn Gln Val Glu Ile Pro His Pro Ser 420 425 430 Ile Val Phe Val Ser Asn Thr Ser Asp Leu Ser Thr Asn Tyr Ile His 435 440 445 Thr Asn Leu Ile Pro Ser Asp Trp Ser Phe Asn Trp Ser Leu Trp Pro 450 455 460 Ser Leu Ser Gly Met Gly Val Val Gly Gly Ala Leu Leu Leu Leu Val 465 470 475 480 Leu Cys Cys Cys Cys Arg Ala Ser Pro Pro Pro Pro Ser Tyr Gly Ile 485 490 495 Pro Met Gln Gln Phe Ser Arg Ser Gln Met Val 500 505 <210> 3 <211> 1174 <212> DNA <213> Chlorella vulgaris <400> 3 cggctgacaa agatgagcga gaagccgatg tcaggttggt tgctgctctc agcctctggg 60 caggctgggc tatgcagtgt gtggtcgtgt gcgctgctgg ggcggtccag cccacttagc 120 ttgctttagc ttgtacccag gtggcctagg cactccacaa tgctgtcgtt cacttgtctc 180 atccccttct gtgctctgcc cgcccggcgc ttgcagctgc 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Claims (5)

1. VHSV (Viral hemorrhagic septicemia virus) 당단백질을 발현하는 형질전환 미세조류를 유효성분으로 포함하는 바이러스성출혈성패혈증(Viral hemorrhagic septicemia)의 예방 또는 개선용 사료첨가제 조성물.
2. VHSV (Viral hemorrhagic septicemia virus) 유래 당단백질을 발현하는 형질전환 미세조류를 유효성분으로 포함하는 바이러스성출혈성패혈증(Viral hemorrhagic septicemia)의 예방 또는 치료용 백신 조성물.
3. 제2항에 있어서, 상기 VHSV 당단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
4. 제2항에 있어서, 상기 형질전환 미세조류는 클로렐라(Chlorella), 세네데스무스(Scenedesmus), 두날리엘라(Dunaliella), 스피룰리나(Spirulina), 난노클로롭시스(Nannochloropsis), 테트라셀미스(Tetraselmis), 케토세로스(Chaetoceros), 안키스트로데스무스(Ankistrodesmus) 및 헤마토코커스 플루비아리스(Heamatococcus pluvialis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
5. 제1항의 사료첨가제 조성물을 배합한 어류용 사료조성물.

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