KR20200034696A

KR20200034696A - 효소-금속 융합 나노플라워 및 이를 이용한 염료의 반복적 탈색 방법

Info

Publication number: KR20200034696A
Application number: KR1020200034870A
Authority: KR
Inventors: 산자이; 정성훈; 이정임; 이정걸
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2020-03-23
Filing date: 2020-03-23
Publication date: 2020-03-31
Also published as: KR102218520B1

Abstract

본 발명은 효소-금속 융합 나노플라워 및 이를 이용한 염료의 반복적 탈색 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 효소-금속 융합 나노플라워는 pH 및 온도 변화에 대해 높은 안정성을 나타내고, 우수한 저장 안정성 및 용매 및 억제제에 대한 내성을 나타내며, 염료의 반복적 탈색 효과가 우수하므로, 효소의 특성을 향상시키는 고정화 방법으로서 많은 산업 분야에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

효소-금속 융합 나노플라워 및 이를 이용한 염료의 반복적 탈색 방법{enzyme-metal hybrid nanoflowers and its application in repeated batch decolorization of dyes}

본 발명은 효소-금속 융합 나노플라워 및 이를 이용한 염료의 반복적 탈색 방법에 관한 것이다.

효소는 처리 조건이 온화하고 우수한 생분해성으로 인한 폐수발생을 감소시키는 등 친환경적 특성뿐만 아니라, 특정기질에만 반응하는 기질 특이성으로 인하여 각광받고 있다. 그러나 효소의 최적 조건 이외의 반응 조건에서 급격한 활성 저하가 나타나며, 반응 후 회수 및 재사용이 어렵고, 효소의 생산단가가 높아 실제 산업에 적용하는데 한계가 있다. 효소 고정화는 효소를 일정한 곳에 물리적으로 구속하여 계속, 반복적으로 촉매 활성을 나타낼 수 있도록 하는 방법으로 효소의 이용성과 안정성을 증가시키기 때문에 위와 같은 효소의 한계점을 극복할 수 있는 대안으로 각광받고 있다. 섬유 산업에서 효소 고정화에 대한 연구는 락카아제, 아밀라아제, 셀룰라아제 등을 고정화하여 바이오표백, 염료탈색 및 분해, 산업 폐수 처리, 세탁용 세제의 오염 제거 효과 향상 등의 적용 가능성에 대하여 보고되었다.

효소 고정화는 효소를 쉽게 회수하여 재이용할 수 있기 때문에 효소 반응공정의 경제성을 높여줄 수 있으며, 반응양식을 회분식 또는 연속식으로 다양하게 적용할 수 있다는 데 있다. 고정화된 효소는 반복 사용이 가능하고, 생성물과 효소의 분리가 용이하지만, 고정화되지 않은 효소에 비해 활성이 떨어지는 단점이 있다. 그러나 고정화된 효소는 무엇보다도 편리하게 다룰 수 있다는 점에서 다양한 상업적 적용이 가능하다.

