KR20220021430A - 세포내 종양 유발 단백질을 타겟하는 항체 또는 이의 단일가닥 가변 단편과 암세포 투과성 펩타이드의 융합 단백질 및 이의 용도 - Google Patents

세포내 종양 유발 단백질을 타겟하는 항체 또는 이의 단일가닥 가변 단편과 암세포 투과성 펩타이드의 융합 단백질 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세포내 종양 유발 단백질인 KRAS의 돌연변이를 타겟으로 하는 항체 또는 이의 단일가닥 가변 단편에 암세포 투과성 펩타이드가 유전자 발현법 또는 화학적 결합법에 의해 연결되어 있는 융합 단백질 및 이의 종양 치료 용도에 관한 것이다. 이와 같이 제작된 융합 단백질은 효과적으로 종양 세포에 침투하여 세포내 종양 유발 단백질 또는 종양 유발 돌연변이 단백질를 타겟하는 항체 또는 이의 단일가닥 가변 단편의 항종양 또는 항암 효과를 극대화할 수 있는 장점이 있다.

Description

세포내 종양 유발 단백질을 타겟하는 항체 또는 이의 단일가닥 가변 단편과 암세포 투과성 펩타이드의 융합 단백질 및 이의 용도 {Fusion protein comprising antibody for targeting oncogenic protein or single chain fragment variable (scFv) thereof and cancer cell penetrating peptide and use of the same}
본 발명은 세포내 종양 유발 단백질을 타겟하는 항체 또는 이의 단일가닥 가변 단편과 암세포 투과성 펩타이드의 융합 단백질 및 이의 용도에 관한 것으로, 더 상세하게는 세포내 종양 유발 단백질인 KRAS의 돌연변이를 타겟으로 하는 항체 또는 이의 단일가닥 가변 단편에 암세포 투과성 펩타이드가 유전자 발현법 또는 화학적 결합법에 의해 연결되어 있는 융합 단백질 및 이의 종양 치료 용도에 관한 것이다.
종양은 종양유발 경로가 활성화 되거나 종양억제 경로가 억제됨에 의해 정상세포의 유전자가 변형됨으로써 발생한다 (1). 다양한 종양유발 인자 중에 RAS 돌연변이 단백질은 가장 널리 알려진 종양유발 인자로 전체 암 환자의 약 30%에서 나타난다. RAS 돌연변이 (mutation) 단백질은 GTP와 결합하여 활성화된 상태로 유지되면서 종양 세포의 증식과 성장을 유발한다. RAS는 HRAS, NRAS, KRAS 세 분류로 나눌 수 있고, KRAS 돌연변이는 비소세포폐암 (non-small-cell-lung carcinoma), 대장암 (colorectal carcinoma), 췌장암 (pancreatic carcinoma)에 주로 나타나고, HRAS 돌연변이는 방광암 (bladder carcinoma), 신장암 (kidney carcinoma), 갑상선암 (thyroid carcinoma)에서 나타나며, NRAS 돌연변이는 흑색종 (melanoma), 간세포성암 (hepatocellular carcinoma), 혈액암 (haematologic malignancies) 에서 주로 나타난다 (2). KRAS 유전자 돌연변이는 RAS 돌연변이에 의해 유발된 암 중 86%를 차지하며, 췌장암의 98% 이상, 직장암의 53% 이상, 폐 선암의 30% 이상에서 발생하는 것으로 알려져 있다 (3).
KRAS 돌연변이는 EGFR (epithelial growth factor receptor)을 타켓으로 하는 이레사 (Gefitinib), 타세바 (Erlotinib), 세툭시맙 (Cetuximab) 등 항 EGFR 치료제의 내성 기전에 깊게 관여하는 것으로 알려져 있다. EGFR억제 항암제를 사용해도 EGFR의 하위 개념인 KRAS가 돌연변이로 인해 계속적 활성화된 상태에서는 전혀 효과를 볼 수 없다. 실제로 대장암에서 항 EGFR 단일클론 (monoclonal) 치료 항체를 투여하기 위해서는 KRAS 돌연변이가 없는 환자인지 판별한 후에 투여가 가능하다.
항암치료의 한 수단으로 항체 약물이 많이 연구되고 있으며, 그 예로 트라스트주맙 (Trastuzumab)은 Her2 단백질에 대한 monoclonal antibody로서 유방암 치료제로 사용되고 있으며, (4) 리툭시맙 (Rituximab)은 CD20에 대한 monoclonal antibody로서 B cell malignant lymphoma 치료제로 사용하고 있다 (5). 항체는 타겟에 대한 저해 효과는 뛰어나지만 분자량이 커서 세포막을 통과할 수 없기 때문에, 세포 내부에 항체의 타겟이 있는 경우에는 항체에 의한 저해효과를 얻기가 어렵다.
전립선암은 전 세계에서 세 번째로 흔한 남성암이며, 미국의 경우 발생률이 가장 높은 남성암으로 폐암에 이어 두 번째로 높은 암 특이 사망률을 보인다 (7). 국소 전립선암의 경우에는 수술 또는 방사선 치료로 완치를 기대할 수 있으나 진행성, 전이성 전립선암의 경우 표준적인 치료법으로 화학적 거세법이 주로 시행되고 있다. 전립선암이 남성호르몬 의존성 암이라는 것이 증명된 이후 인위적인 거세법은 진행성 혹은 전이성 전립선암의 1차 치료로 확립 되었고, 다양한 형태의 전립선암에 대한 거세치료가 임상에서 사용되고 있다 (8). 전이성 전립선암에서 거세법은 질환의 진행 및 이에 동반된 증상의 완화 등의 효과를 보이지만, 거세법을 18개월 이상 시행할 경우 75%의 환자만이 지속적으로 치료에 반응을 보이는 것으로 알려져 있다. 거세법은 초기에는 비교적 좋은 반응을 보이지만 시간이 경과하면서 전립선암 세포들이 남성호르몬 차단에 의해 세포고사 (apoptosis)가 되지 않고, 더이상 호르몬 치료에 반응하지 않는 거세 저항성 전립선암 (castration-resistant prostate cancer, CRPC)으로 전환된다 (9).
CRPC란 혈중 테스토스테론이 무고환치로 감소되어 있는 상태에서, 안드로겐 수용체를 통하여 작용을 나타내는 모든 약제를 중단한 후에도 전립선특이항원(prostate specific antigen, PSA)의 감소를 보이지 않으며, 의미있는 PSA의 상승 또는 방사선학적 진행을 보이는 경우로 정의된다. CRPC를 치료 없이 방치하였을 경우 평균 생존기간은 12개월 미만이며 각종 치료에 따른 전이성 전립선암 환자의 평균 생존 기간은 3년 이내이고, 국소 침윤성 질환의 경우 평균 생존 기간은 4.5년에 불과하다 (10).
CRPC에서 안드로겐 수용체 (androgen receptor, AR)는 AR 과별현, 돌연변이, 과민감성, 종양내에서 안드로겐 합성 등 다양한 메카니즘에 의해 재활성화가 된다고 알려져 있다 (11).
FDA 에서 승인한 CRPC 치료제로 Abiraterone은 안드로겐 합성 저해제이며, 2세대 안드로겐 수용체 길항제인 enzalutamide (MDV3100)은 안드로겐 수용체가 안드로겐과 결합하는 것을 완전히 저해하여 안드로겐 수용체가 핵안으로 이동하여 타겟 유전자와 결합하는 것을 억제한다. Abiraterone 또는 enzalutamide 치료 후 재발되는 대부분의 전립선암들은 PSA가 양성이고, 안드로겐 수용체가 다시 활성화 되기 때문에, abiraterone 또는 enzalutamide에 저항성이 있는 CRPC 환자는 새로운 안드로겐 수용체 저해 치료법이 필요하다 (12). 스테로이드 수용체 수퍼패밀리 중에 하나인 안드로겐 수용체는 리간드 의존적 전사인자 (transcription factor)로서 안드로젠에 의해 영향을 받는 유전자의 발현을 조절한다. 전사인자가 타겟 유전자에 접근하기 위해서 전사인자는 핵 안으로 들어가는 것이 꼭 필요하기 때문에 전사인자를 세포질안에만 유지시킬 수 있으면 전사기능을 막을 수 있다. 따라서, 안드로겐 수용체의 핵내로 이동을 조절하는 것이 가장 중요한 단계이다 안드로겐에 민감한 세포는 안드로겐이 없으면 세포질에 있다가 안드로겐이 있으면 핵 안으로 이동하여 타겟 유전자를 활성화 시킨다. 그러나 CRPC 세포는 안드로겐이 없어도 안드로겐 수용체가 핵 안에 계속 머물러 있기 때문에 타겟 유전자를 계속 활성화 시키게 된다 (13). 따라서, 안드로겐 수용체의 핵 안으로 이동하는 것을 억제할 수 있다면, CRPC 종양에서 효과적인 치료로 사용될 수 있다.
KRAS나 안드로겐 수용체와 같은 종양 유발 단백질은 인간의 암 발생에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으나, 이들을 타겟하는 항체 치료제는 아직 임상적으로 사용되고 있지 않다. 그 이유는 세포 내에 분포하는 RAS, androgen receptor에 대한 항체가 분자량이 크기 때문에 세포막을 통과할 수 없기 때문이다. 항체보다 작은 단일가닥 가변 단편 (scFv)은 항체에 비해 분자량이 작고, 면역거부반응을 유발하는 Fc 부분이 없기 때문에, 일반적인 항체에 대한 대안이 될 수 있다고 알려져 있다. 그러나, scFv 자체도 분자량이 25kDa 이상이 되기 때문에, 저분자 약물처럼 세포막을 자유롭게 통과하기 어렵기 때문에, 기대만큼 큰 저해 효과를 얻기가 어렵다.
이에, 본 발명자들은 상기 종래기술의 문제점을 해결하고자 예의 노력한 결과, 세포내 종양 유발 단백질에 대한 항체 또는 이의 단일가닥 가변 단편을 암조직 투과가 가능하도록 암세포 투과 기능성 펩타이드와 융합시키고자 하였다. 융합 방법은 유전자 발현법 또는 화학적 결합법으로 제작하였으며, 이와 같이 제작된 세포투과성의 융합 단백질이 세포 내에서 종양 유발 단백질이 많이 발현되는 암세포의 증식과 성장을 효과적으로 억제할 수 있음을 시험관 내 및 동물 실험을 통해 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
Zhang J, Chen YH, Lu Q. Pro-oncogenic and anti-oncogenic pathways: opportunities and challenges of cancer therapy. Future Oncol. 2010 Apr;6(4):587-603. Cox AD, Fesik SW, Kimmelman AC, Luo J, Der CJ. Drugging the undruggable RAS: mission possible? Nat Rev Drug Discov 2014; 13: 828 - 51. RAS oncogenes: weaving a tumorigenic web. Pylayeva-Gupta Y, Grabocka E, Bar-Sagi D. Nat Rev Cancer. 2011 Oct 13; 11(11):761-74. Trastuzumab (herceptin) for the medical treatment of breast cancer. Bayoudh L, Afrit M, Daldoul O, Zarrad M, Boussen H. Tunis Med. 2012 Jan; 90(1):6-12. Evolution of anti-CD20 monoclonal antibody therapeutics in oncology. Oflazoglu E, Audoly LP. MAbs. 2010 Jan-Feb; 2(1):14-9. Demarest SJ, Glaser SM. Antibody therapeutics, antibody engineering, and the merits of protein stability. Curr Opin Drug Discov Devel. 2008;11(5):675-687. Jemal A, Clegg LX, Ward E, Ries LA, Wu X, Jamison PM, et al. Annual report to the nation on the status of cancer, 1975-2001, with a special feature regarding survival. Cancer 2004;101:3-27. Yagoda A, Petrylak D. Cytotoxic chemotherapy for advanced hormone-resistantprostatecancer. Cancer 1993;71:1098. Rini BI, Small EJ. Hormone-refractory prostate cancer. Curr Treat Opt Oncol 2002;3:437-46. Sella A, Yarom N, Zisman A, Kovel S. Paclitaxel, stramustine and carboplatin combination chemotherapy after initial docetaxel-based chemotherapyincastration resistant prostate cancer. Oncology 2009;76:442. Chen CD, Welsbie DS, Tran C, Baek SH, Chen R, Vessella R, et al. Molecular determinants of resistance to antiandrogen therapy. Nat Med 2004;10:33-9. Boudadi K, Antonarakis ES. Resistance to novel antiandrogen therapies in metastatic castration-resistant prostate cancer. Clin Med Insights Oncol 2016;10:1-9. Zhang L, Johnson M, Le KH, Sato M, Ilagan R, Iyer M, et al. Interrogating androgen receptor function in recurrent prostate cancer. Cancer Res 2003;63:4552-60. Lars Kober, Christoph Zehe, Juergen Bode, Biotechnology and Bioengineering, Vol. 110, No. 4, April, 2013, Optimized signal peptides for the development of high expressing CHO cell lines
본 발명은 목적은 종양 치료 효과가 현저히 개선된 융합 단백질을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 종양 치료용 약학적 조성물을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (i) 세포내 종양 유발 단백질 또는 종양 유발 돌연변이 단백질을 타겟하는 항체 또는 이의 단일가닥 가변 단편과 (ii) 암세포 투과 기능성 펩타이드가 연결되어 있는 융합 단백질을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 융합단백질을 암호화하는 핵산을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 핵산이 도입되어 있는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 벡터가 도입되어 있는 재조합 세포를 제공한다.
