KR20220080493A - 신규한 바실러스 서브틸리스 균주 및 이를 이용하여 발효한 생강의 기능성 - Google Patents
신규한 바실러스 서브틸리스 균주 및 이를 이용하여 발효한 생강의 기능성 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 바실러스 서브틸리스 균주를 이용한 생강 발효물의 제조방법 및 상기 제조방법으로 제조된 생강 발효물에 관한 것이다. 본 발명은 생육이 우수한 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) CMIN-4 균주를 선발하고, 본 균주를 적용한 생강 발효물은 세포 보호활성이 비첨가 및 표준균주와 유사하거나 더 우수하며, 항산화 성분 및 항산화 활성이 우수하므로 항산화용 식품으로 활용이 가능하다.
Description
본 발명은 신규한 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) CMIN-4 균주, 이를 이용한 생강 발효물의 제조방법 및 상기 제조방법으로 제조된 생강 발효물에 관한 것이다.
생강(Zingiber officinale Roscas)은 말레이시아와 인도 등의 열대아시아 지역이 원산지로 추정되며, 생강과에 속하는 다년생 초본식물로 동남아시아 등지에 광범위하게 분포되어 있으며 근경을 주로 식용으로 사용하며 독특한 매운맛과 향기를 지닌 향신료이다. 생강의 국내 생산량은 2014년 기준 약 3만2천여 톤으로 전체 조미 채소 중 약 1.3%에 불과하지만, 시장 규모는 2,000억원 정도로 재배 면적과 생산 농가 수에 비하면 수익성 높은 고소득 작물이다. 국내 생강 식품 산업은 흙 묻은 생강이나 껍질을 깐 생강으로 유통되는 비율이 전체 매출액의 50%를 차지하고 있으며 냉장형 생강 다대기가 40%로 나머지 10% 만을 일반 생강 가공제품이 차지하고 있다.
생강은 한약처방에 있어서 대부분의 약재로 쓰이고 있을 정도로 다양한 약효를 나타내며 사용하는 방법도 다양하고, 민간요법에서 위통, 멀미, 구토, 간질, 인후통, 기침, 타박상, 상처, 해산, 안질환, 간장병, 류머티즘, 근육통, 백선, 천식, 발열, 악성종양 및 종기 등의 치료에 이용하고 있으며, 혈소판응집 억제 효과, 혈액응고를 막는 효과와 혈관을 확장하는 효과와 함께 항암 효과 등 다양한 약리 효과를 나타낸다.
생강의 주요 활성 성분으로는 정유성분(essential oil)과 매운맛 성분을 함유하고 있는 올레오레진(oleoresin) 성분이 보고되어 있다. 정유 성분은 감기, 두통, 관절염 및 정신적 치료에 효과적이다.
이 중에서도 특히, 생강 특유의 맛을 내는 올레오레진은 여러 동족체의 혼합물로 존재하며, 이 중 6-진저롤(6-Gingerol) 및 6-쇼가올(6-Shogaol)은 항균 작용, 항염 작용, 혈청 콜레스테롤 저하 효과, 항산화 작용이 있어 건강식품소재로 지속적인 주목을 받고 있다. 국내에서는 대부분 생강 뿌리를 목적으로 재배되기 때문에 생강의 지상부인 잎과 줄기는 유용하게 활용되지 못하고 있지만, 이화학적(수분, 조단백, 조지방, 탄수화물, 조섬유, 조회분 등) 분석, Catechin류 분석, 기능성 성분 진저롤(Gingerol) 분석에 있어서 생강 뿌리 못지않게 높은 활성을 보인다.
경제성장과 국민소득의 증대에 따라 건강과 장수에 대한 관심이 빠르게 증대되고 있으며, 안전한 먹거리 확보에 대한 관심도 고조되고 있다. 따라서 유용생리활성을 가지면서 부작용이 없는 천연물 유래의 활성물질 탐색에 연구가 집중되고 있으며, 특히 천연 식물자원을 대상으로 항균, 항노화, 성인병 예방, 면역증강, 항산화 효과 등에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으며 생강 또한 마찬가지이다. 그러나, 생강은 성분 중 전분이 전체의 40-60%를 차지하고 있고, 섬유질의 함량도 다른 향신료보다 높기 때문에 착즙 수율이 낮을 뿐만 아니라 착즙 중 대부분의 전분이 착즙액에 잔존하고 있어 생강을 가공식품으로 활용하는데 있어 난점이 있으며, 이에 전분을 분해시켜 제거하는 방법 등의 기술 개발이 요구되고 있다.