일반적인 효소 고정화 방법은 물리적 흡착방법 또는 화학적 방법이다. 물리적 흡착방법은 주로 이온 교환(ion-exchange) 방법을 이용하는데, 이온 교환 방법은 비독성이라는 장점이 있으나 그 결합력이 약하다는 문제점이 있다. 또한 화학적 방법은 화학 반응에 의해 공유결합을 형성시켜 효소를 고정시키기 위하여 화학시약을 사용하는 것으로, 상기 방법은 가교 결합력이 강하기는 하지만 효소의 고정화를 위해 사용하는 시약의 독성때문에 식품 또는 의약 관련 산업에는 사용하기가 힘들다는 단점이 있다. 유기 혹은 무기담체에 효소를 결합시켜서 효소를 고정화하여 재사용과 연속처리 공정을 수행하는 효소고정화는 잘 알려져 있다. 유기물(예, 셀룰로스, 나일론, 폴리아크릴아미드)이 담체로서 불리한 이유는 기계적 안정성이 좋지 않으며, 용매에 의한 부식, pH와 이온 강도에 따르는 변화와 미생물에 의한 침해로 인하여 효소와의 결합이 파괴될 수 있기 때문이다. 따라서 효소가 흡착 혹은 공유적으로 흡착하는 무기물 담체가 제안되었는데, 결합 형태는 효소의 사용조건과 형태 및 기질의 특성에 따른다. 즉, 기질이 강한 염농도이면, 흡착된 효소의 불착이 일어나기 때문에 흡착법은 적용될 수 없으며, 효소의 공유결합이 우선한다. 담체의 표면은 효소의 결합을 유도하는 특이한 기능기를 포괄하여야 한다. 대부분 담체는 기능기를 포괄할 수 없기 때문에, 표면의 전처리가 필요하다. 공유결합에 의한 고정화는 담체의 표면과 효소를 결합제 혹은 교각으로 공유결합시키는 방법으로 담체를 표면처리하거나 효소에 작용기를 도입하여야 하며, 지지된 효소의 활성소가 차폐되지 않도록 하여야 한다.

본 발명자들은 효소를 고정화시키기 위한 방법을 연구하던 중, 효소-금속 융합 나노플라워의 형태가 효소를 고정화시키기에 유용하며, 이의 우수한 염료 탈색 효과를 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 효소-금속 융합 나노플라워를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 나노플라워의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 나노플라워를 이용한 염료의 반복적 탈색 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 효소가 고정화된, 효소-금속 융합 나노플라워를 제공한다.

또한, 본 발명은 효소 및 금속 수화물을 반응시키는 단계를 포함하는, 효소-금속 융합 나노플라워의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 효소-금속 융합 나노플라워를 이용한 염료 탈색 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 효소-금속 융합 나노플라워는 pH 및 온도 변화에 대해 높은 안정성을 나타내고, 우수한 저장 안정성 및 용매 및 억제제에 대한 내성을 나타내며, 염료의 반복적 탈색 효과가 우수하므로, 효소의 특성을 향상시키는 고정화 방법으로서 많은 산업 분야에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 라카아제-Cu₃(PO₄)₂·3H₂O 융합 나노플라워의 합성 및 가교결합을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 2a 내지 2d는 라카아제-금속 융합 나노플라워(2a 및 2b) 및 가교결합된 라카아제 융합 나노플라워(2c 및 2d)의 FE-SEM 이미지를 나타낸 도이다.
도 2e 및 2f는 FITC로 표지된 라카아제-금속 융합 나노플라워 및 라카아제 나노플라워의 CLSM 이미지를 나타낸 도이다.
도 3은 다양한 pH (a) 및 온도 (b) 값에서 유리(FE), 라카아제 나노플라워(NF) 및 라카아제-금속 융합 나노플라워(CL-NF)의 활성을 나타낸 도이다.
도 4는 유리(FE), 유리(FE), 라카아제 나노플라워(NF) 및 라카아제-금속 융합 나노플라워(CL-NF)의 25 ℃에서의 안정성(a), 4 ℃에서의 저장 안정성(b) 및 재사용성(c)을 상대 활성을 통해 나타낸 도이다.
도 5는 유리 라카아제 및 라카아제-금속 융합 나노플라워(CL-NF)의 기질 특이성(a), 용매(b) 및 억제제(c)에 대한 내성을 상대 활성을 통해 나타낸 도이다.
도 6은 라카아제-금속 융합 나노플라워를 이용한 (a) 브로모페놀블루, (b) CBBR-250 및 (c) 자일렌 시아놀의 탈색 프로파일, 및 사이클에 따른 탈색 효과(d)를 나타낸 도이다.

본 발명은 효소-금속 융합 나노플라워 및 이를 이용한 염료의 반복적 탈색 방법을 제공한다.

