KR20220022829A

KR20220022829A - 글리시리진 및 수용성 약물을 포함하는 나노 입자, 이를 포함하는 약제학적 조성물 및 이들의 제조 방법

Info

Publication number: KR20220022829A
Application number: KR1020200176816A
Authority: KR
Inventors: 도은경; 김정환; 이근우; 고광희; 심규식
Original assignee: 주식회사 모든바이오; 도은경
Priority date: 2020-08-19
Filing date: 2020-12-16
Publication date: 2022-02-28
Also published as: WO2022038409A1

Abstract

본 발명은 쉘을 포함하는 미셀(micelle) 구조의 나노 입자 및 수용성 약물을 포함하는 약제학적 조성물 및 이의 제조 방법을 제공한다. 상기 쉘은 글리시리진을 포함하며, 상기 수용성 약물은 상기 쉘에 의해 정의되는 상기 나노 입자의 내부에 담지 된다. 일 실시예의 약학적 조성물은 안정성이 향상된 수용성 약물을 제공하므로, 지속적으로 약효가 발현될 수 있다.

Description

글리시리진 및 수용성 약물을 포함하는 나노 입자, 이를 포함하는 약제학적 조성물 및 이들의 제조 방법{A NANOPARTICLE CONTAINING GLYCYRRHIZIN AND WATER-SOLUBLE DRUG, PHARMACEUTICAL COMPOSITION CONTAINING THE THEREOF, AND METHOD FOR PREPARING THE THEREOF}

본 발명은 글리시리진 및 수용성 약물을 포함하는 나노 입자, 이를 포함하는 약제학적 조성물 및 이들이 제조 방법에 대한 것이다.

글리시리진은 두 개의 D-글루크로닉산(D-glucuronic acid) 분자가 β-1,4 결합한 당질부와 글리시리티닉산(glycyrrhitenic acid)이 글리코사이드(glycoside) 결합을 이루고 있는 트리테르페노이드(triterpenoid)계 사포닌(saponin)이다. 글리시리진은 감초의 뿌리에서 얻을 수 있는 물질로 알려져 있으며, 화학식은 C₄₂H₆₂O₁₆이고 분자량은 822.94g/mol이며, 하기 화학식 1로 표시된다.

[화학식 1]

글리시리진은 종양의 발생을 억제하고, 콜레스테롤을 감소시켜 동맥경화를 개선하며, 간 보호 효과 등이 있는 것으로 알려져 있다.

본 발명은 내부에 수용성 약물을 담지함으로써 수용성 약물의 안정성을 향상시키며 담지된 수용성 약물의 반감기를 증가시킬 수 있는, 글리시리진을 포함하는 나노 입자 및 이를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하는 것을 일 목적으로 한다. 또한, 본 발명은 경구 투여시 내산성이 확보되어 서방출을 달성할 수 있는, 글리시리진을 포함하는 나노 입자 및 이를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하는 것을 일 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 독성이 강한 용매나 시약 및 고가의 합성 장비 사용 없이 환경 친화적인 방법으로 글리시리진을 포함하고 수용성 약물을 담지하는 나노 입자 및 이를 포함하는 약제학적 조성물을 제조하는 것을 일 목적으로 한다.

본 발명은 수용성 약물을 담지하는 글리시리진 나노 입자 및 이를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 상기 나노 입자는 쉘을 포함하는 미셀(micelle) 구조의 나노 입자 및 수용성 약물을 포함할 수 있다. 상기 쉘은 글리시리진을 포함할 수 있다. 상기 수용성 약물은 상기 쉘에 의해 정의되는 상기 나노 입자의 내부에 담지 될 수 있다.

상기 수용성 약물은 상기 글리시리진과 정전기적으로 결합된 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 글리시리진의 양이온성 작용기와 상기 수용성 약물의 음이온성 작용기가 정전기적으로 결합하여 정전기적 복합체를 형성할 수 있다.

본 명세서에서 수용성 약물은 물과 강한 상호작용을 하고 물에 대한 친화력이 강하여 수성 매질에 잘 용해되는 성질을 갖는약물을 의미한다. 즉, 본 명세서에서 수용성 약물은 물에 대한 친화도(affinity)를 가진 약물; 지질(lipid) 또는 리포이드(lipoid) 보다 물에 대하여 강한 친화력을 가지는 약물; 극성(polar) 유체에 대하여 친화력을 가지는 약물; 및 물에 대하여 결합 가능한 작용기(functional group)을 가지는 약물을 모두 포함하는 의미로 사용된다.

본 명세서에서, 수용성 약물의 종류는 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 상기 약물은 화학 합성 약물, 천연물 약물, 항체 의약품과 같은 단백질 약물 및 핵산 분자 등을 포함한다.

