CN114828848A - 用于治疗阿尔茨海默氏病的鼻内丹曲林施用 - Google Patents

Abstract

用于抑制患有或怀疑患有阿尔茨海默氏病(AD)的受试者的神经元中受损的神经发生和/或突触发生的方法、用于改善和/或减缓在神经病理和认知功能障碍发作之后认知功能下降的方法，所述神经病理和所述认知功能障碍由AD引起，用于改善和/或减缓AD的症状发作之前记忆下降的方法、用于增加丹曲林在脑中的浓度和持续时间的方法以及用于改善和/或减缓AD的症状发作之后记忆下降的方法，所述方法包括向有需要的受试者鼻内施用一定量的药物组合物，所述药物组合物包括有效抑制N‑甲基‑D‑天冬氨酸(NMDA)受体和/或兰尼碱受体(RyR)的过度活化的丹曲林。方法进一步包括向所述受试者施用治疗有效量的谷氨酸受体拮抗剂。

Description

用于治疗阿尔茨海默氏病的鼻内丹曲林施用

相关申请的交叉引用

本申请要求于2019年6月28日提交的美国临时申请第62/868,820号的优先权，所述美国临时申请特此通过引用整体并入。

政府权益声明

本发明是根据美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的授权号GM084979和AG061447在政府支持下进行的。美国政府享有本发明的一定权利。

技术领域

本发明涉及用于通过鼻内丹曲林施用治疗阿尔茨海默氏病的方法。本发明还涉及抑制患有或怀疑患有阿尔茨海默氏病(AD)的受试者的神经元中受损的神经发生和/或突触发生的方法；改善和/或减缓在神经病理和认知功能障碍发作之后认知功能下降的方法，所述神经病理和所述认知功能障碍由AD引起；改善AD的症状发作之前的记忆的方法和改善AD的症状发作之后的记忆的方法，所述方法包括向有需要的受试者鼻内施用有效抑制包括丹曲林的药物组合物的兰尼碱受体(RyR)和/或N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体的过度活化的量。

背景技术

阿尔茨海默氏病(AD)是一种破坏性神经退行性疾病。在过去的几十年中，针对淀粉样蛋白病理学的新药开发的不足需要探索可能是AD认知功能障碍的主要原因的替代途径或机制。

散发性AD(SAD)占AD患者的超过95％，但其病理学在很大程度上是未知的。缺乏对SAD机制的了解以及其不充分的细胞或动物模型限制了治疗AD的新有效药物的开发。尽管家族性阿尔茨海默氏病(FAD)的病理学和机制已经得到了相对深入的研究，但其主要是在细胞和动物模型中进行的，而不是在患者中。

将恶性高热的死亡率从85％降低到5％以下的丹曲林是唯一获得FDA批准的临床可用药物，用于治疗这种严重的全身麻醉介导的并发症。长期使用口服丹曲林也用于治疗肌肉痉挛，其中副作用相对可以忍受。鉴于目前用于AD的药物和疗法的不足，迫切需要改善的组合物和治疗AD和其中存在和与其相关的功能障碍的有效治疗方法，所述功能障碍包含但不限于在AD的症状发作之前和之后两者，脑神经元的神经发生和/或突触发生受损，以及认知功能丧失。

发明内容

一方面，本发明提供了一种用于抑制患有或怀疑患有阿尔茨海默氏病(AD)的受试者的神经元中受损的神经发生和/或突触发生的方法，所述神经发生和/或突触发生的损伤至少部分地由内质网(ER)兰尼碱受体(RyR)的过度活化引起，所述方法包括向所述受试者鼻内施用一定量的药物组合物，所述药物组合物包括有效减少源自AD患者的细胞中的ER钙离子(Ca²⁺)的释放的丹曲林(dantrolene)。

另一方面，本发明提供了一种用于改善和/或减缓神经病理和认知功能障碍发作之后认知功能下降的方法，所述神经病理和所述认知功能障碍由阿尔茨海默氏病(AD)引起，所述方法包括向有需要的受试者鼻内施用一定量的药物组合物，所述药物组合物包括有效抑制NMDA受体和/或兰尼碱受体的过度活化的丹曲林。

在另外的方面，本发明提供了一种用于在阿尔茨海默氏病(AD)的症状发作之前改善记忆的方法，所述方法包括向有需要的受试者鼻内施用一定量的药物组合物，所述药物组合物包括有效抑制NMDA受体和/或兰尼碱受体的过度活化的丹曲林。

另一方面，本发明提供了一种用于在阿尔茨海默氏病(AD)的症状发作之后改善记忆丧失的方法，所述记忆丧失由AD引起，所述方法包括向有需要的受试者鼻内施用一定量的药物组合物，所述药物组合物包括有效抑制NMDA受体和/或兰尼碱受体的过度活化的丹曲林。

另一方面，本发明提供了一种用于增加脑中的丹曲林的浓度和持续时间的方法，所述方法包括向有需要的受试者鼻内施用一定量的包括丹曲林的药物组合物。

在另外的方面，本发明提供了一种用于抑制患有或怀疑患有阿尔茨海默氏病(AD)的受试者的神经元中受损的神经发生和/或突触发生的方法，其中所述神经发生和/或突触发生的损伤至少部分地由内质网(ER)兰尼碱受体(RyR)的过度活化引起，所述方法包括：a)向所述受试者鼻内施用一定量的药物组合物，所述药物组合物包括有效减少ER钙离子(Ca^{2 +})的释放的丹曲林；以及b)向步骤(a)的所述受试者施用治疗有效量的谷氨酸受体拮抗剂。

根据以下详细实例和附图，本发明的其它特征和优点将是显而易见的。然而，应当理解，虽然详细说明和具体实例指示了本发明的某些实施例，但仅以说明的方式给出，因为在本发明的精神和范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员来说将变得明显。

附图说明

以下附图形成本说明书的一部分，并且被包含以进一步说明本公开的某些方面，通过参考这些附图中的一个或多个并结合本文呈现的具体实施例的具体实施方式，可以更好地理解所述本公开的发明。本专利或申请文件含有至少一幅彩色附图。在请求并支付必要的费用后，官方将会提供带有一幅或多幅彩色附图的本专利或专利申请公开物的副本。

图1A-1B示出了丹曲林促进了来自阿尔茨海默氏病(AD)患者的诱导多能干细胞(iPSC)的细胞活力并抑制了细胞增殖受损。图1A示出了用丹曲林(DAN；30μM)处理iPSC 24小时不会影响来自健康人受试者(CON)的iPSC，但使来自散发性阿尔茨海默氏病(SAD；P＝0.006)和家族性阿尔茨海默氏病(FAD；P<0.0001)患者的iPSC的细胞活力显著更高。对于细胞活力，相互作用、处理和细胞类型都是变异的重要来源(分别为F[2,40]＝92.56，P<0.0001；F[1,40]＝110.40，P<0.0001；以及F[2,40]＝92.81，P<0.0001)。图1B示出了与对照健康受试者细胞(P＝0.022)相比，通过溴脱氧尿苷(BrdU)阳性细胞的百分比测量的细胞增殖是显著受损的家族性阿尔茨海默氏病细胞。与媒剂对照二甲亚砜(DMSO)相比，丹曲林使家族性阿尔茨海默氏病细胞的增殖更大(P＝0.008，家族性阿尔茨海默氏病丹曲林相比于二甲亚砜)。对于增殖，丹曲林处理和细胞类型是变异的重要来源(分别为F[2,30]＝5.44；P＝0.009；以及F[1,30]＝9.81，P<0.039)。所有数据均表示为五到八个独立实验的平均值±SD(在图1A中，家族性阿尔茨海默氏病，n＝7；对照，n＝8；散发性阿尔茨海默氏病，n＝8；并且在图1B中，用二甲亚砜处理的对照，n＝7；用丹曲林处理的对照，n＝5；散发性阿尔茨海默氏病DMSO和丹曲林组两者，n＝5；家族性阿尔茨海默氏病二甲亚砜，n＝8；丹曲林，n＝6)。**P<0.01；***P<0.001。用Sidak的多重比较测试(Sidak的MCT)通过双向方差分析来确定统计显著性。MTT，3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑。

图2A-2B示出了丹曲林改善了神经祖细胞分化为源自阿尔茨海默氏病(AD)患者的细胞中的未成熟神经元的损伤。神经祖细胞(NPC)向未成熟神经元的分化(分化第23天)在散发性阿尔茨海默氏病(SAD)和家族性阿尔茨海默氏病(FAD)两者中均显著受损，这被丹曲林(DAN)抑制。图2A示出了通过双皮质素(DCX(红色)，用或不用丹曲林处理3天，从诱导多能干细胞(iPSC)的诱导第0天开始)染色的未成熟神经元的代表性免疫荧光图像。比例尺，100μm。图2B示出了与对照(CON)相比，散发性阿尔茨海默氏病细胞(P＝0.004)和家族性阿尔茨海默氏病细胞(P＝0.011)两者的分化均受损。然而，在用丹曲林处理之后，散发性阿尔茨海默氏病(P＝0.008)和家族性阿尔茨海默氏病(P＝0.008)细胞的分化被增强。用Sidak的多重比较测试通过双向方差分析，细胞类型和处理是变异的重要来源(分别为F[2,30]＝8.749；P＝0.001；以及F[1,30]＝25.08，P<0.0001)。数据由六个独立实验的平均值±SD表示(对于所有组，n＝6)。*P<0.05；**P<0.01。DAPI，4',6-双脒基-2-苯基吲哚；DMSO，二甲亚砜。

图3A-3F示出了丹曲林抑制了阿尔茨海默氏病患者细胞中的神经祖细胞(NPC)向皮质神经元和基底前脑胆碱能神经元(BFCN)的分化。图3A示出了NPC向成熟皮质神经元的分化时间线。图3B示出了具有甲状腺激素受体-b(Trb1，红色)和微管相关蛋白-2(MAP2，绿色)的双染色神经元的代表性免疫荧光图像。比例尺，100μM。图3C示出了与对照健康受试者(CON)细胞相比，人散发性阿尔茨海默氏病(SAD；P<0.0001)细胞和家族性阿尔茨海默氏病(FAD)细胞(P＝0.022)两者中的Trb1阳性细胞的百分比显著降低，但在用丹曲林处理之后，SAD细胞的TrB1阳性细胞百分比显著增加(DAN或Dan；P<0.0001)。相互作用、细胞类型和处理是变异的重要来源(分别为F[2,24]＝14.84，P<0.0001；F[2,24]＝15.94，P<0.0001；以及F[1,24]＝7.53，P＝0.011)。图3D示出了神经祖细胞(NPC)分化为成熟BFCN神经元的时间线。图3E示出了从诱导诱导多能干细胞(iPSC)分化为神经元开始，用或不用丹曲林处理3天，MAP2(红色)和胆碱乙酰转移酶(ChAT或CHAT)阳性细胞(绿色)的双染色成熟神经元的代表性免疫荧光图像。比例尺，100μM。图3F示出了SAD(P＝0.004)和细胞FAD(P＝0.017)细胞两者中ChAT阳性细胞(基底前脑胆碱能神经元(BFCN))的百分比显著降低，这通过丹曲林对FAD细胞(P＝0.008)但不是对SAD细胞(P＝0.067)的处理被改善。相互作用、细胞类型和处理是变异的重要来源(分别为F[2,24]＝5.61,P＝0.010；F[2,24]＝6.27，P＝0.006；以及F[1,24]＝14.78，P＝0.001)。使用双向方差分析(ANOVA)随后使用Sidak的多重比较测试确定统计显著性。所有数据均表示为来自五个独立实验的平均值±SD(对于所有组，n＝5)。*P<0.05；**P<0.01；****P<0.0001。DMSO，二甲亚砜；SHH，重组人声波刺猬。

图4A-4E示出了丹曲林抑制了阿尔茨海默氏病细胞中的神经元的树突交叉和突触密度的损伤。从诱导iPSC分化开始，NPC用胰岛素和丹曲林(DAN)处理3天分化为成熟皮质神经元。树突与皮质神经元周围的同心圆之间的平均交叉点数量示出为与体细胞的圆距离(μm)的函数。图4A示出了散发性阿尔茨海默氏病(SAD)细胞和家族性阿尔茨海默氏病(FAD)细胞两者中的交叉点数量显著减少，这在SAD细胞中被丹曲林抑制。图4B示出了与对照(CON)相比，SAD细胞(p<0.0001)和FAD细胞(p<0.0001)中距体细胞150μM左右距离处的平均交叉点数量较少，但在SAD细胞(p<0.0001)和FAD细胞(P＝0.014)两者中通过丹曲林处理显著更多。相互作用(F[2,12]＝42.18，P<0.0001)、细胞类型(F[2,12]＝273.30，P<0.0001)和丹曲林处理(F[1,12]＝78.48，P<0.0001)是变异的重要来源。通过双向方差分析和Sidak的多重比较测试确定统计显著性。图4C示出了通过突触后标志物密度蛋白95(PSD95；红色)和突触前标志物突触蛋白-1(绿色)双重免疫染色确定的突触密度。比例尺，100μM。图4D示出了与对照相比，SAD细胞(P＝0.001)和FAD细胞(P＝0.001)两者的PSD95密度显著更低，但在通过丹曲林处理的FAD细胞(P<0.0001)中显著更高。相互作用(F[2,23]＝8.78，P＝0.002)、细胞类型(F[2,23]＝25.36，P<0.0001)和丹曲林处理(F[1,23]＝28.60，P<0.0001)是变异的重要来源。图4E示出了突触蛋白-1在SAD(P＝0.001)和FAD(p<0.0001)细胞中也显著减少，并且在FAD细胞中通过丹曲林显著增加(p<0.0001)并且在用丹曲林处理的FAD细胞中显著更高(P<0.0001)。相互作用(F[2,23]＝18.12，P<0.0001)、细胞类型(F[2,23]＝21.46，P<0.0001)和丹曲林处理(F[1,23]＝7.18，P＝0.013)是变异的重要来源。数据由至少四个独立实验的平均值±SD表示：对照和FAD细胞(N＝5)和SAD细胞(N＝4)。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。通过双向方差分析和Sidak的多重比较测试确定统计显著性。DMSO，二甲亚砜。

图5A-5D示出了源自SAD或FAD患者的iPSC中的2型兰尼碱受体(RyR-2)增加。图5A-5B示出了2型兰尼碱受体(RyR、RyR-2或RYR-2)RyR-2s在SAD细胞和FAD细胞两者中均增加，并且在来自患者的FAD细胞中显著更多，通过免疫印迹(蛋白质印迹)确定。图5C和5D类似地示出了通过免疫荧光染色确定的SAD细胞中的RyR-2显著更多。所有数据都是来自四次独立实验(N＝4次复制，图5B)或7次独立实验(N＝7次复制，图5D)的平均值±SD。图5B中的数据是非参数的(达戈斯提诺和皮尔逊检验多项正态性测试(D'Agostino-Pearson omnibusnormality test))，随后通过克鲁斯卡尔-沃利斯测试(Kruskall-Wallis test)(P＝0.132)和邓恩多重比较测试(Dunn's multiple comparison test)(P＝0.158)与对照健康受试者(CON)细胞相比进行分析。图5D中的数据也是非参数的，并且通过克鲁斯卡尔-沃利斯测试(P＝0.002)，随后通过邓恩多重比较测试(Dunn's MCT)进行分析。*P＝0.020；**P＝0.002。比例尺，25μm(图5C)。DAPI，4',6-双脒基-2-苯基吲哚。

图6A-6D示出了在来自阿尔茨海默氏病(AD)患者的诱导多能干细胞(iPSC)中，丹曲林显著抑制N-甲基-d-天冬氨酸(NMDA)介导的胞质Ca²⁺浓度([Ca²⁺]_c)升高。NMDA(500μM)在散发性阿尔茨海默病(SAD)细胞和家族性阿尔茨海默病(FAD)细胞中诱导由曲线下面积(AUC；图6A-6D)表示的积分胞质Ca²⁺相比于正常人受试者(CON)的更大总体暴露(分别为对于散发性阿尔茨海默氏病，P＝0.041，对于家族性阿尔茨海默氏病，P＝0.008)。丹曲林(DAN，30μM)改善了家族性阿尔茨海默氏病细胞中NMDA介导的[Ca²⁺]_c和AUC升高(分别为对于峰值，P＝0.436，对于AUC，P<0.0001；图6B、6D)。所有数据均表示为来自三个独立实验(N＝3)的中值[25th,75th]。图6C中的数据也是非参数的，并且通过克鲁斯卡尔–沃利斯测试(P＝0.020)，随后通过邓恩多重比较测试进行分析。图6D的数据也是非参数的，并且使用克鲁斯卡尔–沃利斯测试(P<0.001)，随后通过邓恩多重比较测试进行分析。*P＝0.041，**P＝0.008，****P<0.0001。

图7A-7G示出了丹曲林对来自阿尔茨海默氏病患者的基底前脑胆碱能神经元中的三磷酸腺苷(ATP)介导的胞质钙(Ca²⁺)浓度([Ca²⁺]_c)升高的影响。提供了胞质Ca²⁺浓度的变化(图7A-7D)和对应的统计学分析(图7E-7G)。比较处理(ATP，ATP+Ca²⁺)和细胞类型进行了双向方差分析：对照(CON)、散发性阿尔茨海默氏病(SAD)、家族性阿尔茨海默氏病(FAD)。在存在1mM胞外钙(ATP+Ca²⁺；图7A、7E)的情况下，ATP(30μM)是峰值胞质Ca²⁺浓度[Ca²⁺]_c的重要变异来源(F[1,35]＝14.90，P＝0.0005)，与对照细胞相比，在散发性阿尔茨海默氏病细胞中的浓度显著更高(P＝0.049)。在不存在1mM胞外Ca²⁺(ATP)的情况下，与在存在1mM的胞外Ca²⁺(ATP+Ca²⁺)的情况下的家族性阿尔茨海默氏病细胞相比，ATP使家族性阿尔茨海默氏病细胞中的ATP诱导的峰值[Ca²⁺]_c显著更低(P＝0.031)。(图7B、7E)此外，具有胞外钙(ATP+Ca²⁺)的ATP是积分胞质Ca²⁺(曲线下面积[AUC])的变异的重要来源(F[1,35]＝71.87，P<0.0001)，与单独具有ATP的相同细胞(ATP；E)相比，对照(P＝0.0002)、散发性阿尔茨海默氏病(P＝0.005)和家族性阿尔茨海默氏病(P<0.0001)细胞的曲线下面积显著更高。丹曲林(DAN，30μM)用ATP加胞外Ca²⁺(ATP+Ca²⁺+DAN)预处理细胞是峰值胞质[Ca²⁺]_c的阿尔茨海默氏病细胞类型的变异的重要来源(F[2,42]＝3.65，P＝0.035)，尽管在各组之间没有检测到显著差异(图7C、7F)。添加丹曲林(ATP+Ca²⁺+DAN)也是AUC的阿尔茨海默氏病细胞类型的显著变异来源(F[1,40]＝30.60，P<0.0001)，与仅具有ATP+Ca²⁺的细胞相比，对照(P＝0.033)和家族性阿尔茨海默氏病细胞(P＝0.015)的AUC显著降低(图7C、7F)。丹曲林(30μM)在不存在胞外Ca²⁺(ATP+DAN；D)的情况下用ATP预处理细胞是峰值胞质[Ca²⁺]_c上的变异的重要来源(F[1,33]＝10.01，P＝0.003)，尽管各组之间没有发现显著差异(图7G)，并且Ca²⁺的缺失是AUC的显著变异来源(F[1,33]＝5.95，P＝0.020)，其中各组之间未检测到差异(图7G)。峰值和积分Ca2+浓度示出为来自正常人受试者的CON细胞的基线百分比。所有数据(图7E-7G)均表示为来自至少五个独立实验的平均值±SD(CON，n＝6次复制；散发性阿尔茨海默氏病，n＝5次复制；家族性阿尔茨海默氏病，n＝8-9次复制)。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。显著性通过双向方差分析，随后通过Sidak的多重比较测试确定。