이하 본 발명에 관하여 상세히 설명한다.

먼저, 본 발명은 효소가 고정화된, 효소-금속 융합 나노플라워를 제공한다.

상기 나노플라워는 효소가 금속과 융합하여 나노복합체에 고정화된 것으로, 나노플라워 형태를 나타내며, 상기 효소는 바람직하게는 가교결합(cross-linking)을 통해 상기 나노플라워에 고정화될 수 있다.

상기 가교결합은 바람직하게는 글루타르알데히드, 3-아미노프로필트리에톡시실란(APTES), 카르보디이미드, 시아노 및 폴리에틸렌이민(PEI)에 의해 수행될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 글루타르알데히드에 의해 수행될 수 있다.

본 발명의 나노플라워는 평균 직경이 10 μm 이하일 수 있다.

상기 효소는 바람직하게는 라카아제(laccase) 효소일 수 있으나, 이에 한정하지 아니한다.

상기 금속은 Co, Cu, Fe, Mn, Ni, Zn 및 Pd로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으나 이에 한정하지 아니하며, 바람직하게는 Cu일 수 있다.

또한, 본 발명은 효소 및 금속을 반응시키는 단계를 포함하는, 효소-금속 융합 나노플라워의 제조방법을 제공한다.

상기 금속은 Co, Cu, Fe, Mn, Ni, Zn 및 Pd로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으나 이에 한정하지 아니하며, 바람직하게는 Cu일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 CuSO₄의 형태로 반응에 참여할 수 있다.

상기 제조방법은 상기 반응 후 가교결합 단계를 더 포함할 수 있으며, 바람직하게는 글루타르알데히드에 의해 가교결합될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 효소-금속 융합 나노플라워를 이용한 염료의 탈색 방법을 제공한다.

상기 염료의 탈색은 1회 내지 제15회 반복 가능한 것을 특징으로 하나, 이에 제한되지 않으며, 반복 사용에도 불구하고 높은 탈색 효율을 나타낼 수 있다.

상기 염료는 브로모페놀블루, CBBR 및 자일렌시아놀로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다.

상기 제조방법은 상기 나노플라워를 염료에 처리하는 단계를 포함한다.

이하 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예, 실험예 및 제제예를 제시한다. 그러나 하기 실시예, 실험예 및 제제예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 이에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

준비예 1. 재료 및 시약

ABTS(2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)), 2,6-디메톡시 페놀(2,6-DMP), 3,4-디히드록시-L-페닐알라닌(L-DOPA), 벤조퀴논, 황산구리, 페룰산, FITC(fluorescein isothiocyanate), 글루타르알데히드, 구아야콜, 라카아제 (from Trametes versicolor), p-페닐디아민, 피로갈롤, 및 톨루이딘은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. PBS 및 초순수는 Life Technologies, USA로부터 구입하였다. 브로모페놀 블루는 Shelton Scientific, Inc., USA로부터 구입하였다. CBBR-250 및 자일렌 시아놀은 BioShop Canada Inc., Canada로부터 구입하였다. 다른 모든 화학 물질은 분석 등급이었으며 더 이상의 정제 없이 사용되었다.

실시예 1. 효소-금속 융합 나노플라워의 합성 및 가교결합

라카아제-금속 융합 나노플라워의 합성 및 가교결합 방법을 도 1에 개략적으로 나타내었다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 0.05 내지 0.5 mg mL^-1의 다양한 농도의 라카아제를 함유한 5 mL의 PBS (10 mM, pH 7.4)를 4시간 동안 CuSO₄ (50 μL, 200 mM)와 혼합하여 24 시간 동안 항온 처리한 후 6.0 및 0.8 mM의 CuSO₄를 사용하여 각각 24시간 및 72시간 동안 4 ℃에서 배양하였다. 그 후 완충액(100 mM, pH, 7.0) 내 글루타르 알데하이드 0.1 M를 이용하여 4 ℃에서 4 시간 동안 배양함으로써 라카아제 나노플라워의 가교결합을 수행하여 라카아제-금속 융합 나노플라워(CL-NF)를 제조하였다.

