KR20220079651A - 진통 및 마취 펩티드 및 기타 제제 - Google Patents

Abstract

통증을 치료 또는 예방하고/하거나 마취를 유도하는 제제 및 이를 사용하는 방법이 개시된다. 상기 제제는 어댑틴 단백질 2-클라트린 매개 세포내 이입(adaptin protein 2-clathrin mediated endocytosis; AP2-CME)을 표적화하는 펩티드, siRNA, 및/또는 shRNA이다. 본 개시의 펩티드는 하기 서열 X¹X²X³X⁴ LX⁵ (서열 번호 7)을 함유할 수 있는데, 상기 X¹은 D, E, S, 또는 T이되, 상기 D, E, S, 및/또는 T는 선택적으로 인산화되고, 상기 X², X³, 및 X⁴는 임의의 아미노산으로부터 각각 독립적으로 선택된다.

Description

진통 및 마취 펩티드 및 기타 제제

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2019년 10월 10일 출원된 미국 임시출원 번호 제62/913,512호의 우선권을 주장하며, 이의 개시는 본 명세서에 참조로 포함된다.

연방 지원 연구에 관한 진술

본 발명은 미국 국립 보건원에서 수여한 번호 NS108087 하에 정부 지원으로 만들어졌다. 정부는 본 발명에 대한 일정 권리를 갖는다.

염증성 통증의 생리학은 1차 구심성 뉴런, 중추신경계, 및 면역 시스템의 통합을 포함한다. 배근 신경절(dorsal root ganglion; DRG) 통각수용기의 말초 감작은 염증성 통증을 개시하고 면역 세포 및 손상된 조직으로부터 방출되는 염증 매개 물질에 의해 구동된다. 최근, 칼시토닌 유전자 관련 펩티드(calcitonin gene-related peptide; CGRP) 함유 통각수용기는 다양한 통증 모델에서 열적 및 기계적 민감도의 주요 조정자로 확인되었다. 그러므로, CGRP⁺ 통각수용기를 잠재적 진통 표적으로 고려하는 것이 합리적이다.

부작용이 더 적은 효과적인 진통제에 대한 필요는 충족되지 않았다. 미국에서 가장 널리 처방받는 약제의 종류인 오피오이드(Opioid) 약물은 통증 치료에 흔히 사용된다. 오피오이드는 높은 중독 가능성뿐만 아니라, 저혈압, 수면 무호흡증, 호르몬 생산 감소, 노인의 경우, 낙상 및 고관절 골절을 증가로 이어질 수 있는 우려가 있다. 오피오이드는 또한 호흡 저하를 유발할 수 있고 코비드-19과 팬데믹(pendemic) 오피오이드 에피데믹(epidemic)의 교차(intersection)에 대한 우려가 계속 증가하고 있다. 염증성 통증에 대한 다른 치료 옵션에는 비스테로이드 항염증제(non-steroidal anti-inflammatory drugs) 및 코르티코스테로이드가 포함되지만, 유해한 부작용으로 인해 장기간 사용이 점점 더 금지되고 있다. 통각수용기 이온 채널 억제제는 진통을 위한 매력적인 분자인 것으로 보이지만, 제한된 임상 효능을 나타내어 현재 치료 옵션으로 사용되고 있지 않다. 3000 개를 초과하는 형질전환 마우스 녹아웃 라인을 스크리닝한 후, AAK1(endocytosis associated-adaptin protein kinase 1)은 통증 치료의 잠재 표적으로 간주되었고 이 효소를 억제하기 위한 소분자가 개발되었다. 하지만, AAK1를 전신에서 표적화하는 것은 이의 전신 발현으로 인해 문제가 될 수 있고 통증 완화용 AAK1 억제제의 추가 개발은 아직 추구되지 않았다. 그럼에도, 본 연구는 세포내 이입(endocytosis)를 약리학적으로 억제하여 진통을 제공하려는 최초의 전임상 시도를 하였다.

뉴런의 제1 세포내 이입 기구(machinery)는 다량체 어댑터 단백질 복합체 2(multimeric adaptor protein complex 2; AP2)를 사용하는데, 상기 AP2는 하기 α-서브유닛 동형의 차등 발현을 갖는다: α1 동형은 시냅스 구획(synaptic compartment)에 국한되는 반면, α2 동형은 강력한 시냅스외 발현을 나타낸다. AP2 클라트린-매개 세포내 이입(AP2 clathrin-mediated endocytosis; AP2-CME)은 시험관 내(in vitro) 나트륨-활성화 칼륨 채널(K_Na)의 내재화를 통한 DRG 뉴런 민감도에 기초하고 AP2α2 서브유닛은 단백질 키나아제 A(PKA) 자극 후 이 채널에 결합하는 것으로 나타났다.

본 개시는 통증을 치료 또는 예방하고/하거나 마취를 유도하는 제제 및 이를 사용하는 방법을 제공한다. 상기 제제는 어댑틴 단백질 2-클라트린 매개 세포내 이입(adaptin protein 2-clathrin mediated endocytosis; AP2-CME)을 표적화하는 펩티드, siRNA, 및/또는 shRNA이다. 일 측면에서, 상기 제제의 사용은 통증을 퇴치하기 위한 마약(예를 들면, 오피오이드)의 필요를 감소시키거나 제거할 것이다.

