JP2008092816A - 耐熱性酵素の使用方法 - Google Patents

Abstract

【課題】水不溶性基材（特に、微小粒子形態）に、酵素と親水性ポリマー鎖を担持した、ナノ複合体酵素の様々な産業分野における具体的な用途を提供すること。
【解決手段】上記酵素複合体において、該酵素複合体を構成する酵素が、下記Ａ群の中から選ばれる１種以上の酵素であって、かつ、該酵素複合体に下記Ｂ群の中から選ばれる基質をそれぞれ接触させることを特徴とする、酵素複合体の使用方法を提供することにより、上記の課題を解決し得ることを見出した。（Ａ群）プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、マルターゼ、サッカラーゼ、アミラーゼ、キチナーゼ、チトクローム類、ラクターゼ、及び、デキストラナーゼ（Ｂ群）医薬原料、標識酵素に対する被標識物質、皮膚表面物質、食品前駆物質、環境負荷物質、被洗浄物、及び、被酵素処理繊維
【選択図】 なし

Description

本発明は、耐熱性酵素の使用方法に関する発明である。具体的には、本発明は、優れた耐熱性と分散性を兼ね備えた酵素複合体の、医薬、診断、化粧品、食品工業、環境浄化、洗剤、繊維表面処理、飼料配合剤等の分野における使用方法を提供する発明である。

酵素は農薬の合成、家畜飼料、食品大量生産のためのバイオリアクター、酒類等の醸造業など、多岐にわたって利用されている。しかしながら、酵素はこれらの用途において、凝集や高温による失活の課題を有する。また繰り返し利用するために、基材に酵素を固定した固定化酵素には、経時的な酵素自身の性質が変化や、活性が低下する等の問題が認められている。このため、現時点では、酵素の有効な回収または反復利用技術は十分に確立されているとはいえない。本発明者らは、ナノサイズの水不溶性微小粒子に酵素と水溶性高分子を共固定することにより、上記問題点を解決し得る、耐熱性に優れ、酵素の活性と元の性質を維持しつつ、非特異吸着を抑制し、分散性も高い回収可能な微小粒子担持型酵素複合体（以下、ナノ酵素複合体）を開発した。
国際公開第２００５／０７３３７０号公報 Sastry et.al.,Langmuir,2001,17,pp1674-1679

本発明が解決すべき課題は、上記のナノ複合体酵素の様々な産業分野における具体的な用途を提供することにある。

本発明者は、上記の課題について検討を行った結果、水不溶性基材の表面に、親水性ポリマー鎖の末端に荷電性基若しくは疎水性基を１以上有するポリマー、及び、酵素が、非共有結合的に担持された酵素複合体（ナノ酵素複合体）において、該酵素複合体を構成する酵素が、下記Ａ群の中から選ばれる１種以上の酵素であって、かつ、該酵素複合体に下記Ｂ群の中から選ばれる基質をそれぞれ接触させることを特徴とする、酵素複合体の使用方法（以下、本使用方法ともいう）を提供する発明である。
（Ａ群）プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、マルターゼ、サッカラーゼ、アミラーゼ、キチナーゼ、チトクローム類、ラクターゼ、及び、デキストラナーゼ
（Ｂ群）医薬原料、標識酵素に対する被標識物質、皮膚表面物質、食品前駆物質、環境負荷物質、被洗浄物、及び、被酵素処理繊維

なお、Sastryらは、ペプシンをナノサイズの金コロイド上に固定化したナノ酵素複合体について報告しているが（非特許文献１）、その効果としては、耐熱遠心分離条件下と再分散可能性において、わずかに保存安定性の向上が認められる程度である。本使用方法にかかわるナノ酵素複合体は、このSastryらの酵素複合体よりも、分散安定性と遠心分離安定性において優れている。

本発明により、優れた耐熱性を有する酵素複合体、特に、粒子形態の場合には、優れた分散性を兼ね備えた酵素複合体の、医薬、診断、化粧品、食品工業、環境浄化、洗剤、繊維表面処理、飼料配合剤等の分野における使用方法が提供される。

［ナノ酵素複合体］
本使用方法にて用いるナノ酵素複合体は、水不溶性基材の存在下で、酵素と一定のポリマーとから非共有結合的に形成され、少なくとも、水性媒体における撹拌または遠心等の処理によっては、各構成成分が分離することなく保持される構造物を意味する。

