KR20220068236A - 곤충을 영양소 스트림으로 전환하는 방법 및 이로 인한 프로덕트 - Google Patents

곤충을 영양소 스트림으로 전환하는 방법 및 이로 인한 프로덕트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 곤충을 영양소 스트림, 예컨대 퓨레, 효소적으로 가수분해된 퓨레, 지방 분획 및 단백질 분획으로 전환하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 방법에 의해 얻을 수 있는 (가수분해된) 퓨레 및 분획 그리고 식품 또는 사료 프로덕트 또는 이에 대한 성분으로서의 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 곤충 유충을 항산화 특성을 갖는 조성물로 전환하는 방법에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 또한 곤충 유충을 항산화제 조성물로 전환하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 얻을 수 있는 항산화 특성을 갖는 조성물 및 조성물의 건강 증진 식품 성분 또는 사료 성분으로서의 용도에 관한 것이다.

Description

곤충을 영양소 스트림으로 전환하는 방법 및 이로 인한 프로덕트
본 발명은 곤충을 영양소 스트림, 예컨대 퓨레, 효소적으로 가수분해된 퓨레, 지방 분획 및 단백질 분획으로 전환하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 방법에 의해 얻을 수 있는 (가수분해된) 퓨레 및 분획, 및 이의 식품 또는 사료 프로덕트로서의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 곤충 유충을 항산화 특성을 갖는 조성물로 전환하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 얻을 수 있는 항산화 특성을 갖는 조성물 및 조성물의 건강 증진 식품 성분 또는 사료 성분으로서의 용도에 관한 것이다.
도시 고체 폐기물 관리는 도시 정부가 직면한 가장 시급하고 심각한 환경 문제 중 하나로 여겨진다. 이러한 도전의 심각성은 급속한 도시화와 도시 인구의 증가 추세를 고려할 때 미래에 증가할 것이다. 현재 유기성 폐기물의 재활용은 모든 발생되는 도시 폐기물의 가장 큰 부분이지만, 여전히 상당히 제한적이다.
바이오-폐기물 전환에 대한 상당히 새로운 접근 방식은 예를 들어, 동애등에(black soldier fly)(아메리카 동애등에(Hermetia illucens)), 집파리(무스카 도메스티카(Musca domestica)) 및 밀웜(meal worm)(테네브리오 몰리토 엘.(Tenebrio molitor L.))을 사용하는 곤충 유충에 의한 것이다. 이의 인기는 동물 사료 또는 식품 프로덕트용 단백질 및 지방의 공급원으로 수확된 유충을 사용하여 단백질 및 지방의 다른 (동물) 공급원에 대한 귀중한 대안을 제공하는 유망한 기회와 연결된다.
많은 사람이 곤충을 통째로 섭취하는 것을 싫어하지만, 후속적으로 식품 및 사료 제조에 사용되는 별개의 지방 및 단백질의 공급원으로 곤충을 사용하는 것은 보다 수용적이다. 그러나, 곤충이 상업적으로 실용적인 영양소 공급원이 되기 위해서는 곤충의 생산 및 가공이 대규모로 실행되어야 하며 얻어진 영양소 스트림(nutrient stream)에 원치 않는 향미 및 변색이 없어야 한다.
대규모 곤충 생산 시설이 이미 사용 중이지만, 충분한 품질의 영양소 스트림을 경제적으로 제조하는 것은 여전히 도전으로 남아있다. 국제 특허 출원 WO2014123420에, 곤충 또는 벌레로부터 영양소 스트림을 얻기 위한 일반적인 방법이 기재되어 있다. 여기에 개시된 방법이 충분한 품질의 영양소 스트림을 제공할 수 있다는 사실에도 불구하고, 이러한 방법의 수율 및 이에 따라 얻어진 영양소 스트림의 품질을 추가로 증가시킬 필요가 남아 있다.
곤충은 일반적으로 전세계의 많은 문화권에서 음식으로 소비된다. 유럽 국가에서, 곤충 단백질은 동물 식이에서 고가의 단백질 성분으로 빠르게 수용되고 있다. 유럽 연합은 이미 애완동물 식품 및 양식 사료 제형(aquaculture feed formulation)에 곤충 단백질을 포함하는 것을 승인하였다. 치킨 밀(chicken meal) 및 피쉬 밀(fish meal)은 각각 애완동물 식품 및 양식 사료 제제(preparation)에서 일반적인 성분이다. 곤충 단백질은 이들 시장에서 치킨 밀 및 피쉬 밀의 대안으로서의 검토가 증가되고 있다. 산업적 규모로 생산되고 있는 모든 곤충 중에서 동애등에(아메리카 동애등에(Hermetia illucens)) 유충은 광범위한 유기 잔류물 및 독특한 영양 조성에서 성장하는 능력으로 인해 특별한 주목을 받아왔다. 양식 및 애완동물 식이에서 동애등에 유충(BSF) 단백질의 영양적 적합성은 잘 확립되어 있다.
애완동물(pet)은 나이가 들면서 다양한 건강 장애가 발생한다. 노화는 애완동물의 체내에서 자유 라디칼 손상을 가속화하여 인지 및 로코모토 시스템(locomotor system)의 오작동으로 초래할 수 있다. 마찬가지로 면역 반응의 결과로서 어류의 산화 스트레스는 면역 반응 등이 제대로 발휘되지 못하는(compromised) 건강을 초래할 수 있다. 호중구(백혈구(white blood cells))는 신체의 1차 방어 메커니즘을 담당한다. 신호를 수신하면, 호중구는 병원성 미생물의 침입 부위로 돌진한다. 그 후, 호중구는 식세포 작용 및 활성 산소종(ROS)의 방출에 의해 병원체를 비활성화한다. ROS의 생성은 숙주 방어에 중요하다. 그러나, 장기적으로, 호중구에 의한 과도한 ROS 생성은 동물 세포를 손상시키고 세포 노화, 암, 면역 저하 등을 유발할 수 있다. ROS를 소거할 수 있는 식이 중재(dietary intervention)는 동물 신체의 산화적 손상을 줄이고 결과적으로 건강 상태를 유지하는데 도움이 될 수 있다. 당해 분야는 이러한 식이 중재를 필요로 한다.
본 발명은 선행 기술에 공지된 방법에 비해 곤충으로부터 얻어지는 영양소 스트림의 수율 및 품질을 추가로 개선하는 것을 목적으로 한다. 본 발명은 또한 이러한 방법으로 얻어진 영양소 스트림을 목적으로 한다.
본 발명의 제1 측면은 곤충을 영양소 스트림으로 전환하는 방법에 관한 것으로,
a) 신선한 곤충을 제공하고 이의 펄프를 제조하는 단계;
b) 펄프를 60℃-95℃의 온도에서 50초-100초 동안 가열하는 단계
c) 가열된 펄프를 물리적 분리 단계에 적용하여 지방 분획, 수성 단백질 분획 및 고체-함유 분획을 얻는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 측면은 곤충을 영양소 스트림으로 전환하는 방법에 관한 것으로,
a) 신선한 곤충을 제공하고 이의 펄프를 제조하는 단계; 및
b) 펄프를 60℃-95℃의 온도에서 50초-100초 동안 가열하는 단계,
에 의해 곤충 퓨레(펄프)를 얻는 단계를 포함한다. 영양소 스트림은 동애등에(BSF, Black Soldier Fly) 유충과 같은 신선한 곤충으로부터 제조된 펄프를 가열한 후에 얻어지는 곤충 퓨레이다. 선택적으로, 상기 방법은 단계 b) 후에 추가 단계 c): 가열된 펄프를 물리적 분리 단계에 적용하여 지방 분획, 수성 단백질 분획 및 고체-함유 분획을 얻는 단계를 포함한다. 단백질 분획의 건조는 BSF 유충과 같은 곤충에서 얻어진 프로틴 밀(protein meal)을 드러낸다.
본 발명의 일 측면은 곤충을 영양소 스트림으로 전환하는 방법에 관한 것으로서,
a) 신선한 곤충을 제공하고 이의 펄프를 제조하는 단계;
a1) 단계 a)의 펄프를 미리 정해진(predetermined) 온도에서 미리 정해진 시간 동안 펩티다아제와 접촉시켜 상기 펄프를 효소 가수분해시키는 단계; 후속적으로
b) 단계 a1)의 가수분해된 펄프를 60℃-95℃의 온도에서 50초-100초 동안 가열하는 단계,
이에 의해 가수분해된 곤충 퓨레를 얻는 단계를 포함한다. 영양소 스트림은 BSF 유충과 같은 신선한 곤충에서 얻어진 펄프, 가수분해된 펄프를 가열한 후 얻어지는 가수분해된 곤충 퓨레이다. 선택적으로, 상기 방법은 단계 b) 후에 추가 단계 c): 가열되고 가수분해된 펄프를 물리적 분리 단계에 적용하여 지방 분획, 수성 단백질 분획 및 고체-함유 분획을 얻는 단계를 포함한다. 단백질 분획의 건조는 BSF 유충과 같은 곤충에서 얻어지는 가수분해된 프로틴 밀을 드러낸다.
본 발명의 방법으로 가공된 곤충으로부터 지방의 수율을 증가시키는 것이 가능함을 발견하였다. 놀랍게도 본 발명의 시간-온도 조합을 사용함으로써 단백질 분획에 더 적은 오일이 포획(entrap)된다는 것이 발견되었다. 본 발명의 방법은 본 발명의 단계 b) 및 단계 c)에서 단백질 응집 및 과립 형성이 더 적기 때문에, 100초 보다 긴, 예컨대 적어도 5분의 가열 시간을 적용하는 방법과 비교할 때, 더 적은 오일이 그러한 단백질 응집체에 그리고 그 내부에 포획될 수 있다 (임의의 이론에 의해 구속되는 것을 원하지 않음). 또한 펄프 및 영양소 분획의 변색이 감소되는 것으로 밝혀졌다. 본 발명의 방법은 또한 선행 기술에서 이전에 제안된 바와 같이 펄프를 가열하는 데 필요한 시간이 상당히 적기 때문에 에너지를 절약한다. 또한, 본 발명자는 가열된 곤충 펄프 및 가열된 가수분해된 곤충 펄프가 항산화 특성을 갖는다는 것을 발견하였다.
일 구현예에서, 곤충을 영양소 스트림으로 전환하는 방법으로서,
a) 신선한 곤충을 제공하고 이의 펄프를 제조하는 단계;
b) 펄프를 60℃-95℃의 온도에서 50초-100초 동안 가열하는 단계
c) 가열된 펄프를 물리적 분리 단계에 적용하여 지방 분획, 수성 단백질 분획 및 고체-함유 분획을 얻는 단계를 포함하며, b) 단계 이전에 펄프를 효소로 처리하는 단계 a1)(예, 펄프 중의 단백질의 효소적 가수분해)을 추가로 포함한다. 펄프는 40℃ 내지 70℃의 온도, 바람직하게는 45℃ 내지 65℃, 보다 바람직하게는 50℃±2℃ 또는 약 50℃의 온도에서 0.5시간-3시간, 예컨대 1시간 내지 2시간 동안 효소로 처리될 수 있다. 효소는 펩티다아제와 같은 프로테아제일 수 있으며, 바람직하게는 효소는 플라보자임(Flavourzyme)이다. 가열 단계 b) 이전의 이 효소 처리 단계 a1)은 얻어진 곤충(유충) 퓨레의 유리 아미노산 함량 및 소화율을 증가시키고 후속하는 분리 단계 c)에서 펄프 및 단백질 분획으로부터 지방 분리를 개선하는 것으로 밝혀졌다(지방/지질이 적은 단백질이 얻어진다). 더욱이, 상기 방법의 단계 b) 및 c) 후에 얻어진 가열된 펄프 및 단계 a1) 및 단계 b) 및 단계 c) 후에 얻어진 가열된 효소 가수분해된 펄프는 둘 모두 항산화 특성을 갖는 것으로 확인되었다.
본 발명의 제2 측면은 본 발명에 따른 방법에 의해 얻을 수 있는 지방 분획에 관한 것이다. 곤충의 지방 분획은 상당한 양의 불포화 지방산을 포함하기 때문에, 가열 시간을 줄이는 것은 얻어지는 지방 분획의 품질에 상당한 영향을 미친다. 즉, 지방 분획은 선행 기술에 이미 알려진 방법으로 얻어진 분획보다 덜 산패한다.
본 발명의 일 측면은 본 발명의 방법으로 얻어진, 가열된 곤충 퓨레, 바람직하게는 가열된 BSF 유충 퓨레에 관한 것이다. 이러한 가열된 곤충 퓨레는 놀랍게도 항산화 특성을 가지며 항산화 사료 또는 식품 또는 이의 성분으로 사용하기에 적합하다.
본 발명의 일 측면은 가수분해된 곤충 퓨레, 바람직하게는 가수분해된 BSF 유충 퓨레에 관한 것이다. 예를 들어 펩티다아제의 영향 하에서, 가열 단계 이전에 곤충 퓨레의 가수분해는 항산화 활성이 개선된 퓨레를 생성한다. 더욱이, 이러한 가수분해된 퓨레로부터 분리된 단백질은 본 발명의 방법에 따라 얻어지는 가수분해되지 않은 퓨레와 비교하여, 그리고 예를 들어, 30 분의 연장된 가열 단계를 적용함으로써 통상적으로 얻어지는 가수분해되지 않은 퓨레와 비교하여 개선적으로 더 적은 지방을 포함한다.
본 발명의 일 측면은 본 발명의 방법으로 얻어진 가열된 곤충 퓨레, 바람직하게는 가열된 BSF 유충 퓨레에 관한 것이다. 이러한 가열된 곤충 퓨레는 놀랍게도 항산화 특성을 가지며 건강 증진 사료 또는 식품 또는 이의 성분으로 사용하기에 적합하다.
본 발명의 일 측면은 가수분해된 곤충 퓨레, 바람직하게는 가수분해된 BSF 유충 퓨레에 관한 것이다. 예를 들어 펩티다아제의 영향 하에서, 가열 단계 이전에 곤충 퓨레의 가수분해는 항산화 특성이 향상된 퓨레를 생성한다. 더욱이, 이러한 가수분해된 퓨레로부터 분리된 단백질은 본 발명의 방법에 따라 얻어지는 가수분해되지 않은 퓨레와 비교하여, 그리고 예를 들어, 30 분의 연장된 가열 단계를 적용함으로써 통상적으로 얻어지는 가수분해되지 않은 퓨레와 비교하여 개선적으로 더 적은 지방을 포함한다.
본 발명의 제3 측면은 본 발명에 따른 방법으로 얻어진 단백질 분획에 관한 것이다. 더 낮은/더 짧은 온도-시간-조합으로 인해 단백질은 공지된 곤충 단백질 분획보다 더 적은 지방을 포획(entrap)하였다. 더욱이, 비교적 온화한 처리 조건으로 인해 단백질의 적어도 일부는 기능을 유지하게 될 것이다. 더욱이, 비교적 온화한 처리 조건은 더 긴 처리 시간 및/또는 더 긴 시간 동안 더 높은 온도에서 처리함으로써 유도된 변색과 비교하여, 예를 들어 메일라드(Maillard) 반응에 의한 변색을 감소시킨다. 이는 상기 단백질 분획의 다양한 적용의 용도를 허용한다.
