JP2022538608A - アルツハイマー病の治療のための鼻腔内ダントロレン投与 - Google Patents
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Abstract
アルツハイマー病（ＡＤ）を有するか、または有すると疑われる対象におけるニューロンの神経新生および／またはシナプス形成の障害を抑制するための方法、神経病理学および認知機能障害がＡＤによって引き起こされる、神経病理学および認知機能障害の発症後の認知機能の低下を改善および／または遅らせるための方法、ＡＤの症状の発症前に記憶の低下を改善および／または遅らせるための方法、脳内のダントロレンの濃度および持続時間を増加させるための方法、ならびにＡＤの症状の発症後に記憶の低下を改善および／または遅らせるための方法であり、これらの方法は、Ｎ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体および／またはリアノジン受容体（ＲｙＲ）の過剰な活性化を抑制するのに有効なある量のダントロレンを含む医薬組成物を、それを必要とする対象に鼻腔内投与することを含む。方法は、治療有効量のグルタミン酸受容体拮抗薬を対象に投与することをさらに含む。【選択図】図３
Description
関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年６月２８日に出願された米国仮特許出願第６２／８６８，８２０号の優先権を主張し、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１９年６月２８日に出願された米国仮特許出願第６２／８６８，８２０号の優先権を主張し、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
政府の関心声明
本発明は、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）によって付与された助成金番号ＧＭ０８４９７９およびＡＧ０６１４４７の下で政府の支援により行われた。米国政府は、本発明においてある特定の権利を有する。
本発明は、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）によって付与された助成金番号ＧＭ０８４９７９およびＡＧ０６１４４７の下で政府の支援により行われた。米国政府は、本発明においてある特定の権利を有する。
本発明は、鼻腔内ダントロレン投与によってアルツハイマー病を治療するための方法に関する。本発明はまた、アルツハイマー病（ＡＤ）を有するか、または有すると疑われる対象におけるニューロンの神経新生および／またはシナプス形成の障害を抑制する方法、神経病理学および認知機能障害がＡＤによって引き起こされる、神経病理学および認知機能障害の発症後の認知機能の低下を改善および／または遅らせる方法、ＡＤの症状の発症前に記憶を改善する方法、ならびにＡＤの症状の発症後に記憶を改善する方法に関し、方法は、リアノジン受容体（ＲｙＲ）および／またはＮ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体の過剰な活性化を抑制するのに有効な量の、ダントロレンを含む医薬組成物を、それを必要とする対象に鼻腔内投与することを含む。
アルツハイマー病（ＡＤ）は、壊滅的な神経変性疾患である。過去数十年にわたるアミロイド病理を標的とする新薬の開発の不足により、ＡＤ認知機能障害の主な原因となり得る代替の経路またはメカニズムの探究は当然である。
孤発性ＡＤ（ＳＡＤ）は、ＡＤ患者の９５％以上を占めるが、その病理は、ほとんど知られていない。ＳＡＤのメカニズムの理解の欠如および不十分な細胞または動物モデルは、ＡＤを治療するための新しい効果的な薬物の開発を制限する。家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）の病理学およびメカニズムは、比較的良く研究されているが、それらは、主に細胞および動物モデルにおいてであり、患者においてではない。
悪性高熱症の死亡率を８５％～５％未満に低下させたダントロレンは、この重度の全身麻酔を介した合併症を治療するためにＦＤＡが承認した唯一の臨床的に利用可能な薬物である。経口ダントロレンの慢性的な使用は、比較的忍容できる副作用を伴う筋肉のけいれんの治療にも利用される。ＡＤのための現在の薬物および治療法の不十分さの観点から、ＡＤ、ならびにＡＤの症状の発症前と後の両方での、認知機能の喪失だけではなく、脳のニューロンにおける神経新生および／またはシナプス形成の障害も含むがこれらに限定されない、ＡＤに存在し、それに関連する機能不全を治療する改良された組成物および治療的に有効な方法に対する緊急の必要性が存在する。
一態様では、本発明は、アルツハイマー病（ＡＤ）を有するか、または有すると疑われる対象におけるニューロンの神経新生および／またはシナプス形成の障害を抑制するための方法を提供し、神経新生および／またはシナプス形成の障害は、少なくとも部分的に、小胞体（ＥＲ）リアノジン受容体（ＲｙＲ）の過剰な活性化によって引き起こされ、この方法は、ＡＤ患者に由来する細胞におけるＥＲカルシウムイオン（Ｃａ２＋）の放出を減少させるのに有効なある量のダントロレンを含む医薬組成物を対象に鼻腔内投与することを含む。
別の態様では、本発明は、神経病理学および認知機能障害の発症後の認知機能の低下を改善および／または遅らせるための方法を提供し、神経病理学および認知機能障害は、アルツハイマー病（ＡＤ）によって引き起こされ、この方法は、ＮＭＤＡ受容体および／またはリアノジン受容体の過剰な活性化を抑制するのに有効なある量のダントロレンを含む医薬組成物を、それを必要とする対象に鼻腔内投与することを含む。
さらなる態様では、本発明は、アルツハイマー病（ＡＤ）の症状の発症前に記憶を改善するための方法を提供し、方法は、ＮＭＤＡ受容体および／またはリアノジン受容体の過剰な活性化を抑制するのに有効なある量のダントロレンを含む医薬組成物を、それを必要とする対象に鼻腔内投与することを含む。
別の態様では、本発明は、アルツハイマー病（ＡＤ）の症状の発症後の記憶喪失を改善するための方法を提供し、記憶喪失は、ＡＤによって引き起こされ、この方法は、ＮＭＤＡ受容体および／またはリアノジン受容体の過剰な活性化を抑制するのに有効なある量のダントロレンを含む医薬組成物を、それを必要とする対象に鼻腔内投与することを含む。
別の態様では、本発明は、脳内のダントロレンの濃度および持続時間を増加させるための方法を提供し、方法は、ある量のダントロレンを含む医薬組成物を、それを必要とする対象に鼻腔内投与することを含む。
さらなる態様では、本発明は、アルツハイマー病（ＡＤ）を有するか、または有すると疑われる対象におけるニューロンの神経新生および／またはシナプス形成の障害を抑制するための方法を提供し、神経新生および／またはシナプス形成の該障害は、少なくとも部分的に、小胞体（ＥＲ）リアノジン受容体（ＲｙＲ）の過剰な活性化によって引き起こされ、この方法は、ａ）ＥＲカルシウムイオン（Ｃａ２＋）の放出を減少させるのに有効なある量のダントロレンを含む医薬組成物を該対象に鼻腔内投与することと、ｂ）治療有効量のグルタミン酸受容体拮抗薬をステップ（ａ）の対象に投与することと、を含む。
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明、実施例、および図面から明らかになろう。しかし、本発明の趣旨および範囲内の様々な変更および修正がこの詳細な説明から当業者には明らかになるので、本発明のある特定の実施形態を示す一方で詳細な説明および特定の実施例は、例示としてのみ与えられることを理解されたい。
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本開示のある特定の態様をさらに実証するために含まれ、その発明は、本明細書に提示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて、これらの図面の１つ以上を参照することによってより良く理解することができる。本特許または出願ファイルには、カラーで作成された少なくとも１つの図面が含まれている。カラー図面を有する本特許または特許出願公開のコピーは、要求に応じて、必要な手数料を支払うことにより、官庁から提供される。
ダントロレンが、アルツハイマー病（ＡＤ）患者の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）において、細胞生存率を促進し、細胞増殖の障害を抑制したことを示す。図１Ａは、ダントロレン（ＤＡＮ、３０μＭ）によるｉＰＳＣの２４時間の処置は、健康なヒト対象（ＣＯＮ）からのｉＰＳＣに影響を与えなかったが、孤発性アルツハイマー病（ＳＡＤ、Ｐ＝０．００６）および家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ、Ｐ＜０．０００１）患者からの有意により大きいｉＰＳＣの細胞生存率をもたらしたことを示す。細胞生存率については、相互作用、処置、および細胞型はすべて、重要な変動源であった（それぞれ、Ｆ［２，４０］＝９２．５６、Ｐ＜０．０００１；Ｆ［１，４０］＝１１０．４０、Ｐ＜０．０００１；およびＦ［２，４０］＝９２．８１、Ｐ＜０．０００１）。図１Ｂは、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）陽性細胞の割合によって測定された細胞増殖が、対照の健康な対象の細胞と比較して、著しく害された家族性アルツハイマー病細胞であることを示す（Ｐ＝０．０２２）。ビヒクル対照であるジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）と比較して、ダントロレンは、家族性アルツハイマー病細胞でより大きな増殖をもたらした（Ｐ＝０．００８、家族性アルツハイマー病ダントロレン対ジメチルスルホキシド）。増殖については、ダントロレン処置および細胞型が重要な変動源であった（それぞれ、Ｆ［２，３０］＝５．４４、Ｐ＝０．００９；およびＦ［１，３０］＝９．８１、Ｐ＜０．０３９）。すべてのデータは、５～８回の独立した実験の平均±ＳＤとして表される（図１Ａでは、家族性アルツハイマー病、ｎ＝７；対照、ｎ＝８；孤発性アルツハイマー病、ｎ＝８、図１Ｂでは、ジメチルスルホキシドで処置された対照、ｎ＝７；ダントロレンで治療された対照、ｎ＝５；孤発性アルツハイマー病のＤＭＳＯとダントロレンの両方の群、ｎ＝５；家族性アルツハイマー病のジメチルスルホキシド、ｎ＝８；ダントロレン、ｎ＝６）。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。統計的有意性は、シダックの多重比較検定（シダックのＭＣＴ）による二元配置分散分析を使用して決定された。ＭＴＴ、３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド。
アルツハイマー病（ＡＤ）患者に由来する細胞において、ダントロレンが、神経前駆細胞の未成熟ニューロンへの分化の障害を改善したことを示す。神経前駆細胞（ＮＰＣ）の未成熟ニューロンへの分化（分化２３日目）は、孤発性アルツハイマー病（ＳＡＤ）と家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）の両方で著しく害され、これは、ダントロレン（ＤＡＮ）によって抑制された。図２Ａは、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）からの、誘導０日目から開始して、ダントロレンの有無にかかわらず３日間処置された、ダブルコルチン（ＤＣＸ（赤）によって染色された未成熟ニューロンの代表的な免疫蛍光画像を示す。スケールバー、１００μｍ。図２Ｂは、孤発性アルツハイマー病細胞（Ｐ＝０．００４）と家族性アルツハイマー病細胞（Ｐ＝０．０１１）の両方の分化が、対照（ＣＯＮ）と比較して害されたことを示す。しかしながら、孤発性アルツハイマー病（Ｐ＝０．００８）と家族性アルツハイマー病（Ｐ＝０．００８）細胞の両方の分化は、ダントロレンによる処置後に強化された。シダックの多重比較試験による二元配置分散分析を使用した場合、細胞型および処置が、重要な変動源であった（それぞれ、Ｆ［２，３０］＝８．７４９、Ｐ＝０．００１、およびＦ［１，３０］＝２５．０８、Ｐ＜０．０００１）。データは、６回の独立した実験からの平均±ＳＤで表される（すべての群でｎ＝６）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。ＤＡＰＩ、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール；ＤＭＳＯ、ジメチルスルホキシド。
アルツハイマー病患者の細胞において、ダントロレンが、神経前駆細胞（ＮＰＣ）の皮質ニューロンおよび前脳基底部コリン作動性ニューロン（ＢＦＣＮ）への分化を抑制したことを示す。図３Ａは、ＮＰＣの成熟皮質ニューロンへの分化タイムラインを示す。図３Ｂは、甲状腺ホルモン受容体－ｂ（Ｔｒｂ１、赤）および微小管結合タンパク質－２（ＭＡＰ２、緑）で二重染色されたニューロンの代表的な免疫蛍光画像を示す。スケールバー、１００μＭ。図３Ｃは、Ｔｒｂ１陽性細胞の割合が、対照の健康な対象（ＣＯＮ）の細胞と比較して、ヒト孤発性アルツハイマー病（ＳＡＤ；Ｐ＜０．０００１）および家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）細胞（Ｐ＝０．０２２）の両方で有意により少なかったが、ＳＡＤ細胞は、ダントロレン（ＤＡＮまたはＤａｎ、Ｐ＜０．０００１）で処置した後、ＴｒＢ１陽性細胞の割合が有意により大きかったことを示す。相互作用、細胞型、および処置は、重要な変動源であった（Ｆ［２，２４］＝１４．８４、Ｐ＜０．０００１、Ｆ［２，２４］＝１５．９４、Ｐ＜０．０００１、およびＦ［１，２４］＝７．５３、Ｐ＝０．０１１）。図３Ｄは、神経前駆細胞（ＮＰＣ）の成熟ＢＦＣＮニューロンへの分化のタイムラインを示す。図３Ｅは、ニューロンへの人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の分化の誘導から開始して３日間のダントロレン処置の有無にかかわらず、ＭＡＰ２（赤）およびコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴまたはＣＨＡＴ）陽性細胞（緑）によって二重染色された成熟ニューロンの代表的な免疫蛍光画像を示す。スケールバー、１００μｍ。図３Ｆは、ＣｈＡＴ陽性細胞（前脳基底部コリン作動性ニューロン（ＢＦＣＮ））の割合が、ＳＡＤ（Ｐ＝０．００４）細胞とＦＡＤ（Ｐ＝０．０１７）細胞の両方で有意に減少し、これは、ＦＡＤ細胞（Ｐ＝０．００８）については、ダントロレン処置によって改善されたが、ＳＡＤ細胞（Ｐ＝０．０６７）ではしなかったことを示す。相互作用、細胞型、および処置は、重要な変動源であった（それぞれ、Ｆ［２，２４］＝５．６１、Ｐ＝０．０１０、Ｆ［２，２４］＝６．２７、Ｐ＝０．００６、およびＦ［１，２４］＝１４．７８、Ｐ＝０．００１）。統計的有意性は、二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）と、それに続くシダックの多重比較検定を使用して決定された。すべてのデータは、５回の独立した実験からの平均±ＳＤとして表される（すべての群でｎ＝５）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。ＤＭＳＯ、ジメチルスルホキシド；ＳＨＨ、組換えヒトソニックハリネズミ。
ダントロレンが、アルツハイマー病細胞におけるニューロンの樹状突起交点およびシナプス密度の障害を抑制したことを示す。ＮＰＣは、インスリンで成熟皮質ニューロンに分化し、ダントロレン（ＤＡＮ）処置は、ｉＰＳＣ分化の誘導から開始して３日間であった。樹状突起と皮質ニューロンの周りの同心円との交点の平均数は、体細胞からの円の距離（μｍ）の関数として示される。図４Ａは、交点の数が孤発性アルツハイマー病（ＳＡＤ）細胞と家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）細胞の両方で有意により少なく、これは、ＳＡＤ細胞においてダントロレンによって抑制されたことを示す。図４Ｂは、体細胞から約１５０μＭの距離での交点の平均数が、対照（ＣＯＮ）と比較してＳＡＤ（Ｐ＜０．０００１）およびＦＡＤ細胞（Ｐ＜０．０００１）でより少なかったが、ダントロレン処置により、ＳＡＤ（Ｐ＜０．０００１）とＦＡＤ細胞（Ｐ＝０．０１４）の両方で有意により大きかったことを示す。相互作用（Ｆ［２，１２］＝４２．１８、Ｐ＜０．０００１）、細胞型（Ｆ［２，１２］＝２７３．３０、Ｐ＜０．０００１）、およびダントロレン処置（Ｆ［１，１２］＝７８．４８、Ｐ＜０．０００１）は、重要な変動源であった。統計的有意性は、二元配置分散分析およびシダックの多重比較検定によって決定された。図４Ｃは、シナプス後マーカー密度タンパク質９５（ＰＳＤ９５；赤）およびシナプス前マーカーシナプシン－１（緑）二重免疫染色によって決定されたシナプス密度を示す。スケールバー、１００μＭ。図４Ｄは、ＰＳＤ９５密度が対照と比較してＳＡＤ（Ｐ＝０．００１）とＦＡＤ細胞（Ｐ＝０．００１）の両方で有意により低かったが、ダントロレン処置により、ＦＡＤ細胞（Ｐ＜０．０００１）で有意により大きかったことを示す。相互作用（Ｆ［２，２３］＝８．７８、Ｐ＝０．００２）、細胞型（Ｆ［２，２３］＝２５．３６、Ｐ＜０．０００１）、およびダントロレン処置（Ｆ［１，２３］＝２８．６０、Ｐ＜０．０００１）は、重要な変動源であった。図４Ｅは、シンパプシン－１も、ＳＡＤ（Ｐ＝０．００１）およびＦＡＤｐ＜０．０００１）細胞で有意により少なく、ＦＡＤ細胞（Ｐ＜０．０００１）でダントロレンによって有意に増加し、ダントロレンで処置されたＦＡＤ細胞（Ｐ＜０．０００１）で有意により大きかったことを示す。相互作用（Ｆ［２，２３］＝１８．１２、Ｐ＜０．０００１）、細胞型（Ｆ［２，２３］＝２１．４６、Ｐ＜０．０００１）、およびダントロレン処置（Ｆ［１，２３］＝７．１８、Ｐ＝０．０１３）が重要な変動源であった。データは、少なくとも４回の独立した実験からの平均±ＳＤで表され、対照およびＦＡＤ細胞（Ｎ＝５）、ならびにＳＡＤ細胞（Ｎ＝４）である。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。統計的有意性は、二元配置分散分析およびシダックの多重比較検定によって決定された。ＤＭＳＯ、ジメチルスルホキシド。
ＳＡＤまたはＦＡＤ患者に由来するｉＰＳＣにおける２型リアノジン受容体（ＲｙＲ－２）の増加を示す。図５Ａ～５Ｂは、２型リアノジン受容体（ＲｙＲ、ＲｙＲ－２、またはＲＹＲ－２）であるＲｙＲ－２がＳＡＤとＦＡＤ細胞の両方で増加し、患者からのＦＡＤ細胞ではより劇的であったことを示し、免疫ブロット（ウエスタンブロット）によって決定された。図５Ｃおよび５Ｄは、同様に、ＲｙＲ－２がＳＡＤ細胞で有意により大きかったことを示し、免疫蛍光染色によって決定された。すべてのデータは、４回の独立した実験（Ｎ＝４回の反復、図５Ｂ）または７回の独立した実験（Ｎ＝７回の反復、図５Ｄ）の平均±ＳＤである。図５Ｂのデータは、ノンパラメトリック（ダゴスティーノ－ピアソンオムニバス正規性検定）であり、クラスカル－ウォリス検定（Ｐ＝０．１３２）と、それに続くダンの多重比較検定（Ｐ＝０．１５８）によって分析され、対照の健康な対象（ＣＯＮ）の細胞と比較された。図５Ｄのデータも、ノンパラメトリックであり、クラスカル－ウォリス検定（Ｐ＝０．００２）と、それに続くダンの多重比較検定（ダンのＭＣＴ）によって分析された。＊Ｐ＝０．０２０、＊＊Ｐ＝０．００２。スケールバー、２５μｍ（図５Ｃ）。ＤＡＰＩ、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール。
ダントロレンが、アルツハイマー病（ＡＤ）患者の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）において、Ｎ－メチル－ｄ－アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）を介した細胞質Ｃａ２＋濃度（［Ｃａ２＋］ｃ）の上昇を著しく抑制したことを示す。ＮＭＤＡ（５００μＭ）は、正常なヒト対象（ＣＯＮ）と比較して、孤発性（ＳＡＤ）および家族性（ＦＡＤ）アルツハイマー病細胞の曲線下面積（ＡＵＣ、図６Ａ～６Ｄ）によって表される統合された細胞質Ｃａ２＋のより大きな全体的な曝露を誘発した（それぞれ、孤発性アルツハイマー病の場合はＰ＝０．０４１、家族性アルツハイマー病の場合はＰ＝０．００８）。ダントロレン（ＤＡＮ、３０μＭ）は、家族性アルツハイマー病細胞におけるＮＭＤＡを介した［Ｃａ２＋］ｃおよびＡＵＣの上昇を改善した（それぞれ、ピークの場合はＰ＝０．４３６、ＡＵＣの場合はＰ＜０．０００１、図６Ｂ、６Ｄ）。すべてのデータは、３回の独立した実験（Ｎ＝３）からの中央値［２５、７５］として表される。図６Ｃのデータは、ノンパラメトリックであり、クラスカル－ウォリス検定（Ｐ＝０．０２０）と、それに続くダンの多重比較検定によって分析された。図６Ｄのデータも、ノンパラメトリックであり、クラスカル－ウォリス検定（Ｐ＜０．００１）と、それに続くダンの多重比較検定を使用して分析された。＊Ｐ＝０．０４１、＊＊Ｐ＝０．００８、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
アルツハイマー病患者からの前脳基底部コリン作動性ニューロンにおけるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を介した細胞質カルシウム（Ｃａ２＋）濃度（［Ｃａ２＋］ｃ）の上昇に対するダントロレンの効果を示す。細胞質Ｃａ２＋濃度の変化（図７Ａ～７Ｄ）および対応する統計分析（図７Ｅ～７Ｇ）が提供される。処置（ＡＴＰ、ＡＴＰ＋Ｃａ２＋）と細胞型を比較する二元配置分散分析を実施した：対照（ＣＯＮ）、孤発性アルツハイマー病（ＳＡＤ）、家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）。１ｍＭの細胞外カルシウム（ＡＴＰ＋Ｃａ２＋、図７Ａ、７Ｅ）の存在下でのＡＴＰ（３０μＭ）は、対照細胞と比較して孤発性アルツハイマー病細胞（Ｐ＝０．０４９）で有意により高かった、ピークの細胞質Ｃａ２＋濃度［Ｃａ２＋］ｃに対して重要な変動源（Ｆ［１，３５］＝１４．９０、Ｐ＝０．０００５）であった。ＡＴＰは、１ｍＭの細胞外Ｃａ２＋（ＡＴＰ）の不在下で、１ｍＭの細胞外Ｃａ２＋（ＡＴＰ＋Ｃａ２＋）の存在下での家族性アルツハイマー病細胞と比較して、家族性アルツハイマー病細胞（Ｐ＝０．０３１）で有意により低いＡＴＰ誘導ピーク［Ｃａ２＋］ｃをもたらした。（図７Ｂ、７Ｅ）さらに、細胞外カルシウムを伴うＡＴＰ（ＡＴＰ＋Ｃａ２＋）は、統合された細胞質Ｃａ２＋（曲線下面積［ＡＵＣ］）に対する重要な変動源（Ｆ［１，３５］＝７１．８７、Ｐ＜０．０００１）であり、これは、対照（Ｐ＝０．０００２）、孤発性アルツハイマー病（Ｐ＝０．００５）、および家族性アルツハイマー病（Ｐ＜０．０００１）の細胞で、ＡＴＰのみの同じ細胞（ＡＴＰ、Ｅ）と比較して有意により大きかった。ＡＴＰと細胞外Ｃａ２＋による細胞のダントロレン（ＤＡＮ、３０μＭ）前処置（ＡＴＰ＋Ｃａ２＋＋ＤＡＮ）は、ピークの細胞質［Ｃａ２＋］ｃに対して、アルツハイマー病細胞型の重要な変動源であった（Ｆ［２，４２］＝３．６５、Ｐ＝０．０３５）が、群間で有意差は検出されなかった（図７Ｃ、７Ｆ）。ダントロレン（ＡＴＰ＋Ｃａ２＋＋ＤＡＮ）の添加も、ＡＵＣに対するアルツハイマー病細胞型の有意な変動源（Ｆ［１，４０］＝３０．６０、Ｐ＜０．０００１）であり、ＡＴＰ＋Ｃａ２＋のみの細胞と比較して、対照（Ｐ＝０．０３３）および家族性アルツハイマー病細胞（Ｐ＝０．０１５）について有意に減少した。（図７Ｃ、７Ｆ）。細胞外Ｃａ２＋の不在下でのＡＴＰによる細胞のダントロレン（３０μＭ）前処置（ＡＴＰ＋ＤＡＮ、Ｄ）は、ピークの細胞質［Ｃａ２＋］ｃに対する重要な変動源（Ｆ［１，３３］＝１０．０１、Ｐ＝０．００３）であったが、群間に有意差は見られず（図７Ｇ）、Ｃａ２＋の不在は、ＡＵＣに対する重要な変動源であった（Ｆ［１，３３］＝５．９５、Ｐ＝０．０２０）が、群間で差異は、検出されなかった（図７Ｇ）。ピークおよび統合されたＣａ２＋濃度は、正常なヒト対象からのＣＯＮ細胞からのベースラインのパーセンテージとして示される。すべてのデータ（図７Ｅ～７Ｇ）は、少なくとも５回の独立した実験からの平均±ＳＤとして表される（ＣＯＮ、ｎ＝６回の反復、孤発性アルツハイマー病、ｎ＝５回の反復、家族性アルツハイマー病、ｎ＝８～９回の反復）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．００１。有意性は、二元配置分散分析と、それに続くシダックの多重比較検定によって決定された。
アルツハイマー病患者に由来するニューロンのリソソームＡＴＰアーゼおよび酸性度が対照細胞よりも低かったことを示す。図８Ａは、健康なヒト対象（ＣＯＮ）、孤発性（ＳＡＤ）または家族性（ＦＡＤ）アルツハイマー病患者の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）において、液胞型Ｈ＋－ＡＴＰアーゼ（Ｖ－ＡＴＰアーゼ、赤）の共局在を、リソソーム（ＬＡＭＰ－２、緑）、エンドソーム（ＥＥＡ、緑）、および小胞体（カルネキシン、緑）を標的とする特定のマーカーによる免疫染色を使用して測定されたことを示す。図８Ｂは、細胞酸性度を、ＣＯＮ、ＳＡＤ、およびＦＡＤ細胞（４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール［ＤＡＰＩ］、青）においてｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ陽性酸性ビヒクル（赤）によって測定されたことを示す。図８Ｃは、リソソーム（ＬＡＭＰ－２）のＶ－ＡＴＰアーゼが、対照よりもＳＡＤ細胞（Ｐ＝０．００１）およびＦＡＤ細胞（Ｐ＝０．０１０）で有意に低かったことを示す。相互作用（Ｆ［４，２３］＝４．３５、Ｐ＝０．００８）およびオルガネラの種類（Ｆ［２，２３］＝２９．１５、Ｐ＜０．０００１）に対する重要な変動源があった。図８Ｄは、ダントロレン（ＤＡＮ、３０μＭ）の添加により、ＦＡＤ細胞におけるリソソーム（ＬＡＭＰ－２）のＶ－ＡＴＰアーゼが有意に減少しなくなった（Ｐ＝０．９６５）が、対照と比較して、ＳＡＤ細胞では有意により低いままであったことを示す（Ｐ＝０．００７）。さらに、対照における小胞体（カルネキシン）のｖ－ＡＴＰアーゼは、ＳＡＤ（Ｐ＝０．００１）およびＦＡＤ（Ｐ＜０．０００１）細胞と比較して有意に低下した。相互作用（Ｆ［４，２７］＝８．６６、Ｐ＝０．０００１）、オルガネラの種類（Ｆ［２，２７］＝７９．４９、Ｐ＜０．０００１）、および細胞型（Ｆ［２，２７］＝５．９６、Ｐ＝０．００７）に対する重要な変動源があった。図８Ｅは、ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ陽性酸性小胞が、対照細胞と比較して、孤発性アルツハイマー病（Ｐ＜０．０００１）および家族性アルツハイマー病（Ｐ＝０．０００４）で有意により低かったことを示す。ダントロレンも、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）と比較して、孤発性アルツハイマー病（Ｐ＝０．０２５）と家族性アルツハイマー病（Ｐ＝０．０３６）の両方でトラッカー陽性酸性小胞を有意に増加させた。細胞型およびダントロレンは、重要な変動源であった（それぞれＦ［２，１９］＝２９．８８、Ｐ＜０．０００１、およびＦ［１，１９］＝２３．１６、Ｐ＝０．０００１）。すべてのデータは、４回の独立したものからの平均±ＳＤとして表され（すべての群でｎ＝４回の反復）、二元配置分散分析と、それに続くシダックの多重比較検定によって分析された。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
ダントロレンがＡＤ患者からのｉＰＳＣにおけるＬＣ３ＩＩレベルを増加させたことを示す。図９Ａ、９Ｃは、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ダントロレン（ＤＡＮ）、またはダントロレンとバフィロマイシン（ＢＡＦＩ）による、孤発性アルツハイマー病（ＳＡＤ）、家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）、および健康なヒト対照（ＣＯＮ）からの人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）におけるリソソーム（ＬＡＭＰ２、緑）のＬＣ３ＩＩ（赤）の代表的な免疫組織化学的画像（図９Ａ）および代表的なウエスタンブロット（図９Ｃ）を示す。図９Ｂは、二重標識免疫染色細胞の定量化により、バフィロマイシンを含むダントロレンが、それぞれ、ジメチルスルホキシドまたはダントロレンと比較して、ＳＡＤ（Ｐ＜０．０００１）、ＦＡＤ（Ｐ＜０．０００１）、およびＣＯＮ（Ｐ＜０．０００１）細胞におけるリソソーム（ＬＡＭＰ－２）のＬＣ３ＩＩを有意に増加させたことが示されたことを示す。二元配置分散分析およびシダックの多重比較検定を使用して、相互作用（Ｆ［４，３５］＝８．１８、Ｐ＜０．０００１）、細胞型（Ｆ［２，３５］＝２４．０８、Ｐ＜０．０００１）、および処置（Ｆ［２，３５］＝１７７．００、Ｐ＜０．０００１）における重要な変動源があった。図９Ｄは、ウエスタンブロットの定量化により、バフィロマイシンを含むダントロレンが、ＤＭＳＯまたはＤＡＮ単独と比較して、それぞれ、ＳＡＤ（Ｐ＜０．０００１）、ＦＡＤ（Ｐ＜０．０００１）、およびＣＯＮ（Ｐ＜０．０００１）細胞におけるリソソーム（ＬＡＭＰ－２）のＬＣ３ＩＩを有意に増加させることが同様に示されたことを示す。ダントロレンで処置された家族性アルツハイマー病細胞も、ジメチルスルホキシド細胞で治療された家族性アルツハイマー病と比較して、ＬＣ３ＩＩを有意に増加させた（Ｐ＝０．０００４）。二元配置分散分析およびシダックの多重比較検定を使用して、交互作用（Ｆ［４，１８］＝６．９２、Ｐ＝０．００２）および処置（Ｆ［２，１８］＝３０３．４０、Ｐ＜０．００１）は、重要な変動源であった。図９Ｅは、ＣＯＮ、ＳＡＤ、およびＦＡＤ細胞におけるＰ６２レベルの代表的なウエスタンブロットを示す。図９Ｆは、Ｐ６２ウエスタンブロットの定量化により、細胞ストレスのこのマーカーが、ＣＯＮと比較して、ＦＡＤ細胞（Ｐ＝０．０１５）で有意に増加したことが、クラスカル－ウォリス検定（Ｐ＝０．００４）と、それに続くダンの多重比較検定を使用して見出されたことを示す。すべてのデータは、少なくとも３回の独立した実験からの平均±ＳＤとして表される（すべての群でｎ＝３回の反復）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
経口および鼻腔内投与後のマウスの血漿および脳中のダントロレンの薬物動態分析を示す。図１０Ａは、鼻腔内投与（５ｍｇ／ｋｇ）の２０分後および経口投与（５ｍｇ／ｋｇ）の５０分後にピークのダントロレン血漿濃度（Ｃｍａｘ）が生じたことを示す。＊＊＊Ｐ＝０．０００００８９、経口投与との比較。シダック－ホルム法を使用した複数のｔ検定で決定された。アルファ＝０．０５％。鼻腔内投与の時点、１０、３０、１５０、１８０分、ｎ＝５；２０分、ｎ＝８；５０～１２０分、ｎ＝４；経口投与の時点、１０～１２０分；ｎ＝５。図１０Ｂは、ダントロレンの鼻腔内および経口投与後の血漿における統合されたダントロレン曝露（パネルＡの曲線下面積）（左）およびＣｍａｘ（右）の比較を示す。＊＊Ｐ＝０．００７９、ノンパラメトリック独立マン－ホイットニー検定（両側検定）による。鼻腔血漿（２０分）、ｎ＝８；経口血漿、（５０分）、ｎ＝４；図１０Ｃは、ほとんどの時点で、鼻腔内投与（５ｍｇ／ｋｇ）後のダントロレンの脳内濃度が経口投与後よりも高かったことを示す。Ｃｍａｘは、それぞれ鼻腔内投与の２０分後および経口投与の５０分後に生じた。＊＊＊Ｐ＝０．００００００１２、＊＊Ｐ＝０．００３５（３０分）、＊＊Ｐ＝０．００３７（５０分）、＊＊Ｐ＝０．００２７（１２０分）、対照群との比較（鼻腔内対経口）およびシダック－ホルム法を使用して複数のｔ検定により決定された、アルファ＝０．０５％。鼻腔内投与の時点、１０、３０、１５０、１８０分、ｎ＝５；２０分、ｎ＝８；５０～１２０分、ｎ＝４；経口投与の時点、１０～１２０分；ｎ＝５。図１０Ｄは、ダントロレンの鼻腔内および経口投与後の脳組織における統合されたダントロレン曝露（パネルＣの曲線下面積）（左）、ならびにダントロレンの鼻腔内および経口投与後の脳内のＣｍａｘ（右）の比較を示す、＊＊Ｐ＝０．００７９、非パラメトリック独立マン－ホイットニー検定（両側検定）による。鼻腔投与の脳および経口投与の脳、ｎ＝５；鼻腔投与の脳（２０分）、ｎ＝８；経口投与の脳（５０）分、ｎ＝５。すべてのデータは、平均±９５％ＣＩとして表される。
鼻腔内投与対経口投与後の経時的な脳内のダントロレン濃度を示す。一般的に、鼻腔内投与と経口投与との間でダントロレンの脳／血漿比に有意差はなかった。５０分で、経口のダントロレン脳血漿比は、鼻腔内のダントロレンよりも高かった。経口の脳／血漿比は、ゼロまで低下したが、鼻腔内のダントロレン脳／血漿比は、１８０分まで維持された。データは、平均±９５％ＣＩとして表され、有意性は、アルファ＝５．００％により、ホルム－シダック法を使用した複数のｔ検定によって決定された。％。鼻腔内投与の時点、１０、３０、１５０、１８０分、ｎ＝５；２０分、ｎ＝８；５０～１２０分、ｎ＝４；経口投与の時点、１０～１２０分；ｎ＝５。
