KR20220047970A - 알츠하이머병의 치료를 위한 비강내 단트롤렌 투여 - Google Patents

알츠하이머병의 치료를 위한 비강내 단트롤렌 투여 Download PDF

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거 리앙
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Abstract

알츠하이머병(AD)이 있거나 또는 있는 것으로 의심되는 대상체의 뉴런에서 손상된 신경발생 및/또는 시냅스생성을 저해하는 방법, 신경병리 및 인지기능장애가 AD에 의해 유발되는 신경병리 및 인지기능장애의 발병 후 인지 기능의 저하를 개선하고/하거나 늦추는 방법, AD의 증상의 발병 전에 기억력의 저하를 개선하고/하거나 늦추는 방법, 뇌에서 단트롤렌의 농도 및 지속시간을 증가시키는 방법 및 기억력 AD의 증상의 발병 후 기억력의 저하를 개선하고/하거나 늦추는 방법으로서, 방법은 N-메틸-D-아스파테이트(NMDA) 수용체 및/또는 리아노딘 수용체(RyR)의 과활성화를 저해하는데 효과적인 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물의 양을 이를 필요로 하는 대상체에게 비강내로 투여하는 단계를 포함한다. 방법은 치료적 유효량의 글루타메이트 수용체 길항제를 대상체에게 투여하는 단계를 더 포함한다.

Description

알츠하이머병의 치료를 위한 비강내 단트롤렌 투여
관련 출원에 대한 상호참조
본 발명은 2019년 6월 28일자로 출원된 미국 특허 가출원 제62/868,820호에 대한 우선권을 주장하며, 이는 그 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용된다.
정부 이익 진술
본 발명은 국립 보건원에 부여된 허가번호 GM084979 및 AG061447하에 정부 지원으로 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에 대한 소정의 권리를 보유한다.
기술분야
본 발명은 비강내 단트롤렌(dantrolene) 투여에 의해 알츠하이머병을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 알츠하이머병(Alzheimer's Disease: AD)이 있거나 또는 있을 것으로 의심되는 대상체에서 손상된 신경발생 및/또는 시냅스생성을 억제하는 방법, 신경병리 및 인지기능장애가 AD에 의해 발생되는 신경병리 및 인지기능장애의 발병 후 인지 기능의 저하를 개선하고/하거나 늦추는 방법, AD의 증상의 발병 전 기억력을 개선하는 방법 및 AD의 증상의 발병 후 기억력을 개선하는 방법에 관한 것으로, 방법은 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물의 리아노딘 수용체(ryanodine receptor: RyR) 및/또는 N-메틸-D-아스파테이트(N-methyl-D-aspartate: NMDA) 수용체의 과활성화를 저해하는데 효과적인 양을 이를 필요로 하는 대상체에게 비강내로 투여하는 단계를 포함한다.
알츠하이머병(AD)은 파괴적인 신경퇴행성 질환이다. 지난 수십 년 동안 아밀로이드 병리를 표적으로 하는 신약 개발의 부족은 AD 인지기능장애의 주요 원인이 될 수 있는 대체 경로 또는 메커니즘에 대한 탐구를 정당화한다.
산발성 AD(Sporadic AD: SAD)는 AD 환자의 95% 초과를 차지하지만, 그 병리는 크게 알려져 있지 않다. SAD의 메커니즘에 대한 이해 부족과 불충분한 세포 또는 동물 모델은 AD를 치료하기 위한 새로운 효과적인 약물의 개발을 제한한다. 가족성 알츠하이머병(familial Alzheimer's Disease: FAD)의 병리 및 메커니즘은 비교적 잘 연구되었지만, 이는 환자가 아닌 세포 및 동물 모델에서 주로 연구되었다.
악성 고열의 사망률을 85%에서 5% 미만으로 감소시킨 단트롤렌은 이러한 중증의 전신 마취 매개성 합병증을 치료하기 위해 FDA 승인된 임상적으로 이용 가능한 유일한 약물이다. 경구 단트롤렌의 장기적인 사용은 또한 근육 경련을 치료하는 데에도 이용되며, 비교적 견딜 수 있는 부작용이 있다. 현재 AD에 대한 약물 및 요법의 불충분함의 관점에서, AD 증상의 발병 전후에 인지기능의 상실뿐만 아니라 뇌의 뉴런에서의 신경발생 및/또는 시냅스생성의 손상을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 AD 및 AD에 존재하고 이와 관련된 기능장애를 치료하기 위한 개선된 조성물 및 치료적으로 효과적인 방법에 대한 중대한 요구가 존재한다.
일 양태에서, 본 발명은 알츠하이머병(AD)이 있거나 또는 있는 것으로 의심되는 대상체의 뉴런에서 손상된 신경발생 및/또는 시냅스생성을 저해하는 방법을 제공하며, 신경발생 및/또는 시냅스생성의 손상은 적어도 부분적으로 소포체(endoplasmic reticulum: ER) 리아노딘 수용체(RyR)의 과활성화에 의해 유발되며, 방법은 AD 환자로부터 유래된 세포에서 ER 칼슘 이온(Ca 2+ )의 방출을 감소시키는데 효과적인 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물의 양을 대상체에게 비강내로 투여하는 단계를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 신경병리 및 인지기능장애가 알츠하이머병(AD)에 의해 유발되는 신경병리 및 인지기능장애의 발병 후 인지 기능의 저하를 개선하고/하거나 늦추는 방법을 제공하며, 방법은 NMDA 수용체 및/또는 리아노딘 수용체의 과활성화를 저해하는데 효과적인 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물의 양을 이를 필요로 하는 대상체에게 비강내로 투여하는 단계를 포함한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 알츠하이머병(AD)의 증상의 발병 전에 기억력을 개선하는 방법을 제공하며, 방법은 NMDA 수용체 및/또는 리아노딘 수용체의 과활성화를 저해하는데 효과적인 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물의 양을 이를 필요로 하는 대상체에게 비강내로 투여하는 단계를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 기억력 상실이 AD에 의해 유발되는 알츠하이머병(AD)의 증상의 발병 후 기억력 상실을 개선하는 방법을 제공하며, 방법은 NMDA 수용체 및/또는 리아노딘 수용체의 과활성화를 저해하는데 효과적인 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물의 양을 이를 필요로 하는 대상체에게 비강내로 투여하는 단계를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 뇌에서 단트롤렌의 농도 및 지속시간을 증가시키는 방법을 제공하며, 방법은 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물의 양을 이를 필요로 하는 대상체에게 비강내로 투여하는 단계를 포함한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 알츠하이머병(AD)이 있거나 또는 있는 것으로 의심되는 대상체의 뉴런에서 손상된 신경발생 및/또는 시냅스생성을 저해하는 방법을 제공하되, 상기 신경발생 및/또는 시냅스생성의 손상은 적어도 부분적으로 소포체(ER) 리아노딘 수용체(RyR)의 과활성화에 의해 유발되고, 방법은 a) ER 칼슘 이온(Ca 2+ )의 방출을 감소시키는데 효과적인 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물의 양을 상기 대상체에게 비강내로 투여하는 단계; 및 b) 치료적 유효량의 글루타메이트 수용체 길항제를 (a) 단계의 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 다음의 상세한 설명, 실시예 및 도면으로부터 명백해질 것이다. 본 발명의 정신 및 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 이 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백할 것이기 때문에, 본 발명의 소정의 실시형태를 나타내면서 상세한 설명 및 특정 실시예가 단지 예시의 방식으로 제공됨을 이해하여야 한다.
다음 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고 본 개시내용의 소정의 양태를 추가로 입증하기 위해 포함되며, 본 발명의 발명은 본 명세서에 제시된 특정 실시형태의 상세한 설명과 함께 이러한 도면 중 하나 이상을 참조하여 더 잘 이해될 수 있다. 특허 또는 출원 파일은 컬러로 실행된 적어도 하나의 도면이 포함되어 있다. 컬러 도면(들)이 포함된 이 특허 또는 특허 출원 간행물의 사본은 요청 및 필요한 수수료 지불시 특허청에서 제공될 것이다.
도 1a 내지 도 1b는 알츠하이머병(AD) 환자로부터의 유도 다능성 줄기 세포(induced pluripotent stem cell: iPSC)에서 단트롤렌이 세포 생존능력을 촉진하고 세포 증식 장애를 저해함을 보여준다. 도 1a는 iPS를 단트롤렌(DAN; 30μM)으로 24시간 동안 처리하면 건강한 인간 대상체(CON)로부터의 iPSC에는 영향을 미치지 않았지만, 산발성 알츠하이머병(SAD; P=0.006) 및 가족성 알츠하이머병(FAD; P<0.0001) 환자로부터의 iPSC의 세포 생존능력이 유의하게 더 큼을 보여준다. 세포 생존능력의 경우, 상호작용, 처리 및 세포 유형이 모두 변동의 중요한 원인(sources of variation)이었다(각각 F[2,40]=92.56, P<0.0001; F[1,40]=110.40, P<0.0001; 및 F[2,40]=92.81, P<0.0001). 도 1b는 브로모데옥시우리딘(BrdU)-양성 세포의 백분율에 의해 측정된 세포 증식이 대조군의 건강한 대상체 세포와 비교하여 가족성 알츠하이머병 세포에서 유의하게 손상되었음을 보여준다(P=0.022). 비히클 대조군과 비교하여, 다이메틸 설폭사이드(DMSO), 단트롤렌은 가족성 알츠하이머병 세포(P=0.008, 가족성 알츠하이머병 단트롤렌 대 다이메틸 설폭사이드)에서 더 큰 증식을 초래하였다. 증식의 경우, 단트롤렌 처리 및 세포 유형이 변동의 중요한 원인이었다(각각 F[2,30]=5.44, P=0.009; 및 F[1,30]=9.81, P<0.039). 모든 데이터는 5개 내지 8개의 독립적인 실험에서 평균±SD로 나타내었다(도 1a에서, 가족성 알츠하이머병, n=7; 대조군, n=8; 산발성 알츠하이머병, n=8; 및 도 1b에서, 다이메틸 설폭사이드로 처리된 대조군, n=7; 단트롤렌으로 처리, n=5; 산발성 알츠하이머병 DMSO 및 단트롤렌 그룹 둘 다, n=5; 가족성 알츠하이머병 다이메틸 설폭사이드, n=8; 단트롤렌, n=6). ** P<0.01; *** P<0.001. 통계적 유의성은 시닥 다중 비교 테스트(Sidak's multiple comparisons test: Sidak's MCT)로 이원분산분석(two-way analysis of variance)을 사용하여 결정되었다. MTT, 3-(4,5-다이메틸티아졸-2-일)-2,5-다이페닐테트라졸륨 브로마이드.
도 2a 내지 도 2b는 단트롤렌이 알츠하이머병(AD) 환자로부터 유래된 세포에서 미성숙 뉴런으로 분화하는 신경전구 세포의 손상을 개선함을 보여준다. 신경전구 세포(neural progenitor cell: NPC)의 미성숙 뉴런으로의 분화(분화 23일째)는 산발성 알츠하이머병(SAD) 및 가족성 알츠하이머병(FAD) 모두에서 유의하게 손상되었으며, 이는 단트롤렌(DAN)에 의해 저해되었다. 도 2a는 유도 다능성 줄기 세포(iPSC)로부터 유도 제0일에 시작하여 3일 동안 단트롤렌으로 처리되거나 또는 처리되지 않은 더블코르틴(DCX(적색)에 의해 염색된 미성숙 뉴런의 대표적인 면역형광 이미지를 보여준다. 스케일 바, 100㎛. 도 2b는 산발성 알츠하이머병 세포(P=0.004) 및 가족성 알츠하이머병 세포(P=0.011) 둘 다의 분화가 대조군(CON)과 비교하여 손상되었음을 보여준다. 그러나, 산발성 알츠하이머병(P=0.008) 및 가족성 알츠하이머병(P=0.008) 세포 둘 다의 분화는 단트롤렌 처리 후 향상되었다. 세포 유형 및 처리는 시닥 다중 비교 테스트로 이원분산분석을 사용하는데 변동의 중요한 원인이었다(각각 F[2,30]=8.749, P=0.001; 및 F[1,30]=25.08, P<0.0001). 데이터는 6개의 독립적인 실험(모든 그룹에 대해 n=6)으로부터의 평균±SD로 나타내었다. * P<0.05; ** P<0.01. DAPI, 4,6-다이아미디노-2-페닐인돌; DMSO, 다이메틸 설폭사이드.
도 3a 내지 도 3f는 단트롤렌이 알츠하이머병 환자 세포에서 신경전구 세포(NPC)의 피질 뉴런 및 기저 전뇌 콜린성 뉴런(basal forebrain cholinergic neuron: BFCN)으로의 분화를 저해함을 보여준다. 도 3a는 NPC의 성숙 피질 뉴런으로의 분화 타임라인을 보여준다. 도 3b는 갑상선 호르몬 수용체-b(thyroid hormone receptor-b: Trb1, 적색) 및 미세소관-관련 단백질-2(microtubule-related protein-2: MAP2, 녹색)로 이중-염색된 뉴런의 대표적인 면역형광 이미지를 보여준다. 스케일 바, 100μM. 도 3c는 Trb1 양성 세포의 백분율이 대조군의 건강한 대상체(CON) 세포와 비교하여 인간 산발성 알츠하이머병(SAD; P<0.0001) 및 가족성 알츠하이머병(FAD) 세포(P=0.022) 모두에서 유의하게 적지만, SAD 세포는 단트롤렌(DAN 또는 Dan; P<0.0001)으로 처리한 후 TrB1 양성 세포의 백분율이 훨씬 더 큼을 보여준다. 상호작용, 세포 유형 및 처리가 변동의 중요한 원인이었다(각각 F[2,24]=14.84, P<0.0001; F[2,24]=15.94, P<0.0001; 및 F[1,24]=7.53, P=0.011). 도 3d는 신경전구 세포(NPC)의 성숙 BFCN 뉴런으로의 분화에 대한 타임라인을 보여준다. 도 3e는 뉴런으로의 유도 다능성 줄기 세포(iPSC) 분화의 유도로부터 시작하여 3일 동안 단트롤렌 처리의 유무에 관계없이 MAP2(적색) 및 콜린 아세틸트랜스퍼레이스(choline acetyltransferase: ChAT 또는 CHAT)-양성 세포(녹색)에 의한 이중-염색된 성숙 뉴런의 대표적인 면역형광 이미지를 보여준다. 스케일 바, 100μM. 도 3f는 SAD(P=0.004) 및 FAD(P=0.017) 세포 모두에서 ChAT-양성 세포(기저 전뇌 콜린성 뉴런(BFCN))의 백분율이 유의하게 감소하였으며, 이는 단트롤렌 처리에 의해 FAD 세포(P=0.008)는 개선되었지만 SAD 세포(P=0.067)는 개선되지 않았음을 보여준다. 상호작용, 세포 유형 및 처리가 변동의 중요한 원인이었다(각각 F[2,24]=5.61, P=0.010; F[2,24]=6.27, P=0.006; 및 F[1,24]=14.78, P=0.001). 통계적 유의성은 이원분산분석(ANOVA)에 이어 시닥 다중 비교 테스트로 결정되었다. 모든 데이터는 5개의 독립적인 실험(모든 그룹에 대해 n=5)으로부터의 평균±SD로 나타내었다. * P<0.05; ** P<0.01; **** P<0.0001. DMSO, 다이메틸 설폭사이드; SHH, 재조합 인간 소닉 헤지호그.
도 4a 내지 도 4e는 단트롤렌이 알츠하이머병 세포에서 수상돌기 교차(dendrite intersection) 및 뉴런의 시냅스 밀도의 손상을 저해함을 보여준다. NPC는 iPSC 분화 유도로부터 시작하여 3일 동안 인슐린 및 단트롤렌(DAN) 처리로 성숙 피질 뉴런으로 분화되었다. 피질 뉴런 주위의 수상돌기와 동심원 사이의 교차의 평균 수는 체세포로부터 원 거리(circle distance)(㎛)의 함수로 나타내었다. 도 4a는 교차의 수가 산발성 알츠하이머병(SAD) 및 가족성 알츠하이머병(FAD) 세포 모두에서 유의하게 적었으며, 이는 SAD 세포에서 단트롤렌에 의해 저해되었음을 보여준다. 도 4b는 체세포로부터 약 150㎛의 거리에서 교차의 평균수는 대조군(CON)과 비교하여 SAD(p<0.0001) 및 FAD 세포(p<0.0001)로 더 적었지만, 단트롤렌 처리한 SAD(p<0.0001) 및 FAD 세포(P=0.014) 모두에서 유의하게 더 컸음을 보여준다. 상호작용(F[2,12]=42.18, P<0.0001), 세포 유형(F[2,12]=273.30, P<0.0001) 및 단트롤렌 처리(F[1,12]=78.48, P<0.0001)가 변동의 중요한 원인이었다. 통계적 유의성은 이원분산분석 및 시닥 다중 비교 테스트에 의해 결정되었다. 도 4c는 시냅스후 마커 밀도 단백질 95(postsynaptic marker density protein 95: PSD95; 적색) 및 시냅스전 마커 시냅신-1(presynaptic marker synapsin-1)(녹색) 이중 면역염색에 의해 결정된 시냅스 밀도를 보여준다. 스케일 바, 100μM. 도 4d는 PSD95 밀도가 대조군과 비교하여 SAD(P=0.001) 및 FAD 세포(P=0.001) 모두에서 유의하게 적었지만, 단트롤렌 처리한 FAD 세포(P<0.0001)에서는 유의하게 더 컸음을 보여준다. 상호작용(F[2,23]=8.78, P=0.002), 세포 유형(F[2,23]=25.36, P<0.0001) 및 단트롤렌 처리(F[1,23]=28.60, P<0.0001)가 변동의 중요한 원인이었다. 도 4e는 시냅신-1이 또한 SAD(P=0.001) 및 FAD p<0.0001) 세포에서 더 유의하게 적었고, FAD 세포(p<0.0001)에서 단트롤렌에 의해 유의하게 증가되었으며, 단트롤렌 처리된 FAD 세포(P<0.0001)에서 유의하게 더 컸음을 보여준다. 상호작용(F[2,23]=18.12, P<0.0001), 세포 유형(F[2,23]=21.46, P<0.0001) 및 단트롤렌 처리(F[1,23]=7.18, P=0.013)가 변동의 중요한 원인이었다. 데이터는 적어도 4개의 독립적인 실험으로부터의 평균±SD로 나타내었다: 대조군 및 FAD 세포(N=5) 및 SAD 세포(N=4). * P<0.05; ** P<0.01; *** P<0.001; **** P<0.0001. 통계적 유의성은 이원분산분석 및 시닥 다중 비교 테스트에 의해 결정되었다. DMSO, 다이메틸 설폭사이드.
도 5a 내지 도 5d는 SAD 또는 FAD 환자로부터 유래된 iPSC에서 증가된 유형 2 리아노딘 수용체(RyR-2)를 보여준다. 도 5a 내지 도 5b는 환자로부터의 SAD 및 FAD 세포 모두에서 유형 2 리아노딘 수용체(RyR, RyR-2 또는 RYR-2) RyR-2가 증가하고, FAD 세포에서 극적으로 더 많이 증가함을 보여준다. 도 5c 및 도 5d는 유사하게 면역형광 염색에 의해 결정된 RyR-2가 SAD 세포에서 유의하게 더 큼을 보여준다. 모든 데이터는 4개의 독립적인 실험(N=4 반복, 도 5b) 또는 7개의 독립적인 실험(N=7 반복, 도 5d)으로부터의 평균±SD이다. 도 5b의 데이터는 비모수적(다구스티노-피어슨 옴니버스 정규성 테스트(D'Agostino-Pearson omnibus normality test))이었고, 크러스컬-월리스 테스트(Kruskal-Wallis test)(P=0.132)에 이어 던의 다중 비교 테스트(Dunn's multiple comparison test)(P=0.158)에 의해 대조군의 건강한 대상체(CON) 세포와 비교하여 분석되었다. 도 5d의 데이터도 또한 비모수적이었으며, 크러스컬-월리스 테스트(P=0.002)에 이어 던의 다중 비교 테스트(던의 MCT)에 의해 분석되었다. * P=0.020; ** P=0.002. 스케일 바, 25㎛(도 5c). DAPI, 4'6-다이아미디노-2-페닐인돌.
도 6a 내지 도 6d는 단트롤렌이 알츠하이머병(AD) 환자로부터의 유도 다능성 줄기 세포(iPSC)에서 세포질 Ca2+ 농도([Ca2+]c)의 N-메틸-d-아스파테이트(NMDA) 매개성 상승을 유의하게 저해함을 보여준다. NMDA(500μM)는 정상적인 인간 대상체(CON)와 비교하여 산발성(SAD) 및 가족성(FAD) 알츠하이머 질환 세포(각각 산발성 알츠하이머병의 경우 P=0.041, 가족성 알츠하이머병의 경우 P=0.008)에서 곡선 아래 면적(area under curve: AUC; 도 6a 내지 도 6d)으로 표시되는 통합된 세포질 Ca2+의 더 큰 전체 노출을 유도하였다. 단트롤렌(DAN, 30μM)은 가족성 알츠하이머병 세포(각각 피크의 경우 P=0.436, AUC의 경우 P<0.0001; 도 6b, 도 6d)에서 [Ca2+]c 및 AUC의 NMDA-매개성 상승을 개선하였다. 모든 데이터는 3개의 독립적인 실험(N=3)으로부터의 중앙값[25번째, 75번째]으로 나타내었다. 도 6c의 데이터는 비모수적이었고, 크러스컬-월리스 테스트(P=0.020)에 이어 던의 다중 비교 테스트에 의해 분석되었다. 도 6d에 대한 데이터도 또한 비모수적이었고, 크러스컬-월리스 테스트(P<0.001)에 이어 던의 다중 비교 테스트를 사용하여 분석되었다. * P=0.041, ** P=0.008, **** P<0.0001.
도 7a 내지 도 7g는 알츠하이머병 환자로부터의 기저 전뇌 콜린성 뉴런에서 세포질 칼슘(Ca2+) 농도([Ca2+]c)의 아데노신 트라이포스페이트(ATP)-매개성 상승에 대한 단트롤렌의 효과를 보여준다. 세포질 Ca2+ 농도(도 7a 내지 도 7d) 및 상응하는 통계적 분석(도 7e 내지 도 7g)의 변화가 제공된다. 이원분산분석은 처리(ATP, ATP + Ca2+) 및 세포 유형: 대조군(CON), 산발성 알츠하이머병(SAD), 가족성 알츠하이머병(FAD)을 비교하여 수행되었다. 1mM의 세포외 칼슘(ATP + Ca2+; 도 7a, 도 7e)의 존재하에 ATP(30μM)는 대조군 세포와 비교하여 산발성 알츠하이머 질환 세포(P=0.049)에서 유의하게 더 높았던 피크 세포질 Ca2+ 농도 [Ca2+]c에 대한 변동의 중요한 원인이었다(F[1,35]=14.90, P=0.0005). 1mM의 세포외 Ca2+(ATP)의 부재하에 ATP는 1mM의 세포외 Ca2+(ATP+Ca2+)의 존재하에 가족성 알츠하이머병 세포와 비교하여 가족성 알츠하이머병 세포(P=0.031)에서 유의하게 더 낮은 ATP-유도성 피크 [Ca2+]c를 초래하였다(도 7b, 도 7e). 또한, 세포외 칼슘(ATP +Ca2+)과 함께 ATP는 통합된 세포질 Ca2+(곡선 아래 면적[AUC])에 대한 변동의 중요한 원인이었으며(F[1,35]=71.87, P<0.0001), 이는 ATP 단독(ATP; E)을 이용한 동일한 세포와 비교하여 대조군(P=0.0002), 산발성 알츠하이머병(P=0.005) 및 가족성 알츠하이머병(P<0.0001) 세포에 대해 유의하게 더 컸다. ATP와 세포외 Ca2+를 이용한 세포의 단트롤렌(DAN, 30μM) 전처리(ATP + Ca2+ + DAN)는 그룹 간에 유의한 차이가 검출되지 않았지만, 피크 세포질 [Ca2+]c에 대한 알츠하이머병 세포 유형(F[2,42]=3.65, P=0.035)에 대한 변동의 중요한 원인이었다(도 7c, 도 7f). 단트롤렌의 첨가(ATP + Ca2+ + DAN)는 또한 AUC에 대한 알츠하이머병 세포 유형에 대한 변동의 중요한 원인이었으며(F[1,40]=30.60, P<0.0001), 이는 ATP + Ca2+만을 이용한 세포와 비교하여 대조군(P=0.033) 및 가족성 알츠하이머병 세포(P=0.015)에 대해 유의하게 감소되었다(도 7c, 도 7f). 세포외 Ca2+의 부재하에 ATP와 함께 세포의 단트롤렌(30μM) 전처리(ATP + DAN; D)는 그룹 간에 유의한 차이가 발견되지 않았지만, 피크 세포질 [Ca2+]c에 대해 변동의 중요한 원인이었고(F[1,33]=10.01, P=0.003)(도 7g), Ca2+ 의 부재는 AUC에 대한 변동의 중요한 원인이었으며(F[1,33]=5.95, P=0.020), 그룹 간에 차이가 검출되지 않았다(도 7g). 피크 및 통합된 Ca2+ 농도는 정상적인 인간 대상체로부터의 CON 세포에서 기준선의 백분율로 나타나 있다. 모든 데이터(도 7e 내지 도 7g)는 적어도 5개의 독립적인 실험(CON, n=6 반복; 산발성 알츠하이머병, n=5 반복; 가족성 알츠하이머병, n=8 내지 9 반복)으로부터의 평균±SD로 나타내었다. * P<0.05; ** P<0.01; *** P<0.001. 유의성은 이원분산분석에 이어 시닥 다중 비교 테스트에 의해 결정되었다.