본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는 상기 융합 단백질의 제조방법을 제공한다:
(a) 상기 재조합 세포를 배양하여 제1항의 융합 단백질을 발현시키는 단계; 및
(b) 상기 발현된 융합 단백질을 회수하는 단계.
본 발명은 또한, 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 종양 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서는 종양 발병에 중요한 요인으로 작용하는 세포내 종양 유발 단백질 또는 이들의 돌연변이에 결합하여 그 기능을 저해하는 세포내 종양 유발 단백질 또는 종양 유발 돌연변이 단백질을 타겟하는 항체 또는 이의 단일가닥 가변 단편을 활용하되, 이의 암세포 접근성을 강화시키고자 암세포 투과 기능성 펩타이드를 연결하였다. 이와 같이 제작된 융합 단백질은 효과적으로 종양 세포에 침투하여 세포내 종양 유발 단백질 또는 종양 유발 돌연변이 단백질을 타겟하는 항체 또는 이의 단일가닥 가변 단편의 항종양 또는 항암 효과를 극대화할 수 있는 장점이 있다.
도 1은 본 발명의 개요를 보여주는 모식도이다.
도 2는 암세포 투과능을 가진 KRAS 돌연변이 항체 및 scFv의 발현벡터를 나타낸다.
도 3은 발현 및 정제된 암세포 투과능을 가진 KRAS 돌연변이 항체 및 scFv의 SDS-PAGE, western blot 결과이다.
도 4은 화학적 결합법으로 제작한 암세포 투과능을 가진 KRAS 돌연변이 항체 및 scFv의 SDS-PAGE, western blot 결과이다.
도 5는 암세포 투과능을 가진 KRAS 돌연변이 항체 및 scFv에 의한 암세포 특이적 사멸효과를 확인한 결과이다.
도 6은 GGGGS 링커로 연결된 서열번호 20-23에 의한 Active KRAS (mutant KRAS)의 western blot 결과이다.
도 7은 GGGGSGGGGSGGGGS 링커로 연결된 서열번호 90-93에 의한 Active KRAS (mutant KRAS)의 western blot 결과이다.
도 8은 서열번호 20-23의 암세포 투과능을 확인한 결과이다.
도 9는 Tumor xenograft 동물 모델에서 암조직으로 분포를 평가한 결과이다.
도 10은 Tumor xenograft 동물 모델에서 암조직에서의 형광 강도를 도시한다.
도 11은 서열번호 2 및 서열번호 23의 종양억제 효과를 도시한다.
도 12는 H358에 의해 형성된 종양의 볼륨변화와 희생시 암조직 사진을 도시한다.
도 13은 화학적 결합에 의해 제조된 서열번호 80-83에 의한 Active KRAS (mutant KRAS)의 western blot 결과이다.
도 14는 화학적 결합에 의해 제조된 서열번호 80-83에 의한 암세포 특이적 사멸효과를 확인한 결과이다.
도 15는 화학적 결합법에 의해 제조된 서열번호 80-83의 암세포 투과능을 확인한 결과이다.
도 16은 Tumor xenograft 동물 모델에서 암조직으로 분포를 평가한 결과이다.
도 17은 Tumor xenograft 동물 모델에서 암조직에서의 형광 강도를 도시한다.
도 18은 서열번호 3 및 서열번호 83의 종양억제 효과를 도시한다.
도 19는 H358에 의해 형성된 종양의 볼륨변화와 희생시 암조직 사진을 도시한다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 종양 치료 효과가 있는 세포 내 종양 유발 단백질 또는 이들의 돌연변이를 타겟으로 하는 항체 또는 이의 단일가닥 가변 단편이 암세포에 도달하여도 이들이 종양 세포에 충분히 작용할 수 없다는 점에 착안하여, 암세포 투과 기능성 펩타이드와 연결되어 있는 융합 단백질을 제작하였다. 융합 단백질을 제작하기 위하여, 세포 내 종양 유발 단백질 또는 종양 유발 돌연변이 단백질을 타겟하는 항체 또는 이의 단일가닥 가변 단편의 N-말단 또는 C-말단에 링커를 도입하고, 이에 암세포 투과 기능성 펩타이드를 연결하였는데, 이와 같은 융합 단백질은 유전자 발현법 또는 화학적 결합법의 두 가지 상이한 방법으로 제작하였다. 이와 같이 제작한 융합 단백질을 이용하여 암세포 사멸 실험에서 암세포 투과 기능성 펩타이드가 도입된 융합 단백질은 세포 내 종양 유발 단백질 또는 종양 유발 돌연변이 단백질을 타겟하는 항체 또는 이의 단일가닥 가변 단편을 단독으로 처리한 것에 비해 암세포 특이적으로 현저히 우수한 효과를 발휘함을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서 (i) 세포 내 종양 유발 단백질 또는 종양 유발 돌연변이 단백질을 타겟하는 항체 또는 이의 단일가닥 가변 단편과 (ii) 암세포 투과 기능성 펩타이드가 연결되어 있는 융합 단백질에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 세포내 종양 유발 단백질 또는 종양 유발 돌연변이 단백질은 KRAS 또는 안드로겐 수용체인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단일가닥 가변 단편은 서열번호 1 내지 서열번호 3으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
일 양태로서, 상기 단일가닥 단편은 KRAS mutant scFv로, 하기 서열번호 1로 표시될 수 있다.
서열번호 1:
MAWVWTLLFLMAAAQSIQAEWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSGKGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTKLEIKRGSENLYFQGGSGKPIPNPLLGLDSTGGSGGSHHHHHH
여기서, MAWVWTLLFLMAAAQSIQA는 시그널 펩타이드이며, 그 다음 이어지는 아미노산 서열은 Variable heavy chain (VH) region, GGGGSGKGGSGGGGSGGGGS은 linker, 그 다음 이어지는 아미노산 서열은 Variable light chain (VL) region이다. 시그널 펩타이드는 MTRLTVLALLAGLLASSRA, MKWVTFISLLFLFSSAYS 와 같이 공지된 서열로 대체하여 사용할 수 있다.
다른 양태로서, 상기 단일가닥 단편은 KRAS mutant scFv로, 하기 서열번호 2로 표시될 수 있다.
서열번호 2:
MAQVKLQESGPELVRPGTSVKVSCKASGYAFTNYLIEWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTKLEIKRLEHHHHHH
여기서, MAQVKLQESGPELVRPGTSVKVSCKASGYAFTNYLI는 시그널 펩타이드이며, 그 다음 이어지는 아미노산 서열은 Variable heavy chain (VH) region, GGGGSGGGGSGGGGS은 linker, 그 다음 이어지는 아미노산 서열은 Variable light chain (VL) region이다.
다른 양태로서, 상기 단일가닥 단편은 KRAS mutant scFv로 하기 서열번호 3로 표시될 수 있다.
서열번호 3:
MAWVWTLLFLMAAAQSIQAEWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSGKGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTKCLEIKRGSENLYFQGGSGKPIPNPLLGLDSTGGSGGSHHHHHH
서열번호 3은 서열번호 1과 동일하며, VL 뒤에 Cysteine을 도입하였다.
본 발명에 있어서, 상기 암세포 투과 기능성 펩타이드는 CCPP1 (H4K), CCPP2 (H4P), CCPP3 (LMWP) 및 CCPP4 (hBD3-3)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 암세포 투과 기능성 펩타이드는 서열번호 86 내지 서열번호 89로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 암세포 투과 기능성 펩타이드는 상기 항체 또는 이의 단일가닥 가변 단편의 N-말단 또는 C-말단에 링커를 통해 연결된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 링커는 상기 암세포 투과 기능성 펩타이드와 상기 항체 또는 이의 단일가닥 가변 단편이 연결될 때, 각각이 기능적 구조를 형성할 수 있도록 공간을 부여하기 위한 것으로, 아미노산 G와 S의 적절할 조합에 의한 펩타이드 링커가 바람직하고, G의 개수는 3개에서 20개까지 S의 개수는 1개에서 5개까지 포함하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 가장 바람직하게는 상기 링커는 GGGGS 또는 GGGGSGGGGSGGGGS이다.
본 발명에 있어서, 상기 링커와 암세포 투과 기능성 펩타이드가 연결되어 있는 경우, 이는 서열번호 4에서 서열번호 11의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이 경우, 서열번호 4 내지 7 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 융합 펩타이드는 단일가닥 가변 단편의 C 말단에 연결되는 것이 바람직하고, 서열번호 8 내지 11 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 융합 펩타이드는 단일가닥 가변 단편의 N 말단에 연결되는 것이 바람직하다. 다른 양태로서, 상기 서열번호 4 내지 11 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 융합 펩타이드는 항체의 단일가닥 단편의 중쇄와 경쇄를 연결하는 링커에 추가로 결합될 수 있다. 한편, 서열번호 4 내지 11중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 융합 펩타이드가 항체에 연결되는 경우, 이는 Fc 영역에 존재하는 당 구조에 연결되는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단일가닥 가변 단편과 암세포 투과 기능성 펩타이드는 화학적 결합법으로 연결되는 것을 특징으로 할 수 있다. 이 경우, 상기 융합 단백질은 서열번호 68 내지 서열번호 83 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 서열번호 1 내지 서열번호 3으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 단일가닥 가변 단편의 라이신 또는 시스테인 잔기에 서열번호 86 내지 서열번호 89로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 암세포 투과 기능성 펩타이드가 링커를 통해 연결된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 링커는 CGGGGG 또는 CGGGGGSSGGGGG인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단일가닥 가변 단편과 암세포 투과 기능성 펩타이드는 유전자 발현법으로 연결되어 발현되는 것을 특징으로 할 수 있다. 이 경우, 상기 융합 단백질은 대장균에서 발현될 수 있고, 서열번호 12 내지 서열번호 27 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 또한, 상기 융합 단백질은 포유동물 세포에서 발현될 수 있고, 서열번호 28 내지 서열번호 59 및 서열번호 90 내지 서열번호 93 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
예컨대, 상기 KRAS 돌연변이를 타겟으로 하는 단일가닥 가변 단편(서열번호 1 내지 서열번호 3 중 어느 하나)의 N 말단에 암세포 투과능을 가진 펩타이드와 링커를 연결하거나, C 말단에 암세포 투과능을 가진 펩타이드와 링커를 연결하여 사용할 수 있다. 이에 따른 다양한 양태가 실시예의 표 2 내지 표 5에 구체적으로 기재되어 있다.
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 서열번호 12 내지 서열번호 59, 서열번호 68 내지 서열번호 83 및 서열번호 90 내지 서열번호 93 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 유전자 발현법 또는 화학적 결합법으로 제조할 수 있으나, 그 제조방법이 이에 한정되는 것은 아니다.
유전자 발현법으로 융합 단백질을 제조하는 경우, (i) 세포내 종양 유발 단백질 또는 종양 유발 돌연변이 단백질을 타겟하는 항체 또는 이의 단일가닥 가변 단편과 (ii) 암세포 투과 기능성 펩타이드가 함께 발현되는 벡터를 이용할 수 있다. 이 경우, 상기 항체 또는 이의 단일가닥 가변 단편과 상기 암세포 투과 기능성 펩타이드 사이에 링커 서열을 추가로 포함하여 발현되도록 할 수 있다. pET 벡터, pcDNA 3.4, pcDNA3.1, pcDNA3.1-TOPO, pcDNA3.4-TOPO, pSecTag 벡터 등을 이용할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 본 발명에서는 대장균에서의 발현을 위해 pET 벡터를, 포유동물 세포에서의 발현을 위해 pcDNA3.1-TOPO, pcDNA3.4-TOPO 벡터를 사용하였다.
따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 융합 단백질을 암호화하는 핵산에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 상기 핵산이 도입되어 있는 재조합 벡터에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 벡터가 도입되어 있는 재조합 세포에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 세포는 대장균 또는 포유동물 세포인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에서 사용가능한 바람직한 포유동물 세포주는 중국햄스터난소세포주(CHO: Chinese hamsterovarian cell), 인간 태아 신장세포주(HEK293: human embryonic kidney cells) 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명은 또한, 상기 융합 단백질을 제조하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 (a) 상기 재조합 세포를 배양하여 제1항의 융합 단백질을 발현시키는 단계; 및 (b) 상기 발현된 융합 단백질을 회수하는 단계를 포함한다.
한편, 본 발명에서는 세포내 종양 유발 단백질 또는 종양 유발 돌연변이 단백질을 타겟하는 항체 또는 이의 단일가닥 가변 단편을 유전자에서 발현시켜 정제한 후, 이에 화학적 결합법으로 암세포 투과 기능성 펩타이드를 도입할 수도 있다.