ダントロレンの長期鼻腔内投与は、嗅覚または運動機能に影響を与えなかったことを示す。図１２Ａは、ダントロレン（５ｍｇ／ｋｇ、３回／週）またはビヒクル対照の鼻腔内投与の３週間後、動物が前足で埋められた食品を回収するのに必要な秒単位の時間によって嗅覚を測定したことを示す。図１２Ｂは、ダントロレン（５ｍｇ／ｋｇ、３回／週）の鼻腔内投与の４ヶ月後、食品を見つける時間の長さ（図１２Ａ）およびロータロッドに費やされた時間の長さによって運動機能を決定したことを示す（図１２Ｂ）。嗅覚または運動機能に有意差は検出されなかった。データは、平均±９５％ＣＩとして表され、ノンパラメトリックな独立マン－ホイットニー検定で分析される、すべての群でｎ＝１０。
血液脳関門（ＢＢＢ）抑制剤であるニモジピンおよびエラクリダールがダントロレンの通過に影響を与えなかったことを示す。すべてＲｙａｎｏｄｅｘと同じビヒクルに溶解した、ＢＢＢポンプ抑制剤（Ｐ－ｇｐ／ＢＣＲＰ）、ニモジピン（Ｎｉｍ、２ｍｇ／ｋｇ）、またはエラクリダール（Ｅｌａｃ、１０ｍｇ／ｋｇ）の存在下または不在下でのダントロレン（５ｍｇ／ｋｇ）の鼻腔内投与の２０分後、ダントロレンの脳／血漿比を、ＢＢＢを通過するダントロレンの測定値として決定した。ダントロレン単独と比較して、いずれの抑制剤でも有意差は検出されなかった。データは、平均±９５％ＣＩ、ｎ＝５（Ｄａｎ、Ｄａｎ＋Ｎｉｍ）、ｎ＝６（Ｄａｎ＋Ｅｌａｃ）として表され、クラスカル－ウォリスノンパラメトリックＡＮＯＶＡおよびダンの多重比較検定で分析される。
実施例３：処置、行動試験、および安楽死のタイムラインの実験計画を示す。遺伝子型（５ＸＦＡＤ、ＷＴ）、処置開始年齢（早期処置（ＥＴＧ）、後期処置（ＬＴＧ）群）、および処置の投与経路（鼻腔内、皮下）に基づいて、１２の実験群が設計された。
鼻腔内ダントロレンが、皮下ダントロレンよりも脳への薬物浸透性が高く、脳内濃度が高いことを示す。図１５Ａは、Ｂ６ＳＪＬＦ１／Ｊマウスにおける皮下（青）または鼻腔内（赤）投与の２０分後および６０分後の血漿中のダントロレン濃度を示す。二元配置分散分析は、時間（Ｐ＝０．０１５、Ｆ（１、１６）＝７．４２７）と投与経路（Ｐ＝０．０００４、Ｆ（１、１６）＝１９．７５）の両方で重要な変動源を示した。血漿中のダントロレン濃度は、シダックの多重比較により、皮下投与の２０分で有意により大きかった（Ｐ＝０．００１４）。図１５Ｂは、皮下および鼻腔内アプローチ後の脳ダントロレン濃度を示す。二元配置分散分析は、投与経路に対する重要な変動源を示し（Ｐ＜０．０００１、Ｆ（１、１６）＝２７．０７）、脳内のダントロレン濃度は、シダックの多重比較により、皮下投与（Ｐ＝０．０００２）よりも鼻腔内投与で、６０分で有意に大きかった。図１５Ｃは、ダントロレンの脳／血漿濃度比を示しており、ダントロレンの脳への浸透能力を表している。二元配置分散分析は、投与経路に対する重要な変動源を示し（Ｐ＜０．０００１、Ｆ（１、１６）＝４３．６５）、脳／血漿比は、シダックの多重比較により、鼻腔内投与に関して２０分（ｐ＝０．００３２）と６０分（ｐ＜０．０００１）の両方で有意により大きかった。図１５Ｄは、統合された全体的なダントロレン曝露を反映するために、線形台形法を使用して計算されたダントロレン濃度の曲線下面積（ＡＵＣ）を示す。すべてのデータは、９５％ＣＩによる平均として表される、すべての群でＮ＝５／群、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
ダントロレンの鼻腔内投与が、ＡＤマウスの記憶に対してより良い治療効果を有したことを示す。記憶は、文脈的恐怖条件付け（ＣＦＣ、海馬依存性）と手がかり恐怖条件付け（ＦＣ手がかり、海馬非依存性）の両方の試験で評価された。試験は、早期処置群（ＥＴＧ）の場合、それぞれ月齢６ヶ月（６Ｍ）および１１ヶ月（１１Ｍ）で処置４ヶ月後および９ヶ月後に、後期処置群（ＬＴＧ）の場合、月齢１１ヶ月で処置５ヶ月後に行われた。図１６Ａは、ＣＦＣ試験では、月齢６ヶ月で、ビヒクル（ＩＮ－ＶＥＨ）、ダントロレン（ＩＮ－ＤＡＮ）の鼻腔内投与、およびダントロレンの皮下注射（ＳＱ－ＤＡＮ）を含むすべてのＥＴＧ５ＸＦＡＤマウスが、未処置の５ＸＦＡＤ対照（ＣＯＮ）と比較して有意により大きい記憶を示した（それぞれＰ＝０．０００４、Ｐ＝０．０００２、Ｐ＜０．０００１）。ＩＮ－ＶＥＨおよびＩＮ－ＤＡＮのＥＴＧの５ＸＦＡＤマウス（それぞれＰ＝０．０２４６、Ｐ＝０．０２２８）における月齢１１ヶ月の５ＸＦＡＤマウスの記憶は、５ＸＦＡＤ対照よりも有意に大きかった。ＥＴＧデータは、ダネットの多重比較検定（ＭＣＴ）による二元配置分散分析を使用して分析された。処置が重要な変動源であることが分かった（Ｐ＜０．０００１、Ｆ（３，４９）＝９．５３６）。月齢１１ヶ月で、ＬＴＧ（１１Ｍ－ＬＴＧ）のＩＮ－ＤＡＮおよびＳＱ－ＤＡＮを、５ＸＦＡＤ対照（ＣＯＮ）と比較し、データをダンのＭＣＴによるクラスカル－ウォリス検定を使用して分析した。Ｉｎ－ＤＡＮ群の記憶は、ＣＯＮと比較して大幅に改善された（Ｐ＝０．０４１０）。ＳＱ－ＤＡＮの記憶は、より良い傾向にあったが、統計的に有意ではなかった（Ｐ＝０．１５７５）。図１６Ｂは、月齢６ヶ月の海馬非依存性記憶（ＦＣ手がかり）が、対照と比較して、ＩＮ－ＶＥＨ（Ｐ＝０．０１４５）、ＩＮ－ＤＡＮ（Ｐ＝０．００５５）、およびＳＱ－ＤＡＮ（Ｐ＝０．００１）によりＥＴＧで有意に改善されたことを同様に示す。月齢１１ヶ月では、ＩＮ－ＤＡＮのＥＴＧの記憶は、５ＸＦＡＤ ＣＯＮ群よりも有意に優れており（Ｐ＝０．００１１）、これは、ダネットの多重比較検定（ＭＣＴ）による二元配置分散分析を使用して分析された。処置が重要な変動源であることが分かった（Ｐ＝０．００１３、Ｆ（３，４９）＝６．０９５）。ＥＴＧにおけるＩＮ－ＶＥＨまたはＳＱ－ＤＡＮは、記憶を改善する傾向があったが、統計的には異ならなかった（それぞれ、Ｐ＝０．０６６４、Ｐ＝０．１８４３）。ダンのＭＣＴによるクラスカル－ウォリス検定を使用して、５ＸＦＡＤＣＯＮと比較して、ＩＮ－ＤＡＮまたはＳＱ－ＤＡＮのＬＴＧにおいて１１ヶ月では有意な記憶の改善は検出されなかった。すべてのデータは、９５％ＣＩの平均として表される、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、５ｘＦＡＤ ＣＯＮとの比較。動物数、ＥＴＧ ６Ｍ：ＣＯＮ ｎ＝１３、ＩＮ－ＶＥＨ ｎ＝１２、ＩＮ－ＤＡＮ ｎ＝１４、ＩＮ－ＳＱ ｎ＝１４；ＥＴＧ １１Ｍ：ＣＯＮ ｎ＝１３、ＩＮ－ＶＥＨ ｎ＝１０、ＩＮ－ＤＡＮ ｎ＝１１、ＩＮ－ＳＱ ｎ＝９；ＬＴＧ １１Ｍ：ＩＮ－ＤＡＮ ｎ＝１３、ＳＱ－ＤＡＮ ｎ＝１４、ＣＯＮ＝１３、ＥＴＧ １１Ｍで示したものと同じ対照）。
長期ダントロレン処置の副作用の評価を示す。ダントロレン（ＩＮ－ＤＡＮ）またはビヒクル（ＩＮ－ＶＥＨ）の鼻腔内投与およびダントロレン（ＳＱ－ＤＡＮ）の皮下投与は、早期処置群（ＥＴＧ）の場合は月齢２ヶ月から、後期処置群（ＬＴＧ）の場合は月齢６ヶ月から週３回投与された。図１７Ａは、月齢９ヶ月のすべての群に対してロータロッド試験を使用して測定された運動機能を示す。一元配置分散分析およびダネットの多重比較検定（ＭＣＴ）では、処置群と対照群との間に有意差は検出されなかった。（ＥＴＧ：ＣＯＮ ｎ＝１３、ＩＮ－ＶＥＨ ｎ＝１０、ＩＮ－ＤＡＮ ｎ＝１１、ＳＱ－ＤＡＮ ｎ＝９；ＬＴＧ：ＩＮ－ＤＡＮ ｎ＝１３、ＳＱ－ＤＡＮ ｎ＝１５。）図１７Ｂは、月齢１０ヶ月ですべての群に対して埋没食品試験を使用して測定された嗅覚を示す。ノンパラメトリックデータのためのクラスカル－ウォリス検定およびダンのＭＣＴでは、有意差は見られなかった。（ＥＴＧ：ＣＯＮ ｎ＝１３、ＩＮ－ＶＥＨ ｎ＝１０、ＩＮ－ＤＡＮ ｎ＝１０、ＳＱ－ＤＡＮ ｎ＝９；ＬＴＧ：ＩＮ－ＤＡＮ ｎ＝１３、ＳＱ－ＤＡＮ ｎ＝１５。）図１７Ｃは、血漿アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）活性を測定することにより評価された肝機能を示す。ＡＬＴは、対照群と比較して、ＬＴＧにおいて６ヶ月の鼻腔内処置後に有意に増加した（Ｐ＝０．０３６４）。ノンパラメトリックデータのためのクラスカル－ウォリス検定およびダンのＭＣＴにより、他の処置群と対照群との間に有意差は検出されなかった。（ＥＴＧ：ＣＯＮ ｎ＝９、ＩＮ－ＶＥＨ ｎ＝９、ＩＮ－ＤＡＮ ｎ＝８、ＳＱ－ＤＡＮ ｎ＝８、ＬＴＧ：ＩＮ－ＤＡＮ ｎ＝９、ＳＱ－ＤＡＮ ｎ＝７）。すべてのデータは、９５％ＣＩの平均として表される。図１７Ｄは、ＥＴＧマウスのＨ＆Ｅ染色切片における、月齢１１ヶ月で調べた肝病理を示す。ＥＴＧ群の間で大きな差異は観察されなかった（３つの切片／動物：ＣＯＮ ｎ＝３、ＩＮ－ＶＥＨ ｎ＝３、ＩＮ－ＤＡＮ ｎ＝３、ＳＱ－ＤＡＮ ｎ＝３、バー＝５０μｍ）。図１７Ｅは、ダントロレン（ＩＮ－ＤＡＮ、ＳＱ－ＤＡＮ）またはビヒクル（ＩＮ－ＶＥＨ）による慢性処置（ＥＴＧ、ＬＴＧ）後の死亡率を示し、これは、ログ－ランク（マンテル－コックス）検定を使用して未処置の５ＸＦＡＤ対照と比較された。ダントロレン処置とビヒクル処置との間に有意差は検出されなかった（Ｐ＝０．３６３６）。図１７Ｆは、処置中に監視された体重を示す。反復測定二元配置分散分析を使用して、ＥＴＧ群（Ｐ＝０．１４７８）における５ＸＦＡＤマウスの成長曲線に有意差は検出されなかった。（ＥＴＧ：ＣＯＮ ｎ＝１３、ＩＮ－ＶＥＨ ｎ＝１０、ＩＮ－ＤＡＮ ｎ＝１１、ＳＱ－ＤＡＮ ｎ＝９；ＬＴＧ：ＩＮ－ＤＡＮ ｎ＝１４、ＳＱ－ＤＡＮ ｎ＝１４）すべてのデータは、９５％ＣＩの平均として表される。
ダントロレンは、５ＸＦＡＤマウスの歯状回および海馬のアミロイド斑レベルに著しい影響を与えなかったことを示す。図１８Ａ～１８Ｂは、（ＣＯＮ）、鼻腔内ビヒクル（ＩＮ－ＶＥＨ）、鼻腔内ダントロレン（ＩＮ－ＤＡＮ）、および皮下ダントロレン（ＳＱ－ＤＡＮ）処置についての、早期処置群（ＥＴＧ）および後期処置群（ＬＴＧ）における５ＸＦＡＤマウスの海馬および皮質における６Ｅ１０免疫反応性の代表的な顕微鏡写真を示す。（バー＝１００μｍ）。図１８Ｃおよび１８Ｅは、各試験群について、斑が占める、海馬および皮質の面積パーセントを示す。処置群と対照群との間に有意差は見られなかった。図１８Ｄおよび１８Ｆは、各試験群について、海馬および皮質において計算された、面積（ｍｍ２）当たりのアミロイド斑の数を同様に示す。有意差は見られなかった。すべてのデータは、ノンパラメトリックデータのためのクラスカル－ウォリス検定およびダンのＭＣＴで分析された。（３つの切片／動物；ＤＧおよびＨＩＰ、ＥＴＧ：ＣＯＮ ｎ＝８、ＩＮ－ＶＥＨ ｎ＝４、ＩＮ－ＤＡＮ ｎ＝６、ＳＱ－ＤＡＮ ｎ＝６；ＬＴＧ：ＩＮ－ＤＡＮ ｎ＝６、ＳＱ－ＤＡＮ ｎ＝７）。データは、９５％ＣＩの平均として表わされる。
未処置の野生型および５ＸＦＡＤマウスの記憶障害を示す。文脈的恐怖条件付け（ＣＦＣ、海馬依存）と手がかり恐怖条件付け（ＦＣ手がかり、海馬非依存）の両方の記憶が、恐怖条件付け試験（ＦＣ）により評価された。図１９Ａは、ＣＦＣについて、月齢６ヶ月および１１ヶ月の野生型（ＷＴ）マウスと比較して、５ＸＦＡＤ（ＴＧ）マウスで海馬依存性記憶が有意に害されたことを示しており（それぞれＰ＝０．００１５、Ｐ＝０．００３３）、これは、独立ｔ検定を使用して分析された。遺伝学（ＷＴ対ＴＧ）が記憶の障害に対する重要な変動源であることが分かった（Ｐ＜０．０００１、Ｆ（１，４７）＝２３．４４）。図１９Ｂは、月齢６ヶ月および１１ヶ月のＷＴ－ＣＯＮマウスと比較して、５ＸＦＡＤ－ＣＯＮマウスで海馬非依存性記憶が有意に害されたことを同様に示しており（それぞれＰ＝０．００１９、Ｐ＝０．０００４）、独立ｔ検定を使用して分析された。遺伝学（ＷＴ対ＴＧ）が記憶の障害に対する重要な変動源であることが分かった（Ｐ＜０．０００１、Ｆ（１，４７）＝２７．９４）。データは、９５％ＣＩの平均として表わされる。（ＷＴ：６Ｍ ｎ＝１３、１１Ｍ ｎ＝１２；ＴＧ：６Ｍ ｎ＝１３、１１Ｍ ｎ＝１３）。
野生型（ＷＴ）マウスの記憶を示す。記憶は、文脈的恐怖条件付け（ＣＦＣ；海馬依存性）と手がかり恐怖条件付け（ＦＣ手がかり；海馬非依存性）の両方の試験を使用して評価された。試験は、早期処置群（ＥＴＧ）の場合、それぞれ月齢６ヶ月（６Ｍ）および１１ヶ月（１１Ｍ）で処置４ヶ月後および９ ３７ヶ月後に、後期処置群（ＬＴＧ）の場合、月齢１１ヶ月の処置５ヶ月後に実施された。図２０Ａは、未処置の対照と比較して、ビヒクル（ＩＮ－ＶＥＨ）、ダントロレン（ＩＮ－ＤＡＮ）の鼻腔内投与、ダントロレンの皮下注射（ＳＱ－ＤＡＮ）を含め、月齢６ヶ月と１１ヶ月の両方でのＣＦＣ試験に有意差がないことを示す。これら２つの月齢のＥＴＧデータは、二元配置分散分析とダネットの多重比較検定（ＭＣＴ）を使用して分析された。月齢１１ヶ月のＬＴＧデータは、テューキーのＭＣＴによる一元配置分散分析を使用して分析された。図２０Ｂは、両方の月齢で、海馬非依存性記憶（ＦＣ手がかり）において、すべてのＥＴＧおよびＬＴＧ群に有意差がないことを同様に示す。これら２つの月齢のＥＴＧデータは、ダネットの多重比較検定（ＭＣＴ）による二元配置分散分析を使用して分析された。１１ヶ月のＬＴＧデータは、テューキーのＭＣＴによる一元配置分散分析を使用して分析された。すべてのデータは、９５％ＣＩの平均として表される。ＥＴＧ ６Ｍ：ＣＯＮ ｎ＝１３、ＩＮ－ＶＥＨ ｎ＝１５、ＩＮ－ＤＡＮ ｎ＝１８、ＳＱ－ＤＡＮ ｎ＝１５；ＥＴＧ １１Ｍ：ＣＯＮ ｎ＝１２、ＩＮ－ＶＥＨ ｎ＝１２、ＩＮ－ＤＡＮ ｎ＝１７、ＳＱ－ＤＡＮ ｎ＝１３；ＬＴＧ １１Ｍ：ＩＮ－ＤＡＮ ｎ＝１３、ＳＱ－ＤＡＮ ｎ＝１３。
モリス水迷路（ＭＷＭ）試験によって決定された学習および記憶を示す。学習および記憶は、野生型（ＷＴ）群と５ＸＦＡＤ（ＴＧ）群の両方について、月齢１０ヶ月でＭＷＭによって決定された。図２１Ａ～２１Ｂは、すべての群におけるプラットフォームを見つけるまでの待ち時間が、手がかりトライアル中に５日間連続して有意に減少せず、マウスに視覚障害または水泳障害がなかったことを示唆していることを示す。図２１Ｃ～２１Ｄは、すべての群におけるプラットフォームを見つけるまでの待ち時間が、空間学習能力を決定するための場所トライアル中に５日間連続して有意に減少しなかったことを示す。図２１Ｅは、対照と比較して、すべての群について、マウスが標的象限で費やした時間の割合（プローブトライアル）に有意差がなかったことを示す。図２１Ｆは、すべての群について、動物がプラットフォームを横断した回数に有意差がなかったことを示す。データは、シダックのＭＣＴによる一元配置分散分析を使用して分析された。すべてのデータは、９５％ＣＩの平均として表される。動物数、ＷＴ群：ＥＴＧ：ＣＯＮ ｎ＝１４、ＩＮ ＶＥＨ ｎ＝８、ＩＮ－ＤＡＮ ｎ＝１２、ＳＱ－ＤＡＮ ｎ＝１３、ＬＴＧ：ＩＮ－ＤＡＮ ｎ＝１４、ＳＱ－ＤＡＮ ｎ＝１３；ＴＧ群：ＥＴＧ：ＣＯＮ ｎ＝１３、ＩＮ－ＶＥＨ ｎ＝１０、ＩＮ－ＤＡＮ ｎ＝１０、ＳＱ－ＤＡＮ ｎ＝９、ＬＴＧ：ＩＮ－ＤＡＮ ｎ＝１４、ＳＱ－ＤＡＮ ｎ＝１４。
野生型（ＷＴ）群における長期ダントロレン処置後の副作用を示す。ダントロレン（ＩＮ－ＤＡＮ）またはビヒクル（ＩＮ－ＶＥＨ）の鼻腔内投与およびダントロレン（ＳＱ－ＤＡＮ）の皮下投与は、早期処置群（ＥＴＧ）の場合は月齢２ヶ月から、後期処置群（ＬＴＧ）の場合は月齢６ヶ月から週３回投与された。図２２Ａは、月齢１０ヶ月のすべての群に対してロータロッド試験を使用して測定された運動機能を示す。一元配置分散分析およびダネットの多重比較検定（ＭＣＴ）により、処置群と対照群との間に有意差は検出されなかった。（ＥＴＧ：ＣＯＮ ｎ＝１４、ＩＮ－ＶＥＨ ｎ＝１２、ＩＮ－ＤＡＮ ｎ＝１７、ＳＱ－ＤＡＮ ｎ＝１４；ＬＴＧ：ＩＮ－ＤＡＮ ｎ＝１５、ＳＱ－ＤＡＮ ｎ＝１３。）図２２Ｂは、月齢１０ヶ月ですべての群に対して埋没食品試験を使用して、嗅覚が測定されたことを示す。ノンパラメトリックデータのためのクラスカル－ウォリス検定およびダンのＭＣＴでは、有意差は見られなかった。（ＥＴＧ：ＣＯＮ ｎ＝１４、ＩＮ－ＶＥＨ ｎ＝８、ＩＮ－ＤＡＮ ｎ＝１２、ＳＱ－ＤＡＮ ｎ＝１４；ＬＴＧ：ＩＮ－ＤＡＮ ｎ＝１５、ＳＱ－ＤＡＮ ｎ＝１３。）図２２Ｃは、血漿アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）活性を測定することによって、ＥＴＧおよびＬＴＧについて肝機能が評価されたことを示す。ＡＬＴは、ダネットのＭＣＴによる一元配置分散分析を使用して、対照群と比較して、ＬＴＧにおいて６ヶ月の皮下処置後に有意に増加した（Ｐ＝０．０１４２）。ダネットのＭＣＴによる一元配置分散分析では、対照群と比較して、他の処置群では有意差は検出されなかった。（ＥＴＧ：ＣＯＮ ｎ＝７、ＩＮ－ＶＥＨ ｎ＝８、ＩＮ－ＤＡＮ ｎ＝８、ＳＱ－ＤＡＮ ｎ＝９、ＬＴＧ：ＩＮ－ＤＡＮ ｎ＝８、ＳＱ－ＤＡＮ ｎ＝７）。すべてのデータは、９５％ＣＩの平均として表される。図２２Ｄは、肝病変が、ＥＴＧマウスのＨ＆Ｅ染色切片において、月齢１１ヶ月で調べたことを示す。ＥＴＧ群の間で大きな差異は観察されなかった（３つの切片／動物；ＣＯＮ ｎ＝３、ＩＮ－ＶＥＨ ｎ＝３、ＩＮ－ＤＡＮ ｎ＝３、ＳＱ－ＤＡＮ ｎ＝３、バー＝５０μｍ）。図２２Ｅは、ログ－ランク（マンテル－コックス）検定を使用して、野生型対照（ＷＴ ＣＯＮ）と比較した、ＥＴＧおよびＬＴＧマウスにおけるダントロレン（ＩＮ－ＤＡＮ、ＳＱ－ＤＡＮ）およびビヒクル（ＩＮ－ＶＥＨ）の慢性処置後の死亡率を示す。有意差は見られなかった（Ｐ＝０．２３８８）。図２２Ｆは、動物を安楽死させる前に、体重が月齢１２ヶ月で評価されたことを示す。ダネットのＭＣＴによる一元配置分散分析では、有意差は検出されなかった。（ＥＴＧ：ＣＯＮ ｎ＝１３、ＩＮ－ＶＥＨ ｎ＝１２、ＩＮ－ＤＡＮ ｎ＝１６、ＳＱ－ＤＡＮ ｎ＝１３；ＬＴＧ：ＩＮ－ＤＡＮ ｎ＝１３、ＳＱ－ＤＡＮ ｎ＝１３。）すべてのデータは、９５％ＣＩの平均として表される。
野生型（ＷＴ－ＣＯＮ）および５ＸＦＡＤ（ＴＧ－ＣＯＮ）マウスのアミロイド斑レベルを示す。野生型（ＷＴ）マウス（図２３Ａ）および５ＸＦＡＤ（ＴＧ）（図２３Ｂ）対照マウスの海馬および皮質における６Ｅ１０免疫反応性の代表的な顕微鏡写真を示す（バー＝１００μｍ）。
野生型（ＷＴ）マウスおよび５ＸＦＡＤ（ＴＧ）マウスのシナプス密度を示す。図２４Ａ～２４Ｂは、ウエスタンブロットを使用して、ＰＳＤ９５およびシナプシン１の発現によって決定されたシナプス機能を示す。図２４Ｃ～２４Ｄは、一元配置分散分析およびダネットのＭＣＴを使用して、対照と比較して、すべての群で有意差が検出されなかったことを示す。各群でＮ＝３。すべてのデータは、９５％ＣＩの平均として表される。
アルツハイマー病患者からの人工多能性幹細胞の未成熟ニューロンへの分化が著しく害されたことを示す。健康なヒト対象（対称）または孤発性（ＳＡＤ）もしくは家族性（ＦＡＤ）アルツハイマー病患者からの人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を、ニューロンに分化させた（２３日）。免疫細胞化学が、ＴＵＪ１（図２５Ａ）、ＤＣＸ（図２５Ｂ）、およびＭＡＰ２（図２５Ｃ）染色に使用された。すべてのデータは、平均±ＳＤとして表される。Ｎ＝３～１０。＊ｐ＜０．０５。
アルツハイマー病（ＡＤ）患者からのｉＰＳＣ由来の未成熟ニューロンにおいて、グルタミン酸が細胞生存率を用量依存的に減少させていることを示す。健康なヒト対象（対称）、孤発性（ＳＡＤ）または家族性（ＦＡＤ）アルツハイマー病患者からの人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来するニューロンは、異なる濃度のグルタミン酸に２４時間曝露された。細胞生存率は、ＭＴＴ還元アッセイによって測定された。１０ｍＭ～３０ｍＭまでのグルタミン酸は、用量依存的に３種類の細胞において著しい細胞損傷を誘発した。すべてのデータは、平均±ＳＤとして表される。Ｎ＝３～５、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
グルタミン酸が、用量依存的にＡＴＰ量を家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）細胞においてより有意に減少させたことを示す。健康なヒト対象（対称）、孤発性（ＳＡＤ）または家族性（ＦＡＤ）アルツハイマー病患者からの人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来するニューロンは、異なる濃度のグルタミン酸に２４時間曝露された。ＡＴＰ量は、市販のルシフェラーゼ－ルシフェリンシステムを使用して評価された。すべてのデータは、平均±ＳＤとして表される。Ｎ＝５～８、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、＆Ｐ＜０．０５、＆＆Ｐ＜０．０１。
ダントロレンは、家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）患者からのニューロンにおいて、グルタミン酸を介したミトコンドリアカルシウム濃度の異常な上昇を著しく抑制したことを示す。健康なヒト対象（対称）、孤発性（ＳＡＤ）または家族性（ＦＡＤ）アルツハイマー病患者からの人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来するニューロンは、ダントロレン２０μＭの前処置の有無にかかわらず、２０ｍＭのグルタミン酸に１時間曝露された。ミトコンドリアカルシウム濃度は、クラゲの発光タンパク質であるエクオリンベースのプローブを使用して測定された。ダントロレン前処置なし（図２８Ａ）またはダントロレン前処置あり（図２８Ｂ）でグルタミン酸に曝露されたミトコンドリアカルシウム濃度変化の典型的な曲線が実証された。対称ニューロンと比較して、グルタミン酸２０ｍＭは、ミトコンドリアカルシウム濃度のピーク上昇（図２８Ｃ）および全体的な曝露（ＡＵＣ（曲線下面積））（図２８Ｄ）をＦＡＤニューロンにおいて有意により高く増加させ、これは、ダントロレンの前処置によって消失した。すべてのデータは、平均±ＳＤとして表される。Ｎ＝３～９。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
本主題は、本開示の一部を形成する以下の詳細な説明を参照することにより、より容易に理解することができる。本発明は、本明細書に記載および／または示される特定の方法、製品、条件、またはパラメータに限定されず、本明細書で使用される用語は、例としてのみ特定の実施形態を説明することを目的としており、特許請求された発明を限定することを意図しないことが理解されるべきである。
本明細書で別段の定義がない限り、本出願に関連して使用される科学的および技術的用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈で特に必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。
上記および本開示全体で用いられるように、以下の用語および略語は、特に明記しない限り、以下の意味を有すると理解されるものとする。
本開示において、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、複数形の参照を含み、特定の数値への参照は、文脈が明らかに他のことを示さない限り、少なくともその特定の値を含む。したがって、例えば、「化合物」への言及は、当業者に知られているそのような化合物およびその均等物の１つ以上への言及などである。本明細書で使用される場合、「複数」という用語は、１つ超を意味する。値の範囲が表される場合、別の実施形態は、１つの特定の値から、および／または他の特定の値までを含む。同様に、値が近似値として表される場合、先行詞「約」を使用することにより、特定の値が別の実施形態を形成することが理解される。すべての範囲は包括的かつ組み合わせることができる。
本明細書で使用される場合、「成分」、「組成物」、「化合物の組成物」、「化合物」、「薬物」、「薬理活性物質」、「活性剤」、「治療薬」、「治療」、「処置」、または「薬剤」という用語は、本明細書では言い換え可能に使用され、対象（ヒトまたは動物）に投与されたときに、局所的および／または全身作用により、所望の薬理学的効果および／または生理学的効果を誘導する化合物（複数可）または組成物を指す。
本明細書で使用される場合、「処置」または「治療」という用語（ならびにその異なる形態）は、予防の（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）（例えば、予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ））、治療的、または緩和的処置を含む。本明細書で使用される場合、「処置する」という用語は、状態、疾患、または障害の少なくとも１つの悪影響もしくは否定的影響または症状を軽減するか、または減少することを含む。
「対象」、「個体」、および「患者」という用語は、本明細書では言い換え可能に使用され、本発明による医薬組成物による予防的処置を含む処置が提供される動物、例えばヒトを指す。本明細書で使用される「対象」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物を指す。「非ヒト動物」および「非ヒト哺乳動物」という用語は、本明細書では言い換え可能に使用され、すべての脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類（特に高等霊長類）、ヒツジ、イヌ、げっ歯類（例えば、ネズミまたはラット）、モルモット、ヤギ、ブタ、ネコ、ウサギ、ウシ、ウマなどの哺乳類、ならびに爬虫類、両生類、ニワトリ、およびシチメンチョウなどの非哺乳類が挙げられる。
一態様では、本発明は、アルツハイマー病（ＡＤ）を有するか、または有すると疑われる対象におけるニューロンの神経新生および／またはシナプス形成の障害を抑制するための方法を提供し、神経新生および／またはシナプス形成の障害は、少なくとも部分的に、小胞体（ＥＲ）リアノジン受容体（ＲｙＲ）の過剰な活性化によって引き起こされ、この方法は、ＥＲカルシウムイオン（Ｃａ２＋）の放出を減少させるのに有効なある量のダントロレンを含む医薬組成物を対象に鼻腔内投与することを含む。一実施形態では、神経新生は、神経前駆細胞（ＮＰＣ）から未成熟ニューロンへの神経新生と、それに続く未成熟ニューロンから皮質ニューロンへの神経新生とを含む。ある特定の実施形態では、シナプス形成は、皮質ニューロンで起こる。いくつかの実施形態では、皮質ニューロンは、コリン作動性ニューロンである。様々な実施形態では、皮質ニューロンは、前脳基底部コリン作動性ニューロン（ＢＦＣＮ）ニューロン、前頭前野ニューロン、海馬ニューロン、またはそれらの組み合わせである。一実施形態では、ＡＤは、家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）である。別の実施形態では、ＡＤは、孤発性アルツハイマー病（ＳＡＤ）である。特定の実施形態では、ＲｙＲは、２型ＲｙＲ（ＲｙＲ－２）である。特定の実施形態では、ＲｙＲは、１型ＲｙＲ（ＲｙＲ－１）である。特定の実施形態では、ＲｙＲは、３型ＲｙＲ（ＲｙＲ－３）である。特定の実施形態では、ＲｙＲは、すべてのＲｙＲサブタイプを含む、ＲｙＲサブタイプ、例えば、ＲｙＲ－１、ＲｙＲ－２およびＲｙＲ－３の組み合わせである。様々な実施形態では、小胞体（ＥＲ）リアノジン受容体（ＲｙＲ）の過剰な活性化は、ミトコンドリアカルシウムを上昇させ、ＡＴＰの減少をもたらす。特定の実施形態では、ダントロレンの鼻腔内投与は、上昇したミトコンドリアカルシウムを減少させ、細胞質ＡＴＰを増加させる。いくつかの実施形態では、ダントロレンを含む医薬組成物は、毎日投与される。いくつかの実施形態では、ダントロレンを含む医薬組成物は、週に３回投与される。いくつかの実施形態では、ダントロレンを含む医薬組成物は、週に１回投与される。様々な実施形態では、ダントロレンを含む医薬組成物は、４ヶ月～１年間投与される。いくつかの実施形態では、ダントロレンを含む医薬組成物は、４～６ヶ月間投与される。ある特定の実施形態では、ダントロレンを含む医薬組成物は、最大４ヶ月間投与される。様々な実施形態では、ダントロレンを含む医薬組成物は、１年を超えて投与される。様々な実施形態では、ダントロレンを含む医薬組成物は、最大２年間投与される。様々な実施形態では、ダントロレンを含む医薬組成物は、２年を超えて投与される。ＡＤを有するか、または有することが疑われる対象におけるニューロンの神経細胞形成および／またはシナプス形成の障害を抑制するための提供された方法の様々な実施形態では、ダントロレンを含む医薬組成物の鼻腔内投与は、対象の嗅覚機能、運動機能、または肝機能を害しない。
別の態様では、本発明は、神経病理学および認知機能障害の発症後の認知機能の低下を改善および／または遅らせるための方法を提供し、神経病理学および認知機能障害は、アルツハイマー病（ＡＤ）によって引き起こされ、この方法は、ＮＭＤＡ受容体および／またはリアノジン受容体の過剰な活性化を抑制するのに有効なある量のダントロレンを含む医薬組成物を、それを必要とする対象に鼻腔内投与することを含む。特定の実施形態では、認知機能は、記憶、学習、思考、注意、知覚、言語の使用、推論、意思決定、問題解決、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、ＡＤは、家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）である。様々な実施形態では、ＡＤは、孤発性アルツハイマー病（ＳＡＤ）である。特定の実施形態では、ＲｙＲは、２型ＲｙＲ（ＲｙＲ－２）である。特定の実施形態では、ＲｙＲは、１型ＲｙＲ（ＲｙＲ－１）である。特定の実施形態では、ＲｙＲは、３型ＲｙＲ（ＲｙＲ－３）である。特定の実施形態では、ＲｙＲは、３型ＲｙＲ（ＲｙＲ－３）である。特定の実施形態では、ＲｙＲは、すべてのＲｙＲサブタイプを含む、ＲｙＲサブタイプ、例えば、ＲｙＲ－１、ＲｙＲ－２およびＲｙＲ－３の組み合わせである。いくつかの実施形態では、ダントロレンを含む医薬組成物は、毎日投与される。いくつかの実施形態では、ダントロレンを含む医薬組成物は、週に３回投与される。いくつかの実施形態では、ダントロレンを含む医薬組成物は、週に１回投与される。様々な実施形態では、ダントロレンを含む医薬組成物は、４ヶ月～１年間投与される。いくつかの実施形態では、ダントロレンを含む医薬組成物は、４～６ヶ月間投与される。ある特定の実施形態では、ダントロレンを含む医薬組成物は、最大４ヶ月間投与される。様々な実施形態では、ダントロレンを含む医薬組成物は、１年を超えて投与される。様々な実施形態では、ダントロレンを含む医薬組成物は、最大２年間投与される。様々な実施形態では、ダントロレンを含む医薬組成物は、２年を超えて投与される。神経病理学および認知機能障害がＡＤによって引き起こされる、神経病理学および認知機能障害の発症後の認知機能の低下を改善および／または遅らせるための提供された方法の様々な実施形態では、ダントロレンを含む医薬組成物の鼻腔内投与は、対象の嗅覚機能、運動機能、または対象の肝機能を害しない。
ある特定の実施形態では、認知機能障害は、短期もしくは長期の記憶喪失、学習困難、思考困難、注意／集中の困難、知覚困難、言語使用の困難、推論の困難、意志決定の困難／判断力の低下、問題解決の困難、混乱、不十分な運動協調、またはそれらの組み合わせである。特定の実施形態では、記憶喪失は、海馬依存性および海馬非依存性の記憶喪失である。様々な実施形態では、神経病理学は、脳ニューロン間のアミロイド蓄積である。
神経病理学および認知機能障害がＡＤによって引き起こされる、神経病理学および認知機能障害の発症後の認知機能の低下を改善および／または遅らせるための方法のいくつかの実施形態では、方法は、治療有効量のグルタミン酸受容体拮抗薬を対象に投与することをさらに含む。方法のいくつかの実施形態では、方法は、（ａ）ダントロレンを含む医薬組成物を対象に鼻腔内投与する前に、対象から脳脊髄液（ＣＳＦ）を得ることと、（ｂ）ＣＳＦ中のグルタミン酸のレベルを決定ことと、をさらに含み、対照の対象から得られたＣＳＦ中のグルタミン酸のレベルよりも高い、ステップ（ｂ）で決定されたグルタミン酸のレベルは、ダントロレンによる処置に対する対象の適合性を示す。いくつかの実施形態では、ダントロレンを含む医薬組成物の鼻腔内投与は、対象の嗅覚機能、運動機能、または肝機能を害しない。
いくつかの実施形態では、方法は、治療有効量のグルタミン酸受容体拮抗薬を投与する前に、対象からＣＳＦを得ることと、ＣＳＦ中のグルタミン酸のレベルを決定することと、をさらに含み、対照の対象から得られたＣＳＦ中のグルタミン酸のレベルよりも高い、決定されたグルタミン酸のレベルは、グルタミン酸受容体拮抗薬による処置に対する対象の適合性を示す。
特定の実施形態では、グルタミン酸受容体拮抗薬は、グルタミン酸結合部位での競合的拮抗作用によってＮＭＤＡ受容体を遮断する薬剤であるか、またはグリシン、フェンシクリジン、および／もしくはマグネシウム結合部位での非競合的拮抗作用によってＮＭＤＡ受容体を遮断する薬剤である。いくつかの実施形態では、グルタミン酸結合部位での競合的拮抗作用によってＮＭＤＡ受容体を遮断する薬剤は、セルフオテル（ＣＧＳ１９７５５）アプチガネル（ＣＮＳ１１０２）、ＣＧＰ３７８４９、ＡＰＶもしくはＡＰ－５（Ｒ－２－アミノ－５－ホスホノペンタノエート）、２－アミノ－７－ホスホノ－ヘプタン酸（ＡＰ－７）、３－［（Ｒ）－２－カルボキシピペラジン－４－イル］－プロプ－２－エニル－１－ホスホン酸（ＣＰＰｅｎｅ）、および／またはアスパルテームである。いくつかの実施形態では、フェンシクリジン（ＰＣＰ）、マグネシウム、および／またはＭＫ－８０１（ジゾシルピン）結合部位での非競合的拮抗作用によってＮＭＤＡ受容体を遮断する薬剤は、メマンチン、ケタミン、フェンシクリジン、３－ＭＥＯ－ＰＣＰ、８Ａ－ＰＤＨＱ、アマンタジン、アトモキセチン、ＡＺＤ６７６５、アグマチン、デルセミン、デルセミン、デキストラロルファン、デキストロメトルファン、デキストロルファン、ジフェニジン、エタノール、エチシリジン、ガシクリジン、メトキセタミン（ＭＸＥ）、ミノサイクリジン、ニトロメマンチン、亜酸化窒素、ＰＤ－１３７８８９、ロリシクリジン、テノシクリジン、メトキシジン、チレタミン、ネラメキサン、エリプロジル、エトキサドロール、デキソキサドロール、ＷＭＳ－２５３９、ＮＥＦＡ、レマセミド、硫酸マグネシウム、アプチガネル、ＨＵ－２１１、フペルジンＡ、ジペプチドＤ－Ｐｈｅ－Ｌ－Ｔｙｒ、イボゲイン、キョウチクトウ科、レマセミド、リンコフィリン、ガバペンチン、またはジゾシルピン（ＭＫ－８０１）である。いくつかの実施形態では、グリシン結合部位での非競合的拮抗作用によってＮＭＤＡ受容体を遮断する薬剤は、（ＧＬＹＸ－１３）、ＮＲＸ－１０７４、７－クロロキヌレン酸、４－クロロキヌレン（ＡＶ－１０１）、５，７－ジクロロキヌレン酸、キヌレン酸、ＴＫ－４０（ＧｌｕＮ１グリシン結合部位での競合的拮抗薬）、１－アミノシクロ－プロパンカルボン酸（ＡＣＰＣ）、Ｌ－フェニルアラニン、またはキセノンである。