图8A-8E示出了源自阿尔茨海默氏病患者的神经元中的溶酶体ATP酶和酸度低于对照细胞中的溶酶体ATP酶和酸度。图8A示出了液泡型H+-ATP酶(V-ATP酶；红色)的共定位，使用免疫染色用靶向溶酶体(LAMP-2，绿色)、胞内体(EEA，绿色)和内质网(钙联结蛋白，绿色)的特异性标志物在健康人受试者(CON)、散发性阿尔茨海默氏病(SAD)或家族性阿尔茨海默氏病(FAD)患者的诱导多能干细胞(iPSC)中进行测量。图8B示出了在CON、SAD和FAD细胞(4',6-双脒基-2-苯基吲哚[DAPI]，蓝色)中通过溶酶体阳性酸性媒剂(红色)测量的细胞酸度。图8C示出溶酶体(LAMP-2)中的V-ATP酶在SAD细胞(P＝0.001)和FAD细胞(P＝0.010)中显著低于对照。相互作用(F[4,23]＝4.35，P＝0.008)和细胞器类型(F[2,23]＝29.15，P<0.0001)有显著的变异来源。图8D示出了在添加丹曲林(DAN,30μM)的情况下，与对照相比，FAD细胞中的溶酶体(LAMP-2)中的V-ATP酶不再显著降低(P＝0.965)，但在SAD细胞中仍显著降低(P＝0.007)。另外，与SAD(P＝0.001)细胞和FAD(P<0.0001)细胞相比，对照的内质网(钙联结蛋白)中的v-ATP酶显著降低。存在相互作用(F[4,27]＝8.66，P＝0.0001)、细胞器类型(F[2,27]＝79.49，P<0.0001)和细胞类型(F[2,27]＝5.96，P＝0.007)变异的显著来源。图8E示出了与对照细胞相比，散发性阿尔茨海默氏病(P<0.0001)和家族性阿尔茨海默氏病(P＝0.0004)中溶酶追踪剂阳性酸性囊泡显著降低。与二甲亚砜(DMSO)相比，丹曲林还显著增加了散发性阿尔茨海默氏病(P＝0.025)细胞和家族性阿尔茨海默氏病(P＝0.036)细胞两者中的跟踪剂阳性酸性囊泡。细胞类型和丹曲林是变异的重要来源(分别为F[2,19]＝29.88，P<0.0001；以及F[1,19]＝23.16，P＝0.0001)。所有数据均表示为来自四个独立对象(对于所有组，n＝4次复制)的平均值±SD，并且通过双向方差分析，随后通过Sidak的多重比较测试进行分析。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。

图9A-9F示出了丹曲林增加了来自AD患者的iPSC中的LC3II水平。图9A、9C示出了来自散发性阿尔茨海默氏病(SAD)、家族性阿尔茨海默氏病(FAD)和健康人对照(CON)的诱导多能干细胞(iPSC)中的溶酶体(LAMP2、绿色)中的LC3II(红色)与二甲亚砜(DMSO)、丹曲林(DAN)或丹曲林加巴弗洛霉素(BAFI)的代表性免疫组织化学图像(图9A)和代表性蛋白质印迹(图9C)。图9B示出了对双标记免疫染色细胞的定量示出了，与二甲亚砜或丹曲林相比，丹曲林与巴弗洛霉素分别显著增加SAD(P<0.0001)细胞、FAD(P<0.0001)细胞和CON(P<0.0001)细胞中的溶酶体(LAMP-2)中的LC3II。使用双向方差分析和Sidak的多重比较测试，存在相互作用(F[4,35]＝8.18，P<0.0001)、细胞类型(F[2,35]＝24.08，P<0.0001)和处理(F[2,35]＝177.00，P<0.0001)变化的显著来源。图9D示出了对蛋白质印迹的定量类似地示出了，与DMSO或DAN单独相比，丹曲林与巴弗洛霉素使SAD(P<0.0001)细胞、FAD(P<0.0001)细胞和CON(P<0.0001)细胞中的溶酶体(LAMP-2)中的LC3II分别显著增加。与用二甲亚砜细胞治疗的家族性阿尔茨海默氏病相比，用丹曲林治疗的家族性阿尔茨海默氏病细胞的LC3II也显著增加(P＝0.0004)。相互作用(F[4,18]＝6.92，P＝0.002)和处理(F[2,18]＝303.40，P<0.001)是使用双向方差分析和Sidak的多重比较测试的显著变异来源。图9E示出了CON、SAD和FAD细胞中的P62水平的代表性蛋白质印迹。图9F示出了，使用克鲁斯卡尔-沃利斯测试(P＝0.004)随后邓恩多重测试，对P62蛋白质印迹的定量发现与CON相比，FAD细胞(P＝0.015)中的这种细胞应激标志物显著增加。所有数据均表示为来自至少三个独立实验的平均值±SD(对于所有组，n＝3次复制)。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。

图10A-10D示出了对口服和鼻内施用之后丹曲林在小鼠血浆和脑中的药代动力学分析。图10A示出了在鼻内施用(5mg/kg)之后20分钟和口服施用(5mg/kg)之后50分钟出现的峰值丹曲林血浆浓度(C_max)。与使用Sidak-Holm方法通过多次t测试确定的口服施用相比，***p＝0.0000089，α＝0.05％。鼻内时间点，10、30、150、180分钟，n＝5；20分钟，n＝8；50-120分钟，n＝4；口服时间点，10-120分钟；n＝5。图10B示出了在鼻内和口服施用丹曲林(**p＝0.0079)之后血浆中的积分丹曲林暴露量(图A曲线下的面积)(左)和Cmax(右)与非参数未配对曼-惠特尼测试(Mann-Whitney test)(双尾)的比较。鼻，血浆(20分钟)，n＝8；口服，血浆，(50分钟)，n＝4；图10C示出了在大多数时间点处鼻内施用(5mg/kg)之后丹曲林的脑浓度大于口服施用之后。Cmax分别发生在鼻内施用之后20分钟和口服施用之后50分钟。与对照组(鼻内与口腔)相比，并使用Sidak-Holm方法通过多个t测试确定，***p＝0.00000012，**p＝0.0035(30分钟)，**p＝0.0037(50分钟)，**p＝0.0027(120分钟)，α＝0.05％。鼻内时间点、10、30、150、180分钟，n＝5；20分钟，n＝8；50-120分钟，n＝4；口服时间点，10-120分钟；n＝5。图10D示出了在鼻内和口服施用丹曲林之后脑组织中的积分丹曲林暴露量(图C曲线下的面积)(左)和在鼻内和口服施用丹曲林(**p＝0.0079)之后脑组织Cmax(右)与非参数未配对曼-惠特尼测试(双尾)的比较。鼻脑和口脑，n＝5；鼻脑(20分钟)，n＝8；口脑(50)分钟，n＝5。所有数据均表示为平均值±95％CI。

图11示出了鼻内与口服施用之后脑中丹曲林浓度随时间的变化。通常，鼻内施用与口服施用之间的丹曲林脑/血浆比率没有显著差异。在50分钟时，口服丹曲林脑血浆比率大于鼻内丹曲林。口服脑/血浆比率降至零，而鼻内丹曲林脑/血浆比率持续180分钟。数据表示为平均值±95％CI，使用Holm-Sidak方法通过多次t测试确定显著性，α＝5.00％。％。鼻内时间点、10、30、150、180分钟，n＝5；20分钟，n＝8；50-120分钟，n＝4；口服时间点，10-120分钟；n＝5。

图12A-12B示出了丹曲林的长期鼻内施用不影响嗅觉或运动功能。图12A示出了在鼻内施用丹曲林(5mg/kg，3次/周)或媒剂对照3周之后，通过动物用其前爪取回埋藏的食物所需的时间(以秒为单位)来测量嗅觉。图12B示出了，在鼻内施用丹曲林4个月之后(5mg/kg，3次/周)，运动功能通过寻找食物的时间长度(图12A)和在旋转棒上花费的时间长度确定(图12B)。在嗅觉或运动功能方面没有检测到显著差异。数据表示为均值±95％CI，用非参数非配对曼-惠特尼测试进行分析，对于所有组，n＝10。

图13示出了血脑屏障(BBB)抑制剂尼莫地平(nimodipine)和依克立达(elacridar)对丹曲林的通过没有影响。在存在或不存在BBB泵抑制剂(P-gp/BCRP)、尼莫地平(Nim，2mg/kg)或依克立达(Elac，10mg/kg)的情况下，鼻内施用丹曲林(5mg/kg)20分钟之后，所有溶解在与丹曲林钠(Ryanodex)相同的媒剂中，丹曲林脑/血浆比率被确定为丹曲林穿过BBB的量度。与单独的丹曲林相比，两种抑制剂均未检测到显著差异。数据表示为均值±95％CI，n＝5(Dan，Dan+Nim)，n＝6(Dan+Elac，并使用克鲁斯卡尔-沃利斯非参数方差分析和邓恩多重比较测试进行分析。

图14示出了实例3的实验设计：处理、行为测试和安乐死的时间线。基于基因型(5XFAD、WT)、治疗开始时的年龄(早期治疗(ETG)、晚期治疗(LTG)组)和治疗的施用途径(鼻内、皮下)设计了十二个实验组。

图15A-15D示出了鼻内丹曲林提供了比皮下丹曲林更大的药物渗透入脑和更高的脑浓度。图15A示出了B6SJLF1/J小鼠皮下(蓝色)或鼻内(红色)施用之后20和60分钟血浆中丹曲林的浓度。双向方差分析示出了，时间(p＝0.015；F(1,16)＝7.427)和施用途径(p＝0.0004；F(1,16)＝19.75)两者均存在显著差异来源。通过Sidak的多重比较，皮下施用20分钟时血浆中的丹曲林浓度显著增加(p＝0.0014)。图15B示出了皮下和鼻内途径之后脑丹曲林浓度。双向方差分析示出了施用途径存在显著差异(p<0.0001；F(1,16)＝27.07)，并且通过Sidak的多重比较，在60分钟时鼻内施用的丹曲林浓度显著高于皮下施用(p＝0.0002)。图15C示出了丹曲林脑/血浆浓度比率，表示丹曲林穿透脑的能力。双向方差分析示出了施用途径存在显著差异(p<0.0001；F(1,16)＝43.65)，并且通过Sidak的多重比较，鼻内施用20分钟(p＝0.0032)和60分钟(p<0.0001)时脑/血浆比率显著增加。图15D示出了使用线性梯形法计算的丹曲林浓度曲线下面积(AUC)，以反映整体丹曲林暴露量。所有数据均以95％CI的平均值表示，对于所有组，N＝5/组，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。

图16A-16B示出了丹曲林的鼻内施用对AD小鼠的记忆具有更好的治疗效果。记忆通过情境恐惧条件反射(CFC；海马体依赖)和提示恐惧条件反射(FC线索；海马体无关)测试进行评估。早期治疗组(ETG)分别在6个月(6M)和11个月(11M)大时在治疗4个月和9个月之后进行测试，并且晚期治疗组(LTG)在11个月大时治疗5个月之后进行测试。图16A示出了，通过CFC测试，在6个月大时，所有ETG 5XFAD小鼠，包含鼻内施用媒剂(IN-VEH)、丹曲林(IN-DAN)和皮下注射丹曲林(SQ-DAN)，与未经治疗的5XFAD对照(CON)(分别为p＝0.0004；p＝0.0002；p<0.0001)相比，记忆显著提高。IN-VEH和IN-DAN ETG5XFAD小鼠在11个月大时5XFAD小鼠的记忆(分别为p＝0.0246，p＝0.0228)显著大于5XFAD对照。ETG数据使用双向方差分析通过邓尼特多重比较测试(MCT)进行分析。治疗被发现是变异的重要来源(p<0.0001；F(3,49)＝9.536)。在11个月大时，将LTG(11M-LTG)IN-DAN和SQ-DAN与5XFAD对照(CON)进行比较，并且使用克鲁斯卡尔-沃利斯测试通过邓恩MCT分析数据。与CON相比，In-DAN组的记忆显著提高(p＝0.0410)。SQ-DAN的记忆趋于更好，但没有统计学意义(p＝0.1575)。图16B类似地示出，在6个月大时，与对照相比，海马非依赖性记忆(FC提示)在具有IN-VEH(p＝0.0145)、IN-DAN(p＝0.0055)和SQ-DAN(p＝0.001)的ETG中显著改善。在11个月大时，IN-DAN ETG的记忆明显优于5XFAD CON组(p＝0.0011)，使用邓尼特多重比较测试(MCT)的双向方差分析进行分析。治疗被发现是变异的重要来源(p＝0.0013；F(3,49)＝6.095)。ETG中的IN-VEH或SQ-DAN趋向于改善记忆，但没有统计学差异(分别为p＝0.0664，p＝0.1843)。与5XFAD CON相比，使用克鲁斯卡尔-沃利斯测试通过邓恩MCT，IN-DAN或SQ-DANLTG在11个月时未检测到显著的记忆改善。与5xFAD CON相比，所有数据均以95％CI的平均值表示，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。动物编号，ETG 6M：CON n＝13，IN-VEH n＝12，IN-DAN n＝14，IN-SQ n＝14；ETG 11M：CON n＝13，IN-VEH n＝10，IN-DAN n＝11，IN-SQ n＝9；LTG 11M：IN-DAN n＝13，SQ-DAN n＝14，CON＝13，如所示出的ETG 11M的相同对照)。

图17A-17F示出了对长期丹曲林治疗的副作用的评估。对于早期治疗组(ETG)，从2个月大开始和对于晚期治疗组(LTG)6个月大开始，鼻内施用丹曲林(IN-DAN)或媒剂(IN-VEH)和皮下施用丹曲林(SQ-DAN)3×/周施用。图17A示出了运动功能，所述运动功能是在9个月大时使用旋转棒测试对所有组进行测量的。用单向方差分析和邓尼特多重比较测试(MCT)检测到治疗组与对照组之间没有显著差异。(ETG：CON n＝13，IN-VEH n＝10，IN-DANn＝11，SQ-DAN n＝9；LTG：IN-DAN n＝13，SQ-DAN n＝15)。图17B示出了嗅觉，所述嗅觉是在10个月大时使用埋藏食物测试对所有组进行测量的。非参数数据的克鲁斯卡尔-沃利斯测试和邓恩MCT未发现显著差异。(ETG：CON n＝13，IN-VEH n＝10，IN-DAN n＝10，SQ-DAN n＝9；LTG：IN-DAN n＝13，SQ-DAN n＝15)。图17C示出了通过测量血浆丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性来评估的肝功能。与对照组相比，LTG鼻内治疗6个月之后ALT显著增加(p＝0.0364)。使用非参数数据的克鲁斯卡尔-沃利斯测试和邓恩MCT，在其它治疗组与对照组之间没有检测到显著差异。(ETG：CON n＝9，IN-VEH n＝9，IN-DAN n＝8，SQ-DAN n＝8，LTG：IN-DAN n＝9，SQ-DAN n＝7)。所有数据均以95％CI的平均值呈现。图17D示出了在11个月大时在ETG小鼠的H&E染色切片中检查的肝脏病理学。ETG组之间未观察到明显差异(3个切片/动物：CON n＝3，IN-VEH n＝3，IN-DAN n＝3，SQ-DAN n＝3，尺＝50μm)。图17E示出了用丹曲林(IN-DAN，SQ-DAN)或媒剂(IN-VEH)长期治疗(ETG，LTG)之后的死亡率，使用对数秩(Mantel-Cox)测试将其与未经治疗的5XFAD对照进行比较。未检测到丹曲林与媒剂治疗之间的显著差异(p＝0.3636)。图17F示出了在治疗期间监测的体重。使用重复测量双向方差分析，在ETG组中的5XFAD小鼠的生长曲线中未检测到显著差异(p＝0.1478)。(ETG：CON n＝13，IN-VEH n＝10，IN-DAN n＝11，SQ-DAN n＝9；LTG：IN-DAN n＝14，SQ-DAN n＝14)。所有数据均以95％CI的平均值呈现。

图18A-18F示出了丹曲林对5XFAD小鼠齿状回和海马中的淀粉样蛋白斑块水平没有显著影响。图18A-18B示出了(CON)、鼻内媒剂(IN-VEH)、鼻内丹曲林(IN-DAN)和皮下丹曲林(SQ-DAN)治疗的早期治疗组(ETG)和晚期治疗组(LTG)中的5XFAD小鼠的海马和皮质中的6E10免疫反应性的代表性显微照片。(尺＝100μm)。图18C和18E示出了每个测试组的斑块占据的海马体和皮质的面积百分比。治疗组与对照组之间没有发现显著差异。图18D和18F类似地示出了在每个测试组的海马和皮质中计算的每面积(mm²)的淀粉样蛋白斑数量。没有发现显著差异。所有数据均使用非参数数据的克鲁斯卡尔-沃利斯测试和邓恩MCT进行分析。(3个切片/动物；DG和HIP，ETG：CON n＝8，IN-VEH n＝4，IN-DAN n＝6，SQ-DAN n＝6；LTG：IN-DAN n＝6，SQ-DAN n＝7)。数据均以95％CI的平均值呈现。图19A-19A示出了未经治疗的野生型和5XFAD小鼠的记忆障碍。情境恐惧条件反射(CFC，海马依赖性)和提示恐惧条件反射(FC提示，海马非依赖性)记忆均通过恐惧条件反射测试(FC)进行评估。图19A示出了对于CFC，与野生型(WT)小鼠相比，5XFAD(TG)小鼠在6月龄和11月龄时海马依赖性记忆显著受损(分别为P＝0.0015，P＝0.0033)，使用非配对t测试对其进行了分析。遗传学(WT对TG)被发现是记忆受损的重要变异来源(P<0.0001，F(1,47)＝23.44)。图19B类似地示出了与WT-CON小鼠相比，5XFAD-CON小鼠在6月龄和11月龄时海马非依赖性记忆显著受损(分别为P＝0.0019，P＝0.0004)，使用非配对t测试对其进行了分析。遗传学(WT对TG)被发现是记忆受损的重要变异来源(P<0.0001，F(1,47)＝27.94)。数据均以95％CI的平均值呈现。(WT：6Mn＝13，11M n＝12；TG：6M n＝13，11M n＝13)。

图20A-20B示出了野生型(WT)小鼠的记忆。记忆使用情境恐惧条件反射(CFC；海马体依赖)和提示恐惧条件反射(FC线索；海马体无关)测试进行评估。早期治疗组(ETG)分别在6个月(6M)和11个月(11M)大时在治疗4个月和9 37个月之后进行测试，并且晚期治疗组(LTG)在11个月大时治疗5个月之后进行测试。图20A示出了与未经处理的对照相比，在6个月和11个月大时的CFC测试没有显著差异，包含鼻内施用媒剂(IN-VEH)、丹曲林(IN-DAN)和皮下注射丹曲林(SQ-DAN)。使用双向方差分析通过邓尼特多重比较测试(MCT)来分析这2个年龄的ETG数据。通过图克多MCT使用单向方差分析来分析11月龄的LTG数据。图20B类似地示出了所有ETG和LTG组在两个年龄的海马非依赖性记忆(FC提示)中没有显著差异。使用双向方差分析通过邓尼特多重比较测试(MCT)来分析这2个年龄的ETG数据。通过图克多MCT使用单向方差分析来分析11个月大的LTG数据。所有数据均以95％CI的平均值呈现。ETG 6M：CON n＝13，IN-VEH n＝15，IN-DAN n＝18，SQ-DAN n＝15；ETG 11M：CON n＝12，IN-VEH n＝12，IN-DAN n＝17，SQ-DAN n＝13；LTG 11M：IN-DAN n＝13，SQ-DAN n＝13。

图21A-21F示出了通过莫里斯水迷宫(MWM)测试确定的学习和记忆。对于野生型(WT)组和5XFAD(TG)组两者，学习和记忆在10个月大时通过MWM确定。图21A-21B示出了在提示试验期间所有组中定位平台的延迟在连续5天内没有显著降低，这表明小鼠没有视力障碍或游泳困难。图21C-21D示出了在用于确定空间学习能力的地点试验期间，在所有组中定位平台的延迟在连续5天内没有显著降低。图21E示出了与对照相比，所有组的小鼠在目标象限停留的时间百分比(探测试验)没有显著差异。图21F示出了对于所有组，动物穿过平台的次数没有显著差异。通过Sidak的MCT使用单向方差分析来分析数据。所有数据均以95％CI的平均值呈现。动物编号，WT组：ETG：CON n＝14，IN VEH n＝8，IN-DAN n＝12，SQ-DAN n＝13，LTG：IN-DAN n＝14，SQ-DAN n＝13；TG组：ETG：CON n＝13，IN-VEH n＝10，IN-DAN n＝10，SQ-DAN n＝9，LTG：IN-DAN n＝14，SQ-DAN n＝14。