ナノ酵素複合体を構成する酵素は、本発明の目的に沿うものであれば如何なる酵素であってもよいが、現在、工業的に用いられている酵素を好ましいものとして挙げることができる。このような酵素の例としては、限定されるものでないが、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、コラゲナーゼ、ケラチナーゼ、エラスターゼ、ズブチリシン、パパイン、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、リゾチーム、等のプロテアーゼ；ガストリックリパーゼ、パンクレアチックリパーゼ、植物リパーゼ、ホスホリパーゼ、等のリパーゼ；セルラーゼ、マルターゼ、サッカラーゼ、アミラーゼ、ラクターゼ、デキストラナーゼ、キチナーゼ、等の糖質類分解酵素；チトクロームＣ等チトクローム類に代表され酸化還元酵素等、を挙げることができる。

このような酵素及び水不溶性基材と非共有結合的にバインディングさせるべきポリマーは、水性媒体（生理的条件もしくは非生理的条件下のｐＨに緩衝かされた水溶液、水混和性有機溶媒、例えば、メタノール、エタノール、アセトン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル等の混在する水溶液等）中で酵素と複合体を形成し得る、親水性ポリマー鎖の末端に荷電性差もしくは疎水性基を１ないし多数有するポリマーである。

具体的には、親水性ポリマー鎖が、ポリエチレングリコール、ポリメタクリル酸−２−ヒドロキシエチル、ポリアクリル酸−２−ヒドロキシエチル、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、ポリ−Ｎ，Ｎ−ジメチルメタクリルアミド、ポリビニルピロリドン、アガロースおよびデキストランからなる群より選ばれる、また、荷電性基が、一級、二級もしくは三級アミンを分子内に一種もしくは二種含む低分子アミン化合物に由来するか、または一級、二級もしくは三級アミンを反復単位の側鎖もしくは主鎖内に一種もしくは二種含むポリマー鎖に由来し、または疎水性基がポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリブチリックアシッド等のポリエステルに由来するポリマーである。特に好ましいポリマーは、親水性ポリマー鎖が、ポリエチレングリコール、または、ポリエチレンオキシドに由来するものである。具体的には、下記式（Ｉ）で表されるポリマーを挙げることができる。

上式中、Ｒ^ａは、水素、メチル基、アルデヒド基、アミノ基、カルボキシル基、マレイミド基、ｐ−トルエンスルホニル基またはビニルスルホニル基であり、Ｌ_１、およびＬ_２は、独立して、原子価結合またはリンカーを表し、ｎは、１〜２５００の整数であり、そしてＸは、Ｎ−もしくはＮ，Ｎ−モノもしくはジ−Ｃ_１−Ｃ_３アルキル置換アミノＣ_１−Ｃ_１２アルキル、反復単位が１〜２５００のオリゴもしくはポリ（Ｎ−もしくはＮ，Ｎ−モノもしくはジ−Ｃ_１−Ｃ_３アルキル置換アミノエチルメタアクリレート）鎖、主鎖に二級もしくは三級アミン基を有するポリアミンに由来する、例えば、ポリエチレンイミン鎖、スペルジミン鎖およびカダベリン鎖からなる群より選ばれる基またはオリゴもしくはポリマー鎖セグメントである。

また、より具体的なポリマーには、次式であらわされるものが含まれる。

上式中、ｍおよびｎは、独立して、１〜２５００の整数であり、ＲはＣ_１−Ｃ_３アルキル基である。

上式中、ｍ，ｎおよびｘは、独立して、１〜２５００の整数であり、Ｒ^１は水素またはメチル基であり、Ｒ^２はＣ_１−Ｃ_３アルキル基であり、Ｒ^３は水素またはＣ_１−Ｃ_５アルキル基である。

本発明に関し、例えば、Ｃ_１−Ｃ_１２アルキルというときは、炭素原子数が１〜１２個の直鎖または分岐アルキルを意味する。

以下、上記のポリマーに包含されるポリマーのさらに具体的なものには、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−ｂｌｏｃｋ−ポリ（メタクリル酸−２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）（以下、ＰＥＧ−ＰＭＡＭＡと略記することもある）、ＰＥＧ−ｂｌｏｃｋ−ポリ（メタクリル酸−２−Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチル）（以下、ＰＥＧ−ＰＥＡＭＡと略記することもある）、ＰＥＧ−ｂｌｏｃｋ一ポリ（イソプロピルアクリルアミド）（以下、ＰＥＧ−ＰＮＩＰＡＭと略記することもある〉、ＰＥＧ−ポリアクリルアミド、ＰＭＡＭＡ−ＰＮＩＰＡＭ、ＰＥＡＭＡ−ＰＮＩＰＡＭ、ＰＶＡ−ＰＭＡＭＡ、ＰＶＡ−ＰＥＡＭＡ等が包含される。