別の態様では、本発明は、アルツハイマー病（ＡＤ）の症状の発症前に記憶を改善するための方法を提供し、この方法は、ＮＭＤＡ受容体および／またはリアノジン受容体の過剰な活性化を抑制するのに有効なある量のダントロレンを含む医薬組成物を、それを必要とする対象に鼻腔内投与することを含む。ＡＤの症状の発症前に記憶を改善するために提供された方法のいくつかの実施形態では、ダントロレンを含む医薬組成物の鼻腔内投与は、対象の嗅覚機能、運動機能、または肝機能を害しない。特定の実施形態では、ＡＤの症状は、神経病理学、認知機能障害、またはそれらの組み合わせである。様々な実施形態では、認知機能障害は、短期もしくは長期の記憶喪失、学習困難、思考困難、注意／集中の困難、知覚困難、言語使用の困難、推論の困難、決定の困難／判断の障害、問題解決である。困難、混乱、運動協調不良、またはそれらの組み合わせである。一実施形態では、記憶喪失は、海馬依存性および海馬非依存性の記憶喪失である。いくつかの実施形態では、神経病理学は、脳ニューロン間のアミロイド蓄積である。いくつかの実施形態では、ＡＤは、家族性ＡＤ（ＦＡＤ）である。ある特定の実施形態では、ＡＤは、孤発性ＡＤ（ＳＡＤ）である。特定の実施形態では、ＲｙＲは、２型ＲｙＲ（ＲｙＲ－２）である。特定の実施形態では、ＲｙＲは、１型ＲｙＲ（ＲｙＲ－１）である。特定の実施形態では、ＲｙＲは、３型ＲｙＲ（ＲｙＲ－３）である。特定の実施形態では、ＲｙＲは、すべてのＲｙＲサブタイプを含む、ＲｙＲサブタイプ、例えば、ＲｙＲ－１、ＲｙＲ－２およびＲｙＲ－３の組み合わせである。いくつかの実施形態では、ダントロレンを含む医薬組成物は、毎日投与される。いくつかの実施形態では、ダントロレンを含む医薬組成物は、週に３回投与される。いくつかの実施形態では、ダントロレンを含む医薬組成物は、週に１回投与される。様々な実施形態では、ダントロレンを含む医薬組成物は、４ヶ月～１年間投与される。いくつかの実施形態では、ダントロレンを含む医薬組成物は、４～６ヶ月間投与される。ある特定の実施形態では、ダントロレンを含む医薬組成物は、最大４ヶ月間投与される。様々な実施形態では、ダントロレンを含む医薬組成物は、１年を超えて投与される。様々な実施形態では、ダントロレンを含む医薬組成物は、最大２年間投与される。様々な実施形態では、ダントロレンを含む医薬組成物は、２年を超えて投与される。
ＡＤの症状の発症前に記憶を改善するための方法のいくつかの実施形態では、方法は、治療有効量のグルタミン酸受容体拮抗薬を対象に投与することをさらに含む。方法のいくつかの実施形態では、方法は、（ａ）ダントロレンを含む医薬組成物を対象に鼻腔内投与する前に、対象から脳脊髄液（ＣＳＦ）を得ることと、（ｂ）ＣＳＦ中のグルタミン酸のレベルを決定ことと、をさらに含み、対照の対象から得られたＣＳＦ中のグルタミン酸のレベルよりも高い、ステップ（ｂ）で決定されたグルタミン酸のレベルは、ダントロレンによる処置に対する対象の適合性を示す。いくつかの実施形態では、方法は、治療有効量のグルタミン酸受容体拮抗薬を投与する前に、対象からＣＳＦを得ることと、ＣＳＦ中のグルタミン酸のレベルを決定することと、をさらに含み、対照の対象から得られたＣＳＦ中のグルタミン酸のレベルよりも高い、決定されたグルタミン酸のレベルは、グルタミン酸受容体拮抗薬による処置に対する対象の適合性を示す。特定の実施形態では、グルタミン酸受容体拮抗薬は、グルタミン酸結合部位での競合的拮抗作用によってＮＭＤＡ受容体を遮断する薬剤であるか、またはグリシン、フェンシクリジン、および／もしくはマグネシウム結合部位での非競合的拮抗作用によってＮＭＤＡ受容体を遮断する薬剤である。いくつかの実施形態では、グルタミン酸結合部位での競合的拮抗作用によってＮＭＤＡ受容体を遮断する薬剤は、セルフオテル（ＣＧＳ１９７５５）アプチガネル（ＣＮＳ１１０２）、ＣＧＰ３７８４９、ＡＰＶもしくはＡＰ－５（Ｒ－２－アミノ－５－ホスホノペンタノエート）、２－アミノ－７－ホスホノ－ヘプタン酸（ＡＰ－７）、３－［（Ｒ）－２－カルボキシピペラジン－４－イル］－プロプ－２－エニル－１－ホスホン酸（ＣＰＰｅｎｅ）、および／またはアスパルテームである。いくつかの実施形態では、フェンシクリジン（ＰＣＰ）、マグネシウム、および／またはＭＫ－８０１（ジゾシルピン）結合部位での非競合的拮抗作用によってＮＭＤＡ受容体を遮断する薬剤は、メマンチン、ケタミン、フェンシクリジン、３－ＭＥＯ－ＰＣＰ、８Ａ－ＰＤＨＱ、アマンタジン、アトモキセチン、ＡＺＤ６７６５、アグマチン、デルセミン、デルセミン、デキストラロルファン、デキストロメトルファン、デキストロルファン、ジフェニジン、エタノール、エチシリジン、ガシクリジン、メトキセタミン（ＭＸＥ）、ミノサイクリジン、ニトロメマンチン、亜酸化窒素、ＰＤ－１３７８８９、ロリシクリジン、テノシクリジン、メトキシジン、チレタミン、ネラメキサン、エリプロジル、エトキサドロール、デキソキサドロール、ＷＭＳ－２５３９、ＮＥＦＡ、レマセミド、硫酸マグネシウム、アプチガネル、ＨＵ－２１１、フペルジンＡ、ジペプチドＤ－Ｐｈｅ－Ｌ－Ｔｙｒ、イボゲイン、キョウチクトウ科、レマセミド、リンコフィリン、ガバペンチン、またはジゾシルピン（ＭＫ－８０１）である。いくつかの実施形態では、グリシン結合部位での非競合的拮抗作用によってＮＭＤＡ受容体を遮断する薬剤は、（ＧＬＹＸ－１３）、ＮＲＸ－１０７４、７－クロロキヌレン酸、４－クロロキヌレン（ＡＶ－１０１）、５，７－ジクロロキヌレン酸、キヌレン酸、ＴＫ－４０（ＧｌｕＮ１グリシン結合部位での競合的拮抗薬）、１－アミノシクロ－プロパンカルボン酸（ＡＣＰＣ）、Ｌ－フェニルアラニン、またはキセノンである。
別の態様では、本発明は、アルツハイマー病（ＡＤ）の症状の発症後の記憶喪失を改善するための方法を提供し、該記憶喪失は、ＡＤによって引き起こされ、この方法は、ＮＭＤＡ受容体および／またはリアノジン受容体の過剰な活性化を抑制するのに有効なある量のダントロレンを含む医薬組成物を、それを必要とする対象に鼻腔内投与することを含む。いくつかの実施形態では、ダントロレンを含む医薬組成物の鼻腔内投与は、対象の嗅覚機能、運動機能、または肝機能を害しない。特定の実施形態では、ＡＤの症状は、神経病理学、認知機能障害、またはそれらの組み合わせである。様々な実施形態では、認知機能障害は、短期または長期の記憶喪失、学習困難、思考困難、注意／集中力の困難、知覚困難、言語使用の困難、推論の困難、意志決定の困難／判断力の低下、問題解決の困難、混乱、不十分な運動協調性、またはそれらの組み合わせである。一実施形態では、記憶喪失は、海馬依存性および海馬非依存性の記憶喪失である。いくつかの実施形態では、神経病理学は、脳ニューロン間のアミロイド蓄積である。いくつかの実施形態では、ＡＤは、家族性ＡＤ（ＦＡＤ）である。ある特定の実施形態では、ＡＤは、孤発性ＡＤ（ＳＡＤ）である。特定の実施形態では、ＲｙＲは、２型ＲｙＲ（ＲｙＲ－２）である。特定の実施形態では、ＲｙＲは、１型ＲｙＲ（ＲｙＲ－１）である。いくつかの実施形態では、ＲｙＲは、３型ＲｙＲ（ＲｙＲ－３）である。特定の実施形態では、ＲｙＲは、すべてのＲｙＲサブタイプを含む、ＲｙＲサブタイプ、例えば、ＲｙＲ－１、ＲｙＲ－２およびＲｙＲ－３の組み合わせである。提供された方法のいくつかの実施形態では、ダントロレンを含む医薬組成物は、毎日投与される。いくつかの実施形態では、ダントロレンを含む医薬組成物は、週に３回投与される。いくつかの実施形態では、ダントロレンを含む医薬組成物は、週に１回投与される。様々な実施形態では、ダントロレンを含む医薬組成物は、４ヶ月～１年間投与される。いくつかの実施形態では、ダントロレンを含む医薬組成物は、４～６ヶ月間投与される。ある特定の実施形態では、ダントロレンを含む医薬組成物は、最大４ヶ月間投与される。様々な実施形態では、ダントロレンを含む医薬組成物は、１年を超えて投与される。様々な実施形態では、ダントロレンを含む医薬組成物は、最大２年間投与される。様々な実施形態では、ダントロレンを含む医薬組成物は、２年を超えて投与される。
ＡＤの症状の発症後の記憶を改善するための方法のいくつかの実施形態では、方法は、治療有効量のグルタミン酸受容体拮抗薬を対象に投与することをさらに含む。方法のいくつかの実施形態では、方法は、（ａ）ダントロレンを含む医薬組成物を対象に鼻腔内投与する前に、対象から脳脊髄液（ＣＳＦ）を得ることと、（ｂ）ＣＳＦ中のグルタミン酸のレベルを決定ことと、をさらに含み、対照の対象から得られたＣＳＦ中のグルタミン酸のレベルよりも高い、ステップ（ｂ）で決定されたグルタミン酸のレベルは、ダントロレンによる処置に対する対象の適合性を示す。いくつかの実施形態では、方法は、治療有効量のグルタミン酸受容体拮抗薬を投与する前に、対象からＣＳＦを得ることと、ＣＳＦ中のグルタミン酸のレベルを決定することと、をさらに含み、対照の対象から得られたＣＳＦ中のグルタミン酸のレベルよりも高い、決定されたグルタミン酸のレベルは、グルタミン酸受容体拮抗薬による処置に対する対象の適合性を示す。特定の実施形態では、グルタミン酸受容体拮抗薬は、グルタミン酸結合部位での競合的拮抗作用によってＮＭＤＡ受容体を遮断する薬剤であるか、またはグリシン、フェンシクリジン、および／もしくはマグネシウム結合部位での非競合的拮抗作用によってＮＭＤＡ受容体を遮断する薬剤である。いくつかの実施形態では、グルタミン酸結合部位での競合的拮抗作用によってＮＭＤＡ受容体を遮断する薬剤は、セルフオテル（ＣＧＳ１９７５５）アプチガネル（ＣＮＳ１１０２）、ＣＧＰ３７８４９、ＡＰＶもしくはＡＰ－５（Ｒ－２－アミノ－５－ホスホノペンタノエート）、２－アミノ－７－ホスホノ－ヘプタン酸（ＡＰ－７）、３－［（Ｒ）－２－カルボキシピペラジン－４－イル］－プロプ－２－エニル－１－ホスホン酸（ＣＰＰｅｎｅ）、および／またはアスパルテームである。いくつかの実施形態では、フェンシクリジン（ＰＣＰ）、マグネシウム、および／またはＭＫ－８０１（ジゾシルピン）結合部位での非競合的拮抗作用によってＮＭＤＡ受容体を遮断する薬剤は、メマンチン、ケタミン、フェンシクリジン、３－ＭＥＯ－ＰＣＰ、８Ａ－ＰＤＨＱ、アマンタジン、アトモキセチン、ＡＺＤ６７６５、アグマチン、デルセミン、デルセミン、デキストラロルファン、デキストロメトルファン、デキストロルファン、ジフェニジン、エタノール、エチシリジン、ガシクリジン、メトキセタミン（ＭＸＥ）、ミノサイクリジン、ニトロメマンチン、亜酸化窒素、ＰＤ－１３７８８９、ロリシクリジン、テノシクリジン、メトキシジン、チレタミン、ネラメキサン、エリプロジル、エトキサドロール、デキソキサドロール、ＷＭＳ－２５３９、ＮＥＦＡ、レマセミド、硫酸マグネシウム、アプチガネル、ＨＵ－２１１、フペルジンＡ、ジペプチドＤ－Ｐｈｅ－Ｌ－Ｔｙｒ、イボゲイン、キョウチクトウ科、レマセミド、リンコフィリン、ガバペンチン、またはジゾシルピン（ＭＫ－８０１）である。いくつかの実施形態では、グリシン結合部位での非競合的拮抗作用によってＮＭＤＡ受容体を遮断する薬剤は、（ＧＬＹＸ－１３）、ＮＲＸ－１０７４、７－クロロキヌレン酸、４－クロロキヌレン（ＡＶ－１０１）、５，７－ジクロロキヌレン酸、キヌレン酸、ＴＫ－４０（ＧｌｕＮ１グリシン結合部位での競合的拮抗薬）、１－アミノシクロ－プロパンカルボン酸（ＡＣＰＣ）、Ｌ－フェニルアラニン、またはキセノンである。
別の態様では、本発明は、対象の脳内のダントロレンの濃度および持続時間を増加させるための方法を提供し、この方法は、ある量のダントロレンを含む医薬組成物を、それを必要とする対象に鼻腔内投与することを含む。
さらなる態様では、本発明は、アルツハイマー病（ＡＤ）を有するか、または有すると疑われる対象におけるニューロンの神経新生および／またはシナプス形成の障害を抑制するための方法を提供し、神経新生および／またはシナプス形成の該障害は、少なくとも部分的に、小胞体（ＥＲ）リアノジン受容体（ＲｙＲ）の過剰な活性化によって引き起こされ、この方法は、ａ）ＥＲカルシウムイオン（Ｃａ２＋）の放出を減少させるのに有効なある量のダントロレンを含む医薬組成物を該対象に鼻腔内投与することと、ｂ）治療有効量のグルタミン酸受容体拮抗薬をステップ（ａ）の対象に投与することと、を含む。いくつかの実施形態では、ダントロレンを含む医薬組成物の鼻腔内投与は、対象の嗅覚機能、運動機能、または肝機能を害しない。いくつかの実施形態では、方法は、ｃ）ステップ（ａ）の前に対象から脳脊髄液（ＣＳＦ）を得ることと、ｄ）ＣＳＦ中のグルタミン酸のレベルを決定することと、をさらに含み、対照の対象から得られたＣＳＦ中のグルタミン酸のレベルよりも高い、ステップ（ｄ）で決定されたグルタミン酸のレベルは、ダントロレンによる処置に対する対象の適合性を示す。様々な実施形態では、方法は、ステップ（ｂ）の前に対象からＣＳＦを得ることと、ＣＳＦ中のグルタミン酸のレベルを決定することと、をさらに含み、対照の対象から得られたＣＳＦ中のグルタミン酸のレベルよりも高い、決定されたグルタミン酸のレベルは、グルタミン酸受容体拮抗薬による処置に対する対象の適合性を示す。いくつかの実施形態では、グルタミン酸受容体拮抗薬は、グルタミン酸結合部位での競合的拮抗作用によってＮＭＤＡ受容体を遮断する薬剤であるか、またはグリシン、フェンシクリジン、および／もしくはマグネシウム結合部位での非競合的拮抗作用によってＮＭＤＡ受容体を遮断する薬剤である。様々な実施形態では、グルタミン酸結合部位での競合的拮抗作用によってＮＭＤＡ受容体を遮断する薬剤は、セルフオテル（ＣＧＳ１９７５５）アプチガネル（ＣＮＳ１１０２）、ＣＧＰ３７８４９、ＡＰＶもしくはＡＰ－５（Ｒ－２－アミノ－５－ホスホノペンタノエート）、２－アミノ－７－ホスホノ－ヘプタン酸（ＡＰ－７）、３－［（Ｒ）－２－カルボキシピペラジン－４－イル］－プロプ－２－エニル－１－ホスホン酸（ＣＰＰｅｎｅ）、および／またはアスパルテームである。いくつかの実施形態では、フェンシクリジン（ＰＣＰ）、マグネシウム、および／またはＭＫ－８０１（ジゾシルピン）結合部位での非競合的拮抗作用によってＮＭＤＡ受容体を遮断する薬剤は、メマンチン、ケタミン、フェンシクリジン、３－ＭＥＯ－ＰＣＰ、８Ａ－ＰＤＨＱ、アマンタジン、アトモキセチン、ＡＺＤ６７６５、アグマチン、デルセミン、デルセミン、デキストラロルファン、デキストロメトルファン、デキストロルファン、ジフェニジン、エタノール、エチシリジン、ガシクリジン、メトキセタミン（ＭＸＥ）、ミノサイクリジン、ニトロメマンチン、亜酸化窒素、ＰＤ－１３７８８９、ロリシクリジン、テノシクリジン、メトキシジン、チレタミン、ネラメキサン、エリプロジル、エトキサドロール、デキソキサドロール、ＷＭＳ－２５３９、ＮＥＦＡ、レマセミド、硫酸マグネシウム、アプチガネル、ＨＵ－２１１、フペルジンＡ、ジペプチドＤ－Ｐｈｅ－Ｌ－Ｔｙｒ、イボゲイン、キョウチクトウ科、レマセミド、リンコフィリン、ガバペンチン、またはジゾシルピン（ＭＫ－８０１）である。様々な実施形態では、グリシン結合部位での非競合的拮抗作用によってＮＭＤＡ受容体を遮断する薬剤は、（ＧＬＹＸ－１３）、ＮＲＸ－１０７４、７－クロロキヌレン酸、４－クロロキヌレン（ＡＶ－１０１）、５，７－ジクロロキヌレン酸、キヌレン酸、ＴＫ－４０（ＧｌｕＮ１グリシン結合部位での競合的拮抗薬）、１－アミノシクロ－プロパンカルボン酸（ＡＣＰＣ）、Ｌ－フェニルアラニン、またはキセノンである。ＡＤを有するか、または有すると疑われる対象におけるニューロンの神経新生および／またはシナプス形成の障害を抑制するための方法のいくつかの実施形態では、神経新生は、神経前駆細胞（ＮＰＣ）から未成熟ニューロンへの神経新生と、それに続く未成熟ニューロンから皮質ニューロンへの神経新生とを含む。様々な実施形態では、シナプス形成は、皮質ニューロンで起こる。いくつかの実施形態では、皮質ニューロンは、コリン作動性ニューロンである。ある特定の実施形態では、皮質ニューロンは、前脳基底部コリン作動性ニューロン（ＢＦＣＮ）ニューロン、前頭前野ニューロン、海馬ニューロン、またはそれらの組み合わせである。特定の実施形態では、ＡＤは、家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）または孤発性アルツハイマー病（ＳＡＤ）である。いくつかの実施形態では、ＲｙＲは、２型ＲｙＲ（ＲｙＲ－２）である。特定の実施形態では、ＲｙＲは、１型ＲｙＲ（ＲｙＲ－１）である。いくつかの実施形態では、ＲｙＲは、３型ＲｙＲ（ＲｙＲ－３）である。特定の実施形態では、ＲｙＲは、すべてのＲｙＲサブタイプを含む、ＲｙＲサブタイプ、例えば、ＲｙＲ－１、ＲｙＲ－２およびＲｙＲ－３の組み合わせである。ある特定の実施形態では、小胞体（ＥＲ）リアノジン受容体（ＲｙＲ）の過剰な活性化は、ミトコンドリアカルシウムを上昇させ、ＡＴＰの減少をもたらす。いくつかの実施形態では、ダントロレンの鼻腔内投与は、上昇したミトコンドリアカルシウムを低下させ、細胞質ＡＴＰを増加させる。提供された方法のいくつかの実施形態では、ダントロレンを含む医薬組成物は、毎日投与される。いくつかの実施形態では、ダントロレンを含む医薬組成物は、週に３回投与される。いくつかの実施形態では、ダントロレンを含む医薬組成物は、週に１回投与される。様々な実施形態では、ダントロレンを含む医薬組成物は、４ヶ月～１年間投与される。いくつかの実施形態では、ダントロレンを含む医薬組成物は、４～６ヶ月間投与される。ある特定の実施形態では、ダントロレンを含む医薬組成物は、最大４ヶ月間投与される。様々な実施形態では、ダントロレンを含む医薬組成物は、１年を超えて投与される。様々な実施形態では、ダントロレンを含む医薬組成物は、最大２年間投与される。様々な実施形態では、ダントロレンを含む医薬組成物は、２年を超えて投与される。
本明細書で引用されたすべての科学刊行物は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
以下の実施例は、本発明のある特定の実施形態をより完全に説明するために提示される。しかしながら、実施例は、決して本発明の広い範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
実施例１
ダントロレンは、アルツハイマー病患者からの人工多能性幹細胞の神経新生およびシナプス形成の障害を抑制する
特定の理論に拘束されることを望まないが、ダントロレンは、リアノジン受容体の過剰な活性化および関連するリソソームおよびオートファジー機能の障害によるカルシウム調節不全の修正により、神経新生およびシナプス形成の障害を抑制すると考えられている。この研究では、ＳＡＤ患者とＦＡＤ患者の両方からのｉＰＳＣと、それらに由来する神経前駆細胞（ＮＰＣ）および前脳基底部コリン作動性ニューロン（ＢＦＣＮ）を使用して、神経新生およびシナプス形成に対するダントロレンの効果およびメカニズムを研究した。ダントロレンは、神経新生およびシナプス形成の障害を著しく改善し、これは、ＲｙＲの過剰な活性化、細胞内Ｃａ２＋調節不全、およびオートファジーの破壊の修正と関連していた。
ダントロレンは、アルツハイマー病患者からの人工多能性幹細胞の神経新生およびシナプス形成の障害を抑制する
特定の理論に拘束されることを望まないが、ダントロレンは、リアノジン受容体の過剰な活性化および関連するリソソームおよびオートファジー機能の障害によるカルシウム調節不全の修正により、神経新生およびシナプス形成の障害を抑制すると考えられている。この研究では、ＳＡＤ患者とＦＡＤ患者の両方からのｉＰＳＣと、それらに由来する神経前駆細胞（ＮＰＣ）および前脳基底部コリン作動性ニューロン（ＢＦＣＮ）を使用して、神経新生およびシナプス形成に対するダントロレンの効果およびメカニズムを研究した。ダントロレンは、神経新生およびシナプス形成の障害を著しく改善し、これは、ＲｙＲの過剰な活性化、細胞内Ｃａ２＋調節不全、およびオートファジーの破壊の修正と関連していた。
材料および方法
細胞培養
ヒト対照（ＡＧ０２２６１）および孤発性アルツハイマー病（ＡＧ１１４１４）ｉＰＳＣは、Ｊｏｈｎ Ａ．Ｋｅｓｓｌｅｒの研究室から入手した。家族性アルツハイマー病（ＧＭ２４６７５）ｉＰＳＣは、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから購入した。各種類のｉＰＳＣは、１人の健康な対象または１人のＳＡＤもしくはＦＡＤと診断された患者の皮膚線維芽細胞から生成した。ヒト多能性幹細胞は、ｍＴｅＳＲ（商標）１培地（カタログ番号０５８５０、Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）内にあるマトリゲル被覆プレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で維持し、３７℃で５％のＣＯ２加湿雰囲気で培養した。培地は、毎日交換された。
細胞培養
ヒト対照（ＡＧ０２２６１）および孤発性アルツハイマー病（ＡＧ１１４１４）ｉＰＳＣは、Ｊｏｈｎ Ａ．Ｋｅｓｓｌｅｒの研究室から入手した。家族性アルツハイマー病（ＧＭ２４６７５）ｉＰＳＣは、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから購入した。各種類のｉＰＳＣは、１人の健康な対象または１人のＳＡＤもしくはＦＡＤと診断された患者の皮膚線維芽細胞から生成した。ヒト多能性幹細胞は、ｍＴｅＳＲ（商標）１培地（カタログ番号０５８５０、Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）内にあるマトリゲル被覆プレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で維持し、３７℃で５％のＣＯ２加湿雰囲気で培養した。培地は、毎日交換された。
細胞生存率
９６ウェルプレートの異なるウェルでの細胞生存率は、各々が参照によりその全体が組み込まれる、Ｑｉａｏ Ｈ， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ ２０１７；１２７：４９０、Ｒｅｎ Ｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ ２０１７；７：１２３７８によって以前に説明されたように、２４時間でＭＴＴ（３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）還元アッセイを使用して決定された。ＰＢＳで洗浄した後、試料を、ＭＴＴを含有する（培地中０．５ｍｇ／ｍＬ）新鮮な培地と３７℃で、４時間暗所でインキュベートした。次に、培地を除去し、ホルマザンをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で可溶化した。プレートリーダー（Ｓｙｎｅｒｇｙ（商標）Ｈ１マイクロプレートリーダー、ＢｉｏＴｅｋ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）を使用して、吸光度を５４０ｎｍで測定した。
９６ウェルプレートの異なるウェルでの細胞生存率は、各々が参照によりその全体が組み込まれる、Ｑｉａｏ Ｈ， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ ２０１７；１２７：４９０、Ｒｅｎ Ｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ ２０１７；７：１２３７８によって以前に説明されたように、２４時間でＭＴＴ（３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）還元アッセイを使用して決定された。ＰＢＳで洗浄した後、試料を、ＭＴＴを含有する（培地中０．５ｍｇ／ｍＬ）新鮮な培地と３７℃で、４時間暗所でインキュベートした。次に、培地を除去し、ホルマザンをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で可溶化した。プレートリーダー（Ｓｙｎｅｒｇｙ（商標）Ｈ１マイクロプレートリーダー、ＢｉｏＴｅｋ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）を使用して、吸光度を５４０ｎｍで測定した。
細胞増殖アッセイ
ｉＰＳＣは、ｍＴｅＳＲ（商標）１培地内にあるマトリゲルでコーティングされたカバーガラス上に播種した。５－ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）を、処置終了の４時間前に最終濃度３０μＭでｍＴｅＳＲ（商標）１培地に添加した。次に、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００で透過処理した。ＢｒｄＵ検出では、酸処理（１０分間、氷上での１Ｎ ＨＣＬ、続いて１０分間、室温で２Ｎ ＨＣＬ）によりＤＮＡを一本鎖に分離し、一次抗体が組み込まれたＢｒｄＵにアクセスすることができるようにした。ブロッキング溶液（０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含有するＰＢＳ中の５％の正常ヤギ血清）とインキュベートした後、細胞をラットモノクローナル抗ＢｒｄＵ一次抗体（１：１００；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｌｌａｓ、ＴＸ）と４℃で一晩インキュベートした。続いて０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含有するＰＢＳで洗浄した後、細胞を抗ラットＩｇＧ（１：１，０００；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）と結合した蛍光標識二次抗体と室温で２時間インキュベートした。細胞核を４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）で、室温にて５分間対比染色した。免疫染色された細胞を覆い、次にＯｌｙｍｐｕｓ ＢＸ４１ＴＦ蛍光顕微鏡（２００倍、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＵＳＡ、Ｃｅｎｔｅｒ Ｖａｌｌｅｙ、ＰＡ）に搭載した。画像は、ｉＶｉｓｉｏｎ１０．１０．５ソフトウェア（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｅｘｔｏｎ、ＰＡ）を使用して取得した。カバーガラス上のランダムな位置で５セットの画像を取得し、その後ＩｍａｇｅＪ１．４９ｖソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を使用してマージした。細胞の総数に対する５－ＢｒｄＵ陽性細胞の割合を計算し、少なくとも３つの異なる培養物からの異なる群間で比較した。
ｉＰＳＣは、ｍＴｅＳＲ（商標）１培地内にあるマトリゲルでコーティングされたカバーガラス上に播種した。５－ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）を、処置終了の４時間前に最終濃度３０μＭでｍＴｅＳＲ（商標）１培地に添加した。次に、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００で透過処理した。ＢｒｄＵ検出では、酸処理（１０分間、氷上での１Ｎ ＨＣＬ、続いて１０分間、室温で２Ｎ ＨＣＬ）によりＤＮＡを一本鎖に分離し、一次抗体が組み込まれたＢｒｄＵにアクセスすることができるようにした。ブロッキング溶液（０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含有するＰＢＳ中の５％の正常ヤギ血清）とインキュベートした後、細胞をラットモノクローナル抗ＢｒｄＵ一次抗体（１：１００；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｌｌａｓ、ＴＸ）と４℃で一晩インキュベートした。続いて０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含有するＰＢＳで洗浄した後、細胞を抗ラットＩｇＧ（１：１，０００；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）と結合した蛍光標識二次抗体と室温で２時間インキュベートした。細胞核を４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）で、室温にて５分間対比染色した。免疫染色された細胞を覆い、次にＯｌｙｍｐｕｓ ＢＸ４１ＴＦ蛍光顕微鏡（２００倍、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＵＳＡ、Ｃｅｎｔｅｒ Ｖａｌｌｅｙ、ＰＡ）に搭載した。画像は、ｉＶｉｓｉｏｎ１０．１０．５ソフトウェア（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｅｘｔｏｎ、ＰＡ）を使用して取得した。カバーガラス上のランダムな位置で５セットの画像を取得し、その後ＩｍａｇｅＪ１．４９ｖソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を使用してマージした。細胞の総数に対する５－ＢｒｄＵ陽性細胞の割合を計算し、少なくとも３つの異なる培養物からの異なる群間で比較した。
ｉＰＳＣの分化
ｉＰＳＣから皮質ニューロンおよびＢＦＣＮに分化するためのプロトコルは、その各々は参照によりその全体が組み込まれる、Ｓｈｉ Ｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ２０１２；７：１８３６、Ｂｉｓｓｏｎｎｅｔｔｅ ＣＪ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２０１１；２９：８０２によって説明されるように、以前に説明されたプロトコルから適応された。簡単に説明すると、フィーダーフリーの培養ｉＰＳＣ細胞は、デュアルＳＭＡＤ抑制を介して神経前駆細胞を形成するように誘導された。細胞は、ＳＢ４３１５４２２ｕＭおよびＤＭＨ１２ｕＭ（両方ともＴｏｃｒｉｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮから）を用いて、化学的に定義された条件で７日間培養された。
ｉＰＳＣから皮質ニューロンおよびＢＦＣＮに分化するためのプロトコルは、その各々は参照によりその全体が組み込まれる、Ｓｈｉ Ｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ２０１２；７：１８３６、Ｂｉｓｓｏｎｎｅｔｔｅ ＣＪ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２０１１；２９：８０２によって説明されるように、以前に説明されたプロトコルから適応された。簡単に説明すると、フィーダーフリーの培養ｉＰＳＣ細胞は、デュアルＳＭＡＤ抑制を介して神経前駆細胞を形成するように誘導された。細胞は、ＳＢ４３１５４２２ｕＭおよびＤＭＨ１２ｕＭ（両方ともＴｏｃｒｉｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮから）を用いて、化学的に定義された条件で７日間培養された。
皮質ニューロンの場合、培地は、１２日目に神経維持培地に交換され（つまり、Ｎ－２およびＢ－２７を含有する培地の１：１混合物であり、Ｎ－２培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２ ＧｌｕｔａＭＡＸ、１×Ｎ－２、５μｇ／ｍＬのインスリン、１ｍＭのＬ－グルタミン、１００μｍの非必須アミノ酸、１００μＭの２－メルカプトエタノール、５０Ｕ／ｍＬのペニシリン、５０ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシンからなり、Ｂ－２７培地は、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ、１×Ｂ－２７、２００ｍＭのＬ－グルタミン、５０Ｕ／ｍＬのペニシリン、および５０ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシンからなる。）、１２日目から継続された。細胞は、毎日調べられた。培養物を倒立顕微鏡で２４～２９日目頃に見ると、神経ロゼット構造は、明らかであった。この時点から、培地は、１日おきに交換された。
ＢＦＣＮ分化のために、ｉＰＳＣ由来の原始神経幹細胞をＳＨＨ（５００ｎｇ／ｍＬ、１８４５－ＳＨ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ、ＭＮ、ＵＳＡ）で発達させ、２４日目からＮＧＦ（５０～１００ｎｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄ）で処理した。２８日目に、以前に５，０００細胞／ｃｍ２の密度でラミニン上に播種した神経前駆細胞は、ラミニン基板に付着した。播種された細胞は、好ましくは、参照によりその全体が組み込まれる、Ｌｉｕ Ｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０１３；３１：４４０によって説明されるように、ＮＧＦ（５０～１００ｎｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄ）、ｃＡＭＰ（１μＭ、Ｓｉｇｍａ）、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ（１０ｎｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄ）、ＳＨＨ（５０ｎｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄ）の存在下で、ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地、Ｎ２サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からなる神経分化培地で成長させた。
