KR20220056806A - DNA marker for discriminating genotype of Brassica rapa, Brassica oleracea and their interspecific hybrid and uses thereof - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 배추(Brassica rapa), 양배추(B. oleracea) 및 이들의 종간교배체의 유전형을 구분할 수 있는 DNA 마커 및 이의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to a DNA marker capable of distinguishing the genotypes of Chinese cabbage ( Brassica rapa ), cabbage ( B. oleracea ) and their interspecies, and uses thereof.
종·속간 교배를 통한 신품종의 육성은, 한정된 유전자원으로부터 새로운 형질을 창출해야 하는 기존 육종 방식의 한계를 극복할 수 있는 육종방식이다. 그러나 종·속간 교배에는 다양한 형태의 교배장벽이 작용해, 수정 전부터 교배체의 형성을 어렵게 할 뿐 아니라, 수정 후에도 그 발달과정과 교배체의 임성 회복 등에 다양한 문제점이 발생한다. 뿐만 아니라, 종·속간 교배에서는 초기세대의 감수분열 과정에서 불안정성으로 인해 염색체 이수성(aneuploidy) 등의 비정상 감수분열이 발생하여 염색체 결실 등이 발생하기 쉬우며, 이로 인한 식물체의 비정상적 발달이 일어날 수 있다. 따라서 종간교잡을 통한 유전자원의 다양화와 품종 개발 및 이에 대한 연구를 수행하기 위해서는 이러한 교배장벽을 넘어서기 위한 시도가 필요하며, 생산된 교배체가 정상적으로 교배된 개체인지를 필수적으로 검정해야 한다.Cultivation of new varieties through interspecies/genus crossbreeding is a breeding method that can overcome the limitations of existing breeding methods that require the creation of new traits from limited genetic resources. However, there are various types of barriers to mating between species and genus, making it difficult to form a cross before fertilization, and various problems occur after fertilization, such as the development process and recovery of fertility of the mat. In addition, in interspecies crossbreeding, abnormal meiosis such as chromosomal aneuploidy occurs due to instability in the process of meiosis of the early generation, and chromosomal deletion is easy to occur, which can lead to abnormal development of plants. . Therefore, in order to diversify genetic resources through interspecies crossbreeding, develop varieties, and conduct research on them, it is necessary to attempt to overcome these barriers to crossbreeding, and it is essential to test whether the produced hybrids are normally crossed individuals.
종간교배를 통해 새로운 종이 합성되고 유지될 수 있음은 우장춘 박사의 삼각형 이론을 통해서 이미 널리 알려진 바 있으며, 그 중에서도 유채(Brassica napus)는 배추(B. rapa)와 양배추(B. oleracea)간의 종간교잡을 통해 형성되었다고 알려져 있다. 유채는 전세계적으로 널리 이용되고 있는 주요한 유지작물 중 하나로, 유채씨를 압착하여 생산하는 카놀라유는 포화지방산 함량이 낮고 올레인산 함량이 높아 식용유로 널리 이용된다. 뿐만 아니라 제주도 등에서는 관상용으로 꽃밭 등이 조성되는 등 다양한 경제적 가치를 창출하고 있는 식물체이다.It has already been widely known that new species can be synthesized and maintained through interspecies crossbreeding through Dr. Changchun Woo's triangle theory, and among them, rape ( Brassica napus ) is an interspecies hybrid between Chinese cabbage ( B. rapa ) and cabbage ( B. oleracea ). It is known to have been formed through Rapeseed is one of the major oilseed crops widely used worldwide. Canola oil produced by pressing rapeseed has low saturated fatty acid content and high oleic acid content, so it is widely used as edible oil. In addition, it is a plant that creates various economic values such as flower gardens for ornamental purposes in Jeju-do.
본 발명에서는 배추와 양배추 간의 종간교배로 얻어진 교배체를 검정하고, 염색체의 결실 등을 확인할 수 있는 마커를 제작하여 부모 개체와 교배체의 유전형을 효과적으로 검정할 수 있도록 하였다.In the present invention, hybrids obtained by crossbreeding between Chinese cabbages and cabbages were tested, and markers capable of confirming chromosomal deletions, etc. were produced to effectively test the genotypes of parents and hybrids.
