JP2022533671A - 薬物複合体およびその使用方法 - Google Patents

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Abstract

複合体が提供される。特定の態様において、細胞表面分子に結合する操作されたループを含むノッティンペプチド、およびリンカーを介してノッティンペプチドにコンジュゲート化した抗微小管剤を含む薬物複合体が提供される。いくつかの態様において、細胞表面分子に結合する操作されたループを含むノッティンペプチドが抗体サブユニットまたはその断片に融合されたものを含む融合タンパク質を含む薬物複合体が提供される。そのような薬物複合体は、融合タンパク質にコンジュゲート化された薬物をさらに含む。本開示の複合体を含む組成物およびキットも提供される。複合体を、例えば治療目的で使用する方法も提供される。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１９年５月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／８５１，４４３号の利益を主張する。
癌の化学療法薬は、狭い治療ウィンドウ、つまり最小有効量（腫瘍を殺傷する）と最大耐量（重大な副作用を引き起こす）との間の差異によって制限されることがよくある。標的化ドラッグデリバリーは、標的外毒性を減少させながら、腫瘍での局所濃度を増加させる方法を提供する。抗体薬物複合体（ＡＤＣ：antibody-drug conjugate）は、標的化ドラッグデリバリーの主要な現在のプラットフォームを構成する。ＡＤＣは、血液腫瘍に対して実質的な臨床的成功を示しているが、多くの固形腫瘍やその他の困難な腫瘍標的、例えば脳腫瘍、膵臓腫瘍などに対する有効性は限られている。ＡＤＣは比較的高分子量（ＭＷ）であるため、固形腫瘍に均一に浸透する能力において妨げられている。固形腫瘍および他の困難な腫瘍標的に対する標的療法の有効性を改善するために、薬物動態が変化した代替の標的タンパク質が必要である。
複合体（conjugate）が提供される。特定の態様において、提供されるのは、細胞表面分子に結合する操作された（engineered）ループを含むノッティン（knottin）ペプチド、およびリンカーを介してノッティンペプチドに接合（コンジュゲート化）した抗微小管剤を含む薬物複合体である。いくつかの態様において、提供されるのは、細胞表面分子に結合する操作されたループを含むノッティンペプチドが抗体サブユニットまたはその断片に融合されたものを含む融合タンパク質を含む、薬物複合体である。そのような薬物複合体は、融合タンパク質にコンジュゲート化した薬物をさらに含む。本開示の複合体を含む組成物およびキットも提供される。複合体を使用する方法、例えば治療目的のための方法も提供される。
（ａ）細胞外で安定であり、細胞内在化時にカテプシンプロテアーゼを介して切断されるＭＭＡＥの誘導体であるＶａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥの概略図。（ｂ）本開示のいくつかの実施形態による、ＭＭＡＥ誘導体に接合したノッティン、ノッティン－Ｆｃ、およびノッティン－Ａｂ構築物の概略図。 ＥＥＴＩ２．５Ｆ、２．５Ｚ、および３ＣＭのアミノ酸配列。ＥＥＴＩ－２．５Ｆ、ＥＥＴＩ－２．５Ｚ、およびＥＥＴＩ３ＣＭの配列においてインテグリン結合ループと置換部位が赤で強調表示され、シスチンノット足場のジスルフィド結合が黄色で強調表示される。