JP2022551306A - プロテアーゼのタンパク質分解活性の増強及び安定化 - Google Patents

Abstract

本発明は、プロテアーゼのタンパク質分解活性の増強及び安定化のための方法、増強され安定化されたタンパク質分解活性を有するプロテアーゼを含む組成物を製造するための方法、前述の方法により得られる又は得ることが可能である増強され安定化されたタンパク質分解活性を有するプロテアーゼを含む組成物、医薬及び化粧品の製造におけるそのような組成物の使用、創傷を含む疾患及び障害の処置及び化粧品用途におけるそのような組成物の使用、及び関連するキットに関するものである。【選択図】 図１

Description

［発明の分野］
本発明は、プロテアーゼのタンパク質分解活性の増強及び安定化のための方法、増強され安定化されたタンパク質分解活性を有するプロテアーゼを含む組成物を製造するための方法、前述の方法により得られる又は得ることが可能である増強され安定化されたタンパク質分解活性を有するプロテアーゼを含む組成物、医薬及び化粧品の製造におけるそのような組成物の使用、創傷を含む疾患及び障害の処置及び化粧品用途におけるそのような組成物の使用、及び関連するキットに関するものである。

［背景技術］
パパイン及びブロメラインは、デブリードマンのための医薬製品で、並びに角質除去及び皮膚のライトニングのための化粧品／薬用化粧品で使用されるプロテアーゼである。パパイン及びブロメラインのタンパク質分解活性が、そのようなデブリードマン、角質除去、及び皮膚のライトニングをもたらす。しかし、パパイン調製物もブロメライン調製物も、タンパク質分解活性が不安定なために、その可能性を十分に発揮できていない。

熱傷及び慢性潰瘍などの、創傷に見られるような死滅し、損傷した組織の除去を通じて創傷治癒を促進する安定組成物を開発するのに、以前からかなりの努力が払われてきた。死滅及び死につつある組織は、日和見感染症の優れた培地となるため、有効なデブリードマンが必須である。感染症から生じる敗血症は、重度の熱傷患者の主な死因である。

従来のアプローチの１つは、パパイン、トリプシン、及びブロメラインなどのタンパク質分解酵素を使用することであった。特に、ブロメラインに富むタンパク質分解酵素の濃縮物であるネクソブリッド（ＮｅｘｏＢｒｉｄ）（商標）は、深達性部分層及び全層熱傷の成人の痂皮の除去（すなわち、デブリードマン）として、２０１２年に欧州で承認された。しかし、欧州医薬品庁は、２０１２年９月２０日の「Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｒｅｐｏｒｔ － Ｎｅｘｏｂｒｉｄ － Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅｓ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｉｎ ｂｒｏｍｅｌａｉｎ」２．２．３項、１４頁において、タンパク質分解酵素組成物の共通の問題は、タンパク質分解活性の安定性が低いことであると確認し、
「２５℃及び３７℃における新たな適合性（使用時安定性）試験を実施し、ネクソブリッドが混合後数時間以内に分解することを実証した。したがって、製品は混合後直ちに使用されるべきであるという申請者の結論は支持される。」
と述べた。

したがって、ネクソブリッド（商標）は典型的には凍結乾燥粉末として供給され、これは使用前にゲル媒体で再構成され、製剤化後１５分以内に使用されなければならない。したがって、ネクソブリッド（商標）のような組成物を使用準備が整った形態で、再構成の必要なく提供することは有利であろう。しかし、そのためには、許容可能な保存期間を達成するために、創傷清拭活性の安定性を著しく増強させる必要があるだろう。

同様に、角質除去作用及び／又は皮膚のライトニング作用を有するとして販売されているパパイン及び／又はブロメラインを含む化粧品では、化粧品中のパパイン及び／又はブロメラインの活性の喪失により角質除去活性は短期間に著しく低下することが多い。

医薬製品中のプロテアーゼのタンパク質分解活性の喪失の問題に取り組むために、以前に、活性の喪失が低い又はないｐＨ（パパインの場合、酸性ｐＨが使用されている）で、又は固体の形態で、酵素を保存することを含む方法が考案されている。しかし、これらの処理は、実現可能な製品を得るためには熟練したエンドユーザーによる加工が必要である。これにより、そのような方法及び組成物の有用性が制限される。

以前試みられた別の方法は、ポリマー基材に酵素を固定化して移動性及び自己反応性を防止することである。固定化酵素の例としては、ＰＥＧ－パパイン及びキトサン－パパインが挙げられる。そのような方法によりタンパク質分解活性の安定性は向上する可能性があるものの、酵素が不可逆的な方法で化学変化し、したがって特定の基質、特に皮膚及び細胞タンパク質などの複雑な基質に適用した場合に、十分な活性を示さない可能性がある。さらに、そのような酵素の化学構造の変化は、アレルギー及び不耐性など、エンドユーザーにとって有害な反応を引き起こす可能性がある。

これらの問題に取り組むために、本発明を裏付ける研究では、カリカ・パパイヤ（Ｃａｒｉｃａ ｐａｐａｙａ）（パパイヤ）植物（パパインを含む）、及びアナナス・コモスス（Ａｎａｎａｓ ｃｏｍｏｓｕｓ）（パイナップル）植物（ブロメラインを含む）などの様々な源から抽出されたプロテアーゼのタンパク質分解活性の喪失について検証した。これらの研究に基づいて、特にパパイヤ及びパイナップル植物由来のプロテアーゼを含む医薬及び化粧品／薬用化粧品組成物における、プロテアーゼのタンパク質分解活性の増強及び安定化のために方法が開発された。

驚くべきことに、且つ、予期せぬことに、タンパク質分解活性の安定性を増強する方法のいくつかは、タンパク質分解活性自体も著しく増強することが判明した。

［発明の概要］
本発明は、プロテアーゼのタンパク質分解活性の増強及び安定化のための新しい方法を教示する。特定の実施形態において、プロテアーゼは、果実及び／又は野菜から得られる又は得ることが可能である。したがって、いくつかの実施形態では、プロテアーゼは果実及び／又は野菜から得られ、一方で他の実施形態では、プロテアーゼは組換え発現系から得られる。特定の実施形態では、プロテアーゼはシステインプロテアーゼである。特定の実施形態では、システインプロテアーゼはパパイン（ＥＣ ３．４．２２．２）、キモパパイン（ＥＣ ３．４．２２．６）、ブロメライン（ステムブロメライン－ＥＣ ３．４．２２．３２及びフルートブロメライン－ＥＣ ３．４．２２．３３）、フィカイン（ＥＣ ３．４．２２．３）、又はアクチニダイン（ＥＣ ３．４．２２．１４）であってもよい。特定の実施形態では、プロテアーゼは、カリカ・パパイヤ（パパイヤ）植物又はアナナス・コモスス（パイナップル）植物から得られる又は得ることが可能である。特定の実施形態では、プロテアーゼはパパイン又はブロメラインである。

第１の態様では、本発明はプロテアーゼのタンパク質分解活性の増強及び／又は安定化のための方法であって、（ｉ）プロテアーゼを還元剤と接触させるステップであって、プロテアーゼのシステイン残基が還元状態で維持されるステップ及び（ｉｉ）プロテアーゼを取り囲む領域から実質的にすべての酸素ガスを除去するステップを含む、方法を提供する。一実施形態では、酸素ガスは調製物を脱気することにより除去される。一実施形態では、プロテアーゼは実質的に酸素を含まない雰囲気（ａｔｍｏｓｐｈｅｒｅ）に入れられる（ｐａｃｋａｇｅｄ）。

関連する態様では、本発明はプロテアーゼのタンパク質分解活性の増強及び／又は安定化のための方法であって、（ｉ）プロテアーゼを含む溶液又はゲルを用意するステップ、（ｉｉ）溶液又はゲル中のプロテアーゼを還元剤と接触させるステップであって、プロテアーゼのシステイン残基が還元状態で維持されるステップ、及び（ｉｉｉ）溶液又はゲルから実質的にすべての酸素ガスを除去するステップを含む、方法を提供する。

第２の態様では、本発明は増強された及び／又は安定化されたタンパク質分解活性を有するプロテアーゼを含む組成物を製造するための方法であって、（ｉ）プロテアーゼを還元剤と接触させるステップであって、プロテアーゼのシステイン残基が還元状態で維持されるステップ及び（ｉｉ）組成物を取り囲む領域から実質的にすべての酸素ガスを除去するステップを含む、方法を提供する。一実施形態では、酸素ガスは組成物を脱気することにより除去される。一実施形態では、組成物は実質的に酸素を含まない雰囲気に入れられる。

関連する態様では、本発明は増強された及び／又は安定化されたタンパク質分解活性を有するプロテアーゼを含む組成物を製造するための方法であって、（ｉ）プロテアーゼを含む溶液又はゲルを用意するステップ、（ｉｉ）溶液又はゲル中のプロテアーゼを還元剤と接触させるステップであって、プロテアーゼのシステイン残基が還元状態で維持されるステップ、及び（ｉｉｉ）溶液又はゲルから実質的にすべての酸素ガスを除去するステップを含む、方法を提供する。

第３の態様では、本発明は増強された及び／又は安定化されたタンパク質分解活性を有する１種以上のプロテアーゼを含む組成物であって、（ｉ）プロテアーゼを還元剤と接触させるステップであって、プロテアーゼのシステイン残基が還元状態で維持されるステップ及び（ｉｉ）組成物を取り囲む領域から実質的にすべての酸素ガスを除去するステップを含む方法などの第１の態様の方法により得られる又は得ることが可能である、組成物を提供する。一実施形態では、酸素ガスは組成物を脱気することにより除去される。一実施形態では、組成物は実質的に酸素を含まない雰囲気に入れられる。

第４の態様では、本発明は１種以上のプロテアーゼ及び還元剤を含む組成物であって、プロテアーゼのシステイン残基が還元状態で維持され、組成物が実質的に酸素を含まない、組成物を提供する。一実施形態では、酸素ガスは組成物を脱気することにより除去される。一実施形態では、組成物は実質的に酸素を含まない雰囲気に入れられる。

本発明によれば、プロテアーゼのタンパク質分解活性の増強及び／又は安定化は、プロテアーゼをアニオン性ポリマーマトリックスに固定化することにより達成することもできる。アニオン性ポリマーの使用によって、プロテアーゼをマトリックスに非共有結合で結合させることが可能になる。これは、たとえば、プロテアーゼの第一級アミンの一部をカルボマーのカルボキシル基と反応させ、プロテアーゼの残りの第一級アミンの一部をアミン反応性架橋試薬を使用して架橋することにより、マトリックス材料と共有結合を形成することによるプロテアーゼを固定化するための当技術分野の従来の方法とは対照的である。

