KR102332689B1 - Molecular marker based on mitochondrial genome sequence for discriminating Panax ginseng 'GeumJin' and 'SeonHyang' cultivar and uses thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 인삼 '금진' 및 '선향' 품종을 구별하기 위한 미토콘드리아 게놈 서열 기반 분자마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 InDel 분자마커는 다양한 국내인삼 품종 중에서 '금진' 및 '선향' 품종만을 신속·정확하게 구별할 수 있으므로, 인삼 품종의 육종 및 개발과 한약재로 가공되어 유통되는 과정에서 명확히 판별하여 원료의 혼용 방지 및 원료 품질 관리에 대한 지표로서 유용하게 활용될 수 있을 것이다.The present invention relates to a mitochondrial genome sequence-based molecular marker for differentiating 'Geumjin' and 'Seonhyang' cultivars of ginseng and its use. Since it can be distinguished quickly and accurately, it can be clearly identified in the process of breeding and developing ginseng varieties and processing and distributing oriental medicines, so that it can be usefully used as an indicator for prevention of mixing of raw materials and quality control of raw materials.
Description
본 발명은 14개의 인삼 품종으로부터 인삼 '금진' 및 '선향' 품종을 구별하기 위한 미토콘드리아 게놈 서열 기반 분자마커 및 이의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to a mitochondrial genome sequence-based molecular marker for distinguishing 'Geumjin' and 'Seonhyang' cultivars of ginseng from 14 ginseng cultivars and their use.
고려인삼 (Panax ginseng)은 아시아 극동지방에서 자생하는 대표적 약용식물로, 자생지 분포 형태가 우리나라의 삼국시대에 고구려의 영토 및 한반도와 일치하며, 고대의 많은 문헌 기록에서 볼 수 있듯 그 전통이 깊고 역사적으로 명성이 높으며, 전통적으로 국제 인삼 시장에서 고려인삼의 가치와 품질이 고가로 인정되는 바, 한국이 인삼의 종주국이라고 할 수 있다. 인삼의 육종은 채종까지 3년, 생육상과 뿌리의 형질 등을 조사하여 우량개체를 선발하는데 5~6년의 기간이 소요되는 등의 특수성으로 인해 우수 품종의 육성까지 수십 년이 걸리는 어려움이 있다.Korean ginseng (Panax ginseng) is a representative medicinal plant that grows wild in the Far East of Asia, and its distribution form matches the territory of Goguryeo and the Korean Peninsula during the Three Kingdoms Period of Korea. Korean ginseng is traditionally recognized for its high value and quality in the international ginseng market, so Korea can be said to be the birthplace of ginseng. Ginseng breeding is difficult because it takes several decades to cultivate excellent varieties due to the peculiarities that it takes 3 years to harvest and 5 to 6 years to select good individuals by examining growth patterns and root traits.
이러한 난관 속에서도 한국인삼연초연구원으로부터 순계 분리 육종을 통해 천풍, 연풍, 고풍, 금풍, 선풍, 선운, 선원, 선향, 청선 등의 다양한 품종이 개발되어 등록되어 있으나, 생육과 증식속도가 느리고 종자의 증식량이 낮은 인삼의 생식 특성으로 인해 종자 생산체계가 제대로 확립되지 못하여 우수 품종이 실제 농가에 보급되는 비율은 미미한 실정이다. 또한 육성된 우수 품종들 간의 식별 방법과 기존의 재래 혼계종과의 식별 방법은 생육과정 중에 경험적인 형태적 관찰을 통해서만 이루어지고 있기 때문에 보다 체계적이고 과학적인 기술이 요구되는 실정이다.Despite these difficulties, various varieties such as Cheonpung, Yeonpung, Gopoung, Geumpung, Seonpung, Seonun, Seonwon, Seonhyang, and Cheongseon have been developed and registered by the Korea Ginseng and Tobacco Research Institute through pure breeding. Due to the reproductive characteristics of ginseng with a low yield, the seed production system has not been properly established, so the rate at which excellent varieties are actually distributed to farms is insignificant. In addition, a more systematic and scientific technique is required because the identification method between cultivated excellent breeds and the existing hybrid breeding method is performed only through empirical morphological observation during the growth process.