これらのポリマーの分子量については、理論的に制限はないが、５００〜１０００，０００が好ましく、２０００〜５０００００がより好ましく、合成の容易さから考えると３０００〜１０００００が、特に好ましい。以上のポリマーは、それ自体公知であるか、または公知のものに準ずる方法により容易に得ることができる。例えば、ＰＥＧ−ＰＭＡＭＡ、ＰＥＧ−ＰＥＡＭＡ等については、Ｙ．Ｎａｇａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ，１９９７，１８，９２７、ポリエチレングリコール鎖のα−末端に各種官能基を導入する場合、分子量を調整する場合、また、疎水性ポリマー鎖を有するポリマーを入手する場合は、ＷＯ９６／３２４３４（ＵＳＰ５９７３０６９に対応）、ＷＯ９６／３３２３３（ＵＳＰ６０９０３１７に対応）、ＷＯ９７／０６２０２（ＵＳＰ５９２９１７７に対応）を参照することができる。

また、本発明の酵素複合体の構成成分とすることができる水不溶性基材は、上記のごときポリマーと酵素が非共有結合的（静電結合的、疎水結合的、水素結合的等の共有結合以外のあらゆる結合様式を包含する）にバインディングでき、本発明の目的に沿うものであれば、材質、形状等を問うことなく使用できる。典型的には、微小粒子形態が挙げられる。該微小粒子のサイズは、平均粒子径として、数ｎｍ〜数ｍｍ、好ましくは、１ｎｍ〜数１００μｍ、さらに好ましくは、５ｎｍ〜１０００ｎｍである。従来技術では、コロイド状金粒子に酵素をバインディングないし固定したものは、水性媒体中である程度の分散安定性を有するが、コロイド状を超えたサイズの粒子も、酵素以外に、ポリマーがバインディングしていることにより、極めて良好な水性媒体中での分散安定性を示すことができる。

特に限定されるものでないが、これらの微小粒子の代表的なものとしては、コロイド状金、コロイド状銀、コロイド状酸化アルミニウム、コロイド状シリカ、コロイド状酸化チタン、微小磁鉄鋼粒子、およびコロイド状半導体を挙げることができる。このような粒子はいずれも市販品をそのまま、又は、精製して使用することができる。また、半導体微小粒子は、例えば、周期律表のＩＩＢ族もしくはＩＩＩＢ族元素の塩化物（例えば、塩化カドミウム〉と同ＶＩＢ族元素のアルカリ金属塩（例えば、硫化ナトリウム）とを水性媒体中で反応させて調製することもできる。こうして調整できる半導体微小粒子の代表的なものには、ＣｄＳおよびＣｄＳｅ微小粒子が包含される。

水不溶性基材として、微小粒子形態以外の形態をとることも許容される。すなわち、該水不溶性基材の表面は、上記のような微小粒子以外の形態で、水不溶性表面を有する対象物の表面である。該水不溶性基材は、酵素の基質と接触させる対象物であり、例えば、バイオリアクターにおける酵素固定体であって、平面又は曲面状の酵素固定用表面を有するものが挙げられる。該水不溶性基材の表面は、上述した微小粒子を構成する素材、例えば、金、銀、酸化アルミニウム、シリカ、酸化チタン、鉄鋼、半導体等により構成されており、特に、金が好適である。少なくとも、酵素と基質の接触表面がこのような素材で構成されていることが必要であり、対象物全体がこれらの物質である必要はない。典型的には、対象物表面に、用いる素材に応じた公知のコーティング方法やメッキ方法により、所望する水不溶性表面を作出することができる。

ナノ酵素複合体は、まず、酵素と、水不溶性基材を、水性媒体において接触させて、該基材の表面に酵素を吸着させるとともに、またその後に、親水性ポリマー鎖の末端に荷電性基もしくは疎水性基を１ないし多数有するポリマーを加えて、室温下、必要があれば、例えば、冷却（数℃）下にて混合攪拌することにより、その表面に酵素がバインディングした水不溶性基材を、さらに該ポリマーで被覆することができる。酵素を、水不溶性基材の表面に担持させるには、例えば、そのまま、必要により、酵素に一般的な方法でメルカプト基を導入し、水不溶性基材の表面ヘバインディングさせる方法を選ぶこともできる。酵素に対する水不溶性基材の表面積の割合も、通常、小実験を行って決定することができる。例えば、水不溶性基材が微小粒子形態である場合には、酵素対微小粒子の比（質量基準〉が０．０００１：１００００〜１００００：０．０００１で利用が可能であり、１：１００００〜１００００：１がさらに好ましい。効率的な利用では１：１０００〜１０００：１程度がもっとも好ましい。より具体的には、例えば、酵素（分子）対コロイド状金（個数）は、０．０１：１〜１００００：１、特に、２０：１〜１０００：１であることができる。また、水不溶性物質の表面を有する対象物においては、該水不溶性物質の質量を上記微小粒子の質量に代えて換算した比が該当する。