본 발명에 이용될 수 있는 약물은 예를 들어, 항염증제, 진통제, 항관절염제, 진경제, 항우울증제, 항정신병약물, 신경안정제, 항불안제, 마약길항제, 항파킨스질환 약물, 콜린성 아고니스트, 항암제, 항혈관신생억제제, 면역억제제, 항바이러스제, 항생제, 식욕억제제, 진통제, 항콜린제, 항히스타민제, 항편두통제, 호르몬제, 관상혈관, 뇌혈관 또는 말초혈관 확장제, 피임약, 항혈전제, 이뇨제, 항고혈압제, 심혈관질환 치료제 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

예를 들어, 상기 수용성 약물은 나파모스타트, 알부테롤, 벤드아무스틴, 캅토프릴, 카르보플라틴, 시프로플록사신, 젬시타빈, 이반드로네이트, 라미부딘, 메트포르민, 니아신, 옥시코돈, 라니티딘, 수마트립탄, 부설판, 클로람부실, 시클로포스파미드, 멜파란, 시스플라틴, 이포스파미드, 시타라빈, 5-플루오로우라실, 메토트렉세이트, 악티노마이신-D, 블레오마이신, 테오필린, 메토프로롤, 트라마돌 및 알로푸리놀로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상 또는 이들의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 수용성 약물은 나파모스타트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염일 수 있다.

일 실시예에서, 상기 약제학적으로 허용 가능한 염의 비제한적인 예로는, 염산, 브롬산, 인산 또는 황산과 같은 무기산과의 염; 아세트산, 트리플루오로아세트산, 구연산, 말레인산, 수산, 호박산, 벤조산, 주석산, 푸마르산, 만델산, 아스코르브산 또는 말산과 같은 유기 카르복실산이나, 메탄설폰산 또는 파라-톨루엔설폰산과 같은 설폰산과의 염; 혹은 기타 약제학적으로 허용 가능한 염을 형성할 수 있는 것으로 알려진 다양한 산과의 염 등을 포함할 수 있다.

예를 들어, 상기 약제학적으로 허용 가능한 염은 메실산염일 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 코로나바이러스감염증-19, 췌장염, 췌장암 및 혈액응고증으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 예방 또는 치료용 조성물일 수 있다. 상기 혈액 응고증은 구체적으로 파종혈관내응고증(범발성혈관내응고증) 또는 관류혈액응고증일 수 있다. 관류혈액응고증은 환자의 혈액 체외 순환(예를 들어, 투석) 시 발생하는 혈액응고관련 질환을 의미한다. 예를 들어, 상기 약제학적 조성물은 코로나바이러스감염증-19의 예방 또는 치료용 조성물 일 수 있다.

후술할 바와 같이, 일 실시예에 따른 약제학적 조성물은 수용성 약물을 글리시리진 나노입자 내에 담지함으로써 내산성이 향상되고 안정성이 증가하여 수용성 약물의 서방출을 달성하고, 수용성 약물의 반감기를 증가시켜 우수한 효과를 달성할 수 있다. 또한, 일 실시예에 따른 약제학적 조성물은 항바이러스 효과, 항암 효과 및 항염 증 효과 등이 있는 글리시리진 및 수용성 약물(예를 들어, 나파모스타트)를 동시에 투여함으로써 질환(예를 들어, 코로나바이러스감염증-19, 췌장염, 췌장암 및 혈액응고증 등)에 대한 상승적인(synergetic) 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있다.

상기 약제학적 조성물의 투여 경로는 특별히 한정되는 것은 아니며, 경구 또는 비경구 투여되는 것일 수 있다. 상기 약제학적 조성물은 예를 들어 경구 투여되는 것일 수 있다. 상기 약제학적 조성물은 비경구 투여, 예를 들어 피내 주사, 피하 주사, 근육 주사 또는 정맥 주사 등 주사 투여되는 것일 수 있다. 상기 약제학적 조성물은 서방출 제제일 수 있다. 상기 약제학적 조성물의 약물 방출률은 투여 후 10시간 동안 약 80% 이하, 약 70% 이하, 약 65% 이하 또는 약 60% 이하일 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 상기 수용성 약물을 담지하는 글리시리진 나노 입자 외에 약제학적으로 허용 가능한 담체 등 당 기술분야에서 통상적으로 사용되는 첨가제들을 더 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 하기의 단계 (a) 내지 단계 (d)를 포함하는, 전술한 수용성 약물을 담지하는 글리시리진 나노 입자 및 이를 포함하는 약제학적 조성물의 제조 방법을 제공한다.