형태적으로 구분하는 방법에 있어서도, 파종 후 많은 시간이 지나서야 식별이 가능하기 때문에 이를 악용하여 재래 혼계종의 종자를 개발된 품종의 종자로 둔갑하여 비싼 값에 판매하는 행위가 일어나고 있으며, 이로 인한 농가의 피해가 증가하리라 예상되고 있다. 개발된 품종들에 있어서도 품종 간 식별이 어려운 단점 및 증식 과정의 비의도적 오염과 혼입 등에 의해 품종의 균일도가 현저히 낮아 명품 인삼을 생산하는데 장애 요인으로 지적되고 있다. 또한, 6년에 걸쳐 생산한 생산품은 뿌리 부위만 유통이 되기 때문에 우수한 품종의 생산품과 우수하지 않은 품종 및 재래 혼계종의 식별이 생육 단계가 아닌 생산품에서 가능하여야 하는데 이에 대한 기반 기술은 거의 없는 상태이며 이를 위한 최선의 방법은 품종을 DNA 수준에서 식별할 수 있는 마커의 활용이다.As for the morphological classification method, since it is possible to identify only after a lot of time has passed after sowing, there is an act of disguising the seeds of a conventional hybrid breed as seeds of a developed breed and selling them at a high price. damage is expected to increase. Even in the developed varieties, it is pointed out as an obstacle to the production of premium ginseng due to the disadvantage of difficult identification between varieties and the remarkably low uniformity of varieties due to unintentional contamination and mixing in the process of propagation. In addition, since products produced over 6 years are distributed only in the root part, it should be possible to distinguish between excellent varieties and non-excellent varieties and native hybrids in products that are not at the growth stage. And the best way to do this is to use a marker that can identify the cultivar at the DNA level.
최근 분자생물학 분야의 급진적인 발전과 더불어 식물의 속, 종간 또는 종 내 품종 간 분류에 분자생물학적인 방법들이 다양하게 사용되고 있으며, 이를 위해 DNA 수준에서 유전자원의 다양성 연구를 가능하게 하는 다양한 DNA 마커들이 개발되고 있다. 분자생물학 수준에서의 DNA 분석에 의한 감별은 양적 수준과 더불어 다수의 특성을 파악할 수 있으며 환경의 영향을 배제할 수 있는 장점이 있다. 근래에 발달한 차세대염기서열분석(next generation sequencing, NGS) 기술을 통해 DNA 정보를 비교하여 차이점을 찾아내고, 이를 활용한 분자마커 개발은 인삼 품종의 정확한 구별을 가능하게 한다. 유전체 정보에 근거한 여러 가지 형태의 분자마커 중 InDel(Insertion/Deletion) 마커는 PCR(polymerase chain reaction) 기술을 이용하여 다형성을 검출하는 방법으로 비교적 간단한 방법으로 신속한 결과를 얻을 수 있는 방법이다. InDel 마커는 염기서열에서 삽입(insertion)되거나 결실(deletion)된 염기서열의 차이를 이용하는 것으로 종간뿐만 아니라 종내에서도 다양한 유전형으로 존재하여 품종 구분에 적합한 분자마커이다.With the recent radical development in the field of molecular biology, a variety of molecular biological methods are being used to classify plant genus, interspecies, or within species. is being developed Differentiation by DNA analysis at the molecular biology level has the advantage of being able to grasp a number of characteristics along with a quantitative level and excluding the influence of the environment. Through the recently developed next generation sequencing (NGS) technology, DNA information is compared to find differences, and molecular marker development using this technology enables accurate differentiation of ginseng varieties. Among the various types of molecular markers based on genomic information, the InDel (Insertion/Deletion) marker is a method for detecting polymorphisms using PCR (polymerase chain reaction) technology. InDel markers are molecular markers suitable for breed classification because they exist in various genotypes not only between species but also within species by using the difference in the nucleotide sequence inserted or deleted from the nucleotide sequence.