한편, 한국공개특허 제2020-0055666호에는 '배추, 무 및 이들의 속간교배체의 유전형을 구분할 수 있는 DNA 마커 및 이의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명의 '배추, 양배추 및 이들의 종간교배체의 유전형을 구분할 수 있는 DNA 마커 및 이의 용도'에 대해서는 기재된 바가 없다.On the other hand, Korean Patent Application Laid-Open No. 2020-0055666 discloses 'DNA markers capable of discriminating genotypes of Chinese cabbage, radish and their intergenus and their use', but the present invention 'Chinese cabbage, cabbage and interspecies crosses thereof' are disclosed. There is no description about a DNA marker capable of discriminating the genotype of a body and its use.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 배추와 양배추의 유전자 염기서열을 비교하여, 배추와 양배추 간의 이종상동유전자(ortholog)를 선발하였고, 이 중 유전자의 길이 차이를 기준으로 1,206개 유전자를 선별하였다. 선별된 이종상동유전자 세트 간의 정렬을 수행하여, 배추와 양배추 두 종을 공통적으로 증폭할 수 있으면서 증폭 산물의 크기에 차이가 날 것으로 예상되는 InDel 다형성 기반 PCR 프라이머 세트를 제작하였다. 상기 프라이머 세트를 이용하여 배추와 양배추의 게노믹 DNA를 이용하여 PCR을 수행하여 두 종을 구별할 수 있는 프라이머 세트를 선별하였고, 이를 배추와 양배추의 종간교배체의 게노믹 DNA를 이용한 PCR에 적용한 결과, 배추와 양배추의 유전형이 모두 나타나는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.The present invention was derived by the above request, and the present inventors compared the gene sequences of Chinese cabbage and cabbage, and selected orthologs between Chinese cabbage and cabbage, and among them, based on the difference in the length of the gene 1,206 genes were selected. By performing alignment between the selected orthologous gene sets, an InDel polymorphism-based PCR primer set, which can amplify Chinese cabbage and cabbage, and is expected to have a difference in the size of the amplification product, was prepared. Using the primer set, PCR was performed using the genomic DNA of Chinese cabbage and cabbage to select a primer set capable of distinguishing the two species, and this was applied to PCR using the genomic DNA of an interspecies hybrid of Chinese cabbage and cabbage. As a result, by confirming that both genotypes of Chinese cabbage and cabbage appear, the present invention was completed.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 배추와 양배추의 종간교배체의 유전형을 판별하기 위한 프라이머 세트 조성물을 제공한다.In order to solve the above problems, the present invention provides an oligonucleotide primer set of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2; And SEQ ID NO: 3 and an oligonucleotide primer set of SEQ ID NO: 4; provides a primer set composition for determining the genotype of a crossbreeding of Chinese cabbage and cabbage, comprising one or more primer sets selected from the group consisting of.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트 조성물 및 증폭반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 배추와 양배추의 종간교배체의 유전형을 판별하기 위한 키트를 제공한다.In addition, the present invention provides a kit for determining the genotype of an interspecies cross between Chinese cabbage and cabbage, comprising the primer set composition and a reagent for performing an amplification reaction.
또한, 본 발명은 배추와 양배추의 종간교배체 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 상기 프라이머 세트 조성물을 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 배추와 양배추의 종간교배체의 유전형을 판별하는 방법을 제공한다.In addition, the present invention comprises the steps of isolating genomic DNA from an interspecies sample of Chinese cabbage and cabbage; amplifying a target sequence by using the isolated genomic DNA as a template and performing an amplification reaction using the primer set composition of the present invention; and detecting the product of the amplification step; provides a method for determining the genotype of an interspecies cross of Chinese cabbage and cabbage.
본 발명에서 개발된 DNA 마커를 이용하면 종간교잡체의 개발 초기단계에 효율적으로 교배체를 검정하고 유전적으로 안정된 개체를 선발할 수 있으므로, 연구기관에서 종간교잡체에 관한 후속연구의 기초자료 작성 시, 또는 육종회사 등에서 새로운 유채 품종을 종간교잡 방식을 이용하여 개발할 때 활용할 수 있을 것으로 사료된다.When using the DNA marker developed in the present invention, it is possible to efficiently test the hybrid and select genetically stable individuals at the initial stage of the development of interspecies hybrids. It is thought that it can be utilized when developing new rapeseed varieties using interspecies hybridization method, such as , or breeding companies.
