KR20230148585A

KR20230148585A - 생체적합성 코어-셸-구조의 Si-기반 NiO 나노플라워, 그의 제조 방법 및 항암제

Info

Publication number: KR20230148585A
Application number: KR1020220047530A
Authority: KR
Inventors: 이도남; 권기학; 이선화
Original assignee: 광운대학교 산학협력단
Priority date: 2022-04-18
Filing date: 2022-04-18
Publication date: 2023-10-25

Abstract

나노 크기의 입자에 비해 코어-셸-구조의 나노 플라워는 표면적이 높고 꽃과 같은 구조로 되어 있어 생리활성 물질로서 큰 주목을 받고 있다. 본 연구에서는 코어-셸-구조의 NiO 나노플라워인 Si@NiO를 변형된 화학욕 증착법으로 제조한 후 열환원하였다. 합성물의 결정 형태 및 기본 구조는 분말 X선 회절(PXRD), 푸리에 변환 적외선 스펙트럼(FT-IR), 주사전자현미경(SEM), 투과전자현미경(TEM), 비표면적(BET) 및 다공성 분석(BJT) 및 유도 결합 플라즈마 발광 광학 분광기(ICP-OES)로 특징이 식별된다. Si@NiO 나노플라워의 전기화학적 특성은 코어-셸 나노플라워 표면에 존재하는 금속 이온과 아스코르브산의 산화환원 반응을 통해 조사되었다. 이 반응은 활성산소 종의 형성을 유리하게 했다. Si@NiO 나노플라워는 인간 유방암 세포주(MCF-7)와 쥐 배아섬유아세포주(MEF)에 대해 각각 우수한 항암 활성과 낮은 세포독성을 보여, Si@NiO 나노플라워의 항암 활성은 방출된 금속 이온보다는 주로 표면의 금속 이온의 산화 용량에서 파생된 것으로 나타났다. 따라서 이는 Si 기반의 NiO 나노플라워가 치료 응용에 유망한 후보로 작용할 수 있음을 증명한다.

Description

생체적합성 코어-셸-구조의 Si-기반 NiO 나노플라워, 그의 제조 방법 및 항암제{Biocompatible Core-Shell-Structured Si-Based NiO Nanoflowers, Making Method For The Same and Anticancer Agent}

본 발명은 생체적합성 코어-셸-구조의 Si-기반 NiO 나노플라워, 그의 제조 방법 및 항암제에 관한 것이며, 보다 상세하게는 인간 유방암 세포주(MCF-7)와 쥐 배아섬유아세포주(MEF)에 대해 각각 우수한 항암 활성과 낮은 세포독성을 보여, Si@NiO 나노플라워의 항암 활성은 방출된 금속 이온보다는 주로 표면의 금속 이온의 산화 용량에서 파생되며, Si 기반의 NiO 나노플라워가 치료 응용에 유망한 후보로 작용하게 하는 생체적합성 코어-셸-구조의 Si-기반 NiO 나노플라워, 그의 제조 방법 및 항암제에 관한 것이다.

암은 비정상적인 세포 성장과 관련된 질병으로 신체의 다른 부분으로 전이될 수 있다. 전세계적으로 암 관련 사망자는 심혈관 질환 관련 사망자에 이어 두 번째이지만, 전세계적으로 가장 중요한 건강 문제로 꼽힌다. 암 치료를 위한 기존의 약물과 진단은 표적 부위의 흡수가 잘 되지 않고, 반복 투여가 필요하며, 높은 용량 투여와 관련이 있다.

따라서 전단계 암에서 적절한 진단을 보장하기 위해 효과적인 약물 투여와 암 치료법을 위해 새롭고 개선된 기술이 필요하다. 현재 의료 기관과 연구진은 효과적인 암 치료법을 개발하기 위해 협력하고 있다.

나노테크놀로지 기반의 약물 시스템과 암 치료법은 일반적으로 크기가 10~1000 nm인 나노입자(NP)에 기초하고 있으며, 리포좀, 미셀, 덴드리머, CNT, 퀀텀닷 및 기타 복합물질에 기반한 다양한 나노기술은 약물의 효능을 높이고 소수성 약물의 용해성을 향상시키고 약물 방출을 적절히 통제한다.

나노입자는 약물 독성 및 생물 분포 측면에서 벌크 물질과 다른 독특하고 유리한 특성을 가지고 있다. 나노기술은 그 뛰어난 특징 때문에 암 치료의 새로운 해결책으로 떠올랐다.

그러나 나노입자의 작은 크기는 간, 비장, 폐를 포함한 장기에 비특이적으로 축적되어 세포독성을 초래하기 때문에 때때로 부작용을 일으킬 수 있다. Dosil, Egirard, Abraxanes, Genexol PM, Onivyde를 포함한 다양한 나노 약물이 FDA에 의해 승인되었지만, 이로 인해 암 치료에 다양한 나노입자를 광범위하게 적용하는 데 방해가 되었다.