次いで、このようにして調製した酵素を担持した水不溶性基材と、前記親水性ポリマーを前記の水性媒体中で、室温下、必要があれば、例えば、冷却（数℃）下に混合することにより、所望ずるナノ酵素複合体を調製することができる。

この場合、混合する割合は、特にポリマーの種類により最適値が変動するので、通常、小実験を行って決定するのがよいが、例えば、酵素担持微小粒子において担持されている酵素対ポリマーの質量比が０．０００１：１００００〜１００００：０．０００１で利用が可能であり、１：１００００〜１００００：１がさらに好ましい。また、たとえば、側鎖に三級アミンを担持するＰＥＧ−ＰＭＡＭＡ等を用いる場合には、三級アミン基が、酵素１モルに対して少なくとも１、好ましくは５以上、より具体的には、１〜５０００（例えば、リゾチーム）、または３０〜３０００（例えば、リパーゼ）当量となるように混合する。また、水不溶性物質の表面を有する対象物においては、該水不溶性物質の質量を上記微小粒子の質量に代えて換算した比が該当する。

こうして、所望するナノ酵素複合体を製造することができる。該ナノ酵素複合体は、例えば、７０℃の高温に昇温し、１０分間保持した後冷却し、再度同昇温を行うサイクルを数回繰り返しても酵素活性を少なくとも５０％は保持する、強力な熱安定性を示す。

［本使用方法］
本使用方法は、ナノ酵素複合体において用いる酵素の種類に応じて規定される。
（１）プロテアーゼの場合
（ａ）医薬原料を基質として、ナノ酵素複合体の酵素をプロテアーゼとした、ナノプロテアーゼ複合体を作用させる場合として、例えば、長鎖蛋白をプロテアーゼ処理によりペプチド化することにより、該医薬原料を医薬の配合成分とする場合が挙げられる。このような場合には、該ナノプロテアーゼ複合体の優れた安定性により（微小粒子形態の場合は優れた分散性も好適条件となる）、所望する医薬の配合成分の生産効率を格段に向上させることができる。なお、ナノプロテアーゼ複合体自体を内服剤、例えば、消化酵素剤の有効成分として用いることも可能である、ナノプロテアーゼ複合体は、その優れた安定性と分散性により、経口投与を行っても、失活しづらく、分散性も良好であり、所望する蛋白分解効果を効率的に挙げることが可能となる。

（ｂ）皮膚表面物質を基質として、ナノプロテアーゼ複合体を作用させる場合として、皮膚外用剤の有効成分として、ナノプロテアーゼ複合体を用いる場合が挙げられる。

すなわち、プロテアーゼを皮膚外用剤の有効成分として、皮膚表面物質、例えば、角質等と接触させる場合、美肌効果（化粧品等としての効果）や、消炎効果又は鮮創効果（医薬品や医薬部外品等としての効果）を発揮し得ることが知られているが、このプロテアーゼの代わりに、ナノプロテアーゼ複合体を用いることにより、該複合体の優れた分散性により製剤が格段に容易となり、さらに、その優れた安定性により、薬効が経時的に安定した皮膚外用剤が提供される。この場合は、微小粒子形態が好適な対象となる。

（ｃ）食品前駆物質、具体的には、プロテアーゼ処理を前提として最終的な食品とする物質をプロテアーゼの基質とする場合、これに代えてナノプロテアーゼ複合体を用いることにより、食品加工の工程において行われる高温に対してもプロテアーゼの酵素活性を本質的に失わずに、効率的にプロテアーゼ処理工程を行うことができる。具体的には、チーズ製造における凝集酵素レンネットの代用品や、レンネットの補助酵素として、ナノプロテアーゼ複合体を用いることにより、効率的にチーズ製造を行うことができる。ビールや清酒の混濁の原因となる不溶性結合物を基質として、ナノプロテアーゼ複合体を作用させることにより、微小粒子形態においては、その優れた分散性により、効率的に該不溶性結合物を除去して、ビールや清酒の透明性を保つことが可能である。また、味噌や醤油の発酵過程において、蒸し煮大豆にナノプロテアーゼ複合体を、微小粒子形態若しくは水不溶性表面を有する対象物として作用させることにより、その優れた耐熱性により、蒸し煮大豆の粗熱による酵素失活が大幅に抑制されるために、効率的に味噌や醤油を製造することが可能となる。

（ｄ）被洗浄物、具体的には、洗濯を行う際の汚れ物にナノプロテアーゼ複合体を、特に微小粒子形態にて接触させることにより、蛋白質汚れを効率的に分解することが可能である。すなわち、現在、用いられているプロテアーゼ配合の洗剤において、プロテアーゼに代えて、ナノプロテアーゼ複合体を用いることにより、その優れた安定性により、効率的に汚れ落としを行うことが可能となる。