도 8a 내지 도 8e는 알츠하이머병 환자로부터 유래된 뉴런에서의 라이소솜 ATPase 및 산도(acidity)가 대조군 세포에서보다 적음을 보여준다. 도 8a는 건강한 인간 대상체(CON), 산발성(SAD) 또는 가족성(FAD) 알츠하이머병 환자의 유도 다능성 줄기 세포(iPSC)에서 라이소솜(LAMP-2, 녹색), 엔도솜(EEA, 녹색) 및 소포체(칼넥신, 녹색)를 표적으로 하는 특정 마커를 사용하는 면역염색을 사용하여 액포-유형 H+-ATPase(V-ATPase; 적색)의 공국재화(colocalization)가 측정됨을 보여준다. 도 8b는 세포 산도가 CON, SAD 및 FAD 세포(4',6-다이아미디노-2-페닐인돌[DAPI], 청색)에서 라이소트래커(lysotracker)-양성 산성 비히클(적색)에 의해 측정됨을 보여준다. 도 8c는 라이소솜(LAMP-2)의 V-ATPase가 SAD 세포(P=0.001) 및 FAD 세포(P=0.010)에서 대조군보다 유의하게 더 낮음을 보여준다. 상호작용(F[4,23]=4.35, P=0.008) 및 세포소기관 유형(F[2,23]=29.15, P<0.0001)이 변동의 중요한 원인이었다. 도 8d는 단트롤렌(DAN, 30μM)을 첨가하면, FAD 세포에서 라이소솜(LAMP-2)의 V-ATPase가 더 이상 유의하게 감소되지 않았지만(P=0.965), 대조군과 비교하여 SAD 세포(P=0.007)에서 유의하게 더 낮게 유지됨을 보여준다. 또한, 대조군의 소포체(칼넥신)의 v-ATPase는 SAD(P=0.001) 및 FAD(P<0.0001) 세포와 비교하여 유의하게 감소되었다. 상호작용(F[4,27]=8.66, P=0.0001), 세포소기관 유형(F[2,27]=79.49, P<0.0001) 및 세포 유형(F[2,27]=5.96, P=0.007)이 변동의 중요한 원인이었다. 도 8e는 라이소트래커-양성 산성 소포가 대조군 세포와 비교하여 산발성 알츠하이머병(P<0.0001) 및 가족성 알츠하이머병(P=0.0004)에서 유의하게 더 낮았음을 보여준다. 단트롤렌은 또한 다이메틸 설폭사이드(DMSO)와 비교하여 산발성 알츠하이머병(P=0.025) 및 가족성 알츠하이머병(P=0.036) 세포 모두에서 트래커-양성 산성 소포를 유의하게 증가시켰다. 세포 유형 및 단트롤렌은 변동의 중요한 원인이었다(각각 F[2,19]=29.88, P<0.0001; 및 F[1,19]=23.16, P=0.0001). 모든 데이터는 4개의 독립적인 실험(모든 그룹에 대해 4회 반복)으로부터의 평균±SD로 나타내었으며, 이원분산분석에 이어 시닥 다중 비교 테스트에 의해 분석되었다. * P<0.05; ** P<0.01; *** P<0.001; **** P<0.0001.
도 9a 내지 도 9f는 단트롤렌이 AD 환자로부터의 iPSC에서 LC3II 수준을 증가시켰음을 보여준다. 도 9a, 도 9c는 다이메틸 설폭사이드(DMSO), 단트롤렌(DAN) 또는 단트롤렌과 바필로마이신(bafilomycin: BAFI)을 이용한 산발성 알츠하이머 질환(SAD), 가족성 알츠하이머 질환(FAD) 및 건강한 인간 대조군(CON)으로부터의 유도 다능성 줄기 세포(iPSC)의 라이소솜(LAMP2, 녹색)에서 LC3II(적색)의 대표적인 면역조직화학 이미지(도 9a) 및 대표적인 웨스턴 블롯(도 9c)을 보여준다. 도 9b는 이중-표지된 면역염색된 세포의 정량화가 바필로마이신과 함께 단트롤렌이 각각 다이메틸 설폭사이드 또는 단트롤렌과 비교하여 SAD(P<0.0001), FAD(P<0.0001) 및 CON(P<0.0001) 세포에서 라이소솜(LAMP-2)의 LC3II를 유의하게 증가시켰음을 나타내는 것을 보여준다. 이원분산분석 및 시닥 다중 비교 테스트를 사용하여 상호작용(F[4,35]=8.18, P<0.0001), 세포 유형(F[2,35]=24.08, P<0.0001) 및 처리(F[2,35]=177.00, P<0.0001)는 변동의 중요한 원인이 있었다. 도 9d는 웨스턴 블롯의 정량화가 유사하게 바필로마이신과 단트롤렌이 각각 DMSO 또는 DAN 단독과 비교하여 SAD(P<0.0001), FAD(P<0.0001) 및 CON(P<0.0001) 세포의 라이소솜(LAMP-2)에서 LC3II를 유의하게 증가시켰음을 나타내는 것을 보여준다. 단트롤렌으로 처리된 가족성 알츠하이머병 세포는 또한 다이메틸 설폭사이드 세포로 처리된 가족성 알츠하이머병과 비교하여 LC3II(P=0.0004)을 유의하게 증가시켰다. 이원분산분석 및 시닥 다중 비교 테스트를 사용하여 상호작용(F[4,18]=6.92, P=0.002) 및 처리(F[2,18]=303.40, P<0.001)가 변동의 중요한 원인이었다. 도 9e는 CON, SAD 및 FAD 세포에서 P62 수준의 대표적인 웨스턴 블롯을 보여준다. 도 9f는 P62 웨스턴 블롯의 정량화가 크러스컬-월리스 테스트(P=0.004)에 이어 던의 다중 비교 테스트를 사용하여 CON과 비교하여 FAD 세포(P=0.015)에서 세포 스트레스의 이러한 마커가 유의하게 증가되는 것을 발견하였음을 보여준다. 모든 데이터는 적어도 3개의 독립적인 실험(모든 그룹에 대해 n=3 반복)으로부터의 평균±SD로 나타내었다. * P<0.05; ** P<0.01; *** P<0.001; **** P<0.0001.
도 10a 내지 도 10d는 경구 및 비강내 투여 후 마우스의 혈장 및 뇌에서 단트롤렌의 약동학적 분석을 보여준다. 도 10a는 비강내 투여(5 ㎎/㎏) 후 20분 및 경구 투여(5 ㎎/㎏) 후 50분에 발생되는 피크 단트롤렌 혈장 농도(Cmax)를 보여준다. ***p=0.0000089는 시닥-홀름 방법(Sidak-Holm method)(알파=0.05%. 비강내 시점, 10분, 30분, 150분, 180분, n=5; 20분, n=8; 50분 내지 120분, n=4; 경구 시점, 10분 내지 120분; n=5)을 사용하는 다중 t-검정으로 결정된 경구 투여와 비교된다. 도 10b는 단트롤렌의 비강내 및 경구 투여 후 혈장에서 통합된 단트롤렌 노출(패널 A의 곡선 아래 면적)(왼쪽) 및 Cmax(오른쪽)의 비교를 보여주며, 비모수적 독립표본 맨-휘트니 검정(Mann-Whitney test)(양측 검정)으로 **p=0.0079이다. 비강 혈장(20분), n=8; 경구 혈장(50분), n=4; 도 10c는 비강내 투여(5 ㎎/㎏) 후 단트롤렌의 뇌 농도가 대부분의 시점에서 경구 투여 후보다 더 높았음을 보여준다. Cmax는 비강내 투여 후 20분 및 경구 투여 후 50분에 각각 발생하였다. 대조 그룹(비강내 대 경구)과 비교되고 그리고 시닥-홀름 방법을 사용하는 다중 t-검정(알파=0.05%)으로 결정된 ***p=0.00000012, **p=0.0035(30분), **p=0.0037(50분), **p=0.0027(120분)이었다. 비강내 시점, 10분, 30분, 150분, 180분, n=5; 20분, n=8; 50분 내지 120분, n=4; 경구 시점, 10분 내지 120분; n=5. 도 10d는 단트롤렌의 비강내 및 경구 투여 후 뇌 조직에 통합된 단트롤렌 노출(패널 C의 곡선 아래 면적)(왼쪽) 및 단트롤렌의 비강내 및 경구 투여 후 뇌에서 Cmax(오른쪽)의 비교를 보여주며, 비모수적 독립표본 맨-휘트니 검정(양측 검정)으로 **p=0.0079였다. 비강 뇌 및 경구 뇌, n=5; 비강 뇌(20분), n=8; 경구 뇌(50)분, n=5. 모든 데이터는 평균 ± 95% CI로 나타내었다.
도 11은 비강내 대 경구 투여 후 시간 경과에 따른 뇌에서의 단트롤렌 농도를 보여준다. 일반적으로, 비강내 및 경구 투여 사이에 단트롤렌 뇌/혈장 비에는 유의한 차이가 없었다. 50분에, 경구 단트롤렌 뇌 혈장 비는 비강내 단트롤렌보다 더 컸다. 경구 뇌/혈장 비는 0으로 떨어진 반면, 비강내 단트롤렌 뇌/혈장 비는 180분 동안 걸쳐 유지되었다. 데이터는 평균 ± 95% CI로 나타내었으며, 유의성은 알파=5.00%인 홀름-시닥 방법으로 다중 t-검정에 의해 결정된다. %. 비강내 시점, 10분, 30분, 150분, 180분, n=5; 20분, n=8; 50분 내지 120분, n=4; 경구 시점, 10분 내지 120분; n=5.
도 12a 내지 도 12b는 단트롤렌의 장기 비강내 투여가 후각 또는 운동 기능에 영향을 미치지 않았음을 보여준다. 도 12a는 단트롤렌(5 ㎎/㎏, 3 시간/주) 또는 비히클 대조군의 비강내 투여 3주 후, 후각이 동물이 앞발로 매장된 식품을 회수하는데 필요한 시간(초)으로 측정되었음을 보여준다. 도 12b는 단트롤렌(5 ㎎/㎏, 3시간/주)의 비강내 투여 4개월 후, 운동 기능이 식품을 찾는 시간(도 12a) 및 로타로드에서 보낸 시간(도 12b)에 의해 결정되었음을 보여준다. 후각 또는 운동 기능에 유의한 차이는 검출되지 않았다. 데이터는 비모수적 독립표본 맨-휘트니 검정(모든 그룹에 대해 n=10)으로 분석된 평균 ± 95% CI로 나타내었다.
도 13은 혈액 뇌 장벽(blood brain barrier: BBB) 저해제인 니모디핀(nimodipine) 및 엘라크리다르(elacridar)가 단트롤렌 통과에 효과가 없었음을 보여준다. 단트롤렌(5 ㎎/㎏)의 비강내 투여 20분 후, 모두 리아노덱스(Ryanodex)와 같은 동일한 비히클에 용해된 BBB 펌프 저해제(P-gp/BCRP)인 니모디핀(Nim, 2 ㎎/㎏) 또는 엘라크리다르(Elac, 10 ㎎/㎏)의 존재 또는 부재하에, 단트롤렌 뇌/혈장 비가 BBB를 가로지르는 단트롤렌 통과의 척도로서 결정되었다. 단트롤렌 단독과 비교하여 두 저해제 모두 유의한 차이는 검출되지 않았다. 데이터는 평균 ± 95% CI로 나타내었으며(n=5(Dan, Dan + Nim), n=6(Dan + Elac)), 던의 다중 비교 테스트와 크러스컬-월리스 비-모수적 ANOVA로 분석되었다.
도 14는 실시예 3: 치료, 행동 테스트 및 안락사에 대한 타임라인의 실험적 설계를 보여준다. 12개의 실험 그룹은 유전자형(5XFAD, WT), 처리 시작(조기 처리(Early Treatment: ETG), 지연 처리(Late Treatment: LTG) 그룹)시 연령 및 처리의 투여 경로(비강내, 피하)에 기초하여 설계되었다.
도 15a 내지 도 15d는 비강내 단트롤렌이 피하 단트롤렌보다 뇌에 더 큰 약물 투과 및 더 높은 뇌 농도를 제공함을 보여준다. 도 15a는 B6SJLF1/J 마우스에서 피하(청색) 또는 비강내(적색) 투여 후 20분 및 60분에 혈장에서의 단트롤렌 농도를 보여준다. 이원분산분석은 시간(p=0.015; F(1, 16)=7.427) 및 투여 경로(p=0.0004; F(1, 16)=19.75) 모두에서 변동의 중요한 원인을 보여주었다. 혈장에서 단트롤렌 농도는 시닥 다중 비교를 이용한 피하 투여(p=0.0014)의 경우 20분에서 유의하게 더 높았다. 도 15b는 피하 및 비강내 접근법 후 뇌 단트롤렌 농도를 보여준다. 이원분산분석은 투여 경로(p<0.0001; F(1, 16)=27.07)에 대한 변동의 중요한 원인을 보여주었고, 뇌에서의 단트롤렌 농도는 시닥 다중 비교를 이용한 피하 투여(p=0.0002)보다 비강내 투여의 경우 60분에 유의하게 더 높았다. 도 15c는 단트롤렌의 뇌에 침투하는 능력을 나타내는 단트롤렌 뇌/혈장 농도 비를 보여준다. 이원분산분석은 투여 경로(p<0.0001; F(1, 16)=43.65)에 대한 변동의 중요한 원인을 보여주었고, 뇌/혈장 비는 시닥 다중 비교를 이용하여 비강내 투여의 경우 20분(p=0.0032) 및 60분(p<0.0001) 모두에서 유의하게 더 컸다. 도 15d는 통합된 전체 단트롤렌 노출을 반영하기 위해 선형 사다리꼴 계산법(Linear Trapezoidal Method)을 사용하여 계산된 단트롤렌 농도의 곡선 아래 면적(AUC)을 보여준다. 모든 데이터는 모든 그룹에 대해 95% CI, N=5/그룹의 평균으로 나타내었으며, ** p<0.01, *** p<0.001, **** p<0.0001이다.
도 16a 내지 도 16b는 단트롤렌의 비강내 투여가 AD 마우스에서 기억력에 대해 더 나은 치료적 효과를 가짐을 보여준다. 기억력은 맥락적 공포 조건화(contextual fear conditioning: CFC; 해마-의존적) 및 단서적 공포 조건화(cued fear conditioning: FC-단서적; 해마-독립적) 테스트 모두로 평가되었다. 테스트는 조기 처리 그룹(ETG)의 경우 각각 6개월령(6M) 및 11개월령(11M)에서 처리 4개월 및 9개월 후 및 지연 처리 그룹(LTG)의 경우 11개월령에서 처리 5개월 후에 수행되었다. 도 16a는 비히클(IN-VEH), 단트롤렌(IN-DAN)의 비강내 투여 및 단트롤렌(SQ-DAN)의 피하 주사를 포함하여 6개월령의 모든 ETG 5XFAD 마우스에서의 CFC 테스트는 처리되지 않은 5XFAD 대조군(CON)과 비교하여 상당히 더 큰 기억력을 나타냄(각각 p=0.0004; p=0.0002; p<0.0001)을 보여주었다. IN-VEH 및 IN-DAN ETG 5XFAD 마우스에서 11개월령의 5XFAD 마우스의 기억력(각각 p=0.0246, p=0.0228)은 5XFAD 대조군보다 상당히 더 컸다. ETG 데이터는 던넷 다중 비교 테스트(Dunnett's multiple comparison test: MCT)와 함께 이원분산분석을 사용하여 분석되었다. 처리는 변동의 중요한 원인인 것으로 밝혀졌다(p<0.0001; F(3,49)=9.536). 11개월령에서, LTG(11M-LTG) IN-DAN 및 SQ-DAN이 5XFAD 대조군(CON)과 비교되었으며, 데이터는 던의 MCT와 함께 크러스컬-월리스 테스트를 사용하여 분석되었다. In-DAN 그룹의 기억력은 CON(p=0.0410)과 비교하여 유의하게 개선되었다. Q-DAN의 기억력은 더 나은 경향이 있었지만, 통계적으로 유의하지는 않았다(p=0.1575). 도 16b는 유사하게 6개월령에 해마-독립적 기억력(FC-단서적)이 대조군과 비교하여 IN-VEH(p=0.0145), IN-DAN(p=0.0055) 및 SQ-DAN(p=0.001)을 이용한 ETG에서 유의하게 개선되었다. 11개월령에서, IN-DAN ETG의 기억력은 던넷 다중 비교 테스트(MCT)와 함께 이원분산분석을 사용하여 분석된 5XFAD CON 그룹보다 유의하게 우수하였다(p=0.0011). 처리는 변동의 중요한 원인인 것으로 밝혀졌다(p=0.0013; F(3,49)=6.095). ETG에서 IN-VEH 또는 SQ-DAN은 기억력을 개선하는 경향이 있었지만, 통계적으로 상이하지 않았다(각각 p=0.0664, p=0.1843). 던의 MCT와 함께 크러스컬-월리스 테스트를 사용하여 5XFAD CON과 비교하여, IN-DAN 또는 SQ-DAN LTG에서 11개월 동안 유의한 기억력 개선은 검출되지 않았다. 모든 데이터는 5xFAD CON과 비교하여 95% CI, * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001, **** p<0.0001의 평균으로 나타내었다. (동물 수, ETG 6M: CON n=13, IN-VEH n=12, IN-DAN n=14, IN-SQ n=14; ETG 11M: CON n=13, IN-VEH n=10, IN-DAN n=11, IN-SQ n=9; LTG 11M: IN-DAN n=13, SQ-DAN n=14, CON=13, ETG 11M에 대해 표시된 것과 동일한 대조군).
도 17a 내지 도 17f는 장기 단트롤렌 처리의 부작용에 대한 평가를 보여준다. 단트롤렌(IN-DAN) 또는 비히클(IN-VEH)의 비강내 투여 및 단트롤렌(SQ-DAN)의 피하 투여는 조기 처리 그룹(ETG)의 경우 2개월령 및 지연 처리 그룹(LTG)의 경우 6개월령에서 시작하여 3회/주로 투여되었다. 도 17a는 9개월령에 모든 그룹에 대해 로타로드 테스트를 사용하여 측정된 운동 기능을 보여준다. 일원분산분석 및 던넷 다중 비교 테스트(MCT)로 처리 그룹과 대조군 그룹 사이에 유의한 차이는 검출되지 않았다. (ETG:CON n=13, IN-VEH n=10, IN-DAN n=11, SQ-DAN n=9; LTG: IN-DAN n=13, SQ-DAN n=15). 도 17b는 10개월령에 모든 그룹에 대해 매장 식품 테스트(buried food test)를 사용하여 측정된 후각을 보여준다. 비모수적 데이터의 경우 크러스컬-월리스 테스트 및 던의 MCT로 유의한 차이는 발견되지 않았다. (ETG:CON n=13, IN-VEH n=10, IN-DAN n=10, SQ-DAN n=9; LTG: IN-DAN n=13, SQ-DAN n=15). 도 17c는 혈장 알라닌 아미노트랜스퍼레이스(ALT) 활성을 측정함으로써 평가된 간 기능을 보여준다. ALT는 대조군 그룹과 비교하여 LTG에서 6-개월 비강내 처리 후 유의하게 증가되었다(p=0.0364). 비모수적 데이터의 경우 크러스컬-월리스 테스트 및 던의 MCT에서는 다른 처리 그룹과 대조군 그룹 사이에 유의한 차이는 검출되지 않았다. (ETG: CON n=9, IN-VEH n=9, IN-DAN n=8, SQ-DAN n=8, LTG: IN-DAN n=9, SQ-DAN n=7). 모든 데이터는 95% CI의 평균으로 나타내었다. 도 17d는 ETG 마우스의 H&E 염색된 절편에서 11개월에 조사된 간 병리를 보여준다. ETG 그룹 간에 큰 차이는 관찰되지 않았다(3개의 절편/동물: CON n=3, IN-VEH n=3, IN-DAN n=3, SQ-DAN n=3, 바=50㎛). 도 17e는 단트롤렌(IN-DAN, SQ-DAN) 또는 비히클(IN-VEH)을 사용한 장기 처리(ETG, LTG) 후 사망률을 보여주며, 이는 로그-순위(만텔-콕스(Mantel-Cox)) 테스트를 사용하여 처리되지 않은 5XFAD 대조군과 비교되었다. 단트롤렌과 비히클 처리 간에 유의한 차이는 검출되지 않았다(p=0.3636). 도 17f는 처리 동안 모니터링된 체중을 보여준다. ETG 그룹(p=0.1478)에서 5XFAD 마우스에 대한 성장 곡선에서는 반복 측정 이원분산분석을 사용하여 유의한 차이가 검출되지 않았다. (ETG: CON n=13, IN-VEH n=10, IN-DAN n=11, SQ-DAN n=9; LTG: IN-DAN n=14, SQ-DAN n=14). 모든 데이터는 95% CI의 평균으로 나타내었다.
도 18a 내지 도 18f는 단트롤렌이 5XFAD 마우스의 치아 이랑(dentate gyrus) 및 해마에서 아밀로이드 플라크 수준에 유의한 영향을 미치지 않았음을 보여준다. 도 18a 내지 도 18b는 (CON), 비강내 비히클(IN-VEH), 비강내 단트롤렌(IN-DAN) 및 피하 단트롤렌(SQ-DAN) 처리에 대한 조기 처리 그룹(ETG) 및 지연 처리 그룹(LTG)에서 5XFAD 마우스의 해마 및 피질에서의 6E10 면역반응성의 대표적인 현미경 사진을 보여준다. (바=100㎛). 도 18c 및 도 18e는 각 테스트 그룹에 대한 플라크가 차지하는 해마 및 피질의 면적 백분율을 보여준다. 처리 그룹과 대조군 사이에 유의한 차이는 발견되지 않았다. 도 18d 및 도 18f는 유사하게 각 테스트 그룹에 대한 해마 및 피질에서 계산된 면적(㎟)당 아밀로이드 플라크의 수를 보여준다. 유의한 차이는 발견되지 않았다. 모든 데이터는 비모수적 데이터에 대한 크러스컬-월리스 테스트 및 던의 MCT로 분석되었다. (3개의 절편/동물; DG 및 HIP, ETG: CON n=8, IN-VEH n=4, IN-DAN n=6, SQ-DAN n=6; LTG: IN-DAN n=6, SQ-DAN n=7). 데이터는 95% CI의 평균으로 나타내었다.
도 19a 내지 도 19a는 처리되지 않은 야생형 및 5XFAD 마우스에서 기억력 손상을 보여준다. 맥락적 공포 조건화(CFC, 해마-의존적) 및 단서적 공포 조건화(FC-단서적, 해마-독립적) 기억력 둘 다를 공포 조건화 테스트(FC)로 평가하였다. 도 19a는 CFC에 대해 해마-의존적 기억이 6개월령 및 11개월령의 야생형(WT) 마우스(각각 P=0.0015, P=0.0033)와 비교하여 5XFAD (TG) 마우스에서 유의미하게 손상됨을 보여주며, 이를 독립표본 t-검정을 사용하여 분석하였다. 유전학(WT 대 TG)은 기억력 장애에 대한 변동의 중요한 원인으로 밝혀졌다(P<0.0001, F(1,47)=23.44). 도 19b는 유사하게 6개월령 및 11개월령의 WT-CON 마우스(각각 P=0.0019, P=0.0004)와 비교하여 5XFAD-CON 마우스에서 해마-독립적 기억력이 유의미하게 손상되었음을 보여주며, 이를 독립표본 t-검정을 사용하여 분석하였다. 유전학(WT 대 TG)은 기억력 장애에 대한 변동의 중요한 원인으로 밝혀졌다(P<0.0001, F(1,47)=27.94). 데이터는 95% CI의 평균으로 나타내었다. (WT: 6M n=13, 11M n=12; TG: 6M n=13, 11M n=13).
도 20a 내지 도 20b는 야생형(WT) 마우스에서의 기억력을 보여준다. 기억력은 맥락적 공포 조건화(CFC; 해마-의존적) 및 단서적 공포 조건화(FC-단서적; 해마-독립적) 테스트 둘 다를 사용하여 평가되었다. 테스트는 조기 처리 그룹(ETG)의 경우 각각 6개월령(6M) 및 11개월령(11M)에서 4개월 및 937개월 처리 후 그리고 지연 처리 그룹(LTG)의 경우 11개월령에서 5개월의 처리 후에 수행되었다. 도 20a는 처리되지 않은 대조군과 비교하여 비히클(IN-VEH), 단트롤렌(IN-DAN)의 비강내 투여 및 단트롤렌(SQ-DAN)의 피하 주사를 포함하는 6개월령 및 11개월령 모두에서의 CFC 테스트에서 유의한 차이가 없음을 보여준다. 이러한 두 연령의 ETG 데이터는 던넷 다중 비교 테스트(MCT)를 사용한 이원분산분석을 사용하여 분석되었다. 11개월령에서의 LTG 데이터는 터키의 MCT를 사용한 일원분산분석을 사용하여 분석되었다. 도 20b는 유사하게 두 연령 모두에서의 해마-독립적 기억력(FC-단서적)에서 모든 ETG 및 LTG 그룹에 유의한 차이가 없음을 보여준다. 이러한 두 연령의 ETG 데이터는 던넷 다중 비교 테스트(MCT)를 사용한 이원분산분석을 사용하여 분석되었다. 11개월에서의 LTG 데이터는 터키의 MCT를 사용한 일원분산분석을 사용하여 분석되었다. 모든 데이터는 95% CI의 평균으로 나타내었다. ETG 6M: CON n=13, IN-VEH n=15, IN-DAN n=18, SQ-DAN n=15; ETG 11M: CON n=12, IN-VEH n=12, IN-DAN n=17, SQ-DAN n=13; LTG 11M: IN-DAN n=13, SQ-DAN n=13.
도 21a 내지 도 21f는 모리스 수중 미로(Morris Water Maze: MWM) 테스트에 의해 결정된 학습 및 기억력을 보여준다. 학습 및 기억력은 야생형(WT) 및 5XFAD(TG) 그룹 모두에 대해 10개월령에 MWM에 의해 결정되었다. 도 21a 내지 도 21b는 큐 시험(cue trial) 동안 모든 그룹에서 플랫폼의 위치를 찾기 위한 대기 시간이 연속 5일 동안 유의미하게 감소하지 않았음을 보여주며, 이는 마우스가 시력 손상 또는 수영의 어려움을 겪지 않았음을 시사한다. 도 21c 내지 도 21d는 공간 학습 능력을 결정하기 위한 장소 시험(place trial) 동안 모든 그룹에서 플랫폼의 위치를 찾기 위한 대기 시간이 연속 5일 동안 유의미하게 감소하지 않았음을 보여준다. 도 21e는 대조군과 비교하여 모든 그룹에 대해 마우스가 표적 사분면(quadrant)에서 보낸 시간 백분율(프로브 시험(probe trial))에서 유의한 차이가 없음을 보여준다. 도 21f는 모든 그룹에 대해 동물이 플랫폼을 횡단한 횟수에 유의한 차이가 없음을 보여준다. 데이터는 시닥의 MCT를 사용한 일원분산분석을 사용하여 분석되었다. 모든 데이터는 95% CI의 평균으로 나타내었다. 동물 수, WT 그룹: ETG: CON n=14, IN VEH n=8, IN-DAN n=12, SQ-DAN n=13, LTG: IN-DAN n=14, SQ-DAN n=13; TG 그룹: ETG: CON n=13, IN-VEH n=10, IN-DAN n=10, SQ-DAN n=9, LTG: IN-DAN n=14, SQ-DAN n=14.