Ｃａ２＋測定
クラゲ発光タンパク質エクオリンベースのプローブを使用して、ＡＴＰ曝露後のｉＰＳＣの細胞質Ｃａ２＋濃度（［Ｃａ２＋］ｃ）の変化を測定した。７．５～１．２×１０４細胞を２４ウェルプレート上の１２ｍｍのカバースリップ上に播種し、５０～６０％コンフルエンスまで成長させ、次いで、メーカーの指示に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００トランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してｃｙｔ－Ａｅｑプラスミドでトランスフェクトした。翌日、トランスフェクトされた細胞は、１ｍＭのＣａＣｌ２で補充された改変クレブス－リンガー緩衝液（ｍＭ単位で、１４０のＮａＣｌ、２．８のＫＣｌ、２のＭｇＣｌ２、１０のＨｅｐｅｓ、１１のグルコース、ｐＨ７．４）中で１時間、５μＭのセレンテラジンとインキュベートし、次に灌流チャンバーに移した。すべてのエクオリン測定は、ＫＲＢで実施され、麻酔薬は、指定されたものと同じ培地に添加された。実験は、特注のエクオリン記録システムで行われた。細胞外のＣａ２＋を含まない実験では、Ｃａ２＋を含まない緩衝液を使用した（Ｃａ２＋を含まないが、５ｍＭのＥＧＴＡを含むＫＲＢ）。実験は、低張性のＣａ２＋が豊富な溶液（Ｈ２Ｏ中１０ｍＭのＣａＣｌ２）中の１００μＭのジギトニンで細胞を溶解することによって終了されたため、残りのエクオリンプールを排出した。光信号は、その各々は参照によりその全体が組み込まれる、Ｆｉｌａｄｉ Ｒ，ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ２０１５；２０１５０４８８０、Ｂｏｎｏｒａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ２０１３；８：２１０５によって以前に説明されたように、収集され、ｐＨ、［Ｍｇ２＋］、およびイオン強度の生理学的条件でのエクオリンのＣａ２＋応答曲線に基づくアルゴリズムによって［Ｃａ２＋］ｃ値に較正された。
クラゲ発光タンパク質エクオリンベースのプローブを使用して、ＡＴＰ曝露後のｉＰＳＣの細胞質Ｃａ２＋濃度（［Ｃａ２＋］ｃ）の変化を測定した。７．５～１．２×１０４細胞を２４ウェルプレート上の１２ｍｍのカバースリップ上に播種し、５０～６０％コンフルエンスまで成長させ、次いで、メーカーの指示に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００トランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してｃｙｔ－Ａｅｑプラスミドでトランスフェクトした。翌日、トランスフェクトされた細胞は、１ｍＭのＣａＣｌ２で補充された改変クレブス－リンガー緩衝液（ｍＭ単位で、１４０のＮａＣｌ、２．８のＫＣｌ、２のＭｇＣｌ２、１０のＨｅｐｅｓ、１１のグルコース、ｐＨ７．４）中で１時間、５μＭのセレンテラジンとインキュベートし、次に灌流チャンバーに移した。すべてのエクオリン測定は、ＫＲＢで実施され、麻酔薬は、指定されたものと同じ培地に添加された。実験は、特注のエクオリン記録システムで行われた。細胞外のＣａ２＋を含まない実験では、Ｃａ２＋を含まない緩衝液を使用した（Ｃａ２＋を含まないが、５ｍＭのＥＧＴＡを含むＫＲＢ）。実験は、低張性のＣａ２＋が豊富な溶液（Ｈ２Ｏ中１０ｍＭのＣａＣｌ２）中の１００μＭのジギトニンで細胞を溶解することによって終了されたため、残りのエクオリンプールを排出した。光信号は、その各々は参照によりその全体が組み込まれる、Ｆｉｌａｄｉ Ｒ，ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ２０１５；２０１５０４８８０、Ｂｏｎｏｒａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ２０１３；８：２１０５によって以前に説明されたように、収集され、ｐＨ、［Ｍｇ２＋］、およびイオン強度の生理学的条件でのエクオリンのＣａ２＋応答曲線に基づくアルゴリズムによって［Ｃａ２＋］ｃ値に較正された。
ＮＭＤＡへの曝露後のｉＰＳＣの細胞質Ｃａ２＋濃度（［Ｃａ２＋］ｃ）の変化は、前述の方法を使用してＦｕｒａ－２／ＡＭ蛍光（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）によって測定された。アッセイは、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ７０倒立顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ Ａｍｅｒｉｃａ Ｉｎｃ、Ｃｅｎｔｅｒ Ｖａｌｌｅｙ、ＰＡ）およびＩＰＬａｂ ｖ３．７１ソフトウェア（Ｓｃａｎａｌｙｔｉｃｓ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）で実施された。簡単に説明すると、ｉＰＳＣを３５ｍｍの培養皿に播種した。
細胞を、Ｃａ２＋を含まないダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）で３回洗浄し、同じ緩衝液中の２．５μｍのＦｕｒａ－２／ＡＭとともに３７℃で３０分間装填した後、次に、細胞を２回洗浄し、Ｃａ２＋を含まないＤＭＥＭと３７℃でさらに３０分間インキュベートした。Ｆｕｒａ－２ＡＭは、３４０ｎｍと３８０ｎｍの励起で交互に記録することにより測定され、５１０ｎｍでの発光が各処理について最大１０分間検出された。誘発された変化は、ダントロレン３０μＭ（Ｄａｎ）の有無にかかわらず５００μＭのＮＭＤＡの処置に応答して記録された。結果は、Ｆ３４０／Ｆ３８０ｎｍの比率として表され、少なくとも３回の別々の実験から平均化した。
ウエスタンブロッティング
標準的な手順に従ってウエスタンブロッティングを行った。ｉＰＳＣ細胞からの総タンパク質抽出物を、参照によりその全体が組み込まれる、Ｈｏｌｌｏｍｏｎ，ＭＧ， ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ ２０１３；１３：５００によって記載されるように、プロテアーゼ抑制剤のカクテルの存在下で氷冷溶解緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、および１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）中で細胞を溶解することにより得た。遠心分離後、上清を回収し、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）タンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用して総タンパク質を定量化した。各レーンに等量のタンパク質を装填し、１５％のドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳＰＡＧＥ）で分離した。
標準的な手順に従ってウエスタンブロッティングを行った。ｉＰＳＣ細胞からの総タンパク質抽出物を、参照によりその全体が組み込まれる、Ｈｏｌｌｏｍｏｎ，ＭＧ， ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ ２０１３；１３：５００によって記載されるように、プロテアーゼ抑制剤のカクテルの存在下で氷冷溶解緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、および１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）中で細胞を溶解することにより得た。遠心分離後、上清を回収し、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）タンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用して総タンパク質を定量化した。各レーンに等量のタンパク質を装填し、１５％のドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳＰＡＧＥ）で分離した。
電気泳動後、タンパク質をポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に移した。膜をＰＢＳ－Ｔに溶解した５％の無脂肪ミルクにより室温で１時間ブロックし、次に一次抗体により４℃で一晩染色した。ＰＢＳ－Ｔで洗浄した後、膜を１：１，０００希釈の二次抗体（ＨＲＰ結合抗ウサギおよび抗マウスＩｇＧ）とインキュベートし、β－アクチンを装填対照として使用した。シグナルを、強化された化学発光検出システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）で検出し、走査デンシトメトリーによって定量化した。
免疫細胞化学
細胞を４％のパラホルムアルデヒドで１５分間固定した後、１×ＰＢＳで３回洗浄した。次に、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含有するＰＢＳ中の５％の正常ヤギ血清によって、室温で１時間ブロックした。一次抗体は、１％のＢＳＡおよび０．３％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘ－１００を含有する１ｘＰＢＳ中で、４℃で一晩適用された。ＰＢＳで３回洗浄した後、ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ結合二次抗体（１：１０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＤＡＰＩ（１：２０００）と一緒に１時間添加した。さらに３回洗浄した後、カバースリップにＰｒｏｌｏｎｇ Ｇｏｌｄ退色防止試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でマウントし、画像を作成した。
細胞を４％のパラホルムアルデヒドで１５分間固定した後、１×ＰＢＳで３回洗浄した。次に、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含有するＰＢＳ中の５％の正常ヤギ血清によって、室温で１時間ブロックした。一次抗体は、１％のＢＳＡおよび０．３％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘ－１００を含有する１ｘＰＢＳ中で、４℃で一晩適用された。ＰＢＳで３回洗浄した後、ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ結合二次抗体（１：１０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＤＡＰＩ（１：２０００）と一緒に１時間添加した。さらに３回洗浄した後、カバースリップにＰｒｏｌｏｎｇ Ｇｏｌｄ退色防止試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でマウントし、画像を作成した。
使用した一次抗体は、Ｏｃｔ４（１：５００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、Ｓｏｘ２（１：５００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＰＡＸ６（１：５００、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、Ｔｂｒ１（１：５００、Ａｂｃａｍ）、ＣｈＡＴ（１：１００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、Ｍａｐ２（１：５００、Ｓｉｇｍａ）、ＰＳＤ９５（１：５００、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、Ｓｙｎａｐｓｉｎ－１（１：５００、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＥＥＡ１（１：１００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＬＡＭＰ－２（１：１００、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、Ｃａｌｎｅｘｉｎ（１：１００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、およびＬＣ３（１：２００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）であった。
リソソーム酸性度測定
参照によりその全体が組み込まれる、Ｒｅｎ Ｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ ２０１７；７：１２３７８によって以前に説明されたように、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）Ｒｅｄ ＤＮＤ－９９（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）プローブストック溶液を、ＨＢＳＳ＋中で５０ｎＭの作業濃度に希釈した。ｉＰＳＣ細胞は、ｍＴｅＳＲ（商標）１（カタログ番号０５８５０）内にあるマトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でコーティングされたカバースリップ上に播種した。ＨＢＳＳ＋で３回洗浄した後、細胞にＨＢＳＳ＋を含有する予熱した（３７℃）プローブを装填し、３７℃で１時間インキュベートした。標識溶液の代わりに新鮮な培地を添加した。細胞は、使用したプローブに適したフィルターセットを備える蛍光顕微鏡によって観察して、細胞が十分に蛍光を発しているかどうかを判断した。ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄは、最大発光が約５９０ｎｍ、励起最大が約５７７ｎｍであった。
参照によりその全体が組み込まれる、Ｒｅｎ Ｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ ２０１７；７：１２３７８によって以前に説明されたように、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）Ｒｅｄ ＤＮＤ－９９（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）プローブストック溶液を、ＨＢＳＳ＋中で５０ｎＭの作業濃度に希釈した。ｉＰＳＣ細胞は、ｍＴｅＳＲ（商標）１（カタログ番号０５８５０）内にあるマトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でコーティングされたカバースリップ上に播種した。ＨＢＳＳ＋で３回洗浄した後、細胞にＨＢＳＳ＋を含有する予熱した（３７℃）プローブを装填し、３７℃で１時間インキュベートした。標識溶液の代わりに新鮮な培地を添加した。細胞は、使用したプローブに適したフィルターセットを備える蛍光顕微鏡によって観察して、細胞が十分に蛍光を発しているかどうかを判断した。ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄは、最大発光が約５９０ｎｍ、励起最大が約５７７ｎｍであった。
データ分析および統計
すべてのデータは、コルモゴロフ－スミルノフ（ＫＳ）正規性検定およびブラウン－フォーサイス検定によって正規分布について検定して、統計分析にパラメトリック検定またはノンパラメトリック検定が使用されているかを判断した。パラメトリック変数は、平均値±ＳＤとして表され、スチューデントの独立両側ｔ検定、一元配置分散分析または二元配置分散分析、続いてシダックの事後解析を使用して分析された。非パラメータ変数は、クラスカル－ウォリス検定と、それに続くダンの多重比較検定を使用して分析された。統計分析およびグラフ作成には、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）を使用した。０．０５未満のＰ値は、統計的に有意であるとみなされた。
すべてのデータは、コルモゴロフ－スミルノフ（ＫＳ）正規性検定およびブラウン－フォーサイス検定によって正規分布について検定して、統計分析にパラメトリック検定またはノンパラメトリック検定が使用されているかを判断した。パラメトリック変数は、平均値±ＳＤとして表され、スチューデントの独立両側ｔ検定、一元配置分散分析または二元配置分散分析、続いてシダックの事後解析を使用して分析された。非パラメータ変数は、クラスカル－ウォリス検定と、それに続くダンの多重比較検定を使用して分析された。統計分析およびグラフ作成には、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）を使用した。０．０５未満のＰ値は、統計的に有意であるとみなされた。
結果
ダントロレンは、ＡＤ患者のｉＰＳＣにおける細胞生存率を促進し、細胞増殖の障害を抑制した
健康なヒト対象またはＳＡＤ／ＦＡＤ患者からのｉＰＳＣ、ＮＰＣ、およびニューロンを培養し、特定の種類の細胞を標的とする特定の抗体によって特徴付けた。健康なヒト対象またはＳＡＤ／ＦＡＤ患者の間で、ｉＰＳＣのＭＴＴ還元アッセイによって決定された細胞生存率に有意差はなかった。しかしながら、ダントロレンは、ｉＰＳＣ ＳＡＤのＭＴＴを１５．１％（Ｎ＝８、Ｐ＜０．０１）、ＦＡＤを６７．６％（Ｎ＝７Ｐ＜０．０００１、図１Ａ）有意に増加させた。健康なヒト対象と比較して、ＳＡＤ／ＦＡＤ患者からのｉＰＳＣは、５－ＢｒｄＵの取り込みによって決定されるように、ＦＡＤ ｉＰＳＣでより顕著であった、増殖能力の障害を有する傾向があり、これは、ダントロレンによって抑制された（図１Ｂ）。対照と比較して、ダントロレンは、ｉＰＳＣのＮＰＣへの分化に著しい影響を及ぼさなかった。
ダントロレンは、ＡＤ患者のｉＰＳＣにおける細胞生存率を促進し、細胞増殖の障害を抑制した
健康なヒト対象またはＳＡＤ／ＦＡＤ患者からのｉＰＳＣ、ＮＰＣ、およびニューロンを培養し、特定の種類の細胞を標的とする特定の抗体によって特徴付けた。健康なヒト対象またはＳＡＤ／ＦＡＤ患者の間で、ｉＰＳＣのＭＴＴ還元アッセイによって決定された細胞生存率に有意差はなかった。しかしながら、ダントロレンは、ｉＰＳＣ ＳＡＤのＭＴＴを１５．１％（Ｎ＝８、Ｐ＜０．０１）、ＦＡＤを６７．６％（Ｎ＝７Ｐ＜０．０００１、図１Ａ）有意に増加させた。健康なヒト対象と比較して、ＳＡＤ／ＦＡＤ患者からのｉＰＳＣは、５－ＢｒｄＵの取り込みによって決定されるように、ＦＡＤ ｉＰＳＣでより顕著であった、増殖能力の障害を有する傾向があり、これは、ダントロレンによって抑制された（図１Ｂ）。対照と比較して、ダントロレンは、ｉＰＳＣのＮＰＣへの分化に著しい影響を及ぼさなかった。
ダントロレンは、ＳＡＤ／ＦＡＤ細胞の両方で、ＮＰＣの未成熟ニューロン、皮質ニューロン、およびＢＦＣＮへの分化の障害を改善した
神経新生に対して適切なダントロレン神経保護を発揮させるためのパイロット研究に基づいて、ｉＰＳＣは、ＮＰＣへのｉＰＳＣ分化の誘導から開始して、３日間連続でダントロレン（３０μＭ）により処置された（図２Ａ～２Ｂおよび３Ａ～３Ｆ）。分化２３日目のＳＡＤ／ＦＡＤのｉＰＳＣに由来するＮＰＣの未成熟ニューロンへの分化は、対照と比較して、それぞれ９．１％（Ｎ＝６、Ｐ＜０．０５）および８．１８％（Ｎ＝６、Ｐ＜０．０５）減少し、これは、ダントロレンによって消失した（図２Ａ～２Ｂ）。対照と比較して、ＳＡＤおよびＦＡＤ患者の成熟皮質ニューロン（図３Ｂ、Ｔｒｂ１陽性細胞、赤）は、対照と比較して、それぞれ３５．２％（Ｎ＝５、Ｐ＜０．０００１）および１５．７％（Ｎ＝５、Ｐ＜０．０５）減少し、これは、ダントロレンによって消失した効果（図３Ｃ）。ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ、図３Ｄ）を使用して、ｉＰＳＣからのＢＦＣＮ（ＣｈＡＴ陽性ニューロン、緑色）の生成をさらに調べた。対照と比較して、特定のＢＦＣＮへの分化（図３Ｅ）は、ＳＡＤ／ＦＡＤのｉＰＳＣでそれぞれ、１０．７％（Ｎ＝５、Ｐ＜０．０１）および９．２％（Ｎ＝５、Ｐ＜０．０５）減少し（図３Ｆ）、これも、ダントロレンによって消失した。
神経新生に対して適切なダントロレン神経保護を発揮させるためのパイロット研究に基づいて、ｉＰＳＣは、ＮＰＣへのｉＰＳＣ分化の誘導から開始して、３日間連続でダントロレン（３０μＭ）により処置された（図２Ａ～２Ｂおよび３Ａ～３Ｆ）。分化２３日目のＳＡＤ／ＦＡＤのｉＰＳＣに由来するＮＰＣの未成熟ニューロンへの分化は、対照と比較して、それぞれ９．１％（Ｎ＝６、Ｐ＜０．０５）および８．１８％（Ｎ＝６、Ｐ＜０．０５）減少し、これは、ダントロレンによって消失した（図２Ａ～２Ｂ）。対照と比較して、ＳＡＤおよびＦＡＤ患者の成熟皮質ニューロン（図３Ｂ、Ｔｒｂ１陽性細胞、赤）は、対照と比較して、それぞれ３５．２％（Ｎ＝５、Ｐ＜０．０００１）および１５．７％（Ｎ＝５、Ｐ＜０．０５）減少し、これは、ダントロレンによって消失した効果（図３Ｃ）。ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ、図３Ｄ）を使用して、ｉＰＳＣからのＢＦＣＮ（ＣｈＡＴ陽性ニューロン、緑色）の生成をさらに調べた。対照と比較して、特定のＢＦＣＮへの分化（図３Ｅ）は、ＳＡＤ／ＦＡＤのｉＰＳＣでそれぞれ、１０．７％（Ｎ＝５、Ｐ＜０．０１）および９．２％（Ｎ＝５、Ｐ＜０．０５）減少し（図３Ｆ）、これも、ダントロレンによって消失した。
ダントロレンは、ＳＡＤ／ＦＡＤ患者のｉＰＳＣから生成されたニューロンのシナプス形成障害を救助した
ｉＰＳＣ誘導期間の最初の３日間に適用されたダントロレンのｉＰＳＣを起源とするニューロンのシナプス形成に対する影響を決定するために、皮質ニューロンの樹状突起と、体細胞からの円の距離（μｍ）として示される同心円との交点の数を定量化した（図４Ａ）。対照ニューロンと比較して、交点の数（シナプス形成に相当）は、ＳＡＤおよびＦＡＤの両方の患者ｉＰＳＣから生成された皮質ニューロンで有意に減少し、それぞれ体細胞から約１５０μＭの距離（図４Ａ）で７６．３％（Ｎ＝３、Ｐ＜０．０００１）および２３．７％と最も劇的に減少し（Ｎ＝３、Ｐ＜０．０５）、これは、特にＳＡＤ細胞（図４Ｂ）でダントロレンによって抑制された。シナプス密度に対するダントロレンの効果は、二重免疫染色技術を使用して、シナプス前マーカーシナプシン－１（緑）およびシナプス後マーカーＰＳＤ９５（赤）を決定することによって調べた（図４Ｃ）。ＰＳＤ９５（図４Ｄ）またはシナプシン－１（図４Ｅ）のいずれかによって決定されたシナプス密度はいずれも、ＰＳＤ９５（Ｎ＝５、Ｐ＜０．０１）においてはＳＡＤから生成された皮質ニューロンで５８．２％（Ｎ＝４～５、Ｐ＜０．００１）またはＦＡＤで５２．３％、および、シナプシン－１（Ｎ＝５、Ｐ＜０．０００１）においてはＳＡＤで５９．１％（Ｎ＝４～５、Ｐ＜０．０１）またはＦＡＤで８９．８％有意に減少し、両方ともＦＡＤのｉＰＳＣでダントロレンによって抑制された。
ｉＰＳＣ誘導期間の最初の３日間に適用されたダントロレンのｉＰＳＣを起源とするニューロンのシナプス形成に対する影響を決定するために、皮質ニューロンの樹状突起と、体細胞からの円の距離（μｍ）として示される同心円との交点の数を定量化した（図４Ａ）。対照ニューロンと比較して、交点の数（シナプス形成に相当）は、ＳＡＤおよびＦＡＤの両方の患者ｉＰＳＣから生成された皮質ニューロンで有意に減少し、それぞれ体細胞から約１５０μＭの距離（図４Ａ）で７６．３％（Ｎ＝３、Ｐ＜０．０００１）および２３．７％と最も劇的に減少し（Ｎ＝３、Ｐ＜０．０５）、これは、特にＳＡＤ細胞（図４Ｂ）でダントロレンによって抑制された。シナプス密度に対するダントロレンの効果は、二重免疫染色技術を使用して、シナプス前マーカーシナプシン－１（緑）およびシナプス後マーカーＰＳＤ９５（赤）を決定することによって調べた（図４Ｃ）。ＰＳＤ９５（図４Ｄ）またはシナプシン－１（図４Ｅ）のいずれかによって決定されたシナプス密度はいずれも、ＰＳＤ９５（Ｎ＝５、Ｐ＜０．０１）においてはＳＡＤから生成された皮質ニューロンで５８．２％（Ｎ＝４～５、Ｐ＜０．００１）またはＦＡＤで５２．３％、および、シナプシン－１（Ｎ＝５、Ｐ＜０．０００１）においてはＳＡＤで５９．１％（Ｎ＝４～５、Ｐ＜０．０１）またはＦＡＤで８９．８％有意に減少し、両方ともＦＡＤのｉＰＳＣでダントロレンによって抑制された。
２型ＲｙＲ（ＲｙＲ－２）は、ＡＤ患者からのｉＰＳＣで異常に増加した
メカニズム研究のために、ＲｙＲ－２の発現をイムノブロッティング（図５Ａ、５Ｂ）と免疫染色（図５Ｃ、５Ｄ）の両方を使用して最初に決定した。健康な対象と比較して、ＳＡＤ／ＦＡＤ患者のｉＰＳＣのＲｙＲ－２レベルは、ＦＡＤで３９．５％（Ｎ＝４、Ｐ＝０．０５５８）増加し（図５Ｂ）、平均ランクは、ＳＡＤで１１．１（Ｎ＝７、Ｐ＜０．０１）異なった（図５Ｄ）。
メカニズム研究のために、ＲｙＲ－２の発現をイムノブロッティング（図５Ａ、５Ｂ）と免疫染色（図５Ｃ、５Ｄ）の両方を使用して最初に決定した。健康な対象と比較して、ＳＡＤ／ＦＡＤ患者のｉＰＳＣのＲｙＲ－２レベルは、ＦＡＤで３９．５％（Ｎ＝４、Ｐ＝０．０５５８）増加し（図５Ｂ）、平均ランクは、ＳＡＤで１１．１（Ｎ＝７、Ｐ＜０．０１）異なった（図５Ｄ）。
ダントロレンは、ＳＡＤ患者とＦＡＤ患者の両方からのｉＰＳＣにおける細胞質Ｃａ２＋濃度（［Ｃａ２＋］ｃ）のＮＭＤＡまたはＡＴＰを介した異常な上昇を著しく抑制した
さらに調査されたのは、ＳＡＤ／ＦＡＤのｉＰＳＣで神経新生およびシナプス形成が害され、ダントロレンによって改善される可能性のあるメカニズムであった。ＡＤのｉＰＳＣにおけるこの上昇したＲｙＲ－２と一致して、ＮＭＤＡを介したピーク［Ｃａ２＋］ｃの上昇（図６Ａ、６Ｃ）および統合された曝露（図６Ａ、６Ｄ）は、ＦＡＤおよびＳＡＤのｉＰＳＣにおいて、正常な対照よりも有意に高く、これは、ダントロレンによって抑制された可能性があった（図６Ｂ～６Ｄ）。３種類の細胞をＡＴＰ（３０μＭ）で処理することによって細胞外Ｃａ２＋からのＣａ２＋放出について調べると、ＳＡＤ／ＦＡＤのｉＰＳＣは、［Ｃａ２＋］ｃのピーク上昇が有意により高く（それぞれ、１４０．４％、Ｐ＜０．０５または１２８．３％、Ｐ＝０．２０５５対対照での８４．１％、Ｎ＝５～９）、これは、細胞外Ｃａ２＋の除去および細胞外空間からの関連するＣａ２＋流入（図７Ａ、７Ｂ、７Ｅ）、ならびにダントロレン（３０μＭ）による１時間の前処置（図７Ｃ、７Ｆ）によって消失した。細胞外空間からのＣａ２＋流入がない場合、ＡＴＰは、３種類の細胞すべてにおいて、［Ｃａ２＋］ｃの有意により低い全体的な上昇を引き起こした（図７Ｅ）。細胞外Ｃａ２＋流入がない場合、ダントロレンは、［Ｃａ２＋］ｃのＡＴＰを介したピークまたは全体的な上昇を抑制する傾向があるだけで、ＳＡＤ／ＦＡＤ細胞では統計的に有意ではなかった（図７Ｄまたは７Ｇ）。
さらに調査されたのは、ＳＡＤ／ＦＡＤのｉＰＳＣで神経新生およびシナプス形成が害され、ダントロレンによって改善される可能性のあるメカニズムであった。ＡＤのｉＰＳＣにおけるこの上昇したＲｙＲ－２と一致して、ＮＭＤＡを介したピーク［Ｃａ２＋］ｃの上昇（図６Ａ、６Ｃ）および統合された曝露（図６Ａ、６Ｄ）は、ＦＡＤおよびＳＡＤのｉＰＳＣにおいて、正常な対照よりも有意に高く、これは、ダントロレンによって抑制された可能性があった（図６Ｂ～６Ｄ）。３種類の細胞をＡＴＰ（３０μＭ）で処理することによって細胞外Ｃａ２＋からのＣａ２＋放出について調べると、ＳＡＤ／ＦＡＤのｉＰＳＣは、［Ｃａ２＋］ｃのピーク上昇が有意により高く（それぞれ、１４０．４％、Ｐ＜０．０５または１２８．３％、Ｐ＝０．２０５５対対照での８４．１％、Ｎ＝５～９）、これは、細胞外Ｃａ２＋の除去および細胞外空間からの関連するＣａ２＋流入（図７Ａ、７Ｂ、７Ｅ）、ならびにダントロレン（３０μＭ）による１時間の前処置（図７Ｃ、７Ｆ）によって消失した。細胞外空間からのＣａ２＋流入がない場合、ＡＴＰは、３種類の細胞すべてにおいて、［Ｃａ２＋］ｃの有意により低い全体的な上昇を引き起こした（図７Ｅ）。細胞外Ｃａ２＋流入がない場合、ダントロレンは、［Ｃａ２＋］ｃのＡＴＰを介したピークまたは全体的な上昇を抑制する傾向があるだけで、ＳＡＤ／ＦＡＤ細胞では統計的に有意ではなかった（図７Ｄまたは７Ｇ）。
ダントロレンは、ＡＤ患者のｉＰＳＣにおけるリソソームｖＡＴＰアーゼおよび酸性度の減少を抑制した
参照によりその全体が組み込まれる、Ｌｅｅ ＪＨ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ２０１０；１４１：１１４６によって説明されるように、ＲｙＲの過剰な活性化によるＡＤプレセニリン１変異におけるＥＲカルシウム濃度の低下は、ＥＲからリソソームへのｖＡＴＰアーゼの合成および分泌を害し、その後リソソームの酸性度および機能を低下させた。本発明者らは、様々な種類のｉＰＳＣにおいて、リソソーム対ＥＲ ｖＡＴＰアーゼの変化、ならびにリソソーム酸性度を決定した。ｖＡＴＰアーゼの位置は、リソソーム（ＬＡＭＰ－２）、ＥＲ（カルネキシン）、およびエンドソーム（ＥＥＡ）を標的とする二重免疫染色および共局在化によって決定され（図８Ａ）、細胞酸性ビヒクルは、ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒによって決定された（図８Ｂ）。リソソームｖＡＴＰアーゼの量は、ＳＡＤからのｉＰＳＣで３９．７％（Ｎ＝４、Ｐ＜０．００１、およびＦＡＤで２９．９％（Ｎ＝４、Ｐ＜０．０５）、有意に減少し（図８Ｃ ＊ＣＯＮと比較）、これは、特にＦＡＤのｉＰＳＣでダントロレンによって抑制された可能性がある（図８Ｄ ＊ＣＯＮと比較）。一貫して、細胞酸性ビヒクルは、正常の対照と比較して、ＳＡＤとＦＡＤのｉＰＳＣの両方で、それぞれ５０％（Ｎ＝４、Ｐ＜０．０００１）および３３．９％（Ｎ＝４、Ｐ＜０．０１）と有意に減少し、これも、ダントロレンによって著しく抑制された（図８Ｅ ＊ＣＯＮとの比較、＋ＳＡＤとの比較、＃ＦＡＤとの比較）。
参照によりその全体が組み込まれる、Ｌｅｅ ＪＨ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ２０１０；１４１：１１４６によって説明されるように、ＲｙＲの過剰な活性化によるＡＤプレセニリン１変異におけるＥＲカルシウム濃度の低下は、ＥＲからリソソームへのｖＡＴＰアーゼの合成および分泌を害し、その後リソソームの酸性度および機能を低下させた。本発明者らは、様々な種類のｉＰＳＣにおいて、リソソーム対ＥＲ ｖＡＴＰアーゼの変化、ならびにリソソーム酸性度を決定した。ｖＡＴＰアーゼの位置は、リソソーム（ＬＡＭＰ－２）、ＥＲ（カルネキシン）、およびエンドソーム（ＥＥＡ）を標的とする二重免疫染色および共局在化によって決定され（図８Ａ）、細胞酸性ビヒクルは、ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒによって決定された（図８Ｂ）。リソソームｖＡＴＰアーゼの量は、ＳＡＤからのｉＰＳＣで３９．７％（Ｎ＝４、Ｐ＜０．００１、およびＦＡＤで２９．９％（Ｎ＝４、Ｐ＜０．０５）、有意に減少し（図８Ｃ ＊ＣＯＮと比較）、これは、特にＦＡＤのｉＰＳＣでダントロレンによって抑制された可能性がある（図８Ｄ ＊ＣＯＮと比較）。一貫して、細胞酸性ビヒクルは、正常の対照と比較して、ＳＡＤとＦＡＤのｉＰＳＣの両方で、それぞれ５０％（Ｎ＝４、Ｐ＜０．０００１）および３３．９％（Ｎ＝４、Ｐ＜０．０１）と有意に減少し、これも、ダントロレンによって著しく抑制された（図８Ｅ ＊ＣＯＮとの比較、＋ＳＡＤとの比較、＃ＦＡＤとの比較）。
ダントロレンは、ＡＤ患者からのｉＰＳＣにおいてオートファジー活性を促進した
オートファジーに対するダントロレンの影響をさらに決定した。オートファジーバイオマーカーＬＣ３ＩＩの全体的な細胞レベルによって示される全体的な活性は、３種類のｉＰＳＣ間で有意差はなかった（図９Ａ～９Ｃ）。しかしながら、ダントロレン処置により、ＬＣ３ＩＩレベルを、それぞれ、ＳＡＤのｉＰＳＣ（図９Ｂ）で４７．３％（Ｎ＝５、Ｐ＝０．３４８３）およびＦＡＤのｉＰＳＣで４９．４％（Ｎ＝３Ｐ＜０．００１）増加し（図９Ｃ＃ＦＡＤとの比較）、これは、オートファジーフラックスを害する薬剤であるバフィロマイシンとの同時処置によってさらに上昇する可能性があった（図９Ｂ、９Ｃ）。これは、ダントロレンがオートファジーフラックスを害するのではなく、オートファジー誘導を増加させたことを示唆する。ＳＡＤ／ＦＡＤのｉＰＳＣのオートファジーフラックスの障害は、それぞれ、ＳＡＤで４８．９％（Ｎ＝３、Ｐ＝０．３５９４）およびＦＡＤ ｉＰＳＣで１１０．９％（Ｎ＝３、Ｐ＜０．０５）有意に上昇したｐ６２によってさらに支持された（図９Ｄ ＊ＣＯＮとの比較）。
