KR20220073203A - 자동화장비 연동이 가능한 오가노이드 (또는 스페로이드) 배양용 마이크로 채널 - Google Patents

자동화장비 연동이 가능한 오가노이드 (또는 스페로이드) 배양용 마이크로 채널 Download PDF

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KR20220073203A
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최경현
홍효원
정대영
김현영
윤새봄
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한국화학연구원
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Abstract

본 발명은 자동화장비 연동이 가능한 오가노이드 (또는 스페로이드) 배양용 마이크로 채널에 관한 것으로, 보다 상세하게는 배양액이 일정한 속도로 웰 사이를 흐를 수 있도록 채널을 형성하고, 물리적인 상하 티핑(tipping) 운동을 접목하여, 생체액의 흐름을 모사하는 것에 관한 것으로, 본 발명에 따른 장치는 유체 배양을 구현함에 있어, 로커 및 인큐베이터 이외의 부속이 필요하지 않은 단순한 구조를 가지며, 다량의 플레이트를 일정한 배양 환경에서 동시에 운전할 수 있는 장점이 있다. 또한 72-웰 플레이트를 이용한 자동 스크리닝 장비에 적용 가능하도록 하여 호환성 문제를 해결하였다. 또한, 투명성이 높고, 조립식 구조로 인해 샘플의 추출이 용이하여, 정확하고 신뢰성 있는 데이터 분석이 가능한 장점이 있다.

Description

자동화장비 연동이 가능한 오가노이드 (또는 스페로이드) 배양용 마이크로 채널{Microchannel for culturing organoid or spheroid that can be linked with automated equipment}
본 발명은 자동화장비 연동이 가능한 오가노이드 (또는 스페로이드) 배양용 마이크로 채널에 관한 것으로, 보다 상세하게는 배양액이 일정한 속도로 웰 사이를 흐를 수 있도록 채널을 형성하고, 물리적인 상하 티핑(tipping) 운동을 접목하여, 생체액의 흐름을 모사하는 것에 관한 것이다.
3차원 세포 배양(3D-cell cultivation)은 최근 가장 주목 받는 배양 기술로, 2차원 배양에서 구현하기 어려운 고차원적인 세포-세포 간의 상호작용을 재현할 수 있다(Wan ACA, 2016). 단순히 스페로이드(spheroid)가 아닌 하나의 소(小)장기로 실질적인 장기의 기능을 구현하고, 질병 모델로 확립 시, 질병에서 유래하는 다양한 증상을 그대로 나타내기 때문에, 신약 개발을 위한 연구 모델로서 다양하게 이용되고 있다(Kondo J and Inoue M., 2019). 따라서, 효과적인 3차원 배양은 건강한 미니 장기 구축에 필수적이며, 이를 위한 다양한 배양액 및 배양 플레이트 등이 개발되고 있다..
배양 플레이트의 경우, 생체 환경과 유사한 배양 조건을 구현하기 위해 모터를 장착하고 배관을 연결하여 배양액에 흐름을 가하는 방법을 주로 채택하고 있다. 특히, 췌장 오가노이드의 경우, 이러한 방법을 통하여 췌장액의 배양액 조성과 흐름을 구현한다(Jun Y et al. 2019). 뿐만 아니라, 심장, 간 등의 여러 장기를 배관으로 연결함으로써, 타겟 장기 오가노이드의 약물에 대한 반응성을 다각적으로 분석하기도 한다(Skardal A et al., 2017). 그러나, 이러한 배양 플레이트는 많은 부속품을 요구할 뿐만 아니라, 공간적 요구 및 비효율적인 비용 측면에 있어 적절하지 않다. 또한, 배양한 오가노이드를 이용하여 후보 약물 스크리닝을 하기 위해, 플레이트를 관련 장비에 적용할 때, 낮은 호환성을 보이는 문제가 있다. 따라서, 생체 환경과의 유사성을 어느 정도 유지하면서도, 공간, 비용 절감 및 자동화 장비와의 연결이 가능한, 고효율 배양 플레이트의 제작이 요구된다.
본 발명자들은 상기와 같은 문제를 해결하기 위해 유속을 로킹(rocking)을 통한 방식으로 구현할 수 있는 72-웰(well) 플레이트를 개발하였다. 상기 플레이트는 3개의 웰이 채널로 연결되어 있으며, 중간 웰을 U-타입(type)으로 제작하여 둥근 형테의 오가노이드 또는 스페로이드가 유속에 휩쓸리지 않고 안착할 수 있도록 하였다. 또한, 하나의 웰에 배양액을 분주하고 일정 속도로 로킹하여 유체 배양을 구현함으로써 본 발명을 완성하였다.