본 개시의 성질 및 목적의 더 완전한 이해를 위해, 첨부 도면과 함께 하기 상세한 설명을 참조해야 한다.
도 1은 마우스에서 급성 염증성 통증-유사 행동을 약화시키는 AP2A2 서브유닛의 유전자 녹아웃을 도시한다. 도 1a는 5% 포르말린 주사 후 C57BL/6 마우스의 요약된 통증-유사 행동을 제시한다. 단계 1은 주사 후 0 내지 10분이고 단계 2는 주사 후 11 내지 60분이다(스크램블된 shRNA(scrambled shRNA 그룹 n=6; AP2A2 그룹 n=6). 표시된 데이터는 누적 평균값 ± s.e.m으로 제시된다. 유의도(* (p < 0.05), ** (p < 0.01))는 Bonferroni 교정을 한 이원 분산분석(2-way ANOVA)을 사용하여 결정되었다.도 1b는 C57BL/6 마우스에서 통증-유사 행동을 도시하는 대표 이미지를 제공하며, 왼쪽은 포르말린 주사 후 2분일 때, 중간은 포르말린 주사 후 20분일 때, 오른쪽은 포르말린 후 60분일 때 C57BL/6 마우스이다. 도 1b의 오른쪽 하단에 나타낸 화살표는 AP2A2가 고갈된 마우스의 염증이 있는 발의 사용을 강조한다. 도 1c 상단에 도시한 것은 AP2A2 녹다운의 정도를 보여주는 대표적인 웨스턴 블롯이다. 상기 대표적인 웨스턴 블롯은 동일한 동물에서 취한 반대측 및 동측 샘플 쌍이다. 도 1c 하단에 도시된 것은 웨스턴 블롯의 덴시토메트리 분석(densitometryanalysis)이다(n=3). 데이터는 평균값 ± s.e.m으로 제시된다. 유의도(* (p < 0.05)는 Bonferroni 교정을 한 이원 분산분석을 사용하여 결정되었다.
도 2는 만성 염증성 통증 모델에서 열적 민감도의 개시 및 유지에 대한 AP2A2 녹다운의 영향을 도시한다. 도 2a 상단은 선행 녹다운 모델에서 만성 염증성 통증의 시점을 강조하는 타임라인이다. 도 2a 하단은 Hargreaves 분석의 요약된 데이터를 나타낸다. 스크램블된 (n=11) 그룹 및 AP2A2 (n=12) shRNA 그룹에 대한 반대측 및 동측 발 회피 지연 시간이 나타난다. 표시된 데이터는 평균값 ± s.e.m으로 나타난다. 유의도(* (p < 0.05), ** (p < 0.01))는 Bonferroni 교정을 한 이원 분산분석을 사용하여 결정되었다. 도 2b 상단은 실제(facto) 녹다운 모델에서 만성 염증성 통증 후 시점을 표시한 타임라인이다. 도 2b 하단은 Hargreaves 분석의 요약된 데이터를 나타낸다. 스크램블된 (n=8) 그룹 및 AP2α2 (n=8) shRNA 그룹에 대한 반대측 및 동측 발 회피 지연 시간이 나타난다. 데이터는 평균값 ± s.e.m으로 나타난다. 유의도 (* (p < 0.05), ** (p < 0.01))는 Bonferroni 교정을 한 이원 분산분석을 사용하여 결정되었다.
도 3은 마우스에서 급성 및 만성 염증성 통증 행동을 약화시키는 AP2 억제 펩티드의 발바닥 내 주사(interplantar injection)를 나타낸다. 도 3a는 5% 포르말린 주사 후 C57BL/6 마우스의 요약된 통증-유사 행동을 제공한다. 주사 후 0 내지 10분인 단계 1, 및 주사 후 11 내지 60분인 단계 2(스크램블된 펩티드 그룹 n=6; AP2 억제 펩티드 그룹 n=6)가 나타난다. 표시된 데이터는 누적 평균값± s.e.m으로 제시된다. 유의도(* (p < 0.05))는 Bonferroni 교정을 한 이원 분산분석을 사용하여 결정되었다. 도 3b는 Hargreaves 분석의 요약된 데이터를 나타낸다. 스크램블된 그룹 및 AP2 억제 펩티드 그룹에 대한 반대측 및 동측 발 회피 지연 시간이 나타난다. 데이터는 평균값 ± s.e.m으로 나타난다. 유의도(* (p < 0.05), ** (p < 0.01), *** (p < 0.005))는 이원 분산분석을 사용하여 결정되었다. 도 3c는 Von Frey 분석의 요약된 데이터를 도시한다. 데이터는 발 회피 반응을 이끌어내는데 필요한 평균 힘± s.e.m으로 제시된다. 유의도(* (p < 0.05))는 다중 t-검정을 사용하여 결정되었다.
도 4는 AP2 복합체의 펩티드 억제를 위한 제안된 메커니즘을 도시한다. 지질화된 펩티드는 플립-플롭(flip-flop) 메커니즘에 의해 세포에 들어가는 것으로 제안된다. 세포 안에 들어가면, 이 펩티드는 원형질 막의 내부 엽(inner leaflet)에 묶인 채로 남아있다. 이후, 이 펩티드(디류신계(dileucine-based)는 AP2 복합체와 상호작용한다. 이 상호작용은 AP2 복합체가 기질에 결합하여 세포내 이입하는 것을 억제한다.
도 5는 마우스에서 급성 염증성 통증 행동을 부분적으로 약화시키는 펩티드 유사체를 도시한다. 5% 포르말린 주사 후 요약된 통증-유사 행동이 나타난다. 2개의 단계가 도시된다 - 단계 1은 주사 후 0 내지 10분이고 단계 2는 주사 후 11 내지 60분이다(스크램블된 펩티드 그룹 n=6; AP2 억제 펩티드 그룹 n=6; P1 그룹 n=3; P2 그룹 n=3; P3 그룹 n=3, P4 그룹 n=3). P3 펩티드의 인산화 변이체인 P4 펩티드만이 핥는 행동 및 발을 들어올리는 행동 둘 모두에서 유의한 감소를 나타냈다. 데이터는 누적 평균값 ± s.e.m으로 제시된다. 유의도(* (p < 0.05))는 다중 t-검정을 사용하여 결정되었다.
도 6은 AP2-매개 세포내 이입의 결실이 동측 뒷발의 부종에 영향을 미치지 않았음을 나타낸다. 도 6의 A는 shRNA 신경 주사 7일 후; CFA 주사 전후 24시간에 C57BL/6 마우스 동측 발의 요약된 단면적을 나타낸다. 발의 가장 두꺼운 부분에서 캘리퍼(caliper)로 측정이 이루어졌다. 데이터는 평균 단면적 ± s.e.m으로 제시된다(n=3). 도 6의 B는 CFA 주사 전후 24시간에 C57BL/6 마우스의 동측 발의 요약된 단면적을 제시한다. 두 그룹 모두 '사전-CFA' 측정 24시간 전에 펩티드가 사전주입되었다. 발의 가장 두꺼운 부분에서 캘리퍼로 측정이 이루어졌다. 데이터는 평균 단면적± s.e.m으로 제시된다 (n=3).
도 7은 AP2α2가 IB4^-, CGRP⁺ 통각수용기에서 발현되고 생체 내(in vivo) AP2α2 녹다운이 침해방어성 행동(nocifensive behavior)을 약화시키는 것을 나타낸다. 도 7ab의 A: AP2α2 및 CGRP의 발현 양상을 나타내는 대표적인 면역형광 이미지. IB4 반응성은 펩티드성 및 비펩티드성 DRG 뉴런을 구분하기 위해 사용되었다. AP2α2는 작은 크기 및 중간 크기의 CGRP⁺ DRG 뉴런에서 우선적으로 발현되었지만, IB4⁺ 뉴런에서는 발현되지 않았다. 화살표는 CGRP 및 AP2α2의 강력한 공동-국소화(co-localization)를 강조한다. 도 7ab의 B: 녹다운 7일 후, 동일한 동물에서 취한 반대측 DRG와 비교한 생체 내 AP2α2 녹다운 후 동측 DRG에서의 면역반응성. 도 7c [왼쪽]: AP2α2 녹다운의 정도를 나타내는 대표적인 웨스턴 블롯. 동일한 동물로부터 취한 반대측 및 동측 샘플 쌍. 도 7c [오른쪽]: 웨스턴 블롯의 덴시토메트리 분석 (n=3). 녹다운 7일 후 동물들은 희생되었다. 데이터는 평균값 ± s.e.m으로 제시된다. 유의도는 Holms-Sidak 교정을 한 일원 분산분석(one-way ANOVA)으로 결정되었다(* p < 0.05); 도 7d: 다양한 조건 하에서 기록한 해리된 성체 DRG 뉴런의 대표적인 트레이스(trace), [상단] 대조군 조건, [중간] PKA 자극 조건 동안 스크램블된 shRNA로 형질감염된 DRG 뉴런, [하단] PKA 자극 조건 동안 AP2α2 shRNA로 형질감염된 DRG 뉴런. IB4-는 IB4-alexa fluor 488 접합체와 인큐베이팅한 후 형광의 부재로 결정되어 선택적으로 기록되었다. 도 7e: 5% 포르말린 주사 후 C57BL/6 마우스의 요약된 침해방어성 행동. 단계 1; 주사 후 0 내지 10분, 단계 2; 주사 후 11 내지 60분 (스크램블된 shRNA 그룹 n=6; AP2α2 그룹 n=6). 도 7f: C57BL/6 마우스에서 통증-유사 행동을 도시하는 대표 이미지, [왼쪽] 주사 후 2분, [중간] 주사 후 20분, [오른쪽] 주사 후 60분. 화살표는 염증이 있는 발의 사용을 강조한다. 데이터는 누적 평균값 ± s.e.m으로 제시된다. 유의도는 Bonferroni 교정을 한 반복 측정 이원 분산분석을 사용하여 결정되었다(p < 0.05; *, p < 0.01; **)
도 8은 만성 염증성 통증에서 열적 민감도의 발달 및 유지를 방해하는 AP2α2 녹다운을 나타낸다. 도 8a: 스크램블된 (n=11) 그룹 및 AP2α2 (n = 12) shRNA 그룹에 대한 사전-염증성 녹다운 범례(paradigm)를 갖는 CFA 통증 모델에서 동물의 열적 민감도. 데이터는 평균 발 회피 지연 시간(paw withdrawal latency; PWL) ± s.e.m으로 나타난다. 유의도는 Bonferroni 교정을 한 반복 측정 이원 분산분석을 사용하여 결정되었다(p < 0.05; *, p < 0.01; **). 도 8b: 염증이 개시되기 전에 녹다운이 일어난 만성 염증성 통증 모델에서 동측 뒷발의 기계적 민감도. 스크램블된 (n = 8) 그룹 및 AP2α2 (n = 8) shRNA 그룹에 대한 데이터는 기준선에 대한 평균 퍼센트± s.e.m 으로 나타난다. 유의도는 Bonferroni 교정을 한 반복 측정이원 분산분석을 사용하여 결정되었다(p < 0.05; *). 반대측 PWT는 도 13에서 확인할 수 있다. 도 8c: 염증의 확립 후, 스크램블된 (n = 8) shRNA 및 AP2α2 (n = 8) shRNA가 주사된 동물의 열적 민감도. 데이터는 평균 PWL ± s.e.m으로 나타난다. 유의도는 Bonferroni 교정을 한 반복 측정 이원 분산분석을 사용하여 결정되었다(p < 0.05; *, p < 0.01; **).
도 9는 지질화된 펩티드가 말초 구심성 신경(peripheral neuronal afferents)을 침투하는 것을 나타낸다. 도 9a: 대조군 조건 하에서 나이브 C57BL/6 마우스(naive C57BL/6 mouse) 뒷발에의 항원성 지질화-HA 펩티드 주사. 이 HA 펩티드는 주사 후 지질화된 펩티드 분포의 면역형광 시각화를 가능하게 했다. [A']. 면역반응성의 히트맵 분석 [A'']: 지질화 -HA 펩티드는 지질 밀도가 높은 영역 내에 진피에 우선적으로 분배(partitioned)되었다. [A1] 삽입도(Insert)는 진피 내에서 말초 구심성 신경(peripheral afferents)의 HA 면역반응성을 도시한다. [A2] 삽입도는 근육 조직에서 말초 구심성 신경의 면역반응성을 도시한다. 구심성 신경들은 면역표지화(immunolabeling)를 나타냈지만, 근육 세포는 그러지 않았다. 도 9b: CFA-유도 염증 하에서 나이브 C57BL/6 마우스에의 항원성 지질화 펩티드모방체 주사. [B']. 히트맵 분석은 염증이 있는 조직 내에서 펩티드의 더 긴 체류 시간을 나타냈다 [B'']. 이번에도, 지질화-HA 펩티드는 진피, 특히, 지질 밀도가 높은 영역에 우선적으로 분배되었다. [B1] 삽입도는 진피에서 말초 구심성 신경의 면역반응성을 도시한다. [B2] 삽입도는 말초 신경 섬유 및 근육 조직에서 면역반응성을 도시한다
도 10은 지질화된 AP2 억제 펩티드에 의한 말초 세포내 이입의 억제가 금성 및 만성 염증 동안 통증 행동들을 약화시키는 것을 나타낸다. 도 10a: 5% 포르말린 주사 후 C57BL/6 마우스의 요약된 침해방어성 행동들. 이 AP2 억제 펩티드 억제제는 포르말린 주사 전 24시간에 뒷발에 주입되었다. 단계 1; 주사 후 0 내지 10 분, 단계 2; 주사 후15 내지 60분 (스크램블된 shRNA 그룹 n = 6; AP2α2 그룹 n = 6). 데이터는 평균값 ± s.e.m으로 제시된다. 유의도는 Bonferroni 교정을 한 반복 측정이원 분산분석을 사용하여 결정되었다 (p < 0.05; *). 도 10b 내지 10cd: 확립된 CFA-유도 염증성 통증 동안 동물에서의 열적 민감도. 데이터는 평균 PWL ± s.e.m으로 나타난다. 유의도는 Bonferroni 교정을 한 반복 측정 이원 분산분석을 사용하여 결정되었다 p < 0.05; *, p < 0.01; **, p < 0.005; ***). 도 10b: 스크램블된 펩티드 (n = 8) 또는 AP2 억제 펩티드 (n = 8)가 제공된 모든 동물의 합성 그래프. 각 그룹은 CFA 주사 후 24시간에 펩티드를 각각 주사 받았다. 도 10cd의 C: CFA 주사 후 스크램블된 (n = 4) 펩티드 및 AP2 억제 (n = 4) 펩티드를 주사 받은 수컷 동물의 열적 민감도. 수컷은 AP2 억제 펩티드 주사 후 기준선으로 즉시 회복하는 것을 나타냈다. 도 10cd의 D: 스크램블된 (n = 4) 그룹 및 AP2 억제 (n = 4) 펩티드 그룹을 주사한 암컷 동물의 열적 민감도. AP2 억제 펩티드를 주사 받은 암컷은 스크램블된 펩티드와 비교하여 가속화된 회복을 보여주었지만, 수컷 마우스와 비교하여 지연된 회복을 보였다. 도 10efg: 각 실험 조건에 대한 총 곡선 아래 면적 (A.U.C.) 정량화. 데이터는 평균 A.U.C. ± s.e.m으로 나타난다. 통계적 유의도는 Holms-Sidak 교정을 한 일원 분산분석을 사용하여 결정되었다(p < 0.05; *, p < 0.01; **, p < 0.005; ***, p < 0.001; ****). 도 10efg의 E: 도 10b에서 표시된 실험 조건 하에서 모든 동물에 대한 총 A.U.C.; 스크램블된 펩티드 (n = 8) 및 AP2 억제 펩티드 (n = 8). 세포내 이입의 약리학적 억제는 동측 발에 대한 A.U.C.의 유의한 증가를 생성하였다. 도 10efg의 F: 실험 조건들 하에서 수컷 동물에 대한 총A.U.C.; 스크램블된 펩티드 (n = 4) 및 AP2 억제 펩티드 (n = 4). 전체 데이터 세트에서 수컷 대상체를 분리한 결과 도 10efg의 E에서 관찰된 진통-유사 효과가 유지되는 것을 나타냈다. 도 10efg의 G: 실험 조건들 하에서 암컷 동물에 대한 총 A.U.C.; 스크램블된 펩티드 (n = 4) 및 AP2 억제 펩티드 (n = 4). 흥미롭게도, 전체 데이터 세트로부터 암컷 대상체를 분리하면 약화된(muted) 진통-유사 효과를 나타냈다. 도 10hij: 지수적 감쇠 방정식(exponential decay equation)으로 피팅된(fit) 회복 곡선. 도 10 hij의H: 도 10의 B로부터 회복 곡선을 피팅한 결과 세포내 이입의 억제는 타우(tau) 감소로 나타난 것과 같이 회복 속도를 가속화하는 것을 나타냈다. 도 10 hij의 I: 수컷에 대한 회복 곡선을 도 10cd의 C로부터 취하고 지수적 감쇠 방정식에 피팅했다. 수컷 동물은 타우의 강력한 감소로 나타난 것과 같이 세포내 이입의 억제에 잘 반응했다. 도 10 hij의 J: 암컷에 대한 회복 곡선을 도 10cd의 D로부터 취하고 지수적 감쇠 방정식에 피팅했다. 암컷 동물은 세포내 이입의 억제 후 회복 속도의 변화를 겪지 않았다. 도 10k: CFA-유도 염증성 통증의 확립 후 스크램블된 펩티드 (n = 11) 또는 AP2 억제 펩티드 (n = 11) 그룹에서 동물의 기계적 동측 PWT. 데이터는 평균 PWL(기준선 PWT에 대한 퍼센트) ± s.e.m으로 나타난다. 유의도는 Bonferroni 교정을 한 반복 측정 이원 분산분석을 사용하여 결정되었다(p < 0.05; *). 반대측 PWT는 도 14에서 확인할 수 있다.
도 11은 지질화된 AP2 억제 펩티드에 의한 말초 세포내 이입의 약리학적 억제가 수술 후 통증 모델에서 열적 민감도를 약화시키는 것을 나타낸다. 도 11ab의 A: 지질화된 AP2 억제 펩티드의 주사 프로토콜을 도시하는 개략도(Schematic). 도 11ab의 B 내지 11cd: 절개 후 통증 모델에서 동물의 열적 민감도. 데이터는 평균 PWL ± s.e.m으로 나타난다. 유의도는 Bonferroni 교정을 한 반복 측정 이원 분산분석을 사용하여 결정되었다(p < 0.05; *, p < 0.01; **, p < 0.005; ***, p < 0.001; ****). 도 11ab의 B: 발바닥 근육 절개 후 스크램블된 펩티드 (n = 12) 또는 AP2 억제 펩티드 (n = 12)를 주사 받은 동물의 열적 민감도를 도시하는 합성 그래프. 도 11cd의 C: 발바닥 절개 후 스크램블된 펩티드 (n = 6) 및 AP2 억제 펩티드 (n = 6)를 주사 받은 수컷 동물의 열적 민감도. 수컷은 1일차 내지 4일차에서 PWT의 통계적으로 유의한 증가를 특징으로 하는 세포내 이입의 국소 억제에 대한 초기 단계 반응을 나타냈다. 도 11cd의 D: 발바닥 절개 후 스크램블된 펩티드 (n = 6) 및 AP2 억제 펩티드를 주사 받은 암컷 동물의 열적 민감도. 암컷은 3일차 내지 6일차에서 PWT의 통계적으로 유의한 증가를 특징으로 하는 세포내 이입의 국소 억제의 후기-단계 반응을 나타냈다. 도 11efg: 각 실험 조건에 대한 총 곡선 아래 면적 (A.U.C.) 정량화. 데이터는 평균 A.U.C. ± s.e.m으로 나타난다. 통계적 유의도는 Holms-Sidak 교정을 한 일원 분산분석을 사용하여 결정되었다(p < 0.05; *, p < 0.01; **, p < 0.005; ***, p < 0.001; ****). 도 11efg의 E: 도 11ab의 B에서 표시된 실험 조건 하에서 모든 동물에 대한 총 A.U.C.; 스크램블된 펩티드 (n = 12) 및 AP2 억제 펩티드 (n = 12). 세포내 이입의 약리학적 억제는 동측 발에 대해 A.U.C.의 유의한 억제를 생성하였다. 도 11efg의 F: 실험 조건들 하에서 수컷 동물에 대한 총 A.U.C.; 스크램블된 펩티드 (n = 6) 및 AP2 억제 펩티드 (n = 6). 전체 데이터 세트로부터 수컷 대상체를 분리한 결과 진통-유사 효과를 나타내는 경향이 나타났다. 도 11efg의 G: 실험 조건들 하에서 암컷 동물에 대한 총 A.U.C.; 스크램블된 펩티드 (n = 6) 및 AP2 억제 펩티드 (n = 6). 흥미롭게도, 전체 데이터 세트로부터 암컷 대상체를 분리한 결과 이 또한 진통-유사 효과를 나타내는 경향을 나타났다. 도 11hij의 H 내지 J: 지수적 감쇠 방정식으로 피팅된 회복 곡선. 도 11hij의 H: 도 11ab의 B로부터 회복 곡선을 피팅한 결과 세포내 이입의 억제는 타우(tau) 감소로 나타난 것과 같이 회복 속도를 가속화하는 것을 나타냈다. 도 11hij의 I: 수컷에 대한 회복 곡선을 도 11cd의 C로부터 취하고 지수적 감쇠 방정식에 피팅했다. 수컷 동물은 타우의 강력한 감소로 나타난 것과 같이 세포내 이입의 억제에 잘 반응했다. 도 11hij의 J: 암컷에 대한 회복 곡선을 도 11cd의 D로부터 취하고 지수적 감쇠 방정식에 피팅했다. 도 11k: 절개 후 스크램블된 펩티드 (n = 11) 또는 AP2 억제 펩티드 (n = 11)에서 동물의 기계적 동측 PWT. 데이터는 평균 PWL (기준선 PWL에 대한 퍼센트) ± s.e.m으로 나타난다. 유의도는 Bonferroni 교정을 한 반복 측정 이원 분산분석을 사용하여 결정되었다(p < 0.05; *). 반대측 PWT는 도 16에서 확인할 수 있다.
도 12는 말초 통각수용기에서 세포내 이입의 국소 억제가 진피의 표층에서 CGRP 면역반응성을 강화시키고 Ap2α2가 CGRP⁺ 인간 DRG 뉴런에 차등 분포되어 있는 것을 나타낸다. 도 12abc의 A: 스크램블된 펩티드를 주사 받은 염증이 없는 뒷발에서 CGRP 면역반응성을 나타내는 대표 이미지. 통상적으로, CGRP 면역반응성은 근위 과립층(stratum granulosum; SG)을 종점으로 한다. 도 12abc의 B: AP2 억제 펩티드를 주사 받은 염증이 없는 뒷발에서 CGRP 면역 반응성을 보여주는 대표 이미지. 흰색 화살표; SG의 가장 원위층(very distal layer)에서 말초 신경 섬유는 강력한 CGRP 면역반응성을 나타내고 각질층(stratum corneum; SC) 표면 가까이에 일부 CGRP 면역반응성 섬유가 발견되었다. 노란색 화살표; SC의 표층에서 CGRP 면역반응성을 나타내는 말초 신경 섬유. 도 12abc의 A' 및 B': SG 4분면을 도시하는 확대된 섹션. 도 12abc의 C: 각 SG 4분면에서 CGRP⁺ 구심성 말단의 정량화 (n = 3). 유의도는 다중 t-검정을 사용하여 결정되었다 (p < 0.05;*). 데이터는 평균값 ± s.e.m으로 제시된다. 도 12d: hDRG에서 AP2α2 (왼쪽) 및 CGRP (중간)의 발현 양상을 나타내는 대표 면역형광 이미지. AP2α2는 CGRP⁺ DRG 뉴런에서 차등 발현된다. 화살표는 CGRP 및 AP2α2의 강력한 공동-국소화를 강조한다.
도 13은 AP2α2의 shRNA 매개 녹다운이 CFA-유도 동측 종창(swelling) 또는 반대측 기계적 행동을 유의하게 손상시키지 않았음을 나타낸다. 도 13ab의A: CFA 주사 전후 24시간 동안 동측 뒷발의 단면적. 깨어 있는 C57BL/6 마우스로부터 캘리퍼로 측정이 이루어졌다. 뒷발의 가장 넓은 부분으로부터 폭 및 높이를 취하였다. 각 그룹 (스크램블된 shRNA 및 AP2α2 shRNA)은 n = 3을 가진다. CFA 주사 전후에 동일한 동물을 측정하였다. 데이터는 단면적 평균값 ± s.e.m.으로 나타나고 Bonferroni 교정을 한 이원 분산분석 통계적 검정을 사용하여 분석했다(p < 0.05). 도 13ab의 B 내지 13d: 만성 염증성 통증의 CFA-유도 모델에서 동물의 본 프레이 필라멘트 테스트. 데이터는 평균 PWT (기준선 PWT에 대한 퍼센트) ± s.e.m.으로 나타난다. 통계적 유의도는 Bonferroni 교정을 한 반복 측정 이원 분산분석 통계적 검정을 사용하여 결정되었다(p < 0.05; *) 도 13ab의 B: 반대측 PWT. 데이터는 도 2b에 제시된 데이터와 상보적이다. 도 13c: [왼쪽] 스크램블된 shRNA (n = 4) 또는 AP2α2 shRNA (n = 4)를 주사 받은 수컷 동물에 대한 반대측 PWT. [오른쪽] 동측 발. 도 13d: [왼쪽] 스크램블된 shRNA (n = 4) 또는 AP2α2 shRNA (n = 4)를 주사 받은 암컷 동물에 대한 반대측 PWT. [오른쪽] 동측 발.
도 14는 지질화된 HA-펩티드가 유사분열 세포 및 유사분열 후 뉴런에서 강력한 안정성을 나타내는 것을 보여준다. CHO 세포는 시딩(seeding) 후 적어도 2일 동안 적절한 조건에서 배양하였다. 실험 당일에, 배지를 교체하고, HA-펩티드(10 μM)가 보충된 성장 배지로 교체했다. 세포를 3시간 동안 HA-펩티드 보충된 배지에서 인큐베이팅하고, 3시간이 지난 그 시점에서 배지를 제거하고, 세포를 PBS로 세척하고 수집할 때까지 성장시켰다. 세포를 고정시키고 HA-특이적 항체로 염색하였다. 도 14a: 다양한 투과 조건 및 시점 하에서 HA-펩티드에 노출된, 배양된 CHO 세포의 대표 이미지. '-Triton x-100'은 세포외에서만의 HA-펩티드를 나타내는 반면, '+Triton x-100'은 총 HA-펩티드 면역반응성을 나타낸다. 투과 및 비투과 조건을 사용하여 HA-펩티드가 세포막의 양쪽에서 연속적으로 플립 플롭할 수 있고 따라서 주로 막으로 구분된다는 것이 나타났다. 도 14b: HA-펩티드에 노출된 후 3일에 배양된 배아 DRG 뉴런에서의 HA 면역 반응성의 대표 이미지. 도 14b 하단: 염색 강도를 도시하는 상단 이미지의 룩업 테이블(look-up-table) 변환.
도 15는 세포내 이입의 약리학적 억제가 CFA-유도 염증 및 기계적 민감도의 발달을 변경시키지 않았음을 나타낸다. 도 15ab의 A: CFA 주사 전후 24시간 동안 동측 뒷발의 단면적. 깨어 있는(awake) C57BL/6 마우스로부터 캘리퍼로 측정이 이루어졌다. 뒷발의 가장 넓은 부분으로부터 폭 및 높이를 취하였다. 각 그룹 (스크램블된 그룹 및 AP2α2 펩티드모방체 그룹)은 n = 3을 가진다. CFA 주사 전후에 동일한 동물을 측정하였다. 데이터는 단면적 평균값 ± s.e.m.으로 나타나고 Bonferroni 교정을 한 이원 분산분석 통계적 검정을 사용하여 분석했다(p < 0.05). 도 15ab의 B 내지 15d: 만성 염증성 통증의 CFA-유도 모델에서 동물의 본 프레이 필라멘트 테스트. 데이터는 평균 PWT (기준선 PWT에 대한 퍼센트) ± s.e.m.으로 나타난다. 통계적 유의도는 Bonferroni 교정을 한 반복 측정 이원 분산분석 통계적 검정을 사용하여 결정되었다(p < 0.05). 도 15의 B: 반대측 PWT. 데이터는 도 4K에 제시된 데이터와 상보적이다. 도 15c: [왼쪽] 스크램블된 펩티드 (n = 7) 또는 AP2α2 억제 펩티드 (n = 7)를 주사 받은 수컷 동물에 대한 반대측 PWT. [오른쪽] 동측 발. 도 15d: [왼쪽] 스크램블된 shRNA (n = 4) 또는 AP2α2 shRNA (n = 4)를 주사 받은 암컷 동물에 대한 반대측 PWT. [오른쪽] 동측 발.
도 16은 세포내 이입의 약리학 적 억제가 절개 후 통증 모델에서 반대측 기계적 민감도를 변경시키지 않았음을 나타낸다. 만성 염증성 통증의 절개 후 모델에서 동물의 동적 본 프레이 필라멘트(Dynamic Von frey filament) 테스트를 하였다. 데이터는 평균 PWT (기준선 PWT에 대한 퍼센트) ± s.e.m으로 나타난다. 통계적 유의도는 Bonferroni 교정을 한 반복 측정 이원 분산분석 통계적 검정을 사용하여 결정되었다(p < 0.05). 데이터는 도 11k에 제시된 데이터와 상보적이다.
도 17은 스크램블된 펩티드를 주입 받은 동물의 절개 후 통증 모델에서 초기 회복의 정도가 약간의 성별-의존적 경향을 나타내는 것을 보여준다. 절개 후 통증 모델에서 대조군 동물은 열 자극으로부터 발 회피 지연 시간으로 측정시 초기 단계 회복 동안에 약간의 성별 차이를 나타냈다. 암컷 대조군 동물 (n = 6)은 절개 후 24시간에 더 높은 발 회피 지연 시간을 갖는 경향이 있는 반면에, 상대적으로 평평한(flat) 회복 속도를 나타냈다. 수컷 대조군 동물 (n = 6)은 회복 후 24시간에 더 낮은 발 회피 지연 시간을 나타내는 반면에, 이후 후기 시점에서 암컷 동물과 매칭되는 선형 회복 속도를 나타냈다.
도 18은 진통의 효능이 펩티드 서열에 의존하는 것을 나타낸다. 도 18a: 5% 포르말린 주사 후 C57BL/6 마우스의 요약된 통증-유사 행동. 단계 1; 주사 후 0 내지10분, 단계 2; 주사 후 11 내지 60분 (스크램블된 펩티드 그룹 n = 6; AP2 억제 펩티드 그룹 n = 6; P1 그룹 n = 3; P2 그룹 n = 3; P3 그룹 n = 3; P4 그룹 n = 3). 펩티드 서열은 표 1에서 확인된다. 데이터는 누적 평균값 ± s.e.m으로 제시된다. 유의도는 Bonferroni 교정을 한 이원 분산분석을 사용하여 결정되었다(p < 0.05; *). 도 18b: 상이한 Na_V1.8를 표적화하는 하기 펩티드모방체를 주사 받은 랫트의 요약된 열적 민감도: Ch1001 (n = 10) 및 Ch1002 (n = 10) (Pryce et al., ref 17로부터 유래). 밝은 회색 선은 참조로서 AP2 펩티드모방체 평균을 나타낸다. 모든 데이터는 평균값 ± s.e.m으로 나타나고 Bonferroni 교정을 한 이원 분산분석으로 분석되었다(p < 0.05; +). '+'는 Ch1002 및 스크램블된 그룹들 사이의 통계적 유의도를 나타낸다.
도 19는 세포내 이입의 국소 억제가 면역 세포 동원을 변경시키지 않았지만, 절개통증 모델(incisional pain model)에서 육아종-유사 인공물(artifact)을 생성했음을 나타낸다. 도 19의 A: 방법 섹션에서 이전에 명시한 것과 같이 동물들이 처리되었다. 하지만, 어떠한 행동도 수집하지 않았고, 대신에, 경심 관류(transcardial perfusion)를 통해 동물들을 희생시키고, 염색을 위해 조직을 수집하였다. 도 19의 상단: 스크램블된 펩티드 그룹 (n = 2) 및 AP2 억제 펩티드 그룹 (n = 2)에서 랫트(rat) 뒷발의 헤마톡실린 & 에오신 염색을 도시하는 대표 이미지. 국소화된 면역 세포는 각 조건에서 진피에서 관찰될 수 있다. 도 19의 하단: 절개 후 24시간에, 면역 세포의 수가 급격히 증가하였다. 도 19의 우측 하단: 세포내 이입의 억제는 면역 세포의 밀집된 클러스터링을 초래했다. 펩티드의 주사는 보행에 있어 어떠한 관찰가능한 변화도 강화(potentiate)시키지 않았다. 도 19의 B: 스크램블된 펩티드(상단) 또는 AP2 억제 펩티드(하단)를 받은 동물에서 절개 위치의 대표 이미지. 검은색 화살표는 유의한 육아종-유사 구조를 강조한다.
도 20은 세포내 이입이 염증이 있는 발에서 진피 CGRP 면역 반응성을 유의하게 변화시키지 않았음을 나타낸다. 도 20의 A: 스크램블된 펩티드모방체를 주사 받은 24시간 CFA-유도 염증이 있는 뒷발에서 CGRP 면역반응성을 나타내는 대표 이미지. 도 20의 B: AP2 억제 펩티드모방체를 주사 받은 염증이 있는 뒷발에서 CGRP 면역반응성을 나타내는 대표 이미지.
도 21은 AP2α2 shRNA의 주사가 동측 DRG에서 AP2α2 단백질 발현을 유의하게 감소시키는 것을 나타낸다. 도 21의 상단: 도 7로부터의 전체 웨스턴 블롯 이미지. 눈에 보이는 밴드는 AP2α2에 대응한다. 도 21의 하단: 도 7로부터의 전체 웨스턴 블롯 이미지. 눈에 보이는 밴드는 액틴에 대응한다.