도 1A는 본 발명에서 부모로 이용된 배추와 양배추 및 이로부터 얻어진 종간교잡체(F1)의 모습이며, 도 1B는 marker Bro1 및 marker Bro2 세트를 배추, 양배추 및 이들의 종간교잡체(모본: 배추, 부본: 양배추)에 적용한 PCR 산물의 전기영동 결과이고, 도 1C는 marker Bro1을 배추, 양배추 및 이들의 종간교잡체에 적용한 PCR 산물의 전기영동 결과이다.1A is a view of Chinese cabbage and cabbage used as parents in the present invention and an interspecies hybrid (F1) obtained therefrom, and FIG. , sub: cabbage) is the result of electrophoresis of the PCR product, and FIG. 1C is the electrophoresis result of the PCR product applying marker Bro1 to Chinese cabbage, cabbage, and cross-species hybrids thereof.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 배추와 양배추의 종간교배체의 유전형을 판별하기 위한 프라이머 세트 조성물을 제공한다.In order to achieve the object of the present invention, the present invention provides an oligonucleotide primer set of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2; And SEQ ID NO: 3 and an oligonucleotide primer set of SEQ ID NO: 4; provides a primer set composition for determining the genotype of a crossbreeding of Chinese cabbage and cabbage, comprising one or more primer sets selected from the group consisting of.
본 발명의 일 구현 예에 따른 프라이머 세트에 있어서, 상기 2개의 프라이머 세트는 InDel (Insertion/Deletion) 다형성에 기반한 것으로, 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 배추의 BraA01g000530.3C와 양배추의 Bo1g002690.1을 표적하며, 배추에서는 871 bp 크기, 양배추에서는 637 bp 크기의 증폭산물을 생성한다. 또한, 상기 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 배추의 BraA01g002540.3C와 양배추의 Bo1g005950.1을 표적하는 것으로, 배추에서는 884 bp 크기, 양배추에서는 1,194 bp 크기의 증폭산물을 생성한다.In the primer set according to an embodiment of the present invention, the two primer sets are based on the InDel (Insertion/Deletion) polymorphism, and the oligonucleotide primer sets of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 are BraA01g000530.3C of Chinese cabbage and cabbage of Bo1g002690.1, and produces an amplification product with a size of 871 bp in Chinese cabbage and 637 bp in size in cabbage. In addition, the oligonucleotide primer sets of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 target BraA01g002540.3C of Chinese cabbage and Bo1g005950.1 of cabbage, and produce an amplification product of 884 bp size in Chinese cabbage and 1,194 bp in size in cabbage.
본 발명의 프라이머 세트 조성물은 바람직하게는 상기 2개의 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 프라이머 세트를 포함하며, 2개의 프라이머 세트, 즉, 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;를 모두 포함할 수 있다. 2개의 프라이머 세트를 동시에 이용하면 배추와 양배추의 종간교배체의 유전형을 더욱 효율적으로 판별할 수 있다.The primer set composition of the present invention preferably comprises at least one primer set selected from the group consisting of the two primer sets, and comprises two primer sets, that is, an oligonucleotide primer set of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2; and oligonucleotide primer sets of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4; If two primer sets are used at the same time, the genotype of the crossbreeding of Chinese cabbage and cabbage can be more efficiently determined.
상기 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 1 내지 4의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1의 프라이머(21개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 1의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 서열번호 1 내지 4의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.The primer may include an oligonucleotide consisting of a fragment of 16 or more, 17 or more, 18 or more, 19 or more, 20 or more consecutive nucleotides in the sequence of SEQ ID NOs: 1 to 4, depending on the sequence length of each primer. there is. For example, the primer of SEQ ID NO: 1 (21 oligonucleotides) is an oligonucleotide consisting of a fragment of 16 or more, 17 or more, 18 or more, 19 or more, 20 or more consecutive nucleotides in the sequence of SEQ ID NO: 1 may include In addition, the primer may also include an addition, deletion or substitution of the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 1 to 4.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.In the present invention, "primer" refers to a single-stranded oligonucleotide sequence complementary to a nucleic acid strand to be copied, and can serve as a starting point for synthesis of a primer extension product. The length and sequence of the primers should allow synthesis of the extension product to begin. The specific length and sequence of the primer will depend on the conditions of use of the primer, such as temperature and ionic strength, as well as the complexity of the DNA or RNA target required.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.As used herein, the oligonucleotide used as a primer may also contain a nucleotide analogue, for example, a phosphorothioate, an alkylphosphorothioate or a peptide nucleic acid. An intercalating agent may be included.