도 22a 내지 도 22f는 야생형(WT) 그룹에서 장기 단트롤렌 처리 후 부작용을 보여준다. 단트롤렌(IN-DAN) 또는 비히클(IN-VEH)의 비강내 투여 및 단트롤렌의 피하 투여(SQ-DAN)는 조기 처리 그룹(ETG)의 경우 2개월령에서 또는 지연 처리 그룹(LTG)의 경우 6개월령에서 시작하여 주 3회 투여되었다. 도 22a는 10개월령의 모든 그룹에 대해 로타로드 테스트를 사용하여 측정된 운동 기능을 보여준다. 일원분산분석 및 던넷 다중 비교 테스트(MCT)에서는 처리 그룹과 대조군 그룹 사이에 유의한 차이는 검출되지 않았다. (kETG: CON n=14, IN-VEH n=12, IN-DAN n=17, SQ-DAN n=14; LTG: IN-DAN n=15, SQ-DAN n=13). 도 22b는 10개월령의 모든 그룹에 대해 매장 식품 테스트를 사용하여 후각을 측정한 것을 보여준다. 비모수적 데이터에 대한 크러스컬-월리스 테스트 및 던의 MCT에서는 유의한 차이가 발견되지 않았다. (ETG: CON n=14, IN-VEH n=8, IN-DAN n=12, SQ-DAN n=14; LTG: IN-DAN n=15, SQ-DAN n=13). 도 22c는 혈장 알라닌 아미노트랜스퍼레이스(ALT) 활성을 측정함으로써 ETG 및 LTG에 대해 간 기능이 평가되었음을 보여준다. ALT는 던넷의 MCT로 일원분산분석을 사용하여 대조군 그룹과 비교하여 LTG에서 6-개월 피하 처리 후 유의미하게 증가하였다(p=0.0142). 던넷의 MCT로 일원분산분석을 한 대조군 그룹과 비교하여 다른 처리 그룹에서 유의한 차이는 검출되지 않았다. (ETG: CON n=7, IN-VEH n=8, IN-DAN n=8, SQ-DAN n=9, LTG: IN-DAN n=8, SQ-DAN n=7). 모든 데이터는 95% CI의 평균으로 나타내었다. 도 22d는 11개월령의 ETG 마우스의 H&E 염색된 절편에서 간 병리가 조사되었음을 보여준다. ETG 그룹 간에 큰 차이는 관찰되지 않았다(3개의 절편/동물; CON n=3, IN-VEH n=3, IN-DAN n=3, SQ-DAN n=3, 바=50㎛). 도 22e는 로그 순위(만텔-콕스) 테스트를 사용하여 야생형 대조군(WT CON)과 비교하여 ETG 및 LTG 마우스에서 단트롤렌(IN-DAN, SQ-DAN) 및 비히클(IN-VEH)의 장기 처리 후 사망률을 보여준다. 유의한 차이는 발견되지 않았다(P=0.2388). 도 22f는 동물이 안락사되기 전 12개월령에 체중이 평가되었음을 보여준다. 일원분산분석과 던넷의 MCT에서는 유의한 차이가 검출되지 않았다. (ETG: CON n=13, IN-VEH n=12, IN-DAN n=16, SQ-DAN n=13; LTG: IN-DAN n=13, SQ-DAN n=13). 모든 데이터는 95% CI의 평균으로 나타내었다.
도 23a 내지 도 23b는 야생형(WT-CON) 및 5XFAD(TG-CON) 마우스에서 아밀로이드 플라크 수준을 보여준다. 야생형(WT)(도 23a) 및 5XFAD(TG)(도 23b) 대조군 마우스의 해마 및 피질에서 6E10 면역반응성의 대표적인 현미경 사진이 제시되어 있다(바=100㎛).
도 24a 내지 도 24d는 야생형(WT) 및 5XFAD(TG) 마우스에서 시냅스 밀도를 보여준다. 도 24a 내지 도 24b는 웨스턴 블롯을 사용하여 발현 PSD95 및 시냅신1에 의해 결정된 시냅스 기능을 보여준다. 도 24c 내지 도 24d는 일원분산분석 및 던넷의 MCT을 사용한 대조군과 비교하여 모든 그룹에서 유의한 차이가 검출되지 않았음을 보여준다. 각 그룹에서 N=3. 모든 데이터는 95% CI의 평균으로 나타내었다.
도 25a 내지 도 25c는 알츠하이머병 환자로부터 유도된 다능성 줄기 세포의 미성숙 뉴런으로의 분화가 유의하게 손상되었음을 보여준다. 건강한 인간 대상체(대조군) 또는 산발성(SAD) 또는 가족성(FAD) 알츠하이머병 환자로부터의 유도 다능성 줄기 세포(iPSC)가 뉴런으로 분화하였다(23일). 면역조직화학이 TUJ1(도 25a), DCX(도 25b) 및 MAP2(도 25c) 염색을 위해 사용되었다. 모든 데이터는 평균±SD로 나타내었다. N=3-10. *P<0.05.
도 26은 알츠하이머병(AD) 환자의 iPSC 유래된 미성숙 뉴런에서 글루타메이트 용량-의존적으로 감소된 세포 생존능력을 보여준다. 건강한 인간 대상체(대조군), 산발성(SAD) 또는 가족성(FAD) 알츠하이머병 환자의 유도 다능성 줄기 세포(iPSC)로부터 유래된 뉴런은 24시간 동안 다양한 농도의 글루타메이트에 노출되었다. 세포 생존능력은 MTT 감소 검정에 의해 측정되었다. 10mM에서 최대 30mM까지의 글루타메이트는 용량-의존적으로 세 가지 유형의 세포에서 상당한 세포 손상을 유도하였다. 모든 데이터는 평균±SD로 나타내었다. N=3-5, ****P<0.0001.
도 27은 글루타메이트 용량-의존적으로 감소된 ATP 양이 가족성 알츠하이머병(FAD) 세포에서 훨씬 더 많음을 보여준다. 건강한 인간 대상체(대조군), 산발성(SAD) 또는 가족성(FAD) 알츠하이머병 환자의 유도 다능성 줄기 세포(iPSC)로부터 유래된 뉴런은 24시간 동안 다양한 농도의 글루타메이트에 노출되었다. ATP 양은 상업적으로 이용 가능한 루시퍼레이스-루시페린 시스템을 사용하여 평가되었다. 모든 데이터는 평균±SD로 나타내었다. N=5 내지 8, ****P<0.0001, &P<0.05, &&P<0.01.
도 28a 내지 도 28d는 가족성 알츠하이머병(FAD) 환자로부터의 뉴런에서 미토콘드리아 칼슘 농도의 글루타메이트 매개된 비정상적인 상승을 유의하게 저해하였음을 보여준다. 건강한 인간 대상체(대조군), 산발성(SAD) 또는 가족성(FAD) 알츠하이머병 환자의 유도 다능성 줄기 세포(iPSC)로부터 유래된 뉴런은 단트롤렌 20μM 전처리 유무에 관계없이 1시간 동안 20mM 글루타메이트에 노출되었다. 미토콘드리아 칼슘 농도는 해파리 발광단백질 에쿼린(aequorin)-기반 프로브를 사용하여 측정되었다. 단트롤렌 전처리(도 28a) 없이 또는 단트롤렌 전처리(도 28b)와 함께 글루타메이트에 노출된 미토콘드리아 칼슘 농도 변화의 전형적인 곡선이 나타나 있다. 대조군 뉴런과 비교하여, 글루타메이트 20mM은 FAD 뉴런에서 상당히 더 높은 미토콘드리아 칼슘 농도의 피크 상승(도 28C) 및 전체 노출(AUC(곡선 아래 면적))(도 28d)을 증가시켰으며, 이는 단트롤렌의 전처리에 의해 제거되었다. 모든 데이터는 평균±SD로 나타내었다. N=3 내지 9. *P<0.05, **P<0.01.
본 발명은 본 개시내용의 일부를 형성하는 다음의 상세한 설명을 참조하여 보다 쉽게 이해될 수 있다. 본 발명은 본 명세서에 설명 및/또는 도시된 특정 방법, 제품, 조건 또는 매개변수에 제한되지 않고, 본 명세서에서 사용된 용어는 단지 예로서 특정 실시형태를 설명하기 위한 목적으로 사용되며 청구된 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않음을 이해하여야 한다.
달리 정의되지 않는 한, 본 출원과 관련하여 사용되는 과학 및 기술 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 또한, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함하고 복수 용어는 단수를 포함한다.
상기 및 본 개시내용 전체에 걸쳐 사용된 바와 같이, 달리 나타내지 않는 한 하기 용어 및 약어는 하기 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다.
본 개시내용에서, 단수 형태는 복수의 언급을 포함하며, 특정 수치에 대한 언급은 문맥이 명확하게 달리 나타내지 않는 한 적어도 해당 특정 값을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "화합물"에 대한 언급은 당업자에게 공지된 이러한 화합물 및 이의 등가물 중 하나 이상에 대한 언급 등이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "복수"는 하나 이상을 의미한다. 값의 범위가 표현될 때, 또 다른 실시형태는 하나의 특정 값으로부터 그리고/또는 다른 특정 값까지를 포함한다. 유사하게는, when 값이 근사치로 표현될 때, 선행사 "약"을 사용하여, 특정 값이 또 다른 실시형태를 형성하는 것으로 이해된다. 모든 범위는 포괄적이며 조합 가능하다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "성분", "조성물", "화합물의 조성물", "화합물", "약물", "약물학적으로 활성인 작용제", "활성제", "치료제", "요법", "치료" 또는 "약제"는 대상체(인간 또는 동물)에 투여될 때 국부 및/또는 전신 작용에 의해 목적하는 약물학적 및/또는 생리학적 효과를 유도하는 화합물 또는 물질의 화합물 또는 조성물을 지칭하기 위해 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "치료" 또는 "요법"(뿐만 아니라 이의 상이한 형태)은 예방적(preventative)(예를 들어, 예방적(prophylactic)), 치유적 또는 완화적 치료를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "치료하는"은 병태, 질환 또는 장애의 적어도 하나의 부작용 또는 부정적 효과 또는 증상을 완화 또는 감소시키는 것을 포함한다.
용어 "대상체", "개체" 및 "환자"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되며, 본 발명에 따른 약제학적 조성물로 예방적 치료를 비롯한 치료를 받는 동물, 예를 들어, 인간을 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "대상체"는 인간 및 비-인간 동물을 지칭한다. 용어 "비-인간 동물" 및 "비-인간 포유동물"은 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되며, 모든 척추동물, 예를 들어, 포유동물, 예컨대, 비-인간 영장류, (특히 고등 영장류), 양, 개, 설치류, (예를 들어, 마우스 또는 래트), 기니피그, 염소, 돼지, 고양이, 토끼, 소, 말 및 비-포유동물, 예컨대, 파충류, 양서류, 닭 및 칠면조를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 신경발생 및/또는 시냅스생성의 손상이 적어도 부분적으로 소포체(ER) 리아노딘 수용체(RyR)의 과활성화에 의해 유발되는 알츠하이머병(AD)이 있거나 또는 있는 것으로 의심되는 대상체의 뉴런에서 손상된 신경발생 및/또는 시냅스생성을 저해하는 방법을 제공하며, 방법은 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물의 ER 칼슘 이온(Ca 2+ )의 방출을 감소시키는데 효과적인 양을 대상체에게 비강내로 투여하는 단계를 포함한다. 실시형태에서, 신경발생은 신경전구 세포(NPC)로부터 미성숙 뉴런으로의 신경 발생에 이어서, 미성숙 뉴런으로부터 피질 뉴런으로의 신경 발생을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 시냅스생성은 피질 뉴런에서 발생한다. 일부 실시형태에서, 피질 뉴런은 콜린성 뉴런이다. 다양한 실시형태에서, 피질 뉴런은 기저 전뇌 콜린성 뉴런(BFCN) 뉴런, 전두엽전 피질 뉴런, 해마 뉴런 또는 이들의 조합이다. 실시형태에서, AD는 가족성 알츠하이머병(FAD)이다. 또 다른 실시형태에서, AD는 산발성 알츠하이머병(SAD)이다. 특정 실시형태에서, RyR은 유형 2 RyR(RyR-2)이다. 특정 실시형태에서, RyR은 유형 1 RyR(RyR-1)이다. 특정 실시형태에서, RyR은 유형 3 RyR(RyR-3)이다. 특정 실시형태에서, RyR은 모든 RyR 하위유형을 포함하는 RyR 하위유형, 예를 들어, RyR-1, RyR-2, RyR-3의 조합이다. 다양한 실시형태에서, 소포체(ER) 리아노딘 수용체(RyR)의 과활성화는 미토콘드리아 칼슘을 상승시켜 ATP를 감소시킨다. 특정 실시형태에서, 단트롤렌의 비강내 투여는 상승된 미토콘드리아 칼슘을 감소시키고, 세포질 ATP를 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물은 매일 투여된다. 일부 실시형태에서, 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물은 주당 3회 투여된다. 일부 실시형태에서, 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물은 주당 1회 투여된다. 다양한 실시형태에서, 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물은 4개월 내지 1년 동안 투여된다. 일부 실시형태에서, 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물은 4개월 내지 6개월 동안 투여된다. 소정의 실시형태에서, 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물은 최대 4개월 동안 투여된다. 다양한 실시형태에서, 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물은 1년 이상 동안 투여된다. 다양한 실시형태에서, 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물은 최대 2년 동안 투여된다. 다양한 실시형태에서, 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물은 2년 이상 동안 투여된다. AD가 있거나 또는 있는 것으로 의심되는 대상체의 뉴런에서 손상된 신경발생 및/또는 시냅스생성을 저해하기 위해 제공된 방법의 다양한 실시형태에서, 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물의 비강내 투여는 대상체의 후각 기능, 운동 기능 또는 간 기능을 손상시키지 않는다.
다른 양태에서, 본 발명은 신경병리 및 인지기능장애가 알츠하이머병(AD)에 의해 유발되는 신경병리 및 인지기능장애의 발병 후 인지 기능의 저하를 개선하고/하거나 늦추는 방법을 제공하며, 방법은 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물의 NMDA 수용체 및/또는 리아노딘 수용체의 과활성화를 저해하는데 효과적인 양을 이를 필요로 하는 대상체에게 비강내로 투여하는 단계를 포함한다. 특정 실시형태에서, 인지 기능은 기억력, 학습, 사고, 주의력, 지각, 언어 사용, 추론, 의사 결정, 문제 해결 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, AD는 가족성 알츠하이머병(FAD)이다. 다양한 실시형태에서, AD는 산발성 알츠하이머병(SAD)이다. 특정 실시형태에서, RyR은 유형 2 RyR(RyR-2)이다. 특정 실시형태에서, RyR은 유형 1 RyR(RyR-1)이다. 특정 실시형태에서, RyR은 유형 3 RyR(RyR-3)이다. 특정 실시형태에서, RyR은 유형 3 RyR(RyR-3)이다. 특정 실시형태에서, RyR은 모든 RyR 하위유형을 포함하는 RyR 하위유형, 예를 들어, RyR-1, RyR-2, RyR-3의 조합이다. 일부 실시형태에서, 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물은 매일 투여된다. 일부 실시형태에서, 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물은 주당 3회 투여된다. 일부 실시형태에서, 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물은 주당 1회 투여된다. 다양한 실시형태에서, 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물은 4개월 내지 1년 동안 투여된다. 일부 실시형태에서, 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물은 4개월 내지 6개월 동안 투여된다. 소정의 실시형태에서, 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물은 최대 4개월 동안 투여된다. 다양한 실시형태에서, 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물은 1년 이상 동안 투여된다. 다양한 실시형태에서, 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물은 최대 2년 동안 투여된다. 다양한 실시형태에서, 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물은 2년 이상 동안 투여된다. 신경병리 및 인지기능장애가 AD에 의해 유발되는 신경병리 및 인지기능장애의 발병 후 인지 기능의 저하를 개선하고/하거나 늦추기 위해 제공된 방법의 다양한 실시형태에서, 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물의 비강내 투여는 대상체의 후각 기능, 운동 기능 또는 간 기능을 손상시키지 않는다.
소정의 실시형태에서, 인지기능장애는 단기 또는 장기 기억력 상실, 학습 장애, 사고 장애, 주의력/집중 장애, 지각 장애, 언어 사용 장애, 추론 장애, 의사결정 장애/판단력 저하, 문제 해결 장애, 혼란, 불량한 운동 협응 또는 이들의 조합이다. 특정 실시형태에서, 기억력 상실은 해마-의존적 및 해마-독립적 기억력 상실이다. 다양한 실시형태에서, 신경병리는 뇌 뉴런 사이의 아밀로이드 축적이다.
신경병리 및 인지기능장애가 AD에 의해 유발되는 신경병리 및 인지기능장애의 발병 후 인지 기능의 저하를 개선하고/하거나 늦추는 방법의 일부 실시형태에서, 방법은 치료적 유효량의 글루타메이트 수용체 길항제를 대상체에게 투여하는 단계를 더 포함한다. 방법의 일부 실시형태에서, 방법은 (a) 대상체 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물을 대상체에게 비강내로 투여하기 전 대상체로부터 뇌척수액(cerebrospinal fluid: CSF)을 얻는 단계; 및 (b) CSF에서 글루타메이트의 수준을 결정하는 단계로서, 대조군 대상체로부터 얻은 CSF에서의 글루타메이트의 수준보다 더 높은 (b) 단계에서 결정된 글루타메이트의 수준은 단트롤렌을 사용한 치료에 대한 대상체의 적합성을 나타내는, 상기 CSF에서 글루타메이트의 수준을 결정하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물의 비강내 투여는 대상체의 후각 기능, 운동 기능 또는 간 기능을 손상시키지 않는다.
일부 실시형태에서, 방법은 치료적 유효량의 글루타메이트 수용체 길항제를 투여하기 전 대상체로부터 CSF를 얻는 단계; 및 CSF에서 글루타메이트의 수준을 결정하는 단계로서, 대조군 대상체로부터 얻은 CSF에서 글루타메이트의 수준보다 높은 결정된 글루타메이트의 수준은 글루타메이트 수용체 길항제를 사용한 치료에 대한 대상체의 적합성을 나타내는, 상기 CSF에서 글루타메이트의 수준을 결정하는 단계를 더 포함한다.
특정 실시형태에서, 글루타메이트 수용체 길항제는 글루타메이트-결합 부위에서 경쟁적 길항작용에 의해 NMDA 수용체를 차단하는 작용제이거나 또는 글리신, 펜시클리딘 및/또는 마그네슘 결합 부위에서 비경쟁적 길항작용에 의해 NMDA 수용체를 차단하는 작용제이다. 일부 실시형태에서, 글루타메이트-결합 부위에서 경쟁적 길항작용에 의해 NMDA 수용체를 차단하는 작용제는 셀포텔(selfotel)(CGS 19755) 압티가넬(aptiganel)(CNS 1102), CGP 37849, APV 또는 AP-5(R-2-아미노-5-포스포노펜타노에이트), 2-아미노-7-포스포노-헵탄산(AP-7), 3-[(R)-2-카복시피페라진-4-일]-프로프-2-엔일-1-포스포산(CPPene) 및/또는 아스파탐이다. 일부 실시형태에서, 펜시클리딘(PCP), 마그네슘 및/또는 MK-801(다이조실핀(dizocilpine)) 결합 부위에서 비경쟁적 길항작용에 의해 NMDA 수용체를 차단하는 작용제는 메만틴(memantine), 케타민(ketamine), 펜시클리딘, 3-MEO-PCP, 8A-PDHQ, 아만타딘(amantadine), 아토목세틴(atomoxetine), AZD6765, 아그마틴(agmatine), 델루세민(delucemine), 델루세민, 엑스트랄로르판(dextrallorphan), 덱스트로메토르판(dextromethorphan), 덱스트로르판, 다이페니딘(diphenidine), 에탄올, 에티사일리딘(eticylidine), 가사이클리딘(gacyclidine), 메톡세타민(methoxetamine: MXE), 미노사이클린(minocycline), 나이트로메만틴(nitromemantine), 이산화질소, PD-137889, 롤리사이클리딘(rolicyclidine), 테노사이클리딘(tenocyclidine), 메톡시딘, 틸레타민(tiletamine), 네라멕세인(neramexane), 엘리프로딜(eliprodil), 에톡사드롤(etoxadrol), 덱소사드롤(dexoxadrol), WMS-2539, NEFA, 레마세미드(remacemide), 마그네슘 설페이트, 압티가넬, HU-211, 후페리진 A(huperzine A), 다이펩타이드 D-Phe-L-Tyr, 이보가인(Ibogaine), 아포사이나세아에(Apocynaceae), 레마세미드, 린코필린(Rhynchophylline), 가바펜틴(gabapentin) 또는 다이조실핀(MK-801)이다. 일부 실시형태에서, 글리신 결합 부위에서 비경쟁적 길항작용에 의해 NMDA 수용체를 차단하는 작용제는 (GLYX-13), NRX-1074, 7-클로로카이누렌산, 4-클로로카이누레닌(AV-101), 5,7-다이클로로카이누렌산, 카이누렌산, TK-40(GluN1 글리신 결합 부위에서의 경쟁적 길항제), 1-아미노사이클로-프로페인카복실산(ACPC), L-페닐알라닌 또는 제논이다.
다른 양태에서, 본 발명은 알츠하이머병(AD)의 증상의 발병 전에 기억력을 개선하는 방법을 제공하며, 방법은 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물의 NMDA 수용체 및/또는 리아노딘 수용체의 과활성화를 저해하는데 효과적인 양을 이를 필요로 하는 대상체에게 비강내로 투여하는 단계를 포함한다. AD의 증상의 발병 전에 기억력을 개선하기 위해 제공된 방법의 일부 실시형태에서, 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물의 비강내 투여는 대상체의 후각 기능, 운동 기능 또는 간 기능을 손상시키지 않는다. 특정 실시형태에서, AD의 증상은 신경병리, 인지기능장애 또는 이들의 조합이다. 다양한 실시형태에서, 인지기능장애는 단기 또는 장기 기억력 상실, 학습 장애, 사고 장애, 주의력/집중 장애, 지각 장애, 언어 사용 장애, 추론 장애, 의사결정 장애/판단력 저하, 문제 해결 장애, 혼란, 불량한 운동 협응 또는 이들의 조합이다. 실시형태에서, 기억력 상실은 해마-의존적 및 해마-독립적 기억력 상실이다. 일부 실시형태에서, 신경병리는 뇌 뉴런 사이의 아밀로이드 축적이다. 일부 실시형태에서, AD는 가족성 AD(FAD)이다. 소정의 실시형태에서, AD는 산발성 AD(SAD)이다. 특정 실시형태에서, RyR은 유형 2 RyR(RyR-2)이다. 특정 실시형태에서, RyR은 유형 1 RyR(RyR-1)이다. 특정 실시형태에서, RyR은 유형 3 RyR(RyR-3)이다. 특정 실시형태에서, RyR은 모든 RyR 하위유형을 포함하는 RyR 하위유형, 예를 들어, RyR-1, RyR-2 및 RyR-3의 조합이다. 일부 실시형태에서, 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물은 매일 투여된다. 일부 실시형태에서, 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물은 주당 3회 투여된다. 일부 실시형태에서, 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물은 주당 1회 투여된다. 다양한 실시형태에서, 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물은 4개월 내지 1년 동안 투여된다. 일부 실시형태에서, 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물은 4개월 내지 6개월 동안 투여된다. 소정의 실시형태에서, 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물은 최대 4개월 동안 투여된다. 다양한 실시형태에서, 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물은 1년 이상 동안 투여된다. 다양한 실시형태에서, 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물은 최대 2년 동안 투여된다. 다양한 실시형태에서, 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물은 2년 이상 동안 투여된다.
AD의 증상의 발병 전에 기억력을 개선하는 방법의 일부 실시형태에서, 방법은 치료적 유효량의 글루타메이트 수용체 길항제를 대상체에게 투여하는 단계를 더 포함한다. 방법의 일부 실시형태에서, 방법은 (a) 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물을 대상체에게 비강내로 투여하기 전에 대상체로부터 뇌척수액(CSF)을 얻는 단계; 및 (b) CSF에서 글루타메이트의 수준을 결정하는 단계로서, 대조군 대상체로부터 얻은 CSF에서 글루타메이트의 수준보다 높은 (b) 단계에서 결정된 글루타메이트의 수준은 단트롤렌을 사용한 치료에 대한 대상체의 적합성을 나타내는, 상기 CSF에서 글루타메이트의 수준을 결정하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 치료적 유효량의 글루타메이트 수용체 길항제를 투여하기 전에 대상체로부터 CSF를 얻는 단계; 및 CSF에서 글루타메이트의 수준을 결정하는 단계로서, 대조군 대상체로부터 얻은 CSF에서 글루타메이트의 수준보다 높은 결정된 글루타메이트의 수준은 글루타메이트 수용체 길항제를 사용한 치료에 대한 대상체의 적합성을 나타내는, 상기 CSF에서 글루타메이트의 수준을 결정하는 단계를 더 포함한다. 특정 실시형태에서, 글루타메이트 수용체 길항제는 글루타메이트-결합 부위에서 경쟁적 길항작용에 의해 NMDA 수용체를 차단하는 작용제이거나, 또는 글리신, 펜시클리딘 및/또는 마그네슘 결합 부위에서 비경쟁적 길항작용에 의해 NMDA 수용체를 차단하는 작용제이다. 일부 실시형태에서, 글루타메이트-결합 부위에서 경쟁적 길항작용에 의해 NMDA 수용체를 차단하는 작용제는 셀포텔(CGS 19755) 압티가넬(CNS 1102), CGP 37849, APV 또는 AP-5(R-2-아미노-5-포스포노펜타노에이트), 2-아미노-7-포스포노-헵탄산(AP-7), 3-[(R)-2-카복시피페라진-4-일]-프로프-2-엔일-1-포스포산(CPPene) 및/또는 아스파탐이다. 일부 실시형태에서, 펜시클리딘(PCP), 마그네슘 및/또는 MK-801(다이조실핀) 결합 부위에서 비경쟁적 길항작용에 의해 NMDA 수용체를 차단하는 작용제는 메만틴, 케타민, 펜시클리딘, 3-MEO-PCP, 8A-PDHQ, 아만타딘, 아토목세틴, AZD6765, 아그마틴, 델루세민, 델루세민, 엑스트랄로르판, 덱스트로메토르판, 덱스트로르판, 다이페니딘, 에탄올, 에티사일리딘, 가사이클리딘, 메톡세타민(MXE), 미노사이클린, 나이트로메만틴, 이산화질소, PD-137889, 롤리사이클리딘, 테노사이클리딘, 메톡시딘, 틸레타민, 네라멕세인, 엘리프로딜, 에톡사드롤, 덱소사드롤, WMS-2539, NEFA, 레마세미드, 마그네슘 설페이트, 압티가넬, HU-211, 후페리진 A, 다이펩타이드 D-Phe-L-Tyr, 이보가인, 아포사이나세아에, 레마세미드, 린코필린, 가바펜틴 또는 다이조실핀(MK-801)이다. 일부 실시형태에서, 글리신 결합 부위에서 비경쟁적 길항작용에 의해 NMDA 수용체를 차단하는 작용제는 (GLYX-13), NRX-1074, 7-클로로카이누렌산, 4-클로로카이누레닌(AV-101), 5,7-다이클로로카이누렌산, 카이누렌산, TK-40(GluN1 글리신 결합 부위에서의 경쟁적 길항제), 1-아미노사이클로-프로페인카복실산(ACPC), L-페닐알라닌 또는 제논이다.
