KR20220059386A - 바이오마커 기반 치료용 조성물 - Google Patents

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KR20220059386A
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홍승우
문재희
신재식
김요셉
박윤선
이민기
정준의
이소희
최순진
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웰마커바이오 주식회사
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Abstract

본 발명은 티에노피리딘 유도체 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 단백질 키나제에 내성인 환자 치료용 항암제를 제공한다. 이때, 상기 환자는 활성을 RON을 가지는 환자일 수 있다. 또한, 상기 환자는 정상형 KRAS를 가지는 환자일 수 있다. 또한, 상기 항암제는 EGFR 억제제에 내성을 가지는 환자에 적용될 수 있다. 특히, 상기 항암제는 세툭시맙 치료제에 내성이 있는 환자의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

바이오마커 기반 치료용 조성물
본 발명은 활성형 RON 키나제를 보유하고 있는 암 환자에 적용가능한 티에노피리딘 유도체 및 이를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
세툭시맙은 표피 성장 인자 수용체(EGFR)의 억제제이다. 특히, 전이성 대장 암, 전이성 비소 세포 폐암 및 두경부암의 암세포에서 EGFR이 과별현되므로, 세툭시맙은 상기 질환의 치료에 주로 사용되고 있다. 그러나, 상기 항암제에 내성을 가지는 환자는 세툭시맙을 이용할 수 없다. 세툭시맙에 내성을 가지는 원인은 여러가지가 있다. 대표적으로 EGFR 신호 전달 체계에 위치하는 KRAS와 같은 단백질에 돌연변이가 있는 암세포는 세툭시맙에 내성을 띠게 된다. 따라서, 효과적인 암치료를 위해서는 종래 항암제에 내성을 가지는 환자에 적합한 새로운 항암제가 필요하다.
한편, 세포내 신호 전달 체계에서 가장 중요한 단백질 중 하나가 단백질 키나제이다. 단백질 키나제는 다른 단백질을 인산화시킴으로써 해당 단백질의 활성, 위치 및 기능을 조절하여, 세포 내 신호전달 과정을 제어한다. 상기 단백질 키나제로는 AB1, ACK, ALK, ARG, ARK5, AURORA, AX1, BMX, c-MET, c-RAF, c-SRC, EGFR, FAK, FES, FGFR, FLT3, GSK3, IGF, IKK, JAK, LCK, LIMK, LYN, MEK, MER, MK-2, RET, RON, ROS, RSE 등이 있다. 이러한 단백질 키나제에 돌연변이가 생길 경우에는 암, 면역질환, 신경질환, 대사질환 및 감염 등의 질병이 발생할 수 있다.
이 중, 암세포에서의 비정상적인 c-MET 활성화는 항암 치료의 예후를 악화시키는 것과 밀접하게 관계가 있다고 보고되었다. 특히, 비소세포성 폐암(non-small cell lung cancer, NSCLC)과 같은 여러 암질환에서 c-MET의 과발현 및 돌연변이가 관찰되었다. 종양의 침윤 및 전이는 암환자의 주요 사망 원인이므로 c-MET 신호전달을 억제시키는 것은 암 치료에 효과적일 수 있다. 특히, RON(recepteur d'origine nantais)은 c-MET 계열에 속하는 단백질 수용체로서, 간에서 분비되며 대식세포의 작용을 조절하는 혈청 단백질(macrophage-stimulating protein; MSP)의 수용체이다. RON의 활성 여부는 종양의 발생, 진행 및 전이에 중요한 역할을 한다. 특히, 대장암 및 유방암에서 과발현 또는 과활성되면 종양의 침윤 및 전이를 유도하고 세포사멸을 억제하는데 기여하는 것으로 보고되고 있다.
따라서, 비정상적으로 활성화된 RON의 활성을 특이적으로 억제할 수 있는 물질은 RON과 관련된 여러 질환, 특히 대장암과 같은 종양을 효과적으로 치료할 수 있다. 따라서, 비정상적으로 활성화된 RON의 활성을 억제할 수 있는 항암제의 개발이 시급한 실정이다.
본 발명의 목적은 비정상적으로 활성화된 RON의 활성을 억제할 수 있는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 하는 암 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 특히, 세툭시맙과 같은 항암제에 내성이 있는 환자에 효과적으로 작용할 수 있는 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 과제를 해결하기 위하여 화학식 1로 표시되는 티에노피리딘 유도체 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하며, 세툭시맙과 같은 단백질 키나제 억제제에 내성인 환자를 치료하기 위한 항암제를 제공한다.
본 발명에 따른 항암용 약학적 조성물은 활성형 RON 키나제를 보유하고 있는 암환자에 적용 가능하다. 특히, 상기 약학적 조성물은 종래 항암 치료에 사용되고 있는 세툭시맙에 내성이 있는 환자의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 RON 돌연변이(△160)인 대장암 종양 세포주(KM12C)에서 시료 화합물의 농도(1 μM 및 5 μM)에 따른 세포사멸율(%)을 나타낸 그래프이다.
도 2는 RON 돌연변이(△160)인 KM12C 세포주에서 실시예 18을 농도별로 처리한 후 활성형 RON(pTyr-RON)의 발현 감소를 확인한 것이다.
도 3은 RON 돌연변이(△160)에 대한 kinase assay를 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 RON 돌연변이(△155)에 대한 kinase assay를 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 Colo320HSR 세포주에 RON 돌연변이(mt#1: △160, mt#2: △155)를 과발현한 후 실시예 18에 대한 효능을 확인한 것이다.
도 6은 Colo320HSR 세포주에 RON 돌연변이(mt#1: △160, mt#2: △155)를 과발현한 후, 웨스턴 블랏(western blot) 분석으로 실시예 18에 대한 효능을 확인한 것이다.
도 7은 RON 돌연변이(△160) KM12C 세포주에 실시예 18을 처리한 후 활성형 RON(pTyr-RON)의 발현 감소를 확인하고, 실시예 18의 작용 기전을 분석한 것이다.
도 8은 KM12C 세포주가 이식된 동물 모델에서 실시예 18에 대한 종양 성장 억제 효능 확인한 것이다.
도 9는 KM12C 세포가 이식된 동물 모델에서 실시예 18에 대한 종양 성장 억제 효능 확인한 것이다.
도 10은 KM12C 세포주가 이식된 동물 모델에서 실시예 18을 투여했을 때 마우스 체중 변화를 확인한 것이다.
도 11은 KM12C 세포주가 이식된 동물 모델에서 실시예 18 처리시, 활성형 RON(pTyr-RON) 및 p-ERK, cleaved caspase3의 발현 변화를 확인한 것이다.
도 12는 KM12C 세포주가 이식된 동물 모델에서 실시예 18 투여 종료 후 종양을 적출하여, 활성형 RON(pTyr-RON) 및 cleaved caspase 3의 발현 변화를 확인한 것이다.
도 13은 KM12C 세포주가 이식된 동물 모델에서 실시예 18 투여시 종양 성장 억제 효능을 분석한 것이다.
도 14는 KM12C 세포주가 이식된 동물 모델에서 실시예 18 투여 후 마우스의 상태 및 각 마우스에서 적출된 종양의 크기를 분석한 것이다.
도 15는 KM12C 세포주가 이식된 동물 모델에서 실시예 18 투여시 마우스의 체중 변화를 관찰한 것이다.
도 16은 KM12C 세포주가 이식된 동물 모델에서 유효 투여 농도를 확인한 것이다.
도 17은 KM12C 세포주가 이식된 동물 모델에서 유효 투여 농도를 확인한 것이다.
도 18은 대장암 환자 조직을 이식한 동물 모델에서 실시예 18의 효능을 분석한 것이다.
도 19는 대장암 환자 조직을 이식한 마우스에 실시예 18을 투여한 후 마우스의 상태 및 각 마우스에서 적출된 종양의 크기를 분석한 것이다.
도 20은 대장암 환자 조직을 이식한 동물 모델에서 실시예 18의 효능을 분석한 것이다.
도 21은 대장암 환자 조직을 이식한 동물 모델에서 적출한 종양의 크기를 분석한 것이다.
도 22는 대장암 환자 유래 세포주 중 활성형 RON 발현 여부에 따른 실시예 18의 세포 사멸 효능을 분석한 것이다.
도 23은 대장암 환자 유래 세포주 중 활성형 RON 발현 여부에 따른 실시예 18의 효능을 분석한 것이다.
도 24는 대장암 환자 유래 세포주 중 RON을 발현하지 않는 세포주에서 실시예 18에 대한 세포 사멸 효능을 분석한 것이다.
도 25는 대장암 환자 유래 세포주 중 RON을 발현하지 않는 세포주에서 실시예 18에 대한 효능을 분석한 것이다.
도 26은 대장암 세포주에서 바이오마커(RON mutation)에 대해 유전자 분석을 수행한 결과이다.
도 27은 한국인 대장암 환자군에서 RON 돌연변이에 대해 유전자 분석을 수행한 결과이다.
도 28은 한국인 대장암 환자군에서 RON 및 KRAS 돌연변이에 대해 유전자 분석을 수행한 결과이다.
도 29는 코카사스 인종(Caucasian) 대장암 환자군에서 RON 돌연변이 분석을 수행한 결과이다.
도 30은 코카사스 인종(Caucasian) 대장암 환자군에서 RON 및 KRAS 돌연변이 분석을 수행한 결과이다.
도 31은 대장암 환자 종양세포가 이식된 동물모델 조직에서 RON 및 KRAS 돌연변이 확인을 위해 유전자 분석을 수행한 결과이다.
발명의 실시를 위한 최선의 형태
이하 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.
용어의 정의
본 명세서에 있어서, 용어 "할로겐"은 다른 언급이 없으면 F, Cl, Br 또는 I를 의미한다.
용어 "알킬"은, 달리 명시되지 않는 한, 선형 또는 분지형의 포화된 탄화수소 잔기를 의미한다. 예를 들어, "C1-10알킬"은 1 내지 10개 탄소로 골격이 이루어진 알킬을 의미한다. 구체적으로 C1-10알킬은 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필, n-부틸, i-부틸, t-부틸, n-펜틸, i-펜틸, t-펜틸, sec-펜틸, 네오펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실 등을 포함할 수 있다.
용어 "할로알킬"은 하나 이상의 할로겐으로 치환된 알킬을 의미한다. 구체적으로, 할로알킬은 동종의 할로겐이 2개 이상 치환되거나 2종 이상의 할로겐이 치환된 알킬일 수 있다.
용어 "헤테로사이클"은 하나 이상의 헤테로원자를 갖는 방향성 또는 비방향성의 고리를 의미하며, 포화되거나 불포화될 수 있고, 단일고리 또는 다중고리일 수 있다. 예를 들어 "4 내지 10원의 헤테로사이클"은 헤테로원자 및 탄소원자를 포함하여 총 4 내지 10개의 원자로 골격이 이루어진 헤테로사이클을 의미한다. 구체적으로 4 내지 10원의 헤테로사이클은 아제티딘, 디아제티딘, 피롤리딘, 피롤, 이미다졸리딘, 이미다졸, 피라졸리딘, 피라졸, 옥사졸리딘, 옥사졸, 이속사졸리딘, 이속사졸, 티아졸리딘, 티아졸, 이소티아졸리딘, 이소티아졸, 피페리딘, 피리딘, 피페라진, 디아진, 모폴린, 티오모폴린, 아제판, 디아제판 등을 포함할 수 있다.
용어 "헤테로원자"는 탄소(C) 이외의 원자를 의미하며, 구체적으로 질소(N), 산소(O) 또는 황(S) 원자일 수 있다.
용어 "치환"은, 지정된 원자 상의 원자가(valence)를 초과하지 않으면서 이러한 치환으로부터 화학적으로 안정한 화합물이 되도록, 분자 구조체 내의 수소 원자를 치환기로 대체하는 것을 지칭한다. 예를 들어 "그룹 A가 치환기 B로 치환"된다는 것은, 그룹 A의 골격을 구성하는 탄소 등의 원자에 결합된 수소 원자가 치환기 B로 대체되어, 그룹 A와 치환기 B가 공유 결합을 형성함을 의미할 수 있다.
약학적 조성물
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 단백질 키나제 억제제에 내성인 암환자 치료용 약학적 조성물을 제공한다:
[화학식 1]
Figure pct00001
상기 식에서,
RA는 C1-10알킬, 페닐 또는 벤질이고, 여기서 RA는 할로겐 및 C1-10알콕시 중에서 선택되는 하나 이상의 치환기를 갖거나 갖지 않고;
X는 -C(-RB')= 또는 -N=이고;
RB 및 RB'는 각각 독립적으로 H, 할로겐, C1-10알킬, 또는 C1-10알콕시이고;
RC는 H, 할로겐, 또는 C1-10알킬이고;
L은 단일결합 또는 C1-6알킬렌이고;
R은 N 및 S 중에서 선택되는 1개 또는 2개의 헤테로원자를 갖는 5 내지 8원의 헤테로사이클이고;
RD는 H, C1-10알킬, -(CH2)n-Y-RG, 또는 -CH2-NRERF이고;
RE 및 RF는 각각 독립적으로 H, C1-10알킬 또는 -(CH2)n-Y-RG이거나, 또는 RE와 RF는 서로 연결되어 이들이 결합된 N 원자와 함께 4 내지 10원의 헤테로사이클을 형성하고;
여기서 n은 0 내지 10의 정수이고; Y는 -O-, -C(=O)-, -C(=O)-O-, -S- 또는 -S(=O)2-이고; RG은 직쇄 또는 분지쇄의 C1-10알킬이며, 이때 RG는 할로겐, 아미노, 히드록시 및 C1-6알콕시로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 치환기를 갖거나 갖지 않고;
상기 4원 내지 10원의 헤테로사이클은 RE와 RF가 결합된 N 원자 이외에도 N, O 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 또는 2개의 헤테로원자를 더 갖거나 갖지 않으며, 또한 4원 내지 10원의 헤테로사이클은 할로겐 및 C1-6알킬 중에서 선택되는 하나 이상의 치환기를 갖거나 갖지 않는다.
일 구현예에 따르면, 상기 화학식 1에서, RA는 메틸, 페닐, 할로벤질, 또는 할로페닐일 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 화학식 1에서, RB 및 RB'는 각각 독립적으로 H, 메틸, 메톡시 또는 에톡시일 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 화학식 1에서, X는 -C(-RB')=이고; RB 및 RB'는 각각 독립적으로 H, 메틸, 메톡시 또는 에톡시이며, 이때 RB 및 RB'는 동시에 H가 아닌 것일 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 화학식 1에서, RC는 H 또는 할로겐일 수 있다. 여기서 할로겐은 F, Cl, Br 또는 I일 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 화학식 1에서, L은 단일결합 또는 메틸렌이고; R은 이미다졸릴, 피라졸릴, 피리디닐, 피페라지닐 또는 싸이아졸릴일 수 있다.
일 구현예에 따르며, RD는 H, 메틸, 에틸, 메톡시메틸, 또는 -CH2-NRERF이고; RE 및 RF는 각각 독립적으로 H, C1-6알킬, 또는 -C1-6알킬렌-O-C1-10알킬이고, 이때 RE 및 RF는 동시에 H가 아닌 화합물일 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 화학식 1에서, RE 및 RF는 이들이 결합된 N 원자와 함께
Figure pct00002
를 형성하고; 여기서 Ra 및 Rb는 각각 독립적으로 C1-3알킬렌이고; A는 -N(-C1-6알킬)- 또는 -O-인 화합물일 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 화학식 1에서, RA는 메틸, 페닐, 할로벤질, 또는 할로페닐이고; X는 -CH=이고; RB는 H, 메틸, 메톡시 또는 에톡시이고; RC는 H 또는 할로겐이고; L은 단일결합 또는 메틸렌이고; R은 이미다졸릴, 피라졸릴, 피리디닐, 싸이아졸릴, 또는 피페라지닐이고; RD는 H, 메틸, 에틸, 메톡시메틸, 또는 -CH2-NRERF이고; 여기서 RE는 -C2H4-O-CH3이고 RF은 H 또는 메틸이거나, 또는 RE 및 RF는 서로 연결되어 이들이 결합된 N 원자와 함께 모폴리노 또는 메틸피페라지닐을 형성할 수 있다. 여기서 할로겐은 F, Cl, Br 또는 I일 수 있다.
본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 약학적으로 허용가능한 염을 포함한다. 상기 약학적으로 허용가능한 염은 인간에 대한 독성이 낮아야 하며, 모(母) 화합물의 생물학적 활성 및 물리화학적 특성에 임의의 부정적인 영향을 주지 않아야 한다.
예를 들어, 상기 약학적으로 허용가능한 염은 약학적으로 허용가능한 유리 산(free acid)에 의해 형성된 산부가염일 수 있다. 상기 유리 산으로는 무기 산 또는 유기 산을 사용할 수 있으며, 이때 무기 산은 염산, 황산, 질산, 인산, 과염소산, 브롬산 등일 수 있고, 유기 산은 아세트산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, p-톨루엔설폰산, 푸마르산, 말레산, 말론산, 프탈산, 석신산, 락트산, 시트르산, 글루콘산, 타르타르산, 살리실산, 말산, 옥살산, 벤조산, 엠본산, 아스파트산, 글루탐산 등일 수 있다.
상기 산부가염은 통상의 방법, 예를 들어 상기 화학식 1의 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들어 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조될 수 있다.
또한, 상기 약학적으로 허용가능한 염은 알칼리금속염(나트륨염 등) 또는 알칼리토금속염(칼륨염 등)일 수 있다. 상기 알칼리금속염 또는 알칼리토금속염은, 예를 들어 상기 화학식 1의 화합물을 과량의 알칼리금속 수산화물 또는 알칼리토금속 수산화물 용액 중에 용해시키고, 미용해된 화합물 염을 여과한 후 여액을 증발 및 건조시켜 얻을 수 있다.
또한, 본 발명의 화합물은 키랄 탄소 중심을 가질 수 있으며, 이에 따라 R 또는 S 이성질체, 라세미 화합물, 개개의 거울상 이성질체 또는 혼합물, 개개의 부분입체 이성질체 또는 혼합물 형태로 존재할 수 있으며, 이러한 모든 입체 이성질체 및 이들의 혼합물이 본 발명의 범주에 속할 수 있다.
