KR20220070537A - 프로테아제의 단백질 분해 활성의 강화 및 안정화 - Google Patents

프로테아제의 단백질 분해 활성의 강화 및 안정화 Download PDF

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KR20220070537A
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Abstract

본 발명은 프로테아제의 단백질 분해 활성의 강화 및 안정화 방법, 강화되고 안정화된 단백질 분해 활성을 갖는 프로테아제를 포함하는 조성물의 제조 방법, 상기 방법에 의해 얻거나 얻을 수 있는 강화되고 안정화된 단백질 분해 활성을 갖는 프로테아제를 포함하는 조성물, 의약품 및 화장품 제조에서의 이러한 조성물의 용도, 상처를 비롯한 질병 및 질환의 치료, 미용 적용 및 관련 키트에서의 이러한 조성물의 용도에 관한 것이다.

Description

프로테아제의 단백질 분해 활성의 강화 및 안정화
본 발명은 프로테아제의 단백질 분해 활성의 강화 및 안정화 방법, 강화되고 안정화된 단백질 분해 활성을 갖는 프로테아제를 포함하는 조성물의 제조 방법, 상기한 방법에 의해 얻어지거나 얻을 수 있는 강화되고 안정화된 단백질 분해 활성을 갖는 프로테아제를 포함하는 조성물, 의약품 및 화장품 제조에서의 이러한 조성물의 용도, 상처를 포함하는 질병 및 질환의 치료, 미용 응용 및 관련 키트에서의 이러한 조성물의 용도에 관한 것이다.
파파인(papain)과 브로멜라인(bromelain)은 괴사조직 제거용 의약품과, 각질 제거 및 피부 미백용 화장 제품/코스메슈티컬 제품에 사용되는 프로테아제들이다. 파파인과 브로멜라인의 단백질 분해 활성은, 이러한 괴사조직 제거, 각질 제거 및 피부 미백을 유발한다. 그러나, 파파인이나 브로멜라인 제제는 단백질 분해 활성의 불안정성으로 인해 그 잠재력을 발휘하지 못하고 있었다.
화상 및 만성 궤양과 같은 상처에서 발견되는 것과 같은 죽은 조직 및 손상된 조직의 제거를 통해 상처 치유를 촉진하는 안정한 조성물을 개발하기 위한 상당한 노력이 이전에 투자되었다. 죽은 조직과 죽어가는 조직은 기회 감염(opportunistic infection)에 대한 우수한 배양 배지(culture medium)이기 때문에 효율적인 괴사조직 제거는 필수적인 것이다. 감염으로 인한 패혈증은 심하게 화상을 입은 환자의 주요 사망 원인이다.
이전의 접근 방식 중 하나는 파파인, 트립신 및 브로멜라인과 같은 단백질 분해 효소를 사용하는 것이었다. 특히, 브로멜라인이 풍부한 단백질 분해 효소 농축물인 NexoBridTM는, 2012년 유럽에서 깊은 부분 및 전체 두께 열화상을 입은 성인에 대한 가피 제거(즉, 괴사조직 제거)로 승인을 받았다. 그러나, 유럽 의약품청(European Medicines Agency)은 2012년 9월 20일 섹션 2.2.3, 14페이지의 "Assessment report - Nexobrid - Concentrate of proteolytic enzymes enriched in bromelain"에서 다음과 같이 언급하면서, 단백질 분해 효소 조성물의 일반적인 문제는 단백질 분해 활성의 낮은 안정성임을 확인했다:
"25℃ 및 37℃에서 새로운 호환성(사용 중 안정성) 연구를 수행한 바 NexoBrid가 혼합 이후 몇 시간 내에 분해됨을 보여주었다. 따라서 혼합 직후에 제품이 사용되어야 한다는 신청인의 결론은 지지된다."
따라서, NexoBrid™는 일반적으로 젤 비히클과 함께 사용하기 전에 재구성되는 동결 건조된 분말로 공급되며 제제화 후 15분 이내에 사용되어야 한다. 따라서 재구성이 필요 없는 즉시 사용 가능한 형태로 NexoBridTM와 같은 조성물을 제공하는 것이 유리할 것이다. 그러나, 그렇게 하려면 허용 가능한 저장 수명을 달성하기 위해 괴사 조직 제거 활성의 안정성이 크게 향상되어야 한다.
유사하게, 각질 제거 및/또는 피부 미백 특성이 있는 것으로서 시판되는 파파인 및/또는 브로멜라인 함유 화장품의 경우, 화장품에서의 파파인 및/또는 브로멜라인의 활성 손실로 인해 각질 제거 활성이 종종 단기간에 심하게 감소한다.
활성 손실이 낮거나 없는 pH(파파인의 경우, 산성 pH가 사용됨)에서 또는 고체 형태로 효소를 저장하는 것을 비롯하여, 의약품에서 프로테아제의 단백질 분해 활성 손실 문제를 해결하기 위한 방법이 이전에 고안되었다. 그러나, 이러한 처리는 실행 가능한 제품을 얻기 위해 전문적인 최종 사용자의 처리를 필요로 한다. 이것은 그러한 방법 및 조성물의 유용성을 제한한다.
이전에 시도된 또 다른 방법은 이동성과 자기 반응성을 방지하기 위해 고분자 기질에 효소를 고정화하는 것이다. 고정화 효소(immobilised enzyme)의 예는 PEG-파파인 및 키토산-파파인이다. 이러한 방법에 의해 단백질 분해 활성의 안정성이 향상될 수 있는 반면, 효소는 비가역적인 방식으로 화학적으로 변경될 수 있으며 따라서 특정 기질(특히, 피부 및 세포 단백질과 같은 복잡한 기질에 적용될 때)에 대하여 충분한 활성을 나타내지 않을 수 있다. 또한, 이러한 효소의 변경된 화학 구조는 알레르기 및 과민증과 같은 최종 사용자에게 유해한 반응을 초래할 수 있다.
이러한 문제를 해결하기 위해, 본 발명을 뒷받침하는 연구는 카리카 파파야(파파야) 식물(파파인 포함) 및 아나나스 코모수스(파인애플) 식물(브로멜라인 포함)과 같은 다양한 소스들에서 추출한 프로테아제의 단백질 분해 활성 손실을 조사하였다. 이러한 연구에 기초하여, 특히 파파야 및 파인애플 식물들에서 유래된 프로테아제를 함유하는 제약 및 화장 조성물/코스메슈티컬 조성물에서, 프로테아제의 단백질 분해 활성의 강화 및 안정화를 위한 방법이 개발되었다.
놀랍게도 그리고 예상 외로, 단백질 분해 활성의 안정성을 향상시키는 여러 방법들이 단백질 분해 활성 자체도 또한 상당히 향상시키는 것으로 밝혀졌다.
본 발명은 프로테아제의 단백질 분해 활성의 강화 및 안정화를 위한 새로운 방법을 교시한다. 특정 실시형태들에서, 프로테아제는 과일 및/또는 야채로부터 얻거나 얻을 수 있다. 따라서, 일부 실시형태들에서, 프로테아제는 과일 및/또는 야채로부터 얻어지는 한편, 다른 실시형태들에서, 프로테아제는 재조합 발현 시스템으로부터 얻어진다. 특정 실시형태들에서, 프로테아제는 시스테인 프로테아제이다. 특정 실시형태들에서, 시스테인 프로테아제는 파파인(EC 3.4.22.2), 키모파파인(EC 3.4.22.6), 브로멜라인(줄기 브로멜라인 - EC 3.4.22.32 및 과일 브로멜라인 - EC 3.4.22.33), 피카인(EC 3.4.22.3) 또는 악티니다인(EC 3.4.22.14)일 수 있다. 특정 실시형태들에서, 프로테아제는 카리카 파파야(파파야) 식물 또는 아나나스 코모수스(파인애플) 식물로부터 얻거나 얻을 수 있다. 특정 실시형태들에서, 프로테아제는 파파인 또는 브로멜라인이다.
제 1 양태에서, 본 발명은 프로테아제의 단백질 분해 활성의 강화 및/또는 안정화를 위한 방법을 제공하며, 이 방법은 (i) 프로테아제를 환원제와 접촉시키는 단계 - 프로테아제의 시스테인 잔기는 환원된 상태로 유지됨 -, (ii) 프로테아제를 둘러싸는 영역으로부터 실질적으로 모든 산소 가스를 제거하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 산소 가스는 제제의 탈가스에 의해 제거된다. 일 실시형태에서, 프로테아제는 실질적으로 무산소 분위기에서 패키징된다.
관련된 양태에서, 본 발명은 프로테아제의 단백질 분해 활성의 강화 및/또는 안정화를 위한 방법을 제공하며, 이 방법은 (i) 프로테아제를 포함하는 용액 또는 겔을 제공하는 단계; (ii) 용액 또는 겔 내의 프로테아제를 환원제와 접촉시키는 단계 - 프로테아제의 시스테인 잔기는 환원된 상태로 유지됨 - 및 (iii) 용액 또는 겔로부터 실질적으로 모든 산소 가스를 제거하는 단계를 포함한다.
제 2 양태에서, 본 발명은 강화된 및/또는 안정화된 단백질 분해 활성을 갖는 프로테아제를 포함하는 조성물을 생산하는 방법을 제공하며, 이 방법은 (i) 프로테아제를 환원제와 접촉시키는 단계 - 프로테아제의 시스테인 잔기는 환원된 상태로 유지됨 - 및 (ii) 조성물을 둘러싸는 영역으로부터 실질적으로 모든 산소 가스를 제거하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 산소 가스는 조성물의 탈가스에 의해 제거된다. 일 실시형태에서, 조성물은 실질적으로 무산소 분위기에서 패키징된다.
관련된 양태에서, 본 발명은 강화된 및/또는 안정화된 단백질 분해 활성을 갖는 프로테아제를 포함하는 조성물을 생산하는 방법을 제공하며, 이 방법은 (i) 프로테아제를 포함하는 용액 또는 겔을 제공하는 단계; (ii) 용액 또는 겔 내의 프로테아제를 환원제와 접촉시키는 단계 - 프로테아제의 시스테인 잔기는 환원된 상태로 유지됨 - 및 (iii) 용액 또는 겔로부터 실질적으로 모든 산소 가스를 제거하는 단계를 포함한다.
제 3 양태에서, 본 발명은 강화된 및/또는 안정화된 단백질 분해 활성을 갖는 하나 이상의 프로테아제를 포함하는 조성물을 제공하며, 이 조성물은 (i) 프로테아제를 환원제와 접촉시키는 단계 - 프로테아제의 시스테인 잔기는 환원된 상태로 유지됨 - 및 (ii) 조성물을 둘러싸는 영역으로부터 실질적으로 모든 산소 가스를 제거하는 단계를 포함하는 제 1 양태의 방법에 의해 얻어지거나 얻을 수 있다. 일 실시형태에서, 산소 가스는 조성물의 탈가스에 의해 제거된다. 일 실시형태에서, 조성물은 실질적으로 무산소 분위기에서 패키징된다.
제 4 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 프로테아제 및 환원제를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 프로테아제의 시스테인 잔기는 환원된 상태로 유지되고, 조성물은 실질적으로 산소가 없다. 일 실시형태에서, 산소 가스는 조성물의 탈가스에 의해 제거된다. 일 실시형태에서, 조성물은 실질적으로 무산소 분위기에서 패키징된다.
본 발명에 따르면, 프로테아제의 단백질 분해 활성의 강화 및/또는 안정화는 또한 프로테아제를 음이온성 폴리머 매트릭스에 고정화함으로써 달성될 수 있다. 음이온성 폴리머를 사용하면 프로테아제가 매트릭스에 비공유적으로 결합될 수 있다. 이것은 예를 들어 프로테아제의 1차 아민의 일부를 카르보머의 카르복실기와 반응시키는 것에 의해 매트릭스 물질과 공유 결합을 형성함으로써 프로테아제를 고정화시키는 당업계의 이전 방법과 대조되며, 여기서 프로테아제의 나머지 1차 아민의 일부는 아민 반응성 가교제를 사용하여 가교 결합된다.