したがって、第５の態様では、本発明はプロテアーゼのタンパク質分解活性の増強及び／又は安定化のための方法であって、プロテアーゼがアニオン性ポリマーマトリックスに非共有結合で結合するようにプロテアーゼとアニオン性ポリマーマトリックスとを組み合わせるステップを含む、方法を提供する。一実施形態では、ポリマーはカルボマーである。一実施形態では、組成物は実質的に酸素を含まない雰囲気に入れられる。

第６の態様では、本発明は増強された及び／又は安定化されたタンパク質分解活性を有するプロテアーゼを含む組成物を製造するための方法であって、プロテアーゼがアニオン性ポリマーマトリックスに非共有結合で結合するようにプロテアーゼとアニオン性ポリマーマトリックスとを組み合わせるステップを含む、方法を提供する。一実施形態では、ポリマーはカルボマーである。一実施形態では、組成物は実質的に酸素を含まない雰囲気に入れられる。

第７の態様では、本発明は増強された及び／又は安定化されたタンパク質分解活性を有する１種以上のプロテアーゼを含む組成物であって、プロテアーゼがアニオン性ポリマーマトリックスに非共有結合で結合するようにプロテアーゼとアニオン性ポリマーマトリックスとを組み合わせるステップを含む方法により得られる又は得ることが可能である、組成物を提供する。一実施形態では、ポリマーはカルボマーである。一実施形態では、組成物は実質的に酸素を含まない雰囲気に入れられる。

第８の態様では、本発明は１種以上のプロテアーゼ及びアニオン性ポリマーマトリックスを含む組成物であって、プロテアーゼがアニオン性ポリマーマトリックスに非共有結合で結合している、組成物を提供する。一実施形態では、ポリマーはカルボマーである。一実施形態では、組成物は実質的に酸素を含まない雰囲気に入れられる。

本発明で教示された方法は、組み合わせることもできる。たとえば、第１の態様の方法は第５の態様の方法と組み合わせることができ、又は第２の態様の方法は第６の態様の方法と組み合わせることができる。

したがって、第９の態様では、本発明はプロテアーゼのタンパク質分解活性の増強及び／又は安定化のための方法であって、（ｉ）プロテアーゼを還元剤と接触させるステップであって、プロテアーゼのシステイン残基が還元状態で維持されるステップ、（ｉｉ）プロテアーゼを取り囲む領域から実質的にすべての酸素ガスを除去するステップ、及び（ｉｉｉ）プロテアーゼがアニオン性ポリマーマトリックスに非共有結合で結合するようにプロテアーゼとアニオン性ポリマーマトリックスとを組み合わせるステップを含む、方法を提供する。一実施形態では、酸素ガスは調製物を脱気することにより除去される。一実施形態では、ポリマーはカルボマーである。一実施形態では、プロテアーゼは実質的に酸素を含まない雰囲気に入れられる。

一実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）はステップ（ｉ）及び（ｉｉ）の前に実行される。別の実施形態では、ステップ（ｉ）～（ｉｉｉ）はこの順番で実行される。

関連する態様では、本発明はプロテアーゼのタンパク質分解活性の増強及び／又は安定化のための方法であって、（ｉ）プロテアーゼを含む溶液を用意するステップ、（ｉｉ）溶液中のプロテアーゼを還元剤と接触させるステップであって、プロテアーゼのシステイン残基が還元状態で維持されるステップ、（ｉｉｉ）溶液から実質的にすべての酸素ガスを除去するステップ、及び（ｉｖ）プロテアーゼがアニオン性ポリマーマトリックスに非共有結合で結合するようにプロテアーゼとアニオン性ポリマーマトリックスとを組み合わせるステップを含む、方法を提供する。

一実施形態では、ステップ（ｉｖ）はステップ（ｉ）～（ｉｉｉ）の前に実行される。別の実施形態では、ステップ（ｉ）～（ｉｖ）はこの順番で実行される。

第１０の態様では、本発明は増強された及び／又は安定化されたタンパク質分解活性を有するプロテアーゼを含む組成物を製造するための方法であって、（ｉ）プロテアーゼを還元剤と接触させるステップであって、プロテアーゼのシステイン残基が還元状態で維持されるステップ、（ｉｉ）プロテアーゼを取り囲む領域から実質的にすべての酸素ガスを除去するステップ、及び（ｉｉｉ）プロテアーゼがアニオン性ポリマーマトリックスに非共有結合で結合するようにプロテアーゼとアニオン性ポリマーマトリックスとを組み合わせるステップを含む、方法を提供する。一実施形態では、酸素ガスは調製物を脱気することにより除去される。一実施形態では、ポリマーはカルボマーである。一実施形態では、組成物は実質的に酸素を含まない雰囲気に入れられる。

関連する態様では、本発明は増強された及び／又は安定化されたタンパク質分解活性を有するプロテアーゼを含む組成物を製造するための方法であって、（ｉ）プロテアーゼを含む溶液又はゲルを用意するステップ、（ｉｉ）溶液又はゲル中のプロテアーゼを還元剤と接触させるステップであって、プロテアーゼのシステイン残基が還元状態で維持されるステップ、（ｉｉｉ）溶液又はゲルから実質的にすべての酸素ガスを除去するステップ、及び（ｉｖ）プロテアーゼがアニオン性ポリマーマトリックスに非共有結合で結合するようにプロテアーゼとアニオン性ポリマーマトリックスとを組み合わせるステップを含む、方法を提供する。

第１１の態様では、本発明は増強された及び／又は安定化されたタンパク質分解活性を有する１種以上のプロテアーゼを含む組成物であって、（ｉ）プロテアーゼを還元剤と接触させるステップであって、プロテアーゼのシステイン残基が還元状態で維持されるステップ、（ｉｉ）プロテアーゼを取り囲む領域から実質的にすべての酸素ガスを除去するステップ、及び（ｉｉｉ）プロテアーゼがアニオン性ポリマーマトリックスに非共有結合で結合するようにプロテアーゼとアニオン性ポリマーマトリックスとを組み合わせるステップを含む方法などの第９の態様の方法により得られる又は得ることが可能である、組成物を提供する。一実施形態では、酸素ガスは調製物を脱気することにより除去される。一実施形態では、ポリマーはカルボマーである。一実施形態では、組成物は実質的に酸素を含まない雰囲気に入れられる。

第１２の態様では、本発明は１種以上のプロテアーゼ、還元剤、及びアニオン性ポリマーマトリックスを含む組成物であって、プロテアーゼのシステイン残基が還元状態で維持され、組成物が実質的に酸素を含まず、プロテアーゼがアニオン性ポリマーマトリックスに非共有結合で結合している、組成物を提供する。一実施形態では、酸素ガスは組成物を脱気することにより除去される。一実施形態では、ポリマーはカルボマーである。一実施形態では、組成物は実質的に酸素を含まない雰囲気に入れられる。

一実施形態では、組成物はゲルの形態である。

第１３の態様では、本発明は医薬の製造における第３、第４、第７、第８、第１１、及び／又は第１２の態様の組成物の使用を提供する。いくつかの実施形態では、薬剤は創傷を含む疾患及び障害の処置のためのものである。いくつかの実施形態では、薬剤はデブリードマンのためのものである。いくつかの実施形態では、薬剤は熱傷を処置するためのものである。いくつかの実施形態では、薬剤は潰瘍を処置するためのものである。いくつかの実施形態では、薬剤は壊疽を処置するためのものである。

第１４の態様では、本発明は化粧品の製造における第３、第４、第７、第８、第１１、及び／又は第１２の態様の組成物の使用を提供する。いくつかの実施形態では、化粧品は角質除去、皮膚のライトニングのためか、又は皺、皮膚のしみ、そばかす、吹き出物、にきび、酒さ、日光斑、瘢痕、若しくは静脈瘤に適用するためか、又は乾燥皮膚、老化皮膚、若しくは損傷皮膚に適用するためのものである。

第１５の態様では、本発明は第３、第４、第７、第８、第１１、及び／又は第１２の態様の組成物を、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤、界面活性剤、及び／又はアジュバントと共に含む医薬組成物を提供する。

第１６の態様では、本発明は第３、第４、第７、第８、第１１、及び／又は第１２の態様の組成物を、化粧品的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤、界面活性剤、及び／又はアジュバントと共に含む化粧品組成物を提供する。

第１７の態様では、本発明は創傷を含む疾患及び障害の処置で使用するための第３、第４、第７、第８、第１１、及び／又は第１２の態様の組成物、又は第１５の態様の医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、処置はデブリードマンである。いくつかの実施形態では、処置は熱傷に対するものである。いくつかの実施形態では、処置は潰瘍に対するものである。いくつかの実施形態では、処置は壊疽に対するものである。いくつかの実施形態では、組成物は局所的に適用される。

第１８の態様では、本発明は創傷を含む疾患及び障害の処置のための方法であって、対象に第３、第４、第７、第８、第１１、及び／又は第１２の態様の組成物、又は第１５の態様の医薬組成物を投与するステップを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、処置はデブリードマンである。いくつかの実施形態では、処置は熱傷に対するものである。いくつかの実施形態では、処置は潰瘍に対するものである。いくつかの実施形態では、処置は壊疽に対するものである。いくつかの実施形態では、組成物は局所的に適用される。

第１９の態様では、本発明は皮膚のライトニング、角質除去で使用するためか、又は皺、皮膚のしみ、そばかす、吹き出物、にきび、酒さ、日光斑、瘢痕、若しくは静脈瘤に適用するためか、又は乾燥皮膚、老化皮膚、若しくは損傷皮膚に適用するための第３、第４、第７、第８、第１１、及び／又は第１２の態様の組成物、又は第１６の態様の化粧品組成物を提供する。

第２０の態様では、本発明は第３、第４、第７、第８、第１１、及び／若しくは第１２の態様の組成物、第１５の態様の医薬組成物、又は第１６の態様の化粧品組成物を含むキットを提供する。一実施形態では、キットは第１８の態様の方法を実行するために、又は第１７及び第１９の態様の使用のために、使用される。

従来利用可能な組成物とは対照的に、本発明の組成物は医薬用途又は化粧品用途に十分に安定であるように凍結乾燥する必要がない。したがって、そのような組成物は、たとえば、カプセル、錠剤、クリーム、軟膏、溶液、ペースト、滴剤、スプレー剤、エアロゾル、蒸気、ワイプ、パッチ、ガーゼ、ゲル、又は液剤として製剤化することが可能である。したがって、一実施形態では、本発明の組成物はカプセル、錠剤、クリーム、軟膏、溶液、ペースト、滴剤、スプレー剤、エアロゾル、蒸気、ワイプ、パッチ、ガーゼ、ゲル、又は液剤として提供又は包装され、使用前に再構成される必要はない。好ましい実施形態では、本発明の組成物はゲル又は液体の形態で提供又は包装され、使用前に再構成される必要はない。