치료를 위해 생체 재료로서의 Ag, Au, Pt 나노입자를 포함한 귀금속 나노입자의 적합성이 집중적으로 연구되었다. 한편, CuO, ZnO, TiO₂, NiO와 같은 금속 산화물은 항균 활성이 양호한 새로운 대안으로 소개되었다. 특히 ZnO 나노입자는 암세포에 독성이 있기 때문에 암치료에 널리 사용되고 있으나, 고용량에서는 높은 세포 독성을 보인다.

히스티딘의 메틸화는 방광암 T-24 세포에 대한 저용량에서 항암 활성을 증가시켰고, 낮은 농도의 ZnO에서 독성이 낮은 새로운 후생 메커니즘을 발견했다. 또한, Fe, Co 및 Ni를 포함하는 금속 산화물 나노입자는 광촉매, 약물 전달, 촉매, 자기 공명 영상 및 암 치료와 같은 다양한 분야에서 이용될 수 있는 고유한 광학, 전자 및 물리 화학적 특성 때문에 큰 관심을 끌고 있다.

나노 기술에서 입자 크기와 형태학은 의약품 적용의 효능을 결정하는 데 매우 중요하다. NiO 나노입자는 항암 활성을 보이는 다른 금속산화물에 비해 금속이온 방출, 높은 표면적 대 체적비, 향상된 흡착력, 낮은 독성 등 고유한 특성으로 인해 세포독성 효과가 우수하다.

나노스피어나 나노로드와 같은 나노구조와 비교하여 꽃잎의 모양이 다양한 나노플라워와 같은 구조는 높은 표면적을 제공한다. 그러나 문헌 조사에 따르면 항암 시약으로 금속산화물 기반 나노플라워를 조사한 연구는 극히 일부에 불과하며, 이에 관한 연구 개발이 필요한 실정이다.

대한민국 공개특허공보 제2020-0034696호 대한민국 공개특허공보 제2021-0062599호 대한민국 공개특허공보 제2013-0016933호

Cho, K.; Wang, X.; Nie, S.; Chen, Z.G.; Shin, D.M. Therapeutic nanoparticles for drug delivery in cancer. Clin. Cancer Res. 2008, 14, 1310-1316. Maeda, H. The enhanced permeability and retention (EPR) effect in tumor vasculature: The key role of tumor-selective macromolecular drug targeting. Adv. Enzym. Regul. 2001, 41, 189-207. Allen, T.M.; Cullis, P.R. Liposomal drug delivery systems: From concept to clinical applications. Adv. Drug Deliv. Rev. 2013, 65, 36-48.

본 연구에서는 높은 항암 활성과 낮은 세포 독성을 보이는 새로운 꽃 모양의 NiO 나노입자를 탐구하였다. 코어-쉘-구조의 Si 기반의 NiO(Si@NiO) 나노플라워는 변형된 화학 증착 방법으로 제조되었으며, 그 후 열적 환원이 이루어졌다.

이들의 물리적 및 전기화학적 특성은 다양한 현미경, 분광 및 전기화학적 기술을 사용하여 조사되었다. Si@NiO 나노플라워의 치료 잠재력은 Si@NiO의 존재 하에서 인간 유방암 세포주 MCF-7의 생존가능성과 쥐 배아섬유아세포(MEF)에 대한 Si@NiO의 세포독성을 시험함으로써 조사되었다. 이하에서는 Si@NiO의 잠재적 치료 특성과 그 항암 메커니즘을 제시하였다.

본 발명의 일 실시형태인 생체적합성 코어-셸-구조의 Si-기반 NiO 나노플라워의 제조 방법은, Si 나노입자를 물 및 에탄올이 혼합된 비커에 분산시켜 1시간 내지 3시간 동안 초음파 처리하여 제1 용액을 제조하는 제1 단계; Ni(CH₃COO)₂·4H₂O 및 과산화수소이황산칼륨을 물 및 에탄올을 함유한 비커에 용해시켜 제2 용액을 제조하는 제2 단계; 상기 제1 용액을 용액 2과 혼합하여 제3 용액을 제조하는 제3 단계; NH₄OH를 탈이온수에 희석하여 교반하고 상기 용액 3에 추가하여 30분 내지 1시간 반응하는 제4 단계; 상기 제4 단계에서 발생한 침전물을 탈이온수로 세척하여 흡착이온인 SO₄ ^2-, K⁺, Ni²⁺ 및 CH₃COO^-을 제거하는 제5 단계; 상기 제5 단계에서 얻어진 갈색의 Si@NiOOH 나노플라워를 40℃ 내지 80℃에서 5시간 내지 7시간 건조하는 제6 단계;를 포함한다.

상기 제6 단계에서 건조된 Si@NiOOH 나노플라워를 1℃ min^-1 내지 3℃ min^-1 의 가열 속도로 최대 350℃의 온도까지 아르곤 흐름 하에서 가열하여 NiO 코팅된 Si(Si@NiO)로 변환하는 제7 단계;를 더욱 포함한다.

상기 제1 단계의 Si 나노입자의 직경은 50nm 내지 100nm 인 것을 사용한다.