Wan ACA, Recapituating Cell-Cell Interations for Organoid Construction - Are Biomaterials Dispensable? Trends Biotechnol. 34(9):711-712, Sep 2016. Kondo J, Inoue M. Application of Cancer Organoid Model for Drug Screening and Personalized Therapy. Cells. 8(5):470, May 17, 2019. Jun Y, Lee J, Choi S et al. In vivo-mimicking microfluidic perfusion culture of pancreatic islet spheroids. Sci Adv. 5(11):eaax4520, 2019. Skardal A, Murphy SV, Devarasetty M et al. Multi-tissue interactions in an integrated three-tissue organ-on-a-chip platform. Sci Rep. 7(1):8837, 2017.
본 발명은 자동화장비 연동이 가능한 오가노이드 (또는 스페로이드) 배양용 마이크로 채널을 제공한다.
본 발명에 따른 오가노이드 (또는 스페로이드) 배양용 마이크로 채널(200)은 오가노이드 배양을 위한 오목 홈이 구비된 배양 플레이트(230); 배양액 수용공간을 형성하는 장형의 개방홈을 구비하며, 상기 배양 플레이트의 오목 홈이 상기 장형 개방홈의 중앙에 위치되도록 배양 플레이트 위에 구비되는 제 1 챔버 플레이트(220); 및 상기 제 1 챔버 플레이트 상부에 구비되며 3개의 통공이 구비된 제 2 챔버 플레이트(210);이며, 상기 3개의 통공은 상기 장형의 개방홈에 수용된 배양액이 상기 통공들의 공간으로 유통될 수 있도록 상기 제 1 챔버 플레이트의 장형 개방홈 상에 길이 방향으로 위치하도록 구비된다.
본 발명의 일 예에 따른 오가노이드 (또는 스페로이드) 배양용 마이크로 채널에 있어서, 상기 제 1 챔버 플레이트의 3개의 통공 중 중앙 통공이 상기 배양 플레이트의 오목 홈과 동일 수직선 상에 위치하도록 구비될 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 오가노이드 (또는 스페로이드) 배양용 마이크로 채널에 있어서, 상기 제 1 챔버 플레이트의 3개의 통공 중 외측 통공 2개는 상기 배양 플레이트의 오목 홈의 양 말단에 맞추어 위치하도록 구비될 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 오가노이드 (또는 스페로이드) 배양용 마이크로 채널에 있어서, 상기 제 1 챔버 플레이트 하부에 상기 오가노이드 (또는 스페로이드) 배양용 마이크로 채널을 고정하는 고정 브라켓(250)이 구비될 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 오가노이드 (또는 스페로이드) 배양용 마이크로 채널에 있어서, 상기 제 2 챔버 플레이트 상부에 상기 오가노이드 (또는 스페로이드) 배양용 마이크로 채널을 고정하는 플레이트 커버(240)가 구비될 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 오가노이드 (또는 스페로이드) 배양용 마이크로 채널에 있어서, 상기 오가노이드 (또는 스페로이드) 배양용 마이크로 채널이 복수개 구비될 수 있다(100).
본 발명의 일 예에 따른 오가노이드 (또는 스페로이드) 배양용 마이크로 채널에 있어서, 상기 장형의 개방홈에 수용된 배양액이 상기 통공들의 공간으로의 유동은 상기 장형 개방홈의 길이 방향으로의 시소 운동에 의한 것일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 오가노이드 (또는 스페로이드) 배양용 마이크로 채널에 있어서, 상기 오목 홈의 깊이는 0.5 내지 2 mm일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 오가노이드 (또는 스페로이드) 배양용 마이크로 채널에 있어서, 상기 통공의 높이는 1 내지 20 mm일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 오가노이드 (또는 스페로이드) 배양용 마이크로 채널에 있어서, 상기 장형의 개방홈의 길이는 10 내지 40 mm일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 오가노이드 (또는 스페로이드) 배양용 마이크로 채널에 있어서, 상기 오가노이드는 뇌, 안배(optic cup), 신장, 간, 췌장, 신경관, 위장, 대장, 전립선, 유방, 심장, 침샘(salivary gland), 자궁내막(endometrium), 젖샘(mammary gland), 갑상선, 혀, 및 폐 오가노이드로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 따른 오가노이드 (또는 스페로이드) 배양시스템은 상기 오가노이드 (또는 스페로이드) 배양용 마이크로 채널; 및 시소(티핑) 운동이 가능한 진동기(shaker);를 포함한다.