图22A-22F示出了在野生型(WT)组中长期丹曲林治疗之后的副作用。对于早期治疗组(ETG)，从2个月大开始或对于晚期治疗组(LTG)6个月大开始，鼻内施用丹曲林(IN-DAN)或媒剂(IN-VEH)和皮下施用丹曲林(SQ-DAN)3×/周施用。图22A示出了在10个月大时使用旋转棒测试对所有组进行测量的运动功能。通过单向方差分析和邓尼特多重比较测试(MCT)，未检测到治疗组与对照组之间存在显著差异。(ETG：CON n＝14，IN-VEH n＝12，IN-DAN n＝17，SQ-DAN n＝14；LTG：IN-DAN n＝15，SQ-DAN n＝13)。图22B示出了在10个月大时使用埋藏食物测试对所有组进行测量的嗅觉。非参数数据的克鲁斯卡尔-沃利斯测试和邓恩MCT未发现显著差异。(ETG：CON n＝14，IN-VEH n＝8，IN-DAN n＝12，SQ-DAN n＝14；LTG：IN-DAN n＝15，SQ-DAN n＝13)。图22C示出了通过测量血浆丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性评估ETG和LTG的肝功能。与对照组相比，通过邓尼特MCT使用单向方差分析，LTG皮下治疗6个月之后ALT显著增加(p＝0.0142)。通过邓尼特MCT使用单向方差分析，与对照组相比，其它治疗组未检测到显著差异。(ETG：CON n＝7，IN-VEH n＝8，IN-DAN n＝8，SQ-DAN n＝9，LTG:IN-DAN n＝8，SQ-DAN n＝7)。所有数据均以95％CI的平均值呈现。图22D示出了在11个月大时在ETG小鼠的H&E染色切片中检查的肝脏病理学。ETG组(3个切片/动物；CON n＝3，IN-VEHn＝3，IN-DAN n＝3，SQ-DAN n＝3，尺＝50μm)之间没有观察到明显差异。图22E示出了与野生型对照(WT CON)相比，使用对数秩(Mantel-Cox)测试在ETG和LTG小鼠中进行长期丹曲林(IN-DAN，SQ-DAN)和媒剂(IN-VEH)治疗之后的死亡率。未发现显著差异(P＝0.2388)。图22F示出了在动物被安乐死之前在12个月大时评估体重。通过单向方差分析和邓尼特MCT未检测到显著差异。(ETG：CON n＝13，IN-VEH n＝12，IN-DAN n＝16，SQ-DAN n＝13；LTG：IN-DANn＝13，SQ-DAN n＝13)。所有数据均以95％CI的平均值呈现。

图23A-23B示出了野生型(WT-CON)和5XFAD(TG-CON)小鼠中的淀粉样蛋白斑块水平。呈现了野生型(WT)(图23A)和5XFAD(TG)(图23B)对照小鼠的海马和皮质中的6E10免疫反应性的代表性显微照片(尺＝100μm)。

图24A-24D示出了野生型(WT)和5XFAD(TG)小鼠的突触密度。图24A-24B示出了突触功能，其使用蛋白质印迹通过表达PSD95和突触蛋白1确定。图24C-24D示出了，与对照相比，通过单向方差分析和邓尼特MCT，在所有组中未检测到显著差异。每组N＝3。所有数据均以95％CI的平均值呈现。

图25A-25C示出了来自阿尔茨海默氏病患者的诱导多能干细胞向未成熟神经元的分化显著受损。来自健康人受试者(对照)或散发性阿尔茨海默氏病(SAD)或家族性阿尔茨海默氏病(FAD)患者的诱导多能干细胞(iPSC)分化为神经元(23天)。免疫细胞化学用于TUJ1(图25A)、DCX(图25B)和MAP2(图25C)染色。所有数据均表示为平均值±SD。N＝3-10。*P<0.05。

图26示出了来自阿尔茨海默氏病(AD)患者的iPSC衍生的未成熟神经元中谷氨酸剂量依赖性地降低细胞活力。源自来自健康人受试者(对照)、散发性阿尔茨海默氏病(SAD)或家族性阿尔茨海默氏病(FAD)患者的诱导多能干细胞(iPSC)的神经元暴露于不同浓度的谷氨酸中24小时。通过MTT还原测定测量细胞活力。10mM到30mM的谷氨酸以剂量依赖性方式在三种类型的细胞中诱导显著的细胞损伤。所有数据均表示为平均值±SD。N＝3-5，****P<0.0001。

图27示出了在家族性阿尔茨海默氏病(FAD)细胞中，谷氨酸剂量依赖性地降低了更多的ATP量。源自来自健康人受试者(对照)、散发性阿尔茨海默氏病(SAD)或家族性阿尔茨海默氏病(FAD)患者的诱导多能干细胞(iPSC)的神经元暴露于不同浓度的谷氨酸中24小时。ATP量使用市售的荧光素酶-荧光素系统进行评估。所有数据均表示为平均值±SD。N＝5-8，****P<0.0001，^&P<0.05，^&&P<0.01。

图28A-28D示出了丹曲林显著抑制来自家族性阿尔茨海默氏病(FAD)患者的神经元中的谷氨酸介导的线粒体钙浓度异常升高。源自来自健康人受试者(对照)、散发性阿尔茨海默氏病(SAD)或家族性阿尔茨海默氏病(FAD)患者的诱导多能干细胞(iPSC)的神经元暴露于20mM的谷氨酸中1小时，在有或没有丹曲林20μM预处理的情况下。使用基于水母光蛋白水母发光蛋白的探针测量线粒体钙浓度。展示了在没有丹曲林预处理(图28A)或在丹曲林预处理(图28B)的情况下暴露于谷氨酸的线粒体钙浓度变化的典型曲线。与对照神经元相比，谷氨酸20mM增加了FAD神经元中线粒体钙浓度的峰值升高(图28C)和总暴露(AUC(曲线下面积))(图28D)，这通过对丹曲林的预处理消除了。所有数据均表示为平均值±SD。N＝3-9。*P<0.05，**P<0.01。

具体实施方式

可以通过参考形成本公开的一部分的以下详细描述更容易地理解本发明。应当理解，本发明不限于本文描述和/或示出的具体方法、产品、条件或参数，并且本文使用的术语仅出于通过实例描述特定实施例的目的，并非旨在限制要求保护的本发明。

除非本文中另外定义，否则结合本申请使用的科学术语和技术术语将具有本领域的普通技术人员通常理解的含义。进一步地，除非上下文另外需要，否则单数术语应包含复数，并且复数术语应包含单数。

如上文和整个公开中所采用的，除非另有说明，否则以下术语和缩略语应被理解为具有以下含义。

在本公开中，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包含复数指代，并且除非上下文另有明确指示，否则对特定数值的引用至少包含所述特定值。因此，例如，提及“化合物”即提及本领域的技术人员已知的一种或多种此类化合物和其等效物等等。如本文所用，术语“多个”意指多于一个。当表达值的范围时，另一个实施例包含从一个特定值和/或到另一个特定值。类似地，当通过使用先行词“约”将值表示为近似值时，应当理解，特定值形成另一个实施例。所有范围都是包含性的且可组合的。

如本文所用，术语“组分”、“组合物”、“化合物的组合物”、“化合物”、“药物”、“药理活性剂”、“活性剂”、“治疗剂”、“疗法”、“治疗”或“药剂”在本文中可互换使用，是指在施用于受试者(人或动物)时，通过局部和/或全身作用诱导期望的药理学和/或生理学效果的一种或多种化合物或物质的组合物。

如本文所用，术语“治疗”或“疗法”(以及其不同形式)包含预防性(例如，预防性)、治愈性或姑息性治疗。如本文所用，术语“治疗”包含减轻或减少病状、疾病或病症的至少一种不利或负面作用或症状。

术语“受试者”、“个体”和“患者”在本文中可互换使用，并且指动物，例如人，向其提供用根据本发明的药物组合物的治疗，包含预防性治疗。如本文所用，术语“受试者”是指人和非人动物。术语“非人动物”和“非人哺乳动物”在本文中可互换使用并且包含所有脊椎动物，例如，如非人灵长类动物(特别是高等灵长类动物)、绵羊、狗、啮齿动物(例如小鼠或大鼠)、豚鼠、山羊、猪、猫、兔、牛、马等哺乳动物和如爬行动物、两栖动物、鸡和火鸡等非哺乳动物。

一方面，本发明提供了一种用于抑制患有或怀疑患有阿尔茨海默氏病(AD)的受试者的神经元中受损的神经发生和/或突触发生的方法，所述神经发生和/或突触发生的损伤至少部分地由内质网(ER)兰尼碱受体(RyR)的过度活化引起，所述方法包括向所述受试者鼻内施用有效减少包括丹曲林的药物组合物的ER钙离子(Ca²⁺)的释放的量。在实施例中，所述神经发生包括从神经祖细胞(NPC)到未成熟神经元的神经发生，随后是从未成熟神经元到皮质神经元的神经发生。在某些实施例中，所述突触发生发生在皮质神经元中。在一些实施例中，所述皮质神经元是胆碱能神经元。在各个实施例中，所述皮质神经元是基底前脑胆碱能神经元(BFCN)神经元、前额皮质神经元、海马神经元或其组合。在实施例中，所述AD是家族性阿尔茨海默氏病(FAD)。在另一个实施例中，所述AD是散发性阿尔茨海默氏病(SAD)。在特定实施例中，所述RyR是2型RyR(RyR-2)。在特定实施例中，所述RyR是1型RyR(RyR-1)。在特定实施例中，所述RyR是3型RyR(RyR-3)。在特定实施例中，所述RyR是RyR亚型的组合，例如RyR-1、RyR-2、RyR-3，包含所有RyR亚型。在各个实施例中，所述内质网(ER)兰尼碱受体(RyR)的过度活化使线粒体钙升高，从而使ATP减少。在特定实施例中，丹曲林的鼻内施用使升高的线粒体钙降低并且增加胞质ATP。在一些实施例中，每天施用包括丹曲林的药物组合物。在一些实施例中，所述包括丹曲林的药物组合物每周施用三次。在一些实施例中，所述包括丹曲林的药物组合物每周施用一次。在一些实施例中，所述包括丹曲林的药物组合物施用持续四个月到一年。在一些实施例中，所述包括丹曲林的药物组合物施用持续四到六个月。在某些实施例中，所述包括丹曲林的药物组合物施用持续至多四个月。在各个实施例中，所述包括丹曲林的药物组合物施用持续长于一年。在各个实施例中，所述包括丹曲林的药物组合物施用持续至多两年。在各个实施例中，所述包括丹曲林的药物组合物施用持续长于两年。在所提供的用于抑制患有或怀疑患有AD的受试者的神经元中受损的神经发生和/或突触发生的方法的各个实施例中，所述包括丹曲林的药物组合物的鼻内施用不会损害所述受试者的嗅觉功能、运动功能或肝功能。

另一方面，本发明提供了一种用于改善和/或减缓神经病理和认知功能障碍发作之后认知功能下降的方法，所述神经病理和所述认知功能障碍由阿尔茨海默氏病(AD)引起，所述方法包括向有需要的受试者鼻内施用有效抑制包括丹曲林的药物组合物的NMDA受体和/或兰尼碱受体的过度活化的量。在特定实施例中，所述认知功能是记忆、学习、思考、注意力、感知、语言使用、推理、决策、解决问题或其组合。在一些实施例中，所述AD是家族性阿尔茨海默氏病(FAD)。在各个实施例中，所述AD是散发性阿尔茨海默氏病(SAD)。在特定实施例中，所述RyR是2型RyR(RyR-2)。在特定实施例中，所述RyR是1型RyR(RyR-1)。在特定实施例中，所述RyR是3型RyR(RyR-3)。在特定实施例中，所述RyR是3型RyR(RyR-3)。在特定实施例中，所述RyR是RyR亚型的组合，例如RyR-1、RyR-2、RyR-3，包含所有RyR亚型。在一些实施例中，每天施用包括丹曲林的药物组合物。在一些实施例中，所述包括丹曲林的药物组合物每周施用三次。在一些实施例中，所述包括丹曲林的药物组合物每周施用一次。在一些实施例中，所述包括丹曲林的药物组合物施用持续四个月到一年。在一些实施例中，所述包括丹曲林的药物组合物施用持续四到六个月。在某些实施例中，所述包括丹曲林的药物组合物施用持续至多四个月。在各个实施例中，所述包括丹曲林的药物组合物施用持续长于一年。在各个实施例中，所述包括丹曲林的药物组合物施用持续至多两年。在各个实施例中，所述包括丹曲林的药物组合物施用持续长于两年。在所提供的用于改善和/或减缓神经病理和认知功能障碍发作之后认知功能下降的方法的各个实施例中，所述神经病理和认知功能障碍由AD引起，所述包括丹曲林的药物组合物的鼻内施用不会损害所述受试者的嗅觉功能、运动功能或肝功能。

在某些实施例中，认知功能障碍是短期或长期记忆丧失、学习困难、思考困难、注意力/集中困难、感知困难、语言使用困难、推理困难、决策困难/判断力受损、解决问题困难、混淆、运动协调性差或其组合。在特定实施例中，所述记忆丧失是海马依赖性和海马非依赖性记忆丧失。在各个实施例中，所述神经病理是脑神经元之间的淀粉样蛋白累积。

在所述用于改善和/或减缓神经病理和认知功能障碍发作之后认知功能下降的方法的一些实施例中，所述神经病理和认知功能障碍由AD引起，所述方法进一步包括向所述受试者施用治疗有效量的谷氨酸受体拮抗剂。在所述方法的一些实施例中，所述方法进一步包括(a)在向所述受试者鼻内施用所述包括丹曲林的药物组合物之前从所述受试者中获得脑脊液(CSF)；以及(b)确定所述CSF中的谷氨酸水平，其中步骤(b)中的所确定的谷氨酸水平高于从对照受试者中获得的CSF中的谷氨酸水平表明所述受试者适合用丹曲林治疗。在一些实施例中，所述包括丹曲林的药物组合物的鼻内施用不会损害所述受试者的嗅觉功能、运动功能或肝功能。

在一些实施例中，所述方法进一步包括：在施用所述治疗有效量的所述谷氨酸受体拮抗剂之前从所述受试者中获得CSF；以及确定所述CSF中的谷氨酸水平，其中所确定的谷氨酸水平高于从对照受试者中获得的CSF中的谷氨酸水平表明所述受试者适合用谷氨酸受体拮抗剂治疗。

在特定实施例中，所述谷氨酸受体拮抗剂是通过在谷氨酸结合位点处的竞争性拮抗作用阻断所述NMDA受体的药剂，或者是通过在甘氨酸、苯环利定(phencyclidine)和/或镁结合位点处的非竞争性拮抗作用阻断所述NMDA受体的药剂。在一些实施例中，通过在谷氨酸结合位点处的竞争性拮抗作用阻断所述NMDA受体的所述药剂是赛福太(CGS 19755)、阿替加奈(CNS 1102)、CGP 37849、APV或AP-5(R-2-氨基-5-膦酰基戊酸酯)、2-氨基-7-膦酰基-庚酸(AP-7)、3-[(R)-2-羧基哌嗪-4-基]-丙-2-烯基-1-膦酸(CPPene)和/或阿斯巴甜。在一些实施例中，通过在苯环利定(PCP)、镁和/或MK-801(地佐环平(dizocilpine))结合位点处的非竞争性拮抗作用阻断所述NMDA受体的所述药剂是美金刚(memantine)、氯胺酮(ketamine)、苯环利定、3-MEO-PCP、8A-PDHQ、金刚烷胺(amantadine)、托莫西汀(atomoxetine)、AZD6765、胍丁胺(agmatine)、德芦西明(delucemine)、德芦西明、右甲吗南(dextrallorphan)、右美沙芬(dextromethorphan)、右啡烷(dextrorphan)、地非尼丁(diphenidne)、乙醇、乙炔丙啶(eticylidine)、加环利定(gacyclidine)、甲基苯丙胺(methoxetamine)(MXE)、米诺环素(minocycline)、硝胺美金刚胺(nitromemantine)、一氧化二氮、PD-137889、咯环利定(rolicyclidine)、替诺环定(tenocyclidine)、甲氧嘧啶(methoxydine)、替来他明(tiletamine)、奈拉美仙(neramexane)、依利罗地(eliprodil)、乙苯噁啶(etoxadrol)、右奥沙屈(dexoxadrol)、WMS-2539、NEFA、雷马西米(remacemide)、硫酸镁、阿替加奈、HU-211、石杉碱A(huperzine A)、二肽D-Phe-L-Tyr、伊博格碱(Ibogaine)、夹竹桃科(Apocynaceae)、雷马西米、钩藤碱(Rhynchophylline)、加巴喷丁(gabapentin)或地佐环平(MK-801)。在一些实施例中，通过甘氨酸结合位点处的非竞争性拮抗作用阻断所述NMDA受体的所述药剂是(GLYX-13)、NRX-1074、7-氯犬尿酸、4-氯犬尿氨酸(AV-101)、5,7-二氯犬尿酸、犬尿酸、TK-40(GluN1甘氨酸结合位点处的竞争性拮抗剂)、1-氨基环丙烷羧酸(ACPC)、L-苯丙氨酸或氙。

另一方面，本发明提供了一种用于在阿尔茨海默氏病(AD)的症状发作之前改善记忆的方法，所述方法包括向有需要的受试者鼻内施用有效抑制包括丹曲林的药物组合物的NMDA受体和/或兰尼碱受体的过度活化的量。在所提供的用于在AD的症状发作之前改善记忆的方法的一些实施例中，所述包括丹曲林的药物组合物的鼻内施用不会损害所述受试者的嗅觉功能、运动功能或肝功能。在特定实施例中，所述AD的症状是神经病理、认知功能障碍或其组合。在各个实施例中，所述认知功能障碍是短期或长期记忆丧失、学习困难、思考困难、注意力/集中困难、感知困难、语言使用困难、推理困难、决策困难/判断力受损、解决问题困难、混淆、运动协调性差或其组合。在实施例中，所述记忆丧失是海马依赖性和海马非依赖性记忆丧失。在一些实施例中，所述神经病理是脑神经元之间的淀粉样蛋白累积。在一些实施例中，所述AD是家族性AD(FAD)。在某些实施例中，所述AD是散发性AD(SAD)。在特定实施例中，所述RyR是2型RyR(RyR-2)。在特定实施例中，所述RyR是1型RyR(RyR-1)。在特定实施例中，所述RyR是3型RyR(RyR-3)。在特定实施例中，所述RyR是RyR亚型的组合，例如RyR-1、RyR-2和RyR-3，包含所有RyR亚型。在一些实施例中，每天施用包括丹曲林的药物组合物。在一些实施例中，所述包括丹曲林的药物组合物每周施用三次。在一些实施例中，所述包括丹曲林的药物组合物每周施用一次。在一些实施例中，所述包括丹曲林的药物组合物施用持续四个月到一年。在一些实施例中，所述包括丹曲林的药物组合物施用持续四到六个月。在某些实施例中，所述包括丹曲林的药物组合物施用持续至多四个月。在各个实施例中，所述包括丹曲林的药物组合物施用持续长于一年。在各个实施例中，所述包括丹曲林的药物组合物施用持续至多两年。在各个实施例中，所述包括丹曲林的药物组合物施用持续长于两年。

在所述用于在AD的症状发作之前改善记忆的方法的一些实施例中，所述方法进一步包括向所述受试者施用治疗有效量的谷氨酸受体拮抗剂。在所述方法的一些实施例中，所述方法进一步包括(a)在向所述受试者鼻内施用所述包括丹曲林的药物组合物之前从所述受试者中获得脑脊液(CSF)；以及(b)确定所述CSF中的谷氨酸水平，其中步骤(b)中的所确定的谷氨酸水平高于从对照受试者中获得的CSF中的谷氨酸水平表明所述受试者适合用丹曲林治疗。在一些实施例中，所述方法进一步包括：在施用所述治疗有效量的所述谷氨酸受体拮抗剂之前从所述受试者中获得CSF；以及确定所述CSF中的谷氨酸水平，其中所确定的谷氨酸水平高于从对照受试者中获得的CSF中的谷氨酸水平表明所述受试者适合用谷氨酸受体拮抗剂治疗。在特定实施例中，所述谷氨酸受体拮抗剂是通过在谷氨酸结合位点处的竞争性拮抗作用阻断所述NMDA受体的药剂，或者是通过在甘氨酸、苯环利定和/或镁结合位点处的非竞争性拮抗作用阻断所述NMDA受体的药剂。在一些实施例中，通过在谷氨酸结合位点处的竞争性拮抗作用阻断所述NMDA受体的所述药剂是赛福太(CGS 19755)、阿替加奈(CNS1102)、CGP 37849、APV或AP-5(R-2-氨基-5-膦酰基戊酸酯)、2-氨基-7-膦酰基-庚酸(AP-7)、3-[(R)-2-羧基哌嗪-4-基]-丙-2-烯基-1-膦酸(CPPene)和/或阿斯巴甜。在一些实施例中，通过在苯环利定(PCP)、镁和/或MK-801(地佐环平)结合位点处的非竞争性拮抗作用阻断所述NMDA受体的所述药剂是美金刚、氯胺酮、苯环利定、3-MEO-PCP、8A-PDHQ、金刚烷胺、托莫西汀、AZD6765、胍丁胺、德芦西明、德芦西明、右甲吗南、右美沙芬、右啡烷、地非尼丁、乙醇、乙炔丙啶、加环利定、甲基苯丙胺(MXE)、米诺环素、硝胺美金刚胺、一氧化二氮、PD-137889、咯环利定、替诺环定、甲氧嘧啶、替来他明、奈拉美仙、依利罗地、乙苯噁啶、右奥沙屈、WMS-2539、NEFA、雷马西米、硫酸镁、阿替加奈、HU-211、石杉碱A、二肽D-Phe-L-Tyr、伊博格碱、夹竹桃科、雷马西米、钩藤碱、加巴喷丁或地佐环平(MK-801)。在一些实施例中，通过甘氨酸结合位点处的非竞争性拮抗作用阻断所述NMDA受体的所述药剂是(GLYX-13)、NRX-1074、7-氯犬尿酸、4-氯犬尿氨酸(AV-101)、5,7-二氯犬尿酸、犬尿酸、TK-40(GluN1甘氨酸结合位点处的竞争性拮抗剂)、1-氨基环丙烷羧酸(ACPC)、L-苯丙氨酸或氙。