상기 제2 단계의 Ni(CH₃COO)₂·4H₂O 및 과산화수소이황산칼륨의 혼합 비율은 질량비로 1:0.1 내지 0.3인 것을 사용한다.

상기 NiO의 셸의 두께는 10 nm 내지 30 nm 인 것을 사용한다.

본 발명의 일 실시형태인 생체적합성 코어-셸-구조의 Si-기반 NiO 나노플라워는, Si 나노입자의 코어는 구형의 형상으로 그 직경은 50nm 내지 100nm 이며, NiO의 셸은 플라워 형상으로 두께는 10 nm 내지 30 nm 인 것을 사용한다.

상기 Si는 (111), (220), (311), (400), (331), (331) 격자 구조를 갖으며 2θ의 피크는 28.3°, 47.2°, 55.9°, 75.7°, 87.9°에서 관측되며, 상기 NiO는 (111), (200), (220) 격자 구조를 갖으며 2θ의 피크는 37.1°, 43.4°, 62.6°에서 관측된다.

또한, 실리콘 함량은 70 중량% 내지 80 중량%인 것을 사용한다.

여기서, Si@NiO에 대한 N₂ 흡착 곡선은 상대압력(P/P^o) 0.5 내지 1 범위에서 이력 루프를 나타내며, NiO의 쉘을 형성한 후 Si@NiO가 메조포어화되는 것을 사용한다.

한편, Si@NiO의 마이크로포어 부피(Vmicro)는 0.008cm³/g 내지 0.03cm³/g, 메조포어 부피(Vmeso)는 0.5 cm³/g 내지 0.6 cm³/g, 비표면적(SBET)은 200 m²/g 내지 220 m²/g, 평균 기공 크기는 6 nm 내지 7 nm인 것을 사용한다.

나아가, Si@NiO의 분해는 25℃에서 0.9중량% 식염수 1mg/mL 농도에서 방출된 Ni(II) 이온의 농도는 6시간 7 내지 9ppm, 48시간 후 18ppm 내지 20ppm인 것을 사용한다.

본 발명의 일 실시형태인 생체적합성 코어-셸-구조의 Si-기반 NiO 나노플라워을 함유하는 항암제는 Si@NiO 농도 25 내지 200μg/mL에서 MCF-7 암 세포군의 20% 내지 62%가 사멸하는 것을 사용한다.

또한, Si@NiO 농도 0 내지 100μg/mL에서 MEF 정상 세포군의 생존성은 90% 이상인 것을 사용한다.

본 발명의 일 실시형태인 생체적합성 코어-셸-구조의 Si-기반 NiO 나노플라워을 사용하여 MCF-7 암 세포군을 사멸하는 방법은, Si@NiO 농도 0 μg/mL 내지 100 μg/mL에서 MEF 정상 세포군의 생존성은 90% 이상을 유지하며, Si@NiO 농도 25 μg/mL 내지 200 μg/mL에서 MCF-7 암 세포군의 20% 내지 62%가 사멸한다.

본 발명에 의하면, 생체적합성 코어-셸-구조의 Si-기반 NiO 나노플라워의 합성물의 결정 형태 및 기본 구조는 분말 X선 회절(PXRD), 푸리에 변환 적외선 스펙트럼(FT-IR), 주사전자현미경(SEM), 투과전자현미경(TEM), 비표면적(BET) 및 다공성 분석(BJT) 및 유도 결합 플라즈마 발광 광학 분광기(ICP-OES)로 특정될 수 있다.

여기서, Si@NiO 나노플라워는 인간 유방암 세포주(MCF-7)와 쥐 배아섬유아세포주(MEF)에 대해 각각 우수한 항암 활성과 낮은 세포독성을 보여, Si@NiO 나노플라워의 항암 활성을 갖고, Si 기반의 NiO 나노플라워가 치료 응용되는 효과를 갖는다.

도 1은 Si@NiO 나노플라워의 합성 개략도를 나타낸다.
도 2는 Si 나노입자 및 Si@NiO 나노플라워의 SEM 및 TEM 이미지를 나타낸다.
도 3은 Si 나노입자 및 Si@NiO의 사진을 나타낸다.
도 4는 Si 나노입자 및 Si@NiO의 PXRD 패턴을 나타낸다.
도 5는 Si 나노입자 및 Si@NiO의 FT-IR 스펙트럼을 나타낸다.
도 6은 Si NP 및 Si@NiO의 대기에서의 TGA 곡선을 나타낸다.
도 7은 Si 나노입자 및 Si@NiO 나노플라워의 N₂ 흡착탈착 등온선을 나타낸다.
도 8은 BJH법에 기초한 Si NPs 및 Si@NiO의 기공 크기 분포를 나타낸다.
도 9는 0.1M AA를 포함하는 PBS에서 획득한 Si NP 및 Si@NiO의 CV 곡선을 나타낸다.
도 10은 Si@NiO 나노플라워로부터의 금속 이온 방출을 나타낸다.
도 11은 24 시간 배양 후 MEF 및 MCF-7 세포에 대한 Si@NiO의 세포독성을 나타낸다.
도 12는 MEF 및 MCF-7 세포에서의 Si@NiO의 IC₅₀ 값을 나타낸다.
도 13은 다양한 농도의 Si@NiO를 24 시간 배양 후 MEF 및 MCF-7 세포에서의 생사 염색 이미지를 나타낸다.