또한, 본 발명은 상기 배양시스템을 이용한 오가노이드 (또는 스페로이드)의 배양방법을 제공한다.
본 발명에 따른 장치는 유체 배양을 구현함에 있어, 로커 및 인큐베이터 이외의 부속이 필요하지 않은 단순한 구조를 가지며, 다량의 플레이트를 일정한 배양 환경에서 동시에 운전할 수 있는 장점이 있다. 또한 72-웰 플레이트를 이용한 자동 스크리닝 장비에 적용 가능하도록 하여 호환성 문제를 해결하였다. 또한, 투명성이 높고, 조립식 구조로 인해 샘플의 추출이 용이하여, 정확하고 신뢰성 있는 데이터 분석이 가능한 장점이 있다.
도 1은 본 발명에 따른 오가노이드 배양용 마이크로 채널의 구성 요소에 관한 것이고,
도 2는 본 발명에 따른 오가노이드 배양용 마이크로 채널의 평면 및 측면 모식도 및 로커(rocker)를 이용한 유체 배양의 모식도에 관한 것이고,
도 3은 본 발명에 따른 오가노이드 배양용 마이크로 채널의 구성 요소의 구성 요소의 구체적인 일 예에 관한 것이고,
도 4는 본 발명의 일 예에 따른 플레이트 커버와 제 2 플레이트(72-웰 플레이트)에 관한 것이고,
도 5는 본 발명의 일 예에 따른 제 1 플레이트 및 배양 플레이트에 관한 것이고,
도 6은 본 발명의 일 예에 따른 고정 브라켓에 관한 것이고,
도 7은 본 발명의 일 예에 따른 오가노이드 배양용 마이크로채널에 오가노이드를 분주한 후, 상부에서 바라본 모습에 관한 것이고,
도 8은 본 발명의 일 예에 따른 오가노이드 배양용 마이크로 채널 장치를 종래 고효율 자동화 장비와의 호환 가능 여부를 확인하기 위한 실험 예시에 관한 것이고,
도 9는 본 발명의 일 예에 따른 오가노이드 배양용 마이크로 채널 장치의 특정 웰에 선택적으로 배양액이나 오가노이드의 분주가 가능한지 여부를 검사한 결과이다.
이하 첨부한 표 또는 도면들을 참조하여 본 발명의 오가노이드 (또는 스페로이드) 배양용 마이크로 채널에 대해 상세히 설명한다.
도면이 기재되어 있을 경우, 이는 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 예로서 제공되는 것이다. 따라서 본 발명은 제시되는 도면들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있으며, 상기 도면들은 본 발명의 사상을 명확히 하기 위해 과장되어 도시될 수 있다.
제 1, 제 2 등의 용어는 다양한 구성 요소들을 설명하는 데 사용될 수 있지만, 상기 구성 요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 권리 범위를 벗어나지 않으면서 제 1 구성요소는 제 2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제 2 구성요소도 제 1 구성요소로 명명될 수 있다.
이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의되지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
또한 본 발명의 명세서에서 사용되는 단수 형태는 문맥에서 특별한 지시가 없는 한 복수 형태도 포함하는 것으로 의도할 수 있다.
또한 본 발명의 명세서에서 특별한 언급 없이 사용된 단위는 중량을 기준으로 하며, 일 예로 % 또는 비의 단위는 중량% 또는 중량비를 의미한다.
또한 본 발명의 명세서에서, “포함한다”는 표현은 “구비한다”, “함유한다”, “가진다” 또는 “특징으로 한다” 등의 표현과 등가의 의미를 가지는 개방형 기재이며, 추가로 열거되어 있지 않은 요소, 재료 또는 공정을 배제하지 않는다. 또한 “실질적으로…로 구성된다”는 표현은 특정된 요소, 재료 또는 공정과 함께 열거되어 있지 않은 다른 요소, 재료 또는 공정이 발명의 적어도 하나의 기본적이고 신규한 기술적 사상에 허용할 수 없을 만큼의 현저한 영향을 미치지 않는 양으로 존재할 수 있는 것을 의미한다. 또한 “구성된다”는 표현은 기재된 요소, 재료 또는 공정만이 존재하는 것을 의미한다.