オートファジーに対するダントロレンの影響をさらに決定した。オートファジーバイオマーカーＬＣ３ＩＩの全体的な細胞レベルによって示される全体的な活性は、３種類のｉＰＳＣ間で有意差はなかった（図９Ａ～９Ｃ）。しかしながら、ダントロレン処置により、ＬＣ３ＩＩレベルを、それぞれ、ＳＡＤのｉＰＳＣ（図９Ｂ）で４７．３％（Ｎ＝５、Ｐ＝０．３４８３）およびＦＡＤのｉＰＳＣで４９．４％（Ｎ＝３Ｐ＜０．００１）増加し（図９Ｃ＃ＦＡＤとの比較）、これは、オートファジーフラックスを害する薬剤であるバフィロマイシンとの同時処置によってさらに上昇する可能性があった（図９Ｂ、９Ｃ）。これは、ダントロレンがオートファジーフラックスを害するのではなく、オートファジー誘導を増加させたことを示唆する。ＳＡＤ／ＦＡＤのｉＰＳＣのオートファジーフラックスの障害は、それぞれ、ＳＡＤで４８．９％（Ｎ＝３、Ｐ＝０．３５９４）およびＦＡＤ ｉＰＳＣで１１０．９％（Ｎ＝３、Ｐ＜０．０５）有意に上昇したｐ６２によってさらに支持された（図９Ｄ ＊ＣＯＮとの比較）。
この研究は、ＮＰＣから一般的な皮質およびＡＤ特異的欠損ＢＦＣＮへの神経新生が、健康なヒト対象と比較して、ＳＡＤ／ＦＡＤ患者において著しく害され、これは、ダントロレンによって抑制される可能性のあったことを示す。また、ダントロレンは、ＳＡＤ／ＦＡＤ患者のｉＰＳＣに由来する皮質ニューロンのシナプス形成の障害を著しく抑制した。ＳＡＤ／ＦＡＤのｉＰＳＣにおけるＲｙＲ－２数は、異常に増加し、これは、ＮＭＤＡ受容体の活性化ならびに関連する機能不全のリソソーム酸性度およびオートファジー機能によって引き起こされる［Ｃａ２＋］ｃの著しい異常な上昇に寄与した。一貫して、ダントロレンは、ＮＭＤＡを介した細胞内Ｃａ２＋ホメオスタシスの破壊およびリソソーム機能障害を著しく抑制すると同時に、ＳＡＤ／ＦＡＤ細胞のオートファジー活性も促進した。
この研究の結果は、ＡＤ患者からのｉＰＳＣにおける異常に上昇したＲｙＲ－２（図５Ａ～５Ｄ）および結果として生じるＣａ２＋調節不全（図６Ａ～６Ｄ、７Ａ～７Ｇ）がリソソームの酸性度および機能の障害と関連していたことを示す（図８Ａ～８Ｅ）。オートファジーフラックスは、ＡＤ細胞で一貫して害されていたが、ダントロレンは、主にオートファジー活動を促進するようであったが、リソソームの酸性度および機能の障害も改善した。（図８Ａ～８Ｅ、９Ａ～９Ｆ）。ＡＤ患者からのｉＰＳＣに由来するニューロンにおける神経新生／シナプス形成の障害のダントロレンを介した抑制は、全体的なオートファジー活性を促進し、リソソーム機能の障害を改善する能力と関連している。
実施例２
ダントロレンの鼻腔内投与は、脳内の濃度および持続時間を増加させた
鼻腔内ダントロレン投与は、その毒性および副作用を最小限に抑えながら、様々な神経変性疾患、特にＡＤにおけるダントロレンの潜在的な神経保護効果を最大化するための新しい治療アプローチとして提案されている。本明細書に記載されるように、この研究は、マウスにおける鼻腔内ダントロレン投与が、一般的に使用される経口投与と比較して、脳内のダントロレンの濃度および持続時間を有意に増加させたことを実証する。
ダントロレンの鼻腔内投与は、脳内の濃度および持続時間を増加させた
鼻腔内ダントロレン投与は、その毒性および副作用を最小限に抑えながら、様々な神経変性疾患、特にＡＤにおけるダントロレンの潜在的な神経保護効果を最大化するための新しい治療アプローチとして提案されている。本明細書に記載されるように、この研究は、マウスにおける鼻腔内ダントロレン投与が、一般的に使用される経口投与と比較して、脳内のダントロレンの濃度および持続時間を有意に増加させたことを実証する。
材料および方法
動物
すべての手順は、ペンシルベニア大学の施設内動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認されたプロトコルに従って実行された。すべての実験で、月齢２～４ヶ月、体重２５～３５ｇのオスとメスのＣ５７ＢＬ／６マウスを使用した。マウスを２１～２２℃、１２時間の明暗サイクルで餌と水は自由の状態にさせた。マウスの苦痛と数を最小限に抑えるために、あらゆる努力が払われた。
動物
すべての手順は、ペンシルベニア大学の施設内動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認されたプロトコルに従って実行された。すべての実験で、月齢２～４ヶ月、体重２５～３５ｇのオスとメスのＣ５７ＢＬ／６マウスを使用した。マウスを２１～２２℃、１２時間の明暗サイクルで餌と水は自由の状態にさせた。マウスの苦痛と数を最小限に抑えるために、あらゆる努力が払われた。
薬物投与
薬物動態研究では、マウスをランダムに２つの実験群に分けた。鼻腔内ダントロレン（Ｎ＝４～１３／群、鼻腔内投与後２０分間についてはＮ＝１３であり、再現性と信頼性を確認するためにこの時点で実験を繰り返した。）および経口ダントロレン（Ｎ＝５）の送達。ビヒクルは、ＲＹＡＮＯＤＥＸ（登録商標）（Ｅａｇｌｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）について報告されたものと同じであり、２０ｍＬのｄｄＨ２Ｏ中の１２５ｍｇのマンニトール、２５ｍｇのポリソルベート８０、４ｍｇのポビドンＫ１２からなり、ｐＨを１０．３に調整した。ダントロレン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）をビヒクルで５ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈した。鼻腔内投与のために、マウスを保持し、手のひらに固定した。ピペットを使用して、体重１グラム当たり１μＬの製剤またはビヒクルを送達した。鼻腔内送達を支援するために、いくつかの重要なステップを行った：１）マウスの頭が床と平行になるように保持した、２）マウスが頭や首を動かせないように保持した、３）小さな液滴をピペットから排出させた、４）次の液滴が送達される前に、マウスが溶液を吸入するのに２～３秒おいた、５）送達終了後、マウスを１０～１５秒間保持した。この手順には、約１０分／マウスかかった。経口投与は、参照によりその全体が組み込まれる、Ｗｕ， Ｚ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ Ｄｉｓ Ａｓｓｏｃ Ｄｉｓｏｒｄ ２０１５；２９：１８４によって以前に記載されたように行われた。マウスを同じように配置し、マイクロリットル注射器に取り付けられた強制飼養を使用して、体重１グラム当たり５μＬの薬物を送達した。
薬物動態研究では、マウスをランダムに２つの実験群に分けた。鼻腔内ダントロレン（Ｎ＝４～１３／群、鼻腔内投与後２０分間についてはＮ＝１３であり、再現性と信頼性を確認するためにこの時点で実験を繰り返した。）および経口ダントロレン（Ｎ＝５）の送達。ビヒクルは、ＲＹＡＮＯＤＥＸ（登録商標）（Ｅａｇｌｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）について報告されたものと同じであり、２０ｍＬのｄｄＨ２Ｏ中の１２５ｍｇのマンニトール、２５ｍｇのポリソルベート８０、４ｍｇのポビドンＫ１２からなり、ｐＨを１０．３に調整した。ダントロレン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）をビヒクルで５ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈した。鼻腔内投与のために、マウスを保持し、手のひらに固定した。ピペットを使用して、体重１グラム当たり１μＬの製剤またはビヒクルを送達した。鼻腔内送達を支援するために、いくつかの重要なステップを行った：１）マウスの頭が床と平行になるように保持した、２）マウスが頭や首を動かせないように保持した、３）小さな液滴をピペットから排出させた、４）次の液滴が送達される前に、マウスが溶液を吸入するのに２～３秒おいた、５）送達終了後、マウスを１０～１５秒間保持した。この手順には、約１０分／マウスかかった。経口投与は、参照によりその全体が組み込まれる、Ｗｕ， Ｚ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ Ｄｉｓ Ａｓｓｏｃ Ｄｉｓｏｒｄ ２０１５；２９：１８４によって以前に記載されたように行われた。マウスを同じように配置し、マイクロリットル注射器に取り付けられた強制飼養を使用して、体重１グラム当たり５μＬの薬物を送達した。
脳からのダントロレンクリアランスの減少を、参照によりその全体が組み込まれる、Ｆｕｃｈｓ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓｐｏｓ ２０１４；４２：１７６１によって説明されるように、ダントロレンを脳から排出する抑制剤である、一次タンパク質（Ｐ－ｇｐ／ＢＣＲＰ）のためのニモジピン（ｎ＝５）またはエラクリダール（ｎ＝６）の鼻腔内投与によって調べた。ニモジピン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）およびエラクリダール（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）をビヒクルでそれぞれ２ｍｇ／ｍＬおよび１０ｍｇ／ｍＬに希釈した。５ｍｇ／ｍＬのダントロレン（体重の１μＬ／ｇ）の鼻腔内投与の３０分前に、鼻腔内ニモジピンまたはエラクリダールまたはビヒクル体重の１μＬ／ｇを送達した。ダントロレンの組織濃度は、鼻腔内ダントロレン投与の２０分後に調べた。
薬物安全性研究のために、ダントロレンの慢性投与の潜在的な悪影響を調べた。マウスの別々のコホートをランダムに群に分け、上記のように、鼻腔内ダントロレン（５ｍｇ／ｋｇ）または鼻腔内ビヒクルを週３回、３週間または４ヶ月間投与した。
試料収集
動物は、２～４％のイソフルランで麻酔し、ダントロレン投与の１０、２０、３０、５０、７０、１２０、１５０、および１８０分後に心臓穿刺によって血液試料（０．２ｍＬ）を得た。次に、動物をＰＢＳによる心臓内灌流および放血によって安楽死させて、脳を採取する前に、ダントロレンが脳血管系から完全に洗い流されることを確実にした。抗凝固処理した血液試料を３０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離し、上清を回収した。すべての手順は、冷蔵室（４℃）で行われた。血漿試料と脳試料の両方を－８０℃で保存し、アッセイまで光から保護した。マウスの別々のコホートは、３週間の慢性ダントロレン投与および嗅覚または運動機能試験の後に上記のように安楽死させた。
動物は、２～４％のイソフルランで麻酔し、ダントロレン投与の１０、２０、３０、５０、７０、１２０、１５０、および１８０分後に心臓穿刺によって血液試料（０．２ｍＬ）を得た。次に、動物をＰＢＳによる心臓内灌流および放血によって安楽死させて、脳を採取する前に、ダントロレンが脳血管系から完全に洗い流されることを確実にした。抗凝固処理した血液試料を３０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離し、上清を回収した。すべての手順は、冷蔵室（４℃）で行われた。血漿試料と脳試料の両方を－８０℃で保存し、アッセイまで光から保護した。マウスの別々のコホートは、３週間の慢性ダントロレン投与および嗅覚または運動機能試験の後に上記のように安楽死させた。
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
屈折率モニターを備えたＡｉｇｌｅｎｔ Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄモデル１１００シリーズの高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システム（Ａｉｇｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、血液および脳のダントロレン濃度を定量化した。アセトニトリルを移動相の成分Ａとして使用し、リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を成分Ｂとして使用した。移動相の流量は、１．０ｍＬ／分で、移動相の成分ＡおよびＢの比率は、それぞれ１２％～８８％であった。検出は、２５４ｎｍのＵＶ検出器を使用して行われた。
屈折率モニターを備えたＡｉｇｌｅｎｔ Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄモデル１１００シリーズの高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システム（Ａｉｇｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、血液および脳のダントロレン濃度を定量化した。アセトニトリルを移動相の成分Ａとして使用し、リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を成分Ｂとして使用した。移動相の流量は、１．０ｍＬ／分で、移動相の成分ＡおよびＢの比率は、それぞれ１２％～８８％であった。検出は、２５４ｎｍのＵＶ検出器を使用して行われた。
有害な副作用を調べるための行動アッセイ
埋没食品試験
マウスの嗅覚は、その全体が参照により組み込まれる、Ｙａｎｇ，Ｍ．ａｎｄ Ｊ．Ｎ．Ｃｒａｗｌｅｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２００９：ｐ．８．２４．１－８．２４．１２によって説明されるように、埋没食品試験を使用して、３週間の鼻腔内ダントロレン（５ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝１０）またはビヒクル（同等の量、ｎ＝１０）の後に別のコホートで評価された。 マウスをランダムに２つの実験群に分けた（ｎ＝１０／群）。ダントロレンまたはビヒクルは、１日１回、週３回（平日の隔日）投与された。３週間の慢性投与後、動物は、埋没食品試験に供された。１日目に、クッキー（２匹のマウスに対して１つのクッキー）をケージに入れ、一晩放置した。クッキーが消費されたことを確認するために、２日目にケージを観察した。２日目の午後４時ごろ、餌をケージから取り出し、試験マウスを一晩絶食させ、水は利用可能であった。３日目の午前１１時ごろ、マウスを試験室に運び、順応のためにそこに１時間置いた。次に、マウスを個別に、３ｃｍの深さのベッドを備える清潔なケージに入れた。クッキーを、隅のベッドの下１ｃｍに埋めた。マウスが餌を取り出し、前足で保持するのにかかった時間を最大９００秒間記録した。
埋没食品試験
マウスの嗅覚は、その全体が参照により組み込まれる、Ｙａｎｇ，Ｍ．ａｎｄ Ｊ．Ｎ．Ｃｒａｗｌｅｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２００９：ｐ．８．２４．１－８．２４．１２によって説明されるように、埋没食品試験を使用して、３週間の鼻腔内ダントロレン（５ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝１０）またはビヒクル（同等の量、ｎ＝１０）の後に別のコホートで評価された。 マウスをランダムに２つの実験群に分けた（ｎ＝１０／群）。ダントロレンまたはビヒクルは、１日１回、週３回（平日の隔日）投与された。３週間の慢性投与後、動物は、埋没食品試験に供された。１日目に、クッキー（２匹のマウスに対して１つのクッキー）をケージに入れ、一晩放置した。クッキーが消費されたことを確認するために、２日目にケージを観察した。２日目の午後４時ごろ、餌をケージから取り出し、試験マウスを一晩絶食させ、水は利用可能であった。３日目の午前１１時ごろ、マウスを試験室に運び、順応のためにそこに１時間置いた。次に、マウスを個別に、３ｃｍの深さのベッドを備える清潔なケージに入れた。クッキーを、隅のベッドの下１ｃｍに埋めた。マウスが餌を取り出し、前足で保持するのにかかった時間を最大９００秒間記録した。
ロータロッド試験
鼻腔内ダントロレン（５ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝１０）またはビヒクル（等価用量、ｎ＝１０）のいずれかを１日１回、週に３回、４ヶ月間投与されたマウスの別のコホートにおいて、参照によりその全体が組み込まれる、Ｐｅｎｇ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ ２０１２；５１６：２７４によって説明されるように、運動協調性をロータロッドで調べた。動物は、９ｒｐｍで、ロータロッド（ＩＩＴＣ Ｓｅｒｉｅｓ８、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｗｏｏｄｌａｎｄ Ｈｉｌｌｓ、ＣＡ）上で６０秒のトレーニングトライアルを２回受け、トライアルの間隔は、３０分であった。次に、マウスは、４～４０ｒｐｍの可変速度で最大１２０秒間、試験トライアルを３回行い、トライアルの間隔は、６０分であった。ロータロッドに費やされた時間は、各マウスについて記録された。
鼻腔内ダントロレン（５ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝１０）またはビヒクル（等価用量、ｎ＝１０）のいずれかを１日１回、週に３回、４ヶ月間投与されたマウスの別のコホートにおいて、参照によりその全体が組み込まれる、Ｐｅｎｇ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ ２０１２；５１６：２７４によって説明されるように、運動協調性をロータロッドで調べた。動物は、９ｒｐｍで、ロータロッド（ＩＩＴＣ Ｓｅｒｉｅｓ８、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｗｏｏｄｌａｎｄ Ｈｉｌｌｓ、ＣＡ）上で６０秒のトレーニングトライアルを２回受け、トライアルの間隔は、３０分であった。次に、マウスは、４～４０ｒｐｍの可変速度で最大１２０秒間、試験トライアルを３回行い、トライアルの間隔は、６０分であった。ロータロッドに費やされた時間は、各マウスについて記録された。
統計分析
ダントロレン濃度を測定し、平均±ＳＥＭとして報告し、スチューデントのｔ検定（両側）または一元配置分散分析と、それに続くテューキー事後解析で分析した。この研究のすべての分析の有意水準は、９５％に設定された（Ｐ＜０．０５）。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）をすべての統計分析に使用した。
ダントロレン濃度を測定し、平均±ＳＥＭとして報告し、スチューデントのｔ検定（両側）または一元配置分散分析と、それに続くテューキー事後解析で分析した。この研究のすべての分析の有意水準は、９５％に設定された（Ｐ＜０．０５）。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）をすべての統計分析に使用した。
結果
鼻腔内ダントロレン投与は、脳内におけるそのピーク濃度および持続時間を増加させた
ダントロレンの薬物動態は、経口および鼻腔内投与後の血漿と脳の両方で比較した。鼻経路からのダントロレンの全身吸収は、経口からの吸収よりもわずかに速かった（図１０Ａ、１０Ｃ）。鼻腔内投与後の血漿と脳の両方におけるピークダントロレン濃度は、経口経路後のものよりも有意に高かった（図１０Ａ、１０Ｃ）。血漿ダントロレン濃度は、経口投与後約７０分で有意に減少したが、鼻腔内投与後は比較的高く維持された（図１０Ａ）。同様に、脳内のダントロレン濃度は、経口投与（図１０Ｃ、約７０分）よりも、鼻腔内投与後（図１０Ｃ、１８０分）に著しく長い期間、比較的高いレベルのままであった。したがって、血漿と脳の両方における統合されたダントロレン曝露は、経口投与後よりも鼻腔内投与後に有意に高かった（図１０Ｂ、１０Ｄ）。
鼻腔内ダントロレン投与は、脳内におけるそのピーク濃度および持続時間を増加させた
ダントロレンの薬物動態は、経口および鼻腔内投与後の血漿と脳の両方で比較した。鼻経路からのダントロレンの全身吸収は、経口からの吸収よりもわずかに速かった（図１０Ａ、１０Ｃ）。鼻腔内投与後の血漿と脳の両方におけるピークダントロレン濃度は、経口経路後のものよりも有意に高かった（図１０Ａ、１０Ｃ）。血漿ダントロレン濃度は、経口投与後約７０分で有意に減少したが、鼻腔内投与後は比較的高く維持された（図１０Ａ）。同様に、脳内のダントロレン濃度は、経口投与（図１０Ｃ、約７０分）よりも、鼻腔内投与後（図１０Ｃ、１８０分）に著しく長い期間、比較的高いレベルのままであった。したがって、血漿と脳の両方における統合されたダントロレン曝露は、経口投与後よりも鼻腔内投与後に有意に高かった（図１０Ｂ、１０Ｄ）。
鼻腔内ダントロレンは、時間依存的に血液脳関門（ＢＢＢ）を渡るその通過に影響を与える
鼻腔内ダントロレンが、ＢＢＢを渡るダントロレンの通過を実際に増加させたかどうかを調べるために、脳／血漿ダントロレン濃度比を比較した。ダントロレン血漿中濃度は、経口投与後７０分でゼロに近いため、投与後１２０分前の時点でのダントロレン脳／血漿濃度比のみを調べて比較し、それは、血漿中と脳内ダントロレン濃度の両方が投与後１２０分でゼロに達したためであった（図１０Ａ、１０Ｃ）。経口投与後のダントロレンの脳／血漿比は、ほとんどの時点で鼻腔内アプローチ後と比較的同じであった（図１１）。しかしながら、鼻腔内投与後の脳ダントロレンは、鼻腔内投与後１２０分で比較的高いままであり、それは、血漿と脳ダントロレン濃度の両方が経口投与後１２０分でゼロに達したためであったが、鼻腔内投与後１５０分でまだある一定のレベルを維持した（図１０Ａ、１０Ｃ）。
鼻腔内ダントロレンが、ＢＢＢを渡るダントロレンの通過を実際に増加させたかどうかを調べるために、脳／血漿ダントロレン濃度比を比較した。ダントロレン血漿中濃度は、経口投与後７０分でゼロに近いため、投与後１２０分前の時点でのダントロレン脳／血漿濃度比のみを調べて比較し、それは、血漿中と脳内ダントロレン濃度の両方が投与後１２０分でゼロに達したためであった（図１０Ａ、１０Ｃ）。経口投与後のダントロレンの脳／血漿比は、ほとんどの時点で鼻腔内アプローチ後と比較的同じであった（図１１）。しかしながら、鼻腔内投与後の脳ダントロレンは、鼻腔内投与後１２０分で比較的高いままであり、それは、血漿と脳ダントロレン濃度の両方が経口投与後１２０分でゼロに達したためであったが、鼻腔内投与後１５０分でまだある一定のレベルを維持した（図１０Ａ、１０Ｃ）。
鼻腔内ダントロレンの慢性使用は、嗅覚機能を害さなかった
ダントロレンの慢性鼻腔内投与による鼻膜損傷および嗅覚機能障害の可能性を調べるために、５ｍｇ／ｋｇの鼻腔内投与を週３回、３週間または４ヶ月後にマウスにおいて嗅覚機能試験を行った。鼻腔内ダントロレンは、嗅覚機能に影響を与えず、ダントロレンは、慢性鼻腔内投与後の嗅覚機能に著しい副作用を有さなかったことを示している（図１２）。
ダントロレンの慢性鼻腔内投与による鼻膜損傷および嗅覚機能障害の可能性を調べるために、５ｍｇ／ｋｇの鼻腔内投与を週３回、３週間または４ヶ月後にマウスにおいて嗅覚機能試験を行った。鼻腔内ダントロレンは、嗅覚機能に影響を与えず、ダントロレンは、慢性鼻腔内投与後の嗅覚機能に著しい副作用を有さなかったことを示している（図１２）。
Ｐ－ｇｐ／ＢＣＲＰ抑制は、脳内のダントロレン濃度を増加させなかった
Ｐ－ｇｐ／ＢＣＲＰ抑制剤であるニモジピンまたはエラクリダールがダントロレンの脳内濃度を上昇させるかどうかを調べた。ニモジピンもエラクリダールも、ダントロレン脳／ダントロレン血漿濃度比を有意に増加させなかった（図１３）。
Ｐ－ｇｐ／ＢＣＲＰ抑制剤であるニモジピンまたはエラクリダールがダントロレンの脳内濃度を上昇させるかどうかを調べた。ニモジピンもエラクリダールも、ダントロレン脳／ダントロレン血漿濃度比を有意に増加させなかった（図１３）。
この研究は、経口投与と比較して、鼻腔内ダントロレン投与が、ＲＹＡＮＯＤＥＸ（登録商標）配合物（Ｅａｇｌｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）を使用して、嗅覚、肝臓、または運動機能に明らかな副作用なしに、脳内のその濃度および持続時間を有意に増加させたことを示す。鼻腔内ダントロレンは、投与後の最初の７０分間、脳濃度対血漿濃度の比に有意差がなかったため、ＢＢＢを渡るその通過を増加させなかった。Ｐ－ｇｐ／ＢＣＲＰポンプの抑制剤は、ダントロレンの脳内濃度の変化に関与しなかった。したがって、ＡＤを含む様々な神経変性疾患の患者を治療するためのダントロレンの慢性使用は、実行可能であり、かつ忍容できる。鼻腔内ダントロレンは、一般的に使用される経口アプローチと比較して、ピーク脳濃度を有意に増加させ、ＡＤを含む様々な神経変性疾患を治療するための最小治療濃度にダントロレンを到達させる新しい方法を提供する。さらに、脳内のダントロレンの持続時間は、経口投与後よりも鼻腔内投与後の方がはるかに長く続き、脳内の全体的な曝露を有意に増加させた。全体的に脳のダントロレン曝露が増えると、脳卒中およびＡＤを含む様々な神経変性疾患でダントロレンの神経保護が成功する可能性が大幅に高まり、副作用が軽減される可能性がある。この研究の結果は、鼻腔内投与による脳濃度が、経口アプローチによる０ｎＭと比較して、１５０分で４７９ｎＭ（１５０．５３ｎｇ／ｇ）（図１０Ｃ）であったことを実証する。したがって、経口投与と比較して、神経保護に最低限必要な脳濃度に到達するための鼻腔内ダントロレンの比較的低用量が、重大な末梢副作用を最小限に抑えながら可能である。鼻腔内ダントロレン投与は、経口ダントロレン投与と関連するよりも低い血漿ダントロレン濃度と関連している。鼻腔内アプローチはまた、経口投与とは異なり、肝臓の初回通過代謝を回避する。これは、ＡＤを含む様々な神経変性疾患の治療およびそれにおける神経保護のための重要な新しい方法である。
この研究における鼻腔内ダントロレンは、最初の７０分間、経口アプローチと比較した場合、ＢＢＢを渡るその通過を増加させなかった。しかしながら、脳内のダントロレン濃度の持続時間が長いため、鼻腔内投与後１２０～１５０分のダントロレン血漿／脳濃度比は、計算できたが、血漿と脳の両方のダントロレン濃度がゼロに達したとき、経口アプローチ後は計算できなかった。本明細書におけるこの研究は、３週間のダントロレンの鼻腔内投与が、嗅覚機能に影響を与えず、最大４ヶ月の鼻腔内処置後にも運動機能に影響を与え、または明らかな副作用を引き起こさかったことを示す。これらの結果は、ダントロレンの慢性投与が比較的安全であり、ＡＤの治療に長期間使用されることを示す。ダントロレンの脳内濃度および持続時間を維持することができるが、血漿中濃度を低下させ得るこの新しい方法は、その慢性使用をより忍容できる、実用的なものにするであろう。
要約すると、ＲＹＡＮＯＤＥＸ（登録商標）配合物を使用する鼻腔内ダントロレン投与は、慢性使用後でもいかなる明らかな重大な副作用もなしに、脳のピーク濃度および持続時間を有意に増加させ、ＡＤおよびその中で現れた認識機能障害を治療することを含む、様々な神経変性疾患におけるダントロレン神経保護を増強させるための新しい潜在的なアプローチを提供する。
実施例３
アルツハイマー病の５ＸＦＡＤマウスにおける疾患修飾薬としての鼻腔内ダントロレン
この研究では、５ＸＦＡＤマウスにおいて、症状緩和薬としてだけではなく、疾患修飾薬として、鼻腔内ダントロレンの血漿および脳濃度ならびに治療効果、かつ関連する副作用を調査し、参照によりその全体が組み込まれる、Ｐｅｎｇ Ｊ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ ２０１２；５１６：２７４によって説明されるように、異なるＦＡＤ動物モデルにおいて行われたような皮下アプローチと比較した。
アルツハイマー病の５ＸＦＡＤマウスにおける疾患修飾薬としての鼻腔内ダントロレン
この研究では、５ＸＦＡＤマウスにおいて、症状緩和薬としてだけではなく、疾患修飾薬として、鼻腔内ダントロレンの血漿および脳濃度ならびに治療効果、かつ関連する副作用を調査し、参照によりその全体が組み込まれる、Ｐｅｎｇ Ｊ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ ２０１２；５１６：２７４によって説明されるように、異なるＦＡＤ動物モデルにおいて行われたような皮下アプローチと比較した。
材料および方法
動物
すべての手順は、ペンシルベニア大学の施設内動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認された。２対の５ＸＦＡＤマウス（Ｂ６ＳＪＬ－Ｔｇ（ＡＰＰＳｗＦＩＬ ｏｎ、ＰＳＥＮ１＊Ｍ１４６Ｌ＊ＬＶ２８６Ｖ）６７９９Ｖａｓ／Ｍｍｊａｘ）および野生型マウス（Ｂ６ＳＪＬＦ１／Ｊ）マウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）から購入し、飼育した。これらの５ＸＦＡＤトランスジェニックマウスは、参照によりその全体が組み込まれる、Ｏａｋｌｅｙ Ｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００６； ２６：１０１２９によって説明されるように、スウェーデン（Ｋ６７０Ｎ、Ｍ６７１Ｌ）、フロリダ（Ｉ７１６Ｖ）、およびロンドン（Ｖ７１７Ｉ）の家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）変異を伴う変異ヒトＡＰＰを、２つのＦＡＤ変異、Ｍ１４６ＬおよびＬ２８６Ｖを持つヒトＰＳ１と一緒に過剰発現する。参照によりその全体が組み込まれる、Ｈｉｌｌｍａｎｎ Ａ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ａｇｉｎｇ ２０１２；３３ ８３３によって説明されるように、５ＸＦＡＤマウスモデルは、攻撃的なＡＤ動物モデルであり、細胞内アミロイドが最初に月齢２ヶ月で現れ、認知機能障害が月齢６ヶ月で始まり、これは、薬効を試験するのに好適である。動物は、１２時間の光サイクルおよび制御された室温下で、ペンシルベニア大学の動物施設に収容された。餌と水は、ケージの中で利用可能であった。すべてのマウスは、月齢１ヶ月以内に離乳し、離乳前にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析によって遺伝的に同定した。このとき、マウスは、年齢および性別によって異なるケージに分けられ、ケージ当たり５匹以下であった。この研究では、オスとメスの両方のマウスを使用した。
動物
すべての手順は、ペンシルベニア大学の施設内動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認された。２対の５ＸＦＡＤマウス（Ｂ６ＳＪＬ－Ｔｇ（ＡＰＰＳｗＦＩＬ ｏｎ、ＰＳＥＮ１＊Ｍ１４６Ｌ＊ＬＶ２８６Ｖ）６７９９Ｖａｓ／Ｍｍｊａｘ）および野生型マウス（Ｂ６ＳＪＬＦ１／Ｊ）マウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）から購入し、飼育した。これらの５ＸＦＡＤトランスジェニックマウスは、参照によりその全体が組み込まれる、Ｏａｋｌｅｙ Ｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００６； ２６：１０１２９によって説明されるように、スウェーデン（Ｋ６７０Ｎ、Ｍ６７１Ｌ）、フロリダ（Ｉ７１６Ｖ）、およびロンドン（Ｖ７１７Ｉ）の家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）変異を伴う変異ヒトＡＰＰを、２つのＦＡＤ変異、Ｍ１４６ＬおよびＬ２８６Ｖを持つヒトＰＳ１と一緒に過剰発現する。参照によりその全体が組み込まれる、Ｈｉｌｌｍａｎｎ Ａ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ａｇｉｎｇ ２０１２；３３ ８３３によって説明されるように、５ＸＦＡＤマウスモデルは、攻撃的なＡＤ動物モデルであり、細胞内アミロイドが最初に月齢２ヶ月で現れ、認知機能障害が月齢６ヶ月で始まり、これは、薬効を試験するのに好適である。動物は、１２時間の光サイクルおよび制御された室温下で、ペンシルベニア大学の動物施設に収容された。餌と水は、ケージの中で利用可能であった。すべてのマウスは、月齢１ヶ月以内に離乳し、離乳前にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析によって遺伝的に同定した。このとき、マウスは、年齢および性別によって異なるケージに分けられ、ケージ当たり５匹以下であった。この研究では、オスとメスの両方のマウスを使用した。
鼻腔内対皮下ダントロレン投与および薬物濃度測定
ダントロレン投与
月齢２ヶ月のＷＴマウスをランダムに鼻腔内（Ｎ＝５）または皮下（Ｎ＝５）の群に分け、注射用滅菌水５ｍＬ中のマンニトール１２５ｍｇ、ポリソルベート８０ ２５ｍｇ、ポビドンＫ１２ ４ｍｇからなり、ｐＨを１０．３に調整した、ＲＹＡＮＯＤＥＸ（登録商標）（ダントロレンナトリウム、Ｅａｇｌｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）と同じビヒクルに溶解したダントロレンを投与した。ダントロレン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）は、鼻腔内投与または皮下投与のために、それぞれ５ｍｇ／ｍＬおよび１ｍｇ／ｍＬの濃度にビヒクルで希釈した。鼻腔内投与のために、マウスの首筋を片手で保持し、他方の手で、合計体重１グラム当たり１μＬのダントロレン溶液またはビヒクルを、ピペットを使用して送達した。例えば、体重２０ｇのマウスには、２０μｌの溶液を与えられていた。参照によりその全体が組み込まれる、Ｍｅｄ Ｌｅｔｔ Ｄｒｕｇｓ Ｔｈｅｒ．２０１５；５７：１００によって説明されるように、溶液は、ゆっくりとマウスの鼻に直接送達された。マウスへのストレスが最小限に抑えられ、それぞれの溶液が鼻腔内に留まり、胃や肺に入らないように注意が払われた。皮下ダントロレン投与は、参照によりその全体が組み込まれる、Ｐｅｎｇ Ｊ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ．２０１２；５１６：２７４によって以前に記載されたように、体重１グラム当たり５μｌの総皮下注射で行われた。
