KR102200745B1 - 약물전달용 메조 다공성 실리카 기반 복합 나노 입자 및 그 제조방법 - Google Patents

약물전달용 메조 다공성 실리카 기반 복합 나노 입자 및 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 COP(cerium oxide nanoparticle) 캡핑 다공성 나노 입자실리카 기반 복합 나노 입자, 이의 제조방법에 관한 것으로, 상세하게는 실리카 화합물 및 계면활성제를 포함하는 용액을 이용하여 제조된 메조 다공성 나노 입자실리카 기반 복합 나노 입자로서, 상기 나노 입자는 COP에 의해 캡핑된 pH 반응성 약물전달용 나노 입자에 관한 것이다. 본 발명은 산성 pH 조건에서 COP가 분리되어 나노 입자로부터 용이하게 약물이 방출되고, 산성 pH 조건에서 COP에 의해 ROS 생성이 증가하여 항암치료를 위한 시너지 효과를 제공한다.

Description

약물전달용 메조 다공성 실리카 기반 복합 나노 입자 및 그 제조방법{mesoporous silica-based composite nanoparticles for drug delivery and preparation method thereof}
본 발명은 약물전달용 메조 다공성 실리카 기반 복합 나노 입자 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
약물전달 시스템은 1970년대부터 선진국들이 첨단기술을 동원해 활발히 연구하고 있는 분야로, 안정성과 유효성이 입증된 기존 의약품의 부작용을 최소화하고 효능 및 효과를 극대화시켜 필요한 양의 약물을 효율적으로 전달할 수 있도록 설계한 제형을 말하는 것으로, 기존의 신약개발에 비해 시간과 비용은 줄어드는 반면 안전성과 유효성이 입증된 기존의 약물을 이용함으로써 높은 효과를 얻을 수 있는 장점이 있다.
약물을 병리적 위치 근처로 선택적으로 분비하기 위해 약물전달 시스템의 효율화가 필요하며, 항암 생체 분자 전달을 위한 캐리어 디자인 시 선택적인 약물 방출이 필요하다. 암 연관 조직은 기계적 힘, pH 및 전기적 신호 등과 같은 자극을 생산하며 물리적 접촉 또는 화학적 반응에 의한 자극(trigger)이 캐리어에 의해 발견될 수 있다(Mura, S. et al., Nat. Mater. 2013, 12, 9911003; Baek, S. et al., Nanoscale 2015, 7, 1419114216; Kwon, S. et al., J. Tissue Eng. 2013, 4). 자극은 종양 미세환경 근처의 약산성 pH에 의해 발생할 수 있으며, 이는 캐리어에게 약물 방출 신호를 주게된다(Mura, S. et al., Nat. Mater. 2013, 12, 9911003; Baek, S. et al., Nanoscale 2015, 7, 1419114216; Kwon, S. et al., J . Tissue Eng. 2013, 4; Kwon, S. et al., Acta Biomater. 2014, 10, 14311442; Singh, R. K. et al., Langmuir 2015, 31, 1134411352; Baek, S. et al., ACS Appl. Mater. Interfaces 2016, 8, 89678979; Davis, M. E. et al., Nat. Rev. Drug Discovery 2008, 7, 771782). 그러나, pH 반응 시스템은 정상 조직과 종양 조직간의 pH 차이가 불충분하는 등 자극의 미세성 때문에 기술적인 장애요소가 존재한다(Davis, M. E. et al., Nat. Rev. Drug Discovery 2008, 7, 771782; Peer, D. et al., Nat. Nanotechnol. 2007, 2, 751760). 외부의 물리적 또는 화학적 자극에 대해 반응하는 약물전달 시스템은 활발하게 연구가 이뤄지는 분야로, MSN(mesoporous silica nanoparticle)은 생물학적 호환성, 효율적인 생체분자 로딩 능력, 넓은 표면적, 표면 기능화의 용이성과 같은 특성 때문에 주목을 받고 있다(Tang, F. et al. Adv. Mater. 2012, 24, 15041534; Yang, P. et al., Chem. Soc. Rev. 2012, 41, 36793698).
한편, 세륨의 산화물 형태인 플루어라이트(Fluorite) 결정 구조를 갖는 COP(cerium oxide nanoparticle)는 연구자들의 관심을 끌어왔다. 카탈라아제가 첨가되어 과산화물 유사 활성(superoxide-like activity)을 갖고, 산화 효소 유사 활성(oxidase-like property)을 갖는 세륨 산화물은 바이오 분석(Asati, A. et al., Angew. Chem., Int. Ed. 2009, 48, 23082312; Li, X. et al., Chem. Commun. 2011, 47, 947949), 바이오 스캐폴딩(Mandoli, C. et al., Adv. Funct. Mater. 2010, 20, 16171624; Karakoti, A. S. et al., J. Mater. Chem. 2010, 20, 89128919), 약물전달(Li, M. et al., Chem. Sci. 2013, 4, 25362542; Xu, C. et al., Adv. Healthcare Mater. 2013, 2, 15911599), 바이오 약물(Celardo, I. et al., Nanoscale 2011, 3, 14111420)에 대해 매력적이고 생산적인 물질이다. 또한, COP는 비독성 특성 및 뛰어난 바이오 호환성 때문에 높은 주목을 받을 가치가 있다. COP는 Ce3+ 및 Ce4+ 원자가 상태를 토글(toggle)할 수 있기 때문에 pH 의존적 항산화제 유사 활성을 가진다(Alili, L. et al., Biomaterials 2011, 32, 29182929; Pagliari, F. et al., ACS Nano 2012, 6, 37673775). Ce3+/Ce4+에서 산화상태(oxidation states)의 순환은 COP에게 카탈라제 유사 활성 및 SOD(superoxide dismutase) 유사 활성을 나타내게 한다. 3+ 산화도는 O2·를 H2O2로 불균등화(dismutates) 하여, Ce3+/Ce4+ 비율에서 4+로 산화 정도를 변화시킨다. 그러나, 생리학적 pH에서 카탈라제 유사 활성을 갖는 4+ 산화도의 세륨에 의해 증가된 H2O2는 빠르게 H2O 및 O2로 비독성화 된다21. 두 가지 효소 유사 행동의 결합 효과는 COP에게 추가적인 항산화 특성을 준다. 따라서, COP는 방사능 치료에서 정상세포를 보호하고 척수에서 뉴런세포를 보호한다(Tarnuzzer, R. W. et al., Nano Lett. 2005, 5, 25732577; Chen, J. et al., Nat. Nanotechnol. 2006, 1, 142150; Perez, J. M. et al., Small 2008, 4, 552556; Karakoti, A. et al., Chem. Soc. Rev. 2010, 39, 44224432). 그러므로, COP는 암세포 및 정상세포에서 친산화성물질(pro-oxidants) 및 항산화제(antioxidants)로서 각각 행동한다.
MSN은 이전부터 pH 유발 약물전달 시스템으로 사용되어 왔으나 대부분 시스템은 약물 방출을 가능케 하기 위해 심각한 pH(pH2~7 또는 9)를 필요로 하여 바이오 의약 분야에서 이의 사용이 제한되었다(Muhammad, F. et al., J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 87788781; Zhang, J. et al., ACS Appl. Mater. Interfaces 2015, 7, 2666626673; Wang, Y. et al., J. Mater. Chem. 2009, 19, 64516464; Wu, S. et al., J. Mater. Chem. B 2015, 3, 14261432). 나노 입자와 결합된 산 반응성 링커(예를 들어, 아연, 금, 자성 물질) 또는 초분자 나노밸브는 약물 방출의 환경 반응 유발자로서 사용되어 왔다(Park, C. et al., Angew. Chem., Int. Ed. 2007, 46, 14551457; Angelos, S. et a;., J. Am. Chem. Soc. 2009, 131, 1291212914). . pH 유발 결합 본드(아미드, 보로네이트 에스테르 및 아세탈과 같은)의 한계 중 하나는 낮은 pH(3~7)에서 가수분해되는 것이며, 이는 세포 내 적용과 산화 환원 활동에 도움이 되지 않는다(Zhang, X. F. et al., J. Mater. Chem. B 2012, 22, 1445014457; Aznar, E. et al., J. Am. Chem. Soc. 2009, 131, 68336843; Liu, R. et al., J. Am. Chem. Soc. 2010, 132, 15001501).