바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)는 흔히 '고초균'으로 불리는 세균으로, 주로 토양 속에서 서식하는 바실러스 속에 속하는 균으로서 그람 양성(gram positive)의 아포 형성 균이다. 바실러스 서브틸리스는 산소를 좋아하는 호기성 미생물로서, 주모성 편모를 가지고 운동을 하며, 아포(spore)는 난원형이고 중앙에 위치하고 있다. 바실러스 서브틸리스는 프로테아제(protease, 단백질 분해효소), 아밀라아제(amylase, 전분 분해효소) 및 셀룰라아제(cellulase, 섬유소 분해효소) 등을 분비하는 능력을 가지고 있어서 산업적으로 널리 이용되고 있으며, 유전공학분야에서 대장균(E.coli)과 더불어 재조합 DNA 기술의 플라스미드(plasmid)로써 가장 많이 이용되고 있는 세균이다. 또한 우리나라에서는 청국장의 발효능이 있는 미생물로서 연구개발되고 있으며, 기타 여러 미생물 제제로서도 이용되고 있다.
바실러스는 다른 미생물과 구별되는 많은 장점을 지니고 있어서, 최근에 많은 각광을 받고 있다.
첫째, 포자를 형성함으로써 강한 위산에 대한 내산성을 가져 장에 도달할 때까지 활성을 유지할 수 있으며, 내열성을 지니고 있어 80℃ 이상 고온에서 제조하는 펠렛사료 제조시 생존이 가능하기 때문에 사료에 첨가하는 것이 용이하다.
둘째, 바실러스 속은 넓은 항균범위와 다양한 구조를 지니는 박테리오신이나 BLS(bacteriocin-like substances)를 생산한다. 저분자 항균 펩타이드는 생합성 기작에 따라 리보솜 펩타이드(ribosome peptide)와 비리보솜 펩타이드(nonribosomal peptide)로 구분이 되는데, 90% 이상이 비리보솜 펩타이드 항생제이다. 비리보솜 펩타이드에는 서팩틴(surfactin), 이투린그룹(iturin group), 펜기신(fengycin), 그래미시딘(gramicidins), 티로시딘(tyrocidine) 및 바시트라신(bacitracin)이 속하고, 항생 및 항진균 활성이 있으며 현재까지 약 10여 종의 리포펩타이드(lipopeptide)가 분리되어 그 구조가 확인되어 있다. 주로 그람 양성균의 생육을 저해할 수 있는 유산균 생산 박테리오신과 달리, 바실리스가 생산하는 박테리오신은 그 항균 활성 범위가 매우 넓고 다양한 특성을 지닌다. 그러나, 바실러스 속에서 생산된 박테리오신에 관한 관심은 유산균에서 유래한 박테리오신보다 상대적으로 미흡하다.
셋째, 바실러스 균주들이 생산하는 중요한 산물인 프로테아제, 아밀라아제, 셀룰라아제, 글루카나아제(glucanases, 글루칸 소화효소) 등은 산업계에서 필요로 하는 효소의 공급원이며, 특히 가축 사료에 첨가하는 경우 사료효율 개선, 악취발생 억제 등의 효과를 발휘할 수 있다.
넷째, 장류 발효 등 식품제조에 이용되고 있기 때문에 안전성이 확립되어 있다.
이에 신규한 바실러스 서브틸리스 균주를 발굴하고, 이를 생강 농축액에 첨가하여 세포 보호활성이 비첨가 및 표준균주보다 우수하며 항산화 활성이 우수한 생강 발효물을 제조하고자 본 연구를 실시하였다.
본 발명의 목적은 생육이 우수하고 세포 보호활성이 우수하며, 항산화 성분 및 항산화 활성이 우수한 생강 발효물의 제조방법 및 상기 방법을 이용하여 제조된 생강 발효물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
수탁번호 KACC 81139BP로 기탁된 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) CMIN-4 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 생강 농축물을 제조하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 생강 농축물에 수탁번호 KACC 81139BP로 기탁된 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) CMIN-4 균주를 접종하여 생강 발효물을 제조하는 단계;를 포함하는, 생강 발효물의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 생강 발효물을 제공한다.
본 발명은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) CMIN-4 균주 및 상기 균주를 이용한 생강 발효물의 제조방법에 관한 것이다, 구체적으로, 본 발명자들은 생육이 우수한 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) CMIN-4 균주를 선발하고, 본 균주를 적용한 생강 발효물은 세포 보호활성이 비첨가 및 표준균주와 유사하거나 더 우수하며, 항산화 성분 및 항산화 활성이 우수한 생강 발효물을 제조할 수 있음을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 생강 발효물의 제조방법 및 그러한 제조방법에 의하여 제조한 생강 발효물은 항산화용 식품으로 활용이 가능한 이점이 있다.