암세포 투과 기능성 펩타이드는 링커와 crosslinker에 의해 상기 항체 또는 단일가닥 가변 단편에 연결될 수 있다. 링커는 기능적 구조를 형성할 수 있도록 공간을 부여할 수 있는 것이라면 어떠한 것이라도 사용할 수 있을 것이다. 예를 들어, 상기 링커는 천연 및/또는 합성 기원의 펩타이드성 링커일 수 있다. 천연 및/또는 합성 기원의 펩타이드성 링커는 1 내지 50개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 사슬로 이루어질 수 있고, 경첩 기능을 갖는 폴리펩타이드와 같이 천연 발생 폴리펩타이드의 반복적인 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 양태로서, 상기 펩타이드성 링커 아미노산 서열은 글리신, 글루타민, 및/또는 세린 잔기가 풍부하도록 지정된 합성 링커 아미노산 서열일 수 있다. 이들 잔기는 예를 들어 5개 이하의 아미노산의 작은 반복 단위로 배열될 수 있고 상기 작은 반복 단위는 멀티머 단위를 형성하도록 반복되어 배열될 수 있다. 멀티머 단위의 아미노- 및/또는 카르복시- 말단에서, 6개 이하의 추가의 임의의 천연 발생 아미노산이 첨가될 수 있다. 기타 합성 펩타이드성 링커는 10 내지 20회 반복되는 단일 아미노산 구성일 수 있고, 아미노- 및/또는 카르복시-말단에 6개 이하의 추가 임의의 천연 발생 아미노산일 수 있다. 한편, 상기 링커는 아미노산이 화학적으로 변형된 형태일 수 있으며, 예컨데, 블로킹 그룹(Blocking group)으로 Fmoc-(9-Fluorenylmethoxycarbonyl)이 결합된 Fmoc-6-aminohexanoic acid의 형태로 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 일부 양태로서, 암세포 투과 기능성 펩타이드와 링커가 결합된 융합 펩타이드는 서열번호 60 내지 서열번호 67 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시될 수 있다. 이 경우, 암세포 투과 기능성 펩타이드의 N 말단에 위치한 cysteine의 sulfhydryl기는 서열번호 1의 링커 부분에 있는 lysine의 아민기 또는 입체 구조에서 노출된 부분에 있는 lysine의 아민기에 연결될 수 있다.
이 경우, 사용가능한 crosslinker는 1,4-비스-말레이미도부탄(1,4-bis-maleimidobutane, BMB), 1,11-비스-말레이미도테트라에틸렌글리콜(1,11-bis-maleimidotetraethyleneglycol, BM[PEO]4), 1-에틸-3-[3-디메틸 아미노프로필] 카보디이미드 하이드로클로라이드(1-ethyl-3-[3-dimethyl aminopropyl] carbodiimide hydrochloride, EDC), 숙시니미딜-4-[N-말레이미도메틸시클로헥산-1-카복시-[6-아미도카프로에이트]](succinimidyl-4-[N-maleimidomethylcyclohexane-1-carboxy-[6-amidocaproate]], SMCC) 및 그의 설폰화염(sulfo-SMCC), 숙시미딜 6-[3-(2-피리딜디티오)-로피오나미도] 헥사노에이트](succimidyl 6-[3-(2-pyridyldithio)-ropionamido] hexanoate, SPDP) 및 그의 설폰화염(sulfo-SPDP), m-말레이미도벤조일-N-하이드로시숙시니미드 에스터(m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester, MBS) 및 그의 설폰화염(sulfo-MBS), 숙시미딜[4-(p-말레이미도페닐) 부틸레이트](succimidyl[4-(p-maleimidophenyl) butyrate], SMPB) 및 그의 설폰화염(sulfo-SMPB)등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
한편, 서열번호 3의 C 말단의 cysteine의 sulfhydryl기를 환원시킨 후, 서열번호 60 내지 서열번호 67 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 융합 펩타이드의 N 말단에 위치한 cysteine의 sulfhydryl와 연결할 수 있는 crosslinker는 트리스 2-카복시에틸포스핀 (tris(2-carboxyethyl)phosphine, TCEP), 5,50 디티오비스-(2-니트로벤조익 액시드) (5,50-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid, DTNB) 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 화학적 결합법을 이용하여 융합 단백질을 제조하는 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 세포내 종양 유발 단백질 또는 종양 유발 돌연변이 단백질을 타겟하는 항체 또는 이의 단일가닥 가변 단편의 링커 부위 또는 노출된 부분에 존재하는 라이신의 아민기를 crosslinker로 활성화 하는 단계;
(b) 암세포 투과 기능성 펩타이드를 crosslinker로 활성화된 상기 항체 또는 단일가닥 가변 단편에 연결하는 단계; 및
(c) 상기 항체 또는 단일가닥 가변 단편과 암세포 투과 기능성 펩타이드가 연결되어 있는 융합 단백질을 정제하는 단계.
대안적으로, 상기 방법에서 (a)단계는 세포내 종양 유발 단백질 또는 종양 유발 돌연변이 단백질을 타겟하는 항체 또는 이의 단일가닥 가변 단편의 시스테인 잔기의 sulfhydryl기를 환원시키는 단계일 수 있다.
상기 화학적 결합법에 의해 생성되는 융합 단백질은 서열번호 68 내지 서열번호 83 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 따른 양태로서, 상기 융합 단백질은 세포내 종양 유발 단백질 또는 종양 유발 돌연변이 단백질을 타겟하는 항체 또는 이의 단일가닥 가변 단편의 라이신 또는 시스테인 잔기와 암세포 투과 기능성 펩타이드가 크로스-링커에 의해 연결되는 것을 특징으로 할 수 있다.
바람직하게는, 상기 융합 단백질은 서열번호 1 내지 서열번호 3으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 단일가닥 가변 단편의 라이신 또는 시스테인 잔기와 서열번호 60 내지 서열번호 67로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 융합 펩타이드가 크로스-링커에 의해 화학적 결합하는 것을 특징으로 할 수 있다.
이 경우, 상기 잔기가 라이신인 경우, 상기 크로스-링커는 1,4-비스-말레이미도부탄(1,4-bis-maleimidobutane, BMB), 1,11-비스-말레이미도테트라에틸렌글리콜(1,11-bis-maleimidotetraethyleneglycol, BM[PEO]4), 1-에틸-3-[3-디메틸 아미노프로필] 카보디이미드 하이드로클로라이드(1-ethyl-3-[3-dimethyl aminopropyl] carbodiimide hydrochloride, EDC), 숙시니미딜-4-[N-말레이미도메틸시클로헥산-1-카복시-[6-아미도카프로에이트]](succinimidyl-4-[N-maleimidomethylcyclohexane-1-carboxy-[6-amidocaproate]], SMCC) 및 그의 설폰화염(sulfo-SMCC), 숙시미딜 6-[3-(2-피리딜디티오)-로피오나미도] 헥사노에이트](succimidyl 6-[3-(2-pyridyldithio)-ropionamido] hexanoate, SPDP) 및 그의 설폰화염(sulfo-SPDP), m-말레이미도벤조일-N-하이드로시숙시니미드 에스터(m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester, MBS) 및 그의 설폰화염(sulfo-MBS), 숙시미딜[4-(p-말레이미도페닐) 부틸레이트](succimidyl[4-(p-maleimidophenyl) butyrate], SMPB) 및 그의 설폰화염(sulfo-SMPB)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
한편, 상기 잔기가 시스테인인 경우, 상기 크로스-링커는 트리스 2-카복시에틸포스핀 (tris(2-carboxyethyl)phosphine, TCEP) 또는 5,50 디티오비스-(2-니트로벤조익 액시드) (5,50-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid, DTNB)인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 따른 KRAS 돌연변이 단백질은 암세포의 성장을 가속화하여 종양발생의 중요한 인자로 알려져 있으나, 세포막 안쪽에 존재하기 때문에, KRAS 돌연변이를 타겟으로 하는 항체 또는 단일가닥 가변 단편에 의한 저해 효과가 크지 않다. 그러나, 암세포 투과능 펩타이드를 도입한 후 KRAS 돌연변이에 대한 항체 또는 단일가닥 가변 단편에 의한 종양 증식 억제 효과를 확인하였을 때, 시험관 내 실험 및 동물 실험 결과 모두에서 해당 암세포 투과능을 가진 KRAS 돌연변이를 타겟으로 하는 항체 또는 단일가닥 가변 단편은 종양 세포의 증식을 현저히 억제하는 효과가 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 다른 관점에서, 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 종양 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 종양은 비소세포폐암, 대장암, 췌장암, 방광암, 신장암, 갑상선암, 유방암, 결장암, 간암, 뇌종양, 피부암, 흑색종, 대장암, 전립선 암및 혈액암으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물은 주사제, 경구투여용 제제, 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 액제 (예를 들어, 주사용), 캡슐, 과립, 정제, 점막투여제제 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 제형으로 제제화되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이들 제제는 당분야에서 제제화에 사용되는 통상의 방법 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA 에 개시되어 있는 방법으로 제조될 수 있으며 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 다양한 제제로 제제화될 수 있다.
한편, 본 발명의 약학적 조성물은 상기암세포 투과능을 가진 KRAS 돌연변이를 타겟으로 하는 항체 또는 단일가닥 가변 단편 이외에 약제학적으로 허용가능한 담체를 1 종 이상 더 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 필요에 따라 약제학적으로 허용가능한 보조제를 추가로 함유하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 보조제는 부형제, 희석제, 분산제, 완충제, 항균성 보존제, 정균제, 계면활성제, 결합제, 윤활제, 산화방지제, 증점제 및 점도개질제로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 전문가의 소견에 따라 다양하게 변경되어 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시양태로서, 상기 펩타이드의 일회 투여량은 1μg/kg 내지 100 ㎎/㎏, 바람직하게는 5μg/kg 내지 50 ㎎/㎏이고, 일일 일회 또는 주 1-3회 투여하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 투여량과 투여간격이 이에 한정되는 것은 아니다
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 융합 단백질을 투여하는 단계를 포함하는 종양의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 종양의 예방 또는 치료를 위한 상기 융합 단백질의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 종양의 치료를 위한 약제의 제조에 있어 상기 융합 단백질의 사용에 관한 것이다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 암세포 투과능을 가진 KRAS 돌연변이를 타겟으로 하는 scFv의 단백질 발현법에 의한 제작
실시예 1-1: 대장균에서 암세포 투과능을 가진 KRAS 돌연변이를 타겟으로 하는 scFv의 발현
KRAS mutant scFv, 암세포 투과능 펩타이드가 도입된 KRAS mutant scFv 발현 백터를 각각 특이적인 프라이머를 이용하여 PCR 방법으로 제작하였다. 본 발명에서 사용된 KRAS mutant scFv는 서열번호 1 내지 서열번호 3 중 어느 하나이다.
KRAS mutant scFv (서열번호 1):
MAWVWTLLFLMAAAQSIQAEWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSGKGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTKLEIKRGSENLYFQGGSGKPIPNPLLGLDSTGGSGGSHHHHHH
KRAS mutant scFv (서열번호 2):
MAQVKLQESGPELVRPGTSVKVSCKASGYAFTNYLIEWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTKLEIKRLEHHHHHH
KRAS mutant scFv (서열번호 3):
MAWVWTLLFLMAAAQSIQAEWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSGKGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTK C LEIKRGSENLYFQGGSGKPIPNPLLGLDSTGGSGGSHHHHHH
pET 21a(+) DNA는 Nde I과 Xho I으로 절단하였으며, pMX DNA도 Nde I과 Xho I으로 절단하여, 767 bp의 Kras scFv 유전자 단편을 아가로스 전기 용출(agarose electro elution) 방법으로 회수하였다. 이를 pET 21a(+) 벡터에 삽입하기 위하여 PCR을 통해 유전자를 증폭시켰다. PCR 프라이머로는 정방향 프라이머(5'-AAGGAGATATACATATGATGGCATGGGTTTGGAC-3') 및 역방향 프라이머(5'-AGCCCGAAGGGAATTCATTTGCAGATACAAAGTGTTTTTAGAGTTG-3')를 이용하였다. 각각의 절단된 벡터와 인서트를 0.5 μg과 1.0 μg의 비율로 혼합하였고, Tris-HCl 500 mM, MgCl2 100 mM, DTT 200 mM, ATP 10 mM 조성의 라이게이션 완충 용액에서 T4 DNA 리가아제를 사용하여, 4℃에서 16-18시간 동안 반응시켰다.
재조합된 DNA 용액을 대장균 DH5a에 형질전환시키고, LB+Amp 고체 배지에 도말하여 형질전환체를 선별하였다.
각각의 플라즈미드로 형질전환된 대장균 RosettaTM 2(DE3) SinglesTM (Novagen) 균주의 단일 콜로니(colony)를 10μg/ml 농도의 엠피실린(ampicillin) 항생제가 포함되어 있는 20ml LB에 접종하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 배양액의 1ml을 같은 농도의 항생제가 들어있는 새로운 200ml의 LB에 희석시켰다. KRAS scFv의 발현은 OD600에서의 세포의 밀도 0.8 값에서 IPTG의 최종농도가 1mM이 되도록 넣고 over night 동안 배양시킴으로써 유도되었다. 세포들을 원심분리법을 통하여 수확하였고 10ml lysis buffer(50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, pH 8.0)에 섞어서 풀어주었다. 세포의 초음파 분쇄(sonication)후, 4℃12000g 조건에서 10분간의 원심분리를 통해 단백질을 total(전체), soluble(수용성), insoluble(불수용성) 부분으로 나누었고 SDS-PAGE를 통해 분석하였다(S.I. Choi et al., Protein solubility and folding enhancement by interaction with RNA, PLoS ONE 3 (2008) e2677).
분리된 KRAS scFv는 니켈 크로마토그래피 (HisTrapTM excel Kit, GE Healthcare)에 의해 분리, 정제되었다. 다음 [50mM NaH2PO4 (pH 8.0), 300mM NaCl] 조건의 버퍼로 니켈 컬럼 (column)을 미리 적셔 균등하게 해준 후 같은 버퍼 조건의 단백질 수용액을 적용시켰다. 20mM의 이미다졸(imidazole)이 포함되어 있는 위 버퍼를 이용하여 세척을 진행한 후 이미다졸을 50mM부터 500mM까지 점진적으로 증가시킨 버퍼를 이용하여 단백질을 분리하였다. 분리된 단백질을 모아서 desalting column(PD-10 Columns, GE Healthcare)을 이용하여 투석하였다.