삭제
종양 조직과 같은 신체의 특정 조직은 다른 정상 조직과 혈액과 비교하여 산성 pH를 가지며(Alili, L. et al., Biomaterials 2011, 32, 29182929; Asati, A. et al., ACS Nano 2010, 4, 53215331; Trombetta, E. S. et al., Science 2003, 299, 14001403; Yang, Q. et al., Chem. Mater. 2005, 17, 59996003), 여기서 pH 의존 COP의 독성은 명백할 수 있다. 나노 입자의 독성은 리소좀과 엔도좀(Trombetta, E. S. et al., Science 2003, 299, 14001403; Yang, Q. et al., Chem. Mater. 2005, 17, 59996003), 또는 세포질(cytoplasmic spreading) (Alili, L. et al., Biomaterials 2011, 32, 29182929; Asati, A. et al., ACS Nano 2010, 4, 53215331)과 같은 특유의 세포 기관에서의 국지화(localization)에 의존한다고 보고되었다.
본 발명자들은 생체 내 효과적인 약물전달을 위한 나노 입자를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 메조 다공성 실리카 기반 복합 나노 입자의 표면을 COP(cerium oxide nanoparticle)로 코팅하는 경우에 pH에 따라 약물 방출이 제어되고, COP의 세포 독성 효과에 의해 활성 산소종(reactive oxygen species, ROS) 생성이 증가하여 약물과 함께 시너지 효과를 제공함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 pH 반응성 약물전달용 나노 입자를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 pH 반응성 약물전달용 나노 입자를 제조하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 되나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 실리카 화합물 및 계면활성제를 포함하는 용액을 이용하여 제조된 메조 다공성 실리카 기반 복합 나노 입자로서, 상기 나노 입자는 아민 기능화된 COP로 캡핑된 pH 반응성 약물전달용 나노 입자를 제공한다.
본 발명자들은 생체 내 효과적인 약물전달용 나노 입자를 개발하고자 노력하였다. 그 결과 메조 다공성 실리카 기반 복합 나노 입자의 표면을 아민 기능화된 COP로 코팅하는 경우 pH에 따라 약물 방출이 제어됨을 확인하였다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 메조 다공성 실리카 기반 복합 나노 입자는 400℃ 내지 600℃에서 소성 처리된 것이다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 메조 다공성 실리카 기반 복합 나노 입자는 500℃ 내지 600℃에서 소성 처리된 것이다.
본 발명의 상기 메조 다공성 실리카 기반 복합 나노 입자는 표면 카르복실기를 갖는 것이다.
본 발명의 상기 약물은 상기 메조 다공성 실리카 기반 복합 나노 입자 내 카르복실기와 결합을 형성할 수 있는 것이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 약물은 항암제, 성장인자, 시토크롬, 사이토카인, 호르몬, 유전자, 천연물, 합성신약 또는 이들의 혼합물일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 항암제는 독소루비신(Doxorubicin), 싸이클로포스파마이드(cyclophoaphamide), 메톡트렉세이트(methotrexate), 파클리탁셀(paclitaxel), 치오테파(thiotepa), 미톡산트론(mitoxantrone), 빈크리스틴(vincristine), 캄토테신(camptothecin) 또는 다우노루비신(daunorubicin) 등을 예로 들수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 약물은 독소루비신이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 단백질은 골 형성 단백질(BMP), 섬유아세포 성장인자(FGF), 상피세포 성장인자(EGF), 혈관 내피 성장인자(VFGF), 혈소판유래 성장인자(PDGF)와 같은 성장인자 또는 시토크롬 등을 예로 들수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 단백질은 시토크롬C 이다.
본 발명의 메조 다공성 실리카 기반 복합 나노 입자는 1 내지 5nm 의 평균 기공 크기를 갖는다. 본 발명의 일 구현예에 따르면 메조 다공성 실리카 기반 복합 나노 입자는 2 내지 4nm 의 평균 기공 크기를 갖는다.
본 발명의 메조 다공성 실리카 기반 복합 나노 입자는 80 내지 130nm의 평균 직경을 갖는다. 본 발명의 일 구현예에 따르면 메조 다공성 실리카 기반 복합 나노 입자는 90 내지 120nm의 평균 직경을 갖는다.
본 발명의 상기 pH 반응성 약물전달용 나노 입자의 Ce:Si의 몰비는 10~30:70~90이다.
본 발명의 상기 pH 반응성 약물전달용 나노 입자는 pH7.0 내지 8.0의 중성 pH 반응 조건에서의 약물 방출 속도와 비교하여 pH3.0 내지 6.0의 산성 pH 반응 조건에서 1.5 내지 10배의 약물 방출 속도를 갖는다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 pH 반응성 약물전달용 나노 입자 제조 방법을 제공한다.
(a) 실리카 화합물 및 계면활성제를 포함하는 반응 용액을 이용하여 메조 다공성 실리카 기반 복합 나노 입자(MSN)를 제조하는 단계;
(b) 상기 (a)의 결과물에 아미노실란 및 숙신산 용액을 첨가하여 MSN 표면에 카르복실기를 생성하는 단계;
(c) 상기 (b)의 결과물에 약물을 내장하는 단계; 및
(d) 상기 (c)의 결과물에 아민 기능화된 COP를 캡핑하는 단계.
상기 단계 (a)는 메조 다공성 실리카 기반 복합 나노 입자를 제조하기 위하여 실리카 화합물 및 기공형성 주형으로 계면활성제를 포함하는 반응 용액을 이용하여 메조 다공성 실리카 기반 복합 나노 입자를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 단계 (a)의 메조 다공성 실리카 기반 복합 나노 입자는 400℃ 내지 600℃ 에서 소성 처리되어 제조된 것이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 단계 (a)의 계면활성제는 CTAB(Cetyl trimethylammonium bromide), CPC(Cetylpyridinium chrolide), BAC(Benzalkonium chloride), BZT(Benzethonium chrolide), 5-브로모-5-니트로-1,3-다이옥산(5-Bromo-5-nitro-1,3-dioxane), 디메틸디옥타데실암묘늄 클로라이드(Dimethyldioctadecylammonium chloride), 세트리모늄 브로마이드(Cetrimonium bromide) 또는 DODAB(Dioctadecyldimethylammonium bromide)이다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 계면활성제는 CTAB이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 단계 (a)의 실리카 화합물은 TEOS(Tetraethyl orthosilicate), TOMCATS(tetramethylcyclotetrasiloxane), 퓸드 실리카(fumed silica) 또는 규산나트륨(sodium silicate)이다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 실리카 화합물은 TEOS이다.
다음으로, 상기 (a)의 결과물에 아미노실란 및 숙신산 용액을 첨가하여 MSN 표면에 카르복실기를 생성한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면 상기 단계 (b)의 아미노실란은 APTES((3-aminopropyl)-triethoxysilane), APDEMS((3-aminopropyl)-diethoxy-methylsilane), APDMES((3-aminopropyl)-dimethyl-ethoxysilane) 또는 APTMS((3-aminopropyl)-trimethoxysilane)이다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 아미노실란은 APTES이다.