또한, 본 발명의 화합물은 상기 화학식 1의 화합물의 수화물 및 용매화물을 포함할 수 있다. 상기 수화물 및 용매화물은 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있으며, 무독성 및 수용성인 것이 바람직하다. 특히, 바람직하게는 상기 수화물 및 용매화물은 각각 물 및 알코올성 용매(특히, 에탄올 등)의 1 내지 5개의 분자가 결합된 것일 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 구체적인 예는 아래와 같다:
1) 4-에톡시-N-(3-플루오로-4-(2-(1-메틸-1H-이미다졸-4-일)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일옥시)페닐)-1-(4-플루오로페닐)-2-옥소-1,2-디하이드로피리딘-3-카르복스아미드;
2) 4-에톡시-N-(3-플루오로-4-(2-(1-메틸-1H-이미다졸-4-일)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일옥시)페닐)-1-메틸-2-옥소-1,2-디하이드로피리딘-3-카르복스아미드;
3) 4-에톡시-N-(3-플루오로-4-(2-(1-메틸-1H-이미다졸-2-일)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일옥시)페닐)-1-(4-플루오로페닐)-2-옥소-1,2-디하이드로피리딘-3-카르복스아미드;
4) 4-에톡시-N-(3-플루오로-4-(2-(1-메틸-1H-피라졸-4-일)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일옥시)페닐)-1-(4-플루오로페닐)-2-옥소-1,2-디하이드로피리딘-3-카르복스아미드;
5) 4-에톡시-N-(3-플루오로-4-(2-(피리딘-2-일)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일옥시)페닐)-1-(4-플루오로페닐)-2-옥소-1,2-디하이드로피리딘-3-카르복스아미드;
6) 4-에톡시-N-(3-플루오로-4-(2-(피리딘-3-일)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일옥시)페닐)-1-(4-플루오로페닐)-2-옥소-1,2-디하이드로피리딘-3-카르복스아미드;
7) 4-에톡시-N-(3-플루오로-4-(2-(싸이아졸-2-일)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일옥시)페닐)-1-(4-플루오로페닐)-2-옥소-1,2-디하이드로피리딘-3-카르복스아미드;
8) 4-에톡시-N-(4-(2-(1-에틸-1H-이미다졸-4-일)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일옥시)-3-플루오로페닐)-1-(4-플루오로벤질)-2-옥소-1,2-디하이드로피리딘-3-카르복스아미드;
9) 4-메톡시-N-(3-플루오로-4-(2-(1-(메톡시메틸)-1H-이미다졸-4-일)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일옥시)페닐)-1-페닐-2-옥소-1,2-디하이드로피리딘-3-카르복스아미드;
10) 4-에톡시-N-(3-플루오로-4-(2-(피페라진-1-일메틸)싸이에노[3,2-b]피리딘- 7-일옥시)페닐)-1-(4-플루오로페닐)-2-옥소-1,2-디하이드로피리딘-3-카르복스아미드;
11) 4-에톡시-N-(3-플루오로-4-(2-((4-메틸피페라진-1-일)메틸)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일옥시)페닐)-1-(4-플루오로페닐)-2-옥소-1,2-디하이드로피리딘-3-카르복스아미드;
12) 4-에톡시-N-(3-플루오로-4-{[2-(5-{[(2-메톡시에틸)아미노]메틸}피리딘-2-일)티에노[3,2-b] 피리딘-7-일]옥시}페닐)-2-옥소-1-페닐-1,2-디히드로피리딘-3-카르복스아미드;
13) 4-에톡시-N-(3-플루오로-4-{[2-(5-{[(2-메톡시에틸)아미노]메틸}피리딘-2-일)티에노[3,2-b]피리딘-7-일]옥시}페닐)-1-(4-플루오로페닐)-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-카르복스아미드;
14) N-(3-클로로-4-{[2-(5-{[(2-메톡시에틸)아미노]메틸}피리딘-2-일)티에노[3,2-b]피리딘-7-일]옥시}페닐)-1-(4-플루오로페닐)-4-메톡시-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-카르복스아미드;
15) 4-에톡시-N-(3-플루오로-4-{[2-(5-{[(2-메톡시에틸)아미노]메틸}피리딘-2-일)티에노[3,2-b]피리딘-7-일]옥시}페닐)-1-(3-플루오로페닐)-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-카르복스아미드;
16) N-(3-플루오로-4-{[2-(5-{[(2-메톡시에틸)아미노]메틸}피리딘-2-일)티에노[3,2-b]피리딘-7-일]옥시}페닐)-1-(4-플루오로페닐)-4-메틸-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-카르복스아미드;
17) 4-에톡시-N-(3-플루오로-4-{[2-(5-{[(2-메톡시에틸)(메틸)아미노]메틸}피리딘-2-일)티에노[3,2-b]피리딘-7-일]옥시}페닐)-1-(4-플루오로페닐)-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-카르복스아미드;
18) 4-에톡시-N-[3-플루오로-4-({2-[5-(모르폴리노메틸)피리딘-2-일]티에노[3,2-b]피리딘-7-일}옥시)페닐] -1-(4-플루오로페닐)-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-카르복스아미드;
19) 4-에톡시-N-[3-플루오로-4-({2-[5-(모르폴리노메틸)피리딘-2-일]티에노[3,2-b]피리딘-7-일}옥시)페닐]-2-옥소-1-페닐-1,2-디히드로피리딘-3-카르복스아미드;
20) 4-에톡시-N-{3-플루오로-4-[(2-{5-[(4-메틸피페라진-1-일)메틸]피리딘-2-일}티에노[3,2-b]피리딘-7-일)옥시]페닐}-1-(4-플루오로페닐)-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-카르복스아미드; 및
21) 4-에톡시-N-{3-플루오로-4-[(2-{5-[(-메틸피페라진-1-일)메틸]피리딘-2-일}티에노[3,2-b]피리딘-7-일)옥시]페닐}-2-옥소-1-페닐-1,2-디히드로피리딘-3-카르복스아미드.
약학적 조성물의 적용 범위
상기 단백질 키나제는 다른 단백질을 인산화시켜 단백질의 활성, 위치 및 기능을 조절하여 다양한 세포 내 과정을 제어하는 효소이다. 이러한 단백질 키나제의 제어 기능 이상은 암, 면역질환, 신경질환, 대사질환 및 감염 등의 질병 기작과 밀접하게 연관되어 있다. 상기 단백질 키나제에는 ABl, ACK, ALK, ARG, ARK5, AURORA, AXl, BMX, BTK, CDK, CHK, c-KIT, c-MET, c-RAF, c-SRC, EGFR, FAK, FES, FGFR, FLT3, GSK3, IGF, IKK, JAK, LCK, LIMK, LYN, MEK, MER, MK-2, P38ALPHA, PDGFR, PDK, PIM, PKA, PKB, PKCR, PLK-1/3, RET, ROS, RSE, TIE, TRK, TYRO3, VEGFR, YES 등이 포함된다. 이때, 바람직하게 상기 단백질 키나제는 EGFR일 수 있다.
또한, 상기 약학적 조성물이 적용 가능한 암환자는 활성형 RON(Recepteur d'Origine Nantais)을 보유하고 있을 수 있다. 또한, 상기 환자는 정상형 KRAS를 보유한 환자일 수 있다. 바람직하게, 상기 약학적 조성물은 활성형 RON을 가지고, 정상형 KRAS를 가진 환자에 적용될 수 있다. 특히, 상기 환자는 세툭시맙에 내성을 나타내는 환자일 수 있다.
상기 RON(Recepteur d'Origine Nantais)은 MET(c-MET) 계열에 속하는 단백질 수용체로서, 간에서 분비되며 대식세포의 작용을 조절하는 혈청 단백질(MSP)의 수용체이다. 본 명세서에서 사용된 용어, "활성형 RON" 은 정상형 RON과는 달리 항상 활성화가 되어 있는 것을 의미한다. 이러한 RON의 활성 정도는 진핵 생물에서 유전자 발현 조절의 중요한 과정 중 하나인 선택적 스플라이싱(alternative splicing)에 의해서 조절된다.
활성형 RON의 예시로는, RONΔ155, RONΔ160 및 RONΔ165 등일 수 있다. 상기 활성형 RON은 스플라이싱에 의한 엑손들의 스키핑(skipping)에 의해 생성되는 형태로서 리간드 없이도 구조적으로 항상 활성화되어 있다. 따라서, 상기 암환자가 가지고 있는 활성형 RON의 일 구체예로는 RONΔ155, RONΔ160, RONΔ165 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 활성형 RON은 돌연변이 RON일 수 있다. 상기 "돌연변이 RON" 은 RON의 일부 아미노산이 치환, 결실 또는 삽입되어 RON이 항상 활성화가 되어 있는 것을 의미한다. 또한, MSP(메틸화 특이적 중합효소 연쇄 반응, methylation specific PCR)가 있는 경우에는 정상형 RON인 경우에도 활성화되어 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 활성형 RON에 작용하여, 활성형 RON의 활성을 억제시킬 수 있다.
또한, 상기 약학적 조성물은 유방암, 폐암, 위암, 전립선암, 자궁암, 난소암, 신장암, 췌장암, 간암, 대장암, 피부암, 두경부암 및 갑상선암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 암을 치료하기 위한 조성물 일 수 있다. 이때, 상기 암은 활성형 RON을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 암은 RONΔ155, RONΔ160 및 RONΔ165로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 활성형 RON을 가지고 있을 수 있다.
약학적 조성물의 제형
본 발명의 약학적 조성물은 유효성분으로서 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을, 조성물의 총 중량을 기준으로 약 0.1 중량% 내지 약 90 중량%, 구체적으로 약 0.1 중량% 내지 약 75 중량%, 보다 구체적으로 약 1 중량% 내지 약 50 중량%로 함유할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은, 통상적인 방법에 따라 제제로 배합되는 통상적이고 무독성인 약학적으로 허용가능한 첨가제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물에 사용되는 첨가제의 예는 감미제, 결합제, 용매, 용해 보조제, 습윤제, 유화제, 등장화제, 흡수제, 붕해제, 산화방지제, 보존제, 윤활제, 활택제, 충전제, 향미제 등을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 첨가제는 락토오스, 덱스트로스, 수크로스, 만니톨, 소르비톨, 셀룰로스, 글리신, 실리카, 활석, 스테아르산, 스테아린, 마그네슘 스테아레이트, 마그네슘 알루미노실리케이트, 전분, 젤라틴, 트라가칸트 검, 알긴산, 나트륨 알기네이트, 메틸셀룰로스, 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 한천, 물, 에탄올, 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 염화나트륨, 염화칼슘, 오렌지 에센스, 딸기 에센스, 바닐라 향 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 경구 투여(예컨대, 정제, 환제, 산제, 캡슐제, 시럽 또는 에멀젼) 또는 비경구 투여(예컨대, 근육내, 정맥내 또는 피하 주사)를 위한 다양한 제제 형태로 배합될 수 있다.
바람직하게는 본 발명의 조성물은 경구 투여용 제제로 배합될 수 있으며, 이때 사용되는 첨가제로는 셀룰로스, 칼슘 실리케이트, 옥수수 전분, 락토오스, 수크로스, 덱스트로스, 칼슘 포스페이트, 스테아르산, 마그네슘 스테아레이트, 칼슘 스테아레이트, 젤라틴, 활석, 계면활성제, 현탁제, 유화제, 희석제 등이 포함될 수 있다. 구체적으로, 활택제(Glidant)의 예로는 콜로이드성 이산화규소(Colloidal Silicon Dioxide), 마그네슘 실리케이트(Magnesuim Sillicate) 등이 있고; 희석제(Diluent)의 예로는 미세결정질 셀룰로오스(Microcrystalline Cellulose), 락토오스 Fast Flo 락토오스 무수물(Lactose Anhydrous), 락토오스 1수화물(Lactose Monohydrate), 규화(silicified) MCC HD 90 등이 있으며, 붕해제(Disintegrant)의 예로는 크로스카르멜로스 소듐(Croscarmellose Sodium), 크로스포비돈(Crospovidone) 등이 있고; 윤활제(Lubricant)의 예로는 마그네슘 스테아레이트(Magnesium Stearate), 소듐 라우릴 설페이트(Sodium Lauryl Sulfate), 스테아르산(Stearic Acid) 등이 있다.
또한, 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 유제, 시럽제 등이 예시될 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
또한, 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액제, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈61. 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 한편, 주사제에는 용해제, 등장화제, 현탁화제, 유화제, 안정화제, 방부제 등과 같은 종래의 첨가제가 포함될 수 있다.
약학적 조성물의 용량 및 용법
본 발명의 화합물 또는 조성물은 치료학적으로 유효한 양 또는 약학적으로 유효한 양으로 환자에 투여될 수 있다.
여기서 "치료학적으로 유효한 양" 또는 "약학적으로 유효한 양"이란 대상 질환을 예방 또는 치료하는데 유효한 화합물 또는 조성물의 양으로서, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미한다. 상기 상기 유효량의 수준은 환자의 건강상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명의 화합물 또는 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 조성물에서 화합물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 kg 당 약 0.1 mg 내지 약 1,000 mg, 또는 약 5 mg 내지 약 200 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1회 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로, 본 발명의 범위는 이에 한정되지 않는다.
바람직하게, 본 발명의 화합물 또는 조성물은 화학요법, 방사선 요법, 면역요법, 호르몬 치료, 골수 이식, 줄기세포 대체치료, 다른 생물학적 치료, 수술적 개입 또는 이들의 조합과 병용하여 종양 요법을 위해 투여될 수 있다. 예컨대, 본 발명의 화합물 또는 조성물은 장기적으로 진행되는 다른 치료 전략과 함께 보조 요법으로 사용되거나, 중증 환자에서 종양 퇴행 또는 화학 예방 요법 후 환자의 상태를 유지하기 위해 사용될 수 있다.
약학적 조성물의 병용 투여
본 발명의 약학적 조성물은 1종 이상의 유효성분을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 추가의 유효성분은 항-증식 화합물 예컨대, 아로마타제 저해제, 항-에스트로겐, 토포이소머라제 I 저해제, 토포이소머라제 II 저해제, 미세소관 활성 화합물, 알킬화 화합물, 히스톤 데아세틸라제 저해제, 세포 분화 과정을 유도하는 화합물, 시클로옥시게나제 저해제, MMP 저해제, mTOR 저해제, 항-신생물 항-대사물질, 백금계 화합물, 단백질 또는 지질 키나제 활성을 표적화/감소시키는 화합물, 항-혈관신생 화합물, 단백질 또는 지질 포스파타제의 활성을 표적화하거나 감소시키거나 저해하는 화합물, 고나도렐린 효능제, 항-안드로겐, 메티오닌 아미노펩티다제 저해제, 비스포스포네이트, 생물학적 반응 개질제, 항-증식성 항체, 헤파라나제 저해제, Ras 종양원성 이소형의 저해제, 텔로머라제 저해제, 프로테아솜 저해제, 혈액계 악성종양의 치료에 사용되는 화합물, Flt-3의 활성을 표적화하거나 감소시키거나 저해하는 화합물, Hsp90 저해제, 키네신 스핀들 단백질 저해제, MEK 저해제, 류코보린, EDG 결합제, 항-백혈병 화합물, 리보뉴클레오티드 리덕타제 저해제, S-아데노실메티오닌 데카르복실라제 저해제, 지혈성 스테로이드, 코르티코스테로이드, 다른 화학요법 화합물, 광감작 화합물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 추가의 유효성분은 공지의 항암제일 수 있다. 상기 항암제의 비제한적인 예는 DNA 알킬화제(DNA alkylating agents)로 메클로에타민(mechloethamine), 클로람부칠(chlorambucil), 페닐알라닌(phenylalanine), 무스타드(mustard), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosfamide), 카르무스틴(carmustine: BCNU), 로무스틴(lomustine: CCNU), 스트렙토조토신(streptozotocin), 부술판(busulfan), 티오테파(thiotepa), 시스플라틴(cisplatin) 및 카보플라틴(carboplatin); 항암 항생제(anti-cancer antibiotics)로 닥티노마이신(dactinomycin: actinomycin D), 독소루비신(doxorubicin: adriamycin), 다우노루비신(daunorubicin), 이다루비신(idarubicin), 미토크산트론(mitoxantrone), 플리카마이신(plicamycin), 마이토마이신 C(mitomycin C) 및 블레오마이신(bleomycin); 및 식물 알카로이드(plant alkaloids)로 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 에토포시드(etoposide), 테니포시드(teniposide), 토포테칸(topotecan) 및 이리도테칸(iridotecan) 등을 포함한다.
본 발명의 다른 측면으로서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 단백질 키나제 억제제를 추가적으로 더 포함하는 암 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
약학적 조성물을 이용한 치료 방법
본 발명의 다른 측면으로서, i) 암 환자가 활성형 RON을 가지고 있는지 확인하는 단계; ii) 활성형 RON을 가지고 있는 환자에게 상술한 화학식 I로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 항암제를 투여하는 단계를 포함하는 단백질 키나제 억제제에 내성인 환자를 치료하는 방법을 제공한다.
이때, 상기 단백질 키나제는 상술한 바와 같으며, 상기 활성형 RON은 RON△155, RON△160, RON△165 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
발명의 실시를 위한 형태
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 더욱 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의하여 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
제조예 1: 4-에톡시-1-(4-플루오로페닐)-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-카르복시산의 제조
단계 1: 에틸 4-에톡시-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-카복실레이트의 제조
Figure pct00003
에틸 시아노아세테이트(70.5 mL, 0.66 mol)에 트리에틸 오쏘아세테이트(249.6 mL, 1.32 mmol), 아세트산(19.6 mL, 0.33 mol)를 넣은 후 120℃에서 12시간 이상 교반하였다. 반응 혼합물의 용매를 농축하고, DMFDEA(N,N-디메틸포름아미드 디에틸아세탈)(141 mL, 0.55 mol)를 첨가하였다. 70℃에서 2시간 이상 교반하였다. 반응 혼합물에 아세트산 500 mL와 증류수 60 mL를 넣고 12시간 이상 환류하였다. 반응 혼합물을 상온으로 냉각시키고, 탄산수소나트륨 포화 수용액과 물을 넣었다. 디클로로메탄과 메탄올 9:1 혼합용매로 추출하였다. 유기층을 무수 황산마그네슘으로 건조하고 여과 및 감압 농축하였다. 에틸아세테이트 100 mL를 넣고 농축하였다. 이때 생성된 고체를 여과하여 화합물 에틸 4-에톡시-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-카복실레이트(37 g, 수율: 26%)를 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.61 (bs, 1H), 7.46 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 6.21 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 4.14(m, 4H), 1.22 (m, 6H)
MS (ESI) m/z 212.12 (M + H)+
단계 2: 에틸 4-에톡시-1-(4-플루오로페닐)-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-카복실레이트의 제조
Figure pct00004
세슘카보네이트(114 g, 0.35 mol)에 N,N-디메틸포름아미드 100 mL를 넣고, 질소기체를 충전하였다. 10분 동안 상온에서 교반시키고, 혼합물에 상기 단계 1에서 얻은 화합물 에틸 4-에톡시-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-카복실레이트(10.2 g, 0.07 mol)를 N,N-디메틸포름아미드 200 mL에 녹여 넣고, 요오드화구리(10 g, 0.05 mol), 4-플루오로-아이오도벤젠 58.3 g(0.26 mol)과 상기에서 얻은 화합물(37g, 0.17 mol)을 첨가하였다. 24시간 동안 110℃에서 교반하였다. 반응 종료 후, 상온으로 냉각한 후 에틸아세테이트를 넣고 10분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트 패드로 여과하고 물과 에틸아세테이트로 추출하였다. 유기 층을 무수 황산 마그네슘으로 건조시켜 여과한 후 감압 하에 용매를 제거하였다.
단계 3: 4-에톡시-1-(4-플루오로페닐)-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-카르복시산의 제조
Figure pct00005
상기 단계 2에서 용매를 완전히 제거한 화합물을 에탄올 200 mL에 용해시키고, 3N 염화수소 수용액 400 mL를 첨가하였다. 60℃에서 24시간 동안 교반하였다. 생성된 고체를 여과하여 4-에톡시-1-(4-플루오로페닐)-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-카르복시산(21 g, 2 스텝 수율: 43%)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.95 (d, J = 76 Hz, 1H), 7.48 (m, 2H), 7.35 (m, 2H), 6.58 (d, J = 8 Hz, 1H), 4.28 (q, J = 68 Hz, 2H), 1.32 (t, J = 68 Hz, 3H)
MS (ESI) m/z 276.09 (M + H)+
제조예 2: 4-에톡시-2-옥소-1-페닐-1,2-디히드로피리딘-3-카르복시산의 제조
상기 제조예 1과 동일한 방법으로 제조하되, 제조예 1의 단계 2에서 4-플루오로-아이오도벤젠 대신 아이오도벤젠을 사용하여 하기 화합물을 제조하였다.