位置１５（赤Ｘ１）は、アジド含有非天然アミノ酸である５－アジド－ｌ－ノルバリンが存在する場所を示し、ＫＤＣの位置特異的バイオコンジュゲーションを可能にするために置換されている。位置３１（赤Ｘ２）は、ＵＶ－Ｖｉｓ分光法を使用した濃度測定の改善を可能にするためにフェニルアラニンがチロシンに置き換えられた部位を示している。 ２．５Ｆ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ ＫＤＣの調製。（ａ）Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥは、細胞外で安定であり細胞内在化時にカテプシンプロテアーゼを介して切断されることが知られているＭＭＡＥの誘導体である。（ｂ）ノッティン－薬物複合体（ＫＤＣ）は、固相ペプチド合成によって調製されたアジド－ノッティンから調製され、銅フリークリックケミストリーを使用してＶａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥに接合された５－アジドノルバリンを含む。 ＫおよびＫＤＣのＬＣ－ＭＳおよびＵＶクロマトグラム。３ＣＭノッティンペプチド（Ｋ）の（ａ）ＵＶクロマトグラムおよび（ｂ）ＬＣ－ＭＳ。本方法は、１６分間での１０％から４６％への溶媒Ｂの直線的グラジエントで構成される。３ＣＭ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥノッティン－薬物複合体（ＫＤＣ）の（ｃ）ＵＶクロマトグラムおよび（ｄ）ＬＣ－ＭＳ。本方法は、３０％溶媒Ｂでの２分間のアイソクラティック保持と、それに続く１５分間での３０％～１００％溶媒Ｂの直線的グラジエントで構成される。 ２．５Ｆ－Ａｂ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ ＫＦＤＣの調製。（ａ）Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥはＭＭＡＥの誘導体であり、細胞外で安定しており細胞内在化時にカテプシンプロテアーゼを介して切断されることが知られている。（ｂ）ノッティン－Ｆｃ－薬物複合体（ＫＦＤＣ）は、ＨＩＰＳリンカーＭＭＡＥ誘導体とアルデヒドタグ付きＫＦｃのＨｙｄｒａｚｉｎｏ－Ｐｉｃｔｅｔ－Ｓｐｅｎｇｌｅｒライゲーション１によって調製された。 ＫＦＤＣの生産を確認する質量分析データ。 ２．５Ｆ－Ａｂ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ ＫＡＤＣの調製。（ａ）Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥはＭＭＡＥの誘導体であり、細胞外で安定しており細胞内在化時にカテプシンプロテアーゼを介して切断されることが知られている。（ｂ）ノッティン－Ａｂ－薬物複合体（ＫＡＤＣ）は、ＨＩＰＳリンカーＭＭＡＥ誘導体とアルデヒドタグ付き（α－ＦＩＴＣ）ＫＡｂのＨｙｄｒａｚｉｎｏ－Ｐｉｃｔｅｔ－Ｓｐｅｎｇｌｅｒライゲーション１によって調製された。 ＫＡＤＣの生産を確認する質量分析データ。 Ｕ８７ＭＧ細胞上のノッティン標的タンパク質の結合親和性。（ａ）ＡＦ４８８標識Ｋ、ＫＦｃ、およびＫＡｂのＵ８７ＭＧ細胞への直接結合（ＫについてはＫｄ＝０．３５ｎＭ、ＫＦｃについては２．５ｎＭ、ＫＡｂについては２．３ｎＭ）。（ｂ）１ｎＭＡＦ４８８－２．