다음으로, 상기 (b)의 결과물에 약물을 내장한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 약물은 항암제, 성장인자, 시토크롬, 사이토카인, 호르몬, 유전자, 천연물, 합성신약 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 항암제는 독소루비신이다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 시토크롬은 시토크롬 C이다.
마지막으로, 상기 (c)의 결과물에 아민 기능화된 COP를 캡핑한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 (c)의 결과물인 약물 로딩된 MSN을 가교결합제 및 아민-COP 수용액을 이용하여 COP로 캡핑한다.
본 발명에 따라 제조된 상기 pH 반응성 약물전달용 나노 입자는 pH7.0 내지 8.0의 중성 pH 반응 조건에서의 약물 방출 속도와 비교하여 pH3.0 내지 6.0의 산성 pH 반응 조건에서 1.5 내지 10배의 약물 방출 속도를 갖는다.
본 발명은 pH 반응성 약물전달용 나노 입자 및 이의 제조방법을 제공한다
본 발명은 pH에 따라 나노 입자로부터 용이하게 약물을 방출할 수 있다.
도 1(a)는 COP 코팅 MSN으로부터 pH에 의한 약물 방출 조절을 나타낸다. (b)-(d)는 MSN, COP, COP 코팅 MSN의 TEM 이미지를 나타낸다. (e)는 COP 코팅 MSN의 EDX(energy-dispersive X ray) 분석을 통해 Ce/Si 비율을 측정하였다. (f)는 동적 광산란 분석에 의해 COP 캡핑 전 입자크기(99.8nm)과 COP 캡핑 후 입자크기(108.8nm)를 측정하였다.
도 2(a)는 MSN및 COP 캡핑 MSN(COP@MSN)의 low-angle XRD 분석을 나타낸다. (b)는 MSN, COP 및 COP 캡핑 MSN의 wide-angle XRD 분석을 나타낸다. (c)는 MSN 및 COP 캡핑 MSN의 N2 흡착/탈착 등온선 곡선이다. 기공의 캡핑으로 등온선 곡선이 변경되고, 표면적이 감소하였다. (d)는 아민 COP, 카르복실 MSN 및 COP 캡핑 MSN의 FTIR 스펙트럼 분석을 나타낸다. (e)는 MSN 및 COP 캡핑 MSN의 N2 흡착/탈착 등온선 곡선으로 기공 크기의 분포를 확인하였다. (f)는 기능화된 MSN (g)는 COP 및 아민-COP의 FTIR 스펙트럼 분석을 나타낸다.
도 3은 나노 입자 표면에서 Ce3+/Ce4+ 변화를 나타낸다. (a)는 COP 및 COP-MSN의 XPS이다. (b)는 COP 및 COP-MSN의 UV 스펙트럼이다. (c)는 COP 및 COP-MSN 의 라만 스펙트럼이다. 모두 460cm-1에서 진동 피크를 나타낸다. (d)는 표면 H202를 함유한, 함유하지 않은 COP@MSN 수용액의 과산화물 유사 특성을 DMPO 스핀 트래핑 EPR 분광법에 의해 나타낸다. (e)-(h)는 기능화된 MSN, 기능화된 COP 및 COP@MSN의 제타전위를 나타낸다. (g)는 카르복실 MSN, 아민 COP 및 COP@MSN의 제타전위를 나타낸다.
도 4는 COP@MSN 나노 입자에서 DOX 로딩 및 방출을 나타낸다. (a) 다양한 DOX 농도에서 DOX의 로딩 양을 나타낸다. (b)는 37℃, 다양한 pH에서 COP@DOX-MSN 나노 입자의 약물 방출을 나타낸다). (c)는 37℃, pH 7.4 및 5에서의 COP 캡핑 없는 MSN에서 DOX의 방출을 나타낸다. (d)는 다양한 CytoC 농도에서 CytoC의 로딩 양을 나타낸다. (e)는 37℃, pH 7.4 및 5에서 COP@CytoC-MSN 나노 입자에서 약물의 방출을 나타낸다. (f)는 37℃, pH 7.4 및 5에서의 COP 캡핑 없는 MSN에서 CytoC 방출을 나타낸다.
도 5(a)는 4시간 동안 COP@DOX-MSN과 함께 배양한 HeLa 세포의 형광 현미경 이미지를 나타낸다. (b)는 리소좀 내 COP@MSN의 다양한 농도를 나타낸다. (c)는 다양한 농도의 COP@MSN을 처리한 후 리소좀 내 산화제 성질을 확인하였다. (d)는 HeLa 세포 생존력에 대한 DOX, COP@MSN, COP@DOX-MSN의 효과를 나타낸다. (e)는 다양한 용량의 DOX, COP@MSN, COP@DOX-MSN의 HeLa 세포내 섭취를공초점 현미경을 통해 관찰한 결과이다 (f)는 DOX, COP@MSN, COP@DOX-MSN의 세포 내 섭취 효율을 FACS로 분석한 결과이다.
도 6은 COP@MSN, DOX, COP@DOX-MSN을 24시간 동안 처리한 후의 세포 아폽토시스를 나타낸다. (a)는 세포 아폽토시스 플롯을 나타낸다. (b)는 다양한 단계(생존, 초기 아폽토시스, 후기 아폽토시스, 세포 괴사)의 세포 비율을 나타낸다.
도 7은 ROS 생성에 대해 대조군, COP@MSN, DOX 및 COP@DOX-MSN의 시너지 효과를 나타낸다. (a)는 세포의 형광 이미지를 통해 녹색 ROS 신호를 나타낸다. (b)는 대조군과 비교한 ROS 생성 비율을 나타낸다.
도 8은 암 세포내에서 pH에 의해 촉발되는 DOX 로딩 COP@MSN 시스템의 세포 내 ROS 치료 및 화학요법을 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명한 것이다,
실시예 1 : 재료 및 방법
메조 다공성 실리카 기반 복합 나노 입자(MSN)의 합성
메조 다공성 실리카 기반 복합 나노 입자는 CTAB(hexadecytrimethyl ammonium bromide)를 기질 및 계면활성제로 사용하고, 실리카 재료로 TEOS(tetraethyl orthosilicate)를 사용하고, 물, 에톡시에탄올 및 에탄올을 공동용액으로 사용하여 상온에서 반응시켰다. 구체적으로, 1g의 CTAB를 2mL의 암모니아수, 40mL의 2-에톡시에탄올, 20mL의 에탄올 및 160mL의 H20에 용해시켰다. 상기 혼합물을 30분간 교반한 후, TEOS 1.2mL를 첨가하고, 4시간 동안 교반하여 백색 침전물을 얻었다. 나노 입자를 원심분리하고 물과 에탄올로 여러번 세척한 후 24시간 동안 80℃ 에서 건조하고, 5시간 동안 550℃에서 하소하였다.
카르복실 MSN의 합성
상기 제조한 MSN의 표면을 카르복실기로 기능화하기 위해, MSN을 APTES(3-amino propyltriethoxysilane) 100㎕를 함유한 에탄올 100mL에 현탁시키고 48시간 동안 76℃에서 환류시켰다. 아민 MSN 용액을 원심분리한 후 물과 에탄올로 세척한 후 48시간 동안 37℃에서 건조시켰다. 카르복실 MSN을 제조하기 위해, 아민 MSN을 20mL의 DMSO(dimethylsulfoxide) 용액에 분산시킨 후, 5mL의 DMSO에 용해된 무수 숙신산 용액(succinic anhydride solution)에서 24시간 동안 40℃에서 교반하였다. 원심분리에 의한 침전회수의 일반적인 과정을 따른 후, 에탄올 세척 및 24시간 동안 37℃에서 건조하였다.