본 발명에서 사용한 링커와 암세포 투과 기능성 펩타이드 서열은 다음 표 1과 같다.
linker 종류 및 위치 암세포 투과 기능성 펩타이드
cancer cell penetrating peptide (CCPP)		 linker와 암세포 투과 기능성 펩타이드의아미노산 서열 서열번호 scFv의 연결부위
N term of CCPP-GGGGS CCPP-1 (H4K) GGGGS- HRRCNKNNKKR 4 C term
CCPP-2 (H4P) GGGGS- HRRCNPNNKKR 5 C term
CCPP-3 (LMWP) GGGGS- VSRRRRRRGGRRRR 6 C term
CCPP-4 (hBD3-3) GGGGS- GKCSTRGRKCCRRKK 7 C term
C term of CCPP-GGGGS CCPP-1 (H4K) HRRCNKNNKKR-GGGGS 8 N term
CCPP-2 (H4P) HRRCNPNNKKR- GGGGS 9 N term
CCPP-3 (LMWP) VSRRRRRRGGRRRR- GGGGS 10 N term
CCPP-4 (hBD3-3) GKCSTRGRKCCRRKK- GGGGS 11 N term
대장균에서 발현되는 암세포 투과 기능성 펩타이드와 KRAS 돌연변이 scFv가 연결된 융합 단백질의 아미노산 서열은 다음 표 2와 같다.
융합 단백질 아미노산 서열 서열번호
서열번호 1-GGGGS-H4K MAWVWTLLFLMAAAQSIQAEWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSGKGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTK - GGGGS - HRRCNKNNKKR -LEIKRGSENLYFQGGSGKPIPNPLLGLDSTGGSGGSHHHHHH 12
서열번호 1-GGGGS-H4P MAWVWTLLFLMAAAQSIQAEWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSGKGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTK - GGGGS - HRRCNPNNKKR -LEIKRGSENLYFQGGSGKPIPNPLLGLDSTGGSGGSHHHHHH 13
서열번호 1-GGGGS-LMWP MAWVWTLLFLMAAAQSIQAEWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSGKGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTK - GGGGS - VSRRRRRRGGRRRR-LEIKRGSENLYFQGGSGKPIPNPLLGLDSTGGSGGSHHHHHH 14
서열번호 1-GGGGS-hBD3-3 MAWVWTLLFLMAAAQSIQAEWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSGKGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTK - GGGGS - GKCSTRGRKCCRRKK - LEIKRGSENLYFQGGSGKPIPNPLLGLDSTGGSGGSHHHHHH 15
H4K-GGGGS-서열번호 1 MAWVWTLLFLMAAAQSIQA - HRRCNKNNKKR - GGGGS -EWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSGKGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTKLEIKRGSENLYFQGGSGKPIPNPLLGLDSTGGSGGSHHHHHH 16
H4P-GGGGS-서열번호 1 MAWVWTLLFLMAAAQSIQA - HRRCNPNNKKR - GGGGS -EWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSGKGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTKLEIKRGSENLYFQGGSGKPIPNPLLGLDSTGGSGGSHHHHHH 17
LMWP-GGGGS-서열번호 1 MAWVWTLLFLMAAAQSIQA- VSRRRRRRGGRRRR - GGGGS -EWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSGKGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTKLEIKRGSENLYFQGGSGKPIPNPLLGLDSTGGSGGSHHHHHH 18
hBD3-3-GGGGS-서열번호 1 MAWVWTLLFLMAAAQSIQA - GKCSTRGRKCCRRKK - GGGGS -EWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSGKGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTKLEIKRGSENLYFQGGSGKPIPNPLLGLDSTGGSGGSHHHHHH 19
서열번호 2-GGGGS-H4K MAQVKLQESGPELVRPGTSVKVSCKASGYAFTNYLIEWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTK - GGGGS - HRRCNKNNKKR - LEIKRLEHHHHHH 20
서열번호 2-GGGGS-H4P MAQVKLQESGPELVRPGTSVKVSCKASGYAFTNYLIEWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTK - GGGGS - HRRCNPNNKKR - LEIKRLEHHHHHH 21
서열번호 2-GGGGS-LMWP MAQVKLQESGPELVRPGTSVKVSCKASGYAFTNYLIEWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTK - GGGGS - VSRRRRRRGGRRRR -LEIKRLEHHHHHH 22
서열번호 2-GGGGS-hBD3-3 MAQVKLQESGPELVRPGTSVKVSCKASGYAFTNYLIEWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTK - GGGGS - GKCSTRGRKCCRRKK - LEIKRLEHHHHHH 23
H4K-GGGGS-서열번호 2 MAQVKLQESGPELVRPGTSVKVSCKASGYAFTNYLI - HRRCNKNNKKR - GGGGS -EWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSGKGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTKLEIKRLEHHHHHH 24
H4P-GGGGS-서열번호 2 MAQVKLQESGPELVRPGTSVKVSCKASGYAFTNYLI - HRRCNPNNKKR - GGGGS -EWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSGKGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTKLEIKRLEHHHHHH 25
LMWP-GGGGS-서열번호 2 MAQVKLQESGPELVRPGTSVKVSCKASGYAFTNYLI- VSRRRRRRGGRRRR - GGGGS -EWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSGKGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTKLEIKRLEHHHHHH 26
hBD3-3-GGGGS-서열번호 2 MAQVKLQESGPELVRPGTSVKVSCKASGYAFTNYLI - GKCSTRGRKCCRRKK - GGGGS -EWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSGKGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTKLEIKRLEHHHHHHH 27
실시예 1-2: 동물세포(mammalian cell)에서 암세포 투과능을 가진 KRAS 돌연변이를 타겟으로 하는 scFv의 발현
동물세포에서 사용할 KRAS mutant scFv, 암세포 투과능 펩타이드가 도입된 KRAS mutant scFv 발현 백터를 각각 특이적인 프라이머를 이용하여 PCR 방법으로 제작하였다.
동물세포 발현을 위해 pcDNA3.4-TOPO 벡터에 클로닝된 암세포 투과 기능성 펩타이드와 KRAS 돌연변이 scFv가 연결된 융합 단백질의 아미노산 서열은 다음 표 3과 같다.
융합 단백질 아미노산 서열 서열번호
서열번호 1-GGGGS-H4K MAWVWTLLFLMAAAQSIQAEWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSGKGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTK - GGGGS - HRRCNKNNKKR -LEIKRGSENLYFQGGSGKPIPNPLLGLDSTGGSGGSHHHHHH 28
서열번호 1-GGGGS-H4P MAWVWTLLFLMAAAQSIQAEWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSGKGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTK - GGGGS - HRRCNPNNKKR -LEIKRGSENLYFQGGSGKPIPNPLLGLDSTGGSGGSHHHHHH 29
서열번호 1-GGGGS-LMWP MAWVWTLLFLMAAAQSIQAEWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSGKGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTK - GGGGS - VSRRRRRRGGRRRR-LEIKRGSENLYFQGGSGKPIPNPLLGLDSTGGSGGSHHHHHH 30
서열번호 1-GGGGS-hBD3-3 MAWVWTLLFLMAAAQSIQAEWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSGKGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTK - GGGGS - GKCSTRGRKCCRRKK - LEIKRGSENLYFQGGSGKPIPNPLLGLDSTGGSGGSHHHHHH 31
H4K-GGGGS-서열번호 1 MAWVWTLLFLMAAAQSIQA - HRRCNKNNKKR - GGGGS -EWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSGKGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTKLEIKRGSENLYFQGGSGKPIPNPLLGLDSTGGSGGSHHHHHH 32
H4P-GGGGS-서열번호 1 MAWVWTLLFLMAAAQSIQA - HRRCNPNNKKR - GGGGS -EWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSGKGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTKLEIKRGSENLYFQGGSGKPIPNPLLGLDSTGGSGGSHHHHHH 33
LMWP-GGGGS-서열번호 1 MAWVWTLLFLMAAAQSIQA- VSRRRRRRGGRRRR - GGGGS -EWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSGKGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTKLEIKRGSENLYFQGGSGKPIPNPLLGLDSTGGSGGSHHHHHH 34
hBD3-3-GGGGS-서열번호 1 MAWVWTLLFLMAAAQSIQA - GKCSTRGRKCCRRKK - GGGGS -EWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSGKGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTKLEIKRGSENLYFQGGSGKPIPNPLLGLDSTGGSGGSHHHHHH 35
서열번호 2-GGGGS-H4K MAQVKLQESGPELVRPGTSVKVSCKASGYAFTNYLIEWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTK - GGGGS - HRRCNKNNKKR - LEIKRLEHHHHHH 36
서열번호 2-GGGGS-H4P MAQVKLQESGPELVRPGTSVKVSCKASGYAFTNYLIEWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTK - GGGGS - HRRCNPNNKKR - LEIKRLEHHHHHH 37
서열번호 2-GGGGS-LMWP MAQVKLQESGPELVRPGTSVKVSCKASGYAFTNYLIEWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTK - GGGGS - VSRRRRRRGGRRRR -LEIKRLEHHHHHH 38
서열번호 2-GGGGS-hBD3-3 MAQVKLQESGPELVRPGTSVKVSCKASGYAFTNYLIEWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTK - GGGGS - GKCSTRGRKCCRRKK - LEIKRLEHHHHHH 39
H4K-GGGGS-서열번호 2 MAQVKLQESGPELVRPGTSVKVSCKASGYAFTNYLI - HRRCNKNNKKR - GGGGS -EWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSGKGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTKLEIKRLEHHHHHH 40
H4P-GGGGS-서열번호 2 MAQVKLQESGPELVRPGTSVKVSCKASGYAFTNYLI - HRRCNPNNKKR - GGGGS -EWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSGKGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTKLEIKRLEHHHHHH 41
LMWP-GGGGS-서열번호 2 MAQVKLQESGPELVRPGTSVKVSCKASGYAFTNYLI- VSRRRRRRGGRRRR - GGGGS -EWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSGKGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTKLEIKRLEHHHHHH 42
hBD3-3-GGGGS-서열번호 2 MAQVKLQESGPELVRPGTSVKVSCKASGYAFTNYLI - GKCSTRGRKCCRRKK - GGGGS -EWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSGKGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTKLEIKRLEHHHHHHH 43
동물세포 발현을 위해 pcDNA3.1-TOPO 벡터에 클로닝된 암세포 투과 기능성 펩타이드와 KRAS 돌연변이 scFv가 연결된 융합 단백질의 아미노산 서열은 다음 표 4와 같다.
융합 단백질 아미노산 서열 서열번호
서열번호 1-GGGGS-H4K MAWVWTLLFLMAAAQSIQAEWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSGKGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTK - GGGGS - HRRCNKNNKKR -LEIKRGSENLYFQGGSGKPIPNPLLGLDSTGGSGGSHHHHHH 44
서열번호 1-GGGGS-H4P MAWVWTLLFLMAAAQSIQAEWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSGKGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTK - GGGGS - HRRCNPNNKKR -LEIKRGSENLYFQGGSGKPIPNPLLGLDSTGGSGGSHHHHHH 45
서열번호 1-GGGGS-LMWP MAWVWTLLFLMAAAQSIQAEWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSGKGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTK - GGGGS - VSRRRRRRGGRRRR-LEIKRGSENLYFQGGSGKPIPNPLLGLDSTGGSGGSHHHHHH 46
서열번호 1-GGGGS-hBD3-3 MAWVWTLLFLMAAAQSIQAEWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSGKGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTK - GGGGS - GKCSTRGRKCCRRKK - LEIKRGSENLYFQGGSGKPIPNPLLGLDSTGGSGGSHHHHHH 47
H4K-GGGGS-서열번호 1 MAWVWTLLFLMAAAQSIQA - HRRCNKNNKKR - GGGGS -EWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSGKGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTKLEIKRGSENLYFQGGSGKPIPNPLLGLDSTGGSGGSHHHHHH 48
H4P-GGGGS-서열번호 1 MAWVWTLLFLMAAAQSIQA - HRRCNPNNKKR - GGGGS -EWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSGKGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTKLEIKRGSENLYFQGGSGKPIPNPLLGLDSTGGSGGSHHHHHH 49
LMWP-GGGGS-서열번호 1 MAWVWTLLFLMAAAQSIQA- VSRRRRRRGGRRRR - GGGGS -EWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSGKGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTKLEIKRGSENLYFQGGSGKPIPNPLLGLDSTGGSGGSHHHHHH 50
hBD3-3-GGGGS-서열번호 1 MAWVWTLLFLMAAAQSIQA - GKCSTRGRKCCRRKK - GGGGS -EWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSGKGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTKLEIKRGSENLYFQGGSGKPIPNPLLGLDSTGGSGGSHHHHHH 51
서열번호 2-GGGGS-H4K MAQVKLQESGPELVRPGTSVKVSCKASGYAFTNYLIEWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTK - GGGGS - HRRCNKNNKKR - LEIKRLEHHHHHH 52
서열번호 2-GGGGS-H4P MAQVKLQESGPELVRPGTSVKVSCKASGYAFTNYLIEWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTK - GGGGS - HRRCNPNNKKR - LEIKRLEHHHHHH 53
서열번호 2-GGGGS-LMWP MAQVKLQESGPELVRPGTSVKVSCKASGYAFTNYLIEWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTK - GGGGS - VSRRRRRRGGRRRR -LEIKRLEHHHHHH 54
서열번호 2-GGGGS-hBD3-3 MAQVKLQESGPELVRPGTSVKVSCKASGYAFTNYLIEWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTK - GGGGS - GKCSTRGRKCCRRKK - LEIKRLEHHHHHH 55
H4K-GGGGS-서열번호 2 MAQVKLQESGPELVRPGTSVKVSCKASGYAFTNYLI - HRRCNKNNKKR - GGGGS -EWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSGKGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTKLEIKRLEHHHHHH 56
H4P-GGGGS-서열번호 2 MAQVKLQESGPELVRPGTSVKVSCKASGYAFTNYLI - HRRCNPNNKKR - GGGGS -EWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSGKGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTKLEIKRLEHHHHHH 57
LMWP-GGGGS-서열번호 2 MAQVKLQESGPELVRPGTSVKVSCKASGYAFTNYLI- VSRRRRRRGGRRRR - GGGGS -EWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSGKGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTKLEIKRLEHHHHHH 58
hBD3-3-GGGGS-서열번호 2 MAQVKLQESGPELVRPGTSVKVSCKASGYAFTNYLI - GKCSTRGRKCCRRKK - GGGGS -EWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSGKGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTKLEIKRLEHHHHHHH 59
동물세포 발현을 위해 pcDNA3.4-TOPO 벡터에 클로닝된 암세포 투과 기능성 펩타이드와 KRAS 돌연변이 scFv가 연결된 융합 단백질의 아미노산 서열은 다음 표 5와 같다.