본 발명의 일 측면은 가수분해된 펄프가 펄프를 가열하는 단계에 적용되기 전에 곤충 펄프의 효소적 가수분해 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 방법으로 얻어진 단백질 분획에 관한 것이다. 더 낮은/더 짧은 온도-시간-조합 및 가수분해 단계로 인해, 단백질은 공지된 곤충 단백질 분획보다 더 적은 지방을 포획하였다. 더욱이, 비교적 온화한 처리 조건은 더 긴 처리 시간 및/또는 더 긴 시간 동안 더 높은 온도에서 처리함으로써 유도된 변색과 비교하여, 예를 들어 메일라드 반응에 의한 변색을 감소시킨다. 이는 상기 단백질 분획의 다양한 적용의 용도를 허용한다.
본 발명의 제4 측면은 상기 지방 분획 및/또는 단백질 분획 및/또는 곤충 퓨레 및/또는 가수분해된 곤충 퓨레의 식품 또는 사료 프로덕트, 또는 이의 성분으로서의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 제5 측면은 본 발명에 따른 방법의 단계 a) 및 b), 또는 단계 a), a1) 및 b)에 의해 얻을 수 있는 곤충 펄프에 관한 것이다. 바람직하게는, 곤충 펄프는 동애등에 유충 펄프이다.
본 발명의 제6 측면은 가수분해된 곤충 펄프 및/또는 곤충 펄프, 예컨대 (가수분해된) 동애등에 유충 펄프의 항산화 식품 성분 또는 사료 성분으로서의 용도에 관한 것으로, 상기 (가수분해된) 펄프는 본 발명의 방법으로 얻을 수 있으며, 상기 방법은 방법의 단계 b) 이전에 효소 가수분해 단계 a1)을 포함하거나 포함하지 않는다.
본 발명의 일 측면은 가수분해된 곤충 펄프 및/또는 곤충 펄프, 예컨대 (가수분해된) 동애등에 유충 펄프의 건강증진 식품 성분 또는 사료 성분으로의 용도에 관한 것으로, 상기 (가수분해된) 펄프는 본 발명의 방법으로 얻을 수 있으며, 상기 방법은 방법의 단계 b) 이전에 효소 가수분해 단계 a1)을 포함하거나 포함하지 않는다.
본 발명의 제7 측면은 가수분해된 곤충 펄프 및/또는 곤충 펄프, 예컨대 동애등에 유충 펄프의 식품 성분 또는 사료 성분으로의 용도에 관한 것으로, 상기 (가수분해된) 펄프는 본 발명의 방법으로 얻을 수 있으며, 상기 방법은 방법의 단계 b) 이전에 효소 가수분해 단계 a1)을 포함하거나 포함하지 않는다.
본 발명의 일 측면은 사료 또는 사료 성분으로, 특히 애완동물 식품으로 사용되는 본 발명에 따른 곤충 펄프 또는 가수분해된 곤충 펄프 또는 이의 유도체에 관한 것이다.
본 발명의 일 측면은 본 발명에 따른 곤충 펄프 또는 가수분해된 곤충 펄프 또는 그의 유도체의 건강 증진 가능성(health promoting potential)을 갖는 식품 또는 사료 성분으로서의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 일 측면은 세포 산화 손상(cellular oxidative damage)의 예방 및/또는 억제 방법에 사용하기 위한 본 발명에 따른 곤충 펄프 또는 가수분해된 곤충 펄프 또는 그의 유도체에 관한 것이다.
도 1은 펄프의 가열 시간의 함수로서 BSF 유충 펄프에서의 지방 분리를 나타낸다.
도 2는 BSF 유충 퓨레의 가열 시간이 곤충 펄프의 색상에 미치는 영향을 도시한다.
도 3a: BSF 유충 퓨레 및 퓨레의 총 중량을 기준으로 0.1wt% 또는 0.5wt% 펩티다아제가 처리된 BSF 유충 퓨레에서의 유리 아미노-산 ?t량.
도 3b: BSF 유충 퓨레 및 퓨레의 총 중량을 기준으로 0.1wt% 또는 0.5wt% 펩티다아제가 처리된 BSF 유충 퓨레의 펩신 소화율.
도 3c: BSF 유충 퓨레 및 퓨레의 총 중량을 기준으로 0.1wt% 또는 0.5wt% 펩티다아제가 처리된 BSF 유충 퓨레에서 분리된 프로틴 밀 중의 지질(지방) 함량.
도 4: 30분 인큐베이션 후 BSF PureeXTM(BSF-P), BSF 가수분해된 퓨레(BSF-HP), 치킨 밀(CM) 및 피쉬 밀(FM)의 DPPH 라디칼 소거 활성(n=3).
도 5: 60분 인큐베이션 후 BSF PureeXTM(BSF-P), BSF 가수분해된 퓨레(BSF-HP), 치킨 밀(CM) 및 피쉬 밀(FM)의 DPPH 라디칼 소거 활성(n=3).
도 6: 30분 인큐베이션 후 BSF PureeXTM(BSF-P), BSF 가수분해된 퓨레(BSF-HP), 치킨 밀(CM) 및 피쉬 밀(FM)의 ABTS 양이온 라디칼 소거 활성(n=3).
도 7: SIEFED 어세이를 사용한 BSF PureeXTM(BSF-P), BSF 가수분해된 퓨레(BSF-HP), 치킨 밀(CM) 및 피쉬 밀(FM)의 MPO 반응 조절 활성(n=3).
도 8: 클래식 측정(classical measurement)을 사용한 BSF PureeXTM(BSF-P), BSF 가수분해된 퓨레(BSF-HP), 치킨 밀(CM) 및 피쉬 밀(FM)의 MPO 반응 조절 활성(n=3).
도 9: BSF PureeXTM(BSF-P), BSF 가수분해된 퓨레(BSF-HP), 치킨 밀(CM) 및 피쉬 밀(FM)의 호중구 반응 조절 활성(n=3).
도 10: 메탄올에서 수행된 WSEP의 ABTS 라디칼 소거 활성. 결과는 3회 반복한 3개의 독립적인 어세이의 평균 ± SD이다.
본원에서 사용된 용어 "곤충"은 성충, 곤충 유충, 곤충 전용(prepupae) 및 번데기(pupae)와 같은 임의의 발달 단계에 있는 곤충을 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "부화(hatching)"는 통상적인 의미를 가지며 어린 유충이 알에서 나오는 과정을 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "유충"은 통상적인 의미를 가지며, 완전변태 곤충(holometabolous insect)의 유년기(juvenile stadium), 예컨대 동애등에 유충을 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "부화한 유생(hatchling)" 또는 "신생충(neonate)"는 통상적인 의미를 가지며 알에서 막 부화한 유충을 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "전용(prepupae)"는 유충의 키틴 함량이 상당히 증가된 마지막 유충 단계를 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "번데기(pupae)"는 통상적인 의미를 가지며 유충에서 성충, 예컨대 동애등에로 변태하는 곤충 생활의 단계를 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "펄프" 또는 "곤충 펄프" 또는 "퓨레" 또는 "유충 퓨레"는 모두 동일한 의미를 가지며 곤충을 0.5mm 미만의 크기로 기계적으로 크기를 감소시킨 후 얻어지는 프로덕트를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "영양소 스트림(nutrient stream)"은 통상적인 의미를 가지며 지방, 단백질 및 단백질-유래 물질, 탄수화물, 미네랄 및/또는 키틴과 같은 영양소를 함유하는 스트림을 지칭한다. 본 발명의 맥락 내에서, 키틴은 또한 영양소로 간주된다.
용어 "항산화 특성"은 일반적인 과학적 의미를 가지며 본원에서는 항염증 반응과 같은 항산화 활성을 갖는 항산화제로 구성되거나 이를 포함하는, 본 발명의 퓨레 및 가수분해된 퓨레 그리고 본 발명의 방법으로 얻을 수 있는 것과 같은 화합물 또는 조성물을 의미한다. 전형적으로, 이러한 항염증 반응은 예를 들어 애완동물 또는 인간 대상체와 같은 포유동물의 세포, 또는 어류의 세포에서, 예를 들어 활성산소종(reactive oxygen species)에 의해 유도된 염증 반응에 대한 반응이다. 예를 들어 "Antioxidants in Food: Practical Applications"(Jan Pokorny, Nedyalka Yanishlieva 및 Michael Gordon(편집자), 2001, Cambridge: CRC Press, Woodhead Publishing Ltd. ISBN 1 85573 463 X, CRC Press, ISBN 0-8493-1221-1)의 제1, 5 및 6장이 참조된다. 항산화제는, 항산화 활성을 갖는 화합물 또는 항산화 활성을 갖는 조성물 또는 숙주 면역 반응으로 인한 산화적 손상에 대한 활성과 같은 항산화 활성을 갖는 화합물을 포함하는 조성물이다. 예를 들어 항산화제는 산화를 억제한다. 예를 들어 대상체에서 산화, 예를 들어 활성산소종은 세포 (산화적) 손상을 유도한다.
'건강증진 식품,' '건강증진 활성,' '건강증진 특성,' 및 '건강증진 가능성'에서와 같은 '건강증진'이라는 용어는 일반적인 과학적 의미를 가지며 본원에서 본 발명의 퓨레 또는 가수분해된 퓨레, 또는 본 발명에서 얻을 수 있은 것과 같은 화합물 또는 조성물이 동물에 의해 소비될 때, 이러한 화합물 또는 조성물의 동물, 예컨대 포유동물(mammal), 예컨대 애완동물 또는 인간 대상체에 대한 효과를 지칭한다. 건강 증진 가능성이 있는 화합물 또는 조성물의 소비는 동물, 예컨대 포유동물, 예컨대 애완동물 또는 인간 대상체의 건강 상태에 기여하거나 지지하거나 촉진시키거나 증가시키거나 유지시킨다. 예를 들어 "Antioxidants in Food: Practical Applications"(Jan Pokorny, Nedyalka Yanishlieva and Michael Gordon (editors), 2001, Cambridge: CRC Press, Woodhead Publishing Ltd. ISBN 1 85573 463 X, CRC Press, ISBN 0-8493-1221-1)의 제1, 5 및 6장이 참조된다.
본 발명의 제1 측면은 곤충을 영양소 스트림으로 전환하는 방법에 관한 것으로,
a) 신선한 곤충을 제공하고 이의 펄프를 제조하는 단계;
b) 펄프를 60℃-95℃의 온도에서 50초-100초 동안 가열하는 단계;
c) 가열된 펄프를 물리적 분리 단계에 적용하여 지방 분획, 수성 단백질 분획 및 고체-함유 분획을 얻는 단계를 포함한다. 설명, 실시예, 구현예, 청구범위 전체에 걸쳐, 용어 "퓨레"와 "펄프"는 동일한 의미를 갖는다.
놀랍게도 본 발명의 방법으로 가공된 곤충으로부터 지방의 수율을 증가시킬 수 있다는 것을 발견하였다. 본 발명의 시간-온도 조합을 사용함으로써 단백질 분획에 더 적은 오일이 포획된다는 것을 추가로 발견하였다. 또한 펄프 및 영양소 분획의 변색이 감소되는 것을 또한 발견하였다. 본 발명의 방법은 또한, 선행 기술에서 이전에 제안된 방법에 필요한 시간과 대조적으로, 펄프를 가열하는 데 필요한 시간이 상당히 적기 때문에 에너지가 절약된다.
본 발명의 일 측면은 곤충을 영양소 스트림으로 전환하는 방법에 관한 것으로,
a) 신선한 곤충을 제공하고 이의 펄프를 제조하는 단계; 및
b) 펄프를 60℃-95℃의 온도에서 50초-100초 동안 가열하는 단계,
에 의해 곤충 퓨레(펄프)를 얻는 단계를 포함한다. 영양소 스트림은 동애등에(BSF, Black Soldier Fly) 유충과 같은 신선한(fresh) 곤충으로부터 제조된 펄프를 가열한 후에 얻어지는 곤충 퓨레이다. 선택적으로, 상기 방법은 단계 b) 후에 추가 단계 c): 가열된 펄프를 물리적 분리 단계에 적용하여 지방 분획, 수성 단백질 분획 및 고체-함유 분획을 얻는 단계를 포함한다. 단백질 분획의 건조는 BSF 유충과 같은 곤충에서 얻어진 프로틴 밀(protein meal)을 드러낸다.
본 발명의 일 측면은 곤충을 영양소 스트림으로 전환하는 방법에 관한 것으로서,
a) 신선한 곤충을 제공하고 이의 펄프를 제조하는 단계;
a1) 단계 a)의 펄프를 미리 정해진(predetermined) 온도에서 미리 정해진 시간 동안 펩티다아제와 접촉시켜 상기 펄프를 효소 가수분해시키는 단계; 후속적으로
b) 단계 a1)의 가수분해된 펄프를 60℃-95℃의 온도에서 50초-100초 동안 가열하는 단계,
이에 의해 가수분해된 곤충 퓨레를 얻는 단계를 포함한다. 영양소 스트림은 BSF 유충과 같은 신선한 곤충에서 얻어진 펄프, 가수분해된 펄프를 가열한 후에 얻어지는 가수분해된 곤충 퓨레이다. 선택적으로, 상기 방법은 단계 b) 후에 추가 단계 c): 가열되고 가수분해된 펄프를 물리적 분리 단계에 적용하여 지방 분획, 수성 단백질 분획 및 고체-함유 분획을 얻는 단계를 포함한다. 단백질 분획의 건조는 BSF 유충과 같은 곤충에서 얻어진 가수분해된 프로틴 밀을 드러낸다.
민스된(minced) 유충과 같은 효소-처리된 곤충 펄프 및 효소 처리가 없는 (대조군) 곤충 펄프(예, 효소에 의해 가수분해되지 않은 민스된 유충)는 예를 들어 90℃로 가열되고 펄프는 예를 들어 이 온도에서 80초 동안 유지된다. 얻어진 곤충 퓨레는 유리 아미노산 함량 및 소화율 측정을 위해 시험될 수 있다. 가열된 BSF 유충 펄프와 같은 가열된 곤충 펄프 및 가열 단계 전에 효소 처리 후 가열된 펄프에서 프로틴 밀을 얻을 수 있다. 예를 들어, 프로틴 밀은 90℃에서의 가열하는 단계 전에 0.1wt%, 또는 0.5wt% 플러버자임(Flavourzyme)을 사용하여 먼저 단백질의 효소 가수분해 처리된 가열된 BSF 유충 펄프의 배치의 펄프에서 단백질 분리, 증발, 건조 및 분쇄의 단계에 의해 얻어진다. 가열 전에 효소 처리되지 않은 곤충 퓨레와 비교하여, 가열 전에 곤충 퓨레(BSF 유충 퓨레)가 효소 처리될 때 지방이 단백질 분획으로부터 더 많이 분리된다는 것은 본 발명의 일부이다. 본 발명에 따르면, 적용된 효소의 양을 고려할 때, 단백질로부터 용량 의존적 정도(dose dependent extent)의 지방 분리가 얻어진다. 따라서, 본 발명에 따르면, 가열하는 단계 전에 플러버자임을 사용한 예를 들어, 민스된 BSF 유충과 같은 민스된 유충의 효소 처리는 유리 아미노산 함량을 증가시키고 얻어진 가수분해된 유충 퓨레의 펩신 소화율을 증가시키며, 결과적으로, 가수분해된 단백질을 포함하는 얻어진 퓨레는 본 발명에 따른 더 좋은 맛(유리 아미노산 함량은 동물 및 인간이 유리 아미노산을 포함하는 프로덕트를 소비할 때 매력적이고, 마음에 드는 맛에 관련된다)을 가지며, 고도로 소화가능하고 항산화 특성을 갖는다(하기의 시험 결과 참조). 또한, 본 발명에 따른, BSF 유충 펄프의 효소 처리는, 90℃에서 가열하기 전에 효소 가수분해 단계를 거치지 않은 유충 퓨레로 얻어진 단백질 분획으로부터의 지방 분리와 비교할 때, 효소적 가수분해 및 효소적으로 다이제스트된 펄프의 열처리 후의 후속 분리 단계에서 지방 분리를 개선하며, 이는 프로틴 밀로부터의 지방 추출을 증가시킨다.