대조군으로, 글루타르 알데히드에 의한 가교결합 후 합성된 라카아제 나노플라워(NF)를 제조하였다.

실시예 2. 활성 측정 방법

유리 라카아제, 라카아제 나노플라워(NF) 및 라카아제-금속 융합 나노플라워(CL-NF) 활성은 ABTS (1 mM) 산화를 이용하여 420 nm에서 흡광도를 측정함으로써 결정하였다.

실시예 3. 기기분석 방법

합성된 CL-NF의 형태는 필드방사 주사전자현미경(FE-SEM)에 의해 관찰하였다.

흡수 스펙트럼은 UV-Vis 분광광도계(Patel et al., 2016c)를 사용하여 기록하였다.

CL-NFs의 크기는 동적 광산란(DLS) 분석을 통하여 측정하였다.

FITC로 표지된 라카아제가 고정화된 NF의 공초점 레이저 스캐닝 현미경(CLSM) 이미지는 FV-1000 Olympus 공초점 현미경을 사용하여 얻었다.

실험예 1. 라카아제-금속 융합 나노플라워의 캡슐화 수율(EY) 및 상대 활성(RA)

상기 실시예 2와 같이, 0.25mg mL^-1의 라카아제를 사용하여 융합 나노플라워를 제조하였으며, 온도(4℃ 내지 25℃), Cu 농도(0.8, 2.0 및 6.0 mM) 및 배양 기간(24 및 72시간)에 따른 캡슐화 수율(Encapsulation yields; EY) 및 상대 활성( Relative activity; RA)을 계산하여 하기 표 1에 나타내었다. 여기서 캡슐화 수율 및 상대 활성은 하기 식을 이용하여 계산하였다.

EY = 고정화 효소량/초기 효소량×100

RA = 고정화 효소의 총 비특이적 활성/유리 효소의 총 비특이적 활성×100

합성 조건			라카아제
Cu (mM)	온도(℃)	배양 시간(h)	EY^a (%)	RA^b (%)
Cu (mM)	온도(℃)	배양 시간(h)	EY^a (%)	고정화 후	가교결합 후
0.8	4	24	61.7 ± 5.1	137 ± 12	141 ± 12
0.8	25	72	48.3 ± 4.6	128 ± 12	132 ± 11
2.0	4	24	78.1 ± 5.1	172 ± 16	204 ± 19
2.0	25	72	80.4 ± 5.8	104 ± 10	116 ± 11
6.0	4	24	65.0 ± 5.6	89.5 ± 7.9	91.9 ± 9.0
6.0	25	72	71.3 ± 5.5	50.1 ± 4.7	50.3 ± 5.0

표 1에 나타낸 바와 같이, EY와 RA는 각각 48.3 %에서 80.4 % 그리고 50.1 %에서 172 %까지 다양하였으며, 글루타르 알데히드에 의해 가교된 NF는 효소 효율의 18.6 % 향상을 가져왔다.

시험된 합성 조건 중, 4 ℃에서 24 시간의 배양시간을 갖는 2.0 mM의 Cu를 사용한 경우, 글루타르 알데하이드 가교결합 후 204 %의 최대 고정화 효율이 달성되었다. 하기 실험에서 이를 최적조건으로 설정하였다.

또한, 높은 농도의 Cu (6.0 mM)에서의 합성은 RA의 감소를 가져왔다. RA가 낮으면 고농도의 Cu에서 라카아제 활성이 억제될 가능성이 있음을 확인하였다.

상기 라카아제 고정화에 대한 EY 및 RA 결과는 본 발명의 합성 방법이 초음파 화학 합성법보다 더 효과적임을 나타낸다 (Batule et al., 2015).