융합 단백질 아미노산 서열 서열번호
서열번호 2-GGGGSGGGGSGGGGS -H4K MAQVKLQESGPELVRPGTSVKVSCKASGYAFTNYLIEWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTK - GGGGSGGGGSGGGGS - HRRCNKNNKKR - LEIKRLEHHHHHH 90
서열번호 2-GGGGSGGGGSGGGGS -H4P MAQVKLQESGPELVRPGTSVKVSCKASGYAFTNYLIEWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTK- GGGGSGGGGSGGGGS - HRRCNPNNKKR - LEIKRLEHHHHHH 91
서열번호 2-GGGGSGGGGSGGGGS -LMWP MAQVKLQESGPELVRPGTSVKVSCKASGYAFTNYLIEWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTK - GGGGSGGGGSGGGGS - VSRRRRRRGGRRRR- LEIKRLEHHHHHH 92
서열번호 2-GGGGSGGGGSGGGGS -hBD3-3 MAQVKLQESGPELVRPGTSVKVSCKASGYAFTNYLIEWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTK - GGGGSGGGGSGGGGS - GKCSTRGRKCCRRKK - LEIKRLEHHHHHH 93
pcDNA3.1-TOPO 또는 pcDNA3.4-TOPO를 EcoR I과 BamH I으로 절단하여, 900-960 bp의 KRAS mutant scFv 유전자 단편을 아가로스 전기 용출(agarose electro elution) 방법으로 회수하였다. 이를 pcDNA3.1-TOPO 및 pcDNA3.4-TOPO 벡터에 삽입하기 위하여 PCR을 통해 유전자를 증폭시켰으며, 동시에 BamH I과 EcoR I 제한효소 사이트를 합성하였다. 각각의 절단된 벡터와 인서트를 4 μl와 4 μl의 비율로 혼합하였고, Tris-HCl 500 mM, MgCl2 100 mM, DTT 200 mM, ATP 10 mM 조성의 라이게이션 완충 용액에서 T4 DNA 리가아제를 사용하여, 4℃에서 16-18시간 동안 반응시켰다.
본 발명자들은 제조된 벡터를 중국 햄스터 난소 세포주 Expi-CHO-S와 인체 배아 신장세포주 Expi-293F에 형질전환시켰다. 중국 햄스터 난소 세포주 ExpiCHO-S는 Thermo Fisher Scientific (USA)에서 제공받았고, ExpiCHO Expression medium(GIBCO, USA) 배지에서 배양하였다.
이후 ExpiCHO-S 세포주(3X108 cells)를 250 mL disposable Erlenmeyer flask에 50 mL의 배양액에 깔아주었다. 50 μg의 플라스미드가 들어있는 2 mL의 Opti-MEM에 1.84 mL의 Opti-MEM에 희석한 ExpiFectamine CHO Reagent (Gibco, Cat # A20130) 160 μL를 혼합하여 상온에서 5분간 정지 반응시킨 후, 준비된 중국 햄스터 난소 세포에 골고루 점적하고, 18시간 동안 37 ℃8 % CO2 항온기에서 배양한 후, ExpiCHO enhancer 300 μL와 ExpiCHO Feed 12 mL을 추가하여 5일동안 배양하였다.
인체 배아 신장세포주 Expi-293F는 Thermo Fisher Scientific (USA)에서 제공받았고, Expi293 Expression medium(GIBCO, USA) 배지에서 배양하였다. 이후 Expi-293F 세포주 (1.50X107 cells)를 250 mL disposable Erlenmeyer flask에 50 mL의 배양액에 깔아주었다. 50 μg의 플라스미드가 들어있는 3 mL의 Opti-MEM에 2.8 mL의 Opti-MEM에 희석한 ExpiFectamine 293 Reagent (Gibco, Cat # A14525) 160 μL를 혼합하여 상온에서 20분간 정지 반응시킨 후, 준비된 인체 배아 신장 세포에 골고루 점적하고, 18시간 동안 37 ℃8 % CO2 항온기에서 배양하였다. 이후 ExpiFectamine 293 transfection enhancer 1 300 μL와 ExpiFectamine 293 transfection enhancer 2 3 mL을 추가하여 3일동안 배양하였다.
형질도입(transfection) 이후 6일 후, 배양 배지를 수집하여, 제균 후 FPLC를 사용하여 정제를 하였다. 컬럼은 니켈 크로마토그래피 (HisTrapTM excel, GE healthcare)를 사용하여 분리 정제되었으며 다음 [20mM sodium phosphate, 0.5M NaCl, pH7.4] 조건의 버퍼로 니켈 컬럼을 미리 적셔 균등하게 해준 후 배지를 적용시켰다. 25mM의 이미다졸(imidazole)이 포함되어 있는 위 버퍼를 이용하여 세척을 진행한 후 이미다졸을 125mM로 증가시켜 단백질을 분리하였다. 분리된 단백질을 모아서 desalting을 통해 이미다졸을 제거하여 보관하였다.
도3 (B)는 pcDNA3.4-TOPO, ((C)는 pcDNA3.1-TOPO에서 발현되어 정제된 암세포 투과능을 가진 KRAS 돌연변이를 타겟으로 하는 항체 또는 단일가닥 가변 단편의 SDS-PAGE와 western blot 결과이다.
실시예 2: 암세포 투과능 펩타이드와 항KRAS 돌연변이 단일가닥 가변단편 (scFv)의 화학적 결합에 의한 제작
실시예 2-1: 세포투과성 펩타이드의 합성
화학적 결합법에 사용되는 암세포 투과 기능성 펩타이드와 링커의 아미노산 서열은 표 6과 같다.
linker 종류 암세포 투과 기능성 펩타이드 (CCPP) linker와 암세포 투과 기능성 펩타이드의 아미노산 서열 및 서열번호
CGGGGG CCPP1 (H4K) 60: CGGGGG- HRRCNKNNKKR
CCPP2 (H4P) 61: CGGGGG- HRRCNPNNKKR
CCPP3 (LMWP) 62: CGGGGG- VSRRRRRRGGRRRR
CCPP4 (hBD3-3) 63: CGGGGG- GKCSTRGRKCCRRKK
CGGGGGSSGGGGG CCPP1 (H4K) 64: CGGGGGSSGGGGG- RKKNNKNCRRH
CCPP2 (H4P) 65: CGGGGGSSGGGGG- RKKNNPNCRRH
CCPP3 (LMWP) 66: CGGGGGSSGGGGG-RRRRGGRRRRRRSV
CCPP4 (hBD3-3) 67: CGGGGGSSGGGGG- GKCSTRGRKCCRRKK
아미노산 및 합성에 필요한 시약은 GL biochem과 Sigma-Aldirich에서 구입하였다. 펩타이드를 반응용기를 이용하여 C 말단으로부터 F-moc 고체상 화학합성방법으로 합성하였다. 즉, 블로킹 그룹(Blocking group)으로 Fmoc-(9-Fluorenylmethoxycarbonyl)이 결합된 Rink amide MBHA resin (0.678mmol/g, 100 ~ 200 mesh)을 사용하여 합성하였으며, 반응 용기에 1g의 Rink amide MBHA resin을 넣은 뒤 DMF로 resin을 스웰링(swelling) 시킨 후 Fmoc-group의 제거를 위해 20% piperidine/DMF 용액을 사용하였다. C 말단부터 서열대로 0.5M amino acid 용액(용매: 디메틸포름아마이드, DMF), 1.0M DIPEA(용매: 디메틸포름아마이드&엔메틸피롤리돈, DMF&NMP), 0.5M HBTU (용매: 디메틸포름아마이드, DMF)를 각각 5, 10, 5 당량씩 넣어 질소 기류하에서 1~2시간 동안 반응시켰다. 상기 디프로텍션(deprotection)과 커플링(coupling) 단계가 끝날 때마다 DMF와 methanol로 3번 세척하는 과정을 거쳤다. 마지막 아미노산을 커플링(coupling) 시킨 후에도 디프로텍션(deprotection)을 해주어 Fmoc-group을 제거하였다.
합성의 확인은 닌하이드린 테스트(ninhydrin test) 방법을 이용하였고, 테스트를 거치고 합성이 완료된 레진(resin)은 진공건조시킨 후 트리플루오로아세트산 (TFA) cleavage cocktail을 resin 1g 당 10ml의 비율로 넣어 3시간 shaking 시킨 후 필터링을 통해 resin과 펩타이드가 녹아 있는 cocktail을 분리하였다. 필터로 걸러진 용액을 콜드 에테르(cold ether)에 넣어주거나 펩타이드가 녹아있는 TFA cocktail 용액에 직접 콜드 에테르를 과량 넣어주어 펩타이드를 고체상으로 결정화시키고 이를 원심분리하여 분리 하였다. 이때 에테르(ether)로 여러 번 세척과 원심분리 과정을 거쳐 TFA cocktail을 완전히 제거하였다. 이렇게 해서 얻어진 펩타이드를 진공 건조 하였다.
합성된 펩타이드는 고성능 액체크로마토그래피 (Shimadzu, Japan) 에 의해 분리, 정제하였다. 직경 4.6mm의 C18 컬럼을 이용하여 유속 1ml/min으로 0.1% TFA/H2O 와 0.1% TFA/아세토나이트릴 (acetonitrile)를 5~45%의 변화를 주면서 40분간 흘려주는 방법으로 분석하였으며, 이때 자외선 검출기의 파장은 220nm로 하였다. 정제는 직경 50mm의 컬럼을 이용하여 유속 50ml/min으로 용매와 검출 파장을 같은 조건으로 실시하였다. 정제된 펩타이드의 분자량을 Mass spectrometry를 통해 확인하였다.
실시예 2-2: KRAS 돌연변이를 타겟하는 scFv의 linker 부분에 암세포 투과능을 가진 펩타이드의 화학결합 및 정제
서열번호 1의 1.02mg KRAS scFv을 1mL PBS buffer (pH 8.3)에 용해하였다. 2.12mg SPDP (succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate, ThermoFisher, 21857)을 120uL DMSO (Dimethyl sulfoxide)에 용해하였다. KRAS scFv 용액에 40uL SPDP 용액을 첨가하고, 1시간 동안 차광시켜 반응하는 것을 3회 반복하였다. 또는 2mg sulfo-SMCC (succinimidyl 4-[N-maleimidomethyl]cyclohexane-1-carboxylate, ThermoFisher, 22322)을 PBS에 용해하였다. KRAS scFv 용액에 40uL sulfo-SMCC 용액을 첨가하고, 1시간 동안 차광시켜 반응하는 것을 3회 반복하였다.
반응이 종결되면 PD-10 Desalting Column (GE healthcare)을 사용하여 Desalting을 진행하고, 3.5mL의 pyridyldithiol activated KRAS scFv를 수득하였다. 여기에 3차 정제수 300μL에 2.5mg Cys-G5-H4K (서열번호 60), Cys-G5-H4P (서열번호 61), Cys-G5-LMWP (서열번호 62), Cys-G5-hBD3-3 (서열번호 63), Cys-G5S2G5-H4K(서열번호 64), Cys-G5S2G5-H4P (서열번호 65), Cys-G5S2G5-LMWP (서열번호 66), Cys-G5S2G5-hBD3-3 (서열번호 67) 용액을 각각 혼합하고, 1M tris buffer (pH=9)를 사용하여 pH8.3으로 조정하였다. 차광 후 4℃에서 혼합하면서 overnight 반응시켰다. FPLC (Akta Pure, GE healthcare)로 heparin column (HiTrap, GE Healthcare)을 사용하여 암세포 투과능을 가진 펩타이드가 결합된 KRAS 돌연변이 scFv를 정제하였다.