선행 기술에 곤충 펄프로부터 영양소 스트림을 분리하기 위한 방법이 기술되어 있지만, 비교적 온화한(mild) 처리, 즉 비교적 낮은 그리고 짧은 온도/시간 처리가 지방의 수율을 증가시킬 수 있다는 것은 지금까지는 인식되지 않았었다. 이와 관련하여 WO2014/123420가 참조되며, 여기에 영양소 스트림을 분리하는 방법이 기재되어 있지만, 곤충 펄프로부터 얻어진 지방의 수율을 증가시키기 위해서는 비교적 길고 높은 온도/시간 조합이 사용되어야 하는 것으로 고려되었다.
그러나, 길고 높은 온도/시간 조합의 사용은 영양소 스트림, 특히 얻어진 지방 분획의 품질에 부정적인 영향을 미친다. 예를 들어, 곤충 펄프를 비교적 높은 온도에서 비교적 장시간 가열하면 펄프가 변색된다. 또한, 가공된 곤충의 지방 분획은 비교적 높은 양의 불포화지방산을 함유하므로, 지방이 산패하게 된다. 이는 지방 분획의 풍미-상실(off-flavour)을 유발하고 사용 범위를 제한한다.
본 발명의 방법으로 이러한 문제가 대부분 극복된다. 우선, 본 발명의 방법으로 곤충 펄프의 변색이 크게 감소된다. 본 방법의 추가의 놀라운 이점은 곤충 펄프로부터 얻어지는 지방 분획이 당업계에 공지된 방법으로 얻어지는 지방 분획보다 덜 산패된다는 것이다. 또한, 가공된 곤충으로부터의 지방 수율도 상당히 더 높다. 임의의 이론에도 구속되지 않고, 공지된 방법을 사용할 때 지방의 상당 부분이 변성된 단백질 내에 포획되는 것으로 추정된다. 보다 온화한 처리 조건을 사용함으로써, 이러한 지방의 포획(entrapment)이 방지될 수 있으며, 그 결과 곤충 펄프로부터 지방의 수율이 더 높아진다. 또한, 단백질과의 메일라드(Maillard) 반응은 온화한 온도에서 짧은 가열 시간으로 인해 덜 발생한다.
일 구현예는 곤충이 곤충 유충, 바람직하게는 동애등에 유충인 본 발명에 따른 방법이다.
일 구현예는 동애등에 유충이 12일 내지 30일령, 바람직하게는 14일 내지 28일, 보다 바람직하게는 14일 내지 26일, 가장 바람직하게는 유충이 전용으로 변태하기 전 12시간 내지 3일, 예컨대 변태 전 1일 내지 2일인 본 발명에 따른 방법이다.
일 구현예는 펄프가 가열 전에 효소적으로 처리되지 않는 본 발명에 따른 방법이다.
일 구현예는 본 발명에 따른 방법으로서, 상기 방법이 단계 b) 이전에 효소에 의해 펄프를 처리하는 단계 a1)을 추가로 포함하는 방법이다.
일 구현예는 본 발명에 따른 방법으로서, 상기 방법이 단계 b) 이전에 효소에 의해 펄프를 처리하는 단계 a1)을 추가로 포함하고, 펄프는 40℃ 내지 70℃의 온도, 바람직하게는 45℃ 내지 65℃, 보다 바람직하게는 50℃±2℃의 온도에서 0.5시간 내지 3시간, 바람직하게는 1시간 내지 2시간 동안 효소로 처리되는 방법이다.
일 구현예는 본 발명에 따른 방법으로서, 상기 방법은 단계 b) 이전에 효소로 펄프를 처리하는 단계 a1)을 추가로 포함하고, 효소는 펩티다아제와 같은 프로테아제, 바람직하게는 적어도 하나의 프로테아제 및 적어도 하나의 펩티다아제의 혼합물, 예컨대 플라보자임(Flavourzyme)이다.
일 구현예는 단계 a)에서 펄프가 곤충을 민싱(mincing)하여 제조되는 본 발명에 따른 방법이다.
일 구현예는 단계 a)의 펄프 중의 곤충 잔해의 평균 입자 크기가 10 마이크론 내지 500 마이크론 범위인 본 발명에 따른 방법이다.
일 구현예는 단계 b)에서 펄프가 60℃-95℃의 온도에서 60초-90초 동안, 특히 90℃±2℃의 온도에서 75초-85초 동안 가열되는 본 발명에 따른 방법이다.
일 구현예는 물리적 분리 단계가 디캔팅(decanting) 및/또는 원심분리를 포함하는 본 발명에 따른 방법이다.
일 구현예는 수성 단백질 분획 및 고체-함유 분획이 단계 (c) 후에 바람직하게는 분무-건조, 보다 바람직하게는 유동층 건조에 의해 함께 건조되는 본 발명에 따른 방법이다.
일 구현예는 수성 단백질 분획 및 고체-함유 분획이 단계 c) 후에 별도로 건조되고, 수성 단백질 분획은 바람직하게는 분무 건조, 유동층 건조, 동결 건조(lyophilization) 또는 굴절 건조, 또는 이들의 조합에 의해 건조된다.
분리 단계, 즉 단계 c)의 결과로, 지방 분획, 수성 단백질 분획 및 고체-함유 분획이 얻어진다. 이러한 방식에서, 이 방법은 여러 영양소 스트림을 직접 생성한다. 다른 분획의 분리가 일반적으로 본 발명의 최종 목표이지만, 단계 b) 후에 얻어진 곤충 펄프를 사용하는 것이 유리한 적용도 있다. 따라서, 본 발명은 또한 상기한 바와 같지만 단계 a) 및 b)만을 포함하는 방법에 관한 것이다. 그 후 펄프는 보관될 수 있고, 포장될 수 있고 예컨대 식품 또는 사료 성분으로 가능하게 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 상기 방법의 단계 a) 및 b)에 의해 얻을 수 있는 또는 얻어지는 곤충 펄프에 관한 것이다.
곤충 펄프를 제조하기 위해 사용되는 곤충은 바람직하게는 곤충 유충, 바람직하게는 완전변태 곤충의 유충이다. 유충은 전용이 되기 전에 곤충 펄프로 제조되는 것이 바람직하다. 곤충 펄프의 제조에 전용을 사용할 수 있지만, 전용의 키틴 함량은 전용으로 변형되기 전의 '정상' 유충에 비교하여 상대적으로 높기 때문에, 전용을 인간이나 동물이 소비하는 영양 공급원으로 제조하는 것은 덜 적합하다. 동애등에의 유충을 사용하는 것이 매우 바람직하며, 유충이 재배(cultivate) 되었지만 아직 전용 단계에 도달하지 않은 것이 가장 바람직하다. 전형적으로 이는 부화 후 10일-30일, 바람직하게는 12일-28일, 보다 바람직하게는 14일-24일, 예컨대 14, 16, 18, 20, 22일 동안 정상적인 성장 조건에서 성장하도록 허용되었다. 유충으로부터의 영양소 스트림의 최대 수율을 위해, 전용상(prepupae phase)으로 변태되기 직전에 유충에 본 발명의 방법을 적용하는 것이 바람직하다.
따라서, 유충이 전용으로의 변태를 시작하기 12시간 내지 3일 전에, 바람직하게는 전용으로 변태하기 1일 내지 2일 전에 유충을 본 발명의 방법에 적용하는 것이 유리하다. 동애등에 유충과 같은 유충은, 전용으로의 변태 단계 직전에 있을 때, 가장 큰 크기에서 유충 생활사 중 초기 및 후기 단계와 비교하여 최대량의 단백질과 지방을 함유한다. 또한, 동애등에의 유충을 고려할 때, 전용으로 변태를 시작하는 유충은 연한 노란색(light-yellow)에서 회색/갈색으로 변색하며, 이는 연한 색상의 흰색/노란색 단백질이 요구되는 경우에 바람직하지 않다. 본 발명의 방법에서 전용의 적용으로 인해 더 진한 갈색/회색 색상을 갖는 곤충 펄프 및 이로부터 유래된 단백질은 백색/노란색 외관을 갖는 더 밝은 색상의 프로덕트와 비교할 때 열등한 품질의 프로덕트로 인식된다. 이와 관련하여, 아래에 언급된 옵션 및 선호도는 바람직하게는 이러한 동애등에 유충에서 유래된 곤충 펄프로 수행된다는 점에 유의해야 한다.
곤충으로부터 펄프의 제조-본 발명의 방법의 단계 a)에서 언급된 바와 같이-는 다른 방식으로 수행될 수 있다. 한 가지 옵션은 곤충을 으깨서(squash) 펄프를 얻는 것이다. 바람직하게는, 펄프를 제조하기 위해 민싱(mincing), 절단(cutting) 또는 밀링(milling)이 사용된다. 그 결과 점성(viscous consistency)이 균일한 출발 물질이 생성된다. 크기 감소는 마이크로-커터 밀에서 편리하게 수행될 수 있지만, 다른 적절한 기술도 사용될 수 있다. 이 단계 동안, 펄프에 잔류하는 곤충, 바람직하게는 유충의 입자 크기는 500 마이크론 미만, 바람직하게는 10 마이크론 내지 500 마이크론(현미경을 사용하여 결정되는 최대 크기)인 것이 바람직하다. 마이크로-커터 밀의 경우 특정 나이프와 플레이트 조합 및 회전 속도의 선택으로 입자 크기를 제어할 수 있다. 체(sieve)(예, 스테인리스 스틸로 제조된)를 사용하여 곤충을 이를 통해 밀어내는(push) 것도 가능하다. 원칙적으로 작은 잔류 입자 크기는 펄프에서 지방 추출을 용이하게 하므로 유리하지만, 너무 작은 입자 크기는 다음 공정 단계에서 지방과 단백질을 분리하는 것을 더 어렵게 만드는 에멀젼을 생성할 수 있다. 따라서, 입자 크기는 바람직하게는 10 마이크론보다 크다. 바람직하게는, 평균 입자 크기(d32; 부피/평균)는 10 마이크론 내지 500 마이크론 범위이다.
다음 단계, 단계(b)에서 펄프는 60℃-95℃의 온도로 가열된다. 가열은 후속 분리 단계에 적합한 혼합물을 제조하기 위해 대부분의 지방이 액화되는 것을 보장한다. 바람직하게는 가열은 수상(watery phase) 및 지방상과 같은 다른 상(phase)의 분리를 촉진하기 위해 혼합 조건하에 수행된다. 변색(예, 메일라드 반응 프로덕트의 형성에 의한) 및 지방 산화를 방지하고 지방 수율을 개선하기 위해, 펄프는 상기 온도에서 비교적 짧은 시간, 즉 50초 내지 100초 동안만 가열된다. 바람직하게는 펄프는 60초-90초 동안 60℃-95℃로, 특히 90℃±2℃의 온도에서 75초-85초 동안 가열된다.
펄프를 상기 언급된 온도로 가열한 후, 펄프는 물리적 분리 단계, 즉 본 발명의 방법의 단계 (c)를 거친다. 이 단계 동안, 다양한 영양소 스트림(예컨대 지방 및 단백질)이 적어도 부분적으로 서로 분리된다. 그러나, 상기 설명한 바와 같이, 지방의 수율은 당업계에 공지된 방법에서와 같이, 본 발명의 방법에서 상당히 더 높다. 또한, 영양소 스트림의 품질도 향상되었다. 바람직하게는, 얻어진 영양소 스트림은 지방 함유 분획, 수성 단백질 함유 분획 및 고체 함유 분획이다. 물리적 분리는 바람직하게는 디캔팅, 원심분리 또는 이들 방법의 조합을 포함한다. 바람직하게는, 물리적 분리는 정상(normal) (대기) 압력에서 수행된다.
지방은 디캔팅에 의해 분리될 수 있고, 잔류 혼합물은 디캔팅 또는 원심분리에 의해 수성 단백질 분획 및 고체-함유 분획으로 추가로 분리된다. 그러나, 예를 들어, 3상 디캔터(3-phase decanter)를 사용하여, 지방, 단백질 및 고체-함유 분획을 다른 순서로 또는 동시에 얻는 것도 가능하다. 이러한 동시 방법의 이점은 최소의 단계로 3가지 영양소 스트림이 얻어지며, 따라서 프로덕트의 손실이 최소화된다는 것이다. 연속 공정에서 사용할 때 분리 단계의 수를 줄이는 것도 이점이 있다.
본 발명의 구현예에서, 지방 분획이 먼저, 예를 들어 디캔팅에 의해 분리되고, 잔류 혼합물은 더 이상 분리되지 않고 건조된다. 따라서 잔류 혼합물은 고체 분획과 수성 단백질 분획을 모두 겸비한다. 이 구현예에서, 무-지방 상(non-fat phases)은 바람직하게는 추가로 건조되어 건조된 물질을 생성한다. 건조된 물질은 단백질이 풍부하고 수성 단백질 분획과 고체-함유 분획으로부터 단백질이 풍부한 물질을 둘 모두 함유한다. 본 발명의 방법으로 단백질로부터 지방을 더 잘 분리하는 것이 가능하기 때문에, 더 높은 품질의 프로덕트가 얻어진다. 또한, 본 발명의 방법으로, 메일라드 반응으로 인한 (단백질의) 변색이 크게 방지되어, 얻어진 프로덕트의 품질이 개선된다. 건조는 공기 건조, 유동층 건조, 드럼 건조, 디스크 건조, 플래시 건조, 동결건조, 굴절 건조(refractive drying)와 같은 다양한 방법 또는 바람직하게는 분무 건조에 의해 수행될 수 있다.
추가 구현예에서, 수성 단백질 분획 및 고체-함유 분획은 단계 c) 후에 별도로 건조된다. 비교적 온화한 가열 조건으로 인해, 수성 단백질 분획에 존재하는 단백질의 적어도 일부는 기능성(functionality)을 유지한다. 후속 건조 동안 이러한 기능성을 잃지 않는 것이 유리할 것이다. 따라서, 유동층 건조 또는 분무 건조 또는 냉동 건조(freeze drying) 또는 굴절 건조가 이러한 상황에 바람직하다.
본 발명의 제2 측면은 본 발명에 따른 방법에 의해 얻을 수 있는 지방 분획에 관한 것이다. 곤충의 지방 분획은 다수의 불포화 지방산을 포함하기 때문에, 가열 시간을 줄이는 것은 얻어지는 지방 분획의 품질에 상당한 영향을 미친다. 즉, 지방 분획이 선행 기술에 이미 공지된 방법으로 얻은 분획보다 덜 산패한다. 본 발명에 따른 방법에 의해 얻어진 지방 분획은 원하는 특성을 얻도록 다른 공급원으로부터 얻어진 지방 분획과 혼합될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명에 의해 얻을 수 있는 지방 분획을 포함하는 지방 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 일 측면은 본 발명의 방법으로 얻어진, 가열된 곤충 퓨레, 바람직하게는 가열된 BSF 유충 퓨레에 관한 것이다. 이러한 가열된 곤충 퓨레는 놀랍게도 항산화 특성을 가지며 항산화 사료 또는 식품 또는 이의 성분으로 사용하기에 적합하다.