또한, 상기 최적 조건 하에서 다양한 농도의 라카아제(0.05-0.50 mg)를 사용하여 라카아제-금속 융합 나노플라워를 합성하였으며, 이의 EY 및 RA를 하기 표 2에 나타내었다.

라카아제 (mg mL^-1)	EY^a(%)	RA^b (%)
라카아제 (mg mL^-1)	EY^a(%)	고정화 후	가교결합 후
0.05	87.0 ± 4.3	140 ± 13	147 ± 13
0.10	84.5 ± 4.4	151 ± 15	168 ± 15
0.25	78.1 ± 5.1	172 ± 16	204 ± 19
0.50	41.6 ± 3.7	128 ± 12	123 ± 11

표 2에 나타낸 바와 같이, 라카아제의 EY는 라카아제 농도가 0.05에서 0.5 mg mL^-1로 증가함에 따라 87.0 %에서 41.7 %로 감소하였고, 라카아제-금속 융합 나노플라워는 고정화 후 128-172 %의 범위에서 증진된 RA를 나타냈다.

반면, 글루타르 알데히드에 의한 가교결합 후 합성된 라카아제 나노플라워의 경우 단백질 0.25 mg mL^-1까지 RA의 204 % 향상이 관찰되었다. 단백질 농도가 0.50 mg mL^-1로 더 증가하면 RA가 128 %에서 123 %로 약간 감소함을 확인하였다.

실험예 2. 제조된 나노플라워의 특성 확인

제조된 나노플라워를 확인하기 위하여 FE-SEM 분석을 수행하였으며, 그 결과를 도 2a 내지 2d에 나타내었다.

도 2a 및 2b에 나타낸 바와 같이, 라카아제-금속 융합 나노복합체의 나노플라워 형태를 확인하였고, 도 2c 및 2d에 나타낸 바와 같이, 가교결합된 라카아제 융합 나노복합체의 나노플라워 형태를 확인하였다.

또한 FITC로 표지된 라카아제-금속 융합 나노플라워 및 라카아제 나노플라워의 CLSM 이미지를 확인하였으며, 그 결과를 도 2e 및 2f에 나타내었다.

도 2e 및 2f에 나타낸 바와 같이, 밝은 채널과 비교하여 녹색 채널의 고강도 FITC 색상을 통해 효율적인 라카아제 고정을 확인하였다.

또한, 다양한 pH 및 온도에서 유리 라카아제 및 고정화된 라카아제 나노플라워의 활성 프로파일을 확인하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3a에 나타낸 바와 같이, NF와 CL-NF의 최적 활성은 pH 3.0에서 최대 활성을 얻은 유리 라카아제와 달리, 3.5보다 높은 pH에서 관찰되었다. 구체적으로, NF는 유리 라카아제보다 3.5-7.0의 넓은 pH 범위에서 더 높은 잔류 활성을 유지하였으며, CL-NF는 유사한 조건 하에서보다 안정한 잔류 활성을 나타내었다. NF 및 CL-NF는 모두 pH 7.0에서 유리 효소보다 잔류 활성이 각각 9.0 및 17.1 배 더 높았다.

상기 결과와 유사하게, 도 3b에 나타낸 바와 같이, NF 및 CL-NF는 유리 효소와 비교하여 40-70 ℃의 상대적으로 높은 온도 범위에서 더 높은 잔류 활성을 유지하였다. 유리 NF 및 CL-NF 라카아제의 최적 온도 값은 각각 40 ℃, 45 ℃ 및 45 ℃였다. 라카아제 NF 및 CL-NF는 모두 70 ℃에서 유리 효소보다 각각 3.7 배와 11.8 배 높은 잔류 활성을 나타내었다.