ダントロレン投与
月齢２ヶ月のＷＴマウスをランダムに鼻腔内（Ｎ＝５）または皮下（Ｎ＝５）の群に分け、注射用滅菌水５ｍＬ中のマンニトール１２５ｍｇ、ポリソルベート８０ ２５ｍｇ、ポビドンＫ１２ ４ｍｇからなり、ｐＨを１０．３に調整した、ＲＹＡＮＯＤＥＸ（登録商標）（ダントロレンナトリウム、Ｅａｇｌｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）と同じビヒクルに溶解したダントロレンを投与した。ダントロレン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）は、鼻腔内投与または皮下投与のために、それぞれ５ｍｇ／ｍＬおよび１ｍｇ／ｍＬの濃度にビヒクルで希釈した。鼻腔内投与のために、マウスの首筋を片手で保持し、他方の手で、合計体重１グラム当たり１μＬのダントロレン溶液またはビヒクルを、ピペットを使用して送達した。例えば、体重２０ｇのマウスには、２０μｌの溶液を与えられていた。参照によりその全体が組み込まれる、Ｍｅｄ Ｌｅｔｔ Ｄｒｕｇｓ Ｔｈｅｒ．２０１５；５７：１００によって説明されるように、溶液は、ゆっくりとマウスの鼻に直接送達された。マウスへのストレスが最小限に抑えられ、それぞれの溶液が鼻腔内に留まり、胃や肺に入らないように注意が払われた。皮下ダントロレン投与は、参照によりその全体が組み込まれる、Ｐｅｎｇ Ｊ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ．２０１２；５１６：２７４によって以前に記載されたように、体重１グラム当たり５μｌの総皮下注射で行われた。
ダントロレン濃度の測定
月齢２ヶ月の野生型マウスに、５ｍｇ／ｋｇの用量で皮下または鼻腔内ダントロレンを１回投与した。血漿または脳組織は、上記のＰｅｎｇ Ｊらによって説明されるように、薬物投与の２０分後または６０分後に得た。血漿または脳のダントロレン濃度は、上記のＰｅｎｇ Ｊらによって説明されるように、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ Ｍｏｄｅｌ１１００シリーズおよび方法を使用して、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって決定された。簡単に説明すると、凍結した脳組織を２００μｌの混合溶液（アセトニトリル：Ｈ２Ｏ、２：１）に入れてホモジナイズし、次いで、懸濁液を４・１６１Ｃａｔ ２０，０００×ｇで２０分間遠心分離し、５０μｌの上清を分析のためにＨＰＬＣに注入した。アセトニトリルを移動相の成分Ａとして使用し、リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を成分Ｂとして使用した。移動相の流量は、１．０ｍＬ／分で、移動相の成分ＡおよびＢの比率は、それぞれ１２％～８８％であった。検出は、２５４ｎｍのＵＶ検出器を使用して行われた。タンパク質は、脳または血漿から沈殿されなかった。
月齢２ヶ月の野生型マウスに、５ｍｇ／ｋｇの用量で皮下または鼻腔内ダントロレンを１回投与した。血漿または脳組織は、上記のＰｅｎｇ Ｊらによって説明されるように、薬物投与の２０分後または６０分後に得た。血漿または脳のダントロレン濃度は、上記のＰｅｎｇ Ｊらによって説明されるように、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ Ｍｏｄｅｌ１１００シリーズおよび方法を使用して、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって決定された。簡単に説明すると、凍結した脳組織を２００μｌの混合溶液（アセトニトリル：Ｈ２Ｏ、２：１）に入れてホモジナイズし、次いで、懸濁液を４・１６１Ｃａｔ ２０，０００×ｇで２０分間遠心分離し、５０μｌの上清を分析のためにＨＰＬＣに注入した。アセトニトリルを移動相の成分Ａとして使用し、リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を成分Ｂとして使用した。移動相の流量は、１．０ｍＬ／分で、移動相の成分ＡおよびＢの比率は、それぞれ１２％～８８％であった。検出は、２５４ｎｍのＵＶ検出器を使用して行われた。タンパク質は、脳または血漿から沈殿されなかった。
ダントロレン処置および実験群
この研究では、年齢を一致させたオスとメスの両方のマウスを使用した。すべてのマウスは、月齢約１ヶ月で遺伝子型が決定されたときに、ランダムに１２の群に分けられた。最初の８つの群は、早期処置群（ＥＴＧ、図１４を参照）と名付け、それは、これらの群の処置は、原発性アミロイド病理が発症して認知機能障害が現れる前である、動物が月齢２ヶ月のときに開始されたためである。次の４つの群は、後期処置群（ＬＴＧ、図１４を参照）と名付け、それは、ダントロレンを疾患修飾薬として決定するために、アミロイド病態と認知機能障害の発症後かなり経った、動物が月齢６ヶ月のときに、ダントロレン処置を開始したためである。異なる処置群の動物は、鼻腔内ダントロレン（ＩＮ－ＤＡＮ）、皮下ダントロレン（ＳＱ－ＤＡＮ）、鼻腔内対照ビヒクル（ＩＮ－ＶＥＨ）、または無処置（ＣＯＮ、陰性対照）を受けた。ＥＴＧの動物は、細胞内アミロイド病変およびいかなる認知機能障害の発症前に、月齢２ヶ月から処置（月曜日、水曜日、および金曜日）した。後期処置群（ＬＴＧ）、鼻腔内ダントロレン（ＩＮ－ＤＡＮ）、および皮下ダントロレン（ＳＱ－ＤＡＮ）は、細胞外アミロイド斑の蓄積および認知機能障害の発症後かなり経った、月齢６ヶ月で同じ処置を開始した。対照ビヒクルは、新鮮に作られ、Ｒｙａｎｏｄｅｘ、Ｍｅｄ Ｌｅｔｔ Ｄｒｕｇｓ Ｔｈｅｒ．２０１５；５７：１００のすべての不活性成分を含有した。それぞれ、５ｍｇ／ｍＬまたは１ｍｇ／ｍＬの用量レベルの新鮮なダントロレンを使用した。鼻腔内（５ｍｇ／ｍＬ）および皮下（１ｍｇ／ｍＬ）投与用のビヒクルを投与する前に、毎回新鮮なダントロレン溶液を作製した。すべてのマウスは、月齢１２ヶ月で安楽死させるまで処置を受け続けた。
この研究では、年齢を一致させたオスとメスの両方のマウスを使用した。すべてのマウスは、月齢約１ヶ月で遺伝子型が決定されたときに、ランダムに１２の群に分けられた。最初の８つの群は、早期処置群（ＥＴＧ、図１４を参照）と名付け、それは、これらの群の処置は、原発性アミロイド病理が発症して認知機能障害が現れる前である、動物が月齢２ヶ月のときに開始されたためである。次の４つの群は、後期処置群（ＬＴＧ、図１４を参照）と名付け、それは、ダントロレンを疾患修飾薬として決定するために、アミロイド病態と認知機能障害の発症後かなり経った、動物が月齢６ヶ月のときに、ダントロレン処置を開始したためである。異なる処置群の動物は、鼻腔内ダントロレン（ＩＮ－ＤＡＮ）、皮下ダントロレン（ＳＱ－ＤＡＮ）、鼻腔内対照ビヒクル（ＩＮ－ＶＥＨ）、または無処置（ＣＯＮ、陰性対照）を受けた。ＥＴＧの動物は、細胞内アミロイド病変およびいかなる認知機能障害の発症前に、月齢２ヶ月から処置（月曜日、水曜日、および金曜日）した。後期処置群（ＬＴＧ）、鼻腔内ダントロレン（ＩＮ－ＤＡＮ）、および皮下ダントロレン（ＳＱ－ＤＡＮ）は、細胞外アミロイド斑の蓄積および認知機能障害の発症後かなり経った、月齢６ヶ月で同じ処置を開始した。対照ビヒクルは、新鮮に作られ、Ｒｙａｎｏｄｅｘ、Ｍｅｄ Ｌｅｔｔ Ｄｒｕｇｓ Ｔｈｅｒ．２０１５；５７：１００のすべての不活性成分を含有した。それぞれ、５ｍｇ／ｍＬまたは１ｍｇ／ｍＬの用量レベルの新鮮なダントロレンを使用した。鼻腔内（５ｍｇ／ｍＬ）および皮下（１ｍｇ／ｍＬ）投与用のビヒクルを投与する前に、毎回新鮮なダントロレン溶液を作製した。すべてのマウスは、月齢１２ヶ月で安楽死させるまで処置を受け続けた。
埋没食品試験
嗅覚機能は、参照によりその全体が組み込まれる、Ｙａｎｇ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００９；４８：８．２４によって説明されるように、埋没食品試験の３日間のプロトコルを使用して月齢８ヶ月ですべての群において評価された。
嗅覚機能は、参照によりその全体が組み込まれる、Ｙａｎｇ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００９；４８：８．２４によって説明されるように、埋没食品試験の３日間のプロトコルを使用して月齢８ヶ月ですべての群において評価された。
初日、マウスを一般的な状況下で飼育ケージに入れ、クッキー（Ｇａｌｌｅｔａｓ Ｌａ Ｍｏｄｅｒｎａ、ＳＡ ｄｅ ＣＶ；２匹のマウスに対して１つのクッキー）をケージのベッドの下に２４時間埋め、次に消費されたクッキーの数を記録した。マウスは、２日目の午後４時に始まり、３日目の午前９時に終わるように絶食させた。この間、水は自由に利用可能であった。
埋没食品試験は、３日目の午前９時から１１時頃に実施した。試験前に少なくとも１時間、試験室に順応させた。マウスを、清潔なベッドが入っている清潔なケージに個別に入れ、隅のベッドの下に１つのクッキーを埋めた。動物がクッキーを見つけるまでの待ち時間（前足でクッキーを捕まえると認識された）を手動で記録した。動物が１５分以内にクッキーを見つけられなかった場合、それをホームケージに戻した。清潔なケージおよびベッドを各動物に使用し、調査員は、実験条件を知らされていなかった。
ロータロッド試験
筋弛緩薬としてのダントロレンの一般的な副作用である筋力低下を検出するために、運動機能を調べた。加速ロータロッド（ＩＩＴＣシリーズ８、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｗｏｏｄｌａｎｄ Ｈｉｌｌｓ、ＣＡ）に費やされた時間は、上記のＰｅｎｇ Ｊらによって説明されるように、月齢６ヶ月のＥＴＧのマウス（データは表示されていない）および月齢９ヶ月のすべての群について評価された。簡単に言えば、動物は、試験前、少なくとも１時間前、試験室に順応させた。一定速度（９ｒｐｍ）での６０秒のトレーニングトライアルを２回、３０分間隔で行った。次に、１２０秒の試験トライアルを３回、徐々に増加する速度（４～４０ｒｐｍ）で、トライアルの間隔を６０分にして実施した。ロータロッドから落下するまでの待ち時間は、自動的に記録され、分析された。
筋弛緩薬としてのダントロレンの一般的な副作用である筋力低下を検出するために、運動機能を調べた。加速ロータロッド（ＩＩＴＣシリーズ８、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｗｏｏｄｌａｎｄ Ｈｉｌｌｓ、ＣＡ）に費やされた時間は、上記のＰｅｎｇ Ｊらによって説明されるように、月齢６ヶ月のＥＴＧのマウス（データは表示されていない）および月齢９ヶ月のすべての群について評価された。簡単に言えば、動物は、試験前、少なくとも１時間前、試験室に順応させた。一定速度（９ｒｐｍ）での６０秒のトレーニングトライアルを２回、３０分間隔で行った。次に、１２０秒の試験トライアルを３回、徐々に増加する速度（４～４０ｒｐｍ）で、トライアルの間隔を６０分にして実施した。ロータロッドから落下するまでの待ち時間は、自動的に記録され、分析された。
恐怖条件付け試験
記憶および学習は、ＥＴＧでは月齢６ヶ月と１１ヶ月で評価されたが、ＬＴＧでは月齢１１ヶ月でのみ評価された。海馬依存性と非依存性の両方の記憶を、参照によりその全体が組み込まれる、Ｚｈａｎｇ Ｙ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ ２０１２；７１：６８７によって説明されるように、恐怖条件付け試験を使用して評価した。動物は、試験室に順応させるために、試験の少なくとも１時間前に試験室に運ばれた。最初の試験日に、各マウスを試験チャンバーに入れ、各サイクルの間に６０秒間隔で３つの条件刺激ペアリングを経験させた。２０００Ｈｚ、８５ｄＢの３０秒の音を音刺激として使用し、０．７ｍＡの２秒の電気足衝撃を衝撃刺激として使用した。最後の刺激の３０秒後にマウスをチャンバーから取り出した。２日目には、海馬依存性記憶を測定するために、文脈的恐怖条件付け試験を最初に行った。マウスを、緊張または衝撃を与えずに６分間、同じチャンバーに入れ、その後、チャンバーから取り出した。２時間後、海馬非依存性記憶を測定するために、手がかり恐怖条件付け試験を行った。マウスを、異なる洗浄液を使用したサイズおよび匂いが異なる別のチャンバーに入れた。最初の３分間は、音または衝撃はなかった。その後、マウスは、各サイクルの間に６０秒間隔で３サイクルの同じ音を体験させ、動けない時間を記録した。次に、最後の音の６０秒後に動物をチャンバーから取り出した。ＡＮＹ迷路制御恐怖条件付けシステムは、ビデオカメラおよびＡＮＹ迷路ソフトウェア（Ｖ．４．９９ Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ Ｃｏ． Ｗｏｏｄ Ｄａｌｅ、ＩＬ）を備える音響減衰チャンバー（モデル：４６０００－５９０、ＵＧＯ Ｂａｓｉｌｅ、Ｇｅｍｏｎｉｏ Ｉｔａｌｙ）で構成され、これにより、動けない時間を記録した。チャンバーは、トレーニングトライアルの初日および文脈的恐怖条件付け試験の２日目に７５％のアルコール溶液で、および手がかり恐怖条件付け試験の２日目に水で、トライアルの間に徹底的に洗浄された。調査員は、処置群を知らされていなかった。
記憶および学習は、ＥＴＧでは月齢６ヶ月と１１ヶ月で評価されたが、ＬＴＧでは月齢１１ヶ月でのみ評価された。海馬依存性と非依存性の両方の記憶を、参照によりその全体が組み込まれる、Ｚｈａｎｇ Ｙ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ ２０１２；７１：６８７によって説明されるように、恐怖条件付け試験を使用して評価した。動物は、試験室に順応させるために、試験の少なくとも１時間前に試験室に運ばれた。最初の試験日に、各マウスを試験チャンバーに入れ、各サイクルの間に６０秒間隔で３つの条件刺激ペアリングを経験させた。２０００Ｈｚ、８５ｄＢの３０秒の音を音刺激として使用し、０．７ｍＡの２秒の電気足衝撃を衝撃刺激として使用した。最後の刺激の３０秒後にマウスをチャンバーから取り出した。２日目には、海馬依存性記憶を測定するために、文脈的恐怖条件付け試験を最初に行った。マウスを、緊張または衝撃を与えずに６分間、同じチャンバーに入れ、その後、チャンバーから取り出した。２時間後、海馬非依存性記憶を測定するために、手がかり恐怖条件付け試験を行った。マウスを、異なる洗浄液を使用したサイズおよび匂いが異なる別のチャンバーに入れた。最初の３分間は、音または衝撃はなかった。その後、マウスは、各サイクルの間に６０秒間隔で３サイクルの同じ音を体験させ、動けない時間を記録した。次に、最後の音の６０秒後に動物をチャンバーから取り出した。ＡＮＹ迷路制御恐怖条件付けシステムは、ビデオカメラおよびＡＮＹ迷路ソフトウェア（Ｖ．４．９９ Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ Ｃｏ． Ｗｏｏｄ Ｄａｌｅ、ＩＬ）を備える音響減衰チャンバー（モデル：４６０００－５９０、ＵＧＯ Ｂａｓｉｌｅ、Ｇｅｍｏｎｉｏ Ｉｔａｌｙ）で構成され、これにより、動けない時間を記録した。チャンバーは、トレーニングトライアルの初日および文脈的恐怖条件付け試験の２日目に７５％のアルコール溶液で、および手がかり恐怖条件付け試験の２日目に水で、トライアルの間に徹底的に洗浄された。調査員は、処置群を知らされていなかった。
モリス水迷路
モリス水迷路（ＭＷＭ）も使用して、月齢１１ヶ月のすべての群に対して学習および記憶を測定した。簡単に説明すると、水で満たされた直径１．５ｍのプールおよび１５ｃｍのプラットフォームを、試験全体を通して使用した。水を二酸化チタンで不透明にし、温度を２１～２４℃に制御した。最初の５日間（１日目～５日目）、マウスは、４日間の手がかりトライアルを経験した。プールを白いカーテンによって囲み、プラットフォームを水面下１～１．５ｃｍに沈め、上部にマウスの手がかりとして旗を立てた。プラットフォームの位置および開始点は、手がかりトライアル中、ランダムであった。マウスがプールからプラットフォームに逃げたとき、１５秒間そこに留まらせた。マウスがプラットフォームを見つけられなかった場合、実験者は、マウスをプラットフォームにそっと誘導した。各マウスがプラットフォームを見つけるまでの待ち時間を記録した。次の５日間（６日目～１０日目）、動物は、毎日４回の場所トライアルを経験した。カーテンおよびプラットフォームを取り外した。壁にはいくつかの視覚的な手がかりがあった。プラットフォームの場所は、固定されており、開始点は、ランダムであった。それ以来、試験室の状況は、一定に保たれた。手がかりトライアルと同様に、マウスは、プールから取り出す前に１５秒間プラットフォーム上に留まるか、または、６０秒以内にプラットフォームが見つからなかった場合は、マウスをプラットフォームに誘導した。各マウスがプラットフォームを見つけるまでの待ち時間を記録した。マウスは、プラットフォームを取り外した日である翌日（１１日目）に、プローブトライアルを経験した。開始点は、プラットフォームが配置されていた場所とは反対の象限に固定した。各マウスが各象限で費やした時間を記録した。反対側の象限と比較した、各マウスが標的象限で費やした時間の比率を計算した。
モリス水迷路（ＭＷＭ）も使用して、月齢１１ヶ月のすべての群に対して学習および記憶を測定した。簡単に説明すると、水で満たされた直径１．５ｍのプールおよび１５ｃｍのプラットフォームを、試験全体を通して使用した。水を二酸化チタンで不透明にし、温度を２１～２４℃に制御した。最初の５日間（１日目～５日目）、マウスは、４日間の手がかりトライアルを経験した。プールを白いカーテンによって囲み、プラットフォームを水面下１～１．５ｃｍに沈め、上部にマウスの手がかりとして旗を立てた。プラットフォームの位置および開始点は、手がかりトライアル中、ランダムであった。マウスがプールからプラットフォームに逃げたとき、１５秒間そこに留まらせた。マウスがプラットフォームを見つけられなかった場合、実験者は、マウスをプラットフォームにそっと誘導した。各マウスがプラットフォームを見つけるまでの待ち時間を記録した。次の５日間（６日目～１０日目）、動物は、毎日４回の場所トライアルを経験した。カーテンおよびプラットフォームを取り外した。壁にはいくつかの視覚的な手がかりがあった。プラットフォームの場所は、固定されており、開始点は、ランダムであった。それ以来、試験室の状況は、一定に保たれた。手がかりトライアルと同様に、マウスは、プールから取り出す前に１５秒間プラットフォーム上に留まるか、または、６０秒以内にプラットフォームが見つからなかった場合は、マウスをプラットフォームに誘導した。各マウスがプラットフォームを見つけるまでの待ち時間を記録した。マウスは、プラットフォームを取り外した日である翌日（１１日目）に、プローブトライアルを経験した。開始点は、プラットフォームが配置されていた場所とは反対の象限に固定した。各マウスが各象限で費やした時間を記録した。反対側の象限と比較した、各マウスが標的象限で費やした時間の比率を計算した。
組織の調製
すべての行動試験が終了した後、月齢１１～１２ヶ月でマウスを犠牲にした。前述のように、動物は、ノーズコーンを介して送達された２～４％のイソフルランで麻酔し、濃度は、動物の反応に従って調整された。３０Ｇの針を備える注射器を使用して、心臓から血液を採取した。血液を３０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離し、上澄みを収集し、－８０℃で凍結した。濃度研究に使用する場合、血漿試料を光から保護した。肝臓および脳を摘出する前に、冷たいリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）による経心臓灌流を行った。脳濃度研究のために、光から保護され、－８０℃で凍結された脳全体を解剖した。ダントロレン処置群では、肝臓および脳を解剖した。肝臓および脳の左半分を４％のパラホルムアルデヒドで、４℃にて一晩後固定し、切片化のためにパラフィン包埋した。各群からのいくつかの動物は、免疫組織化学的および組織学的および研究のために、切片化されるようにランダムに選択し、各評価のための動物の正確な数が各図の凡例に示されている。脳の右半分は、生化学的アッセイのために－８０℃で凍結された。
すべての行動試験が終了した後、月齢１１～１２ヶ月でマウスを犠牲にした。前述のように、動物は、ノーズコーンを介して送達された２～４％のイソフルランで麻酔し、濃度は、動物の反応に従って調整された。３０Ｇの針を備える注射器を使用して、心臓から血液を採取した。血液を３０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離し、上澄みを収集し、－８０℃で凍結した。濃度研究に使用する場合、血漿試料を光から保護した。肝臓および脳を摘出する前に、冷たいリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）による経心臓灌流を行った。脳濃度研究のために、光から保護され、－８０℃で凍結された脳全体を解剖した。ダントロレン処置群では、肝臓および脳を解剖した。肝臓および脳の左半分を４％のパラホルムアルデヒドで、４℃にて一晩後固定し、切片化のためにパラフィン包埋した。各群からのいくつかの動物は、免疫組織化学的および組織学的および研究のために、切片化されるようにランダムに選択し、各評価のための動物の正確な数が各図の凡例に示されている。脳の右半分は、生化学的アッセイのために－８０℃で凍結された。
免疫組織化学染色
上記のＰｅｎｇ，Ｊら、２０１２に記載されるように、パラフィン包埋冠状脳切片（１０μｍ）を免疫組織化学染色のために作製した。簡単に説明すると、切片を脱パラフィンし、水和させた。圧力鍋内の抗原脱マスキング溶液で抗原賦活化を行った。次に、切片を、１０％の正常ヤギ血清（ＮＧＳ）で３０分間、ＭＯＭマウスＩｇブロッキング試薬（ＰＫ－２２００、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂ）で１時間、およびＭＯＭ希釈液で５分間連続してインキュベートした。スライドを、一次抗体である抗６Ｅ１０（１：５００、８０３００１、Ｂｉｏ Ｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）と４℃で一晩インキュベートし、続いてＭＯＭビオチン化抗マウスＩｇＧ試薬（ＰＫ－２２００、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂ）と１０分間およびＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ ＡＢＣ試薬と５分間、それぞれインキュベートした。次に、切片を脱水し、Ｐｅｒｍｏｕｎｔでカバースリップした。すべての画像は、Ｑ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｒｅｔｉｇａ２０００ＲデジタルカメラおよびｉＶｉｓｉｏｎイメージングソフトウェア（Ｂｉｏ Ｖｉｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｅｘｔｏｎ、ＰＡ）を備えるＯｌｙｍｐｕｓ（ＢＸ５１Ｗ１）顕微鏡で撮影した。面積当たりの細胞数は、群を知らされていない調査員によって、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを使用して定量化した。海馬全体および歯状回における面積当たりの斑の数および斑が占める面積の割合を計算した。
上記のＰｅｎｇ，Ｊら、２０１２に記載されるように、パラフィン包埋冠状脳切片（１０μｍ）を免疫組織化学染色のために作製した。簡単に説明すると、切片を脱パラフィンし、水和させた。圧力鍋内の抗原脱マスキング溶液で抗原賦活化を行った。次に、切片を、１０％の正常ヤギ血清（ＮＧＳ）で３０分間、ＭＯＭマウスＩｇブロッキング試薬（ＰＫ－２２００、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂ）で１時間、およびＭＯＭ希釈液で５分間連続してインキュベートした。スライドを、一次抗体である抗６Ｅ１０（１：５００、８０３００１、Ｂｉｏ Ｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）と４℃で一晩インキュベートし、続いてＭＯＭビオチン化抗マウスＩｇＧ試薬（ＰＫ－２２００、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂ）と１０分間およびＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ ＡＢＣ試薬と５分間、それぞれインキュベートした。次に、切片を脱水し、Ｐｅｒｍｏｕｎｔでカバースリップした。すべての画像は、Ｑ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｒｅｔｉｇａ２０００ＲデジタルカメラおよびｉＶｉｓｉｏｎイメージングソフトウェア（Ｂｉｏ Ｖｉｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｅｘｔｏｎ、ＰＡ）を備えるＯｌｙｍｐｕｓ（ＢＸ５１Ｗ１）顕微鏡で撮影した。面積当たりの細胞数は、群を知らされていない調査員によって、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを使用して定量化した。海馬全体および歯状回における面積当たりの斑の数および斑が占める面積の割合を計算した。
ウエスタンブロット法
シナプス密度は、上記のＰｅｎｇ，Ｊら、２０１２によって記載されるように、ウエスタンブロット分析による、特定のタンパク質の発現によって評価された。簡単に説明すると、試料を、タンパク質抑制剤を含有する氷冷したＲＩＰＡで溶解した。タンパク質の濃度は、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）キット（２３２２７、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して測定された。４×ローディング緩衝液とのｄｄＨ２Ｏとの各タンパク質の混合物を、同じ体積の混合物および同量のタンパク質を達成するようにそれぞれ作製した。等量の試料をＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動に装填し、ニトロセルロース膜に移した。膜を、５％の脱脂乳と、室温で１時間インキュベートし、続いて、一次抗体ＰＳＤ９５（１：５００、８１０４０１、Ｂｉｏ Ｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、シナプシン１（１：５００、５１５２００、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）、およびβ－アクチン（１：２０００、Ａ５４４１、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）と、それぞれ４℃で一晩インキュベートした。膜を、関連する二次抗体と、室温で１時間インキュベートした。ブロットは、強化された化学発光検出システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ， ＭＡ）を使用して検出された。β－アクチンに正規化された標的タンパク質の密度は、ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を使用して計算された。
シナプス密度は、上記のＰｅｎｇ，Ｊら、２０１２によって記載されるように、ウエスタンブロット分析による、特定のタンパク質の発現によって評価された。簡単に説明すると、試料を、タンパク質抑制剤を含有する氷冷したＲＩＰＡで溶解した。タンパク質の濃度は、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）キット（２３２２７、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して測定された。４×ローディング緩衝液とのｄｄＨ２Ｏとの各タンパク質の混合物を、同じ体積の混合物および同量のタンパク質を達成するようにそれぞれ作製した。等量の試料をＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動に装填し、ニトロセルロース膜に移した。膜を、５％の脱脂乳と、室温で１時間インキュベートし、続いて、一次抗体ＰＳＤ９５（１：５００、８１０４０１、Ｂｉｏ Ｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、シナプシン１（１：５００、５１５２００、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）、およびβ－アクチン（１：２０００、Ａ５４４１、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）と、それぞれ４℃で一晩インキュベートした。膜を、関連する二次抗体と、室温で１時間インキュベートした。ブロットは、強化された化学発光検出システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ， ＭＡ）を使用して検出された。β－アクチンに正規化された標的タンパク質の密度は、ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を使用して計算された。
血漿ＡＬＴ活性評価
肝機能の指標である血漿ＡＬＴ活性は、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）活性比色分析キット（Ｋ７５２、Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ（Ｍｉｌｐｉｔａｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）をメーカーの指示に従って使用して測定された。最も長い時間（１１ヶ月）ダントロレンで処置されたＥＴＧおよびＬＧＴについて血漿ＡＬＴ活性を測定した。簡単に説明すると、１０μＬの血漿を、８６μｌのＡＬＴアッセイ緩衝液、２μｌのＯｘｉＲｅｄプローブ、２μｌのＡＬＴ酵素ミックス、および１０μｌのＡＬＴ基質を含む合計１００μＬの反応ミックスで希釈して、アラニンによりα－ケトグルタル酸から変換されたピルビン酸を分析した。ピルビン酸標準曲線を、０、２、４、６、８、１０ｎｍｏｌ／ウェルのピルビン酸濃度を使用して同時に生成した。５７０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）を、反応物を３７℃でインキュベートした１０分後（Ａ１）に、再度６０分後（Ａ２）に測定した。ピルビン酸濃度は、標準曲線の直線範囲で測定された。ＡＬＴ活性は、ＡＬＴ活性＝（Ａ２－Ａ１）／５０＊１０ｍＵ／ｍＬの式を使用して計算された。
肝機能の指標である血漿ＡＬＴ活性は、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）活性比色分析キット（Ｋ７５２、Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ（Ｍｉｌｐｉｔａｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）をメーカーの指示に従って使用して測定された。最も長い時間（１１ヶ月）ダントロレンで処置されたＥＴＧおよびＬＧＴについて血漿ＡＬＴ活性を測定した。簡単に説明すると、１０μＬの血漿を、８６μｌのＡＬＴアッセイ緩衝液、２μｌのＯｘｉＲｅｄプローブ、２μｌのＡＬＴ酵素ミックス、および１０μｌのＡＬＴ基質を含む合計１００μＬの反応ミックスで希釈して、アラニンによりα－ケトグルタル酸から変換されたピルビン酸を分析した。ピルビン酸標準曲線を、０、２、４、６、８、１０ｎｍｏｌ／ウェルのピルビン酸濃度を使用して同時に生成した。５７０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）を、反応物を３７℃でインキュベートした１０分後（Ａ１）に、再度６０分後（Ａ２）に測定した。ピルビン酸濃度は、標準曲線の直線範囲で測定された。ＡＬＴ活性は、ＡＬＴ活性＝（Ａ２－Ａ１）／５０＊１０ｍＵ／ｍＬの式を使用して計算された。
肝臓の病理学的評価
肝臓切片（５μｍ）を病理学的評価のために画像化した。各ＥＴＧから３匹の動物（１匹の動物当たり３つの切片）を病理評価のためにランダムに選択し、スライドは、調査員に知らせなかった。切片をヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色し、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５１Ｗ１顕微鏡で画像化した。切片は、急性または慢性肝炎、炎症、線維症、壊死、肝硬変、胆汁うっ滞、および非特異性肝細胞異常などの肝障害について評価された。
肝臓切片（５μｍ）を病理学的評価のために画像化した。各ＥＴＧから３匹の動物（１匹の動物当たり３つの切片）を病理評価のためにランダムに選択し、スライドは、調査員に知らせなかった。切片をヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色し、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５１Ｗ１顕微鏡で画像化した。切片は、急性または慢性肝炎、炎症、線維症、壊死、肝硬変、胆汁うっ滞、および非特異性肝細胞異常などの肝障害について評価された。
統計分析