이하에서는 도면을 참고하여 본 발명의 바람직한 실시 예를 설명한다. 이하에서 설명하는 바람직한 실시 예는 해당 기술 분야의 통상의 지식을 가진 사람이라면 본 발명의 기술적 사상의 범위에서 다양하게 설계를 변경될 수 있다.

1. 재료 및 방법

1.1. Si@NiO 나노플라워의 합성

Si@NiO 나노플라워 합성은 앞서 보고된 바와 같이 화학욕 증착법(CBD)과 후속된 환원 가열에 의해 합성되었다. Si@NiOOH 나노플라워를 합성하기 위해 시그마-아드리치사(St. Louis, MO, USA)에서 구입한 플라즈마 합성 Si 나노입자(20mg, 입자 크기: 50~100nm, 순도 99%)를 물(4 mL)과 에탄올(2 mL)이 혼합된 비커에 분산시켜 2시간 동안 초음파 처리하였다(용액 1). Ni(CH₃COO)₂·4H₂O(0.25g)와 과산화수소이황산칼륨(0.05g)을 물(4mL)과 에탄올(2mL)을 함유한 비커에 녹였다(용액 2). 용액 1은 200rpm에서 자기교반 하에 용액 2와 혼합되었다(용액 3). NH₄OH(28~37중량%, 0.2 mL)를 탈이온수(10 mL)에 희석하여 교반하여 용액 3에 한 방울씩(초당 1방울) 추가하였다. 황색 용액은 몇 분 후에 서서히 어두워졌다. NH₄OH 첨가 후 30분간 반응이 지속되었으며, 침전물을 다량의 탈이온수로 세척하여 흡착이온(SO₄ ^2-, K⁺, Ni²⁺, CH₃COO^-등)을 제거하였다. 얻어진 갈색 Si@NiOOH 나노플라워를 60℃에서 6시간 동안 오븐에서 건조시켰다. 건조된 Si@NiOOH 나노플라워는 2 ℃min^-1의 가열 속도로 최대 350℃까지 아르곤 플로우 하에서 가열하여 NiO 코팅된 Si(Si@NiO)로 변환되었다. 샘플은 온도 조절 프로그램을 사용하여 가열된 후 주변 온도로 자연 냉각되었다.

1.2. Si@NiO 나노플라워의 특성

Si 나노입자와 Si@NiO 나노플라워의 형태는 10 kV의 가속전압으로 주사전자현미경(SEM; Hitachi SU8230, Hitachi High-Tec, Tokyo, Japn)과 투과전자현미경(TEM; Tecnai G2F20 TWIN TMP, FEI, 미국 오리건주 힐스보로)으로 식별 가능하다. Si 나노입자 및 Si@NiO 나노플라워의 분말 X선 회절(PXRD) 패턴을 Cu Kα 방사선과 Ni 필터가 있는 회절계(SmartLab, Rigaku, Japan Tokyo)를 이용하여 기록하였다. 회절계의 X선 튜브 내 전압과 전류는 각각 40 kV와 30 mA로 유지되었으며, 패턴은 4°/min의 스캔 속도와 0.02°의 간격으로 획득되었다. 푸리에 변환 적외선(FT-IR) 스펙트럼은 KBr 펠릿을 사용하여 바이오-라드사의 FTS 135 분광계(Hercules, CA, USA)에 기록되었다. 열 특성은 열중량분석기(TGA, TG 209 F3 Tarsus, NETSCH, Selb, Germany)로 평가되었다. 표본의 비표면적은 3FLEX 표면 특성 분석기 및 물리 흡착 분석기(Micromeritics, Atlanta, Goergia, USA)를 사용하는 브루나우어-에메트-텔러(BET) 방법을 사용하여 -196℃에서 측정되었다. 기공 크기 분포는 Barrett-Joyner-Halenda(BJH) 방법을 사용하여 흡착 분기에서 측정되었다.

1.3. Si@NiO 나노플라워의 전기화학적 특성

Si@NiO 샘플을 작업 전극으로 하는 유리상 탄소 전극(GCE), 포화 KCl을 기준 전극으로 하는 Ag/AgCl, 대향 전극으로 Pt 와이어를 사용하여 25℃로 전기화학적 특성을 측정하였다. 재료 잉크는 Si@NiO 4 mg과 5% Nafion 용액(Sigma-Aldrich사) 0.1 mL를 혼합하여 제조하였다. 잉크를 GCE에 방울로 떨어뜨렸다. 순환 전압-전류법(CV) 측정은 0.01M의 아스코르브산(AA)이 함유된 인산염 완충 식염수(PBS)에서 스캔 속도 100 mV/s, 전압 창 0.0~1.0V로 수행되었다.