Figure pct00006
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.98 (d, J = 8 Hz, 1H), 7.56-7.41 (m, 5H), 6.60 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 4.30(q, J = 7.2 Hz, 2H), 1.34 (t, J = 7.2 Hz, 3H)
MS (ESI) m/z 260.05 (M + H)+
제조예 3: 1-(4-플로오로페닐)-4-메톡시-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-카르복시산의 제조
단계 1: 메틸 4-메톡시-1-(4-플루오로페닐)-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-카복실레이트의 제조
에틸 4-에톡시-1-(4-플루오로페닐)-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-카복실레이트(0.37 g, 1.20 mmol)를 28% NaOMe 용액으로 처리한 후 상온에서 10분간 교반하였다. 감압농축으로 용매를 제거한 후 하기 화합물(0.26 g, 수율: 77%)을 얻었다.
Figure pct00007
단계 2: 4-메톡시-1-(4-플루오로페닐)-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-카르복시산의 제조
메틸 4-메톡시-1-(4-플루오로페닐)-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-카복실레이트(0.33 g, 1.18 mmol)를 에탄올 5 mL로 처리한 후 2.75N 염산 용액 10 mL을 상온에서 적가하였다. 4 시간 동안 60℃에서 교반한 후, 생성된 고체를 여과하여 하기 화합물(0.16 g, 수율: 52%)을 얻었다.
Figure pct00008
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.89 (bs, 1H), 8.02 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.53-7.48 (m, 2H), 7.40-7.34 (m, 2H), 6.63 (d, J = 8 Hz, 1H), 4.02 (s, 3H)
MS (ESI) m/z 264.06 (M + H)+
제조예 4: 4-메톡시-2-옥소-1-페닐-1,2-디히드로피리딘-3-카르복시산의 제조
상기 제조예 3과 동일한 방법으로 제조하되, 제조예 3의 단계 1에서 에틸 4-에톡시-1-(4-플루오로페닐)-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-카복실레이트 대신 제조예 2에서 사용된 에틸 4-에톡시-1-페닐-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-카복실레이트을 사용하여 하기 화합물을 제조하였다.
Figure pct00009
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.96 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.55-7.45 (m, 5H), 6.58 (d, J = 78 Hz, 1H), 3.99 (s, 3H)
MS (ESI) m/z 246.06 (M + H)+
제조예 5: 4-에톡시-1-메틸-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-카르복시산의 제조
제조예 1의 단계 1에서 얻은 화합물(에틸 4-에톡시-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-카복실레이트)(5 g, 23.7 mmol)에 N,N-디메틸포름아미드 30 mL, 세슘카보네이트(15.4 g, 0.05 mol)를 넣고, 10분 동안 상온에서 교반하였다. 아이오도메탄(6.7 g, 47.3 mmol)을 첨가하고 실온에서 5시간 동안 교반하였다. 반응 종결 후, 혼합물을 농축하고, 에틸아세테이트 50 mL를 첨가 후 다시 농축하였다. 농축된 혼합물에 이소프로필 에테르 50 mL를 첨가하고 교반하여 슬러리 형태의 고체를 여과하여 수득하였다. 수득된 고체에 테트라히드로푸란 20 mL, 3N 염화수소 수용액 10 mL를 넣고 80℃에서 5시간 동안 교반하고 농축하였다. 디클로로메탄 180 mL, 메탄올 10 mL를 넣고 유기층을 분리하였다. 분리한 유기층에 무수 황산 마그네슘을 넣고 여과하여 얻어진 여액을 농축하고 생성된 고체를 여과하여 하기 화합물(3g, 수율: 64 %)을 수득하였다.
Figure pct00010
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.04 (d, J = 8 Hz, 1H), 6.56 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 4.24 (q, J = 6.8 Hz, 1H), 1.32 (t, J = 7.2 Hz, 1H)
MS (ESI) m/z 198.17 (M + H)+
제조예 6: 4-에톡시-1-(4-플루오로벤질)-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-카르복시산의 제조
제조예 5와 동일한 방법으로 제조하되, 아이오도메탄, 세슘카보네이트 대신 4-플루오로벤질브로마이드, 수소화나트륨을 사용하여 하기 화합물을 수득하였다.
Figure pct00011
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.50 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.31 (d, J = 5.2 Hz, 2H), 7.29 (d, J = 5.2 Hz, 2H), 6.29 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 5.15 (s, 2H), 4.28 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 1.52 (t, J = 7.2 Hz, 3H)
MS (ESI) m/z 289.98 (M + H)+
제조예 7: 4-에톡시-1-(3-플루오로페닐)-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-카르복실산의 제조
Figure pct00012
상기 제조예 1의 합성 경로에 따라 제조하되, 단계 2에서 4-플루오로-아이오도벤젠 대신 4-플루오로-아이오도벤젠을 사용하여 표제 화합물(192 mg, 수율: 73%, 하얀색 고체)을 얻었다.
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 13.70 (brs, 1H), 7.99 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 7.60-7.56 (m, 1H), 7.43 (dt, J = 10.0 및 5.0 Hz, 1H), 7.36 (td, J = 10.0 및 5.0 Hz, 1H), 7.30 (dd, J = 10.0 및 5.0 Hz, 1H), 6.61 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 4.30 (qt, J = 5.0 Hz, 2H), 1.34 (t, J = 5.0 Hz, 3H)
제조예 8: 4-메틸-2-옥소-1-(4-플루오로페닐)-1,2-디히드로피리딘-3-카르복실산의 제조
단계 1: 에틸 2-(4-플루오로아닐리노카르보닐)-3-메틸-2-부틸레이트의 합성
Figure pct00013
4-플루오로아닐린(0.20 mL, 2.05 mmol), 디에틸 이소프로필리덴말로네이트(1.60 mL, 8.20 mmol), 이미다졸(139 mg, 2.05 mmol) 혼합물을 200℃에서 5시간 동안 교반하였다. 상온으로 냉각시키고 감압 농축하여 얻은 잔여물을 관크로마토그래피로 정제하여 표제 화합물(151 mg, 수율: 28%, 노란색 오일)을 얻었다.
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 10.25 (s, 1H), 7.65-7.62 (m, 2H), 7.17-7.13 (m, 2H), 4.12 (qt, J = 5.0 Hz, 2H), 2.16 (s, 3H), 1.88 (s, 3H), 1.16 (t, J = 5.0 Hz, 3H)
단계 2: 에틸 4-메틸-2-옥소-1-(4-플루오로페닐)-1,2-디히드로피리딘-3-카르복실레이트의 합성
Figure pct00014
상기 단계 1에서 제조한 화합물(96 mg, 0.36 mmol)과 1,1-디메톡시-N,N-디메틸메탄아민(72 μL, 0.54 mmol) 혼합물을 100℃에서 1시간 동안 교반하였다. 상온으로 냉각시키고 감압 농축하여 얻은 잔여물을 관크로마토그래피로 정제하여 표제 화합물(34 mg, 수율: 34%, 갈색 고체)을 얻었다.
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.36-7.33 (m, 2H), 7.27-7.26 (m, 1H), 7.17-7.13 (m, 2H), 6.13 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 4.39 (qt, J = 5.0 Hz, 2H), 2.28 (s, 3H), 1.37 (t, J = 5.0 Hz, 3H)
단계 3: 4-메틸-2-옥소-1-(4-플루오로페닐)-1,2-디히드로피리딘-3-카르복실산의 합성
Figure pct00015
상기 단계 2에서 제조한 화합물(34 mg, 0.12 mmol)을 출발물질로 하여 상기 제조예 1의 단계 3과 동일한 방법으로 반응시켜 표제 화합물(29 mg, 수율: 100%, 노란색 고체)을 얻었다.
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 7.90 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 7.56-7.52 (m, 2H), 7.42-7.37 (m, 2H), 6.56 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 2.52 (s, 3H)
실시예 1: 4-에톡시-N-(3-플루오로-4-(2-(1-메틸-1H-이미다졸-4-일)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일옥시)페닐)-1-(4-플루오로페닐)-2-옥소-1,2-디하이드로피리딘-3-카르복스아미드의 제조
단계 1: 7-클로로싸이에노[3,2-b]피리딘의 제조
Figure pct00016
염화포스포릴 25 mL를 60℃로 가열하고, 싸이에노[3,2-b]피리딘-7-올(15 g, 99.2 mmol)을 첨가하였다. 동일한 온도에서 1시간 동안 교반한 후, 상온으로 냉각하였다. 반응 혼합물을 감압 농축하고, 얼음물 100 mL를 첨가하여 모두 용해시켰다. 암모니아수를 첨가하여 염기화하고 생성된 고체를 여과하였다. 여과된 고체를 에틸아세테이트에 용해시켜 여과하였다. 여액을 무수 황산마그네슘으로 건조하고 감압 농축하여 흰색 고체인 7-클로로싸이에노[3,2-b]피리딘(15 g, 89%)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.66 (d, J = 4.8 Hz, 1H), 8.26 (d, J = 56 Hz, 1H), 7.67 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 7.58 (d, J = 4.8 Hz, 1H)
MS (ESI) m/z 169.92 (M + H)+
단계 2: 7-클로로-2-(1-메틸-1H-이미다졸-4-일)싸이에노[3,2-b]피리딘의 제조
Figure pct00017
테트라히드로퓨란 500 mL에 7-클로로싸이에노[3,2-b]피리딘(50 g, 294.8 mmol)을 용해시킨 후, -78℃로 냉각하였다. 동일한 온도에서 노르말 부틸리튬(25M 헥산 용액)(118 mL, 294.8 mmol)을 서서히 첨가하여 10분간 교반하였다. 염화아연(1M 디에틸에테르용액)(295 mL, 294.8 mmol)을 서서히 첨가하여 10분간 교반하였다. 상온으로 서서히 승온하여 1시간 동안 교반한 후, 테트라키스트리페닐포스핀팔라듐(28 g, 29.5 mmol)과 4-아이오도-1-메틸-1H-이미다졸(51 g, 245.6 mmol)을 첨가하여 4시간 동안 환류 교반하였다. 반응 혼합물을 상온으로 냉각하고 감압 농축하였다. 에틸아세테이트 500 mL와 물 20 mL를 투입하여 교반하고, 셀라이트 패드를 통과하여 여과하였다. 여과한 여액을 감압 농축하고 디클로로메탄을 첨가한 후 1N 염화수소 수용액으로 산성화하여 생성된 고체를 여과하였다. 여과된 고체를 암모니아수와 물로 세척하여 미백색의 고체 7-클로로-2-(1-메틸-1H-이미다졸-4-일)싸이에노[3,2-b]피리딘(29 g, 수율: 39%)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.55 (d, J = 4.8 Hz, 1H), 7.90 (S, 1H), 7.75 (s, 1H), 7.74 (s, 1H), 7.45(d, J = 4.8 Hz, 1H), 3.73 (s, 3H)
MS (ESI) m/z 249.98 (M + H)+, 252.02 (M + Na)+
단계 3: 7-(2-플루오로-4-니트로페녹시)-2-(1-메틸-1H-이미다졸-4-일)싸이에노[3,2-b]피리딘의 제조
Figure pct00018
디페닐에테르 200 mL와 7-클로로-2-(1-메틸-1H-이미다졸-4-일)싸이에노[3,2-b]피리딘(29 g, 116.1 mmol) 혼합물에 무수탄산칼륨 64 g(464.5 mmol)과 2-플루오로-4-니트로페놀(36 g, 232.2 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 200℃로 가열하여 3시간 동안 교반하였다. 상온으로 냉각시킨 후, 물을 투입하여 교반하고 생성된 고체를 여과하여 7-(2-플루오로-4-니트로페녹시)-2-(1-메틸-1H-이미다졸-4-일)싸이에노[3,2-b]피리딘(16.6 g, 수율: 39%)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.53 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 8.46 (dd, J = 10.4 및 2.8 Hz, 1H), 8.21-8.18 (m, 1H), 7.88 (d, J = 1.2 Hz, 1H), 7.73 (s, 1H), 7.72 (d, J = 12 Hz, 1H), 7.68 (t, J = 8.4 Hz, 1H), 6.87 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 3.73 (s, 3H)
MS (ESI) m/z 370.91 (M + H)+
단계 4: 3-플루오로-4-((2-(1-메틸-1H-이미다졸-4-일)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일)옥시)아닐린의 제조
Figure pct00019
에탄올 400 mL와 물 200 mL 혼합액에 7-(2-플루오로-4-니트로페녹시)-2-(1-메틸-1H-이미다졸-4-일)싸이에노[3,2-b]피리딘(16.2 g, 43.7 mmol)과 철(7 g, 131.2 mmol), 염화암모늄(23.4 g, 437.4 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 100℃로 승온하여 1시간 동안 교반하였다. 상온으로 냉각시킨 후, 셀라이트 패드를 통과하여 여과하고 감압 농축하였다. 물을 첨가하고 교반한 후, 여과하여 3-플루오로-4-((2-(1-메틸-1H-이미다졸-4-일)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일)옥시)아닐린 8.3 g(56%)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.40 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 7.84 (S, 1H), 7.71 (s, 1H), 7.64 (s, 1H), 7.10 (t, J = 88 Hz, 1H), 6.55-6.43 (m, 3H), 5.52 (s, 2H), 3.72 (s, 3H)
MS (ESI) m/z 34111 (M + H)+
단계 5: 4-에톡시-N-(3-플루오로-4-(2-(1-메틸-1H-이미다졸-4-일)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일옥시)페닐)-1-(4-플루오로페닐)-2-옥소-1,2-디하이드로피리딘-3-카르복스아미드의 제조
Figure pct00020
디클로로메탄 100 mL와 4-에톡시-1-(4-플루오로페닐)-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-카르복시산(10 g, 36.6 mmol)의 혼합물에 염화티오닐(116 g, 97.5 mmol)을 첨가하였다. 상온에서 2시간 동안 교반한 후, 감압 농축하여 4-에톡시-1-(4-플루오로페닐)-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-카르보닐 클로라이드를 합성하였다. 3-플루오로-4-((2-(1-메틸-1H-이미다졸-4-일)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일)옥시)아닐린(8.3 g, 24.4 mmol)을 디클로로메탄 100 mL에 용해시킨 후, 트리에틸아민(4.93 g, 48.8 mmol)을 첨가하여 상온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물에 감압 농축한 4-에톡시-1-(4-플루오로페닐)-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-카르보닐 클로라이드를 첨가하여 2시간 동안 교반하였다. 생성된 고체를 여과하고 물로 세척하여 미백색 고체인 4-에톡시-N-(3-플루오로-4-(2-(1-메틸-1H-이미다졸-4-일)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일옥시)페닐)-1-(4-플루오로페닐)-2-옥소-1,2-디하이드로피리딘-3-카르복스아미드(10.4 g, 수율: 71%)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.61 (s, 1H), 8.42 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 7.92 (dd, J = 2.0 및 13.6 Hz, 1H), 7.86 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.86 (s, 1H), 7.72 (s, 1H), 7.68 (s, 1H), 7.50-7.43 (m, 4H), 7.37 (t, J= 8.8 Hz, 1H), 6.59 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 6.52 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 4.26 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.73 (s, 1H), 1.31 (t, J = 7.2 Hz, 3H)
MS (ESI) m/z 600.16 (M + H)+
실시예 2: 4-에톡시-N-(3-플루오로-4-(2-(1-메틸-1H-이미다졸-4-일)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일옥시)페닐)-1-메틸-2-옥소-1,2-디하이드로피리딘-3-카르복스아미드의 제조
실시예 1과 유사한 방법으로 하기 화합물을 제조하였다.
Figure pct00021
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.58 (s, 1H), 8.43 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 7.94 (d, J = 13.2 Hz, 1H), 7.87 (t, J = 4.0 Hz, 2H), 7.73 (s, 1H), 7.69 (s, 1H), 7.46 (m, 2H), 6.60 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 6.39 (d, J =8.0 Hz, 1H), 4.19 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.74 (s, 3H), 3.44 (s, 3H), 1.28 (t, J = 7.2 Hz, 3H)
MS (ESI) m/z 520.15 (M + H)+
실시예 3: 4-에톡시-N-(3-플루오로-4-(2-(1-메틸-1H-이미다졸-2-일)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일옥시)페닐)-1-(4-플루오로페닐)-2-옥소-1,2-디하이드로피리딘-3-카르복스아미드의 제조
실시예 1과 유사한 방법으로 하기 화합물을 제조하였다.
Figure pct00022
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 11.65 (s, 1H), 8.47 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 7.97 (dd, J = 12.8 Hz, 2.4 Hz, 1H), 7.72-7.68 (m, 3H), 7.54-7.50 (m, 3H), 7.38-7.35 (m, 2H), 7.34-7.31 (m, 1H), 7.24-7.12 (m, 3H), 7.03 (d, J = 0.8 Hz, 1H), 6.53 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 6.37 (d, J = 8 Hz, 1H), 4.37 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.96 (s, 3H), 1.63 (t, J = 7.2 Hz, 3H)
MS (ESI) m/z 599.99 (M + H)+
실시예 4: 4-에톡시-N-(3-플루오로-4-(2-(1-메틸-1H-피라졸-4-일)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일옥시)페닐)-1-(4-플루오로페닐)-2-옥소-1,2-디하이드로피리딘-3-카르복스아미드의 제조
실시예 1과 유사한 방법으로 하기 화합물을 제조하였다.
Figure pct00023
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.60 (s, 1H), 8.44 (d, 1H, J = 5.6 Hz, 1H), 8.31 (s, 1H), 7.80 (s, 1H), 7.93 (dd, J = 2.8 Hz, J = 12.8 Hz, 1H), 7.86 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.69 (s, 1H), 7.47 (m, 5H), 7.37 (t, J = 8.8 Hz, 1H), 6.60 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 6.52 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.27 (q, J : 7.2 Hz, 2H), 3.90 (s, 3H), 1.31(t, J = 7.2 Hz, 3H)
MS (ESI) m/z 600.10 (M + H)+
실시예 5: 4-에톡시-N-(3-플루오로-4-(2-(피리딘-2-일)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일옥시)페닐)-1-(4-플루오로페닐)-2-옥소-1,2-디하이드로피리딘-3-카르복스아미드의 제조
실시예 1과 유사한 방법으로 하기 화합물을 제조하였다.
Figure pct00024
1H NMR (400 MHz, MeOH-d4) δ 8.61 (dd, J = 4.8 Hz, 0.4 Hz, 1H), 8.47 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 8.1 (s, 1H), 8.08 (s, 1H), 7.95-7.91 (m, 2H), 7.77 (d, J = 8 Hz, 1H), 7.46-7.37 (m, 5H), 7.27 (t, J = 8.4 Hz, 2H), 6.65 (dd, J = 0.8, 5.6 Hz, 1H), 6.58 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 4.32 (q, J = 6.8 Hz, 2H), 1.46 (t, J = 7.2 Hz, 3H)
MS (ESI) m/z 597.16 (M + H)+
실시예 6: 4-에톡시-N-(3-플루오로-4-(2-(피리딘-3-일)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일옥시)페닐)-1-(4-플루오로페닐)-2-옥소-1,2-디하이드로피리딘-3-카르복스아미드의 제조
실시예 1과 유사한 방법으로 하기 화합물을 제조하였다.