따라서, 제 5 양태에서, 본 발명은 프로테아제의 단백질 분해 활성의 강화 및/또는 안정화 방법을 제공하며, 이 방법은 프로테아제가 음이온성 폴리머 매트릭스에 비공유적으로 결합되도록 프로테아제와 음이온성 폴리머 매트릭스를 조합하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 폴리머는 카보머이다. 일 실시형태에서, 조성물은 실질적으로 무산소 분위기에서 패키징된다.
제 6 양태에서, 본 발명은 강화된 및/또는 안정화된 단백질 분해 활성을 갖는 프로테아제를 포함하는 조성물을 생산하는 방법을 제공하며, 이 방법은 프로테아제가 음이온성 폴리머 매트릭스에 비공유적으로 결합되도록 프로테아제와 음이온성 폴리머 매트릭스를 조합하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 폴리머는 카보머이다. 일 실시형태에서, 조성물은 실질적으로 무산소 분위기에서 패키징된다.
제 7 양태에서, 본 발명은 강화된 및/또는 안정화된 단백질 분해 활성을 갖는 하나 이상의 프로테아제를 포함하는 조성물을 제공하며, 이 조성물은 프로테아제가 음이온성 폴리머 매트릭스에 비공유적으로 결합되도록 프로테아제와 음이온성 폴리머 매트릭스를 조합하는 단계를 포함하는 방법에 의해 얻어지거나 얻을 수 있다. 일 실시형태에서, 폴리머는 카보머이다. 일 실시형태에서, 조성물은 실질적으로 무산소 분위기에서 패키징된다.
제 8 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 프로테아제 및 음이온성 폴리머 매트릭스를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 프로테아제는 음이온성 폴리머 매트릭스에 비공유적으로 결합된다. 일 실시형태에서, 폴리머는 카보머이다. 일 실시형태에서, 조성물은 실질적으로 무산소 분위기에서 패키징된다.
본 발명에서 교시된 방법들은 또한 조합될 수 있다. 예를 들어, 제 1 양태의 방법이 제 5 양태의 방법과 조합될 수 있거나, 제 2 양태의 방법이 제 6 양태의 방법과 조합될 수 있다.
따라서, 제 9 양태에서, 본 발명은 프로테아제의 단백질 분해 활성의 강화 및/또는 안정화를 위한 방법을 제공하며, 이 방법은 (i) 프로테아제를 환원제와 접촉시키는 단계 - 프로테아제의 시스테인 잔기는 환원된 상태로 유지됨 -, (ii) 프로테아제를 둘러싸는 영역으로부터 실질적으로 모든 산소 가스를 제거하는 단계 및 (iii) 프로테아제가 음이온성 폴리머 매트릭스에 비공유적으로 결합되도록 프로테아제와 음이온성 폴리머 매트릭스를 조합하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 산소 가스는 제제의 탈가스에 의해 제거된다. 일 실시형태에서, 폴리머는 카보머이다. 일 실시형태에서, 프로테아제는 실질적으로 무산소 분위기에서 패키징된다.
일 실시형태에서 단계 (iii)은 단계 (i) 및 (ii) 전에 수행된다. 다른 실시형태에서, 단계 (i) 내지 (iii)은 그 순서로 수행된다.
관련된 양태에서, 본 발명은 프로테아제의 단백질 분해 활성의 강화 및/또는 안정화를 위한 방법을 제공하며, 이 방법은 (i) 프로테아제를 포함하는 용액을 제공하는 단계; (ii) 용액 내의 프로테아제를 환원제와 접촉시키는 단계 - 프로테아제의 시스테인 잔기는 환원된 상태로 유지됨 -, (iii) 용액으로부터 실질적으로 모든 산소 가스를 제거하는 단계; 및 (iv) 프로테아제가 음이온성 폴리머 매트릭스에 비공유적으로 결합되도록 프로테아제와 음이온성 폴리머 매트릭스를 조합하는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 단계 (iv)는 단계 (i) 내지 (iii) 전에 수행된다. 다른 실시형태에서, 단계 (i) 내지 (iv)는 그 순서로 수행된다.
제 10 양태에서, 본 발명은 강화된 및/또는 안정화된 단백질 분해 활성을 갖는 프로테아제를 포함하는 조성물을 생산하는 방법을 제공하며, 이 방법은 (i) 프로테아제를 환원제와 접촉시키는 단계 - 프로테아제의 시스테인 잔기는 환원된 상태로 유지됨 -, (ii) 프로테아제를 둘러싸는 영역으로부터 실질적으로 모든 산소 가스를 제거하는 단계 및 (iii) 프로테아제가 음이온성 폴리머 매트릭스에 비공유적으로 결합되도록 프로테아제와 음이온성 폴리머 매트릭스를 조합하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 산소 가스는 제제의 탈가스에 의해 제거된다. 일 실시형태에서, 폴리머는 카보머이다. 일 실시형태에서, 조성물은 실질적으로 무산소 분위기에서 패키징된다.
관련된 양태에서, 본 발명은 강화된 및/또는 안정화된 단백질 분해 활성을 갖는 프로테아제를 포함하는 조성물을 생산하는 방법을 제공하며, 이 방법은 (i) 프로테아제를 포함하는 용액 또는 겔을 제공하는 단계; (ii) 용액 또는 겔 내의 프로테아제를 환원제와 접촉시키는 단계 - 프로테아제의 시스테인 잔기는 환원된 상태로 유지됨-; (iii) 용액 또는 겔로부터 실질적으로 모든 산소 가스를 제거하는 단계; 및 (iv) 프로테아제가 음이온성 폴리머 매트릭스에 비공유적으로 결합되도록 프로테아제와 음이온성 폴리머 매트릭스를 조합하는 단계를 포함한다.
제 11 양태에서, 본 발명은 강화된 및/또는 안정화된 단백질 분해 활성을 갖는 하나 이상의 프로테아제를 포함하는 조성물을 제공하며, 이 조성물은 (i) 프로테아제를 환원제와 접촉시키는 단계 - 프로테아제의 시스테인 잔기는 환원된 상태로 유지됨 -, (ii) 프로테아제를 둘러싸는 영역으로부터 실질적으로 모든 산소 가스를 제거하는 단계, (iii) 프로테아제가 음이온성 폴리머 매트릭스에 비공유적으로 결합되도록 프로테아제와 음이온성 폴리머 매트릭스를 조합하는 단계를 포함하는 제 9 양태의 방법에 의해 얻어지거나 얻을 수 있다. 일 실시형태에서, 산소 가스는 제제의 탈가스에 의해 제거된다. 일 실시형태에서, 폴리머는 카보머이다. 일 실시형태에서, 조성물은 실질적으로 무산소 분위기에서 패키징된다.
제 12 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 프로테아제, 환원제 및 음이온성 폴리머 매트릭스를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 프로테아제의 시스테인 잔기는 환원된 상태로 유지되고, 조성물은 실질적으로 무산소이고, 프로테아제는 음이온성 폴리머 매트릭스에 비공유 결합된다. 일 실시형태에서, 산소 가스는 조성물의 탈가스에 의해 제거된다. 일 실시형태에서, 폴리머는 카보머이다. 일 실시형태에서, 조성물은 실질적으로 무산소 분위기에서 패키징된다.
일 실시형태에서, 조성물은 겔 형태이다.
제 13 양태에서, 본 발명은 의약품의 제조에서 제 3, 제 4, 제 7, 제 8, 제 11 및/또는 제 12 양태의 조성물의 용도를 제공한다. 일부 실시형태들에서, 의약품은 상처를 포함하는 질병 및 질환의 치료를 위한 것이다. 일부 실시형태들에서, 의약품은 괴사조직 제거를 위한 것이다. 일부 실시형태들에서, 의약품은 화상 치료를 위한 것이다. 일부 실시형태들에서, 의약품은 궤양을 치료하기 위한 것이다. 일부 실시형태들에서, 의약품은 괴저를 치료하기 위한 것이다.
제 14 양태에서, 본 발명은 화장품의 제조에 있어서 제 3, 제 4, 제 7, 제 8, 제 11 및/또는 제 12 양태의 조성물의 용도를 제공한다. 일부 실시형태들에서, 화장품은 각질 제거, 피부 미백, 또는 주름, 피부 잡티, 주근깨, 뾰루지, 여드름, 장미증, 기미, 흉터 또는 정맥류에 적용하거나, 건조, 노화 또는 손상된 피부에 적용하기 위한 것이다.
제 15 양태에서, 본 발명은 약학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제, 계면활성제 및/또는 보조제와 함께 제 3, 제 4, 제 7, 제 8, 제 11 및/또는 제 12 양태의 조성물을 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
제 16 양태에서, 본 발명은 미용적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제, 계면활성제 및/또는 보조제와 함께 제 3, 제 4, 제 7, 제 8, 제 11 및/또는 제 12 양태의 조성물을 포함하는 화장 조성물을 제공한다.
제 17 양태에서, 본 발명은 상처를 포함하는 질병 및 질환의 치료에 사용하기 위한, 제 3, 제 4, 제 7, 제 8, 제 11 및/또는 제 12 양태의 조성물, 또는 제 15 양태의 제약 조성물을 제공한다. 일부 실시형태들에서, 치료는 괴사조직 제거이다. 일부 실시형태들에서, 치료는 화상에 대한 것이다. 일부 실시형태들에서, 치료는 궤양에 대한 것이다. 일부 실시형태들에서, 치료는 괴저에 대한 것이다. 일부 실시형태들에서, 조성물은 국소적으로 적용된다.
제 18 양태에서, 본 발명은 제 3, 제 4, 제 7, 제 8, 제 11 및/또는 제 12 양태의 조성물, 또는 제 15 양태의 제약 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 상처를 포함한 질병 및 질환의 치료 방법을 제공한다. 일부 실시형태들에서, 치료는 괴사조직 제거이다. 일부 실시형태들에서, 치료는 화상에 대한 것이다. 일부 실시형태들에서, 치료는 궤양에 대한 것이다. 일부 실시형태들에서, 치료는 괴저에 대한 것이다. 일부 실시형태들에서, 조성물은 국소적으로 적용된다.
제 19 양태에서, 본 발명은 피부 미백, 각질 제거에서 사용하거나 또는 주름, 피부 잡티, 주근깨, 뾰루지, 여드름, 장미증, 기미, 흉터 또는 정맥류에 적용하거나, 또는 건조, 노화 또는 손상된 피부에 적용하기 위한 제 3, 제 4, 제 7, 제 8, 제 11 및/또는 제 12 양태의 조성물, 또는 제 16 양태의 화장 조성물을 제공한다.
제 20 양태에서, 본 발명은 제 3, 제 4, 제 7, 제 8, 제 11 및/또는 제 12 양태의 조성물, 제 15 양태의 제약 조성물 또는 제 16 양태의 화장 조성물을 포함하는 키트를 제공한다. 일 실시형태에서, 키트는 제 18 양태의 방법을 수행하기 위해 또는 제 17 및 제 19 양태의 용도를 위해 사용된다.
이전에 이용 가능했던 조성물과 대조적으로, 본 발명의 조성물은 제약 또는 화장품 용도에 충분히 안정하도록 하기 위해 동결 건조될 필요가 없다. 따라서 이러한 조성물은 예를 들어 캡슐, 정제, 크림, 연고, 용액, 페이스트, 점적제, 스프레이, 에어로졸, 증기, 와이프, 패치, 거즈, 겔 또는 액체로서 제형화될 수 있다. 따라서, 일 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 캡슐, 정제, 크림, 연고, 용액, 페이스트, 점적제, 스프레이, 에어로졸, 증기, 와이프, 패치, 거즈, 겔 또는 액체로서 제공되거나 패키징되며 사용 전에 재구성해야 할 필요가 없다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 겔 또는 액체 형태로 제공되거나 패키징되며 사용 전에 재구성해야 할 필요가 없다.