본 발명의 일 측면은 가수분해된 곤충 퓨레, 바람직하게는 가수분해된 BSF 유충 퓨레에 관한 것이다. 예를 들어, 펩티다아제의 영향 하에서, 가열 단계 이전에 곤충 퓨레의 가수분해는 항산화 활성이 개선된 퓨레를 생성한다. 더욱이, 이러한 가수분해된 퓨레로부터 분리된 단백질은 본 발명의 방법에 따라 얻어지는 가수분해되지 않은 퓨레와 비교하여 그리고 예를 들어 30분의 연장된 가열 단계를 적용함으로써 통상적으로 얻어지는 가수분해되지 않은 퓨레와 비교하여 개선적으로 더 적은 지방을 포함한다.
본 발명의 일 측면은 본 발명의 방법으로 얻어진 가열된 곤충 퓨레, 바람직하게는 가열된 BSF 유충 퓨레에 관한 것이다. 이러한 가열된 곤충 퓨레는 놀랍게도 항산화 특성을 가지며 건강 증진 사료 또는 식품 또는 이의 성분으로 사용하기에 적합하다.
본 발명의 일 측면은 가수분해된 곤충 퓨레, 바람직하게는 가수분해된 BSF 유충 퓨레에 관한 것이다. 예를 들어, 펩티다아제의 영향 하에서, 가열 단계 이전에 곤충 퓨레의 가수분해는 항산화 특성이 개선된 퓨레를 생성한다. 더욱이, 이러한 가수분해된 퓨레로부터 분리된 단백질은 본 발명의 방법에 따라 얻어지는 가수분해되지 않은 퓨레와 비교하여 그리고 예를 들어 30분의 연장된 가열 단계를 적용함으로써 통상적으로 얻어지는 가수분해되지 않은 퓨레와 비교하여 개선적으로 더 적은 지방을 포함한다.
본 발명의 제3 측면은 본 발명에 따른 방법으로 얻어진 단백질 분획에 관한 것이다. 더 낮은 온도-시간-조합으로 인해 단백질은 공지된 곤충 단백질 분획보다 더 적은 지방을 포획하였다. 더욱이, 비교적 온화한 처리 조건으로 인해 단백질의 적어도 일부는 기능성을 유지하게 될 것이다. 이는 이전에는 불가능했던 상기 단백질 분획의 다양한 적용의 용도를 허용한다. 또한, 본 발명의 방법으로, 메일라드 반응으로 인한 (단백질의) 변색이 크게 방지되어, 얻어진 프로덕트의 품질이 개선된다. 단백질 분획은 단계 c)에서 얻어진 수성 단백질 분획의 형태일 수 있거나 이의 건조된 형태, 즉 건조된 단백질 분획의 형태일 수 있다. 그러나, 단백질의 기능성을 잃지 않기를 원하면, 분무 건조 또는 냉동 건조 또는 굴절 건조와 같은 비교적 온화한 건조 방법이 사용되어야 한다.
고체-함유 분획은 50 중량% 이상의 건조 물질 함량을 갖는 펄프를 포함한다. 이 펄프는 수성 단백질 분획으로부터 쉽게 구별되고 분리될 수 있다. 펄프는 키틴 및 그 유도체와 같은 고체를 함유한다. 고체-함유 분획은 또한 잔류 지방 또는 단백질을 포함할 수 있지만, 공지된 방법보다 적은 정도로 포함할 수 있다. 이 고체-함유 분획은 추가로 건조될 수 있고 키틴도 이로부터 분리될 수 있다. 얻어진 키틴은 식품 또는 사료의 성분으로 사용될 수 있다.
본 발명의 일 측면은 가수분해된 곤충 펄프 및/또는 곤충 펄프, 예컨대 (가수분해된) 동애등에 유충 펄프의 건강-증진 식품 성분 또는 사료 성분으로의 용도에 관한 것으로, (가수분해된) 펄프는 본 발명의 방법으로 얻을 수 있고, 상기 방법은 상기 방법의 단계 b) 이전에 효소 가수분해 단계 a1)을 포함하거나 포함하지 않는다.
본 발명의 제7 측면은 가수분해된 곤충 펄프 및/또는 곤충 펄프, 예컨대 동애등에 유충 펄프의 식품 성분 또는 사료 성분으로의 용도에 관한 것으로, (가수분해된) 펄프는 본 발명의 방법으로 얻을 수 있고, 상기 방법은 상기 방법의 단계 b) 이전에 효소 가수분해 단계 a1)을 포함하거나 포함하지 않는다.
본 발명의 일 측면은 사료 또는 사료 성분, 특히 애완동물 식품으로 사용하기 위한 본 발명에 따른 곤충 펄프 또는 가수분해된 곤충 펄프 또는 이의 유도체에 관한 것이다.
본 발명의 일 측면은 건강 증진 가능성을 갖는 식품 또는 사료 성분으로의 본 발명에 따른 곤충 펄프 또는 가수분해된 곤충 펄프 또는 그의 유도체의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 일 측면은 세포 산화 손상의 예방 및/또는 억제 방법에서 사용하기 위한 본 발명에 따른 곤충 펄프 또는 가수분해된 곤충 펄프 또는 그의 유도체에 관한 것이다.
본 발명자는 놀랍게도 라디칼 소거 모델(DPPH 및 ABTS 어세이), 미엘로퍼옥시다아제(myeloperoxidase) 반응을 포함하는 효소 모델(클래식(classical) 및 SIEFED 어세이), 및 호중구 반응을 포함하는 세포 모델을 사용하여 동애등에 단백질 및 단백질 가수분해물의 시험관내(in vitro) 항산화 활성을 확증하고 분석하였다. 상업용 피쉬 밀 및 치킨 밀을 비교예에서 산업적 벤치마크로 사용하였다. 본 발명자에 의해 수행된 시험 및 비교의 결과는 피쉬 밀 및 치킨 밀은 호중구 및 미엘로퍼옥시다아제 반응의 결과로 발생하는 산화적 손상을 억제하는 측면에서 이점을 거의 또는 전혀 제공하지 않음을 나타낸다. 더욱이, 피쉬 밀 및 치킨 밀은 또한 사용된 일부 시험 어세이 및 모델에서 산화촉진 거동(pro-oxidant behavior)을 나타낸다. 결과는 동애등에 단백질 ((가수분해된) 유충 퓨레의 일부로서)이 숙주 호중구 및 미엘로퍼옥시다아제 반응으로 인한 세포 손상에 대한 보호에 효과적임을 나타낸다. 따라서, 본 발명자에 의해 시험된 동애등에 유도체(퓨레, 가수분해된 퓨레)는, 치킨 밀 및 피쉬 밀에 비해 사료 성분으로서 사용과 같은 애완동물 식품/사료 및 양식 사료 제형에의 포함에 있어서 이점을 나타낸다.
본 발명자는 BSF 단백질 가수분해물이 상당한 점유율의 <1000 Da 단백질을 갖는다는 것을 확증하였다. 이는 단쇄 펩티드 및 유리 아미노산의 혼합물을 포함한다. 일부 단쇄 펩티드 및 유리 아미노산은 항산화 활성을 갖는 것으로 알려져 있다. 이들 분자는 ROS 및 자유 라디칼을 적극적으로 소거(scavenge)할 수 있다. Firmansyah 및 Abduh[3]는 BSF 단백질 가수분해물의 DPPH(2,2-디페닐-1-피크릴히드라질) 소거 활성을 평가하였다. Zhu 등[4]은 BSF 단백질 가수분해물의 DPPH, ABTS(2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산), 수퍼옥사이드 및 하이드록실 라디칼 소거 활성을 평가하였다. 본 발명자가 아는 한, BSF 유충 퓨레 및 가수분해된 BSF 유충 퓨레에 의한 놀라운 높은 항산화 활성 및 산화 스트레스 및/또는 손상에 대한 놀라운 높은 보호를 나타내는, 기본적 효소 및 세포 모델을 사용한, BSF 단백질 가수분해물의 항산화 활성을 확증하는 연구가 이제까지 실현된 바 없다. 따라서, 현재 확증된 발명 이전에는, BSF 단백질 가수분해물의 항산화 가능성에 대한 근본적인 수준의 이해가 부족하여 아직까지 공개되지도, 예상되지도, 기대되지도 않았다. 본 발명에 따라, BSF 단백질 및 단백질 가수분해물의 시험관내 항산화 활성에 대한 상세한 조사는 동물 건강을 개선하기 위한 이들 단백질 유도체의 새로운 적용을 가능하게 한다.
본 발명자는 (1) DPPH 및 ABTS를 포함하는 라디칼 소거 모델; (2) 미엘로퍼옥시다아제 반응을 포함하는 효소 모델; 및 (2) 호중구 반응을 포함하는 세포 모델을 사용하여, BSF 단백질 및 단백질 가수분해물의 놀랍게도 높은 항산화 가능성을 밝혀냈다. 치킨 밀 및 피쉬 밀은 본 발명에 따른 (가수분해된) BSF 유충 퓨레의 항산화 활성과 비교하기 위한 비교예에서 산업적 벤치마크로 사용되었다.
본 발명자는 놀랍게도 90℃에서 40초 동안 가열된 곤충 퓨레가 유리 지방산에 대해 상대적으로 많은 양(약 70%)을 갖는다는 것을 확증하였다. 예를 들어, 본 발명의 방법에 민스된 동애등에 유충을 적용하는 것과 관련된 실시예 4가 참조된다. 퓨레를 단지 40초 동안 가열하는 것은 리파아제의 비활성화에 효과가 없다. 한편, 퓨레를 80초 동안 가열하면 소량의 유리 지방산이 관찰되어, 90℃에서 효소 비활성화에 이 시간이 충분함을 나타낸다. 최대 300초 또는 1800초와 같이 80초를 초과하는 가열 시간에서, 지방산 함량이 동애등에 유충 퓨레를 80초 동안 가열할 때 얻어지는 낮은 지방산 함량과 비교하여 증가한다. 따라서, 본 발명의 방법으로 비교적 낮은 유리 지방산 함량을 포함하는 단백질 분획을 얻기 위해, 본 발명의 방법에서 가열 시간은 40초보다 길고 300초보다 짧아야 하며, 예컨대 50초-100초, 또는 60초-90초, 또는 70초-85초, 예컨대 약 80초에서 선택된 가열 시간이어야 한다. 바람직한 가열 시간은 약 90℃ 또는 90℃ ± 2℃이다.
놀랍게도, 50초 미만의 가열 단계 지속 시간일 수 있으나 (이는 본 발명의 방법에서 벗어남), 본 발명자는 동애등에 유충을 민싱(mincing)하여 얻은 퓨레와 같은 민스된 곤충 펄프를 본 발명의 방법 단계에 적용할 때, 50초 미만, 예컨대 약 40초의 가열 지속 시간에 대하여 더 높은 과산화물 값(peroxide value)이 관찰된다는 사실을 확증하였다. 퓨레 또는 펄프를 40초 동안 가열할 때 얻어지는, 하이드로퍼옥사이드 생성을 초래하는 효소 산화에 참여할 수 있는 다량의 유리 지방산은, 비교적 다량의 과산화물이 발생하는 근거이다. 그러나, 곤충 펄프 또는 퓨레, 예컨대 동애등에 유충에서 얻어진 퓨레가 본 발명의 방법에 적용되는 경우, 80초 처리의 가열 단계로, 50초 보다 짧게 가열하는 경우에 얻어지는 값과 비교하여, 상대적으로 더 낮은 과산화물 값이 얻어진다. 본 발명의 방법에 따라 100초 이하 보다 더 긴 기간 동안, 예컨대 300초 또는 1800초 동안 프로덕트(예, 유충의 퓨레)을 가열하는 것은, 예를 들어 퓨레 또는 펄프를 80초 동안 가열할 때의 과산화물 값에 비하여 과산화물 값이 증가한다는 점에서 지방 산화에 영향을 미친다. 따라서, 본 발명의 방법을 사용하여 비교적 낮은 과산화물 값을 포함하는 단백질 분획을 얻기 위해, 본 발명의 방법에서 가열 시간은 40초보다 길고 300초보다 짧은, 예컨대 50초-100초이거나 또는 60초-90초, 또는 70초-85초, 예컨대 약 80초에서 선택된 가열 시간이어야 한다. 바람직한 가열 시간은 약 90℃ 또는 90℃ ± 2℃이다.
놀랍게도, 본 발명자는 본 발명의 방법에 의해 얻어지거나 제공되는 단백질 분획이 라디칼 소거 활성을 갖는다는 것을 확증하였다. 상기 라디칼 소거 활성은, 본 발명의 방법으로 얻어진 동애등에 유충 단백질의 일련의 투여량(dose)을 포함하는 어류 사료를 공급한 후 어육의 산화 상태를 평가하는 경우(최저 투여량: 사료 중 0% BSF 유충 단백질, 최고 투여량: 100% BSF 유충 단백질, 25% 및 50%도 어류에게 공급되는 어류 사료의 총 질량(mass)을 기준으로 시험된다), 어류에게 공급되는 기존의 어류 사료로 얻을 수 있는 라디칼 소거 활성보다 높다. 또한 하기 실시예 섹션의 실시예 5가 참조된다. 본 발명의 방법으로 얻은 단백질을 포함하거나 이로 구성된 사료(수용성 추출물 분말(Water soluble extract powders, WSEP)이라고 함)를 어류에 미리 공급한 후 어육의 ABTS 라디칼 소거 활성을 본 발명의 방법으로 얻어진 동애등에 유충 단백질 분획이 결여된 기존의 사료를 어류에 미리 공급한 후 어육의 라디칼 소거 활성과 비교하였다. 모든 샘플에 대해 농도 증가는 평균 억제 값의 증가를 가져왔다(어육에서 라디칼 소거 활성이 평가될 때 공급된 사료의 항산화 거동을 나타냄). 공급된 사료의 총 질량(mass)을 기준으로 본 발명의 방법으로 얻은 BSF 유충 단백질을 각각 25, 100, 50 및 0 중량% 포함하는 어류 사료에 대하여, Emax(시험 동안 얻은 최대 억제)는 다음 순서였다: HI-25> HI-100> HI-50> HI-0(모두 최종 농도, 0.2 mg/ml에서 획득). 이 결과는 HI-25 샘플의 투여량에서, 최고의 ABTS 라디칼 소거 활성이 얻어짐을 나타낸다. 한편, HI-0 샘플은 최소의 ABTS 라디칼 소거 활성을 나타낸다. ABTS 어세이를 사용하여 평가한 바와 같이, 동애등에 유충에 본 발명의 방법을 적용하여 얻은 모든 단백질 샘플은 용량-의존적 방식(dose-dependent manner)으로 항산화 활성을 나타낸다. HI-25 샘플은 최고의 항산화 활성을 나타낸다.