한편, 한국등록특허 제1607562호에 인삼 핵 게놈 서열 내 '단일염기다형성을 이용한 고려인삼 G-1 품종 선별방법'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1481723호에 인삼 핵 게놈 서열 내 SNP에 기반한 '고려인삼 K-1 품종 선별용 프라이머 세트 및 이를 이용한 K-1 품종 선별방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 인삼 '금진' 및 '선향' 품종을 구별하기 위한 미토콘드리아 게놈 서열 기반 분자마커 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.On the other hand, Korea Patent No. 1607562 discloses a 'Korean ginseng G-1 variety selection method using single nucleotide polymorphism' in the ginseng nuclear genome sequence, and Korean Patent No. 1481723 discloses a 'based on SNPs in the ginseng nuclear genome sequence' Although a primer set for selecting Korean ginseng K-1 varieties and a K-1 variety selection method using the same have been disclosed, a molecular marker based on the mitochondrial genome sequence and uses thereof for distinguishing the 'Geumjin' and 'Seonhyang' varieties of ginseng of the present invention There is nothing described about
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자는 14개의 인삼 품종의 미토콘드리아 게놈 서열을 비교하여 InDel(insertion/deletion) 다형성을 보이는 염기서열에 기반한 프라이머 세트를 제작한 후, 상기 프라이머 세트를 이용하여 14개의 인삼 품종을 대상으로 PCR을 수행한 결과, 본 발명의 프라이머 세트가 'K-1, 선운, 금선, 청선, 천량, 선원, 고원, 연풍, 선풍, 금풍, 고풍, 천풍, 금진 및 선향' 품종으로부터 '금진'과 '선향' 품종을 정확하게 구별할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.The present invention was derived from the above needs, and the present inventors compared the mitochondrial genome sequences of 14 ginseng varieties to prepare a primer set based on a nucleotide sequence showing InDel (insertion/deletion) polymorphism, and then the primer set As a result of performing PCR on 14 ginseng varieties using and Seonhyang' varieties, 'Geumjin' and 'Seonhyang' varieties can be accurately distinguished from the varieties, thereby completing the present invention.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 인삼 '금진' 및 '선향' 품종 구별용 프라이머 세트를 제공한다.In order to solve the above problems, the present invention provides a primer set for distinguishing ginseng 'Geumjin' and 'Seonhyang' varieties including the oligonucleotide primer sets of SEQ ID NOs: 1 and 2.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 인삼 '금진' 및 '선향' 품종 구별용 키트를 제공한다.In addition, the present invention provides a kit for distinguishing ginseng 'Geumjin' and 'Seonhyang' varieties including the primer set.
또한, 본 발명은 인삼 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 인삼 '금진' 및 '선향' 품종을 구별하는 방법을 제공한다.In addition, the present invention comprises the steps of isolating genomic DNA from a ginseng sample; amplifying a target sequence by using the isolated genomic DNA as a template and performing an amplification reaction using the primer set; and detecting the product of the amplification step; provides a method for distinguishing ginseng 'Geumjin' and 'Seonhyang' varieties, including.
본 발명의 InDel 분자마커는 다양한 국내인삼 품종 중에서 '금진'과 '선향' 품종만을 신속·정확하게 구별할 수 있으므로, 인삼 품종의 육종 및 개발과 한약재로 가공되어 유통되는 과정에서 명확히 판별하여 원료의 혼용 방지 및 원료 품질 관리에 대한 지표로서 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.Since the InDel molecular marker of the present invention can quickly and accurately distinguish only 'Geumjin' and 'Seonhyang' varieties among various domestic ginseng varieties, it is clearly identified in the process of breeding and development of ginseng varieties and processing and distribution as oriental medicines and mixing of raw materials. It is expected to be usefully utilized as an indicator for prevention and quality control of raw materials.
도 1은 본 발명의 Pg-MT-InDel12 프라이머 세트(표 1)를 이용하여 14개의 인삼 품종의 PCR 증폭산물을 겔 전기영동한 결과이다. 1 is a gel electrophoresis result of PCR amplification products of 14 ginseng varieties using the Pg-MT-InDel12 primer set (Table 1) of the present invention.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 인삼 '금진' 및 '선향' 품종 구별용 프라이머 세트를 제공한다.In order to achieve the object of the present invention, the present invention provides a primer set for distinguishing ginseng 'Geumjin' and 'Seonhyang' varieties comprising the oligonucleotide primer sets of SEQ ID NOs: 1 and 2.