도 1은 바실러스 서브틸리스 CMIN-4 및 근연종들의 16S 염기서열을 이용하여 작성한 계통도이다.
도 2는 생강 농축물에서 바실러스 균주를 첨가하여 배양한 후, 흡광도를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 생강 농축물에서 배양기간에 따른 바실러스 균주의 생육 변화를 나타내는 그래프이다.
도 4는 생강 발효물이 대식세포의 생존율에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
도 5는 생강 발효물의 산화 자극으로부터 대식세포를 보호하는 효과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 생강 농축물에서 바실러스 균주를 첨가하여 배양한 후, 흡광도를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 생강 농축물에서 배양기간에 따른 바실러스 균주의 생육 변화를 나타내는 그래프이다.
도 4는 생강 발효물이 대식세포의 생존율에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
도 5는 생강 발효물의 산화 자극으로부터 대식세포를 보호하는 효과를 나타내는 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
한편, 본 발명의 실시 형태는 여러가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시 형태로 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 실시 형태는 당해 기술분야에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다. 나아가, 명세서 전체에서 어떤 구성요소를 포함한다는 것은 특별히 반대되는 기재가 없는 한, 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있다는 것을 의미한다.
본 발명은
수탁번호 KACC 81139BP로 기탁된 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) CMIN-4 균주를 제공한다.
상기 균주는 생육, 세포 보호활성 및 항산화 활성으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상이 우수하다.
상기 균주는 생강 발효물 제조용일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은,
1) 생강 농축액을 제조하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 생강 농축액에 수탁번호 KACC 81139BP로 기탁된 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) CMIN-4 균주를 접종하여 생강 발효물을 제조하는 단계;를 포함하는, 생강 발효물의 제조방법을 제공한다.
상기 단계 2)의 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) CMIN-4 균주를 접종한 후, 1일 내지 5일 동안 정치배양할 수 있고, 바람직하게는 1일 내지 4일 동안 정치배양할 수 있고, 더욱 바람직하게는 2일 내지 4일 동안 정치배양할 수 있고, 더욱 바람직하게는 2일 내지 3일 동안 정치배양할 수 있고, 가장 바람직하게는 3일 동안 정치배양할 수 있다.
또한, 상기 단계 2)의 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) CMIN-4 균주를 접종한 후, 10 내지 50℃에서 정치배양할 수 있고, 바람직하게는 15 내지 45℃에서 정치배양할 수 있고, 더욱 바람직하게는 20 내지 40℃에서 정치배양할 수 있고, 더욱 바람직하게는 25 내지 35℃에서 정치배양할 수 있고, 가장 바람직하게는 30℃에서 정치배양할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) CMIN-4 균주는 생육이 우수하고, 산화 자극에 대한 생강 발효물의 대식세포 보호 효과가 우수하며, 생강 발효물의 항산화 성분 및 항산화 활성이 우수하여 국립농업과학원(농업유전자원센터; KACC)에 2020년 10월 15일자로 기탁하여 수탁번호 KACC 81139BP를 부여받았다.
또한, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) CMIN-4 균주를 이용하여 생강 발효물을 제조한 결과, 생육이 우수하고, 세포 보호활성이 균 무첨가 및 표준균주 발효물과 유사하거나 더 우수하며, 항산화 성분 및 항산화 활성이 우수한 생강 발효물을 제조할 수 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) CMIN-4 균주는 생강 발효물 제조에 유용하게 사용될 수 있고, 상기 균주를 이용한 생강 발효물의 제조방법을 통해 생육이 우수하고, 세포 보호활성이 우수하며, 항산화 성분 및 항산화 활성이 우수한 생강 발효물을 제조할 수 있다.
이하, 본 발명의 실시예 및 실험예를 하기에 구체적으로 예시하여 설명한다. 다만, 후술하는 실시예 및 실험예는 본 발명의 일부를 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 생강 발효물 제조를 위한 균주 선발
<1-1> 샘플 수집 및 바실러스 서브틸리스 분리 및 선발
전국 각지에서 다양한 식물 및 한국 전통 발효 식품을 확보하여 0.85% 살린 용액(saline buffer)에 연속 단계 희석한 다음, R2A 고체 배지에 도말하여 28℃에서 2일간 배양하여 단일 균락을 분리하였다. 분리한 각각의 균락들은 R2A 고체 배지에 획선 도말하여 28℃에서 2-5일간 배양하여 바실러스 형태의 균주들을 분리하였다.