Figure pct00025
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 11.68 (s, 1H), 9.02 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 8.63 (dd, J = 4.8 Hz, 1.2 Hz, 1H), 8.49 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 8.02 (dt, J = 8, 1.6 Hz, 1H), 7.96 (dd, J = 12.4 Hz, 2.4 Hz, 1H), 7.80 (s, 1H), 7.51 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.41-7.31 (m, 4H), 7.25-7.15 (m, 3H), 6.53 (dd, J = 5.2 Hz, 0.8 Hz 1H), 6.36 (d, J = 8 Hz, 1H), 4.36 (q, J = 6.8 Hz, 2H), 1.58 (t, J = 7.2 Hz, 3H)
MS (ESI) m/z 597.13 (M + H)+
실시예 7: 4-에톡시-N-(3-플루오로-4-(2-(싸이아졸-2-일)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일옥시)페닐)-1-(4-플루오로페닐)-2-옥소-1,2-디하이드로피리딘-3-카르복스아미드의 제조
실시예 1과 유사한 방법으로 하기 화합물을 제조하였다.
Figure pct00026
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 11.65 (s, 1H), 8.49 (d, 1H, J = 5.6 Hz, 1H), 7.96 (dd, J = 2.8 Hz, J = 12.8 Hz, 1H), 7.93 (s, 1H), 7.88 (d, J = 3.6 Hz, 1H), 7.51 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.42 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 7.22-7.38 (m, 6H), 7.18 (t, J = 8.8 Hz, 1H), 6.54 (dd, J = 1.2 Hz, J = 5.6 Hz, 1H), 6.37 (d, J = 8.0Hz, 1H), 4.37 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 1.59 (t, J = 7.2 Hz, 3H)
MS (ESI) m/z 603.15 (M + H)+
실시예 8: 4-에톡시-N-(4-(2-(1-에틸-1H-이미다졸-4-일)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일옥시)-3-플루오로페닐)-1-(4-플루오로벤질)-2-옥소-1,2-디하이드로피리딘-3-카르복스아미드의 제조
실시예 1과 유사한 방법으로 하기 화합물을 제조하였다.
Figure pct00027
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 11.76 (s, 1H), 8.43 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 7.95 (dd, J = 12.8 및 2.0 Hz, 1H), 7.66 (s, 1H), 7.55 (s, 1H), 7.44 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.28-7.37 (m, 4H), 7.19 (t, J = 8.8 Hz, 1H), 7.00 (t, J = 8.8 Hz, 1H), 6.47 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 6.24 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 5.15 (s, 1H), 4.27 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 4.05 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 1.53 (t, J = 7.2 Hz, 3H)
MS (ESI) m/z 628.24 (M + H)+
실시예 9: 4-메톡시-N-(3-플루오로-4-(2-(1-(메톡시메틸)-1H-이미다졸-4-일)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일옥시)페닐)-1-페닐-2-옥소-1,2-디하이드로피리딘-3-카르복스아미드의 제조
실시예 1과 유사한 방법으로 하기 화합물을 제조하였다.
Figure pct00028
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.66 (s, 1H), 8.44 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 8.04 (s, 1H), 7.95-7.89 (m, 3H), 7.77 (s, 1H), 7.56-7.40 (m, 7H), 6.61 (d, J = 56 Hz, 1H), 6.53 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 5.37 (s, 2H), 3.94 (s, 1H), 3.27 (s, 3H)
MS (ESI) m/z 568.12 (M + H)+
실시예 10: 4-에톡시-N-(3-플루오로-4-(2-(피페라진-1-일메틸)싸이에노[3,2-b]피리딘- 7-일옥시)페닐)-1-(4-플루오로페닐)-2-옥소-1,2-디하이드로피리딘-3-카르복스아미드 하이드로클로라이드의 제조
단계 1: 7-클로로싸이에노[3,2-b]피리딘-2-카르발데히드의 제조
Figure pct00029
테트라히드로푸란 20 mL에 7-클로로싸이에노[3,2-b]피리딘(1 g, 5.89 mmol)을 용해시킨 후, -70℃로 냉각하였다. 노르말 부틸리튬(25M 헥산용액)(3.06 mL, 7.66 mmol)을 첨가한 다음, 1시간 동안 교반하였다. 동일한 온도에서 무수 N,N-디메틸포름아미드(0.68 mL, 8.84 mmol)를 첨가한 다음, 1시간 동안 교반하였다. 상온으로 냉각시킨 후 물 40 mL를 넣고 에틸아세테이트 40 mL로 추출 후, 무수 황산마그네슘으로 건조하고 여과 및 감압 농축하여 7-클로로싸이에노[3,2-b]피리딘-2-카르발데히드(1.17 g, 수율: 98%)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.24(s, 1H), 8.82(d, J = 4.8 Hz, 1H), 8.64(s, 1H), 7.81(d, J = 4.8 Hz, 1H)
MS (ESI) m/z 197.99 (M + H)+
단계 2: 7-(2-플루오로-4-니트로페녹시)싸이에노[3,2-b]피리딘-2-카르발데히드의 제조
Figure pct00030
디페닐 에테르 20 mL에 단계 1에서 얻은 화합물(1.17 g, 5.91 mmol)과 2-플루오로-4-니트로페놀(1.39 g, 8.87 mmol) 및 탄산칼륨(2.45 g, 17.73 mmol)을 넣고 170℃로 가열하여 29시간 동안 환류하였다. 반응 종결 후 상온으로 냉각시켰다. 물 40 mL를 넣고 에틸아세테이트 40 mL로 추출하였다. 무수 황산마그네슘으로 건조하고 여과 및 감압 농축 후 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 7-(2-플루오로-4-니트로페녹시)싸이에노[3,2-b]피리딘-2-카르발데히드(1.05 g, 수율: 54%)를 분리 정제하였다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.26 (s, 1H), 8.75 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 8.63 (s, 1H), 8.49 (dd, J = 10.4 Hz, 2.8 Hz, 1H), 8.24 (m, 1H), 7.79 (t, J = 8 Hz, 1H), 7.11 (dd, J = 52 Hz, 0.4 Hz, 1H)
MS (ESI) m/z 351.08 (M + H)+
단계 3: 터트-부틸 4-((7-(2-플루오로-4-니트로페녹시)싸이에노[3,2-b]피리딘-2-일)메틸)피페라진-1-카르복실레이트의 제조
Figure pct00031
단계 2에서 얻은 화합물(100 mg, 0.31 mmol)을 무수 디클로로메탄 1 mL에 녹이고, 터트-부틸 피페라진-1-카르복실레이트(64.3 mg, 0.34 mmol)를 첨가하였다. 상온에서 1시간 교반하였다. 트리아세톡시수소화붕소나트륨(95.8 mg, 0.45 mmol)을 첨가하고, 상온에서 2시간 동안 교반하였다. 탄산수소나트륨 포화 수용액 2 mL를 넣고, 디클로로메탄 1 mL로 추출하였다. 무수 황산 마그네슘으로 건조하고 여과 및 감압 농축하여 터트-부틸 4-((7-(2-플루오로-4-니트로페녹시)싸이에노[3,2-b]피리딘-2-일)메틸)피페라진-1-카르복실레이트(148.5 mg, 수율: 97%)를 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.54 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 8.46 (dd, J = 10.4 Hz, 24 Hz, 1H), 8.20 (m, 1H) 7.68 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 7.52 (s, 1H), 6.88 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 3.33 (t, J = 4.8 Hz, 4H), 2.44 (t, J= 4.8 Hz, 4H), 1.39 (s, 9H)
MS (ESI) m/z 489.27 (M + H)+
단계 4: 터트-부틸 4-((7-(4-아미노-2-플루오로페녹시)싸이에노[3,2-b]피리딘-2-일)메틸)피페라진-1-카르복실레이트의 제조
Figure pct00032
단계 3에서 얻은 화합물(140 mg, 0.28 mmol)을 에탄올:물(2:1) 10 mL에 용해시킨 후 철(48 mg, 0.86 mmol)과 염화암모늄(152 mg, 2.85 mmol)을 첨가하였다. 110℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 종료 후, 상온으로 냉각한 후 에틸아세테이트를 넣고 10분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 에틸아세테이트로 세척하며 셀라이트에 통과시켜 나온 용액에 증류수를 넣고 에틸아세테이트로 추출하였다. 유기 층을 무수 황산 마그네슘으로 건조시켜 여과한 후 감압 하에 용매를 제거하여 터트-부틸 4-((7-(4-아미노-2-플루오로페녹시)싸이에노[3,2-b]피리딘-2-일)메틸)피페라진-1-카르복실레이트(120 mg, 수율: 93%)를 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.42 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 7.43 (s, 1H), 7.08 (t, J = 9.2 Hz, 1H), 6.54-6.49 (m, 2H), 6.44 (dd, J = 8.8 Hz, 2.4 Hz, 1H), 5.51 (bs, 2H), 3.86 (s, 1H), 3.33 (m, 4H), 2.43 (m, 4H), 1.39 (s, 9H)
MS (ESI) m/z 459.31 (M + H)+
단계 5: 터트-부틸 4-((7-(4-(4-에톡시-1-(4-플루오로페닐)-2-옥소-1,2-디하이드로피리딘-3-카르복스아미도)-2-플루오로페녹시)싸이에노[3,2-b]피리딘-2-일)메틸)피페라진-1-카르복실레이트의 제조
Figure pct00033
4-에톡시-1-(4-플루오로페닐)-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-카르복시산(90.6 mg, 0.32 mmol)을 디클로로메탄 4 mL에 용해시킨 후 염화 티오닐(47.5 uL, 0.65 mmol)을 서서히 첨가하고, 상온에서 1시간 교반하였다. 감압 하에 용매를 제거하고, 진공 하에서 건조시켜 4-에톡시-1-(4-플루오로페닐)-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-카보닐 클로라이드를 합성하였다.
단계 4에서 얻은 화합물(100 mg, 0.21 mmol)을 디클로로메탄 2 mL에 용해시켰다. 트리에틸아민(45.6 uL, 0.32 mmol)을 첨가하였다. 상온에서 30분간 교반하였다. 감압 하에 용매를 제거한 산염화물을 다시 디클로로메탄 2 mL에 녹이고 반응물에 첨가하였다. 상온에서 1시간 교반하였다. 물과 탄산수소나트륨 포화 수용액을 넣고 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기층을 무수 황산마그네슘으로 건조하고 여과 및 감압 농축 후 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 터트-부틸 4-((7-(4-(4-에톡시-1-(4-플루오로페닐)-2-옥소-1,2-디하이드로피리딘-3-카르복스아미도)-2-플루오로페녹시)싸이에노[3,2-b]피리딘-2-일)메틸)피페라진-1-카르복실레이트(150 mg, 수율: 99%)를 분리 정제하였다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.59 (s, 1H), 8.44 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 7.92 (dd, J = 12.8 Hz, 2 Hz, 1H), 7.86 (d, J = 8 Hz, 1H), 7.49-7.41 (m, 5H), 7.39-7.34 (m, 2H), 6.60 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 6.51 (d, J =7.6 Hz, 1H), 4.26 (q, J = 6.8 Hz, 2H), 3.87 (s, 1H), 3.35 (bs, 4H), 2.45 (bs, 1H), 1.39 (s, 9H), 1.30 (t, J = 1.4 Hz, 3H)
MS (ESI) m/z 718.44 (M + H)+
단계 6: 4-에톡시-N-(3-플루오로-4-(2-(피페라진-1-일메틸)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일옥시)페닐)-1-(4-플루오로페닐)-2-옥소-1,2-디하이드로피리딘-3-카르복스아미드 하이드로클로라이드의 제조
Figure pct00034
단계 5에서 얻은 화합물(126 mg, 0.17 mmol)을 디클로로메탄에 용해시킨 후, 4N 염화수소 수용액 다이옥세인을 첨가하였다. 상온에서 12시간 동안 교반하였다. 감압 농축 후, 디에틸에테르를 첨가하고 고체를 여과하여 4-에톡시-N-(3-플루오로-4-((2-(피페라진-1-일메틸)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일)옥시)페닐)-1-(4-플루오로페닐)-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-카르복스아미드 히드로클로라이드(123 mg, 수율: 95%)를 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.66 (s, 1H), 8.63 (d, J = 6 Hz, 1H), 8.05 (m, 2H), 7.87 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.55-7.44 (m, 5H), 7.40-7.34 (m, 2H), 6.90 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 6.53 (d, J = 8 Hz, 1H), 4.26 (q, J = 6.8 Hz, 2H), 3.23 (bs, 4H), 2.97 (bs, 4H), 1.30 (t, J = 7.2 Hz, 3H)
MS (ESI) m/z 652.02 (M + HCl)-
실시예 11: 4-에톡시-N-(3-플루오로-4-(2-((4-메틸피페라진-1-일)메틸)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일옥시)페닐)-1-(4-플루오로페닐)-2-옥소-1,2-디하이드로피리딘-3-카르복스아미드의 제조
실시예 10과 유사한 방법으로 하기 화합물을 제조하였다.
Figure pct00035
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 11.65 (s, 1H), 8.45 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 7.96 (dd, J = 12.4 및 2.0 Hz, 1H), 8.45 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.40-7.24 (m, 6H), 7.15 (t, J = 8.8 Hz, 1H), 6.49 (d, J = 4.8 Hz, 1H), 6.39 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 4.39 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.90 (s, 1H), 2.87-2.52 (m, 8H), 1.61 (t, J = 72 Hz, 3H), 1.27 (s, 3H)
MS (ESI) m/z 632.25 (M + H)+
실시예 12: 4-에톡시-N-(3-플루오로-4-{[2-(5-{[(2-메톡시에틸)아미노]메틸}피리딘-2-일)티에노[3,2-b] 피리딘-7-일]옥시}페닐)-2-옥소-1-페닐-1,2-디히드로피리딘-3-카르복스아미드 염산염의 제조
단계 1: N-{(6-브로모피리딘-3-일)메틸}-2-메톡시에탄아민의 합성
Figure pct00036
6-브로모피리딘-3-카르복스알데히드(5 g, 26.88 mmol)를 1, 2-디클로로에탄에 용해시킨 후 2-메톡시에틸아민(3.5 mL, 40.32 mmol)과 아세트산(1.6 mL, 28.76 mmol)을 차례로 넣고 20분 동안 교반하였다. 이후, 트리아세톡시수소화붕소나트륨(8.5 g, 40.32 mmol)을 넣어주고 상온에서 2시간 동안 교반하였다. 1N 염산 수용액으로 반응을 종결하고 2N 수산화나트륨 수용액으로 pH를 9로 맞춘 후 디클로로메탄으로 추출하였다. 분리한 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조하고, 여과 및 감압 농축하여 얻은 잔여물을 관크로마토그래피로 정제하여 표제 화합물(4.05 g, 수율: 70%, 연붉은 오일)을 얻었다.
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.31 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 7.70 (dd, J = 10.0 및 5.0 Hz, 1H), 7.58 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 3.69 (s, 2H), 3.37 (t, J = 5.0 Hz, 1H), 3.22 (s, 3H), 2.60 (d, J = 5.0 Hz, 2H)
단계 2: t-부틸 [(6-브로모피리딘-3-일)메틸](2-메톡시에틸)카바메이트의 합성
Figure pct00037
상기 단계 1에서 제조한 화합물(4.05 g, 16.52 mmol)을 테트라히드로퓨란에 용해시킨 후 디-t-부틸 디카르보네이트(3.9 mL, 17.02 mmol)를 넣어 주고 상온에서 30분 동안 교반하였다. 에틸아세테이트로 추출하고, 분리된 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조한 다음 여과 및 감압 농축하여 얻은 잔여물을 관크로마토그래피로 정제하여 표제 화합물(5.52 g, 수율: 97%, 무색 오일)을 얻었다.
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.27 (s, 1H), 7.64-7.59 (m, 2H), 4.40 (s, 2H), 3.40 (m, 4H), 3.21 (s, 3H), 1.42-1.31 (m, 9H)
단계 3: t-부틸 {[6-(7-클로로티에노[3,2-b]피리딘-2-일)피리딘-3-일]메틸}(2-메톡시에틸)카바메이트의 합성
Figure pct00038
7-클로로티에노[3,2-b]피리딘(5.4 g, 31.86 mmol)을 테트라히드로퓨란에 용해시킨 후, 2.5M n-부틸리튬 헥산 용액(2.7 mL, 31.86 mmol)을 -78℃에서 천천히 넣어 주고 30분 동안 교반하였다. 1M 염화아연 디에틸에테르 용액(31.9 mL, 31.86 mmol)을 서서히 첨가하고, 10분 후 상온으로 서서히 승온한 다음 1시간 동안 교반하였다. 이후, 테트라키스트리페닐포스핀팔라듐(920 mg, 0.79 mmol)과 단계 2에서 제조한 화합물(5.5 g, 15.93 mmol)을 첨가하고 2시간 동안 환류하였다. 상온으로 냉각하고 감압 농축하여 얻은 잔여물을 아세토니트릴로 여과, 건조하여 표제 화합물(5.2 g, 수율: 75%, 미색 고체)을 얻었다.
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.66 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 8.54 (s, 1H), 8.42 (s, 1H), 8.29 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 7.82 (dd, J = 10.0 및 5.0 Hz, 1H), 7.59 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 4.50 (s, 2H), 3.45-3.36 (m, 4H), 3.23 (s, 3H), 1.45-1.34 (m, 9H)
단계 4: t-부틸 {[6-[7-(2-플루오로-4-니트로페녹시)티에노[3,2-b]피리딘-2-일]피리딘-3-일]메틸}(2-메톡시에틸)카바메이트의 합성
Figure pct00039
상기 단계 3에서 제조한 화합물(2.0 g, 4.61 mmol)을 디페닐 에테르에 용해시킨 후 무수 탄산칼륨(765 mg, 5.53 mmol)과 2-플루오로-4-니트로페놀(1.4 g, 9.22 mmol)을 차례로 첨가하고 160℃에서 5시간 동안 교반하였다. 상온으로 냉각하고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 분리된 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조하고 여과 및 감압 농축하였다. 잔여물을 테트라히드로퓨란에 용해시킨 후 디-t-부틸 디카르보네이트(1.06 mL, 4.61 mmol)를 첨가하고 상온에서 30분 동안 교반하였다. 감압 농축하여 얻은 잔여물을 관크로마토그래피로 정제하여 표제 화합물(1.2 g, 수율: 46%, 미색 고체)을 얻었다.