청구 대상이 특정 구현예/실시예 관점에서 기술되지만, 본 명세서에 제시된 모든 이점 및 특징을 제공하지 않은 다른 구현예/실시예를 포함하는 다른 구현예/실시예 또한 본 개시의 범위 내에 있다. 다양한 구조적, 논리적, 및 공정 단계의 변경이 본 개시의 범위를 벗어나지 않고 이루어질 수 있다.

값의 범위가 본 명세서에 개시된다. 범위는 하한값 및 상한값을 제시한다. 달리 명시되지 않는 한, 범위는 가장 작은 크기 값의 모든 값(심지어 하한값 또는 상한값) 및 명시된 범위의 값들 사이의 모든 범위들을 포함한다.

본 출원 전체에 걸쳐, 단수형은 복수형을 포함하고 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 본 출원에 인용된 참고문헌은 본 명세서에 참조로 포함된다. 보충 섹션 또는 도면을 포함하는 본 출원의 모든 섹션은 본 출원의 일부이다.

본 명세서에 사용되는 용어 "치료"는 치료되는 특정 상태와 관련된 하나 이상의 증상 또는 특징의 감소를 의미한다. 치료는 반드시 완전한 치유 또는 관해(remission)를 의미하지 않고, 병이 다시 발병하거나 재발하는 것을 배제하지 않는다. 예를 들면, 본 개시의 치료는 통증을 감소(통증 민감도의 감소)하거나 통증 민감도을 증가시키는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "치료학적 유효량" 은 치료의 의도된 목적으로 단일 또는 다중 용량으로 달성기에 충분한 제제의 양을 의미한다. 치료가 완전한 치유로 이어질 필요는 없지만, 완전한 치유로 이어질 수 있다. 치료는 적응증(indication)의 하나 이상의 증상 또는 마커의 완화를 의미할 수 있다. 요구되거나 필요한 정확한 양은 사용되는 특정 화합물 또는 조성물, 이들의 투여 방식, 환자 특이사항(patient specifics) 등에 따라 달라진다. 적절한 유효량은 오직 통상의 실험만을 사용하여 본 개시를 알게된 당업자에 의해 결정될 수 있다. 치료는 예를 들면, 증상을 억제하기 위해 증상에 따라 맞춰질 수 있다. 이는 예를 들면, 유지 요법의 맥락 내에서 단기간에 걸쳐, 중기적으로 수행되거나, 장기간 치료일 수 있다. 치료는 연속적이거나 간헐적일 수 있다.

달리 나타내지 않는 한, 핵산은 5'에서 3'을 향해 왼쪽에서 오른쪽으로 기재되고; 아미노산 서열은 아미노에서 카르복실을 향해 왼쪽에서 오른쪽으로 기재된다. 본 명세서에 인용된 수치 범위는 범위를 정의하는 숫자들을 포함하고 정의된 범위 내 각 정수를 포함한다. 아미노산은 IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission에서 권장하는 일반적으로 알려진 3글자 기호 또는 1글자 기호로 본 명세서에 언급될 수 있다. 마찬가지로, 뉴클레오티드는 일반적으로 받아들여진 1글자 코드로 언급될 수 있다.

본 개시는 통증을 치료 또는 완화하고 마취를 유도하는 제제 및 이를 사용하는 방법을 제공한다. 상기 제제는 어댑틴 단백질 2(AP2)-클라트린 매개 세포내 이입 (CME)를 표적화하는 펩티드, siRNA, 및/또는 shRNA일 수 있다. 일 측면에서, 이 제제들의 사용은 통증을 퇴치하기 위한 마약(예를 들면, 오피오이드)의 필요를 감소시키거나 제거할 것이다.

본 개시는 표 1에 따른 서열을 갖는 폴리펩티드를 제공한다.

밑줄 - 실험에 나타낸 (D/E/S/T)XXXL(L/I) AP2 결합 모티프

볼드 - 인산화된 잔기

본 개시는 또한 서열 (D/E/S/T)XXXL(L/I) (서열 번호 7)을 포함하는 펩티드를 제공한다. 상기 서열은 X¹X²X³X⁴LX⁵ (서열 번호 7)로 나타낼 수 있고, 이때, X¹은 D, E, S, 또는 T이고, 상기 D, E, S, 및/또는 T는 선택적으로 인산화되고, X², X³, 및 X⁴는 임의의 아미노산으로부터 각각 독립적으로 선택될 수 있고(예를 들면, 표준 아미노산(X²는 I, L, 또는 K일 수 있고; X³은 K, R, V, 또는 Q일 수 있고; X⁴는 R, Y, 또는 T일 수 있음), 또는 비표준 아미노산), X⁵는 L 또는 I일 수 있다. 본 개시의 펩티드는 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 아미노산 잔기 길이일 수 있다. 다양한 예시에서, 상기 펩티드는 하기 서열을 가질 수 있다: EIKRLL (서열 번호 9), TLRRLL (서열 번호 10), DIVYLI (서열 번호 11), 또는 DKQTLL (서열 번호 12). 다양한 예시에서, 상기 펩티드는 10 내지 13개의 아미노산 잔기 길이(예를 들면, 10, 11, 12, 또는 13)일 수 있다. 임의의 특정 이론에 얽매이는 것을 의도하지 않고, 총 10 내지 13개의 아미노산 길이를 갖는 펩티드는 바람직한 세포 투과 및 표적 결합 특성을 가질 수 있는 것으로 간주된다. 다양한 예시에서, 서열 번호 7의 임의의 아미노산 잔기(예를 들면, 아미노산 잔기들의 임의의 조합 또는 모든 아미노산 잔기)는 인산화될 수 있다.

일 구현예에서, 펩티드 서열 중 D/E/S/T가 인산화될 수 있다. 본 명세서에 보고된 실험에서, T가 인산화되었다. 나아가, 상기 인산화된 T는 인산화된 S로 대체될 수 있었다.

일 구현예에서, S 또는 T가 (D/E/S/T)XXXL(L/I) (서열 번호 7) 서열 앞에 있으며 ((S/T)(D/E/S/T)XXXL(L/I) (서열 번호 8)), 이는 선택적으로 인산화될 수 있다. 서열 번호 8 은 X⁶X¹X²X³X⁴LX⁵로 나타낼 수 있는데 (서열 번호 8), X¹은 D, E, S, 또는 T이되, X¹ 은 선택적으로 인산화될 수 있고, X², X³, 및 X⁴는 임의의 아미노산으로부터 각각 독립적으로 선택되고 (예를 들면, X²는 I, L, 또는 K일 수 있고; X³은 K, R, V, 또는 Q일 수 있고; X⁴는 R, Y, 또는 T일 수 있음), X⁵는 L 또는 I이고, X⁶은 S 또는 T이다.

또 다른 구현예에서, 본 개시의 펩티드의 C-말단 또는 상기 C-말단 직전의 아미노산은 선택적으로 인산화될 수 있다.

바람직한 구현예에서, 상기 펩티드는 지질화된다. 지질화에 사용되는 모이어티는 미리스토일 (C₁₄), 옥타노일 (C₈), 라우로일 (C₁₂), 팔미토일 (C₁₆) 및 스테아로일 (C₁₈)을 포함한다.

다양한 구현예에서, 상기 펩티드(들)의 N-말단 또는 N-말단들은 미리스토일화된다. 따라서, 상기 펩티드의 N 말단은 지질화될 수 있다. 대안적으로는, 상기 펩티드의 C-말단이 지질화될 수 있다. 예를 들면, 상기 C-말단의 지질화는 C-말단이 라이신일 때 유용할 수 있다.

또한, 본 개시는 AP2-CME mRNA에 향하는 RNAi 제제(AP2-CME mRNA의 RNA 간섭 매개 사일런싱 또는 하향조절에 사용되는 제제)를 기술한다. RNAi 제제는 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA)로 세포에서 일반적으로 발현되는 제제이다. ShRNA는 센스 가닥(sense strand), 안티센스 가닥(antisense strand), 및 상기 센스 가닥 및 안티센스 가닥 사이의 짧은 루프 서열을 함유하는 RNA 분자이다. ShRNA는 세포질 내로 내보내지고 세포질에서 다이서(dicer)에 의해 짧은 간섭 RNA (short interfering RNA; siRNA)로 처리된다. siRNA는 통상적으로 20 내지 23개의 뉴클레오티드 이중 가닥 RNA 분자이고 RNA-유도 사일런싱 복합체(RNA-induced silencing complex; RISC)에 의해 인식된다. RISC에 통합되면, siRNA는 표적화된 RNA의 절단 및 분해를 촉진한다. 따라서, 상기 RNAi 제제는 siRNA 또는 shRNA일 수 있다. 일 구현예에서, 상기 제제는 AP2-CME mRNA의 RNA 간섭(RNAi) 매개 사일런싱 또는 하향조절에 사용되는 siRNA이다. 상기 RNAi 제제는, 인간, 비인간, 또는 부분적으로 인간화된 것일 수 있다.

shRNA는 임의의 적합한 벡터, 예컨대, 2개의 별개의 상보적인 RNA 분자, 또는 2개의 상보적인 부위를 갖는 단일 RNA 분자로서의 재조합 바이러스 벡터로부터 발현될 수 있다. 이와 관련하여, 발현될 shRNA 분자(들)에 대한 코딩 서열을 수용할 수 있는 임의의 바이러스 벡터가 사용될 수 있다. 적합한 벡터의 예시는 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 레트로바이러스(예를 들면, 렌티바이러스), 랍도바이러스(rhabdoviruses), 뮤린 백혈병 바이러스(murine leukemia virus), 헤르페스 바이러스 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 바람직한 바이러스는 렌티바이러스이다. 바이러스 벡터의 향성(tropism)은 다른 바이러스의 외피 단백질 또는 기타 표면 항원으로 벡터를 슈도타이핑(pseudotyping)하여 변형될 수 있다. 재조합 벡터로 인한 세포 내 shRNA 발현에 대한 대안으로서, 화학적으로 안정화된 shRNA 또는 siRNA들 또한 본 개시의 방법에서 제제로 투여되어 사용될 수 있다. 일단 세포 내에 도입되면 siRNA를 생산하는 shRNA를 발현하기 위한 벡터는 상업적으로 이용 가능하다. 또한, 사실상 거의 모든 공지된 인간 유전자들을 표적화하는 shRNA들 또는 siRNA들 또한 상업적으로 이용 가능하다.

본 개시는 또한 약제학적으로 허용 가능한 담체 및 AP2-CME mRNA에 향하는 상기 펩티드 및/또는 상기 RNAi 제제 및, 선택적으로, 진통제(예를 들면, 비스테로이드 항염증제(NSAID) 및/또는 마취제 및/또는 항염증제(예를 들면, 글루코코르티코이드(glucorticoid))를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 진통제의 예시는 아세트아미노펜, 이부프로펜, 나프록센, 멜록시캄, 케토로락, 디클로페낙, 케토프로펜, 피록시캄 및 메타미졸을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 마취제의 예시는 부피바카인, 에티도카인, 레보부피바카인, 리도카인, 메피바카인, 프릴로카인, 로피바카인, 프로카인, 클로로프로카인, 히드로코르티손, 트리암시놀론, 메틸프레드니솔론을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 당업자에게 알려진 기술 및 담체를 사용하여(예를 들면, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2005) 21st Edition, Philadelphia, PA. Lippincott Williams & Wilkins), 조성물은 예를 들면, 근육내, 정맥내, 동맥내, 피내, 척수강내, 피하, 복강내, 폐내, 비강내 및 두개내 주사제 또는 조성물로서 제형화될 수 있다. 이들은 또한 예를 들면, 구강, 협측(buccal), 또는 설하 조성물, 좌약, 국소 크림, 또는 경피 패치로서 제형화될 수 있다.

조성물의 비제한적인 예시는 용액, 현탁액, 유화제, 사용 전 용매 중 용해 또는 현탁된 고형 주사 가능한 조성물 등을 포함한다. 주사제는 희석제에 활성 성분들 중 하나 이상을 용해, 현탁 또는 유화시켜 제조될 수 있다. 희석제의 예시는 주사용 증류수, 생리 식염수, 식물성 오일, 알코올 및 이들의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 주사제는 안정화제, 가용화제, 현탁제, 유화제, 진정제(soothing agents), 완충액, 보존제 등을 함유할 수 있다. 주사제는 최종 제형 단계에서 멸균되거나 멸균 절차에 의해 제조될 수 있다. 본 개시의 조성물은 또한 예를 들면, 동결 건조에 의해 멸균 고형 제제로 제형화될 수 있고, 사용 직전에 멸균 주사용 수(sterile injectable water) 또는 기타 멸균 희석제(들) 중 멸균 또는 용해시킨 후 사용될 수 있다.

일 측면에서, 본 개시는 AP2-CME mRNA에 향하는 상기 펩티드 및/또는 상기 RNAi 제제의 치료학적, 예방학적 또는 마취학적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에 투여함으로써 통증을 치료 또는 예방하거나 마취를 유도하는 방법을 제공한다.

일 구현예에서, 상기 대상체는 인간 또는 비인간 포유동물이다.

추가 구현예에서, 상기 대상체는 오피오이드를 섭취하지 않거나, 오피오이드에 잘 견디지 못하거나, 또는 오피오이드 중독이 재발할 위험이 있다. 오피오이드 내성, 중독, 또는 재발 위험은 의료 전문가, 예컨대, 외과의사 또는 기타 임상의에 의해 주관적으로 또는 객관적으로 결정될 수 있다.

일 구현예에서, 상기 통증은 통각수용성(nociceptive)이다. 또 다른 구현예에서, 상기 통증은 신경병증성(neuropathic)이다. 상기 통증은 임의의 질병, 상태, 또는 발병의 증상일 수 있는데, 예컨대, 손상(예를 들면, 척수 손상, 신경 손상, 신체 손상 또는 화상), 만성 질환(예를 들면, 당뇨병, 대상 포진, 주요 우울 장애, 섬유근육통, 두통, 관절염, 암, 다발 경화증, 염증성 장 질환 또는 HIV/AIDS), 신경근병증, 만성 염증(예를 들면, 반복적인 스트레스와 관련된 만성 염증, 예컨대, 손목 터널 증후군), 화학요법, 방사선, 모턴 신경종(Morton's neuroma), 기계적/열적 스트레스, 이질통/통각 과민증(이들 각각은 기계적 또는 열적이거나, 움직임과 관련될 수 있음)의 증상일 수 있다. 일 구현예에서, 상기 통각 과민증은 오피오이드-유도성(opioid-induced)이다. 상기 통증은 수술 후 통증일 수 있다. 예방되는 통증은 예상되는 통증, 예컨대, 수술, 복강경, 화학요법, 치과 치료, 방사선, 및 출산 중 통증일 수 있다. 상기 통증은 만성 및/또는 급성 통증일 수 있다.

만성 통증은 약 12주를 초과하여 지속되는 임의의 통증이다. 또 다른 구현예에서, 만성 통증은 예상되는 치유 기간을 초과하는 통증이다.

급성 통증은 날카로운 느낌(sharp)이며, 통상적으로 약 6개월을 초과하여 지속되지 않는다. 급성 통증은 더 이상 통증의 근본 원인이 없을 때 사라진다. 급성 통증의 원인은 수술, 복강경검사, 골절, 치과 치료, 화상, 베인 상처(cuts), 진통/출산, 및 이들의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

통증의 치료 또는 예방은, 예를 들면, 다양한 검증된 통증 측정 도구(예를 들면, 시각적 상사 척도(visual analog pain scale; VAS), 숫자 통증 평가 척도(numeric rating pain; NRS), 범주형 구술 통증 평가 척도(verbal rating pain scale; VRS), SaO2 및 통증의 인지적 및 생리학적 차원을 평가하는 다차원 척도, 건강 관련 삶의 질 평가, 통증 관련 기능 평가)를 사용한 통증 평가를 기반으로 한 대상체의 기술(description)에 의해 결정될 수 있다. 통증 측정 도구의 비제한적인 예시는 VAS, NRS, VRS, 맥길 통증 설문지 (McGill Pain Questionnaire; MPQ) 및 이의 축약형(Short Form), 간이 통증 조사지(The Brief Pain Inventory; BPI), 신경병증성 통증 점수(Neuropathic Pain Score; NPS), 통증 자기 효능 설문지(Pain Self-Efficacy Questionnaire), 환자의 전반적인 변화 척도(Patient Global Impression of Change scale), 유럽형 삶의 질 평가 기기(European Quality of Life Instrument; EQ 5D), 통증 장애 지표(Pain Disability Index; PDI), 오스웨스트리 장애 지표(Oswestry Disability Indexㅣ ODI), 벡 우울 조사지(Beck Depression Inventory) 및 기분 상태 프로파일(Profile of Mood States), Wong-Baker 얼굴 통증 척도, FLACC 척도 (얼굴, 다리, 활동, 울음, 및 마음의 안정도(consolability)), CRIES 척도 (울음 , SaO2 <95%를 위한 O2 필요 , 활력 신호(BP 및 HR) 증가, 얼굴 표현(expression), 불면(sleepless)), COMFORT 척도, Mankoski 통증 척도, 통증 강도의 지시자 구별 척도(descriptor differential scale of pain intensity), 및 이들의 조합을 포함한다.

통증이 적어도 부분적으로 완화될 때 통증은 치료되거나 예방된다. 마찬가지로, 본 발명은 완전한 마취를 필요로 하지 않는다. 예를 들면, 본 치료 또는 예방은 대상체의 기계적/촉각적 민감도가 적어도 감소되었을 때 마취적으로 효과적인 것으로 간주된다. 대상체의 기계적/촉각적 민감도는 대상체 및/또는 의료 전문가, 예컨대, 외과의사, 기타 의사 또는 기타 임상의에 의해 주관적으로 또는 객관적으로 결정될 수 있다. 마취는 국소적이거나 중추적(central)일 수 있다.

대상체의 통증(예를 들면, 통증 민감도)이 감소되었을 때 대상체의 통증이 완화될 수 있다. 예를 들면, 대상체의 통증(예를 들면, 통증 민감도)가 바람직한 수준(예를 들면, 통증이 불편하지 않음)일 때 대상체의 통증이 완화된다.

일 구현예에서, 투여 후, 대상체의 통증은, 100번째 자리의 모든 정수 및 소수 그리고 그 사이의 모든 범위를 포함하여 0.25 내지 120 시간(예를 들면, 24 내지 120 시간, 1 내지 48시간, 12 내지 48시간, 또는 24 내지 48시간) 동안 완화/치료/예방될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 투여 후, 마취는100번째 자리의 모든 정수 및 소수 그리고 그 사이의 모든 범위를 포함하여 0.25 내지 100시간동안 유도된다.

AP2-CME mRNA에 향하는 상기 펩티드 및/또는 상기 RNAi 제제는 단독으로 투여 또는 사용되거나 진통제 및/또는 마취제 및/또는 항염증제와 병용하여 투여 또는 사용될 수 있다. 진통제, 마취제, 및 항염증제의 예시는 상기에 제공된다. 병용하여 투여될 때, 상기 투여 또는 사용은 동시에 또는 순차적으로(임의의 순서로) 일어날 수 있다. 전술한 것 중 임의의 것은 복합 제형(combined formulation) 또는 개별 제형으로 제형화될 수 있다.