<1-2> 16S 서열 분석 결과
분리된 균주들을 동정하기 위하여 다음과 같이 분자생물학적 동정을 실시하였다. 분리된 균주를 GenoTech Corp.(Genotech, Daejeon, Korea)에 의뢰하여 universal primer인 518F(5'-CCA GCA GCC GCG GTA ATA CG-3')와 800R(5'-TAC CAG GGT ATC TAA TCC-3')을 이용하여 partial 16S rRNA gene의 염기서열을 분석하였다. 분석을 통해 얻은 CMIN-4 균주의 서열번호 1의 염기서열은 NCBI genbank에서 Blast search를 통해 등록된 표준 균주들과 서열의 유사성을 확인하였다. 계통 분석 결과, Bacillus subtilis 사이에서 계통적으로 명확히 구별할 수 없으나, CMIN-4 균주는 Bacillus subtilis subsp. subtilis 표준균주와 1bp 차이를 보이며, 99.93%로 가장 유사하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.
<1-3> 선발한 균주의 생화학적 활성 분석
CMIN-4 균주의 생화학적 활성 분석을 위하여 API Zym kit를 이용하여 CMIN-4 균주의 효소 활성능을 분석하였고, 그 결과를 표 1에 나타내었다.
| 효소 | 활성 | 효소 | 활성 |
| Alkaline phosphatase | + | Naphthol-AS-BI-phosphohydrolase | + |
| esterase (C4) | + | α-galactosidase | - |
| esterase lipase (C8) | + | β-galactosidase | - |
| lipase (C14) | - | β-glucuronidase | - |
| leucine arylamidase | - | α-glucosidase | + |
| valine arylamidase | - | β-glucosidase | + |
| cystine arylamidase | - | N-acetyl-β-glucosaminidase | - |
| Trypsin | - | α-mannosidase | - |
| α-chymotrypsin | - | α-fucosidase | - |
| acid phosphatase | w | - |
<1-4> 선발한 균주의 탄소원 이용 특성 분석
상기 선발한 균주가 다양한 종류의 탄소원을 이용하는지 여부를 조사하기 위해 다양한 탄소원(Glycerol, Erythritol, D-Arabinose, L-Arabinose, D-Ribose, D-Xylose, L-Xylose, D-Adonitol, Methyl-D-Xylopyranoside, D-Galactose, D-Glucose, D-Fructose, D-Manose, L-Sorbose, L-Rhamnose, Dulcitol, Inositol, D-Manitol, D-Sorbitol, Metyl-αD-Mannopyranoside, Metyl-αD-Glucopyranoside, N-Acetylglucosamine, Amygdalin, Arbutin, Esculin, ferric citrate, Salicin, D-Cellobiose, D-Maltose, D-Lactose, D-Melibiose, D-Saccharose (sucrose), D-Trehalose, Inulin, D-Melezitose, D-Raffinose, Amidon (starch), Glycogen, Xylitol, Genitobiose, D-Turanose, D-Lyxose, D-Tagatose, D-fucose, L-fucose, D-Arabitol, L-Arabitol, Potassium gluconate, Potassium 2-ketogluconate, Potassium 5-ketogluconate)을 첨가하여 생육 특성을 조사하였다. 그 결과를 표 2에 나타내었다.
| 탄소원 | 활성 | 탄소원 | 활성 |
| Glycerol | + | Salicin | + |
| Erythritol | - | D-Cellobiose | + |
| D-Arabinose | - | D-Maltose | + |
| L-Arabinose | + | D-Lactose | - |
| D-Ribose | + | D-Melibiose | + |
| D-Xylose | + | D-Saccharose (sucrose) | + |
| L-Xylose | - | D-Trehalose | + |
| D-Adonitol | - | Inulin | + |
| Methyl-D-Xylopyranoside | - | D-Melezitose | - |
| D-Galactose | - | D-Raffinose | - |
| D-Glucose | + | Amidon (starch) | + |
| D-Fructose | + | Glycogen | + |
| D-Manose | + | Xylitol | - |
| L-Sorbose | - | Genitobiose | + |
| L-Rhamnose | - | D-Turanose | + |
| Dulcitol | - | D-Lyxose | - |
| Inositol | + | D-Tagatose | - |
| D-Manitol | + | D-fucose | - |
| D-Sorbitol | + | L-fucose | - |
| Metyl-αD-Mannopyranoside | - | D-Arabitol | - |
| Metyl-αD-Glucopyranoside | - | L-Arabitol | - |
| N-Acetylglucosamine | + | Potassium gluconate | + |
| Amygdalin | + | Potassium 2-ketogluconate | - |
| Arbutin | + | Potassium 5-ketogluconate | - |
| Esculin, ferric citrate | + | - |
본 발명의 균주를 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) CMIN-4로 명명하고, 국립농업과학원(농업유전자원센터; KACC)에 2020년 10월 15일자로 기탁하여 수탁번호 KACC 81139BP를 부여받았다.