본 발명의 명세서에서 사용된 용어, "성분", "조성물", "화합물의 조성물", "화합물", "약물", "약학적 활성제", "활성제", "치유" "치료법" "치료" 또는 "약제"는 대상체(인간 또는 동물)에 투여될 때 국소 및/또는 전신 작용에 의해 원하는 약학적 및/또는 생리학적 효과를 유도하는 화합물 또는 화합물(들) 또는 물질의 조성물을 의미하기 위해 상호교환적으로 사용된다.
본 발명에 있어 “샘플” 또는 “시료”는 분석을 위한 대상을 나타내는 것으로, 명세서에 걸쳐 동일한 의미로 사용되었다.
이하, 본 발명의 내용을 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.
이하 본 발명의 오가노이드 (또는 스페로이드) 배양용 마이크로 채널에 대해 상세히 설명한다.
본 발명에 있어 “오가노이드(organoid)”는 조직 또는 전분화능줄기세포에서 유래된 세포를 3D 형태로 배양하여 인공장기와 같은 형태로 제작한 초소형 생체기관을 의미한다. 상기 오가노이드는 줄기세포에서 발생하고 생체 내 상태와 유사한 방식으로 자가-조직화(또는 자가-패턴화)하는 장기 특이적 세포를 포함하는 삼차원 조직 유사체로서 제한된 요소(Ex. growth factor) 패터닝에 의해 특정 조직으로 발달할 수 있다. 상기 오가노이드는 세포의 본래 생리학적 특성을 가지며, 세포 혼합물(한정된 세포 유형뿐만 아니라 잔존 줄기세포, 근접 생리학적 니치(physiological niche)를 모두 포함) 원래의 상태를 모방하는 해부학적 구조를 가질 수 있다. 상기 오가노이드는 3차원 배양 방법을 통해 세포와 세포의 기능이 더욱 잘 배열되고, 기능성을 가지는 기관 같은 형태와 조직 특이적 기능을 가질 수 있다. 상기 오가노이드는 뇌, 안배(optic cup), 신장, 간, 췌장, 신경관, 위장, 대장, 전립선, 유방, 심장, 침샘(salivary gland), 자궁내막(endometrium), 젖샘(mammary gland), 갑상선, 혀, 및 폐 오가노이드로 이루어진 군에서 하나 이상 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 오가노이드 (또는 스페로이드) 배양용 마이크로 채널(200)은 오가노이드 배양을 위한 오목 홈이 구비된 배양 플레이트(230); 배양액 수용공간을 형성하는 장형의 개방홈을 구비하며, 상기 배양 플레이트의 오목 홈이 상기 장형 개방홈의 중앙에 위치되도록 배양 플레이트 위에 구비되는 제 1 챔버 플레이트(220); 및 상기 제 1 챔버 플레이트 상부에 구비되며 홀수개, 일예로, 3개의 통공이 구비된 제 2 챔버 플레이트(210);이며, 상기 홀수개, 일예로, 3개의 통공은 상기 장형의 개방홈에 수용된 배양액이 상기 통공들의 공간으로 유통될 수 있도록 상기 제 1 챔버 플레이트의 장형 개방홈 상에 길이 방향으로 위치하도록 구비된다. 다만, 배양하고자 하는 오가노이드의 종류나 특성에 따라 요구되는 배양액이나 산소의 양이 달라질 수 있다. 따라서, 오가노이드의 배양 환경을 고려하여 챔버의 크기, 직경 등을 달리할 수 있으며 다량의 배양액이 필요한 경우라면 상기 제1챔버(101)의 부피나 개수를 증가시킴으로써 배양액의 공급을 원활하게 할 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 오가노이드 (또는 스페로이드) 배양용 마이크로 채널에 있어서, 상기 제 1 챔버 플레이트의 홀수개, 일예로 3개의 통공 중 중앙 통공이 상기 배양 플레이트의 오목 홈과 동일 수직선 상에 위치하도록 구비될 수 있다. 상기와 같은 구성을 통해, 시소 운동(티핑 운동)을 통해 배양시, 무게 중심의 유지를 통해, 배양이 원활하게 이루어질 수 있으며, 시소 운동을 발생하는 운동 장치의 내구성에 문제를 일으키지 않아, 바람직하다.