도 1은 X+Y, Z 및 X+Y+Z 처리를 사용한 오팔의 안정성을 도시한 것이다. 이 도면은 X+Y, Z 및 X+Y+Z 처리 후 BApNA 분석에 의해 측정된 총 단백질 분해 활성을 보여준다. 이 도면은 초기 오팔 활성에 대한 비율(2E3 USP units/mL)을 보여준다. t=0에서의 활성은 X+Y, Z 및 X+Y+Z 처리에 의한 단백질 분해 활성의 즉각적인 향상을 나타낸다. 모든 처리는 동일한 배치의 오팔에서 수행되었다.
도 2는 X+Y, Z 및 X+Y+Z 처리에 따른 파파인의 안정성을 도시한 것이다. 이 도면은 X+Y, Z 및 X+Y+Z 처리 후 BApNA 분석에 의해 측정된 총 단백질 분해 활성을 보여준다. 이 도면은 초기 P 활성에 대한 비율(1E4 USP units/mL)을 보여준다. t=0에서의 활성은 X+Y, Z 및 X+Y+Z 처리에 의한 단백질 분해 활성의 즉각적인 향상을 나타낸다. 모든 처리는 동일한 파파인 배치에서 수행되었다.
도 3은 X+Y, Z 및 X+Y+Z 처리를 통한 브로멜라인의 안정성을 도시한 것이다. 이 도면은 X+Y, Z 및 X+Y+Z 처리 후 BApNA 분석에 의해 측정된 총 단백질 분해 활성을 보여준다. 이 도면은 초기 B 활성에 대한 비율(1.5E4 USP units/mL)을 보여준다. t=0에서의 활성은 X+Y, Z 및 X+Y+Z 처리에 의한 단백질 분해 활성의 즉각적인 향상을 나타낸다. 모든 처리는 동일한 배치의 브로멜라인에서 수행되었다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료가 기재되어 있다. 본 발명의 목적을 위해, 댜음과 같은 용어들이 하기에 정의된다.
본 명세서에서 사용되는 단수 형태는 하나 또는 둘 이상(즉, 적어도 하나)을 지칭하는데 사용된다. 예를 들어, "일 요소"는 하나의 요소 또는 둘 이상의 요소를 의미한다.
"대략"은 수량, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 무게 또는 길이가 기준으로 적용되는 수량, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 무게 또는 길이보다 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1%만큼 변할 수 있음을 의미한다.
본 명세서 전반에 걸쳐, 문맥상 다르게 필요로 하지 않는 한, 단어 "포함하다(comprise)", "포함한다" 및 "포함하는"은 언급된 단계 또는 요소 또는 단계나 요소의 군의 포함을 내포하지만 임의의 다른 단계 또는 요소 또는 단계나 요소의 군의 배제를 의미하는 것으로 이해될 것이다. 그러므로, 용어 "포함하는" 등의 사용은, 나열된 요소가 필요하거나 의무적이지만, 다른 요소가 선택적이고 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있음을 나타낸다. "~로 구성되는"이란, 어구 "~으로 구성되는"에 따라오는 모든 것을 포함하고 이로 제한됨을 의미한다. 그러므로, 어구 "~로 구성되는"은, 나열된 요소가 필요하거나 의무적이고, 다른 요소가 존재하지 않음을 나타낸다. "~로 필수적으로 구성되는"이란, 어구 다음에 나열된 임의의 요소를 포함하고, 나열된 요소에 대해 개시내용에서 명시된 활성 또는 작용을 방해하거나 기여하지 않는 다른 요소로 제한됨을 의미한다. 그러므로, 어구 "~로 필수적으로 구성되는"은, 나열된 요소가 필요하거나 의무적이지만, 다른 요소가 선택적이고 이러한 다른 요소가 나열된 요소의 활성 또는 작용에 영향을 미치거나 미치지 않는지의 여부에 따라 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있음을 나타낸다.
"괴사조직 제거(debridement)"라는 용어는 상처에서 죽은 조직과 손상된 조직을 제거하는 것을 의미한다.
본 발명의 조성물과 관련하여 사용될 때, "얻을 수 있는"이라는 용어는 특정 명시된 방법에 의해 생성된 조성물 뿐만 아니라, 예를 들어 과일 또는 야채로부터 프로테아제를 소싱하거나 재조합 DNA 기술 또는 기타 유전 공학 방법, 예를 들어 재조합 발현 시스템을 사용하여 생성된 동일한 조성물을 포함한다.
"단리된"이란, 물질의 본래의 상태에서 통상적으로 동반되는 성분이 실질적으로 또는 본질적으로 없는 물질을 의미한다. 예를 들어, 본 명세서에서 사용되는 "단리된 프로테아제"는 그것의 천연 세포 환경으로부터, 및 세포의 다른 성분과의 연관으로부터의(즉, 생체 내 물질과 연관이 없음) 펩티드 또는 폴리펩티드 프로테아제 분자의 시험관 내 단리 및/또는 정제를 지칭한다.
"오팔(Opal)"이라는 용어는 파파야 열매에서 얻은 파파인 함유 조성물을 의미한다(과일 껍질의 라텍스는 포함하지 않음). 오팔은 예를 들어 국제 특허 출원 번호 PCT/AU2003/000931(WO2004/008887로 공개됨)(이 문헌의 전체 내용은 본 명세서에 참조로서 포함됨)에 개시된 방법들에 의해 마련될 수 있다.
"환자", "대상체" 및 "개체"라는 용어는 상호 교환적으로 사용되고 인간 또는 기타 포유동물의 환자, 대상체 및 개체를 지칭하는 것이며 이것은 본 발명을 사용하여 중증도의 질병, 질환 또는 상태를 치료, 예방, 개선 또는 감소시키려는 모든 것들을 포함한다. 그러나, "환자"가 증상이 있다는 것을 의미하지는 않음을 이해해야 한다. 본 발명의 범위에 속하는 적합한 포유동물에는 영장류(예를 들면, 인간, 침팬지) 가축 동물(예를 들면, 양, 소, 말, 당나귀, 돼지), 실험실 테스트 동물(예를 들면, 토끼, 생쥐, 쥐, 기니피그, 햄스터), 반려동물(예를 들면, 고양이, 개) 및 포획된 야생 동물(예를 들면, 여우, 사슴, 딩고)을 포함한다.
본 명세서 전반에 걸쳐 "실질적으로 무산소"라는 어구는 1ppm 미만의 농도를 포함한다.
"프로테아제의 단백질 분해 활성의 강화 및/또는 안정화" 및 "강화된 및/또는 안정화된 단백질 분해 활성"이라는 어구 및 본 명세서에서 사용되는 동등한 어구는 프로테아제의 단백질 분해 활성 강화를 위한 방법 및 주어진 시간 단위에 대해 또는 참조 활성 수준에 대해 통상적인 효소 기능을 수행하는 프로테아제 능력의 감소를 증가, 보존, 연장 또는 지연시키는 것과 같은 프로테아제의 단백질 분해 활성의 안정화를 위한 방법을 지칭한다. 따라서 이러한 방법을 통해 본 방법이 없을 때 효소 기능을 수행하는데 걸리는 시간보다 짧은 시간에 효소 기능을 수행하는 프로테아제 조성물을 생성할 수 있다. 대안적으로, 이 방법을 통해 예를 들어 본 방법이 수행된 후 특정 시점 또는 시점들에서 측정될 때 본 방법이 없을 때보다 더 높은 활성 수준에서 프로테아제가 효소 기능을 수행하게 할 수 있다. 더 적은 시간이 소요되거나 더 높은 수준의 활성은 또한 프로테아제 조성물의 보관 시간 및 보관 조건뿐만 아니라 열 및 살균 방사선에 대한 노출, 그리고 온도, 습도 및 대기압을 포함한 모든 운송 조건을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다른 요인 범위에 대해 측정될 수 있다.
프로테아제의 단백질 분해 활성의 강화 및/또는 안정화는 예를 들어, 본 발명의 방법에 따른 프로테아제(예를 들면, "샘플 A")의 효소 활성을 본 발명의 방법이 적용되지 않은 프로테아제(예를 들어, "대조군 샘플", 이는 예를 들어 야생형 또는 자연 발생 프로테아제일 수 있음)와 비교하는 것에 의해 측정 또는 확인할 수 있다. 샘플 간의 이러한 비교는 예를 들어 대조 샘플에 비해 "샘플 A" 프로테아제의 안정성 및/또는 활성의 증가를 확인하기 위해 본 발명의 방법이 수행된 이후 지정된 시간에 수행될 수 있다.
"야생형" 및 "자연 발생"이라는 용어는 집단에서 가장 빈번하게 관찰되어 "정상" 또는 "야생형" 형태의 유전자로 임의로 지정된 유전자 산물(예를 들면, 프로테아제와 같은 폴리펩타이드)을 지칭하기 위해 상호 교환적으로 사용된다.
"상처"라는 용어는 피부가 베이거나 벗겨진 살아있는 조직의 손상을 의미하며 피부 궤양 및 화상을 포함한다. 피부 궤양에는 당뇨병성 궤양, 욕창, 정맥(또는 정맥류) 궤양 및 동맥 궤양이 포함될 수 있다.
본 명세서에서 어떤 선행기술에 대해 언급하는 것은 선행기술이 본 기술 분야에서 숙련된 전문가의 일반적인 상식의 일부분을 형성한다는 것을 인정하거나 어떤 형태로든 암시하는 것이 아니며, 그렇게 받아들여지지 않아야 한다.
본 명세서에서 인용된 모든 간행물, 특허, 특허 출원 및 기타 자료의 전체 내용은 여기에 참조로서 포함된다.
발명의 상세한 설명
티올 프로테아제 및 시스테인 엔도펩티다아제(EC 3.4.22)로도 알려진 시스테인 프로테아제는 단백질을 분해하는 효소이다. 이들은 촉매 트라이어드 또는 다이어드에서 친핵성 시스테인 티올을 포함하는 공통 촉매 메커니즘을 공유한다. 이들은 다양한 유기체에서 발생한다. 특히, 이들은 파파야(Carica papaya 및 Vasconcellea cundianmarcensus), 파인애플(Ananas comosus), 무화과(Ficus carica) 및 키위(Actinidia chinensis)를 포함하는 과일에서 흔히 발견되지만, 다른 다양한 과일 및 야채에서도 발견될 수 있다. 시스테인 프로테아제는 과일 추출물과 같은 생물학적 물질(예를 들어, 파파야 펄프)로부터의 추출, 또는 적절한 숙주 세포에서의 재조합 발현을 비롯한 다양한 방법에 의해 얻어질 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명의 조성물에 존재하거나 본 발명의 방법에 적용되는 프로테아제는 WO2004/008887에 기재된 방법과 같이, 파파야의 익은 과육으로부터 마련되는 프로테아제이다. 다른 실시형태에서, 프로테아제는 브로멜라인(EC 3.4.22.33)이다.
안정화 절차
본 발명의 일 양태에서, 시스테인 프로테아제를 포함하는 조성물은 환원된 상태에서 프로테아제의 활성 부위 시스테인 아미노산 잔기를 유지하는 환원제에 의해서 처리된다. 산화될 시에 시스테인 잔기들은 효소 활성을 방해하는 이황화 다리(disulphide bridge)를 형성할 수 있다. 환원제는 활성 부위 잔기를 환원된 형태로 유지하고, 이미 산화된 시스테인 잔기들을 환원된 형태로 전환시키는데 도움이 될 수 있다. 적합한 환원제는 당업계에 공지되어 있으며, 시스테인을 포함한다. 첨가되는 환원제의 양은 일반적으로 용액에서 프로테아제의 활성 부위 시스테인 아미노산 잔기의 전부 또는 대부분을 재생하고 이들을 환원된 형태로 유지하기에 충분해야 한다. 이것은 일반적으로 과량의 환원제를 첨가하는 것을 포함한다. 일 실시형태에서, 시스테인과 같은 환원제의 농도는 통상적으로 10 내지 200 mM, 예를 들면 50 내지 150 mM이다. 특정 실시형태들에서, 시스테인과 같은 환원제의 농도는 60 내지 140mM, 70 내지 130mM, 80 내지 120mM, 90 내지 100mM, 92 내지 108mM, 94 내지 106mM, 96 내지 104mM 또는 98 내지 102mM이다. 하나의 특정 실시형태에서, 시스테인과 같은 환원제의 농도는 약 100mM이거나 또는 100mM이다.