일 실시예의 제조 방법은, 하기의 단계를 포함하는 글리시리진이 포함된 쉘을 포함하는 미셀 (micelles) 구조의 나노 입자; 및 상기 미셀에 담지된 수용성 약물을 포함하는 약제학적 조성물의 제조 방법을 제공한다.

상기 단계는 (a) 상기 글리시리진과 제1 수용성 용매의 혼합물을 지용성 용매와 혼합하는 단계; (b) 상기 단계 (a)에서 생성된 혼합물에서 수용성 층을 분리하는 단계; (c) 상기 수용성 약물과 제2 수용성 용매의 혼합물을, 단계 (b)에서 분리한 수용성층과 혼합하여 상기 미셀 구조를 형성하는 단계; 및 (d) 상기 단계 (c)에서 생성된 혼합물에서 상기 나노 입자를 정제하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 단계 (a)는, 상기 글리시리진과 상기 제1 수용성 용매의 혼합물을 상기 지용성 용매에 첨가하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 글리시리진과 상기 제1 수용성 용매의 상기 지용성 용매에 첨가할 경우 층전환이 일어나면서 더 효율적인 나노 입자 형성이 가능할 수 있다.

상기 단계 (a)에서 제1 수용성 용매 1ml당 글리시리진을 약 1mg 이상 100mg 이하로 혼합할 수 있다. 예를 들어, 제1 수용성 용매 1ml당 글리시리진을 약 20mg 혼합 할 수 있다.

상기 단계 (b)에서 제2 수용성 용매 10 ml당 수용성 약물을 약 1mg 이상 25mg 이하로 혼합할 수 있다. 예를 들어, 제2 수용성 용매 10ml당 수용성 약물을 약 4mg 혼합할 수 있다.

상기 단계 (c)는, 상기 단계 (c)에서 형성된 혼합물에 소정의(predetermined) 물리적 충격을 가하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 소정의 물리적 충격을 가하는 단계는 특별히 제한되는 것은 아니나, 교반하는 단계 또는 초음파 처리하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 소정의 물리적 충격을 가하는 단계는 1회 이상 초음파 처리하는 단계일 수 있다. 즉, 일 실시예의 제조 방법은 상기 분리된 수용성 층에 초음파와 같은 물리적인 충격을 가함으로써 글리시리진의 카르복실기(-COOH)와 나파모스타트의 아민기(-NH2)가 정전기적 복합체(글리시리진:나파모스타트=2:1 비율)를 잘 형성할 수 있도록 할 수 있다. 또한, 수용성 층 내에 나노 입자를 균일하게 형성시키면서도, 잘 분산되도록 할 수 있다.

상기 단계 (d)는 상기 혼합물을 pH5.5 내지 pH6.5에서 투석(dialysis)하여 유리 글리시리진 및 유리 수용성 약물을 제거하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 pH는 예를 들어 약 6.0일 수 있다. 상기 투석 단계에서 투석액으로는 탈이온수를 사용할 수 있다.

상기 제조 방법은 상기 (d) 단계 이후에, 상기 정제된 나노 입자를 건조하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 건조 공정은 동결 건조 공정일 수 있다.

상기 수용성 약물은 나파모스타트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 일수 있다. 상기 약제학적으로 허용 가능한 염은 메실산 염일 수 있다.

상기 제1 수용성 용매 및 상기 제2 수용성 용매는 서로 동일하거나 상이할 수 있다. 상기 제1 수용성 용매 및 상기 제2 수용성 용매는 특별히 한정되는 것은 아니나, 각각 독립적으로 물, 탄소수 1 이상 4 이하의 알코올, 글리세롤, 부틸렌글라이콜, 다이프로필렌글라이콜, 플로필렌글라이콜, 메칠프로판다이올 에틸렌 글라이콜의 모노메틸 에테르, 에틸렌 글라이콜의 모노에틸 에테르, THF, 다이옥산, 아세톤, 아세토나이트릴, 에틸렌 글라이콜의 다이메틸 에테르 및 PBS(Phosphate-buffered saline)와 같은 염의 수용액 중 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있다. 상기 탄소수 1 이상 4 이하의 알코올은 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 이소프로판올, n-부탄올, iso-부탄올, sec-부탄올 또는 tert-부탄올 일 수 있다. 예를 들어, 상기 단계 (a)에서 수용성 용매는 물일 수 있고, 상기 단계 (b)에서 수용성 용매는 에탄올일 수 있다.