본 발명의 일 예에 따른 오가노이드 (또는 스페로이드) 배양용 마이크로 채널에 있어서, 상기 제 1 챔버 플레이트의 홀수개, 일예로, 3개의 통공 중 외측 통공 2개는 상기 배양 플레이트의 오목 홈의 양 말단에 맞추어 위치하도록 구비될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 이를 통해 하나 이상의 오가노이드 배양용 마이크로 채널을 구비한 장치(100)의 구성에 있어, 가로 방향으로 일정한 거리로 이격된 통공이 형성될 수 있어, 오가노이드의 배양이 실제의 생명체 모델과의 유사성을 갖도록 할 수 있어 바람직하다.
본 발명의 일 예에 따른 오가노이드 (또는 스페로이드) 배양용 마이크로 채널에 있어서, 상기 제 1 챔버 플레이트 하부에 상기 오가노이드 (또는 스페로이드) 배양용 마이크로 채널을 고정하는 고정 브라켓(250)이 구비될 수 있다. 상기 브라켓은 배양 플레이트에 형성된 오목홈의 크기와 동일하거나 미세하게 클 수 있으며, 이를 통해 상기 배양플레이트와의 결합이 용이하게 이루어져, 고정될 수 있어 바람직하다.
본 발명의 일 예에 따른 오가노이드 (또는 스페로이드) 배양용 마이크로 채널에 있어서, 상기 제 2 챔버 플레이트 상부에 상기 오가노이드 (또는 스페로이드) 배양용 마이크로 채널을 고정하는 플레이트 커버(240)가 구비될 수 있으며, 이를 통해 배양 중인 오가노이드 및 배양액이 넘쳐 흘러내리는 것을 방지하도록 할 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 오가노이드 (또는 스페로이드) 배양용 마이크로 채널에 있어서, 상기 오가노이드 (또는 스페로이드) 배양용 마이크로 채널이 복수개 구비(100)될 수 있으며, 이를 통해 하나 이상의 오가노이드 (또는 스페로이드) 세포를 별도의 마이크로 채널 상에서 별도로 배양할 수 있어, 다양한 종류의 오가노이드 (또는 스페로이드)를 같은 조건에서 동시에 배양할 수 있으며, 이를 통해 오가노이드 (또는 스페로이드) 간의 배양 결과를 효과적으로 비교할 수 있어 바람직하다.
본 발명의 일 예에 따른 오가노이드 (또는 스페로이드) 배양용 마이크로 채널에 있어서, 상기 장형의 개방홈에 수용된 배양액이 상기 통공들의 공간으로의 유동은 상기 장형 개방홈의 길이 방향으로의 시소 운동에 의한 것일 수 있다. 상기 시소 운동은, 상기 통공이 연결된 방향으로 상하의 운동을 가함으로써, 연결된 개방홈을 통해 유체가 상기 통공 사이를 용이하게 이동할 수 있으며, 이를 통해 실제 생물체에서의 유체의 흐름을 모사할 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 오가노이드 (또는 스페로이드) 배양용 마이크로 채널에 있어서, 상기 오목 홈의 깊이는 일예로, 0.5 내지 2 mm, 좋게는 0.5 내지 1.5 mm, 더욱 좋게는 0.5 내지 1.0 mm일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 비치하고자 하는 오가노이드 또는 스페로이드의 크기에 따라 크기의 변화를 줄 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 오가노이드 (또는 스페로이드) 배양용 마이크로 채널에 있어서, 상기 통공의 높이는 일예로, 1 내지 20 mm, 좋게는 3 내지 18 mm, 더욱 좋게는 5 내지 15 mm일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 범위에서 시소 운동에 따른 유체의 운동이 오가노이드 (또는 스페로이드)의 위치 변화에 영향을 주지 않으면서 효과적인 배양이 이루어질 수 있어 바람직하다.
본 발명의 일 예에 따른 오가노이드 (또는 스페로이드) 배양용 마이크로 채널에 있어서, 상기 장형의 개방홈의 길이는 일예로, 10 내지 40 mm, 좋게는 13 내지 35 mm, 더욱 좋게는 17 내지 30 mm일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 범위에서 오가노이드 (또는 스페로이드)의 효과적인 배양이 이루어질 수 있어 바람직하다.
본 발명의 일 예에 따른 오가노이드 (또는 스페로이드) 배양용 마이크로 채널에 있어서, 상기 오가노이드는 뇌, 안배(optic cup), 신장, 간, 췌장, 신경관, 위장, 대장, 전립선, 유방, 심장, 침샘(salivary gland), 자궁내막(endometrium), 젖샘(mammary gland), 갑상선, 혀, 및 폐 오가노이드로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 배양 목적에 따라 적절한 조직 또는 기관 세포를 채취하여 배양할 수 있음은 물론이다.