아민 기능화된 COP(cerium oxide nanoparticle)의 합성
세륨 (Ⅲ) 아세틸아세토네이트 수화물(Ce(acac)3) 8mmol을 1시간 동안 50% 에탄올 용액 100mL에 용해시켰다. 여기에 수소화붕소나트륨(NaBH4) 25mmol을 첨가하고, 2시간 후 APTES 1mL를 신속하게 첨가하고, 반응 혼합물을 24시간 동안 상온에서 교반했다. 침전물은 원심분리에 의해 수집, 에탄올로 세척 및 24시간 동안 37℃에서 건조하였다.
약물 로딩, 캡핑, 방출 방법
독소루비신(DOX)을 항암제로, 시토크롬C(CytoC)를 단백질로 사용하였다. 음전하를 띤 카르복실 MSN을 사용하여 양전하를 띤 DOX와 CytoC를 확인하였다. DOX 로딩을 확인하기 위해, 다양한 양의 DOX(0~120㎎/㎖)를 카르복실 MSN(1mg)과 함께 PBS 1 mL에 분산시켰다. DOX를 MSN에 로딩하기 위해 상기 용액을 24시간 동안 37℃에서 배양하였다. 그 후 482nm에서 UV 흡광도를 측정했다. 나노 입자의 약물 로딩 효율은 나노 입자를 2분 동안 10000rpm에서 수집한 다음 PBS로 세척한 후 UV 분광광도계로 흡광도를 측정하였다. 표준곡선에 의해 로딩능력을 계산했다. 유사한 방법으로 다양한 농도(0 내지 300㎍/㎖)에서 CytoC의 로딩 양도 측정하였다. MSN에 대한 단백질 흡착능은 408nm에서 CytoC를 사용하여 만들어진 표준곡선에 의해 결정되었다.
COP 캡핑을 위해, DOX 로딩된 MSN(DOX-MSN)(120㎍/㎖, DOX) 분말을 물에 재분산시킨 다음, 가교결합제인 EDC(1-ethyl-3-(3-dimethyl aminopropyl) Carbodiimide) 및 아민-COP 수용액을 첨가하였다. 혼합물을 다시 1시간 동안 교반 했다. 또한, COP 코팅된 DOX-MSN(COP@DOX-MSN) 침전물을 10000rpm으로 원심분리하고, 탈 이온수로 수회 세척 한 다음, 24시간 동안 37℃에서 건조시켰다.
코팅 후, PBS(pH7.4) 및 아세테이트 완충액(pH6.0, 5.0 및 4.0)에서 COP@DOX-MSN로부터 DOX의 pH 의존 방출 프로필을 120시간 동안 37℃에서 조사하였다. 배양 용액을 10000rpm으로 원심분리하고, 상층액은 DOX 정량화를 위해 사용하였다. 새로운 완충액(인산 완충액과 아세테이트 완충액)을 준비하여 나노 입자는 재분산시키고 37℃에서 배양하였다. 매질을 갈아준 후(refresh) 약물이 매질로 방출되는 서로 다른 시점을 측정하였다. CytoC 방출 시험도 동일한 방법으로 수행하였다.
세포 배양 및 생존 분석
ATCC(American Type Culture Collection, Rockville)에서 인간 자궁 경부암 세포주(HeLa)를 구입하였다. 세포는 10% 우태아혈청(Gibco)과 1% 페니실린-스트렙토마이신이 함유된 최소필수배지(Gibco)에서 37℃, CO2 농도 5%로 배양하였다. 배지는 일주일에 세 번 교체하고 세포는 서브컨플루언트될 때까지 계대배양하였다.
COP@MSN, DOX 및 COP@DOX-MSN의 세포 독성을 HeLa 세포와 함께 CCK-8 분석에 의해 측정하였다. 구체적으로, 1×104 세포/웰의 96 웰 플레이트에 HeLa 세포를 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후 HeLa 세포에 다양한 농도의 COP@MSN, DOX 및 COP@DOX-MSN이 첨가된 새로운 배지를 추가하였다. 이들 샘플에 CCK-8 시약(Dojindo, 일본)을 넣고 37℃에서 3시간 동안 암실에서 배양하였다. 형광은 iMark 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 450nm에서 측정하였다.
세포 내 섭취 분석(in vitro)
HeLa 세포는 배양 플레이트에 분주하고 37℃, CO2 농도 5%로 4시간 동안 COP@MSN, DOX 및 COP@DOX-MSN로 처리하였다. 4시간 후, 차가운 PBS로 세포를 세척하고 30분 동안 4% PFA(para formaldehyde) 용액으로 고정시켰다. DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole)은 세포 핵을 염색하는 데 사용하였다. 공초점 현미경(Zeiss LSM 510)은 DOX(빨간색) 및 핵(파란색)의 존재를 시각화하였다.
COP@MSN, DOX 및 COP@DOX-MSN 나노 입자의 세포 내 섭취를 확인하기 위해 유동세포계측법을 사용하였다. HeLa 세포를 6-well 배양 플레이트에 분주하고 24시간 동안 부착되도록 하였다. 이어서, 세포는 COP@MSN, DOX 및 COP@DOX-MSN에 4시간 동안 노출되었다. 그 후, PBS로 세포 세척을 2회 행한 후, 1000rpm에서 5분간 원심분리하여 세포를 수집하였다. 세포는 PBS에 재현탁하고, 형광 DOX의 섭취를 CellQuest 소프트웨어를 사용하여 FACS(fluorescence-ativated cell sorting, FACS Calibar)으로 분석하였다.
HeLa 세포를 배양 플레이트에 분주하고 COP@MSN, DOX 및 COP@DOX-MSN으로 4시간 동안 처리하였다. 그 후 세포를 Lysotracker Green DND26에 의해 37℃에서 1시간 동안 CO2 농도 5%에서 염색하였다. 1시간 후, 세포는 4% PFA로 30분간 고정되었고, DAPI로 처리하여 핵을 염색하였다. 공초점 현미경을 사용하여 검사했다.
리소좀 분리는 공지된 방법을 사용하여 수행하였다. 이를 위해 성장한 HeLa 세포는 다양한 농도의(0, 5, 10, 20, 40, 60, 80 및 100μg/mL) COP@MSN로 4시간 동안 처리하였다. 세척 후 1500rpm에서 3분간 원심분리를 통해 리소좀을 분리하였다. 리소좀 펠렛은 100㎕의 TMB(3,3,5,5-tetramethylbenzidine) 1.0 ㎎/㎖에 재분산시키고 24시간 동안 37℃에서 배양하였다. 24시간 후, 리소좀의 UV 흡수스펙트럼을 652nm에서 측정하였다. 리소좀 내부의 COP@MSN 양은 652nm에서 TMB를 사용하여 만들어진 표준곡선에 의해 결정되었다.
아폽토시스 확인을 위한 유동 세포 계측 분석
아폽토시스 검출 키트(BD Pharmingen)를 사용하여 유동 세포 계측 분석을 통한 아폽토시스 세포의 백분율을 측정하였다. 배양 플레이트에서 성장한 HeLa 세포를 COP@MSN, COP@DOX-MSN 및 DOX로 24시간동안 처리한 후 세척 및 결합 완충액에서 현탁시켰다. 이 세포의 염색은 Annexin V-FITC 및 PI(propidium iodide)로 실온에서 어두운 곳에서 15분 동안 수행하였다. 이 샘플들은 CellQuest 소프트웨어를 사용하여 유동 세포 계측법으로 정량화했다.