조성물은 예를 들어 프로테아제를 포함하는 액체 또는 겔 형태일 수 있다. 일 실시형태에서, 프로테아제는 환원제를 사용한 상기 처리 단계 이전에 하기에 기재된 바와 같은 음이온성 폴리머와 사전에 조합되었다.
조성물은 또한 프로테아제를 둘러싼 영역에 존재하는 실질적으로 모든 산소, 예를 들어 프로테아제를 함유하는 용액과 같은 액체 또는 겔에 존재하는 실질적으로 모든 산소를 제거하는 단계를 거칠 수 있다. 이것은 예를 들어 질소 또는 아르곤과 같은 불활성 가스로 조성물을 플러싱하는 것에 의하여, 조성물을 탈가스함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 25 mL/s의 유속으로 20-40분 동안 질소 또는 아르곤 퍼징을 수행하면 약 0.2-0.4 ppm의 잔류 용존 산소를 얻을 수 있다. 조성물에 존재하는 실질적으로 모든 산소를 제거하는 다른 방법이 사용될 수도 있으며, 이것은 예를 들어 대기압 또는 감압 하에 가열하거나 대기압 또는 감압 하에서 초음파 처리하는 등과 같이 당업자에게 알려진, 그러나 이에 제한되지 않는 것일 수 있다. 산소 제거 단계는 환원제의 첨가 전에, 첨가와 동시에 또는 첨가 직후에 수행될 수 있다.
생성된 조성물은 시스테인 프로테아제 및 시스테인 프로테아제의 하나 이상의 활성 부위 시스테인 잔기를 감소시키는 환원제를 포함하며, 여기서 이 조성물은 실질적으로 산소가 없다. 환원제의 적어도 일부는 시스테인 프로테아제 및/또는 조성물 내의 다른 성분들과의 반응의 결과로서 산화된 상태에 있을 수 있다.
보관 중 산소와의 접촉을 줄이기 위해, 조성물은 산소 흡수를 줄이거나 방지하도록 패키징될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 실질적으로 산소가 없는 분위기에서, 예를 들어 질소 또는 아르곤과 같은 불활성 가스가 있는 용기에 패키징될 수 있다. 대안적으로, 조성물은 진공 패키징될 수 있다.
본 발명의 전술한 양태들과 조합될 수도 있는 또 다른 양태에서, 음이온성 폴리머 매트릭스는 시스테인 프로테아제가 음이온성 폴리머 매트릭스에 비공유적으로 결합될 수 있도록 시스테인 프로테아제와 조합될 수 있다. 이것은 효소 분자들을 비공유 방식으로 분리하여 자가 분해 및 효소 비활성화를 제한하기 위한 것이다. 음이온성 폴리머의 선택은 일반적으로 파파인 및 관련 프로테아제들의 높은 등전점(pI)을 기반으로 하며, 이것은 중성 pH에서 이들이 양전하를 띤다는 것을 의미한다.
음이온성 폴리머는 또한 예를 들어 pH 6.5 내지 8 또는 알칼리성 pH에서 겔을 형성하도록 선택될 수 있다.
일 실시형태에서, 음이온성 폴리머 매트릭스는 아크릴산의 호모폴리머, 코폴리머 또는 인터폴리머와 같은 폴리아크릴산이다. 음이온성 폴리머는 일반적으로 고분자량을 갖는다. 호모폴리머의 예는 다수의 폴리알코올 알릴 에테르(예를 들어, 알릴 에테르 펜타에리트리톨, 수크로스의 알릴 에테르 또는 프로필렌의 알릴 에테르) 중 임의의 것과 가교 결합되는 아크릴산의 폴리머이다. 코폴리머의 예는 예를 들어 알릴 펜타에리트리톨과 가교 결합되는 C10-C30 알킬 아크릴레이트 및 아크릴산의 폴리머이다. 적합한 음이온성 폴리머의 특정 예는 Carbopol, Carbopol Ultrez, Carbomer 910, Carbomer 934, Carbomer 934p, Carbomer 940 및 Carbomer 941(Lubrizol에서 얻을 수 있음)이다.
음이온성 폴리머는 프로테아제와 조합되어 액체 현탁액을 생성할 수 있다. 음이온성 폴리머의 농도는 0.01 내지 3% w/w 이상, 예를 들면 0.1 내지 2% w/w일 수 있다. 본 발명의 다른 양태들과 조합되는 경우, 아직 수행되지 않았다면, 환원제가 이 단계에서 첨가될 수 있으며, 예를 들어 질소 플러싱에 의해 산소가 제거될 수 있다. 그 다음 알칼리를 첨가하여 액체 현탁액을 겔화함으로써 점성 겔을 생성할 수 있다(예를 들면, pH를 7.5에서 8로 조정하는 것에 의해).
세 가지 상이한 치료 단계들이 서로 다른 순서로 수행될 수 있다. 예를 들어, 음이온성 폴리머와의 조합이 먼저 수행된 이후에 환원제의 첨가/산소 제거가 어느 순서로든 수행될 수 있다. 대안적으로는 환원제의 첨가/산소 제거가 어느 순서로든 수행된 다음에 음이온성 폴리머와의 조합이 뒤따를 수 있다. 환원제의 첨가와 산소 제거 단계들 사이에서 음이온성 고분자와의 조합을 수행하는 것도 가능하다. 다양한 단계들이 순차적으로 또는 동시에(또는 어느 정도 중첩하면서) 수행될 수 있다.
본 발명의 조성물들은 통상적으로 대응하는 미처리된 프로테아제 대조군 샘플, 즉 음이온성 폴리머에 비공유적으로 결합되지 않고 일반적인 산화 조건 하에서(예를 들어 대기 산소 수준에서) 저장되며 환원제를 첨가하지 않는 것보다 더 큰 안정성의 단백질 분해 활성을 나타낸다. 예를 들어, 본 발명의 일부 프로테아제 조성물들, 특히 파파인(P) 및 파파야 추출물(예를 들면, 오팔)은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 또는 60일 이상 동안 상온, 상압 보관 이후에 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 또는 95% 이상의 단백질 분해 활성을 나타낼 수 있으며, 다른 조성물들, 특히 브로멜라인(B)은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14일 이상 동안 상온, 상압 보관 이후에 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 또는 95% 이상의 단백질 분해 활성을 나타낼 수 있다. 측정된 활성은 본 발명의 프로세스에 따른 처리 직후의 활성과 비교될 수 있다.
일부 실시형태들에서, 본 발명의 프로테아제 조성물들의 초기 단백질 분해 활성은 미처리된 프로테아제 조성물들보다 크고, 예를 들어 미처리된 프로테아제에 비해 1.5배 이상의 활성을 가지며, 예를 들어 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5 또는 10배 이상의 활성을 갖는다. 비교를 위해, 초기 활성은 치료 단계들이 수행된 직후에 측정될 수 있다.
활성은 BApNA 분광 광도법 분석을 사용하여 측정될 수 있다: BApNA 용액(DMSO 중 10 mM)이 반응 완충액(인산칼륨 100 mM, 염화칼륨 116 mM 및 EDTA 3 mM, pH 6)과 함께 마련될 수 있다. 예비 혼합물이 물 2부, 반응 완충액 2부 및 v/v BApNA 1부로 만들어질 수 있다. 분광 광도계(예를 들면, Jasco V-630 UV-Vis 분광 광도계)는 예비 혼합 용액으로 410 nm에서 블랭킹될 수 있다. 그런 다음 1/5 v/v 물을 대조군 샘플(control sample)과 양성 샘플(positive sample) 모두에 첨가할 수 있으며 그 직후에 판독이 시작될 수 있다. 상대적인 효소 활성이 결과 선의 기울기로서 측정될 수 있다.
조성물
이전에 이용 가능했던 조성물과 대조적으로, 본 발명의 조성물은 제약품 및/또는 화장품 용도로 충분히 안정하도록 하기 위해 동결 건조될 필요가 없다. 따라서 이러한 조성물들은 예를 들어 캡슐, 정제, 크림, 연고, 용액, 페이스트, 점적제, 스프레이, 에어로졸, 증기, 와이프, 패치, 거즈, 겔 또는 액체로서 제형화될 수 있다. 따라서, 일 실시형태에서, 본 발명의 조성물들은 캡슐, 정제, 크림, 연고, 에멀젼, 용액, 페이스트, 점적제, 스프레이, 에어로졸, 증기, 와이프, 패치, 거즈, 겔 또는 액체로서 제공되거나 패키징되어 사용 전에 재구성될 필요가 없다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 조성물들은 겔 또는 액체 형태로 제공되거나 패키징되어 사용 전에 재구성될 필요가 없다.
본 발명의 특정 양태들에서, 조성물들은 겔 또는 액체의 형태일 수 있다. 조성물의 단백질 분해 활성에 대한 개선된 안정성으로 인해 조성물이 액체 또는 겔 형태로 제공될 수 있으며, 이는 조성물이 사용될 준비가 되어 있어서 사용 직전에 재구성될 필요가 없음을 의미한다. 이것은 조성물의 투여에 매우 유리하며, 상처(예를 들어 화상)에 대하여 즉각적인 치료를 필요로 하는 동결 건조된 조성물을 재구성하기 어려운 상황(예를 들어 임상 환경 외부)에서 유용할 수 있다.
조성물들은 또한 상처 드레싱과 같은 고체 물질에 흡수/흡착될 수 있다. 조성물들은 또한 제약적으로 및/또는 화장적으로 담체, 희석제, 부형제, 계면활성제 및/또는 보조제와 조합되어 본 발명의 제약 조성물 또는 화장 조성물을 얻을 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물들은 하나 이상의 추가 성분을 포함하도록 제형화될 수 있다.
예를 들어, 계면활성제는 조성물의 물리적 특성을 개선하기 위해 프로테아제 조성물의 일부로서 사용될 수 있다. 계면활성제의 존재는 조성물의 효능에 영향을 미치지 않는다. 따라서, 조성물은 소르비탄 에스테르 또는 이것의 폴리옥시에틸렌 유도체와 같은 음이온성, 양이온성 또는 비이온성 계면활성제 등의 임의의 적합한 계면활성제를 포함할 수도 있다. 적합한 계면활성제는 또한 소듐 도데실 설페이트(SDS), 암모늄 라우릴 설페이트, 소듐 라우레스 설페이트, 및 소듐 미레스 설페이트를 포함할 수 있다. 계면활성제는 일반적으로 비특이적 흡착을 줄이기 위해 사용되며, 신중한 선택과 최적화가 필요하다. 천연 검(natural gum)과 같은 현탁제, 셀룰로오스 유도체 또는 규산 실리카와 같은 무기 물질 및 라놀린과 같은 기타 성분이 포함될 수도 있다.
조성물들은 당업자에게 공지된 방법에 따라 마련될 수 있으며, 또한 추가의 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수도 있다. 담체, 부형제 및 희석제는 조성물의 다른 성분과의 상용성이라는 측면에서 "허용되는" 것이어야 하며, 필요한 경우 더 오랜 기간 동안 보관될 수 있는 조성물 형성에 유해하지 않아야 한다. 이러한 담체, 부형제 및 희석제는 본 발명의 조성물들의 완전성 및 반감기를 더욱 향상시키기 위해 사용될 수 있다.