또한 본 발명에 따른 오가노이드 (또는 스페로이드) 배양시스템(300)은 상기 오가노이드 (또는 스페로이드) 배양용 마이크로 채널; 및 시소(티핑) 운동이 가능한 진동기(shaker);를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 마이크로 채널과 호환되는 다양한 장비에 연결하여 배양할 수 있음은 물론이다.
또한, 본 발명은 상기 배양시스템을 이용한 오가노이드 (또는 스페로이드)의 배양방법을 제공한다.
한편, 상기 오가노이드는 3차원 배양을 통해 효율적으로 배양될 수 있으며, 매트리겔 등 당해 기술분야에서 널리 활용되는 하이드로겔을 통해 효과적으로 배양될 수 있다. 상기 “3차원 배양(three-dimensional culture)”은 세포가 평편한 플레이트의 2차원적인 환경에 적응하는 과정을 배제하여 실제 조직과 유사한 환경을 제공하며, 생체 내 세포 성장, 분화 및 기능을 유도할 수 있다. 상기 3차원 배양은　in vitro　환경에서 실제　in　vivo　조직 환경을 효과적으로 모방하며 결과의 확실성, 실험의 안정성 및 타당성을 향상시킬 수 있다. 상기 “하이드로겔(hydrogel)”은 졸-겔 상변이를 통해 물을 분산매로 하는 액체가 굳어 유동성을 상실하고 다공성 구조를 이루는 물질로서, 3차원 망목 구조와 미결정 구조를 갖는 친수성 고분자가 물을 함유하여 팽창함으로써 형성될 수 있다. 상기 “매트리겔(matrigel)”은 EHS(Engelbreth-Holm-Swarm) 마우스의 육종세포에서 추출된 단백질 복합체로서(BD Bioscience社의 제품명), 라미닌(lamonin), 콜라겐(collagen), 헤파란 설페이트 프로테오글리칸(heparan sulfate proteoglycan)과 같은 세포외 매트릭스와 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor; FGF), 상피세포 성장인자(epidermal growth factor; EGF), 인슐린 성장인자(insulin-like growth factor; IGF), 형질전환 성장인자-베타(transforming growth factor-beta; TGF-β또는 혈소판 유래 성장인자(platelet-derived growth factor; PDGF)를 포함할 수 있다.
상기 오가노이드는 특성에 따라 배양 특성이나 속도가 상이하므로 배양 환경을 고려하여 챔버의 형태나 부피를 달리할 수 있다.
상기 배양은 적합한 조건에서 세포를 유지 및 성장시키는 과정을 의미하며, 적합한 조건은 예컨대, 세포가 유지되는 온도, 영양소 가용성, 대기 CO2　함량 및 세포 밀도를 의미할 수 있다.
서로 다른 유형의 세포를 유지, 증식, 확대 및 분화 시키기 위한 적절한 배양 조건은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 문서화 되어있다. 상기 오가노이드 형성에 적합한 조건은 세포 분화 및 다세포 구조의 형성을 용이하게 하거나 허용하는 조건일 수 있다.
이하 실시예를 통해, 본 발명을 더욱 상술하나 하기 실시예에 의해 본 발명이 제한되지 아니함은 자명하다.
[실시예 1] 오가노이드 배양용 마이크로 채널 제작
도 3의 좌측 그림과 같이 오가노이드 배양용 마이크로 채널을 127.5 mm x 85.5 mm x 15.4mm의 크기로 제작하였다.
상기 오가노이드 배양용 마이크로 채널은 우측 그림과 같이 5가지 결합 요소를 볼트 조립 체결 방식으로 순차적으로 적층하여 결합하는 방식으로 제작하였다.
플레이트 커버 및 제 2 챔버 플레이트 제작
상기 결합 요소 중 상단을 덮는 플레이트 커버와 제 2 챔버 플레이트에 해당하는 72-웰 플레이트는 NC(numerical control) 장비를 이용하여 가공, 제작하였고, 이 때, 상기 플레이트 커버는 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmethacrylate, PMMA) 소재로 제작되었고, 상기 오가노이드 배양용 마이크로 채널 전체의 크기와 같은 규격으로 이루어졌다(도 4 참조).