상기 지용성 용매는 특별히 한정되는 것은 아니나, 식물성 오일일 수 있다. 예를 들어, 지용성 용매는 아보카도오일, 알몬드 오일, 스위트알몬드오일, 비터알몬드오일, 올리브오일, 세사미(참깨)오일, 라이스브랜오일, 홍화오일, 대두유, 콘오일, 카눌라오일, 애프리코트커넬오일, 피치커넬오일, 팜커넬오일, 팜오일, 피마자오일, 해바라기씨오일, 포도씨오일, 목화씨오일, 코코넛오일, 동백오일, 복숭아씨오일, 살구씨오일 대두유, 올리브유, 포도씨유, 캐놀라유 및　콘오일 중 선택되는 1종 이상의 식용 오일일 수 있다. 예를 들어, 상기 지용성 용매는 콘오일일 수 있다. 일 실시예의 제조 방법에 따르면, 인체에 독성이 없는 식용 용매를 지용성 용매로 사용함으로써, 높은 안전성을 갖고 생체 독성이 없으면서도 안정성이 향상된 수용성 약물이 담지된 글리시리진 나노 입자 및 이를 포함하는 약제학적 조성물을 제조할 수 있다.

본원 명세서에 기재된 수용성 약물을 담지하는 글리시리진 나노 입자 및 이를 포함하는 약제학적 조성물;과 이들의 제조 방법에 대한 설명은, 서로 모순되지 않는 한 어느 하나에 기재된 설명이 다른 하나에도 동일하게 적용될 수 있다.

일 실시예에 따른 나노 입자 및 이를 포함하는 약제학적 조성물은 글리시리진을 포함하는 나노 입자 내부에 수용성 약물을 담지함으로써 수용성 약물의 안정성을 향상시킬 수 있다. 따라서, 담지된 수용성 약물의 반감기가 증가할 수 있으며 적은 양을 투여하더라도 지속적으로 우수한 효과를 나타낼 수 있다. 또한, 일 실시예의 약제학적 조성물은 경구 투여시 내산성이 확보되어 서방출이 달성될 수 있다

일 실시예에 따른 나노 입자 및 이를 포함하는 약제학적 조성물의 제조 방법은 독성이 강한 용매나 시약 및 고가의 합성 장비 사용 없이도 환경 친화적인 방법으로 나노 입자 및 이를 포함하는 약제학적 조성물을 제조할 수 있다.

도 1a는 일 실시예에 따른 나노 입자를 광학 현미경으로 관찰한 이미지를 도시한 것이다.
도 1b는 일 실시예에 따른 나노 입자를 투과 전자 현미경으로 관찰한 이미지를 도시한 것이다.
도 2는 UV-VIS 분광 광도계를 이용하여 측정한 실시예 1 및 비교예1에 따른 나노 입자의 흡광 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 3a, 도 3b, 도 4a 및 도 4b는 입자분석기를 이용하여 측정한 실시예 1 및 비교예 1에 따른 나노 입자의 입도 분포를 도시한 그래프이다.
도 5a 및 도 5b는 입자분석기를 이용하여 측정한 실시예 1 및 비교예 1에 따른 나노 입자의 제타 전위 분포를 도시한 그래프이다.
도 6은 일 실시예의 나노 입자를 투여한 경우 A549 세포주의 세포 생존률을 도시한 그래프이다.
도 7 및 도 8은 일 실시예의 나노 입자의 농도에 따른 세린단백질분해효소 억제 효과를 도시한 그래프이다.
도 9는 실시예에 따른 나노 입자의 서방출 효과를 확인한 그래프이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

1. 수용성 약물이 담지된 나노 입자의 제조예

순도 98% 이상의 글리시리진 20 mg을 에탄올 1 ml에 혼합 및 용해시켰다. 이후 콘 오일(corn oil) 1 ml와 혼합 한뒤 5분 간 교반 (150 rpm) 하였다. 글리시리진 나노 입자가 포함된 층전환된 상층액(수층)을 피펫을 이용하여 조심스럽게 분리하였다. 이후 나파모스타트의 메실산 염(엔지켐생명과학) 4 mg을 물 10 ml (pH 6) 에 녹인 후, 글리시리진이 용해된 용액에 나파모스타트 혼합액을 첨가하고 글리시리진의 카르복실기(-COOH)와 나파모스타트의 아민기(-NH2)가 정전기적 복합체(글리시리진:나파모스타트=2:1 비율)를 이룰 수 있도록 초음파를 1분간 가하였다.

이후, 입자가 균일하게 형성되고 수층에 잘 분산될 수 있도록 초음파를 약 5초 동안 세 번 가하였다.