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.62 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 8.50-8.48 (m, 2H), 8.39 (s, 1H), 8.28 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 8.21 (d, J = 10.0 및 5.0 Hz, 1H), 7.80 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 7.72 (t, J = 10.0 Hz, 1H), 6.98 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 4.48 (s, 2H), 3.43-3.35 (m, 4H), 3.23 (s, 3H), 1.44-1.33 (m, 9H)
단계 5: t-부틸 {[6-[7-(4-아미노-2-플루오로페녹시)티에노[3,2-b]피리딘-2-일]피리딘-3-일]메틸}(2-메톡시에틸)카바메이트의 합성
Figure pct00040
상기 단계 4에서 제조한 화합물(1.2 g, 2.16 mmol)을 에탄올과 물에 녹인 후 철(363 mg, 6.49 mmol)과 염화암모늄(1.16 g, 21.64 mmol)을 상온에서 차례로 첨가하고 100℃로 승온하여 3시간 동안 교반하였다. 반응 종결 후, 따듯한 상태에서 셀라이트 패드를 이용하여 여과하고 감압 농축하여 얻은 잔여물을 디클로로메탄으로 추출하였다. 분리한 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조하고 감압 농축한 후 디에틸에테르로 여과하여 표제 화합물(833 mg, 수율: 73%, 미색 고체)을 얻었다.
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.51-8.49 (m, 2H), 8.30 (s, 1H), 8.24 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 7.78 (dd, J = 10.0 및 5.0 Hz, 1H), 7.13 (t, J = 10.0 Hz, 1H), 6.60 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 6.53 (dd, J = 15.0 및 5.0 Hz, 1H), 6.45 (dd, J = 10.0 및 5.0 Hz, 1H), 5.55 (s, 2H), 4.48 (s, 2H), 3.43-3.33 (m, 4H), 3.23 (s, 3H), 1.44-1.34 (m, 9H)
단계 6: t-부틸 [(6-{7-[4-(4-에톡시-2-옥소-1-페닐-1,2-디히드로피리딘-3-카르복스아미도)-2-플루오로페녹시]티에노[3,2-b]피리딘-2-일}피리딘-3-일)메틸](2-메톡시에틸)카바메이트의 합성
Figure pct00041
상기 제조예 2의 4-에톡시-2-옥소-1-페닐-1,2-디히드로피리딘-3-카르복실산(0.57 g, 2.2 mmol)과 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 염산염(0.42 g, 2.2 mmol), 히드록시벤조트리아졸(0.3 g, 2.2 mmol)을 디클로로메탄에 용해시킨 후 트리에틸아민(0.22 g, 2.2 mmol)과 단계 5에서 제조한 화합물(0.58 g, 1.1 mmol)을 차례로 첨가하고 상온에서 24시간 이상 교반하였다. 포화 중탄산나트륨 수용액으로 반응을 종결하고 디클로로메탄으로 추출한 후, 분리한 유기층을 무수 황산마그네슘으로 건조하고 감압 농축하여 얻은 잔여물을 관크로마토그래피로 정제하여 표제 화합물(0.69 g, 수율: 82%, 미색 고체)을 얻었다.
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 10.64 (brs, 1H), 8.52-8.51 (m, 2H), 8.33 (s, 1H), 7.95 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 7.87 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 7.79 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 7.56-7.40 (m, 8H), 6.71 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 6.52 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 4.48 (s, 2H), 4.27 (qt, J = 7.5 Hz, 2H), 3.43-3.36 (m, 4H), 3.23 (s, 3H), 1.14-1.30 (m, 12H)
단계 7: 4-에톡시-N-(3-플루오로-4-{[2-(5-{[(2-메톡시에틸)아미노]메틸}피리딘-2-일)티에노[3,2-b]피리딘-7-일]옥시}페닐)-2-옥소-1-페닐-1,2-디히드로피리딘-3-카르복스아미드 염산염의 합성
Figure pct00042
상기 단계 6에서 제조한 화합물(0.69 g, 0.9 mmol)에 10 mL의 4M 염산 1,4-디옥산 용액을 넣어 주고 상온에서 1시간 이상 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 농축하고 소량의 에탄올에 용해시킨 후 디에틸에테르를 투입하여 생성된 고체를 여과, 건조하여 표제 화합물(0.61 g, 수율: 96%, 미색 고체)을 얻었다.
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 10.70 (brs, 1H), 9.50 (brs, 2H), 8.80 (s, 1H), 8.69 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 8.47 (s, 1H), 8.44 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 8.22 (dd, J = 10.0 및 5.0 Hz, 1H), 7.99 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 7.88 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 7.57-7.40 (m, 7H), 6.97 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 6.53 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 4.29-4.25 (m, 4H), 3.65 (t, J = 5.0 Hz, 2H), 3.31 (s, 3H), 3.16-3.12 (m, 2H), 1.31 (t, J = 5.0 Hz, 3H)
실시예 13: 4-에톡시-N-(3-플루오로-4-{[2-(5-{[(2-메톡시에틸)아미노]메틸}피리딘-2-일)티에노[3,2-b]피리딘-7-일]옥시}페닐)-1-(4-플루오로페닐)-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-카르복스아미드 염산염의 제조
상기 실시예 12의 합성 경로에 따라 제조하되, 단계 6의 출발물질로서 상기 제조예 1의 4-에톡시-1-(4-플루오로페닐)-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-카르복실산을 이용하여 표제 화합물(수율: 52.8%)을 얻었다.
Figure pct00043
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 10.67 (br s, 1H), 9.32 (br s, 2H), 8.78 (s, 1H), 8.62 (d, J=5.0Hz, 1H), 8.46 (s, 1H), 8.41 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 8.18 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 7.99-7.96 (m, 1H), 7.90-7.88 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 7.53-7.39 (m, 6H), 6.86 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 6.55 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 4.30-4.26 (m, 4H), 3.64 (m, 2H), 3.33 (s, 3H), 3.19-3.14 (m, 2H), 1.32 (t, J = 5.0 Hz, 3H)
실시예 14: N-(3-클로로-4-{[2-(5-{[(2-메톡시에틸)아미노]메틸}피리딘-2-일)티에노[3,2-b]피리딘-7-일]옥시}페닐)-1-(4-플루오로페닐)-4-메톡시-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-카르복스아미드 염산염의 제조
상기 실시예 12의 합성 경로에 따라 제조하되, 단계 6의 출발물질로서 상기 제조예 3의 1-(4-플루오로페닐)-4-메톡시-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-카르복실산을 이용하고, 단계 4에서 2-플루오로-4-니트로페놀 대신 2-클로로-4-니트로페놀을 이용하여 표제 화합물(수율: 88.6%)을 얻었다.
Figure pct00044
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 10.72 (brs, 1H), 9.44 (brs, 2H), 8.79 (s, 1H), 8.65 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 8.45 (s, 1H), 8.42 (d, J : 10.0 Hz, 1H), 8.21-8.17 (m, 2H), 7.92 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 7.70 (dd, J = 10.0 및 5.0 Hz, 1H), 7.54 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 7.49-7.36 (m, 4H), 6.84 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 6.56 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 4.27 (t, J = 5.0 Hz, 2H), 3.94 (s, 3H), 3.65 (t, J = 5.0 Hz, 2H), 3.31 (s, 3H), 3.16-3.12 (m, 2H)
실시예 15: 4-에톡시-N-(3-플루오로-4-{[2-(5-{[(2-메톡시에틸)아미노]메틸}피리딘-2-일)티에노[3,2-b]피리딘-7-일]옥시}페닐)-1-(3-플루오로페닐)-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-카르복스아미드 염산염의 제조
상기 실시예 12의 합성 경로에 따라 제조하되, 단계 6의 출발물질로서 상기 제조예 7의 4-에톡시-1-(3-플루오로페닐)-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-카르복실산을 이용하여 표제 화합물(수율: 73.5%)을 얻었다.
Figure pct00045
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 10.70(s, 1H), 9.47(brs, 2H), 8.79(s, 1H), 8.66(d, J = 5.0 Hz, 1H), 8.46(s, 1H), 8.43(d, J = 10.0 Hz, 1H), 8.21(dd, J = 10.0 Hz 및 5.0 Hz, 1H), 7.98(d, J = 15.0 Hz, 1H), 7.91(d, J = 10.0 Hz, 1H), 7.61-7.53(m, 3H), 7.39-7.33(m, 2H), 7.28(d, J = 10.0 Hz, 1H), 6.93(d, J = 5.0 Hz, 1H), 6.55(d, J = 5.0 Hz, 1H), 4.30-4.26(m, 4H), 3.65(t, J = 5.0 Hz, 2H), 3.31(s, 3H), 3.16-3.12(m, 2H), 1.30(t, J = 5.0 Hz, 3H)
실시예 16: N-(3-플루오로-4-{[2-(5-{[(2-메톡시에틸)아미노]메틸}피리딘-2-일)티에노[3,2-b]피리딘-7-일]옥시}페닐)-1-(4-플루오로페닐)-4-메틸-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-카르복스아미드 염산염의 제조
상기 실시예 12의 합성 경로에 따라 제조하되, 단계 6의 출발물질로서 상기 제조예 8의 4-메틸-2-옥소-1-(4-플루오로페닐)-1,2-디히드로피리딘-3-카르복실산을 이용하여 표제 화합물(수율: 67.4%)을 얻었다.
Figure pct00046
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 10.95 (s, 1H), 9.24 (brs, 2H), 8.75 (s, 1H), 8.58 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 8.44 (s, 1H), 8.39 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 8.14 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 7.98 (d, J = 15.0 Hz, 1H), 7.75 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 7.53-7.49 (m, 4H), 7.41-7.37 (m, 2H), 6.79 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 6.38 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 4.27 (t, J = 5.0 H, 2H), 3.63 (t, J = 5.0 Hz, 2H), 3.32 (s, 3H), 3.17-3.13 (m, 2H), 2.31 (s, 3H)
실시예 17: 4-에톡시-N-(3-플루오로-4-{[2-(5-{[(2-메톡시에틸)(메틸)아미노]메틸}피리딘-2-일)티에노[3,2-b]피리딘-7-일]옥시}페닐)-1-(4-플루오로페닐)-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-카르복스아미드 염산염의 제조
Figure pct00047
실시예 13 화합물을 메탄올 1 mL에 녹인 후 포름알데히드(0.02 mL, 0.28 mmol)를 적가하였다. 1시간 동안 교반한 후 소듐 시아노히드라이드(12 mg, 0.19 mmol)를 첨가하고 12시간 동안 교반하였다. 반응 종결 후 디클로로메탄으로 추출한 후 포화 염화나트륨 수용액으로 씻어주었다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조하고 감압 농축하여 얻은 잔여물을 관크로마토그래피로 정제한 후 0.2 mL의 4M 염산 1,4-디옥산 용액을 사용하여 표제 화합물(17.5 mg, 수율: 50.5%, 미색 고체)을 얻었다.
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 10.67 (s, 1H), 10.51 (brs, 1H), 8.80 (s, 1H), 8.60 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 8.48 (s, 1H), 8.43 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 8.21 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 7.96 (d, J = 15.0 Hz, 1H), 7.88 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 7.52-7.45 (m, 4H), 7.39-7.36 (m, 2H), 6.83 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 6.53 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 4.51-4.36 (m, 2H), 4.27 (q, J = 5.0 Hz, 2H), 3.73 (t, J = 5.0 Hz, 2H), 3.38-3.29 (m, 2H), 3.32 (s, 3H), 2.75 (d, J = 5.0 Hz, 3H)
실시예 18: 4-에톡시-N-[3-플루오로-4-({2-[5-(모르폴리노메틸)피리딘-2-일]티에노[3,2-b]피리딘-7-일}옥시)페닐] -1-(4-플루오로페닐)-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-카르복스아미드 염산염의 제조
단계 1: N-[4-({2-[5-(1,3-디옥솔란-2-일)피리딘-2-일]티에노[3,2-b]피리딘-7-일}옥시)-3-플루오로페닐]-4-에톡시-1-(4-플루오로페닐)-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-카르복스아미드의 합성
Figure pct00048
국제특허공보 WO 2009/026717의 제조방법을 이용해 쉽게 제조할 수 있는 4-({2-[5-(1,3-디옥솔란-2-일)피리딘-2-일]티에노[3,2-b]피리딘-7-일}옥시)-3-플루오로아닐린을 출발물질로 하여 상기 실시예 12의 단계 6과 동일한 방법으로 반응시켜 표제 화합물(135 mg, 수율: 64%, 미색 고체)을 얻었다.
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 10.63 (s, 1H), 8.70 (s, 1H), 8.52 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 8.41 (s, 1H), 8.32 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 7.99 (dd, J = 10.0 및 5.0 Hz, 1H), 7.94 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 7.87 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 7.50-7.45 (m, 4H), 7.39-7.35 (m, 2H), 6.71 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 6.52 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 5.90 (s, 1H), 4.27 (qt, J = 5.0 H, 2H), 4.12-4.07 (m, 2H), 4.04-3.99 (m, 2H), 1.31 (t, J = 5.0 Hz, 3H)
단계 2: 4-에톡시-N-{3-플루오로-4-[2-(5-포밀피리딘-2-일)티에노[3,2-b]피리딘-7-일]옥시페닐}-1-(4-플루오로페닐)-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-카르복스아미드의 합성
Figure pct00049
상기 단계 1에서 제조한 화합물(100 mg, 0.15 mmol)을 아세톤과 물의 혼합 용액에 용해시킨 후 2 mL의 트리플루오로아세트산을 상온에서 적가하고, 60℃에서 12시간 동안 교반하였다. 상온으로 냉각하고 생성된 고체를 감압 여과한 후 물과 디에틸에테르로 씻어주고 건조하여 표제 화합물(82 mg, 수율: 88%, 미색 고체)을 얻었다.
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 10.64 (s, 1H), 10.14 (s, 1H), 9.15 (s, 1H), 8.59-8.58 (m, 2H), 8.52 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 8.39 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 7.95 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 7.87 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 7.51-7.45 (m, 4H), 7.39-7.36 (m, 2H), 6.78 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 6.53 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 4.27 (qt, J = 5.0 H, 2H), 1.31 (t, J = 5.0 Hz, 3H)
단계 3: 4-에톡시-N-[3-플루오로-4-({2-[5-(히드록시메틸)피리딘-2-일]티에노[3,2-b]피리딘-7-일}옥시)페닐]-1-(4-플루오로페닐)-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-카르복스아미드의 합성
Figure pct00050
상기 단계 2에서 제조한 화합물(82 mg, 0.13 mmol)을 1,2-디클로로에탄에 용해시킨 후 트리아세톡시수소화붕소나트륨(83 mg, 0.39 mmol)을 넣어 주고 상온에서 12시간 동안 교반하였다. 포화 중탄산나트륨 수용액으로 반응을 종결하고 디클로로메탄으로 추출한 후 무수 황산나트륨으로 건조하고 감압 농축하여 얻은 잔여물을 관크로마토그래피로 정제하여 표제 화합물(53 mg, 수율: 64%, 흰색 고체)을 얻었다.
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 10.63 (s, 1H), 8.58 (s, 1H), 8.51 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 8.33 (s, 1H), 8.25 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 7.94 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 7.89-7.86 (m, 2H), 7.50-7.45 (m, 4H), 7.39-7.36 (m, 2H), 6.69 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 6.52 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 5.43 (t, J = 5.0 Hz, 1H), 4.59 (d, J = 5.0 Hz, 2H), 4.27 (qt, J = 5.0 H, 2H), 1.31 (t, J = 5.0 Hz, 3H)
단계 4: N-[4-({2-[5-(클로로메틸)피리딘-2-일]티에노[3,2-b]피리딘-7-일}옥시)-3-플루오로페닐]-4-에톡시-1-(4-플루오로페닐)-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-카르복스아미드의 합성
Figure pct00051
상기 단계 3에서 제조한 화합물(296 mg, 0.49 mmol)을 디클로로메탄에 용해시킨 후 티오닐클로라이드(0.07 mL, 0.97 mmol)를 첨가하고 상온에서 3시간 동안 교반하였다. 0℃에서 포화 중탄산나트륨 수용액으로 반응을 종결하고 디클로로메탄으로 추출한 후 무수 황산나트륨으로 건조하고 감압 농축하여 표제 화합물(240 mg, 수율: 78%, 노란색 고체)을 얻었다.
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 10.63 (s, 1H), 8.72 (s, 1H), 8.52 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 8.40 (s, 1H), 8.32 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 8.04 (dd, J = 10.0 및 5.0 Hz, 1H), 7.94 (d, J = 15.0 Hz, 1H), 7.87 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 7.50-7.46 (m, 4H), 7.39-7.36 (m, 2H), 6.71 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 6.53 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 4.88 (s, 2H), 4.27 (qt, J = 5.0 H, 2H), 1.31 (t, J = 5.0 Hz, 3H)
단계 5: 4-에톡시-N-[3-플루오로-4-({2-[5-(모르폴리노메틸)피리딘-2-일]티에노[3,2-b]피리딘-7-일}옥시)페닐]-1-(4-플루오로페닐)-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-카르복스아미드 염산염의 합성
Figure pct00052
상기 단계 4에서 제조한 화합물(40 mg, 0.06 mmol)을 아세토니트릴에 용해시킨 후 모르폴린(0.01 mL, 0.12 mmol)과 탄산칼륨(13 mg, 0.09 mmol)을 첨가하고 80℃에서 5시간 동안 교반하였다. 상온으로 냉각하고 감압 농축한 후 디클로로메탄과 소량의 메탄올로 추출하였다. 분리한 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조하고 감압 농축하여 얻은 잔여물을 관크로마토그래피로 정제한 후 0.2 mL의 4M 염산 1,4-디옥산 용액을 사용하여 표제 화합물(16.6 mg, 수율: 30%, 미색 고체)을 얻었다.
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 10.66 (s, 1H), 8.81 (s, 1H), 8.60 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 8.48 (s, 1H), 8.43 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 8.23 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 7.96 (d, J = 15.0 Hz, 1H), 7.87 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 7.52-7.45 (m, 4H), 7.39-7.36 (m, 2H), 6.83 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 6.53 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 4.44 (s, 2H), 4.26 (qt, J = 5.0 H, 2H), 3.96-3.94 (m, 2H), 3.77 (t, J = 10.0 Hz, 2H), 3.32-3.30 (m, 2H), 3.14 (qt, J = 10.0 2H), 1.31 (t, J = 5.0 Hz, 3H)
실시예 19: 4-에톡시-N-[3-플루오로-4-({2-[5-(모르폴리노메틸)피리딘-2-일]티에노[3,2-b]피리딘-7-일}옥시)페닐]-2-옥소-1-페닐-1,2-디히드로피리딘-3-카르복스아미드 염산염의 제조
상기 실시예 18의 합성 경로에 따라 제조하되, 단계 1에서 상기 제조예 2의 4-에톡시-2-옥소-1-페닐-1,2-디히드로피리딘-3-카르복실산을 출발물질로 이용하여 표제 화합물(수율: 52.3%)을 얻었다.
Figure pct00053
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 10.66 (s, 1H), 8.80 (s, 1H), 8.58 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 8.47 (s, 1H), 8.43 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 8.20 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 7.96 (d, J = 15.0 Hz, 1H), 7.87 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 7.56-7.47 (m, 5H), 7.43-7.40 (m, 2H), 6.80 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 6.52 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 4.44 (s, 2H), 4.26 (qt, J = 5.0 H, 2H), 3.97-3.95 (m, 2H), 3.74 (t, J = 10.0 Hz, 2H), 3.33-3.30 (m, 2H), 3.14 (qt, J = 10.0 2H), 1.31 (t, J = 5.0 Hz, 3H)
실시예 20: 4-에톡시-N-{3-플루오로-4-[(2-{5-[(4-메틸피페라진-1-일)메틸]피리딘-2-일}티에노[3,2-b]피리딘-7-일)옥시]페닐}-1-(4-플루오로페닐)-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-카르복스아미드 염산염의 제조
상기 실시예 18의 합성 경로에 따라 제조하되, 단계 5에서 모르폴린 대신 N-메틸피페라진을 이용하여 표제 화합물(수율: 22.2%)을 얻었다.