전술한 투여(들) 중 임의의 것 또는 전부는 예를 들면, 근육내 투여, 정맥내 투여, 동맥내 투여, 피내 투여, 척수강내 투여, 복강내 투여, 폐내 투여, 비강내 투여, 두개내 투여, 경구 투여, 협측 투여, 설하 투여, 피하 투여, 항문 투여, 국소 투여, 경피 투여, 또는 신경 주사에 의해 이루어질 수 있다. 일 구현예에서, 상기 투여는 니들 없는 주사(들)에 의해 수행된다.

바람직한 구현예에서, shRNA는 신경(들)에 직접 투여된다.

일 구현예에서, AP2-CME mRNA에 향하는 상기 펩티드 및/또는 상기 RNAi 제제는 수술 절차 또는 진통/출산 동안 투여된다.

일 측면에서, 본 개시는 키트를 추가로 제공한다. 키트는 AP2-CME mRNA에 향하는 펩티드 및/또는 RNAi제제를 포함하는 약제학적 조성물을 포함할 수 있다.

일 구현예에서, 키트는 약제학적 조성물을 함유하는 패키지(폐쇄된 또는 밀봉된 패키지), 예컨대, 하나 이상의 폐쇄된 또는 밀봉된 바이알, 병, 블리스터 (버블) 팩, 또는 약제학적 조성물의 판매, 분배, 또는 사용을 위한 임의의 다른 적합한 패키징을 포함한다.

일 구현예에서, 키트는 프린팅된 물질(printed material)을 추가로 포함한다. 상기 프린팅된 물질은 프린팅된 정보를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 프린팅된 정보는 예를 들면, 라벨, 또는 종이 삽입물(paper insert) 상에 제공될 수 있거나, 패키징 물질 그 자체에 프린팅될 수 있다. 상기 프린팅된 정보는 예를 들면, 패키지 내 조성물을 식별하는 정보, 다른 활성 및/또는 비활성 성분의 양 및 유형, 및 조성물을 섭취하는 지침, 예컨대, 주어진 기간 동안 복용할 복용 횟수, 및/또는 약사 및/또는 의료 제공자(예컨대, 외과의사) 또는 환자에게 전달되는 정보를 포함할 수 있다. 예를 들면, 이 제품은 용기의 내용물을 설명하고 상기 용기의 내용물의 사용과 관련된 표시 및/또는 지침을 제공하는 라벨을 포함한다.

본 명세서에서 개시된 다양한 구현예 및 예시에서 설명된 방법의 단계들은 본 개시의 방법들을 수행하기에 충분하다. 따라서, 일 구현예에서, 본 방법은 본 명세서에 개시된 방법들의 단계들의 조합으로 필수적으로 이루어진다. 또 다른 구현예에서, 본 방법은 이러한 단계들로 이루어진다.

하기 진술에서, 본 개시의 펩티드, 조성물, 및 상기 펩티드 및 조성물을 사용하는 방법의 다양한 예시들이 기재된다.

진술 1. 하기 서열: X¹X²X³X⁴ LX⁵ (서열 번호 7)을 포함하는 펩티드로서, 상기 X¹은 D, E, S 및 T로부터 선택되고; 상기 X², X³, 및 X⁴는 임의의 아미노산으로부터 각각 독립적으로 선택되고; 상기 X⁵는 L 및 I로부터 선택되며; 상기 L, X¹, 및/또는 X⁵는 선택적으로 인산화되고 펩티드는 6 내지 20 아미노산 잔기(예를 들면, 6, 7, 8, ,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20) (예를 들면, 10 내지 13 아미노산 잔기(예를 들면, 10, 11, 12, 또는 13)) 길이인, 펩티드.

진술 2. 진술 1에 있어서, 상기 C-말단 아미노산 잔기 또는 상기 C-말단 아미노산 직전의 아미노산 잔기는 인산화되는 것인, 펩티드.

진술 3. 진술 1 또는 진술 2에 있어서, 상기 펩티드는 지질화된 것인, 펩티드.

진술 4. 진술 3에 있어서, 상기 지질화는 N-말단 아미노산 잔기에서 이루어지는 것인, 펩티드.

진술 5. 진술 3 또는 진술 4에 있어서, 상기 지질화는 미리스토일화(myristoylation), 옥타노일화(octanoylation), 라우오릴화(lauorylation), 팔미토일화(palmitoylation), 또는 스테아로일화(tearoylation)인 것인, 펩티드.

진술 6. 진술 1 내지 진술 5 중 어느 한 진술에 있어서, 상기 펩티드는 하기 서열: X⁶X¹X²X³X⁴LX⁵ (서열 번호8)을 가지며, 상기 X⁶은 S 및 T로부터 선택되고, 상기 X⁶은 선택적으로 인산화되는 것인, 펩티드.

진술 7. 진술 1 내지 진술 6중 어느 한 진술에 있어서, 상기 펩티드는 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 10, 11, 및 12로부터 선택되는 서열을 포함하는 것인, 펩티드.

진술 8. 진술 1 내지 진술 7 중 어느 한 진술에 기재된 펩티드 하나 이상 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 조성물.

진술 9. 진술 8에 있어서, 상기 조성물은 하나 이상의 진통제 및/또는 하나 이상의 마취제를 더 포함하는, 조성물.

진술 10. 진술 8 또는 진술 9에 있어서, 상기 하나 이상의 진통제 및/또는 상기 하나 이상의 마취제는 아세트아미노펜, 아스피린, 이부프로펜, 나프록센, 멜록시캄, 케토로락, 디클로페낙, 케토프로펜, 피록시캄, 메타미졸, 부피바카인, 에티도카인, 레보부피바카인, 리도카인, 메피바카인, 프릴로카인, 로피바카인, 프로카인, 클로로프로카인, 하이드로코르티손, 트리암시놀론, 메틸프레드니솔론, 또는 이들의 조합인 것인, 조성물.

진술 11. 진술 8 내지 진술 10 중 어느 한 진술에 있어서, 상기 조성물은 AP2-CME 표적 shRNA 및/또는 AP2-CME 표적 siRNA를 더 포함하는, 조성물.

진술 12. 치료를 필요로 하는 대상체에서 통증을 치료하거나 통증 민감도를 증가시키는 방법으로서, 상기 방법은: 진술 8 내지 진술 10 중 어느 한 진술에 기재된 조성물 하나 이상의 치료학적 유효량을 치료를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하고,

상기 치료를 필요로 하는 대상체의 통증은 완화되거나 상기 치료를 필요로 하는 대상체의 통증 민감도는 증가되는 것인, 방법.

진술 13. 진술 12에 있어서, 상기 방법은 하나 이상의 진통제 및/또는 하나 이상의 마취제를 투여하는 단계를 더 포함하는, 방법.

진술 14. 진술 12 또는 진술 13에 있어서, 상기 투여 단계는 통증을 예상하여 수행되는 것인, 방법.

진술 15. 진술 12 내지 진술 14 중 어느 한 진술에 있어서, 상기 치료를 필요로 하는 대상체는 손상, 만성 질환, 만성 염증, 모턴 신경종, 수술 중/수술 후 통증 또는 이들의 조합을 갖는 것인, 방법.

진술 16. 진술 15에 있어서, 상기 손상은 척수 손상, 신경 손상, 화상, 또는 이들의 조합인 것인, 방법.

진술 17. 진술 16에 있어서, 상기 만성 질환은 당뇨병, 대상 포진, 주요 우울 장애, 섬유근육통, 두통, 관절염, 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 다발성 경화증, 염증성 장 질환, 정신 분열증(schizophrenia), 자폐 스펙트럼 장애(autism spectrum disorders), 암, 신경근병증 또는 이들의 조합인 것인, 방법.

진술 18. 진술 12 내지 진술 17 중 어느 한 진술에 있어서, 상기 대상체에 투여되는 펩티드는 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 10, 11, 12, 및 이들의 조합으로부터 선택되는 서열을 갖는, 방법.

진술 19. 진술 12 내지 진술 18 중 어느 한 진술에 있어서, 상기 대상체의 통증은 1회 투여 단계 후 1 내지 120 시간 동안 완화되는 것인, 방법.

진술 20. 진술 12 내지 진술 19 중 어느 한 진술에 있어서, 상기 대상체의 통증은 1회 투여 단계 후 24 내지 120 시간 동안 완화되는 것인, 방법.

하기 실시예들은 본 개시를 예시하기 위해 제시된다. 이들은 어떠한 청구 대상도 제한하려는 의도가 아니다.

실시예 1

본 실시예는 본 개시의 방법에 대한 설명을 제공한다.

생체 내 DRG 뉴런 유전자 녹다운 기술을 사용하여 이전 연구의 시험관내 데이터를 확증하였다. 생체 내 연구에서AP2-CME가 행동 과정에 영향을 미칠 수 있는지 이해하는 것은 어렵다. 형질전환 기반 접근은 발달 과정에서 AP2-CME가 수행하는 필수적인 역할로 인해 제한적이다. 이 제한을 극복하기 위해, 척수 신경 주사 기술(spinal nerve injection technique)을 사용하여 생체 내 AP2 복합체의 알파-2-서브유닛(AP2A2)을 표적화하는 shRNA를 나이브 마우스의 좌골 신경에 편측으로 형질감염(unilaterally transfect)시켰다. 금성 및 만성 염증성 통증 모델에서, AP2A2 결핍은 통증-유사 행동의 유의한 감소를 초래한다. 특히, 포르말린 분석에서, AP2A2-결핍 마우스는 말초 통각수용기 감작으로 인해 통증-유사 행동의 완화를 나타냈다. 완전 프로인트 아쥬반트(Complete Freund's Adjuvant; CFA) 매개 만성 통증 동안에, AP2A2-결핍 마우스는 열적 행동 테스트 동안 발 회피 지연 시간의 유의한 증가를 나타내어, AP2-CME가 만성 통증 상태의 개시에 필요한 것을 시사했다. 또한, 확립된 CFA 만성 통증 동안에, AP2A2 서브유닛의 녹다운은 열 통각 과민(thermal hyperalgesia)을 빠르게 역전(reversed)시켜, AP2-CME가 만성 통증 상태의 유지에 필요한 것을 시사했다.

마지막으로, AP2-CME의 국소 약리학적 억제를 유전 연구를 보충하는데 사용하였고, 유사하게도 급성 및 만성 열적 통증 행동의 약화를 발견하였다. 본 명세서에서, 통증 신호전달에서 배근 신경절 AP2-CME에 대한 특정 기능이 설명되고 통증 관리를 위한 약리학적 표적으로서 말초 신경 말단이 확인되었다.

유전적 접근 및 약리학적 접근 둘 모두에 의한 세포내 이입의 억제는 마우스에서 통증-유사 행동의 강력한 감소를 초래했고, 이는 놀라웠다. 임의의 이론에 얽매이지 않고, 세포내 이입의 억제는 염증 동안 DRG에서 Slack K_Na 채널과 같은 막 단백질의 내재화를 방지하는 막 "서스펜션(suspension)"을 유도하는 것으로 믿어진다. Slack 채널 내재화를 방지하는 것은 예를 들면 염증 전에 막에서 이러한 채널을 고정시키고 기저막 흥분성을 유지시키고 염증-유도 통각수용기 과흥분성을 방지한다.

그럼에도 불구하고, 감소된 통증 행동에 기여하는 다른 고정된 막 단백질의 가능성을 배제할 수 없다. 예를 들면, DRG 뉴런은 침해수용유도성(pro-nociceptive) 및 항침해수용성(anti-nociceptive) G 단백질 결합 수용체(G-protein coupled receptor; GPCR) 둘 모두를 발현시킨다. 항-침해수용성 GPCR을 탈감작하지 못하는 것은 관찰된 효과에 기여할 수 있다. GPCR을 탈감작하지 않는 것(non-desensitizing)은 통증을 악화시킬 수도 있다. 실제로 연구에 따르면 베타2-어레스틴(beta2-arrestin) 녹아웃 마우스에서 포르말린 단계 II 염증성 통증이 악화된 것으로 나타났다. 이론에 얽매이지 않고, 통증 신호전달에 대한 서스펜딩된 GPCR(suspended GPCR)의 가능한 순 효과는 가장 작을 것이고, 흥분성을 조절하는 막 이온 채널이 이 절차에 더 적절한 것으로 여겨진다.

유전적 접근 및 약리학적 접근 둘 모두를 사용하여, 본 결과는 염증성 통증 상태의 개시가 뉴런 세포내 이입에 의존한다는 것을 나타냈다. 만성 염증성 통증 상태 동안 PKA 신호전달에서 PKC 신호전달로의 전이에 대한 광범위한 문헌이 있다. 이전 연구에서 CHO 세포에서 이종 발현될 때 PKC 활성화는 Slack 채널 강화(Slack channel potentiation)를 유발하는 것이 나타났기 때문에, Slack K_Na 채널의 세포내 이입이 만성 염증성 통증을 유지하는데 중요하다는 것은 놀라웠다. 하지만, Slack 채널 및 Ywhaz의 이종적 공동-발현 동안에, PKC 활성화가 Slack 채널의 세포내 이입 및 Slack K_Na 전류의 하향조절을 유발하는 것으로 관찰되었다. 상기 관찰은 DRG 뉴런 세포내 이입이 만성 염증성 통증 상태를 유지하는데 중요하다는 생각과 더 일치한다.

또한, 밀접하게 관련된 Slick 채널은 또한 AP2 세포내 디류신 모티프(dileucine motif)를 함유한다. 이전 연구에서 DRG 뉴런에서 빠르게 활성화되는 Slick 채널을 과발현시키는 것은 뉴런이 역치상 자극(suprathreshold stimulation) 동안 활동 전위를 발화할 수 없게 하는 것을 나타냈다. 또한, Slick 채널은 CGRP를 함유하는 큰 조밀 코어 소포(dense core vesicles)에 국소화된 것이 나타났다. 임의의 이론에 얽매이지 않고, Slick 채널들은 염증 신호전달 동안에 DRG 뉴런 막에 축적되고 이들을 내재화할 수 없는 것은 통증 행동의 감소, 특히 열 통각 과민의 감소에 기여할 수 있다. Slick 채널은 열 검출을 인코딩하는 CGRP 양성 뉴런에 독점적으로 발현된다.

AP2A2를 유전적으로 표적화한 후, 미리스토일화된 세포 투과 펩티드를 사용하여 세포내 이입의 약리학적 억제를 추구하였다. 임의의 이론에 얽매이지 않고, AP2-CME는 염증성 통증 개시 및 유지에 중요한 것으로 간주된다. 염증성 통증 처리(inflammatory pain processing)에서 DRG 말초 신경 말단(DRG peripheral terminal) 세포내 이입의 역할은 또한 유전적 조작 접근법과 관련된 가능한 중추 효과로부터 차별화되었다. 즉, 펩티드의 작용이 국소적인 것으로 해석된다. 세포 투과 펩티드를 진통을 위한 소분자로 사용했다. 염증 부위에 직접AP2 억제 펩티드를 투여하는 것은 급성 염증성 통증 모델에서 핥는 행동을 약화시키고 CFA 만성 염증성 통증 모델에서 주사 후 24시간에 동물의 열 과민성(thermal hypersensitivity)를 강력히 감소시켰다. 임의의 이론에 얽매이지 않고, 이 펩티드의 효능은 축삭을 통해 측방향(laterally) 및 종방향(longitudinally)으로 확산하는 능력에 기인한다. 핥는 행동 vs 발을 들어 올리는 행동에 대한 다양한 디류신 펩티드들의 차등 효과가 나타났고, 이때, 펩티드의 인산화 상태가 각 행동에서 효능에 결정적인 영향을 미치는 것으로 보였다 (표 1 및 도 18a). 데이터는 막을 통한 빠른 측방향 확산을 나타냈다(단일 주사는 주사 후 24시간에 효과적임). 데이터는 또한 더 느린 종방향 확산을 나타낸다(효과의 지속 시간은 만성 통증 모델에서 72시간을 초과함). 임의의 이론에 얽매이지 않고, 본 발명자는 AP2 억제 펩티드가 통각수용기 막 단백질의 AP2-CME 의존적 변경을 방지하는 세포내 이입의 장기 억제를 생성하였다고 믿는다. 임의의 이론에 얽매이지 않고, 본 발명자는 이는 DRG 회복을 강화하는 통각수용친화성 상태로 더 진행하는 것을 방지하는 생물학적 정지 상태로 막을 필수적으로 잠구었다고(locking)다고 믿는다. 임의의 이론에 얽매이지 않고, 본 발명자는 펩티드의 인산화가 펩티드 흡수 및/또는 AP2 복합체 억제 효능을 향상시킬 수 있다고 믿는다.

생체 내 AP2A2 녹다운은 급성 염증성 통증 행동을 감소시켰다. 이전 연구에 따르면 시험관 내에서 AP2-CME를 억제하는 것은 PKA-유도 DRG 뉴런 과흥분성을 감소시키고 AP2A2 서브유닛이 PKA 자극 후 DRG 뉴런의 Slack K_Na 채널에 직접 결합하는 것으로 나타났다. 통증 행동에 대한 AP2A2의 생체 내 녹다운의 결과를 조사했다. 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA) 서열을 함유하는 비바이러스 벡터의 척수 신경 주사 기술을 사용했다. 이 기술은 축삭 역행 수송을 통해 DRG 감각 뉴런 세포체로 shRNA 플라스미드가 전달되는 것을 가능하게 한다. 나이브 수컷 마우스 및 나이브 암컷 마우스에 AP2A2 shRNA의 척수 신경 내 주사를 수행했고, 7일 후에, 본 발명자는 포르말린 분석을 사용하여 급성 통증을 평가했다. 5% 포르말린의 발바닥내 (i.pl.) 주사는 이 급성 염증성 통증 모델과 관련된 2단계 염증성 통증 반응을 유도했다. 간략히 말하자면, 포르말린 분석은 2단계로 나뉠 수 있다(단계 I 및 단계 II). 단계 I은 포르말린에 의한 통각수용기의 직접적인 활성화로 인한 것으로 생각되는 단기(brief) 행동 반응이고, 단계 II는 말초 및 중추 감작 둘 모두로 인한 장기 반응이며, 중추 감작은 척수로의 지속적인 통각수용성 투입물로 인한 것이다. AP2A2 서브유닛의 녹다운은 단계 I 반응을 유의하게 변경하지 않았지만; 단계 II 반응의 유의한 감소를 나타냈다(도 1a). 마우스는 감소된 침해방어성 행동을 나타냈고(도 1b), 감소된 통증 표현형은 쉽게 관찰 가능했다. 단백질 녹다운을 입증하기 위해 마우스를 분석 후 희생시켰고, AP2A2 사일런싱을 웨스턴 분석으로 확인하였다. AP2A2 단백질 발현은 편측 shRNA-의존성 녹다운 후 유의하게 감소되는 것으로 확인되었다 (도 1c).