図１は、Ｘ＋Ｙ、Ｚ、及びＸ＋Ｙ＋Ｚ処理を施したオパール（Ｏｐａｌ）の安定性を示す図である。Ｘ＋Ｙ、Ｚ、及びＸ＋Ｙ＋Ｚ処理後のＢＡｐＮＡアッセイにより測定された総タンパク質分解活性を示す。初期オパール活性（２Ｅ３ ＵＳＰ単位／ｍＬ）に対する比率。ｔ＝０における活性は、Ｘ＋Ｙ、Ｚ、及びＸ＋Ｙ＋Ｚ処理によるタンパク質分解活性の即時増強を反映している。すべての処理は同一バッチのオパールに対して実行された。 図２は、Ｘ＋Ｙ、Ｚ、及びＸ＋Ｙ＋Ｚ処理を施したパパインの安定性を示す図である。Ｘ＋Ｙ、Ｚ、及びＸ＋Ｙ＋Ｚ処理後のＢＡｐＮＡアッセイにより測定された総タンパク質分解活性を示す。初期Ｐ活性（１Ｅ４ ＵＳＰ単位／ｍＬ）に対する比率。ｔ＝０における活性は、Ｘ＋Ｙ、Ｚ、及びＸ＋Ｙ＋Ｚ処理によるタンパク質分解活性の即時増強を反映している。すべての処理は同一バッチのパパインに対して実行された。 図３は、Ｘ＋Ｙ、Ｚ、及びＸ＋Ｙ＋Ｚ処理を施したブロメラインの安定性を示す図である。Ｘ＋Ｙ、Ｚ、及びＸ＋Ｙ＋Ｚ処理後のＢＡｐＮＡアッセイにより測定された総タンパク質分解活性を示す。初期Ｂ活性（１．５Ｅ４ ＵＳＰ単位／ｍＬ）に対する比率。ｔ＝０における活性は、Ｘ＋Ｙ、Ｚ、及びＸ＋Ｙ＋Ｚ処理によるタンパク質分解活性の即時増強を反映している。すべての処理は同一バッチのブロメラインに対して実行された。

定義
別段に定義されていない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が通常理解するのと同じ意味を有する。本発明の実施又は試験には、本明細書に記載されたものと類似又は同等の任意の方法及び材料を使用することができるが、好ましい方法及び材料を記載する。本発明の目的のために、以下の用語は以下のように定義される。

本明細書において、冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、１つ又は１つを超える（すなわち、少なくとも１つの）冠詞の文法的目的語を指すために使用される。例として、「要素（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は１つの要素又は１つを超える要素を意味する。

「約」は、基準となる量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）、レベル、値、数、頻度、割合、寸法、サイズ、量（ａｍｏｕｎｔ）、重量、又は長さに対して、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１％だけ変化する量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）、レベル、値、数、頻度、割合、寸法、サイズ、量（ａｍｏｕｎｔ）、重量、又は長さを意味する。

本明細書を通じて、文脈が他に要求しない限り、語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、言明されたステップ若しくは要素又はステップ若しくは要素の群を含むが、他の任意のステップ若しくは要素又はステップ若しくは要素の群を除外しないことを意味すると理解されるであろう。したがって、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの使用は、列挙された要素が必須又は強制的であるが、他の要素は任意選択であり、存在してもしなくてもよいことを示す。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、句「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」に続くものすべてを含み、それらに限定されることを意味する。したがって、句「からなる」は、列挙された要素が必須又は強制的であり、他の要素が存在してはならないことを示す。「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、句の後に列挙された任意の要素を含むことを意味し、列挙された要素について開示で規定された活性又は作用を妨害しない又は寄与しない他の要素に限定される。したがって、句「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、列挙された要素が必須又は強制的であるが、他の要素は任意選択であり、列挙された要素の活性又は作用に影響するかどうかによって、存在してもしなくてもよいことを示す。

用語「デブリードマン」は、創傷からの死滅し、損傷した組織の除去を指す。

用語「得ることが可能である」は、本発明の組成物に関連して使用されるとき、特定の規定された方法により製造された組成物のみならず、たとえば、果実若しくは野菜からプロテアーゼを入手することによる、又は組換えＤＮＡ技術若しくは他の遺伝子工学的方法、たとえば組換え発現システムを使用することによる、どんな方法で製造されても同一の組成物も含む。

「単離された」は、その本来の状態で通常は材料に付随する成分を実質的に又は本質的に含まない材料を意味する。たとえば、本明細書で使用される場合、「単離されたプロテアーゼ」は、ペプチド又はポリペプチドプロテアーゼ分子の、その天然の細胞環境からの、及び細胞の他の成分との会合からの、インビトロでの単離及び／又は精製を指し、すなわち、それはインビボ物質と会合していない。

用語「オパール」は、パパイヤの果実（果皮の乳樹脂は含まない）から得られるパパイン含有組成物を指す。オパールは、たとえば、国際公開第２００４／００８８８７として公開された、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＡＵ２００３／０００９３１に開示された方法により調製することができ、その全内容は参照により本明細書に組み込まれている。

用語「患者」、「対象」、及び「個体」は、相互に交換可能に使用され、ヒト又は他の哺乳動物の患者、対象、及び個体を指し、本発明を使用して疾患、障害、又は状態を処置するか、予防するか、改善するか、又は疾患、障害、又は状態の重症度を低減することが望まれる任意のものを含む。しかし、「患者」は症状があることを含意しないことが理解されるであろう。本発明の範囲に入る適切な哺乳動物としては、限定されないが、霊長類（たとえば、ヒト、チンパンジー）家畜動物（たとえば、ヒツジ、ウシ、ウマ、ロバ、ブタ）、実験用試験動物（たとえば、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター）、伴侶動物（たとえば、ネコ、イヌ）及び捕獲野生動物（たとえば、キツネ、シカ、ディンゴ）が挙げられる。

本明細書を通じて、句「実質的に酸素を含まない」は、１ｐｐｍ未満の濃度を含む。

本明細書で使用される場合、句「プロテアーゼのタンパク質分解活性の増強及び／又は安定化」及び「増強された及び／又は安定化されたタンパク質分解活性」及び同等の句は、所与の時間単位に対して、又は活性の基準レベルに対して、プロテアーゼがその通常の酵素機能を発揮する能力の低下を増加することか、保存することか、延長することか、又は遅らせることなどによるプロテアーゼのタンパク質分解活性の増強のための方法及びプロテアーゼのタンパク質分解活性の安定化のための方法を指す。したがって、そのような方法は、その方法がない場合にその酵素機能を発揮するのに要する時間よりも短い時間でその酵素機能を発揮するプロテアーゼ組成物をもたらす可能性がある。或いは、本方法は、たとえば、本方法を実施した後の特定の時点又は複数の時点で測定したときに、本方法を実施しない場合の活性レベルよりも高い活性レベルでプロテアーゼがその酵素機能を発揮する結果をもたらす可能性がある。要するより短い時間又はより高い活性レベルは、限定されないが、熱及び滅菌放射線への曝露、並びにプロテアーゼ組成物の保存時間及び保存条件、さらには、温度、湿度、及び大気圧などの任意の輸送条件などの他の様々な要因との関連で測定することもできる。

プロテアーゼのタンパク質分解活性の増強及び／又は安定化は、たとえば、本発明の方法に供されたプロテアーゼ（たとえば、「試料Ａ」）の酵素活性と本発明の方法に供されていないプロテアーゼ（たとえば、「対照試料」であり、これはたとえば野生型又は天然に存在するプロテアーゼでもよい）の安定性を比較することにより測定又は確認することができる。そのような試料間の比較は、たとえば、本発明の方法を実施した後の特定の時期に、対照試料に対する「試料Ａ」のプロテアーゼの安定性及び／又は活性の増加を確認するために実施することが可能である。

用語「野生型」及び「天然に存在する」は、集団において最も頻繁に観察される遺伝子産物（たとえば、プロテアーゼなどのポリペプチド）を指すために相互に交換可能に使用され、したがって、遺伝子の「正常」又は「野生型」形態と任意に呼ばれる。

用語「創傷」は、皮膚が切断された又は損傷した生体組織の傷害を意味し、皮膚潰瘍及び熱傷を含む。皮膚潰瘍としては、糖尿病性潰瘍、圧迫性潰瘍、静脈性（又は静脈瘤性）潰瘍、及び動脈性潰瘍が挙げられ得る。

本明細書における従来技術の参照は、従来技術が当業者の通常の一般知識の一部を形成していることを認めるものでも、何らかの形態で示唆するものでもなく、認めるもの又は何らかの形態で示唆するものと解釈すべきではない。

本明細書に挙げられているすべての刊行物、特許、特許出願及びその他の資料の全内容は、参照により本明細書に組み込まれている。

［発明の詳細な説明］
システインプロテアーゼは、チオールプロテアーゼ及びシステインエンドペプチダーゼ（ＥＣ ３．４．２２）としても知られ、タンパク質を分解する酵素である。システインプロテアーゼは、触媒性トリアド又はダイアドにおいて求核性のシステインチオールが関与する、通常の触媒機構を共有する。システインプロテアーゼは、様々な生物に存在する。特に、システインプロテアーゼは、パパイヤ（カリカ・パパイヤ及びヴァスコンセレア・クンディアンマルセンサス（Ｖａｓｃｏｎｃｅｌｌｅａ ｃｕｎｄｉａｎｍａｒｃｅｎｓｕｓ））パイナップル（アナナス・コモスス）、イチジク（フィカス・カリカ（Ｆｉｃｕｓ ｃａｒｉｃａ））、及びキウイフルーツ（オニマタタビ（Ａｃｔｉｎｉｄｉａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ））などの果実で通常見られるが、他の様々な果実及び野菜で見られることもある。システインプロテアーゼは、たとえばパパイヤ果肉からの果実抽出物などの生物学的材料からの抽出を含む様々な方法により、又は適切な宿主細胞での組換え発現により得ることが可能である。一実施形態では、本発明の組成物中に存在する、又は本発明の方法に供されるプロテアーゼは、国際公開第２００４／００８８８７に記載の方法などによる、パパイヤの熟した果肉から調製されるプロテアーゼである。別の実施形態では、プロテアーゼはブロメライン（ＥＣ ３．４．２２．３３）である。