본 발명의 상기 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라 서열번호 1 및 2의 서열 내의 13개 이상, 14개 이상, 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상의 연속 뉴클레오드티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1의 프라이머(18개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 1의 서열 내의 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 증폭 부위에 결합할 수 있는, 서열번호 1 및 2의 각 염기서열에서 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다. 상기 서열번호 중 홀수 번호의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 정방향 프라이머이며, 짝수 번호의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 역방향 프라이머이다.The primer of the present invention is an oligo consisting of fragments of 13 or more, 14 or more, 15 or more, 16 or more, 17 or more consecutive nucleotides in the sequences of SEQ ID NOs: 1 and 2 according to the sequence length of each primer. nucleotides. For example, the primer of SEQ ID NO: 1 (18 oligonucleotides) may include an oligonucleotide consisting of fragments of 15 or more, 16 or more, 17 or more consecutive nucleotides in the sequence of SEQ ID NO: 1. In addition, the primer may also include a sequence added, deleted, or substituted in each of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 and 2, capable of binding to the amplification site. The odd-numbered oligonucleotide primers in the SEQ ID NO: are forward primers, and the even-numbered oligonucleotide primers are reverse primers.
본 발명에 따른 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 인삼의 핵 게놈 상에 위치하는 InDel 마커를 증폭할 수 있는 프라이머 세트로, 인삼 품종 'K-1, 선운, 금선, 청선, 천량, 선원, 고원, 연풍, 선풍, 금풍, 고풍, 천풍, 금진 및 선향' 중에서 '금진' 및 '선향' 품종을 다른 인삼 품종으로부터 구별할 수 있는 프라이머 세트이다.The oligonucleotide primer sets of SEQ ID NOs: 1 and 2 according to the present invention are primer sets capable of amplifying the InDel marker located on the nuclear genome of ginseng. , Gowon, Yeonpung, Seonpung, Geumpung, Gopung, Cheonpung, Geumjin and Seonhyang' is a primer set that can distinguish 'Geumjin' and 'Seonhyang' cultivars from other ginseng cultivars.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.In the present invention, "primer" refers to a single-stranded oligonucleotide sequence complementary to a nucleic acid strand to be copied, and can serve as a starting point for synthesis of a primer extension product. The length and sequence of the primers should allow synthesis of the extension product to begin. The specific length and sequence of the primer will depend on the conditions of use of the primer, such as temperature and ionic strength, as well as the complexity of the DNA or RNA target required.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.In the present specification, the oligonucleotide used as a primer may contain or insert a nucleotide analogue, for example, a phosphorothioate, an alkylphosphorothioate or a peptide nucleic acid. It may contain an intercalating agent.
본 발명은 또한, 상기 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 인삼 '금진' 및 '선향' 품종 구별용 키트를 제공한다.The present invention also provides a kit for distinguishing ginseng 'Geumjin' and 'Seonhyang' varieties comprising the oligonucleotide primer sets of SEQ ID NOs: 1 and 2.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 키트는 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 추가로 포함할 수 있고, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In one embodiment of the present invention, the kit may further include a reagent for performing the amplification reaction, and the reagent for performing the amplification reaction may include DNA polymerase, dNTPs and a buffer, but this not limited
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 키트는 또한 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, 역전사 완충액 및 PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.In one embodiment of the present invention, the kit may further include a user guide describing optimal conditions for performing the reaction. The handbook is a printout explaining how to use the kit, eg, how to prepare reverse transcription buffer and PCR buffer, and suggested reaction conditions. Instructions include a brochure in the form of a pamphlet or leaflet, a label affixed to the kit, and instructions on the surface of the package containing the kit. In addition, the guide includes information published or provided through electronic media such as the Internet.
본 발명은 또한, The present invention also
인삼 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;isolating genomic DNA from the ginseng sample;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및amplifying a target sequence by using the isolated genomic DNA as a template and performing an amplification reaction using the oligonucleotide primer sets of SEQ ID NOs: 1 and 2; and
상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 인삼 '금진' 및 '선향' 품종을 구별하는 방법을 제공한다.Detecting the product of the amplification step; provides a method for distinguishing ginseng 'Geumjin' and 'Seonhyang' varieties, including.