다른 양태에서, 본 발명은 알츠하이머병(AD)의 증상의 발병 후 기억력 상실을 개선하는 방법을 제공하되, 상기 기억력 상실은 AD에 의해 유발되며, 방법은 NMDA 수용체 및/또는 리아노딘 수용체의 과활성화를 저해하는데 효과적인 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물의 양(RyR)을 이를 필요로 하는 대상체에게 비강내로 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물의 비강내 투여는 대상체의 후각 기능, 운동 기능 또는 간 기능을 손상시키지 않는다. 특정 실시형태에서, AD의 증상은 신경병리, 인지기능장애 또는 이들의 조합이다. 다양한 실시형태에서, 인지기능장애는 단기 또는 장기 기억력 상실, 학습 장애, 사고 장애, 주의력/집중 장애, 지각 장애, 언어 사용 장애, 추론 장애, 의사결정 장애/판단력 저하, 문제 해결 장애, 혼란, 불량한 운동 협응 또는 이들의 조합이다. 실시형태에서, 기억력 상실은 해마-의존적 및 해마-독립적 기억력 상실이다. 일부 실시형태에서, 신경병리는 뇌 뉴런 사이의 아밀로이드 축적이다. 일부 실시형태에서, AD는 가족성 AD(FAD)이다. 소정의 실시형태에서, AD는 산발성 AD(SAD)이다. 특정 실시형태에서, RyR은 유형 2 RyR(RyR-2)이다. 특정 실시형태에서, RyR은 유형 1 RyR(RyR-1)이다. 일부 실시형태에서, RyR은 유형 3 RyR(RyR-3)이다. 특정 실시형태에서, RyR은 모든 RyR 하위유형을 포함하는 RyR 하위유형, 예를 들어, RyR-1, RyR-2 및 RyR-3의 조합이다. 제공된 방법의 일부 실시형태에서, 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물은 매일 투여된다. 일부 실시형태에서, 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물은 주당 3회 투여된다. 일부 실시형태에서, 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물은 주당 1회 투여된다. 다양한 실시형태에서, 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물은 4개월 내지 1년 동안 투여된다. 일부 실시형태에서, 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물은 4개월 내지 6개월 동안 투여된다. 소정의 실시형태에서, 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물은 최대 4개월 동안 투여된다. 다양한 실시형태에서, 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물은 1년 이상 동안 투여된다. 다양한 실시형태에서, 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물은 최대 2년 동안 투여된다. 다양한 실시형태에서, 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물은 2년 이상 동안 투여된다.
AD의 증상의 발병 후 기억력을 개선하는 방법의 일부 실시형태에서, 방법은 치료적 유효량의 글루타메이트 수용체 길항제를 대상체에게 투여하는 단계를 더 포함한다. 방법의 일부 실시형태에서, 방법은 (a) 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물을 대상체에게 비강내로 투여하기 전에 대상체로부터 뇌척수액(CSF)을 얻는 단계; 및 (b) CSF에서 글루타메이트의 수준을 결정하는 단계로서, 대조군 대상체로부터 얻은 CSF에서 글루타메이트의 수준보다 높은 (b) 단계에서 결정된 글루타메이트의 수준은 단트롤렌을 사용한 치료에 대한 대상체의 적합성을 나타내는, 상기 CSF에서 글루타메이트의 수준을 결정하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 치료적 유효량의 글루타메이트 수용체 길항제를 투여하기 전에 대상체로부터 CSF를 얻는 단계; 및 CSF에서 글루타메이트의 수준을 결정하는 단계로서, 대조군 대상체로부터 얻은 CSF에서 글루타메이트의 수준보다 높은 결정된 글루타메이트의 수준은 글루타메이트 수용체 길항제를 사용한 치료에 대한 대상체의 적합성을 나타내는, 상기 CSF에서 글루타메이트의 수준을 결정하는 단계를 더 포함한다. 특정 실시형태에서, 글루타메이트 수용체 길항제는 글루타메이트-결합 부위에서 경쟁적 길항작용에 의해 NMDA 수용체를 차단하는 작용제이거나, 또는 글리신, 펜시클리딘 및/또는 마그네슘 결합 부위에서 비경쟁적 길항작용에 의해 NMDA 수용체를 차단하는 작용제이다. 일부 실시형태에서, 글루타메이트-결합 부위에서 경쟁적 길항작용에 의해 NMDA 수용체를 차단하는 작용제는 셀포텔(CGS 19755) 압티가넬(CNS 1102), CGP 37849, APV 또는 AP-5(R-2-아미노-5-포스포노펜타노에이트), 2-아미노-7-포스포노-헵탄산(AP-7), 3-[(R)-2-카복시피페라진-4-일]-프로프-2-엔일-1-포스포산(CPPene) 및/또는 아스파탐이다. 일부 실시형태에서, 펜시클리딘(PCP), 마그네슘 및/또는 MK-801(다이조실핀) 결합 부위에서 비경쟁적 길항작용에 의해 NMDA 수용체를 차단하는 작용제는 메만틴, 케타민, 펜시클리딘, 3-MEO-PCP, 8A-PDHQ, 아만타딘, 아토목세틴, AZD6765, 아그마틴, 델루세민, 델루세민, 엑스트랄로르판, 덱스트로메토르판, 덱스트로르판, 다이페니딘, 에탄올, 에티사일리딘, 가사이클리딘, 메톡세타민(MXE), 미노사이클린, 나이트로메만틴, 이산화질소, PD-137889, 롤리사이클리딘, 테노사이클리딘, 메톡시딘, 틸레타민, 네라멕세인, 엘리프로딜, 에톡사드롤, 덱소사드롤, WMS-2539, NEFA, 레마세미드, 마그네슘 설페이트, 압티가넬, HU-211, 후페리진 A, 다이펩타이드 D-Phe-L-Tyr, 이보가인, 아포사이나세아에, 레마세미드, 린코필린, 가바펜틴 또는 다이조실핀(MK-801)이다. 일부 실시형태에서, 글리신 결합 부위에서 비경쟁적 길항작용에 의해 NMDA 수용체를 차단하는 작용제는 (GLYX-13), NRX-1074, 7-클로로카이누렌산, 4-클로로카이누레닌(AV-101), 5,7-다이클로로카이누렌산, 카이누렌산, TK-40(GluN1 글리신 결합 부위에서의 경쟁적 길항제), 1-아미노사이클로-프로페인카복실산(ACPC), L-페닐알라닌 또는 제논이다.
다른 양태에서, 본 발명은 대상체의 뇌에서 단트롤렌의 농도 및 지속시간을 증가시키는 방법을 제공하며, 방법은 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물의 양을 뇌에서 단트롤렌의 농도 및 지속시간을 증가시키는 것을 필요로 하는 대상체에게 비강내로 투여하는 단계를 포함한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 알츠하이머병(AD)이 있거나 또는 있는 것으로 의심되는 대상체의 뉴런에서 손상된 신경발생 및/또는 시냅스생성을 저해하는 방법을 제공하되, 상기 신경발생 및/또는 시냅스생성의 손상은 적어도 부분적으로 소포체(ER) 리아노딘 수용체(RyR)의 과활성화에 의해 유발되며, 방법은 (a) ER 칼슘 이온(Ca2 + )의 방출을 감소시키는데 효과적인 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물의 양을 상기 대상체에게 비강내로 투여하는 단계; 및 (b) 치료적 유효량의 글루타메이트 수용체 길항제를 (a) 단계의 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물의 비강내 투여는 대상체의 후각 기능, 운동 기능 또는 간 기능을 손상시키지 않는다. 일부 실시형태에서, 방법은 c) (a) 단계 전에 대상체로부터 뇌척수액(CSF)을 얻는 단계; 및 d) CSF에서 글루타메이트의 수준을 결정하는 단계로서, 대조군 대상체로부터 얻은 CSF에서 글루타메이트의 수준보다 높은 단계 (d)에서 결정된 글루타메이트의 수준은 단트롤렌을 사용한 치료에 대한 대상체의 적합성을 나타내는, 상기 CSF에서 글루타메이트의 수준을 결정하는 단계를 더 포함한다. 다양한 실시형태에서, 방법은 (b) 단계 전에 대상체로부터 CSF를 얻는 단계; 및 CSF에서 글루타메이트의 수준을 결정하는 단계로서, 대조군 대상체로부터 얻은 CSF에서 글루타메이트의 수준보다 높은 결정된 글루타메이트의 수준은 글루타메이트 수용체 길항제를 사용한 치료에 대한 대상체의 적합성을 나타내는, 상기 CSF에서 글루타메이트의 수준을 결정하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 글루타메이트 수용체 길항제는 글루타메이트-결합 부위에서 경쟁적 길항작용에 의해 NMDA 수용체를 차단하는 작용제이거나, 또는 글리신, 펜시클리딘 및/또는 마그네슘 결합 부위에서 비경쟁적 길항작용에 의해 NMDA 수용체를 차단하는 작용제이다. 다양한 실시형태에서, 글루타메이트-결합 부위에서 경쟁적 길항작용에 의해 NMDA 수용체를 차단하는 작용제는 셀포텔(CGS 19755) 압티가넬(CNS 1102), CGP 37849, APV 또는 AP-5(R-2-아미노-5-포스포노펜타노에이트), 2-아미노-7-포스포노-헵탄산(AP-7), 3-[(R)-2-카복시피페라진-4-일]-프로프-2-엔일-1-포스포산(CPPene) 및/또는 아스파탐이다. 일부 실시형태에서, 펜시클리딘(PCP), 마그네슘 및/또는 MK-801(다이조실핀) 결합 부위에서 비경쟁적 길항작용에 의해 NMDA 수용체를 차단하는 작용제는 메만틴, 케타민, 펜시클리딘, 3-MEO-PCP, 8A-PDHQ, 아만타딘, 아토목세틴, AZD6765, 아그마틴, 델루세민, 델루세민, 엑스트랄로르판, 덱스트로메토르판, 덱스트로르판, 다이페니딘, 에탄올, 에티사일리딘, 가사이클리딘, 메톡세타민(MXE), 미노사이클린, 나이트로메만틴, 이산화질소, PD-137889, 롤리사이클리딘, 테노사이클리딘, 메톡시딘, 틸레타민, 네라멕세인, 엘리프로딜, 에톡사드롤, 덱소사드롤, WMS-2539, NEFA, 레마세미드, 마그네슘 설페이트, 압티가넬, HU-211, 후페리진 A, 다이펩타이드 D-Phe-L-Tyr, 이보가인, 아포사이나세아에, 레마세미드, 린코필린, 가바펜틴 또는 다이조실핀(MK-801)이다. 다양한 실시형태에서, 글리신 결합 부위에서 비경쟁적 길항작용에 의해 NMDA 수용체를 차단하는 작용제는 (GLYX-13), NRX-1074, 7-클로로카이누렌산, 4-클로로카이누레닌(AV-101), 5,7-다이클로로카이누렌산, 카이누렌산, TK-40(GluN1 글리신 결합 부위에서의 경쟁적 길항제), 1-아미노사이클로-프로페인카복실산(ACPC), L-페닐알라닌 또는 제논이다. AD가 있거나 또는 있는 것으로 의심되는 대상체의 뉴런에서 손상된 신경발생 및/또는 시냅스생성을 저해하는 방법의 일부 실시형태에서, 신경발생은 신경전구 세포(NPC)에서 미성숙 뉴런으로의 신경발생에 이어서 미성숙 뉴런에서 피질 뉴런으로의 신경 발생을 포함한다. 다양한 실시형태에서, 시냅스생성은 피질 뉴런에서 발생한다. 일부 실시형태에서, 피질 뉴런은 콜린성 뉴런이다. 소정의 실시형태에서, 피질 뉴런은 기저 전뇌 콜린성 뉴런(BFCN) 뉴런, 전두엽전 피질 뉴런, 해마 뉴런 또는 이들의 조합이다. 특정 실시형태에서, AD는 가족성 알츠하이머병(FAD) 또는 산발성 알츠하이머병(SAD)이다. 일부 실시형태에서, RyR은 유형 2 RyR(RyR-2)이다. 특정 실시형태에서, RyR은 유형 1 RyR(RyR-1)이다. 일부 실시형태에서, RyR은 유형 3 RyR(RyR-3)이다. 특정 실시형태에서, RyR은 모든 RyR 하위유형을 포함하는 RyR 하위유형, 예를 들어, RyR-1, RyR-2 및 RyR-3의 조합이다. 소정의 실시형태에서, 소포체(ER) 리아노딘 수용체(RyR)의 과활성화는 미토콘드리아 칼슘을 상승시켜 ATP를 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 단트롤렌의 비강내 투여는 상승된 미토콘드리아 칼슘을 감소시키고, 세포질 ATP를 증가시킨다. 제공된 방법의 일부 실시형태에서, 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물은 매일 투여된다. 일부 실시형태에서, 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물은 주당 3회 투여된다. 일부 실시형태에서, 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물은 주당 1회 투여된다. 다양한 실시형태에서, 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물은 4개월 내지 1년 동안 투여된다. 일부 실시형태에서, 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물은 4개월 내지 6개월 동안 투여된다. 소정의 실시형태에서, 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물은 최대 4개월 동안 투여된다. 다양한 실시형태에서, 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물은 1년 이상 동안 투여된다. 다양한 실시형태에서, 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물은 최대 2년 동안 투여된다. 다양한 실시형태에서, 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물은 2년 이상 동안 투여된다.
본 명세서에 인용된 모든 과학 간행물은 그 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용된다.
하기 실시예는 본 발명의 소정의 실시형태를 보다 완전하게 예시하기 위해 제공된다. 그러나, 실시예는 본 발명의 넓은 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예
실시예 1
단트롤렌은 알츠하이머병 환자의 유도 다능성 줄기 세포에서 손상된 신경발생 및 시냅스생성을 저해한다
임의의 특정 이론에 얽매이는 것은 아니지만, 단트롤렌은 리아노딘 수용체의 과활성화 및 라이소솜과 자가포식(autophagy) 기능의 관련 손상으로 인한 칼슘 조절장애의 교정에 의해 손상된 신경발생 및 시냅스생성을 저해하는 것으로 여겨진다. 이 연구에서 SAD 및 FAD 환자 모두로부터의 iPSC와 이들의 파생된 신경전구 세포(NPC) 및 기저 전뇌 콜린성 뉴런(BFCN)을 사용하여 신경발생 및 시냅스생성에 대한 단트롤렌의 효과 및 메커니즘을 연구하였다. 단트롤렌은 RyR 과활성화, 세포내 Ca2+ 조절장애 및 자가포식의 파괴의 교정과 관련된 신경발생 및 시냅스생성의 손상을 크게 개선하였다.
물질 및 방법
세포 배양
인간 대조군(AG02261) 및 산발성 알츠하이머병(AG11414) iPSC를 John A. Kessler의 랩으로부터 얻었다. 가족성 알츠하이머병(GM24675) iPSC는 코리엘 연구소(Coriell Institute)로부터 구입하였다. 한 명의 건강한 인간 대상체 또는 SAD 또는 FAD로 진단받은 한 명의 환자의 피부 섬유아세포로부터 각 유형의 iPSC를 생성하였다. 인간 다능성 줄기 세포를 Matrigel 코팅 플레이트(비디 사이언시스(BD Biosciences))의 mTeSR™1 배지(카탈로그 #05850, 스템 셀 테크놀로지스(Stem Cell Technologies))에서 유지하고, 37℃의 5% CO2 가습 분위기에서 배양하였다. 배양 배지는 매일 교체하였다.
세포 생존능력
문헌[Qiao H, et al., Anesthesiology 2017; 127:490; Ren G, et al., Sci Rep 2017; 7:12378](각각 그 전문이 참조에 의해 원용되어 있음)에 의해 이전에 기술된 바와 같이 24시간에 MTT(3-(4,5-다이메틸티아졸-2-일)-2,5-다이페닐테트라졸륨 브로마이드, 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 미주리주 세인트루이스 소재) 감소 검정을 사용하여 96-웰 플레이트의 상이한 웰 상의 세포 생존능력을 결정하였다. PBS로 세척한 후, 샘플을 MTT(배지 중 0.5 ㎎/㎖)를 함유하는 새로운 배양 배지와 함께 암실에서 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음, 배지를 제거하고, 포마잔을 다이메틸 설폭사이드(DMSO)로 용해시켰다. 흡광도를 플레이트 판독기(Synergy™ H1 마이크로플레이트 판독기, 바이오텍(BioTek), 버몬트주 위누스키 소재)로 540㎚에서 측정하였다.
세포 증식 검정
iPSC를 mTeSR™1 배지 중 Matrigel로 코팅된 커버 유리 상에 플레이팅하였다. 5-브로모데옥시우리딘(BrdU, 인비트로젠(Invitrogen), 오리건주 유진 소재)을 30μM의 최종 농도로 처리 종료 4시간 전에 mTeSR™1 배지에 첨가하였다. 그런 다음, 세포를 4% 파라폼알데하이드에 고정하고, 0.1% Triton X-100으로 투과화하였다. BrdU 검출을 위해, 산 처리(얼음에서 1N HCL 10분, 이어서 실온에서 2N HCL 10분)하여 DNA를 단일 가닥으로 분리하여 1차 항원이 혼입된 BrdU에 접근할 수 있도록 하였다. 차단 용액(0.1% Triton X-100을 함유하는 PBS 중 5% 정상 염소 혈청)과 함께 인큐베이션한 후, 세포를 래트 단일클론 항-BrdU 1차 항원(1:100; 산타 크루즈 바이오테크놀로지(산타 크루즈 Biotechnology), 텍사스주 댈러스 소재)과 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 추후 0.1% Triton X-100을 함유하는 PBS로 세척한 후, 세포를 항-래트 IgG(1: 1,000; 인비트로젠, 오리건주 유진 소재)와 접합된 형광 표지된 2차 항원과 함께 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 세포 핵을 4',6-다이아미디노-2-페닐인돌(DAPI, 인비트로젠, 오리건주 유진 소재)로 실온에서 5분 동안 대비염색하였다. 면역염색된 세포에 커버를 덮은 다음, Olympus BX41TF 형광 현미경(200×; 올림푸스 유에스에이(Olympus USA), 펜실베니아 센터 밸리 소재) 상에 마운팅하였다. iVision 10.10.5 소프트웨어(바이오비전 테크놀로지스(Biovision Technologies), 펜실베니아 엑스턴 소재)를 사용하여 이미지를 획득하였다. 커버 유리 상의 랜덤 위치에서 다섯 세트의 이미지를 획득한 후, ImageJ 1.49v 소프트웨어(내셔널 인스티튜트 오브 헬스(National Institutes of Health), 메릴랜드주의 베서스다 소재)를 사용하여 병합하였다. 총 세포 수에 대한 5-BrdU-양성 세포의 백분율을 계산하고, 적어도 3개의 상이한 배양에서 다른 그룹에 걸쳐 비교하였다.
iPSC의 분화
iPSC에서 피질 뉴런 및 BFCN으로의 분화를 위한 프로토콜은 문헌[Shi Y, et al., Nat Protoc 2012; 7:1836; Bissonnette CJ, et al., Stem Cells 2011; 29:802](각각 그 전문이 참조에 의해 원용되어 있음)에 의해 기술된 바와 같이 이전에 기재된 프로토콜에서 채택하였다. 간략하게는, 피더가 없이(feeder-free) 배양된 iPSC 세포를 Dual-SMAD 저해를 통해 신경전구 세포를 형성하도록 유도하였다. 세포를 SB431542 2uM 및 DMH1 2uM(둘 다 미네소타주 미니애폴리스 소재 토크리스(Tocris) 제품)을 사용한 화학적으로 정의된 조건하에서 7일 동안 배양하였다.
피질 뉴런의 경우, 배지는 제12일에 신경 유지 배지(즉, N-2 및 B-27-함유 배지의 1:1 혼합물임, 여기서 N-2 배지는 DMEM/F-12 GlutaMAX, 1ХN-2, 5 ㎍/㎖ 인슐린, 1mM L-글루타민, 100㎛ 비필수 아미노산, 100μM 2-머캅토에탄올, 50U/㎖ 페니실린 및 50 ㎎/㎖ 스트렙토마이신으로 구성되고, B-27 배지는 신경기초물질(Neurobasal), 1ХB-27, 200mM L-글루타민, 50 U/㎖ 페니실린 및 50 ㎎/㎖ 스트렙토마이신으로 구성됨)로 교체하고, 제12일부터 계속 유지하였다. 세포는 매일 확인하였다. 신경 로제트 구조(neural rosette structure)는 배양물을 약 24일 내지 29일에 도립 현미경으로 관찰하였을 때 명백하였다. 이 시점으로부터, 배지를 격일로 교체하였다.
BFCN 분화를 위해, iPSC-유래 원시 신경 줄기 세포를 SHH(500 ng/㎖; 1845-SH; 알앤디 시스템(R&D System), 미국 미네소타주 소재)하에 발달시킨 다음 24일부터 NGF(50 ng/㎖ 내지 100 ng/㎖; 알앤디)로 처리하였다. 제28일에, 신경전구세포를 5,000 세포/㎠의 밀도로 라미닌에 이전에 플레이팅된 라미닌 기질에 부착시켰다. 플레이팅된 세포를 바람직하게는 문헌[Liu Y, et al., Nat Biotechnol 2013; 31:440](그 전문이 참조에 의해 원용되어 있음)에 기술되어 있는 바와 같이 NGF(50 ng/㎖ 내지 100 ng/㎖; 알앤디), cAMP(1μM; 시그마(Sigma)), BDNF, GDNF(10 ng/㎖; 알앤디), SHH(50 ng/㎖; 알앤디)의 존재하에 신경기초 배지, N2 보충제(인비트로젠)로 구성된 뉴런 분화 배지에서 성장시켰다.
Ca 2+ 측정
ATP 노출 후 iPSC의 세포질 Ca2+ 농도([Ca2+]c)의 변화를 해파리 발광단백질 에쿼린-기반 프로브를 사용하여 측정하였다. 7.5 내지 1.2×104개 세포를 24 웰 플레이트의 12㎜ 커버슬립 상에 플레이팅하고, 50% 내지 60%의 컨플루언스로 성장시킨 다음, 제조업체의 지침에 따라 리포펙타민 3000 형질감염 시약(써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific))을 사용하여 cyt-Aeq 플라스미드로 형질감염시켰다. 다음날, 형질감염된 세포를 1mM CaCl2가 보충된 수정된 Krebs-Ringer 완충액(mM 단위: 140 NaCl, 2.8 KCl, 2 MgCl2, 10 Hepes, 11 글루코스, pH 7.4)에서 5μM 코엘렌터라진과 함께 1시간 동안 인큐베이션한 다음, 관류 챔버로 옮겼다. 모든 에쿼린 측정은 KRB에서 수행하였고, 지정된 것과 동일한 배지에 마취제를 첨가하였다. 주문 제작한 에쿼린 기록 시스템에서 실험을 수행하였다. 세포외 Ca2+ 유리 실험을 위해, Ca2+ 유리 완충액을 사용하였다(5mM EGTA가 포함된 Ca2+가 없는 KRB). 저장성(hypotonic) Ca2+-풍부 용액(H2O 중 10mM CaCl2)에서 100μM 디지토닌으로 세포를 용해하여 나머지 에쿼린 풀을 방출함으로써 실험을 종료하였다. 이전에 문헌[Filadi R, et al., PNAS 2015; 201504880; Bonora M, et al., Nat Protoc 2013; 8:2105](각각 그 전문이 참조에 의해 원용되어 있음)에 기술된 바와 같이 pH, [Mg2+] 및 이온 강도의 생리학적 조건에서 에쿼린의 Ca2+ 반응 곡선에 기초한 알고리즘에 의해 광 신호를 수집하고 [Ca2+]c 값으로 보정하였다.
NMDA에 대한 노출 후 iPSC의 세포질 Ca2+ 농도([Ca2+]c)의 변화를 이전에 설명된 방법을 사용하여 Fura-2/AM 형광(몰리큘러 프로브(Molecular probe), 오리건주 유진 소재)에 의해 측정하였다. Olympus IX70 도립 현미경(올림푸스 아메리카 인코포레이션(Olympus America Inc), 펜실베니아 센터 밸리 소재) 및 IPLab v3.71 소프트웨어(에스씨아날리틱스(Scanalytics), 위스콘신주 밀워키 소재)에서 검정을 수행하였다. 간략하게는, iPSC를 35㎜ 배양 디쉬 상에 플레이팅하였다.
세포를 Ca2+-미포함 둘베코 변형 이글 배지(DMEM, 깁코(Gibco), 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재)로 3회 세척한 후, 동일한 완충액에서 2.5㎛ Fura-2/AM으로 37℃에서 30분 동안 로딩한 다음, 세포를 2회 세척하고, Ca2+-미포함 DMEM과 함께 37℃에서 추가로 30분 동안 인큐베이션하였다. Fura-2AM은 340㎚ 및 380㎚ 여기에서 교대로 기록하여 측정하였고, 510㎚에서 방출은 각 처리에 대해 최대 10분 동안 검출하였다. 유발된 변화를 단트롤렌 30μM(Dan)이 있거나 없는 500μM NMDA의 처리에 대한 반응으로 기록하였다. 결과는 F340/F380㎚의 비로 나타내었으며, 적어도 3개의 개별 실험으로부터의 평균을 내었다.
웨스턴 블로팅
표준 절차에 따라 웨스턴 블로팅을 수행하였다. 문헌[Hollomon, MG, et al., BMC Cancer 2013; 13:500](그 전문이 참조에 의해 원용되어 있음)에 기술되어 있는 바와 같은 프로테이스의 칵테일의 존재하에 얼음-냉각 용해 완충액(50mM Tris-HCl, 150mM NaCl 및 1% Triton X-100)에서 세포를 용해하여 iPSC 세포로부터의 총 단백질 추출물을 얻었다. 원심분리 후, 상청액을 수집하고, 총 단백질을 바이신코닌산(BCA) 단백질 검정 키트(써모 사이언티픽, 일리노이주 록포드 소재)를 사용하여 정량화하였다. 각 레인에 대해 동일한 양의 단백질을 로딩하고, 15% 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 (SDSPAGE)에서 분리하였다.