요약하면, 본 발명의 방법으로 곤충으로부터 가치 있는 영양소 스트림을 얻는 것이 가능하게 되었다. 이러한 스트림은 외래 화학 물질에 의해 오염되지 않으며 순전히 생물학적 기원을 갖는다. 분리된 영양소 스트림은 식품, 사료 또는 의약품의 제조에 사용될 수 있다. 더욱이, 의도된 적용에 따라, 얻어진 영양소 스트림은 예를 들어, 특정한 성분, 예컨대 가수분해된 단백질, 아미노산 또는 특정한 지방산을 분리하도록 추가로 처리될 수 있다.
일 구현예는 곤충을 본 발명에 따른 영양소 스트림으로 전환하는 방법으로서, 단계 b)에서 펄프는 75℃-95℃ 특히 80℃-93℃의 온도, 바람직하게는 85℃-90℃의 온도에 있다. 일 구현예는 곤충을 본 발명에 따른 영양소 스트림으로 전환하는 방법으로서, 단계 b)에서 펄프는 60초-95초, 특히 70초-90초, 바람직하게는 75초-85초, 예컨대 78초-82초 동안 가열된다. 상기한 바와 같이, 본 발명자는 본 발명의 (동애등에) 유충 처리 방법을 적용함으로써, 상기 방법의 단계 a)에서, 단백질 공급원으로서 동애등에 유충으로부터 얻어진 수성 단백질 분획의 스트림을 포함하는 영양소 스트림이 얻어지며, 이 단백질 분획은 유럽 특허 출원 EP2953487에 개괄된 방법(이의 실시예 섹션, 특히 실시예 1, 페이지 12, 8-13줄, 및 페이지 13, 3-5줄)과 같은 당업계에 공지된 대안적인 동애등에 유충 처리 방법을 적용하여 이러한 유충으로부터 얻은 단백질과 비교할 때, 놀랍게도 개선된 특징 및 구조적 특징을 갖는다는 것을 확증하였다. 특히, 본 발명의 방법의 단계 b)에서 100초 또는 100초 미만의 비교적 짧은 가열 시간은 단계 b)에서 개선된 유충 펄프를 얻고 후속적으로 상기 방법의 단계 c)에서 개선된 수성 단백질 분획을 얻기 위해 필수적인 것으로 여겨진다. 본 발명자는 시간-온도 조합을 사용함으로써 수성 단백질 분획 내에 더 적은 오일이 포획되고, 이에 따라, 단백질 공급원으로 동애등에 유충으로부터 단백질 분획을 분리하기 위한 대안적인, 현재의 수단 및 방법을 사용하여 제공된 단백질 공급원에 비하여, 본 발명의 방법의 단계 c)에서 보다 순수한 단백질 공급원이 제공된다는 것을 발견하였다. 또한, 메일라드 반응으로 인한, 방법의 단계 b)에서의 가열된 펄프(단백질의)의 변색이 크게 방지되어, 얻어진 프로덕트, 예를 들어, 본 발명의 방법의 단계 b)의 가열된 펄프 및 단계 c)의 수성 단백질 분획의 품질이 개선되는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 지방 함량이 감소된 수성 단백질 분획은 민스된 동애등에 유충을 90℃에서 80초 동안 또는 90℃±2℃의 온도에서 75초-85초 동안 가열할 때 얻어진다. EP2953487에서, 가열 시간은 적어도 5분이며, 심지어 30분이다. 또한, 민스된 동애등에 유충 펄프(상기 방법의 단계 a)에서 제공됨)의 최대 100초, 바람직하게는 약 70초-90초의 비교적 짧은 가열 시간은, 당업계에 공지된 현재의 방법에 적용된 더 긴 가열 시간과 비교하여, 상기 방법의 단계 b)에서 덜 과립화되고 덜 응집된 가열 곤충 펄프를 초래한다. 상기 방법의 단계 b) 후의 덜 과립화된 유충 펄프는, 예를 들어 펄프에 포함된 단백질의 효소적 가수분해에 유익하고, 일반적으로 덜 과립화되고 응집된 곤충 펄프 및 후속 단백질 분획은 개선된 분리 결과 그리고 펄프 및 단백질 개선된 가공 용이성에 기여한다. 예를 들어, 입자상 물질은 효소 분자에 대한 접근성이 떨어지기 때문에 과립화는 효소 효율을 감소시킨다. 본 발명의 방법의 일부로서 유충 처리 방법 단계를 적용함으로써, 동애등에 유충 펄프가 100초를 초과하여, 예컨대 5분에서 최대 30분 동안 가열될 때 얻어지는 더 큰 단백질 응집체 및 입자와 비교하여, 짧은 가열 시간은 더 작은 단백질 클러스터, 응집체, 입자, 또는 심지어 (주로) 단백질 단량체 및/또는 작은 다량체(multimer)로 구성된 단백질 조성물을 생성한다. 또한, 곤충 펄프를 예를 들어 90℃에서 100초 보다 장시간 가열한 후 상대적으로 큰 단백질 펄프 클러스터 및 단백질 분획 응집체 내부에 지방이 포획된다.
본 발명은 하기 비제한적인 실시예에 의해 추가로 설명될 것이다.
실시예 및 구현예
실시예 1
14일령의 살아있는 세척된 유충(5kg)을 민서(mincer) 직전에 수집하여 사용할 때까지 4℃에서 보관하였다. 각 실험을 대하여, 100g의 유충을 새로 민스(mince)하였다. 민스된(minced) 유충 100g을 90℃로 가열하고(핫 플레이트를 사용하고 계속 교반하면서) 프로덕트를 이 온도에서 0, 40, 80, 120, 300, 600 및 1800초 동안 유지하였다. 약 30g의 가열된 유충을 3개의 원심분리 가능한 튜브에 수집하고 3200G에서 5분 동안 원심분리하였다. 원심분리 후 지방 분획을 추출하고 파스퇴르 피펫을 사용하여 수집하고 무게를 달아 지방 분리 %(습식 기준으로 총 퓨레 중량)를 계산하였다.
시간의 함수로서 지방 분리는 하기 표 1 및 도 1에 제공된다. 이로부터 가열되지 않은 곤충 펄프의 원심분리에서는 지방이 얻어지지 않았지만, 80초의 가열 시간까지 꾸준히 증가되었음이 명확하다. 그 후 600초의 가열 시간까지 안정적으로 유지되었으며, 그 후 지방 분리가 감소하기 시작하였다. 놀라운 결과는 당업계에서 예상한 것과는 달리, 가열된 곤충 펄프에서 지방을 가장 효율적으로 제거하는데 10분 이하의 비교적 짧은 가열 시간이 사용될 수 있음을 보여준다. 또한, 감소된 가열 시간으로 인해, 가열된 곤충 펄프의 변색이 덜 발생하여, 더 높은 품질의 프로덕트(및 유래된 영양소 스트림)이 생성된다. 도 2에는 가열 시간이 곤충 펄프의 색상에 미치는 영향이 도시되어 있다. 더욱이, 짧은 가열 시간은 600초를 초과하는 더 긴 가열 시간에 비해 덜 과립화 및 덜 응집된 곤충 펄프를 생성한다(예, 도 2 참조).
Figure pct00001
실시예 2
BSF PureeXTM(BSF-P)로도 지칭되는 BSF 유충의 퓨레와 BSF 유충의 퓨레를 효소 가수분해하여 얻은 가수분해된 퓨레(BSF-HP)는 Protix B.V.(동겐, 네델란드)에 의해 2019년 10월에 제조되었다. 하기의 방법으로 퓨레 및 효소 다이제스트 퓨레(enzymatically digested puree)를 얻었다. 유충을 민싱(mincing)하기 위한 민서(mincer) (이에 의해 유충 펄프가 제공됨) 직전에, 14일령의 살아있는 세척된 동애등에 유충을 수집하고 후속적으로 사용할 때까지 4℃에서 보관하였다. 각 실험에 대해, 유충을 새로 민스하였다. 민스된 유충은 민스된 유충의 질량을 기준으로, 0.1% 또는 0.5% 플라보자임(Flavourzyme)으로 45℃ 내지 65℃(±2℃)에서 0.5시간-3시간, 예를 들어 1시간 내지 2시간 동안 연속 교반 하에 처리되었다. 실시예 2에서 적용된 가수분해된 BSF 유충 퓨레의 배치는 50℃(±2℃)에서 1시간 동안 효소 가수분해에 의해 얻어졌다. 플라보자임(Flavourzyme)(Novozymes, 덴마크)는 엔도펩티다아제와 엑소펩티다아제 활성을 갖는 아미노펩티다아제의 조합이다. 효소-처리된 민스된 유충 및 효소 처리를 하지 않은 대조군(control) 유충을 90℃로 가열하고 프로덕트를 이 온도에서 80초 동안 유지하였다. 얻어진 곤충 퓨레는 유리 아미노산 함량(도 3a: 유리 아미노산 함량(n=1)-퓨레에서 시험됨) 및 펩신 소화율(도 3b: 소화율(n=1)- 퓨레에서 시험됨)을 측정하는 데 사용되었다. 가열된 BSF 유충 펄프와 90℃에서 가열 단계 전에 0.1wt% 또는 0.5wt% 플라보자임(Flavourzyme)을 사용하여 단백질의 효소 가수분해가 먼저 적용된 가열된 BSF 유충 펄프의 두 배치로부터 예를 들어, 펄프에서 단백질 분리, 증발, 건조 및 그라인딩(grinding)의 단계에 의해 프로틴 밀을 얻었다. 지방 분리의 백분율은 분리 단계 동안 측정되었다(도 3c: 지방 분리% (n=3) - 프로틴 밀을 제조하는 분리 단계 동안 시험됨). 수행된 모든 실험에서, 적용된 효소의 양을 고려할 때, 용량 의존적 효과가 관찰되었다. 따라서, 민스된 유충을 가열단계 이전에 플라보자임(Flavourzyme)을 이용하여 효소 처리하면 유리 아미노산 함량이 증가하고 얻어진 가수분해된 유충 퓨레의 펩신 소화율이 증가하여, 그 결과, 가수분해된 단백질을 포함하는 얻어지는 퓨레가 더 좋은 맛을 갖게 되고(유리 아미노산 함량은 동물과 인간이 유리 아미노산을 포함하는 프로덕트를 섭취할 때 매력적이고 마음에 드는 맛과 관련된다), 소화율이 높으며 항산화 특성을 갖는다(하기 시험 결과 참조). 또한, BSF 유충 펄프의 효소 처리는, 90℃에서 가열하기 전에 효소 가수분해 단계에 적용되지 않은 유충 퓨레로 얻어진 단백질 분획으로부터의 지방 분리와 비교할 때, 효소 가수분해 및 효소적으로 다이제스트된 펄프의 열처리 후의 후속 분리 단계에서 지방 분리를 개선하여 프로틴 밀로부터의 지방 추출을 증가시킨다.
실시예 3
2. 물질 및 방법
2.1. 시약
모든 시약은 분석 등급이었다. 디메틸설폭사이드, 메탄올, 에탄올, 염화칼슘, 염화칼륨, 염화나트륨, 하이드로젼 퍼옥사이드 및 Tween-20은 Merck(VWR, 루뱅, 벨기에)에서 구입하였다. 아질산나트륨, 소 혈청 알부민, 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(phorbol 12-myristate 13-acetate) 및 PercollTM 은 Sigma(보넴, 벨기에)에서 구입하였다. 수성 추출물 및 용액은 Milli-Q 물 시스템(Millipore, 베드포드, 미국)을 사용하여 얻은 Milli-Q 물에서 제조하였다. 비신코닌산(bichinchoninic acid) 및 황산구리(II) 용액은 Sigma(슈타인하임, 독일)에서 구입하였다. Whatman 여과지 등급 4(270mm)는 Amersham(버킹엄셔, 영국)에서 구입하였다. Sterlip 30 ml 일회용 진공 필터 시스템은 Millipore(베드포드, 미국)에서 구입하였다. 2,2-디페닐-1-피크릴히드라질(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl) 및 2'-아지노-비스(3-에틸벤즈티아졸린-6-설폰산)은 Aldrich(다름슈타트, 독일)에서 구입하였다. 8-아미노-5-클로로-7-페닐피리도[3,4-d]피리다진-1,4(2H,3H)디온(L-012)은 Wako Chemicals(노이스, 독일)에서 구입하였다.
2.2. 원료
치킨 밀(CM) 및 피쉬 밀(FM)은 2019년 9월에 온라인 웹샵에서 구입하였다. 공급업체가 공표한 두 성분의 화학적 조성은 표 2에 나타낸다.
Figure pct00002
BSF-P 및 가수분해된 퓨레 BSF-HP는 2019년 10월에 Protix B.V.(동겐, 네덜란드)에서 제조하였다. (1). BSF-P는 -20℃에서 냉동 공급된 저온 살균된(pasteurized) BSF 민스된 '고기'(퓨레, 펄프)이었다. BSF-P는 또한 BSF 프로틴 밀(ProteinXTM)을 생산하는 원료이다. (2). BSF-HP는 또한 -20℃에서 냉동 공급된 가수분해되고 저온 살균된 BSF 고기(퓨레)이었다. (3). 두 성분 BSF-P와 BSF-HP의 화학 조성은 표 3에 나타낸다.
Figure pct00003
수용성 추출물은 CM, FM, BSF-P 및 BSF-HP에 대해 제조하였다. 이들 프로덕트(각각 100g)을 각각의 건조 물질 함량을 기준으로 6배 부피의 Milli-Q 물에 용해시키고(예, BSF-P는 건조 물질 함량이 33.3%이고 200ml Milli-Q 물로 희석됨) 자기 교반기에서 2시간 교반되었다. 원심분리 후(4℃에서 30분 동안 1000 x g), 상부 지방층을 제거하고 상청액(supernatant)을 Whatman Filter(등급 4)를 사용하여 여과하였다. 모든 불용성 잔류물을 제거하기 위해 원심분리 및 여과 단계를 다시 반복하였다. 마지막으로 Sterlip Filter(50mL, 0.22μm)를 사용하여 상청액을 여과하고 2일의 기간에 걸쳐 냉동 건조하여 각각의 수용성 추출물 분말을 얻었다. 4가지 수용성 추출물 모두 추가 사용이 있을 때까지 데시케이터(18℃에서)에 보관되었다.
2.3. 단백질 정량화
4개의 수용성 추출물의 총 단백질 함량을 비신코닌산(BCA) 단백질 어세이를 이용하여 분석하였다[5]. 검량선은 농도: 0, 0.125, 0.25, 0.5 및 1 mg/ml에서 표준물질로 소 혈청 알부민(BSA)을 사용하여 얻었다. 3 mg/ml 수용성 추출물의 스톡 용액을 분석에 사용하였다. BCA(49/50) 4900μl 및 황산구리(II)(1/50) 100μl를 용해시켜 시험용액을 제조하였다. 샘플 스톡 용액(10μl) 및 시험용액(200μl)을 96웰 플레이트의 웰에 첨가하였다. 이 플레이트를 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하고 Multiscan Ascent(Fisher Scientific, 아스, 벨기에)를 사용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
2.4. DPPH 어세이
DPPH 라디칼 소거 활성은 다소 변형된 Brand-Willams 등의 프로토콜[6]에 따라 분석하였다. DPPH 시험용액은 40ml 에탄올에 10.5mg DPPH를 용해시켜 제조하였다. 시험용액을 새로 제조하였고 추가 사용이 있을 때까지 어두운 곳에 보관하였다. DPPH 작업용액은 시험용액을 10배 에탄올로 희석하여 제조하였다(517 nm에서 0.6 내지 0.8의 흡광도가 얻어지도록). DPPH 작업용액(1920μl)을 20μl의 샘플 희석액(Milli-Q 물 중의 4가지의 수용성 추출물)과 혼합하여 0.0125, 0.025, 0.05, 0.1 및 0.2mg/ml의 최종 농도를 얻었다. 어두운 곳에서 30분 및 60분 인큐베이션 후 HP 8453 UV-vis 분광광도계(Agilent Technologies, 발트브론, 독일)를 사용하여 510nm에서 흡광도 감소를 기록하였다. 대조군의 경우 샘플 희석액 대신 Milli-Q 물만 사용하였다.