另一方面，本发明提供了一种用于在阿尔茨海默氏病(AD)的症状发作之后改善记忆丧失的方法，其中所述记忆丧失由AD引起，所述方法包括向有需要的受试者鼻内施用一定量的药物组合物，所述药物组合物包括有效抑制NMDA受体和/或兰尼碱受体(RyR)的过度活化的丹曲林。在一些实施例中，所述包括丹曲林的药物组合物的鼻内施用不会损害所述受试者的嗅觉功能、运动功能或肝功能。在特定实施例中，所述AD的症状是神经病理、认知功能障碍或其组合。在各个实施例中，所述认知功能障碍是短期或长期记忆丧失、学习困难、思考困难、注意力/集中困难、感知困难、语言使用困难、推理困难、决策困难/判断力受损、解决问题困难、混淆、运动协调性差或其组合。在实施例中，所述记忆丧失是海马依赖性和海马非依赖性记忆丧失。在一些实施例中，所述神经病理是脑神经元之间的淀粉样蛋白累积。在一些实施例中，所述AD是家族性AD(FAD)。在某些实施例中，所述AD是散发性AD(SAD)。在特定实施例中，所述RyR是2型RyR(RyR-2)。在特定实施例中，所述RyR是1型RyR(RyR-1)。在一些实施例中，所述RyR是3型RyR(RyR-3)。在特定实施例中，所述RyR是RyR亚型的组合，例如RyR-1、RyR-2和RyR-3，包含所有RyR亚型。在所提供的方法的一些实施例中，每天施用包括丹曲林的药物组合物。在一些实施例中，所述包括丹曲林的药物组合物每周施用三次。在一些实施例中，所述包括丹曲林的药物组合物每周施用一次。在一些实施例中，所述包括丹曲林的药物组合物施用持续四个月到一年。在一些实施例中，所述包括丹曲林的药物组合物施用持续四到六个月。在某些实施例中，所述包括丹曲林的药物组合物施用持续至多四个月。在各个实施例中，所述包括丹曲林的药物组合物施用持续长于一年。在各个实施例中，所述包括丹曲林的药物组合物施用持续至多两年。在各个实施例中，所述包括丹曲林的药物组合物施用持续长于两年。

在所述用于在AD的症状发作之后改善记忆的方法的一些实施例中，所述方法进一步包括向所述受试者施用治疗有效量的谷氨酸受体拮抗剂。在所述方法的一些实施例中，所述方法进一步包括(a)在向所述受试者鼻内施用所述包括丹曲林的药物组合物之前从所述受试者中获得脑脊液(CSF)；以及(b)确定所述CSF中的谷氨酸水平，其中步骤(b)中的所确定的谷氨酸水平高于从对照受试者中获得的CSF中的谷氨酸水平表明所述受试者适合用丹曲林治疗。在一些实施例中，所述方法进一步包括：在施用所述治疗有效量的所述谷氨酸受体拮抗剂之前从所述受试者中获得CSF；以及确定所述CSF中的谷氨酸水平，其中所确定的谷氨酸水平高于从对照受试者中获得的CSF中的谷氨酸水平表明所述受试者适合用谷氨酸受体拮抗剂治疗。在特定实施例中，所述谷氨酸受体拮抗剂是通过在谷氨酸结合位点处的竞争性拮抗作用阻断所述NMDA受体的药剂，或者是通过在甘氨酸、苯环利定和/或镁结合位点处的非竞争性拮抗作用阻断所述NMDA受体的药剂。在一些实施例中，通过在谷氨酸结合位点处的竞争性拮抗作用阻断所述NMDA受体的所述药剂是赛福太(CGS 19755)、阿替加奈(CNS1102)、CGP 37849、APV或AP-5(R-2-氨基-5-膦酰基戊酸酯)、2-氨基-7-膦酰基-庚酸(AP-7)、3-[(R)-2-羧基哌嗪-4-基]-丙-2-烯基-1-膦酸(CPPene)和/或阿斯巴甜。在一些实施例中，通过在苯环利定(PCP)、镁和/或MK-801(地佐环平)结合位点处的非竞争性拮抗作用阻断所述NMDA受体的所述药剂是美金刚、氯胺酮、苯环利定、3-MEO-PCP、8A-PDHQ、金刚烷胺、托莫西汀、AZD6765、胍丁胺、德芦西明、德芦西明、右甲吗南、右美沙芬、右啡烷、地非尼丁、乙醇、乙炔丙啶、加环利定、甲基苯丙胺(MXE)、米诺环素、硝胺美金刚胺、一氧化二氮、PD-137889、咯环利定、替诺环定、甲氧嘧啶、替来他明、奈拉美仙、依利罗地、乙苯噁啶、右奥沙屈、WMS-2539、NEFA、雷马西米、硫酸镁、阿替加奈、HU-211、石杉碱A、二肽D-Phe-L-Tyr、伊博格碱、夹竹桃科、雷马西米、钩藤碱、加巴喷丁或地佐环平(MK-801)。在一些实施例中，通过甘氨酸结合位点处的非竞争性拮抗作用阻断所述NMDA受体的所述药剂是(GLYX-13)、NRX-1074、7-氯犬尿酸、4-氯犬尿氨酸(AV-101)、5,7-二氯犬尿酸、犬尿酸、TK-40(GluN1甘氨酸结合位点处的竞争性拮抗剂)、1-氨基环丙烷羧酸(ACPC)、L-苯丙氨酸或氙。

另一方面，本发明提供了一种用于增加受试者的脑中的丹曲林的浓度和持续时间的方法，所述方法包括向有需要的受试者鼻内施用一定量的包括丹曲林的药物组合物。

在另外的方面，本发明提供了一种用于抑制患有或怀疑患有阿尔茨海默氏病(AD)的受试者的神经元中受损的神经发生和/或突触发生的方法，其中所述神经发生和/或突触发生的损伤至少部分地由内质网(ER)兰尼碱受体(RyR)的过度活化引起，所述方法包括：(a)向所述受试者鼻内施用一定量的药物组合物，所述药物组合物包括有效减少ER钙离子(Ca²⁺)的释放的丹曲林；以及(b)向步骤(a)的所述受试者施用治疗有效量的谷氨酸受体拮抗剂。在一些实施例中，所述包括丹曲林的药物组合物的鼻内施用不会损害所述受试者的嗅觉功能、运动功能或肝功能。在一些实施例中，所述方法进一步包括：c)在步骤(a)之前从所述受试者中获得脑脊液(CSF)；以及d)确定所述CSF中的谷氨酸水平，其中步骤(d)中的所确定的谷氨酸水平高于从对照受试者中获得的CSF中的谷氨酸水平表明所述受试者适合用丹曲林治疗。在各个实施例中，所述方法进一步包括：在步骤(b)之前从受试者中获得CSF；以及确定所述CSF中的谷氨酸水平，其中所确定的谷氨酸水平高于从对照受试者中获得的CSF中的谷氨酸水平表明所述受试者适合用谷氨酸受体拮抗剂治疗。在一些实施例中，所述谷氨酸受体拮抗剂是通过在谷氨酸结合位点处的竞争性拮抗作用阻断所述NMDA受体的药剂，或者是通过在甘氨酸、苯环利定和/或镁结合位点处的非竞争性拮抗作用阻断所述NMDA受体的药剂。在各个实施例中，通过在谷氨酸结合位点处的竞争性拮抗作用阻断所述NMDA受体的所述药剂是赛福太(CGS 19755)、阿替加奈(CNS 1102)、CGP 37849、APV或AP-5(R-2-氨基-5-膦酰基戊酸酯)、2-氨基-7-膦酰基-庚酸(AP-7)、3-[(R)-2-羧基哌嗪-4-基]-丙-2-烯基-1-膦酸(CPPene)和/或阿斯巴甜。在一些实施例中，通过在苯环利定(PCP)、镁和/或MK-801(地佐环平)结合位点处的非竞争性拮抗作用阻断所述NMDA受体的所述药剂是美金刚、氯胺酮、苯环利定、3-MEO-PCP、8A-PDHQ、金刚烷胺、托莫西汀、AZD6765、胍丁胺、德芦西明、德芦西明、右甲吗南、右美沙芬、右啡烷、地非尼丁、乙醇、乙炔丙啶、加环利定、甲基苯丙胺(MXE)、米诺环素、硝胺美金刚胺、一氧化二氮、PD-137889、咯环利定、替诺环定、甲氧嘧啶、替来他明、奈拉美仙、依利罗地、乙苯噁啶、右奥沙屈、WMS-2539、NEFA、雷马西米、硫酸镁、阿替加奈、HU-211、石杉碱A、二肽D-Phe-L-Tyr、伊博格碱、夹竹桃科、雷马西米、钩藤碱、加巴喷丁或地佐环平(MK-801)。在各个实施例中，通过甘氨酸结合位点处的非竞争性拮抗作用阻断所述NMDA受体的所述药剂是(GLYX-13)、NRX-1074、7-氯犬尿酸、4-氯犬尿氨酸(AV-101)、5,7-二氯犬尿酸、犬尿酸、TK-40(GluN1甘氨酸结合位点处的竞争性拮抗剂)、1-氨基环丙烷羧酸(ACPC)、L-苯丙氨酸或氙。在所述用于抑制患有或疑似患有AD的受试者的神经元中受损的神经发生和/或突触发生的方法的一些实施例中，所述神经发生包括从神经祖细胞(NPC)到未成熟神经元的神经发生，随后是从未成熟神经元到皮质神经元的神经发生。在各个实施例中，所述突触发生发生在皮质神经元中。在一些实施例中，所述皮质神经元是胆碱能神经元。在某些实施例中，所述皮质神经元是基底前脑胆碱能神经元(BFCN)神经元、前额皮质神经元、海马神经元或其组合。在特定实施例中，所述AD是家族性阿尔茨海默氏病(FAD)或散发性阿尔茨海默氏病(SAD)。在一些实施例中，所述RyR是2型RyR(RyR-2)。在特定实施例中，所述RyR是1型RyR(RyR-1)。在一些实施例中，所述RyR是3型RyR(RyR-3)。在特定实施例中，所述RyR是RyR亚型的组合，例如RyR-1、RyR-2和RyR-3，包含所有RyR亚型。在某些实施例中，所述内质网(ER)兰尼碱受体(RyR)的过度活化使线粒体钙升高，从而使ATP减少。在一些实施例中，丹曲林的鼻内施用使升高的线粒体钙降低并且增加胞质ATP。在所提供的方法的一些实施例中，每天施用包括丹曲林的药物组合物。在一些实施例中，所述包括丹曲林的药物组合物每周施用三次。在一些实施例中，所述包括丹曲林的药物组合物每周施用一次。在一些实施例中，所述包括丹曲林的药物组合物施用持续四个月到一年。在一些实施例中，所述包括丹曲林的药物组合物施用持续四到六个月。在某些实施例中，所述包括丹曲林的药物组合物施用持续至多四个月。在各个实施例中，所述包括丹曲林的药物组合物施用持续长于一年。在各个实施例中，所述包括丹曲林的药物组合物施用持续至多两年。在各个实施例中，所述包括丹曲林的药物组合物施用持续长于两年。

本文所引用的所有科学出版物都以全文引用的方式并入本文中。

呈现以下实例是为了更全面地说明本发明的某些实施例。然而，所述实例决不应该被解释为限制本发明的广泛范围。

实例

实例1

丹曲林抑制来自阿尔茨海默氏病患者的诱导多能干细胞中的受损的神经发生和突触发生

尽管不希望受任何特定理论的束缚，但据信丹曲林通过纠正由于兰尼碱受体过度活化和相关的溶酶体和自噬功能受损引起的钙失调来抑制受损的神经发生和突触发生。在这项研究中，并且通过使用来自SAD患者和FAD患者两者的iPSC以及其衍生的神经祖细胞(NPC)和基底前脑胆碱能神经元(BFCN)，研究了丹曲林对神经发生和突触发生的影响和机制。丹曲林显著改善了神经发生和突触发生的损伤，这与其纠正RyR过度活化、细胞内Ca²⁺失调和自噬中断相关。

材料与方法

细胞培养

人对照(AG02261)和散发性阿尔茨海默氏病(AG11414)iPSC从John A.Kessler的实验室获得。家族性阿尔茨海默氏病(GM24675)iPSC购自科里尔研究所(CoriellInstitute)。每种类型的iPSC均由一名健康人受试者或一名诊断为SAD或FAD的患者的皮肤成纤维细胞产生。将人多能干细胞维持在mTeSR^TM1培养基(目录号#05850，干细胞技术公司(Stemcell Technologies))中的基质胶包被的板(BD生物科学公司(BD Biosciences))上，并在37℃下在5％CO₂湿润气氛中培养。每天更换培养基。

细胞活力

使用MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物，密苏里州圣路易斯西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO))还原测定确定96孔板中不同孔在24小时的细胞活力，如先前由以下所描述的：Qiao H等人,《麻醉学(Anesthesiology)》2017；127:490；Ren G等人,《科技报告(Sci Rep)》2017；7:12378，所述文献中的每个文献通过引用整体并入本文。用PBS洗涤之后，将样品与含有MTT(培养基中0.5mg/mL)的新鲜培养基在37℃下避光温育4小时。然后去除培养基并用二甲亚砜(DMSO)溶解甲臜。用读板仪(Synergy^TMH1读板仪，佛蒙特州威努斯基伯腾公司(BioTek,Winooski,VT))在540nm处测量吸光度。

细胞增殖测定

将iPSC铺板在mTeSR^TM1培养基中的用基质胶包被的盖玻片上。在处理结束前4小时，将5-溴脱氧尿苷(BrdU，俄勒冈州尤金英杰公司(Invitrogen,Eugene,OR))以30μM的终浓度添加到mTeSR^TM1培养基中。然后将细胞固定在4％多聚甲醛中，并用0.1％Triton X-100进行透化。对于BrdU检测，酸处理(1N HCL在冰上10分钟，随后在室温下2N HCL 10分钟)将DNA分离成单链，使得第一抗体可以进入掺入的BrdU。在用封闭溶液(含有0.1％Triton X-100的PBS中的5％正常山羊血清)温育之后，将细胞与大鼠单克隆抗BrdU第一抗体(1:100；德克萨斯州拉达斯圣克鲁兹生物技术公司(Cruz Biotechnology,Dallas,TX))在4℃下温育过夜。随后用含有0.1％Triton X-100的PBS洗涤之后，将细胞与和抗大鼠IgG(1:1,000；俄勒冈州尤金英杰公司)缀合的荧光标记的第二抗体在室温下温育2小时。细胞核在室温下用4',6-双脒基-2-苯基吲哚(DAPI，俄勒冈州尤金英杰公司)复染5分钟。将免疫染色的细胞覆盖，并且然后安装在Olympus BX41TF荧光显微镜(200×；宾夕法尼亚州中央谷奥林巴斯美国(Olympus USA,Center Valley,PA))上。使用iVision 10.10.5软件(宾夕法尼亚州艾克斯顿生物视觉公司(Biovision Technologies,Exton,PA))获取图像。在盖玻片上的随机位置获取五组图像，并且随后使用ImageJ 1.49v软件(马里兰州贝塞斯达美国国立卫生研究院(National Institutes of Health,Bethesda,MD))合并。计算了5-BrdU阳性细胞占细胞总数的百分比，并且在来自至少三种不同培养物的不同组之间进行比较。

iPSC的分化

从iPSC分化为皮质神经元和BFCN的方案改编自先前描述的方案，如以下中所描述的：Shi Y等人,《自然实验手册(Nat Protoc)》2012；7:1836；Bissonnette CJ等人,《干细胞(Stem Cells)》2011；29:802，所述文献中的每个文献通过引用整体并入。简言之，通过双SMAD抑制诱导无饲养层培养的iPSC细胞形成神经祖细胞。细胞在化学品定义的条件下用SB4315422uM和DMH1 2uM(均来自明尼苏达州明尼阿波里斯托克里斯公司(Tocris,Minneapolis,MN))培养7天。

对于皮质神经元，培养基在第12天改为神经维持培养基(即，是含N-2和B-27的培养基的1:1混合物，其中N-2培养基由DMEM/F-12GlutaMAX、1×N-2、5μg/mL胰岛素、1mM的L-谷氨酰胺、100μm的非必需氨基酸、100μM的2-巯基乙醇、50U/mL的青霉素和50mg/mL链霉素组成，并且B-27培养基由基础培养基、1×B-27、200mM的L-谷氨酰胺、50U/mL的青霉素和50mg/mL的链霉素组成)并从第12天继续。每天检查细胞。在第24-29天左右用倒置显微镜观察培养物时，神经玫瑰花结结构很明显。从这一点开始，每隔一天更换一次培养基。

对于BFCN分化，iPSC衍生的原始神经干细胞在SHH(500ng/mL；1845-SH；美国明尼苏达州R&D系统公司(R&D System,MN,USA))下开发，并且然后用NGF(50-100ng/mL；R&D)从第24天开始处理。在第28天，神经祖细胞以5,000个细胞/cm²的密度粘附到先前铺板在层粘连蛋白上的层粘连蛋白基质上。在存在NGF(50-100ng/mL；R&D)、cAMP(1μM；西格玛公司)、BDNF、GDNF(10ng/mL；R&D)、SHH(50ng/mL；R&D)的情况下，铺板的细胞优选地在由神经基础培养基、N2补充剂(英杰公司)组成的神经元分化培养基中生长如Liu Y等人,《自然生物技术(Nat Biotechnol)》2013；31:440所描述的，所述文献通过引用整体并入。

Ca²⁺测量

使用基于水母发光蛋白水母发光蛋白的探针测量ATP暴露之后iPSC的胞质Ca²⁺浓度([Ca²⁺]_c)的变化。7.5-1.2×10⁴个细胞被铺板在24孔板中的12mm盖玻片上，生长至50-60％汇合，然后根据制造商的说明使用Lipofectamine 3000转染试剂(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific))用cyt-Aeq质粒转染。第二天，将转染的细胞与5μM的腔肠素一起在补充有1mM CaCl₂的改良Krebs-Ringer缓冲液(以mM为单位：140NaCl、2.8KCl、2MgCl₂、10Hepes、11葡萄糖、pH 7.4)中温育1小时，并且然后转移到灌注室中。所有水母发光蛋白测量均在KRB中进行，将麻醉剂添加到指定的相同培养基中。实验是在定制的水母发光蛋白记录系统中进行的。对于胞外无Ca²⁺实验，使用无Ca²⁺缓冲液(不含Ca²⁺的KRB，含5mMEGTA)。通过在富含低渗Ca²⁺的溶液(H₂O中的10mM CaCl₂)中用100μM的洋地黄皂苷裂解细胞来终止实验，从而排出剩余的水母发光蛋白池。通过基于水母发光蛋白在pH、[Mg²⁺]和离子强度等生理条件下的Ca²⁺应答曲线的算法收集光信号并校准为[Ca²⁺]_c值，如先前通过以下所描述的：Filadi R等人,《美国国家科学院院刊(PNAS)》2015；201504880；Bonora M等人,《自然实验手册》2013；8:2105，所述文献中的每个文献通过引用整体并入。