전기영동 후, 단백질을 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 막으로 옮겼다. 막을 PBS-T에 용해시킨 5% 무지방 우유로 실온에서 1시간 동안 차단시킨 후, 1차 항원으로 4℃에서 밤새 염색하였다. PBS-T로 세척한 후, 막을 1:1,000 희석으로 2차 항체(HRP 접합된 항-토끼 및 항-마우스 IgG)와 함께 인큐베이션하고, β-액틴을 로딩 대조군으로 사용하였다. 신호를 강화된 화학발광 검출 시스템(밀리포어(Millipore), 매사추세츠주 빌레리카 소재)으로 검출하고, 스캐닝 농도계(scanning densitometry)에 의해 정량화하였다.
면역조직화학
세포를 4% 파라폼알데하이드에서 15분 동안 고정시킨 후 3회 1×PBS로 세척하였다. 그런 다음, 세포를 0.1% Triton X-100을 함유하는 PBS 중 5% 정상 염소 혈청에 의해 실온에서 1시간 동안 차단하였다. 1% BSA 및 0.3% Triton-X-100을 함유하는 1×PBS에서 1차 항체를 4℃에서 밤새 적용하였다. PBS로 3회 세척 후, DAPI(1:2000)와 함께 알렉사 플루오르 접합된 2차 항체(1:1000, 인비트로젠)를 1시간 동안 첨가하였다. 3회 더 세척한 후, 커버슬립을 Prolong Gold antifade 시약(인비트로젠)으로 마운팅하고, 이미지화하였다.
다음의 1차 항체를 사용하였다: Oct4(1:500, 셀 시그널링 테크놀로지(Cell Signaling Technology)), Sox2(1:500, 밀리포어), PAX6(1:500, 바이오레전드(BioLegend)), Tbr 1(1:500, 압캠(Abcam)), ChAT(1:100, 밀리포어), Map2(1:500, 시그마), PSD95(1:500, 바이오레전드), 시냅신-1(1:500, 바이오레전드), EEA1(1:100, 셀 시그널링 테크놀로지), LAMP-2(1:100, 산타 크루즈(Santa Cruz)), 칼넥신(1:100, 셀 시그널링 테크놀로지) 및 LC3(1:200, 셀 시그널링 테크놀로지).
라이소솜 산도 측정
이전에 문헌[Ren G, et al., Sci Rep 2017; 7:12378](그 전문이 원용되어 있음)에 기술되어 있는 바와 같이, 라이소트래커® Red DND-99(몰리큘러 프로브, 오리건주 유진 소재) 프로브 스톡 용액을 HBSS+ 중 50nM의 작업 농도로 희석하였다. IPSC 세포를 mTeSR™1(카탈로그 #05850)에서 Matrigel(비디 사이언시스)로 코팅된 커버슬립 상에 플레이팅하였다. HBSS+로 3회 세척한 후, 세포를 미리 가온된(37℃) 프로브 함유 HBSS+와 함께 로딩하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 새로운 배지를 추가하여 표지 용액을 대체하였다. 세포가 충분히 형광성인지 결정하기 위해 사용된 프로브에 대해 올바른 필터 세트가 장착된 형광 현미경에 의해 세포를 관찰하였다. 라이소트래커 Red는 약 590㎚의 최대 방출과 약 577㎚의 최대 여기를 사용하였다.
데이터분석 및 통계
모든 데이터를 Kolmogorov-Smirnov(KS) 정규성 테스트 및 Brown-Forsy 테스트에 의해 정규 분포에 대해 테스트하여 통계적 분석에 모수적 또는 비모수적 테스트가 사용되는지 여부를 결정하였다. 모수적 변수는 평균±SD로 나타내었고, 스튜던트 독립표본 양측 검정 t 테스트, 일방향 또는 양방향 ANOVA에 이어 시닥의 사후 분석(Sidak's post hoc analysis)을 사용하여 분석하였다. 비-모수적 변수는 크러스컬-월리스 테스트에 이어서 던의 다중 비교 테스트를 사용하여 분석하였다. 통계적 분석 및 그래프 생성을 위해 GraphPad Prism 소프트웨어(그래프패드 소프트웨어 인코포레이션(GraphPad Software, Inc.), 미국 소재)를 사용하였다. 0.05 미만의 P 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
결과
단트롤렌은 AD 환자로부터의 iPSC에서 세포 생존능력을 촉진하고 세포 증식의 손상을 저해하였다.
건강한 인간 대상체 또는 SAD/FAD 환자로부터의 iPSC, NPC 및 뉴런을 배양하고, 특정 유형의 세포를 표적으로 하는 특정 항체에 의해 특성화하였다. 건강한 인간 대상체 또는 SAD/FAD 환자 사이에서 iPSC의 MTT 감소 검정에 의해 결정된 세포 생존능력에는 유의한 차이가 없었다. 그러나, 단트롤렌은 MTT를 iPSC SAD에서 15.1%(N=8, P<0.01) 그리고 FAD에서 67.6%(N=7 P<0.0001, 도 1a) 유의하게 증가시켰다. 건강한 인간 대상체와 비교하여, SAD/FAD 환자로부터의 iPSC는 5-BrdU 혼입에 의해 결정된 바와 같이 손상된 증식 능력을 갖는 경향이 있었고, 단트롤렌에 의해 저해된 FAD iPSC에서는 더 현저하였다(도 1b). 대조군과 비교하여, 단트롤렌은 iPSC가 NPC로 분화하는데 유의한 영향을 미치지 않았다.
단트롤렌은 SAD/FAD 세포 모두에서 미성숙 뉴런, 피질 뉴런 및 BFCN으로의 NPC 분화 장애를 개선하였다.
신경발생에 대한 적절한 단트롤렌 신경보호를 발휘하기 위한 파일럿 연구에 기초하여, iPSC의 NPC로의 분화 유도로부터 시작하여 연속 3일 동안 iPSC를 단트롤렌(30μM)으로 처리하였다(도 2a 내지 도 2b 및 도 3a 내지 도 3f). 분화 23일째에 SAD/FAD iPSC로부터 유래된 NPC의 미성숙 뉴런으로의 분화는 대조군과 비교하여 각각 9.1%(N=6, P<0.05) 및 8.18%(N=6, P<0.05)로 감소하였으며, 이는 단트롤렌(도 2a 내지 도 2b)에 의해 제거되었다. 대조군과 비교하여, SAD 및 FAD 환자에서 성숙 피질 뉴런(도 3b, Trb1 양성 세포, 적색)은 대조군과 비교하여 각각 35.2%(N=5, P<0.0001) 및 15.7%(N=5, P<0.05)로 감소되었으며, 이 효과는 단트롤렌에 의해 폐지된 효과이다(도 3c). 소닉 헤지호그(SHH, 도 3d)를 사용하여, iPSC로부터 BFCN(ChAT 양성 뉴런, 녹색)의 생성을 추가로 조사하였다. 대조군과 비교하여, 특정 BFCN으로의 분화(도 3e)는 SAD/FAD iPSC에서 각각 10.7%(N=5, P<0.01) 및 9.2%(N=5, P<0.05)로 감소하였으며(도 3f), 이는 단트롤렌에 의해 폐지되었다.
단트롤렌은 SAD/FAD 환자의 iPSC로부터 생성된 뉴런의 시냅스생성 장애를 구제하였다.
iPSC 유도 기간의 처음 3일 동안 적용된 단트롤렌이 iPSC 기원 뉴런의 시냅스생성에 미치는 영향을 결정하기 위해, 체세포로부터 원의 거리(㎛)로 나타낸 피질 뉴런의 수상돌기와 동심원 사이의 교차의 수를 정량화하였다(도 4a). 대조군 뉴런과 비교하여, SAD 및 FAD 환자 iPSC 모두에서 생성된 피질 뉴런에서 교차(시냅스생성과 같음)의 수가 유의하게 감소하였으며, 체세포로부터 대략 150μM 거리에서(도 4a) 가장 극적으로 각각 76.3%(N=3, P<0.0001) 및 23.7%(N=3, P<0.05)였으며, 이는 특히 SAD 세포에서 단트롤렌에 의해 저해되었다(도 4b). 시냅스 밀도에 대한 단트롤린의 효과는 이중 면역염색 기법을 사용하여 시냅스전 마커인 시냅신-1(녹색) 및 시냅스후 마커인 PSD95(적색)를 사용하여 결정함으로써 조사하였다(도 4c). PSD95(도 4d) 또는 시냅신-1(도 4e)에 의해 결정된 시냅스 밀도는 PSD95에서 SAD로부터 생성된 피질 뉴런을 58.2%(N=4-5, P<0.001)로 또는 FAD로부터 생성된 피질 뉴런을 52.3%(N=5, P<0.01)로 그리고 시냅신-1에서 SAD에서 59.1%(N=4-5, P<0.01) 또는 FAD에서 89.8%(N=5, P<0.0001)까지 상당히 감소시켰으며, 이들 모두 FAD iPSC에서 단트롤렌에 의해 저해되었다.
유형 2 RyR(RyR-2)은 AD 환자로부터의 iPSC에서 비정상적으로 증가되었다.
메커니즘 연구를 위해, RyR-2의 발현을 먼저 면역블롯팅(도 5a, 도 5b) 및 면역염색(도 5c, 도 5d) 둘 다를 사용하여 결정하였다. 건강한 인간 대상체와 비교하여, SAD/FAD 환자 iPSC에서 RyR-2 수준은 FAD에서 39.5%(N=4, P=0.0558) 증가하였고(도 5b), SAD에서 평균 순위가 11.1(N=7, P<0.01) 차이가 났다(도 5d).
단트롤렌은 SAD 및 FAD 환자 모두의 iPSC에서 NMDA 또는 ATP 매개된 세포질 Ca 2+ 농도([Ca 2+ ] c )의 비정상적인 상승을 유의하게 저해하였다.
SAD/FAD iPSC에서 신경발생 및 시냅스생성이 손상되고 단트롤렌에 의해 개선되는 가능한 메커니즘을 추가로 조사하였다. AD iPSC에서 이러한 상승된 RyR-2와 일치하게, 피크 [Ca2+]c(도 6a, 도 6c) 및 통합된 노출(도 6a, 도 6d)의 NMDA 매개성 상승은 단트롤렌에 의해 저해될 수 있는 정상 대조군에서보다 FAD 및 SAD iPSC에서 유의하게 더 높았다(도 6b 내지 도 6d). 세 가지 유형의 세포에 ATP(30μM)를 처리하여 세포내 Ca2+ 저장소로부터의 Ca2+ 방출을 조사하였을 때, SAD/FAD iPSC는 세포외 Ca2+ 의 제거에 의해 폐지된 [Ca2+]c의 유의하게 더 높은 피크 상승을 보였으며(각각 140.4%, P<0.05 또는 128.3% P=0.2055 대 대조군 84.1%, N=5 내지 9), 관련 Ca2+ 유입(influx)은 세포외 공간을 형성하고(도 7a, 도 7b, 도 7e) 1시간 동안 단트롤렌(30μM)에 의해 전처리하였다(도 7c, 도 7f). 세포외 공간으로부터 Ca2+ 유입이 없으면, ATP는 모든 세 가지 세포 유형 모두에서 [Ca2+]c의 전반적인 상승을 유의하게 낮추었다(도 7e). 세포외 Ca2+ 유입의 부재하에, 단트롤렌은 단지 ATP-매개성 피크 또는 [Ca2+]c의 전반적인 상승을 저해하는 경향이 있지만, SAD/FAD 세포에서 통계적으로 유의하지는 않았다(도 7d 또는 도 7g).
단트롤렌은 AD 환자의 iPSC에서 라이소솜 vATPase 및 산도의 감소를 저해하였다.
RyR의 과활성화로 인한 AD 프리세닐린 1 돌연변이에서 감소된 ER 칼슘 농도는 문헌[Lee JH, et al., Cell 2010; 141:1146](그 전문이 참조에 의해 원용되어 있음)에 기술되어 있는 바와 같이 ER에서 라이소솜으로의 vATPase의 합성 및 분비를 손상시키고, 후속적으로 라이소솜 산도 및 기능을 감소시킨다. 본 발명자들은 라이소솜 대 ER vATPase의 변화뿐만 아니라 다양한 유형의 iPSC에서 라이소솜 산도를 결정하였다. vATPase의 위치는 라이소솜(LAMP-2), ER(칼넥신) 및 엔도솜(EEA)을 표적으로 하는 이중 면역염색 및 공국재화에 의해 결정하였고(도 8a), 세포 산도 비히클은 라이소트래커(lysotracker)에 의해 결정하였다(도 8b). 라이소솜 vATPase의 양은 SAD에서 39.7%까지 iPSC에서 유의하게 감소하였으며(N=4, P<0.001 및 FAD는 29.9%(N=4, P<0.05)(도 8c *CON과 비교), 이는 특히 FAD iPSC에서 단트롤렌에 의해 저해될 수 있었다(도 8d *CON과 비교). 일관되게, 세포 산도 비히클은 정상 대조군과 비교하여 SAD 및 FAD iPSC 모두에서 각각 50%(N=4, P<0.0001) 및 33.9%(N=4, P<0.01) 유의하게 감소하였으며, 이는 또한 단트롤렌에 의해 유의하게 저해되었다(도 8e *CON과 비교, +SAD와 비교, #FAD와 비교).
단트롤렌은 AD 환자의 iPSC에서 자가포식 활성을 촉진하였다.
자가포식에 대한 단트롤렌의 효과를 추가로 결정하였다. 자가포식 바이오마커 LC3II의 전체 세포 수준에 의해 표시된 전체 활성은 세 가지 유형의 iPSC 간에 유의하게 다르지 않았다(도 9a 내지 도 9c). 그러나, 단트롤렌 처리는 증가된 LC3II 수준을 각각 SAD iPSC에서 47.3%(N=5, P=0.3483)(도 9b) 및 FAD iPSC에서 49.4%(N=3 P<0.001)(도 9c #FAD와 비교) 증가시켰으며, 손상된 자가포식 플럭스를 손상시키는 작용제인 바필로마이신으로 동시 처리에 의해 추가로 증가될 수 있었다(도 9b, 도 9c). 이는 자가포식 플럭스를 손상시키기보다는 자가포식 유도를 증가시켰음을 시사한다. SAD/FAD iPSC에서 손상된 자가포식 플럭스는 각각 SAD iPSC에서 48.9%(N=3, P=0.3594) 및 FAD iPSC에서 110.9%(N=3, P<0.05) 유의하게 상승된 p62에 의해 추가로 뒷받침되었다(도 9d *CON과 비교).
이 연구는 NPC로부터 공통 피질 및 AD-특이적 결핍 BFCN으로의 신경발생이 건강한 인간 대상체와 비교하여 SAD/FAD 환자에서 유의하게 손상되었으며, 이는 단트롤렌에 의해 저해될 수 있었음을 나타낸다. 또한, 단트롤렌은 SAD/FAD 환자의 iPSC로부터 유래된 피질 뉴런에서 시냅스생성 장애를 유의하게 저해하였다. SAD/FAD iPSC의 RyR-2 수치가 비정상적으로 증가되었으며, 이는 NMDA 수용체 활성화 및 관련된 제대로 기능하지 못하는 라이소솜 산도 및 자가포식 기능에 의해 촉발된 [Ca2+]c의 현저한 비정상적인 상승에 기여하였다. 지속적으로, 단트롤렌은 SAD/FAD 세포에서 자가포식 활성을 촉진하는 동시에 세포내 Ca2+ 항상성 및 라이소솜 기능장애의 NMDA-매개성 파괴를 유의하게 저해하였다.
이 연구로부터의 결과는 비정상적으로 상승된 RyR-2(도 5a 내지 도 5d) 및 그 결과로 인한 AD 환자에서의 Ca2+ 조절장애(도 6a 내지 도 6d, 도 7a 내지 도 7g)가 손상된 라이소솜 산도 및 기능과 관련이 있었음을 나타낸다(도 8a 내지 도 8e). 자가포식 플럭스는 AD 세포에서 지속적으로 손상되었지만, 단트롤렌은 개선된 손상된 라이소솜 산도 및 기능을 개선하기는 하였지만 주로 자가포식 활성을 촉진하는 것으로 보였다(도 8a 내지 도 8e, 도 9a 내지 도 9f). AD 환자의 iPSC로부터 유래된 뉴런에서 손상된 신경발생/시냅스생성의 단트롤렌 매개성 저해는 전반적인 자가포식 활성을 촉진하고 손상된 라이소솜 기능을 개선하는 능력과 관련이 있었다.
실시예 2
단트롤렌의 비강내 투여는 뇌에서 농도 및 지속시간을 증가시켰다.
비강내 단트롤렌 투여는 독성 및 부작용을 최소화하면서 다양한 신경퇴행성 질환, 특히 AD에서 단트롤렌의 잠재적인 신경보호 효과를 최대화하기 위한 새로운 치료적 접근법으로 제안된다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 이 연구는 일반적으로 사용되는 경구 투여와 비교하여 뇌에서 단트롤렌의 농도 및 지속시간을 유의하게 증가시켰다는 것을 입증한다.
물질 및 방법
동물
모든 절차는 펜실베니아 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee: IACUC)에 의해 승인된 프로토콜에 따라 수행하였다. 2개월령 내지 4개월령, 체중 25g 내지 35g의 수컷 및 암컷 C57BL/6 마우스를 모든 실험에 사용하였다. 마우스에 음식과 물을 자유롭게 주면서 12시간 명암 주기로 21℃ 내지 22℃에서 유지하였다. 마우스의 고통과 수를 최소화하기 위해 모든 노력을 기울였다.
약물 투여
약동학적 연구를 위해, 마우스를 무작위로 다음 2개의 실험 그룹으로 나누었다; 비강내 단트롤렌(N=4 내지 13/그룹, 비강내 투여 후 20분 동안 N=13; 반복성 및 신뢰성을 확인하기 위해 이 시점에서 실험을 반복함) 및 경구 단트롤렌(N=5) 전달. 비히클은 RYANODEX®(이글 파마슈티칼스 인코포레이션(Eagle Pharmaceuticals, Inc.))에 대해 보고된 것과 동일하며, 125㎎의 만니톨, 25㎎의 폴리소르베이트 80, 20㎖의 ddH2O 중 4㎎의 포비돈 K12로 구성되고 pH가 10.3으로 조정되었다. 단트롤렌(시그마, 미주리주 세인트루이스 소재)을 5㎎/㎖의 농도로 비히클에 희석하였다. 비강내 투여를 위해, 마우스를 잡고 손바닥에 고정시켰다. 체중 그램당 1㎕의 약물 제형 또는 비히클을 피펫을 사용하여 전달하였다. 비강내 전달을 돕기 위해 몇 가지 주요 단계를 수행하였다: 1) 마우스의 머리는 바닥과 평행하도록 잡고 있었다; 2) 마우스가 머리나 목을 움직일 수 없도록 잡고 있었다; 3) 작은 액적을 피펫에서 배출하였다; 4) 다음 액적이 전달되기 전 마우스가 용액을 흡입하도록 2초 내지 3초 유지하였다; 5) 전달이 끝난 후 마우스를 10초 내지 15초 동안 잡고 있었다. 이 절차에는 약 10분/마우스가 소요되었다. 경구 투여는 이전에 문헌[Wu, Z., et al., Alzheimer Dis Assoc Disord 2015; 29:184](그 전문이 참조에 의해 원용되어 있음)에 기술되어 있는 바와 같이 수행하였다. 마우스를 같은 방식으로 배치하고, 체중 그램당 5㎕의 약물을 마이크로리터 주사기에 부착된 위관을 사용하여 전달하였다.
뇌로부터 단트롤렌 청소율을 감소시키는 것은 문헌[Fuchs, H., et al., Drug Metab Dispos 2014; 42:1761](그 전문이 참조에 의해 원용되어 있음)에 기술되어 있는 바와 같이 뇌로부터 단트롤렌을 펌핑하는 1차 단백질(P-gp/BCRP)에 대한 저해제 니모디핀(n=5) 또는 엘라크리다르(n=6)의 비강내 투여에 의해 조사하였다. 니모디핀(시그마, 미주리주 세인트루이스 소재) 및 엘라크리다르(시그마, 미주리주 세인트루이스 소재)를 각각 2㎎/㎖ 및 10㎎/㎖의 비히클에 희석하였다. 비강내 니모디핀 또는 엘라크리다르 또는 비히클 1 ㎕/체중 1g을 5㎎/㎖ 단트롤렌(1 ㎕/체중 1g)의 비강내 투여 30분 전에 전달하였다. 단트롤렌의 조직 농도를 비강내 단트롤렌 투여 20분 후에 조사하였다.
약물 안전성 연구를 위해, 단트롤렌의 장기 투여의 잠재적인 유해 효과를 조사하였다. 별도의 마우스 코호트를 위에 설명된 바와 같이 3주 또는 4개월 동안 비강내 단트롤렌(5 ㎎/㎏) 또는 비강내 비히클을 3회/주 투여받는 그룹으로 무작위로 나누었다.
샘플 수집
동물을 2% 내지 4%의 아이소플루레인으로 마취시키고, 단트롤렌 투여 10분, 20분, 30분, 50분, 70분, 120분, 150분 및 180분 후 심장 천자에 의해 혈액 샘플(0.2㎖)을 얻었다. 그런 다음, 동물을 심장내 관류 및 PBS로 방혈하여 안락사시켜 뇌를 수거하기 전에 단트롤렌이 뇌혈관계에서 완전히 세척되도록 하였다. 항응고된 혈액 샘플을 4℃에서 10분 동안 3000rpm에서 원심분리하고, 상청액을 수집하였다. 모든 절차는 냉장실(4℃)에서 수행하였다. 혈장 및 뇌 샘플은 모두 -80℃에 보관하였으며, 검정하기 전까지 빛으로부터 보호하였다. 3주의 장기 단트롤렌 투여 및 후각 또는 운동 기능 테스트 후에 별도의 마우스 코호트를 위와 같이 안락사시켰다.
고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)
굴절률 모니터가 장착된 Aiglent Hewlett Packard 모델 1100 시리즈, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 시스템(애질런트 테크놀로지스(Aiglent Technologies))을 사용하여 혈액 및 뇌의 단트롤렌 농도를 정량화하였다. 아세토나이트릴을 이동상의 성분 A로, 포타슘 포스페이트 완충용액(pH 7.0)을 성분 B로 사용하였다. 이동상의 유속은 1.0 ㎖/분이었고, 이동상의 성분 A 및 성분 B의 비율은 각각 12% 내지 88%였다. 254㎚에서 UV 검출기로 검출을 수행하였다.
유해 부작용의 조사를 위한 행동 검정
매장 식품 테스트
마우스 후각은 문헌[Yang, M. and J.N. Crawley, Current protocols in neuroscience, 2009: p. 8.24. 1-8.24. 12](그 전문이 참조에 의해 원용되어 있음)에 기술되어 있는 바와 같이 매장 식품 테스트를 사용하여 3주의 비강내 단트롤렌(5 ㎎/㎏, n=10) 또는 비히클(동일 부피, n=10)을 투여한 후 별도의 코호트에서 평가하였다. 마우스를 무작위로 2개의 실험 그룹(n=10/그룹)으로 나누었다. 단트롤렌 또는 비히클을 1일 1회, 주 3회(평일에는 격일로) 투여하였다. 3주의 장기 투여 후, 동물에게 매장 식품 테스트를 하였다. 1일차에, 쿠키(2마리의 마우스에 대해 쿠키 1개)를 케이지에 넣고 밤새 방치하였다. 쿠키를 먹었는지 확인하기 위해 2일차에 케이지를 관찰하였다. 2일차 오후 4시경, 케이지에서 음식을 제거하고, 실험용 마우스는 밤새 금식시키고 물은 이용할 수 있게 하였다. 3일차 오전 11시경, 마우스를 실험실로 데려와 1시간 동안 적응시켰다. 그런 다음, 마우스를 3㎝ 깊이의 베딩이 있는 깨끗한 케이지에 개별적으로 넣었다. 쿠키는 모서리에 있는 베딩 아래 1㎝에 묻어두었다. 마우스가 음식을 회수하여 앞발로 잡는데 걸린 시간을 최대 900초 동안 기록하였다.
로타로드 테스트
비강내 단트롤렌(5 ㎎/㎏, n=10) 또는 비히클(동일 용량, n=10)을 1일 1회, 3회/주, 4개월 동안 투여한 별도의 마우스 코호트에서 문헌[Peng, J., et al., Neurosci Lett 2012; 516:274](그 전문이 참조에 의해 원용되어 있음)에 기술되어 있는 바와 같이 로타로드로 운동 협응을 조사하였다. 동물을 시험간 30-분 간격으로 9rpm으로 로타로드(IITC 시리즈 8, 라이프 사이언시스(Life Sciences), 캘리포니아 우들랜드 힐스 소재)에서 두 번의 60초 훈련 시험을 받게 하였다. 그런 다음, 마우스를 시험간 60분 간격으로 다양한 속도, 4rpm 내지 40rpm에서 최대 120초 동안 세 번의 테스트 시험을 받게 하였다. 로타로드에서 보낸 시간을 각 마우스에 대해 기록하였다.
통계적 분석
단트롤렌 농도를 측정하고, 평균 ± SEM으로 보고하고, 스튜던트 t-검정(양방향) 또는 일방향 ANOVA에 이어서 터키 사후 분석으로 분석하였다. 본 연구의 모든 분석에 대한 유의 수준은 95%(P<0.05)로 설정하였다. GraphPad Prism 소프트웨어(그래프패드 소프트웨어 인코포레이션(GraphPad Software Inc.))를 모든 통계적 분석에 사용하였다.
결과
비강내 단트롤렌 투여는 뇌에서 피크 농도 및 지속시간을 증가시켰다.
경구 및 비강내 투여 후 혈장 및 뇌 모두에서 단트롤렌 약동학을 비교하였다. 비강 경로로부터의 단트롤렌의 전신 흡수는 경구보다 약간 더 빨랐다(도 10a, 도 10c). 비강내 투여 후 혈장 및 뇌 모두에서 피크 단트롤렌 농도는 경구 경로 후보다 유의하게 더 높았다(도 10a, 도 10c). 혈장 단트롤렌 농도는 경구 투여 후 약 70분에 유의하게 감소하였지만, 비강내 투여 후 비교적 높에 유지되었다(도 10a). 유사하게는, 뇌에서의 단트롤렌 농도는 경구 투여(도 10c, 약 70분)보다 비강내 투여(도 10c, 180분) 후 상당히 더 긴 기간 동안 비교적 높은 수준으로 유지되었다. 따라서, 혈장 및 뇌 모두에서 통합된 단트롤렌 노출은 경구 투여 후보다 비강내 투여 후 유의하게 더 높았다(도 10b, 도 10d).
비강내 단트롤렌은 혈액 뇌 장벽(BBB) 통과에 시간-의존적으로 영향을 미친다.