安定化の手順
本発明の一態様では、システインプロテアーゼを含む組成物を、プロテアーゼの活性部位システインアミノ酸残基を還元状態に維持する還元剤での処理に供する。システイン残基は酸化されるとジスルフィド架橋を形成し、これにより酵素活性が阻害され得る。還元剤は、活性部位残基を還元型に保つことができ、また、既に酸化されたシステイン残基を還元型に変換することもできる。適切な還元剤は当技術分野で公知であり、システインが含まれる。還元剤の添加量は、一般に、溶液中のプロテアーゼの活性部位システインアミノ酸残基の全部又は大部分を再生し、それらを還元型に維持するのに十分な量であるべきである。この場合、典型的には、還元剤を過剰に添加する。一実施形態では、システインなどの還元剤の濃度は、典型的には１０～２００ｍＭ、たとえば５０～１５０ｍＭである。特定の実施形態では、システインなどの還元剤の濃度は、６０～１４０ｍＭ、７０～１３０ｍＭ、８０～１２０ｍＭ、９０～１００ｍＭ、９２～１０８ｍＭ、９４～１０６ｍＭ、９６～１０４ｍＭ、又は９８～１０２ｍＭである。一実施形態では、システインなどの還元剤の濃度は、約１００ｍＭ又は１００ｍＭである。

組成物は、たとえば、プロテアーゼを含む液体又はゲルの形態であってもよい。一実施形態では、プロテアーゼは、還元剤による上記の処理ステップの前に、以下に記載するようにアニオン性ポリマーと予め結合している。

この組成物は、プロテアーゼを取り囲む領域に存在する酸素を実質的にすべて除去するステップ、たとえば、プロテアーゼを含む溶液などの液体又はゲルに存在する酸素を実質的にすべて除去するステップに供することもできる。これは、たとえば、組成物の脱気、たとえば組成物を窒素又はアルゴンなどの不活性ガスでフラッシングすることにより達成することができる。たとえば、窒素又はアルゴンを流速２５ｍＬ／ｓで２０～４０分パージすることで残留溶存酸素を約０．２～０．４ｐｐｍとすることができる。組成物中に存在する酸素を実質的にすべて除去する他の方法も用いることができ、たとえば、限定されないが、大気圧若しくは減圧下での加熱、又は大気圧若しくは減圧下での超音波処理などであり、当業者には公知の方法であろう。酸素除去のステップは、還元剤の添加前、添加と同時、又は添加直後に実行することができる。

得られた組成物は、システインプロテアーゼ、及び当該システインプロテアーゼの１つ又は複数の活性部位システイン残基を還元する還元剤を含み、ここで組成物は実質的に酸素を含まない。還元剤の少なくとも一部は、組成物中のシステインプロテアーゼ及び／又は他の成分と反応した結果、酸化状態になっていてもよい。

保存中、酸素との接触を減らすために、組成物を包装して酸素吸収を減少又は防止することができる。たとえば、組成物は、実質的に酸素を含まない雰囲気で、たとえば窒素又はアルゴンなどの不活性ガスが入った容器内に包装されてもよい。或いは、組成物は真空包装されてもよい。

別の態様では、本発明の前述の態様と組み合わせることもできるが、アニオン性ポリマーマトリックスは、システインプロテアーゼと組み合わせてシステインプロテアーゼがアニオン性ポリマーマトリックスに非共有結合で結合するようにすることができる。これは、酵素分子を非共有結合的な方法で分離することで自己分解及び酵素不活性化を抑制することを意図している。アニオン性ポリマーの選択は、一般にパパイン及び関連プロテアーゼの高い等電点（ｐＩ）、すなわちパパイン及び関連プロテアーゼが中性ｐＨで正に帯電していることに基づく。

アニオン性ポリマーは、たとえば６．５～８の間のｐＨで、又はアルカリｐＨでゲルを形成するように選択することもできる。

一実施形態では、アニオン性ポリマーマトリックスは、アクリル酸のホモポリマー、コポリマー、又はインターポリマーなどのポリアクリル酸である。アニオン性ポリマーは、典型的に高分子量を有する。ホモポリマーの例としては、いくつかの多価アルコールアリルエーテル（たとえば、アリルエーテルペンタエリスリトール、スクロースのアリルエーテル、又はプロピレンのアリルエーテル）のいずれかで架橋されているアクリル酸のポリマーが挙げられる。コポリマーの例としては、たとえばアリルペンタエリスリトールで架橋した、アクリル酸とＣ１０～Ｃ３０アクリル酸アルキルのポリマーが挙げられる。適切なアニオン性ポリマーの具体例としては、カルボポール（Ｃａｒｂｏｐｏｌ）、カルボポール ウルトレッツ（Ｃａｒｂｏｐｏｌ Ｕｌｔｒｅｚ）、カルボマー９１０、カルボマー９３４、カルボマー９３４ｐ、カルボマー９４０、及びカルボマー９４１（Ｌｕｂｒｉｚｏｌから入手できる）が挙げられる。

アニオン性ポリマーは、プロテアーゼと組み合わせて、液体懸濁液を得ることができる。アニオン性ポリマーの濃度は、０．０１～３％ｗ／ｗ以上、たとえば０．１～２％ｗ／ｗであってもよい。本発明の別の態様と組み合わせる場合、まだ実行されていなければ、この段階で還元剤を添加することができ、窒素フラッシングなどにより酸素を除去することができる。その後アルカリを添加して、たとえばｐＨを７．５～８に調製することにより液体懸濁液のゲル化を引き起こし、粘性のゲルを得ることができる。

３つの異なる処理ステップは異なる順序で実行することができる。たとえば、アニオン性ポリマーとの組合せを先に実行し、その後還元剤の添加／酸素の除去をいずれの順番でも実行することができる。或いは、還元剤の添加／酸素の除去をいずれの順番で実行してから、アニオン性ポリマーとの組合せを実行することもできる。還元剤のステップと酸素の除去のステップの間に、アニオン性ポリマーとの組合せを実行することも可能であろう。様々なステップを順次又は同時に（又はある程度重複して）実行してもよい。

本発明の組成物は、典型的には、対応する未処理のプロテアーゼ対照試料、すなわち、アニオン性ポリマーと非共有結合で結合されておらず、通常の酸化条件下、たとえば大気中の酸素レベルで、還元剤を添加せずに保存されるものよりも、タンパク質分解活性の安定性が大きいことを示す。たとえば、本発明の一部のプロテアーゼ組成物、特にパパイン（Ｐ）及びパパイヤ抽出物（オパールなど）は、室温及び室圧で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、又は６０日間又はそれを超えて保存した後に、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、又は９５％のタンパク質分解活性を示すことができ、一方で他のプロテアーゼ組成物、特にブロメライン（Ｂ）は、室温及び室圧で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４日間又はそれを超えて保存した後に、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、又は９５％のタンパク質分解活性を示すことができる。測定された活性は、本発明のプロセスによる処理の直後の活性と比較することができる。

いくつかの実施形態では、本発明のプロテアーゼ組成物の初期タンパク質分解活性は、未処理のプロテアーゼと比較して少なくとも１．５倍の活性、たとえば少なくとも２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、又は１０倍の活性を有するなど、未処理のプロテアーゼ組成物よりも大きい。比較の目的のために、処理ステップを実行した直後に初期活性を測定することができる。

ＢＡｐＮＡ分光光度アッセイを使用して活性を測定することができる：ＢＡｐＮＡ溶液（ＤＭＳＯ中１０ｍＭ）を反応緩衝液（リン酸カリウム１００ｍＭ、塩化カリウム１１６ｍＭ、及びＥＤＴＡ３ｍＭ、ｐＨ６）と共に調製することが可能である。プレミックスを２部の水、２部の反応緩衝液及び１部ｖ／ｖのＢＡｐＮＡで作成することができる。分光光度計（たとえば、Ｊａｓｃｏ Ｖ－６３０ ＵＶ－Ｖｉｓ分光光度計）はプレミックス溶液で４１０ｎｍでブランクにすることができる。その後対照試料及び陽性試料の両方に１／５ ｖ／ｖの水を添加し、その直後に読取りを開始することができる。相対的な酵素活性を、得られた直線の傾きとして測定することができる。

組成物
従来利用可能な組成物とは対照的に、本発明の組成物は医薬用途及び／又は化粧品用途に十分に安定であるように凍結乾燥する必要がない。したがって、そのような組成物は、たとえば、カプセル、錠剤、クリーム、軟膏、溶液、ペースト、滴剤、スプレー剤、エアロゾル、蒸気、ワイプ、パッチ、ガーゼ、ゲル、又は液剤として製剤化することが可能である。したがって、一実施形態では、本発明の組成物はカプセル、錠剤、クリーム、軟膏、乳剤、溶液、ペースト、滴剤、スプレー剤、エアロゾル、蒸気、ワイプ、パッチ、ガーゼ、ゲル、又は液剤として提供又は包装され、使用前に再構成される必要はない。好ましい実施形態では、本発明の組成物はゲル又は液体の形態で提供又は包装され、使用前に再構成される必要はない。

本発明の特定の態様では、組成物はゲル又は液体の形態であってもよい。組成物のタンパク質分解活性の安定性の向上により、液体又はゲルの形態で提供することが可能となり、これはすぐに使用することができ、使用直前に再構成する必要がないことを意味する。これは、組成物の投与において非常に有益であり、凍結乾燥組成物を再構成することが困難な状況、たとえば、熱傷などの創傷が即時処置を必要とする臨床環境外において有用となることがある。

組成物は創傷被覆材などの固体材料に吸収／吸着させることもできる。組成物は、薬学的及び／又は化粧品的に担体、希釈剤、賦形剤、界面活性剤、及び／又はアジュバントと組み合わせて、本発明の医薬組成物又は化粧品組成物を得ることができる。したがって、本発明の組成物は１種以上の追加の成分を含むように製剤化することができる。

たとえば、組成物の物理的特性を改善するために、界面活性剤をプロテアーゼ組成物の一部として使用することができる。界面活性剤の存在は、組成物の効力に影響を与えない。したがって、組成物は、ソルビタンエステル又はそのポリオキシエチレン誘導体などのアニオン性、カチオン性、又は非イオン性界面活性剤といった任意の適切な界面活性剤も組み入れることができる。適切な界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ラウリル硫酸アンモニウム、ラウレス硫酸ナトリウム、及びミレス硫酸ナトリウムも挙げられ得る。界面活性剤は非特異的吸着を減少させるために通常使用され、慎重な選択及び最適化が必要である。また、天然ガム、セルロース誘導体、又はシリカセウスシリカ（ｓｉｌｉｃａｃｅｏｕｓ ｓｉｌｉｃａ）などの無機材料などの懸濁剤、及びラノリンなどの他の成分を含んでもよい。