생체 내 AP2A2 녹다운은 만성 염증성 통증 행동을 감소시켰다. CFA가 설치류 뒷발에 주입될 때, 다양한 무해한 자극에 대한 과민성을 일으키는 강력한 면역-매개 염증 반응이 도출된다- 인간에서 만성 염증성 통증 반응을 근접하게 모방함. CFA-유도 염즘성 통증의 발달에서 AP2A2 결핍의 결과를 조사했다. 실험 개요에 대한 개략도(schematic representation)를 도 2a에 도시했다. 나이브 수컷 및 나이브 암컷 마우스에서 AP2A2 shRNA 척수 신경 내 주사 전에 기준선 열 반응성을 수행했다. 척수 신경 수술 후, 동물들이 CFA 주사 전 7일 동안 회복하도록 하였다. CFA를 동측 뒷발에 주사하였고 열 반응성을 측정했다. CFA 앰퓰 (Thermo Scientific)을 사용하여 각 동물들이 동일한 활성으로 CFA를 받는 것을 보장하였다; 결과의 재현성 강화. 대조군 shRNA를 주사 받은 마우스는 CFA 주사 후 발 회피 지연 시간(PWL)의 예상된 감소를 나타냈고, 이전에 이 마우스의 균주에서 관찰되었다. 하지만, AP2A2 결핍은 여러 테스트 증분(at multiple testing increments)에서 PWL을 약화시켰다 (도 2a). 임의의 이론에 얽매이지 않고, 상기 결과는 AP2A2가 CFA-유도 통각 과민의 발달에 필요함을 시사한다. AP2A2 녹다운이 확립된 CFA-염증성 통증을 약화시킬 수 있는지 여부를 조사했다. 실험 개요의 개략도는 도 2b 상단에 도시했다. 다시, 동측 및 반대측 발에서 기초 열 반응성이 확립된 후 CFA 주입이 이루어졌다. 도 2a에 나타낸 바와 같이, CFA는 24시간에 피크 PWL을 유발한 후, 기준선 값으로 점진적으로 복귀하여 전형적인 CFA 반응을 나타낸다. 마우스에서 척수 신경 주사 기술은 최소 침윤적이고, 강력하며, 빠르고 재현성이 높은 것으로 나타났다. 마우스는 마취에서 회복된 후 즉시 탐색적 행동과 클라이밍(climbing)을 보였다. 따라서 CFA를 뒷발에 주입한 후 24시간에 수술을 수행하고 회복 전 통각 과민 행동을 계속 평가할 수 있도록 수술 후 4일째에 열적 행동 테스트(thermal behavior test)를 시작하기로 결정했다. AP2A2를 녹다운하면 대조군 shRNA와 비교하여 PWL의 상당한 약화를 초래하여 기준선 열 반응성으로의 복귀를 촉진하는 것으로 밝혀졌다(도 2b). 상기 결과는 확립된 만성 염증 통증 동안에 AP2-CME를 표적화하는 것은 통증 완화를 초래하는 것을 시사한다.

세포 투과성 AP2 펩티드 억제제는 급성 및 만성 염증성 통증 행동을 감소시켰다. AP2A2는 시냅스 외에서 발현되는 것으로 나타났지만, 시냅스 전 동형 AP2A1과 달리 AP2A2 녹다운은 척수에서 시냅스 전달에 영향을 미치지 않는 것으로 조사되었다. 단계 I 포르말린 행동의 현저한 감소의 부재(도 1a)는 시냅스 전달이 유전자 조작에 의해 변하지 않았음을 시사한다. 그럼에도 불구하고, 세포 투과성 AP2 억제제는 국소적으로 사용되어 말초 신경 말단 기능을 조절하였다.

미리스토일화 펩티드는 생체 내 신경 말단 기능을 표적화하기 위해 사용되어 왔다. 구체적으로, AP2 억제제는 디류신계 펩티드이다. 디류신계 펩티드는 구조적으로 AP2 복합체의 σ2 인터페이스에 결합하는 것으로 나타났다. 더욱이, AP2 억제 펩티드는 막으로의 클라트린 동원을 차단하고, 1차 DRG 뉴런에서 Slack 채널 내재화를 차단하고, PKA 자극 동안 과흥분성을 방지한다는 것이 이전에 밝혀졌다.

같은 발에 5% 포르말린을 주사하기 24시간 전에 AP2 억제 펩티드 또는 스크램블된 펩티드(100μM, 20μl)를 마우스의 오른쪽 뒷발에 단일 i.pl 주사했다. 펩티드 서열은 표 1에 제시되어 있다. AP2 억제 펩티드와의 전처리는 스크램블된 펩티드와 비교하여 단계 II 발 핥는 통증 유사 행동을 유의하게 감소시켰다(도 3a). 일련의 디류신계 펩티드를 검사할 때 단계 II 통증 행동의 감소가 관찰되었다(표 1 및 도 18a). 이는 AP2-CME가 이 디류신계 펩티드를 사용하여 생체 내에서 국소적으로 억제될 수 있음을 나타낸다.

포르말린 분석 및 이 국소 펩티드 접근법을 사용하는 것의 한 가지 한계는 포르말린 주사 부위의 구심성 신경이 가장 높은 농도의 포르말린을 받고 고정을 겪을 가능성이 가장 높다는 것다. 이러한 동일한 구심성 신경 또한 가장 높은 농도의 펩티드를 받게 되므로, 포르말린 분석은 잠재적으로 이러한 펩티드의 실제 진통 잠재력을 과소평가하였다. 따라서, 확립된 CFA-유도 만성 통증 시 진통 특성이 결정됨을 확인하였다. 이 경우에서, AP2 펩티드 억제제 및 스크램블된 펩티드 대조군을 CFA 주사 후 24시간에 염증이 있는 발에 직접 주사하였다. 이후, AP2 펩티드의 단일 국소 투여 후 열 반응성을 평가하고 스크램블된 펩티드 대조군과 비교하였다. AP2 억제제 투여 1일 이내에 열 통각 과민의 유의한 약화가 관찰되었다. 또한, 열 통각 과민의 감소는 1회 주입 후 다시 96시간 동안 지속되었다(도 3b). 기계적 이질통은 본 프레이 테스트를 사용하여 평가되었으며 AP2 펩티드 억제제의 1회 투여는 투여 후 24시간에 작지만 유의한 통증 행동의 감소를 생성하는 것으로 나타났다. 하지만, 그 효과는 적당하고 오래 지속되지 않았다(도 3c). 이 데이터는 AP2 억제 및 통증 행동의 감소가 기계적 이질통보다 열 통각 과민에 대한 선택성을 보여주었음을 시사한다. 또한 유전적 녹다운이나 펩티드 억제가 염증성 부종에 영향을 미치지 않는다는 사실이 주목되었다(도 15ab의 A). 이는 통증 행동 효과가 염증 세포 세포내 이입의 억제가 아니라 뉴런 AP2-CME 억제에 기인한다는 것을 시사했다.

실험 재료 및 방법

동물. C57BL/6 마우스는 Envigo에서 구입했다. 사용된 모든 동물을 버팔로 대학교(University at Buffalo; UB) 제이콥스 의학 및 생물의학 대학(Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences)에 위치한 실험 동물 시설에 12시간의 명암 주기(light/dark cycle)로 수용했다. 수컷 C57BL/6 마우스는 공격성 문제로 인해 단일 수용되었으며, 암컷은 케이지당 4마리씩 그룹화되었다. 모든 동물들은 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있었다. 모든 동물 실험들을 미국 국립 보건원이 제공한 "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals"에서 정한 가이드라인에 따라 수행했다. 모든 동물 프로토콜은 UB 동물 실험 윤리 위원회(UB Institute Animal Care Use Committee)에 의해 검토되고 승인되었다.

JetPEI®를 사용한 생체내 형질감염. 이전에 설명한 것과 같이 신경 주사를 수행했다. 간단히 말하면, C57BL/6 마우스를 마취시키고(유도: 3%, 유지: 2%) 엎드린 자세로 두었다. 동물들이 꼬리 및 뒷발 핀치 모두에 대한 반응의 상실로 나타나는 수술이 가능한 정도의 마취(surgical plane of anesthesia) 하에 있으면, 동측 뒷다리의 배측 영역을 요추 영역에서 슬개골 바로 위까지 결 반대로 면도했다. 이어서, 해당 부위를 클로로헥시딘으로 소독한 다음 에탄올 면봉으로 소독하고 마지막으로 몇 방울의 요오드를 사용하여 소독했다. 소독 후 척추의 요추 세그멘트에 3cm 후부 세로 절개를 했다. 멸균된 이쑤시개(toothpick)을 사용하여, L4 척추 근처에서 동측 척추 주위 근육을 조심스럽게 분리하여 좌골 신경을 노출시켰다. 이어서, 주사를 용이하게 하기 위해 신경을 약간 조작했다. N/P 비 8의 PEI/shRNA 플라스미드 DNA 폴리플렉스 1.5μl를 32 게이지 니들(Hamilton 80030, Hamilton, Reno, NV)에 연결된 주사기를 사용하여 오른쪽 뒷발의 척수 신경에 직접 천천히 주사했다. AP2α2 shRNA 및 대조군 shRNA는 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA, USA)에서 구입했다. 주사 후, 용액의 확산을 촉진하고 누출을 최소화하기 위해 니들을 좌골 신경에 적어도 1분 동안 유지하였다. 완전한 지혈이 확인된 후 상처를 상처 클립으로 봉합하고 마우스를 수술 후 관찰하여 주사로 인한 부작용이 없는지 확인했다. 통각 테스트를 재개하기 전에 7일 동안 마우스를 회복시켰다.

세포-투과성 펩티드 제조. 맞춤형 미리스토일화 펩티드는 Genscript에서 주문하고 도착시 -20°C 냉동고에 저장했다. 미리스토일화된 펩티드를 500 μL의 DMSO에 용해시켜 작동 스톡 용액을 생성했다. 적절한 부피의 DMSO 스톡 용액을 1mL의 멸균 식염수에 용해시켜 향후 테스트를 위한 100μM 앨리쿼트들을 생성했다. 임의의 스톡 솔루션과 함께 이 앨리쿼트들을 필요할 때까지 -80°C에서 동결시켰고, 필요한 시점에서 한 앨리쿼트를 해동하고 주입한 다음, 샘플의 동결-해동 주기를 최소화하기 위해 폐기했다. 포르말린-펩티드 실험에서 동물들은 실험 전 24시간에 용해된 펩티드의 20 μL 발바닥내 주사를 받았다. FCA-펩티드 실험에서, 동물들은 FCA 주사 후 24시간에 용해된 펩티드의 20μL 발바닥내 주사를 받았다.

간략히 말하면, 펩티드들은 고체상 합성 방법에 의해 합성되었다. 이는 C-말단에서 N-말단 방향(생체내 생물학적 시스템에서 단백질 합성의 방향과 반대)으로 아미노산을 단계별로 통합하는 것을 포함했다. 합성은 하나의 아미노산의 카르복실기가 다른 아미노산의 아미노기에 커플링된 2개의 아미노산 사이의 펩티드 결합의 형성을 기반으로 했다. 원하는 펩티드 서열이 얻어질 때까지 이 과정을 반복했다. 모든 아미노산의 측쇄는 합성의 주기적인 단계 전반에 걸쳐 지속적인 화학적 처리를 견딜 수 있는 특정 "영구적인" 기(group)으로 캡핑(capping)되어 있으며 초기 펩티드 사슬의 정제 직전에 절단하였다. 또한, 들어오는 각 아미노산의 N-말단은 9-플루오레닐메톡시카르보닐(Fmoc) 기로 보호되었으며, 이는 다음 아미노산이 사슬에 통합될 수 있도록 각 주기에서 약한 염기에 의해 제거되었다. 이러한 Fmoc 그룹은 펩티드 사슬의 길이 또는 분지의 변화로 이어지는 합성 중 비특이적 반응을 방지했다. 탈보호는 일반적으로 펩티드 사슬의 작용기를 알킬화할 가능성이 있는 양이온을 생성한다. 따라서 물, 아니솔 또는 티올 유도체와 같은 스캐빈저(scavenger)를 탈보호 중에 첨가하여 자유 반응성 종을 차단했다. 미리스토일화는 단백질 N-미리스토일화(N-말단에서)를 촉매하는 효소인 N-미리스토일트랜스퍼라제에 의해 달성되었다다. 하나 이상의 이러한 하이드록시-아미노산을 함유하는 펩티드의 경우, 선택적 인산화는 직교 보호(orthogonal protection) 또는 Fmoc-보호된 인산화 아미노산에 의해 달성될 수 있다.

RNAi. shRNA는 2개의 별개의 상보적 RNA 분자로 또는 2개의 상보적 영역을 갖는 단일 RNA 분자로 재조합 바이러스 벡터와 같은 임의의 적합한 벡터로부터 발현될 수 있다. 이와 관련하여, 발현될 shRNA 분자(들)에 대한 코딩 서열을 수용할 수 있는 임의의 바이러스 벡터가 사용될 수 있다. 적합한 벡터의 예시는 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 레트로바이러스(예를 들면, 렌티바이러스), 랍도바이러스, 뮤린 백혈병 바이러스, 헤르페스 바이러스 등으로부터 유래된 벡터를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 바람직한 바이러스는 렌티바이러스이다. 바이러스 벡터의 향성은 또한 다른 바이러스의 외피 단백질 또는 기타 표면 항원으로 벡터를 슈도타이핑(pseudotyping)하여 변형될 수 있다. 재조합 벡터로 인한 세포 내 shRNA 발현에 대한 대안으로서, 화학적으로 안정화된 shRNA 또는 siRNA들 또한 사용될 수 있다. shRNA(일단 세포 내에 도입되면 siRNA를 생산함)를 발현하기 위한 벡터는 상업적으로 이용 가능하다.

포르말린 분석. 수컷 및 암컷 C57BL/6 마우스를 대조군 또는 실험군에 무작위로 할당하였다. 동물들을 30분 동안 또는 실험 당일 탐색 행동이 중단될 때까지 포르말린 테스트 챔버에 적응시켰다. 적응 기간 후, 동물들을 챔버에서 꺼내고 동측 뒷발에 5% 포르말린을 발바닥내 주사한 다음, 테스트 챔버에 다시 배치하고 기록했다. Active WebCam 소프트웨어를 사용하여 포르말린 주사 후 적어도 90분 동안 동물들을 기록했다. 이후에 발 핥기 횟수, 발 들어 올림 횟수 및 전신 움찔거림 횟수에 대해 비디오로 점수를 매겼다. 모든 행동은 90분의 비디오 기록 동안에, 5분마다 1분 동안 점수가 매겨졌다.

프로인트 완전 아쥬반트 만성 통증 모델. C57BL/6 마우스를 마취시키고 (유도: 3%, 유지: 2%) 엎드린 자세로 두었다. 동물들이 꼬리 및 뒷발 핀치(pinch) 모두에 대해 반응이 없는 것으로 나타나는 수술이 가능한 정도의 마취(surgical plane of anesthesia) 하에 있으면, 이들에 20 μL Imject^TM 프로인트 완전 아쥬반트 (FCA; Thermo Fisher Scientific)를 주사하고 회복시켰다. FCA 주사 후 24시간에 행동 테스트를 재개했다. 동물들의 각 코호트는 그룹 간의 변동을 최소화하기 위해 이전에 개봉되지 않은 진공 밀봉 유리 앰퓰로부터 FCA를 받았다.

Hargreaves 분석. 동물들을 폐쇄된 높은 간유리(frosted glass) 플랫폼(Ugo Baseline)에 배치하고 30분 동안 적응시켰다. 탐색 행동이 중단되면, 자동 Hargreaves 장치가 동물들의 뒷발(들) 아래에서 조작된다(Ugo Baseline). 뒷다리당 4회 시행의 평균값으로 발 회피 지연 시간을 계산했다. 시행들 사이의 적절한 회복 시간을 허용하기 위해 5분의 지연 시간이 각 시행에 이어졌다.

본 프레이 분석. 동물들을 폐쇄된 높은 철망 플랫폼(Ugo Baseline)에 배치하고 30분 동안 그 폐쇄 공간(enclosure)에 적응시켰다. 이후, Touch Test 감각 프로브(Touch Test Sensory Probes) (Stoelting)을 반대측 및 동측 뒷발바닥 표면 적용했다. 기계적 통각수용 테스트를 위한 단순화된 Up-Down 방법(Simplified Up-Down method; SUDO) 후에, 필라멘트를 오름 차순으로 적용했고, 필라멘트 제시(filament presentation) 사이에 5분의 지연 시간을 가졌다. 요컨대, 이 시리즈 중, 중간 필라멘트를 동물의 뒷발에 제시했다. 반응을 도출되면, 제시될 다음 필라멘트는 시리즈에서 다음으로 가장 낮은 필라멘트일 것이다. 반응이 도출되지 않으면, 제시될 다음 필라멘트는 시리즈에서 다음으로 가장 높은 필라멘트일 것이다. 이 필라멘트 제시 방법을 5회 반복하였고, 5회차 필라멘트 제시가 마지막이었다. 이어서, 조정 계수(adjustment factor)를 필라멘트 값에 추가하고 일련의 변환 방정식을 사용하여 발 회피의 힘을 계산했다.

웨스턴 블롯 분석. 실험 후 동물들에서 수집한 배근 신경절(DRG) 조직으로부터 전체 단백질을 수집했다. 프로테아제 억제제를 함유하는 냉각된 RIPA 완충액(Sigma)에서 DRG를 균질화하고 필요할 때까지 -80℃에서 저장했다. Mini-PROTEAN TGX Precast Gel (Bio-Rad)에서 모든 샘플들을 실행하였고 0.45 μm 니트로셀룰로오스 막 (BioRad)에 옮겼다. 막을 1x TBST(tris-buffered saline-tween)에서 제조된 5% BSA(bovine serum albumin) 중 토끼 항-AP2α2 (1:1000, Abcam) 및 토끼 항-β-액틴 (1:1000, Sigma)으로 4°C에서 밤새 프로빙(probed)했다. 다음 날, 막을 1xTBST에서 5분 동안 3회 세척한 후, 1x TBST 용액 중 5% BSA에서 제조된 2차 항-토끼 홀스래디쉬 퍼옥시다제 접합 항체(anti-rabbit horseradish peroxidase conjugate antibody) (1:5000; Promega)에서 1시간 동안 실온에서 인큐베이팅했다. 2차 항체 인큐베이션 후, 막을 세척당 5분 동안 3회 더 세척한 다음, 현상 및 이미지화했다. 밴드는 Chemidoc Touch Imaging System (Bio-rad)에서 향상된 화학발광으로 시각화되었고 Image J Software (NIH)로 정량화되었다. 각 실험은 적어도 3회 반복되었다.

통계적 방법. 모든 통계적 검정은 (GraphPad)을 사용하여 수행했다. 데이터는 평균값 ± s.e.m으로 나타난다. 0.05로 설정된 α-값으로 검출 한계를 달성하기 위해 동물 실험에 대해 검증력 분석을 수행했다. 모든 실험에 대해 p-값 < 0.05을 사용하여 통계적 유의도를 결정하였다. 달리 명시되지 않는 한, 다중 비교 및 Bonferroni 사후 교정을 한 이원 분산분석 통계적 검정을 모든 통계적 분석에 수행했다.

실시예 2

본 실시예는 본 개시의 방법에 대한 설명을 제공한다.

통각수용기 세포내 이입은 국소적으로 파괴되었고 다양한 염증성 통증 모델을 사용하여 염증성 통증에 대한 시냅스외 AP2-CME의 생체 내 기여를 특성화하였다. 염증성 통증의 집행 조절자(executive regulator)로서 펩티드성 통각수용기에 대한 추가 증거가 제공된다. 본 개시는 표재성 구심성 신경(superficial nerve afferent)을 표적화하고 장기간 지속되는 진통(analgesia)을 제공하는 지질화된 펩티드모방체의 능력을 강조한다. 또한, 통증 모델 및 동물 종에 걸친 염증 동안의 통증 행동에 있어 성적 이형적(sexually dimorphic) 차이가 기술된다.