（ｅ）被酵素処理繊維、プロテアーゼによって繊維の表面を処理して肌ざわりや風合いをよくする技術が知られており、このプロテアーゼに代えて、主に微小粒子形態のナノプロテアーゼ複合体を用いることにより、その優れた分散性と安定性により、該繊維処理を効率的に行うことができる。

（ｆ）環境負荷物質、例えば、富栄養化が進んでいる汚染領域に、ナノプロテアーゼ複合体を、微小粒子形態又は不溶性表面を有する対象物の形態にて作用させることにより、蛋白質系の汚染物質の分解を、その優れた安定性と分散性故に、極めて効率的に行うことができる。

（ｇ）配合飼料
配合飼料中に、微小粒子形態のナノプロテアーゼ複合体を混合することにより、生体内での活性が維持されている時間を維持することにより、家畜等の生育をいっそう促進することができる。

（２）リパーゼ
（ａ）医薬原料（医薬に用途は問わない）を基質として、微小粒子形態又は不溶性表面を有する対象物の形態のナノ酵素複合体の酵素をプロテアーゼとした、ナノリパーゼ複合体を作用させる場合として、例えば、油脂を加水分解して脂肪酸を製造する場合や、エステル合成による界面活性剤の製造を行う場合や、光学分割を行う場合や、油脂・乳化剤等の改質等が挙げられる。

特に、脂肪酸は、現在油脂を約５０気圧・２５０℃前後で分解するという、典型的な多消費型プロセスによって生産されている。従って、固定化したリパーゼを素子とするバイオリアクターにより油脂を分解する需要は非常に高い。しかしながら、通常、リパーゼは熱に弱く、６０℃・１０分で完全に失活し、使用温度は３０℃程度が限界という結果も示されている。このリパーゼを素子とするバイオリアクターとして、ナノリパーゼ複合体を用いることにより、その優れた耐熱性（微小粒子形態は分散性が優れている点において有利である）により、極めて効率的に脂肪酸を製造することが可能となる。なお、微小粒子形態のナノリパーゼ複合体自体を内服剤、例えば、消化酵素剤の有効成分として用いることも可能である、該ナノプロテアーゼ複合体は、その優れた安定性と分散性により、経口投与を行っても、失活しづらく、分散性も良好であり、所望する脂肪分解効果を効率的に挙げることが可能となる。

（ｂ）皮膚表面物質を基質として、ナノリパーゼ複合体を作用させる場合として、皮膚外用剤の有効成分として、微小粒子形態のナノリパーゼ複合体を用いる場合が挙げられる。

すなわち、リパーゼを皮膚外用剤の有効成分として、皮膚表面物質、例えば、皮脂等と接触させる場合、美肌効果（化粧品等としての効果）を発揮し得ることが知られているが、このリパーゼの代わりに、微小粒子形態のナノリパーゼ複合体を用いることにより、該複合体の優れた分散性により製剤が格段に容易となり、さらに、その優れた安定性により、薬効が経時的に安定した皮膚外用剤が提供される。

（ｃ）食品前駆物質、具体的には、リパーゼ処理を前提として最終的な食品とする物質をリパーゼの基質とする場合、これに代えて微小粒子形態又は水不溶性表面を有する形態のナノリパーゼ複合体を用いることにより、食品加工の工程において行われる高温に対してもリパーゼの酵素活性を本質的に失わずに、効率的にリパーゼ処理工程を行うことができる。具体的には、乳、卵、肉、酒、味噌等の香味、保存性、起泡性の改良のために、これらの食品の関連物質にナノリパーゼ複合体を作用させることにより、該複合体の優れた経時安定性と分散性故に、極めて効率的に所望する脂肪分解が行われる。

（ｄ）被洗浄物、具体的には、洗濯を行う際の汚れ物に、微小粒子形態のナノリパーゼ複合体を接触させることにより、油汚れを効率的に分解することが可能である。すなわち、現在、用いられているリパーゼ配合の洗剤において、リパーゼに代えて、微小粒子形態のナノリパーゼ複合体を用いることにより、その優れた安定性により、効率的に油汚れ落としを行うことが可能となる。

（ｅ）被酵素処理繊維、リパーゼによって繊維の表面を処理して肌ざわりや風合いをよくする技術が知られており、このリパーゼに代えて、好適には微小粒子形態のナノリパーゼ複合体を用いることにより、その優れた分散性と安定性により、該繊維処理を効率的に行うことができる。

（ｆ）環境負荷物質、例えば、富栄養化が進んでいる汚染領域に、微小粒子形態又は水不溶性表面を有するナノリパーゼ複合体を作用させることにより、油脂系の汚染物質の分解を、その優れた安定性（微小粒子形態においては優れた分散性が好適に働く）故に、極めて効率的に行うことができる。