이후, 용액을 Dialysis bag (MWCO(Molecular weight cut-off) 1,000)에 넣고 pH 6.0의 탈이온수(deionized water)를 투석액으로 사용하여 투석하였다. 이 때, 글리시리진의 카르복실기와 나파모스타트의 아민기의 정전기적 복합체가 해리되어 콜로이드(colloid) 내 입자의 불안정화 및 분해(disassembly)에 의한 침전을 발생 시키는 것을 방지하기 위해, 탈이온수의 pH는 약 6.0으로 유지하였다. 이후, 약 24시간 동안 150rpm으로 상온(25℃)에서 교반하여 반응하지 않은 유리(free) 글리시리진 및 나파모스타트를 제거하여 나노 입자를 정제하였다.

투석이 끝난 뒤 동결 건조 안정제인 만니톨 5 mg 내지 10 mg과 수크로스(sucrose) 6mg 내지 140 mg을 넣고 -4℃에서 동결 한 뒤 동결 건조기(FD8508, 일신바이오베이스, 대한민국)를 이용하여 건조 하였고 나파모스타트가 함유 된 글리시리진 나노 입자를 제조 하였다.

일 실시예의 제조 방법에 따라 나노 입자를 제조하는 경우 뒤에서 자세히 설명할 것과 같이 나파모스타트를 담지하는 글리시리진 나노 입자를 효과적으로 얻을 수 있음을 확인하였다.

또한, 일 실시예의 제조 방법에 따라 나노 입자를 제조하는 경우, 독성이 강한 용매나 시약 또는 고가의 합성 장비 없이 환경 친화적인 방법으로 나노 입자 및 이를 포함하는 약제학적 조성물을 제조할 수 있음을 확인하였다.

2. 제조된 나노 입자의 입자화 및 수용성 약물의 담지 결과 확인

Dialysis를 완료한 후, 광학현미경, UV-VIS 분광 광도계(UV-VIS spectroscopy), 투과전자현미경(TEM, Transmission Electron Microscope) 및 입자분석기(Particle size analyzer)로 입자의 흡광도, 형상, 크기 및 콜로이드 안정성 (제타전위, Zeta Potential)을 확인하였다.

(1a) 광학현미경을 이용한 입자화 및 수용성 약물의 담지 결과 확인

광학현미경(OLYMPUS CKX53, OLYMPUS, Japan)을 이용하여 위의 제조예에 따라 제조된 콜로이드를 600배의 배율로 관찰하였다. 관찰 결과, 글리시리진이 미셀 구조의 나노 입자로 입자화 되었으며 나파모스타트가 담지 된 것을 확인하였다. 구체적으로, 도 1a을 참조하면 일 실시예에 따른 제조방법에 의해 제조된 나파모스타트가 담지된 나노 입자들이 확인된다.

(1b) 투과전자현미경을 이용한 입자화 및 수용성 약물의 담지 결과 확인

투과전자현미경(Talos L120C, FEI, Czech)을 이용하여 위의 제조예에 따라 제조된 콜로이드를 15000배의 배율로 관찰하였다. 관찰 결과, 글리시리진이 미셀 구조의 나노 입자로 입자화 되었으며 나파모스타트가 담지 된 것을 확인하였다. 구체적으로, 도 1b을 참조하면 일 실시예에 따른 제조방법에 의해 제조된 나파모스타트가 담지된 나노 입자들이 확인된다.

(2) UV-VIS 분광 광도계를 이용한 흡광 스펙트럼의 분석

UV-VIS 분광 광도계(NB1-A-190104, Microdigital co., Korea)를 이용하여 위의 제조예에 따라 제조된 나노 입자의 흡광 스펙트럼을 DW로 back ground 를 잡고 제조예에 따라 제조된 나노 입자는 1 mg/ml의 농도로 DW에 60배 희석하여 분산 한 뒤 전용 큐벳에 1 ml 넣고 파장대는 100 nm 에서 999nm로 설정하여 측정하였다.

도 2를 참조하면, 일 실시예에 따른 나파모스타트를 담지하는 글리시리진 나노 입자 그룹(MBD-601a-NM)에서 나파모스타트 peak(세번째 peak)와 글리시리진 나노입자 피크(첫번째 피크)가 확연히 확인된다.

이는 나파모스타트를 담지하지 않는 글리시리진 나노 입자 그룹(MDB-601a-색소)에서 글리시리진 나노입자 피크(첫번째 피크) 및 색소에 대한 피크(두번째 피크)가 확인되고, 유리 나파모스타트 및 유리 글리시리진 그룹(MDB-601-NM)에서 유리글리시리진에 대한 피크만 확인되는 것과 명확히 구분된다. 따라서, 일 실시예의 제조 방법에 따를 때 글리시리진이 미셀 구조로 나노 입자화 되며, 나파모스타트가 상기 나노 입자에 의해 정의되는 나노 입자의 내부에 담지 됨이 확인된다.