Figure pct00054
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 10.67 (s, 1H), 8.81 (brs, 1H), 8.60 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 8.46 (s, 1H), 8.41 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 8.20 (s, 1H), 7.96 (d, J = 15.0 Hz, 1H), 7.87 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 7.52-7.45 (m, 4H), 7.39-7.36 (m, 2H), 6.84 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 6.53 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 4.26 (qt, J = 5.0 H, 2H), 4.07 (brs, 8H), 3.56 (brs, 2H), 2.80 (s, 3H), 1.31 (t, J = 5.0 Hz, 3H)
실시예 21: 4-에톡시-N-{3-플루오로-4-[(2-{5-[(-메틸피페라진-1-일)메틸]피리딘-2-일}티에노[3,2-b]피리딘-7-일)옥시]페닐}-2-옥소-1-페닐-1,2-디히드로피리딘-3-카르복스아미드 염산염의 제조
상기 실시예 19의 합성 경로에 따라 제조하되, 단계 5에서 모르폴린 대신 N-메틸피페라진을 이용하여 표제 화합물(수율: 31.4%)을 얻었다.
Figure pct00055
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 10.68 (s, 1H), 8.82 (brs, 1H), 8.61 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 8.47 (s, 1H), 8.41 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 8.23 (s, 1H), 7.97 (d, J = 15.0 Hz, 1H), 7.87 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 7.56-7.46 (m, 5H), 7.42-7.40 (m, 2H), 6.86 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 6.52 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 4.26 (qt, J = 5.0 H, 2H), 3.93 (brs, 8H), 3.58 (brs, 2H), 2.81 (s, 3H), 1.31 (t, J = 5.0 Hz, 3H)
또한 비교를 위해 아래의 공지 화합물들을 사용하였다.
비교예 1
US 8,536,200 B2의 화합물 1, N-{4-[(2-아미노-3-클로로-4-피리디닐)옥시]-3-플루오로페닐}-4-에톡시-1-(4-플루오로페닐)-2-옥소-1,2-디히드로-3-피리딘카르복스아미드, 상기 비교예 1의 화합물은 RON 저해제로 알려진 BMS-777607.
비교예 2
US 8,088,794 B2의 실시예 73의 화합물, N-(3-플루오로-4-(7-메톡시퀴놀린-4-일옥시)페닐)-1-(2-히드록시-2-메틸프로필)-5-메틸-3-옥소-2-페닐-2,3-디히드로-1H-피라졸-4-카르복스아미드.
비교예 3
US 8,030,302 B2의 실시예 1의 화합물, N-(3-플루오로-4-(1-메틸-6-(1H-피라졸-4-일)-1H-인다졸-5-일옥시)페닐)-1-(4-플루오로페닐)-6-메틸-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-카르복스아미드.
실험예 1. RON 활성 억제 분석: 실시예 1 및 5
2 ng/uL의 RON 효소의 기질로 작용하는 250 uM G4Y1 펩티드, 50 uM ATP를 반응 버퍼(40 mM Tris-HCl(pH 7.5), 20 mM MgCl2, 0.1 mg/mL bovine serum albumin, 50 uM DTT) 내에서 효소 반응을 수행하였다. 상기 실시예에서 제조된 화합물 및 비교예를 다양한 농도로 처리하여 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후, ADP-GloTM Reagent 및 Kinase detection reagent를 순차적으로 추가하고 실온에서 각각 40분 및 30분간 반응시켰다.
이후 Wallaac Victor 2TM(PerkinElmer life sciences, 1420-042)를 이용하여 luminescence를 측정하였다. 측정한 RLU 값으로 데이터를 분석하여 RON 억제제의 활성을 검증하였다. 화합물을 처리하지 않은 시료의 RLU 값을 100% 대조군으로 하고, 시험하고자 하는 농도의 화합물을 처리한 시료에서 RONT 효소의 잔류 활성의 %로서 RON 억제제의 활성을 평가하였다. 대조군 대비 50% RON 효소 활성 억제가 일어나는 화합물의 농도를 RON 억제제의 IC50 값(nM)으로 결정하였다. 그 결과를 아래 표 1에 나타내었다.
Figure pct00056
실험예 2. RON 활성 억제능 분석: 실시예 12 내지 21
상기 티에노피리딘 유도체의 효소 활성 저해 효능(IC50) 분석은 형광공명 에너지 전달(FRET; fluorescence resonance energy transfer) 기술을 이용하여 측정하였다. RON 키나제(Carna Bioscience)를 최종 반응 농도의 2배 농도(0.4 nM)가 되도록 키나제 반응 버퍼(kinase assay buffer, 50 mM HEPES pH 7.5, 1 mM EGTA, 10 mM MgCl2, 2 mM DTT 및 0.01% Tween-20)에 희석하여 384-웰 플레이트에 5 μL씩 첨가하였다.
시료 화합물로는 본 발명의 실시예에서 합성된 화합물 및 비교예의 화합물을 사용하였다. 시료 화합물들을 100% DMSO를 이용하여 1 mM 농도로 제조하여 10배 희석을 통해 단계적으로 8회 희석하였다. 시료 화합물의 최종 반응 농도의 4배 농도로 화합물을 키나제 버퍼에 희석한 후 384-웰 플레이트에 2.5 μL씩 첨가하고 이후 15분간 상온에서 배양하였다.
다음으로 0.25 M 농도로 제조한 ATP 용액(Sigma Aldrich)을 최종 반응 농도의 4배(60 μM)가 되록 키나제 반응 버퍼에 희석했고, 여기에 티로신(tyrosine) 펩티드 기질(Perkin-Elmer)을 최종 반응 농도의 4배 농도(400 nM)가 되도록 희석하여 384-웰 플레이트에 2.5 μL씩 첨가하였다. 이후 상온에서 384-웰 플레이트를 배양하여 60분 동안 반응을 진행시켰다. 60분 이후 EDTA(Sigma Aldrich)를 최종 반응 농도의 4배(40 mM)가 되도록 TR-FRET 검출 버퍼(Perkin-Elmer)에 희석하였다.
희석한 EDTA 용액에 최종 반응 농도의 4배(8 nM)가 되도록 유로퓸을 함유하는 포스포타이로신 항체(Perkin-Elmer)를 희석하여 RON 키나제 반응의 정지액을 제조하였다. 제조한 정지액을 384-웰 플레이트에 10 μL씩 첨가하여 반응을 종료한 후 상온에 60분간 배양하였다. 60분 후 플레이트를 Victor X5 플레이트 리더(Perkin-Elmer사) 상에서 판독하였다. 이때 여기 파장은 340 nm이고, 방출 파장은 620 nm와 665 nm이었다. 시료 화합물의 IC50는 GraphPad PrismTM 5을 이용하여 도출하였으며 665 nm에서의 방출 에너지를 시료 화합물 농도의 함수로 나타내어 IC50을 도출하였다. 그 결과를 표 2에 나타내었다.
Figure pct00057
상기 표 2에 나타난 바와 같이, 실시예의 화합물들은 RON 티로신 키나제 효소에 대하여 매우 우수한 저해 효과를 가지고 있다.
실험예 3. 세포성장 억제 분석: 실시예 1 내지 11
본 발명에 따른 화합물이 세포외 신호조절 키나제 활성 억제를 통하여 암세포 증식 억제 효과를 가지는지 여부를 확인하기 위하여 MTS 분석을 수행하였다.
인간의 위암 세포주인 MKN45 세포주(활성형 RON을 발현하는 세포주)를 대상으로 하기와 같은 분석을 수행하였다. MKN45 세포주는 10% FBS를 포함하는 RPMI-1640 배지(Gibco, Invitrogen)가 들어있는 96-웰 플레이트에 각각 5,000 세포/웰의 농도로 분주한 후, 5% CO2 및 37℃ 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 각 웰에 상기 실시예에서 제조한 화합물들을 각각 10 μM 고농도로 하여 순차희석하여 처리하였고, 용매 대조군으로는 디메틸설폭사이드(DMSO)를 화합물 처리시 사용한 것과 동일한 01 %(v/v)의 농도로 처리하였다. 그 후, 각 세포를 48시간 동안 배양하였다.
세포의 생존 정도를 확인하기 위하여, 상기 각 배양된 세포의 배지에 CellTiter 96 AQuous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay Kit(Promega)에서 제공되는 MTS와 PMS(phenazine methosulfate)의 혼합물을 첨가하고, 37℃ 조건에서 2시간 30분 동안 추가로 배양하였다. 그 후, 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 화합물을 처리하지 않은 용매대조군 세포의 흡광도를 기준으로 각 화합물들의 처리 농도에 따른 세포 증식 저해 정도를 산출하였으며, 이때 암세포의 증식을 50% 억제하는 각 화합물의 농도를 IC50(nM)값으로 결정하였다. 그 결과를 상기 표 3에 나타내었다. 하기에서, A: < 10 nM, B: 10 ~ 50 nM, C: > 50 nM을 나타낸다.
Figure pct00058
실험예 4. 세포사멸 효능 측정: 실시예 12 내지 21
돌연변이(△160)를 가지고 있는 KM12C(80015, KCLB, MEM+10% FBS) 대장암 세포주를 6-웰 플레이트에 5x104 세포/웰로 준비하였다. 24시간 후 배지를 교환하면서, 시료 화합물들을 농도별(1 μM, 5 μM)로 48시간 동안 처리하였다.
시료 화합물로는 본 발명의 실시예에서 합성된 화합물 및 비교예의 화합물을 사용하였다. 48시간 후 세포액을 수거하고 원심분리(1,500 rpm, 4분)하여 셀을 얻고, 트리판 블루(15250-061, Gibco) 배제 에세이를 통하여 살아있는 세포와 죽은 세포를 정량하였다(n=2). 통계학적인 분석은 마이크로소프트사의 ExcelTM의 T-테스트를 이용하였다. 비교예 1 내지 3 및 실시예 1의 화합물의 세포사멸율(%)을 측정한 결과를 도 1에 나타내었다. 또한 실시예 및 비교예의 화합물들의 세포사멸율을 각각 측정하고, 그 결과를 비교예 1에 대한 상대적 비율로 표 4에 나타내었다.
Figure pct00059
상기 표 4, 도 1에 나타난 바와 같이, 실시예의 화합물들은 RON 돌연변이(△160)(KM12C) 대장암 종양 세포주에서 종래 대비 상대적으로 높은 항암 효능을 갖는다.
실험예 5. MTS 에세이를 이용한 세포독성 확인
약물의 특이적 세포독성 유무를 확인하기 위해 배양된 세포를 0.05% 트립신/EDTA(0.5% Trypsin EDTA(10X), 제품번호: 15400-054, Gibco)로 처리하여 배양접시에서 떼어낸 후, 웰당 3,000개(KM12C), 2,000개(HT29, Colo 320 HSR)의 세포를 분주하였다. 24시간 후, 시료 화합물을 DMSO(제품번호: D8418-250ML, SIGMA)를 용매로 하여 10 mM 농도로 녹인 용액을 희석하여 사용하였다. 시료 화합물로는 본 발명의 실시예에서 합성된 화합물 및 비교예의 화합물을 사용하였다. 10 mM부터 10분의 1의 비율로 8가지 농도(KM12C) 및 10 mM부터 2분의 1의 비율로 9가지 농도(HT29)로 DMSO를 이용하여 희석하였고, 희석한 약물은 가장 높은 농도 기준으로 농도가 100 μM이 되도록 하였다. 약물 처리 후, 72시간 동안 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
72시간 후, MTS 용액(CellTiter 96 aqueous one solution Cell proliferation assay, 제품번호: G3581, Promega)을 웰당 20 μL씩 분주하여 잘 섞어준 뒤 1~4시간 동안 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 이후 Victor X5 플레이트 리더(Perkin-Elmer사)를 이용하여 490 nm의 파장에서 흡광도 값을 측정하여 IC50 값을 도출하였다. 그 결과를 표 5에 나타내었다.
Figure pct00060
상기 표 5에 나타난 바와 같이, 실시예의 화합물들은 RON 돌연변이(△160)를 가지고 있는(KM12C) 대장암 종양 세포주에서 종래 대비 상대적으로 높은 항암 효능을 갖는다.
실험예 6. RON 돌연변이(△160)를 가지고 있는 KM12C에서 실시예 18에 대한 효능 분석
실시예 18 및 비교예 1에 대한 MTS assay는 96웰 플레이트에 웰당 KM12C 세포주를 1,000개씩 씨딩(seeding) 하고 24시간 후 각 웰당 100 ul의 10% FBS-MEM 배지(Welgene)에서 다양한 농도(0.000001 uM-10 uM)의 실시예 18 및 비교예 1을 처리하였다. 이후 72시간 동안 세포를 배양한 다음 MTS 용액(Promega)을 20㎕씩 가하고 2시간 동안 배양한 다음 490 nm에서 흡광도를 측정하였으다. GraphPad PrismTM 5을 이용하여 실시예 18 및 비교예 1에 대한 IC50를 도출하여 세포 독성을 조사하였다.
실시예 18 및 비교예 1의 세포 사멸 유도능은 RON 돌연변이(△160)를 가지고 있고 세툭시맙 저항성 세포주인 KM12C 및 RON을 발현하고 있지 않은 세포주인 Colo320HSR 세포주에서 측정하였다. 2종의 대장암 세포주를 60 mm 플레이트에 2x105 개씩 씨딩(seeding)한 후 24시간 후 배지를 교환하면서, 시료 화합물들을 농도별(1 μM, 5 μM)로 48시간 동안 처리하였다. 48시간 후 세포 및 세포액을 수거하고(1,500 rpm, 3분), 트리판 블루(Gibco) 배제 어세이를 통하여 살아있는 세포와 죽은 세포를 정량하였다(n=2).
실시예 18 및 비교예 1의 세포 사멸 효능을 분석한 후 세포를 수거하여 웨스턴 블랏으로 실시예 18의 활성형 RON 저해능을 확인하였다. 각 세포에 RIPA 용해 버퍼(T&I)를 첨가하여 용해시킨 후 BCA kit(Pierce)로 단백질을 정량하고 단백질 농도를 40 μg으로 하여, 6% SDS-polyacrylamide에 로딩하여 125 V로 전기영동을 진행하였다.
전기영동하여 분리한 단백질은 트랜스퍼 버퍼(20% 메탄올, 25 mM Tris-HCl, 192 mM 글리신)를 사용하여 270 mA에서 90분간 PVDF membrane(Millipore)으로 트랜스퍼 시키고 5% non-fat skim milk-TBST 용액으로 1시간 동안 블락킹을 수행하였다. 이후 5% non-fat skim milk-TBST 용액에 1:1,000으로 희석한 1차 항체(활성형 RON, beta actin)와 4℃에서 24시간 또는 48시간 반응시킨 후 TBST로 3회 세척하고, 1:1,000으로 희석된 anti-rabbit 및 anti-mouse IgG conjugated horse radish peroxidase(HRP) 2차 항체와 상온에서 2시간 반응시킨 후 TBST로 3회 세척하였다. 이후 멤브레인에 ECL 용액(GE healthcare)을 처리하여 X-ray film에 노출하여 현상한 후 밴드를 확인하였다.
그 결과, 하기 표 6, 표 7 및 도 2에 나타낸 바와 같다.
Figure pct00061
비교예: BMS777607
Figure pct00062
상기 표 6, 표 7 및 도 3은 RON 돌연변이(△160)를 가지고 있어 활성형 RON을 발현하고 세툭시맙(Cetuximab) 저항성 세포주인 KM12C에 실시예 18을 처리하였을 때 세포 사멸 유도 효능을 보이는 것을 나타내었다. 실시예 18에 대한 RON kinase assay 결과는 비교예 1에 비해 kinase에 대한 높은 억제 효능을 보이는 것을 확인할 수 있고, MTS assay를 통해 비교 분석한 결과 6.9 nM로 높은 세포 성장 억제 효능을 보이는 것을 확인하였다.
상기 결과와 같이 RON negative인 Colo320HSR의 경우 약물에 대한 반응성이 없는 것을 확인하였다. 또한, 활성형 RON 발현하는 세포주인 KM12C에서 실시예 18를 처리한 경우 비교예 1에 비해 세포 사멸 효능을 보이며 이 때 활성형 RON 발현이 감소하는 것을 웨스턴 블랏 분석을 통해 확인하였다(도 2).
실험예 7. RON 돌연변이에 대한 kinase assay
RON 돌연변이를 대체할 수 있는 방법으로 RON negative 세포주인 Colo320HSR에 각각의 돌연변이(△160, △155)를 형질주입하고 실시예 18 또는 비교예 1을 농도별로 처리한 후 활성형 RON의 발현 감소 여부를 면역침강법 및 웨스턴 블랏 분석법을 통해 확인하였다. 구체적인 방법은 다음과 같다. RON negative Colo320SHR 대장암 세포주에 RON△160, RON △155 각각 12 ug을 lipofectamine 2000(Invitrogen, cat# 11668-019)을 이용하여 형질주입(transfection)을 실시하였다. 동일한 형질주입 효율을 위하여 24시간 후에 60 mm dish에 형질전환된 균주를 나누었다. 형질주입 후 48시간 후에 비교예 1, 실시예 18 약물을 각각 농도 의존적으로 처리하였다. 약물을 2시간 처리한 후에 세포를 수거하여 PBS 세척 후에 RIPA 용해 버퍼(T&I, cat# BRI-9001)로 용해시켰다.
Bradford(BioRad, cat# 5000205) 방법을 이용하여 단백질 농도를 정량한 후에, 단백질 500 ug과 myc 항체 1 ug(cell signaling, cat#2276)을 RIPA 버퍼와 혼합하고 4℃에서 밤새 반응시켰다. 면역침강시킨 용액을 Protein-G agarose beads(Santa Cruz Biotechnology, sc-2002)를 20 ul 첨가한 후 교반기를 이용하여 4℃에서 2시간 반응시켰다. RIPA 버퍼를 이용하여 5번 세척한 후 2XSDS 샘플 버퍼를 20 ul 첨가한 후 100℃, 5분간 반응시켰다.
SDS-PAGE를 사용하여 전기영동 한 후 PVDF 멤브레인에 옮긴 후, phospho-Tyrosine 항체(Cell signaling, cat#9411), myc 항체(Cell signaling, cat#2276)를 5% skimmilk TBS-T(T&I, cat# BTT-9120) 용액에 각각 1:1,000으로 희석한 후 4℃에서 밤새 반응시켰다. TBS-T 용액으로 10분간 3번 세척한 후에 anti-mouse-HRP 항체(Cell signaling, cat# 7076)를 5% skimmilk in 1XTBS-T 용액에 1:2,000으로 희석한 후 상온에서 2시간 반응시켰다. 1XTBS-T 용액으로 3번 세척한 후에 ECL 용액(GE Healthcare, cat# RPN2108)을 사용하여 필름을 현상하였다. 현상한 필름을 Image-J를 이용하여 densitometry로 분석한 후에 Graphpad prism(Graphpad Software Inc)을 이용하여 IC50을 구하였다.