2.5. ABTS 어세이
ABTS 양이온 라디칼 소거 활성은 다소 변형된 Arnao 등의 프로토콜[7]에 따라 분석하였다. ABTS 시험용액은 Milli-Q 물에 7.0mmol/l ABTS 및 2.45mmol/l 과황산칼륨을 용해시켜 제조하였다. 시험용액을 실온의 어두운 곳에 밤새 유지하였다. ABTS 작업 용액은 734 nm에서 0.7 내지 0.8의 흡광도가 얻어지도록 메탄올로 희석하여 제조하였다. ABTS 작업 용액(1920μl)을 20μl의 샘플 희석액(Milli-Q 물 중의 4가지의 수용성 추출물)과 혼합하여 0.0125, 0.025, 0.05, 0.1 및 0.2mg/ml의 최종 농도를 얻었다. 어두운 곳에서 30분 인큐베이션 후 HP 8453 UV-vis 분광광도계(Agilent Technologies, 발트브론, 독일)를 사용하여 734nm에서 흡광도 감소를 기록하였다. 대조군의 경우 샘플 희석액 대신 Milli-Q 물만 사용하였다.
2.6. 특정 면역학적 추출 후 효소 검출(SIEFED) 어세이를 사용한 미엘로퍼옥시다아제(MPO) 활성
SIEFED 어세이는 동물 기원 MPO의 특정 검출을 위해 Franck 등[8]에 의해 개발되어 허가된 방법이다. MPO 용액은 인간 MPO를 20mM 인산염 완충 셀라인(pH 7.4에서), 5g/l BSA 및 0.1% Tween-20에 희석하여 제조하였다. 최종 농도가 0.0125, 0.025, 0.05, 0.1 및 0.2 mg/ml인 샘플 희석액을 최종 농도가 25ng/ml인 MPO 용액과 함께 10분 동안(37℃에서) 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 상기 혼합물을 말 MPO에 대한 토끼 다클론성 항체(3μl/ml)로 코팅된 96웰 마이크로타이터 플레이트의 웰에 로딩하고 어두운 곳에서 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 웰을 세척한 후, 하이드로젼 퍼옥사이드(10μM), NO2 -(10mM) 및 AmplexTM Red(40μM)를 첨가하여 항체에 의해 포획된 효소의 활성을 측정하였다. AmplexTM Red의 형광 부가물 레조루핀으로의 산화는 Fluorosckan Ascent(Fisher Scientific, 아스, 벨기에)를 사용하여 37℃에서 30분 동안 모니터링하였다. 대조군의 경우 샘플 희석액 대신 Milli-Q 물만 사용하였다.
2.7. 클래식한 측정법을 이용한 미엘로퍼옥시다아제(MPO) 활성
MPO 용액은 섹션 2.6에 언급된 바와 같이 제조하였다. 최종 농도가 0.0125, 0.025, 0.05, 0.1 및 0.2 mg/ml인 샘플 희석액을 최종 농도가 25ng/ml인 MPO 용액과 함께 10분 동안(37℃에서) 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 상기 혼합물(100μl)을 즉시 96웰 마이크로타이터 플레이트(microtitre plate)로 옮겼다. 이어서 10μl의 NO2 -(10mM) 및 100μl의 AmplexTM Red 및 하이드로젼 퍼옥사이드 혼합물 (섹션 2.6에서 언급된 농도)을 추가하였다. AmplexTM Red의 형광 부가물 레조루핀으로의 산화는 관련 혼합물을 첨가한 직후 Fluorosckan Ascent(Fisher Scientific, 아스, 벨기에)를 사용하여 37℃에서 30분 동안 모니터링하였다. 대조군의 경우 샘플 희석액 대신 Milli-Q 물만 사용하였다.
2.8. 세포 항산화 활성
호중구 및 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA) 용액의 제조는 Paul 등[2]에 따라 수행되었다. 샘플의 호중구 반응 조절 활성은 Tsumbu 등의 프로토콜[1]을 사용하여 분석하였다. 호중구 서스펜션(1백만 세포/143μl PBS)을 96웰 마이크로타이터 플레이트의 웰에 로딩하고 최종 농도가 0.0125, 0.025, 0.05, 0.1 및 0.2mg/ml인 샘플의 인산염 완충 셀라인 용액과 함께 10분 동안(어두운 곳에서 37℃에서) 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 25μl 염화칼슘(10μM) 및 20μl L-012(100μM)를 웰에 첨가하였다. Fluorosckan Ascent(Fisher Scientific, 아스, 벨기에)를 사용하여 37℃에서 30분 동안 호중구의 화학발광 반응을 모니터링하기 직전에 10μl PMA(16μM)로 호중구를 활성화하였다. 대조군의 경우 샘플 희석액 대신 인산염 완충 셀라인만 사용하였다.
2.9. 통계 어세이
모든 분석은 3중(triplicate)으로 수행되었다. 단백질 정량화를 위해, 선형 회귀를 사용하여 적합선 방정식(the equation of a fitted line)과 R-제곱값을 계산하였다. 항산화 어세이에서 얻은 농도와 억제 사이의 관계는 본질적으로 비단조적(non-monotonic)이었다. 이를 해결하기 위해, LOESS(Local Estimated scatterpot smoothing) 회귀 기법을 사용하여 관계를 모델링하였다[9]. 모델은 R 통계 소프트웨어를 사용하여 피팅(fit)되었다[10]. 이러한 모델에는 로컬 회귀(local regression)의 평활화 감도(smoothing sensitivity)를 정의하는 스팬 파라미터(span parameter)가 필요하다. 육안 검사로 0.4의 스팬 파라미터 값(span parameter value)이 모든 농도 및 억제 관계 곡선에 적합한 것으로 확인되었다. IC50(50% 억제에 도달하는 농도)과 같은 관심의 예측된 억제 백분율 농도는 수치 검색 루틴과 조합된 적합 모델(fitted model)을 사용하여 확인되었다.
3. 결과
3.1. 단백질 정량화
BSA를 사용하여 얻은 검량선, 선 방정식 및 R-제곱값을 확립한다. 샘플의 광학 밀도 및 단백질의 상대 농도(선 방정식을 이용하여 계산)는 표 3에 언급되어 있다. BSF-P 추출물 용액(3mg/ml)이 최고로 나타난 반면, BSF-HP 용액은 비신코닌산 어세이를 사용하여 시험된 용액 중에서 최저 단백질 농도를 나타낸다.
Figure pct00004
3.2. DPPH 어세이
30분 및 60분의 인큐베이션 후의 모든 5개 샘플의 DPPH 라디칼 소거 활성을 각각 도 3 및 도 4에 나타낸다. 플롯은 측정값과 LOESS에서 얻어진 적합 곡선(fitted curves)을 보여준다. CM은 30분 및 60분 인큐베이션 후의 모든 시험 농도에서 산화촉진 거동(pro-oxidant behavior)을 나타냈다. 반면, FM은 30분 인큐베이션 후의 5개 시험 농도 중 4개에서 그리고 60분 인큐베이션 후의 모든 시험 농도에서 산화촉진 거동을 나타냈다. 60분 인큐베이션 후의 BSF-HP의 IC50은 표 5에 나타낸다. 다른 샘플에 대해서는 어세이 동안 샘플이 산화촉진 활성(pro-oxidant activity)을 나타내거나 또는 50% 억제가 달성되지 않았기 때문에, 다른 샘플(30분 또는 60분 인큐베이션 후)에 대한 IC50을 계산하는 것이 불가능하였다. 모든 샘플의 Emax(어세이 동안 달성된 최대 억제)는 또한 표 6에 나타내며, 30분 및 60분 인큐베이션 후 순서는 각각 다음과 같다: BSF-HP> BSF-P> FM 및 BSF-HP> BSF-P.
Figure pct00005
Figure pct00006
3.3. ABTS 어세이
30분 인큐베이션 후 샘플의 ABTS 양이온 라디칼 소거 활성을 도 6에 나타낸다(측정값 및 LOESS에서 얻은 적합 곡선). 모든 샘플은 유사한 억제 패턴, 즉, 농도 증가의 함수로서 억제%가 증가함을 나타냈다. 샘플의 IC50는 표 5에 기재되어 있으며 순서는 다음과 같다: FM> CM> BSF-HP> BSF-P. IC50이 낮을수록 ABTS 양이온 라디칼 소거 활성이 높다. 모든 샘플의 Emax(어세이 동안 달성된 최대 억제)는 표 6에 나타내며, 순서는 다음과 같다: BSF-P> BSF-HP> FM> CM.
3.4. 특정 면역학적 추출 후 효소 검출(SIEFED) 어세이를 이용한 미엘로퍼옥시다아제(MPO) 활성
SIEFED 어세이를 이용하여 얻은 샘플의 MPO 반응 조절 활성을 도 7에 나타낸다(측정값 및 LOESS에서 얻은 적합 곡선). BSF-HP는 0.20 mg/ml 농도에서 >75% 억제로 강력한 억제 거동을 나타냈다. 샘플의 IC50은 표 5에 언급되어 있으며 다음 순서이다: BSF-HP. 샘플의 Emax는 표 6에 나타내어져 있고, 다음 순서이다: BSF-HP> BSF-P. FM 및 CM은 모든 시험 농도에서 산화촉진 거동을 나타낸다. 한편, BSF-P에 대한 Emaz는 < 50%였다.
3.5. 클래식한 어세이를 이용한 미엘로퍼옥시다아제(MPO) 활성
클래식한 어세이를 이용하여 얻은 샘플의 MPO 반응 조절 활성은 도 8에 나타낸다(측정값 및 LOESS에서 얻은 적합 곡선). CM 및 FM은 모든 시험 농도에서 산화촉진 거동을 나타냈다. 모든 시험된 샘플의 Emax는 표 6에 나타낸다. BSF-P 및 BSF-HP는 Emax>75%를 나타냈다. 샘플의 IC50는 표 5에 언급되어 있고, 다음 순서이다: BSF-P> BSF-HP
3.5. 세포 항산화 활성
샘플의 호중구 반응 조절 활성(측정값 및 LOESS에서 얻은 적합 곡선) 및 Emax는 각각 도 9 및 표 6에 나타내어져 있다. 모든 시험 샘플은 Emax>0%를 나타냈다. FM 및 CM은 Emax<40%를 나타냈다. CM은 5개의 시험 농도 중 3개에서 산화촉진 거동을 나타냈다. 샘플의 IC50은 표 5에 언급되어 있다. BSF-P 및 BSF-HP는 동일한 수치의 IC50 값을 갖는다.
4. 논의
4.1. 단백질 정량화
비신코닌산 어세이를 이용하여 추정된 4가지 수용성 추출물의 단백질 농도는 표 4에 나타낸다. 동애등에 단백질, FM 및 CM 사이의 아미노산 패턴 유사성을 고려할 때, 4가지 수용성 추출물의 단백질 함량은 다음 순서이다: BSF-P> CM> FM> 45.5%> BSF-HP.
4.2. DPPH 라디칼 소거 활성
DPPH 및 ABTS 어세이는 일반적으로 식품 및 사료 프로덕트의 항산화 가능성을 분석하기 위해 사용된다. DPPH 라디칼 소거 활성은 자유 라디칼을 안정화하기 위해 샘플이 수소 원자(수소 원자 전달이라고 함) 또는 전자(단일 전자 전달이라고 함)를 공여(donate)하는 능력을 나타낸다. 모든 시험된 샘플에 대한 DPPH 어세이 IC50 및 Emax는 각각 표 10 및 표 11에 언급되어 있다. 30분의 인큐베이션 후, 모든 시험된 샘플은 Emax<50%를 나타낸다(BSF-HP가 최고 Emax를 나타낸다). 한편, 60분의 인큐베이션 후 BSF-HP만 Emax>50%를 나타낸다. BSF-HP는 동애등에 단백질의 조절된 가수분해에 의해 제조되며 <1000 Da 단백질을 최소 24% 함유한다(표 3 참조). 한편, BSF-P는 <1000 Da 단백질을 적어도 6% 함유한다. 본 발명자는 FM 및 CM의 분자량 분포에 대한 어떠한 대표적인 문헌도 찾을 수 없었다. 그러나, 문헌에 따르면, FM 및 CM은 각각 2.2% 및 1.1%의 유리 아미노산(총 단백질의)을 함유한다[Li, P.; Wu, G. Composition of amino acids and related nitrogenous nutrients in feedstuffs for animal diets. Amino Acids 2020, 1-20, doi:10.1007/s00726-020-02833-4.]. 이는 FM 및 CM가 각각 <1000 Da 단백질을 적어도 2.2% 및 1.1% 함유하는 것으로 해석된다. 자유 라디칼을 소거하는 단백질성 물질의 능력(capacity)은 단백질 분자량 분포에 의존한다. 저분자량 펩티드를 갖는 단백질은 자유 라디칼을 보다 효율적으로 소거할 수 있다. 단백질성 분자의 자유 라디칼 소거 활성은 또한 다음에 의해 영향을 받는다: (1) 아미노산 조성: 소수성 아미노산(예, Tyr, Phe, Pro, Ala, His 및 Leu)은 친수성 아미노산에 비해 우수한 라디칼 소거 활성을 갖는다; (2) 아미노산 서열: 양친매성 성질(amphiphilic nature) 펩티드는 샘플의 라디칼 소거 활성을 향상시킬 수 있다. 화학적 분석은 Tyr이 수소 원자 전달 메커니즘을 통해 항산화 거동을 나타내는 것으로 나타냈다. 한편, Cys, Trp 및 His와 같은 아미노산은 단일 전자 전달 메커니즘을 통해 항산화 거동을 나타낸다.
FM 및 CM은 30분 및 60분의 인큐베이션 후에 시험된 대부분의 농도에서 산화촉진 거동을 나타낸다(도 3 및 4 참조). 이 거동은 주로 열처리에서 발생한다. FM 및 CM 모두에서, 열처리는 일반적으로 원료 프로덕트를 고온에서 15분 내지 20분 동안 가열하는 것을 포함한다. 노르웨이에서는, 피쉬 밀 생산 과정에서, 장내세균(Enterobacteriaceae) 및 살모넬라(Salmonella) 수의 100 log10 감소를 달성하기 위해 ≥70℃의 온도에서 ≥20분 동안 야생에서 잡은 어류를 가열 처리한다. 이러한 엄격한 열처리 조건은 지방 및 단백질의 산화를 초래할 수 있다. 피쉬 밀은 열 산화에 더욱 민감한 고도불포화지방산(polyunsaturated fatty acid)이 풍부한 지질을 함유한다. 항산화제는 일반적으로 고도불포화지방산의 산화 방지를 위해 피쉬 밀에 첨가된다(표 7에서도 볼 수 있음). 아미노산의 열 유도 산화는 광범위한 산화 프로덕트의 발달로 이어진다. 프로덕트에 의한 아미노산 산화의 산화촉진 거동은 이미 알려져 있다. 이는 동물 신체의 광범위한 건강 상태를 야기할 수 있다. 본 발명자가 사용 및 분석한 모든 동애등에 단백질 유도체(퓨레, 가수분해된 퓨레)는 <100℃의 온도에서 <1.5분 동안(예, 90℃에서 80 초 동안) 열처리되었다. 본 발명의 이러한 열처리 시간-온도 조합이 영양소(단백질 및 지방) 최소 손상 및 병원성 미생물총(microbiota)의 충분한(adequate) 비활성화를 보장하기 위해 채택되었다. 이는 FM 및 CM의 산화촉진 거동이 주로 엄격한 생산방법으로 인해 발생함을 의미한다.