상기 제 2 챔버 플레이트에 해당하는 72-웰 플레이트 또한 플레이트 커버와 동일한 소재로 제작되었으며, 123 mm x 81 mm x 10 mm (길이*폭*높이; L*W*H)의 규격으로 제작하였다. 이 때 상기 제 2 챔버 플레이트에서 원통형으로 타공된 각 웰은 7 mm의 직경을 갖도록 제작하였다.
제 1 챔버 플레이트 및 배양 플레이트 제작
상기 결합 요소 중 제 1 챔버 플레이트는 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane, PDMS) 소재를 사용하여, 시트를 형성하고, 상기 시트 형상에 컷팅 방식을 적용하여 24개의 마이크로 채널을 형성하도록 하였다. 제 1 챔버 플레이트에 형성된 마이크로 채널의 규격은 25 mm x 7.5 mm x 0.8 mm가 되도록 하였다(도 5 참조).
배양 플레이트는 두께 1 mm의 PMMA 기판에 열 성형 가공 기술을 적용하여, U-타입으로 제작하였다. 상기 배양 플레이트는 오가노이드 배양 시 유체 속에서 세포가 부착되는 현상의 방지를 위해 플루로닉 F127(Pluronic-F127)으로 코팅하였다. 상기 배양 플레이트의 전체 규격은 111 mm x 63 mm x 1 mm, 배양을 위한 U-타입의 오목홈의 크기는 직경 6 mm, 깊이 1.7 mm가 되도록 하였다.
고정 브라켓 제작
상기 결합 요소 중 하단에 고정되는 고정 브라켓은 NC(numerical control) 장비를 이용하여 가공, 제작하였고, 이 때, 상기 고정 브라켓의 소재는 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmethacrylate, PMMA)를 이용하였다. 상기 고정 브라켓은 127.5 mm x 85.5 mm x 9 mm의 크기로 제작되었으며, 상부에 결합되는 배양 플레이트의 U-타입의 오목홈에 해당하는 위치에 동일한 크기의 오목 홈을 형성하도록 하였다.
오가노이드 배양용 마이크로 채널 제작
상기 방법으로 제작된 5가지 구성 요소를 도 3에 예시된 바와 같이, 순서대로 연결되도록 하여, 오가노이드 배양을 위한 마이크로 채널 장치를 제작하였다.
[실시예 2] 제작된 오가노이드 배양용 마이크로채널에 대한 오가노이드 분주
상기 실시예 1을 통해 제작된 오가노이드 배양용 마이크로채널에 오가노이드를 분주한 후, 상부에서 바라본 모습을 도 7에 도시하였다. 도 7의 마지막 그림에서 확인할 수 있는 바와 같이, 오가노이드가 분주된 오목홈상에 3개의 통공이 서로 연결되어 있으며, 이를 통해 유체의 이동이 서로 가능하도록 하여, 실제 생체 환경의 움직임과 유사한 환경이 되도록 구현하였다.
[실시예 3] 고효율 스크리닝 장비와의 호환
상기 실시예 1에서 제작한 오가노이드 배양용 마이크로 채널 장치를 종래 고효율 자동화 장비와의 호환 가능 여부를 확인하기 위해, biomek FX 자동분주 시스템(Beckman사)에 상기 마이크로 채널을 장착하고, 배양액을 도 8과 같이 분주하였다.
그 결과, 상기 장비와의 규격에 해당하는 96-웰 플레이트와 같은 규격의 형태로 제작되었기 때문에, 자동화 장비와의 호환성이 높고, 배양액의 분주 또한 정교하게 진행된 것을 확인하였다.
오가노이드 배양용 마이크로채널 장비의 특정 웰에 배양액과 오가노이드 분주 가능 여부
상기 방법으로 장착한 오가노이드 배양용 마이크로 채널 장치의 특정 웰에 선택적으로 배양액이나 오가노이드의 분주가 가능한지 여부를 검사하였다. 그 결과 도 9에 도시한 바와 같이, 오가노이드가 안착되어 있는 2번째 통공에 특이적으로 분주가 가능한 것을 확인하였다. 즉, 오가노이드 크기에 맞는 팁을 사용하는 경우, 상기 마이크로 채널 장비에 오가노이를 분주할 수 있으며, 이후 배양이 진행된 오가노이드를 취합하여 다른 시험에 용이하게 적용할 수 있는 것을 확인하였다.