나노 입자에 대한 ROS 효과(In Vitro)
H2O2 유발 세포 내 ROS 양은 H2DCFDA(2,7-dichlorodihydro-fluorescein diacetate)를 사용하여 제조사 프로토콜에 따라 측정하였다. 구체적으로, 웰당 104 세포를 96-웰 플레이트에 분주하고, 24시간 동안 부착시켰다. 이를 위해, COP@MSN, DOX 및 COP@DOX-MSN을 추가하고 4시간 동안 배양했다. H2DCFDA 용액은 HBSS에서 5μM H2DCFDA를 희석하여 제조하였다. 희석된 H2DCFDA 용액을 세포에 적용하여 37℃에서 CO2 농도 5%로 30분간 처리하였다. HBSS로 세척한 후, 미량 정량 판독기(Tecan, In-M2000)를 사용하여 485nm의 여기 파장 및 530nm의 방출 파장으로 형광 강도를 측정했다. 공초점 레이저 스캐닝 현미경(CLSM, Zeiss LSM700)을 사용하여 세포의 형광 이미지를 관찰하였다.
실시예２：COP 캡핑 MSN의 물리화학적 특성 분석
COP 코팅 MSN으로부터 pH에 의해 약물 방출이 조절되는 것은 도 1(a)에 나타냈다. MSN을 PBS 용액에 담구어 MSN에 DOX가 담지되도록 하였으며, 또한 MSN의 표면을 카르복실기로 기능화하였다. 캡핑을 위해 카르복실 MSN의 나노 사이즈 기공은 EDC와의 커플링을 통해 기능화된 아민-COP에 의해 밀봉되었다. 약물 방출은 COP의 아민기(-NH2)의 양성자화에 의존하고 메조기공으로부터 DOX 방출을 유도한다. COP의 양성자화 기능성에 기초한 pH는 약물방출 속도를 조절한다.
COP, MSN 및 COP@MSN 나노 입자의 형태 및 구조를 전자 현미경 분석으로 분석 하였다. 그 결과 MSN의 평균 직경이 ~100nm였다(도 1b). COP는 직경이 3~4nm였다(도 1c). TEM 이미지는 MSN의 표면에서 3~4nm의 크기를 갖는 특유의 어두운 결정질 반점을 관찰하여 COP와 함께 MSN의 캡핑을 확인했다(도 1d). COP 캡핑 전후의 MSN의 입자 크기 분포는 동적 광산란 분석에 의해 측정하였다(도 1f). COP 캡핑 전과 후의 입자 크기는 각각 99.8nm과 108.8nm로 COP 캡핑에 따라 입자 크기가 약간 증가했다. COP는 실리카 표면에 어두운 패턴으로 MSN의 표면 전체를 덮었다. 더 어두운 영역은 실리카 입자 내의 COP이다. 샘플에 대한 EDX 분석은 O, Si 및 Ce의 X 선 에너지를 보여주며, 실리카 표면 내 세리아의 존재를 확인하였다. Ce/Si의 비율은 EDX 스펙트럼에서 19.22%로 측정되었으며 이는 MSN에 대한 COP 양을 의미한다(도 1e).
COP의 MSN 캡핑은 XRD 및 BET 측정에 의해 결정하였다. Low-angle XRD 분석(1°<2θ<8°) 결과 MSN의 메조 기공이 COP 캡핑되어 MSN의 피크 강도가 감소하였다(도 2a). MSN과 비교했을 때, COP@MSN의 d100에서 매우 낮은 피크를 관찰했다. MSN, COP 및 COP@MSN 샘플의 순도 및 결정성을 XRD 분석했다. MSN은 15°~ 35°사이에서 폭 넓은 패턴을 보여 MSN의 무정형을 나타낸다. COP@MSN 표본은 또한 각각 세리아의 (111) 및 (220) 피크에 대응되는 28°및 46°에서 폭 넓은 패턴을 나타내어 COP의 형성을 확인했다. COP의 넓은 확산 패턴은 COP의 극히 미세한 결정 크기의 존재를 암시한다. COP@MSN 나노 입자는 무정형 MSN의 존재와 매우 작은 크기의 COP 조합으로 더 넓은 피크를 보였다(도 2b). N2 흡착 / 탈착 등온선 곡선으로, COP에 의한 기공의 캡핑을 확인했다(도 2c). MSN 등온선 곡선은 IV 형 메조 다공성 구조를 나타내는 곡선과 동일하다. MSN 나노 입자의 표면적은 635m2/g이고 기공 부피는 0.45cm3/g이다. BJH 방법을 통해 나노 입자의 2.4nm에서의 좁은 폭의 기공 크기 분포를 확인하였다(도 2e). MSN의 COP 캡핑 후, COP@MSN 나노 입자의 표면적, 기공 부피 및 기공 크기는 모두 MSN에 비해 감소되어 MSN의 기공 폐쇄를 확인했다. MSN은 635m2/g의 높은 표면적을 나타낸 반면 COP@MSN 나노 입자는 180m2/g의 표면적을 가지며, 비 다공성 물질의 전형적인 II 형 등온선을 나타낸다. 공극 캡핑 효과는 COP@MSN 나노 입자의 등온선 곡선 유형이 변하고 표면적과 기공 크기 분포가 감소로부터 확인했다.
MSN, COP 및 COP@MSN 나노 입자의 표면 기능기의 존재는 FTIR 스펙트럼에 의해 결정되었다. COP를 캡핑하기 전과 후에 MSN 입자의 FTIR 분광 분석을 수행했다(도 2d). COP 캡핑 후, 실리카의 Si-O-Si 및 Si-OH 구조 밴드를 관찰했다. MSN에서 1228, 1085, 801, 958 및 464cm-1에서 실리카 진동 밴드 피크를 발견했다. MSN은 1753cm-1에서 흡수 밴드를 보였으며, 이는 카르복실기의 탄소 구조 밴드 C=O의 구부러짐에 의해 결정된 것이다(도 2f). COP의 Ce-O 스트레칭 밴드는 356cm-1이고, -NH2 밴드는 1300-1700cm-1이다(도 2g). COP@MSN 나노 입자도 실라놀 결합을 변화시키지 않으면서 MSN과 유사한 진동 밴드(1228, 801, 958 및 464cm-1)를 가졌다. 그러나 실리카(1085cm-1)와 세륨(356cm-1)의 진동 밴드가 MSN에 비해 COP@MSN에서 더 높은 파수로 이동한다는 것을 발견했다. 이는 자기 양전성(electropositive) COP와 MSN의 고도의 전기적 음성 산소의 상호 작용 때문이다.
실시예３：COP@MSN 나노 입자 표면에서의 Ce 3+ / Ce 4+ 변이 특성
세륨의 산화 상태(Ce3+/Ce4+)는 COPs의 생물학적 반응을 결정한다. COP@MSN 나노 입자의 표면에서의 Ce3+/Ce4+ 산화 상태의 변화는 XPS, 라만 분광법, 자외선 분광법, 그리고 ξ전위에 의해 나타냈다.