<실시예 2> 생강농축액에서 생육이 우수한 바실러스 서브틸리스 선발
<2-1> 생강 농축액에서 생육이 우수한 균주 선발
바실러스 서브틸리스를 비롯한 바실러스 표준균주 2균주와 식물 및 한국 전통발효식품에서 분리한 45종의 바실러스 균주를 흡광도 측정이 가능한 조건을 맞추기 위해, 증류수를 동량 넣어 희석한 생강농축액에 접종하여, 흡광도를 측정하였다. 생강농축물 희석액 1 mL에 바실러스 현탁액 10 ㎕를 첨가하여 30℃에서 호기적으로 2일간 정치 배양하였다. 배양액을 현탁한 후, 흡광도 측정기(Spectrophotometer)를 이용하여 600 nm에서 흡광도를 측정하였다.
측정 결과, 대부분의 바실러스 균주 접종액에서 흡광도가 증가하였으며, 비첨가군은 0.20, 표준균주는 평균적으로 0.58, 분리한 45균주는 평균적으로 0.54 증가하였으며, 이 가운데, CMIN-4 균주는 0.75로 다른 바실러스 균주보다 높은 생육 증가량을 보였다. 이를 근거로 생강농축물에 첨가 발효할 수 있는 균주로 바실러스 서브틸리스 CMIN-4 균주를 최종 선발하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.
<2-2> 생강 농축물에 접종한 균의 생육 변화
바실러스 서브틸리스 CMIN-4 균주 접종 후, 배양 기간에 따른 생강 발효물 내 생균수 변화를 확인하기 위해, 바실러스 서브틸리스 CMIN-4 균주 및 표준균주를 접종 후, 생균수 변화를 확인하였다. 생강 농축물 75 mL에 바실러스 현탁액 50 ㎕을 접종하여, 초기 생균수를 104 CFU/mL이 되도록 한 후, 30℃에서 호기적으로 3일간 정치배양 하였다.
발효 초기에는 표준균주 바실러스 서브틸리스 KACC 10854T의 생육 속도가 바실러스 서브틸리스 CMIN-4 균주보다 빠르게 진행되나, 2일차 이후, CMIN-4 균주의 생육 속도가 급격히 증가하여, 배양 3일차에는 1010 CFU/mL 가까이 도달하였다. 3일차 이후부터 CMIN-4 균주 및 KACC 10854T 균주 모두 내생포자를 형성하여 배양을 종료하였고, 최적 배양 기간을 72시간으로 판단하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.
<실험예 1> 산화 자극에 대한 생강 발효물의 대식세포 보호 효과
본 발명의 바실러스 서브틸리스 CMIN-4 균주의 산화자극으로부터 대식세포 보호 효과를 측정하기 위하여 먼저 한국세포주은행으로부터 분양받은 마우스 유래 대식세포주인 RAW264.7 세포는 10% fetal bovine serum(FBS), 1% penicillin-streptomycin이 첨가된 Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
산화 자극에 대한 생강 발효물의 대식세포 보호 효과를 알아보기 위하여 RAW264.7 세포를 96 well plate에 최종농도 2×105 cells/mL가 되도록 분주한 뒤 24시간 배양하였다. 바실러스 서브틸리스 CMIN-4 균주와 바실러스 서브틸리스 KACC 10854T(표준균주)로 30℃, 48시간 발효시킨 생강 발효물을 멸균(121℃, 15분) 후 0.45 μm 멤브레인 필터하였다. 각 시료를 전체 세포배양액의 10%, 20%를 처리하고, 1시간 후 0.75 mM H2O2를 첨가하여 24시간 배양하였다. 반응 종료 후 Ez-Cytox 시약 20 μL를 넣어 4시간 반응시키고 480 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율은 대조군에 대한 생존율로 나타내었다.