허용되는 담체 또는 희석제의 추가 예는 탈염수 또는 증류수; 생리 식염수; 땅콩유, 홍화유, 올리브유, 면실유, 옥수수유, 참기름, 아라키스유 또는 코코넛유와 같은 식물성 오일; 메틸 폴리실록산, 페닐 폴리실록산 및 메틸페닐 폴리솔폭산과 같은 폴리실록산을 포함하는 실리콘 오일; 휘발성 실리콘; 유동 파라핀, 연질 파라핀 또는 스쿠알란과 같은 미네랄 오일; 메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스 또는 히드록시프로필메틸-셀룰로오스와 같은 셀룰로오스 유도체; 저급 알칸올, 예를 들어 에탄올 또는 이소-프로판올; 저급 아르알칸올; 저급 폴리알킬렌 글리콜 또는 저급 알킬렌 글리콜, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜 또는 글리세린; 이소프로필 팔미테이트, 이소프로필 미리스테이트 또는 에틸 올레에이트와 같은 지방산 에스테르; 폴리비닐피롤리돈; 우무(agar); 트라가칸트 검 또는 아카시아 검, 및 페트로리움 젤리이다. 폴리비닐피롤리돈(PVP), 카르복시메틸셀룰로오스, 폴리비닐알코올, 폴리에틸렌옥사이드 등의 담체가 사용될 수도 있다.
본 발명의 조성물들에 포함될 수 있는 추가의 담체는 수크로오스와 같은 비환원당 및 락툴로오스와 같은 환원당을 포함한다. 이러한 담체 뿐만 아니라 만니톨, 자일리톨, 글리세롤 및 소르비톨과 같은 당 알코올이 또한 항산화제 및 잠재적인 안정화제로 작용할 수 있기 때문에 본 발명의 조성물들에 포함시키는 데 유용하다.
투여 가능한 조성물들을 마련하는 방법은 당업자에게 자명하며, 예를 들어 본 명세서에 참조로서 포함되는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA.]에 보다 상세하게 기재되어 있다.
용도
본 발명의 조성물들은 피부 상태 및 상처를 포함하는 질병, 질환 및 상태의 치료와 관련된 다양한 제약 응용들에 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물들은 또한 다양한 화장 응용들에 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 추가로 본 발명의 조성물의 국소 적용을 포함하는 상처의 괴사조직 제거 방법, 상처 치료 방법에 사용하기 위한 본 발명의 조성물, 화상으로 고통받는 개체를 치료하는 방법 - 이 방법은 본 발명의 제제를 개체의 환부에 국소적으로 또는 다른 투여 경로에 의해 투여하는 것을 포함함 -, 상처 치료 방법에 사용하기 위한 본 발명의 조성물, 상처에 국소적으로 또는 다른 투여 경로에 의해 본 발명의 조성물을 투여하는 것을 포함하는 상처 치유를 향상시키는 방법, 피부에 본 발명의 화장 조성물을 적용하는 것을 포함하는 피부 각질 제거 또는 미백 방법, 피부 각질 제거 또는 미백을 위한 본 발명의 화장 조성물의 용도, 피부에 본 발명의 화장 조성물을 적용하는 것을 포함하는 건조, 노화 또는 손상된 피부의 치료 방법, 및 건조, 노화 또는 손상된 피부를 치료하기 위한 본 발명의 화장 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명의 프로테아제 조성물들은 특히 혈관/압박 피부 궤양, 화상과 같은 만성 상처를 비롯한, 상처를 포함하는 다양한 피부 상태, 습진, 건선, 여드름, 장미증, 어린선, 백반증, 두드러기, 지루성 피부염을 포함하지만 이에 한정되지 않는 기타 피부 상태를 예방, 치료, 감소 또는 개선하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물들은 치료학적으로 또는 미용적으로 투여될 수 있다. 이러한 응용들에서, 조성물들은 상태 및 임의의 합병증을 치료하거나 적어도 부분적으로 정지시키기에 충분한 양으로, 이미 어떤 상태로부터 고통을 받고 있는 대상체에게 투여될 수 있다. 조성물의 양은 환자를 효과적으로 치료하기에 충분해야 한다.
조성물들은 또한 리포솜들의 형태로 투여될 수 있다. 리포솜들은 인지질 또는 다른 지질 물질로부터 유래할 수 있으며, 수성 매질에 분산된 단일층 또는 다중층 수화된 액정에 의해 형성될 수 있다. 리포솜들을 형성할 수 있는 무독성, 생리학적으로 허용 가능한 대사성 지질이 사용될 수 있다. 리포솜 형태의 조성물들은 안정화제, 보존제 및 부형제를 함유할 수 있다. 바람직한 지질들은 인지질 및 포스파티딜 콜린(레시틴), 천연 및 합성 모두를 포함한다. 리포솜들을 생산하는 방법은 당업계에 알려져 있으며, 이와 관련하여 다음의 문헌을 구체적으로 참조하도록 하며: Prescott, Ed., Methods in Cell Biology, Volume XIV, Academic Press, New York, N.Y. (1976), p. 33 et seq., 이 문헌의 내용은 참조로서 본 명세서에 포함된다.
투여량
특정 환자에 대한 "치료적으로 효과적인" 투여량 수준은 치료 중인 상태 및 상태의 중증도, 사용되는 조성물의 활성, 환자의 연령, 체중, 일반 건강, 성별 및 식이요법, 투여 시간, 투여 경로, 치료 기간, 및 치료와 함께 또는 동시에 사용되는 임의의 약물을 비롯한 다양한 인자와 함께 당업계에 널리 공지된 기타 관련 인자를 포함한다. 따라서 당업자는 일상적인 실험을 통해, 적용 가능한 상태들을 치료하는데 필요한 조성물의 유효하고, 무독성인 양을 결정할 수 있을 것이다.
또한, 조성물의 개별 투여에 대한 최적의 양 및 간격은 치료되는 상태의 특성 및 정도, 투여 형태, 경로 및 부위, 및 치료받는 특정 개인의 특성에 의해 결정될 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 또한, 이러한 최적 상태들은 종래 기술들에 의해 결정될 수 있다.
또한 정의된 일수 동안 하루에 제공되는 조성물의 투여 횟수와 같은, 최적의 치료 과정이 통상의 치료 결정 시험 과정을 사용하여 당업자에 의해 확인될 수 있다는 것이 당업자에게는 명백할 것이다.
투여 경로
본 발명의 조성물들은 표준 경로로 투여될 수 있다. 일반적으로, 조성물들은 국소 경로로 투여될 수 있다. 통상적으로, 본 발명의 조성물들은 개체의 환부에 국소적으로 투여된다.
다른 실시형태들에서, 조성물들은 직장(rectal), 혀밑(sublingual) 또는 입술밑(sublabial)과 같은 다른 입구/진입 경로에 의해, 또는 경막외(epidural), 뇌내(intracerebral) 또는 뇌실내(intracerebroventricular) 경로와 같은 중추신경계를 통해 투여될 수 있다. 투여를 위한 다른 위치는 표피, 경피, 피내, 비강, 동맥내, 심장내, 골내, 척추강내, 복강내, 방광내, 유리체내, 해면체내, 질내 또는 자궁내 경로를 통한 경로를 포함할 수 있다.
치료의 타이밍
통상적으로, 치료적 응용들에서, 치료는 질병 상태의 기간 동안일 것이다.
당업자는 본 명세서에 개시된 조성물들이 단일 제제로서 또는 본 명세서에 개시된 방법들에 대한 병용 요법 접근 방식의 일부로서 진단 시에 또는 그 이후에, 예를 들어, 그러한 치료에 대해 현재 이용 가능한 요법들에 대한 보완으로서 후속 치료 또는 강화 요법으로서 투여될 수 있음을 이해할 것이다. 본 명세서에 개시된 조성물들은 또한 유전적으로 또는 환경적으로 이러한 질병이 발병하는 경향이 있는 대상체에 대한 예방 요법으로서 사용될 수도 있다.
조성물들은 상태의 개선이 보일 때까지와 같이 필요한 만큼 규칙적으로 투여될 수 있다. 따라서 이 조성물들은 매시간, 하루에 여러 번, 매일, 일주일에 여러 번, 매주, 매월 또는 적절한 빈도로 투여될 수 있다.
키트
본 발명의 키트들은 본 발명의 방법 및 용도의 사용을 용이하게 한다. 통상적으로, 본 발명의 방법 또는 용도를 수행하기 위한 키트들은 방법을 수행하기 위해 필요한 모든 시약 및 수단을 포함한다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 키트는 본 발명의 조성물 및 선택적으로 현장 진료 방법을 위한 장치와 같은 조성물을 투여하기 위한 수단을 포함할 수 있다.
통상적으로, 본 명세서에서 설명되는 키트들은 또한 하나 이상의 용기를 포함할 것이다. 본 발명의 맥락에서, 구획화된 키트는 조성물이 별도의 용기에 함유된 임의의 키트를 포함하며, 또한 작은 유리 용기, 플라스틱 용기 또는 플라스틱 또는 종이 스트립을 포함할 수도 있다. 이러한 용기들은 조성물들의 교차 오염을 피하면서 한 구획에서 다른 구획으로 조성물들을 효율적으로 전달할 수 있고, 정량적 방식으로 한 구획에서 다른 구획으로 각 용기의 제제 또는 용액을 첨가할 수 있다.
통상적으로, 본 발명의 키트는 또한 적절한 방법 및 용도를 수행하기 위해 키트를 사용하기 위한 지침을 포함할 것이다.
본 발명의 방법, 용도, 조성물 및 키트는 예를 들어 인간이 아닌 영장류, 말, 소, 양, 염소, 레포린, 조류, 고양이 및 개 종을 비롯한 인간을 포함하는 임의의 동물에 동등하게 적용 가능하다. 따라서, 상이한 종들에 적용하기 위해, 본 발명의 단일 키트가 적용될 수 있거나, 대안적으로는 예를 들어 각각의 개별 종에 대해 특정한 조성물을 함유하는 상이한 키트가 필요할 수도 있다.
당업자는 본 명세서에 개시된 상이한 특징들이 결합되어 본 발명의 범위 내에 있는 특징들의 조합을 형성할 수 있음을 이해하고 인식할 것이다.
다양한 실시형태들
1. 프로테아제의 단백질 분해 활성의 강화 및/또는 안정화를 위한 방법으로서, (i) 프로테아제를 환원제와 접촉시키는 단계 - 프로테아제의 시스테인 잔기는 환원된 상태로 유지됨 -, (ii) 프로테아제를 둘러싸는 영역으로부터 실질적으로 모든 산소 가스를 제거하는 단계, 및 (iii) 프로테아제가 음이온성 폴리머 매트릭스에 비공유적으로 결합되도록 프로테아제와 음이온성 폴리머 매트릭스를 조합하는 단계를 포함하는 방법.
2. 실시형태 2에 있어서, 프로테아제가 실질적으로 무산소 분위기에서 패키징되는 방법.
3. 강화된 및/또는 안정화된 단백질 분해 활성을 갖는 프로테아제를 포함하는 조성물을 생산하는 방법으로서, (i) 프로테아제를 환원제와 접촉시키는 단계 - 프로테아제의 시스테인 잔기는 환원된 상태로 유지됨 -, (ii) 프로테아제를 둘러싸는 영역으로부터 실질적으로 모든 산소 가스를 제거하는 단계, 및 (iii) 프로테아제가 음이온성 폴리머 매트릭스에 비공유적으로 결합되도록 프로테아제와 음이온성 폴리머 매트릭스를 조합하는 단계를 포함하는 방법.
4. 실시형태 3에 있어서, 조성물이 실질적으로 무산소 분위기에서 패키징되는 방법.
5. 실시형태 1 내지 4 중 어느 일 실시형태에 있어서, 산소 가스가 제제의 탈가스에 의해 제거되는 방법.
6. 실시형태 1 내지 5 중 어느 일 실시형태에 있어서, 폴리머가 카보머(carbomer)인 방법.