최근 연구 중 하나[3]에서, 연구자는 브로멜라인 효소(bromelain enzyme)를 이용하여 BSF 단백질 가수분해물을 제조하였다. 브로멜라인 유래 단백질 가수분해물은 또한 DPPH 라디칼 소거 활성에 대해 시험되어, 8.4 mg/ml의 IC50을 나타냈다. 이 브로멜라인 유래 단백질 가수분해물의 DPPH 라디칼 소거 활성은 BSF-HP와 같은 프로덕트(60분 인큐베이션 후 IC50 0.18 mg/ml)의 활성과 비교할 때 훨씬 더 낮았다. 본 발명자에 의해 발견된 BSF-HP의 더 높은 활성은 (이 섹션에서 이전에 논의된 바와 같이) 구성요소 속성 및 원료 자체의 품질에 기인할 수 있다. Protix는 HACCP 조건 하에서 GMP+ 및 SecureFeed 인증 시설에서 곤충 단백질을 생산하고 있는 것으로 알려져 있다.
4.3. ABTS 양이온 라디칼 소거 활성
ABTS 양이온 라디칼 소거는 샘플이 전자를 공여하고 자유 라디칼을 안정화하는 능력을 나타낸다. 모든 샘플의 ABTS 어세이 IC50은 표 5에 나타낸다. 그 순서는 다음과 같다: FM> CM> BSF-HP> BSF-P. IC50이 높을수록 항산화 활성이 낮다. 이 어세이에서, 심지어 FM 및 CM도 항산화 활성을 나타낸다. FM 및 CM 추출물은 단일 전자 전달 메커니즘을 이용하여 자유 라디칼(들)이 안정화될 수 있는 경우 효율적일 수 있는 것으로 보인다. 그러나, 이들은 BSF 유도체 BSF 유충 퓨레 및 가수분해된 BSF 유충 퓨레의 놀랍게도 높은 소거 활성과 비교하여 여전히 더 낮은 소거 활성을 나타낸다.
단백질 분자량에 대한 라디칼 소거 활성의 의존성은 이미 섹션 4.2에 설명되어 있다. Protix에서 본 발명자는 BSF-P 및 BSF-HP가 정확히 동일한 아미노산 조성을 갖는다는 것을 확인했다. 그러나, 단백질 가수분해로 인해, <1000 Da 단백질의 양이 BSF-P에서 보다 BSF-HP에서 더 높다. 따라서 BSF-P IC50 값이 BSF-HP에 비해 약간 더 낮았다는 것은 다소 놀라운 일이다. 이는 가수분해의 메커니즘으로 설명될 수 있다. 효소 가수분해는 엑소- 및 엔도-펩티다아제를 통해 달성된다. 엑소펩티다아제는 말단 펩티드 결합을 절단하고, 반면에 엔도펩티다아제는 비-말단 펩티드 결합을 절단한다. 두 경우 모두 아미노산의 서열이 변경된다. 단일 전자 전달을 통해 생성된 펩티드의 라디칼 소거 능력은 또한 단백질 분자의 양친매성 성질에 의존한다. BSF-HP 중의 펩티드는 본질적으로 덜 양친매성이고, 이는 BSF-P에 비해 BSF-HP의 더 낮은 ABTS 양이온 라디칼 소거 활성을 초래할 수 있다.
Zhu 등[4]은 광범위한 시판 효소를 사용하여 BSF 단백질 가수분해물을 개발하였다. 가수분해물은 한외여과(ultrafiltration)를 이용하여 다음 그룹으로 추가로 분별되었다: 그룹 1(<3000 Da), 그룹 2(3000 내지 10,000 Da) 및 그룹 3(>10,000 Da). 또한 이들 가수분해된 분획물의 활성을 ABTS 양이온 라디칼 소거 활성에 대해 조사하였다. 실시예에서 아스코르브산이 레퍼런스 분자로 사용되었다. 흥미롭게도 가장 성능이 좋은 분획물 및 아스코르브산은 0.05mg/ml 농도에서 ABTS 양이온 라디칼을 각각 85.67% 및 92.11% 억제할 수 있었다. 본 발명자는 이제 놀랍게도 BSF-P가 이미 89 정도로 높은 ABTS 양이온 라디칼 소거 Emax를 나타냄을 확인하였다(0.2mg/ml에서). 이는 BSF-P를 분획화(fractioning)하면 매우 강력한 항산화 가능성을 가진 분획을 드러낸다는 것을 보여준다.
4.4. 호중구 반응 조절 활성
BSF 유도체의 강력한 자유 라디칼 소거 활성은 섹션 4.2 및 4.3에서 분명히 확인된다. 또한, 모든 샘플은 호중구 반응 조절 활성에 대하여 시험되었다. 호중구는 동물 체내에(인간, 애완동물, 어류, 가금류 및 돼지 포함) 존재하는 백혈구(white blood cells)이다. 이는 병원체에 대한 1차 방어에 관여한다. 병원성 미생물이 동물 체내로 들어가면, 호중구는 침입 부위로 달려가 방어를 시작한다. 과립화 동안, 호중구는 NADPH 옥시다아제를 포함하여 광범위한 산화 효소를 방출하며, 이는 수퍼옥사이드(superoxide) 음이온 및 부산물(예, 하이드로젼 퍼옥사이드) 생성의 원인이 된다. 수퍼옥사이드 음이온은 추가로 산화질소 라디칼과 반응하여 퍼옥시니트라이트(peroxynitrite)를 생성할 수 있다. 이 과정은 또한 히드록실 라디칼을 생성한다(하이드로젼 퍼옥사이드와 금속 이온의 반응에 의해). 이 산화 반응의 배터리는 숙주 동물의 방어에 중요하다. 그러나, 숙주 방어 중에 생성된 이러한 ROS는 신체 세포의 효소, 단백질, 지질 등과 반응하여 다양한 건강 상태(예, 세포 노화, 암 등)를 유발할 수 있다. 이 연구에서 수행된 호중구 어세이는 호중구 활성의 결과로 생성된 ROS를 소거하는 단백질성 분자의 능력을 결정한다. PMA는 호중구에 존재하는 단백질 키나제 C를 활성화하는데 사용되었으며, 이로써 ROS 생성에 대하여 촉매작용을 하는 NADPH 옥시다아제가 생성된다. 시스템에서 ROS 생성은 루시게닌(lucigenin) 증폭 화학발광과 조합된다. 단백질성 샘플의 ROS(특히 수퍼옥사이드 음이온) 소거 활성은 화학발광 감소로 표시된다.
본 발명자가 아는 한, 이는 BSF 유도체 BSF 유충 퓨레 및 가수분해된 BSF 유충 퓨레의 시험관내 호중구 반응 조절 활성에 대한 첫 번째 분석이다. CM은 5개의 시험 농도 중 3개에서 산화촉진 거동을 나타냈으며, Emax는 0.2mg/ml에서 단지 5%에 였다(도 9 및 표 6 참조). CM은 일반적으로 애완동물 식품 제조에 사용된다. 그러나, 본 발명의 실시예 및 구현에서의 비교 시험 결과는 CM 포함이 호중구에 의해 생성된 ROS 소거와 관련된 이점을 거의 또는 전혀 제공하지 않음을 나타낸다. 더욱이, CM 포함은 심지어 숙주 세포에 염증성 손상을 일으킬 수도 있다. 개 또는 고양이 세포의 반복적인 염증성 손상은 노화 가속화, 인지 기능 저하 등과 같은 상태로 해석될 수 있다.
한편, FM은 이 어세이에서 22%의 Emax인 온화한 항산화 거동을 나타낸다(표 6 참조). 0.2 mg/ml에서, FM은 5%의 억제를 나타낸다. 양식 사육 배지(즉, 물)는 병원성 박테리아의 지속적인 버퍼를 제공한다. 따라서, 양식 유기체는 지속적인 병원성 박테리아 침입의 위험에 처해 있다. 이는 면역 감소, 노화 등을 포함하는 광범위한 건강 상태를 초래한다. 본 발명자의 비교예는 반복적인 호중구 활성으로 인한 염증성 손상을 억제하는데 FM이 부적절함을 강조한다. 이는 종종 항생제 및 영양 보충제 사용의 결과로 발생하는 증분 비용으로 해석된다. BSF-P는 각각 59.57% 및 0.15mg/ml의 Emax 및 IC50을 나타낸다(표 6 참조). 더욱이, BSF-HP는 또한 BSF-P에 필적하는 호중구 반응 조절 활성을 나타낸다(표 5 참조).
4.5. MPO 반응 조절 활성(SIEFED 및 클래식한 분석)
호중구 반응의 일반적인 메커니즘은 알려져 있다. 호중구 세포외 트랩은 병원성 미생물을 비활성화하는데 필요한 몇 가지 분자를 함유한다. 호중구 세포외 트랩에 존재하는 MPO 효소는 하이드로젼 퍼옥사이드와 염소 이온으로부터 하이포염소산을 생성할 수 있다. 또한, MPO는 티로신을 티로실 자유 라디칼로 산화시킬 수 있다. MPO 산화의 두 가지 프로덕트(하이포염소산 및 티로실 자유 라디칼)은 병원체를 비활성화하는데 중요하다. 다시 말하면, 이들 분자와 동물 세포의 반복적인 상호작용으로 염증성 손상이 발생한다. 동물 체내에서, MPO-Fe(Ⅲ)(활성 형태)는 하이드로젼 퍼옥사이드와 반응하여 옥소페릴 π 양이온 라디칼(CpI 형태)을 형성한다. CpI 형태는 염소 이온과 결합된 MPO-Fe(Ⅲ)로 다시 전환되어 하이포염소산으로 변환된다. 그러나, 본 실험에서 CpI 형태의 MPO-Fe(Ⅲ)로의 역환원(back reduction)은 2단계로 달성되었다. 아질산염(nitrite) 이온을 통한 전자 전달에 의한 CpI의 MPO-Fe(Ⅳ)=O로의 제1 환원. 그 후, MPO-Fe(Ⅳ)=O를 MPO-Fe(Ⅲ) 형태로 전환시키는 전자 공급(electron provisioning)(AmplexTM Red 산화에 의한 레조루핀 반응으로)이 수행되었다. 단백질성 분자는 CpI 형태와 직접 반응하여 할로겐화를 종료하거나, 또는 MPO 활성의 결과로 생성된 ROS에 수소를 공여(수소 원자 전달)함으로써 MPO로 인한 산화적 손상을 방지할 수 있다. MPO 반응 조절 활성은 클래식 및 SIEFED 어세이를 이용하여 분석하였다. 클래식한 분석은 CpI 형태와 복합체를 형성하여 ROS를 안정화하는 샘플의 능력을 측정한다. 한편, SIEFED 어세이에서는, MPO가 토끼 다클론성 항체에 결합되어(그리고 나머지 화합물은 세척제거됨), CpI 형태와 복합체를 형성하는 샘플의 능력을 순수하게 측정한다.
호중구 반응 조절 활성과 마찬가지로, BSF 유도체 BSF 유충 퓨레 및 가수분해된 BSF 유충 퓨레의 MPO 반응 조절 활성도, 본 발명의 방법에 따라 퓨레를 제공한 후 본 발명자에 의해 처음으로 확증되었다. FM 및 CM은 두 가지 어세이 모두에서 산화촉진 거동을 나타낸다(도 7 및 8 참조). 산화촉진 반응을 개시할 수 있는 FM 및 CM에서의 산화 반응 프로덕트의 존재(제조 공정의 결과로서)는 이미 섹션 4.2에서 논의되었다. 본 발명자에 의해 실현된 상세한 시험관내 조사는 동물 식이에 FM 및 CM을 포함시키는 것이 염증성 손상을 초래할 수 있음을 나타낸다.
클래식한 어세이에서, BSF 유도체는 BSF-P> BSF-HP 순서의 IC50로 놀라울 정도로 강력한 항산화 가능성을 나타낸다. SIEFED 어세이에서, BSF-P는 50% 억제에 도달하지 않았다(심지어 시험된 최고 농도에서도). 따라서 BSF-P가 ROS를 안정화하는 데 더 효과적인 반면, BSF-HP는 MPO의 CpI 형태의 복합화에 더 높은 효능을 갖는다. 이러한 관찰은 두 가지 BSF 유도체가 MPO 활성으로 인한 염증성 손상을 효과적으로 억제하기 위해 애완동물 식품 및 양식 제형의 성분으로 사용하기에 적합하다는 것을 보여준다.
BSF 단백질 유도체는 FM 및 CM에 비해 항산화 이점을 제공한다.
실시예 4
퓨레 가열 시간의 결과로 인한 지방 산화
도입부
저온살균은 가공된 곤충 단백질 생산에 중요하다. 최적의 가열 시간과 최적의 가열 온도 조합은 다음에 대하여 중요하다:
(1). 병원체의 비활성화; 및
(2). 식품의 영양적 품질 보존.
지방의 품질(곤충 단백질의)과 관련하여, 저온살균 시간 x 온도 조합은 다음에 대하여 중요하다.
(1). 장내 SN-1,3-리파아제의 비활성화: 비활성화되지 않은 경우, 이 효소는 트리글리세리드를 유리 지방산(트리글리세리드의 SN-1,3 위치에 존재) 및 2-모노글리세리드로 가수분해할 수 있다.
(2). 지질 산화: 가열하면 다중불포화 지방산의 (비효소적) 산화를 초래할 수 있다. 리파아제 활성으로 인해 형성된 유리 지방산은 또한 리폭시게나제(lipoxygenase)를 통해 (효소적) 산화를 겪을 수 있다. 이 두 가지 산화 과정은 1차(예, 하이드로퍼옥사이드) 및 2차 산화 프로덕트(예, 알데히드 및 케톤)의 형성을 초래한다. 이러한 반응은 식품의 감각 품질과 또한 소비 동물의 건강에 부정적인 영향을 미친다.
본 실시예 4에서, (리파아제 비활성화를 분석하기 위해) 저온살균된 퓨레에서 FFA 형성의 정도와 가열 시간의 결과로서 하이드로퍼옥사이드의 발생이 확인된다.
물질 및 방법
사육단위(Protix, 네덜란드)에서 약 5kg의 살아있는 동애등에 유충을 채취하였다. 이 유충은 눈에 보이는 모든 불순물을 제거하기 위해 철저히 세척되었다. 세척된 유충 300g을 매 처리시 사용하였다. 유충을 민스하여 부드러운 슬러리(퓨레)를 얻고 표 7에 나타낸 처리에 따라 저온살균하였다. 저온살균된 유충 퓨레를 즉시 냉동하였다(-20°C까지). 이러한 냉동 샘플은 나중에 해동되어 유리 지방산 함량 및 퍼옥사이드 값에 대해 분석되었다. 모든 실험은 이중으로 수행되었다.