（ｇ）配合飼料
配合飼料中に、微小粒子形態のナノリパーゼ複合体を混合することにより、生体内での活性が維持されている時間を維持することにより、家畜等の生育をいっそう促進することができる。

（３）糖質分解酵素
（ａ）医薬原料（医薬に用途は問わない）を基質として、微小粒子形態又は水不溶性表面を有するナノ酵素複合体の酵素をアミラーゼ等の糖質分解酵素とした、ナノ糖質分解酵素複合体を作用させる場合として、例えば、糖質を基質として加水分解して新たな糖質（例えば、デンプン→ブドウ糖）を製造する場合等が挙げられる。このような原料の工業的な生産において、酵素の活性の安定性や、酵素自体の分散性は、生産効率に大きく影響する。その点、ナノ糖質分解酵素複合体は、経時的安定性や分散性に非常に優れており、これらの工業的な生産効率を飛躍的に向上させることが可能である。

（ｂ）食品前駆物質
糖質分解酵素は、デンプンから水飴を製造する工程や、パンの品質向上、アルコール発酵等の食品分野に用いられる。すなわち、糖質分解酵素は、これらの最終製品に至る前段階の食品前駆物質に個別具体的に用いられる。これらの工程において、糖質分解酵素そのものに代えて、微小粒子形態又は水不溶性表面を有するナノ糖質分解酵素複合体を用いることにより、該酵素複合体の耐熱性、経時的安定性、優れた分散性（微小粒子形態）等により、所望する酵素反応が効率よく進行し、最終製品の製造効率を格段に向上させることができる。

（ｃ）被酵素処理繊維
糖質分解酵素は、繊維における糊抜、すなわち、機織のとき糸切れ防止のために付着させた糊を原布から一旦除去する作業、において用いられる。この作業では、耐熱性が求められるために、極めて耐熱性に優れた、微小粒子形態又は水不溶性表面を有するナノ糖質分解酵素複合体を、糖質分解酵素そのものに代えて用いることにより、いっそう効率的に糊抜を行うことができる。

（ｄ）配合飼料
配合飼料中に、微小粒子形態のナノ糖質分解酵素複合体を混合することにより、生体内での活性が維持されている時間を維持することにより、家畜等の生育をいっそう促進することができる。

（ｅ）皮膚表面物質を基質として、ナノ糖質分解酵素複合体を作用させる場合として、皮膚外用剤の有効成分として、ナノ糖分解酵素複合体を用いる場合が挙げられる。

すなわち、微小粒子形態の糖質分解酵素複合体を皮膚外用剤の有効成分として、皮膚表面物質、例えば、皮脂等と接触させる場合、美肌効果（化粧品等としての効果）を発揮し得ることが知られているが、この糖質分解酵素の代わりに、ナノ糖質分解酵素複合体を用いることにより、該複合体の優れた分散性により製剤が格段に容易となり、さらに、その優れた安定性により、薬効が経時的に安定した皮膚外用剤が提供される。

（４）その他
糖尿検査に用いられるグルコース・オキシダーゼ、尿素測定に用いられるウレアーゼ、尿酸の定量に用いられるウリカーゼ、等を、微小粒子形態又は水不溶性表面を有するナノ酵素複合体とすることにより、その感度や安定性を向上させることができる。

［製造例］ ナノリパーゼ複合体の製造
この製造例は、リパーゼ溶液にコロイド状金（金コロイド）を加えた後、さらにポリマー［ＰＥＧ−ポリ（メタクリル酸−２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）：Ｍｎ＝４０００］を加えて処理した例を示す。

リパーゼ（シグマ社 リパーゼ：Candida rugasa由来）６．０ｍｇ（０．１μｍｏｌ）をメスフラスコに採り、リン酸緩衝液（ｐＨ７．０、５０ｍＭ）で１００ｍＬに調整した。これを１ｍＬずつ分取し、金コロイド溶液（ＢＢＩ社、１０ｎｍ）５ｍＬを加え、４℃で１０分間静置した。

この時点で調製されたリパーゼ・金コロイド複合体を、ナノリパーゼ複合体（ＰＥＧ・リパーゼ担持金コロイド）の対照として用いる（１）リパーゼ担持金コロイド、とした。

さらに、上記ポリマー２８．６ｍｇ（４μｍｏｌ）を、上記リパーゼ担持金コロイド溶液に加えた。このようにして得られた溶液を、（２）ナノリパーゼ複合体である、ＰＥＧ・リパーゼ担持金コロイドとした。