실험예 3. 융합 NF의 운동학적 연구

25 ℃에서 유리, NF 및 CL-NF 라카아제의 최적 pH에서 운동 파라미터(겉보기 Km 및 Vmax)를 결정하기 위하여 Michaelis-Menten 모델을 사용하였으며, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다. 운동 파라미터는 25 ℃에서 ABTS (0.005-2.0 mM)를 사용하여 비선형 회귀 (Prism 5, Graphpad Software, USA)를 통해 얻었다(Patel et al., 2016a).

라카아제	K _m(mM)	V _max(μmol min^-1 mg protein^-1)	k _cat K _m ^-1(s^-1M¹)
Free	29.3 ± 2.2	1890 ± 30	71.0 ± 5.2
NF	22.9 ± 1.1	3140 ± 30	151 ± 10
CL-NF	27.0 ± 1.6	3770 ± 40	154 ± 11

표 3에 나타낸 바와 같이, 유리 라카아제는 각각 29.3 mM과 1890 μmol min-1 mg protein-1의 Km과 Vmax 값을 나타내었고, NF는 각각 22.9 mM과 3140 μmol min-1 mg protein-1의 값을 나타내었다. 가교결합 후, Km 및 Vmax의 값은 각각 21.3 mM 및 3770 μmol min-1 mg protein-1이었다.

전체적으로, 라카아제의 촉매 효율(k_cat Km^-1)은 유리 효소 값 71.0 s^-1 μM^-1에 대하여, 글루타르 알데히드에 의한 고정화 및 가교결합을 통해 2.2배 향상되었다.

상기 k_cat Km^-1 값의 향상은 물질 전달 한계, 유리한 입체 구조 및 NF의 높은 표면적을 극복하는 고정 효소의 협동 효과와 관련이 있다.

실험예 4. 라카아제-금속 융합 나노플라워의 안정성 및 재사용성

유리, NF 및 CL-NF의 실내 온도 (25 ℃) 및 보관 온도 (4 ℃)에서의 안정성 및 재사용성을 분석하기 위하여 상대 활성을 측정하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

먼저, 버퍼 용액(50 mM)에서 최적의 조건 하에 동량의 NF 및 CL-NF를 동등 배양한 후, 시료의 잔류 활성을 여러 간격으로 측정하였고 초기 활성은 100 %로 간주하여 안정성을 평가하였으며, 그 결과를 도 4a 및 4b에 나타내었다.

도 4a에 나타낸 바와 같이, NF는 25 ℃에서 10일간의 배양 후 유리 형태에 비해 유의하게 높은 안정성을 나타내었고, 놀랍게도, CL-NF는 최적 조건 하에서 잔류 활성의 86.2 %를 유지하는 반면, 유리 라카아제는 7 일간의 배양 동안 그 활성을 완전히 잃어버린 것을 확인하였다.

또한, 도 4b에 나타낸 바와 같이, 4 ℃에 60일간의 배양 후 유리, NF 및 CL-NF는 각각 3.8 %, 53.3 % 및 91.5 %의 잔류 활성을 유지하였고, NF 및 CL-NF는 유리 효소보다 잔류 활성이 14.0 및 24.1 배 더 높았다.

또한, NF 및 CL-NF 라카아제의 재사용성을 10 사이클 동안 표준 분석 조건 하에서 평가하였다. NF 또는 CL-NF는 원심 분리에 의해 회수한 후, 인산 완충액으로 2 회 세척한 후 다음 사이클에 사용되었고, 라카아제 초기 활동은 100 %로 간주하여 재사용성을 평가하였으며, 그 결과를 도 4c에 나타내었다.

도 4c에 나타낸 바와 같이, 5주기 후에 NF 및 CL-NF는 각각 85.8 %와 96.8 %의 잔류 활성을 나타내었고 잔류 활성은 재사용 10 사이클 후에 각각 41.2 %와 92.3 %로 더 감소되었으며, 가교결합 후 NF에 의해 약 2.2 배 더 높은 잔류 활성이 나타남을 확인하였다.