５Ｆと競合する薬物複合体の間接結合（ＫＤＣについてはＫｉ＝０．９、ＫＦｃについては１．２、ＫＡｂについては１．３）。 ノッティンベースのタンパク質の内在化。（ａ）抗ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８クエンチング抗体のみとインキュベートされた細胞、または４℃でインキュベートされた細胞（細胞膜を凍結し、内在化を阻害するため）は、細胞の上方でのみ検出可能な蛍光を示した。（ｂ）ＡＦ４８８標識されたＫ、ＫＦｃ、およびＫＡｂの内在化。（ｃ）一価の一アームＫＦｃと比較した二価ＫＦｃの内在化。（ｄ）Ｎ末端ＫＡｂおよびＫＦｃと比較したＣ末端ノッティン－抗体融合体（ＡｂＫ）内在化。 内在化に対する変性培地とＰＢＳＡの効果。ｃ１ｑを含む血清タンパク質は、抗体のＦｃ領域と相互作用することができ、細胞内在化に影響を与える可能性がある。血清タンパク質が内在化率に影響を及ぼしているかどうかを試験するために、細胞を完全培地（ＤＭＥＭ）、熱変性ＤＭＥＭ、または０．１％ＢＳＡ（ＰＢＳＡ）を伴うリン酸緩衝生理食塩水中のＡＦ４８８標識タンパク質とともにインキュベートした。 内在化に対するＦｃブロッカーと過剰なＫの効果。（ａ）ＡＦ４８８－Ｋ、過剰な非標識Ｋ（Ｋ’）と同時投与されたＡＦ４８８－Ｋ、および非結合ＣＴＲＬノッティンの内在化。（ｂ）ＡＦ４８８－ＫＦｃ、Ｆｃブロッカーと同時投与されたＡＦ４８８－ＫＦｃ、過剰なＫ’と同時投与されたＡＦ４８８－ＫＦｃ、および非結合ＣＴＲＬ－Ｆｃの内在化。（ｃ）一アームのモノＡＦ４８８－ＫＦｃ、Ｆｃブロッカーと同時投与されたモノＡＦ４８８－ＫＦｃ、および過剰なＫ’と同時投与されたモノＡＦ４８８－ＫＦｃの内在化。
インビトロ細胞増殖のＰＤＣ阻害。（ａ）ＫＤＣと非接合Ｋ、（ｂ）ＫＦＤＣと非接合ＫＦｃ、および（ｃ）ＫＡＤＣと非接合ＫＡｂと比較した、ＭＭＡＥで処理されたＵ８７ＭＧ細胞。１２０時間での細胞増殖は、λ＝４５０ｎｍでＣＣＫ８試薬から生じる吸光度を測定することによって評価され、未処理の細胞と比較した最大パーセントとして報告される。すべての薬物複合体は、追加の実験で再度試験され、（ｄ）に一緒にプロットされた。 ＰＤＣの経時的な増殖阻害と細胞毒性。ＲＦＰを発現するＵ８７ＭＧ細胞をＭＭＡＥまたは薬物複合体で処理し、ＩｎｃｕＣｙｔｅ画像を介して増殖と細胞毒性（ＳＹＴＯＸグリーンを介して）を経時的に測定した。（ａ）２４時間後に同じ処理条件を含む新鮮な培地で洗浄した細胞間の増殖の比較。（ｂ）２４時間後に新鮮な薬物非含有培地で洗浄した細胞間の増殖の比較。（ｃ）２４時間後に同じ処理条件を含む新鮮な培地で洗浄した細胞間の細胞毒性の比較。（ｄ）２４時間後に新鮮な薬物非含有培地で洗浄した細胞間の細胞毒性の比較。 ３時間のインキュベーション後の増殖のＰＤＣ阻害。ＲＦＰを発現するＵ８７ＭＧ細胞をＭＭＡＥまたは薬物複合体で処理し、ＩｎｃｕＣｙｔｅ画像を介して増殖を経時的に測定した。３時間後に新鮮な薬物非含有培地で洗浄した細胞間の増殖の比較。 ＡＦ６８０標識ＰＤＣＳのインビボ画像。Ｕ８７ＭＧ股関節異種移植片を有するマウスに、１．５ｎｍｏｌの（ａ）ＡＦ６８０－ＫＤＣ、（ｂ）ＡＦ６８０－ＫＦＤＣ、または（ｃ）ＡＦ６８０－ＫＡＤＣを注射した。マウス（ｎ＝３）は、６４０ｎｍの励起および７１０ｎｍの発光フィルターを使用して定期的に画像化した。各処置群からの単一のマウスが、クリアランスと局在化率の違いを説明するために、選択された時点で示されている。 ＰＤＣの薬物動態。