서열번호 1의 1.02mg scFv을 1mL PBS buffer (pH 7.4)에 용해하였다. 2.98mg Sulfo-SMCC (sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carbocylate, ThermoFisher, catalog 22322)을 300μL 3차 정제수에 용해하였다. scFv 용액에 100μL Sulfo-SMCC 용액을 첨가하고, 30분 동안 차광시켜 반응하는 것을 3회 반복하였다. 반응이 종결되면 PD-10 Desalting Column (GE healthcare, 17-0851-01)을 사용하여 Desalting을 진행하고, 3.5mL의 Maleimide activated scFv를 수득하였다. 여기에 PBS buffer (pH 8.3) 300μL에 2.5mg Cys-G5-H4K (서열번호 60), Cys-G5-H4P (서열번호 61), Cys-G5-LMWP (서열번호 62), Cys-G5-hBD3-3 (서열번호 63), Cys-G5S2G5-H4K (서열번호 64), Cys-G5S2G5-H4P (서열번호 65), Cys-G5S2G5-LMWP (서열번호 66), Cys-G5S2G5-hBD3-3 (서열번호 67) 용액을 각각 혼합하고, pH 7.0~7.5으로 조정하였다. 차광 후 4℃에서 혼합하면서 overnight 반응시켰다. FPLC (Akta Pure, GE healthcare)로 heparin column (HiTrap, GE Healthcare)을 사용하여 암세포 투과능을 가진 펩타이드가 결합된 scFv를 정제하였다.
도 4는 화학적 결합방법으로 제조된 암세포 투과능을 가진 KRAS 돌연변이를 타겟으로 하는 항체 또는 단일가닥 가변 단편의 SDS-PAGE와 western blot 이다.
서열번호 1의 KRAS 돌연변이 scFv의 분자량이 약 30kDa이고, 암세포 투과능 펩타이드가 결?d된 KRAS 돌연변이 scFv의 분자량은 약 32kDa 으로 측정되었다. 또한, western blot에서 KRAS antibody와 결합되어 나온 밴드의 분자량 역시 서열번호 1의 scFv의 경우, 30kDa에서, 암세포 투과능 펩타이드가 결합된 경우 약 32kDa에서 측정되어, scFv에 펩타이드가 결합되어 있음을 확인하였다.
실시예 2-3: KRAS 돌연변이 scFv의 C 말단 부분에 암세포 투과능 펩타이드의 화학결합 및 정제
서열번호 3의 KRAS 돌연변이 scFv를 20 molar equivalents tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)를 상온에서 3 시간 동안 반응시켜 Free thiol기를 형성시켰다. KRAS 돌연변이 scFv 용액에 100 molar equivalents 5,50-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) (DTNB)를 가하여 상온에서 1시간 동안 반응시켜, free thiol기에 결합시켰다. KRAS 돌연변이 scFv와 결합하지 않은 과량의 DTNB는 FPLC (Akta Pure, GE healthcare)로 heparin column (HiTrap, GE Healthcare)을 사용하여 제거하였다. 그 후, KRAS 돌연변이 scFv-DTNB conjugates은 10 molar equivalents의 암세포 투과능 펩타이드 (서열번호 60-67)와 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. FPLC (Akta Pure, GE healthcare)로 heparin column (HiTrap, GE Healthcare)을 사용하여 암세포 투과능 펩타이드가 결합된 KRAS 돌연변이 scFv를 정제하였다.
화학적 결합법에 의해 생성된 암세포 투과 기능성 펩타이드와 KRAS 돌연변이 scFv가 연결된 융합 단백질의 아미노산 서열은 표 7과 같다.
서열번호 1의 scFv 및 암세포 투과 기능성 펩타이드의 결합체의 서열번호 서열번호 3의 scFv 및 암세포 투과 기능성 펩타이드의 결합체의 서열번호
68: MAWVWTLLFLMAAAQSIQAEWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSG K- CGGGGG-HRRCNKNNKKR-GGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTKLEIKRGSENLYFQGGSGKPIPNPLLGLDSTGGSGGSHHHHHH
scFv의 Linker 부분 lysine의 amine group에 CGGGGG- HRRCNKNNKKR를 연결
Figure pat00001
 76: MAWVWTLLFLMAAAQSIQAEWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSGKGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTK C- CGGGGG-HRRCNKNNKKR-LEIKRGSENLYFQGGSGKPIPNPLLGLDSTGGSGGSHHHHHH
C 말단 부분의 cysteine의 SH group에 CGGGGG- HRRCNKNNKKR를 연결
Figure pat00002
69: MAWVWTLLFLMAAAQSIQAEWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSG K- CGGGGG-HRRCNPNNKKR-GGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTKLEIKRGSENLYFQGGSGKPIPNPLLGLDSTGGSGGSHHHHHH
scFv의 Linker 부분 lysine의 amine group에 CGGGGG- HRRCNPNNKKR를 연결
Figure pat00003
 77: MAWVWTLLFLMAAAQSIQAEWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSGKGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTK C- CGGGGG-HRRCNPNNKKR-LEIKRGSENLYFQGGSGKPIPNPLLGLDSTGGSGGSHHHHHH
C 말단 부분의 cysteine의 SH group에 CGGGGG- HRRCNPNNKKR를 연결
Figure pat00004
70: MAWVWTLLFLMAAAQSIQAEWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSG K- CGGGGG-VSRRRRRRGGRRRR-GGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTKLEIKRGSENLYFQGGSGKPIPNPLLGLDSTGGSGGSHHHHHH
scFv의 Linker 부분 lysine의 amine group에 CGGGGG- VSRRRRRRGGRRRR를 연결
Figure pat00005
 78: MAWVWTLLFLMAAAQSIQAEWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSGKGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTK C- CGGGGG-VSRRRRRRGGRRRR-LEIKRGSENLYFQGGSGKPIPNPLLGLDSTGGSGGSHHHHHH
C 말단 부분의 cysteine의 SH group에 CGGGGG- VSRRRRRRGGRRRR를 연결
Figure pat00006
71: MAWVWTLLFLMAAAQSIQAEWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSG K- CGGGGG-GKCSTRGRKCCRRKK-GGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTKLEIKRGSENLYFQGGSGKPIPNPLLGLDSTGGSGGSHHHHHH
scFv의 Linker 부분 lysine의 amine group에 CGGGGG- GKCSTRGRKCCRRKK를 연결
Figure pat00007
 79: MAWVWTLLFLMAAAQSIQAEWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSGKGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTK C- CGGGGG-GKCSTRGRKCCRRKK-LEIKRGSENLYFQGGSGKPIPNPLLGLDSTGGSGGSHHHHHH
C 말단 부분의 cysteine의 SH group에 CGGGGG- GKCSTRGRKCCRRKK를 연결
Figure pat00008
72: MAWVWTLLFLMAAAQSIQAEWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSG K- CGGGGGSSGGGG-HRRCNKNNKKR-GGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTKLEIKRGSENLYFQGGSGKPIPNPLLGLDSTGGSGGSHHHHHH
scFv의 Linker 부분 lysine의 amine group에 CGGGGGSSGGGG- HRRCNKNNKKR를 연결
Figure pat00009
 80: MAWVWTLLFLMAAAQSIQAEWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSGKGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTK C- CGGGGGSSGGGG-HRRCNKNNKKR-LEIKRGSENLYFQGGSGKPIPNPLLGLDSTGGSGGSHHHHHH
C 말단 부분의 cysteine의 SH group에 CGGGGGSSGGGG- HRRCNKNNKKR를 연결
Figure pat00010
73: MAWVWTLLFLMAAAQSIQAEWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSG K- CGGGGGSSGGGGG-RKKNNPNCRRH-GGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTKLEIKRGSENLYFQGGSGKPIPNPLLGLDSTGGSGGSHHHHHH
scFv의 Linker 부분 lysine의 amine group에 CGGGGGSSGGGGG- RKKNNPNCRRH를 연결
Figure pat00011
 81: MAWVWTLLFLMAAAQSIQAEWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSGKGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTK C- CGGGGGSSGGGGG-RKKNNPNCRRH-LEIKRGSENLYFQGGSGKPIPNPLLGLDSTGGSGGSHHHHHH
C 말단 부분의 cysteine의 SH group에 CGGGGGSSGGGGG- RKKNNPNCRRH를 연결
Figure pat00012
74: MAWVWTLLFLMAAAQSIQAEWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSG K- CGGGGGSSGGGGG-RRRRGGRRRRRRSV-GGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTKLEIKRGSENLYFQGGSGKPIPNPLLGLDSTGGSGGSHHHHHH
scFv의 Linker 부분 lysine의 amine group에 CGGGGGSSGGGGG-RRRRGGRRRRRRSV를 연결
Figure pat00013
 82: MAWVWTLLFLMAAAQSIQAEWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSGKGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTK C- CGGGGGSSGGGGG-VSRRRRGGRRRRRRSV-LEIKRGSENLYFQGGSGKPIPNPLLGLDSTGGSGGSHHHHHH
C 말단 부분의 cysteine의 SH group에 CGGGGGSSGGGGG-VSRRRRGGRRRRRRSV를 연결
Figure pat00014
75: MAWVWTLLFLMAAAQSIQAEWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSG K- CGGGGGSSGGGGG-GKCSTRGRKCCRRKK-GGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTKLEIKRGSENLYFQGGSGKPIPNPLLGLDSTGGSGGSHHHHHH
scFv의 Linker 부분 lysine의 amine group에 CGGGGGSSGGGGG- GKCSTRGRKCCRRKK를 연결
Figure pat00015
 83: MAWVWTLLFLMAAAQSIQAEWIKQRPGQGLEWIGVIHPGNGGTNYNENFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCASGNDGSYWGQGTTVTVSSGGGGSGKGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGDQKIYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSVSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYNYPYTFGGGTK C- CGGGGGSSGGGGG-GKCSTRGRKCCRRKK-LEIKRGSENLYFQGGSGKPIPNPLLGLDSTGGSGGSHHHHHH
C 말단 부분의 cysteine의 SH group에 CGGGGGSSGGGGG-GKCSTRGRKCCRRKK를 연결
Figure pat00016
실시예 3: KRAS mutant 발현정도가 다른 암세포에 대한 억제능 확인
본 발명에 따른 암세포 투과능의 KRAS 돌연변이를 타겟으로 하는 항체 및 scFv의 암세포 특이적 증식 억제 정도를 확인하기 위하여, 96-웰(well)에 H358 (cancer cell expressing KRAS mutant), human dermal fibroblast (normal cell)을 5x103 cell/well로 분주한 후, RPMI medium 1640 (Gibco) 배지로 24시간 배양하였다. 각 scFv를 (서열번호 1, 28-35)는 5 μM의 농도로 처리하였다. 세포 독성은 CCK-8(Cell Counting Kit-8, CK04, Dojindo Lab.)을 이용하여 측정하였다. 각각의 융합체 처리 후 48시간 뒤에 배지를 제거하고, 새로운 RPMI medium 1640에 CCK-8 용액을 100 ㎕씩 분주하였다. 1시간 30분 뒤에 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 5에서와 같이 서열번호 28-31, 68, 69는 H358 세포에서 100-500nM의 IC50 (세포의 50%가 사멸하는 농도)를 보였으며, 서열번호 1은 농도가 5 μM에서도 IC50을 산출할 수 없었다. 이는 서열번호 1은 암세포를 투과하지 못하여 암세포 사멸의 효과를 보이지 않았으나, 서열번호 28-31, 68, 69는 암세포 투과 기능성이 있기 때문에 세포독성을 보인 것으로 사료된다. 정상세포인 human dermal fibroblast에서는 모든 농도에서 80% 이상의 세포생존률을 보였다. 이는 암세포 투과 기능성 KRAS 돌연변이를 타겟하는 scFv 융합체가 암세포 특이적으로 세포독성이 있는 것을 뜻한다.
실시예 4: 암세포 투과능을 가진 KRAS 돌연변이를 타겟으로 하는 항체 및 scFv에 의한 active KRAS (mutant KRAS)의 발현 저해능 평가
H358 세포 (ATCC, CRL-5807) 1.0 x 106 개를 시딩하고, 24시간 동안 RPMI Medium 1640(1X) 배지 (Gibco, 22400-089) 에서 배양한 후, 다시 16 시간 동안 starvation 시켰다. EGF (epithelial growth factor, R&D Systems. 236-EG) 50ng/mL을 10분 처리하고, 각 variant를 1 μM씩 처리하였다. 37도에서 24시간 배양하였다. 24시간 경과 후에 배지를 제거하고, DPBS로 wash한 후, 세포를 수득하여, 1500 rpm으로 3분 동안 원심분리하였다. 1x 용해 버퍼 (1X Lysis/Binding/Wach buffer, 11524S)를 150 μL 가하고, 혼합 후 얼음에서 5분간 반응하였다. 16,000 rpm, 4도, 15분 동안 원심분리하여 상층액을 분리하였다. BCA assay 로 단백질 농도를 측정 (Thermo scientific, 23227)하였다. 1x 용해 버퍼 400 μL 로 wash 하고, 원심분리 6000 xg, 15초로 2회 진행하였다.