동물: 모든 동물들을 Envigo에서 구입했고 모든 실험에 대해 연령/체중을 일치시켰다. 모든 동물들을 버팔로 대학교 제이콥스 의학 및 생물의학 대학에 위치한 실험 동물 시설에 12시간의 명암 주기(light/dark cycle)로 수용했다. 일관성을 위해, 모든 동물들은 실험 기간 동안 단독으로 수용되었다. 모든 동물들은 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있었다. 모든 동물 실험들을 미국 국립 보건원이 제공한 "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals"에서 정한 가이드라인에 따라 수행했다. 모든 동물 프로토콜은 UB 동물 실험 윤리 위원회(UB Institute Animal Care Use Committee)에 의해 검토되고 승인되었다.

α2 표적 shRNA 및 생체 내- jetPEI®를 사용한 좌골 신경의 생체 내 형질감염: 이전에 기술한 것과 같이 신경 주사를 수행했다. 간단히 말하면, C57BL/6 마우스를 마취시키고 엎드린 자세로 두었다. 소독 후, 척추의 요추 세그멘트에 3cm 후부 세로 절개(posterior longitudinal incision)를 수행했다. 멸균된 이쑤시개(toothpick)을 사용하여, 동측 척추 주위 근육을 조심스럽게 분리하여 좌골 신경을 노출시켰다. 오토클레이빙된 스틱을 사용하여, 주사하기 쉽게 신경을 약간 조작했다. 1.5 uL의 PEI/shRNA 플라스미드 DNA 폴리플렉스(polyplex)를 8의 N/P 비로 32 게이지 니들(Hamilton 80030, Hamilton, Reno, NV)에 연결된 주사기를 사용하여 오른쪽 좌골 신경에 직접 주사했다. AP2α2 shRNA 및 대조군 shRNA를 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA, USA)에서 구입했다. 주사 후, 니들은 폴리플렉스의 확산을 촉진하기 위해 적어도 1분 동안 좌골 신경에서 유지되었다. 상처를 상처 클립(wound clip)으로 닫았고 주사로 인한 부작용이 없는지 확인하기 위해 마우스를 수술 후 관찰하였다. 행동 테스트가 재개되기 전에 마우스에 7일의 회복 기간이 제공되었다.

미리스토일화된 펩티드 제조: 맞춤형 지질화된 펩티드모방체를 Genscript®로부터 주문하고 도착 시 동결건조된 샘플을 -20℃ 냉동고에 저장하였다. 연구에 사용된 펩티드 서열은 표 1에서 확인할 수 있다. 지질화된 펩티드모방체를 초기에 10μL의 DMSO에 용해시켜 작동 스톡 용액을 생성했다. 적절한 부피의 DMSO 스톡 용액을 1mL의 멸균 식염수에 용해시켜 향후 테스트를 위한 100μM 앨리쿼트들(aliquots)를 생성했다. 최종 DMSO 농도는 <0.05%였다. 임의의 스톡 솔루션과 함께 이 앨리쿼트들을 필요할 때까지 -80°C에서 동결시켰고, 필요한 시점에서 한 앨리쿼트를 해동하고 주입한 다음, 샘플의 동결-해동 주기를 최소화하기 위해 폐기했다.

포르말린 분석: 수컷 및 암컷 C57BL/6 마우스를 대조군 또는 실험군에 무작위로 할당했다. 동물들은 실험 전 24시간에 100 μM(총 3.154 μg)의 지질화된 펩티드모방체 20 μL 발바닥 주사를 받았다. 동물들을 30분 동안 또는 실험 당일 탐색 행동이 중단될 때까지 포르말린 테스트 챔버(chamber)에 적응시켰다. 적응 기간 후, 동물들을 챔버에서 꺼내고 동측 뒷발에 5% 포르말린을 발바닥내 주사한 다음 즉시 테스트 챔버에 다시 배치하고 기록했다. Active WebCam 소프트웨어를 사용하여 포르말린 주입 후 적어도 90분 동안 동물들을 기록했다. 이후에 발 핥기 횟수, 발 들어 올림 횟수 및 전신 움찔거림 횟수에 대해 비디오로 점수를 매겼다. 모든 행동은 90분의 비디오 기록 동안에, 5분마다 1분 동안 점수가 매겨졌다. 점수를 매기는 자는 실험 조건에 대해 알지 못했다.

완전 프로인트 아쥬반트 유도 염증성 통증: 수컷 및 암컷 C57BL/6 마우스를 무작위로 실험군 및 대조군로 배정했다. 주사 부위와 관련하여 일관성을 유지하기 위해 마우스를 마취시키고 20 μL의 Imject™ 완전 프로인트 아쥬반트 (Thermo Fisher Scientific)가 채워진 32 게이지 일회용 주사기로 오른쪽 뒷발의 발바닥 표면에 주사하고 회복시켰다. 행동 테스트는 CFA 주사 후 24시간에 재개되었으며, 이 시점에서 동물은 1일차 행동 테스트 종료 직후 지질화된 펩티드모방체 100μM(총 3.154μg)의 20μL 발바닥 주사를 받았다. 그룹들 사이의 실험 오차를 최소화하기 위해 각 동물 그룹들은 동일한 특정 활성의 CFA를 보장하는 이전에 개봉하지 않은 진공 밀봉 유리 앰퓰로부터 CFA를 받았다.

절개 수술 후 통증 모델: 수술 후 통증을 모델링하기 위해 확립된 랫트 절개 모델을 사용하였다. 요컨대, 수컷과 암컷 랫트를 실험군이나 대조군에 무작위로 배정했다. 수술 당일 동물들을 마취시키고 엎드린 자세로 두었다. 동물이 수술이 가능한 정도의 마취(surgical plane of anesthesia) 하에 있으면, 100μM(총 31.54μg) 지질화된 펩티드모방체의 200μL 발바닥내 주사를 동측 뒷발에 수행했다. 이후, 동물을 홈 케이지로 돌려보냈고 회복시켰다. 같은 날, 사전 주입 후 6시간에 동물들을 마취시키고 엎드린 자세로 두고 절개 손상을 준비하였다. 클로로헥시딘, 70% 에탄올 및 요오드의 연속적 면봉법을 사용하여 동측 뒷발을 멸균시켰다. 이어서, 크기 10 메스(scalpel)를 사용하여 동측 뒷발의 발바닥 표면에 1cm 길이의 절개를 수행했다. 짧지만 단단한 스트로크를 사용하여 뒷발의 피부, 근막 및 근육을 절개했다. 절개 후, 절개된 발바닥 근육의 각 "절반"에 100μM(주사당 7.885㎍)의 지질화된 펩티드모방체를 함유하는 50μL 주사를 2회 수행했다. 근육에 주사한 후 봉합사 제거를 방지하기 위해 6/0 실크 봉합사(Ethicon)를 사용하여 피부를 연속적으로 봉합했다. 봉합이 끝나면 지질화된 펩티드모방체 100μM(주사당 3.9425㎍)을 함유하는 25μL 주사를 절개부에 인접한 "사분면"에 4회 수행했다. 마지막으로, 동물들을 이들의 홈 케이지로 돌려보내고 적어도 16시간 동안 회복시켰다.

열적 민감도 테스트: 테스트 전에, 동물들을 매일 1시간 동안 테스트 공간에 적응시켰다. 동물들을 폐쇄된 높은 간유리 플랫폼(Ugo Baseline)에 배치하고 30분 동안 적응시켰다. 탐색 행동이 중단되면, 자동 Hargreaves 장치가 동물들의 뒷발(들) 아래에서 조작된다(Ugo Baseline). 뒷다리당 4회 시행의 평균값으로 발 회피 지연 시간을 계산했다. 시행들 사이의 적절한 회복 시간을 허용하기 위해 5분의 지연 시간이 각 시행에 이어졌다.

기계적 민감도 테스트: 매일, 동물들을 폐쇄된 높은 철망 플랫폼 (Ugo Basile)에 배치하고 1시간 동안 그 폐쇄 공간에 적응시켰다. 마우스에 대해, Touch Test® 감각 프로브 (Stoelting)를 반대측 및 동측 뒷발의 발바닥 표면에 적용했다. 기계적 통각수용 테스트를 위한 단순화된 UP-Down 방법(SUDO) 후에 필라멘트를 오름차순 또는 내림차순으로 적용했다. 요컨대, 이 시리즈의 중간 필라멘트를 동물의 뒷발에 제시했다. 반응을 도출되면, 이 시리즈에서 다음으로 가장 낮은 필라멘트를 제시했다. 반응이 도출되지 않으면, 이 시리즈에서 다음으로 가장 높은 필라멘트를 제시했다. 이 필라멘트 제시 방법을 5회 반복하였고, 5^th 필라멘트 제시가 마지막이었다. 이어서, 조정 계수(adjustment factor)를 필라멘트 값에 추가하고 일련의 변환 방정식을 사용하여 발 회피의 힘을 계산했다. 필라멘트 제시 사이에 5분의 지연 시간을 동물당 각각의 발에 제공하여 발에서 감작의 가능성을 감소시켰다.

자동화된 Dynamic Plantar Aesthesiometer(Ugo Basile)를 사용하여 랫트에 대한 기계적 민감도 테스트를 수행했다. 랫트를 철망 플랫폼 위의 높은 폐쇄 공간에 배치했다. 각 테스트 날에, 쥐가 공간 및 챔버에 적응하도록 1시간을 제공했다. 테스트는 마우스와 유사한 방식으로 수행하였으나 거울이 부착된 자동 프로브(automatic probe)를 사용하였다. 프로브는 20초 동안 최대 50g의 상방향 힘(upward force)을 가하도록 설정되었다. 반응을 도출하는데 필요한 힘(프로브에서 발을 신속하게 제거하는 것에 의해 측정)을 시행으로서 기록했다. 각 동물들은 과민성을 최소화하기 위해 기록 사이에 최소 5분을 받았다. 동물당 총 5회 각 뒷발을 테스트하였다.

면역형광 염색: 이전에 기재된 것과 같이, 표준 경심 관류 프로토콜(standard transcardial perfusion protocol)에 따라 동물 조직을 수집했다. 염색용 슬라이스는 DRG(마우스 및 인간)의 경우 15미크론, 뒷발의 경우 50미크론으로 제작되었다. 마우스 DRG(mDRG) 조직을 대전된 Superfrost 현미경 슬라이드(Fisherbrand)에 부착했다. 섹션을 먼저 PBS로 3회 세척한 다음 차단 배지(PBS 중 10% 정상 염소 혈청, 3% 소 혈청 알부민 및 0.025% Triton X-100)에서 밤새 인큐베이팅했다. 다음 날, 슬라이드를 1차 항체(마우스 항-CGRP; 1:500 Abcam, Rabbit 항-AP2α2 1:500 Abcam)에서 밤새 인큐베이팅했다. 다음 날, 슬라이드를 2차 항체(염소 항-토끼 546 1:1000 Invitrogen, Donkey anti-Mouse 488 Abcam)와 함께 배양했다. 다음 날, 슬라이드를 PBS로 3회 헹구(rinse)고 IB4-647 접합체(Invitrogen)와 함께 실온에서 2시간 동안 인큐베이팅했다. 이후, 슬라이드를 2회 더 헹구고 ProLong™ Glass Antifade Mountant(Invitrogen)를 사용하여 장착(mounted) 했다.

인간 L5 배근 신경절 (hDRGs)을 Anabois에서 구입했다. 공여자는 49세의 여성으로 눈에 띄지 않은 병력을 가지고 있다. 공여자로부터 hDRG를 수집했고 식별 정보는 연구원과 공유되지 않았기 때문에 이 연구는 버팔로 대학 내부 심의위원회(Internal Review Board)에 의해 면제로 인증되었다. hDRG를 초기에 포름알데히드에 보존하였고 70% 에탄올에 드라이아이스로 운송하였다. 도착 시, hDRG를 PBS 대 물의 비율을 감소시키면서 순차적으로 재수화(rehydrate)하였다: 50% PBS 중 24시간, 30% PBS 중 24시간. 재수화 후, hDRG를 4°C에서 30% 수크로스 중 동결 보호하고 조직 동결 배지(Electron Microscopy Sciences)에 담그고 드라이아이스 냉각 2-메틸부탄을 사용하여 동결시켰다. 생성된 블록이 완전히 동결되면 -80°C 냉동고에 48시간 동안 두었다. 저온 절편(cryosection)을 취하여 충전된 Superfrost 현미경 슬라이드 상에 장착했다. hDRG를 분절화하고 동일한 항체 농도를 사용하여 mDRG에 대해 앞서 설명한 것과 유사한 방식으로 염색했다.

뒷발을 자유 부동 섹션(free-floating sections)으로 염색하고 DRG 조직에 대해 기재한 것과 유사한 방식으로 프로빙했다. 적용 가능한 경우 하기 1차 항체를 사용했다: 마우스 항-HA 1차 항체(1:500 Abcam) 및 마우스 항-CGRP(1:500 Abcam). 두 경우 모두에 사용된 이차 항체는 염소 항-마우스 555 이차 항체(1:1000 Abcam)였다. 이차 항체를 세척한 후, 증가하는 양의 티오디에탄올(TDE)로 섹션을 인큐베이팅했다. TDE는 형광 신호 침투를 돕는 조직 투명제(tissue clearing agent) 역할을 한다. 제1 인큐베이션은 밤새 ddH₂O 중 PBS의 1:1 용액에서의 10% TDE로 이루어졌다. 제2 인큐베이션은 밤새 ddH₂O 중 1:1 PBS에서의 25% TDE에서 이루어졌다. 제3 인큐베이션은 밤새 ddH₂O 중 1:1 PBS에서의 50% TDE에서 이루어졌다. 최종 인큐베이션은 ddH₂O 중 1:1 PBS에서의 97% TDE에서 이루어졌다. 최종 TDE 담금 후, 섹션을 ddH₂O 중 1:1 PBS로 1회 헹구고 ProLong™ Glass Antifade Mountant를 사용하여 충전된 Superfrost 현미경 슬라이드에 장착했다.

모든 슬라이드가 영상화 전에 4℃에서 24시간 동안 고정되도록 하였다. sCMOS Leica 카메라(Lieca)가 장착되고 THUNDER 지원 LAS X 영상화 소프트웨어가 탑재된 HP Z4 G4 워크스테이션(HP)에 연결된 Leica DMi 8 도립 형광 현미경을 사용하여 모든 이미지를 수집했다. LAS X 영상화 소프트웨어가 로딩된 별개의 HP Z4 G4 워크스테이션을 사용하여 모든 이미지를 분석하였다. ImageJ(NIH)를 사용하여 이미지를 내보내고 추가로 수정하고(즉, 축척 막대 추가, 히트 맵 변환) Adobe Illustrator(Adobe)를 사용하여 파일로 컴파일했다.

전기생리학: 수직 피펫 풀러(vertical pipette puller) (Narishige Group)를 사용하여 유리 전극을 잡아당기고 5-8MΩ의 저항에 대해 불 연마(fire-polished)했다. 전류 클램프 기록은 스크램블된 대조군 shRNA 또는 α2 표적 shRNA로 생체 내 형질감염된 마우스로부터 해리된 성인 DRG 뉴런에서 수행되었다. 성인 마우스 뉴런은 이전에 기술한 것과 같이 해리되었다. 전기생리학 실험은 이전에 설명한 대로 수행되었다. 해리된 뉴런을 Alexa fluor-488 접합된 IB4(Invitrogen I21411)와 함께 5분 동안 인큐베이팅하고, 기록을 시작하기 전에 멸균 PBS로 3회 세척했다. 형광이 없는 중소 크기의 DRG 뉴런만이 기록되었다. 1000ms 동안 400pA의 초임계 자극을 주입하여 발화 빈도(Firing frequency)를 조사했다. 124mM 글루콘산칼륨, 2mM MgCl₂, 13.2mM NaCl, 1mM EGTA, 10mM HEPES, pH 7.2로 이루어진 피펫 용액을 사용했다. 140mM NaCl, 5.4mM KCl, 1mM CaCl₂, 1mM MgCl₂, 15.6mM HEPES 및 10mM 글루코스, pH 7.4로 이루어진 배쓰 용액을 사용했다. Multiclamp-700B(Molecular Devices)를 사용하여 모든 데이터를 수집하고 디지털화하고 2kHz에서 필터링했다. pClamp 10.2를 사용하여 데이터 수집을 모니터링 및 조절하였고 Clampex(Molecular Devices)를 사용하여 분석하였다.

웨스턴 블롯 분석: 실험 후 동물들에서 수집한 DRG 조직으로부터 전체 단백질을 수집했다. 프로테아제 억제제를 함유하는 냉각된 RIPA 완충액(Sigma)에서 DRG를 균질화하고 필요할 때까지 -80℃에서 저장했다. Mini-PROTEAN TGX Precast Gel (Bio-Rad)에서 모든 샘플들을 실행하였고 0.45 μm 니트로셀룰로오스 막 (BioRad)에 옮겼다. 막을 1x TBST(tris-buffered saline-tween)에서 제조된 5% BSA(bovine serum albumin) 중 토끼 항-AP2α2 (1:1000, Abcam) 또는 토끼 항-β-액틴 (1:1000, Sigma)으로 4°C에서 밤새 프로빙했다. 다음 날, 막을 1xTBST에서 5분 동안 3회 세척한 후, 1x TBST 용액 중 5% BSA에서 제조된 2차 항-토끼 홀스래디쉬 퍼옥시다제 접합 항체 (1:5000; Promega)에서 1시간 동안 실온에서 인큐베이팅했다. 2차 항체 인큐베이션 후, 막을 세척당 5분 동안 3회 더 세척한 다음, 현상 및 이미지화했다. 밴드는 Chemidoc Touch Imaging System (Bio-rad)에서 향상된 화학발광으로 시각화되었고 Image J Software (NIH)로 정량화되었다. 각 실험은 적어도 3회 반복되었다.

통계: 모든 통계적 검정은 Prism (GraphPad)을 사용하여 수행했다. 데이터는 평균값 ± s.e.m으로 나타난다. 0.05로 설정된 α-값으로 검출 한계를 달성하기 위해 동물 실험에 대해 검증력 분석을 수행했다. 모든 실험에 대해 p-값 < 0.05을 사용하여 통계적 유의도를 결정하였다. 다중 비교 및 엄격한 Bonferroni 교정을 한 반복 측정 이원 분산분석 통계적 검정, Holms-Sidak 교정을 한 일원 분산분석, 및 student t-검정을 적절하게 사용했다. 하기 방정식을 사용하여 타우 분석을 수행했다:

, 여기서 'W_t'는 주어진 시간 't'에서 회피 역치이고, 'W₀'는 t=0에서 회피 역치이고, 'p'는 안정기 값(plateau value)이고, 'k'는 속도 상수이고, 't'는 일(day) 단위의 시간이다. 무한에 가까운 타우 값을 방지하기 위해 하기 제약 조건을 구현하였다; W₀ > 1 및 p < 16. 2단계 감쇠 피팅(two-phase decay fitting)을 위해, 하기 방정식을 사용했다:

(W_t: 주어진 시간 't'에서 회피 역치, F: 감쇠의 빠른 성분(fast component)

, S: 감쇠의 느린 성분

, F_p: 빠른 단계(fast phase)로 인한 회피 역치의 분율, W₀: t=0에서 회피 역치, p: 안정기 값, a: 빠른 속도 상도, l: 느린 속도 상수, t: 일(day) 단위의 시간).