各群の動物の数は、Ｐｅｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ Ｄｅｍｅｎｔ ７：ｅ６７によって以前に説明されたように決定し、各図の凡例に列挙する。統計分析は、Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ８．０によって行われ、各図の凡例に列挙される。ＡＮＯＶＡによる反復測定は、死亡率のために必ずしも可能ではなかった。データは、９５％ＣＩの平均として表される。ｐ値が０．０５以下の場合、統計的に有意な差として受け入れた。（Ｐ＜０．０５）。
各群の動物の数は、Ｐｅｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ Ｄｅｍｅｎｔ ７：ｅ６７によって以前に説明されたように決定し、各図の凡例に列挙する。統計分析は、Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ８．０によって行われ、各図の凡例に列挙される。ＡＮＯＶＡによる反復測定は、死亡率のために必ずしも可能ではなかった。データは、９５％ＣＩの平均として表される。ｐ値が０．０５以下の場合、統計的に有意な差として受け入れた。（Ｐ＜０．０５）。
鼻腔内ダントロレンは、皮下投与と比較して、血液脳関門（ＢＢＢ）通過および脳濃度を増加させた。
全身投与後に観察されたダントロレンの限られたＢＢＢ透過性は、薬剤の使用および潜在的な有効性を制限した。この研究における鼻腔内ダントロレン投与は、皮下アプローチと比較して、投与後２０分で測定された、より低い血漿濃度をもたらした（図１５Ａを参照）。対照的に、鼻腔内ダントロレン投与は、投与後６０分で皮下投与よりもかなり高い脳濃度をもたらした（図１５Ｂを参照）。組み合わせて、ＢＢＢ全体への薬物浸透を示すために良く使用される変数である、脳／血漿ダントロレン濃度比（図１５Ｃを参照）は、皮下アプローチと比較して、鼻腔内投与後の両方の時点で有意により高かった。脳内の統合された全体的なダントロレン曝露は、皮下投与よりも鼻腔内投与後に有意に高かった（図１５Ｄ、左パネル）。対照的に、血漿中の統合された全体的なダントロレン曝露は、皮下投与よりも鼻腔内投与後に有意に低かった（図１５Ｄ、右パネル）。
全身投与後に観察されたダントロレンの限られたＢＢＢ透過性は、薬剤の使用および潜在的な有効性を制限した。この研究における鼻腔内ダントロレン投与は、皮下アプローチと比較して、投与後２０分で測定された、より低い血漿濃度をもたらした（図１５Ａを参照）。対照的に、鼻腔内ダントロレン投与は、投与後６０分で皮下投与よりもかなり高い脳濃度をもたらした（図１５Ｂを参照）。組み合わせて、ＢＢＢ全体への薬物浸透を示すために良く使用される変数である、脳／血漿ダントロレン濃度比（図１５Ｃを参照）は、皮下アプローチと比較して、鼻腔内投与後の両方の時点で有意により高かった。脳内の統合された全体的なダントロレン曝露は、皮下投与よりも鼻腔内投与後に有意に高かった（図１５Ｄ、左パネル）。対照的に、血漿中の統合された全体的なダントロレン曝露は、皮下投与よりも鼻腔内投与後に有意に低かった（図１５Ｄ、右パネル）。
初期の鼻腔内または皮下ダントロレン処置は、５ＸＦＡＤマウスにおける記憶喪失を改善した。
海馬依存性および海馬非依存性の記憶は、それぞれ月齢６ヶ月および１１ヶ月で評価し、これは、ＥＴＧにおけるダントロレン処置の４ヶ月後および９ヶ月後（図１６Ａ～１６Ｄを参照）ならびにＬＴＧにおける月齢１１ヶ月での処置の５ヶ月後であった。両方の認知測定は、ＷＴ対照と比較して、５ＸＦＡＤ対照で著しく害されており（図１９Ａ～１９Ｂ）、これにより、５ＸＦＡＤモデルにおける攻撃的なＡＤ表現型が確認された。５ＸＦＡＤマウスでは、鼻腔内ダントロレン処置は、いかなる処置もない５ＸＦＡＤ対照と比較して、ＥＴＧ群の月齢６ヶ月と１１ヶ月の両方で海馬依存性（図１６Ａを参照）および海馬非依存性（図１６Ｂを参照）の記憶を著しく改善した（図１６Ａ～１６Ｂ）。鼻腔内ダントロレンはまた、ＬＴＧの月齢１１ヶ月での海馬依存性記憶喪失を著しく改善し、海馬非依存性記憶を改善する傾向があった（図１６Ａ～１６Ｂ）。興味深いことに、鼻腔内ビヒクルも、月齢６ヶ月と月齢１１ヶ月の両方で海馬依存性記憶喪失を改善したが、５ＸＦＡＤのＥＴＧでは月齢６ヶ月で海馬非依存性記憶を改善しただけであった。皮下ダントロレンは、ＥＴＧでは月齢１１ヶ月ではなく、月齢６ヶ月で両方の種類の記憶喪失を改善し、ＬＴＧでは月齢１１ヶ月で有益な効果がなかった（図１６Ａ～１６Ｂ）。どちらの経路でも、ダントロレンの投与は、野生型マウスにおける記憶に影響を与えなかった（図２０Ａ～２０Ｂ）。ダントロレンで処置された５ＸＦＡＤマウスの動けない時間は、ＷＴの動けない時間に匹敵し（図２０Ａ～２０Ｂ）、トランスジェニックマウスの記憶の改善をさらに支持する。
海馬依存性および海馬非依存性の記憶は、それぞれ月齢６ヶ月および１１ヶ月で評価し、これは、ＥＴＧにおけるダントロレン処置の４ヶ月後および９ヶ月後（図１６Ａ～１６Ｄを参照）ならびにＬＴＧにおける月齢１１ヶ月での処置の５ヶ月後であった。両方の認知測定は、ＷＴ対照と比較して、５ＸＦＡＤ対照で著しく害されており（図１９Ａ～１９Ｂ）、これにより、５ＸＦＡＤモデルにおける攻撃的なＡＤ表現型が確認された。５ＸＦＡＤマウスでは、鼻腔内ダントロレン処置は、いかなる処置もない５ＸＦＡＤ対照と比較して、ＥＴＧ群の月齢６ヶ月と１１ヶ月の両方で海馬依存性（図１６Ａを参照）および海馬非依存性（図１６Ｂを参照）の記憶を著しく改善した（図１６Ａ～１６Ｂ）。鼻腔内ダントロレンはまた、ＬＴＧの月齢１１ヶ月での海馬依存性記憶喪失を著しく改善し、海馬非依存性記憶を改善する傾向があった（図１６Ａ～１６Ｂ）。興味深いことに、鼻腔内ビヒクルも、月齢６ヶ月と月齢１１ヶ月の両方で海馬依存性記憶喪失を改善したが、５ＸＦＡＤのＥＴＧでは月齢６ヶ月で海馬非依存性記憶を改善しただけであった。皮下ダントロレンは、ＥＴＧでは月齢１１ヶ月ではなく、月齢６ヶ月で両方の種類の記憶喪失を改善し、ＬＴＧでは月齢１１ヶ月で有益な効果がなかった（図１６Ａ～１６Ｂ）。どちらの経路でも、ダントロレンの投与は、野生型マウスにおける記憶に影響を与えなかった（図２０Ａ～２０Ｂ）。ダントロレンで処置された５ＸＦＡＤマウスの動けない時間は、ＷＴの動けない時間に匹敵し（図２０Ａ～２０Ｂ）、トランスジェニックマウスの記憶の改善をさらに支持する。
海馬依存性学習および記憶は、両方の遺伝子型について、月齢１０ヶ月でＭＷＭを使用して調べた。未処置の野生型（ＷＴ）または５ＸＦＡＤ（ＴＧ）の対照と比較して、経時的に、すべての処置群の手がかりトライアルについて有意差は見られなかった（図２１Ａ～２１Ｂ）。場所トライアルでは、遺伝子型または処置に関係なく、対照と比較して、すべての群について逃避潜時に有意差はなかった（図２１Ｃ～２１Ｄ）。動物は、経時的に課題を学習したが、処置群間でも遺伝子型間でも差異はなかった。標的象限で費やされた時間（図２１Ｅ）およびマウスがプラットフォームを横切った回数（図２１Ｆ）のデータでは、対照と比較して、すべての群間で有意差は見られなかった。
皮下ではなく、鼻腔内のダントロレン処置は、疾患修飾薬として５ＸＦＡＤの記憶喪失を改善した。
海馬依存性と海馬非依存性の両方の記憶は、鼻腔内または皮下ダントロレン処置をＡＤ病理と症状の両方が現れた月齢６ヶ月から開始して、１０ヶ月齢でＬＴＧについてＦＣＴを使用して評価された。５ＸＦＡＤマウスでは、皮下（図１７Ｂを参照）ではなく鼻腔内（図１７Ａを参照）のダントロレン処置は、海馬依存性記憶の障害を著しく抑制し（図１７Ａを参照、文脈的）、海馬非依存性記憶喪失を改善する傾向があった（図１７Ｂを参照、音）。実際に、鼻腔内ダントロレン処置は、海馬依存性記憶をＷＴ対照と同じレベルに回復させた。
海馬依存性と海馬非依存性の両方の記憶は、鼻腔内または皮下ダントロレン処置をＡＤ病理と症状の両方が現れた月齢６ヶ月から開始して、１０ヶ月齢でＬＴＧについてＦＣＴを使用して評価された。５ＸＦＡＤマウスでは、皮下（図１７Ｂを参照）ではなく鼻腔内（図１７Ａを参照）のダントロレン処置は、海馬依存性記憶の障害を著しく抑制し（図１７Ａを参照、文脈的）、海馬非依存性記憶喪失を改善する傾向があった（図１７Ｂを参照、音）。実際に、鼻腔内ダントロレン処置は、海馬依存性記憶をＷＴ対照と同じレベルに回復させた。
慢性的な鼻腔内または皮下ダントロレン処置は、忍容性が良かった
この研究では、対照と比較して、７ヶ月の処置（ＥＴＧ）および３ヶ月の処置（ＬＴＧ）後のロータロッドの成績における運動機能に関して５ＸＦＡＤマウスに有意差はなかった（図１７Ａ）。長期の鼻腔内ダントロレン処置はまた、鼻細胞に損傷を与え、嗅覚を害する可能性がある。本研究では、５ｘＦＡＤマウスにおいて、鼻腔内処置の６ヶ月後（ＥＴＧ）、または処置の２ヶ月後（ＬＴＧ）に、嗅覚が著しく害されなかったことが分かった（図１７Ｂ）。（図１６Ｂも参照、それぞれ、ＥＴＧについては６～７ヶ月の処置、ＬＴＧについては２～３ヶ月の処置。）長期使用での高用量の経口ダントロレンは、肝機能を害する可能性がある。この研究では、鼻腔内または皮下での１０ヶ月間のダントロレン処置（ＥＴＧ）は、５ＸＦＡＤマウスにおける肝機能または肝構造に対して著しい影響はなかった（図１７Ｃ～１７Ｄ）。（図１８Ｃも参照、９～１０ヶ月の処置）および肝臓の構造（図１８Ｄを参照、９～１０ヶ月の処置）。さらに、最大１０ヶ月間の慢性的な鼻腔内または皮下ダントロレン処置は、５ＸＦＡＤマウスのいずれの群においても死亡率または体重に影響を与えなかった（図１７Ｅ～１７Ｆ）。野生型マウスでは、嗅覚、運動機能、死亡率、または体重に有意差はなかった（図２２Ａ～２２Ｃ、２２Ｅ、２２Ｆ）。肝臓酵素であるアラニンアミノトランスフェラーゼの著しい増加が野生型マウスで１０ヶ月の処置後（ＥＴＧ）に検出されたが、値は、依然として正常な生理学的範囲内であった（図２２Ｄ）。また、最大１０ヶ月の慢性的な鼻腔内または皮下ダントロレン処置は、いずれの種類のマウスにおいても死亡率に影響を与えなかった（表１）。
この研究では、対照と比較して、７ヶ月の処置（ＥＴＧ）および３ヶ月の処置（ＬＴＧ）後のロータロッドの成績における運動機能に関して５ＸＦＡＤマウスに有意差はなかった（図１７Ａ）。長期の鼻腔内ダントロレン処置はまた、鼻細胞に損傷を与え、嗅覚を害する可能性がある。本研究では、５ｘＦＡＤマウスにおいて、鼻腔内処置の６ヶ月後（ＥＴＧ）、または処置の２ヶ月後（ＬＴＧ）に、嗅覚が著しく害されなかったことが分かった（図１７Ｂ）。（図１６Ｂも参照、それぞれ、ＥＴＧについては６～７ヶ月の処置、ＬＴＧについては２～３ヶ月の処置。）長期使用での高用量の経口ダントロレンは、肝機能を害する可能性がある。この研究では、鼻腔内または皮下での１０ヶ月間のダントロレン処置（ＥＴＧ）は、５ＸＦＡＤマウスにおける肝機能または肝構造に対して著しい影響はなかった（図１７Ｃ～１７Ｄ）。（図１８Ｃも参照、９～１０ヶ月の処置）および肝臓の構造（図１８Ｄを参照、９～１０ヶ月の処置）。さらに、最大１０ヶ月間の慢性的な鼻腔内または皮下ダントロレン処置は、５ＸＦＡＤマウスのいずれの群においても死亡率または体重に影響を与えなかった（図１７Ｅ～１７Ｆ）。野生型マウスでは、嗅覚、運動機能、死亡率、または体重に有意差はなかった（図２２Ａ～２２Ｃ、２２Ｅ、２２Ｆ）。肝臓酵素であるアラニンアミノトランスフェラーゼの著しい増加が野生型マウスで１０ヶ月の処置後（ＥＴＧ）に検出されたが、値は、依然として正常な生理学的範囲内であった（図２２Ｄ）。また、最大１０ヶ月の慢性的な鼻腔内または皮下ダントロレン処置は、いずれの種類のマウスにおいても死亡率に影響を与えなかった（表１）。
ダントロレン処置は、５ＸＦＡＤマウスの海馬および皮質におけるアミロイド負荷を減少させなかった
アミロイド陽性細胞の数および面積を決定し、海馬と皮質の両方について分析した（図１８Ａ～１８Ｆを参照）。ＷＴ対照と比較して、５ＸＦＡＤマウスの海馬（データは示されず）と皮質（データは示されず）の両方で有意に多くのアミロイド斑があった。鼻腔内または皮下のダントロレン処置は、５ＸＦＡＤマウスの海馬または皮質におけるアミロイド負荷を著しく変化させなかった（図１８Ａ～１８Ｆを参照）。ＷＴマウスでは、アミロイドは検出されなかった（図２３Ａ～２３Ｂ）。
アミロイド陽性細胞の数および面積を決定し、海馬と皮質の両方について分析した（図１８Ａ～１８Ｆを参照）。ＷＴ対照と比較して、５ＸＦＡＤマウスの海馬（データは示されず）と皮質（データは示されず）の両方で有意に多くのアミロイド斑があった。鼻腔内または皮下のダントロレン処置は、５ＸＦＡＤマウスの海馬または皮質におけるアミロイド負荷を著しく変化させなかった（図１８Ａ～１８Ｆを参照）。ＷＴマウスでは、アミロイドは検出されなかった（図２３Ａ～２３Ｂ）。
シナプス機能関連タンパク質に有意差は見られなかった
脳全体からのＰＳＤ９５およびシナプシン１の発現を決定し、ＥＴＧおよびＬＴＧについて分析した。どちらの遺伝子型についても、処置群と対照群の間に有意差はなかった（図２４Ａ～２４Ｄ）。
脳全体からのＰＳＤ９５およびシナプシン１の発現を決定し、ＥＴＧおよびＬＴＧについて分析した。どちらの遺伝子型についても、処置群と対照群の間に有意差はなかった（図２４Ａ～２４Ｄ）。
５ＸＦＡＤマウスを使用したＡＤの攻撃的な動物モデルにおいて、本研究は、明らかなＡＤ神経病理学および認知機能障害の発症後に鼻腔内ダントロレン処置を開始した場合でも、皮下ではなく慢性的な鼻腔内ダントロレン処置により、記憶喪失がほぼ消失したことを実証した。鼻腔内ダントロレン処置は、５ＸＦＡＤマウスにおける運動協調性、嗅覚、肝機能、および死亡率に明らかな悪影響を与えることなく、疾患修飾特性を示した。皮下アプローチと比較して、鼻腔内投与後の脳濃度が高いことから明らかなように、脳へのダントロレンの浸透が大きいことは、５ＸＦＡＤマウスにおける記憶障害の改善に対する治療効果が優れていることと一致している。これは、皮下アプローチと比較して、疾患修飾薬としても、鼻腔内投与後の認知機能障害に対するダントロレンの改善されたＣＮＳ浸透および優れた治療効果を示した最初の研究であり、鼻腔内ダントロレン処置をＡＤのための新薬治療とする。
この研究では、投与後２０分および６０分でダントロレンの血漿および脳濃度を選択したが、それは、パイロット研究において、これらがそれぞれ鼻腔内投与または皮下投与後にピーク濃度に達することが特定された時間であるためである。
この研究では、皮下アプローチと比較して、鼻腔内投与後２０分および６０分で血漿濃度が同時に低下するとともに、ダントロレンの脳内濃度が増加することが分かった。これは、鼻腔内送達が皮下アプローチよりも脳へのより良い浸透を提供することを示唆している。本発明者らはまた、鼻腔内ダントロレンアプローチがピーク脳濃度を増加させ、経口アプローチよりも脳内の持続時間を延長させたが、ＢＢＢを通過するその能力を著しく増加させなかったことを見出した。血漿と比較して、鼻腔内アプローチによる増加した脳の利点は、治療用量が減少したことによって、末梢の副作用が最小限に抑えられることである。
この研究では、ＭＷＭ試験でも、月齢１０ヶ月のＷＴマウスと５ＸＦＡＤマウスの間で異なる認知機能は検出されず（図２１Ａ～２１Ｆ）、高齢マウスにおける学習および記憶の変化を決定するためのＭＷＭの感度が低いことをさらに示している（図２２Ｆ）。一方で、恐怖条件付け試験では、ＷＴ対照と比較して、月齢１１ヶ月の５ＸＦＡＤマウスで海馬依存性および非依存性の記憶が減少したことを実証した。さらに、本研究では、ダントロレンの皮下投与ではなく、同じ用量でのダントロレンの鼻腔内投与のみが、ＡＤ病理および認知機能障害の発症後に処置が開始されたときに、疾患修飾薬として、記憶喪失を改善することが分かり、脳へのその比較的より効率的な浸透およびより高い脳ダントロレン濃度と一致している。ダントロレンは、５ＸＦＡＤマウスにおいて、海馬非依存性記憶よりも効率的に海馬依存性記憶を回復させる。認知機能障害の発症前にＡＤを効果的に診断することは通常困難で不便であるため、これらの結果は、臨床的に重要である。したがって、記憶喪失の発症後でも効果的な処置は、鼻腔内ダントロレン処置をＡＤ患者にとって有望な治療法にする。ＡＤ患者におけるダントロレンの鼻腔内投与の別の利点は、他の投与方法と比較して、患者にとってのその使いやすさおよび利便性である。
ＡＤ病理および認知機能障害の発症前または発症後のいずれかに開始された鼻腔内ダントロレン処置は、５ＸＦＡＤマウスにおける細胞外斑に影響を与えなかったが、それは、記憶喪失をほぼ消失させ、疾患修飾薬として作用した。
この研究は、最大９～１０ヶ月間の、５ｍｇ／ｋｇでの鼻腔内または皮下ダントロレンが、５ＸＦＡＤマウスにおける死亡率、肝臓の構造、および機能に影響を与えず、他の重篤な副作用を引き起こさず、慢性使用後のダントロレンの安全性をさらに強化することを示した。さらに、ダントロレンの神経保護効果は、明らかに用量依存的であるため、皮下アプローチと比較して、鼻腔内投与後のより高い脳濃度およびより低い血漿濃度は、効果的な治療を維持しながら、鼻腔内ダントロレン用量をさらに減少させることを可能にする。
鼻腔内ダントロレン投与は、細胞外アミロイド斑に大きな影響を与えたり、明らかな副作用を引き起こしたりすることなく、疾患修飾薬として、皮下アプローチと比較してより高い脳濃度および記憶喪失を改善するためのより良い治療効果を提供する。
実施例４
ダントロレンは、アルツハイマー病患者からのニューロンにおけるグルタミン酸誘発性ミトコンドリアカルシウムの増加を改善する
グルタミン酸興奮毒性および関連する細胞内カルシウム恒常性の破壊は、アルツハイマー病（ＡＤ）における病理、シナプス、および認知機能障害において重要な役割を果たす。リアノジン受容体（ＲｙＲ）の過剰な活性化を介したＥＲからの過剰なカルシウム放出は、ミトコンドリアカルシウム過負荷およびＡＤにおける機能障害、例えば、酸素消費量の減少およびＡＴＰ産生を引き起こす。ＲｙＲカルシウムチャネルは、ＥＲ放出によって引き起こされるミトコンドリアＣａ２＋の増加に必要である。この研究では、ダントロレンが、ＲｙＲおよびＮ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体を抑制するその能力により、ＡＤを有する患者からの人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来のニューロンにおけるグルタミン酸誘導性ミトコンドリアカルシウム過負荷を改善するかどうかを調査した。この研究は、ダントロレンが、ＡＤ患者に由来するニューロンにおけるグルタミン酸誘発性ミトコンドリアカルシウムの増加および関連する細胞質ＡＴＰ濃度の減少を著しく抑制したことを実証する。
ダントロレンは、アルツハイマー病患者からのニューロンにおけるグルタミン酸誘発性ミトコンドリアカルシウムの増加を改善する
グルタミン酸興奮毒性および関連する細胞内カルシウム恒常性の破壊は、アルツハイマー病（ＡＤ）における病理、シナプス、および認知機能障害において重要な役割を果たす。リアノジン受容体（ＲｙＲ）の過剰な活性化を介したＥＲからの過剰なカルシウム放出は、ミトコンドリアカルシウム過負荷およびＡＤにおける機能障害、例えば、酸素消費量の減少およびＡＴＰ産生を引き起こす。ＲｙＲカルシウムチャネルは、ＥＲ放出によって引き起こされるミトコンドリアＣａ２＋の増加に必要である。この研究では、ダントロレンが、ＲｙＲおよびＮ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体を抑制するその能力により、ＡＤを有する患者からの人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来のニューロンにおけるグルタミン酸誘導性ミトコンドリアカルシウム過負荷を改善するかどうかを調査した。この研究は、ダントロレンが、ＡＤ患者に由来するニューロンにおけるグルタミン酸誘発性ミトコンドリアカルシウムの増加および関連する細胞質ＡＴＰ濃度の減少を著しく抑制したことを実証する。
方法
細胞培養
健康な対照細胞（ＡＧ０２２６１）および孤発性アルツハイマー病からのｉＰＳＣ（ＡＧ１１４１４）は、Ｊｏｈｎ Ａ．Ｋｅｓｓｌｅｒの研究室から入手した。家族性アルツハイマー病からのｉＰＳＣ（ＧＭ２４６７５）は、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｃａｍｄｅｎ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）から購入した。各種類のｉＰＳＣは、１人の健康なヒト対象または孤発性アルツハイマー病もしくは家族性アルツハイマー病のいずれかと診断された１人の患者の皮膚線維芽細胞から生成した。ＡＧ０２２６１細胞株は、６１歳の男性の健康な患者に由来した。別のＡＧ１１４１４細胞株は、ＡＰＯＥ３／Ｅ４遺伝子型を示した早期発症型アルツハイマー病を有する３９歳の男性患者に由来した。ＧＭ２４６７５細胞株は、ＡＰＯＥ遺伝子型３／３を有する６０歳の家族性アルツハイマー病患者に由来した。ヒト誘導多能性幹細胞は、ｍＴｅＳＲ（商標）プラス培地中内にあるマトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）被覆プレート（カタログ番号０５８２５、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｎａｄａ）上に維持し、３７℃で５％のＣＯ２加湿雰囲気中で培養した。培地は、毎日交換した。
細胞培養
健康な対照細胞（ＡＧ０２２６１）および孤発性アルツハイマー病からのｉＰＳＣ（ＡＧ１１４１４）は、Ｊｏｈｎ Ａ．Ｋｅｓｓｌｅｒの研究室から入手した。家族性アルツハイマー病からのｉＰＳＣ（ＧＭ２４６７５）は、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｃａｍｄｅｎ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）から購入した。各種類のｉＰＳＣは、１人の健康なヒト対象または孤発性アルツハイマー病もしくは家族性アルツハイマー病のいずれかと診断された１人の患者の皮膚線維芽細胞から生成した。ＡＧ０２２６１細胞株は、６１歳の男性の健康な患者に由来した。別のＡＧ１１４１４細胞株は、ＡＰＯＥ３／Ｅ４遺伝子型を示した早期発症型アルツハイマー病を有する３９歳の男性患者に由来した。ＧＭ２４６７５細胞株は、ＡＰＯＥ遺伝子型３／３を有する６０歳の家族性アルツハイマー病患者に由来した。ヒト誘導多能性幹細胞は、ｍＴｅＳＲ（商標）プラス培地中内にあるマトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）被覆プレート（カタログ番号０５８２５、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｎａｄａ）上に維持し、３７℃で５％のＣＯ２加湿雰囲気中で培養した。培地は、毎日交換した。
ｉＰＳＣから未成熟皮質ニューロンへの分化のためのプロトコルは、参照によりその全体が組み込まれる、Ｓｈｉ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ，２０１２；７：１８３６によって以前に説明された。簡単に言えば、フィーダーフリー培養は、デュアルＳＭＡＤ抑制を介して神経前駆細胞に誘導した。細胞は、２μＭのＳＢ４３１５４２および２μＭのＤＭＨ１（両方ともＴｏｃｒｉｓ、ＵＳＡから）を用いて、化学的に定義された条件で７日間培養した。培地を１２日目から神経維持培地に変更した（これは、Ｎ－２およびＢ－２７を含有する培地の１：１混合物であり、Ｎ－２培地は、ダルベッコの改良イーグル培地／Ｆ－１２ ＧｌｕｔａＭＡＸ、１×Ｎ－２２、５μｇ／ｍｌのインスリン、１ｍＭのｌ－グルタミン、１００μＭの非必須アミノ酸、１００μＭの２－メルカプトエタノール、５０ユニット／ｍｌのペニシリン、および５０ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシンからなり、Ｂ－２７培地は、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ、１×Ｂ－２７、２００ｍＭのｌ－グルタミン、５０Ｕ／ｍｌのペニシリン、および５０ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシンからなる）。培養物を倒立顕微鏡で１２～１７日目頃に見ると、神経ロゼットの構造が明らかになるはずである。この時点から、培地は、１日おきに交換された。
免疫細胞化学
細胞を播種し、ガラスカバースリップを備える２４ウェルプレートで処置した。処置後、細胞をＰＢＳで簡単にすすぎ、４％のパラホルムアルデヒドで、室温で１５分間固定し、続いてＰＢＳで５分間ずつ３回洗浄した。次に、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含有するＰＢＳ中の５％の正常ヤギ血清により、室温で１時間ブロックした。一次抗体は、１％のウシ血清アルブミンおよび０．３％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含有するＰＢＳで希釈された。ＰＢＳで３回洗浄した後、細胞を、ＰＢＳで希釈した二次抗体（１：１０００）内で、暗所、室温で１～２時間インキュベートした。最後に、カバースリップをＰＢＳで１回すすぎ、ＰＢＳ中のＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（１：１０００）で２～５分間染色した。ＰＢＳで５分間３回洗浄した後、細胞をＧｏｌｄ退色防止試薬でマウントし、暗所で平らな表面で一晩硬化させ、マニキュアで密封し、画像化した。一次抗体濃度は、次のように列挙された：ＴＵＪ１（１：１０００）、ＤＣＸ（１：５００）、ＭＡＰ２（１：５００）。画像取得および分析は、実験的処置を知らされていない人々によって実行される。カバーガラス上のランダムな位置で５セットの画像を取得し、その後、Ｉｍａｇｅ Ｊ １．４９ｖソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）を使用してマージした。細胞の総数に対する陽性細胞の割合を計算し、少なくとも３つの異なる培養物からの異なる群間で比較した。
細胞を播種し、ガラスカバースリップを備える２４ウェルプレートで処置した。処置後、細胞をＰＢＳで簡単にすすぎ、４％のパラホルムアルデヒドで、室温で１５分間固定し、続いてＰＢＳで５分間ずつ３回洗浄した。次に、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含有するＰＢＳ中の５％の正常ヤギ血清により、室温で１時間ブロックした。一次抗体は、１％のウシ血清アルブミンおよび０．３％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含有するＰＢＳで希釈された。ＰＢＳで３回洗浄した後、細胞を、ＰＢＳで希釈した二次抗体（１：１０００）内で、暗所、室温で１～２時間インキュベートした。最後に、カバースリップをＰＢＳで１回すすぎ、ＰＢＳ中のＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（１：１０００）で２～５分間染色した。ＰＢＳで５分間３回洗浄した後、細胞をＧｏｌｄ退色防止試薬でマウントし、暗所で平らな表面で一晩硬化させ、マニキュアで密封し、画像化した。一次抗体濃度は、次のように列挙された：ＴＵＪ１（１：１０００）、ＤＣＸ（１：５００）、ＭＡＰ２（１：５００）。画像取得および分析は、実験的処置を知らされていない人々によって実行される。カバーガラス上のランダムな位置で５セットの画像を取得し、その後、Ｉｍａｇｅ Ｊ １．４９ｖソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）を使用してマージした。細胞の総数に対する陽性細胞の割合を計算し、少なくとも３つの異なる培養物からの異なる群間で比較した。
細胞生存率
細胞生存率は、前述のように、３－（４，５－ジメチルチアゾール－２イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）還元アッセイを使用して決定された。処置の前日、１つのウェル当たり５０，０００個の細胞を９６ウェルプレートに播種し、２４時間インキュベートした。各実験中、各処置を少なくとも３回繰り返した。処置の最後に、１０μｌ／ウェルの０．２５％のＭＴＴ溶液を９６ウェルプレートに添加し、顕微鏡下で細胞内の紫色のホルマザン結晶が見えるまで、暗所で３７℃にて４時間インキュベートした。次に、培地を除去し、ホルマザン結晶を１つのウェル当たり１５０μｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で可溶化し、室温でインキュベートし、紫色の結晶が溶解するまで、シェーカー上で、ホイルで３０分間覆った。吸光度をプレートリーダー（Ｓｙｎｅｒｇｙ（商標）Ｈ１マイクロプレートリーダー、ＢｉｏＴｅｋ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ、ＵＳＡ）で、５４０ｎｍで測定した。
細胞生存率は、前述のように、３－（４，５－ジメチルチアゾール－２イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）還元アッセイを使用して決定された。処置の前日、１つのウェル当たり５０，０００個の細胞を９６ウェルプレートに播種し、２４時間インキュベートした。各実験中、各処置を少なくとも３回繰り返した。処置の最後に、１０μｌ／ウェルの０．２５％のＭＴＴ溶液を９６ウェルプレートに添加し、顕微鏡下で細胞内の紫色のホルマザン結晶が見えるまで、暗所で３７℃にて４時間インキュベートした。次に、培地を除去し、ホルマザン結晶を１つのウェル当たり１５０μｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で可溶化し、室温でインキュベートし、紫色の結晶が溶解するまで、シェーカー上で、ホイルで３０分間覆った。吸光度をプレートリーダー（Ｓｙｎｅｒｇｙ（商標）Ｈ１マイクロプレートリーダー、ＢｉｏＴｅｋ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ、ＵＳＡ）で、５４０ｎｍで測定した。
細胞質ＡＴＰ産生
細胞質のＡＴＰ産生は、前述のように、市販のルシフェラーゼ－ルシフェリンシステム（ＡＴＰｌｉｔｅ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して評価された。処置の前日、１つのウェル当たり５０，０００個の細胞を、１００μＬの培地を有する９６ウェルプレートに播種し、２４時間インキュベートした。各実験中、各処置を少なくとも３回繰り返した。９６ウェルプレートの１つのウェル当たり５０μＬの哺乳動物細胞溶解溶液を添加した。プレートを振とうし、次に、５０μＬの基質溶液をウェルに添加した。発光をＢｉｏＴｅｃｈ ＳｙｎｅｒｇｙＨ１プレートリーダーで測定した。
細胞質のＡＴＰ産生は、前述のように、市販のルシフェラーゼ－ルシフェリンシステム（ＡＴＰｌｉｔｅ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して評価された。処置の前日、１つのウェル当たり５０，０００個の細胞を、１００μＬの培地を有する９６ウェルプレートに播種し、２４時間インキュベートした。各実験中、各処置を少なくとも３回繰り返した。９６ウェルプレートの１つのウェル当たり５０μＬの哺乳動物細胞溶解溶液を添加した。プレートを振とうし、次に、５０μＬの基質溶液をウェルに添加した。発光をＢｉｏＴｅｃｈ ＳｙｎｅｒｇｙＨ１プレートリーダーで測定した。
細胞質およびミトコンドリアＣａ２＋濃度測定
グルタミン酸曝露後のｉＰＳＣ由来のニューロンの細胞質Ｃａ２＋濃度（［Ｃａ２＋］ｃ）およびミトコンドリアＣａ２＋濃度（［Ｃａ２＋］ｍ）の変化は、参照によりその全体が組み込まれる、Ｂｏｎｏｒａ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ２０１３；８：２１０５によって説明されるように、クラゲ発光タンパク質エクオリンベースのプローブを使用して測定された。１２～１５×１０４細胞を２４ウェルプレート上の１２ｍｍのカバースリップ上に播種し、６０～７０％のコンフルエンスまで成長させ、次いで、メーカーの指示に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００トランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）を使用してｃｙｔ－Ａｅｑプラスミドでトランスフェクトした。翌日、トランスフェクトされた細胞は、１ｍＭのＣａＣｌ２および５ｍＭのグルコースで補充された改変クレブス－リンガー緩衝液（ｍＭ単位で、１３５のＮａＣｌ、５のＫＣｌ、１のＭｇＣｌ２、２０のＨｅｐｅｓ、０．４のＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４）中のダントロレン２０μＭの有無にかかわらず、１時間、５μＭのセレンテラジンとインキュベート、次に灌流チャンバーに移した。すべてのエクオリン測定は、クレブス－リンガー緩衝液中で実施し、ダントロレン２０μＭの有無にかかわらずグルタミン酸２０ｍＭを同じ培地に添加した。実験は、特注のエクオリン記録システムで行った。実験は、低張性のＣａ２＋が豊富な溶液（Ｈ２Ｏ中１０ｍＭのＣａＣｌ２）中の１００μＭのジギトニンで細胞を溶解することによって終了させたため、残りのエクオリンプールを排出した。光信号は、前述のとおり、収集し、ｐＨ、［Ｍｇ２＋］、およびイオン強度の生理学的条件でのエクオリンのＣａ２＋応答曲線に基づくアルゴリズムによって［Ｃａ２＋］ｃまたは［Ｃａ２＋］ｍ値に較正した。