본 발명의 방법은 인삼 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할수도 있고, Wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.The method of the present invention includes isolating genomic DNA from a ginseng sample. The method for isolating the genomic DNA may use a method known in the art, for example, the CTAB method may be used, or a Wizard prep kit (Promega) may be used. The target sequence may be amplified by performing an amplification reaction using the isolated genomic DNA as a template and using the oligonucleotide primer set according to an embodiment of the present invention as a primer. Methods for amplifying a target nucleic acid include a polymerase chain reaction (PCR), a ligase chain reaction, a nucleic acid sequence-based amplification, and a transcription-based amplification system. amplification system), strand displacement amplification or amplification via Qβ replicase, or any other suitable method for amplifying nucleic acid molecules known in the art. Among them, PCR is a method of amplifying a target nucleic acid from a primer pair that specifically binds to the target nucleic acid using a polymerase. Such PCR methods are well known in the art, and commercially available kits may be used.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 전술한 것과 같다.In one embodiment of the present invention, the amplified target sequence may be labeled with a detectable labeling substance. The labeling material may be a material emitting fluorescence, phosphorescence, or radioactivity, but is not limited thereto. Preferably, the labeling substance is Cy-5 or Cy-3. When PCR is performed by labeling Cy-5 or Cy-3 at the 5'-end of the primer during amplification of the target sequence, the target sequence may be labeled with a detectable fluorescent labeling material. In addition, when a radioactive isotope such as 32 P or 35 S is added to a PCR reaction solution for labeling using a radioactive material, the amplification product is synthesized and radioactivity is incorporated into the amplification product, so that the amplification product can be radioactively labeled. The oligonucleotide primer sets used to amplify the target sequence are as described above.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 인삼 '금진' 및 '선향' 품종을 구별하기 위한 방법은 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 증폭 단계 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.In one embodiment of the present invention, the method for distinguishing between 'Geumjin' and 'Seonhyang' cultivars of ginseng comprises detecting a product of the amplification step, and the detection of the product of the amplification step is a DNA chip, gel electric It may be carried out through electrophoresis, capillary electrophoresis, radiometric measurement, fluorescence measurement or phosphorescence measurement, but is not limited thereto. As one of the methods for detecting the amplification product, capillary electrophoresis may be performed. Capillary electrophoresis may use, for example, an ABi Sequencer. In addition, gel electrophoresis can be performed, and agarose gel electrophoresis or acrylamide gel electrophoresis can be used for gel electrophoresis depending on the size of the amplification product. In addition, in the fluorescence measurement method, when PCR is performed by labeling the 5'-end of the primer with Cy-5 or Cy-3, the target sequence is labeled with a detectable fluorescent labeling material, and the labeled fluorescence is measured using a fluorometer. can do. In addition, the radioactive measurement method is a radioactive isotope such as 32 P or 35 S is added to the PCR reaction solution during PCR to label the amplification product, and then a radioactive measuring instrument, for example, a Geiger counter (Geiger counter) or liquid scintillation The radioactivity can be measured using a liquid scintillation counter.
본 발명의 일 구현 예에 따른 인삼 '금진' 및 '선향' 품종을 구별하는 방법에 있어서, 상기 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 인삼 게놈 DNA를 주형으로 PCR을 수행한 경우, 343 bp 크기의 밴드가 검출되면 '금진'과 '선향' 품종으로 판별할 수 있고, 269 bp 크기의 밴드가 검출되면 'K-1, 선운, 금선, 청선, 천량, 선원, 고원, 연풍, 선풍, 금풍, 고풍 또는 천풍' 품종으로 판별할 수 있다. In the method for distinguishing ginseng 'Geumjin' and 'Seonhyang' varieties according to an embodiment of the present invention, when PCR is performed using ginseng genomic DNA as a template using the oligonucleotide primer sets of SEQ ID NOs: 1 and 2, When a band with a size of 343 bp is detected, it can be distinguished into 'Geumjin' and 'Seonhyang' varieties, and when a band with a size of 269 bp is detected, 'K-1, Seonun, Geumseon, Cheongseon, Cheonryang, Seonwon, Gowon, Yeonpung, Seonpung' , Geumpung, Gopoong, or Cheonpung' varieties can be distinguished.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of Examples. However, the following examples are merely illustrative of the present invention, and the content of the present invention is not limited to the following examples.