본 발명의 일 구현 예에 따른 프라이머 세트에 있어서, 상기 배추와 양배추의 종간교배체는 이에 한정되지 않으나, Chiifu-401-42 배추와 TO1000 양배추의 종간교배체일 수 있다.In the primer set according to an embodiment of the present invention, the crossbreeding of Chinese cabbage and cabbage is not limited thereto, but may be a crossbreeding of Chiifu-401-42 Chinese cabbage and TO1000 cabbage.
또한, 본 발명에서 개발된 프라이머 세트는, 배추와 양배추 모두에서 PCR을 통해 증폭이 가능하며, 증폭 산물 간 크기 차이를 보인다. 이를 이용하여 배추와 양배추를 교잡하여 얻어진 종간교배체가 배추와 양배추의 염색체를 모두 포함하고 있는지를 효율적으로 확인할 수 있을 뿐 아니라, 여러 염색체에서 유래한 프라이머 세트를 동시에 이용하여 해당 프라이머가 타겟으로 하는 염색체에서 결실이 일어났는지를 확인할 수도 있다.In addition, the primer set developed in the present invention can be amplified through PCR in both Chinese cabbage and cabbage, and shows a size difference between the amplification products. Using this, it is possible to efficiently check whether an interspecies cross obtained by hybridizing Chinese cabbage and cabbage contains both Chinese cabbage and cabbage chromosomes. It is also possible to check whether a result has occurred in
본 발명은 또한, 상기 프라이머 세트 조성물 및 증폭반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 배추와 양배추의 종간교배체의 유전형을 판별하기 위한 키트를 제공한다.The present invention also provides a kit for determining the genotype of an interspecies cross of Chinese cabbage and cabbage, comprising the primer set composition and a reagent for performing an amplification reaction.
본 발명의 키트에서 상기 프라이머 세트 조성물은 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 것일 수 있으며, 상세한 내용은 전술한 것과 같다.In the kit of the present invention, the primer set composition comprises: an oligonucleotide primer set of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2; and oligonucleotide primer sets of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4; may include one or more primer sets selected from the group consisting of, details are the same as described above.
또한, 본 발명의 키트에서 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.In addition, the reagent for performing the amplification reaction in the kit of the present invention may be DNA polymerase, dNTPs, buffer, etc., but is not limited thereto. In addition, the kit of the present invention may further include a user's guide describing optimal conditions for performing the reaction. A handbook is a printout explaining how to use the kit, eg, how to prepare a PCR buffer, and suggested reaction conditions. Instructions include a brochure in the form of a pamphlet or leaflet, a label affixed to the kit, and instructions on the surface of the package containing the kit. In addition, the guide includes information published or provided through electronic media such as the Internet.
본 발명은 또한,The present invention also
배추와 양배추의 종간교배체 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;isolating genomic DNA from a sample of Chinese cabbage and a crossbreeding of cabbage;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 상기 프라이머 세트 조성물을 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및amplifying a target sequence by using the isolated genomic DNA as a template and performing an amplification reaction using the primer set composition of the present invention; and
상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 배추와 양배추의 종간교배체의 유전형을 판별하는 방법을 제공한다.It provides a method for determining the genotype of an interspecies cross of Chinese cabbage and cabbage, including; detecting the product of the amplification step.
본 발명의 방법에서, 상기 프라이머 세트 조성물은 전술한 것과 같다.In the method of the present invention, the primer set composition is the same as described above.
본 발명의 배추와 양배추의 종간교배체의 유전형을 판별하는 방법은 배추와 양배추의 종간교배체 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 배추와 양배추의 종간교배체 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수도 있고, Wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다.The method for determining the genotype of a Chinese cabbage and a cabbage crossbreed of the present invention includes isolating genomic DNA from a sample of the Chinese cabbage and cabbage crossbreeding. The method for isolating genomic DNA from the crossbreeding sample of Chinese cabbage and cabbage may use a method known in the art, for example, CTAB method may be used, or Wizard prep kit (Promega) may be used. .