생강 발효물이 RAW264.7 세포의 생존율에 미치는 영향을 분석한 결과, 생강 발효물을 세포배양액의 10% 농도로 처리하였을 때 세포독성을 보이지 않았다. 그러나 생강 발효물을 20% 농도로 처리했을 때에는 세포생존율이 감소하였다. 즉, 발효하지 않은 생강(none fermentation; NF)의 세포생존율은 80.79%, 바실러스 서브틸리스 CMIN-4 균주 처리군은 73.96.%, 표준균주 처리군은 78.98%로 감소하였다. 이에 본 발명에서는 산화 자극으로부터 대식세포 보호 효과 확인을 위한 생강 발효물의 농도를 전체 배양액의 10%로 결정하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.
산화 자극으로부터 생강 발효물의 RAW264.7 세포 보호 효과를 조사하기 위해 각 시료를 세포배양액의 10% 처리하여 1시간 미리 배양한 다음 0.75 mM H2O2를 첨가하여 24시간 배양 후 세포 생존율을 확인하였다. 그 결과, H2O2 처리군의 세포생존률은 51.92%로 감소되었고, 균 무처리 생강농축액(NF) 처리군은 54.77%, 바실러스 서브틸리스 CMIN-4 균 접종 생강발효물은 58.85.%, 표준균주를 접종한 생강농축액은 60.98%로 세포 생존율이 증가되었다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.
상기 결과로 본 발명의 바실러스 서브틸리스 CMIN-4 균주를 접종 배양한 생강농축액이 산화 자극으로부터 대식세포를 보호하는 효과가 표준균주인 바실러스 서브틸리스 KACC 10854T를 이용했을 때와 유사한 활성을 보임을 알 수 있었다.
<실험예 2> 생강 발효물의 항산화 성분 및 항산화 활성 측정
<2-1> 시료 제조
생강 농축액 (고형분 3% 이상)에 동량의 증류수를 넣고 희석한 후, 희석액 1 ml에 바실러스 서브틸리스 표준균주(10854-1) 및 신규 균주(CMIN-4) 현탁액 10 μl를 첨가, 배양한 것을 시료로 사용하였다.
<2-2> 바실러스 서브틸리스로 발효한 생강 농축액의 총 폴리페놀 함량 측정
여과지(Watman No.2)로 여과한 액 100 μL에 2% Na2CO3 용액 2 mL를 가하고 3분간 방치한 후, 50% Folin-Ciocalteu reagent 100 μL를 가한 후 혼합하여 30분간 실온에서 정치한 다음 Microplate Reader를 이용하여 750 nm에서 흡광도 값을 측정하였다. 표준물질로는 gallic acid를 이용하였고 시료와 동일한 방법으로 시험하고 얻은 표준곡선으로부터 환산하여 정량하였다.
그 결과를 표 3에 나타내었다.
| 종류 | 총 폴리페놀 함량 (mg/100ml) |
| NF | 50.05±0.61b2) |
| KACC 10854T | 106.24±1.52a |
| CMIN-4 | 108.63±1.58a |
NF: 균 무처리 생강 농축액
KACC 10854T: 표준균주
CMIN-4: 신규 균주
Duncan's multiple range test에 따라 2)의 의미는 p<0.05에서 서로 확연한 차이가 존재하는 것을 의미한다.
표 3을 참조하면, 균 무처리 생강 농축액과 비교하여 KACC 10854T(표준균주)를 첨가, 배양한 경우에 총 폴리페놀 함량이 약 2.1배 증가한 것을 알 수 있으며, CMIN-4 균주를 첨가, 배양한 경우에는 KACC 10854T(표준균주)를 첨가, 배양한 생강 농축액과 유사하거나 더 많은 폴리페놀 함량을 나타내는 것을 알 수 있었다.
<2-3> 바실러스 서브틸리스로 발효한 생강 농축액의 총 플라보노이드 함량 측정
여과지(Watman No.2)로 여과한 액 250 μL에 증류수 1 mL와 5% NaNO2 75 μL를 가한 후 5분 동안 실온에서 방치하였다. 이후 10% AlCl3·6H2O 150 μL를 가하고 6분간 방치한 후 1 M NaOH 500 μL를 넣고 혼합한 후 11분간 정치시켰다. 반응액의 흡광도 값은 Microplate Reader를 이용하여 510 nm에서 측정하였다. 표준물질로는 (+)-catechin hydrate를 사용하여 표준곡선을 작성한 후, 총 플라보노이드 함량을 시료 mg당 100mL로 나타냈다.