(3) 입도 분포 및 제타 전위의 측정

입자분석기(SZ-100V2, HORIBA instruments inc, Japan)를 이용하여 위의 제조예에 따라 제조된 콜로이드(실시예 1), 및 유리 글리시리진, 에탄올 및 수용성 색소를 포함하는 용액(비교예 2)의 입도 분포 및 입자의 제타 전위를 측정하여 도 3a 내지 도 5b 및 하기 표 1 및 표 2에 나타내었다.

도 3a 내지 4b 및 표 1을 참조하면, 실시예1(도 3a, 3b)에서 미셀 구조의 나노입자가 잘 형성되어, DLS 측정 결과 284.45±11.81 nm의 크기를 보이는 것이 확인된다. 이는, 비교예 1(도 4a, 4b)에서는 미셀 구조가 형성되지 않아 나노입자 크기가 측정 되지 않는 것과 구분된다.

도 5a 및 도 5b 및 표 2를 참조하면, 실시예1(도 5a)에서 미셀 구조의 나노 입자가 잘 형성되며 제타 준위 측정 결과 -87.7 mV의 안정적인 값을 보인 반면, 비교예 1(도 5b)에서는 미셀 구조가 형성되지 않아 실시예1에 비해 불안정한 값인 -53.2 mV의 제타 준위 값을 보이는 것을 볼 수 있다.

3. 제조된 나노 입자의 효과 확인

(1) 제조된 나노 입자의 세포 독성 확인

사람 폐 세포주(A549)는 우태아혈청(Fetal bovine serum)을 10% 첨가한 배지(　Roswell Park Memorial Institute 1640 medium)로 2일마다 배지 교환하며, 37℃, 5% CO2에서 배양하였다. 사람 폐 세포주(A549) 를 96-well 플레이트에 1×104 cell/well 농도로 접종한 뒤, 실시예1을 각각 농도 별 (250, 150, 50, 10, 1μM)로 투여하였다. 24시간 배양 후 물질투여 없이 배양한 세포를 음성대조군으로 하여 세포 생존도 분석을 EZ-Cytox(Dogen, Korea) kit를 사용해 진행하였다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 10uM 이하의 농도에서 세포 독성이 전혀 없는 것 으로 확인되었으며 50uM~250uM 농도에서도 거의 독성이 없는 것 으로 확인된다.

도 6에 도시된 것과 같이, ARPE-19 세포주에 1mg/ml의 농도의 나파모스타트가 담지된 글리시리진 나노 입자를 1/10, 1/100 및 1/1000으로 희석하여 투여한 경우의 세포 생존률은 이를 투여하지 않은 세포의 생존률과 실질적으로 동등한 수치를 보였다. 즉, 일 실시예에 따른 나노 입자의 세포 독성이 매우 낮은 것으로 확인된다.

(2) 제조된 나노 입자의 세린 단백질 가수분해효소(Ser-protease) 선택적 억제 효과의 확인

1) 세린 단백질 가수분해효소 선택적 억제 효과 확인

Covid19 바이러스의 세포 내 진입을 돕는 TMPRSS-2(세린프로테아제)를 억제하여 covid-19 바이러스 감염을 차단하는 본원 발명의 효과를 확인하기 위해 serum에 0.001 ug/ml, 0.01 ug/ml, 0.1 ug/ml 및 1ug/ml 농도의 실시예 1의 조성물을 serum과 1:1의 비율로 섞었다. 또한, 비교예로 serum과 나파모스타트 1ug/ml을 1:1 비율로 섞었다. 이후, 37℃에서 1시간 incubation 시켜준 뒤 96well plate에 Well당 100μl씩 Succinylated Casein Solution 넣어주었다. Well당 100μl씩 Assay buffer 넣어 준 뒤 Well당 50μl씩 Standard sample과 Test sample을 넣어주었다. 37℃에서 20분간 incubation 시켜 준 뒤 Well당 50μl씩 TNBSA 넣어주었다. 37℃에서 20분 incubation 시켜 준 뒤 450nm 흡광도로 96well plate를 Plate Reader(EPOCH 2, BioTek instruments inc, USA)로 측정하였다.