グルタミン酸曝露後のｉＰＳＣ由来のニューロンの細胞質Ｃａ２＋濃度（［Ｃａ２＋］ｃ）およびミトコンドリアＣａ２＋濃度（［Ｃａ２＋］ｍ）の変化は、参照によりその全体が組み込まれる、Ｂｏｎｏｒａ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ２０１３；８：２１０５によって説明されるように、クラゲ発光タンパク質エクオリンベースのプローブを使用して測定された。１２～１５×１０４細胞を２４ウェルプレート上の１２ｍｍのカバースリップ上に播種し、６０～７０％のコンフルエンスまで成長させ、次いで、メーカーの指示に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００トランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）を使用してｃｙｔ－Ａｅｑプラスミドでトランスフェクトした。翌日、トランスフェクトされた細胞は、１ｍＭのＣａＣｌ２および５ｍＭのグルコースで補充された改変クレブス－リンガー緩衝液（ｍＭ単位で、１３５のＮａＣｌ、５のＫＣｌ、１のＭｇＣｌ２、２０のＨｅｐｅｓ、０．４のＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４）中のダントロレン２０μＭの有無にかかわらず、１時間、５μＭのセレンテラジンとインキュベート、次に灌流チャンバーに移した。すべてのエクオリン測定は、クレブス－リンガー緩衝液中で実施し、ダントロレン２０μＭの有無にかかわらずグルタミン酸２０ｍＭを同じ培地に添加した。実験は、特注のエクオリン記録システムで行った。実験は、低張性のＣａ２＋が豊富な溶液（Ｈ２Ｏ中１０ｍＭのＣａＣｌ２）中の１００μＭのジギトニンで細胞を溶解することによって終了させたため、残りのエクオリンプールを排出した。光信号は、前述のとおり、収集し、ｐＨ、［Ｍｇ２＋］、およびイオン強度の生理学的条件でのエクオリンのＣａ２＋応答曲線に基づくアルゴリズムによって［Ｃａ２＋］ｃまたは［Ｃａ２＋］ｍ値に較正した。
データ分析および統計
統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）を使用して行われた。すべての値は、平均値±ＳＤとして表される。データは、群間要因としてグルタミン酸濃度およびダントロレンを使用して、一元配置分散分析および二元配置分散分析で分析された。Ｐ＜０．０５は、統計的に有意な結果を示すとみなされた。各実験は、少なくとも３回繰り返した。使用された実験単位（ｎ）および統計分析は、図および凡例に示される。
統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）を使用して行われた。すべての値は、平均値±ＳＤとして表される。データは、群間要因としてグルタミン酸濃度およびダントロレンを使用して、一元配置分散分析および二元配置分散分析で分析された。Ｐ＜０．０５は、統計的に有意な結果を示すとみなされた。各実験は、少なくとも３回繰り返した。使用された実験単位（ｎ）および統計分析は、図および凡例に示される。
結果
アルツハイマー病患者の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から未成熟ニューロンへの分化は、著しく害されていた
健康なヒト対象（対照）および孤発性（ＳＡＤ）または家族性（ＦＡＤ）アルツハイマー病患者からの人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を誘導し、未成熟ニューロンに分化し（２３日）、異なる種類の細胞を標的とする特異的抗体によって特徴付けた。神経前駆細胞（ＴＪＵ１染色、図１９Ａ）および成熟ニューロン（ＭＡＰ２、図１９Ｃ）陽性細胞における３種類の細胞の間に有意差はなかった。しかしながら、対称と比較して、ＳＡＤおよびＦＡＤ患者に由来する未成熟ニューロン（ＤＣＸ、図１９Ｂ）陽性細胞は、有意に減少した。
アルツハイマー病患者の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から未成熟ニューロンへの分化は、著しく害されていた
健康なヒト対象（対照）および孤発性（ＳＡＤ）または家族性（ＦＡＤ）アルツハイマー病患者からの人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を誘導し、未成熟ニューロンに分化し（２３日）、異なる種類の細胞を標的とする特異的抗体によって特徴付けた。神経前駆細胞（ＴＪＵ１染色、図１９Ａ）および成熟ニューロン（ＭＡＰ２、図１９Ｃ）陽性細胞における３種類の細胞の間に有意差はなかった。しかしながら、対称と比較して、ＳＡＤおよびＦＡＤ患者に由来する未成熟ニューロン（ＤＣＸ、図１９Ｂ）陽性細胞は、有意に減少した。
グルタミン酸は、ｉＰＳＣ由来の未成熟ニューロン細胞の生存率およびＡＴＰ産生を用量依存的に減少させた
ＭＴＴ還元アッセイを使用して、ｉＰＳＣ由来の未成熟ニューロン細胞の生存に対するグルタミン酸の効果に関する用量反応研究を行った。１０～３０ｍＭのグルタミン酸は、用量依存的に３種類の細胞に著しい細胞損傷を誘発した（図２０）。ＡＴＰ産生は、市販のルシフェラーゼ－ルシフェリンシステムを使用して評価された。細胞質ＡＴＰ産生も、細胞がグルタミン酸（２０～３０ｍＭ）に曝露された場合、用量依存的に減少した。健康な対照と比較して、ＦＡＤ患者のｉＰＳＣからの未成熟ニューロンは、１５ｍＭおよび２０ｍＭのグルタミン酸に曝露されたときにＡＴＰ産生が著しく害される傾向があった（図２１）。
ＭＴＴ還元アッセイを使用して、ｉＰＳＣ由来の未成熟ニューロン細胞の生存に対するグルタミン酸の効果に関する用量反応研究を行った。１０～３０ｍＭのグルタミン酸は、用量依存的に３種類の細胞に著しい細胞損傷を誘発した（図２０）。ＡＴＰ産生は、市販のルシフェラーゼ－ルシフェリンシステムを使用して評価された。細胞質ＡＴＰ産生も、細胞がグルタミン酸（２０～３０ｍＭ）に曝露された場合、用量依存的に減少した。健康な対照と比較して、ＦＡＤ患者のｉＰＳＣからの未成熟ニューロンは、１５ｍＭおよび２０ｍＭのグルタミン酸に曝露されたときにＡＴＰ産生が著しく害される傾向があった（図２１）。
ダントロレンは、ｉＰＳＣ由来の未成熟ニューロンにおけるグルタミン酸を介したミトコンドリアカルシウムの増加を改善した。
ＦＡＤ患者のｉＰＳＣ由来のニューロンにおいてＡＴＰ産生が害される可能性のあるメカニズムをさらに調査した。クラゲ発光タンパク質イクオリンベースのプローブを使用して、ミトコンドリアカルシウム濃度を測定した（図２２Ａ、２２Ｂ）。ＦＡＤ患者由来のニューロンにおけるミトコンドリアカルシウム濃度のグルタミン酸を介したピーク上昇および全体的な曝露（ＡＵＣ（曲線下面積））は、健康な対照よりも有意に高く、これは、ダントロレンの前処置によって改善された（図２２Ｃ、２２Ｄ）。
ＦＡＤ患者のｉＰＳＣ由来のニューロンにおいてＡＴＰ産生が害される可能性のあるメカニズムをさらに調査した。クラゲ発光タンパク質イクオリンベースのプローブを使用して、ミトコンドリアカルシウム濃度を測定した（図２２Ａ、２２Ｂ）。ＦＡＤ患者由来のニューロンにおけるミトコンドリアカルシウム濃度のグルタミン酸を介したピーク上昇および全体的な曝露（ＡＵＣ（曲線下面積））は、健康な対照よりも有意に高く、これは、ダントロレンの前処置によって改善された（図２２Ｃ、２２Ｄ）。
その広範な発明の概念から逸脱することなく、上述の実施形態に変更を加えることができることが当業者には理解されよう。したがって、本発明は、開示された特定の実施形態に限定されないが、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨および範囲内にある変更をカバーすることが意図されることが理解される。
Claims (89)
- アルツハイマー病（ＡＤ）を有するか、または有すると疑われる対象におけるニューロンの神経新生および／またはシナプス形成の障害を抑制するための方法であって、前記神経新生および／またはシナプス形成の障害が、少なくとも部分的に、小胞体（ＥＲ）リアノジン受容体（ＲｙＲ）の過剰な活性化によって引き起こされ、ＥＲカルシウムイオン（Ｃａ２＋）の放出を減少させるのに有効なある量のダントロレンを含む医薬組成物を前記対象に鼻腔内投与することを含む、方法。
- 前記神経新生が、神経前駆細胞（ＮＰＣ）から未成熟ニューロンへの神経新生と、それに続く未成熟ニューロンから皮質ニューロンへの神経新生とを含む、請求項１に記載の方法。
- 前記シナプス形成が、皮質ニューロンで起こる、請求項１または２に記載の方法。
- 前記皮質ニューロンが、コリン作動性ニューロンである、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記皮質ニューロンが、前脳基底部コリン作動性ニューロン（ＢＦＣＮ）ニューロン、前頭前野ニューロン、海馬ニューロン、またはそれらの組み合わせである、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＡＤが、家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）または孤発性アルツハイマー病（ＳＡＤ）である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＲｙＲが、１型ＲｙＲ（ＲｙＲ－１）、２型ＲｙＲ（ＲｙＲ－２）、３型ＲｙＲ（ＲｙＲ－３）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記小胞体（ＥＲ）リアノジン受容体（ＲｙＲ）の過剰な活性化が、ミトコンドリアカルシウムを上昇させ、ＡＴＰを低下させる、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
- ダントロレンの鼻腔内投与が、前記上昇したミトコンドリアカルシウムを低下させ、細胞質ＡＴＰを増加させる、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ダントロレンを含む医薬組成物が、週に３回投与される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ダントロレンを含む医薬組成物が、４ヶ月～１年間投与される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ダントロレンを含む医薬組成物が、最大２年間投与される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ダントロレンを含む医薬組成物が、２年を超えて投与される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記投与が、前記対象の嗅覚機能、運動機能、または肝機能の障害をもたらさない、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 神経病理学および認知機能障害の発症後の認知機能の低下を改善および／または遅らせるための方法であって、前記神経病理学および認知機能障害が、アルツハイマー病（ＡＤ）によって引き起こされ、ＮＭＤＡ受容体および／またはリアノジン受容体（ＲｙＲ）の過剰な活性化を抑制するのに有効なある量のダントロレンを含む医薬組成物を、それを必要とする対象に鼻腔内投与することを含む、方法。
- 前記認知機能が、記憶、学習、思考、注意、知覚、言語使用、推論、意思決定、問題解決、またはそれらの組み合わせである、請求項１５に記載の方法。
- 前記ＡＤが、家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）または孤発性アルツハイマー病（ＳＡＤ）である、請求項１５または１６に記載の方法。
- 前記ＲｙＲが、１型ＲｙＲ（ＲｙＲ－１）、２型ＲｙＲ（ＲｙＲ－２）、３型ＲｙＲ（ＲｙＲ－３）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ダントロレンを含む医薬組成物が、週に３回投与される、請求項１５～１８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ダントロレンを含む医薬組成物が、４ヶ月～１年間投与される、請求項１５～１８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ダントロレンを含む医薬組成物が、最大２年間投与される、請求項１５～１８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ダントロレンを含む医薬組成物が、２年を超えて投与される、請求項１５～１８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記投与が、前記対象の嗅覚機能、運動機能、または肝機能の障害をもたらさない、請求項１５～２２のいずれか一項に記載の方法。
- アルツハイマー病（ＡＤ）の症状の発症前に記憶を改善するための方法であって、ＮＭＤＡ受容体および／またはリアノジン受容体（ＲｙＲ）の過剰な活性化を抑制するのに有効なある量のダントロレンを含む医薬組成物を、それを必要とする対象に鼻腔内投与することを含む、方法。
- 前記ダントロレンを含む医薬組成物が、週に３回投与される、請求項２４に記載の方法。
- 前記ダントロレンを含む医薬組成物が、４ヶ月～１年間投与される、請求項２４または２５に記載の方法。
- 前記ダントロレンを含む医薬組成物が、最大２年間投与される、請求項２４または２５に記載の方法。
- 前記ダントロレンを含む医薬組成物が、２年を超えて投与される、請求項２４または２５に記載の方法。
- 投与が、前記対象の嗅覚機能、運動機能、または肝機能を害しない、請求項２４～２８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＡＤの症状が、神経病理学、認知機能障害、またはそれらの組み合わせである、請求項２４～２９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記認知機能障害が、短期もしくは長期の記憶喪失、学習困難、思考困難、注意／集中の困難、知覚困難、言語使用の困難、推論の困難、意思決定の困難／判断力の低下、問題解決の困難、混乱、不十分な運動協調性、またはそれらの組み合わせである、請求項３０に記載の方法。
- 前記短期または長期の記憶喪失が、海馬依存性および海馬非依存性の記憶喪失である、請求項３１に記載の方法。
- 前記神経病理学が、脳ニューロン間のアミロイド蓄積である、請求項３１または３２に記載の方法。
- 前記ＡＤが、家族性ＡＤ（ＦＡＤ）または孤発性ＡＤ（ＳＡＤ）である、請求項２４～３３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＲｙＲが、１型ＲｙＲ（ＲｙＲ－１）、２型ＲｙＲ（ＲｙＲ－２）、３型ＲｙＲ（ＲｙＲ－３）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２４～３４のいずれか一項に記載の方法。
- アルツハイマー病（ＡＤ）の症状の発症後の記憶喪失を改善するための方法であって、前記記憶喪失が、ＡＤによって引き起こされ、ＮＭＤＡ受容体および／またはリアノジン受容体（ＲｙＲ）の過剰な活性化を抑制するのに有効なある量のダントロレンを含む医薬組成物を、それを必要とする対象に鼻腔内投与することを含む、方法。
- 前記ダントロレンを含む医薬組成物が、週に３回投与される、請求項３６に記載の方法。
- 前記ダントロレンを含む医薬組成物が、４ヶ月～１年間投与される、請求項３６または３７に記載の方法。
- 前記ダントロレンを含む医薬組成物が、最大２年間投与される、請求項３６または３７に記載の方法。
- 前記ダントロレンを含む医薬組成物が、２年を超えて投与される、請求項３６または３７に記載の方法。
- 投与が、前記対象の嗅覚機能、運動機能、または肝機能を害しない、請求項３６～４０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＡＤの症状が、神経病理学、認知機能障害、またはそれらの組み合わせである、請求項３６～４１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記認知機能障害が、短期もしくは長期の記憶喪失、学習困難、思考困難、注意／集中の困難、知覚困難、言語使用の困難、推論の困難、意思決定の困難／判断力の低下、問題解決の困難、混乱、不十分な運動協調性、またはそれらの組み合わせである、請求項４２に記載の方法。
- 前記記憶喪失が、海馬依存性および海馬非依存性の記憶喪失である、請求項４３に記載の方法。
- 前記神経病理学が、脳ニューロン間のアミロイド蓄積である、請求項４２～４４に記載の方法。
- 前記ＡＤが、家族性ＡＤ（ＦＡＤ）または孤発性ＡＤ（ＳＡＤ）である、請求項３６～４５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＲｙＲが、１型ＲｙＲ（ＲｙＲ－１）、２型ＲｙＲ（ＲｙＲ－２）、３型ＲｙＲ（ＲｙＲ－３）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３６～４６のいずれか一項に記載の方法。
- 対象の脳内のダントロレンの濃度および持続時間を増加させるための方法であって、ある量のダントロレンを含む医薬組成物を、それを必要とする対象に鼻腔内投与することを含む、方法。
- アルツハイマー病（ＡＤ）を有するか、または有すると疑われる対象におけるニューロンの神経新生および／またはシナプス形成の障害を抑制するための方法であって、前記神経新生および／またはシナプス形成の障害が、少なくとも部分的に、小胞体（ＥＲ）リアノジン受容体（ＲｙＲ）の過剰な活性化によって引き起こされ、
ａ）ＥＲカルシウムイオン（Ｃａ２＋）の放出を減少させるのに有効なある量のダントロレンを含む医薬組成物を前記対象に鼻腔内投与することと、
ｂ）治療有効量のグルタミン酸受容体拮抗薬をステップ（ａ）の前記対象に投与することと、を含む、方法。 - ｃ）ステップ（ａ）の前に前記対象から脳脊髄液（ＣＳＦ）を得ることと、
ｄ）前記ＣＳＦ中のグルタミン酸のレベルを決定することと、をさらに含み、
対照の対象から得られたＣＳＦ中のグルタミン酸のレベルよりも高い、ステップ（ｄ）で決定されたグルタミン酸のレベルが、ダントロレンによる処置に対する前記対象の適合性を示す、請求項４９に記載の方法。 - ステップ（ｂ）の前に前記対象からＣＳＦを得ることと、ＣＳＦ中のグルタミン酸のレベルを決定することと、をさらに含み、対照の対象から得られたＣＳＦ中のグルタミン酸のレベルよりも高い、決定されたグルタミン酸のレベルが、グルタミン酸受容体拮抗薬による処置に対する前記対象の適合性を示す、請求項５０に記載の方法。
- 前記グルタミン酸受容体拮抗薬が、グルタミン酸結合部位での競合的拮抗作用によってＮＭＤＡ受容体を遮断する薬剤であるか、またはグリシン、フェンシクリジン、および／あるいはマグネシウム結合部位での非競合的拮抗作用によって前記ＮＭＤＡ受容体を遮断する薬剤である、請求項４９または５０に記載の方法。
- グルタミン酸結合部位での競合的拮抗作用によって前記ＮＭＤＡ受容体を遮断する前記薬剤が、セルフオテル（ＣＧＳ１９７５５）アプチガネル（ＣＮＳ１１０２）、ＣＧＰ３７８４９、ＡＰＶもしくはＡＰ－５（Ｒ－２－アミノ－５－ホスホノペンタノエート）、２－アミノ－７－ホスホノ－ヘプタン酸（ＡＰ－７）、３－［（Ｒ）－２－カルボキシピペラジン－４－イル］－プロプ－２－エニル－１－ホスホン酸（ＣＰＰｅｎｅ）、および／またはアスパルテームである、請求項５２に記載の方法。
- フェンシクリジン（ＰＣＰ）、マグネシウム、および／またはＭＫ－８０１（ジゾシルピン）結合部位での非競合的拮抗作用によって前記ＮＭＤＡ受容体を遮断する前記薬剤が、メマンチン、ケタミン、フェンシクリジン、３－ＭＥＯ－ＰＣＰ、８Ａ－ＰＤＨＱ、アマンタジン、アトモキセチン、ＡＺＤ６７６５、アグマチン、デルセミン、デルセミン、デキストラロルファン、デキストロメトルファン、デキストロルファン、ジフェニジン、エタノール、エチシリジン、ガシクリジン、メトキセタミン（ＭＸＥ）、ミノサイクリジン、ニトロメマンチン、亜酸化窒素、ＰＤ－１３７８８９、ロリシクリジン、テノシクリジン、メトキシジン、チレタミン、ネラメキサン、エリプロジル、エトキサドロール、デキソキサドロール、ＷＭＳ－２５３９、ＮＥＦＡ、レマセミド、硫酸マグネシウム、アプチガネル、ＨＵ－２１１、フペルジンＡ、ジペプチドＤ－Ｐｈｅ－Ｌ－Ｔｙｒ、イボゲイン、キョウチクトウ科、レマセミド、リンコフィリン、ガバペンチン、またはジゾシルピン（ＭＫ－８０１）である、請求項５２に記載の方法。
- グリシン結合部位での非競合的拮抗作用によって前記ＮＭＤＡ受容体を遮断する前記薬剤が、（ＧＬＹＸ－１３）、ＮＲＸ－１０７４、７－クロロキヌレン酸、４－クロロキヌレン（ＡＶ－１０１）、５，７－ジクロロキヌレン酸、キヌレン酸、ＴＫ－４０（ＧｌｕＮ１グリシン結合部位での競合的拮抗薬）、１－アミノシクロ－プロパンカルボン酸（ＡＣＰＣ）、Ｌ－フェニルアラニン、またはキセノンである、請求項５２に記載の方法。
- 前記神経新生が、神経前駆細胞（ＮＰＣ）から未成熟ニューロンへの神経新生と、それに続く未成熟ニューロンから皮質ニューロンへの神経新生とを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記シナプス形成が、皮質ニューロンで起こる、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記皮質ニューロンが、コリン作動性ニューロンである、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記皮質ニューロンが、前脳基底部コリン作動性ニューロン（ＢＦＣＮ）ニューロン、前頭前野ニューロン、海馬ニューロン、またはそれらの組み合わせである、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＡＤが、家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）または孤発性アルツハイマー病（ＳＡＤ）である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 小胞体（ＥＲ）リアノジン受容体（ＲｙＲ）の前記過剰な活性化が、ミトコンドリアカルシウムを上昇させ、ＡＴＰを低下させる、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
- ダントロレンの鼻腔内投与が、前記上昇したミトコンドリアカルシウムを低下させ、細胞質ＡＴＰを増加させる、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ダントロレンを含む医薬組成物が、週に３回投与される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ダントロレンを含む医薬組成物が、４ヶ月～１年間投与される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ダントロレンを含む医薬組成物が、最大２年間投与される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ダントロレンを含む医薬組成物が、２年を超えて投与される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記投与が、前記対象の嗅覚機能、運動機能、または肝機能の障害をもたらさない、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＲｙＲが、１型ＲｙＲ（ＲｙＲ－１）、２型ＲｙＲ（ＲｙＲ－２）、３型ＲｙＲ（ＲｙＲ－３）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項４９～６７のいずれか一項に記載の方法。
- 治療有効量のグルタミン酸受容体拮抗薬を前記対象に投与することをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
- ａ）前記ダントロレンを含む医薬組成物を前記対象に鼻腔内投与する前に、前記対象から脳脊髄液（ＣＳＦ）を得ることと、
ｂ）前記ＣＳＦ中のグルタミン酸のレベルを決定することと、をさらに含み、
対照の対象から得られたＣＳＦ中のグルタミン酸のレベルよりも高い、ステップ（ｂ）で決定されたグルタミン酸のレベルが、ダントロレンによる処置に対する前記対象の適合性を示す、請求項１５に記載の方法。 - 前記治療有効量の前記グルタミン酸受容体拮抗薬を投与する前に、前記対象からＣＳＦを得ることと、前記ＣＳＦ中のグルタミン酸のレベルを決定することと、をさらに含み、対照の対象から得られたＣＳＦ中のグルタミン酸のレベルよりも高い、決定されたグルタミン酸のレベルが、グルタミン酸受容体拮抗薬による処置に対する前記対象の適合性を示す、請求項７０に記載の方法。
- 前記グルタミン酸受容体拮抗薬が、グルタミン酸結合部位での競合的拮抗作用によってＮＭＤＡ受容体を遮断する薬剤であるか、またはグリシン、フェンシクリジンおよび／もしくはマグネシウム結合部位での非競合的拮抗作用によって前記ＮＭＤＡ受容体を遮断する薬剤である、請求項７０に記載の方法。
- グルタミン酸結合部位での競合的拮抗作用によって前記ＮＭＤＡ受容体を遮断する前記薬剤が、セルフオテル（ＣＧＳ１９７５５）アプチガネル（ＣＮＳ１１０２）、ＣＧＰ３７８４９、ＡＰＶもしくはＡＰ－５（Ｒ－２－アミノ－５－ホスホノペンタノエート）、２－アミノ－７－ホスホノ－ヘプタン酸（ＡＰ－７）、３－［（Ｒ）－２－カルボキシピペラジン－４－イル］－プロプ－２－エニル－１－ホスホン酸（ＣＰＰｅｎｅ）、および／またはアスパルテームである、請求項７２に記載の方法。
- フェンシクリジン（ＰＣＰ）、マグネシウム、および／またはＭＫ－８０１（ジゾシルピン）結合部位での非競合的拮抗作用によって前記ＮＭＤＡ受容体を遮断する前記薬剤が、メマンチン、ケタミン、フェンシクリジン、３－ＭＥＯ－ＰＣＰ、８Ａ－ＰＤＨＱ、アマンタジン、アトモキセチン、ＡＺＤ６７６５、アグマチン、デルセミン、デルセミン、デキストラロルファン、デキストロメトルファン、デキストロルファン、ジフェニジン、エタノール、エチシリジン、ガシクリジン、メトキセタミン（ＭＸＥ）、ミノサイクリジン、ニトロメマンチン、亜酸化窒素、ＰＤ－１３７８８９、ロリシクリジン、テノシクリジン、メトキシジン、チレタミン、ネラメキサン、エリプロジル、エトキサドロール、デキソキサドロール、ＷＭＳ－２５３９、ＮＥＦＡ、レマセミド、硫酸マグネシウム、アプチガネル、ＨＵ－２１１、フペルジンＡ、ジペプチドＤ－Ｐｈｅ－Ｌ－Ｔｙｒ、イボゲイン、キョウチクトウ科、レマセミド、リンコフィリン、ガバペンチン、またはジゾシルピン（ＭＫ－８０１）である、請求項７２に記載の方法。
- グリシン結合部位での非競合的拮抗作用によって前記ＮＭＤＡ受容体を遮断する前記薬剤が、（ＧＬＹＸ－１３）、ＮＲＸ－１０７４、７－クロロキヌレン酸’、４－クロロキヌレン（ＡＶ－１０１）、５，７－ジクロロキヌレン酸、キヌレン酸、ＴＫ－４０（ＧｌｕＮ１グリシン結合部位での競合的拮抗薬）、１－アミノシクロ－プロパンカルボン酸（ＡＣＰＣ）、Ｌ－フェニルアラニン、またはキセノンである、請求項７２に記載の方法。
- 治療有効量のグルタミン酸受容体拮抗薬を前記対象に投与することをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
- ａ）前記ダントロレンを含む医薬組成物を前記対象に鼻腔内投与する前に、前記対象から脳脊髄液（ＣＳＦ）を得ることと、
ｂ）前記ＣＳＦ中のグルタミン酸のレベルを決定することと、をさらに含み、
対照の対象から得られたＣＳＦ中のグルタミン酸のレベルよりも高い、ステップ（ｂ）で決定されたグルタミン酸のレベルが、ダントロレンによる処置に対する前記対象の適合性を示す、請求項２４に記載の方法。 - 前記治療有効量の前記グルタミン酸受容体拮抗薬を投与する前に、前記対象からＣＳＦを得ることと、前記ＣＳＦ中のグルタミン酸のレベルを決定することと、をさらに含み、対照の対象から得られたＣＳＦ中のグルタミン酸のレベルよりも高い、決定されたグルタミン酸のレベルが、グルタミン酸受容体拮抗薬による処置に対する前記対象の適合性を示す、請求項７７に記載の方法。
- 前記グルタミン酸受容体拮抗薬が、グルタミン酸結合部位での競合的拮抗作用によってＮＭＤＡ受容体を遮断する薬剤であるか、またはグリシン、フェンシクリジン、および／もしくはマグネシウム結合部位での非競合的拮抗作用によって前記ＮＭＤＡ受容体を遮断する薬剤である、請求項７７に記載の方法。
- グルタミン酸結合部位での競合的拮抗作用によって前記ＮＭＤＡ受容体を遮断する前記薬剤が、セルフオテル（ＣＧＳ１９７５５）アプチガネル（ＣＮＳ１１０２）、ＣＧＰ３７８４９、ＡＰＶもしくはＡＰ－５（Ｒ－２－アミノ－５－ホスホノペンタノエート）、２－アミノ－７－ホスホノ－ヘプタン酸（ＡＰ－７）、３－［（Ｒ）－２－カルボキシピペラジン－４－イル］－プロプ－２－エニル－１－ホスホン酸（ＣＰＰｅｎｅ）、および／またはアスパルテームである、請求項７９に記載の方法。
- フェンシクリジン（ＰＣＰ）、マグネシウム、および／またはＭＫ－８０１（ジゾシルピン）結合部位での非競合的拮抗作用によって前記ＮＭＤＡ受容体を遮断する前記薬剤が、メマンチン、ケタミン、フェンシクリジン、３－ＭＥＯ－ＰＣＰ、８Ａ－ＰＤＨＱ、アマンタジン、アトモキセチン、ＡＺＤ６７６５、アグマチン、デルセミン、デルセミン、デキストラロルファン、デキストロメトルファン、デキストロルファン、ジフェニジン、エタノール、エチシリジン、ガシクリジン、メトキセタミン（ＭＸＥ）、ミノサイクリジン、ニトロメマンチン、亜酸化窒素、ＰＤ－１３７８８９、ロリシクリジン、テノシクリジン、メトキシジン、チレタミン、ネラメキサン、エリプロジル、エトキサドロール、デキソキサドロール、ＷＭＳ－２５３９、ＮＥＦＡ、レマセミド、硫酸マグネシウム、アプチガネル、ＨＵ－２１１、フペルジンＡ、ジペプチドＤ－Ｐｈｅ－Ｌ－Ｔｙｒ、イボゲイン、キョウチクトウ科、レマセミド、リンコフィリン、ガバペンチン、またはジゾシルピン（ＭＫ－８０１）である、請求項７９に記載の方法。
- グリシン結合部位での非競合的拮抗作用によって前記ＮＭＤＡ受容体を遮断する前記薬剤が、（ＧＬＹＸ－１３）、ＮＲＸ－１０７４、７－クロロキヌレン酸、４－クロロキヌレン（ＡＶ－１０１）、５，７－ジクロロキヌレン酸、キヌレン酸、ＴＫ－４０（ＧｌｕＮ１グリシン結合部位での競合的拮抗薬）、１－アミノシクロ－プロパンカルボン酸（ＡＣＰＣ）、Ｌ－フェニルアラニン、またはキセノンである、請求項７９に記載の方法。
- 治療有効量のグルタミン酸受容体拮抗薬を前記対象に投与することをさらに含む、請求項３６に記載の方法。
- ａ）前記ダントロレンを含む医薬組成物を前記対象に鼻腔内投与する前に、前記対象から脳脊髄液（ＣＳＦ）を得ることと、
ｂ）前記ＣＳＦ中のグルタミン酸のレベルを決定することと、をさらに含み、
対照の対象から得られたＣＳＦ中のグルタミン酸のレベルよりも高い、ステップ（ｂ）で決定されたグルタミン酸のレベルが、ダントロレンによる処置に対する前記対象の適合性を示す、請求項３６に記載の方法。 - 前記治療有効量の前記グルタミン酸受容体拮抗薬を投与する前に、前記対象からＣＳＦを得ることと、前記ＣＳＦ中のグルタミン酸のレベルを決定することと、をさらに含み、対照の対象から得られたＣＳＦ中のグルタミン酸のレベルよりも高い、決定されたグルタミン酸のレベルが、グルタミン酸受容体拮抗薬による処置に対する前記対象の適合性を示す、請求項８４に記載の方法。
- 前記グルタミン酸受容体拮抗薬が、グルタミン酸結合部位での競合的拮抗作用によってＮＭＤＡ受容体を遮断する薬剤であるか、またはグリシン、フェンシクリジンおよび／もしくはマグネシウム結合部位での非競合的拮抗作用によって前記ＮＭＤＡ受容体を遮断する薬剤である、請求項８５に記載の方法。
- グルタミン酸結合部位での競合的拮抗作用によって前記ＮＭＤＡ受容体を遮断する前記薬剤が、セルフオテル（ＣＧＳ１９７５５）アプチガネル（ＣＮＳ１１０２）、ＣＧＰ３７８４９、ＡＰＶもしくはＡＰ－５（Ｒ－２－アミノ－５－ホスホノペンタノエート）、２－アミノ－７－ホスホノ－ヘプタン酸（ＡＰ－７）、３－［（Ｒ）－２－カルボキシピペラジン－４－イル］－プロプ－２－エニル－１－ホスホン酸（ＣＰＰｅｎｅ）、および／またはアスパルテームである、請求項８６に記載の方法。
- フェンシクリジン（ＰＣＰ）、マグネシウム、および／またはＭＫ－８０１（ジゾシルピン）結合部位での非競合的拮抗作用によって前記ＮＭＤＡ受容体を遮断する前記薬剤が、メマンチン、ケタミン、フェンシクリジン、３－ＭＥＯ－ＰＣＰ、８Ａ－ＰＤＨＱ、アマンタジン、アトモキセチン、ＡＺＤ６７６５、アグマチン、デルセミン、デルセミン、デキストラロルファン、デキストロメトルファン、デキストロルファン、ジフェニジン、エタノール、エチシリジン、ガシクリジン、メトキセタミン（ＭＸＥ）、ミノサイクリジン、ニトロメマンチン、亜酸化窒素、ＰＤ－１３７８８９、ロリシクリジン、テノシクリジン、メトキシジン、チレタミン、ネラメキサン、エリプロジル、エトキサドロール、デキソキサドロール、ＷＭＳ－２５３９、ＮＥＦＡ、レマセミド、硫酸マグネシウム、アプチガネル、ＨＵ－２１１、フペルジンＡ、ジペプチドＤ－Ｐｈｅ－Ｌ－Ｔｙｒ、イボゲイン、キョウチクトウ科、レマセミド、リンコフィリン、ガバペンチン、またはジゾシルピン（ＭＫ－８０１）である、請求項８６に記載の方法。
- グリシン結合部位での非競合的拮抗作用によって前記ＮＭＤＡ受容体を遮断する前記薬剤が、（ＧＬＹＸ－１３）、ＮＲＸ－１０７４、７－クロロキヌレン酸、４－クロロキヌレン（ＡＶ－１０１）、５，７－ジクロロキヌレン酸、キヌレン酸、ＴＫ－４０（ＧｌｕＮ１グリシン結合部位での競合的拮抗薬）、１－アミノシクロ－プロパンカルボン酸（ＡＣＰＣ）、Ｌ－フェニルアラニン、またはキセノンである、請求項８６に記載の方法。
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