使用之前所描述的方法通过Fura-2/AM荧光(俄勒冈州尤金分子探针公司(Molecular probe,Eugene,OR))测量iPSC暴露于NMDA之后胞质Ca²⁺浓度([Ca²⁺]_c)的变化。测定在Olympus IX70倒置显微镜(宾夕法尼亚州中央谷奥林巴斯美国公司)和IPLab v3.71软件(威斯康星州密尔沃基扫描分析公司(Scanalytics,Milwaukee WI))上进行。简言之，将iPSC铺板到35mm培养皿上。

将细胞在不含Ca²⁺的达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM，纽约州格兰德岛Gibco公司(Gibco,Grand Island,NY))中洗涤三次并在相同缓冲液中在37℃下用2.5μm Fura-2/AM加载30分钟之后，然后将细胞洗涤两次并且与不含Ca²⁺的DMEM在37℃下再温育30分钟。Fura-2AM通过在340和380nm激发处交替记录来测量，并且每次处理检测到510nm处的发射至多10分钟。响应于500μM NMDA与或不与丹曲林30μM(Dan)的处理记录诱发的变化。结果以F340/F380 nm的比率表示，并且从至少三个单独的实验中取平均值。

蛋白质印迹

根据标准程序进行蛋白质印迹。在存在蛋白酶抑制剂混合物的情况下，通过在冰冷的裂解缓冲液(50mM Tris–HCl、150mM NaCl和1％Triton X-100)中裂解细胞，获得iPSC细胞的总蛋白提取物，如通过以下所描述的：Hollomon,MG等人,《BMC癌症(BMC Cancer)》2013；13:500，所述文献通过引用整体并入。离心之后，收集上清液，并且使用二辛可宁酸(BCA)蛋白质测定试剂盒(伊利诺伊州罗克福德赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific,Rockford,IL))对总蛋白质进行定量。每个泳道加载等量的蛋白质，并且在15％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)上分离。

电泳之后，将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。将膜用溶于PBS-T的5％脱脂牛奶在室温封闭1小时，并且然后在4℃下用第一抗体染色过夜。用PBS-T洗涤之后，将膜与第二抗体(HRP缀合的抗兔和抗小鼠IgG)以1:1,000稀释度一起温育，并且β-肌动蛋白用作加载对照。用增强型化学发光检测系统(马萨诸塞州比尔里卡密理博公司(Millipore,Billerica,MA))检测信号并且通过扫描光密度法进行定量。

免疫细胞化学

细胞在4％多聚甲醛中固定15分钟，随后用三次1×PBS洗涤。然后将所述细胞用含0.1％Triton X-100的PBS中的5％正常山羊血清在室温下封闭1小时。第一抗体在4℃下在含有1％BSA和0.3％Triton-X-100的1xPBS中施加过夜。用PBS洗涤三次之后，添加alexafluor缀合的第二抗体(1:1000，英杰公司)连同DAPI(1:2000)一起，持续1小时。再洗涤三次之后，盖玻片用Prolong Gold抗褪色试剂(英杰公司)固定并成像。

使用的第一抗体是：Oct4(1:500，细胞信号传导技术公司(Cell SignalingTechnology))、Sox2(1:500，密理博公司)、PAX6(1:500，生物传奇公司(BioLegend))、Tbr 1(1:500，艾博抗公(Abcam))、ChAT(1:100，密理博公司)、Map2(1:500，西格玛公司)、PSD95(1:500，生物传奇公司)、突触蛋白-1(1:500，生物传奇公司)、EEA1(1:100，细胞信号传导技术公司)、LAMP-2(1:100，圣克鲁兹公司(Santa Cruz))、钙联结蛋白(1:100，细胞信号传导技术公司)和LC3(1:200，细胞信号传导技术公司)。

溶酶体酸度测量

如先前通过以下所描述的：Ren G等人,《科技报告》2017；7:12378，所述文献通过引用整体并入，

Red DND-99(俄勒冈州尤金分子探针公司)探针储备溶液在HBSS+中稀释至50nM的工作浓度。将IPSC细胞铺板在mTeSR^TM1(目录号#05850)中的用基质胶(BD生物科学公司)包被的盖玻片上。用HBSS+洗涤三次之后，将细胞用含有HBSS+的预热(37℃)探针加载，并且在37℃下温育1小时。添加新鲜培养基以替代标记溶液。通过装有适合所用探针的正确滤光片组的荧光显微镜观察细胞，以确定细胞是否具有足够的荧光。LysoTracker Red使用约590nm的最大发射和约577nm的最大激发。

数据分析和统计

所有数据均通过Kolmogorov-Smirnov(KS)正态性测试和Brown-Forsythe测试进行正态分布测试，以确定是否使用参数或非参数检验进行统计学分析。参数变量表示为平均值±SD，并且使用学生的非配对双尾t测试、单向或双向方差分析，随后Sidak的事后分析进行分析。使用克鲁斯卡尔-沃利斯测试，随后使用邓恩多重比较测试分析非参数变量。GraphPad Prism软件(美国GraphPad软件公司(GraphPad Software,Inc.,USA))用于统计学分析和图形创建。P值小于0.05被认为具有统计学意义。

结果

丹曲林促进来自AD患者的iPSC中的细胞活力并抑制细胞增殖损伤

来自健康人受试者或SAD/FAD患者的iPSC、NPC和神经元被培养并通过针对特定类型细胞的特异性抗体进行表征。通过iPSC的MTT减少测定确定的细胞活力在健康人受试者或SAD/FAD患者中没有显著差异。然而，丹曲林使iPSC SAD中的MTT显著增加了15.1％(N＝8，P<0.01)并且FAD中显著增加了67.6％(N＝7，P<0.0001，图1A)。与健康人受试者相比，来自SAD/FAD患者的iPSC往往具有受损的增殖能力，这由5-BrdU掺入所确定，在FAD iPSC中更为显著，其被丹曲林抑制(图1B)。与对照相比，丹曲林对iPSC向NPC的分化没有显著影响。

丹曲林改善了SAD/FAD细胞两者中NPC分化为未成熟神经元、皮质神经元和BFCN的损伤

基于对神经发生发挥足够的丹曲林神经保护作用的初步研究，从诱导iPSC分化为NPC开始，用丹曲林(30μM)处理iPSC连续3天(图2A-2B和3A-3F)。在分化第23天，源自SAD/FAD iPSC的NPC向未成熟神经元的分化与对照相比分别降低了9.1％(N＝6，P<0.05)和8.18％(N＝6，P<0.05)，其被丹曲林消除(图2A-2B)。与对照相比，SAD和FAD患者的成熟皮质神经元(图3B，Trb1阳性细胞，红色)与对照相比分别减少35.2％(N＝5，P<0.0001)和15.7％(N＝5，P<0.05)，丹曲林消除了这种效果(图3C)。使用声波刺猬(SHH，图3D)，进一步检查了由iPSC产生的BFCN(ChAT阳性神经元，绿色)。与对照相比，在SAD/FAD iPSC中分化为特定BFCN(图3E)分别减少了10.7％(N＝5，P<0.01)和9.2％(N＝5，P<0.05)(图3F)，并且也被丹曲林消除。

丹曲林挽救了由SAD/FAD患者的iPSC产生的神经元的突触发生损伤

为了确定在iPSC诱导期的前三天施加丹曲林对iPSC起源神经元突触发生的影响，皮质神经元的树突与同心圆之间的交叉点数，示出为圆距体细胞的距离(μm)被定量(图4A)。与对照神经元相比，由SAD和FAD患者两者的iPSC产生的皮质神经元的交叉点(相当于突触发生)显著减少，并且最显著在距体细胞150μM左右的距离处(图4A)分别减少76.3％(N＝3，P<0.0001)和23.7％(N＝3，P<0.05)，其被丹曲林抑制，尤其是在SAD细胞中(图4B)。通过使用双重免疫染色技术确定突触前标志物突触蛋白-1(绿色)和突触后标志物PSD95(红色)来检查丹曲林对突触密度的影响(图4C)。通过PSD95(图4D)或突触蛋白-1(图4E)确定的突触密度在SAD产生的皮质神经元中显著减少58.2％(N＝4-5，P<0.001)或PSD95中由FAD产生的皮质神经元中减少52.3％(N＝5，P<0.01)，并且在突触蛋白-1中由SAD产生的皮质神经元中减少59.1％(N＝4-5，P<0.01)或由FAD产生的皮质神经元中减少89.8％(N＝5，P<0.0001)并且在FAD iPSC中，两者都被丹曲林抑制。

来自AD患者的iPSC中2型RyR(RyR-2)异常增加。

对于机制研究，首先使用免疫印迹(图5A、5B)和免疫染色(图5C、5D)确定RyR-2的表达。与健康人受试者相比，SAD/FAD患者iPSC中的RyR-2水平在FAD中增加了39.5％(N＝4，P＝0.0558)(图5B)，并且平均排名在SAD中相差11.1(N＝7，P<0.01)(图5D)。

丹曲林显著抑制来自SAD和FAD患者两者的iPSC中的NMDA或ATP介导的胞质Ca²⁺浓度([Ca²⁺]_c)异常升高。

进一步研究了在SAD/FAD iPSC中神经发生和突触发生受损并被丹曲林改善的可能机制。与AD iPSC中这种升高的RyR-2一致，NMDA介导的峰值[Ca²⁺]_c升高(图6A、6C)和积分暴露(图6A、6D)在FAD和SAD iPSC中显著高于在正常对照中，其可以被丹曲林抑制(图6B-6D)。当通过用ATP(30μM)处理三种类型的细胞来检查从细胞内Ca²⁺储存中释放Ca²⁺时，SAD/FAD iPSC示出了显著更高的[Ca²⁺]_c峰值升高(140.4％，P<0.05或128.3％，P＝0.2055，分别对对照84.1％，N＝5-9)，通过去除胞外Ca²⁺和相关的Ca²⁺从胞外空间流入(图7A、7B、7E)和用丹曲林(30μM)预处理1小时(图7C、7F)而消除。在没有来自胞外空间的Ca²⁺流入的情况下，ATP会使所有三种细胞类型中[Ca²⁺]_c的总体升高显著降低(图7E)。在不存在胞外Ca²⁺流入的情况下，丹曲林仅倾向于抑制ATP介导的峰值或[Ca²⁺]_c的总体升高，但在SAD/FAD细胞中没有统计学意义(图7D或7G)。

丹曲林抑制来自AD患者的iPSC中的溶酶体vATP酶和酸度的减少。

由于RyR的过度活化，导致AD早老素1突变中ER钙浓度降低，从而损害了vATP酶从ER向溶酶体的合成和分泌，并且随后降低了溶酶体酸度和功能，如通过以下所描述的：LeeJH等人,《细胞(Cell)》2010；141:1146，所述文献通过引用整体并入。发明人已经确定了溶酶体相对于ER vATP酶的变化，以及各种类型的iPSC中的溶酶体酸度。vATP酶的位置通过双重免疫染色和共定位靶向溶酶体(LAMP-2)、ER(钙联结蛋白)和胞内体(EEA)确定(图8A)，并且细胞酸度媒剂通过溶酶体追踪剂确定(图8B)。来自SAD的iPSC中的溶酶体vATP酶的量显著减少了39.7％(N＝4，P<0.001，并且来自FAD的减少了29.9％(N＝4，P<0.05)(图8C*与CON相比)，这可能是被丹曲林抑制，尤其是在FAD iPSC中(图8D*与CON相比)。一致地，与正常对照的细胞酸度媒剂相比，SAD和FAD iPSC两者中的细胞酸度媒剂分别显著减少了50％(N＝4，P<0.0001)和33.9％(N＝4，P<0.01)，其也被丹曲林显著抑制(图8E*与CON相比，+与SAD相比，#与FAD相比)。

丹曲林促进了来自AD患者的iPSC的自噬活性。

进一步确定了丹曲林对自噬的影响。由自噬生物标志物LC3II的整体细胞水平指示的整体活性在三种类型的iPSC之间没有显著差异(图9A-9C)。然而，丹曲林处理分别使SAD中的LC3II水平增加了47.3％(N＝5，P＝0.3483)(图9B)，在FAD iPSC中增加了49.4％(N＝3，P<0.001)(图9C#与FAD相比)，这可以通过与巴弗洛霉素(一种损害自噬通量的药剂)共同处理而进一步升高(图9B、9C)。这表明丹曲林增加了自噬诱导，而不是损害了自噬通量。SAD/FAD iPSC中受损的自噬通量进一步得到SAD中p62显著升高48.9％(N＝3，P＝0.3594)和FAD iPSC中升高110.9％(N＝3，P<0.05)的支持(图9D*与CON相比)。

此研究表明，与健康人受试者中的相比，SAD/FAD患者从NPC到常见皮质和AD特异性缺陷BFCN的神经发生显著受损，这可以被丹曲林抑制。此外，丹曲林显著抑制源自SAD/FAD患者的iPSC的皮质神经元的突触发生损伤。SAD/FAD iPSC中的RyR-2数量异常增加，这导致由NMDA受体活化和相关溶酶体酸度和自噬功能失调触发的[Ca²⁺]_c显著异常升高。一致地，丹曲林显著抑制NMDA介导的细胞内Ca²⁺稳态破坏和溶酶体功能障碍，同时还促进SAD/FAD细胞的自噬活性。

这项研究的结果表明，来自AD患者的iPSC中异常升高的RyR-2(图5A-5D)和导致的Ca²⁺失调(图6A-6D、7A-7G)与溶酶体酸度和功能受损相关(图8A-8E)。自噬通量在AD细胞中始终受损，但丹曲林似乎主要促进自噬活性，尽管它也改善了受损的溶酶体酸度和功能。(图8A-8E、9A-9F)丹曲林介导的对源自来自AD患者的iPSC的神经元中受损的神经发生/突触发生的抑制与其促进整体自噬活性和改善受损溶酶体功能的能力相关。

实例2

丹曲林的鼻内施用增加了其在脑中的浓度和持续时间

鼻内施用丹曲林被提议作为一种新的治疗方法，以最大化丹曲林在各种神经退行性疾病，特别是AD中的潜在神经保护作用，同时最大小化其毒性和副作用。如本文所描述的，此研究表明，与常用的口服施用相比，小鼠鼻内施用丹曲林显著增加了丹曲林在脑中的浓度和持续时间。

材料与方法

动物

所有程序均按照宾夕法尼亚大学机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准的方案进行。在所有实验中使用雄性和雌性C57BL/6小鼠，2-4个月大，体重25-35g。小鼠保持在21-22℃下，12小时明暗循环，随意进食和饮水。所有的努力都是为了最小化小鼠的痛苦和数量。

药物施用

对于药代动力学研究，将小鼠随机分为两个实验组；鼻内丹曲林(N＝4-13/组，鼻内施用之后20分钟N＝13；在此时间点重复实验以确认重复性和可靠性)和口服丹曲林(N＝5)递送。媒剂与

(伊格尔制药公司(Eagle Pharmaceuticals,Inc.))报道的媒剂相同，由20mL的ddH₂O中的125mg甘露醇、25mg聚山梨醇酯80、4mg聚维酮K12组成，并且pH调节至10.3。丹曲林(密苏里州圣路易斯西格玛公司)在媒剂中稀释至5mg/mL的浓度。对于鼻内施用，将小鼠握住并固定在手掌上。使用移液器递送每克体重1μL的药物调配物或媒剂。执行了几个关键步骤以协助鼻内递送：1)握住小鼠的头部，使其与地面平行；2)小鼠被握住使得其头部或颈部无法移动；3)小液滴从移液管中喷出；4)在下一个液滴递送之前，留出2-3秒让小鼠吸入溶液；5)递送完成之后，小鼠保持10-15秒。此过程约需要10分钟/小鼠。口服施用如通过Wu,Z.等人,《阿尔茨海默氏病以及相关病症(Alzheimer Dis AssocDisord)》2015；29:184先前所描述地进行，所述文献通过引用整体并入。小鼠以相同的方式放置，并且使用附接到微升注射器的管饲法递送每克体重5μL的药物。

通过鼻内施用抑制剂尼莫地平(n＝5)或依克立达(n＝6)对将丹曲林从脑中泵出的初级蛋白(P-gp/BCRP)进行检查，从而降低丹曲林从脑中的清除率，如通过Fuchs,H.等人,《药物代谢作用与处置(Drug Metab Dispos)》2014；42:1761所描述的，所述文献通过引用整体并入。尼莫地平(密苏里州圣路易斯西格玛公司)和依克立达(密苏里州圣路易斯西格玛公司)在媒剂中分别稀释为2mg/mL和10mg/mL。在鼻内施用5mg/mL丹曲林(1μL/g体重)之前30分钟，鼻内递送尼莫地平或依克立达或媒剂1μL/g体重。在鼻内丹曲林施用之后20分钟检查丹曲林的组织浓度。

对于药物安全性研究，检查了长期施用丹曲林的潜在副作用。如上文所描述的，将单独的小鼠群组随机分成接受鼻内丹曲林(5mg/kg)或鼻内媒剂，3次/周，持续3周或4个月的组。

样品收集

在丹曲林施用10、20、30、50、70、120、150和180分钟之后，用2-4％异氟醚和通过心脏穿刺获得的血液样品(0.2mL)麻醉动物。然后通过心内灌注和用PBS放血对动物进行安乐死，以确保在采集脑之前将丹曲林完全从脑血管系统中洗掉。抗凝血液样品在4℃下以3000rpm离心10分钟，并且然后收集上清液。所有程序均在冷藏室(4℃)中进行。血浆和脑样品均储存在-80℃下并避光，直至测定。在慢性丹曲林施用和气味或运动功能测试3周之后，按上述方法对不同组的小鼠进行安乐死。

高效液相色谱法(HPLC)

配备有折光率监视器的Aiglent Hewlett Packard Model 1100系列高效液相色谱法(HPLC)系统(安捷伦科技公司(Aiglent Technologies))用于对血液和脑中的丹曲林浓度进行定量。乙腈用作流动相的组分A，并且磷酸钾缓冲溶液(pH 7.0)用作组分B。流动相的流速为1.0毫升/分钟，其中组分A和B的比例分别为流动相的12％到88％。通过UV检测器在254nm处进行检测。

用于检查不良副作用的行为测定

埋藏食物测试

使用埋藏食物测试，在鼻内丹曲林(5mg/kg，n＝10)或媒剂(等效体积，n＝10)3周之后，在单独的队列中评估小鼠嗅觉，如通过Yang,M.和J.N.Crawley,《神经科学的当前方案(Current protocols in neuroscience)》,2009:第8.24页1-8.24.12所描述的，所述文献通过引用整体并入。小鼠随机分为两个实验组(n＝10/组)。丹曲林或媒剂每天施用一次，每周施用三次(工作日每隔一天施用一次)。长期施用3周之后，对动物进行埋藏食物测试。在第1天，将饼干(2只小鼠1块饼干)放置到笼中并遗留过夜。第二天观察笼子以确保饼干被食用。在第2天约下午4点，从笼子中去除食物，并且测试小鼠禁食过夜，提供水。在第3天约上午11点，将小鼠带到测试室并在那里放置1小时以适应环境。然后将小鼠单独放置到干净的笼子中，其中笼子里有3cm深的垫料。饼干被埋在角落里的被褥下面1cm处。记录小鼠取回食物并用前爪握住食物的时间最长为900秒。

旋转棒测试

在单独的一组小鼠中使用旋转棒检查运动协调性，如通过Peng,J.等人,《神经科学通讯快报(Neurosci Lett)》2012；516:274所描述的，所述文献通过引用整体并入，这些小鼠每天一次，3次/周，给予鼻内丹曲林(5mg/kg，n＝10)或媒剂(等效剂量，n＝10)，持续4个月。动物在旋转棒(加利福尼亚州伍德兰希尔斯生命科学仪器公司IITC系列8(IITCSeries8,Life Sciences,Woodland Hills,CA))上以9rpm接受了两次60秒的训练试验，其中试验之间有30分钟的间隔。然后，小鼠以4-40rpm的可变速度进行了最多120秒的三项测试试验，其中试验之间的间隔为60分钟。记录每只小鼠在旋转棒上花费的时间。

统计学分析

测量丹曲林浓度并报告为平均值±SEM，并且用学生t测试(双尾)或单向方差分析进行分析，随后进行图克多事后分析。本研究所有分析的显著性水平设定为95％(P<0.05)。GraphPad Prism软件(GraphPad软件公司)用于所有统计学分析。

结果

鼻内施用丹曲林增加了其在脑中的峰值浓度和持续时间

口服和鼻内施用之后，比较了血浆和脑两者中的丹曲林药代动力学。经鼻途径的丹曲林全身吸收略快于经口途径(图10A、10C)。鼻内施用之后血浆和脑两者中的丹曲林峰值浓度显著高于口服途径之后的峰值浓度(图10A、10C)。口服施用之后约70分钟血浆丹曲林浓度显著降低，但鼻内施用之后仍维持相对较高(图10A)。类似地，与口服施用(图10C，约70分钟)相比，鼻内施用之后(图10C，180分钟)，脑中的丹曲林浓度保持在相对较高水平的持续时间显著更长。因此，鼻内施用之后血浆和脑两者中的积分丹曲林暴露显著高于口服施用之后(图10B、10D)。