그 결과 비교예 1에 비해 실시예 18을 처리한 그룹에서 약물 처리에 따른 감소가 빠르게 나타나는 것을 확인하였다(도 3 및 도 4). 이 결과를 바탕으로 RON 활성 정도를 기준으로 IC50 값을 계산한 결과, 비교예 1과 비교해 볼 때 실시예 18에서 높은 억제 효능을 보이는 것을 확인하였다.
실험예 8. Colo320HSR 세포주에 RON 돌연변이(mt#1: △160, mt#2: △155)를 과발현한 후 약물에 대한 효능 분석
RON 돌연변이(mutant)에 대한 효능 분석은 RON 돌연변이를 과발현 시킨 후, 세포사멸 유도능 및 웨스턴 블랏을 통해 확인하였다. Colo320HSR 세포주를 100 mm 플레이트에 씨딩 후 RON 돌연변이 #1(△160) 혹은 RON 돌연변이 #2(△155) 발현 벡터를 트랜스펙션 용액(Polyplus)을 사용하여 세포주에 도입하였다. 24시간 후 세포주를 60 mm 플레이트에 2x105 개씩 씨딩한 후, 24시간 후 배지를 교환하면서, 실시예 18을 농도별(1 μM, 5 μM)로 48시간 동안 처리하였다.
48시간 후 세포 및 세포액을 수거하고(1,500 rpm, 3분), 트리판 블루(Gibco) 배제 어세이를 통하여 살아있는 세포와 죽은 세포를 정량하였다(n=2). 이후 남은 세포를 수거하여 웨스턴 블랏으로 활성형 RON 저해능 및 세포 사멸 유도능을 확인하기 위해 각 세포에 RIPA 용해 버퍼(T&I)를 첨가하여 용해시킨 후 BCA kit(Pierce)로 단백질을 정량하였다. 단백질 40 μg을 8% 또는 15% SDS-polyacrylamide에 로딩하여 125 V로 전기영동하였다. 전기영동하여 분리한 단백질은 트랜스퍼 버퍼(20% 메탄올, 25 mM Tris-HCl, 192 mM 글리신)를 사용하여 270 mA에서 90분간 PVDF membrane(Millipore)으로 옮긴 후, 5% non-fat skim milk-TBST 용액으로 1시간 동안 블락킹을 수행하였다.
이후 5% non-fat skim milk-TBST 용액에 1:1,000으로 희석한 1차 항체(활성형 RON, cleaved caspase-3, beta actin)와 4℃에서 24시간 또는 48시간 반응시킨 후 TBST로 3회 세척하고, 1:1,000으로 희석된 anti-rabbit 및 anti-mouse IgG conjugated horse radish peroxidase(HRP) 2차 항체와 상온에서 2시간 반응시킨 후 TBST 로 3회 세척하였다. 이후 멤브레인에 ECL 용액(GE healthcare)을 처리하여 X-ray film에 노출하여 현상한 후 밴드를 확인하였다.
그 결과, RON negative이고 KRAS wt인 세포주, Colo320HSR에 RON 돌연변이 #1(△160) 혹은 RON 돌연변이 #2(△155)를 lipofectamine2000을 이용ㅎ여 형질주입 한 후 실시예 18에 대한 약물의 효능을 분석하였다. 실시예 18을 농도별로 처리한 후 48시간 후에 수거하고 트리판 블루 배제 어세이(trypan blue exclusion assay)를 통해 세포 사멸 비율을 확인하였다. 그 결과 RON 돌연변이를 형질주입한 그룹에서 농도에 따른 세포 사멸이 유도되는 것을 확인할 수 있었다(도 5). 이 때 웨스턴 블랏을 통해 단백질의 발현 변화를 분석한 결과 활성형 RON이 감소하고, cleaved caspase 3 발현이 증가하는 양상을 보이는 것을 확인하였다(도 6).
실험예 9. RON 돌연변이(△160)를 가지고 있는 KM12C 세포주에서 실시예 18의 기전 분석
KM12C 세포주를 100 mm 플레이트에 5x105 개씩 씨딩한 후 24시간 뒤 실시예 18을 농도별(1 μM, 5 μM)로 48시간 동안 처리하였다. 48시간 후 세포 및 세포액을 수거하여(1,500 rpm, 3분) 웨스턴 블랏으로 관련 단백질들의 발현 변화를 확인하였다. 각 세포에 RIPA 용해 버퍼(T&I)를 첨가하여 용해시킨 후 BCA kit(Pierce)로 단백질을 정량 후 8% SDS-polyacrylamide에 로딩하여 125 V로 전기영동하였다.
전기영동하여 분리한 단백질은 트랜스퍼 버퍼(20% 메탄올, 25 mM Tris-HCl, 192 mM 글리신)를 사용하여 270 mA에서 90분간 PVDF membrane(Millipore)으로 옮겼다. 그 후, 5% non-fat skim milk-TBST 용액으로 1시간 동안 블락킹을 수행하였다. 이후 5% non-fat skim milk-TBST 용액에 1:1,000으로 희석한 1차 항체와 4℃에서 24시간 또는 48시간 반응시킨 후 TBST로 3회 세척하고, 1:1,000으로 희석된 anti-rabbit 및 anti-mouse IgG에 HRP가 결합된 2차 항체와 상온에서 2시간 반응시킨 후 TBST 로 3회 세척하였다. 이후 멤브레인에 ECL 용액(GE healthcare)을 처리하여 X-ray film에 노출하여 현상한 후 밴드를 확인하였다.
그 결과, RON 돌연변이(△160)를 가지고 있어 활성형 RON을 발현하고 세툭시맙에 저항성을 가지는 세포주인 KM12C에 실시예 18을 농도별로 처리한 후 관련 단백질들의 발현 변화를 웨스턴 블랏 방법을 통해 확인하였다. 그 결과 활성형 RON이 감소하고, p-ERK, p-Src, p-Akt, p-Gab1이 감소하는 것을 확인하였다(도 7).
실험예 10. KM12C 세포주가 이식된 동물 모델에서 종양 성장 억제 효능 확인
5주령 암컷 BALB/c nude 마우스를 구입하여 1주 순화 후, 사람 유래 대장암 세포주 KM12C(1.5×106 cells/mice)(활성형 RON을 발현하는 세포주/ RON 돌연변이(△160))를 PBS에 희석하여 마우스의 오른쪽 배측면에 피하(100 μl)로 주사하였다. 종양의 크기가 약 100 mm3이 되었을 때 비교예 1, 실시예 18을 경구로 투여하였다. 1일 1회, 2주동안 약물을 투여하였으며, 주 2회 종양 크기와 체중을 측정하였다. 그 결과, 실시예 18이 투여된 그룹에서 약물 투여에 따른 종양 성장 억제 효능을 확인할 수 있었다(도 8). 또한, 약물 투여가 종료된 후 실험동물은 안락사 시킨 후 종양을 적출하여 무게를 측정하였다. 그 결과, 실시예 18 처리 그룹에서 vehicle 그룹보다 종양 무게가 감소한 것을 확인할 수 있었다(도 9). 이 때 마우스 체중 변화는 없는 것을 확인하였다(도 10).
또한, 적출한 종양 조직의 일부를 10% 포르말린으로 고정한 후 파라핀 block을 제작한 후에 각각의 단백질의 발현 변화를 면역화학염색법을 통해 확인하였다. 그 결과 실시예 18을 투여한 그룹에서 활성형 RON과 p-ERK의 발현이 감소하는 것을 확인하였고 cleaved caspase 3의 경우 발현이 유도되는 것을 확인하였다(도 11). Vehicle과 5 mpk(mg/kg) 처리 그룹의 종양 조직을 수거한 후 웨스턴 블랏 분석 방법을 통해 발현 변화를 비교한 결과, 활성형 RON이 감소하고 cleaved caspase 3 발현이 증가하는 것을 확인하였다(도 12).
실험예 11. KM12C 세포주가 이식된 동물 모델에서 실시예 18에 대한 효능 분석
5주령 암컷 BALB/c nude 마우스를 구입하여 1주 순화 후, 사람 유래 대장암 세포주 KM12C(1.5×106 cells/mice)를 PBS에 희석하여 마우스의 오른쪽 배측면에 피하(100 μl)로 주사하였다. 종양의 크기가 약 100 mm3이 되었을 때 비교예 1, 실시예 18을 경구로 투여하였다. 1일 1회, 2주 동안 30 mpk, 50 mpk로 약물을 투여하였으며, 주 2회 종양 크기와 체중을 측정하였다. 그 결과 비교예 1 및 실시예 18 모두 종양 성장 억제 효능이 아주 높게 나타난 것을 확인하였다(도 13 및 도 14, 표 8). 이 때 마우스 체중 변화는 거의 없는 것을 확인하였다(도 15). 약물 투여가 종료된 후 실험동물은 안락사 시켜 종양 적출하여 무게를 측정하여 비교 분석하였다. 그 결과 비교예 1에 비해 약물 투여 그룹에서 높은 종양 성장 억제(tumor growth inhibition, TGI) 효능을 보이는 것을 확인하였다.
Figure pct00063
실험예 12. KM12C 세포주가 이식된 동물 모델에서 유효 투여 농도 확인
5주령 암컷 BALB/c nude 마우스를 구입하여 1주 순화 후, 사람 유래 대장암 세포주 KM12C(1.5×106 cells/mice)를 PBS에 희석하여 마우스의 오른쪽 배측면에 피하(100 μl)로 주사하였다. 종양의 크기가 약 100 mm3이 되었을 때 실시예 18을 용량별로 경구 투여를 진행하였다. 1일 1회, 2주동안 약물을 투여하였으며, 주 2회 종양 크기와 체중을 측정하여 비교 분석하였다. 약물 투여가 종료된 후 실험동물은 안락사 시켜 종양 적출하여 무게를 측정하여 비교 분석하였다.
그 결과, 농도별로 종양 성장이 억제되는 효과를 확인하였다(도 16). 이 때, 종양 조직 크기 및 무게도 투여 농도에 따라 감소함을 확인하였다. 이 결과를 바탕으로 하여 유효 투여 농도가 5.214 mpk임을 확인하였다(도 17).
실험예 13. 대장암 환자 조직 종양세포가 이식된 동물 모델에서 실시예 18의 효능 분석
5주령 암컷 BALB/c nude 마우스를 구입하여 1주 순화 후, 대장암 환자 유래 암조직을 마우스의 오른쪽 배측면에 이식하였다. 종양의 크기가 약 100 mm3이 되었을 때 실시예 18을 경구로 투여하였다. 1일 1회, 4주동안 약물을 투여하였으며, 주 2회 종양 크기와 체중을 측정하여 비교 분석하였다. 약물 투여가 종료된 후 실험동물은 안락사 시켜 종양 적출하여 무게를 측정하여 비교 분석하였다.
그 결과, 대장암 환자 종양세포가 이식된 동물 모델(RON mutant: △160)에 실시예 18을 투여한 결과 종양 성장이 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 약물은 경구로 매일 투여하였고, 용량은 50 mpk로 사용하였다. 4주간 약물을 투여한 결과 종양 성장이 80% 이상 억제되는 것을 확인하였다(도 18). 또한, 약물 투여 종료 후 종양 조직을 적출하여 무게를 비교 분석한 결과 vehicle 대비 약 83% 정도 종양 성장이 억제된 것을 확인하였다(도 19 및 도 18). 도 19의 하단 사진은 각 그룹별 대표 개체의 종양 적출한 사진을 제시한 것이다.
실험예 14. 대장암 환자 조직 종양세포가 이식된 동물 모델에서 실시예 18에 대한 효능 분석
대장암 환자 조직 종양세포가 이식된 동물 모델과 동일한 환자 조직(활성형 RON/RON 돌연변이 #1: △160) 세포가 이식된 동물 모델에 실시예 18과 비교예 1을 30 mpk로 4주 동안 투여한 결과 실시예 18을 투여한 그룹의 경우 종양 성장 억제 효능이 약 73%인 것을 확인하였다(도 20). 반면, 비교예 1을 투여한 그룹의 경우 약 18%로 실시예 18에 비해 낮은 효능을 보이는 것을 확인하였다(도 21). 도 21의 하단 사진은 각 그룹별 대표 개체의 종양 적출한 사진을 제시한 것이다.
실험예 15. 대장암 환자 유래 세포주 중 활성형 RON 발현 여부에 따른 실시예 18에 대한 효능 분석
상기 실험의 조건과 방법은 다음과 같이 수행하였다. 인간 대장암 환자 유래 세포주 2종(KRAS 정상형, RON 활성형 및 비활성형)을 REBM(Lonza) 배양배지에 배양 후 각 세포주 당 5x104 cells씩의 24웰 플레이트에 멸균된 12mmΦ Microscope cover glass를 웰당 1개씩 얹은 웰에 씨딩하여 배양하였다. 배양 중인 각 대장암 환자 유래 세포주에 실시예 18과 비교예 1를 각각 5 ug씩 처리 후 48시간 동안 배양하고 배양이 끝난 각 플레이트를 PBS로 2회 세척 후 100% Me-OH로 5분간 상온에서 고정하였다.
Me-OH를 제거하고, PBS로 5분간 3회 세척 후 0.1% Triton X-100(in PBS) 100 ul씩 분주하여 5분간 permeabilization하여 PBS로 5분간 3회 세척 후 PBS를 넣어 마르지 않도록 하였다. 24웰 플레이트 커버에 parafilm을 부착 후 parafilm 위에 3% BSA가 포함된 PBS-T(PBS+0.1% Tween 20)를 20 ul씩 떨어뜨렸다. 각 대장암 환자 유래 세포주가 고정되어 있는 커버 글라스를 세포가 부착되어 있는 곳이 바닥을 향하게 하여, 3% BSA 위에 얹어 상온에서 30분간 블락킹을 하였다.
그 후, 새로운 24 웰 플레이트 커버에 parafilm을 부착하여 1% BSA가 포함된 PBS-T(PBS+0.1% Tween 20)에 1차 항체(cytokeratin 18, cleaved caspase 3)를 희석한 후, parafilm 위에 10 ul씩 떨어뜨렸다. 그 후, 블락킹이 완료된 커버 글라스(cover glass)를 세포가 부착되어 있는 곳이 바닥을 향하게 하여 얹어 4℃에서 밤새 반응시켰다.
1차 항체 반응 끝난 커버 글라스를 세포가 부착되어 있는 곳이 위로 향하게 하여 PBS-T(PBS+0.1% Tween 20)가 들어 있는 24웰 플레이트에 각각 넣어 5분간 3회 세척하였다. 그 후 새로운 24웰 플레이트 커버에 parafilm을 부착하여 1% BSA가 포함된 PBS-T(PBS+0.1% Tween 20)에 2차 항체(immunofluorescence 2차 항체)를 희석한 후 parafilm 위에 10 ul씩 떨어뜨셨다. 그 후, 커버 글라스를 세포가 부착되어 있는 곳이 바닥을 향하게 하여 얹어 커버 글라스를 얹어 상온에서 2시간 반응시켰다.
2차 항체 반응 끝난 커버 글라스를 세포가 부착되어 있는 곳이 위로 향하게 하여 PBS-T(PBS+0.1% Tween 20)가 들어 있는 24웰 플레이트에 각각 넣어 5분간 3회 세척하였다. 그 후, 1 μg/mL Hoechst stain(DAPI)을 PBS-T(PBS+0.1% Tween 20)와 혼합한 후, 24웰 플레이트 각 웰에 100 ul씩 첨가하여 1분간 반응시켰다. 그 후 PBS-T(PBS+0.1% Tween 20)로 2회 세척하고, 형광 현미경을 이용하여 염색 여부 확인하였다. 그 후, 슬라이드 글라스에 mount solution을 5 ul drop하여 염색한 후, cover glass를 얹어 고정하여 형광 현미경을 이용해 형광 이미지를 촬영하였다.
그 결과, 대장암 환자 유래 세포주 중 활성형 RON을 발현하는 세포주에 실시예 18과 비교예 1을 처리한 결과, 실시예 18을 처리한 그룹의 경우 세포 사멸 유도 효능을 보이는 것을 확인하였다(도 22 및 도 23). 또한, 아래 도면과 같이 활성형 RON이 negative인 경우 약물 처리에 의한 반응성을 보이지 않는 것을 확인하였다(도 24 및 도 25). 이 때 cytokeratin 18을 대장암 마커로 사용하였다.
실험예 16. 대장암 세포주에서 RON 바이오마커 유전자 분석
인간 대장암 세포주 35종(KRAS 정상형 19종, KRAS 돌연변이형 16종)을 배양 후 수거하여 각 세포당 1x106 내지 2x106 cells씩의 1.5 ml tube에 담아 cell pellet을 획득하였다. 그 후 각 샘플에 Trizol 1 ml를 첨가 후 파이펫팅하여 세포를 분쇄한 후, 클로로포름 200 ul를 첨가하여 15초간 부드럽게 섞어준 뒤 3분간 실온에서 반응시켰다. 반응이 끝난 샘플을 원심분리기를 이용하여 4℃에서 15분간 12,000xg로 원심분리하여 맑은 상층액을 새로운 1.5 ml tube에 담았다. 그 후, 0.5 ml 이소프로판올을 첨가하여 15초간 부드럽게 섞어준 뒤 상온에서 10분간 반응시켰다.
반응이 끝난 샘플을 원심분리기를 이용하여 4℃에서 1분간 12,000xg로 원심분리하여 tube 하단에 하얀색 RNA pellet을 확인한 후 상층액은 제거하였다. 그 후, 75% Et-OH을 1 ml을 첨가하여 vortex를 이용하여 10초간 섞어준 뒤 4℃에서 10분간 12,000xg로 원심분리하였다. 그 후, RNA 펠릿을 확인한 후 상층액을 제거하고 tube를 뒤집어 액체가 없도록 상온에서 건조시켰다. 물기가 제거된 RNA 펠릿은 50 ul 내지 100 ul의 RNase-free water로 녹였다. 그 후, 추출된 총 RNA를 nano-drop을 이용하여 농도를 측정하고, 총 RNA 1 ug과 oligo dT 1 ul를 새로운 tube에 섞어 heat block 또는 water bath를 이용하여 70℃ 온도로 5분간 반응시킨 후 얼음에 담아 냉각시켰다.
cDNA 합성 kit tube(AccuPower CycleScript RT PreMix, 바이오니아)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 RT-PCR premix kit tube(AccuPower Gold Multiplex PCR PreMix, 바이오니아), RON exon5-6(RON d5_6) 또는 exon11(RON d11) 증폭용 forward primer(10 pmol) 및 reverse primer(10 pmol)를 이용하여 RT-PCR을 진행하였다. 그 후, 증폭된 산물을 전기영동 시킨 후, 서열을 분석하였다.
Figure pct00064
그 결과, 도 26에 나타낸 바와 같이 35종의 대장암 세포주에서 RON 정상형 유전자(wild type)와 RON 활성형 돌연변이 유전자(mutant type;Δ160, Δ155, Δ165)의 비율은 RON 정상형 유전자를 갖는 세포주가 11종(31.4%)이며 RON 활성형 돌연변이 유전자를 갖는 세포주가 21종(60%), RON 유전자가 발현하지 않는 세포주는 3종(8.6%)로 분석되었다.