7. 강화된 및/또는 안정화된 단백질 분해 활성을 갖는 하나 이상의 프로테아제를 포함하는 조성물로서, (i) 프로테아제를 환원제와 접촉시키는 단계 - 프로테아제의 시스테인 잔기는 환원된 상태로 유지됨 -, (ii) 프로테아제를 둘러싸는 영역으로부터 실질적으로 모든 산소 가스를 제거하는 단계, 및 (iii) 프로테아제가 음이온성 폴리머 매트릭스에 비공유적으로 결합되도록 프로테아제와 음이온성 폴리머 매트릭스를 조합하는 단계를 포함하는 방법에 의해 얻어지거나 얻을 수 있는 조성물.
8. 하나 이상의 프로테아제, 환원제 및 음이온성 폴리머 매트릭스를 포함하는 조성물로서, 프로테아제의 시스테인 잔기는 환원된 상태로 유지되고, 조성물은 실질적으로 산소가 없고, 프로테아제는 음이온성 폴리머 매트릭스에 비공유적으로 결합되는 조성물.
9. 실시형태 7 또는 8에 있어서, 산소 가스가 조성물의 탈가스에 의해 제거되는 조성물.
10. 실시형태 7 내지 9 중 어느 일 실시형태에 있어서, 폴리머가 카보머인 조성물.
11. 실시형태 7 내지 10 중 어느 일 실시형태에 있어서, 조성물이 실질적으로 무산소 분위기에서 패키징되는 조성물.
12. 프로테아제의 단백질 분해 활성의 강화 및/또는 안정화를 위한 방법으로서, (i) 프로테아제를 환원제와 접촉시키는 단계 - 프로테아제의 시스테인 잔기는 환원된 상태로 유지됨 -, 및 (ii) 프로테아제를 둘러싸는 영역으로부터 실질적으로 모든 산소 가스를 제거하는 단계를 포함하는 방법.
13. 실시형태 12에 있어서, 프로테아제가 실질적으로 무산소 분위기에서 패키징되는 방법.
14. 강화된 및/또는 안정화된 단백질 분해 활성을 갖는 프로테아제를 포함하는 조성물을 생산하는 방법으로서, (i) 프로테아제를 환원제와 접촉시키는 단계 - 프로테아제의 시스테인 잔기는 환원된 상태로 유지됨 - 및 (ii) 조성물을 둘러싸는 영역으로부터 실질적으로 모든 산소 가스를 제거하는 단계를 포함하는 방법.
15. 실시형태 12 내지 14 중 어느 일 실시형태에 있어서, 산소 가스가 조성물의 탈가스에 의해 제거되는 방법.
16. 실시형태 14 또는 15에 있어서, 조성물이 실질적으로 무산소 분위기에서 패키징되는 방법.
17. 강화된 및/또는 안정화된 단백질 분해 활성을 갖는 하나 이상의 프로테아제를 포함하는 조성물로서, (i) 프로테아제를 환원제와 접촉시키는 단계 - 프로테아제의 시스테인 잔기는 환원된 상태로 유지됨 - 및 (ii) 조성물을 둘러싸는 영역으로부터 실질적으로 모든 산소 가스를 제거하는 단계를 포함하는 방법에 의해 얻어지거나 얻을 수 있는 조성물.
18. 하나 이상의 프로테아제들 및 환원제를 포함하는 조성물로서, 프로테아제의 시스테인 잔기가 환원된 상태로 유지되고, 조성물은 실질적으로 산소가 없는 조성물.
19. 실시형태 17 또는 18에 있어서, 산소 가스가 조성물의 탈가스에 의해 제거되는 조성물.
20. 실시형태 17 내지 19 중 어느 일 실시형태에 있어서, 조성물이 실질적으로 무산소 분위기에서 패키징되는 조성물.
21. 프로테아제의 단백질 분해 활성의 강화 및/또는 안정화를 위한 방법으로서, 프로테아제가 음이온성 폴리머 매트릭스에 비공유적으로 결합되도록 프로테아제와 음이온성 폴리머 매트릭스를 조합하는 단계를 포함하는 방법.
22. 강화된 및/또는 안정화된 단백질 분해 활성을 갖는 프로테아제를 포함하는 조성물을 생산하는 방법으로서, 프로테아제가 음이온성 폴리머 매트릭스에 비공유적으로 결합되도록 프로테아제와 음이온성 폴리머 매트릭스를 조합하는 단계를 포함하는 방법.
23. 실시형태 21 또는 22에 있어서, 폴리머가 카보머인 방법.
24. 실시형태 21 내지 23 중 어느 일 실시형태에 있어서, 조성물이 실질적으로 무산소 분위기에서 패키징되는 방법.
25. 강화된 및/또는 안정화된 단백질 분해 활성을 갖는 하나 이상의 프로테아제를 포함하는 조성물로서, 조성물은 프로테아제가 음이온성 폴리머 매트릭스에 비공유적으로 결합되도록 프로테아제와 상기 음이온성 폴리머 매트릭스를 조합하는 단계를 포함하는 방법에 의해 얻어지거나 얻을 수 있는 조성물.
26. 하나 이상의 프로테아제들 및 음이온성 폴리머 매트릭스를 포함하고, 프로테아제는 음이온성 폴리머 매트릭스에 비공유적으로 결합되는 조성물.
27. 실시 형태 25 또는 26에 있어서, 폴리머가 카보머인 조성물.
28. 실시형태 25 내지 27 중 어느 일 실시형태에 있어서, 조성물이 실질적으로 무산소 분위기에서 패키징되는 조성물.
29. 상처를 포함하는 질병 및 질환의 치료용, 괴사조직 제거용, 또는 화상, 궤양 또는 괴저를 치료하기 위한 의약품의 제조에 있어서의 실시형태 7 내지 11, 17 내지 20 또는 25 내지 28 중 어느 하나의 실시형태의 조성물의 용도.
30. 피부 미백, 각질 제거를 위한 또는 주름, 피부 잡티, 주근깨, 뾰루지, 여드름, 장미증, 기미, 흉터 또는 정맥류에 적용하기 위한, 또는 건조, 노화 또는 손상된 피부에 적용하기 위한 화장품의 제조에 있어서의 실시형태 7 내지 11, 17 내지 20 또는 25 내지 28 중 어느 하나의 실시형태의 조성물의 용도.
31. 실시형태 7 내지 11, 17 내지 20 또는 25 내지 28 중 어느 하나의 실시형태의 조성물을 약학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제, 계면활성제 및/또는 아주반트와 함께 포함하는 제약 조성물.
32. 실시형태 7 내지 11, 17 내지 20 또는 25 내지 28 중 어느 하나의 실시형태의 조성물을 미용적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제, 계면활성제 및/또는 보조제와 함께 포함하는 화장 조성물.
33. 실시형태 7 내지 11, 17 내지 20 또는 25 내지 28 중 어느 하나의 실시형태의 조성물, 또는 실시형태 31의 제약 조성물로서, 상처를 포함하는 질병 및 질환의 치료에서의 사용, 괴사조직 제거, 또는 화상, 궤양 또는 괴저의 치료를 위한 조성물 또는 제약 조성물.
34. 실시형태 33에 있어서, 조성물이 국소적으로 적용되는 조성물.
35. 상처를 포함하는 질병 및 질환의 치료, 괴사조직 제거, 또는 화상, 궤양 또는 괴저의 치료를 위한 방법으로서, 실시형태 7 내지 11, 17 내지 20 또는 25 내지 28 중 어느 하나의 실시형태의 조성물 또는 실시형태 31의 제약 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
36. 실시형태 35에 있어서, 조성물이 국소적으로 적용되는 방법.
37. 실시형태 7 내지 11, 17 내지 20 또는 25 내지 28 중 어느 하나의 실시형태의 조성물 또는 실시형태 32의 화장 조성물로서, 피부 미백, 각질 제거에서 사용하거나 또는 주름, 피부 잡티, 주근깨, 뾰루지, 여드름, 장미증, 기미, 흉터 또는 정맥류에 적용하거나, 또는 건조, 노화 또는 손상된 피부에 적용하기 위한 조성물 또는 화장 조성물.
38. 실시형태 7 내지 11, 17 내지 20 또는 25 내지 28 중 어느 하나의 실시형태의 조성물, 실시형태 31의 제약 조성물 또는 실시형태 32의 화장료 조성물을 포함하는 키트.
39. 실시형태 38에 있어서, 상처를 포함하는 질병 및 질환의 치료, 괴사조직 제거, 또는 화상, 궤양 또는 괴저 치료, 또는 피부 미백, 각질 제거, 또는 주름, 피부 잡티, 주근깨, 뾰루지, 여드름, 장미증, 기미, 흉터 또는 정맥류에의 적용, 또는 건조, 노화 또는 손상된 피부에의 적용을 위해 사용되는 경우의 키트.
본 발명에 대하여 이제 단지 예시적이고 비제한적인 하기 실시예들을 참조하여 추가로 설명할 것이다.
실시예들
시스테인 프로테아제는 활성 부위에 있는 아미노산 시스테인의 존재를 특징으로 하는 프로테아제 계열이다. 이러한 황 함유 아미노산은 보조 히스티딘 잔기와 함께 펩티드 결합의 아미드 카르보닐을 공격하여 티오에스테르를 형성하는 것에 의하여 단백질 분해 활성을 담당하며, 이 티오에스테르는 나중에 물에 의한 공격을 받아 시스테인을 재생하고 카르복실산을 방출한다.
시스테인 프로테아제는 카리카 파파야(파파인, 키모파파인, 카리카인, 글리실 엔도펩티다제), 피쿠스 속(피신) 및 아나나스 코모수스(브로멜라인)와 같은 브로멜리아시아 계열의 여러 구성원과 같은 수많은 식물 종의 라텍스에서 풍부하게 발견된다.
그러나, 시스테인 프로테아제는 유용성을 제한하는 주요 약점이 있다: 시스테인은 티올 그룹의 상대적으로 강한 환원 전위(E0 = -0.34V) 때문에 산화에 특히 민감하다. 따라서 산소 또는 산화제의 존재하에서, 티올은 일련의 산화 단계를 거쳐 궁극적으로 설폰산 그룹(-SO3-)을 생성한다. 이들 산화된 종 중 어느 것도 펩타이드 결합에 대한 촉매 활성을 보존하지 않기 때문에, 산화는 시스테인 프로테아제를 비활성화할 수 있다.
프로테아제의 열악한 단백질 분해 안정성에 대한 또 다른 이유는 자가 분해이다. 프로테아제는 그 자체가 단백질이기 때문에, 활성 프로테아제에 의해 분해되어, 단백질 분해 활성이 손실될 수 있다. 이것은 시스테인 프로테아제를 포함한 모든 프로테아제에 해당되며, 산소와 같은 외부 작용제가 필요하지 않다. 이론에 구속되는 것은 아니지만, 따라서 본 발명은 자가 분해를 예방하거나 억제할 수 있다.
본 연구에서는 프로테아제의 단백질 분해 활성을 강화하고 안정화시키는 것으로 나타난 방법들의 조합을 확인하고 테스트했다. 따라서 이러한 방법들은 산화 손상 및 자가 분해로 인한 프로테아제 불활성화 문제에 대한 해결책을 제공한다.
본 발명의 방법들은 일 양태에서, 환원제로서 시스테인을 첨가하여 프로테아제의 활성 부위 시스테인 잔기를 환원된 상태로 유지하고, 예를 들어, 질소 또는 아르곤과 같은 안정한 할로겐 가스로 용액을 플러싱하는 것에 의해, 프로테아제를 둘러싸는 영역으로부터 산소 가스를 실질적으로 제거하는 것을 포함한다.