재료 및 방법Materials and Methods
1. 인삼의 자원수집 및 게놈 DNA 추출1. Ginseng resource collection and genomic DNA extraction
실험에 사용된 총 14개의 인삼 품종 'K-1, 금진, 선운, 금선, 청선, 선향, 천량, 선원, 고원, 연풍, 선풍, 금풍, 고풍 및 천풍'은 농촌진흥청에서 잎 형태로 제공받았으며, -70℃의 초저온 냉동고에 보관하였다. DNA 추출은 액체질소로 어린 잎 시료를 급속 냉각하고 막자사발을 이용하여 분쇄한 후 Biomedic사의 plant gDNA Extraction kit를 사용하여 추출하였다.A total of 14 ginseng varieties 'K-1, Geumjin, Seonun, Geumseon, Cheongseon, Seonhyang, Cheonryang, Seonwon, Gowon, Yeonpung, Seonpung, Geumpung, Gopung and Cheonpung' used in the experiment were provided in leaf form by the Rural Development Administration. It was stored in a cryogenic freezer at -70°C. DNA extraction was performed by rapidly cooling young leaf samples with liquid nitrogen and pulverizing them using a mortar, followed by extraction using a plant gDNA Extraction kit from Biomedic.
2. InDel 마커 개발2. InDel Marker Development
상기 추출된 14개의 인삼 품종의 게놈 DNA를 대상으로 NGS(Next Generation Sequencing) 분석을 실시하여 인삼 품종들의 DNA 염기서열 정보를 획득한 후 상기 인삼 품종들의 염기서열을 CLC genomics workbench 프로그램(version 8.0.1)을 통해 비교·분석을 수행하여, 'K-1, 선운 금선, 청선, 천량, 선원, 고원, 연풍, 선풍, 금풍, 고풍 및 천풍' 품종과 '금진' 및 '선향' 품종 간의 삽입(insertion) 또는 결실(deletion)의 차이를 보이는 InDel 다형성 영역을 탐색하였고, 상기 InDel 다형성 영역을 증폭하기 위한 프라이머 세트를 제작하였다(표 1). 프라이머 세트는 최대 길이, 최소 길이, 증폭 산물의 크기, 온도, GC 비율 등의 조건을 조절하여 제작되었다. After obtaining DNA sequence information of the ginseng varieties by performing NGS (Next Generation Sequencing) analysis on the genomic DNA of the 14 extracted ginseng varieties, the CLC genomics workbench program (version 8.0.1) ) through comparison and analysis, inserting between 'K-1, Seonun Geumseon, Cheongseon, Cheonryang, Seonwon, Gowon, Yeonpung, Seonpung, Geumpung, Gopung and Cheonpung' varieties and 'Geumjin' and 'Seonhyang' varieties. ) or deletion (deletion) was searched for an InDel polymorphic region, and a primer set for amplifying the InDel polymorphic region was prepared (Table 1). The primer set was prepared by controlling conditions such as the maximum length, the minimum length, the size of the amplification product, the temperature, and the GC ratio.
본 발명의 InDel 마커는 MZ389476(NCBI GenBank)의 nad1 및 nad 5 유전자 위치에서 '금진'과 '선향' 품종의 게놈 서열에서 74 bp 염기가 삽입된 다형성 영역에 기반하여 제작된 것이다. 상기 nad1 및 nad 5 유전자는 겹쳐져 있고, 두 유전자 모두 넓게 분포되어 있기 때문에 본 발명의 InDel 마커 증폭용 프라이머 세트는 nad1 및 nad 5 유전자를 표적으로 하고 있다. The InDel marker of the present invention was constructed based on a polymorphic region in which 74 bp bases were inserted in the genomic sequence of 'Geumjin' and ' Seonhyang ' at the nad1 and nad 5 gene positions of MZ389476 (NCBI GenBank). Since the nad1 and nad 5 genes overlap and both genes are widely distributed, the primer set for amplifying the InDel marker of the present invention targets the nad1 and nad 5 genes.