組成物は、当業者に公知の方法に従って調製することができ、追加の担体、賦形剤又は希釈剤を含むこともできる。担体、賦形剤及び希釈剤は、組成物の他の成分と適合するという意味で「許容可能な」ものでなければならず、必要に応じてより長期間保存できる組成物の形成に有害でないものでなければならない。そのような担体、賦形剤及び希釈剤は、本発明の組成物の完全性及び半減期をさらに増強させるために使用することができる。

許容可能な担体又は希釈剤のさらなる例としては、脱塩水又は滅菌水；生理食塩水；ピーナッツ油、サフラワー油、オリーブ油、綿実油、トウモロコシ油、ゴマ油、ラッカセイ油、又はココナッツ油などの植物系油；メチルポリシロキサン、フェニルポリシロキサン、メチルフェニルポリソルポキサン（ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ ｐｏｌｙｓｏｌｐｏｘａｎｅ）といったポリシロキサンなどのシリコーン油；揮発性シリコーン；流動パラフィン、ソフトパラフィン、又はスクワランなどの鉱物油；メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、又はヒドロキシプロピルメチル－セルロースなどのセルロース誘導体；低級アルカノール、たとえばエタノール又はイソプロパノール；低級アラルカノール；低級ポリアルキレングリコール又は低級アルキレングリコール、たとえばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール又はグリセリン；パルミチン酸イソプロピル、ミリスチン酸イソプロピル、又はオレイン酸エチルなどの脂肪酸エステル；ポリビニルピロリドン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｏｌｉｄｏｎｅ）；寒天；トラガカントゴム又はアカシアゴム、及びワセリンが挙げられる。ポリビニルピロリドン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ）（ＰＶＰ）、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルアルコール、及び酸化ポリエチレンなどの担体を用いることもできる。

本発明の組成物に含むことができる追加の担体としては、スクロースなどの非還元糖及びラクツロースなどの還元糖が挙げられる。そのような担体、並びにマンニトール、キシリトール、グリセロール及びソルビトールなどの糖アルコールも、抗酸化剤及び潜在的な安定剤として作用することができるため、本発明の組成物に含めるのに有用である。

投与可能な組成物を調製するための方法は、当業者には明らかであり、たとえば、参照により本明細書に組み込まれているＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、第１５版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．に、より詳細に記載されている。

使用
本発明の組成物は、皮膚の状態及び創傷を含む疾患、障害、及び状態の処置に関連する様々な医薬用途に使用することができる。本発明の組成物はまた、様々な化粧品用途に使用することもできる。

したがって、本発明は、本発明の組成物の局所的な適用を含む創傷のデブリードマンの方法、創傷を処置する方法で使用するための本発明の組成物、熱傷に罹患している個体を処置する方法であって、本発明の調製物を個体の患部に局所的に又は他の投与経路により投与するステップを含む方法、創傷を処置する方法で使用するための、又は使用する場合の本発明の組成物、本発明の組成物を創傷に局所的に又は他の投与経路により投与するステップを含む創傷治癒を促進する方法、本発明の化粧品組成物を皮膚に適用するステップを含む角質除去又は皮膚のライトニングの方法、角質除去又は皮膚をライトニングするための本発明の化粧品組成物の使用、本発明の化粧品組成物を皮膚に適用するステップを含む乾燥皮膚、老化皮膚、又は損傷皮膚を処置する方法、及び乾燥皮膚、老化皮膚、又は損傷皮膚を処置するための本発明の化粧品組成物の使用をさらに提供する。

本発明のプロテアーゼ組成物は、特に、血管／圧迫性皮膚潰瘍、熱傷などの慢性創傷を含む創傷及び、湿疹、乾癬、にきび、酒さ、魚鱗癬、尋常性白斑、蕁麻疹、脂漏性皮膚炎を含むがこれらに限定されないその他の皮膚状態を含む様々な皮膚状態を、予防するため、処置するため、低減するため、又は改善するために使用することができる。

本発明の組成物は、治療的に又は美容的に投与することができる。そのような用途では、組成物は、既にある状態に罹患している対象に、状態及び合併症を治癒する又は少なくとも部分的に阻止するのに十分な量で投与することができる。組成物の量は、患者を効果的に処置するのに十分であるべきである。

組成物はリポソームの形態で投与することもできる。リポソームは、リン脂質又は他の脂質物質に由来してもよく、水性媒体中に分散した単層又は多層ラメラ水和液晶により形成されてもよい。リポソームを形成することができる、無毒で、生理学的に許容可能で、代謝可能な任意の脂質を使用することができる。リポソームの形態の組成物は、安定剤、防腐剤、及び賦形剤を含んでもよい。好ましい脂質としては、天然及び合成の両方のリン脂質及びホスファチジルコリン（レシチン）が挙げられる。リポソームを製造するための方法は当技術分野で公知であり、この点に関して、Ｐｒｅｓｃｏｔｔ編、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１４巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（１９７６）、３３頁以下参照に具体的な言及がなされており、その内容は参照により本明細書に組み込まれている。

投与量
任意の特定の患者に対する「治療的に有効な」用量レベルは、処置される状態及び状態の重症度、用いられる組成物の活性、患者の年齢、体重、一般的健康状態、性別及び食事、投与時間、投与経路、処置期間、及び処置と組み合わせて又は同時に使用される任意の薬剤などの様々な要因、並びに当技術分野で周知の他の関連要因に依存する。したがって、当業者であれば、日常的な実験により、適用可能な状態を処置するために必要となる、組成物の有効で無毒な量を決定することができるであろう。

さらに、組成物の個々の投与量の最適な量及び間隔は、処置される状態の性質及び程度、投与の形態、経路及び部位、並びに処置される特定の個体の性質により決定されることは、当業者には明らかであろう。また、そのような最適な条件は、従来技術により決定することができる。

定められた日数について１日につき与えられる組成物の投与回数などの最適な処置コースは、従来の処置コース決定試験を用いて当業者により確認できることもまた、当業者には明らかであろう。

投与経路
本発明の組成物は、標準的な経路により投与することができる。一般に、組成物は局所的な経路により投与することができる。典型的には、本発明の組成物は、個体の患部に局所的に投与される。

他の実施形態では、組成物は、直腸、舌下、若しくは唇下などの他の腸内／経腸経路により、又は硬膜外、脳内、若しくは脳室内経路などを通じて中枢神経系を介して投与することができる。他の投与場所としては、皮膚上、経皮、皮内、鼻、動脈内、心臓内、骨内、髄腔内、腹腔内、膀胱内、硝子体内、海綿体内、膣内、又は子宮内経路を介するものが挙げられ得る。

治療のタイミング
典型的には、治療用途では、処置は疾患状態の期間中にわたるものである。

当業者は、本明細書に開示された組成物が、診断時に又はその後に続く、たとえば、そのような処置のための現在利用可能な治療の補完としてのフォローアップ処置又は強化治療として、単剤又は本明細書に開示された方法に対する併用治療アプローチの一部として投与することができることを諒解するであろう。本明細書に開示された組成物は、そのような疾患を発症する遺伝的又は環境的傾向を有する対象の予防治療として使用することもできる。

組成物は、状態の改善が見られるまでなど、必要な期間、定期的に投与することができる。したがって、組成物は、１時間ごと、１日に複数回、毎日、１週間に複数回、毎週、毎月又は適切と思われる頻度で投与することができる。

キット
本発明のキットは、本発明の方法及び使用の実施を容易にするものである。典型的には、本発明の方法又は使用を実施するためのキットは、その方法を実施するために必要な試薬及び手段をすべて含む。たとえば、一実施形態では、キットは、本発明の組成物、及び任意選択で、ポイントオブケア方法のためのデバイスなどの組成物を投与する手段を含むことができる。

典型的には、本明細書に記載されるキットは、１つ又は複数の容器も含む。本発明の文脈では、区分けされたキットには、組成物が別々の容器に収容されている任意のキットが含まれ、小さなガラス容器、プラスチック容器、又はプラスチック若しくは紙のストリップが含まれてもよい。そのような容器は、組成物の相互汚染を避けながら、ある区画から別の区画へ組成物を効率的に移すこと、及びある区画から別の区画へ各容器の薬剤又は溶液を定量的な方法で添加することを可能にすることができる。

典型的には、本発明のキットは、適切な方法及び使用を実行するためにキットを使用するための説明書も含む。

本発明の方法、使用、組成物及びキットは、ヒトを含む任意の動物、たとえば、非ヒト霊長類、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、トリ、ネコ及びイヌ種などに等しく適用可能である。したがって、異なる種に適用するためには、本発明の単一のキットを適用することができ、或いは、たとえば、個々の種のそれぞれに特有の組成物を含む異なるキットが必要となることがある。

当業者は、本明細書に開示された異なる特徴を組み合わせて、本発明の範囲内にある特徴の組合せを形成することができることを理解し、諒解するであろう。

列挙された実施形態
１．プロテアーゼのタンパク質分解活性の増強及び／又は安定化のための方法であって、（ｉ）プロテアーゼを還元剤と接触させるステップであって、プロテアーゼのシステイン残基が還元状態で維持されるステップ、（ｉｉ）プロテアーゼを取り囲む領域から実質的にすべての酸素ガスを除去するステップ、及び（ｉｉｉ）プロテアーゼがアニオン性ポリマーマトリックスに非共有結合で結合するようにプロテアーゼとアニオン性ポリマーマトリックスとを組み合わせるステップを含む、方法。

２．プロテアーゼが実質的に酸素を含まない雰囲気に入れられる、実施形態２に記載の方法。

３．増強された及び／又は安定化されたタンパク質分解活性を有するプロテアーゼを含む組成物を製造するための方法であって、プロテアーゼを還元剤と接触させるステップであって、プロテアーゼのシステイン残基が還元状態で維持されるステップ、（ｉｉ）プロテアーゼを取り囲む領域から実質的にすべての酸素ガスを除去するステップ、及び（ｉｉｉ）プロテアーゼがアニオン性ポリマーマトリックスに非共有結合で結合するようにプロテアーゼとアニオン性ポリマーマトリックスとを組み合わせるステップを含む、方法。

４．組成物が実質的に酸素を含まない雰囲気に入れられる、実施形態３に記載の方法。

５．酸素ガスが調製物を脱気することにより除去される、実施形態１～４のいずれか１つに記載の方法。

６．ポリマーがカルボマーである、実施形態１～５のいずれか１つに記載の方法。

７．増強された及び／又は安定化されたタンパク質分解活性を有する１種以上のプロテアーゼを含む組成物であって、（ｉ）プロテアーゼを還元剤と接触させるステップであって、プロテアーゼのシステイン残基が還元状態で維持されるステップ、（ｉｉ）プロテアーゼを取り囲む領域から実質的にすべての酸素ガスを除去するステップ、及び（ｉｉｉ）プロテアーゼがアニオン性ポリマーマトリックスに非共有結合で結合するようにプロテアーゼとアニオン性ポリマーマトリックスとを組み合わせるステップを含む方法により得られる又は得ることが可能である、組成物。