1.4. Si@NiO 나노플라워로부터의 금속 이온 방출

대두카제인소화한천(TSA) 플레이트의 Si@NiO 나노플라워로부터의 금속 이온 방출을 테스트했다. Si@NiO(1mg)를 0.9% 식염수(1mL)에 첨가하고 25℃에서 6~48 시간 동안 교반하였다. 이 용액은 25℃, 5000 rpm에서 5분간 원심분리하여 상등액을 반응 튜브에서 분리하였다. 샘플에서 방출된 금속 이온은 유도 결합 플라즈마 광학 발광 분광법(ICP-OES, ICAP 7400 ICP-OES Duo, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)을 사용하여 확인되었다.

1.5 세포 배양

인간 유방암 세포주(MCF-7)와 쥐 배아섬유아세포주(MEF)는 10% 열불활성 소태아혈청, 100 unit/mL 페니실린과 100 ㎛/mL 스트렙토마이신(Invitogen, Carlsbad, CA, USA)을 함유한 고글루코스 둘베코 수정배지(DMEM, Gibco Laboratories, Grand Island, NY, USA)에서 5% 이산화탄소를 포함하는 대기에서 37℃로 배양되었다. 배지는 이틀에 한 번씩 교체되었고, 세포는 트립신으로 소화되었고 합류하기 전에 새로운 배지에 다시 현탁되었다.

1.6. 시험관내 항암 활성

MTT(3-(4,5-dimethylthiazon-2-yl)-5-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) 분석에서 MTT(3-4,5-2-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltertrazolium bromide)와 유사한 세포 생존성을 정량적으로 측정하였다. MCF-7과 MEF는 DMEM 배치에서 96-웰 플레이트(웰당 2×10 ⁴ 세포)에 분주되었다. 12시간 후 배지는 다양한 농도의 Si@NiO(0~200 μg/mL)를 함유한 신선한 배지 200 μL로 대체하였다. 24시간 배양 후 Si@NiO 함유 배지를 조심스럽게 제거하고 PBS로 두 번 세척하였다. MTS 세포 증식 분석 키트 용액(20 μL)과 신선한 배지(200 μL)를 웰에 각각 첨가하였다. 4시간 추가 배양 후 마이크로플레이트 리더(Synergy H1, BioTek, Winuski, VT, USA)를 사용하여 490 nm에서 흡광도를 측정했다. 증식세포의 수는 세포의 표준 곡선을 이용하여 정량화하였다. 또한 세포 생존성은 살아있는 세포와 죽은 세포가 각각 녹색과 적색 형광으로 식별된 생사분석기(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA)을 사용하여 정량적으로 분석되었다. 이를 위해 MCF-7과 MEF는 웰당 5×10⁴ 세포의 밀도로 48-웰 플레이트에 분주되었다. 12시간 후 배지는 다양한 농도의 Si@NiO(0~200 μg/mL)를 함유한 신선한 배지 200 μL로 대체하였다. 24시간 배양 후 PBS로 세포를 헹군 후 4μM Calcein-AM과 2μM ethidium homodimer-1(EtBr-1)을 포함한 PBS에서 30분간 배양하였다. PBS로 세척한 후 역형광 현미경(IX83, Olympus, Center Valley, PA, USA)을 사용하여 염색 세포를 관찰하였다. 세포의 생존가능성은 총 세포수에 대한 살아있는 세포의 비율을 계산하여 정량화하였다.

1.7. 통계 분석

모든 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표현되며, 실험은 최소 3회 이상 수행되었다. 통계적으로 유의한 차이는 t-test를 사용하여 평가되었으며 통계적 유의성은 (*) p < 0.05, (**) p < 0.01 및 (**) p < 0.001이었다.

2. 결과와 토론

2.1. Si@NiO 나노플라워의 제조

Si@NiO 나노플라워는 도 1과 같이 제조되었다. CBD 동안 Si 나노입자는 다공성 꽃 모양의 NiOOH 껍질(즉, Si@NiOOH)에 봉입되었고, 이후 다공성 꽃 모양의 NiO 껍질로 환원되어 아르곤 흐름 하에서 350℃에서 약한 가열로 Si@NiO를 생성하였다. SEM 및 TEM 이미지는 Si 나노입자가 평균 크기가 100nm인 구형인 반면, Si@NiO는 꽃과 같은 코어-쉘 구조(도 2)를 가지고 있었으며, Si 코어는 얇은 나노플라워와 같은 NiO 껍질로 균일하게 덮여 있었다. 표면에 열린 꽃잎 구조를 가진 꽃과 같은 모양은 더 많은 어닐링 후에도 안정적이고 잘 유지되었다. 앞서 보고한 바와 같이, 쉘 레이어는 TEM에 의해 관찰된 10-30 nm의 균일한 두께를 가지고 있었다 (도 2, 하단).