도 3a는 Ce의 고해상도 XPS 스펙트럼을 나타내며, Ce에 의한 총 5개의 피크가 나타났다. 두 개의 피크(검은선)는 Ce3+에서 기인하고 세 개의 피크(붉은 선)는 Ce4+에 의한 것이다. Ce3+와 Ce4+에 관련된 피크의 존재는 다양한 원자가 상태를 나타낸다. 또한 Ce3+는 COP에서 산소 결손을 생성한다. 준비된 COP에서 세륨은 대부분 Ce4+ 산화 상태로 존재하는 반면, COP가 MSN을 코팅한 후 세륨은 Ce3+ 산화 상태로 환원된다(도 3a). 산소 결핍은 COP 표면에서 발생하므로, COP@MSN 나노 입자에서 Ce3+의 함량이 상대적으로 더 많다. 또한, 산소 결핍은 생물학적 분자의 산소 부분을 배분하여, 산화 촉진 특성을 감소시킬 수 있다. Ce3+도 라디칼 소거능에 있어서 더 반응성이 있으며 더 우수하다. COP는 산화 효소 유사 활성을 가지고 있으며 2,2-아자노비스(3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산)(2,2-azinobis(3-ethylbenzothizoline-6-sulfonic acid)와 TMB를 포함한 친숙한 기질을 산화시킨다. CeO2의 산화 활성은 pH 의존적이다.
전이 금속 이온의 배위 및 산화 상태는 UV-vis 분광기에 의해 결정될 수 있다. UV-vis 시스템에 의해 COPs와 COP@MSN 나노 입자의 광학 특성에 대한 표면 흡착의 효과를 조사했다(도 3b). COP 나노 입자는 312nm 부근에 강한 흡수 피크를 보인다. 캡핑 또는 MSN과의 상호 작용 후에, Ce4+의 피크(312nm)의 강도가 감소되었다. 상당히 약화된 312nm 피크와 함께 280nm에서 새로운 피크가 나타났다. 312nm 피크는 Ce4+에 기인하고 280nm 피크는 Ce3+에 기인한다. UV 스펙트럼으로부터 나노 입자의 표면에서 Ce3+는 Ce4+과 비교하여 더 높은 에너지로 이동한다. 한편, Ce3+의 양이 높으면 나노 입자는 산화 특성을 나타낸다.
COP와 COP@MSN 나노 입자의 라만 스펙트럼을 조사했다(도 3c). 460 cm-1에서 발생하는 강한 밴드는 각 세륨 이온 근처의 산소 원자의 F2g 진동 밴드에 기인하며, 세륨의 이온 질량은 원자의 진동을 일으키는 데 영향을 미치지 않는다. COP의 나노 입자의 연장된 진동은 라만 스펙트럼의 넓은 피크에 대한 이유이다. 또한 COP@MSN 나노 입자에 대해 590cm-1의 밴드를 독점적으로 관찰했다. 이 밴드는 Ce3+ 이온에 의해 생성된 산소 결함 때문에 발생한다. 이 설명은 Ce3+ 이온이 COP에서보다 COP@MSN 입자에서 더 많이 발견되는 XPS와 UV 결과에 의해 뒷받침된다.
COP@MSN의 표면 과산화물 유사 활성은 반응 가능한 활성 산소종에 대해 실온에서 DMPO 스핀 트래핑 EPR 분광법에 의해 측정하였다. 도 3d는 H2O2가 있거나 없는 COP@MSN 시스템의 과산화물 유사 특성 EPR 스펙트럼을 나타낸다. "*"(DMPO 및 DMPO-COP)로 표시된 피크는 탄소 중심 라디칼(ccr)의 형성에 의한 것이다. DMPO와 세륨 이온 사이의 반응은 세륨 이온-DMPO 복합체를 생성시켰는데, 이는 원자 재 배열을 유도하여 EPR을 생성하고 강도는 감소시켰다. H2O2의 존재하에, ccr 신호는 사라졌지만, ·OH-DMPO의 특징적인 신호가 나타났다. ·OH-DMPO 신호의 외관은 DMPO와 활성 ·OH 라디칼의 표면 과산화물-유사(Ce3+ +O2↔Ce4++O2-) 성질 간 반응에 기인한다. 샘플 표면의 국지 구조와 산화 환원(peroxide-like) 성질은 EPR 스펙트럼에 의해 확립되었다.
카르복실 MSN의 ξ 전위는 -19.4mV 이었지만 자유 MSN(-14.5mV)의 전위는 더 높았다(도 3e). 이 결과는 MSN 표면 상에 카르복실기의 부착을 확인했다. 기능화 된 MSN과 COP@MSN의 ξ전위는 각각 -19.4와 +17.7mV였으며(도 3f 및 g), COP@MSN의 전위는 COP 단독의 전위(+11.5 mV)와 유사했다(도 3e). 이 결과는 MSN를 둘러싼 COP 캡핑 층에 기인한 것일 수 있다.
실시예 4: 약물로딩 및 분비
COP@MSN 나노 입자로부터 분비되는 적하분자(cargo molecule) 방출을 조사하기 위해, DOX와 CytoC를 메조 다공성 나노 입자실리카 기반 복합 나노 입자 내에 담지한 다음 COP로 캡핑을 수행하였다. 적하분자의 담지는 MSN를 PBS에 담궈 적하분자가 MSN에 담지되도록 함으로써 이루어졌다. COP는 실리카의 메조 기공을 차단하도록 만들어졌다. DOX와 CytoC는 양전하를 띠고 메조 기공보다 작기 때문에, 이들은 음전하를 띄는 MSN의 카르복시기와 상호 작용하여 MSN의 메조기공에 통합된다. DOX(0~120㎍/mL)(도 4a)와 CytoC(0~300㎍/mL)(도 4d)의 로딩 농도는 다양했지만, 나노 입자(COP@MSN)의 양은 1mg로 고정되어 있었다. DOX와 CytoC 로딩 양은 DOX와 CytoC 농도가 80 및 200㎍/㎖까지 증가함에 따라 선형적으로 증가하였으며 최대 부하량은 DOX는 63㎍, CytoC는 124㎍이었다. 인산염 용액(pH7.4)과 다른 pH를 갖는 아세트산 용액을 사용하여 약물의 방출을 시험하였다. DOX 분산성은 약물에 존재하는 아민 연결의 더 강한 양성자화에 의해 낮은 pH 조건에서 향상되기 때문에 DOX 약물은 pH에 민감하다. 도 4b는 pH7.4(외부 자극 없음)에서 DOX의 방출이 무시할만한 수준이었음을 보여주어 COP가 누출이 거의 없이 약물 분자 유지를 위해 잘 조직화 된 캡으로 작용함을 나타낸다. MSN에 적재된 DOX의 방출은 아민 그룹의 양성자화에 달려 있으며, 산성 조건으로 변하면 캡핑 시스템을 활성화 시킬 수 있다. pH가 감소함에 따라 COP가 더 빨리 분리되고 DOX의 방출이 가속화 되었다. 도 4b는 DOX 방출량이 120시간 후에 pH5.0 및 7.4에서 약 55% 및 10%에 도달한 것을 보여준다. 양성자화 활성은 산성 pH 값에서 증가하고 pH 증가에 따라 감소한다. 아민기(-NH2) 양성자화는 COP를 분리시켜 DOX를 메조 기공으로부터 방출시켰다. 방출 비율은 주로 COP의 pH 매개 양성자화 활성에 따라 결정되므로 pH를 조정하여 적하분자의 방출 속도를 제어할 수 있다.
pH 의존성 방출은 DOX의 성질에 기인한 것이 아니라 COP의 작용에 기인 함을 확인하기 위해(DOX는 pH에 민감한 것으로 알려져 있으므로), pH 비민감성 분자인 CytoC도 실험하였다. COP@MSN에서 CytoC의 분비는 PBS에서 무시할만한 수준(~5%)이었으며, 이는 COP가 MSN 메조 기공을 효율적으로 캡핑함을 나타낸다(도 4e). 반대로 산성 조건(pH 4.0)에서는 COP 분리로 인해 CytoC의 빠른 방출이 일어났다. 대조 실험은 COP 캡핑없이 수행되었으며 120시간에서 pH7.4에서 ~30%, 및 pH5.0에서 ~75%의 DOX의 빠른 방출 속도를 보였다(도 4c). CytoC의 경우 방출 속도는 120시간 후 정체기에 도달하여 pH7.4에서 ~83%, pH5.0에서 ~89% 이었다(도 4f). COP 캡핑이 없는 경우, CytoC가 pH 민감성 분자가 아니기 때문에 모든 pH에서 CytoC 방출이 거의 동일했다.