８．１種以上のプロテアーゼ、還元剤、及びアニオン性ポリマーマトリックスを含む組成物であって、プロテアーゼのシステイン残基が還元状態で維持され、組成物が実質的に酸素を含まず、プロテアーゼがアニオン性ポリマーマトリックスに非共有結合で結合している、組成物。

９．酸素ガスが組成物を脱気することにより除去される、実施形態７又は８に記載の組成物。

１０．ポリマーがカルボマーである、実施形態７～９のいずれか１つに記載の組成物。

１１．組成物が実質的に酸素を含まない雰囲気に入れられる、実施形態７～１０のいずれか１つに記載の組成物。

１２．プロテアーゼのタンパク質分解活性の増強及び／又は安定化のための方法であって、（ｉ）プロテアーゼを還元剤と接触させるステップであって、プロテアーゼのシステイン残基が還元状態で維持されるステップ、及び（ｉｉ）プロテアーゼを取り囲む領域から実質的にすべての酸素ガスを除去するステップを含む、方法。

１３．プロテアーゼが実質的に酸素を含まない雰囲気に入れられる、実施形態１２に記載の方法。

１４．増強された及び／又は安定化されたタンパク質分解活性を有するプロテアーゼを含む組成物を製造するための方法であって、（ｉ）プロテアーゼを還元剤と接触させるステップであって、プロテアーゼのシステイン残基が還元状態で維持されるステップ、及び（ｉｉ）組成物を取り囲む領域から実質的にすべての酸素ガスを除去するステップを含む、方法。

１５．酸素ガスが組成物を脱気することにより除去される、実施形態１２～１４のいずれか１つに記載の方法。

１６．組成物が実質的に酸素を含まない雰囲気に入れられる、実施形態１４又は１５に記載の方法。

１７．増強された及び／又は安定化されたタンパク質分解活性を有する１種以上のプロテアーゼを含む組成物であって、（ｉ）プロテアーゼを還元剤と接触させるステップであって、プロテアーゼのシステイン残基が還元状態で維持されるステップ、及び（ｉｉ）組成物を取り囲む領域から実質的にすべての酸素ガスを除去するステップを含む方法により得られる又は得ることが可能である、組成物。

１８．１種以上のプロテアーゼ及び還元剤を含む組成物であって、プロテアーゼのシステイン残基が還元状態で維持され、組成物が実質的に酸素を含まない、組成物。

１９．酸素ガスが組成物を脱気することにより除去される、実施形態１７又は１８に記載の組成物。

２０．組成物が実質的に酸素を含まない雰囲気に入れられる、実施形態１７～１９のいずれか１つに記載の組成物。

２１．プロテアーゼのタンパク質分解活性の増強及び／又は安定化のための方法であって、プロテアーゼがアニオン性ポリマーマトリックスに非共有結合で結合するようにプロテアーゼとアニオン性ポリマーマトリックスとを組み合わせるステップを含む、方法。

２２．増強された及び／又は安定化されたタンパク質分解活性を有するプロテアーゼを含む組成物を製造するための方法であって、プロテアーゼがアニオン性ポリマーマトリックスに非共有結合で結合するようにプロテアーゼとアニオン性ポリマーマトリックスとを組み合わせるステップを含む、方法。

２３．ポリマーがカルボマーである、実施形態２１又は２２に記載の方法。

２４．組成物が実質的に酸素を含まない雰囲気に入れられる、実施形態２１～２３のいずれか１つに記載の方法。

２５．増強された及び／又は安定化されたタンパク質分解活性を有する１種以上のプロテアーゼを含む組成物であって、プロテアーゼがアニオン性ポリマーマトリックスに非共有結合で結合するようにプロテアーゼとアニオン性ポリマーマトリックスとを組み合わせるステップを含む方法により得られる又は得ることが可能である、組成物。

２６．１種以上のプロテアーゼ及びアニオン性ポリマーマトリックスを含む組成物であって、プロテアーゼがアニオン性ポリマーマトリックスに非共有結合で結合している、組成物。

２７．ポリマーがカルボマーである、実施形態２５又は２６に記載の組成物。

２８．組成物が実質的に酸素を含まない雰囲気に入れられる、実施形態２５～２７のいずれか１つに記載の組成物。

２９．創傷を含む疾患及び障害の処置のため、デブリードマンのため、又は熱傷、潰瘍、若しくは壊疽を処置するための医薬の製造における、実施形態７～１１、１７～２０、又は２５～２８のいずれか１つに記載の組成物の使用。

３０．皮膚のライトニング、角質除去のため、又は皺、皮膚のしみ、そばかす、吹き出物、にきび、酒さ、日光斑、瘢痕、若しくは静脈瘤に適用するため、又は乾燥皮膚、老化皮膚、若しくは損傷皮膚に適用するための化粧品の製造における、実施形態７～１１、１７～２０、又は２５～２８のいずれか１つに記載の組成物の使用。

３１．実施形態７～１１、１７～２０、又は２５～２８のいずれか１つに記載の組成物を、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤、界面活性剤、及び／又はアジュバントと共に含む、医薬組成物。

３２．実施形態７～１１、１７～２０、又は２５～２８のいずれか１つに記載の組成物を、化粧品的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤、界面活性剤、及び／又はアジュバントと共に含む、化粧品組成物。

３３．創傷を含む疾患及び障害の処置で使用するため、デブリードマンのため、又は熱傷、潰瘍、若しくは壊疽を処置するための、実施形態７～１１、１７～２０、又は２５～２８のいずれか１つに記載の組成物、又は実施形態３１に記載の医薬組成物。

３４．組成物が局所的に適用される、実施形態３３に記載の組成物。

３５．創傷を含む疾患及び障害の処置のため、デブリードマンのため、又は熱傷、潰瘍、若しくは壊疽を処置するための方法であって、実施形態７～１１、１７～２０、又は２５～２８のいずれか１つに記載の組成物又は実施形態３１に記載の医薬組成物を対象に投与するステップを含む、方法。

３６．組成物が局所的に適用される、実施形態３５に記載の方法。

３７．皮膚のライトニング、角質除去で使用するため、又は皺、皮膚のしみ、そばかす、吹き出物、にきび、酒さ、日光斑、瘢痕、若しくは静脈瘤に適用するため、又は乾燥皮膚、老化皮膚、若しくは損傷皮膚に適用するための、実施形態７～１１、１７～２０、又は２５～２８のいずれか１つに記載の組成物又は実施形態３２に記載の化粧品組成物。

３８．実施形態７～１１、１７～２０、又は２５～２８のいずれか１つに記載の組成物、実施形態３１に記載の医薬組成物、又は実施形態３２に記載の化粧品組成物を含むキット。

３９．創傷を含む疾患及び障害の処置のため、デブリードマンのため、又は熱傷、潰瘍、若しくは壊疽を処置するため、又は皮膚のライトニング、角質除去で使用するため、又は皺、皮膚のしみ、そばかす、吹き出物、にきび、酒さ、日光斑、瘢痕、若しくは静脈瘤に適用するため、又は乾燥皮膚、老化皮膚、若しくは損傷皮膚に適用するために使用するための、又は使用する場合の、実施形態３８に記載のキット。

次に、本発明を以下の実施例を参照してさらに説明するが、これらはあくまで例示であり、非限定的なものである。

［実施例］
システインプロテアーゼは、活性部位にアミノ酸であるシステインが存在することを特徴とするプロテアーゼのファミリーである。この硫黄含有アミノ酸は、付属するヒスチジン残基と共に、ペプチド結合のアミドカルボニルを攻撃してチオエステルを形成し、後に水により攻撃されてシステインを再生し、カルボン酸を放出することにより、タンパク質分解活性の役割を担っている。

システインプロテアーゼは、カリカ・パパイヤ（パパイン、キモパパイン、カリカイン、グリシルエンドペプチダーゼ）、フィカス属（ｇｅｎｕｓ Ｆｉｃｕｓ）（フィシン）、及びアナナス・コモススなどのパイナップル科のいくつかのメンバー（ブロメライン）などの多くの植物種の乳樹脂に豊富に含まれている。

しかし、システインプロテアーゼには、その有用性を制限する重大な弱点がある。システインはチオール基の還元電位が比較的強いため（Ｅ^０＝－０．３４Ｖ）、システインは酸化に対して特に敏感である。したがって、酸素又は酸化剤の存在下では、チオールは一連の酸化段階を経て、最終的にスルホン酸基（－ＳＯ３－）を生成する。これらの酸化種はいずれもペプチド結合に対する触媒活性を保持しないため、酸化はシステインプロテアーゼを不活性化することがある。

プロテアーゼのタンパク質分解安定性が低いもう一つの理由は、自己分解である。プロテアーゼはそれ自体がタンパク質であるため、活性のあるプロテアーゼにより分解され、タンパク質分解活性が失われることがある。これはシステインプロテアーゼを含むすべてのプロテアーゼに言えることで、酸素などの外部物質を必要としない。理論に束縛されることを望まないが、本発明は、したがって、自己分解を防止又は抑制することができる。

本研究では、プロテアーゼのタンパク質分解活性を増強し、安定化させることが示された方法の組合せを特定し、検証した。したがって、これらの方法は、酸化損傷及び自己分解によるプロテアーゼの不活性化の問題に対する解決策を提供するものである。

本発明の方法は、一態様では、プロテアーゼの活性部位システイン残基を還元状態に維持するための還元剤としてのシステインの添加、及び、たとえば、窒素又はアルゴンなどの安定ハロゲンガスで溶液をフラッシングすることによるプロテアーゼを取り囲む領域からの酸素ガスの実質的除去を含む。

追加の又は代替の態様では、アニオン性ポリマー（架橋ポリアクリレートなど）の添加も、プロテアーゼを非共有結合的な方法で分離することで自己分解を抑制する手段として検証された。パパイン及び関連プロテアーゼの高いｐＩに基づくアニオン性ポリマーの選択は、パパイン及び関連プロテアーゼが中性ｐＨで正に帯電していることを意味する。したがって、本発明によって、プロテアーゼが可逆的な静電相互作用によってポリマーに結合するようになる可能性がある。

材料及び方法
植物性乳樹脂由来のパパイン及びブロメライン（工業グレード）はＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから入手した。パパイン含有組成物をパパイヤの果実（果皮の乳樹脂は含まない）から得た。オパールなどのそのようなパパイン含有組成物は、たとえば、国際公開第２００４／００８８８７として公開された、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＡＵ２００３／０００９３１に開示された方法により調製することができ、その全内容は参照により本明細書に組み込まれている。