제시된 실시예들에 대한 설명은 임의의 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 본 발명을 이용하거나 또는 실시할 수 있도록 제공한다. 이러한 실시예들에 대한 다양한 변형들은 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백할 것이며, 여기에 정의된 일반적인 원리들은 본 발명의 범위를 벗어남이 없이 다른 실시예들에 적용될 수 있다. 그리하여, 본 발명은 여기에 제시된 실시예들로 한정되는 것이 아니라, 여기예 제시된 원리들 및 신규한 특징들과 일관되는 최광의의 범위에서 해석되어야 할 것이다.
100: 복수개의 오가노이드 배양용 마이크로 채널을 구비한 오가노이드 배양용 마이크로 채널 장치
200: 오가노이드 배양용 마이크로 채널
210: 제 2 챔버 플레이트
220: 제 1 챔버 플레이트
230: 배양 플레이트
240: 플레이트 커버
250: 고정 브라켓
300: 오가노이드 배양용 마이크로 채널이 장착된 시소(티핑) 운동이 가능 배양 장치

Claims (13)

  1. 오가노이드 배양을 위한 오목 홈이 구비된 배양 플레이트(230);
    배양액 수용공간을 형성하는 장형의 개방홈을 구비하며, 상기 배양 플레이트의 오목 홈이 상기 장형 개방홈의 중앙에 위치되도록 배양 플레이트 위에 구비되는 제 1 챔버 플레이트(220); 및
    상기 제 1 챔버 플레이트 상부에 구비되며 3개의 통공이 구비된 제 2 챔버 플레이트(210);이며,
    상기 3개의 통공은 상기 장형의 개방홈에 수용된 배양액이 상기 통공들의 공간으로 유통될 수 있도록 상기 제 1 챔버 플레이트의 장형 개방홈 상에 길이 방향으로 위치하도록 구비되는 것인, 오가노이드 (또는 스페로이드) 배양용 마이크로 채널(200).
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 제 1 챔버 플레이트의 3개의 통공 중 중앙 통공이 상기 배양 플레이트의 오목 홈과 동일 수직선 상에 위치하도록 구비되는 것인, 오가노이드 (또는 스페로이드) 배양용 마이크로 채널.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 제 1 챔버 플레이트의 3개의 통공 중 외측 통공 2개는 상기 배양 플레이트의 오목 홈의 양 말단에 맞추어 위치하도록 구비되는 것인, 오가노이드 (또는 스페로이드) 배양용 마이크로 채널.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 제 1 챔버 플레이트 하부에 상기 오가노이드 (또는 스페로이드) 배양용 마이크로 채널을 고정하는 고정 브라켓(250)이 구비되는 것인, 오가노이드 (또는 스페로이드) 배양용 마이크로 채널.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 제 2 챔버 플레이트 상부에 상기 오가노이드 (또는 스페로이드) 배양용 마이크로 채널을 고정하는 플레이트 커버(240)가 구비되는 것인, 오가노이드 (또는 스페로이드) 배양용 마이크로 채널.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 오가노이드 (또는 스페로이드) 배양용 마이크로 채널이 복수개 구비(100)되는 것인, 오가노이드 (또는 스페로이드) 배양용 마이크로 채널.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 장형의 개방홈에 수용된 배양액이 상기 통공들의 공간으로의 유동은 상기 장형 개방홈의 길이 방향으로의 시소 운동에 의한 것인, 오가노이드 (또는 스페로이드) 배양용 마이크로 채널.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 오목 홈의 깊이는 0.5 내지 2 mm인, 오가노이드 (또는 스페로이드) 배양용 마이크로 채널.
  9. 제 1항에 있어서,
    상기 통공의 높이는 1 내지 20 mm인, 오가노이드 (또는 스페로이드) 배양용 마이크로 채널.
  10. 제 1항에 있어서,
    상기 장형의 개방홈의 길이는 10 내지 40 mm인, 오가노이드 (또는 스페로이드) 배양용 마이크로 채널.
  11. 제 1항에 있어서,
    상기 오가노이드는 뇌, 안배(optic cup), 신장, 간, 췌장, 신경관, 위장, 대장, 전립선, 유방, 심장, 침샘(salivary gland), 자궁내막(endometrium), 젖샘(mammary gland), 갑상선, 혀, 및 폐 오가노이드로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인, 오가노이드 (또는 스페로이드) 배양용 마이크로 채널.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 오가노이드 (또는 스페로이드) 배양용 마이크로 채널; 및
    시소(티핑) 운동이 가능한 진동기(shaker);
    를 포함하는 오가노이드 (또는 스페로이드) 배양시스템
  13. 제 12항의 배양시스템을 이용한 오가노이드 (또는 스페로이드)의 배양방법.
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