추가적 또는 대안적 양태에서, 음이온성 폴리머(예를 들면, 가교 결합되는 폴리아크릴레이트)의 첨가는 또한 비공유 방식으로 프로테아제를 분리하여 자가 분해를 제한하는 수단으로서 시험되었다. 높은 pI의 파파인 및 관련 프로테아제를 기반으로 하는 음이온성 폴리머의 선택은 중성 pH에서 양전하를 띠는 것을 의미한다. 따라서, 본 발명은 가역적인 정전기적 상호작용에 의해 폴리머에 결합된 프로테아제를 생성할 수 있다.
재료 및 방법
식물 라텍스의 파파인과 브로멜라인(기술 등급)은 Sigma Aldrich에서 얻었다. 파파인 함유 조성물은 파파야 열매(과일 껍질의 라텍스는 포함하지 않음)로부터 얻었다. 이러한 파파인 함유 조성물(예를 들면, 오팔(Opal))은 예를 들어 국제 특허 출원 번호 PCT/AU2003/000931(WO2004/008887로 공개됨)에 의해 개시된 방법들에 의해 마련될 수 있다(이 문헌의 전체 내용은 참조로서 본 명세서에 포함된다).
질소 가스는 BOC Gases(영국)에서, Carbopol Ultrez는 Lubrizol Inc(OH, USA)에서 공급받았다. 다른 모든 화학 물질은 Sigma Aldrich에서 구입했다. 분광 광도계 판독값은 Jasco V-630 UV-Vis 분광 광도계에서 취했다.
시스테인 첨가: 시스테인을 100 mM의 최종 농도로 각 샘플에 첨가하였다.
질소 플러싱: 샘플을 플라스틱 바이알에 넣고 질소를 실온에서 5분 동안 용액에 버블링했다. 각 바이알은 산소 유입을 방지하기 위해 즉시 폐쇄되었다.
카보폴 첨가: Carbopol Ultrez를 0.25%의 최종 농도로 각 용액에 첨가하여 액체 현탁액을 얻었다. 무산소 샘플들의 경우, 이 단계에서 질소 플러싱을 수행했다. 이후에 NaOH 10 M(1:1000, 최종 10 mM)을 첨가하여 용액을 즉시 겔화함으로써 점성 겔이 생성되었다.
BApNA 분광 광도법 분석: 반응 완충액(인산칼륨 100 mM, 염화칼륨 116 mM 및 EDTA 3 mM, pH 6)과 함께 BApNA 용액(DMSO 중 10 mM)을 제조했다.
2부의 물, 2부의 반응 완충제 및 1부의 v/v BApNA로 예비 혼합물을 제조하였다. 이 용액으로 분광 광도계를 410 nm에서 블랭킹하였다. 그런 다음 1/5 v/v 물을 대조군 샘플과 양성 샘플 모두에 첨가하고 즉시 판독을 시작했다. 상대적인 효소 활성은 결과 라인의 기울기로 측정되었다.
핵심 사항
오팔(또는 O) - 파파야 추출물; P - 파파인; B - 브로멜라인, 각각이 다음과 같이 분석되었다:
ㆍ 처리 없음(O, P 또는 B),
ㆍ 처리 Z - 카보폴(0.25%),
ㆍ 처리 XY - 시스테인(X) 첨가 및 질소(Y)를 사용한 탈가스, 또는
ㆍ 처리 XYZ - 시스테인(X) 첨가 및 카보폴(0.25%) 및 질소(Y)를 사용한 탈가스
오팔 안정화: 갓 만든 오팔(16 mL)을 2x8mL 부분 표본으로 분할하였다. 그런 다음 각 부분 표본을 두 개로 더 분할하여 4x4mL 샘플(오팔, 오팔+XY, 오팔+Z, 오팔+XY+Z)을 생성했다. X 샘플의 경우, 시스테인을 첨가했다(12 mg/mL, 100 mM). Z 샘플의 경우, 카보폴을 첨가했다(0.25%). XY 샘플은 질소 하에 5분 동안 탈가스되었다. 오팔+XY+Z 샘플에 1:1000 NaOH 10 M을 N2 플러시 하에서 최종 pH 7.5로 첨가했다. 오팔+Z 샘플에 1:1000 NaOH 10 M을 최종 pH 7.5로 첨가했다.
파파인 안정화: 파파인 1 mg/mL(16 mL)를 2x8 mL 부분 표본으로 분할하였다. 그런 다음 각 부분 표본을 두 개로 더 분할하여 4x4 mL 샘플(P, P+XY, P+Z, P+XY+Z)을 생성했다. X 샘플의 경우, 시스테인을 첨가했다(12 mg/mL, 100 mM). Z 샘플의 경우, 카보폴을 첨가했다(0.25%). XY 샘플은 질소 하에 5분 동안 탈가스되었다. P+XY+Z 샘플에 1:1000 NaOH 10 M을 N2 플러시 하에서 최종 pH 7.5로 첨가했다. 그런 다음 P+Z 샘플에 1:1000 NaOH 10 M을 최종 pH 7.5로 첨가했다.
브로멜라인 안정화: 브로멜라인 1 mg/mL(16 mL)를 2x8 mL 부분 표본으로 분할했다. 그런 다음 각 부분 표본을 두 개로 더 분할하여 4x4 mL 샘플(B, B+XY, B+Z, B+XY+Z)을 생성했다.
X 샘플의 경우, 시스테인을 첨가했다(12 mg/mL, 100 mM). Z 샘플의 경우, 카보폴을 첨가했다(0.25%). XY 샘플은 질소 하에 5분 동안 탈가스되었다. 그런 다음 B+XY+Z 샘플에 1:1000 NaOH 10 M을 N2 플러시 하에서 최종 pH 7.5로 첨가했다. B+Z 샘플에 1:1000 NaOH 10 M을 최종 pH 7.5로 첨가했다.
결과 및 논의
1. 프로테아제의 단백질 분해 활성의 안정화
요약하면, XY 및 XYZ의 처리는 미처리 오팔 및 파파인 샘플들에 비해, 오팔 및 파파인 샘플들에 대한 프로테아제의 단백질 분해 활성을 안정화시키는 것으로 밝혀졌다. 또한 Z의 처리 결과 파파인 샘플에 대한 프로테아제의 단백질 분해 활성이 안정화되었다. 이것은 도 1과 2에서 확인할 수 있다. XY 및 XYZ의 처리는 처리되지 않은 브로멜라인 샘플들에 비해, 브로멜라인 샘플들에 대한 프로테아제의 단백질 분해 활성의 안정화가 덜함을 보여주었다. 이것은 도 3에서 확인할 수 있다. 이러한 결과는 다음과 같이 더 자세히 논의된다.
파파야 추출물(오팔)
파파야 추출물 안정화 용액의 안정성은 BApNA 분석을 통해 2개월 동안 매주 분석되었다. 그 후에 측정되는 활성들을 1로 설정된 실험 시작 시의 오팔(미처리) 샘플의 활성에 대해 정규화했다. 결과가 도 1에 나와 있다.
시스테인/질소 플러싱 조합의 안정화 효과로 인해 고려된 기간 동안(최소 58일까지) 활성 손실이 감지되지 않았다. 이것은 환원제 시스테인을 환원된 상태로 유지하는 산소의 부재로 설명될 수 있으며, 이에 따라 환원제 시스테인 프로테아제 활성 부위의 활성 시스테인을 환원된 형태로 유지하고 산화를 방지하도록 계속할 수 있다. 유사하게, 카보폴의 안정화 효과는 시스테인/질소 플러싱 조합을 사용한 처리보다 지속 시간이 짧았지만 여전히 중요했다(적어도 12일차까지).
추가 고려 사항은 XY+Z 샘플에서 시간 경과에 따른 효소 활성의 향상이었다(아래 파트 2의 결과에서 논의됨).
1.1 파파인(P)
상업용 라텍스 파파인 용액의 결과가 도 2에 나와 있다. 관찰된 결과는 XY 조합과 Z(카보폴) 처리가 모두 64일째에 효소 용액의 안정화를 가져온다는 점에서 오팔 샘플과 유사하다. 파파인에 대한 XYZ 처리도 64일째에 효소 용액의 안정화를 보였다.
1.2 브로멜라인(B)
브로멜라인에 대해 관찰된 결과는 또한 XY 및 XYZ 처리에 대한 처리 직후 활성 증가와 관련하여 오팔 및 파파인의 결과를 따른다. 시스테인/질소 플러스 카보폴의 즉각적인 효과는 매우 현저하다(처리되지 않은 브로멜라인과 비교하여 10배 이상 증폭에 도달하게 됨)(도 3). 또한, 14일째에 Z 처리로 안정화가 달성되었다.
테스트 기간 동안 브로멜라인에 대한 단백질 분해 활성의 안정화가 떨어졌지만, 그럼에도 불구하고 처리되지 않은 샘플과 비교할 때, 7일째 및 14일째 모두에서 카보폴(0.25%) 단독(Z), 시스테인 및 질소를 사용한 탈가스(XY), 및 시스테인, 카보폴(0.25%) 및 질소를 사용한 탈가스(XYZ) 모두에 의해서 처리될 때 브로멜라인의 단백질 분해 활성에는 순 안정화가 남아 있었다.
2. 프로테아제의 단백질 분해 활성 강화
놀랍게도 그리고 예상 외로, 단백질 분해 활성의 안정성을 향상시키는 방법이 또한 단백질 분해 활성 자체를 유의미하게 향상시킨다는 것이 발견되었다. 요약하면, Z, XY 및 XYZ를 사용한 처리는 모두 미처리 샘플에 비해 오팔, 파파인 및 브로멜라인 샘플 각각에 대한 프로테아제의 단백질 분해 활성을 향상시키는 것으로 밝혀졌다. 이것은 아래 표 1, 2 및 3에서 확인할 수 있으며, 여기서 "평균"은 평균 상대 효소 활성을 나타내고, "SD"는 표준 편차를 나타내고, "Z"는 카보폴(0.25%)을 사용한 처리를 나타내고, "XY"는 시스테인(X) 및 질소(Y)에 의한 탈가스를 사용한 처리를 나타내고, "XYZ"는 시스테인(X), 질소(Y)에 의한 탈가스 및 카보폴(0.25%)(Z)을 사용한 처리를 나타낸다. 각 표에 나와있는 샘플 처리는 모두 동일한 배치(batch)의 동일한 프로테아제를 사용했다.
이러한 결과는 전구효소의 즉각적인 활성화(즉, 전구효소가 효소로 전환됨)를 시사한다. 시스테인 효과는 추정되는 전구효소 및 가역적으로 산화된 종에 대한 시스테인의 환원/활성화 효과 때문일 수 있다. 예상치 못한 카보폴 효과는 효소 응집체의 폴리머에 의한 자가 분해의 중단으로 해석될 수 있다.
2.1 파파야 추출물(오팔)
표 1은 카보폴(0.25%) 단독에 의한 처리(Z)는 처리되지 않은 샘플에 비해 단백질 분해 활성의 즉각적인(0일째) 3배 증가를 초래했음을 보여준다. 활성 증가는 12일째에 최고조에 달한 후 나머지 테스트 기간 동안 활성이 기본 수준으로 떨어졌다.
시스테인 및 질소에 의한 탈가스를 사용한 처리(XY)는 처리되지 않은 샘플에 비해 단백질 분해 활성이 즉시(0일) 3.3배 증가했다. 이러한 활성 증가는 58일째까지 테스트 기간 내내 이 수준 부근에서 지속되었다. 활성의 최대 증가가 12일째에 관찰되었고(3.59배 증가), 활성의 최소 증가는 30일째에 관찰되었다(3배 증가).
시스테인, 질소에 의한 탈가스 및 카보폴(0.25%) 모두를 사용한 처리(XYZ)는 처리되지 않은 샘플에 비해 단백질 분해 활성이 즉시(0일) 12배 증가했다. 유의미하게도, 이러한 단백질 분해 활성의 강화는 시간이 지남에 따라 더욱 증가하여 5일째에 13.8배 증가가 관찰되었고, 12일째에 14.3배 증가가 관찰되었고, 30일째에 16.6배 증가가 관찰되었고, 45일째에 15.3배 증가가 관찰되었으며, 58일째에 17.9배 증가가 관찰되었다. 따라서 전구효소 및/또는 다른 비활성 형태의 효소와 관련된 활성 효소(즉, 프로테아제)는 시간이 지남에 따라 증가하는 것으로 보인다.