또한, KRAS 유전형(정상형 및 돌연변이형)으로 구분하였을 경우 KRAS 정상형 세포주 19종에서는 RON 정상형 유전자를 갖는 세포주가 5종(26.3%)이며 RON 활성형 돌연변이 유전자를 갖는 세포주가 11종(57.9%), RON 유전자가 발현하지 않는 세포주는 3종(15.8%)로 분석되었다. KRAS 돌연변이형 세포주 16종에서는 RON 정상형 유전자를 갖는 세포주가 6종(37.5%)이며 RON 활성형 돌연변이형 유전자를 갖는 세포주가 10종(62.5%), RON 유전자가 발현하지 않는 세포주는 발견되지 않는 것으로 분석되었다.
실험예 17. 대장암 환자에서 RON 및 KRAS 바이오마커 유전자 분석: 한국인 환자 조직
서울아산병원 IRB(생명윤리위원회)으로부터 연구계획을 승인받아 서울아산병원 BRC(조직세포자원센터)에서 제공받은 한국인 대장암 환자의 암 조직 401종을 0.5 cm3~1 cm3 크기로 잘라 1.5 ml tube에 담았다. 그 후, Trizol 1 ml을 첨가 후 전동드릴형 균질기를 이용하여 조직을 5~10분간 덩어리가 보이지 않을 때까지 분쇄시켰다. 그 후 클로로포름 200 ul를 첨가하여 15초간 부드럽게 섞어준 뒤 3분간 실온에서 반응시켰다. 반응이 끝난 샘플을 원심분리기를 이용하여 4℃에서 15분간 12,000xg로 원심분리한 후, 맑은 상층액을 새로운 1.5 ml tube에 담고 0.5 ml 이소프로판올을 첨가하여 15초간 부드럽게 섞어준 뒤 상온에서 10분간 반응시켰다.
환자 조직에서의 mRNA에서 cDNA 합성 kit tube(AccuPower CycleScript RT PreMix, 바이오니아)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 RT-PCR premix kit tube(AccuPower Gold Multiplex PCR PreMix, 바이오니아), RON exon5-6 또는 exon11 증폭용 forward(10 pmol) 및 reverse primer(10 pmol)를 이용하여 RT-PCR을 진행하였다. 그 후, 증폭된 산물을 전기영동 시킨 후, 서열을 분석하였다.
그 결과, 도 27에 나타낸 바와 같이 401종의 대장암 환자 조직에서 KRAS 정상형과 돌연변이형 및 RON 정상형 유전자(wild type)와 RON 활성형 돌연변이 유전자(mutant type; Δ160, Δ155, Δ165) 비율은 KRAS 정상형 환자 조직 262종(65.33%), KRAS 돌연변이형 환자 조직 139종(34.67%)로 확인되었다. 또한, KRAS 정상형 환자 조직 262종 중 RON 정상형 유전자를 갖는 조직 110종(41.98%), RON 활성형 돌연변이 유전자를 갖는 조직 152종(58.02%)이며 KRAS 돌연변이형 환자 조직 139종 중 RON 정상형 유전자를 갖는 조직 63종(45.32%), RON 활성형 돌연변이 유전자를 갖는 조직 76종(54.67%)으로 분석되었다(도 28).
실험예 18. 대장암 환자 조직에서 RON 돌연변이 분석: 코카사스 인종(Caucasian) 환자 조직
해외 업체(Proteogenex)를 통해 구입한, 코카사스 인종(Caucasian) 대장암 환자의 암 조직 182종을 0.5 cm3~1 cm3 크기로 잘라 1.5 ml tube에 담고 Trizol 1 ml을 첨가 후 전동드릴형 균질기를 이용하여 조직을 5~10분간 덩어리가 보이지 않을 때까지 분쇄한 후 클로로포름 200 ul를 첨가하여 15초간 부드럽게 섞어준 뒤 3분간 실온에서 반응시켰다. 반응이 끝난 샘플을 원심분리기를 이용하여 4℃에서 15분간 12,000xg로 원심분리하여 맑은 상층액을 새로운 1.5 ml tube에 담고 0.5 ml 이소프로판올을 첨가하여 15초간 부드럽게 섞어준 뒤 상온에서 10분간 반응시켰다.
환자 조직에서의 mRNA에서 cDNA 합성 kit tube(AccuPower CycleScript RT PreMix, 바이오니아)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 RT-PCR premix kit tube(AccuPower Gold Multiplex PCR PreMix, 바이오니아), RON exon5-6 또는 exon11 증폭용 forward(10 pmol) 및 reverse primer(10 pmol)를 이용하여 RT-PCR을 진행하였다. 그 후, 증폭된 산물을 전기영동 시킨 후, 서열을 분석하였다.
그 결과, 도 29에 나타낸 바와 같이 총 182 케이스의 코카사스 인종(Caucasian) 환자 조직에서 KRAS와 RON 돌연변이를 분석한 결과 KRAS 정상형인 환자에서 RON 돌연변이는 약 34.3%로 확인되었다. 또한, KRAS 돌연변이인 환자 조직에서는 RON 돌연변이 비율이 약 40%인 것을 확인하였다. 각 돌연변이에 대한 비율은 도면에 제시한 것과 같이 Δ160 비율은 18.1%, Δ155 비율은 9.4%, Δ165의 비율은 8.2%이다(도 30).
실험예 19. 대장암 환자 종양세포가 이식된 동물모델 조직에서 RON 및 KRAS 바이오마커 유전자 분석
한국인 대장암 환자의 암 조직 이식 동물모델 5종의 암 조직을 0.5 cm3~1 cm3 크기로 잘라 1.5 ml tube에 담고 Trizol 1 ml을 첨가 후 전동드릴형 균질기를 이용하여 조직을 5~10분간 덩어리가 보이지 않을 때까지 분쇄하였다. 그 후, 클로로포름 200 ul를 첨가하여 15초간 부드럽게 섞어준 뒤 3분간 실온에서 반응시켰다. 반응이 끝난 샘플을 원심분리기를 이용하여 4℃에서 15분간 12,000g로 원심분리하여 맑은 상층액을 새로운 1.5 ml tube에 담고 0.5 ml 이소프로판올을 첨가하여 15초간 부드럽게 섞어준 뒤 상온에서 10분간 반응시켰다.
환자 조직에서의 mRNA에서 cDNA 합성 kit tube(AccuPower CycleScript RT PreMix, 바이오니아)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 RT-PCR premix kit tube(AccuPower Gold Multiplex PCR PreMix, 바이오니아), RON exon5-6 또는 exon11 증폭용 forward(10 pmol) 및 reverse primer(10 pmol)를 이용하여 RT-PCR을 진행하였다. 그 후, 증폭된 산물을 전기영동 시킨 후, 서열을 분석하였다.
그 결과, 도 31에 나타낸 바와 같이 5종의 대장암 환자 종양세포가 이식된 동물모델 조직에서 KRAS 정상형과 돌연변이형 및 RON 정상형 유전자(wild type)와 RON 활성형 돌연변이 유전자(mutant type; Δ160, Δ155, Δ165) 비율은 KRAS 정상형 대장암 환자 종양세포가 이식된 동물모델 조직 4종(80%), KRAS 돌연변이형 환자 조직 1종(20%)로 확인되었다. 한편, KRAS 정상형 환자 조직 4종 중 RON 정상형 유전자를 갖는 대장암 환자 종양세포가 이식된 동물모델 조직은 없었으며, RON 활성형 돌연변이 유전자를 갖는 대장암 환자 종양세포가 이식된 동물모델 조직은 4종(100%)이었다. KRAS 돌연변이형 환자 조직 1종 중 RON 정상형 유전자를 갖는 대장암 환자 종양세포가 이식된 동물모델 조직은 1종(100%), RON 활성형 돌연변이 유전자를 갖는 대장암 환자 종양세포가 이식된 동물모델 조직은 확인되지 않았다.
<110> Wellmarker Bio Co., LTD. <120> A biomarker driven therapeutic agent <130> PCB903029WMB <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RON d5_6 sense primer <400> 1 gagctggtca ggtcactaaa c 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RON d5_6 antisense primer <400> 2 cagacactca gtcccattga c 21 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RON d11 sense primer <400> 3 atctgtggcc agcatctaac 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RON d11 antisense primer <400> 4 aaaggcagca ggataccaag 20

Claims (20)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 단백질 키나제 억제제에 내성인 암환자 치료용 약학적 조성물:
    [화학식 1]
    Figure pct00065

    상기 식에서,
    RA는 C1-10알킬, 페닐 또는 벤질이고, 여기서 RA는 할로겐 및 C1-10알콕시 중에서 선택되는 하나 이상의 치환기를 갖거나 갖지 않고;
    X는 -C(-RB')= 또는 -N=이고;
    RB 및 RB'는 각각 독립적으로 H, 할로겐, C1-10알킬, 또는 C1-10알콕시이고;
    RC는 H, 할로겐, 또는 C1-10알킬이고;
    L은 단일결합 또는 C1-6알킬렌이고;
    R은 N 및 S 중에서 선택되는 1개 또는 2개의 헤테로원자를 갖는 5 내지 8원의 헤테로사이클이고;
    RD는 H, C1-10알킬, -(CH2)n-Y-RG, 또는 -CH2-NRERF이고;
    RE 및 RF는 각각 독립적으로 H, C1-10알킬 또는 -(CH2)n-Y-RG이거나, 또는 RE와 RF는 서로 연결되어 이들이 결합된 N 원자와 함께 4 내지 10원의 헤테로사이클을 형성하고;
    여기서 n은 0 내지 10의 정수이고; Y는 -O-, -C(=O)-, -C(=O)-O-, -S- 또는 -S(=O)2-이고; RG은 직쇄 또는 분지쇄의 C1-10알킬이며, 이때 RG는 할로겐, 아미노, 히드록시 및 C1-6알콕시로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 치환기를 갖거나 갖지 않고;
    상기 4원 내지 10원의 헤테로사이클은 RE와 RF가 결합된 N 원자 이외에도 N, O 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 또는 2개의 헤테로원자를 더 갖거나 갖지 않으며, 또한 4원 내지 10원의 헤테로사이클은 할로겐 및 C1-6알킬 중에서 선택되는 하나 이상의 치환기를 갖거나 갖지 않는다.
  2. 제 1 항에 있어서,
    RA는 메틸, 페닐, 할로벤질, 또는 할로페닐인 화합물인 것인, 약학적 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서,
    RB 및 RB'는 각각 독립적으로 H, 메틸, 메톡시 또는 에톡시인 화합물인 것인, 약학적 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서,
    X는 -C(-RB')=이고;
    RB 및 RB'는 각각 독립적으로 H, 메틸, 메톡시 또는 에톡시이며,
    이때 RB 및 RB'는 동시에 H가 아닌 화합물인 것인, 약학적 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서,
    RC는 H 또는 할로겐인 화합물인 것인, 약학적 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서,
    L은 단일결합 또는 메틸렌이고;
    R은 이미다졸릴, 피라졸릴, 피리디닐, 피페라지닐 또는 싸이아졸릴인 것인, 약학적 조성물.
  7. 제 1 항에 있어서,
    RD는 H, 메틸, 에틸, 메톡시메틸, 또는 -CH2-NRERF이고;
    RE 및 RF는 각각 독립적으로 H, C1-6알킬, 또는 -C1-6알킬렌-O-C1-10알킬이고, 이때 RE 및 RF는 동시에 H가 아닌 화합물인 것인, 약학적 조성물..
  8. 제 1 항에 있어서,
    RE 및 RF는 이들이 결합된 N 원자와 함께
    Figure pct00066
    를 형성하고;
    여기서 Ra 및 Rb는 각각 독립적으로 C1-3알킬렌이고;
    A는 -N(-C1-6알킬)- 또는 -O-인 화합물인 것인, 약학적 조성물.
  9. 제 1 항에 있어서,
    RA는 메틸, 페닐, 할로벤질, 또는 할로페닐이고;
    X는 -CH=이고;
    RB는 H, 메틸, 메톡시 또는 에톡시이고;
    RC는 H 또는 할로겐이고;
    L은 단일결합 또는 메틸렌이고;
    R은 이미다졸릴, 피라졸릴, 피리디닐, 싸이아졸릴, 또는 피페라지닐이고;
    RD는 H, 메틸, 에틸, 메톡시메틸, 또는 -CH2-NRERF이고;
    여기서 RE는 -C2H4-O-CH3이고 RF은 H 또는 메틸이거나, 또는 RE 및 RF는 서로 연결되어 이들이 결합된 N 원자와 함께 모폴리노 또는 메틸피페라지닐을 형성하는 것인, 약학적 조성물.
  10. 제 1 항에 있어서,
    상기 화학식 1로 표시되는 화합물이 하기 화합물인 것인, 약학적 조성물:
    1) 4-에톡시-N-(3-플루오로-4-(2-(1-메틸-1H-이미다졸-4-일)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일옥시)페닐)-1-(4-플루오로페닐)-2-옥소-1,2-디하이드로피리딘-3-카르복스아미드;
    2) 4-에톡시-N-(3-플루오로-4-(2-(1-메틸-1H-이미다졸-4-일)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일옥시)페닐)-1-메틸-2-옥소-1,2-디하이드로피리딘-3-카르복스아미드;
    3) 4-에톡시-N-(3-플루오로-4-(2-(1-메틸-1H-이미다졸-2-일)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일옥시)페닐)-1-(4-플루오로페닐)-2-옥소-1,2-디하이드로피리딘-3-카르복스아미드;
    4) 4-에톡시-N-(3-플루오로-4-(2-(1-메틸-1H-피라졸-4-일)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일옥시)페닐)-1-(4-플루오로페닐)-2-옥소-1,2-디하이드로피리딘-3-카르복스아미드;
    5) 4-에톡시-N-(3-플루오로-4-(2-(피리딘-2-일)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일옥시)페닐)-1-(4-플루오로페닐)-2-옥소-1,2-디하이드로피리딘-3-카르복스아미드;
    6) 4-에톡시-N-(3-플루오로-4-(2-(피리딘-3-일)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일옥시)페닐)-1-(4-플루오로페닐)-2-옥소-1,2-디하이드로피리딘-3-카르복스아미드;
    7) 4-에톡시-N-(3-플루오로-4-(2-(싸이아졸-2-일)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일옥시)페닐)-1-(4-플루오로페닐)-2-옥소-1,2-디하이드로피리딘-3-카르복스아미드;
    8) 4-에톡시-N-(4-(2-(1-에틸-1H-이미다졸-4-일)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일옥시)-3-플루오로페닐)-1-(4-플루오로벤질)-2-옥소-1,2-디하이드로피리딘-3-카르복스아미드;
    9) 4-메톡시-N-(3-플루오로-4-(2-(1-(메톡시메틸)-1H-이미다졸-4-일)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일옥시)페닐)-1-페닐-2-옥소-1,2-디하이드로피리딘-3-카르복스아미드;
    10) 4-에톡시-N-(3-플루오로-4-(2-(피페라진-1-일메틸)싸이에노[3,2-b]피리딘- 7-일옥시)페닐)-1-(4-플루오로페닐)-2-옥소-1,2-디하이드로피리딘-3-카르복스아미드;
    11) 4-에톡시-N-(3-플루오로-4-(2-((4-메틸피페라진-1-일)메틸)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일옥시)페닐)-1-(4-플루오로페닐)-2-옥소-1,2-디하이드로피리딘-3-카르복스아미드;
    12) 4-에톡시-N-(3-플루오로-4-{[2-(5-{[(2-메톡시에틸)아미노]메틸}피리딘-2-일)티에노[3,2-b] 피리딘-7-일]옥시}페닐)-2-옥소-1-페닐-1,2-디히드로피리딘-3-카르복스아미드;
    13) 4-에톡시-N-(3-플루오로-4-{[2-(5-{[(2-메톡시에틸)아미노]메틸}피리딘-2-일)티에노[3,2-b]피리딘-7-일]옥시}페닐)-1-(4-플루오로페닐)-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-카르복스아미드;
    14) N-(3-클로로-4-{[2-(5-{[(2-메톡시에틸)아미노]메틸}피리딘-2-일)티에노[3,2-b]피리딘-7-일]옥시}페닐)-1-(4-플루오로페닐)-4-메톡시-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-카르복스아미드;
    15) 4-에톡시-N-(3-플루오로-4-{[2-(5-{[(2-메톡시에틸)아미노]메틸}피리딘-2-일)티에노[3,2-b]피리딘-7-일]옥시}페닐)-1-(3-플루오로페닐)-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-카르복스아미드;
    16) N-(3-플루오로-4-{[2-(5-{[(2-메톡시에틸)아미노]메틸}피리딘-2-일)티에노[3,2-b]피리딘-7-일]옥시}페닐)-1-(4-플루오로페닐)-4-메틸-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-카르복스아미드;
    17) 4-에톡시-N-(3-플루오로-4-{[2-(5-{[(2-메톡시에틸)(메틸)아미노]메틸}피리딘-2-일)티에노[3,2-b]피리딘-7-일]옥시}페닐)-1-(4-플루오로페닐)-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-카르복스아미드;
    18) 4-에톡시-N-[3-플루오로-4-({2-[5-(모르폴리노메틸)피리딘-2-일]티에노[3,2-b]피리딘-7-일}옥시)페닐] -1-(4-플루오로페닐)-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-카르복스아미드;
    19) 4-에톡시-N-[3-플루오로-4-({2-[5-(모르폴리노메틸)피리딘-2-일]티에노[3,2-b]피리딘-7-일}옥시)페닐]-2-옥소-1-페닐-1,2-디히드로피리딘-3-카르복스아미드;
    20) 4-에톡시-N-{3-플루오로-4-[(2-{5-[(4-메틸피페라진-1-일)메틸]피리딘-2-일}티에노[3,2-b]피리딘-7-일)옥시]페닐}-1-(4-플루오로페닐)-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-카르복스아미드; 및
    21) 4-에톡시-N-{3-플루오로-4-[(2-{5-[(-메틸피페라진-1-일)메틸]피리딘-2-일}티에노[3,2-b]피리딘-7-일)옥시]페닐}-2-옥소-1-페닐-1,2-디히드로피리딘-3-카르복스아미드.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 단백질 키나제는 EGFR인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 환자는 활성형 RON(Recepteur d'Origine Nantais)을 보유하고 있는 것인, 약학적 조성물.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 활성형 RON은 RONΔ155, RONΔ160, RONΔ165 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것인, 약학적 조성물.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 환자는 정상형 KRAS를 보유하고 있는 것인, 약학적 조성물.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 단백질 키나제 억제제는 세툭시맙인 것인, 약학적 조성물.
  16. 제1항에 있어서,
    상기 암이 유방암, 폐암, 위암, 전립선암, 자궁암, 난소암, 신장암, 췌장암, 간암, 대장암, 피부암, 두경부암 및 갑상선암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 약학적 조성물.
  17. 제1항에 있어서,
    단백질 키나제 억제제를 추가적으로 더 포함하는 약학적 조성물.
  18. 제1항에 있어서,
    상기 단백질 키나제 억제제는 EGFR 억제제인 것인, 약학적 조성물.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 EGFR 억제제는 세툭시맙인 것인, 약학적 조성물.
  20. i) 암 환자가 활성형 RON을 가지고 있는지 확인하는 단계; 및
    ii) 활성형 RON을 가지고 있는 환자에게 상술한 화학식 I로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 항암제를 투여하는 단계를 포함하는 단백질 키나제 억제제에 내성인 환자를 치료하는 방법.
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