2.2. Si@NiO 나노플라워의 특성

도 3과 같이 Si 나노입자의 밝은 갈색은 Si 기질을 연속적으로 열처리한 후 짙은 갈색으로 변하여 Si@NiO를 형성하였다. 꽃과 비슷한 Si@NiO 종은 Si 나노입자가 다공성으로 감싼 코어-쉘 구조로 구성되었다. 도 2의 SEM 및 TEM 이미지에서 NiO 시트 확인할 수 있다. Si 나노입자와 Si@NiO의 PXRD 패턴과 FT-IR 스펙트럼이 기록되었다. 도 4와 같이 고강도 회절 피크는 Si(111), (220), (311), (400), (331), (331) 의 격자 구조에 해당하는 28.3°, 47.2°, 55.9°, 75.7°, 87.9°의 2θ 값에서 각각 관측되었으며, 추가 피크는 37.1°, 43.4°, 62.6°의 2θ 값에서 관측되었고, 각각 코팅된 NiO (111), (200), (220)에 대응한다(JCPDS 카드 번호 #47-1049). Si@NiO의 FT-IR 스펙트럼(도 5)은 각각 Ni-O 스트레칭(NiO)과 Si-O 스트레칭(SiO2)에 해당하는 685cm^-1과 1644cm^-1에서 피크를 나타낸다. Si@NiO는 Si 나노입자에서 잘 합성된다는 것을 의미한다. TGA는 Si 나노입자와 Si@NiO의 열 안정성을 조사했으며, Si@NiO는 실리콘 함량이 78.6 중량%로 높은 것으로 나타났다(도 6).

2.3. 기공 구조의 특성

-196℃에서 얻어진 N₂ 흡착-탈착 등온도로부터 Si 나노입자와 Si@NiO 나노플라워의 기공 구조와 표면적이 평가되었다. BET법을 사용하여 마이크로포어 부피(V_micro), 메조포어 부피(V_meso), 비표면적(S_BET)을 계산하고, BJH법을 사용하여 흡착 분기에서 평균 기공 크기를 측정하였다. N₂ 흡착-탈착 등온도와 대응하는 기공 크기 분포 곡선은 각각 도 7 및 도 8과 같다. Si@NiO에 대한 N₂ 흡착 곡선은 0.5에서 1(P/P^o)까지의 이력 루프를 나타내며, NiO 꽃잎 층과 쉘을 형성한 후 Si@NiO가 고도로 메조포어화됨을 나타낸다. 반대로 Si 나노입자는 N₂ 흡착이 미미하고 평균 기공 크기(0.56nm)가 낮아 기공률이 낮았다. 표 1과 같이 Si 나노입자를 코팅하여 Si@NiO를 형성한 후 V_micro, V_meso, S_BET 및 평균 기공 크기가 크게 증가하였다. 특히 Si@NiO의 표면적은 Si 나노입자 및 다른 흡수제(MoS₂, TiO₂)와 비교하여 세포막에 쉽게 부착할 수 있는 보다 유리한 위치를 제공할 것으로 예상할 수 있다.

2.4. 전기화학적 특성

Si@NiO의 CV 곡선은 0.1M AA(C₆H₈O₆)를 포함하는 PBS에서 Ag/AgCl 기준 전극을 사용하여 0.0~1.0V의 전위 범위에서 100mVs^-1의 스캔 속도로 구했다. Si@NiO의 Ni(II) 중심은 AA와의 산화환원 반응에 관여한다:

Ni²⁺ + C₆H₈O₆(AA) → Ni + 2H⁺ + C₆H₆O₆

Si@NiO와 Si 나노입자 모두 AA와의 산화환원 반응에서 쉽게 산화되었고, 양극의 산화환원 전류는 낮은 포텐셜에서 Si 나노입자에 대한 것보다 Si@NiO에 대해 더 높았다(도 9). AA에 의해 Si@NiO가 더 쉽게 환원됨에 따라, Si@NiO는 Si 나노입자보다 더 쉽게 활성산소종(ROS) 형성을 유도할 수 있었다.

[표 1] Si 및 Si@NiO의 마이크로포어 부피(Vmicro), 메조포어 부피(Vmeso), 비표면적(SBET), 평균 기공 크기(nm)

2.5. 이온 방출 테스트

ICP-OES를 이용하여 Si@NiO 나노플라워에서 방출되는 Ni 이온의 양을 측정하였다. Si@NiO 분해는 25℃에서 0.9% 식염수 1mg/mL 농도에서 6, 12, 24, 48시간 동안 시험하였다. Si@NiO에서 방출된 Ni(II) 이온의 농도는 6시간 8.01ppm에서 48시간 후 18.04ppm으로 증가했다(도 10). 방출된 양이 아주 적어서 Si@NiO는 0.9% 식염수에서 꽃과 같은 구조를 잘 유지하며 강인한 것으로 확인되었다.