참고로, 이전에 sonochemical 방법(Batule at al., 2015)에 의해 합성된 라카아제 나노플라워는 5회의 재사용 사이클 후 RA의 60 %를 유지하였다. 이는 본 발명의 라카아제-금속 융합 나노플라워가 효소의 재사용 동안 높은 안정성을 유지하는데 효과적이라는 것을 의미한다.

실험예 5. 라카아제-금속 융합 나노플라워의 기질 특이성

라카아제 활성은 분석에 사용된 기질 유형에 따라 매우 다양하므로(Addorisio et al., 2013 and Kalyani et al., 2015), 본 발명의 라카아제-금속 융합 나노플라워의 기질 특이성을 확인하기 위하여, ABTS, 벤조퀴논, 2, 3, 4, 4, 5, 6, 6-DMP, L-DOPA, 페룰산, 구아야콜, p- 페닐 디아민, 피로갈롤 및 톨루이딘에 대하여 각각 최적의 분석 조건 하에서 유리 라카아제 및 CL-NF의 상대 활성을 측정하였으며, 그 결과를 도 5a에 나타내었다.

도 5a에 나타낸 바와 같이, CL-NF는 페놀 화합물에 대해 훨씬 더 높은 산화 전위를 나타냄을 확인하였다. 이는 페놀 화합물에 대한 바이오센서로서 이용될 수 있음을 의미한다.

실험예 5. 라카아제-금속 융합 나노플라워의 용매 및 억제제에 대한 내성

효소의 활성은 용매에 대하여 크게 영향을 받으므로(Kalyani et al., 2015 and Tavares et al., 2013), 유리 라카아제 및 CL-NF를 여러 수성 및 유기 용매(25 % v v-1)에 대하여 25 ℃에서 4 시간 동안 표준 분석 조건 하에 배양하여 상대 활성을 측정하였으며, 그 결과를 도 5b에 나타내었다.

도 5b에 나타낸 바와 같이, CL-NF는 유리 라카아제보다 각각 아세톤, n-부탄, 에탄올, 헥산 및 톨루엔 (25 %, vv-1)에 대해 15.3, 12.9, 14.0, 9.1 및 10.7보다 높은 내성을 나타내었다.

또한, L-시스테인, 디티오트레이톨(dithiothreitol), SDS 및 티오우레아와 같은 억제제의 존재는 활성 부위 변형을 통해 라카아제 활성을 가변적으로 억제할 수 있으므로(Lorenzo et al., 2005), L-시스테인 나트륨, 디티오트레이톨, SDS, 티오우레아를 포함하는 억제제(0.5 mM)가 라카아제 잔류 활성에 미치는 영향을 표준 분석 조건 하에서 확인하였으며, 그 결과를 도 5c에 나타내었다.

도 5c에 나타낸 바와 같이, 유리 라카아제 및 CL-NF는 각각 1.2-83.5 % 및 27.3-97.3 % 범위의 잔류 활성을 나타냈다. 전반적으로 CL-NF는 유리 라카아제보다 L- 시스테인, 디티오트레이톨, SDS 및 티오우레아에 대해 각각 6.8, 22.7, 1.2 및 2.0배 높은 내성을 보였다. 이는 CL-NF 라카아제가 저해제뿐만 아니라 유기 용매의 존재 하에서도 효과적으로 사용될 수 있음을 의미한다.

실험예 6. 라카아제-금속 융합 나노플라워를 이용한 반복 배치 조건에서 염료의 탈색

브로모페놀블루(λ_max = 592nm), CBBR-250(λ_max = 585nm) 및 자일렌시아놀(λ_max = 615nm)을 포함하는 합성염료(120 μg mL-1)의 탈색을 매개체인 ABTS (0.1 mM)의 존재 또는 부재 하에서 평가하였으며, 그 결과를 도 6a 내지 6c에 나타내었다. 먼저, 유리 라카아제 및 CL-NF를 진탕 조건에서 48시간 (100 rpm, 25 ℃) 동안 완충액 (50 mM)에서 120 μg mL^-1 농도의 염료를 사용하여 탈색을 측정하였다. 염료의 반복적인 탈색은 12시간의 배양 시간으로 10 사이클 동안 평가하였다. 매 사이클 후, CL-NF는 10분 동안 원심 분리(4 ℃)에 의해 회수되었고 후속 사이클에 사용되었다. 초기 탈색 효율은 100 %로 간주되었다.