결과

AP2α2는 CGRP 함유 DRG 뉴런에 우선적으로 발현된다: 설치류 배각(dorsal horn)의 표재성 판(superficial lamina)에서 AP2α2의 이전 면역학적 표지는 통각수용기에서 AP2α2의 추정적 차등 발현을 시사했다. 이를 해결하기 위해, AP2α2, CGRP, 및 Alexa fluor-접합된 IB4에 대한 항체로 mDRG 뉴런을 프로빙했다. 흥미롭게도, CGRP 및 AP2α2 사이의 강력한 면역형광 공동 국소화가 관찰된 반면, 사실상 AP2α2를 발현하는 IB4⁺ 뉴런은 사실상 없었다 (도 7ab의 A). CGRP 및 AP2α2의 중첩되는 면역반응성, 및 IB4⁺ 뉴런에서 면역반응성의 결핍은 AP2α2가 통증 동안 열적 민감도와 연관이 있는 펩티드성 DRG 뉴런 신호전달에 참여하는 것을 시사했다.

생체 내 DRG 뉴런 AP2α2 녹다운은 말초 통각수용기 흥분성을 조절하고 급성 염증성 통증 행동을 감소시킨다: CGRP 발현은 일시적 수용체 전위 바닐로이드 1(transient receptor potential vanilloid 1; TRPV1) 이온 채널의 강력한 공동-발현으로 인해 열 통각수용기에 대한 강력한 마커이다. TRPV1은 산성 pH뿐만 아니라 유해한 열 및 화학적 감각에 대한 통각수용기 반응을 주로 제어하는 것으로 알려져 있다. 그러므로, 염증-유도 지속적 통증은 TRPV1 침해수용성 섬유에 의해 구동된다. AP2α2 및 CGRP의 높은 정도의 동시 발현을 관찰한 결과 AP2α2가 열 및 화학적 반응성에 기여하는 것을 시사했다. 이를 테스트하기 위해 C57BL/6 마우스의 좌골 신경에 AP2α2에 대한 shRNA를 편측 주사했다. 이는 shRNA 주입 후 7일째차에 AP2α2 단백질 발현 수준의 유의한 감소를 일으켰고(도 7ab의 B 및 도 7c), 이 마우스로부터 분리된 성인 DRG 뉴런에서 PKA 유도 과흥분성을 감소시키는데 충분했다(도 7d). 분리된 반대측 IB4-DRG 뉴런은 대조군 조건 하에서 발화 적응(firing accommodation)을 나타냈다 (n = 10, 10개 중 2개만이 2개 초과의 활동 전위를 나타냄, 도 7d 상단). 스크램블된 shRNA 동물에서 배양된 동측 IB4^- DRG 뉴런은 PKA 자극 조건에서 발화 적응의 전형적인 손실을 나타냈다(n = 7, 5/7 과흥분성, 도 7d 중간). AP2α2 shRNA 동물에서 배양된 동측 DRG 뉴런은 발화 적응을 나타냈다(n = 9, 2/9 과흥분성 도 7d 하단).

생체 내 DRG 뉴런 AP2α2 녹다운의 행동 결과는 먼저 포르말린 급성 염증성 통증 분석을 사용하여 평가되었다. 이 분석의 2단계 특성은 별개의 신경 생리학적 변화에 대한 관찰된 행동 효과의 구획화를 제공한다. AP2α2의 DRG 뉴런 녹다운은 일시적인 단계 1 통증 유사 행동을 변경하지 않았지만(도 7e), 염증성 단계 2-발 핥는 행동(스크램블된 shRNA 406 ± 70; AP2 shRNA 193 ± 73) 및 발 들어 올리는 행동(도 7e, 스크램블된 shRNA 246 ± 23, AP2 shRNA 99 ± 43)의 유의한 감소가 있었다. 또한, 동물의 휴식 행동에 시간-의존적 변화가 있었다(도 7f). 관찰 시작 시 단계 1에서 두 그룹 모두 통증을 나타내는 증가된 발 핥기 행동을 나타냈다(도 7f 왼쪽). 하지만, 단계 2를 시작할 때, 스크램블된 shRNA 그룹은 계속 발 핥기에 참여하는 반면에, AP2α2 shRNA 그룹은 그루밍 행동에 참여했다(도 7f 중간). 마지막으로, 관찰 마지막에, 스크램블된 그룹은 발 핥는 행동을 유지한 반면에, AP2α2 그룹은 탐색적 행동을 보이기 시작했다(도 7f 오른쪽).

만성 염증성 통증에 대한 AP2α2의 기여도를 평가하기 위해 CFA(Complete Freund's Adjuvant)의 발바닥내 주사를 수행하였다. CFA는 면역 세포 동원 및 활성화를 통해 통증 및 국소 염증을 유도한다. 이 모델을 사용하여, 만성 염증성 통증 신호의 발달(AP2 녹다운 염증 전 도 8a) 및 유지(AP2 녹다운 염증 후 도 8c)에서 세포내 이입의 기여를 평가하였다. 염증 전 조건에서 대조군 동물(n = 11)은 CFA 주사 후 24시간에 열 자극에 대한 민감도(2.3 ± 0.3초)를 나타낸 반면에, AP2α2 그룹(n = 12)은 CFA 주사 후 감소된 열적 민감도를 나타냈다(4.2 ± 0.8초). 발 회피 지연 시간의 차이는 두 그룹 모두 열적 민감도가 완전히 회복될 때까지 실험 기간 동안 지속되었다. shRNA 매개 AP2α2 녹다운 실험은 염증 후에 수행되었다(도 8c). AP2α2 녹다운 동물은 대조군 shRNA 동물에 비해 더 빠르게 회복했다(n = 8, 5일차: 6.2 ± 0.7초, 9일차: 5.2 ± 0.5초, 13일차: 5.4 ± 0.8초). 펩티드성 뉴런에서 AP2α2의 국소화로 인해, 녹다운은 기계적 민감도를 변경할 것으로 예상되지 않았지만 놀랍게도 AP2α2가 선제적으로 녹다운되었을 때 기계적 민감도의 약간의 감소가 관찰되었고, 13일차에 유의했다(도 8b). 반대측 기계적 반응성 데이터는 도 13에 나타난다. 이 데이터들은 DRG 뉴런 AP2α2 녹다운이 염증 동안 열 및 기계적 민감도 둘 모두에 필요한 신경가소성 절차를 방해하는 것을 시사했다.

지질화된 펩티드모방체는 설치류 뒷발의 지질 구획에 국한된다: 작은 미리스토일화 펩티드는 이전에 통각수용기 말단을 표적화하고 통증 행동을 변형시키는데 사용되었다. 작은 지질화된 펩티드는 세포 내부에 접근하는 플립 플롭 메커니즘에 의해 막을 통과할 수 있다(도 4). 지질화된 펩티드가 어떻게 통각수용성 신경 말단에 들어가고 투여 후 세포 및 조직에서 지속되는지 조사했다. 지질화된 AP2 억제 펩티드의 사용 또한 설명되어 있다. 인플루엔자 혈구응집소(HA) 단백질(HA-펩티드)의 지질화된 버전을 생성하였고 이의 위치를 면역세포화학에 의해 시각화하였다. HA-펩티드가 CHO 세포의 막에 임베딩되어 강력한 막 표지를 생성하는 것으로 밝혀졌다(도 14). 이는 하기 실험 조건을 고려할 때 놀라웠다; 3시간 동안 HA-펩티드에 노출시킨 후 일련의 세척 및 배지 교체. 시간 경과에 따른 HA 면역반응성의 지속성(최소 72시간)도 마찬가지로 놀라웠는데, 이는 작은 지질화된 펩티드가 유사분열과 같은 큰 세포성 이벤트 동안 어느 정도의 안정성을 유지하는 것을 시사했다. 지질화된 펩티드의 지속성은 배양된 DRG 뉴런에서 유사하게 관찰되었으며, 초기 적용 및 일련의 배지 변화 후 72시간에 검출되었다(도 14).

다음으로, 지질화된 HA-펩티드가 생체 내 적용될 때 유사하게 안정성을 나타낼 수 있는지 여부 및 염증이 펩티드의 흡수 및 분포에 영향을 미치는지 여부를 결정하였다. 마우스의 뒷발에 HA-펩티드를 주입하면 진피 및 지질 조밀 구획 내에서 강력한 HA 면역반응성이 생성된 반면에, 표피 및 근육은 국소 주입 후 24시간에 약한 면역반응성을 나타냈다(도 9a). 진피의 신경 유사 섬유(도 9a의 A-1)와 근육 조직(도 9a의 A-2)에서 HA 면역반응의 존재가 주목된다. 신경 유사 섬유에 국한된 근육에서 HA-펩티드의 존재는 지질화된 펩티드가 섬유의 길이를 따라 측 방향으로 확산될 수 있음을 시사했다. 유사한 분포 패턴이 염증성 조건 하에서 또한 관찰되었다(도 9b). 비염증성 조건 하에서 신경유사 섬유의 상당한 표지가 진피(도 9b의 B-1) 및 근육(도 9b의 B-2)에 분포되어 있었다. 염증 조건 하에서 본 발명자는 더 강렬한 전반적인 면역 반응성에 주목했다(도 9b의 B'').

AP2 억제 펩티드는 염증 동안 통증 행동을 약화시켰다: 염증 동안 말초 통각수용기 구심성 신경에서 세포내 이입을 약리학적으로 억제한 결과를 작은 지질화된 펩티드 AP2-CME 억제제를 사용하여 평가하였다. N-말단에 접합된 미리스토일 모이어티를 갖는 인간 CD4 디류신 모티프로부터 유래된 짧은 펩티드(표 1)를 포르말린 분석을 투여하기 24시간 전에 편측 주사하였다. 이 펩티드 서열은 AP2 복합체에 대해 높은 친화도(650nM)를 갖는 것으로 나타났다. 지질화된 AP2 억제 펩티드의 1회 주입은 누적 단계 2 발 핥는 행동(스크램블된 펩티드 n = 6, 184 ± 22; AP2 억제 펩티드 n = 6, 89 ± 23)의 강력한 감소를 생성한 반면에, 통증-유사 행동의 다른 측정값들은 상대적으로 변하지 않았다(도 10a). 이 행동의 대표 비디오는 참조로 제공된다. 여기에, AP2α2 녹다운 실험에서 관찰된 감소된 통증 행동 중 일부가 요약되어 있고, 국소 통각수용기 세포내 이입이 염증성 통증의 발달에 참여한다는 전제를 강화했다.

확립된 CFA-유도 염증성 통증 동안 AP2 억제 펩티드의 진통 가능성을 연구했다. 먼저, 24시간 동안 CFA 염증을 유도한 다음, 펩티드의 간단한 1회 용량 주사를 염증이 있는 발에 직접 전달하였다. AP2 억제 펩티드의 이 단일 주사는 4일 동안 지속하여 발 회피 지연 시간을 지속적으로 증가시켰다(n = 8, 1일차: 2.2 ± 0.3초, 2일차: 6.1 ± 0.8초, 3일차: 7.3 ± 0.6초, 5일차: 8.3 ± 0.7초, 9일차: 8.0 ± 0.6초), 스크램블된 펩티드 그룹(n = 8, 1일차: 2.4 ± 0.3초, 2일차: 3.8 ± 0.5초, 3일: 3.8 ± 0.4초, 5일: 5.5 ± 0.6초, 9일: 7.0 ± 0.8초)는 이 분석의 전형적인 열 반응성 회복 곡선을 나타냈다(도 10b). 흥미롭게도, 데이터를 성별로 분리한 후에, 진통 개시에 대한 예상치 못한 성별 의존적 시간적 요소가 나타났다(도 10cd의 C 및 D). 수컷 마우스(스크램블된 펩티드; n = 4, AP2 억제 펩티드, n = 4)에서, 펩티드에 대한 더 즉각적인 반응이 있었던 반면에(도 4C), 암컷 마우스(스크램블된 펩티드; n = 4, AP2 억제 펩티드; n = 4), 지연된 작용 개시를 나타냈다(도 10cd의 D). 곡선 아래 면적(A.U.C.) 정량화는 함께 그룹화된 동물들이 AP2 억제 펩티드에 대한 진통을 경험한 것으로 나타났고(도 10efg의 E), 데이터를 분리하면 AP2 억제 펩티드가 수컷(도 10efg의 F) 및 암컷(도 10efg의 G) 모두에서 진통 유사 효과를 생성할 수 있음이 나타났다. 열 회복의 성별 차이를 더 이해하기 위해 회복 속도를 시간 상수로 표현하는 방법이 고안되었다. 열적 민감도는 CFA 모델에서 시간에 따른 회복을 나타내기 때문에 스크램블된 펩티드 그룹 회복 단계(1일차 - 11일차)가 열적 민감도의 비보조 분해능(unassisted resolution)의 척도로 선택되었다. 이 곡선을 1차 지수 감쇠 방정식에 피팅함으로써, 시간 상수인 타우(τ)가 계산되었다. 전통적이지는 않지만, 타우의 정량화는 임상적으로 관련된 새로운 진통제의 개발에 중요한, 단일 용량 투여 후 열 회복의 역학에 대한 보다 포괄적인 이해를 가능하게 했다. AP2 억제 펩티드의 적용은 대조군(τcontrol = 4.82, 도 10hij의 H)에 비해 더 빠른 열적 민감도 회복(τAP2 = 2.21)을 초래했다. 성별에 따른 원본 데이터의 분리는 스크램블된 그룹 및 AP2 억제 펩티드 그룹 모두에서 염증 동안 수컷의 회복 및 암컷의 회복 사이의 차이를 밝혀냈다; 수컷 마우스는 타우의 강력한 감소를 겪은 반면에(도 4I; τcontrol = 6.45, τAP2 = 2.04), 암컷 마우스는 타우의 적당한(modest) 감소를 나타냈다(도 4J, τcontrol = 3.23, τAP2 = 2.40). AP2 억제 펩티드의 투여는 기계적 민감도에 오직 약간 영향을 미쳤고 적용 후 24시간에 거의 유의도에 도달했다. 모든 다른 시점들은 구별할 수 없었으며, 이는 세포내 이입의 약리학적 억제가 주로 열적 민감도를 표적화하지만(도 10L), 기계적 민감도에 간접적인 영향을 미칠 수 있음을 시사했다.

화학원성-유도(chemogenic-induced) 염증에 더하여, 손상 유발 염증/랫트 수술 후 통증 모델에서 AP2 억제 펩티드의 진통 가능성 또한 조사하였다. 전임상 절개 모델은 수술 후 초기 단계에서 약리학적 치료의 효능을 결정하는 데 유용하다. 이 분석을 위해 AP2 억제 펩티드에 대한 잠재적 임상 적용 스케줄을 시뮬레이션했다; 절개 전 6시간에 랫트의 뒷발에 피하 투여한 다음, 절개 직후에 일련의 더 작은 피하 및 근육내 주사하였다(도 11ab의 A). AP2 억제 펩티드(n = 12)의 적용은 스크램블된 펩티드(n = 8, 도 11ab의 B)에 비해 열적 민감도에 있어 심오하고 오래 지속되는 감소를 생성했다. 이전 모델과 마찬가지로 AP2 억제 펩티드는 단일 적용 후 실험 기간 동안 열적 민감도의 역치를 증가시킬 수 있었다 (스크램블된 펩티드 1일차: 5.7 ± 0.4초, 2일차: 6.4 ± 0.4초, 3일차: 7.4 ± 0.5초, 4일차: 7.4 ± 0.5초, 5일차: 8.3 ± 0.6초, 6일차: 8.6 ± 0.5초, 7일차: 11.7 ± 0.6초, 8일차: 11.4 ± 0.4초, 9일차: 12.0 ± 0.6초 vs AP2 억제 펩티드 1일차: 8.4 ± 0.4초, 2일차: 9.0 ± 0.3초, 3일차: 10.4 ± 0.5초, 4일차: 10.4 ± 0.6초, 5일차: 11.4 ± 0.5초, 6일차: 11.0 ± 0.6초, 7일차: 12.1 ± 0.6초, 8일차: 11.5 ± 0.5초, 9일차: 12.0 ± 0.5초). CFA 모델에서 나타난 바와 같이, 데이터를 성별로 분리한 후 AP2 억제 펩티드에 대한 명백한 성별 의존적 반응이 있었다. 첫째, 스크램블된 그룹에서 수컷은 손상 후 24시간에 암컷보다 회피 지연시간이 더 빨랐다(도 16). 둘째, 수컷 쥐는 수컷 쥐에 대해 유사하게 보고된 바와 같이 절개 손상 후 점진적인 회복을 보인 반면에, 암컷은 6일 동안 비교적 일정하게 유지된 열 반응성을 보인 후 7일차에 기준선으로 빠르게 복귀했다(도 11cd의 D; 도 17). AP2 억제 펩티드를 주사한 수컷 랫트에서 열적 민감도는 유의하게 감소했지만 비교적 유사한 회복 패턴이 관찰되었다(도 11cd의 C). 놀랍게도, 암컷에서 AP2 억제 펩티드는 열 반응성이 빠르면 3일차에 기준선으로 복귀하도록 하였다(도 11cd의 D). A.U.C. 정량화는 스크램블된 펩티드와 비교하여 AP2 억제 펩티드가 진통 유사 효과를 나타내는 A.U.C.를 증가시킬 수 있음을 나타냈다(도 11efg의 E). 이 효과는 성별에 따라 데이터를 분리할 때 보존되었다; AP2 억제 펩티드는 수컷(도 11efg의 F) 및 암컷(도 11efg의 G) 모두에서 진통 유사 효과를 나타냈다. 또한, AP2 억제 펩티드는 절개 후 회복 속도를 증가시킬 수 있었다(도 11hij의 H; τcontrol = 9.09, τAP2 = 3.37). 이 매개변수에서 암컷 및 수컷 모두 증가된 회복을 보였다(수컷: 도 5의 I; τcontrol = 7.46, τAP2 = 2.70, 암컷: 도 11hij의 J; τcontrol = 11.72, τAP2 = 5.28). 열적 민감도에는 유의한 영향이 있었지만 동측 기계적 민감도에는 큰 변화가 없었다(도 11L).

다른 인간 단백질로부터 유래된 디-류신계 펩티드의 효능을 테스트하였고 다양한 침해방어성 행동에서 서열 의존적 감소가 관찰되었다(도 18). 하지만, 가장 높은 농도의 포르말린을 투여 받는 포르말린 주사 위치에서 구심성 신경은 고정, 불활성화 및/또는 탈감작을 겪을 가능성이 더 크다. 그러므로, 포르말린 분석은 구심성 말단을 투과하도록 설계된 지질화된 펩티드의 진통 잠재력을 본질적으로 과소평가한다. 세포내 이입의 유전적 및 약리학적 억제는 부종(도 13 및 15)이나 면역세포 활성화 및 침윤(도 19)을 배제하지 않았다.

AP2 억제 펩티드의 발바닥내 주사는 통각수용기가 표피의 표피층 내에서 CGRP 보유하는 것을 유발하였다: 말초 통각수용기 구심성 신경은 진피 및 표피에서 구조적으로 별개의 조직 층에서 종결되는 것으로 이전에 나타났다. 구체적으로, CGRP⁺ 통각수용기 구심성 신경은 유극층(stratum spinosum layer)에서 종결되는 것으로 나타났다. 비염증성 조건 하에서 24시간 동안 세포내 이입의 국소적 억제는 과립층(SG)의 가장 원위층에서 CGRP 면역반응성을 시각화를 초래하여 CGRP 색조 방출 감소를 나타낸다(n = 3마리 마우스). 이러한 데이터는 CGRP 통각수용기 구심성 신경이 이전에 생각했던 것보다 실제로 진피에서 훨씬 더 피상적으로 확장되어 있는 것을 시사한다. 하지만, 말초 섬유에서 CGRP 보유는 CFA-유도 염증의 확립 후24시간에 AP2 억제 펩티드를 투여 받은 동물에서 관찰되지 않았다(도 20). 이전 연구에서는 말초 염증을 수반하는 최대 통각 과민 기간 동안 1차 구심성 뉴런에서 CGRP의 방출이 증가하므로 CFA 후 24시간에 제공된 AP2 억제 펩티드가 말초 말단에서 CGRP 면역 반응성을 변경하지 않을 것으로 예상할 수 있음을 나타냈다. 또한 절개 손상 후 면역 세포의 육아종 유사 클러스터링이 관찰되어(이전에 CFA 주사 후 관찰됨) 면역 세포 조정의 가능한 변경을 나타냈다; 하지만, Ap2 억제 펩티드는 손상 부위에 대한 면역 세포의 유인을 방해하는 것으로 보이지 않았다(도 19). 사용된 통증 모델에서 이러한 육아종 유사 인공물의 병태생리학적 결과는 현재 알려져 있지 않지만, CGRP 방출 감소로 인한 것일 수 있다.