Mutant KRAS를 분리하기 위해, Active GTPase Kit (Cell signaling, 11860S)를 사용하여 GST-Raf1-RBD 80 μg 을 넣고 500 μg 단백질을 스핀컵에 분주하였다. 4도에 1시간 반응하고, 6000 xg, 15초 원심분리 후, 새 튜브에 컬럼을 옮기고, 1x 용해 버퍼 400 μL를 가하였다. 6000 xg, 15초 원심분리 후, 새 튜브에 컬럼을 옮기고, 2x SDS buffer(5X SDS Sample loading dye 200ul, Water 300ul 혼합) 50 μL 분주 후 2분 반응하였다. 6000 xg, 2분 원심분리 후, 100도에 7분 가열하였다. 11% SDS-PAGE로 단백질 (단백질 loading volume 20ul/lane)을 전기영동으로 분리하고, nitrocellulose membrane에 transfer 하였다. KRAS의 하위 신호인 ERK1/2 를 측정하기 위해, 단백질은 30 μg 씩 11% SDS-PAGE로 전기영동하고, nitrocellulose membrane에 transfer 하였다. T-TBS에 녹인 5% skim milk로 1시간 블록킹하고, 1차 항체를 T-TBS에 1:1000으로 희석하여 4℃에서 inverting하면서 overnight 반응시켰다. T-TBS로 10분간 3번씩 세척하고, 2차 항체를 T-TBS에 1:3000으로 희석하여 상온에서 inverting하면서 1시간 동안 반응시켰다. T-TBS로 10분간 3번씩 세척한 후, ECL substrate (Thermo, 34580)로 화학발광을 하여 Amersham Imager 680 (GE)로 확인하였다. 사용된 항체의 정보는 아래 표 8과 같다.
사용된 항체
순서 항체 명 회사 명 카탈로그 번호
1 GST Abcam Ab19256
2 Active KRAS Santa cruz SC-30
3 RAS(E4K9L) Cell signaling 91054S
4 p-B-Raf(S445) Cell signaling 2696S
5 p-MEK1/2(S221) Cell signaling 2338S
6 p-Erk1/2 Santa cruz SC-7383
7 GAPDH Cell signaling 2118S
8 Goat anti-Rabbit IgG BETHYL A120-101P
9 Goat anti-Mouse IgG BETHYL A90-116P
서열번호 20-23은 KRAS 돌연변이를 타겟으로 하는 항체 및 scFv와 세포 투과 기능성 펩타이드 사이의 링커가 GGGGS이고, 서열번호 90-93은 링커가 GGGGSGGGGSGGGGS 이다.
그 결과, 도 6에서와 같이, 서열번호 20-23 모두 EGF만 처리하였을 때보다, active KRAS가 감소하였다. 또한, KRAS의 하위신호인 pERK1/2도 서열번호 20-23에 의해 감소한 것을 알 수 있었다.
도 7에서와 같이, 서열번호 90-93 모두 EGF만 처리하였을 때보다, active KRAS가 감소하였다. 또한, KRAS의 하위신호인 pERK1/2은 서열번호 91, 92에 의해 감소한 것을 알 수 있었다.
실시예 5: 암세포 투과능을 가진 KRAS 돌연변이를 타겟으로 하는 항체 및 scFv의 세포 투과능 평가
암세포 투과능을 시험하기 위해, H358 세포를 1X105으로 분주하고, 48시간 후에 서열번호 20-23를 각각 500nM로 가하고, 30분간 배양하였다. 4% paraformaldehyde로 고정하고, 0.1% Triton-X100으로 10분간 permeabilization한 후, 2% BSA로 블록킹하였다. 세포 내에 있는 KRAS는 anti-RAS antibody (Origene, cst53270)으로 1:1000의 비율로 반응하고, anti-Rabbit Alexa Fluor 488 (Invitrogen, A27034)로 1:2000으로 2차 반응하였다. 서열번호 20-23은 V5-Tag antibody (Origene, cst 13202)로 1:1000의 비율로 반응시키고, anti-mouse Alexa Fluor 555 (Invitrogene, A28180)로 1:1000의 비율로 반응시켰다. 세포핵은 0.1㎍/mL DAPI(Thermofisher, R37606)로 염색하였다. 세포 내에 투과된 서열번호 20-23을 공초점시차주사 현미경으로 측정하였다.
그 결과, 도 8에서와 같이, 서열번호 2를 제외하고, 서열번호 20-23은 모두 세포 안으로 투과된 것을 알 수 있었다. 또한, 암세포 내에 존재하는 KRAS와 co-localization 하고 있는 것을 알 수 있었다. 따라서, 서열번호 20-23은 세포 안으로 투과되어 세포 내에 존재하는 KRAS에 결합할 수 있다는 것을 알 수 있었다.
실시예 6: 암세포 투과능을 가진 KRAS 돌연변이를 타겟으로 하는 항체 및 scFv의 Tumor xenograft 동물 모델에서 암조직으로 분포 평가
5-6주령의 암컷 Balb/c nude mouse(5-6 weeks old; Japan SLC Inc, Hamamatsu, Japan) 의 대퇴부에 H358 세포 1X106와 Matrigel (BD Bioscience, San Diego, CA, USA) 100uL에 혼합한 것을 이식하고, 100mm3 크기의 종양이 형성되게 하였다. Cy5.5로 표지한 서열번호 2와 서열번호 23, Cy5.5을 마우스 당 20μg 용량으로 각각 복강에 주사하고, 24시간 후에 각 주요 장기와 암조직에 분포하는 형광을 관찰하였다.
그 결과, 도 9에서와 같이 서열번호 23은 주사 24시간 후에 암조직에 주로 분포하고, 일부는 신장으로 배설되는 것을 알 수 있었다.
또한, 도 10에서와 같이, 형광 강도를 측정하였을 때, 서열번호 23은 암조직에서 형광 강도가 가장 높은 것을 알 수 있었다.
실시예 7: 암세포 투과능을 가진 KRAS 돌연변이를 타겟으로 하는 항체 및 scFv의 Tumor xenograft 동물 모델에서 종양억제 평가
5-6주령의 암컷 Balb/c nude mouse(5-6 weeks old; Japan SLC Inc, Hamamatsu, Japan) 의 대퇴부에 H358 세포 1X106와 Matrigel (BD Bioscience, San Diego, CA, USA) 100uL에 혼합한 것을 이식하고, 100mm3 크기의 종양이 형성되게 하였다. 서열번호 2, 서열번호 23을 1mg/kg의 용량으로 각각 복강에 일주일에 2회씩 30일간 주사하였다. 3~4일 간격으로 종양의 크기를 버니어 캘리퍼로 측정하였고, 30일째에 마우스를 희생시켜 종양을 적출하여 적출된 종양을 사진 관찰하였다.
그 결과, 도 11 및 도 12에서와 같이 서열번호 2는 종양억제 효과가 없었으나, 서열번호 23은 종양억제 효과가 우수하였다. 이는 암조직으로 투과된 서열번호 23이 종양세포의 증식을 효과적으로 억제하는 것을 증명해준다.
실시예 8: 화학적 결합법에 의해 제조된 서열번호 80-83의 융합 단백질의 효과
실시예 8-1: 암세포 투과능의 KRAS 돌연변이를 타겟으로 하는 항체 및 scFv에 의한 active KRAS (mutant KRAS)의 발현 저해능 평가
H358 세포 (ATCC, CRL-5807) 1.0 x 106 개를 시딩하고, 24시간 동안 RPMI Medium 1640(1X) 배지 (Gibco, 22400-089) 에서 배양한 후, 다시 16 시간 동안 starvation 시켰다. EGF (epithelial growth factor, R&D Systems. 236-EG) 50ng/mL을 10분 처리하고, 각 variant를 1 μM씩 처리하였다. 37도에서 24시간 배양하였다. 24시간 경과 후에 배지를 제거하고, DPBS로 wash한 후, 세포를 수득하여, 1500 rpm으로 3분 동안 원심분리하였다. 1x 용해 버퍼 (1X Lysis/Binding/Wach buffer, 11524S)를 150 μL 가하고, 혼합 후 얼음에서 5분간 반응하였다. 16,000 rpm, 4도, 15분 동안 원심분리하여 상층액을 분리하였다. BCA assay 로 단백질 농도를 측정 (Thermo scientific, 23227)하였다. 1x 용해 버퍼 400 μL 로 wash 하고, 원심분리 6000 xg, 15초로 2회 진행하였다.
Mutant KRAS를 분리하기 위해, Active GTPase Kit (Cell signaling, 11860S)를 사용하여 GST-Raf1-RBD 80 μg 을 넣고 500 μg 단백질을 스핀컵에 분주하였다. 4도에 1시간 반응하고, 6000 xg, 15초 원심분리후, 새 튜브에 컬럼을 옮기고, 1x 용해 버퍼 400 μL를 가하였다. 6000 xg, 15초 원심분리 후, 새 튜브에 컬럼을 옮기고, 2x SDS buffer(5X SDS Sample loading dye 200ul, Water 300ul 혼합) 50 μL 분주 후 2분 반응하였다. 6000 xg, 2분 원심분리 후, 100도에 7분 가열하였다. 11% SDS-PAGE로 단백질 (단백질 loading volume 20ul/lane)을 전기영동으로 분리하고, nitrocellulose membrane에 transfer 하였다. KRAS의 하위 신호인 ERK1/2 를 측정하기 위해, 단백질은 30 μg 씩 11% SDS-PAGE로 전기영동하고, nitrocellulose membrane에 transfer 하였다. T-TBS에 녹인 5% skim milk로 1시간 블록킹하고, 1차 항체를 T-TBS에 1:1000으로 희석하여 4℃에서 inverting하면서 overnight 반응시켰다. T-TBS로 10분간 3번씩 세척하고, 2차 항체를 T-TBS에 1:3000으로 희석하여 상온에서 inverting하면서 1시간 동안 반응시켰다. T-TBS로 10분간 3번씩 세척한 후, ECL substrate (Thermo, 34580)로 화학발광을 하여 Amersham Imager 680 (GE)로 확인하였다. 사용된 항체의 정보는 아래 표와 같다.
사용된 항체
순서 항체 명 회사 명 카탈로그 번호
1 GST Abcam Ab19256
2 Active KRAS Santa cruz SC-30
3 RAS(E4K9L) Cell signaling 91054S
4 p-B-Raf(S445) Cell signaling 2696S
5 p-MEK1/2(S221) Cell signaling 2338S
6 p-Erk1/2 Santa cruz SC-7383
7 GAPDH Cell signaling 2118S
8 Goat anti-Rabbit IgG BETHYL A120-101P
9 Goat anti-Mouse IgG BETHYL A90-116P
서열번호 80-83은 KRAS 돌연변이를 타겟으로 하는 항체 및 scFv에 세포투과기능의 펩타이드를 화학적 결합으로 연결한 것이다. 그 결과, 도 13에서와 같이, 서열번호 80-83 모두 EGF만 처리하였을 때보다, active KRAS가 감소하였다. 또한, KRAS의 하위신호인 pERK1/2도 서열번호 80-83에 의해 감소한 것을 알 수 있었다.
실시예 8-2: 암세포 투과능을 가진 KRAS 돌연변이를 타겟으로 하는 항체 및 scFv의 KRAS mutant 발현정도가 다른 암세포에 대한 억제능 확인
본 발명에 따른 암세포 투과능의 KRAS 돌연변이를 타겟으로 하는 항체 및 scFv의 암세포 특이적 증식 억제 정도를 확인하기 위하여, 96-웰(well)에 H358 (cancer cell expressing KRAS mutant), human dermal fibroblast (normal cell)을 5x103 cell/well로 분주한 후, RPMI medium 1640 (Gibco) 배지로 24시간 배양하였다. 각 scFv를 (서열번호 3, 80-83)는 0에서 5 μM의 농도로 처리하였다. 세포 독성은 CCK-8(Cell Counting Kit-8, CK04, Dojindo Lab.)을 이용하여 측정하였다. 각각의 융합체 처리 후 48시간 뒤에 배지를 제거하고, 새로운 RPMI medium 1640에 CCK-8 용액을 100 ㎕씩 분주하였다. 1시간 30분 뒤에 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 14에서와 같이 서열번호 80-83은 H358 세포에서 313-1250nM의 IC50 (세포의 50%가 사멸하는 농도)를 보였으며, 서열번호 3은 농도가 5 μM에서도 IC50을 산출할 수 없었다. 이는 서열번호 3은 암세포를 투과하지 못하여 암세포 사멸의 효과를 보이지 않았으나, 서열번호 80-83는 암세포 투과 기능성이 있기 때문에 세포독성을 보인 것을 알 수 있다. 정상세포인 human dermal fibroblast에서는 모든 농도에서 80% 이상의 세포생존률을 보였다. 이는 암세포 투과 기능성 KRAS 돌연변이를 타겟하는 scFv 융합체가 암세포 특이적으로 세포독성이 있는 것을 뜻한다.
실시예 8-3: 암세포 투과능을 가진 KRAS 돌연변이를 타겟으로 하는 항체 및 scFv의 세포투과능 평가
암세포투과능을 시험하기 위해, H358 세포를 1X105으로 분주하고, 48시간 후에 서열번호 80-83를 각각 500nM로 가하고, 30분간 배양하였다. 4% paraformaldehyde로 고정하고, 0.1% Triton-X100으로 10분간 permeabilization한 후, 2% BSA로 블록킹하였다. 세포내에 있는 KRAS는 anti-RAS antibody (Origene, cst53270)으로 1:1000의 비율로 반응하고, anti-Rabbit Alexa Fluor 488 (Invitrogen, A27034)로 1:2000으로 2차 반응하였다. 서열번호 80-83은 V5-Tag antibody (Origene, cst 13202)로 1:1000의 비율로 반응시키고, anti-mouse Alexa Fluor 555 (Invitrogene, A28180)로 1:1000의 비율로 반응시켰다. 세포핵은 0.1㎍/mL DAPI(Thermofisher, R37606)로 염색하였다. 세포내에 투과된 서열번호 80-83을 공초점시차주사 현미경으로 측정하였다.