3. 중합효소연쇄반응(PCR)을 이용한 DNA 증폭3. DNA amplification using polymerase chain reaction (PCR)
상기 추출된 인삼 품종별 게놈 DNA를 10 ng/㎕로 희석하여 DNA 2 ㎕(DNA 10 ng), InDel marker 2 ㎕(forward primer 1 ㎕, reverse primer 1 ㎕), Taq mixture 10 ㎕, 증류수 6 ㎕을 혼합하여 총 20 ㎕의 PCR 반응 혼합물을 만들었다. PCR은 전변성(pre-denaturation) 95℃ 5분; 변성(denaturation) 95℃ 30초, 결합(annealing) 52℃ 30초, 신장(extension) 72℃ 1분의 과정을 총 34회 반복; 최종 신장(final extension) 72℃ 10분의 조건으로 수행하였다. PCR 증폭 산물은 3% 아가로스 겔에서 전기영동하여 확인하였다.The extracted genomic DNA for each ginseng variety was diluted to 10 ng/μl, and 2 μl of DNA (10 ng of DNA), 2 μl of InDel marker (1 μl of forward primer, 1 μl of reverse primer), 10 μl of Taq mixture, and 6 μl of distilled water were added. The mixture was mixed to make a total of 20 μl of the PCR reaction mixture. PCR was pre-denatured at 95°C for 5 minutes; A total of 34 cycles of denaturation at 95° C. for 30 seconds, annealing at 52° C. for 30 seconds, and extension at 72° C. for 1 minute; Final extension (final extension) was performed under the conditions of 72 ℃ 10 minutes. PCR amplification products were confirmed by electrophoresis on a 3% agarose gel.
실시예 1. 본 발명의 InDel 마커를 이용한 인삼 '선향' 품종의 구별Example 1. Identification of 'Seonhyang' cultivar of ginseng using the InDel marker of the present invention
인삼 품종 간의 InDel 다형성에 기반하여 제작된 Pg-MT-InDel12 프라이머 세트(표 1)를 이용하여 다양한 인삼 품종들의 DNA 시료를 주형으로 하여 PCR을 수행한 후 아가로스 겔에 전기영동하여 Pg-MT-InDel12 프라이머 세트의 다형성 패턴 분석을 수행하였다.PCR was performed using DNA samples of various ginseng cultivars as a template using the Pg-MT-InDel12 primer set (Table 1) prepared based on the InDel polymorphism between ginseng cultivars, and then electrophoresed on an agarose gel to Pg-MT- Polymorphic pattern analysis of the InDel12 primer set was performed.
그 결과, 인삼 '금진'과 '선향' 품종에서는 343 bp의 밴드가 확인되었고, 나머지 'K-1, 선운, 금선, 청선, 천량, 선원, 고원, 연풍, 선풍, 금풍, 고풍 및 천풍' 품종에서는 269 bp의 밴드가 확인되어, 'K-1, 선운, 금선, 청선, 천량, 선원, 고원, 연풍, 선풍, 금풍, 고풍, 천풍, 금진 및 선향'을 포함하는 인삼 품종으로부터 '금진'과 '선향' 품종을 특이적으로 구별하는 것이 가능함을 확인하였다(도 1).As a result, a band of 343 bp was identified in the ginseng cultivars 'Geumjin' and 'Seonhyang', and the remaining 'K-1, Seonun, Geumseon, Cheongseon, Cheonryang, Seonwon, Gowon, Yeonpung, Seonpung, Geumpung, Gopung and Cheonpung' cultivars were identified. A band of 269 bp was identified in 'Geumjin' and 'Geumjin' and It was confirmed that it is possible to specifically distinguish the 'Seonhyang' variety (FIG. 1).
<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Molecular marker based on mitochondrial genome sequence for discriminating Panax ginseng 'GeumJin' and 'SeonHyang' cultivar and uses thereof <130> PN21296 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gggggatctt tccgtttt 18 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 cgagcccctt tttcttttt 19 <110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Molecular marker based on mitochondrial genome sequence for discriminating Panax ginseng 'GeumJin' and 'SeonHyang' cultivar and uses it <130> PN21296 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gggggatctt tccgtttt 18 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 cgagcccctt tttcttttt 19
Claims (4)
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 인삼 '금진' 및 '선향' 품종을 구별하는 방법.isolating genomic DNA from the ginseng sample;
amplifying a target sequence by using the isolated genomic DNA as a template and performing an amplification reaction using the primer set of claim 1; and
A method for distinguishing between 'Geumjin' and 'Seonhyang' varieties of ginseng comprising; detecting the product of the amplification step.
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