CCGRP+ 뉴런에서 AP2α2의 차등 발현 또한 인간 DRG에서 관찰되었다: 인간 및 마우스 AP2α2는 ~98% 아미노산 동일성을 공유하여(데이터는 나타내지 않음) 단백질 기능을 보존하기 위한 강력한 진화적 압력을 시사한다. 여기에서 본 발명자는 AP2α2 및 CGRP에 대해 프로빙하는 hDRG 면역조직화학 연구를 수행했으며 hDRG 또한 CGRP⁺ 뉴런 내에서 AP2α2 차등 발현을 나타내는 것을 관찰했다(도 12의 D). 그러므로, 인간의 염증성 통증은 AP2α2 매개 통각수용기 세포내 이입에 의존할 가능성이 있으며 지질화된 AP2 억제 펩티드에 의한 약리학적 조작에 적합해야 합니다. 이 연구에서 모든 AP2 표적 펩티드는 인간 단백질에서 파생된 서열을 사용했다(표 1).

논의

비-형질전환 동물에서 유전적 및 약리학적 접근을 사용하여, 본 발명자들은 시냅스외 통각수용기 세포내 이입의 억제가 염증성 통증 유사 행동을 유의하게 변화시킨다는 것을 나타냈다. 통각수용기는 국소적으로 표적화되었고 향후 진통제 개발을 위한 새로운 길을 열어주는 오래 지속되는 진통제가 제공되었다.

마우스 DRG 뉴런에서 AP2α2 발현의 특성화는 펩티드성 IB4-뉴런이 AP2α2를 우선적으로 발현한다는 것을 나타냈다(도 7ab의 A). 인간 DRG 뉴런에서 CGRP와의 높은 수준의 공동-발현 또한 관찰되었으며(도 12d), 이는 AP2α2가 CGRP⁺ 통각수용기 신호전달에 참여함을 시사한다. CGRP⁺ 통각수용기는 신경 펩티드들을 조밀 코어 소포(LDCV)에 패키징한다. 이들은 Ca²⁺ 의존적 방식으로 방출되어 염증, 통각 및 면역 세포 활성화를 강화한다. 또한 LDCV는 막에 융합될 때 완전히 붕괴될 수 있다. 강력한 막 회수 메커니즘, 즉 세포내 이입은 추가 LDCV 방출을 가능하게 하기 위해 신경 펩티드 방출 후에 필요할 것이다. 시냅스 소포막 회복에서 AP2-CME의 메커니즘은 시냅스 소포 방출 후 잘 확립된 막 재활용이다. IB4^-뉴런에서 시냅스외 AP2α2의 우선적 발현은 시냅스 외부에서 발생하는 LDCV 방출 후 막 회복의 특정 의존성 때문일 수 있다. AP2 억제 펩티드 주사 후 진피의 SG 층에서 두드러진 CGRP 면역반응성(도 6)은 통증 유사 행동의 변화가 부분적으로 CGRP 방출 메커니즘의 파괴에 기인할 수 있음을 시사했다. 사용된 유전적 또는 약리학적 수단을 통해 세포외 이입으로부터 세포내 이입을 디커플링(decoupling) 하는 것은 막 항상성을 파괴하고 막에 국한된 수용체 신호전달(즉, TrkA), 이온 채널 트래피킹, 및 펩티드성 신호전달에 부정적인 영향을 미쳤다. 그 결과, 동물은 급성 및 만성 염증성 통증 모델에서 통증 유사 행동의 강력한 약화를 나타냈다(도 7d, 8, 10 및 11). 기계적 민감도에 대한 관찰된 효과는 염증 동안 기계적 및 열적 민감도의 조정에 펩티드성 뉴런을 연관시킨 이전에 발표된 연구를 확증한다. 하지만, 기계적 민감도에 미치는 영향의 크기는 말초 뉴런으로부터의 CGRP 방출이 기계적 민감도의 발달에 간접적으로 기여함을 시사한다.

또한, 막에 국한된 KNa 채널의 축적은 통증 유사 행동의 관찰된 변화에 기여할 수도 있다. 이전에 얻은 증거는 뉴런 세포내 이입의 억제가 큰 전도도 Kcnt1(Slack) KNa 채널의 막 보유를 초래하여 배양된 DRG 신경 세포에서 PKA 유도 과흥분성의 결핍을 일으킨 것이었다. AP2α2 생체 내 녹다운의 급격하게 해리된 뉴런에서, 본 발명자들은 또한 PKA 유도 과흥분성의 결핍을 발견했다(도 6의 C). 세포내 이입을 수반하지 않는 LDCV의 지속적인 세포외 배출은 LDCV를 포함하는 CGRP에 국한된 또 다른 큰 전도도 KNa 채널인 막 Kcnt2(Slick) 채널의 증가를 유발할 수 있다. 본 발명자들은 AP2 억제 펩티드 주사 후 CFA에 의해 유도된 열적 민감도의 유의한 감소를 관찰했으며(도 10b,10cd의 C), 이는 완전한 신경성 염증 후에도 진행 중인 세포내 이입을 차단하면(그림 20) 신경 흥분성을 변경하는 것을 나타낸다. 실제로, DRG 뉴런에서 Kcnt2 채널의 과발현은 활동 전위 형성을 둔화시키는 것으로 나타났다.

항원성 지질화된 펩티드모방체(HA-펩티드)를 사용하여 본 발명자들은 비염증성(도 9a) 및 염증성(도 10b) 조건 둘 모두에서 분자적 분할(molecular partitioning)을 나타냈다. HA-펩티드는 작은 지질화된 펩티드가 뉴런 구심성 말단으로 침투하는 방법을 이해하기 위한 프록시(proxy)로 사용되었다. 두 조건 모두 진피에서 HA-면역반응을 보인 반면, 표피와 근육 조직은 신호가 보이지 않았다. 이러한 발견은 지질화된 펩티드가 뒷발의 이러한 구획에서 빠르게 제거되거나 친수성 세포외 기질이 펩티드 침투를 방지하는 것을 시사한다. 행동 테스트는 단일 주사 후 지질화된 펩티드가 시험관 내에서 HA-펩티드에 대해 관찰된 것과 유사한 생체 내 수명을 갖는 것으로 나타났다(도 14). 작은 지질 펩티드의 수명은 막 회전율(membrane turnover) 역학에 따라 달라질 수 있다. 본 지질화된 AP2 억제 펩티드의 주사는 다른 FDA 승인 지질화된 펩티드의 현재 임상 투여와 일치한다. 예를 들어, 둘라글루티드(Trulicity®) 및 세마글루티드(Ozempic®)는 당뇨병을 치료하기 위해 피하 주사(때로는 매일 주사)되는 서로 다른 지질화된 글루카곤 유사 펩티드 1(GLP-1) 펩티드이다. GLP-1 펩티드(~30개 아미노산)는 여기에 설명된 펩티드보다 상당히 크다. 또한, 전신 흡수 및 장기간의 안정성을 달성하기 위해 GLP-1 펩티드를 설치류에 투여되는 지질화된 펩티드의 농도보다 100-1000배 더 높게 투여한다. 최소한의 전신 흡수를 갖는 용량으로 말초 구심성 신경을 국소적으로 표적화하는 것이 구상된다. 하지만, AP2 억제 펩티드 및 Na_V1.8 채널을 표적화하는 펩티드 둘 모두의 투여(도 18)는 추가 조사가 필요하다.

또한 2개의 상이한 염증성 통증 모델 및 2종의 동물에서 성별 의존적 통증 유사 행동이 밝혀졌다. 이러한 결과는 CGRP⁺ 통각수용기의 장기간 지속되는 약리학적 억제와 열 반응성을 해석하기 위한 지수적 감쇠 최적 모델의 구현으로 인해 입증될 수 있었다. 이를 통해 본 발명자들은 Ap2 억제 펩티드의 효능을 특성화하고 회복 역학을 정량화할 수 있다. 하지만, 성별에 따른 차이는 AP2 억제 펩티드를 염증이 발생하기 전에 투여했는지 아니면 염증이 이미 확립된 후에 투여했는지에 따라 다르다. CFA 유도 염증 후, 대조군 펩티드를 주사 받은 수컷 및 암컷 동물은 수일에 걸쳐 회복되는 장기간의 열 통각 과민을 나타냈다. AP2 억제 펩티드의 주사는 수컷 동물에서 열적 민감도의 빠른 회복을 초래한 반면, 암컷 동물은 지연된 반응을 보였다. 더욱이, 대조군 및 AP2 억제 펩티드에 대한 여성의 τ - 값은 유사했다. 회복 역학의 비교는 AP2 억제제가 암컷 동물에게 효과가 없다는 것을 나타낼 수 있지만, A.U.C. 분석은 진통이 남녀 모두에게 제공되었음을 나타냈다(도 10efg의 F 및 G). 대조적으로, 손상 및 염증이 발생하기 전에 AP2 억제 펩티드가 제공된 절개 통증 모델에서 회복 τ - 값은 성별에 관계없이 대조군과 AP2 억제 펩티드 사이에 상당히 차이가 있었다(도 11hij의 I 및 J).

통증의 절개 후 모델에서, 이전 연구는 기계적 민감도 및 핫 플레이트(hot plate) 평가에서 성별 차이가 없음을 발견했다. 신중한(discreet) 편측 열 반응성을 평가하기 위해 Hargreaves의 방법을 사용하여 성적 이형성 통증 반응을 관찰했다. 하지만, 이 모델에서는 6시간의 뒷발 사전 주사 절차가 포함되었다(도 11cd의 C, 11cd의 D, 11hij의 I, 11hij의 J; 도 17). 대조군 수컷 동물은 뒷발 절개 후 전형적인 통증 행동을 나타냈다: 열적 민감도의 유의한 증가에 이어서, 거의 선형인 회복 단계. 암컷의 열적 민감도는 수컷보다 낮았으며(도 17) 거의 유의했다(p = 0.08). 더 많은 동물을 테스트했다면 이러한 데이터가 통계적 의미를 달성했을 것으로 생각된다. 더욱이, 암컷 대조군 동물은 뒷발 절개 후 하기 독특한 행동 프로파일을 나타냈다: 수술 후 7일까지 해결되지 않은 열 통각 과민의 안정기. 회복은 단계 1이 아닌 단계 2 감쇠 방정식(데이터는 표시되지 않음)에 의해 가장 잘 피팅되었으며, 이는 암컷의 절개 통증에 의한 열 통각 과민이 수컷에 비해 다중 절차를 활용하는 것을 시사한다. 수컷 쥐는 절개 후 더 빠른 회복 시간 상수를 보였고(도 11hij의 I, J), 이는 말초 기반 메커니즘의 결과일 수 있다. 대조적으로, 암컷 쥐는 일단 시작되면 지속적인 열적 민감도를 유지하도록 최적화된 생리학적 시스템을 가지고 있는 것으로 보인다. 이는 말초 및 중추 메커니즘 모두의 동원을 시사할 것이다. 동등한 수준의 CGRP mRNA에도 불구하고 3차 신경절(trigeminal ganglion), 수질 및 척수 내의 CGRP 수용체 요소에는 성별 차이가 있다. CGRP⁺ 통각수용기의 장기간 억제를 통해 열 통각 과민이 나타나는 방식의 성별 차이가 밝혀졌다. 이 데이터는 인간의 만성 염증 및 수술 후 통증의 유병률과 강도 모두에 성별 차이가 있다는 생각과 일치한다. 말초 통각수용기 구심성 신경을 표적으로 하는 치료제의 국소 투여는 중독을 비롯한 부작용을 감소시키기 때문에 통증을 치료하기 위한 보다 바람직한 접근법이 되고 있다. 예를 들면, 재구성된 마취제의 국소 주사는 현재 통증 완화를 위한 오피오이드 사용의 대안이다. 하지만, 국소 적용 약물에 특이성과 작용 기간이라는 두 가지 주요 과제가 남아 있다. 지속적인 손상 관련 통증 및 손상 관련 염증이 있는 환자의 경우, 특이적으로 TRPV1/CGRP⁺ 클래스의 구심성 섬유를 표적화하는 것이 효과적인 통증 완화를 제공하는 데 중요할 수 있다. 여기에서, 본 발명자는 지질화된 펩티드모방체를 사용하여 통증 행동의 구체적이고 오래 지속되는 감소를 나타내어 이러한 유형의 분자를 새로운 클래스의 진통제로 위치시켰다.

본 개시는 하나 이상의 특정 구현예 및/또는 실시예와 관련하여 설명되었지만, 본 개시의 범위를 벗어나지 않고 본 개시의 다른 구현예 및/또는 실시예가 이루어질 수 있음이 이해될 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> The Research Foundation for The State University of New York <120> ANALGESIC AND ANESTHETIC PEPTIDES AND OTHER AGENTS <130> 011520.01537 <150> 62/913,512 <151> 2019-10-10 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 1 Arg Met Ser Glu Ile Lys Arg Leu Leu Ser Glu 1 5 10 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 2 Arg Leu Arg Thr Leu Arg Arg Leu Leu Gln Glu 1 5 10 <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 3 Arg Leu Glu Pro Asn Asp Ile Val Tyr Leu Ile Arg Ser 1 5 10 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 4 Arg Ala Ser Asp Lys Gln Thr Leu Leu Pro Asn Gln 1 5 10 <210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 5 Arg Ala Ser Asp Lys Gln Thr Leu Leu Pro Asn Gln 1 5 10 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 6 Ile Glu Arg Leu Ser Glu Met Ser Leu Arg Lys 1 5 10 <210> 7 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X is D, E, S, or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> X is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> X is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> X is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> X is L or I <400> 7 Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa 1 5 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X is S or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> X is D, E, S, or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> X is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> X is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> X is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> X is L or I <400> 8 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa 1 5 <210> 9 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 9 Glu Ile Lys Arg Leu Leu 1 5 <210> 10 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 10 Thr Leu Arg Arg Leu Leu 1 5 <210> 11 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 11 Asp Ile Val Tyr Leu Ile 1 5 <210> 12 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 12 Asp Lys Gln Thr Leu Leu 1 5

Claims (20)

1. 하기 서열: X¹X²X³X⁴ LX⁵ (서열 번호 7)을 포함하는 펩티드로서,
   X¹은 D, E, S, 및 T로부터 선택되고;
   X², X³, 및 X⁴는 임의의 아미노산으로부터 각각 독립적으로 선택되고; 및
   X⁵는 L 및 I로부터 선택되고;
   이때, L, X¹, 및/또는 X⁵는 선택적으로 인산화되고 상기 펩티드는 6 내지 20 아미노산 잔기의 길이인, 펩티드.
   
2. 제1항에 있어서, C-말단 아미노산 잔기 또는 상기 C-말단 아미노산 직전의 아미노산 잔기가 인산화된 것인, 펩티드.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 펩티드는 지질화(lipidated)된 것인, 펩티드.
   
4. 제3항에 있어서, 상기 지질화는 N-말단 아미노산 잔기에서 이루어진 것인, 펩티드.
   
5. 제3항에 있어서, 상기 지질화는 미리스토일화(myristoylation), 옥타노일화(octanoylation), 라우오릴화(lauorylation), 팔미토일화(palmitoylation), 또는 스테아로일화(tearoylation)인 것인, 펩티드.
   
6. 제1항에 있어서, 상기 펩티드는 하기 서열:
   X⁶X¹X²X³X⁴LX⁵ (서열 번호 8)을 가지며, 상기 X⁶은 S 및 T로부터 선택되고, 상기 X⁶은 선택적으로 인산화되는 것인, 펩티드.
   
7. 제1항에 있어서, 상기 펩티드는 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 10, 11, 및 12로부터 선택된 서열을 포함하는, 펩티드.
   
8. 제1항의 펩티드 하나 이상 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 조성물.
   
9. 제8항에 있어서, 상기 조성물은 하나 이상의 진통제 및/또는 하나 이상의 마취제를 더 포함하는, 조성물.
   
10. 제8항에 있어서, 상기 하나 이상의 진통제 및/또는 상기 하나 이상의 마취제는 아세트아미노펜, 아스피린, 이부프로펜, 나프록센, 멜록시캄, 케토로락, 디클로페낙, 케토프로펜, 피록시캄, 메타미졸, 부피바카인, 에티도카인, 레보부피바카인, 리도카인, 메피바카인, 프릴로카인, 로피바카인, 프로카인, 클로로프로카인, 하이드로코르티손, 트리암시놀론, 메틸프레드니솔론, 또는 이들의 조합인 것인, 조성물.
    
11. 제8항에 있어서, 상기 조성물은 AP2-CME 표적 shRNA 및/또는 AP2-CME 표적 siRNA를 더 포함하는, 조성물.
    
12. 치료를 필요로 하는 대상체에서 통증을 치료하거나 통증 민감도를 증가시키는 방법으로서, 상기 방법은:
    제8항의 조성물 하나 이상의 치료학적 유효량을 치료를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하고,
    상기 치료를 필요로 하는 대상체의 통증은 완화되거나 상기 치료를 필요로 하는 대상체의 통증 민감도는 증가되는 것인, 방법.
    
13. 제12항에 있어서, 상기 방법은 하나 이상의 진통제 및/또는 하나 이상의 마취제를 투여하는 단계를 더 포함하는, 방법.
    
14. 제12항에 있어서, 상기 투여 단계는 통증을 예상하여(in anticipation of pain) 수행되는 것인, 방법.
    
15. 제12항에 있어서, 상기 치료를 필요로 하는 대상체는 손상(injury), 만성 질환, 만성 염증, 모턴 신경종(Morton's neuroma), 수술 중/수술 후 통증 또는 이들의 조합을 갖는 것인, 방법.
    
16. 제15항에 있어서, 상기 손상은 척수 손상, 신경 손상, 화상, 또는 이들의 조합인 것인, 방법.
    
17. 제16항에 있어서, 상기 만성 질환은 당뇨병, 대상포진, 주요 우울 장애(major depressive disorder), 섬유근육통, 편두통, 관절염, 근위축성 측삭 경화증, 다발성 경화증, 염증성 장 질환, 정신분열증, 자폐 스펙트럼 장애(autism spectrum disorders), 암, 신경근병증(radiculopathy), 또는 이들의 조합인 것인, 방법.
    
18. 제12항에 있어서, 상기 대상체에 투여되는 펩티드는 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 10, 11, 12, 및 이들의 조합들로부터 선택되는 서열을 갖는 것인, 방법.
    
19. 제12항에 있어서, 상기 대상체의 통증은 1회 투여 단계 후 1 내지 120 시간 동안 완화되는 것인, 방법.
    
20. 제12항에 있어서, 상기 대상체의 통증은 1회 투여 단계 후 24 내지 120 시간 동안 완화되는 것인, 방법.
    

Images