비강내 단트롤렌이 실제로 BBB를 통한 단트롤렌의 통과를 증가시켰는지 여부를 조사하기 위해, 뇌/혈장 단트롤렌 농도 비를 비교하였다. 경구 투여 후 70분에 단트롤렌 혈장 농도는 0에 가깝기 때문에, 투여 후 120분 전 시점의 단트롤렌 뇌/혈장 농도 비만을 조사하였고, 혈장 및 뇌 단트롤렌 농도가 투여 후 120분에 0에 도달하였기 때문에 비교되었다(도 10a, 도 10c). 경구 투여 후 단트롤렌 뇌/혈장 비는 대부분의 시점에서 비강내 접근법 후와 비교적 동일하다(도 11). 그러나, 비강내 투여 후 뇌 단트롤렌은 경구 투여 후 120분에 혈장 및 뇌 단트롤렌 농도가 모두 0에 도달하였지만 비강내 투여 후 150분에 여전히 소정의 수준으로 유지되었기 때문에, 비강내 투여 후 120분 후에도 비교적 더 높게 유지되었다(도 10a, 도 10c).
비강내 단트롤렌의 장기 사용은 후각 기능을 손상시키지 않았다.
장기 단트롤렌의 비강내 투여에 의한 가능한 코 막 손상 및 기능장애를 조사하기 위해, 주 3회, 5 ㎎/㎏의 비강내 투여 3주 또는 4개월 후 마우스에서 후각 기능 테스트를 수행하였다. 비강내 단트롤렌은 후각 기능에 영향을 미치지 않았으며, 이는 단트롤렌이 장기 비강 투여 후에도 후각 기능에 유의한 부작용이 없음을 나타낸다(도 12).
P-gp/BCRP 저해는 뇌에서 단트롤렌 농도를 증가시키지 않았다.
P-gp/BCRP 저해제 니모디핀 또는 엘라크리다르가 단트롤렌 뇌 농도를 증가시킬 것인지 여부를 조사하였다. 니모디핀 또는 엘라크리다르 모두 단트롤렌 뇌/단트롤렌 혈장 농도 비를 유의하게 증가시키지 않았다(도 13).
이 연구는 RYANODEX®(이글 파마슈티말스 인코포레이션) 제형을 사용하는 경구 투여와 비교할 때 비강내 단트롤렌 투여가 후각, 간 또는 운동 기능에 명백한 부작용 없이 뇌에서 농도 및 지속시간을 유의하게 증가시켰음을 보여준다. 비강내 단트롤렌은 투여 후 처음 70분 동안 BBB를 통한 통과를 증가시키지 않았으며, 이는 이 기간 동안 뇌 농도 대 혈장 농도의 비에 유의한 차이가 없었기 때문이다. P-gp/BCRP 펌프의 저해제는 다양한 단트롤렌 뇌 농도에서 역할을 하지 않았다. 따라서, AD를 비롯한 다양한 신경퇴행성 질환이 있는 환자를 치료하기 위한 단트롤렌의 장기 사용은 실현 가능하며 견딜 수 있다. 비강내 단트롤렌은 일반적으로 사용되는 경구 접근법과 비교하여 피크 뇌 농도를 크게 증가시켜, AD를 비롯한 다양한 신경퇴행성 질환을 치료하기 위해 단트롤렌을 최소 치료 농도에 도달하게 하는 새로운 방법을 제공한다. 또한, 뇌에서 단트롤렌의 지속시간은 경구 투여 후보다 비강내 투여 후에 더 오래 지속되어, 뇌의 전반적인 노출이 유의하게 증가하였다. 전반적으로 더 많은 뇌 단트롤렌 노출은 잠재적으로 감소된 부작용과 함께 뇌졸중 및 AD를 포함한 다양한 신경퇴행성 질환에서 성공적인 단트롤렌 신경보호의 기회를 유의하게 증가시킬 것이다. 이 연구의 결과는 비강내 투여시 뇌 농도가 경구 접근법시 0nM과 비교하여 150분에 479nM(150.53 ng/g)(도 10c)였음을 보여준다. 따라서, 상당한 말초 부작용을 최소화하면서 신경보호를 위해 최소한으로 요구되는 뇌 농도에 도달하기 위해 경구 투여에 비해 상대적으로 더 낮은 용량의 비강내 단트롤렌이 가능하다. 비강내 단트롤렌 투여는 경구 단트롤렌 투여와 관련된 것보다 더 낮은 혈장 단트롤렌 농도와 관련이 있다. 비강내 접근법은 또한 경구 투여와 달리 간의 첫 번째 통과 대사를 회피한다. 이는 AD를 비롯한 다양한 신경퇴행성 질환의 치료 및 신경보호를 위한 중요한 새로운 방법이다.
이 연구에서 비강내 단트롤렌은 처음 70분 동안 경구 접근법과 비교할 때 BBB를 통한 통과를 증가시키지 않았다. 그러나, 뇌에서 단트롤렌 농도가 더 오래 지속되기 때문에, 비강내 투여 후 120분 내지 150분 사이의 단트롤렌 혈장/뇌 농도 비는 여전히 계산할 수 있지만, 혈장과 뇌 단트롤렌 농도가 모두 0에 도달한 경우 경구 접근법 후에는 계산할 수 없다. 본 명세서에서 이 연구는 3주 동안 단트롤렌의 비강내 투여가 후각 기능에 영향을 미치지 않았으며, 최대 4개월의 비강 처리 후에도 운동 기능에 영향을 미치거나 명백한 부작용을 일으키지 않았음을 나타낸다. 이러한 결과는 단트롤렌의 장기 투여가 비교적 안전하여, AD의 치료에 장기적인 사용이 가능함을 나타낸다. 단트롤렌 뇌 농도 및 지속시간을 유지할 수 있지만 혈장 농도는 감소시킬 수 있는 이러한 새로운 방법은 장기적인 사용을 더 견딜 수 있고 실행 가능한 것으로 만들 것이다.
요약하면, RYANODEX® 제형을 사용한 비강내 단트롤렌 투여는 장기 사용 후에도 임의의 명백한 유의한 부작용 없이 뇌 피크 농도 및 지속시간을 크게 증가시켜 AD 및 그 안에 나타나는 인지 장애를 치료하는 것을 포함하여 다양한 신경퇴행성 질환에서 단트롤렌 신경보호를 강화하기 위한 새로운 잠재적인 접근법을 제공한다.
실시예 3
알츠하이머 5XFAD 마우스에서 질환-조절 약물로서의 비강내 단트롤렌
이 연구는 5XFAD 마우스에서 비강내 단트롤렌의 혈장과 뇌 농도 및 치료적 효과 및 관련 부작용을 증상-완화뿐만 아니라 질환-조절 약물로서 문헌[Peng J, et al., Neurosci Lett 2012; 516:274](그 전문이 참조에 의해 원용되어 있음)에 기술되어 있는 바와 같은 다양한 FAD 동물 모델에서 수행된 피하 접근법과 비교하여 조사하였다
물질 및 방법
동물
모든 절차는 펜실베니아 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)에 의해 승인되었다. 두 쌍의 5XFAD 마우스(B6SJL-Tg(APPSwFIL on, PSEN1*M146L*LV286V) 6799Vas/Mmjax) 및 야생형 마우스(B6SJLF1/J) 마우스를 잭슨 래보래토리(Jackson Laboratory)(메인주 바 하버 소재)에서 구입하여 사육하였다. 이들 5XFAD 형질전환 마우스는 문헌[Oakley H, et al., J Neurosci. 2006; 26:10129](그 전문이 참조에 의해 원용되어 있음)에 기술되어 있는 바와 같이 2개의 FAD 돌연변이 M146L 및 L286V를 보유하는 인간 PS1과 함께 스웨덴(K670N, M671L), 플로리다(I716V) 및 런던(V717I) 가족성 알츠하이머병(FAD) 돌연변이가 있는 돌연변이체 인간 APP를 과발현한다. 5XFAD 마우스 모델은 문헌[Hillmann A, et al., Neurobiol Aging 2012; 33 833](그 전문이 참조에 의해 원용되어 있음)에 기술되어 있는 바와 같이 세포내 아밀로이드가 2개월령에 처음 나타나고, 6개월령에 인지기능장애가 시작되어 약물 효능을 테스트하는데 적합한 공격성 AD 동물 모델이다. 동물을 펜실베니아 대학의 동물 시설에 12시간 조명 주기 및 제어된 실온하에 수용하였다. 음식과 물은 케이지에서 이용 가능하였다. 모든 마우스는 1개월령 이내에 젖을 떼고, 젖을 떼기 전에 중합효소연쇄반응(PCR)분석에 의해 유전적으로 확인하였다. 이 시점에서, 마우스를 연령 및 성별에 따라 상이한 케이지로 나누었으며, 케이지당 최대 5마리가 있었다. 수컷 및 암컷 마우스를 둘 다 이 연구에 사용하였다.
비강내 대 피하 단트롤렌 투여 및 약물 농도 측정
단트롤렌 투여
2개월령의 WT 마우스를 비강내(N=5) 또는 피하(N=5) 그룹으로 무작위로 나누어, 5㎖의 주사용 멸균수 중 125㎎의 만니톨, 25㎎의 폴리소르베이트 80, 4㎎의 포비돈 K12으로 구성되고 pH가 10.3으로 조정된 RYANODEX®(단트롤렌 소듐, 이글 파마슈티말스 인코포레이션, 뉴 저지 소재)에 대해 동일한 비히클에 용해된 단트롤렌을 투여하였다. 단트롤렌(시그마, 미주리주 세인트루이스 소재)을 각각 비강내 또는 피하 투여를 위해 5㎎/㎖ 및 1㎎/㎖의 농도로 비히클에 희석하였다. 비강내 투여를 위해, 한 손으로 마우스의 목덜미를 잡고 다른 손으로 체중의 그램당 총 1 ㎕/그램 체중의 단트롤렌 용액 또는 비히클을 피펫을 사용하여 전달하였다. 예를 들어, 무게가 20g인 마우스에는 20㎕의 용액이 주어졌을 것이다. 이전에 문헌[Med Lett Drugs Ther. 2015; 57:100](그 전문이 참조에 의해 원용되어 있음)에 기술되어 있는 바와 같이 용액을 마우스의 코에 직접 천천히 전달하였다. 마우스에 최소한의 스트레스를 가하고 각각의 용액이 비강에 머물고 위나 폐에 들어가지 않도록 주의를 기울였다. 이전에 문헌[Peng J, et al., Neurosci Lett. 2012; 516:274](그 전문은 참조에 의해 원용되어 있음)에 기술되어 있는 바와 같이 체중 1그램당 5㎕의 총 피하 주사로 피하 단트롤렌 투여를 수행하였다.
단트롤렌 농도의 측정
2개월령의 야생형 마우스에 단트롤렌을 5 ㎎/㎏의 투여량으로 1회 피하 또는 비강내 투여하였다. 위의 문헌[Peng J, et al.]에 기술되어 있는 바와 같이 약물 투여 후 20분 또는 60분에 혈장 또는 뇌 조직을 얻었다. 혈장 또는 뇌 단트롤렌 농도는 위의 문헌[Peng J, et al.]에 기술되어 있는 바와 같이 Agilent Hewlett Packard 모델 1100 시리즈 및 방법을 사용하여 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 결정하였다. 간략하게는, 동결된 뇌 조직을 200㎕의 혼합 용액(아세토나이트릴:H2O, 2:1)에 넣고 균질화한 다음, 현탁액을 4°161 Cat 20,000Хg에서 20분 동안 원심분리하고, 50㎕의 상청액을 분석을 위해 HPLC에 주입하였다. 아세토나이트릴은 이동상의 성분 A로 사용하고, 포타슘 포스페이트 완충액 용액(pH 7.0)은 성분 B로 사용하였다. 이동상의 유속은 1.0 ㎖/분이었고, 이동상의 성분 A 및 성분 B에 대해 각각 12% 내지 88%의 비율을 가졌다. 254㎚에서 UV 검출기로 검출을 수행하였다. 단백질은 뇌 또는 혈장으로부터 침전되지 않았다.
단트롤렌 처리 및 실험 그룹
이 연구에는 연령이 일치하는 수컷 및 암컷 마우스를 모두 사용하였다. 대략 1개월령에 유전자형을 분석하였을 때 모든 마우스를 무작위로 12개 그룹으로 나누었다. 처음 8개의 그룹은 이들 그룹에 대한 처리가 동물이 1차 아밀로이드 병리의 발병 및 인지기능장애의 출현 전 2개월령이 되었을 때 시작되었기 때문에 조기 처리 그룹(ETG, 도 14 참조)으로 명명하였다. 다음 4개의 그룹은 질환 조절 약물로서 단트롤렌을 결정하기 위해 단트롤렌 처리가 동물이 아밀로이드 병리의 발병 및 인지기능장애 후인 6개월령이 되었을 때 시작되었기 때문에 지연 처리 그룹(LTG, 도 14 참조)으로 명명하였다. 상이한 처리 그룹의 동물에 비강내 단트롤렌(IN-DAN), 피하 단트롤렌(SQ-DAN), 비강내 대조군 비히클(IN-VEH)을 투여하거나 또는 어떠한 처리도 하지 않았다(CON, 음성 대조군). ETG의 동물은 세포내 아밀로이드 병리 및 임의의 인지기능장애의 발병 전인 2개월령부터 치료를 받았다(월요일, 수요일 및 금요일). 지연 처리 그룹(LTG), 비강내 단트롤렌(IN-DAN) 및 피하 단트롤렌(SQ-DAN)은 세포외 아밀로이드 플라크 축적 및 인지기능장애의 발병 후 6개월령에 동일한 처리를 시작하였다. 대조군 비히클을 새로 만들었으며, 리아노덱스의 모든 비활성 성분을 포함하였다(문헌[Med Lett Drugs Ther. 2015; 57:100]). 각각 5 ㎎/㎖ 또는 1 ㎎/㎖ 용량 수준의 새로운 단트롤렌을 사용하였다. 비강내(5 ㎎/㎖) 및 피하(1 ㎎/㎖) 투여를 위한 비히클을 투여하기 전 매번 새로운 단트롤렌 용액을 만들었다. 모든 마우스는 12개월령에 안락사 전까지 계속 치료를 받았다.
매장 식품 테스트
문헌[Yang M, et al., Curr Protoc Neurosci. 2009; 48:8.24](그 전문이 참조에 의해 원용되어 있음)에 의해 기술되어 있는 바와 같은 매장 식품 테스트를 위한 3-일 프로토콜을 사용하여 8개월령에 모든 그룹에서 후각 기능을 평가하였다.
첫날에, 마우스는 일반적인 상황하에 수용 케이지에 넣어 두었고; 쿠키(문헌[Galletas La Moderna, S.A. de C.V.]; 마우스 2마리당 쿠키 1개)를 케이지 베딩 아래 24시간 동안 묻어둔 후 먹은 쿠키 수를 기록하였다. 마우스를 둘째 날 오후 4시에 시작하여 셋째 날 오전 9시까지 금식시켰다. 이 기간 동안 물은 자유롭게 이용할 수 있게 하였다.
매장 식품 테스트를 3일차의 대략 오전 9시 내지 11시에 수행하였다. 마우스를 테스트 전 적어도 1시간 동안 시험실에 적응시켰다. 구석에 있는 베딩 아래 하나의 쿠키가 묻힌 상태에서 마우스를 깨끗한 케이지 베딩이 포함된 깨끗한 케이지에 개별적으로 넣었다. 동물이 쿠키를 찾는데 걸린 시간(앞발로 쿠기를 잡는 것으로 확인함)을 수동으로 기록하였다. 동물이 15분 이내에 쿠키를 찾지 못하면, 홈 케이지에 다시 넣었다. 각 동물에 대해 깨끗한 케이지 및 베딩을 사용하였으며, 조사자는 실험 조건에 대해 맹검 상태였다.
로타로드 테스트
근육 이완제로서의 단트롤렌의 일반적인 부작용인 근력 약화를 검출하기 위해 운동 기능을 조사하였다. 가속 로타로드(IITC 시리즈 8, 라이프 사이언시스, 캘리포니아 우들랜드 힐스 소재)에 걸린 시간을 6개월령(데이터 미제시)의 ETG 및 9개월령의 모든 그룹의 마우스에 대해 위의 문헌[Peng J, et al.]에 기술된 바와 같이 평가하였다. 간략하게는, 동물을 시험 적어도 1시간 전에 시험실에 적응시켰다. 30분 간격으로 일정한 속도(9rpm)에서 2회의 60초 훈련 시험을 수행하였다. 그런 다음, 3회의 120초 테스트 시험을 시험 사이에 60분 간격을 두고 점진적으로 증가하는 속도(4rpm 내지 40rpm)에서 수행하였다. 로타로드에서 떨어지기까지 걸린 시간을 자동으로 기록하고 분석하였다.
공포 조건화 테스트
기억력 및 학습은 ETG의 경우 6개월령 및 11개월령에서 평가하였지만, LTG의 경우 11개월령에서만 평가하였다. 해마-의존적 및 해마-독립적 기억력 둘 다를 문헌[Zhang Y, et al., Ann Neurol 2012; 71:687](그 전문이 참조에 의해 원용되어 있음)에 의해 기술되어 있는 바와 같은 공포 조건화 테스트를 사용하여 평가하였다. 동물을 시험실에 적응시키기 위해 시험 적어도 1시간 전에 시험실로 데려왔다. 테스트 제1일에, 각 마우스를 테스트 챔버에 넣고, 각 주기 사이에 60-초 간격을 두고 3개의 조건-자극 페어링을 거쳤다. 소리 자극(tone stimulation)으로는 2000Hz 및 85dB의 30초 소리를 사용하였고, 충격 자극(충격 stimulation)으로는 0.7㎃의 2-초 전기 발 충격을 사용하였다. 마지막 자극 30초 후 챔버에서 마우스를 꺼내었다. 제2일에, 해마-의존적 기억력을 측정하기 위해 맥락적 공포 조건화 테스트를 먼저 수행하였다. 마우스를 소리 또는 충격 없이 동일한 챔버에 6분 동안 둔 다음 챔버로부터 꺼내었다. 2시간 후, 해마-독립적 기억력을 측정하기 위해 단서적 공포 조건화 테스트를 수행하였다. 마우스를 상이한 세척 용액을 사용하여 크기와 냄새가 다른 또 다른 챔버에 넣었다. 처음 3분 동안 소리 또는 충격은 없었다. 나중에 마우스에 정지 시간이 이록된 각 주기 사이에 60초 간격으로 3주기의 동일한 소리를 겪게 하였다. 그런 다음, 마지막 소리 60초 후 동물을 챔버로부터 꺼내었다. ANY-미로 제어된 공포 조건화 시스템은 비디오 카메라 및 정지 시간이 기록되는 ANY-미로 소프트웨어(V.4.99 스토엘팅 컴퍼니(Stoelting Co.), 일리노이주 우드 데일 소재)가 장착된 소음-감소 챔버(모델: 46000-590, 유고 바실(UGO Basile), 이탈리아 제모니오 소재)로 구성하였다. 훈련 시험의 첫째 날과 맥락적-공포 조건화 테스트의 둘째 날에는 75% 알코올 용액을 사용하고 그리고 단서적-공포 조건화 테스트의 둘째 날에 물을 사용하여 시험 사이에 챔버를 철저하게 청소하였다. 조사자는 처리 그룹에 대해 맹검이었다.
모리스 수중 미로
학습 및 기억력을 또한 모리스 수중 미로(MWM)를 사용하여 11개월령에 모든 그룹에 대해 측정하였다. 간략하게는, 물로 채워진 1.5m 직경의 풀과 15㎝의 플랫폼을 전체 테스트에 걸쳐 사용하였다. 물은 티타늄 다이옥사이드로 불투명하게 하고, 온도는 21℃ 내지 24℃로 조절하였다. 처음 5일(1일에서 제5일) 동안, 마우스는 4일에 걸쳐 단서적 시험을 거쳤다. 풀은 흰색 커튼으로 둘러싸고, 마우스를 위한 신호로 상단에 깃발이 있는 플랫폼은 물 아래로 1㎝ 내지 1.5㎝ 잠기게 하였다. 플랫폼의 위치 및 출발점은 단서적 시험 동안 무작위였다. 마우스가 풀에서 플랫폼으로 탈출하였을 때, 15초 동안 거기에 머물도록 허용하였다. 마우스가 플랫폼을 찾는데 실패하면, 실험자는 플랫폼으로 부드럽게 안내하였다. 각 마우스가 플랫폼을 찾는데 걸린 시간을 기록하였다. 다음 5일(6일에서 10일) 동안, 동물은 매일 네 군데에서 시험을 거쳤다. 커튼 및 플랫폼은 제거하였다. 벽에는 몇 가지 시각적 단서가 있었다. 플랫폼의 위치는 고정하였고, 출발점은 무작위였다. 그때부터 시험실의 상황은 일관되게 유지하였다. 단서적 시험과 유사하게, 마우스는 풀에서 꺼내어지기 전에 15초 동안 플랫폼에 남아 있거나, 또는 마우스가 60초 이내에 플랫폼을 찾지 못하면 플랫폼으로 안내하였다. 각 마우스가 플랫폼을 찾는데 걸린 시간을 기록하였다. 마우스는 플랫폼이 제거된 다음날(11일) 프로브 시험을 거쳤다. 출발점은 플랫폼이 위치한 반대편 사분면에 고정하였다. 각 마우스가 각 사분면에서 보낸 시간을 기록하였다. 반대편 사분면과 비교하여 대상 사분면에서 각 마우스가 보낸 시간의 비를 계산하였다.
조직 준비
모든 행동 테스트를 완료한 후 11개월령 내지 12개월령에 마우스를 희생시켰다. 이전에 설명한 바와 같이, 동물을 코를 통해 전달된 2% 내지 4%의 아이소플루레인으로 마취시키고, 동물의 반응에 따라 농도를 조절하였다. 30G 바늘이 장착된 주사기를 사용하여 심장으로부터 혈액을 채취하였다. 혈액을 4℃에서 10분 동안 3000rpm에서 원심분리하고, 상청액을 수집하고, -80℃에서 동결하였다. 농도 연구를 위해 사용되는 경우, 혈장 샘플은 빛으로부터 보호하였다. 간과 뇌를 제거하기 전에 차가운 포스페이트 완충 식염수(PBS)로 경심 관류(Transcardial perfusion)를 수행하였다. 뇌 농도 연구를 위해 뇌 전체를 해부하여 빛으로부터 보호하고, -80℃에서 동결하였다. 단트롤렌 처리 그룹의 경우, 간과 뇌를 해부하였다. 간 및 뇌의 왼쪽 반구를 4% 파라폼알데하이드에 4℃에서 밤새 후-고정하고, 절편화하기 위해 파라핀-포매하였다. 각 그룹으로부터 여러 동물을 무작위로 선택하여 면역조직화학 및 조직학 및 연구를 위해 절편화하였으며, 각 평가에 대한 정확한 동물의 수는 각 도면의 범례에 표시하였다. 뇌의 오른쪽 반구는 생물화학적 검정을 위해 -80℃에서 동결하였다.
면역조직화학 염색
면역조직화학 염색을 위해 위의 문헌[Peng, J., et al., 2012]에 기술되어 있는 바와 같이 파라핀-포매된 두정(coronal) 뇌 절편(10㎛)을 제조하였다. 간략하게는, 절편을 탈파라핀화하고 수화하였다. 압력 쿠커(pressure cooker)의 항원 비차단 용액(Antigen Unmasking Solution)에서 항원 회복을 수행하였다. 그런 다음, 절편을 10% 정상 염소 혈청(NGS)에서 30분 동안, M.O.M 마우스 Ig 차단 시약(PK-2200, 벡터 랩(Vector Lab))에서 1시간 동안, 그리고 M.O.M 희석제에서 5분 동안 연속하여 인큐베이션하였다. 슬라이드를 1차 항원, 항-6E10(1:500, 803001, 바이오 레전드(Bio Legend), 캘리포니아주 샌디에고 소재)과 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션한 후, 각각 M.O.M 바이오티닐화된 항-마우스 IgG 시약(PK-2200, 벡터 랩)과 함께 10분 동안 그리고 VECTASTAIN ABC 시약과 함께 5분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 절편을 탈수하고, Permount로 커버를 덮었다. 모든 이미지는 Q Imaging Retiga 2000R 디지털 카메라 및 iVision 이미징 소프트웨어(바이오 비전 테크놀로지스(Bio Vision Technologies), 펜실베니아 엑스턴 소재)가 장착된 Olympus(BX51W1) 현미경에서 촬영하였다. 그룹에 대해 맹검인 조사자가 Image J 소프트웨어를 사용하여 면적당 세포수를 정량화하였다. 전체 해마 및 치아 이랑에서 면적당 플라크의 수 및 플라크가 차지하는 면적 백분율을 계산하였다.
웨스턴 블롯
위의[Peng, J., et al., 2012]에 기술되어 있는 바와 같이 웨스턴 블롯분석에 의해 특정 단백질의 발현에 의해 시냅스 밀도를 평가하였다. 간략하게는, 샘플을 단백질 저해제를 함유하는 얼음-냉각된 RIPA에 용해시켰다. 바이신코닌산(BCA) 키트(23227, 써모 피셔 사이언티픽, 매사추세츠주 월섬 소재)를 사용하여 단백질의 농도를 측정하였다. 4× 로딩 완충액 및 ddH2O가 포함된 각 단백질의 혼합물을 동일한 부피의 혼합물과 동일한 양의 단백질에 도달하도록 각각 생성하였다. 동일한 샘플 양을 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동에 로딩하고, 나이트로셀룰로스 막으로 옮겼다. 막을 5% 무지방 우유와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 1차 항원 PSD95(1:500, 810401, 바이오 레전드, 캘리포니아주 샌디에고 소재), 시냅신1(1:500, 515200, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) 및 β-액틴(1:2000, A5441, 시그마, 미주리주 세인트루이스 소재)과 함께 각각 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 막을 관련 2차 항원과 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 강화된 화학발광 검출 시스템(밀리포어, 매사추세츠주 빌레리카 소재)을 사용하여 반점을 검출하였다. β-액틴으로 정규화된 표적 단백질의 밀도를 Image J 소프트웨어(내셔널 인스티튜트 오브 헬스, 메릴랜드주의 베서스다 소재)를 사용하여 계산하였다.