鼻内丹曲林时间依赖性地影响其通过血脑屏障(BBB)

为了检查鼻内丹曲林是否确实增加了丹曲林穿过BBB的通道，比较了脑/血浆丹曲林的浓度比率。由于丹曲林在口服施用之后70分钟时血浆浓度接近于零，因此仅检查和比较了施用之后120分钟之前时间点的丹曲林脑/血浆浓度比率，因为在施用之后120分钟时血浆丹曲林浓度和脑丹曲林浓度两者均达到零(图10A、10C)。在大多数时间点，口服施用之后丹曲林脑/血浆比率与鼻内施用之后相对相同(图11)。然而，鼻内施用之后脑丹曲林在鼻内施用之后120分钟之后仍保持较高水平，因为血浆丹曲林浓度和脑内丹曲林浓度两者在口服施用之后120分钟后均达到零，但在鼻内施用之后150分钟时仍维持在一定水平下(图10A、10C)。

长期鼻内使用丹曲林不会损害嗅觉功能

为了检查慢性鼻内施用丹曲林可能造成的鼻膜损伤和嗅觉功能障碍，在以5mg/kg每周三次鼻内施用3周或4个月之后，对小鼠进行嗅觉功能测试。丹曲林鼻内不影响嗅觉功能，表明丹曲林在长期鼻腔施用之后对嗅觉功能无显著副作用(图12)。

P-gp/BCRP抑制不会增加脑中的丹曲林浓度

检查了P-gp/BCRP抑制剂尼莫地平或依克立达是否会增加丹曲林脑浓度。尼莫地平和依克立达均未显著增加丹曲林脑/丹曲林血浆浓度比率(图13)。

此研究表明，与口服施用相比，使用

(伊格尔制药公司)配方鼻内施用丹曲林显著增加其在脑中的浓度和持续时间，而对嗅觉、肝脏或运动功能没有明显的副作用。在施用之后的前70分钟期间，鼻内丹曲林没有增加其通过BBB的通道，因为在此时间段内脑浓度与血浆浓度的比率没有显著差异。P-gp/BCRP泵的抑制剂在不同的丹曲林脑浓度中没有作用。因此，长期使用丹曲林治疗包含AD的各种神经退行性疾病患者既可行又可以忍受。与常用的口服方法相比，鼻内丹曲林显著增加了脑峰值浓度，为使丹曲林达到治疗各种神经退行性疾病(包含AD)的最低治疗浓度提供了一种新方法。此外，鼻内施用之后丹曲林在脑中的持续时间比口服施用之后长得多，使得脑中的整体暴露显著增加。总体而言，更多的脑丹曲林暴露将显著增加丹曲林在各种神经退行性疾病(包含中风和AD)中成功发挥神经保护作用的机会，并可能减少副作用。此研究的结果证明，与口服方法的0nM相比，鼻内施用的脑浓度在150分钟时为479nM(150.53ng/g)(图10C)。因此，与口服施用相比，相对较低剂量的鼻内丹曲林可达到神经保护所需的最低脑浓度，同时最小化显著的外周副作用。与口服丹曲林施用相比，鼻内施用丹曲林与较低的血浆丹曲林浓度相关。与口服施用不同，鼻内方法还避免肝脏首过代谢。这是治疗和保护各种神经退行性疾病(包含AD)的重要新方法。

在前70分钟内，当与口服方法相比时，本研究中的鼻内丹曲林没有增加其通过BBB的通道。然而，由于丹曲林在脑中的浓度持续时间较长，鼻内施用之后120与150分钟之间的丹曲林血浆/脑浓度比率仍然可以计算，但在口服方法之后，当血浆和脑两者丹曲林浓度均达到零时，则无法计算。本研究表明，在至多四个月的鼻腔治疗之后，丹曲林鼻内施用三周不影响嗅觉功能，也不影响运动功能或引起明显的副作用。这些结果表明，长期施用丹曲林相对安全，使其长期用于治疗AD是可行的。这种可以维持丹曲林脑浓度和持续时间，但降低血浆浓度的新方法，将使其长期使用更具有耐受性和实用性。

总之，使用

配方鼻内丹曲林施用显著增加脑峰值浓度和持续时间，即使在长期使用后也没有任何明显的副作用，为增强丹曲林在各种神经退行性疾病中的神经保护作用提供了一种新的潜在方法，包含治疗AD和其中表现出的认知障碍。

实例3

鼻内丹曲林作为阿尔茨海默氏病5XFAD小鼠的疾病修饰药物

此研究调查了5XFAD小鼠的血浆和脑浓度以及鼻内丹曲林的治疗效果以及相关的副作用，不仅作为一种缓解症状的药物，而且作为一种修饰疾病的药物，并与在不同FAD动物模型中进行的皮下方法相比，如通过Peng J等人,《神经科学通讯快报》2012；516:274所描述的，所述文献通过引用整体并入。

材料与方法

动物

所有程序均获得宾夕法尼亚大学机构动物护理和使用委员会(IACUC)的批准。两对5XFAD小鼠(B6SJL-Tg(APPSwFIL on，PSEN1*M146L*LV286V)6799Vas/Mmjax)和野生型小鼠(B6SJLF1/J)小鼠购自杰克逊实验室(缅因州巴尔港)并饲养。这些5XFAD转基因小鼠过表达具有瑞典(K670N、M671L)、佛罗里达(I716V)和伦敦(V717I)家族性阿尔茨海默氏病(FAD)突变的突变人APP以及具有两个FAD突变M146L和L286V的人PS1，如通过Oakley H等人,《神经科学杂志(J Neurosci.)》2006；26:10129所描述的，所述文献通过引用整体并入。5XFAD小鼠模型是一种侵袭性AD动物模型，细胞内淀粉样蛋白首次出现在2个月大，并且认知功能障碍从6个月大开始出现，其适合测试药物疗效，如通过Hillmann A等人,《衰老神经生物学(Neurobiol Aging)》2012；33 833所描述的，所述文献通过引用整体并入。动物被圈养在宾夕法尼亚大学的动物设施中，在12小时光照循环和受控室温下。笼子里可获得食物和水。所有小鼠都在不迟于一个月大的时候断奶，并在断奶之前通过聚合酶链反应(PCR)分析进行基因鉴定。此时，将小鼠根据年龄、性别分为不同的笼子，其中每笼不超过5只小鼠。本研究中使用了雄性和雌性小鼠。

鼻内对皮下丹曲林施用和药物浓度测量

丹曲林施用

将两个月大的WT小鼠随机分为鼻内(N＝5)或皮下(N＝5)组，接受溶解在与

(丹曲林钠，新泽西州伊格尔制药公司)相同的媒剂中的丹曲林，所述媒剂由125mg甘露醇、25mg聚山梨醇酯80、4mg聚维酮K12和5mL的无菌注射用水组成，并且pH调节至10.3。丹曲林(密苏里州圣路易斯西格玛公司)在媒剂中稀释至5mg/mL和1mg/mL的浓度，分别用于鼻内或皮下施用。对于鼻内施用，用一只手和另一只手握住小鼠的颈背，{1]使用移液管递送每克体重总共1μL//克体重的丹曲林溶液或媒剂。例如，体重为20g的小鼠将会给予20μl的溶液。溶液慢慢地直接递送到小鼠的鼻子中，如先前通过《关于药物和治疗的医学通讯快报(Med Lett Drugs Ther.)》2015；57:100所描述的，所述文献通过引用整体并入。小心确保小鼠受到最小化的压力，并且相应的溶液留在鼻腔中并且没有进入胃部或肺部。进行了皮下丹曲林施用，如先前通过Peng J等人,《神经科学通讯快报》2012；516:274所描述的，所述文献通过引用并入，其中总皮下注射为每克体重5μl。

丹曲林浓度的测量

2月龄的野生型小鼠以5mg/kg的剂量皮下或鼻内给予丹曲林一次。在药物施用之后20或60分钟获得血浆或脑组织，如通过Peng J等人,同上所描述的。使用AgilentHewlett Packard Model 1100系列和方法通过高效液相色谱法(HPLC)确定血浆或脑丹曲林浓度，如通过Peng J等人,同上所描述的。简言之，将冷冻的脑组织放置到200μl的混合溶液(乙腈：H₂O，2:1)中并均质化，然后将悬浮液以4°161Cat 20,000×g离心20分钟，将50μl的上清液注射到HPLC中进行分析。乙腈用作流动相的组分A，并且磷酸钾缓冲溶液(pH 7.0)用作组分B。流动相流速为1.0毫升/分钟，其中组分A和B的比例分别为流动相的12％到88％。用UV检测器在254nm处进行检测。蛋白质没有从脑或血浆中沉淀出来。

丹曲林治疗和实验组

此研究中使用了年龄匹配的雄性和雌性小鼠两者。所有小鼠在1个月左右进行基因分型时随机分为12组。前8组被命名为早期治疗组(ETG，参见图14)，因为这些组的治疗在动物2个月大时开始，在原发性淀粉样蛋白病理发作和认知功能障碍出现之前。接下来的4组被命名为晚期治疗组(LTG，参见图14)，因为丹曲林治疗在动物6个月大时开始，在淀粉样蛋白病理和认知功能障碍发作之后很久，以确定丹曲林作为疾病修饰药物。不同治疗组中的动物接受鼻内丹曲林(IN-DAN)、皮下丹曲林(SQ-DAN)、鼻内对照媒剂(IN-VEH)或不治疗(CON，阴性对照)。ETG中的动物在2个月大时开始接受治疗(星期一、星期三和星期五)，在细胞内淀粉样蛋白病理学和任何认知功能障碍发作之前。晚期治疗组(LTG)、鼻内丹曲林(IN-DAN)和皮下丹曲林(SQ-DAN)在6个月大时开始了相同的治疗，这是在胞外淀粉样蛋白斑块累积和认知功能障碍发生之后很久。对照媒剂是新鲜制备的，并且含有Ryanodex,《关于药物和治疗的医学通讯快报》2015；57:100中的所有非活性成分。分别使用5mg/mL或1mg/mL剂量水平下的新鲜丹曲林。每次在用用于鼻内(5mg/ml)和皮下(1mg/ml)施用的媒剂施用之前制备新鲜的丹曲林溶液。所有小鼠都继续接受治疗，直到它们在12个月大时被安乐死。

埋藏食物测试

使用为期3天的埋藏食物测试方案在8个月大时评估所有组的嗅觉功能，如通过Yang M等人,《神经科学实验指南)2009；48:8.24所描述的，所述文献通过引用整体并入。

第一天，小鼠在一般情况下被关在笼子里；将饼干(Galletas La Moderna,S.A.deC.V.；每2只小鼠1块饼干)埋藏在笼子垫料下24小时，并且然后记录消耗的饼干数量。小鼠在第二天下午4点开始禁食，在第三天上午9点结束。在此期间可以免费获得水。

埋藏食物测试在第三天大约上午9-11点进行。所述小鼠在测试之前适应测试室至少1小时。小鼠被单独放置在干净的笼子里，笼子里有干净的床上用品，一块饼干埋藏在垫料下面的角落中。手动记录动物找到饼干的等待时间(鉴定为用前爪抓住饼干)。如果动物在15分钟内没有找到饼干，它就会被放回自己的笼子里。每只动物都使用干净的笼子和垫料，研究人员对实验条件不知情。

旋转棒测试

检查运动功能以检测肌肉无力，这是丹曲林作为肌肉松弛剂的常见副作用。评估了6个月大的ETG中的小鼠(数据未示出)和所有9个月大的组在加速旋转棒(IITC序列8，加利福尼亚州伍德兰希尔斯生命科学仪器公司)上花费的时间，如通过Peng J等人,同上所描述的。简言之，动物在测试之前至少1小时适应测试室。以恒定速度(9rpm)进行两次60秒的训练试验，其中间隔30分钟。然后，以逐渐增加的速度(4-40rpm)进行三个120秒的测试试验，其中试验之间的间隔为60分钟。自动记录并分析从旋转棒上跌落的等待时间。

恐惧条件测试

ETG在6和11个月大时对记忆和学习进行了评估，但LTG仅在11个月大时进行了评估。使用恐惧条件测试评估海马依赖性和非依赖性记忆，如通过Zhang Y,《神经病学年鉴(Ann Neurol)》2012；71:687所描述的，所述文献通过引用整体并入。在测试之前至少1小时将动物带到测试室以适应测试室。在测试的第一天，每只小鼠都被放置在测试室中，并在每个循环之间进行了60秒的三个条件刺激配对。2000Hz和85dB的30秒音调用作音调刺激，并且2秒0.7mA的足电电击用作电击刺激。在最后一次刺激之后30秒，将小鼠从房间中去除。在第二天，首先进行情境恐惧条件反射测试以测量海马依赖性记忆。小鼠在没有声音或电击的情况下被放置在同一个室中6分钟，并且然后从室中去除。两小时后，进行了提示恐惧条件测试以测量海马非依赖性记忆。小鼠被放置在另一个大小和气味不同的室中，使用不同的清洁液。在前3分钟期间没有音调或点击。之后，小鼠经历了3个相同音调的循环，其中每个循环之间有60秒的间隔，并记录了冻结时间。然后在最后一次音调之后60秒将动物从室中去除。ANY-maze控制的恐惧调节系统由配备有相机和ANY-maze软件(伊利诺伊州伍德戴尔V.4.99Stoelting公司)的消音室(型号：46000-590，意大利杰莫尼奥UGO巴西莱公司)组成，其记录了冻结时间。在训练试验的第一天和情境恐惧条件测试中的第二天，在试验之间用75％的酒精溶液彻底清洁室，并在提示恐惧条件测试中的第二天用水彻底清洁。研究者对治疗组不知情。

莫里斯水迷宫

还使用莫里斯水迷宫(MWM)测量了所有11个月大的组的学习和记忆。简言之，在整个测试中使用了1.5m直径的充满水的池和15cm的平台。用二氧化钛使水不透明，并且温度控制在21-24℃下。在前5天(第1天到第5天)，小鼠经历了4天的提示试验。池被白色窗帘包围，并且平台被淹没在水下1–1.5cm处，顶部有旗帜作为小鼠的提示。在提示试验期间，平台的位置和起点是随机的。当小鼠从池中逃到平台上时，让它在平台停留15秒。如果小鼠没有找到平台，实验者会轻轻地将其引导到平台上。记录每只小鼠找到平台的等待时间。在接下来的5天期间(第6天到第10天)，动物每天进行4次场地试验。窗帘和平台被去除。墙上有若干个视觉提示。平台的位置是固定的，并且起点是随机的。测试室的情况从那以后就一直保持一致。与提示试验类似，小鼠在从池中去除之前在平台上停留15秒，或者如果在60秒内未能找到平台，则将小鼠引导到平台上。记录每只小鼠找到平台的等待时间。第二天(第11天)，小鼠进行了探针试验，其中平台被去除。起点固定在平台所在的相反象限。记录每只小鼠在每个象限中花费的时间。计算每只小鼠在目标象限与相对象限所花费的时间之比。

组织制备

完成所有行为测试之后，在11-12个月大时处死小鼠。如先前所描述的，用通过鼻锥递送的2-4％异氟醚麻醉动物，并且根据动物的应答调整浓度。使用配备有30G针头的注射器从心脏采集血液。血液在4℃下以3000rpm离心10分钟，收集上清液并在–80℃下冷冻。如果用于浓度研究，血浆样品应避光。在去除肝脏和脑之前，用冷磷酸盐缓冲盐水(PBS)进行经心灌注。整个脑被解剖用于脑浓度研究，其避光并在–80℃下冷冻。对于丹曲林治疗组，解剖肝脏和脑。肝脏和脑的左半部分在4℃下在4％多聚甲醛中后固定过夜，并用石蜡包埋进行切片。随机选择每组中的几只动物进行切片以进行免疫组织化学和组织学研究，并且每个评估的确切动物数量呈现在每个图例中。右半脑被冷冻在–80℃以进行生化分析。

免疫组织化学染色

石蜡包埋的冠状脑切片(10μm)用于免疫组织化学染色，如通过Peng,J.等人,2012.同上所描述的。简言之，将切片脱蜡并进行水合。抗原修复在压力锅中的抗原修复溶液中进行。然后将切片在10％正常山羊血清(NGS)中温育30分钟，在M.O.M小鼠Ig阻断试剂(PK-2200，载体实验室(Vector Lab))中温育1小时，然后在M.O.M稀释剂中温育5分钟。将载玻片分别与第一抗体，抗6E10(1:500，803001，加利福尼亚州生物传奇公司(Bio Legend,San Diego,CA))在4℃下温育过夜，随后与M.O.M生物素化抗小鼠IgG试剂(PK-2200，VectorLab)温育10分钟并且与VECTASTAIN ABC试剂温育5分钟。然后将切片脱水并用封片剂盖玻片。所有图像均在配备Q Imaging Retiga 2000R数码相机和i Vision成像软件(宾夕法尼亚州艾克斯顿生物视觉公司)的Olympus(BX51W1)显微镜上拍摄。由对组不知情的研究人员使用Image J软件定量每个区域的细胞数量。计算每面积的斑块数量和斑块在整个海马和齿状回中所占的面积百分比。

蛋白质印迹

通过蛋白质印迹分析特定蛋白质的表达来评估突触密度，如通过Peng,J.等人,2012.同上所描述的。简言之，将样品在冰冷的含有蛋白质抑制剂的RIPA中裂解。使用二辛可宁酸(BCA)试剂盒(23227，马萨诸塞州沃尔瑟姆赛默飞世尔科技)测量蛋白质浓度。分别产生每种蛋白质与4×加载缓冲液和ddH₂O的混合物，以达到相同体积的混合物和相同量的蛋白质。将等量的样品加载在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上并转移到硝酸纤维素膜上。将膜与5％脱脂牛奶在室温下温育1小时，随后分别与第一抗体PSD95(1:500，810401，加利福尼亚州生物传奇公司)、突触蛋白1(1:500，515200，宾夕法尼亚州匹兹堡赛默飞世尔科技公司)和β-肌动蛋白(1:2000，A5441，密苏里州圣路易斯西格玛公司)在4℃下温育过夜。膜与相关第二抗体在室温下温育1小时。使用增强型化学发光检测系统(马萨诸塞州比尔里卡密理博公司)检测印迹。使用图像J软件计算归一化为β-肌动蛋白的靶蛋白的密度。(马里兰州贝塞斯达美国国立卫生研究院)。

血浆ALT活性评估

根据制造商的说明，使用丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性比色测定试剂盒(K752，生物视觉公司(美国加利福尼亚州米尔皮塔斯))测量血浆ALT活性，即肝功能的指标。测量了用丹曲林处理最长时间(11个月)的ETG和LGT的血浆ALT活性。简言之，将10μL的血浆稀释到总共100μL的反应混合物中，包含86μl的ALT测定缓冲液、2μl的OxiRed探针、2μl的ALT酶混合物和10μl的ALT底物，以分析从α-酮戊二酸和丙氨酸转化而来的丙酮酸。同时产生丙酮酸标准曲线，使用丙酮酸浓度为0、2、4、6、8、10nmol/孔。在37℃下温育反应之后10分钟(A1)然后在60分钟(A2)时再次测量570nm处的光密度(OD)。在标准曲线的线性范围内测量丙酮酸浓度。ALT活性使用以下公式计算：ALT活性＝(A2-A1)/50*10mU/mL。

肝脏病理学评估

肝脏切片(5μm)被成像用于病理学评估。随机选择来自每个ETG的三只动物，每只动物三个切片用于病理学评估，并且研究人员对载玻片不知情。切片用苏木精和伊红(H&E)染色，然后在Olympus BX51W1显微镜上成像。评估切片的肝损伤，如急性或慢性肝炎、炎症、纤维化、坏死、肝硬化、胆汁淤积和非特异性肝细胞异常。

统计学分析

确定每组中的动物数量，如先前通过Peng等人,《阿尔茨海默氏病痴呆》7:e67所描述的，并且在每个图例中列出。统计学分析由Graph Pad Prism 8.0进行，并在每个图例中进行了描述。由于死亡率，通过ANOVA的重复测量并不总是可能的。数据表示为95％CI的平均值。当p值小于或等于0.05时，它被认为是统计学上的显著差异。(P<0.05)。