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용 가능한 키트를 이용할 수도 있다.A target sequence may be amplified by using the isolated genomic DNA as a template and performing an amplification reaction using the primer set according to an embodiment of the present invention. Methods for amplifying the target nucleic acid include polymerase chain reaction (PCR), ligase chain reaction, nucleic acid sequence-based amplification, and transcription-based amplification system. amplification system), strand displacement amplification or amplification via Qβ replicase, or any other suitable method for amplifying nucleic acid molecules known in the art. Among them, PCR is a method of amplifying a target nucleic acid from a primer pair that specifically binds to the target nucleic acid using a polymerase. Such PCR methods are well known in the art, and commercially available kits may be used.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 전술한 것과 같다.In the method of the present invention, the amplified target sequence may be labeled with a detectable labeling substance. The labeling material may be a material emitting fluorescence, phosphorescence, or radioactivity, but is not limited thereto. Preferably, the labeling substance is Cy-5 or Cy-3. When PCR is performed by labeling Cy-5 or Cy-3 at the 5'-end of the primer during amplification of the target sequence, the target sequence may be labeled with a detectable fluorescent labeling material. In addition, when a radioactive isotope such as 32 P or 35 S is added to a PCR reaction solution for labeling using a radioactive material, the amplification product is synthesized and radioactivity is incorporated into the amplification product, so that the amplification product can be radioactively labeled. The oligonucleotide primer set used to amplify the target sequence is the same as described above.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 배추와 양배추의 종간교배체의 유전형을 판별하는 방법은 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 증폭 단계 산물의 검출은 겔 전기영동, DNA 칩, 모세관 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.In one embodiment of the present invention, the method for determining the genotype of an interspecies cross of Chinese cabbage and cabbage includes detecting a product of the amplification step, and the detection of the product of the amplification step is gel electrophoresis, a DNA chip , capillary electrophoresis, radiometric measurement, fluorescence measurement, or phosphorescence measurement, but is not limited thereto. As one of the methods for detecting the amplification product, gel electrophoresis may use agarose gel electrophoresis or acrylamide gel electrophoresis depending on the size of the amplification product. In addition, capillary electrophoresis can be performed. Capillary electrophoresis may use, for example, an ABi Sequencer. In addition, in the fluorescence measurement method, when PCR is performed by labeling the 5'-end of the primer with Cy-5 or Cy-3, the target sequence is labeled with a detectable fluorescent labeling material, and the labeled fluorescence is measured using a fluorescence meter. can do. In addition, the radioactive measurement method is a radioactive isotope such as 32 P or 35 S added to the PCR reaction solution during PCR to label the amplification product, and then a radioactive measuring instrument, for example, a Geiger counter (Geiger counter) or liquid scintillation Radioactivity can be measured using a liquid scintillation counter.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of Examples. However, the following examples only illustrate the present invention, and the content of the present invention is not limited to the following examples.
실시예 1. 분자마커의 제작 및 검증Example 1. Preparation and verification of molecular markers
Syntenic orthlog 탐색 프로그램(Synorth_V1.0; http://synorth.genereg.net/)을 이용하여 배추 Chiifu-401-42 (http://brassicadb.cn/)와 양배추 TO1000의 유전체 염기서열을 비교하여, 배추와 양배추 간의 이종상동유전자(ortholog) 31,320개를 선발하였다. 이 중 유전자의 길이 차이가 150 bp에서 200 bp 사이인 유전자 1,206개를 선별하였다. 선별된 이종상동유전자들의 coding sequence를 이용하여 Clustal W 프로그램을 이용한 서열정렬을 수행하여, 배추와 양배추 두 종을 공통적으로 증폭할 수 있으면서 내부에 InDel이 포함되어 증폭 산물의 크기에 차이가 날 것으로 예상되는 PCR 프라이머 세트를 제작하였다. 상기 제작된 프라이머 세트를 이용하여 배추와 양배추의 게노믹 DNA를 시료로 PCR을 수행하여여, 두 종을 구별할 수 있는 프라이머 세트를 선별하였다(표 1).By using the Syntenic orthlog search program (Synorth_V1.0; http://synorth.genereg.net/) to compare the genome sequences of Chinese cabbage Chiifu-401-42 (http://brassicadb.cn/) and cabbage TO1000, 31,320 orthologs between Chinese cabbage and cabbage were selected. Among them, 1,206 genes with a difference in gene length between 150 bp and 200 bp were selected. By performing sequence alignment using the Clustal W program using the coding sequence of the selected orthologous genes, it is possible to amplify both cabbage and cabbage in common, and it is expected that the size of the amplification product will be different because InDel is included inside. A PCR primer set was prepared. Using the prepared primer set, PCR was performed on the genomic DNA of Chinese cabbage and cabbage to select a primer set capable of distinguishing the two species (Table 1).