〔試験例〕
（１）分散安定性試験
方法：試験管に、上記のナノリパーゼ複合体（１）及び（２）、並びに、（３）金コロイド（ＢＢＩ社、平均粒子径１０ｎｍ）を、０．０１質量％ 、ＰＢＳ（ｐＨ７．０，５０ｍＭ）中に分散させた。次いで、それぞれの試験管に、ＮａＣｌを、最終濃度が１４０ｍＭになるように添加して溶解した。添加１０分後と６０分後における、プラズモン吸収による６２０ｎｍにおける吸光度（Ａ６２０）と５２０ｎｍにおける吸光度（Ａ５２０）の比（Ａ５２０／Ａ６２０）を求めた（室温下）。Ａ６２０は大きい粒子によるプラズモン吸収を示し、Ａ５２０は小さい粒子によるプラズモン吸収を表し、この比が小さくなることは、凝集体が形成されたこと（分散性に劣る）ことを示す。

結果：結果を図１に示す。図１の横軸は経過時間を示し、縦軸はＡ５２０／Ａ６２０を示している。黒丸は（２）：ＰＥＧ・リパーゼ担持金コロイドにおける結果を示し、白丸は（１）：リパーゼ担持金コロイドにおける結果を示し、黒四角は（３）：金コロイドにおける結果を示す。この結果より、対照は、ＮａＣｌの添加後（Ｓａｌｔ ａｄｄｉｔｉｏｎ）に急速に凝集体が形成されているのに対し、リパーゼ担持金コロイドにおいては緩叙に凝集体が形成され、ＰＥＧ・リパーゼ担持金コロイドにおいては、ほとんど凝集体の形成が認められなかった。これと同様の結果が、６０℃・６０分の加熱を行った場合にも得られた。よって、ＰＥＧ・リパーゼ担持金コロイドは、塩溶解下においても安定した分散性を示し、さらに、優れた耐熱性が認められることが明らかになった。

（２）耐熱特性試験
方法：上記のナノリパーゼ複合体（１）及び（２）、並びに、（３）リパーゼ（シグマ社 リパーゼ：Candida rugasa由来）を、０．１６１ｍｇ／ｍｌの濃度にて、ＰＢＳ（ｐＨ７．０，５０ｍＭ）中に分散させた。これに対して、２５℃・１０分→６０℃・１０分の加熱サイクルを５回繰り返して、その場合のリパーゼ活性の低下の度合いについて検討した。リパーゼ活性は、吸光度測定により確認を行った。

結果：結果を図２に示す。図２において、横軸は加熱サイクルの順を示し、縦軸は、リパーゼ活性（何も加熱処理を施さない場合の酵素活性値を１とした場合のリパーゼ活性）を示している。図２に示すように、加熱よるリパーゼ活性の低下は、対照のリパーゼがもっとも著しく、リパーゼ担持金コロイドにおいては緩叙であり、ＰＥＧ・リパーゼ担持金コロイドにおいては殆ど低下が認められなかった。

これにより、ＰＥＧ・リパーゼ担持金コロイドにおいては、極めて優れた耐熱性が認められることが明らかとなった。

（３）遠心分離後の活性の検討
方法：上記のナノリパーゼ複合体（２）（ＰＥＧ・リパーゼ担持金コロイド）とリパーゼ（対照：シグマ社 リパーゼ：Candida rugasa由来）を、それぞれ、０．１６１ｍｇ／ｍｌの濃度にて、ＰＢＳ（ｐＨ７．０，５０ｍＭ）中に分散させた。これを、４℃下で遠心分離（３０分）にかけた場合のリパーゼの酵素活性について検討した。酵素活性は、吸光度にて測定し、遠心処理前の酵素活性を１．０として、遠心後の相対活性を算出した。

結果：結果を図３に示す。図３において、横軸は遠心加速度（１００００×ｇ）を示し、縦軸はリパーゼの相対活性を示している。この結果は、ＰＥＧ・リパーゼ担持金コロイドが、２〜６万ｇの遠心分離後でも８０％以上の活性を維持可能であることを示している。よって、ＰＥＧ・リパーゼ担持金コロイドは、物理的刺激に対しても安定であることが明らかになった。

これらの結果により、ＰＥＧ・リパーゼ担持金コロイドが、単にリパーゼを金コロイドに担持した複合酵素よりも、分散安定性（耐塩性）、高温安定性、物理的刺激に対する安定性において、明らかに優れていることがわかった。

これにより、ＰＥＧ・リパーゼ担持金コロイドを、上述したリパーゼが用いられる分野、具体的には、（ａ）医薬原料を対象とする場合、（ｂ）皮膚表面物質を対象とする場合、（ｃ）食品前駆物質を対象とする場合、（ｄ）被洗浄物を対象とする場合、（ｅ）被酵素処理繊維を対象とする場合、（ｆ）環境負荷物質を対象とする場合、（ｇ）配合飼料を対象とする場合、において、ＰＥＧ・リパーゼ担持金コロイドを、リパーゼに代えて用いることで、各分野における酵素反応を極めて効率的に進行させることが可能であり、各分野における効率を格段に向上させ得ることが明らかになった。