与皮下施用相比，鼻内丹曲林增加了血脑屏障(BBB)通道和脑浓度。

全身施用之后观察到的丹曲林有限的BBB渗透性限制了所述药物的使用和潜在有效性。与皮下方法相比，此研究中的鼻内丹曲林施用导致较低的血浆浓度，所述血浆浓度在施用之后20分钟确定(参见图15A)。相比之下，在给药之后60分钟时，鼻内丹曲林施用导致脑浓度显著高于皮下施用(参见图15B)。结合起来，脑/血浆丹曲林浓度比(参见图15C)是一个常用于指示药物穿过BBB的变量，与皮下方法相比，在鼻内施用之后的两个时间点都显著更高。鼻内施用之后脑中积分总体丹曲林暴露显著高于皮下施用(图15D，左图)。相比之下，鼻内施用之后血浆中积分总体丹曲林暴露显著低于皮下施用(图15D，右图)。

早期鼻内或皮下丹曲林治疗改善了5XFAD小鼠的记忆丧失。

海马依赖性和海马非依赖性记忆分别在6个月和11个月大时进行评估，这是在ETG中丹曲林治疗4个月和9个月之后(参见图16A-16D)和在11个月大时在LTG中治疗5个月之后。与WT对照相比，5XFAD对照的两种认知测量均显著受损(图19A-19B)，这证实了5XFAD模型中的侵袭性AD表型。在5XFAD小鼠中，与未经任何治疗的5XFAD对照相比，ETG组在6个月和11个月大两者时鼻内丹曲林治疗显著改善了海马依赖性(参见图16A)和海马非依赖性(参见图16B)记忆(参见图16A-16B)。鼻内丹曲林还显著改善了LTG在11月龄时的海马依赖性记忆丧失，并倾向于改善海马非依赖性记忆(图16A-16B)。有趣的是，鼻内媒剂还改善了6个月和11个月大的海马依赖性记忆丧失，尽管在5XFAD ETG中它仅改善了6个月大的海马非依赖性记忆。皮下丹曲林在ETG中改善了6个月但不是11个月大的两种类型的记忆丧失，并且在LTG中在11个月大时没有有益效果(图16A-16B)。通过任一途径施用丹曲林对野生型小鼠的记忆没有影响(图20A-20B)。经丹曲林治疗的5XFAD小鼠的冷冻时间与WT冷冻时间可比较(图20A-20B)，从而进一步支持转基因小鼠记忆的改善。

两种基因型在10个月大时使用MWM检查海马依赖性学习和记忆。与未经处理的野生型(WT)或5XFAD(TG)对照相比，所有处理组的提示试验随时间未发现显著差异(图21A-21B)。在场所试验中，与对照相比，所有组的逃避等待时间没有显著差异，无论基因型或治疗如何(图21C-21D)。这些动物随时间推移学习了这项任务，但治疗组之间没有差异，基因型之间也没有差异。在目标象限所花费的时间(图21E)和小鼠穿过平台的次数(图21F)的数据中，与对照相比，在所有组之间没有发现显著差异。

鼻内而非皮下丹曲林治疗改善了5XFAD作为疾病修饰药物的记忆丧失。

在10个月大时使用LTG的FCT评估海马依赖性和海马非依赖性记忆，其中鼻内或皮下丹曲林治疗在6个月大时开始，当AD病理学和症状两者都出现时。在5XFAD小鼠中，鼻内(参见图17A)而非皮下(参见图17B)丹曲林治疗显著抑制海马依赖性记忆损伤(参见图17A，上下文)并趋向于改善海马非依赖性记忆丧失(参见图17B，音调)。事实上，鼻内丹曲林治疗将海马依赖性记忆恢复到与WT对照相同的水平。

慢性鼻内或皮下丹曲林治疗耐受性良好

在此研究中，与对照相比，5XFAD小鼠在治疗7个月(ETG)和3个月治疗(LTG)之后，在旋转棒性能方面的运动功能没有显著差异(图17A)。长期鼻内丹曲林治疗也可能损害鼻细胞并损害嗅觉。本研究发现，在5xFAD小鼠中，在6个月的鼻内治疗(ETG)或2个月的治疗(LTG)之后，嗅觉没有显著受损(图17B)。(还参见图16B，分别针对ETG治疗6-7个月，针对LTG治疗2-3个月)长期高剂量口服丹曲林可能会损害肝功能。在此研究中，丹曲林治疗，鼻内或者皮下，10个月(ETG)对5XFAD小鼠的肝功能或肝结构没有显著影响(图17C-17D)。(还参见图18C，9-10个月的治疗)和肝脏结构(还参见图18D，9-10个月的治疗)。此外，至多10个月的慢性鼻内或皮下丹曲林治疗不影响任一组5XFAD小鼠的死亡率或体重(图17E-17F)。在野生型小鼠中，嗅觉、运动功能、死亡率或体重没有显著差异(图22A-22C、22E、22F)。尽管在治疗10个月之后(ETG)在野生型小鼠中检测到肝酶丙氨酸氨基转移酶显著增加，但所述值仍在正常生理范围内(图22D)。此外，至多10个月的慢性鼻内或皮下丹曲林治疗不会影响任一类型的小鼠的死亡率(表1)。

表1：WT对5XFAD小鼠的死亡率

实验组之间无统计学意义。

WT，野生型；In，鼻内；Sub，皮下；Dan，丹曲林

丹曲林治疗并未降低5XFAD小鼠海马和皮质中的淀粉样蛋白负载

确定并分析海马和皮质两者的淀粉样蛋白阳性细胞的数量和面积(参见图18A-18F)。与WT对照相比，5XFAD小鼠的海马(数据未示出)和皮质(数据未示出)两者均存在显著更多的淀粉样蛋白斑块。鼻内和皮下丹曲林治疗均未显著改变5XFAD小鼠海马或皮质中的淀粉样蛋白负载(参见图18A-18F)。在WT小鼠中未检测到淀粉样蛋白(图23A-23B)。

在突触功能相关蛋白中未发现显著差异

确定来自全脑的PSD95和突触蛋白1的表达，并分析ETG和LTG。对于任一基因型，治疗组与对照之间没有显著差异(图24A-24D)。

在使用5XFAD小鼠的AD侵袭性动物模型中，本研究证明，慢性鼻内丹曲林治疗(而非皮下注射)几乎消除了记忆丧失，即使在明显的AD神经病理和认知功能障碍发作之后开始鼻内丹曲林治疗时也是如此。鼻内丹曲林治疗示出疾病修饰特性，对5XFAD小鼠的运动协调性、嗅觉、肝功能和死亡率没有明显的不利影响。与皮下方法相比，丹曲林对脑的更大渗透，正如鼻内施用之后更高的脑浓度所证明的那样，与其对改善5XFAD小鼠记忆损伤的更好治疗效果是一致的。这是第一项研究表明，与皮下方法相比，丹曲林在鼻内施用之后具有改善的CNS渗透和对认知功能障碍的优越治疗效果，甚至作为一种疾病修饰药物，使鼻内丹曲林治疗成为治疗AD的新药。

此研究选择确定剂量施用后20分钟和60分钟的丹曲林血浆和脑浓度，因为这是在初步研究中分别确定的鼻内或皮下施用之后达到峰值浓度的时间。

此研究发现，与皮下方法相比，鼻内施用之后20和60分钟，丹曲林的脑浓度增加，其中同时血浆浓度降低。这表明鼻内递送比皮下方法更好地渗透到脑中。发明人还发现，与口服方法相比，鼻内丹曲林方法增加了脑峰值浓度并延长了脑中的持续时间，但没有显著增加其通过BBB的能力。与使用鼻内方法的血浆相比，增加脑的好处是减少了治疗剂量，从而最小化外周副作用。

在此研究中，MWM测试也没有检测到10个月大的WT与5XFAD小鼠之间的不同认知功能(图21A-21F)，进一步表明MWM对确定老年小鼠的学习和记忆变化的敏感性较低(图22F)。另一方面，恐惧条件测试证明，与WT对照相比，11个月大的5XFAD小鼠的海马依赖性和海马非依赖性记忆降低。此外，本研究发现，在AD病理和认知功能障碍发作之后开始治疗时，在相同剂量下，作为一种疾病修饰药物，仅鼻内施用丹曲林而不是皮下施用丹曲林改善了记忆丧失，与其相对的更有效地渗透到脑和更高的脑丹曲林浓度一致。在5XFAD小鼠中，丹曲林恢复海马依赖性记忆比恢复海马非依赖性记忆更有效。这些结果在临床上很重要，因为在认知功能障碍发作之前有效诊断AD通常是困难和不便的。因此，即使在记忆丧失发作之后的有效治疗也使鼻内丹曲林治疗成为AD患者的有前景的治疗方法。与其它施用模式相比，在AD患者中鼻内施用丹曲林的另一个优点是其易于使用和方便患者。

在AD病理和认知功能障碍发作之前或之后开始的鼻内丹曲林治疗不会影响5XFAD小鼠的胞外斑块，尽管它几乎消除了记忆丧失，充当了疾病修饰药物。

此研究表明，鼻内或皮下5mg/kg的丹曲林至多9-10个月不会影响5XFAD小鼠的死亡率、肝脏结构和功能或引起其它严重的副作用，进一步加强了丹曲林长期使用之后的安全性。此外，由于丹曲林的神经保护作用明显是剂量依赖性的，相对于皮下方法，鼻内施用之后较高的脑浓度和较低的血浆浓度使得进一步降低鼻内丹曲林剂量，同时仍保持有效治疗成为可能。

与皮下方法相比，作为疾病修饰药物，鼻内丹曲林施用提供更高的脑浓度和更好的治疗效果，以改善记忆丧失，而不会显著影响胞外淀粉样蛋白斑块或引起明显的副作用。

实例4

丹曲林改善来自阿尔茨海默氏病患者的神经元的谷氨酸诱导的线粒体钙增加

谷氨酸兴奋性毒性和细胞内钙稳态的相关破坏在阿尔茨海默氏病(AD)的病理、突触和认知功能障碍中发挥重要作用。通过兰尼碱受体(RyR)的过度活化从ER释放过多的钙会导致线粒体钙超载和AD功能障碍，如氧消耗和ATP产生减少。RyR钙通道对于由ER释放引起的线粒体Ca²⁺增加是必需的，所述释放被丹曲林抑制。此研究调查了丹曲林是否改善来自患有AD的患者的诱导多能干细胞(iPSC)衍生神经元中的谷氨酸诱导的线粒体钙超载，并具有抑制RyR和N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体的能力。此研究证明，丹曲林显著抑制了谷氨酸诱导的线粒体钙增加以及源自AD患者的神经元中的胞质ATP浓度的相关降低。

方法

细胞培养物

健康对照细胞(AG02261)和来自散发性阿尔茨海默氏病的iPSC(AG11414)从JohnA.Kessler的实验室获得。来自家族性阿尔茨海默氏病的iPSC(GM24675)购自科里尔研究所(新泽西州卡姆登)。每种类型的iPSC均由一名健康人受试者或一名诊断为散发性阿尔茨海默氏病或家族性阿尔茨海默氏病的患者的皮肤成纤维细胞产生。AG02261细胞系来自61岁的男性健康患者。另一种AG11414细胞系来自39岁的早发性阿尔茨海默氏病男性患者，所述患者显示出APOE3/E4基因型。GM24675细胞系源自具有APOE基因型3/3的60岁的家族性阿尔茨海默氏病患者。将人诱导多能干细胞维持在mTeSR^TM加培养基(目录号05825，加拿大干细胞技术公司)中的基质胶包被的板(美国BD生物科学公司)上，并在37℃下在5％CO₂湿润气氛中培养。每天更换培养基。

用于从iPSC分化为未成熟皮质神经元的方案先前通过Shi,Y.等人,《自然实验手册》,2012；7:1836所描述，所述文献通过引用整体并入。简言之，通过双重SMAD抑制将无饲养层培养物诱导为神经祖细胞。细胞在含有2μM SB431542和2μM DMH1(两者均来自美国托克里斯)的化学品定义的条件下培养7天。从第12天开始，将培养基改为神经维持培养基(这是含N-2和B-27的培养基的1:1混合物；N-2培养基由达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基/F-12GlutaMAX、1×N-22、5μg/ml胰岛素、1mM l-谷氨酰胺、100μM非必需氨基酸、100μM 2-巯基乙醇、50单位/ml青霉素和50mg/ml链霉素组成；B-27培养基由基础培养基、1×B-27、200mMl-谷氨酰胺、50U/ml青霉素和50mg/ml链霉素组成)。在第12-17天左右用倒置显微镜观察培养物时，神经花环结构应该很明显。从这一点开始，每隔一天更换一次培养基。

免疫细胞化学

将细胞铺板在带有玻璃盖玻片的24孔板上并进行处理。处理值后，将细胞在PBS中短暂冲洗并在室温下在4％多聚甲醛中固定15分钟，随后用PBS洗涤三次，每次5分钟。然后将所述细胞在含有0.1％Triton X-100的PBS中通过5％正常山羊血清在室温下封闭1小时。第一抗体在含有1％牛血清白蛋白和0.3％Triton X-100的PBS中稀释。用PBS洗涤三次之后，将细胞在用PBS稀释的第二抗体(1:1000)中在室温避光温育1到2小时。最后，将盖玻片用PBS冲洗一次，并用PBS中的Hoechst 33342(1:1000)染色持续2-5分钟。用PBS洗涤三次持续5分钟之后，用Gold防褪色试剂固定细胞，在平面上避光固化过夜，并且用指甲油密封并成像。第一抗体浓度如下所列出：TUJ1(1:1000)、DCX(1:500)、MAP2(1:500)。图像获取和分析由对实验处理不知情的人进行。在盖玻片上的随机位置获取五组图像，并且随后使用Image J 1.49v软件(美国国立卫生研究院)合并。计算了阳性细胞占细胞总数的百分比，并且在来自至少三种不同培养物的不同组之间进行比较。

细胞活力

如先前所描述的，使用3-(4,5-二甲基噻唑-2基)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT)还原测定确定细胞活力。处理前一天，将每孔50,000个细胞接种在96孔板中并温育24小时。在每个实验期间，每个处理至少重复三次。处理结束时，将10μl/孔的0.25％MTT溶液添加到96孔板中，并且在37℃下避光温育4小时，直到显微镜下可见细胞内紫色甲臜结晶。然后去除培养基，每孔用150μl二甲亚砜(DMSO)溶解甲臜晶体，在室温下温育并在振荡器上用箔覆盖30分钟，直到紫色晶体溶解。在读板仪(Synergy^TMH1读板仪，美国佛蒙特州威努斯基伯腾公司)上在540nm处测量吸光度。

胞质ATP产生

如先前所描述的，通过使用可商购获得的荧光素酶-荧光素系统(ATPlite；马萨诸塞州沃尔瑟姆珀金埃尔默公司(PerkinElmer,Waltham,MA))评估胞质ATP产生。处理前一天，将每孔50,000个细胞接种在具有100μL培养基的96孔板中，并温育24小时。在每个实验期间，每个处理至少重复三次。96孔板的每孔添加50μL的哺乳动物细胞裂解溶液。振荡板，并且然后将50μL底物溶液添加到孔中。用BioTech Synergy H1读板仪测量发光。

胞质和线粒体Ca²⁺浓度测量

使用基于水母发光蛋白水母发光蛋白的探针测量iPSC衍生神经元在谷氨酸暴露之后胞质Ca²⁺浓度([Ca²⁺]_c)和线粒体Ca²⁺浓度([Ca²⁺]_m)的变化，如通过Bonora,M.等人,《自然实验手册》2013；8:2105所描述的，所述文献通过引用整体并入。12-15×10⁴个细胞被铺板在24孔板上的12-mm盖玻片上，生长至60-70％汇合，并且然后根据制造商的说明书使用Lipofectamine 3000转染试剂(美国赛默飞世尔科技公司)用cyt--Aeq或mit-Aeq质粒转染。第二天，将转染的细胞在有或没有丹曲林20μM的情况下与5μM的腔肠素一起在补充有1mM CaCl₂和5mM葡萄糖的改良Krebs-Ringer缓冲液(以mM为单位：135NaCl、5KCl、1MgCl₂、20Hepes、0.4KH₂PO₄、pH 7.4)中温育1小时，并且然后转移到灌注室中。所有水母发光蛋白测量均在Krebs-Ringer缓冲液中进行，并将20mM谷氨酸(含或不含丹曲林20μM)添加到相同培养基中。实验是在定制的水母发光蛋白记录系统中进行的。通过在富含低渗Ca²⁺的溶液(H₂O中的10mM CaCl₂)中用100μM的洋地黄皂苷裂解细胞来终止实验，从而排出剩余的水母发光蛋白池。通过基于水母发光蛋白在pH、[Mg²⁺]和离子强度等生理条件下的Ca²⁺应答曲线的算法收集光信号并校准为[Ca²⁺]_c或[Ca²⁺]_m值，如先前所描述的。

数据分析和统计

使用GraphPad Prism 8软件(美国GraphPad软件公司)进行统计学分析。所有值均表示为平均值±SD。使用谷氨酸浓度和丹曲林作为组间因素，使用单向方差分析和双向方差分析对数据进行分析。P<0.05被认为表明具有统计学意义的结果。每个实验至少重复三次。使用的实验单位(n)和统计学分析在图和图例中表明。

结果

从阿尔茨海默病患者的诱导多能干细胞(iPSC)向未成熟神经元的分化显著受损

来自健康人受试者(对照)和散发性阿尔茨海默氏病(SAD)或家族性(FAD)阿尔茨海默氏病患者的诱导多能干细胞(iPSC)被诱导并分化为未成熟神经元(23天)，并以针对不同类型细胞的特异性抗体为特征。神经祖细胞(TJU1染色，图19A)和成熟神经元(MAP2，图19C)阳性细胞中的三种细胞之间没有显著差异。然而，与对照相比，源自SAD和FAD患者的未成熟神经元(DCX，图19B)阳性细胞显著减少。

谷氨酸剂量依赖性地降低iPSC衍生的未成熟神经元细胞活力和ATP产生

使用MTT还原测定对谷氨酸对iPSC衍生的未成熟神经元细胞存活的影响进行了剂量应答研究。10到30mM的谷氨酸剂量依赖性地在三种细胞中诱导显著的细胞损伤(图20)。通过使用可商购获得的荧光素酶-荧光素系统评估ATP产生。当细胞暴露于谷氨酸(20-30mM)时，胞质ATP产生也呈剂量依赖性降低。与健康对照相比，当暴露于15mM和20mM谷氨酸时，来自FAD患者iPSC的未成熟神经元倾向于具有显著受损的ATP产生(图21)。

丹曲林改善了iPSC衍生的未成熟神经元中谷氨酸介导的线粒体钙增加。

进一步研究了FAD患者iPSC衍生的神经元中ATP产生受损的可能机制。使用基于水母光蛋白水母发光蛋白的探针测量线粒体钙浓度(图22A、22B)。FAD患者衍生的神经元中线粒体钙浓度的谷氨酸介导的峰值升高和总暴露(AUC(曲线下面积))显著高于健康对照，这通过丹曲林的预处理被改善(图22C、22D)。

本领域技术人员将理解，可以在不脱离其广泛的发明构思的情况下对上文所描述的实施例进行改变。因此，应当理解，本发明不限于所公开的特定实施例，而是旨在涵盖在如由所附权利要求书限定的本发明的精神和范围内的修改。

Claims (89)

1.一种用于抑制患有或怀疑患有阿尔茨海默氏病(Alzheimer's Disease，AD)的受试者的神经元中受损的神经发生和/或突触发生的方法，其中所述神经发生和/或突触发生的损伤至少部分地由内质网(ER)兰尼碱受体(RyR)的过度活化引起，所述方法包括向所述受试者鼻内施用一定量的药物组合物，所述药物组合物包括有效减少ER钙离子(Ca²⁺)的释放的丹曲林(dantrolene)。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述神经发生包括从神经祖细胞(NPC)到未成熟神经元的神经发生，随后是从未成熟神经元到皮质神经元的神经发生。

3.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其中所述突触发生发生在皮质神经元中。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述皮质神经元是胆碱能神经元。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述皮质神经元是基底前脑胆碱能神经元(BFCN)神经元、前额皮质神经元、海马神经元或其组合。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述AD是家族性阿尔茨海默氏病(FAD)或散发性阿尔茨海默氏病(SAD)。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述RyR选自由以下组成的组：1型RyR(RyR-1)、2型RyR(RyR-2)、3型RyR(RyR-3)和其组合。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述内质网(ER)兰尼碱受体(RyR)的过度活化使线粒体钙升高并且降低ATP。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中丹曲林的鼻内施用使升高的线粒体钙降低并且增加胞质ATP。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述包括丹曲林的药物组合物每周施用三次。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述包括丹曲林的药物组合物施用持续四个月到一年。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述包括丹曲林的药物组合物施用持续至多两年。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述包括丹曲林的药物组合物施用持续超过两年。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述施用不会导致所述受试者的嗅觉功能、运动功能或肝功能损伤。