그 결과를 표 4에 나타내었다.
| 종류 | 총 플라보노이드 함량 (mg/100ml) |
| NF | 10.92±0.25c2) |
| KACC 10854T | 22.15±0.35b |
| CMIN-4 | 23.30±0.21a |
NF: 균 무처리 생강 농축액
KACC 10854T: 표준균주
CMIN-4: 신규 균주
Duncan's multiple range test에 따라 2)의 의미는 p<0.05에서 서로 확연한 차이가 존재하는 것을 의미한다.
표 4를 참조하면, 균 무처리 생강 농축액과 비교하여 KACC 10854T(표준균주)를 첨가, 배양한 경우에 총 플라보노이드 함량이 약 2.0배 증가한 것을 알 수 있으며, CMIN-4 균주를 첨가, 배양한 경우에는 KACC 10854T(표준균주)를 첨가, 배양한 생강 농축액과 유사하거나 더 많은 플라보노이드 함량을 나타내는 것을 알 수 있었다.
<2-4> 바실러스 서브틸리스로 발효한 생강 농축액의 DPPH radical scavenging activity를 통한 항산화능 측정
여과지(Watman No.2)로 여과한 액 50 μL에 0.2 mM DPPH용액 1 mL를 넣고 30분 동안 상온에서 방치한다. Microplate Reader를 이용하여 520 nm에서 흡광도의 감소치를 측정하여 AEAC(L-ascorbic acid equivalent antioxidant capacity)로 나타내었다. 항산화 성분 및 항산화 활성은 표준균주 및 신규 균주를 접종한 시료의 경우 희석배수 2를 곱하여 계산하였다.
그 결과를 표 5에 나타내었다.
| 종류 | DPPH radical scavenging activity (μg AA eq/100 ml) |
| NF | 18.50±0.22c2) |
| KACC 10854T | 31.37±0.85b |
| CMIN-4 | 34.23±0.58a |
NF: 균 무처리 생강 농축액
KACC 10854T: 표준균주
CMIN-4: 신규 균주
Duncan's multiple range test에 따라 2)의 의미는 p<0.05에서 서로 확연한 차이가 존재하는 것을 의미한다.
표 5를 참조하면, 균 무처리 생강 농축액과 비교하여 KACC 10854T(표준균주)를 첨가, 배양한 경우에 DPPH radical scavenging activity가 약 1.7배 증가한 것을 알 수 있으며, CMIN-4 균주를 첨가, 배양한 경우에는 KACC 10854T(표준균주)를 첨가, 배양한 생강 농축액과 유사하거나 더 높은 DPPH radical scavenging activity를 나타내기 때문에, 항산화 활성이 우수함을 알 수 있었다.
<2-5> 바실러스 서브틸리스로 발효한 생강 농축액의 ABTS radical scavenging activity를 통한 항산화 활성 측정
여과지(Watman No.2)로 여과한 액에 7 mM ABTS(2,2'-Azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid))와 2.45 mM potassium persulfate를 암소에서 12-16시간 동안 방치하여 ABTS radical 양이온을 형성시킨 후, 734 nm에서 Microplate Reader를 이용하여 흡광도 값이 1.4-1.5가 되도록 희석하였다. 희석한 ABTS·+ 용액 1 mL에 추출물 50 μL를 넣고 30분간 상온에서 방치한다. 이후 흡광도의 감소치를 측정하여 AEAC로 나타내었다. 표준균주 및 신규 균주를 접종한 시료의 경우 희석배수 2를 곱하여 계산하였다.
그 결과를 표 6에 나타내었다.
| 종류 | ABTS radical scavenging activity (μg AA eq/100 ml) |
| NF | 15.34±0.61b2) |
| KACC 10854T | 31.53±1.60a |
| CMIN-4 | 31.29±1.42a |
NF: 균 무처리 생강 농축액
KACC 10854T: 표준균주
CMIN-4: 신규 균주
Duncan's multiple range test에 따라 2)의 의미는 p<0.05에서 서로 확연한 차이가 존재하는 것을 의미한다.
표 6을 참조하면, 균 무처리 생강 농축액과 비교하여 KACC 10854T(표준균주)를 첨가, 배양한 경우에 ABTS radical scavenging activity가 약 2.1배 증가한 것을 알 수 있으며, CMIN-4 균주를 첨가, 배양한 경우에는 KACC 10854T(표준균주)를 첨가, 배양한 생강 농축액과 유사하거나 더 높은 ABTS radical scavenging activity를 나타내기 때문에, 항산화 활성이 우수함을 알 수 있었다.