2.6 항암 특성과 세포 독성

암 치료법의 가장 중요한 요구사항은 효능과 선택적 독성이다. 정상적인 세포에 영향을 주지 않고 암세포 사멸을 유도하는 약물의 능력은 효과적인 암 치료를 위한 핵심 요건이다. 금속산화물 나노플라워 표면의 활성 금속 이온은 산화를 통해 적극적으로 ROS 형성에 참여할 수 있기 때문에 암 치료제로서 잠재력이 크다. 또한 금속 이온 방출량이 충분히 높지 않기 때문에 항암 활성에 큰 영향을 주지 않는다. 그럼에도 불구하고 정상 세포와 암 세포에서 Si@NiO 나노플라워의 세포 독성을 측정하는 것이 중요하다. MCF-7 암 세포군과 MEF 정상 세포군은 시험관내 항암 검사에 사용되었다. MTS 검사 결과는 도 11에 나와 있다. 0~100μg/mL Si@NiO MEF가 존재하는 경우 MEF에 대한 명백한 독성 영향은 없었으며, 24시간 배양 후 세포 생존성이 90% 이상 높았다. 그러나, 높은 Si@NiO 농도 200μg/mL에서는 생존성이 67%로 떨어졌다. 이 농도에서 나노플라워는 MEF 세포에 내장되어 낮은 수준의 H₂O₂와 반응하여 영향을 미칠 수 있다. 중요한 것은 MCF-7 세포의 생존성이 저하되고 MCF-7 세포에 대한 Si@NiO의 항암 활성은 Si@NiO의 용량에 따라 유의미하게 증가하였다. 25, 50, 100, 200μg/mL의 Si@NiO 농도에서 암세포의 20%, 29%, 38%, 62%가 사멸하였다. Si@NiO의 절반 최대 억제 농도 값(IC₅₀)은 도 12와 같다. Si@NiO 나노플라워는 MEF 세포보다 MCF-7 세포에 유의하게 더 독성이 있으며, MCF-7 세포에 IC₅₀ 값이 147μg/mL이고, MCF-7 세포에 310 μg/mL이다. 또한 정상 세포와 암 세포에서 Si@NiO 나노플라워의 세포 독성을 재확인하기 위해 생사 분석을 수행했다. 0~100μg/mL Si@NiO 범위에서는 MEF에 대한 뚜렷한 독성 영향이 관찰되지 않았으며, 24시간 배양 후 생존성은 90% 이상이었다. 그러나, Si@NiO 농도가 200μg/mL로 높을 경우 정상세포의 생존가능성은 75%로 감소하였다. 또한, MCF-7 세포의 생존력은 Si@NiO의 용량에 따라 감소하였다. Si@NiO의 25, 50, 100 및 200μg/mL에서의 MCF-7 세포 생존력은 각각 81%, 73%, 49%, 35%였다. 이러한 관찰 결과는 MTS 검사 결과와 일치한다. 이는 초산화 음이온에서 유래한 생체계에 의해 O₂ 대사 중에 처음 생성된 ROS일 가능성이 높다. 일반적으로 암세포는 정상세포보다 유리기의 수치가 높으며, 이러한 현상은 암세포의 신진대사의 증가와 미토콘드리아 기능 장애와 관련이 있다. 암세포의 활성산소 생성 증가는 암세포의 발달, 증식, 전이와 함께 암세포가 화학요법에 저항하는 데 필요한 생화학적, 분자적 변화를 가져온다. 활성산소종을 암 세포 내에서의 세포 독성을 야기하는 수준으로 증가시키는 것은 활성산소에 의해 중재되는 세포자멸사 또는 암 세포 저항을 억제하여 암 세포를 제거하는 효과적인 방법이 될 수 있다. 따라서 금속산화물(NiO)의 표면에서 Ni(II)가 환원될 때 형성되는 ROS는 일반 세포보다 암세포에 대한 독성 영향을 더 많이 일으킨다. 상기 2.5에서 설명한 이온 방출 용량과 나노플라워 표면에서의 ROS의 원활한 형성을 고려할 때(상기 2.4), Si@NiO의 우수한 항암 활성은 Si@NiO에서 세포로 방출되는 금속 이온의 유입이 아닌 Si@NiO 나노플라워 표면에서의 금속 이온의 잠재적 산화 능력에서 비롯되거나 방출된 것으로 추측할 수 있다.

3. 결론

본 특허에서는 Si@NiO 나노플라워를 변형된 CBD 공정을 이용하여 새로운 항암제로 제조하였으며, 그 후 열환원하였다. 이들 나노플라워의 표면적, AA와의 산화환원반응, 금속이온방출특성, 형태학 등을 조사하였으며, 이들 매개변수를 바탕으로 합리적인 항암 활성을 증명하였다. CV 데이터는 산화제(즉, Si@NiO 나노플라워)에 의한 ROS 형성이 부분적으로 암세포 사멸에 기여할 수 있음을 시사했다. 암세포 사멸은 주로 나노플라워 표면이 암세포막과 직접 접촉하거나 나노플라워 표면의 Ni(II) 이온에 의해 형성된 ROS 종에 기인할 수 있다. 이 점에서 표면적이 높고 표면에 양전하를 띤 금속이 암세포 성장을 억제하는 결정적 요인이 될 수 있다. MCF-7 세포에 대한 상당한 항암 활성과 MEF 세포와의 높은 생체적합성은 암 치료 및 의약품에 대한 잠재적 응용을 시사한다. 암세포와의 직접적인 접촉 덕분에 다양한 금속을 포함한 나노플라워에 대한 추가 연구가 치료 기술의 범위를 넓힐 것으로 기대된다.