도 7을 참조하면, 유리 나파모스타트를 투여하는 경우 1 ug/ml의 농도에서 세린 단백질 가수분해효소 억제 효과를 나타내지 않는 것으로 확인된다. 이는, 유리 나파모스타트가 혈청 내에서 약 8분 이내의 반감기를 가질 정도로 매우 불안정하기 때문인 것으로 확인된다. 그러나, 일 실시예에 따른 글리시리진 나노 입자를 투여하는 경우, 나노 입자를 0.1ug/ml의 농도로 투여하는 경우에도 단백질 가수분해효소 억제 효과가 매우 우수한 것으로 확인된다. 이는 일 실시예의 글리시리진 나노 입자는 미셀 구조 내에 나파모스타트를 담지하기 때문에 혈청 내에서도 나파모스타트가 안정하게 유지되며 반감기가 1시간 이상으로 연장되기 때문인 것으로 보인다.

2) 세린 단백질 가수분해효소 선택적 억제 효과 확인

Covid19 바이러스의 세포 내 진입을 돕는 TMPRSS-2(세린프로테아제)를 억제하여 covid-19 바이러스 감염을 차단하는 본원 발명의 효과를 확인하기 위해 세린프로테아제인 trypsin에 20uM 농도의 실시예 1의 조성물을 1:1의 비율로 섞었다. 또한, trypsin에 나파모스타트 1mM을 1:1 비율로 섞었다. 이후, 37℃에서 1시간 incubation 시켜준 뒤 96well plate에 Well당 100μl씩 Succinylated Casein Solution 넣어주었다. Well당 100μl씩 Assay buffer 넣어 준 뒤 Well당 50μl씩 Standard sample과 Test sample을 넣어주었다. 37℃에서 20분 incubation 시켜 준 뒤 Well당 50μl씩 TNBSA 넣어주었다. 37℃에서 20분 incubation 시켜 준 뒤 450nm 흡광도로 96well plate를 Plate Reader(EPOCH 2, BioTek instruments inc, USA)로 측정하였다.

도 8을 참조하면, 일 실시예에 따른 글리시리진 나노 입자는 유리 나파모스타트의 약 2% 농도만 투여하더라도 유리 나파모스타트와 동등한 수준의 세린 단백질 가수분해효소 억제 효과를 보이는 것으로 확인된다. 이는 앞서 설명한 것과 같이 일 실시예의 나노 입자 내의 나파모스타트의 혈청내 안정성이 향상되어 반감기가 1시간 이상으로 연장되기 때문인 것으로 보인다.

이로부터, 나파모스타트를 담지하는 일 실시예의 글리시리진 나노 입자는 세린 단백질 가수분해효소를 선택적으로 억제하여 코로나바이러스-19와 같은 바이러스 감염을 효과적으로 차단할 수 있음이 확인된다.

3) 약물 방출 거동 시험을 통한 서방출 효과 확인

실시예 1에서 제조 된 나노입자로부터 나파모스타트의 약물 방출 거동을 분석하였다. 구체적으로, 실시예의 나노입자 10 mg을 1 ml의 PBS 버퍼(pH 2, 7.4, 그리고 8.4)에 넣고 37℃에서 80 rpm으로 교반하면서 정해진 시간 간격(1, 3, 6 시간 및 1, 3, 5, 7, 10일 간격)으로 새로운 버퍼를 교환해주며 약물(나파모스타트) 방출 거동을 측정하였다. 방출된 나파모스타트의 양은 Plate Reader(EPOCH 2, BioTek instruments inc, USA)를 이용하였고, 나파모스타트는 260 nm 에서 흡광도를 측정하여 분석하였으며, 그 결과를 도 9에 나타내었다.

도 9에서 확인되는 것과 같이, 실시예 1에 따른 나노입자는 초반 1일 동안에는 탑재하고 있던 약물이 다소 빠르게 방출되기는 하였으나, 그 이후로 10일 동안 탑재된 약물이 지속적으로 방출되는 특성을 보였다. 보다 구체적으로, 일 실시예에 따른 나파모스타트의 방출률은 투여 후 10일 동안 약 80% 이하, 약 70% 이하, 약 65% 이하 또는 약 60% 이하인 것으로 확인된다.

이를 통해 일 실시예의 조성물은 pH에 영향을 받지 않고 서방출(sustained-release) 되는 것이 확인되는 바, 일 실시예의 조성물의 경구 투여 시 내산성 효과 및 서방출 효과 또한 확인 된다.