配合飼料中に、ナノプロテアーゼ複合体を混合することにより、生体内での活性が維持されている時間を維持することにより、家畜等の生育をいっそう促進することができる。

ナノリパーゼ複合体の分散性を、塩添加により検討した結果を示した図面である。 ナノリパーゼ複合体の高温に対する安定性を検討した結果を示した図面である。 ナノリパーゼ複合体の物理的刺激に対する安定性を、遠心分離により検討した結果を示した図面である。

Claims (7)

1. 水不溶性基材の表面に、親水性ポリマー鎖の末端に荷電性基若しくは疎水性基を１以上有するポリマー、及び、酵素が、非共有結合的に担持された酵素複合体において、該酵素複合体を構成する酵素が、下記Ａ群の中から選ばれる１種以上の酵素であって、かつ、該酵素複合体に下記Ｂ群の中から選ばれる基質をそれぞれ接触させることを特徴とする、酵素複合体の使用方法。
   （Ａ群）プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、マルターゼ、サッカラーゼ、アミラーゼ、キチナーゼ、チトクローム類、ラクターゼ、及び、デキストラナーゼ
   （Ｂ群）医薬原料、標識酵素に対する被標識物質、皮膚表面物質、食品前駆物質、環境負荷物質、被洗浄物、及び、被酵素処理繊維
2. 前記使用方法において、水不溶性基材が、微小粒子であることを特徴とする、請求項１記載の酵素複合体の使用方法。
3. 前記使用方法において、水不溶性微小粒子が、金粒子であることを特徴とする、請求項２記載の酵素複合体の使用方法。
4. 前記使用方法において、親水性ポリマー鎖の末端に荷電性基若しくは疎水性基を１以上有するポリマーを構成する親水性ポリマー鎖が、（１）ポリエチレングリコール、（２）ポリメタクリル酸−２−ヒドロキシエチル、（３）ポリアクリル酸−２−ヒドロキシエチル、（４）ポリビニルアルコール、（５）ポリアクリルアミド、（６）ポリメタクリルアミド、（７）ポリ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）、（８）ポリ−Ｎ，Ｎ−ジメチルメタクリルアミド、（９）ポリビニルピロリドン、（１０）アガロース、（１１）デキストラン、（１２）荷電性基が、一級、二級もしくは三級アミンを分子内に一種もしくは二種含む低分子アミン化合物に由来するポリマー鎖、（１３）荷電性基が、一級、二級もしくは三級アミンを反復単位の側鎖もしくは主鎖内に一種もしくは二種含むポリマー鎖、（１４）疎水性基がポリ（乳酸）、ポリグリコール酸、及び、ポリブチリックアシッドから選ばれるポリエステルに由来するポリマー、であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の酵素複合体の使用方法。
5. 前記使用方法において、親水性ポリマー鎖が、下記式（Ｉ）で表されるポリマーであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかの請求項記載の酵素複合体の使用方法。
   ［式中、Ｒ^ａは、水素、メチル基、アルデヒド基、アミノ基、カルボキシル基、マレイミド基、ｐ−トルエンスルホニル基またはビニルスルホニル基であり、Ｌ_１、およびＬ_２は、独立して、原子価結合またはリンカーを表し、ｎは、１〜２５００の整数であり、そしてＸは、Ｎ−もしくはＮ，Ｎ−モノもしくはジ−Ｃ_１−Ｃ_３アルキル置換アミノＣ_１−Ｃ_１２アルキル、反復単位が１〜２５００のオリゴもしくはポリ（Ｎ−もしくはＮ，Ｎ−モノもしくはジ−Ｃ_１−Ｃ_３アルキル置換アミノエチルメタアクリレート）鎖、主鎖に二級もしくは三級アミン基を有するポリアミンに由来する基またはオリゴもしくはポリマー鎖セグメントである。］
6. 前記使用方法において、親水性ポリマー鎖が、下記式（ＩＩ）で表されるポリマーであることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかの請求項記載の酵素複合体の使用方法。
   
   ［式中、ｍおよびｎは、独立して、１〜２５００の整数であり、ＲはＣ_１−Ｃ_３アルキル基である。］
7. 前記使用方法において、親水性ポリマー鎖が、下記式（ＩＩＩ）で表されるポリマーであることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかの請求項記載の酵素複合体の使用方法。
   
   ［式中、ｍ，ｎおよびｘは、独立して、１〜２５００の整数であり、Ｒ^１は水素またはメチル基であり、Ｒ^２はＣ_１−Ｃ_３アルキル基であり、Ｒ^３は水素またはＣ_１−Ｃ_５アルキル基である。］