혈장 ALT 활성 평가
제조업체의 지침에 따라 알라닌 아미노트랜스퍼레이스(ALT) 활성 비색 검정 키트(K752, 바이오비전(미국, 캘리포니아주 밀피타스 소재)를 사용하여 간 기능의 지표인 혈장 ALT 활성을 측정하였다. 가장 오랜 기간(11개월) 동안 단트롤렌을 처리한 ETG 및 LGT에 대한 혈장 ALT 활성을 측정하였다. 간략하게는, 10㎕의 혈장을 86㎕의 ALT 검정 완충액, 2㎕의 OxiRed 프로브, 2㎕의 ALT 효소 믹스 및 10㎕의 ALT 기질을 포함하는 총 100㎕의 반응 혼합물에 희석하여 알라닌으로 a-케토글루타레이트로 전환된 피루베이트를 분석하였다. 0, 2, 4, 6, 8, 10 n㏖/웰의 피루베이트 농도를 사용하여 동시에 피루베이트 표준 곡선을 생성하였다. 570㎚에서 광학 밀도(OD)는 37℃에서 반응물을 인큐베이션한 후 10분(A1), 60분(A2)에 다시 측정하였다. 표준 곡선의 선형 범위에서 피루베이트 농도를 측정하였다. ALT 활성은 다음 공식을 사용하여 계산하였다: ALT 활성 =(A2-A1)/50*10 mU/㎖.
간 병리학적 평가
병리학적 평가를 위해 간 절편(5㎛)을 이미지화하였다. 병리 평가를 위해 동물당 3개의 절편이 있는 각 ETG에서 3마리의 동물을 무작위로 선택하고, 조사자에게 슬라이드는 알지 못하게 하였다. 절편을 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색한 후, Olympus BX51W1 현미경으로 이미지화하였다. 절편을 급성 또는 만성 간염, 염증, 섬유증, 괴사, 간경변, 담즙 정체 및 비특이적 간세포 이상과 같은 간 손상에 대해 평가하였다.
통계적 분석
이전에 문헌[Peng, et al., Alzheimers Dement 7:e67]에 의해 기술되어 있는 바와 같이 각 그룹의 동물의 수를 결정하였으며, 이는 각 도면의 범례에 열거되어 있다. Graph Pad Prism 8.0으로 통계적 분석을 수행하였으며, 이는 각 도면의 범례에 기재되어 있다. ANOVA에 의한 반복 측정은 사망률로 인해 항상 가능한 것은 아니었다. 데이터는 95%CI의 평균으로 표시하였다. p 값이 0.05 이하일 때 통계적으로 유의한 차이로 인정하였다. (P<0.05)
비강내 단트롤렌은 피하 투여와 비교하여 혈액 뇌 장벽(BBB) 통과 및 뇌 농도를 증가시켰다.
전신 투여 후에 관찰된 단트롤렌의 제한된 BBB 투과성은 약물의 사용 및 잠재적인 효과를 제한하였다. 이 연구에서 비강내 단트롤렌 투여는 피하 접근법과 비교하여 투여 후 20분에 결정된 더 낮은 혈장 농도를 초래하였다(도 15a 참조). 대조적으로, 비강내 단트롤렌 투여는 투여 후 60분에 피하 투여보다 실질적으로 더 높은 뇌 농도를 초래하였다(도 15b 참조). 조합하여, BBB를 통한 약물 투과를 나타내기 위해 종종 사용되는 변수인 뇌/혈장 단트롤렌 농도 비(도 15c 참조)는 피하 접근법과 비교하여 비강내 투여 후 두 시점 모두에서 유의하게 더 높았다. 뇌에서 통합된 전체 단트롤렌 노출은 피하 투여보다 비강내 투여 후 유의하게 더 높았다(도 15d, 왼쪽 패널). 대조적으로, 혈장에서 통합된 전체 단트롤렌 노출은 피하 투여보다 비강내 투여 후 유의하게 더 낮았다(도 15d, 오른쪽 패널).
조기 비강내 또는 피하 단트롤렌 처리는 5XFAD 마우스에서 기억력 상실을 개선하였다.
해마-의존적 및 해마-독립적 기억력 둘 다를 각각 6개월령 및 11개월령에서 평가하였으며, 이는 11개월령에 ETG에서는 단트롤렌 처리 4개월 및 9개월 후였고(도 16a 내지 도 16D 참조) LTG에서는 처리 5개월 후였다. 두 인지 측정은 5XFAD 모델에서 공격성 AD 표현형을 확인하는 WT 대조군과 비교하여 5XFAD 대조군에서 크게 손상되었다(도 19a 내지 도 19b). 5XFAD 마우스에서, 비강내 단트롤렌 처리는 어떠한 처리도 하지 않은 5XFAD 대조군과 비교하여 ETG 그룹의 6개월령 및 11개월령 모두에서 해마-의존적(도 16a 참조) 및 해마-독립적(도 16b 참조) 기억력을 유의하게 개선하였다(도 16a 내지 도 16b). 비강내 단트롤렌은 또한 LTG의 11개월령에서 해마-의존적 기억력 상실을 유의하게 개선하였으며, 해마-독립적 기억력을 개선하는 경향이 있었다(도 16a 내지 도 16b). 흥미롭게도, 비강내 비히클은 또한 6개월령 및 11개월령 모두에서 해마-의존적 기억력 상실을 개선하였지만, 5XFAD ETG에서는 6개월령에 해마-독립적 기억력만을 개선하였다. 피하 단트롤렌은 6개월령에 두 가지 유형의 기억력 상실을 개선하였지만, ETG에서는 11개월령이 아니었고, LTG에서는 11개월령에 유익한 효과가 없었다(도 16a 내지 도 16b). 어느 경로에 의한 단트롤렌 투여는 야생형 마우스에서 기억력에 영향을 미치지 않았다(도 20a 내지 도 20b). 단트롤렌 처리된 5XFAD 마우스에 대한 정지 시간은 WT 정지 시간과 유사하며(도 20a 내지 도 20b), 형질전환 마우스에서의 개선된 기억력을 추가로 뒷받침한다.
두 유전자형에 대해 10개월령에서 MWM을 사용하여 해마-의존적 학습 및 기억력을 조사하였다. 시간 경과에 따라 처리되지 않은 야생형(WT) 또는 5XFAD(TG) 대조군과 비교하여 모든 처리 그룹에 대한 단서적 시험에 대해 유의한 차이는 발견되지 않았다(도 21a 내지 도 21b). 장소 시험에서, 유전자형 또는 처리에 상관없이 대조군과 비교하여 모든 그룹의 탈출에 걸린 시간에 유의한 차이는 없었다(도 21c 내지 도 21d). 동물들은 시간이 지남에 따라 과제를 학습하였지만, 처리 그룹이나 유전자형 간에 차이는 없었다. 표적 사분면에서 보낸 시간(도 21e) 및 마우스가 플랫폼을 횡단한 횟수(도 21f)에 대한 데이터에서 대조군과 비교하여 모든 그룹 간에 유의한 차이는 발견되지 않았다.
피하가 아닌 비강내 단트롤렌 처리는 질환-조절 약물로서 5XFAD에서 기억력 상실을 개선하였다.
해마-의존적 및 해마-독립적 기억력 둘 다를 10개월령에서 LTG에 대한 FCT를 사용하여 평가하였으며, AD 병리 및 증상이 둘 다 나타났을 때 6개월령에서 비강내 또는 피하 단트롤렌 처리를 시작하였다. 5XFAD 마우스에서, 피하(도 17b 참조)가 아닌 비강내(도 17a 참조) 단트롤렌 처리는 해마-의존적 기억력 손상을 유의하게 저해하였고(도 17a 참조, 맥락적), 해마-독립적 기억력 상실을 개선하는 경향이 있었다(도 17b 참조, 소리). 사실, 비강내 단트롤렌 처리는 해마-의존적 기억력을 WT 대조군과 동일한 수준으로 회복시켰다.
장기 비강내 또는 피하 단트롤렌 처리는 내약성이 우수하였다.
이 연구에서, 대조군과 비교하여 7개월의 처리(ETG) 및 3개월의 처리(LTG) 후 로타로드 성능의 운동 기능에 대해 5XFAD 마우스의 경우 유의한 차이가 없었다(도 17a). 장기 비강내 단트롤렌 처리는 또한 손상 비강 세포를 손상시키고 후각을 손상시킬 수 있다. 본 연구는 후각이 5XFAD 마우스에서 6개월의 비강내 처리(ETG) 후 또는 2개월의 처리(LTG) 후 유의하게 손상되지 않았음을 발견하였다(도 17b). (또한 도 16b 참조, 각각 ETG의 경우 6개월 내지 7개월 처리 및 LTG의 경우 2개월 내지 3개월 처리). 경구 단트롤렌은 고용량으로 장기간 사용하면 간 기능을 손상시킬 수 있다. 이 연구에서, 10개월(ETG) 동안 비강내 또는 피하의 단트롤렌 처리는 5XFAD 마우스에서 간 기능 또는 간 구조에 유의한 영향을 미치지 않았다(도 17c 내지 도 17d). (또한 도 18c 참조, 9개월 내지 10개월 처리) 및 간 구조(도 18d 참조, 9개월 내지 10개월 처리). 또한, 최대 10개월 동안 장기 비강내 또는 피하 단트롤렌 처리는 5XFAD 마우스의 어느 그룹에서도 사망률 또는 체중에 영향을 미치지 않았다(도 17e 내지 도 17f). 야생형 마우스에서, 후각, 운동 기능, 사망률 또는 체중에 유의한 차이는 없었다(도 22a 내지 도 22c, 도 22e, 도 22f). 간 효소인 알라닌 아미노트랜스퍼레이스의 유의한 증가가 10개월의 처리(ETG) 후 야생형 마우스에서 검출되었지만, 값은 여전히 정상 생리학적 범위 내에 있었다(도 22d). 또한, 최대 10개월 동안 장기 비강내 또는 피하 단트롤렌 처리는 두 유형의 마우스에서 사망률에 영향을 미치지 않았다(표 1).
Figure pct00001
단트롤렌 처리는 5XFAD 마우스의 해마 및 피질에서 아밀로이드 부하를 감소시키지 않았다.
아밀로이드 양성 세포의 수 및 면적을 결정하고, 해마 및 피질 모두에 대해 분석하였다(도 18a 내지 도 18f 참조). WT 대조군과 비교하여, 5XFAD 마우스의 해마(데이터 미제시) 및 피질(데이터 미제시) 모두에서 훨씬 더 많은 아밀로이드 플라크가 있었다. 비강내 또는 피하 단트롤렌 처리는 5XFAD 마우스의 해마 또는 피질에서 아밀로이드 부하를 유의하게 변경하지 않았다(도 18a 내지 도 18f 참조). WT 마우스에서 아밀로이드는 검출되지 않았다(도 23a 내지 도 23b).
시냅스 기능-관련 단백질에서는 유의한 차이가 발견되지 않았다.
전체 뇌로부터 PSD95 및 시냅신1의 발현을 결정하고, ETG 및 LTG에 대해 분석하였다. 두 유전자형에 대해 처리 그룹과 대조군 사이에는 유의한 차이가 없었다(도 24a 내지 도 24d).
5XFAD 마우스를 사용한 공격성 AD의 동물 모델에서, 본 연구는 비강내 단트롤렌 처리가 명백한 AD 신경병리 및 인지기능장애의 발병 후에 시작된 경우에도 피하가 아닌 장기 비강내 단트롤렌 처리가 기억력 상실을 거의 폐지하였음을 입증하였다. 비강내 단트롤렌 처리는 5XFAD 마우스에서 운동 협응, 후각, 간 기능 및 사망률에 대해 명백한 유해 효과 없이 질환-조절 특성을 보였다. 피하 접근법과 비교하여 비강내 투여 후 더 높은 뇌 농도에 의해 입증된 바와 같이 뇌로의 더 많은 단트롤렌 투과는 5XFAD 마우스의 기억력 손상 개선에 더 나은 치료적 효과와 일치한다. 이는 피하 접근법과 비교하여 비강내 투여 후 인지기능장애에 대한 단트롤렌의 개선된 CNS 투과 및 우수한 치료 효과를 보여주며 비강내 단트롤렌 처리를 AD의 새로운 약물 치료제로, 질환 조절 약물로도 제공하는 첫 번째 연구이다.
이 연구는 파일럿 연구에서 각각 비강내 또는 피하 투여 후 피크 농도에 도달하는 확인된 시간이기 때문에, 투여 후 20분 및 60분에서 단트롤렌 혈장 및 뇌 농도를 결정하기로 선택하였다.
이 연구는 피하 접근법과 비교하여 비강내 투여 후 20 및 60분에 혈장 농도의 동시 감소와 함께 단트롤렌의 증가된 뇌 농도를 발견하였다. 이는 비강내 전달이 피하 접근법보다 뇌로 더 잘 투과한다는 것을 시사한다. 본 발명자들은 또한 비강내 단트롤렌 접근법이 경구 접근법에 비해 뇌에서 피크 뇌 농도를 증가시키고 지속시간을 연장시켰지만, BBB를 통과하는 능력을 유의하게 증가시키지는 않았음을 발견하였다. 비강내 접근법을 이용한 혈장과 비교하여 증가된 뇌의 이점은 치료적 용량을 줄여 말초 부작용을 최소화한다는 점이다.
이 연구에서, MWM 테스트는 또한 10개월령의 WT와 5XFAD 마우스 간에 상이한 인지 기능을 검출하지 못했으며(도 21a 내지 도 21f), 이는 추가로 노화된 마우스의 학습 및 기억력 변화를 결정하는 것에 대한 MWM의 낮은 민감도를 나타낸다(도 22f). 반면에, 공포 조건화 테스트는 WT 대조군과 비교하여 11개월령의 5XFAD 마우스에서 감소된 해마-의존적 및 해마-독립적 기억력을 보여주었다. 또한, 본 연구는 동일한 용량의 단트롤렌의 피하 투여가 아닌 단트롤렌의 비강내 투여만이 질환-조절 약물로서 AD 병리 및 인지기능장애의 발병 후 치료가 시작될 때 기억력 상실을 개선하였으며, 이는 뇌로의 상대적으로 더 효율적인 투과 및 더 높은 뇌 단트롤렌 농도와 일치함을 발견하였다. 단트롤렌은 5XFAD 마우스에서 해마-독립적 기억력보다 해마-의존적 기억력을 더 효율적으로 회복시킨다. 이러한 결과는 인지기능장애의 발병 전에 AD를 효과적으로 진단하는 것이 일반적으로 어렵고 불편하기 때문에 임상적으로 중요하다. 따라서, 기억력 상실의 발병 후에도 효과적인 치료는 비강내 단트롤렌 치료를 AD 환자에게 유망한 치료제로 만든다. AD 환자에서 단트롤렌의 비강내 투여의 또 다른 이점은 다른 투여 방식과 비교하여 환자가 사용하기 쉽고 편리하다는 점이다.
AD 병리 및 인지기능장애의 발병 전 또는 후에 시작되는 비강내 단트롤렌 처리는 5XFAD 마우스에서 세포외 플라크에 영향을 미치지 않았지만, 이는 질환-조절 약물로서 작용하여 기억력 상실을 거의 폐지하였다.
이 연구는 최대 9개월 내지 10개월 동안 5 ㎎/㎏의 비강내 또는 피하 단트롤렌이 5XFAD 마우스에서 사망률, 간 구조 및 기능에 영향을 미치지 않았거나 또는 다른 심각한 부작용을 유발하지 않았음을 나타내어, 장기 사용 후 단트롤렌의 안정성을 추가로 강화하였다. 또한, 단트롤렌의 신경보호 효과는 분명히 용량-의존적이기 때문에, 피하 접근법에 비해 비강내 투여 후 더 높은 뇌 농도 및 더 낮은 혈장 농도는 효과적인 요법을 여전히 유지하면서 비강내 단트롤렌 용량을 추가로 감소시키는 것을 가능하게 한다.
비강내 단트롤렌 투여는 세포외 아밀로이드 플라크에 영향을 상당히 미치거나 또는 명백한 부작용을 일으키지 않으면서 질환-조절 약물로서 피하 접근법과 비교하여 더 높은 뇌 농도 및 더 나은 치료 효과를 제공하여 기억력 상실을 개선한다.
실시예 4
단트롤렌은 알츠하이머병 환자의 뉴런에서 글루타메이트-유도성 미토콘드리아 칼슘 증가를 개선한다.
글루타메이트 흥분성독성(excitotoxicity) 및 관련 세포내 칼슘 항상성의 파괴는 알츠하이머병(AD)의 병리, 시냅스 및 인지기능장애에서 중요한 역할을 한다. 리아노딘 수용체(RyR)의 과활성화를 통한 ER로부터의 과도한 칼슘 방출은 산소 소비 및 ATP 생산 감소와 같은 AD에서의 미토콘드리아 칼슘 과부하 및 기능장애를 초래한다. RyR 칼슘 채널은 단트롤렌에 의해 저해되는 ER 방출로 인한 미토콘드리아 Ca2+ 증가에 필요하다. 이 연구는 RyR 및 N-메틸-D-아스파테이트(NMDA) 수용체를 저해하는 능력으로 AD 환자로부터의 유도 다능성 줄기 세포(iPSC) 유래 뉴런에서 글루타메이트-유도성 미토콘드리아 칼슘 과부하를 개선하는지 여부를 조사하였다. 이 연구는 단트롤렌이 AD 환자로부터 유래된 뉴런에서 글루타메이트-유도성 미토콘드리아 칼슘 증가 및 관련 세포질 ATP 농도의 감소를 유의하게 저해함을 입증한다.
방법
세포 배양
산발성 알츠하이머병으로부터의 건강한 대조군 세포(AG02261) 및 iPSC(AG11414)를 John A. Kessle의 랩으로부터 얻었다. 가족성 알츠하이머병으로부터의 iPSC(GM24675)는 코리엘 연구소(뉴저지주 캠던 소재)로부터 구입하였다. 각 유형의 iPSC를 한 명의 건강한 인간 대상체, 또는 산발성 알츠하이머병 또는 가족성 알츠하이머병으로 진단된 한 명의 환자의 피부 섬유아세포로부터 생성하였다. AG02261 세포주는 61세 남성 건강한 환자로부터 유래하였다. 또 다른 AG11414 세포주는 APOE3/E4 유전자형을 나타내는 조기 발병 알츠하이머병이 있는 39세 남성 환자로부터 유래하였다. GM24675 세포주는 APOE 유전자형 3/3을 가진 60세 가족성 알츠하이머병 환자로부터 유래하였다. 인간 유도 다능성 줄기 세포를 mTeSR™ 플러스 배지(카탈로그 No. 05825, 스템 셀 테크놀로지스, 캐나다 소재)의 Matrigel(비디 사이언시스, USA)-코팅된 플레이트에서 유지하고, 37℃의 5% CO2 가습 분위기에서 배양하였다. 배양 배지는 매일 교체하였다.
iPSC로부터 미성숙 피질 뉴런으로의 분화를 위한 프로토콜은 이전에 문헌[Shi, Y., et al., Nat Protoc, 2012; 7:1836](그 전문이 참조에 의해 원용되어 있음)에 의해 기술되어 있다. 간략하게는, 피더 비포함 배양은 이중-SMAD 저해를 통해 신경전구세포로 유도하였다. 세포를 7일 동안 2μM SB431542 및 2μM DMH1(둘 다 토크리스, 미국 소재)을 사용하여 화학적으로 정의된 조건에서 배양하였다. 배지는 12일째부터 신경 유지 배지로 변경하였다(이는 N-2 및 B-27-함유 배지의 1:1 혼합물이고; N-2 배지는 둘베코 변형 이글 배지/F-12 GlutaMAX, 1× N-22, 5 ㎍/㎖ 인슐린, 1mM l-글루타민, 100μM 비필수 아미노산, 100μM 2-머캅토에탄올, 50 단위/㎖ 페니실린 및 50 ㎎/㎖ 스트렙토마이신으로 구성되고; B-27 배지는 신경기초물질, 1× B-27, 200mM l-글루타민, 50 U/㎖ 페니실린 및 50 ㎎/㎖ 스트렙토마이신으로 구성됨). 신경 로제트 구조는 배양 12일 내지 17일경에 도립 현미경으로 관찰하였을 때 분명해야 한다. 이 시점으로부터, 배지는 격일로 교체하였다.
면역조직화학
세포를 플레이팅하고, 유리 커버슬립이 있는 24 웰 플레이트에서 처리하였다. 처리 후, 세포를 PBS에서 간단히 헹구고, 실온에서 15분 동안 4% 파라폼알데하이드에 고정한 다음, PBS로 각각 5분 동안 3회 세척하였다. 그런 다음, 이를 0.1% Triton X-100을 함유하는 PBS 중 5% 정상 염소 혈청으로 실온에서 1시간 동안 차단하였다. 1차 항원을 1% 소 혈청 알부민 및 0.3% Triton X-100을 함유하는 PBS에 희석하였다. PBS로 3회 세척 후, 이어서 세포를 PBS로 희석된 2차 항원(1:1000)에서 실온에서 1시간 내지 2시간 동안 암실에서 인큐베이션하였다. 마지막으로, 커버슬립을 PBS로 1회 헹구고, PBS 중 Hoechst 33342(1:1000)로 2분 내지 5분 동안 염색하였다. PBS로 5분 동안 3회 세척한 후, 세포를 Gold antifade 시약으로 마운팅하고, 암실의 평평한 표면에서 밤새 경화시키고, 매니큐어로 밀봉하고 이미지화하였다. 1차 항체 농도는 다음과 같이 나열하였다: TUJ1(1:1000), DCX(1:500), MAP2(1:500). 실험 처리에 대해 맹검인 사람들에 의해 이미지 획득 및 분석을 수행하였다. 커버 유리의 무작위 위치에서 5개의 이미지 세트를 획득한 후, Image J 1.49v 소프트웨어(내셔널 인스티튜트 오브 헬스)를 사용하여 병합하였다. 총 세포수에 대한 양성 세포의 백분율을 계산하고, 적어도 3개의 상이한 배양물로부터 상이한 그룹에 걸쳐 비교하였다.
세포 생존능력
이전에 기술된 바와 같은 3-(4,5-다이메틸티아졸-2일)-2,5-다이페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT) 감소 검정을 사용하여 세포 생존능력을 결정하였다. 처리 전날, 96-웰 플레이트에 웰당 50,000개의 세포를 시딩하고, 24시간 동안 인큐베이션하였다. 각 처리는 각 실험 동안 적어도 3회 반복하였다. 처리 종료시, 10㎕/웰의 0.25% MTT 용액을 96 웰 플레이트에 첨가하고, 세포내 보라색 포마잔 결정이 현미경으로 보일 때까지 암실에서 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음, 배지를 제거하고, 웰당 150㎕의 다이메틸 설폭사이드(DMSO)로 포마잔 결정을 가용화하고, 실온에서 인큐베이션하고, 보라색 결정이 용해될 때까지 진탕기에서 포일로 30분 동안 덮어놓았다. 흡광도를 플레이트 판독기(Synergy™ H1 마이크로플레이트 판독기, 바이오텍, 버몬트주 위누스키 소재, USA)에서 540㎚에서 측정하였다.
세포질 ATP 생산
세포질 ATP 생산은 이전에 기술된 바와 같이 상업적으로 이용 가능한 루시퍼레이스-루시페린 시스템(ATPlite; 퍼킨엘머(PerkinElmer), 매사추세츠주 월섬 소재)을 사용하여 평가하였다. 처리 전날, 웰당 50,000개의 세포를 100㎕의 배지가 포함된 96-웰 플레이트에 시딩하고, 24시간 동안 인큐베이션하였다. 각 처리는 각 실험 동안 적어도 3회 반복하였다. 96-웰 플레이트의 웰당 50㎕의 포유동물 세포 용해 용액을 첨가하였다. 플레이트를 진탕시킨 다음, 50㎕의 기질 용액을 웰에 첨가하였다. 바이오테크 Synergy H1 플레이트 판독기로 발광을 측정하였다.
세포질 및 미토콘드리아 Ca 2+ 농도 측정
글루타메이트 노출 후 iPSC 유래 뉴런의 세포질 Ca2+ 농도([Ca2+]c) 및 미토콘드리아 Ca2+ 농도([Ca2+]m)의 변화를 문헌[Bonora, M., et al., Nat Protoc 2013; 8:2105](그 전문이 참조에 의해 원용되어 있음)에 기술되어 있는 바와 같이 해파리 발광단백질 에쿼린-기반 프로브를 사용하여 측정하였다. 12-15×104개 세포를 24 웰 플레이트의 12-㎜ 커버슬립에 플레이팅하고, 60% 내지 70%의 컨플루언스로 성장시킨 다음, 제조업체의 지침에 따라 리포펙타민 3000 형질감염 시약(써모 피셔 사이언티픽, 미국 소재)을 사용하여 cyt-Aeq 또는 mit-Aeq 플라스미드로 형질감염시켰다. 다음날, 형질감염된 세포를 단트롤렌 20μM을 사용거나 사용하지 않고 1mM CaCl2 및 5mM 글루코스가 보충된 수정된 Krebs-Ringer 완충액(mM 단위: 135 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl2, 20 Hepes, 0.4 KH2PO4, pH 7.4)에서 5μM의 코엘렌터라진과 함께 1시간 동안 인큐베이션한 다음, 관류 챔버로 옮겼다. 모든 에쿼린 측정은 Krebs-Ringer 완충액에서 수행하였으며, 단트롤렌 20μM이 있거나 없는 글루타메이트 20mM을 동일한 배지에 첨가하였다. 주문 제작한 에쿼린 기록 시스템에서 실험을 수행하였다. 실험은 저장성 Ca2+-풍부 용액(H2O 중 10mM CaCl2) 중 100μM 디지토닌으로 세포를 용해하여 나머지 에쿼린 풀을 방출시킴으로써 종료하였다. 광 신호를 수집하고, 이전에 설명한 바와 같이 pH, [Mg2+] 및 이온 강도의 생리학적 조건에서 에쿼린의 Ca2+ 반응 곡선을 기반으로 하는 알고리즘에 의해 [Ca2+]c 또는 [Ca2+]m 값으로 보정하였다.
데이터 분석 및 통계
GraphPad Prism 8 소프트웨어(그래프패드 소프트웨어 인코포레이션, 미국 소재)를 사용하여 통계적 분석을 수행하였다. 모든 값은 평균±SD로 표시하였다. 데이터는 그룹간 인자로서 글루타메이트 농도와 단트롤렌을 사용하여 일방향 ANOVA 및 양방향 ANOVA로 분석하였다. P<0.05는 통계적으로 유의한 결과를 나타내는 것으로 간주하였다. 각 실험은 적어도 3회 반복하였다. 사용된 실험 단위(n) 및 통계적 분석은 도면과 범례에 나타나 있다.
결과
알츠하이머 질환 환자의 유도 다능성 줄기 세포(iPSC)에서 미성숙 뉴런으로의 분화는 상당히 손상되었다.
건강한 인간 대상체(대조군) 및 산발성(SAD) 또는 가족성(FAD) 알츠하이머병 환자로부터의 유도 다능성 줄기 세포(iPSC)를 미성숙 뉴런으로 유도하고 분화시켰으며(23일), 이는 상이한 유형의 세포를 표적으로 하는 특정 항체를 특징으로 하였다. 신경전구세포(TJU1 염색, 도 19a) 및 성숙 뉴런(MAP2, 도 19c) 양성 세포에서 세 가지 유형의 세포 간에는 유의한 차이가 없었다. 그러나, 대조군과 비교하여, SAD 및 FAD 환자로부터 유래된 미성숙 뉴런(DCX, 도 19b) 양성 세포는 유의하게 감소하였다.