결국, 생강 농축물에 첨가하여 생육이 우수한 바실러스 서브틸리스 CMIN-4 균주를 선발하였고, 본 균주를 이용하여 제조한 생강발효물의 세포 보호 활성이 균 무첨가 및 표준균주 발효물과 비교하여 유사하거나 더 우수한 것을 특징으로 하며, 항산화 성분 및 항산화 활성이 우수함을 확인할 수 있었다.
이상, 본 발명을 바람직한 제조예, 실시예 및 실험예를 통해 상세히 설명하였으나, 본 발명의 범위는 특정 실시예에 한정되는 것은 아니며, 첨부된 특허청구범위에 의하여 해석되어야 할 것이다. 또한, 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 범위에서 벗어나지 않으면서도 수정과 변형이 가능함을 이해하여야 할 것이다.
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 16S rRNA
<400> 1
ctcaggacga acgctggcgg cgtgcctaat acatgcaagt cgagcggaca gatgggagct 60
tgctccctga tgttagcggc ggacgggtga gtaacacgtg ggtaacctgc ctgtaagact 120
gggataactc cgggaaaccg gggctaatac cggatggttg tttgaaccgc atggttcaaa 180
cataaaaggt ggcttcggct accacttaca gatggacccg cggcgcatta gctagttggt 240
gaggtaacgg ctcaccaagg cnacgatgcg tagccgacct gagagggtga tcggccacac 300
tgggactgag acacggccca gactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttccgcaatg 360
gacgaaagtc tgacggagca acgccgcgtg agtgatgaag gttttcggat cgtaaagctc 420
tgttgttagg gaagaacaag taccgttcga atagggcggt accttgacgg tacctaacca 480
gaaagccacg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttgtc 540
cggaattatt gggcgtaaag ggctcgcagg cggtttctta agtctgatgt gaaagccccc 600
ggctcaaccg gggagggtca ttggaaactg gggaacttga gtgcagaaga ggagagtgga 660
attccacgtg tagcggtgaa atgcgtagag atgtggagga acaccagtgg cgaaggcgac 720
tctctggtct gtaactgacg ctgaggagcg aaagcgtggg gagcgaacag gattagatac 780
cctggtagtc cacgccgtaa acgatgagtg ctaagtgtta gggggtttcc gccccttagt 840
gctgcagcta acgcattaag cactccgcct ggggagtacg gtcgcaagac tgaaactcaa 900
aggaattgac gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcga 960
agaaccttac caggtcttga catcctctga caatcctaga gataggacgt ccccttcggg 1020
ggcagagtga caggtggtgc atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag 1080
tcccgcaacg agcgcaaccc ttgatcttag ttgccagcat tcagttgggc actctaaggt 1140
gactgccggt gacaaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcatcat gccccttatg 1200
acctgggcta cacacgtgct acaatggaca gaacaaaggg cagcgaaacc gcgaggttaa 1260
gccaatccca caaatctgtt ctcagttcgg atcgcagtct gcaactcgac tgcgtgaagc 1320
tggaatcgct agtaatcgcg gatcagcatg ccgcg 1355
Claims (10)
- 수탁번호 KACC 81139BP로 기탁된 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) CMIN-4 균주.
- 제1항에 있어서,
상기 균주는 생육, 세포 보호활성 및 항산화 활성으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상이 우수한 것인, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) CMIN-4 균주.
- 제1항에 있어서,
상기 균주는 생강 발효물 제조용인 것인, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) CMIN-4 균주.
- 1) 생강 농축액을 제조하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 생강 농축액에 수탁번호 KACC 81139BP로 기탁된 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) CMIN-4 균주를 접종하여 생강 발효물을 제조하는 단계;를 포함하는, 생강 발효물의 제조방법.
- 제4항에 있어서,
상기 단계 2)의 균주를 접종한 후, 추가적으로 1일 내지 5일 동안 정치 배양시키는 것인, 생강 발효물의 제조방법.
- 제4항에 있어서,
상기 단계 2)의 균주를 접종한 후, 추가적으로 3일 동안 정치 배양시키는 것인, 생강 발효물의 제조방법.
- 제4항에 있어서,
상기 단계 2)의 균주를 접종한 후, 추가적으로 20 내지 40℃에서 정치 배양시키는 것인, 생강 발효물의 제조방법.
- 제4항에 있어서,
상기 단계 2)의 균주를 접종한 후, 추가적으로 30℃에서 정치 배양시키는 것인, 생강 발효물의 제조방법.
- 제4항에 있어서,
상기 단계 2)의 균주를 접종한 후, 추가적으로 30℃에서 3일 동안 정치 배양시키는 것인, 생강 발효물의 제조방법.
- 제4항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제조방법으로 제조된 생강 발효물.
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