이상에서는 본 발명의 바람직한 실시 예에 대하여 도시하고 설명하였지만, 본 발명은 상술한 특정의 실시 예에 한정되지 아니하며, 청구범위에 청구하는 본 발명의 요지를 벗어남이 없이 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 다양한 변형 실시가 가능한 것은 물론이고, 이러한 변형 실시들은 본 발명의 기술적 사상이나 전망으로부터 개별적으로 이해되어서는 안 될 것이다.

Claims

Si 나노입자를 물 및 에탄올이 혼합된 비커에 분산시켜 1시간 내지 3시간 동안 초음파 처리하여 제1 용액을 제조하는 제1 단계;
Ni(CH₃COO)₂·4H₂O 및 과산화수소이황산칼륨을 물 및 에탄올을 함유한 비커에 용해시켜 제2 용액을 제조하는 제2 단계;
상기 제1 용액을 용액 2과 혼합하여 제3 용액을 제조하는 제3 단계;
NH₄OH를 탈이온수에 희석하여 교반하고 상기 용액 3에 추가하여 30분 내지 1시간 반응하는 제4 단계;
상기 제4 단계에서 발생한 침전물을 탈이온수로 세척하여 흡착이온인 SO₄ ^2-, K⁺, Ni²⁺ 및 CH₃COO^-을 제거하는 제5 단계;
상기 제5 단계에서 얻어진 갈색의 Si@NiOOH 나노플라워를 40℃ 내지 80℃에서 5시간 내지 7시간 건조하는 제6 단계;를 포함하는 생체적합성 코어-셸-구조의 Si-기반 NiO 나노플라워의 제조 방법.
청구항 1에 있어서,
상기 제6 단계에서 건조된 Si@NiOOH 나노플라워를 1℃ min^-1 내지 3℃ min^-1 의 가열 속도로 최대 350℃의 온도까지 아르곤 흐름 하에서 가열하여 NiO 코팅된 Si(Si@NiO)로 변환하는 제7 단계;를 포함하는 생체적합성 코어-셸-구조의 Si-기반 NiO 나노플라워의 제조 방법.
청구항 2에 있어서,
상기 제1 단계의 Si 나노입자의 직경은 50nm 내지 100nm 인 것을 특징으로 하는 생체적합성 코어-셸-구조의 Si-기반 NiO 나노플라워의 제조 방법.
청구항 3에 있어서,
상기 제2 단계의 Ni(CH₃COO)₂·4H₂O 및 과산화수소이황산칼륨의 혼합 비율은 질량비로 1:0.1 내지 0.3인 것을 특징으로 하는 생체적합성 코어-셸-구조의 Si-기반 NiO 나노플라워의 제조 방법.
청구항 4에 있어서,
상기 NiO의 셸의 두께는 10 nm 내지 30 nm 인 것을 특징으로 하는 생체적합성 코어-셸-구조의 Si-기반 NiO 나노플라워의 제조 방법.
Si 나노입자의 코어는 구형의 형상으로 그 직경은 50 nm 내지 100 nm 이며, NiO의 셸은 플라워 형상으로 두께는 10 nm 내지 30 nm 인 것을 특징으로 하는 생체적합성 코어-셸-구조의 Si-기반 NiO 나노플라워.
청구항 6에 있어서,
상기 Si는 (111), (220), (311), (400), (331), (331) 격자 구조를 갖으며 2θ의 피크는 28.3°, 47.2°, 55.9°, 75.7°, 87.9°에서 관측되며,
상기 NiO는 (111), (200), (220) 격자 구조를 갖으며 2θ의 피크는 37.1°, 43.4°, 62.6°에서 관측되는 것을 특징으로 하는 생체적합성 코어-셸-구조의 Si-기반 NiO 나노플라워.
청구항 6에 있어서,
실리콘 함량은 70중량% 내지 80중량%이며,
또한, Si@NiO에 대한 N₂ 흡착 곡선은 상대압력(P/P^o) 0.5 내지 1 범위에서 이력 루프를 나타내며, NiO의 쉘을 형성한 후 Si@NiO가 메조포어화되는 것을 특징으로 하는 생체적합성 코어-셸-구조의 Si-기반 NiO 나노플라워.
Si@NiO 농도 25 μg/mL 내지 200 μg/mL에서 MCF-7 암 세포군의 20% 내지 62%가 사멸하며, Si@NiO 농도 0 μg/mL 내지 100 μg/mL에서 MEF 정상 세포군의 생존성은 90% 이상인 것을 특징으로 하는 생체적합성 코어-셸-구조의 Si-기반 NiO 나노플라워을 함유하는 항암제.
Si@NiO 농도 0 μg/mL 내지 100 μg/mL에서 MEF 정상 세포군의 생존성은 90% 이상을 유지하며, Si@NiO 농도 25 μg/mL 내지 200 μg/mL에서 MCF-7 암 세포군의 20% 내지 62%가 사멸하는 것을 특징으로 하는 생체적합성 코어-셸-구조의 Si-기반 NiO 나노플라워을 사용하여 MCF-7 암 세포군을 사멸하는 방법.