이상의 결과는 COP@MSN 시스템이 효과적인 생체 분자 나노캐리어로서 작용할 수 있음을 확인한다. 세포 내 리소좀과 엔도좀은 pH가 낮다. 따라서, pH 기반 생체 분자 방출 시스템이 생체 분자 전달에 이용될 수 있다. 이러한 결과는 COP@MSN 나노 캐리어가 종양 치료를 위해 항암 바이오 분자를 국지적으로 방출하는 데 적용될 수 있음을 의미한다.
나노 입자에서 적하분자의 방출 속도는 두 가지 다른 pH 조건(7.4 및 5.0)에서 확인하였다. 인산염 완충액은 정상 조직 환경을 모방하는 반면, 낮은 pH 완충액은 암세포의 세포외 조직을 나타낸다. 정상 및 질환(암) 조직 간의 pH 차이를 이용하여 항암 화학 치료를 위한 자극 유발 전달 시스템을 개발할 수 있다. 예를 들어, 산성 pH에서 적하 분자를 전달하는 pH 민감성 약물 방출 시스템은 암 조직의 표적화 및 치료에 효과적이다.
실시예 5: COP@MSN 나노 입자의 약물전달(In Vitro)
CCK 분석을 이용한 나노 입자의 세포 독성 효과를 24시간 동안 다양한 용량의 자유 DOX, COP@MSN 및 COP@DOX-MSN 시스템에서 시험하였다. HeLa 세포는 DOX, COP@MSN 또는 COP@DOX-MSN 나노 입자로 처리된 경우 용량 의존적으로 세포 생존력이 현저히 감소하였다(도 5d). COP@DOX-MSN은 1-40μg/mL의 농도에서 자유 DOX와 비교했을 때, 비교적 낮은 독성을 보였다. 처음 24시간 동안 나노 입자에서 DOX가 방출되지 않아 자유 DOX 약물의 독성이 COP@DOX-MSN 나노 입자의 독성보다 약간 높았다. 반면에, COP@DOX-MSN은 40-360㎍/㎖ 농도에서 자유 DOX보다 독성이 높았다. COP@MSN에는 더 많은 Ce3+ 이온이 있으므로 COP@MSN의 독성은 COP 때문이다. COP@MSN 나노 입자의 독성의 원인 중 하나는 COP 나노 입자는 산화 스트레스 및 세포 독성을 부여하는 산화 효소 특성에 기인할 수 있다. 또 다른 원인은 COP의 세포 기관 내 산성 환경(lysosome) 또는 중성 환경(cytoplasm)에서 국지화 때문이다. 나노 입자는 약 100nm의 크기를 가지고 있으며 리소좀 경로를 통해 흡수된다. 산성 종양 환경에서는 세륨에 의해 과산화수소가 많이 생성된다. 이는 혈관 생성뿐만 아니라 종양의 성장을 멈추게한다. COP@MSN 나노 입자는 pH 민감성 때문에 잠재적으로 항암 생체 분자를 전달하는데 활용될 수 있다. 또한, COP에서 Ce의 산화상태는 노출된 세포에 대해 보호적이거나 독성의 역할을 결정하는데 주요 역할을 할 가능성이 있다.
HeLa 세포에 의한 COP@MSN, DOX 및 COP@DOX-MSN의 세포 내 섭취는 CLSM 및 FACS에 의해 확인되었다(도 5e). DOX, COP@DOX-MSN와 관련하여, HeLa 세포의 세포질 핵 주위에 DOX의 적색 형광이 관찰되었다. 자유 DOX의 경우, 4시간 후에 세포질에서 확산된 빨간 형광을 관찰했다. 유사하게, COP@DOX-MSN은 세포 내에서 명백한 적색을 띤다. 또한, FACS 분석은 자유 DOX 및 COP@DOX-MSN 그룹 모두에서 DOX 형광 강도가 96% 이상임을 나타냈다(도 5f).
나노 입자는 엔도사이토시스(endocytosis)를 통해 세포로 내재화될 수 있고 엔도사이트(endocytotic) 경로의 최종 구획인 리소좀에서 끝나는 것으로 알려져 있다. COP@MSN의 엔도사이토시스를 관찰하기 위해 형광 현미경을 사용했다(도 5a). 형광 녹색 Lysotracker로 리소좀을 염색하고 핵은 DAPI로 염색되었다. 처음에 HeLa 세포를 COP@MSN으로 처리한 다음 리소좀 염료로 처리했다. 형광 분석에 따르면 COP@MSN이 HeLa 세포로 급속하게 들어가는 것으로 나타났다. COP@MSN은 주로 리소좀에 국지화되어 세포 독성을 일으킨다. 리소좀 내부에는 산성 환경이 있어 COP에 산화 효소와 같은 성질을 부여하여 세포에 산화 스트레스와 세포 독성을 유발한다. 이 결과는 COP가 캡핑제뿐만 아니라 pH 의존적인 항종양제로서 역할을 확립하는 것이기 때문에 중요하다.
COP는 산성 환경에서 2,2-아자노비스(3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산)(2,2-azinobis(3-ethylbenzothizoline-6-sulfonicacid)) 및 TMB와 같은 다른 산화제를 사용하여 산화 효소와 유사한 활성을 갖는 것으로 보고되었다. 이 특성은 TMB를 산화제로 사용하여 나노 입자의 산화 효소 유사 활성을 통해 리소좀 경로에 의한 COP@MSN의 세포 흡수 및 국지화를 평가하는 데 사용되었다. 따라서, 세포를 4시간 동안 COP@MSN의 다양한 농도(0, 5, 10, 20, 40, 60, 80 및 100㎍/mL)로 배양하고 분석을 위해 리소좀을 분리하였다. 분리된 리소좀의 산화 효소 유사 활성은 산화를 위한 TMB의 일정 농도에서 UV 스펙트럼에 의해 측정되었다(도 5b). 세포에서 분리된 리소좀이 산화효소와 유사한 활성을 나타냄을 발견했다. 이 활성은 COP@MSN의 농도가 증가함에 따라 증가했다(도 5c).
아폽토시스는 대부분의 항암제가 암세포를 죽이는 매우 중요한 과정이다. 나노 입자, 자유 DOX 및 COP@DOX-MSN의 세포 아폽토시스를 정량적으로 결정하기 위해 아래 설명한 메카니즘에 의해 Annexin V/PI 염색 분석을 수행하였다. 음성 대조군과 COP@MSN로 배양한 괴사성 HeLa 세포의 비율은 각각 0.69와 27.41%였으며, COP에 의한 산화 스트레스에 의해 COP@MSN가 세포 사멸을 유도함을 추측케 한다. DOX와 COP@MSN의 조합은 자유 DOX 치료와 비교했을 때 세포 사멸을 증가시켰다. COP@DOX-MSN 나노 입자는 자유 DOX(도 5d)에 비해 독성을 현저하게 증가시켜 세포 사멸을 더 높였다. COP@MSN의 괴사 세포 백분율은 DOX와 세리아의 조합에 의한 것으로, COP@MSN이 COP에 의해 세포에 야기되는 산화 스트레스에 의해 세포 괴사를 유발한다는 것을 시사한다. 데이터로부터, HeLa 세포가 DOX와 COP@DOX-MSN 시스템에 의해 사멸하는 메커니즘은 다르며, COP@DOX-MSN 나노 입자 시스템에서 보다 높은 세포 사멸을 확인했다. 또한 DOX 약물이 엔도사이토시스에 의해 세포 내로 내재화 됨을 발견하였다.