窒素ガスはＢＯＣ Ｇａｓｅｓ（ＵＫ）から、カルボポール ウルトレッツはＬｕｂｒｉｚｏｌ Ｉｎｃ（ＯＨ、ＵＳＡ）から供給された。その他の化学物質はすべてＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。分光光度読取りは、Ｊａｓｃｏ Ｖ－６３０ ＵＶ－Ｖｉｓ分光光度計で行った。

システイン添加：システインを最終濃度１００ｍＭとなるように各試料に添加した。

窒素フラッシング：試料をプラスチックバイアルに入れ、室温で５分間窒素を溶液に吹き込んだ。各バイアルは酸素の侵入を防止するためにすぐに閉じられた。

カルボポール添加：カルボポール ウルトレッツを最終濃度０．２５％となるように各溶液に添加し、液体懸濁液を得た。酸素を含まない試料については、この段階で窒素フラッシングを行った。続いて１０ＭのＮａＯＨを添加（１：１０００、最終１０ｍＭ）すると溶液は直ちにゲル化し、粘性のあるゲルが得られた。

ＢＡｐＮＡ分光光度アッセイ：ＢＡｐＮＡ溶液（ＤＭＳＯ中１０ｍＭ）を反応緩衝液（リン酸カリウム１００ｍＭ、塩化カリウム１１６ｍＭ、及びＥＤＴＡ３ｍＭ、ｐＨ６）と共に調製した。

プレミックスを２部の水、２部の反応緩衝液及び１部のｖ／ｖ ＢＡｐＮＡで作成した。分光光度計はこの溶液を用いて４１０ｎｍでブランクにした。その後、対照試料及び陽性試料の両方に１／５ ｖ／ｖの水を添加し、その直後に読取りを開始した。相対的な酵素活性を、得られた直線の傾きとして測定した。

キー
オパール（又はＯ）－パパイヤ抽出物；Ｐ－パパイン；Ｂ－ブロメライン、それぞれ
無処理（Ｏ、Ｐ、又はＢ）、
処理Ｚ－カルボポール（０．２５％）、
処理ＸＹ－システインの添加（Ｘ）及び窒素を用いた脱気（Ｙ）、又は
処理ＸＹＺ－システインの添加（Ｘ）及び窒素を用いた脱気（Ｙ）及びカルボポール（０．２５％）
で評価。

オパール安定化：作りたてのオパール（１６ｍＬ）を２×８ｍＬのアリコートに分割した。次に、各アリコートをさらに２分割し、４×４ｍＬの試料とした（オパール、オパール＋ＸＹ、オパール＋Ｚ、オパール＋ＸＹ＋Ｚ）。Ｘ試料については、システインを添加した（１２ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭ）。Ｚ試料については、カルボポールを添加した（０．２５％）。ＸＹ試料は、窒素下で５分間脱気した。次にオパール＋ＸＹ＋Ｚ試料に１：１０００で１０ＭのＮａＯＨを添加し、Ｎ_２フラッシュ下で最終ｐＨ７．５にした。次にオパール＋Ｚ試料に１：１０００で１０ＭのＮａＯＨを添加し、最終ｐＨ７．５にした。

パパイン安定化：パパイン１ｍｇ／ｍＬ（１６ｍＬ）を２×８ｍＬのアリコートに分割した。次に、各アリコートをさらに２分割し、４×４ｍＬの試料とした（Ｐ、Ｐ＋ＸＹ、Ｐ＋Ｚ、Ｐ＋ＸＹ＋Ｚ）。Ｘ試料については、システインを添加した（１２ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭ）。Ｚ試料については、カルボポールを添加した（０．２５％）。ＸＹ試料は、窒素下で５分間脱気した。次にＰ＋ＸＹ＋Ｚ試料に１：１０００で１０ＭのＮａＯＨを添加し、Ｎ_２フラッシュ下で最終ｐＨ７．５にした。次にＰ＋Ｚ試料に１：１０００で１０ＭのＮａＯＨを添加し、最終ｐＨ７．５にした。

ブロメライン安定化：ブロメライン１ｍｇ／ｍＬ（１６ｍＬ）を２×８ｍＬのアリコートに分割した。各アリコートをさらに２分割し、４×４ｍＬの試料とした（Ｂ、Ｂ＋ＸＹ、Ｂ＋Ｚ、Ｂ＋ＸＹ＋Ｚ）。

Ｘ試料については、システインを添加した（１２ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭ）。Ｚ試料については、カルボポールを添加した（０．２５％）。ＸＹ試料は、窒素下で５分間脱気した。次にＢ＋ＸＹ＋Ｚ試料に１：１０００で１０ＭのＮａＯＨを添加し、Ｎ_２フラッシュ下で最終ｐＨ７．５にした。Ｂ＋Ｚ試料に１：１０００で１０ＭのＮａＯＨを添加し、最終ｐＨ７．５にした。

結果及び考察
１．プロテアーゼのタンパク質分解活性の安定化
要約すると、ＸＹ及びＸＹＺで処理すると、オパール及びパパイン試料について、未処理のオパール及びパパイン試料と比べてプロテアーゼのタンパク質分解活性が安定化することが判明した。Ｚで処理した場合にも、パパイン試料について、プロテアーゼのタンパク質分解活性が安定化した。これは、図１及び２から見てとれる。ＸＹ及びＸＹＺで処理すると、ブロメライン試料について、未処理のブロメライン試料と比べてプロテアーゼのタンパク質分解活性があまり安定化しないことが示された。これは、図３から見てとれる。これらの結果について、以下にさらに詳しく考察する。

パパイヤ抽出物（オパール）
パパイヤ抽出物安定化溶液の安定性は、ＢＡｐＮＡアッセイにより２ヶ月間毎週評価した。次に、測定された活性は、実験開始時のオパール（未処理）試料の活性に正規化し、１に設定した。結果を図１に示す。

システイン／窒素フラッシングの組合せによる安定化効果により、検討期間にわたって（少なくとも５８日目まで）活性の損失が検出されない結果となった。これは、酸素がないために還元剤であるシステインが還元状態に保たれ、それによって今度はシステインプロテアーゼ活性部位の活性システインを還元状態に保ち続け、酸化を防止できるからであると説明することができるであろう。同様に、カルボポールの安定化効果も、システイン／窒素フラッシングの組合せでの処理よりも持続時間が短いものの、依然として顕著であった（少なくとも１２日目まで）。

さらに、ＸＹ＋Ｚ試料では経時的に酵素活性が増強することも考慮した（結果の２部にて後述）。

１．１ パパイン（Ｐ）
市販の乳樹脂パパイン溶液の結果を図２に示す。観察結果は、ＸＹの組合せ及びＺ（カルボポール）処理は、いずれも６４日目に酵素溶液を安定化させるという点でオパール試料と類似している。パパインのＸＹＺ処理でも、６４日目に酵素液の安定化が示された。

１．２ ブロメライン（Ｂ）
ブロメラインの観察結果も、ＸＹ及びＸＹＺ処理における処理直後の活性の上昇に関しては、オパール及びパパインの観察結果と同様である。システイン／窒素＋カルボポールの即効性は極めて顕著で、未処理のブロメラインと比べて１０倍以上の増幅に達している（図３）。さらに、Ｚ処理で１４日目に安定化が達成された。

ブロメラインのタンパク質分解活性の安定化は、試験期間中に低下したが、それでも、カルボポール（０．２５％）単独（Ｚ）で、システイン及び窒素を用いた脱気の両方（ＸＹ）で、並びにシステイン、窒素を用いた脱気、及びカルボポール（０．２５％）のすべて（ＸＹＺ）で処理すると、７日目及び１４日目の両方で、未処理の試料と比べて、ブロメラインのタンパク質分解活性は最終的に安定化が維持された。

２．プロテアーゼのタンパク質分解活性の増強
驚くべきことに、且つ、予期せぬことに、タンパク質分解活性の安定性を増強する方法は、タンパク質分解活性自体も著しく増強することが判明した。要約すると、Ｚ、ＸＹ、及びＸＹＺで処理すると、いずれにおいてもオパール、パパイン、及びブロメラインの各試料について、未処理の試料と比べてプロテアーゼのタンパク質分解活性が増強することが判明した。これは、以下の表１、２、及び３から見てとれ、ここでは「平均」は平均の相対酵素活性を指し、「ＳＤ」は標準偏差を指し、「Ｚ」はカルボポール（０．２５％）での処理を指し、「ＸＹ」はシステイン（Ｘ）及び窒素を用いた脱気（Ｙ）での処理を指し、「ＸＹＺ」はシステイン（Ｘ）、窒素を用いた脱気（Ｙ）、及びカルボポール（０．２５％）（Ｚ）での処理を指す。各表に示した試料処理では、すべて同一バッチの同一プロテアーゼを使用した。

これらの結果は、プロ酵素の即時活性化（すなわち、プロ酵素から酵素への変換）を示唆している。システイン効果は、推定プロ酵素及び可逆的酸化種に対するシステインの還元／活性化効果によるものであり得る。予想外のカルボポール効果は、酵素凝集体のポリマーによる自己分解の妨害と解釈することが可能であろう。

２．１ パパイヤ抽出物（オパール）
表１は、カルボポール（０．２５％）単独（Ｚ）で処理すると、未処理の試料と比べてタンパク質分解活性が即時（０日目）に３倍増加したことを示す。活性の増加は１２日目にピークに達し、その後、試験期間の残りはベースレベルまで活性が低下した。

システイン及び窒素を用いた脱気の両方（ＸＹ）で処理すると、未処理の試料と比べてタンパク質分解活性が即時（０日目）に３．３倍増加した。この活性の増加は、試験期間中、５８日目までずっとほぼこのレベルで維持された。活性の最大増加は１２日目（３．５９倍の増加）に観察され、活性の最小増加は３０日目（３倍の増加）に観察された。

システイン、窒素を用いた脱気、及びカルボポール（０．２５％）のすべて（ＸＹＺ）で処理すると、未処理の試料と比べてタンパク質分解活性が即時（０日目）に１２倍増加した。重要なことに、このタンパク質分解活性の増強は時間と共にさらに増加し、５日目に１３．８倍の増加が観察され、１２日目に１４．３倍の増加が観察され、３０日目に１６．６倍の増加が観察され、４５日目に１５．３倍の増加が観察され、５８日目に１７．９倍の増加が観察された。したがって、プロ酵素及び／又は他の不活性型酵素と会合した活性酵素（すなわち、プロテアーゼ）は、時間と共に増加するように見える。