도 6a 내지 6c에 나타낸 바와 같이, CL-NF는 각각 본래 색의 41.2 %, 73.2 % 및 73.0 %로 이들 염료를 효과적으로 탈색했다. 유리 라카아제는 탈색 효율이 각각 15.6 %, 36.0 % 및 21.6 %로 낮았다.

ABTS의 존재 하에서 CL-NF는 25.9 %, 52.7 % 및 44.2의 유리 효소 값과 비교하여 브로모 페놀블루, CBBR-250 및 자일렌시아놀의 최대 탈색 효율이 56.0 %, 91.3 % 및 93.5 % %였다. CL-NF의 높은 탈색 효율은 유리 라카아제에 비해 현저히 높은 안정성과 관련이 있다.

또한 이들 염료의 반복적인 배치 탈색을 24 시간 배양 기간 동안 평가하였으며, 그 결과를 도 6d에 나타내었다.

도 6d에 나타낸 바와 같이, 재사용 10회 후, CL-NF 라카아제는 브로모페놀블루, CBBR-250 및 자일렌시아놀에 대해 각각 76.2 %, 84.6 % 및 81.3 %의 탈색 효율을 나타냈다.

상기 실험예를 통해 확인한 바와 같이, 본 발명에 따른 효소-금속 융합 나노플라워는 pH 및 온도 변화에 대해 높은 안정성을 나타내고, 우수한 저장 안정성 및 용매 및 억제제에 대한 내성을 나타내며, 염료의 반복적 탈색 효과가 우수하므로, 효소의 특성을 향상시키는 고정화 방법임을 알 수 있다.

Claims

(a) 0.25 mg/mL의 라카아제가 포함된 PBS(10 mM, pH 7.4)에 2.0 mM의 CuSO₄를 첨가하여 4 ℃에서 24 시간 동안 라카아제와 구리(Cu)를 반응시키는 단계; 및
(b) 0.1 M의 글루타르알데히드를 사용하여 4 ℃에서 4 시간 동안 가교결합을 수행하는 단계로 제조되며, 1-10회 재사용 가능한 라카아제-구리(Cu) 융합 나노플라워를 포함하는, 브로모페놀블루, CBBR-250 (Coomassie Brilliant Blue R-250) 및 자일렌시아놀 탈색용 조성물.
(a) 0.25 mg/mL의 라카아제가 포함된 PBS(10 mM, pH 7.4)에 2.0 mM의 CuSO4를 첨가하여 4 ℃에서 24 시간 동안 라카아제와 구리(Cu)를 반응시키는 단계;
(b) 0.1 M 의 글루타르알데히드를 사용하여 4 ℃에서 4 시간 동안 가교결합을 수행하여 라카아제-구리(Cu) 융합 나노플라워를 제조하는 단계;
(c) 상기의 나노플라워를 브로모페놀블루, CBBR-250 (Coomassie Brilliant Blue R-250) 및 자일렌시아놀의 염료에 처리하여,상기 브로모페놀블루 염료에서 50 내지 55%의 탈색 효율, CBBR-250 (Coomassie Brilliant Blue R-250)염료 및 자일렌시아놀 염료에서 90 내지 95%의 탈색 효율을 나타내는 단계;및
(d) 상기 단계 (c)의 나노플라워를 1-10 회 재사용하는 단계;를 포함하는 브로모페놀블루, CBBR-250 (Coomassie Brilliant Blue R-250) 및 자일렌시아놀의 탈색 방법.