실시예 6: COP@MSN 나노 입자의 ROS 생성 효과(in vitro)
암세포에 대한 세륨 기반 나노 입자의 세포 독성 효과는 COP의 산화제 유사 활성에 의해 중재된다. 산화제 유사 활성은 ROS 수준, 특히 H2O2의 양을 상당히 증가시키고 암 세포의 세포 사멸을 유도한다. 그러나 정상세포에서는 COP가 항산화 특성을 나타낸다.
본 발명은 약물과 나노 입자 사이의 아민 링커가 산성 환경(예를들어, 엔도좀과 리소좀)에서 양성자가 될 때 약물을 신속하게 방출하는 pH 반응성 약물을 설계한 것이다. 또한 엔도좀/리소좀에서 COP@DOX-MSN 나노 입자의 국지화 및 pH 의존성 약물 방출을 입증하였고, 산성 pH는 COP@DOX-MSN 나노 입자로부터 DOX 항암제 방출을 유도했다.
나노 입자가 정상세포 배양 조건에서 세포 독성을 나타내는 상기 결과를 토대로, ROS 수준의 조절에 대한 나노 입자의 가능한 기능을 측정하였다. 세포 내 ROS를 감지하는 형광 마커로 일반적으로 사용되는 H2DCFDA 마커를 사용했다. 이를 위해 세포를 H2O2로 처리하여 시험관 내(in vitro) ROS 생성 환경을 만들었다. 세포 내 반응 생성물의 형광 강도의 함수로서 생성되는 ROS를 측정하였다(도 7a). H2O2 100μL에 세포가 30분간 노출되었을 때 ROS의 유의한 생성이 있는 반면, H2O2 없는 조건에서 ROS의 유의한 생성이 없었다. 그러나, 세포를 4시간 동안 나노 입자로 처리한 경우에는, ROS 생성은 유의했다(도 7b). 나노 입자와 자유 DOX를 갖는 세포는 녹색 ROS 형광을 방출하였다. DOX와 함께 배양한 것뿐만 아니라 COP@MSN 나노 입자와 함께 배양한 결과는 치료되지 않은 대조군과 비교하여 30분 이내에 ROS 수준이 증가했다. DOX-MSN@COP는 높은 ROS를 결과하며, 화학요법과 ROS 생성에 의한 시너지 효과를 암시한다.
세륨의 활성은 pH에 의해 결정되며, 중성 pH에서 세포 보호를 산성 pH에서 세포 독성을 나타낸다. 따라서 세리아를 적용하여 건강한 세포를 보호하고, 세리아를 적용하여 암세포의 고유 pH에 따라 암 세포를 파괴하는 것이 암 치료에 유용한 방법이다.
도 8은 암 세포에서 pH에 의해 촉발된 DOX 담지된 COP@MSN 시스템의 세포 내 ROS 요법 및 화학 요법을 나타낸다. ROS 활동 전위와 종래의 화학 요법제의 조합은 종양 치료에서 이전에 보고된 바 없다. 또한, 산성 환경하에서 방출된 약물은 화학요법제로서 작용하고, COP에 의해 발생되는 ROS 생산은 암세포를 사멸시키는 데 시너지 효과를 갖는다. 따라서, pH는 세포 독성을 부여하는 데 주요 요소일 뿐만 아니라, 약물 경로 및 세리아 활성에 영향을 미치는 중요 인자로서 작용한다.

Claims (12)

  1. 실리카 화합물 및 계면활성제를 포함하는 용액을 이용하여 제조된 메조 다공성 실리카 기반 복합 나노 입자로서, 상기 나노 입자는 표면 카르복실기를 갖고 아민 기능화된 COP(cerium oxide nanoparticle)로 캡핑되며, 상기 약물은 상기 나노 입자 내 카르복실기와 결합을 형성할 수 있는 것인 pH 반응성 약물전달용 나노 입자.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 메조 다공성 실리카 기반 복합 나노 입자는 1 내지 5nm의 평균 기공 크기를 갖는 것인 pH 반응성 약물전달용 나노 입자.
  5. 제1항에 있어서, 상기 메조 다공성 실리카 기반 복합 나노 입자는 80 내지 130nm의 평균 직경을 갖는 것인 pH 반응성 약물전달용 나노 입자.
  6. 제1항에 있어서, 상기 pH 반응성 약물전달용 나노 입자의 Ce:Si의 몰비는 10~30:70~90인 pH 반응성 약물전달용 나노 입자.
  7. 제1항에 있어서, 상기 나노 입자는 pH 7.0 내지 8.0의 중성 pH 반응 조건에서의 약물 방출 속도와 비교하여 pH 3.0 내지 6.0의 산성 pH 반응 조건에서 1.5 내지 10배의 약물 방출 속도를 갖는 것을 특징으로 하는 나노 입자.
  8. 다음의 단계를 포함하는 pH 반응성 약물전달용 나노 입자 제조 방법:
    (a) 실리카 화합물 및 계면활성제를 포함하는 반응 용액을 이용하여 메조 다공성 실리카 기반 복합 나노 입자(MSN)을 제조하는 단계;
    (b) 상기(a)의 결과물에 아미노실란 및 숙신산 용액을 첨가하여 MSN 표면에 카르복실기를 생성하는 단계;
    (c) 상기(b)의 결과물에 카르복실기와 결합을 형성할 수 있는 약물을 내장하는 단계; 및
    (d) 상기(c)의 결과물에 아민 기능화된 COP를 캡핑하는 단계.
  9. 제8항에 있어서, 상기 단계(a)의 메조 다공성 실리카 기반 복합 나노 입자는 400℃ 내지 600℃ 에서 소성 처리되어 제조된 것인 pH 반응성 약물전달용 나노 입자 제조 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 단계(a)의 계면활성제는 CTAB(Cetyl trimethylammonium bromide), CPC(Cetylpyridinium chrolide), BAC(Benzalkonium chloride), BZT(Benzethonium chrolide), 5-브로모-5-니트로-1,3-다이옥산(5-Bromo-5-nitro-1,3-dioxane), 디메틸디옥타데실암묘늄 클로라이드(Dimethyldioctadecylammonium chloride), 세트리모늄 브로마이드(Cetrimonium bromide) 또는 DODAB(Dioctadecyldimethylammonium bromide)인 것인 pH 반응성 약물전달용 나노 입자 제조 방법.
  11. 제8항에 있어서, 상기 단계(a)의 실리카 화합물은 TEOS(Tetraethyl orthosilicate), TOMCATS(tetramethylcyclotetrasiloxane), 퓸드 실리카(fumed silica) 또는 규산나트륨(sodium silicate)인 것인 pH 반응성 약물전달용 나노 입자 제조 방법.
  12. 제8항에 있어서, 상기 단계(b)의 아미노실란은 APTES [(3-aminopropyl)-triethoxysilane], APDEMS[(3-aminopropyl)-diethoxy-methylsilane], APDMES[(3-aminopropyl)-dimethyl-ethoxysilane] 또는 APTMS[(3-aminopropyl)-trimethoxysilane]인 것인 pH 반응성 약물전달용 나노 입자 제조 방법.


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