15.一种用于改善和/或减缓神经病理和认知功能障碍发作之后认知功能下降的方法，其中所述神经病理和所述认知功能障碍由阿尔茨海默氏病(AD)引起，所述方法包括向有需要的受试者鼻内施用一定量的药物组合物，所述药物组合物包括有效抑制NMDA受体和/或兰尼碱受体(RyR)的过度活化的丹曲林。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述认知功能是记忆、学习、思考、注意力、感知、语言使用、推理、决策、解决问题或其组合。

17.根据权利要求15到16中任一项所述的方法，其中所述AD是家族性阿尔茨海默氏病(FAD)或散发性阿尔茨海默氏病(SAD)。

18.根据权利要求15到17中任一项所述的方法，其中所述RyR选自由以下组成的组：1型RyR(RyR-1)、2型RyR(RyR-2)、3型RyR(RyR-3)和其组合。

19.根据权利要求15到18中任一项所述的方法，其中所述包括丹曲林的药物组合物每周施用三次。

20.根据权利要求15到18中任一项所述的方法，其中所述包括丹曲林的药物组合物施用持续四个月到一年。

21.根据权利要求15到18中任一项所述的方法，其中所述包括丹曲林的药物组合物施用持续至多两年。

22.根据权利要求15到18中任一项所述的方法，其中所述包括丹曲林的药物组合物施用持续超过两年。

23.根据权利要求15到22中任一项所述的方法，其中所述施用不会导致所述受试者的嗅觉功能、运动功能或肝功能受损。

24.一种用于在阿尔茨海默氏病(AD)的症状发作之前改善记忆的方法，所述方法包括向有需要的受试者鼻内施用一定量的药物组合物，所述药物组合物包括有效抑制NMDA受体和/或兰尼碱受体(RyR)的过度活化的丹曲林。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述包括丹曲林的药物组合物每周施用三次。

26.根据权利要求24或25中任一项所述的方法，其中所述包括丹曲林的药物组合物施用持续四个月到一年。

27.根据权利要求24或25中任一项所述的方法，其中所述包括丹曲林的药物组合物施用持续至多两年。

28.根据权利要求24或25中任一项所述的方法，其中所述包括丹曲林的药物组合物施用持续超过两年。

29.根据权利要求24到28中任一项所述的方法，其中施用不会损害所述受试者的嗅觉功能、运动功能或肝功能。

30.根据权利要求24到29中任一项所述的方法，其中所述AD的症状是神经病理、认知功能障碍或其组合。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述认知功能障碍是短期或长期记忆丧失、学习困难、思考困难、注意力/集中困难、感知困难、语言使用困难、推理困难、决策困难/判断力受损、解决问题困难、混淆、运动协调性差或其组合。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述短期或长期记忆丧失是海马依赖性和海马非依赖性记忆丧失。

33.根据权利要求31或32中任一项所述的方法，其中所述神经病理是脑神经元之间的淀粉样蛋白累积。

34.根据权利要求24到33中任一项所述的方法，其中所述AD是家族性AD(FAD)或散发性AD(SAD)。

35.根据权利要求24到34中任一项所述的方法，其中所述RyR选自由以下组成的组：1型RyR(RyR-1)、2型RyR(RyR-2)、3型RyR(RyR-3)和其组合。

36.一种用于在阿尔茨海默氏病(AD)的症状发作之后改善记忆丧失的方法，其中所述记忆丧失由AD引起，所述方法包括向有需要的受试者鼻内施用一定量的药物组合物，所述药物组合物包括有效抑制NMDA受体和/或兰尼碱受体(RyR)的过度活化的丹曲林。

37.根据权利要求36所述的方法，其中所述包括丹曲林的药物组合物每周施用三次。

38.根据权利要求36或37中任一项所述的方法，其中所述包括丹曲林的药物组合物施用持续四个月到一年。

39.根据权利要求36或37中任一项所述的方法，其中所述包括丹曲林的药物组合物施用持续至多两年。

40.根据权利要求36或37中任一项所述的方法，其中所述包括丹曲林的药物组合物施用持续超过两年。

41.根据权利要求36到40中任一项所述的方法，其中施用不会损害所述受试者的嗅觉功能、运动功能或肝功能。

42.根据权利要求36到41中任一项所述的方法，其中所述AD的症状是神经病理、认知功能障碍或其组合。

43.根据权利要求42所述的方法，其中所述认知功能障碍是短期或长期记忆丧失、学习困难、思考困难、注意力/集中困难、感知困难、语言使用困难、推理困难、决策困难/判断力受损、解决问题困难、混淆、运动协调性差或其组合。

44.根据权利要求43所述的方法，其中所述记忆丧失是海马依赖性和海马非依赖性记忆丧失。

45.根据权利要求42到44所述的方法，其中所述神经病理是脑神经元之间的淀粉样蛋白累积。

46.根据权利要求36到45中任一项所述的方法，其中所述AD是家族性AD(FAD)或散发性AD(SAD)。

47.根据权利要求36到46中任一项所述的方法，其中所述RyR选自由以下组成的组：1型RyR(RyR-1)、2型RyR(RyR-2)、3型RyR(RyR-3)和其组合。

48.一种用于增加受试者的脑中的丹曲林的浓度和持续时间的方法，所述方法包括向有需要的受试者鼻内施用一定量的包括丹曲林的药物组合物。

49.一种用于抑制患有或怀疑患有阿尔茨海默氏病(AD)的受试者的神经元中受损的神经发生和/或突触发生的方法，其中所述神经发生和/或突触发生的损伤至少部分地由内质网(ER)兰尼碱受体(RyR)的过度活化引起，所述方法包括：

a)向所述受试者鼻内施用一定量的药物组合物，所述药物组合物包括有效减少ER钙离子(Ca²⁺)的释放的丹曲林；以及

b)向步骤(a)的所述受试者施用治疗有效量的谷氨酸受体拮抗剂。

50.根据权利要求49所述的方法，其进一步包括：

c)在步骤(a)之前从所述受试者中获得脑脊液(CSF)；以及

d)确定所述CSF中的谷氨酸水平，

其中步骤(d)中的所确定的谷氨酸水平高于从对照受试者中获得的CSF中的谷氨酸水平表明所述受试者适合用丹曲林治疗。

51.根据权利要求50所述的方法，其进一步包括：在步骤(b)之前从所述受试者中获得CSF；以及确定所述CSF中的谷氨酸水平，其中所确定的谷氨酸水平高于从对照受试者中获得的CSF中的谷氨酸水平表明所述受试者适合用谷氨酸受体拮抗剂治疗。

52.根据权利要求49或权利要求50所述的方法，其中所述谷氨酸受体拮抗剂是通过在谷氨酸结合位点处的竞争性拮抗作用阻断所述NMDA受体的药剂，或者是通过在甘氨酸、苯环利定(phencyclidine)和/或镁结合位点处的非竞争性拮抗作用阻断所述NMDA受体的药剂。

53.根据权利要求52所述的方法，其中通过在谷氨酸结合位点处的竞争性拮抗作用阻断所述NMDA受体的所述药剂是赛福太(selfotel)(CGS 19755)、阿替加奈(aptiganel)(CNS1102)、CGP 37849、APV或AP-5(R-2-氨基-5-膦酰基戊酸酯)、2-氨基-7-膦酰基-庚酸(AP-7)、3-[(R)-2-羧基哌嗪-4-基]-丙-2-烯基-1-膦酸(CPPene)和/或阿斯巴甜(aspartame)。

54.根据权利要求52所述的方法，其中通过在苯环利定(PCP)、镁和/或MK-801(地佐环平(dizocilpine))结合位点处的非竞争性拮抗作用阻断所述NMDA受体的所述药剂是美金刚(memantine)、氯胺酮(ketamine)、苯环利定、3-MEO-PCP、8A-PDHQ、金刚烷胺(amantadine)、托莫西汀(atomoxetine)、AZD6765、胍丁胺(agmatine)、德芦西明(delucemine)、德芦西明、右甲吗南(dextrallorphan)、右美沙芬(dextromethorphan)、右啡烷(dextrorphan)、地非尼丁(diphenidne)、乙醇、乙炔丙啶(eticylidine)、加环利定(gacyclidine)、甲基苯丙胺(methoxetamine)(MXE)、米诺环素(minocycline)、硝胺美金刚胺(nitromemantine)、一氧化二氮、PD-137889、咯环利定(rolicyclidine)、替诺环定(tenocyclidine)、甲氧嘧啶(methoxydine)、替来他明(tiletamine)、奈拉美仙(neramexane)、依利罗地(eliprodil)、乙苯噁啶(etoxadrol)、右奥沙屈(dexoxadrol)、WMS-2539、NEFA、雷马西米(remacemide)、硫酸镁、阿替加奈、HU-211、石杉碱A(huperzineA)、二肽D-Phe-L-Tyr、伊博格碱(Ibogaine)、夹竹桃科(Apocynaceae)、雷马西米、钩藤碱(Rhynchophylline)、加巴喷丁(gabapentin)或地佐环平(MK-801)。

55.根据权利要求52所述的方法，其中通过甘氨酸结合位点处的非竞争性拮抗作用阻断所述NMDA受体的所述药剂是(GLYX-13)、NRX-1074、7-氯犬尿酸、4-氯犬尿氨酸(AV-101)、5,7-二氯犬尿酸、犬尿酸、TK-40(GluN1甘氨酸结合位点处的竞争性拮抗剂)、1-氨基环丙烷羧酸(ACPC)、L-苯丙氨酸或氙。

56.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述神经发生包括从神经祖细胞(NPC)到未成熟神经元的神经发生，随后是从未成熟神经元到皮质神经元的神经发生。

57.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述突触发生发生在皮质神经元中。

58.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述皮质神经元是胆碱能神经元。

59.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述皮质神经元是基底前脑胆碱能神经元(BFCN)神经元、前额皮质神经元、海马神经元或其组合。

60.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述AD是家族性阿尔茨海默氏病(FAD)或散发性阿尔茨海默氏病(SAD)。

61.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述内质网(ER)兰尼碱受体(RyR)的过度活化使线粒体钙升高并且降低ATP。

62.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中丹曲林的鼻内施用使升高的线粒体钙降低并且增加胞质ATP。

63.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述包括丹曲林的药物组合物每周施用三次。

64.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述包括丹曲林的药物组合物施用持续四个月到一年。

65.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述包括丹曲林的药物组合物施用持续至多两年。

66.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述包括丹曲林的药物组合物施用持续超过两年。

67.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述施用不会导致所述受试者的嗅觉功能、运动功能或肝功能损伤。

68.根据权利要求49到67中任一项所述的方法，其中所述RyR选自由以下组成的组：1型RyR(RyR-1)、2型RyR(RyR-2)、3型RyR(RyR-3)和其组合。

69.根据权利要求15所述的方法，其进一步包括：向所述受试者施用治疗有效量的谷氨酸受体拮抗剂。

70.根据权利要求15所述的方法，其进一步包括：

a)在向所述受试者鼻内施用所述包括丹曲林的药物组合物之前从所述受试者中获得脑脊液(CSF)；以及

b)确定所述CSF中的谷氨酸水平，

其中步骤(b)中的所确定的谷氨酸水平高于从对照受试者中获得的CSF中的谷氨酸水平表明所述受试者适合用丹曲林治疗。

71.根据权利要求70所述的方法，其进一步包括：在施用所述治疗有效量的所述谷氨酸受体拮抗剂之前从所述受试者中获得CSF；以及确定所述CSF中的谷氨酸水平，其中所确定的谷氨酸水平高于从对照受试者中获得的CSF中的谷氨酸水平表明所述受试者适合用谷氨酸受体拮抗剂治疗。

72.根据权利要求70所述的方法，其中所述谷氨酸受体拮抗剂是通过在谷氨酸结合位点处的竞争性拮抗作用阻断所述NMDA受体的药剂，或者是通过在甘氨酸、苯环利定和/或镁结合位点处的非竞争性拮抗作用阻断所述NMDA受体的药剂。

73.根据权利要求72所述的方法，其中通过在谷氨酸结合位点处的竞争性拮抗作用阻断所述NMDA受体的所述药剂是赛福太(CGS 19755)、阿替加奈(CNS 1102)、CGP 37849、APV或AP-5(R-2-氨基-5-膦酰基戊酸酯)、2-氨基-7-膦酰基-庚酸(AP-7)、3-[(R)-2-羧基哌嗪-4-基]-丙-2-烯基-1-膦酸(CPPene)和/或阿斯巴甜。

74.根据权利要求72所述的方法，其中通过在苯环利定(PCP)、镁和/或MK-801(地佐环平)结合位点处的非竞争性拮抗作用阻断所述NMDA受体的所述药剂是美金刚、氯胺酮、苯环利定、3-MEO-PCP、8A-PDHQ、金刚烷胺、托莫西汀、AZD6765、胍丁胺、德芦西明、德芦西明、右甲吗南、右美沙芬、右啡烷、地非尼丁、乙醇、乙炔丙啶、加环利定、甲基苯丙胺(MXE)、米诺环素、硝胺美金刚胺、一氧化二氮、PD-137889、咯环利定、替诺环定、甲氧嘧啶、替来他明、奈拉美仙、依利罗地、乙苯噁啶、右奥沙屈、WMS-2539、NEFA、雷马西米、硫酸镁、阿替加奈、HU-211、石杉碱A、二肽D-Phe-L-Tyr、伊博格碱、夹竹桃科、雷马西米、钩藤碱、加巴喷丁或地佐环平(MK-801)。

75.根据权利要求72所述的方法，其中通过甘氨酸结合位点处的非竞争性拮抗作用阻断所述NMDA受体的所述药剂是(GLYX-13)、NRX-1074、7-氯犬尿酸、4-氯犬尿氨酸(AV-101)、5,7-二氯犬尿酸、犬尿酸、TK-40(GluN1甘氨酸结合位点处的竞争性拮抗剂)、1-氨基环丙烷羧酸(ACPC)、L-苯丙氨酸或氙。

76.根据权利要求24所述的方法，其进一步包括向所述受试者施用治疗有效量的谷氨酸受体拮抗剂。

77.根据权利要求24所述的方法，其进一步包括：

a)在向所述受试者鼻内施用所述包括丹曲林的药物组合物之前从所述受试者中获得脑脊液(CSF)；以及

b)确定所述CSF中的谷氨酸水平，

其中步骤(b)中的所确定的谷氨酸水平高于从对照受试者中获得的CSF中的谷氨酸水平表明所述受试者适合用丹曲林治疗。

78.根据权利要求77所述的方法，其进一步包括：在施用所述治疗有效量的所述谷氨酸受体拮抗剂之前从所述受试者中获得CSF；以及确定所述CSF中的谷氨酸水平，其中所确定的谷氨酸水平高于从对照受试者中获得的CSF中的谷氨酸水平表明所述受试者适合用谷氨酸受体拮抗剂治疗。

79.根据权利要求77所述的方法，其中所述谷氨酸受体拮抗剂是通过在谷氨酸结合位点处的竞争性拮抗作用阻断所述NMDA受体的药剂，或者是通过在甘氨酸、苯环利定和/或镁结合位点处的非竞争性拮抗作用阻断所述NMDA受体的药剂。

80.根据权利要求79所述的方法，其中通过在谷氨酸结合位点处的竞争性拮抗作用阻断所述NMDA受体的所述药剂是赛福太(CGS 19755)、阿替加奈(CNS 1102)、CGP 37849、APV或AP-5(R-2-氨基-5-膦酰基戊酸酯)、2-氨基-7-膦酰基-庚酸(AP-7)、3-[(R)-2-羧基哌嗪-4-基]-丙-2-烯基-1-膦酸(CPPene)和/或阿斯巴甜。

81.根据权利要求79所述的方法，其中通过在苯环利定(PCP)、镁和/或MK-801(地佐环平)结合位点处的非竞争性拮抗作用阻断所述NMDA受体的所述药剂是美金刚、氯胺酮、苯环利定、3-MEO-PCP、8A-PDHQ、金刚烷胺、托莫西汀、AZD6765、胍丁胺、德芦西明、德芦西明、右甲吗南、右美沙芬、右啡烷、地非尼丁、乙醇、乙炔丙啶、加环利定、甲基苯丙胺(MXE)、米诺环素、硝胺美金刚胺、一氧化二氮、PD-137889、咯环利定、替诺环定、甲氧嘧啶、替来他明、奈拉美仙、依利罗地、乙苯噁啶、右奥沙屈、WMS-2539、NEFA、雷马西米、硫酸镁、阿替加奈、HU-211、石杉碱A、二肽D-Phe-L-Tyr、伊博格碱、夹竹桃科、雷马西米、钩藤碱、加巴喷丁或地佐环平(MK-801)。

82.根据权利要求79所述的方法，其中通过甘氨酸结合位点处的非竞争性拮抗作用阻断所述NMDA受体的所述药剂是(GLYX-13)、NRX-1074、7-氯犬尿酸、4-氯犬尿氨酸(AV-101)、5,7-二氯犬尿酸、犬尿酸、TK-40(GluN1甘氨酸结合位点处的竞争性拮抗剂)、1-氨基环丙烷羧酸(ACPC)、L-苯丙氨酸或氙。

83.根据权利要求36所述的方法，其进一步包括向所述受试者施用治疗有效量的谷氨酸受体拮抗剂。

84.根据权利要求36所述的方法，其进一步包括：

a)在向所述受试者鼻内施用所述包括丹曲林的药物组合物之前从所述受试者中获得脑脊液(CSF)；以及

b)确定所述CSF中的谷氨酸水平，

其中步骤(b)中的所确定的谷氨酸水平高于从对照受试者中获得的CSF中的谷氨酸水平表明所述受试者适合用丹曲林治疗。

85.根据权利要求84所述的方法，其进一步包括：在施用所述治疗有效量的所述谷氨酸受体拮抗剂之前从所述受试者中获得CSF；以及确定所述CSF中的谷氨酸水平，其中所确定的谷氨酸水平高于从对照受试者中获得的CSF中的谷氨酸水平表明所述受试者适合用谷氨酸受体拮抗剂治疗。

86.根据权利要求85所述的方法，其中所述谷氨酸受体拮抗剂是通过在谷氨酸结合位点处的竞争性拮抗作用阻断所述NMDA受体的药剂，或者是通过在甘氨酸、苯环利定和/或镁结合位点处的非竞争性拮抗作用阻断所述NMDA受体的药剂。

87.根据权利要求86所述的方法，其中通过在谷氨酸结合位点处的竞争性拮抗作用阻断所述NMDA受体的所述药剂是赛福太(CGS 19755)、阿替加奈(CNS 1102)、CGP 37849、APV或AP-5(R-2-氨基-5-膦酰基戊酸酯)、2-氨基-7-膦酰基-庚酸(AP-7)、3-[(R)-2-羧基哌嗪-4-基]-丙-2-烯基-1-膦酸(CPPene)和/或阿斯巴甜。

88.根据权利要求86所述的方法，其中通过在苯环利定(PCP)、镁和/或MK-801(地佐环平)结合位点处的非竞争性拮抗作用阻断所述NMDA受体的所述药剂是美金刚、氯胺酮、苯环利定、3-MEO-PCP、8A-PDHQ、金刚烷胺、托莫西汀、AZD6765、胍丁胺、德芦西明、德芦西明、右甲吗南、右美沙芬、右啡烷、地非尼丁、乙醇、乙炔丙啶、加环利定、甲基苯丙胺(MXE)、米诺环素、硝胺美金刚胺、一氧化二氮、PD-137889、咯环利定、替诺环定、甲氧嘧啶、替来他明、奈拉美仙、依利罗地、乙苯噁啶、右奥沙屈、WMS-2539、NEFA、雷马西米、硫酸镁、阿替加奈、HU-211、石杉碱A、二肽D-Phe-L-Tyr、伊博格碱、夹竹桃科、雷马西米、钩藤碱、加巴喷丁或地佐环平(MK-801)。

89.根据权利要求86所述的方法，其中通过甘氨酸结合位点处的非竞争性拮抗作用阻断所述NMDA受体的所述药剂是(GLYX-13)、NRX-1074、7-氯犬尿酸、4-氯犬尿氨酸(AV-101)、5,7-二氯犬尿酸、犬尿酸、TK-40(GluN1甘氨酸结合位点处的竞争性拮抗剂)、1-氨基环丙烷羧酸(ACPC)、L-苯丙氨酸或氙。

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