様々な処理で観察されるオパールのタンパク質分解活性の増強は、かなりの期間持続するように見える。カルボポール（０．２５％）単独（Ｚ）で処理すると、少なくとも１２日間、タンパク質分解活性の増強が示され、一方でシステイン及び窒素を用いた脱気の両方（ＸＹ）で、並びにシステイン、窒素を用いた脱気、及びカルボポール（０．２５％）のすべて（ＸＹＺ）で処理すると、少なくとも５８日間（試験期間全体）タンパク質分解活性の増強が示された。

２．２ パパイン（Ｐ）
表２は、カルボポール（０．２５％）単独（Ｚ）で処理すると、未処理の試料と比べてタンパク質分解活性が即時（０日目）に４．６倍増加したことを示す。この増加は少なくとも２６日目まではほぼ維持され（４．１倍の増加）、その後、少なくとも６４日目までの試験期間の残りは２．６～２．７倍程度の増加まで活性が低下した。

システイン及び窒素を用いた脱気の両方（ＸＹ）で処理すると、未処理の試料と比べてタンパク質分解活性が即時（０日目）に２．１倍増加した。この活性の増加は、それから試験期間を通して次第に低下し、２６日目に１．９０５倍の増加として活性の増加が観察され、５１日目及び６４日目に１．６６７倍の増加として活性の増加が観察された。

システイン、窒素を用いた脱気、及びカルボポール（０．２５％）のすべて（ＸＹＺ）で処理すると、未処理の試料と比べてタンパク質分解活性が即時（０日目）に５．２倍増加した。重要なことに、このタンパク質分解活性の増強は時間と共にさらなる純増加を示し、２６日目に８．０倍の増加が観察され、５１日目に５．７倍の増加が観察され、６４日目に６．１倍の増加が観察された。

様々な処理で観察されるパパインのタンパク質分解活性の増強は、やはりかなりの期間持続するように見える。カルボポール（０．２５％）単独（Ｚ）で、システイン及び窒素を用いた脱気の両方（ＸＹ）で、並びにシステイン、窒素を用いた脱気、及びカルボポール（０．２５％）のすべて（ＸＹＺ）で処理すると、それぞれ少なくとも６４日間（試験期間全体）タンパク質分解活性の増強が示された。

２．３ ブロメライン（Ｂ）
表３は、カルボポール（０．２５％）単独（Ｚ）で処理すると、未処理の試料と比べてタンパク質分解活性が即時（０日目）に１．６倍増加したことを示す。この増加は少なくとも１４日目まではほぼ維持され（１．５倍の増加）、７日目に３．０倍の増加まで活性が増加した。

システイン及び窒素を用いた脱気の両方（ＸＹ）で処理すると、未処理の試料と比べてタンパク質分解活性が即時（０日目）に６．３倍増加した。この活性の増加は、それから試験期間を通して低下し、７日目に０．６倍の増加として活性の増加が観察され、１４日目に０．６５倍の増加として活性の増加が観察された。

システイン、窒素を用いた脱気、及びカルボポール（０．２５％）のすべて（ＸＹＺ）で処理すると、未処理の試料と比べてタンパク質分解活性が即時（０日目）に１１倍増加した。このタンパク質分解活性の増強はそれから経時的に低下し、７日目に４．６倍の増加が観察され、１４日目に１．３倍の増加が観察された。

様々な処理で観察されるブロメラインのタンパク質分解活性の即時増強は、オパール及びパパインの両方で観察された同じ傾向と一致する。ブロメラインは、オパール及びパパインよりも活性の増加が早く減衰したが、それでも、カルボポール（０．２５％）単独（Ｚ）で、システイン及び窒素を用いた脱気の両方（ＸＹ）で、並びにシステイン、窒素を用いた脱気、及びカルボポール（０．２５％）のすべて（ＸＹＺ）で処理すると、試験期間全体にわたって、無処理試料と比べて、ブロメラインのタンパク質分解活性の純増加が維持された。

結論
本明細書に示されたデータは、プロテアーゼのタンパク質分解活性の増強及び安定化が、本明細書に開示された各方法、すなわち、カルボポール（０．２５％）単独（Ｚ）でのプロテアーゼの処理、システイン及び窒素を用いた脱気の両方（ＸＹ）でのプロテアーゼの処理、並びにシステイン、窒素を用いた脱気、及びカルボポール（０．２５％）のすべて（ＸＹＺ）でのプロテアーゼの処理を使用して達成できることを教示している。

驚くべきことに、かつ、予期せぬことに、タンパク質分解活性の安定性を増強する方法は、タンパク質分解活性自体も著しく増強することも判明した。要約すると、Ｚ、ＸＹ、及びＸＹＺで処理すると、いずれにおいてもプロテアーゼのタンパク質分解活性が増強することが判明した。特に、ＸＹＺ処理によるタンパク質分解活性の安定化の増強は、非常に顕著である。

したがって、本明細書に示されたデータは、プロテアーゼのタンパク質分解活性の安定化及びタンパク質分解活性自体の増強の両方が、本明細書に開示された方法を使用して達成できることを教示している。

本明細書に開示された処理法は、安全性に優れ、酵素の化学的共有結合修飾を伴わない試薬を含むため、アレルギーなどの消費者安全に関する問題及び規制上の課題を防止する。

本発明は、特定の態様を参照して開示されてきたが、本発明の真の趣旨及び範囲から逸脱することなく、本発明の他の態様及び変形が当業者により考案され得ることは明らかである。異なるセクションの特徴及び実施形態は、必要な変更を加えて組み合わせることができる。

２．プロテアーゼが実質的に酸素を含まない雰囲気に入れられる、実施形態１に記載の方法。

本発明の方法は、一態様では、プロテアーゼの活性部位システイン残基を還元状態に維持するための還元剤としてのシステインの添加、及び、たとえば、窒素又はアルゴンなどの安定不活性ガスで溶液をフラッシングすることによるプロテアーゼを取り囲む領域からの酸素ガスの実質的除去を含む。

Claims (20)

1. プロテアーゼのタンパク質分解活性の増強及び／又は安定化のための方法であって、（ｉ）プロテアーゼを還元剤と接触させるステップであって、プロテアーゼのシステイン残基が還元状態で維持されるステップ、（ｉｉ）プロテアーゼを取り囲む領域から実質的にすべての酸素ガスを除去するステップ、及び（ｉｉｉ）プロテアーゼがアニオン性ポリマーマトリックスに非共有結合で結合するようにプロテアーゼとアニオン性ポリマーマトリックスとを組み合わせるステップを含む、方法。
2. プロテアーゼが実質的に酸素を含まない雰囲気に入れられる、請求項２に記載の方法。
3. 増強された及び／又は安定化されたタンパク質分解活性を有するプロテアーゼを含む組成物を製造するための方法であって、プロテアーゼを還元剤と接触させるステップであって、プロテアーゼのシステイン残基が還元状態で維持されるステップ、（ｉｉ）プロテアーゼを取り囲む領域から実質的にすべての酸素ガスを除去するステップ、及び（ｉｉｉ）プロテアーゼがアニオン性ポリマーマトリックスに非共有結合で結合するようにプロテアーゼとアニオン性ポリマーマトリックスとを組み合わせるステップを含む、方法。
4. 組成物が実質的に酸素を含まない雰囲気に入れられる、請求項３に記載の方法。
5. 酸素ガスが調製物を脱気することにより除去される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
6. ポリマーがカルボマーである、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
7. 増強された及び／又は安定化されたタンパク質分解活性を有する１種以上のプロテアーゼを含む組成物であって、（ｉ）プロテアーゼを還元剤と接触させるステップであって、プロテアーゼのシステイン残基が還元状態で維持されるステップ、（ｉｉ）プロテアーゼを取り囲む領域から実質的にすべての酸素ガスを除去するステップ、及び（ｉｉｉ）プロテアーゼがアニオン性ポリマーマトリックスに非共有結合で結合するようにプロテアーゼとアニオン性ポリマーマトリックスとを組み合わせるステップを含む方法により得られる又は得ることが可能である、組成物。
8. １種以上のプロテアーゼ、還元剤、及びアニオン性ポリマーマトリックスを含む組成物であって、プロテアーゼのシステイン残基が還元状態で維持され、組成物が実質的に酸素を含まず、プロテアーゼがアニオン性ポリマーマトリックスに非共有結合で結合している、組成物。
9. 酸素ガスが組成物を脱気することにより除去される、請求項７又は８に記載の組成物。
10. ポリマーがカルボマーである、請求項７～９のいずれか一項に記載の組成物。
11. 組成物が実質的に酸素を含まない雰囲気に入れられる、請求項７～１０のいずれか一項に記載の組成物。
12. 創傷を含む疾患及び障害の処置のため、デブリードマンのため、又は熱傷、潰瘍、若しくは壊疽を処置するための医薬の製造における、請求項７～１１のいずれか一項に記載の組成物の使用。
13. 皮膚のライトニング、角質除去のため、又は皺、皮膚のしみ、そばかす、吹き出物、にきび、酒さ、日光斑、瘢痕、若しくは静脈瘤に適用するため、又は乾燥皮膚、老化皮膚、若しくは損傷皮膚に適用するための化粧品の製造における、請求項７～１１のいずれか一項に記載の組成物の使用。
14. 請求項７～１１のいずれか一項に記載の組成物を、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤、界面活性剤、及び／又はアジュバントと共に含む、医薬組成物。
15. 請求項７～１１のいずれか一項に記載の組成物を、化粧品的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤、界面活性剤、及び／又はアジュバントと共に含む、化粧品組成物。
16. 創傷を含む疾患及び障害の処置で使用するため、デブリードマンのため、又は熱傷、潰瘍、若しくは壊疽を処置するための、請求項７～１１のいずれか一項に記載の組成物又は請求項１４に記載の医薬組成物。
17. 組成物が局所的に適用される、請求項１６に記載の組成物。
18. 創傷を含む疾患及び障害の処置のため、デブリードマンのため、又は熱傷、潰瘍、若しくは壊疽を処置するための方法であって、請求項７～１１のいずれか一項に記載の組成物又は請求項１４に記載の医薬組成物を対象に投与するステップを含む、方法。
19. 組成物が局所的に適用される、請求項１８に記載の方法。
20. 皮膚のライトニング、角質除去における使用のため、又は皺、皮膚のしみ、そばかす、吹き出物、にきび、酒さ、日光斑、瘢痕、若しくは静脈瘤に適用するため、又は乾燥皮膚、老化皮膚、若しくは損傷皮膚に適用するための、請求項７～１１のいずれか一項に記載の組成物又は請求項１５に記載の化粧品組成物。

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