Figure pct00007
결과
각각의 처리에 대해 얻어진 유리 지방산 함량 및 과산화물 값은 표 8에 언급되어 있다.
Figure pct00008
표 8에서 볼 수 있듯이, 90℃에서 40초 동안 가열된 곤충 퓨레는 유리 지방산의 양이 비교적 높다(약 70%). 퓨레를 단지 40초 동안 가열하는 것은 리파아제의 비활성화에 비효과적이다. 한편, 퓨레를 80초 동안 가열하면 소량의 유리 지방산이 관찰되어, 90℃에서 효소 비활성화에 이 시간이 충분함을 나타낸다. 80초를 초과하는 가열 시간에서(표 7 및 표 8의 처리 4 및 5), 동애등에 유충 퓨레를 80초 동안 가열할 때 얻어지는 낮은 지방산 함량에 비해 지방산 함량이 증가한다. 따라서, 비교적 낮은 유리 지방산 함량을 포함하는 단백질 분획을 얻기 위해, 본 발명의 방법에서 가열 시간은 40초보다 길고 300초 보다 짧은 것으로, 예컨대 50초-100초, 또는 60초-90초, 또는 70초-85초, 예컨대 약 80초에서 선택된 가열 시간이어야 한다. 바람직한 가열 시간은 약 90℃ 또는 90℃± 2℃이다.
또한 더 높은 과산화물 값이 40초의 가열 기간에 대하여 관찰된다. 이는 하이드로퍼옥사이드의 생산으로 이어지는 효소 산화에 참여할 수 있는 다량의 유리 지방산으로 설명될 수 있다. 그러나, 80초 처리의 경우, 더 낮은 과산화물 값이 얻어진다. 프로덕트를 가열하는 것은, 처리 3, 즉 80초의 가열 시간에 대한 과산화물 값에 비하여 처리 4 및 처리 5의 과산화물 값이 증가한다는 점에서 지방 산화에 추가로 영향을 미친다. 따라서, 상대적으로 낮은 과산화물 값을 포함하는 단백질 분획을 얻기 위해, 본 발명의 방법에서 가열 시간은 40초 보다 길고 300초 보다 짧은 것으로, 예컨대 50초-100초, 또는 60초-90초, 또는 70초-85초, 예컨대 약 80초에서 선택된 가열 시간이어야 한다. 바람직한 가열 시간은 약 90℃ 또는 90℃±2℃이다.
결론
90℃에서 80초 동안 민스된 곤충 유충의 가열이 효소 비활성화에 충분하고, 유리 지방산 형성을 방지하며 과산화물 형성을 방지한다.
실시예 5
어류에 사료보충제를 공급한 후 어류 샘플의 항산화 활성
항-라디칼(ABTS) 기술을 사용하여 생선 필레 샘플의 항산화 활성을 조사하였다. HI-0, HI-25, HI-50 및 HI-100으로 지칭되는 수용성 동애등에 유충 단백질 추출물을 증류수에서 제조하고 다양한 농도로 사용하였다. ABTS 어세이에서, 최대 시험 농도에서의 억제 백분율은 다음 순서였다: HI-25 > HI-100 > HI-50 > HI-0. ABTS 어세이에서, HI-25 필레 샘플은 IC50 ≥50%에 도달하였다. 결론적으로, 시험된 일련의 농도내에서, HI-25샘플은 모든 시험된 생선 필레 샘플 중에서 최대 ABTS 라디칼 소거 활성을 보였다.
ABTS 어세이를 사용하여, 본 발명의 방법으로 얻어진 동애등에 단백질의 라디칼 저하 활성(radical lowering activity)과 관련하여 어육 샘플의 활성을 평가하였다.
물질 및 방법
식이
이 연구에 사용된 ProteinX(아메리카동애등에(Hermetia illucens)의 고 프로틴 밀)는 본 발명의 방법에 따라 생산되었으며 Protix(네덜란드)에 의해 제공되었다. 피쉬 밀(20.6%) 또는 ProteinX(32%)를 주요 단백질 공급원으로 하여 두 가지 등질소(iso-nitrogenous), 등지질(iso-lipidic) 및 등에너지(iso-energetic) 식이가 배합되었다. 두 가지 식이 모두 Research Diet Services(네덜란드)에서 생산되었다. 다이아몰(Diamol)은 소화율 측정을 위한 불활성 마커로 두 가지 식이에 모두 첨가되었다. 두 가지 사료 중 하나를 공급하거나 또는 두 가지 사료를 정해진 비율로 혼합하여 4가지 처리를 형성하였다.
식이 요법은 다음과 같다:
HI0(100% 피쉬 밀 기반 사료);
HI25(25% ProteinX 기반 사료와 혼합된 75% 피쉬 밀 기반 사료);
HI50(두 사료를 동일한 비율로 혼합, 50% ProteinX 기반 사료와 혼합된 50% 피쉬 밀 기반 사료); 및
HI100(100% ProteinX 기반 사료).
네 가지 식이 요법 모두의 대략적인 조성은 표 9에 제시되어 있다.
ProteinX 및 4가지 실험적 식이 요법의 대략적인 조성은 DISAFA 실험실에서 결정되었으며 표 9에 제시되어 있다. 사료 샘플은 절단 민서(MLI 204; Buhler AG, 우즈빌, 스위스)를 사용하여 그라인딩되고 건조 물질 함량(AOAC #934.01), 조단백질(crude protein) 함량(AOAC #984.13), 회분 함량(AOAC #942.05) 및 에테르 추출물(AOAC #2003.05)은 AOAC International에 따라 분석되었다. 조단백질 함량은 다음과 같이 계산되었다. 질소*6.25
어류 및 사육 조건
동물 먹이 주기 실험은 토리노 대학 농림식품과 실험시설(이탈리아)에서 수행되었다. 실험 프로토콜은 실험 동물의 관리 및 사용에 관한 현재 유럽 및 이탈리아 법률의 지침에 따라 설계되었다(유럽 지침(European directive) 86 609/EEC, 이탈리아에서 D.L. 116/92로 법 제정). 실험 프로토콜은 토리노 대학의 윤리 위원회(프로토콜 번호 143811)의 승인을 받았다.
어린 무지개 송어(Juvenile rainbow trout)는 개인 부화장(Troticoltura Bassignana, 쿠네요, 이탈리아)에서 얻었고 12개의 유리 섬유 탱크에 무작위로 배포되었다(n=3)(탱크당 50마리). 탱크에는 8L/min의 유속으로 플로우-스루 시스템(flow-through system)에서 자분정 수(artesian well water (13±1℃)가 공급되었다. 용존 산소는 2주마다 측정되었으며 범위는 7.6 내지 8.7mg/L이였다. 물고기는 탱크당 총 체중의 1.6%로 상업용 식단을 공급하는 4주 동안 실험 설정에 순응하였다. 순응 후, 113일 동안 1.4%의 고정 비율로, 20일 동안 1.1%의 고정 비율로 하여 물고기에게 133일 동안 식이요법을 제한적으로 공급하였다. 사료 섭취량은 각 투여에서 모니터링되었다. 사료는 주 6일, 하루에 두 번 손으로 분배되었다. 각 탱크의 바이오매스는 일일 공급 속도를 수정하기 위해 14일마다 대량(bulk)으로 칭량되었다. 사망률을 매일 확인하였다.
Figure pct00009
샘플링:
실험이 종료시, 물고기는 하루 동안 금식했고, 처리당 9마리의 물고기/처리(3마리의 물고기/탱크) 물고기(MS-222 - PHARMAQ Ltd, UK; 500mg/L)가 마취 과다 복용으로 사망한 경우에 개별적으로 칭량하였다. 각 물고기의 올바른 필레를 수집하고 진공 밀봉하고 냉동(-20℃)한 다음 냉동 건조하였다.
샘플 준비:
물고기 샘플(분말 형태)을 받았다. 샘플은 추가 처리가 될 때까지 냉동실(-20℃)에 보관되었다. Mouithys-Mickalad 등의 프로토콜(2020)에 따라 각 샘플의 수용성 추출물 분말(WSEP)을 제조하였다. WSEP는 추가 실험이 있을 때까지 데시케이터(18℃)에 보관되었다. WSEP의 스톡 용액은 Milli-Q 물에 20mg/mL의 최종 농도로 용해시켜 제조한 후, 이 스톡 용액을 반으로 희석하여 연속적으로 10, 5, 2.5 및 1.25mg/mL를 얻는다.
ABTS 라디칼 소거 활성:
ABTS 라디칼 양이온에 대한 WSEP 샘플의 라디칼 소거 활성은 Arnao 등의 방법(2001)에 따라 분석되었다. ABTS 스톡 용액은 7.0mmol/L ABTS 및 1.35mmol/L 과황산칼륨을 Milli-Q 물에 완전히 용해시켜 제조하였다. 반응이 완료되도록 시험 용액을 어두운 곳(18℃에서)에서 밤새 보관하였다. ABTS 작업 용액은 734 nm에서 0.7 내지 0.8 mm의 흡광도가 얻어지도록 스톡 용액을 메틸 알코올로 희석하여 제조하였다. ABTS 작업 용액(1920μL)을 20μL의 WSEP 용액(Milli-Q 물에 WSEP을 용해하여 얻음)과 혼합하여 0.0125, 0.025, 0.05, 0.1 및 0.2mg/ml의 최종 농도를 얻었다. 어두운 속에서 30분 동안 인큐베이션한 후, HP 8453 UV-vis 분광광도계를 사용하여 흡광도 감소를 734 nm에서 측정하였다. 대조군의 경우, WSEP 희석 대신 Milli-Q 물만 사용하였다. Paul(2007)이 기술한 바와 같이 다양한 샘플의 농도를 증가시키면서 반복을 수행하고 최종 부피 200μL(용매 198μL 및 WSEP 2μL)로 다중 웰 장치(96웰 플레이트)로 옮겼다. 마찬가지로, 30분의 인큐베이션 기간 후에, Multiskan Ascent 판독기(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 740 nm에서 흡광도를 판독하였다.
결과
WSEP 샘플의 ABTS 라디칼 소거 활성은 도 10에 나타낸다: 메탄올에서 수행된 WSEP의 ABTS 라디칼 소거 활성이 표시된다. 결과는 3중(triplicate)으로 한 3개의 독립적인 어세이의 평균±SD이다. 모든 샘플에 대한 농도 증가는 평균 억제 값(항산화 거동을 나타냄)의 증가를 초래하였다. Emax(시험 동안 얻어진 최대 억제)는 다음 순서였다: HI-25 > HI-100 > HI-50 > HI-0(모두 최종 농도, 0.2 mg/ml 에서 획득). 이 결과는 HI-25 샘플이 최고의 ABTS 라디칼 소거 활성을 나타냄을 나타낸다. 한편, HI-0 샘플은 최소의 ABTS 라디칼 소거 활성을 나타낸다. 결국, HI-25 샘플은 평균 억제 값 ≥50%를 나타냈다(IC50이 달성되었다).
결론
ABTS 어세이를 사용하여 평가한 바와 같이, 동애등에 유충에 본 발명의 방법을 적용하여 얻어진 모든 단백질 샘플은 용량-의존적 방식으로 항산화 활성을 나타낸다. HI-25 샘플은 최고의 항산화 활성을 나타낸다.
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Claims (25)

  1. 곤충을 영양소 스트림으로 전환하는 방법으로서,
    a) 신선한 곤충을 제공하고 이의 펄프를 제조하는 단계;
    b) 펄프를 60℃-95℃의 온도에서 50초-100초 동안 가열하는 단계
    c) 가열된 펄프를 물리적 분리 단계에 적용하여 지방 분획, 수성 단백질 분획 및 고체-함유 분획을 얻는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    곤충이 곤충 유충, 바람직하게는 동애등에 유충(black soldier fly)인, 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    동애등에 유충은 12일 내지 30일령, 바람직하게는 14일 내지 28일, 보다 바람직하게는 14일-26일, 가장 바람직하게는 유충이 전용(prepupae)으로 변태하기 전 12시간-3일, 예컨대 변태 전 1일-2일인, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    펄프가 가열하는 단계 전에 효소적으로 처리되지 않는, 방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 b) 전에 펄프를 효소로 처리하는 단계 a1)을 추가로 포함하는, 방법.
  6. 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 펄프를 40℃ 내지 70℃의 온도, 바람직하게는 45℃ 내지 65℃, 보다 바람직하게는 50℃±2℃의 온도에서 0.5시간 내지 3시간, 바람직하게는 1시간 내지 2시간 동안 효소로 처리하는, 방법.
  7. 제5항 또는 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    효소가 프로테아제, 예컨대 펩티다아제, 바람직하게는 적어도 하나의 프로테아제와 적어도 하나의 펩티다아제의 혼합물, 예컨대 플라보자임(Flavourzyme)인, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 a)에서 펄프는 곤충을 민싱(mincing)하여 제조되는, 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    단계 a)의 펄프에서 곤충 잔해의 평균 입자 크기가 10 마이크론 내지 500 마이크론 범위인, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 b)에서 펄프는 60℃-95℃의 온도에서 60초-90초 동안, 특히 90℃±2℃의 온도에서 75초-85초 동안 가열되는, 방법.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 b)에서 펄프는 75℃-95℃의 온도, 특히 80℃-93℃, 바람직하게는 85℃-90℃의 온도에 있는, 방법.
  12. 제1항 내지 제9항 또는 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 b)에서 펄프는 60초-95초, 특히 70초-90초, 바람직하게는 75초-85초, 예컨대 78초-82초 동안 가열되는, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    물리적 분리 단계는 디캔팅 및/또는 원심분리를 포함하는, 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    수성 단백질 분획 및 고체 함유 분획은 단계 (c) 후에, 바람직하게는 분무-건조 또는 유동층 건조에 의해, 가장 바람직하게는 유동층 건조에 의해 함께 건조되는, 방법.
  15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    수성 단백질 분획 및 고체-함유 분획은 단계 c) 후에 별도로 건조되며, 수성 단백질 분획은 바람직하게는 분무 건조, 유동층 건조, 동결건조 또는 굴절 건조, 또는 이의 조합에 의해 건조되는, 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 얻을 수 있는 지방 분획.
  17. 제16항에 따른 지방 분획을 포함하는 지방 조성물.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 얻을 수 있는 건조 단백질 분획.
  19. 제16항에 따른 지방 분획 또는 제17항에 따른 이의 조성물의 식품 또는 사료 프로덕트로서의 용도.
  20. 제15항에 따른 건조된 단백질 분획의 식품 또는 사료 프로덕트로서의 용도.
  21. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 방법의 단계 a) 및 b)에 의해 얻을 수 있는 곤충 펄프.
  22. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 방법의 단계 a), a1) 및 b)에 의해 얻을 수 있는 곤충 펄프.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서,
    사료 또는 사료 성분, 특히 애완동물 식품으로서 사용되는 곤충 펄프.
  24. 제21항 또는 제22항에 따른 곤충 펄프 또는 이의 유도체의 건강 증진 가능성을 갖는 식품 또는 사료 성분으로서의 용도.
  25. 세포 산화 손상의 예방 및/또는 억제 방법에 사용하기 위한 제21항 또는 제22항에 따른 곤충 펄프 또는 이의 유도체.
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