일 실시예에 따른 수용성 약물을 담지하는 글리시리진 나노 입자 및 이를 포함하는 약제학적 조성물은 수용성 약물의 안정성을 향상시킬 수 있다. 따라서, 담지된 수용성 약물이 반감기가 증가하여 적은 양을 투여 하더라도 지속적으로 우수한 효과가 발휘될 수 있다. 또한, 수용성 약물이 나노 입자에 담지 되어 내산성을 보이므로 투여 후에도 나노 입자에 담지된 수용성 약물이 서서히 방출되어

또한, 일 실시예에 따른 나노 입자 및 이를 포함하는 약제학적 조성물은 수용성 약물과 나노 입자에 포함된 글리시리진을 모두 대상체에 투여할 수 있으므로 수용성 약물과 글리시리진의 병용에 따른 우수한 항바이러스 효과를 달성할 수 있다. 예를 들어, 일 실시예에 따른 나노 입자 또는 이를 포함하는 약제학적 조성물은 나파모스타트 및 글리시리진을 모두 대상체에 투여함으로써 우수한 항바이러스 효과(예를 들어, 코로나바이러스-19에 대한 항 바이러스 효과)를 달성할 수 있다.

또한, 일 실시예에 따른 수용성 약물을 담지하는 글리시리진 나노 입자 및 이를 포함하는 약제학적 조성물의 제조 방법은, 제조 공정이 간단하며, 친환경적인 제조 공정을 제공할 수 있다.

이상, 본 발명을 상세히 기술 하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

쉘을 포함하는 미셀(micelle) 구조의 나노 입자 및 수용성 약물을 포함하고, 상기 쉘은 글리시리진을 포함하며, 상기 수용성 약물은 상기 쉘에 의해 정의되는 상기 나노 입자의 내부에 담지 되는 것인 약제학적 조성물.
제1 항에 있어서, 상기 수용성 약물은 상기 글리시리진과 정전기적으로 결합된 것인 약제학적 조성물.
제1 항에 있어서,
상기 수용성 약물은 나파모스타트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염인 것인 약제학적 조성물.
제3 항에 있어서,
상기 약제학적으로 허용 가능한 염은 메실산염인 것인 약제학적 조성물.
제3 항에 있어서,
상기 약제학적 조성물은 코로나바이러스감염증-19, 췌장염, 췌장암 및 혈액응고증으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 예방 또는 치료용 조성물인 것인 약제학적 조성물.
제3 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 코로나바이러스감염증-19의 예방 또는 치료용 조성물인 것인 약제학적 조성물.
제1 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 경구 투여되는 것인 약제학적 조성물.
제1 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 서방출(sustained release) 제제인 것인 약제학적 조성물.
제8 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물의 약물 방출률은 투여 후 10 시간 동안 65% 이하인 것인 약제학적 조성물.
하기의 단계를 포함하는,
글리시리진이 포함된 쉘을 포함하는 미셀 (micelles) 구조의 나노 입자; 및 상기 미셀에 담지된 수용성 약물을 포함하는 약제학적 조성물의 제조 방법:
(a) 상기 글리시리진과 제1 수용성 용매의 혼합물을 지용성 용매와 혼합하는 단계;
(b) 상기 단계 (a)에서 생성된 혼합물에서 수용성 층을 분리하는 단계;
(c) 상기 수용성 약물과 제2 수용성 용매의 혼합물을, 상기 단계 (b)에서 분리한 수용성층과 혼합하여 상기 미셀 구조를 형성하는 단계; 및
(d) 상기 단계 (c)에서 생성된 혼합물에서 상기 나노 입자를 정제하는 단계.
제10 항에 있어서,
상기 단계 (a)는, 상기 글리시리진과 상기 제1 수용성 용매의 혼합물을 상기 지용성 용매에 첨가하는 단계를 포함하는 것인 제조 방법.
제10 항에 있어서,
상기 단계 (c)는 상기 단계 (c)에서 형성된 혼합물에 소정의 물리적 충격을 가하는 단계를 더 포함하는 것인 제조 방법.
제12 항에 있어서,
상기 소정의 물리적 충격을 가하는 단계는 초음파 처리하는 단계를 포함하는 것인 제조 방법.
제10 항에 있어서,
상기 단계 (d)는 상기 혼합물을 pH5.5 내지 pH6.5의 투석액으로 투석(dialysis)하여 유리 글리시리진 및 유리 수용성 약물을 제거하는 단계를 포함하는 것인 제조 방법.
제10 항에 있어서,
상기 수용성 약물은 나파모스타트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염인 것인 제조 방법.
제10 항에 있어서,
상기 약제학적으로 허용 가능한 염은 메실산 염인 것인 제조 방법.
제10 항에 있어서,
상기 제1 수용성 용매 및 상기 제2 수용성 용매는 각각 독립적으로 물 및 탄소수 1 이상 4 이하의 알코올 중 선택되는 1종 이상인 것인 제조 방법.
제10 항에 있어서,
상기 지용성 용매는 콘오일인 것인 제조 방법.
제10 항에 있어서,
상기 제조 방법은 상기 (d) 단계 이후에, 상기 정제된 나노 입자를 동결 건조하는 단계를 더 포함하는 것인 제조 방법.