실시예 2. 분자마커를 이용한 종간교배체의 유전형 분석Example 2. Genotyping analysis of crossbreeds using molecular markers
상기 실시예 1을 통해 선발된 분자마커(표 1)를 이용하여 부모로 이용된 배추와 양배추, 이로부터 얻어진 두 가지 종간교잡체에서 PCR을 수행한 결과는 도 1B와 같다. 상기 결과는 예측한 크기의 증폭산물이 나타남과 동시에 배추와 양배추의 유전형을 명확히 구별할 수 있었다. 이에, 상기 분자마커를 이용하여 배추를 모본으로 교잡한 15개 개체와, 양배추를 모본으로 교잡한 6개 개체(도 1C의 첫째 줄의 첫 번째, 세 번째, 다섯 번째, 여섯 번째와 둘째 줄의 첫 번째, 세 번째)의 유전형을 모두 검정하였고, 21개 개체에서 배추와 양배추의 염색체를 포함하고 있음을 확인할 수 있었다(도 1C).Figure 1B shows the results of PCR on Chinese cabbage and cabbage used as parents using the molecular markers (Table 1) selected in Example 1, and two interspecies hybrids obtained therefrom. As a result, the amplification product of the predicted size appeared, and at the same time, the genotypes of Chinese cabbage and cabbage could be clearly distinguished. Accordingly, 15 individuals hybridized with cabbage as a pattern using the molecular marker and 6 individuals hybridized with cabbage as a pattern (the first, third, fifth, sixth and second lines of the first row of FIG. 1C) The genotypes of the first and third) were all tested, and it was confirmed that the chromosomes of Chinese cabbage and cabbage were included in 21 individuals (FIG. 1C).
본 발명의 2개의 분자마커는 모두 특정한 형질과 연관되어 있는 것은 아니지만, 교배 후에 자라난 식물체가 진정 종간교배를 통해 만들어진 것인지, 아니면 모본의 자가수정이나 다른 화분에 의한 오염으로 인해 발생한 개체는 아닌지에 대한 확인에 사용될 수 있다. 즉, 도 1B 및 도 1C의 종간교배체(F1) 시료가 모본의 자가수정에 의한 것이었다면 부본 특이적인 증폭산물이 확인되지 않게 된다.Both molecular markers of the present invention are not related to specific traits, but whether the plant grown after mating is truly made through interspecies crossbreeding, or whether it is an individual caused by self-fertilization of the parent or contamination by other pollen. can be used to confirm That is, if the interspecies hybrid (F1) sample of FIGS. 1B and 1C was by self-fertilization of the parent, no copy-specific amplification product was identified.
종합하면, 본 발명의 분자마커는 배추와 양배추를 교잡하여 얻어진 종간교배체가 배추와 양배추의 염색체를 모두 포함하고 있는지를 효율적으로 확인할 수 있을 뿐 아니라, 여러 염색체에서 유래한 프라이머 세트를 동시에 이용하여 해당 마커가 타겟으로 하는 염색체에서 결실이 일어났는지 여부를 확인할 수도 있다.Taken together, the molecular marker of the present invention can efficiently determine whether an interspecies cross obtained by hybridizing Chinese cabbage and cabbage contains both the Chinese cabbage and cabbage chromosomes, and can also be used simultaneously with primer sets derived from multiple chromosomes. It is also possible to determine whether a deletion has occurred in the chromosome targeted by the marker.
<110> Seoul National University R&DB Foundation <120> DNA marker for discriminating genotype of Brassica rapa, Brassica oleracea and their interspecific hybrid and uses thereof <130> PN21260 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gacaagtggc tccaatgcct c 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 tgcatccacc tgaacaccta c 21 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 cgtccatgtt ctctcccgtc 20 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gtgggtttcc cgctttgtc 19 <110> Seoul National University R&DB Foundation <120> DNA marker for discriminating genotype of Brassica rapa, Brassica oleracea and their interspecific hybrid and uses thereof <130> PN21260 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gacaagtggc tccaatgcct c 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 tgcatccacc tgaacaccta c 21 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 cgtccatgtt ctctcccgtc 20 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gtgggtttcc cgctttgtc 19
Claims (5)
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 프라이머 세트 조성물을 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 배추와 양배추의 종간교배체의 유전형을 판별하는 방법.isolating genomic DNA from a sample of Chinese cabbage and a crossbreeding of cabbage;
amplifying a target sequence by using the isolated genomic DNA as a template and performing an amplification reaction using the primer set composition of claim 1; and
Detecting the product of the amplification step; A method for determining the genotype of an interspecies cross of Chinese cabbage and cabbage, including.
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