[표 1]
오팔(O)의 단백질 분해 활성 강화
Figure pct00001
다양한 처리로 관찰된 오팔의 강화된 단백질 분해 활성은 상당한 기간 동안 지속되는 것으로 보인다. 카보폴(0.25%) 단독 처리(Z)는 적어도 12일 동안 강화된 단백질 분해 활성을 보인 반면, 시스테인 및 질소에 의한 탈가스를 사용한 처리(XY) 그리고 시스테인, 질소에 의한 탈가스 및 카보폴(0.25%) 모두를 사용한 처리(XYZ)는 전체 테스트 기간인 최소 58일 동안 강화된 단백질 분해 활성을 나타냈다.
2.2 파파인(P)
표 2는 카보폴(0.25%) 단독 처리(Z)가 처리되지 않은 샘플에 비해 단백질 분해 활성의 즉각적인(0일째) 4.6배 증가를 초래했음을 보여준다. 이러한 증가는 적어도 26일까지 유지되는 것에 가까웠고(4.1배 증가), 나머지 시험 기간, 즉 적어도 64일까지 동안 활성이 약 2.6-2.7배 증가했다.
시스테인 및 질소에 의한 탈가스를 사용한 처리(XY)는 처리되지 않은 샘플에 비해 단백질 분해 활성이 즉시(0일) 2.1배 증가했다. 그 후에, 이러한 활성 증가는 테스트 기간 내내 점차적으로 떨어졌고, 26일째의 활성 증가는 1.905배 증가로 관찰되었고 51일째 및 64일째의 활성 증가는 1.667배 증가로 관찰되었다.
시스테인, 질소에 의한 탈가스 및 카보폴(0.25%) 모두를 사용한 처리(XYZ)는 처리되지 않은 샘플에 비해 단백질 분해 활성이 즉시(0일) 5.2배 증가했다. 중요하게도, 단백질 분해 활성의 이러한 강화는 26일째에 8.0배 증가가 관찰되었고, 51일째에 5.7배 증가가 관찰되었으며, 64일째에 6.1배 증가가 관찰되어 시간적으로 추가 순 증가를 보여주었다.
[표 2]
파파인(P)의 단백질 분해 활성 강화
Figure pct00002
다양한 치료로 다시 관찰된 파파인의 강화된 단백질 분해 활성은 상당한 기간 동안 지속되는 것으로 보인다. 카보폴(0.25%) 단독 처리(Z), 시스테인 및 질소에 의한 탈가스를 사용한 처리(XY), 그리고 시스테인, 질소에 의한 탈가스 및 카보폴(0.25%) 모두를 사용한 처리(XYZ) 각각은 테스트 기간 전체인 최소 64일 동안 강화된 단백질 분해 활성을 나타냈다.
2.3 브로멜라인(B)
표 3은 카보폴(0.25%) 단독 처리(Z)가 처리되지 않은 샘플에 비해 단백질 분해 활성의 즉각적인(0일째) 1.6배 증가를 초래했음을 보여준다. 이러한 증가는 적어도 14일째까지 유지되는 것에 가까웠고(1.5배 증가), 7일째에 활성이 3.0배 증가했다.
시스테인 및 질소에 의한 탈가스를 사용한 처리(XY)는 처리되지 않은 샘플에 비해 단백질 분해 활성이 즉시(0일) 6.3배 증가했다. 그 후에 이러한 활성 증가는 테스트 기간 내내 떨어졌으며, 7일째의 활성 증가는 0.6배 증가로 관찰되었고 14일째의 활성 증가는 0.65배 증가로 관찰되었다.
시스테인, 질소에 의한 탈가스 및 카보폴(0.25%) 모두를 사용한 처리(XYZ)는 처리되지 않은 샘플에 비해 단백질 분해 활성이 즉시(0일째) 11배 증가했다. 단백질 분해 활성의 이러한 강화는 시간이 지남에 따라 떨어졌으며, 7일째에 4.6배 증가가 관찰되었고, 14일째에 1.3배 증가가 관찰되었다.
[표 3]
브로멜라인(B)의 단백질 분해 활성 강화
Figure pct00003
다양한 처리로 관찰된 브로멜라인의 단백질 분해 활성의 즉각적인 강화는 오팔과 파파인 모두에서 관찰된 동일한 경향과 일치한다. 활성 증가는 오팔과 파파인보다 브로멜라인에서 더 빨리 떨어졌지만, 그럼에도 불구하고 카보폴(0.25%) 단독(Z), 시스테인과 질소에 의한 탈가스(XY), 그리고 시스테인, 질소에 의한 탈가스 및 카보폴(0.25%) 모두(XYZ)로 처리되었을 때 전체 테스트 기간 동안 처리되지 않은 샘플에 비해 브로멜라인의 단백질 분해 활성의 순 증가를 유지했다.
결론
본 명세서에 제시된 데이터는 프로테아제의 단백질 분해 활성의 강화 및 안정화가 본 명세서에 개시된 각각의 방법, 즉 카보폴(0.25%) 단독으로 프로테아제의 처리(Z), 시스테인 및 질소에 의한 탈가스를 사용한 프로테아제의 처리(XY), 그리고 시스테인, 질소에 의한 탈가스 및 카보폴(0.25%) 모두를 사용한 프로테아제의 처리(XYZ)를 이용하여 달성될 수 있다.
놀랍게도 그리고 예상 외로, 단백질 분해 활성의 안정성을 향상시키는 방법이 또한 단백질 분해 활성 자체를 유의미하게 향상시킨다는 것도 발견되었다. 요약하면, Z, XY 및 XYZ로 처리하면 모두 프로테아제의 단백질 분해 활성이 향상되는 것으로 밝혀졌다. 특히, XYZ 처리에 의한 단백질 분해 활성의 안정화 향상이 매우 두드러진다.
따라서 본 명세서에 제시된 데이터는 프로테아제의 단백질 분해 활성의 안정화 및 단백질 분해 활성 자체의 강화 모두가 본 명세서에 개시된 방법을 사용하여 달성될 수 있음을 교시한다.
본 명세서에 개시된 치료법은 안전성 기록이 우수하고 효소의 화학적 공유 변형을 포함하지 않으며, 따라서 알레르기 및 규제 문제와 같은 소비자 안전 관련 문제를 방지하는 시약을 포함한다.
본 발명이 특정 양태를 참조하여 개시되었지만, 본 발명의 진정한 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 본 발명의 다른 양태 및 변형이 당업자에 의해 고안될 수 있음이 명백하다. 다른 섹션의 특징 및 실시예는 필요한 부분만 수정하여 조합될 수 있다.

Claims (20)

  1. 프로테아제의 단백질 분해 활성의 강화 및/또는 안정화를 위한 방법으로서,
    (i) 프로테아제를 환원제와 접촉시키는 단계 - 상기 프로테아제의 시스테인 잔기는 환원된 상태로 유지됨 -,
    (ii) 상기 프로테아제를 둘러싸는 영역으로부터 실질적으로 모든 산소 가스를 제거하는 단계, 및
    (iii) 상기 프로테아제가 음이온성 폴리머 매트릭스에 비공유적으로 결합되도록 상기 프로테아제와 상기 음이온성 폴리머 매트릭스를 조합하는 단계
    를 포함하는 방법.
  2. 제 2 항에 있어서,
    상기 프로테아제가 실질적으로 무산소 분위기에서 패키징되는 방법.
  3. 강화된 및/또는 안정화된 단백질 분해 활성을 갖는 프로테아제를 포함하는 조성물을 생산하는 방법으로서,
    (i) 프로테아제를 환원제와 접촉시키는 단계 - 상기 프로테아제의 시스테인 잔기는 환원된 상태로 유지됨 -,
    (ii) 상기 프로테아제를 둘러싸는 영역으로부터 실질적으로 모든 산소 가스를 제거하는 단계, 및
    (iii) 상기 프로테아제가 음이온성 폴리머 매트릭스에 비공유적으로 결합되도록 상기 프로테아제와 상기 음이온성 폴리머 매트릭스를 조합하는 단계
    를 포함하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 조성물이 실질적으로 무산소 분위기에서 패키징되는 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    산소 가스가 제제의 탈가스에 의해 제거되는 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리머는 카보머(carbomer)인 방법.
  7. 강화된 및/또는 안정화된 단백질 분해 활성을 갖는 하나 이상의 프로테아제를 포함하는 조성물로서, 상기 조성물은,
    (i) 프로테아제를 환원제와 접촉시키는 단계 - 상기 프로테아제의 시스테인 잔기는 환원된 상태로 유지됨 -,
    (ii) 상기 프로테아제를 둘러싸는 영역으로부터 실질적으로 모든 산소 가스를 제거하는 단계, 및
    (iii) 상기 프로테아제가 음이온성 폴리머 매트릭스에 비공유적으로 결합되도록 상기 프로테아제와 상기 음이온성 폴리머 매트릭스를 조합하는 단계
    를 포함하는 방법에 의해 얻어지거나 얻을 수 있는 조성물.
  8. 하나 이상의 프로테아제들, 환원제 및 음이온성 폴리머 매트릭스를 포함하는 조성물로서,
    상기 프로테아제의 시스테인 잔기는 환원된 상태로 유지되고, 상기 조성물은 실질적으로 산소가 없고, 상기 프로테아제는 상기 음이온성 폴리머 매트릭스에 비공유적으로 결합되는 조성물.
  9. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서,
    산소 가스가 상기 조성물의 탈가스에 의해 제거되는 조성물.
  10. 제 7 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리머는 카보머인 조성물.
  11. 제 7 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물이 실질적으로 무산소 분위기에서 패키징되는 조성물.
  12. 상처를 포함하는 질병 및 질환의 치료용, 괴사조직 제거용, 또는 화상, 궤양 또는 괴저 치료용 의약품의 제조에 있어서의 제 7 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항의 조성물의 용도.
  13. 피부 미백, 각질 제거를 위한 또는 주름, 피부 잡티, 주근깨, 뾰루지, 여드름, 장미증, 기미, 흉터 또는 정맥류에 적용하기 위한, 또는 건조, 노화 또는 손상된 피부에 적용하기 위한 화장품의 제조에 있어서의 제 7 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항의 조성물의 용도.
  14. 제 7 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항의 조성물을 약학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제, 계면활성제 및/또는 보조제와 함께 포함하는 제약 조성물.
  15. 제 7 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항의 조성물을 미용적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제, 계면활성제 및/또는 보조제와 함께 포함하는 화장 조성물.
  16. 제 7 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 조성물 또는 제 14 항의 제약 조성물로서, 상처를 포함하는 질병 및 질환의 치료에서의 사용, 괴사조직 제거, 또는 화상, 궤양 또는 괴저의 치료를 위한 조성물 또는 제약 조성물.
  17. 제 16 항에 있어서,
    상기 조성물은 국소적으로 적용되는 조성물.
  18. 상처를 포함하는 질병 및 질환의 치료, 괴사조직 제거, 또는 화상, 궤양 또는 괴저의 치료를 위한 방법으로서,
    제 7 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항의 조성물 또는 제 14 항의 제약 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  19. 제 18 항에 있어서,
    상기 조성물은 국소적으로 적용되는 방법.
  20. 제 7 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 조성물 또는 제 15 항의 화장 조성물로서, 피부 미백, 각질 제거에서 사용하거나 또는 주름, 피부 잡티, 주근깨, 뾰루지, 여드름, 장미증, 기미, 흉터 또는 정맥류에 적용하거나, 또는 건조, 노화 또는 손상된 피부에 적용하기 위한 조성물 또는 화장 조성물.
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