그 결과, 도 15에서와 같이, 서열번호 3를 제외하고, 서열번호 80-83은 모두 세포 안으로 투과된 것을 알 수 있었다. 또한, 암세포내에 존재하는 KRAS와 co-localization 하고 있는 것을 알 수 있었다. 따라서, 서열번호 80-83은 세포안으로 투과되어 세포내에 존재하는 KRAS에 결합할 수 있다는 것을 알 수 있었다.
실시예 8-4: 암세포 투과능을 가진 KRAS 돌연변이를 타겟으로 하는 항체 및 scFv의 Tumor xenograft 동물 모델에서 암조직으로 분포 평가
5-6주령의 암컷 Balb/c nude mouse(5-6 weeks old; Japan SLC Inc, Hamamatsu, Japan) 의 대퇴부에 H358 세포 1X106와 Matrigel (BD Bioscience, San Diego, CA, USA) 100uL에 혼합한 것을 이식하고, 100mm3 크기의 종양이 형성되게 하였다. Cy5.5로 표지한 서열번호 3와 서열번호 83, Cy5.5을 마우스 당 20μg 용량으로 각각 복강에 주사하고, 24시간 후에 각 주요 장기와 암조직에 분포하는 형광을 관찰하였다.
그 결과, 도 16에서와 같이 서열번호 83은 주사 24시간 후에 암조직에 주로 분포하고, 일부는 신장으로 배설되는 것을 알 수 있었다.
또한, 도 17에서와 같이, 형광 강도를 측정하였을 때, 서열번호 83은 암조직에서 형광 강도가 가장 높은 것을 알 수 있었다.
실시예 8-5: 암세포 투과능을 가진 KRAS 돌연변이를 타겟으로 하는 항체 및 scFv의 Tumor xenograft 동물 모델에서 종양억제 평가
5-6주령의 암컷 Balb/c nude mouse(5-6 weeks old; Japan SLC Inc, Hamamatsu, Japan) 의 대퇴부에 H358 세포 1X106와 Matrigel (BD Bioscience, San Diego, CA, USA) 100uL에 혼합한 것을 이식하고, 100mm3 크기의 종양이 형성되게 하였다. 서열번호 3, 서열번호 83을 1mg/kg의 용량으로 각각 복강에 일주일에 2회씩 30일간 주사하였다. 3~4일 간격으로 종양의 크기를 버니어 캘리퍼로 측정하였고, 30일째에 마우스를 희생시켜 종양을 적출하여 적출된 종양을 사진 관찰하였다.
그 결과, 도 18 및 도 19에서와 같이 서열번호 3은 종양억제 효과가 없었으나, 서열번호 83은 종양억제 효과가 우수하였다. 이는 암조직으로 투과된 서열번호 83이 종양세포의 증식을 효과적으로 억제하는 것을 증명해준다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> NIBEC Co., Ltd. <120> Fusion protein comprising antibody for targeting oncogenic protein or single chain fragment variable (scFv) thereof and cancer cell penetrating peptide and use of the same <130> P21-B195 <160> 93 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 271 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> KRAS mutant scfv <400> 1 Met Ala Trp Val Trp Thr Leu Leu Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser 1 5 10 15 Ile Gln Ala Glu Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp 20 25 30 Ile Gly Val Ile His Pro Gly Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Asn 35 40 45 Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala 50 55 60 Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Phe 65 70 75 80 Cys Ala Ser Gly Asn Asp Gly Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 85 90 95 Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Lys Gly Gly Ser Gly Gly 100 105 110 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro 115 120 125 Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys 130 135 140 Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asp Gln Lys Ile Tyr Leu Thr 145 150 155 160 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp 165 170 175 Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Val 180 185 190 Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp 195 200 205 Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Asp Tyr Asn Tyr Pro Tyr Thr Phe 210 215 220 Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Ser Glu Asn Leu Tyr 225 230 235 240 Phe Gln Gly Gly Ser Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu 245 250 255 Asp Ser Thr Gly Gly Ser Gly Gly Ser His His His His His His 260 265 270 <210> 2 <211> 254 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> KRAS mutant scfv <400> 2 Met Ala Gln Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro 1 5 10 15 Gly Thr Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr 20 25 30 Asn Tyr Leu Ile Glu Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Val Ile His Pro Gly Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu 50 55 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Artificial Sequence <220> <223> fusion peptide <400> 8 His Arg Arg Cys Asn Lys Asn Asn Lys Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 9 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion peptide <400> 9 His Arg Arg Cys Asn Pro Asn Asn Lys Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 10 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion peptide <400> 10 Val Ser Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Arg Arg Arg Arg Gly Gly 1 5 10 15 Gly Gly Ser <210> 11 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion peptide <400> 11 Gly Lys Cys Ser Thr Arg Gly Arg Lys Cys Cys Arg Arg Lys Lys Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 12 <211> 287 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion peptide <400> 12 Met Ala Trp Val Trp Thr Leu Leu Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser 1 5 10 15 Ile Gln Ala Glu Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp 20 25 30 Ile Gly Val Ile His Pro Gly Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Asn 35 40 45 Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp 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Lys Ile Tyr Leu Thr 145 150 155 160 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp 165 170 175 Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Val 180 185 190 Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp 195 200 205 Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Asp Tyr Asn Tyr Pro Tyr Thr Phe 210 215 220 Gly Gly Gly Thr Lys Cys Cys Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly 225 230 235 240 Gly Gly Gly Val Ser Arg Arg Arg Arg Gly Gly Arg Arg Arg Arg Arg 245 250 255 Arg Ser Val Leu Glu Ile Lys Arg Gly Ser Glu Asn Leu Tyr Phe Gln 260 265 270 Gly Gly Ser Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser 275 280 285 Thr Gly Gly Ser Gly Gly Ser His His His His His His 290 295 300 <210> 83 <211> 300 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion peptide <400> 83 Met Ala Trp Val Trp Thr Leu Leu Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser 1 5 10 15 Ile Gln Ala Glu Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp 20 25 30 Ile Gly Val Ile His Pro Gly Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Asn 35 40 45 Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala 50 55 60 Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Phe 65 70 75 80 Cys Ala Ser Gly Asn Asp Gly Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 85 90 95 Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Lys Gly Gly Ser Gly Gly 100 105 110 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro 115 120 125 Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys 130 135 140 Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asp Gln Lys Ile Tyr Leu Thr 145 150 155 160 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp 165 170 175 Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Val 180 185 190 Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp 195 200 205 Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Asp Tyr Asn Tyr Pro Tyr Thr Phe 210 215 220 Gly Gly Gly Thr Lys Cys Cys Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly 225 230 235 240 Gly Gly Gly Gly Lys Cys Ser Thr Arg Gly Arg Lys Cys Cys Arg Arg 245 250 255 Lys Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Ser Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly 260 265 270 Gly Ser Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr 275 280 285 Gly Gly Ser Gly Gly Ser His His His His His His 290 295 300 <210> 84 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 84 aaggagatat acatatgatg gcatgggttt ggac 34 <210> 85 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 85 agcccgaagg gaattcattt gcagatacaa agtgttttta gagttg 46 <210> 86 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H4K <400> 86 His Arg Arg Cys Asn Lys Asn Asn Lys Lys Arg 1 5 10 <210> 87 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H4P <400> 87 His Arg Arg Cys Asn Pro Asn Asn Lys Lys Arg 1 5 10 <210> 88 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LMWP <400> 88 Val Ser Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Arg Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 89 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hBD3-3 <400> 89 Gly Lys Cys Ser Thr Arg Gly 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Tyr Trp Ala Ser Thr Arg 180 185 190 Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Val Ser Gly Thr Asp 195 200 205 Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr 210 215 220 Tyr Cys Gln Asn Asp Tyr Asn Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr 225 230 235 240 Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 245 250 255 His Arg Arg Cys Asn Lys Asn Asn Lys Lys Arg Leu Glu Ile Lys Arg 260 265 270 Leu Glu His His His His His His 275 280 <210> 91 <211> 280 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion peptide <400> 91 Met Ala Gln Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro 1 5 10 15 Gly Thr Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr 20 25 30 Asn Tyr Leu Ile Glu Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Val Ile His Pro Gly Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu 50 55 60 Asn Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr 65 70 75 80 Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr 85 90 95 Phe Cys Ala Ser Gly Asn Asp Gly Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr 130 135 140 Val Thr Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser 145 150 155 160 Leu Leu Asn Ser Gly Asp Gln Lys Ile Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln 165 170 175 Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg 180 185 190 Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Val Ser Gly Thr Asp 195 200 205 Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr 210 215 220 Tyr Cys Gln Asn Asp Tyr Asn Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr 225 230 235 240 Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 245 250 255 His Arg Arg Cys Asn Pro Asn Asn Lys Lys Arg Leu Glu Ile Lys Arg 260 265 270 Leu Glu His His His His His His 275 280 <210> 92 <211> 283 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion peptide <400> 92 Met Ala Gln Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro 1 5 10 15 Gly Thr Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr 20 25 30 Asn Tyr Leu Ile Glu Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Val Ile His Pro Gly Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu 50 55 60 Asn Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr 65 70 75 80 Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr 85 90 95 Phe Cys Ala Ser Gly Asn Asp Gly Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr 130 135 140 Val Thr Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser 145 150 155 160 Leu Leu Asn Ser Gly Asp Gln Lys Ile Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln 165 170 175 Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg 180 185 190 Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Val Ser Gly Thr Asp 195 200 205 Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr 210 215 220 Tyr Cys Gln Asn Asp Tyr Asn Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr 225 230 235 240 Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 245 250 255 Val Ser Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Arg Arg Arg Arg Leu Glu 260 265 270 Ile Lys Arg Leu Glu His His His His His His 275 280 <210> 93 <211> 284 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion peptide <400> 93 Met Ala Gln Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro 1 5 10 15 Gly Thr Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr 20 25 30 Asn Tyr Leu Ile Glu Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Val Ile His Pro Gly Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu 50 55 60 Asn Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr 65 70 75 80 Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr 85 90 95 Phe Cys Ala Ser Gly Asn Asp Gly Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr 130 135 140 Val Thr Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser 145 150 155 160 Leu Leu Asn Ser Gly Asp Gln Lys Ile Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln 165 170 175 Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg 180 185 190 Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Val Ser Gly Thr Asp 195 200 205 Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr 210 215 220 Tyr Cys Gln Asn Asp Tyr Asn Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr 225 230 235 240 Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 245 250 255 Gly Lys Cys Ser Thr Arg Gly Arg Lys Cys Cys Arg Arg Lys Lys Leu 260 265 270 Glu Ile Lys Arg Leu Glu His His His His His His 275 280

Claims (16)

  1. (i) 세포내 종양 유발 단백질 또는 종양 유발 돌연변이 단백질을 타겟하는 항체 또는 이의 단일가닥 가변 단편과 (ii) 암세포 투과 기능성 펩타이드가 연결되어 있는 융합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 상기 세포내 종양 유발 단백질 또는 종양 유발 돌연변이 단백질은 KRAS 또는 안드로겐 수용체인, 융합 단백질.
  3. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단일가닥 가변 단편은 서열번호 1 내지 서열번호 3으로 구성된 군에서 선택되는 융합 단백질.
  4. 제1항에 있어서, 상기 암세포 투과 기능성 펩타이드는 서열번호 86 내지 서열번호 89로 구성된 군에서 선택되는 융합 단백질.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암세포 투과 기능성 펩타이드는 상기 항체 또는 이의 단일가닥 가변 단편의 N-말단 또는 C-말단에 링커를 통해 연결된 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  6. 제5항에 있어서, 상기 링커는 GGGGS 또는 GGGGSGGGGSGGGGS인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질은 서열번호 1 내지 서열번호 3으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 단일가닥 가변 단편의 라이신 또는 시스테인 잔기에 서열번호 86 내지 서열번호 89로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 암세포 투과 기능성 펩타이드가 링커를 통해 연결된 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  8. 제7항에 있어서, 상기 링커는 CGGGGG 또는 CGGGGGSSGGGGG인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  9. 제1항에 있어서, 상기 융합 단백질은 서열번호 12 내지 서열번호 59, 서열번호 68 내지 서열번호 83 및 서열번호 90 내지 서열번호 93 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  10. 제1항의 융합 단백질을 암호화하는 핵산.
  11. 제10항의 핵산이 도입되어 있는 재조합 벡터.
  12. 제11항의 재조합 벡터가 도입되어 있는 재조합 세포.
  13. 제12항에 있어서, 상기 재조합 세포는 대장균 또는 포유동물 세포인 것을 특징으로 하는 재조합 세포.
  14. 다음 단계를 포함하는 제1항의 융합 단백질을 제조하는 방법:
    (a) 제12항의 재조합 세포를 배양하여 제1항의 융합 단백질을 발현시키는 단계; 및
    (b) 상기 발현된 융합 단백질을 회수하는 단계.
  15. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 종양 치료용 약학적 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 종양은 비소세포폐암, 대장암, 췌장암, 방광암, 신장암, 갑상선암, 유방암, 결장암, 간암, 뇌종양, 피부암, 흑색종, 대장암, 전립선 암및 혈액암으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 종양 치료용 약학적 조성물.
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