글루타메이트는 iPSC 유래 미성숙 뉴런 세포 생존능력 및 ATP 생산 용량을 의존적으로 감소시켰다.
iPSC 유래 미성숙 뉴런 세포 생존에 대한 글루타메이트의 효과에 대한 용량 반응 연구를 MTT 감소 검정을 사용하여 수행하였다. 10mM 내지 30mM의 글루타메이트는 용량 의존적으로 세 가지 유형의 세포에서 상당한 세포 손상을 유도하였다(도 20). ATP 생산은 상업적으로 이용 가능한 루시퍼레이스-루시페린 시스템을 사용하여 평가하였다. 세포질 ATP 생산은 또한 글루타메이트(20mM 내지 30mM)에 노출되었을 때 용량 의존적으로 감소하였다. 건강한 대조군과 비교하여, FAD 환자 iPSC로부터의 미성숙 뉴런은 15mM 및 20mM의 글루타메이트에 노출되었을 때 ATP 생산이 상당한 손상되는 경향이 있었다(도 21).
단트롤렌은 iPSC 유래 미성숙 뉴런에서 글루타메이트 매개된 미토콘드리아 칼슘 증가를 개선하였다.
FAD 환자 iPSC 유래 뉴런에서 ATP 생산이 손상되는 가능한 메커니즘을 추가로 조사하였다. 미토콘드리아 칼슘 농도를 해파리 발광단백질 에쿼린-기반 프로브를 사용하여 측정하였다(도 22a, 도 22b). FAD 환자 유래 뉴런에서 미토콘드리아 칼슘 농도의 글루타메이트-매개성 피크 상승 및 전체 노출(AUC(곡선 아래 면적))은 건강한 대조군보다 유의하게 더 높았으며, 이는 단트롤렌의 전처리에 의해 개선되었다(도 22c, 도 22d).
당업자는 본 발명의 광범위한 개념을 벗어나지 않고 위에서 설명된 실시형태에 변경이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명은 개시된 특정 실시형태에 제한되지 않고 첨부된 청구범위에 의해 정의된 바와 같이 본 발명의 사상 및 범위 내에 있는 수정을 포함하도록 의도된 것으로 이해된다.

Claims (89)

  1. 알츠하이머병(Alzheimer's Disease: AD)이 있거나 또는 있는 것으로 의심되는 대상체의 뉴런에서 손상된 신경발생 및/또는 시냅스생성을 저해하는 방법으로서,
    상기 신경발생 및/또는 시냅스생성의 손상은 적어도 부분적으로 소포체(ER) 리아노딘 수용체(ryanodine receptor: RyR)의 과활성화에 의해 유발되며, 상기 방법은 ER 칼슘 이온(Ca 2+ )의 방출을 감소시키는데 효과적인 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물의 양을 상기 대상체에게 비강내로 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 신경발생은 신경전구 세포(neuroprogenitor cell: NPC)에서 미성숙 뉴런으로의 신경발생에 이어서 미성숙 뉴런에서 피질 뉴런으로의 신경 발생을 포함하는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 시냅스생성은 피질 뉴런에서 발생하는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피질 뉴런은 콜린성 뉴런인, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피질 뉴런은 기저 전뇌 콜린성 뉴런(basal forebrain cholinergic neuron: BFCN) 뉴런, 전두엽전 피질 뉴런(prefrontal cortex neuron), 해마 뉴런(hippocampus neuron) 또는 이들의 조합인, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AD는 가족성 알츠하이머병(familial Alzheimer's disease: FAD) 또는 산발성 알츠하이머병(Alzheimer's disease: SAD)인, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RyR은 유형 1 RyR(RyR-1), 유형 2 RyR(RyR-2), 유형 3 RyR(RyR-3) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소포체(ER) 리아노딘 수용체(RyR)의 과활성화는 미토콘드리아 칼슘을 상승시키며 ATP를 감소시키는, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단트롤렌의 비강내 투여는 상승된 미토콘드리아 칼슘을 감소시키고, 세포질 ATP를 증가시키는, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물은 주당 3회 투여되는, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물은 4개월 내지 1년 동안 투여되는, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물은 최대 2년 동안 투여되는, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물은 2년 초과 동안 투여되는, 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여는 대상체의 후각 기능, 운동 기능 또는 간 기능을 손상시키지 않는, 방법.
  15. 신경병리 및 인지기능장애의 발병 후 인지 기능의 저하를 개선하고/하거나 늦추는 방법으로서,
    상기 신경병리 및 인지기능장애는 알츠하이머병(AD)에 의해 유발되며, 상기 방법은 NMDA 수용체 및/또는 리아노딘 수용체(RyR)의 과활성화를 저해하는데 효과적인 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물의 양을 이를 필요로 하는 상기 대상체에게 비강내로 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 인지 기능은 기억력, 학습, 사고, 주의력, 지각, 언어 사용, 추론, 의사 결정, 문제 해결 또는 이들의 조합인, 방법.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 AD는 가족성 알츠하이머병(FAD) 또는 산발성 알츠하이머병(SAD)인, 방법.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RyR은 유형 1 RyR(RyR-1), 유형 2 RyR(RyR-2), 유형 3 RyR(RyR-3) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  19. 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물은 주당 3회 투여되는, 방법.
  20. 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물은 4개월 내지 1년 동안 투여되는, 방법.
  21. 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물은 최대 2년 동안 투여되는, 방법.
  22. 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물은 2년 초과 동안 투여되는, 방법.
  23. 제15항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여는 대상체의 후각 기능, 운동 기능 또는 간 기능을 손상시키지 않는, 방법.
  24. 알츠하이머병(AD)의 증상의 발병 전에 기억력을 개선하는 방법으로서,
    NMDA 수용체 및/또는 리아노딘 수용체(RyR)의 과활성화를 저해하는데 효과적인 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물의 양을 이를 필요로 하는 대상체에게 비강내로 투여하는 단계를 포함하는, AD의 증상의 발병 전에 기억력을 개선하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물은 주당 3회 투여되는, 방법.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물은 4개월 내지 1년 동안 투여되는, 방법.
  27. 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물은 최대 2년 동안 투여되는, 방법.
  28. 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물은 2년 초과 동안 투여되는, 방법.
  29. 제24항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여는 대상체의 후각 기능, 운동 기능 또는 간 기능을 손상시키지 않는, 방법.
  30. 제24항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AD의 증상은 신경병리, 인지기능장애 또는 이들의 조합인, 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 인지기능장애는 단기 또는 장기 기억력 상실, 학습 장애, 사고 장애, 주의력/집중 장애, 지각 장애, 언어 사용 장애, 추론 장애, 의사결정 장애/판단력 저하, 문제 해결 장애, 혼란, 불량한 운동 협응 또는 이들의 조합인, 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 단기 또는 장기 기억력 상실은 해마-의존적 및 해마-독립적 기억력 상실인, 방법.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, 상기 신경병리는 뇌 뉴런 사이의 아밀로이드 축적인, 방법.
  34. 제24항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AD는 가족성 AD(FAD) 또는 산발성 AD(SAD)인, 방법.
  35. 제24항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RyR은 유형 1 RyR(RyR-1), 유형 2 RyR(RyR-2), 유형 3 RyR(RyR-3) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  36. 알츠하이머병(AD)의 증상의 발병 후 기억력 상실을 개선하는 방법으로서,
    상기 기억력 상실은 AD에 의해 유발되며, 상기 방법은 NMDA 수용체 및/또는 리아노딘 수용체(RyR)의 과활성화를 저해하는데 효과적인 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물의 양을 이를 필요로 하는 상기 대상체에게 비강내로 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물은 주당 3회 투여되는, 방법.
  38. 제36항 또는 제37항에 있어서, 상기 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물은 4개월 내지 1년 동안 투여되는, 방법.
  39. 제36항 또는 제37항에 있어서, 상기 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물은 최대 2년 동안 투여되는, 방법.
  40. 제36항 또는 제37항에 있어서, 상기 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물은 2년 초과 동안 투여되는, 방법.
  41. 제36항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여는 대상체의 후각 기능, 운동 기능 또는 간 기능을 손상시키지 않는, 방법.
  42. 제36항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AD의 증상은 신경병리, 인지기능장애 또는 이들의 조합인, 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 인지기능장애는 단기 또는 장기 기억력 상실, 학습 장애, 사고 장애, 주의력/집중 장애, 지각 장애, 언어 사용 장애, 추론 장애, 의사결정 장애/판단력 저하, 문제 해결 장애, 혼란, 불량한 운동 협응 또는 이들의 조합인, 방법.
  44. 제43항에 있어서, 상기 기억력 상실은 해마-의존적 및 해마-독립적 기억력 상실인, 방법.
  45. 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신경병리는 뇌 뉴런 사이의 아밀로이드 축적인, 방법.
  46. 제36항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AD는 가족성 AD(FAD) 또는 산발성 AD(SAD)인, 방법.
  47. 제36항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RyR은 유형 1 RyR(RyR-1), 유형 2 RyR(RyR-2), 유형 3 RyR(RyR-3) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  48. 대상체의 뇌에서 단트롤렌의 농도 및 지속시간을 증가시키는 방법으로서,
    단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물의 양을 뇌에서 단트롤렌의 농도 및 지속시간의 증가를 필요로 하는 대상체에게 비강내로 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  49. 알츠하이머병(AD)이 있거나 또는 있는 것으로 의심되는 대상체의 뉴런에서 손상된 신경발생 및/또는 시냅스생성을 저해하는 방법으로서,
    상기 신경발생 및/또는 시냅스생성의 손상은 적어도 부분적으로 소포체(ER) 리아노딘 수용체(RyR)의 과활성화에 의해 유발되며, 상기 방법은,
    a) ER 칼슘 이온(Ca 2+ )의 방출을 감소시키는데 효과적인 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물의 양을 상기 대상체에게 비강내로 투여하는 단계; 및
    b) 치료적 유효량의 글루타메이트 수용체 길항제를 (a) 단계의 상기 대상체에게 투여하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  50. 제49항에 있어서,
    c) (a) 단계 전에 상기 대상체로부터 뇌척수액(CSF)을 얻는 단계; 및
    d) 상기 CSF에서 글루타메이트의 수준을 결정하는 단계
    를 더 포함하되, 대조군 대상체로부터 얻은 CSF에서 글루타메이트의 수준보다 높은 (d) 단계에서 결정된 글루타메이트의 수준은 단트롤렌을 사용한 치료에 대한 대상체의 적합성을 나타내는, 방법.
  51. 제50항에 있어서, (b) 단계 전에 상기 대상체로부터 CSF를 얻는 단계; 및 상기 CSF에서 글루타메이트의 수준을 결정하는 단계를 더 포함하되, 대조군 대상체로부터 얻은 CSF에서 글루타메이트의 수준보다 높은 결정된 글루타메이트의 수준은 글루타메이트 수용체 길항제를 사용한 치료에 대한 대상체의 적합성을 나타내는, 방법.
  52. 제49항 또는 제50항에 있어서, 상기 글루타메이트 수용체 길항제는 글루타메이트-결합 부위에서 경쟁적 길항작용에 의해 NMDA 수용체를 차단하는 작용제이거나, 또는 글리신, 펜시클리딘 및/또는 마그네슘 결합 부위에서 비경쟁적 길항작용에 의해 NMDA 수용체를 차단하는 작용제인, 방법.
  53. 제52항에 있어서, 상기 글루타메이트-결합 부위에서 경쟁적 길항작용에 의해 NMDA 수용체를 차단하는 작용제는 셀포텔(CGS 19755) 압티가넬(CNS 1102), CGP 37849, APV 또는 AP-5(R-2-아미노-5-포스포노펜타노에이트), 2-아미노-7-포스포노-헵탄산(AP-7), 3-[(R)-2-카복시피페라진-4-일]-프로프-2-엔일-1-포스포산(CPPene) 및/또는 아스파탐인, 방법.
  54. 제52항에 있어서, 상기 펜시클리딘(PCP), 마그네슘 및/또는 MK-801(다이조실핀) 결합 부위에서 비경쟁적 길항작용에 의해 NMDA 수용체를 차단하는 작용제는 메만틴, 케타민, 펜시클리딘, 3-MEO-PCP, 8A-PDHQ, 아만타딘, 아토목세틴, AZD6765, 아그마틴, 델루세민, 델루세민, 엑스트랄로르판, 덱스트로메토르판, 덱스트로르판, 다이페니딘, 에탄올, 에티사일리딘, 가사이클리딘, 메톡세타민(MXE), 미노사이클린, 나이트로메만틴, 이산화질소, PD-137889, 롤리사이클리딘, 테노사이클리딘, 메톡시딘, 틸레타민, 네라멕세인, 엘리프로딜, 에톡사드롤, 덱소사드롤, WMS-2539, NEFA, 레마세미드, 마그네슘 설페이트, 압티가넬, HU-211, 후페리진 A, 다이펩타이드 D-Phe-L-Tyr, 이보가인, 아포사이나세아에, 레마세미드, 린코필린, 가바펜틴 또는 다이조실핀(MK-801)인, 방법.
  55. 제52항에 있어서, 상기 글리신 결합 부위에서 비경쟁적 길항작용에 의해 NMDA 수용체를 차단하는 작용제는 (GLYX-13), NRX-1074, 7-클로로카이누렌산, 4-클로로카이누레닌(AV-101), 5,7-다이클로로카이누렌산, 카이누렌산, TK-40(GluN1 글리신 결합 부위에서의 경쟁적 길항제), 1-아미노사이클로-프로페인카복실산(ACPC), L-페닐알라닌 또는 제논인, 방법.
  56. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신경발생은 신경전구 세포(NPC)에서 미성숙 뉴런으로의 신경발생에 이어서 미성숙 뉴런에서 피질 뉴런으로의 신경 발생을 포함하는, 방법.
  57. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시냅스생성은 피질 뉴런에서 발생하는, 방법.
  58. 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피질 뉴런은 콜린성 뉴런인, 방법.
  59. 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피질 뉴런은 기저 전뇌 콜린성 뉴런(BFCN) 뉴런, 전두엽전 피질 뉴런, 해마 뉴런 또는 이들의 조합인, 방법.
  60. 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AD는 가족성 알츠하이머병(FAD) 또는 산발성 알츠하이머병(SAD)인, 방법.
  61. 제1항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소포체(ER) 리아노딘 수용체(RyR)의 과활성화는 미토콘드리아 칼슘을 상승시키며 ATP를 감소시키는, 방법.
  62. 제1항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단트롤렌의 비강내 투여는 상승된 미토콘드리아 칼슘을 감소시키며 세포질 ATP를 증가시키는, 방법.
  63. 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물은 주당 3회 투여되는, 방법.
  64. 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물은 4개월 내지 1년 동안 투여되는, 방법.
  65. 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물은 최대 2년 동안 투여되는, 방법.
  66. 제1항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물은 2년 초과 동안 투여되는, 방법.
  67. 제1항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여는 대상체의 후각 기능, 운동 기능 또는 간 기능을 손상시키지 않는, 방법.
  68. 제49항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RyR은 유형 1 RyR(RyR-1), 유형 2 RyR(RyR-2), 유형 3 RyR(RyR-3) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  69. 제15항에 있어서, 치료적 유효량의 글루타메이트 수용체 길항제를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  70. 제15항에 있어서,
    a) 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물을 상기 대상체에게 비강내로 투여하기 전에 상기 대상체로부터 뇌척수액(CSF)을 얻는 단계; 및
    b) 상기 CSF에서 글루타메이트의 수준을 결정하는 단계
    를 더 포함하되,
    대조군 대상체로부터 얻은 CSF에서 글루타메이트의 수준보다 높은 (b) 단계에서 결정된 글루타메이트의 수준은 단트롤렌을 사용한 치료에 대한 대상체의 적합성을 나타내는, 방법.
  71. 제70항에 있어서, 상기 치료적 유효량의 글루타메이트 수용체 길항제를 투여하기 전에 상기 대상체로부터 CSF를 얻는 단계; 및 상기 CSF에서 글루타메이트의 수준을 결정하는 단계를 더 포함하되, 대조군 대상체로부터 얻은 CSF에서 글루타메이트의 수준보다 높은 결정된 글루타메이트의 수준은 글루타메이트 수용체 길항제를 사용한 치료에 대한 대상체의 적합성을 나타내는, 방법.
  72. 제70항에 있어서, 상기 글루타메이트 수용체 길항제는 글루타메이트-결합 부위에서 경쟁적 길항작용에 의해 NMDA 수용체를 차단하는 작용제이거나, 또는 글리신, 펜시클리딘 및/또는 마그네슘 결합 부위에서 비경쟁적 길항작용에 의해 NMDA 수용체를 차단하는 작용제인, 방법.
  73. 제72항에 있어서, 상기 글루타메이트-결합 부위에서 경쟁적 길항작용에 의해 NMDA 수용체를 차단하는 작용제는 셀포텔(CGS 19755) 압티가넬(CNS 1102), CGP 37849, APV 또는 AP-5(R-2-아미노-5-포스포노펜타노에이트), 2-아미노-7-포스포노-헵탄산(AP-7), 3-[(R)-2-카복시피페라진-4-일]-프로프-2-엔일-1-포스포산(CPPene) 및/또는 아스파탐인, 방법.
  74. 제72항에 있어서, 상기 펜시클리딘(PCP), 마그네슘 및/또는 MK-801(다이조실핀) 결합 부위에서 비경쟁적 길항작용에 의해 NMDA 수용체를 차단하는 작용제는 메만틴, 케타민, 펜시클리딘, 3-MEO-PCP, 8A-PDHQ, 아만타딘, 아토목세틴, AZD6765, 아그마틴, 델루세민, 델루세민, 엑스트랄로르판, 덱스트로메토르판, 덱스트로르판, 다이페니딘, 에탄올, 에티사일리딘, 가사이클리딘, 메톡세타민(MXE), 미노사이클린, 나이트로메만틴, 이산화질소, PD-137889, 롤리사이클리딘, 테노사이클리딘, 메톡시딘, 틸레타민, 네라멕세인, 엘리프로딜, 에톡사드롤, 덱소사드롤, WMS-2539, NEFA, 레마세미드, 마그네슘 설페이트, 압티가넬, HU-211, 후페리진 A, 다이펩타이드 D-Phe-L-Tyr, 이보가인, 아포사이나세아에, 레마세미드, 린코필린, 가바펜틴 또는 다이조실핀(MK-801)인, 방법.
  75. 제72항에 있어서, 상기 글리신 결합 부위에서 비경쟁적 길항작용에 의해 NMDA 수용체를 차단하는 작용제는 (GLYX-13), NRX-1074, 7-클로로카이누렌산, 4-클로로카이누레닌(AV-101), 5,7-다이클로로카이누렌산, 카이누렌산, TK-40(GluN1 글리신 결합 부위에서의 경쟁적 길항제), 1-아미노사이클로-프로페인카복실산(ACPC), L-페닐알라닌 또는 제논인, 방법.
  76. 제24항에 있어서, 치료적 유효량의 글루타메이트 수용체 길항제를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  77. 제24항에 있어서,
    a) 상기 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물을 상기 대상체에게 비강내로 투여하기 전에 상기 대상체로부터 뇌척수액(CSF)을 얻는 단계; 및
    b) 상기 CSF로부터 글루타메이트의 수준을 결정하는 단계
    를 더 포함하되, 대조군 대상체로부터 얻은 CSF에서 글루타메이트의 수준보다 높은 (b) 단계에서 결정된 글루타메이트의 수준은 단트롤렌을 사용한 치료에 대한 대상체의 적합성을 나타내는, 방법.
  78. 제77항에 있어서, 상기 치료적 유효량의 글루타메이트 수용체 길항제를 투여하기 전에 상기 대상체로부터 CSF를 얻는 단계; 및 상기 CSF에서 글루타메이트의 수준을 결정하는 단계를 더 포함하되, 대조군 대상체로부터 얻은 CSF에서 글루타메이트의 수준보다 높은 결정된 글루타메이트의 수준은 글루타메이트 수용체 길항제를 사용한 치료에 대한 대상체의 적합성을 나타내는, 방법.
  79. 제77항에 있어서, 상기 글루타메이트 수용체 길항제는 글루타메이트-결합 부위에서 경쟁적 길항작용에 의해 NMDA 수용체를 차단하는 작용제이거나, 또는 글리신, 펜시클리딘 및/또는 마그네슘 결합 부위에서 비경쟁적 길항작용에 의해 NMDA 수용체를 차단하는 작용제인, 방법.
  80. 제79항에 있어서, 상기 글루타메이트-결합 부위에서 경쟁적 길항작용에 의해 NMDA 수용체를 차단하는 작용제는 셀포텔(CGS 19755) 압티가넬(CNS 1102), CGP 37849, APV 또는 AP-5(R-2-아미노-5-포스포노펜타노에이트), 2-아미노-7-포스포노-헵탄산(AP-7), 3-[(R)-2-카복시피페라진-4-일]-프로프-2-엔일-1-포스포산(CPPene) 및/또는 아스파탐인, 방법.
  81. 제79항에 있어서, 상기 펜시클리딘(PCP), 마그네슘 및/또는 MK-801(다이조실핀) 결합 부위에서 비경쟁적 길항작용에 의해 NMDA 수용체를 차단하는 작용제는 메만틴, 케타민, 펜시클리딘, 3-MEO-PCP, 8A-PDHQ, 아만타딘, 아토목세틴, AZD6765, 아그마틴, 델루세민, 델루세민, 엑스트랄로르판, 덱스트로메토르판, 덱스트로르판, 다이페니딘, 에탄올, 에티사일리딘, 가사이클리딘, 메톡세타민(MXE), 미노사이클린, 나이트로메만틴, 이산화질소, PD-137889, 롤리사이클리딘, 테노사이클리딘, 메톡시딘, 틸레타민, 네라멕세인, 엘리프로딜, 에톡사드롤, 덱소사드롤, WMS-2539, NEFA, 레마세미드, 마그네슘 설페이트, 압티가넬, HU-211, 후페리진 A, 다이펩타이드 D-Phe-L-Tyr, 이보가인, 아포사이나세아에, 레마세미드, 린코필린, 가바펜틴 또는 다이조실핀(MK-801)인, 방법.
  82. 제79항에 있어서, 상기 글리신 결합 부위에서 비경쟁적 길항작용에 의해 NMDA 수용체를 차단하는 작용제는 (GLYX-13), NRX-1074, 7-클로로카이누렌산, 4-클로로카이누레닌(AV-101), 5,7-다이클로로카이누렌산, 카이누렌산, TK-40(GluN1 글리신 결합 부위에서의 경쟁적 길항제), 1-아미노사이클로-프로페인카복실산(ACPC), L-페닐알라닌 또는 제논인, 방법.
  83. 제36항에 있어서, 치료적 유효량의 글루타메이트 수용체 길항제를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  84. 제36항에 있어서,
    a) 상기 단트롤렌을 포함하는 약제학적 조성물을 상기 대상체에게 비강내로 투여하기 전에 상기 대상체로부터 뇌척수액(CSF)을 얻는 단계; 및
    b) 상기 CSF에서 글루타메이트의 수준을 결정하는 단계
    를 더 포함하되, 대조군 대상체로부터 얻은 CSF에서 글루타메이트의 수준보다 높은 (b) 단계에서 결정된 글루타메이트의 수준은 단트롤렌을 사용한 치료에 대한 대상체의 적합성을 나타내는, 방법.
  85. 제84항에 있어서, 상기 치료적 유효량의 글루타메이트 수용체 길항제를 투여하기 전에 상기 대상체로부터 CSF를 얻는 단계; 및 상기 CSF에서 글루타메이트의 수준을 결정하는 단계를 더 포함하되, 대조군 대상체로부터 얻은 CSF에서 글루타메이트의 수준보다 높은 결정된 글루타메이트의 수준은 글루타메이트 수용체 길항제를 사용한 치료에 대한 대상체의 적합성을 나타내는, 방법.
  86. 제85항에 있어서, 상기 글루타메이트 수용체 길항제는 글루타메이트-결합 부위에서 경쟁적 길항작용에 의해 NMDA 수용체를 차단하는 작용제이거나, 또는 글리신, 펜시클리딘 및/또는 마그네슘 결합 부위에서 비경쟁적 길항작용에 의해 NMDA 수용체를 차단하는 작용제인, 방법.
  87. 제86항에 있어서, 상기 글루타메이트-결합 부위에서 경쟁적 길항작용에 의해 NMDA 수용체를 차단하는 작용제는 셀포텔(CGS 19755) 압티가넬(CNS 1102), CGP 37849, APV 또는 AP-5(R-2-아미노-5-포스포노펜타노에이트), 2-아미노-7-포스포노-헵탄산(AP-7), 3-[(R)-2-카복시피페라진-4-일]-프로프-2-엔일-1-포스포산(CPPene) 및/또는 아스파탐인, 방법.
  88. 제86항에 있어서, 상기 펜시클리딘(PCP), 마그네슘 및/또는 MK-801(다이조실핀) 결합 부위에서 비경쟁적 길항작용에 의해 NMDA 수용체를 차단하는 작용는 메만틴, 케타민, 펜시클리딘, 3-MEO-PCP, 8A-PDHQ, 아만타딘, 아토목세틴, AZD6765, 아그마틴, 델루세민, 델루세민, 엑스트랄로르판, 덱스트로메토르판, 덱스트로르판, 다이페니딘, 에탄올, 에티사일리딘, 가사이클리딘, 메톡세타민(MXE), 미노사이클린, 나이트로메만틴, 이산화질소, PD-137889, 롤리사이클리딘, 테노사이클리딘, 메톡시딘, 틸레타민, 네라멕세인, 엘리프로딜, 에톡사드롤, 덱소사드롤, WMS-2539, NEFA, 레마세미드, 마그네슘 설페이트, 압티가넬, HU-211, 후페리진 A, 다이펩타이드 D-Phe-L-Tyr, 이보가인, 아포사이나세아에, 레마세미드, 린코필린, 가바펜틴 또는 다이조실핀(MK-801)인, 방법.
  89. 제86항에 있어서, 상기 글리신 결합 부위에서 비경쟁적 길항작용에 의해 NMDA 수용체를 차단하는 작용제는 (GLYX-13), NRX-1074, 7-클로로카이누렌산, 4-클로로카이누레닌(AV-101), 5,7-다이클로로카이누렌산, 카이누렌산, TK-40(GluN1 글리신 결합 부위에서의 경쟁적 길항제), 1-아미노사이클로-프로페인카복실산(ACPC), L-페닐알라닌 또는 제논인, 방법.
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