（ａ）ＡＦ６８０－ＫＤＣ、（ｂ）ＡＦ６８０－ＫＦＤＣ、または（ｃ）ＡＦ６８０－ＫＡＤＣで処置されたマウスの腫瘍または肩を中心とする同等領域（バックグラウンド）における放射効率の定量化。循環半減期は、二相性指数関数的減衰曲線をバックグラウンドデータに適合させることによって推定された。（ｄ～ｆ）腫瘍対バックグラウンド比は、腫瘍における放射効率を、肩を中心とする同等領域の放射効率で割ったものとして計算された。 ＰＤＣの生体内分布。Ｕ８７ＭＧ異種移植腫瘍を有するマウスに、１．５ｎｍｏｌの蛍光標識薬物複合体を注射した。腫瘍、肝臓、腎臓、脾臓、膵臓、心臓、肺、膀胱、大腿四頭筋（筋肉）、および胸骨（骨）を、画像化のために投与の４時間後および２４時間後に取り出された。 ＰＢＳ、ＫＤＣ、ＫＦＤＣ、またはＫＡＤＣで週３回３週間処理された、Ｕ８７ＭＧ股関節異種移植片を有するＮｕ／Ｎｕマウスの腫瘍増殖。各用量には、２．３８ｎｍｏｌのＭＭＡＥに正規化された適切な薬物複合体（約０．６ｍｇ／ｋｇのＫＤＣ、約５ｍｇ／ｋｇのＫＦＤＣ、約１０ｍｇ／ｋｇのＫＡＤＣ）が含まれていた。エンドポイント基準は、腫瘍面積＞１００ｍｍ２であった。（ａ）カプランマイヤー生存曲線。（ｂ）各処置群の平均腫瘍面積。安楽死基準に達したマウスは、最後に記録された腫瘍面積として平均に含まれた。（ｃ）各グループ内の個々のマウスの腫瘍測定。（ｄ）開始時の体重に対して正規化された平均体重。 ＰＢＳ、非接合Ｋ、又は１ミリグラム／ｋｇあるいは５ｍｇ／ｋｇのＫＤＣで週１回４週間処置した後の、Ｕ８７ＭＧ股関節異種移植片を有するＮｕ／Ｎｕマウスの腫瘍増殖。エンドポイント基準は、腫瘍領域＞１５０ｍｍ２であった。（ａ）カプランマイヤー生存曲線。（ｂ）各処置群の平均腫瘍面積。安楽死基準に達したマウスは、最後に記録された腫瘍面積として平均に含まれている。（ｃ）各グループ内の個々のマウスの腫瘍測定。 ＰＢＳ、非接合ＫＦｃ、または５ｍｇ／ｋｇもしくは１０ｍｇ／ｋｇのＫＦＤＣで週１回４週間処置した、Ｕ８７ＭＧ股関節異種移植片を有するＮｕ／Ｎｕマウスの腫瘍増殖。エンドポイント基準は、腫瘍領域＞１５０ｍｍ２であった。（ａ）カプランマイヤー生存曲線。（ｂ）各処置群の平均腫瘍面積。安楽死基準に達したマウスは、最後に記録された腫瘍面積として平均に含まれている。（ｃ）各グループ内の個々のマウスの腫瘍測定。 ＰＢＳ、非接合（α－ＣＥＡ）ＫＡｂ、または５ｍｇ／ｋｇもしくは１０ｍｇ／ｋｇのＫＡＤＣで週１回４週間処置した、Ｕ８７ＭＧ股関節異種移植片を有するＮｕ／Ｎｕマウスの腫瘍増殖。エンドポイント基準は、腫瘍面積＞１５０ｍｍ２であった。（ａ）カプランマイヤー生存曲線。（ｂ）各処置群の平均腫瘍面積。安楽死基準に達したマウスは、最後に記録された腫瘍面積として平均に含まれている。（ｃ）各グループ内の個々のマウスの腫瘍測定。 （ａ）カプランマイヤー生存曲線。（ｂ）各処置群の平均腫瘍面積。安楽死基準に達したマウスは、最後に記録された腫瘍面積として平均に含まれている。（ｃ）各グループ内の個々のマウスの腫瘍測定。 ３０ｍｇ／ｋｇで投与されたＫＡＤＣの治療効果。ＰＢＳ、１０ｍｇ／ｋｇのＫＡＤＣ、または３０ｍｇ／ｋｇのＫＡＤＣで週１回４週間治療した、Ｕ８７ＭＧ股関節異種移植片を有するＮｕ／Ｎｕマウスの腫瘍増殖。エンドポイント基準は、腫瘍領域＞１５０ｍｍ２であった。（ａ）カプランマイヤー生存曲線。（ｂ）各処置群の平均腫瘍面積。安楽死基準に達したマウスは、最後に記録された腫瘍面積として平均に含まれている。（ｃ）各グループ内の個々のマウスの腫瘍測定。 ＫＡＤＣとＫＡＢの同時投与の治療効果。ＰＢＳ、１０ｍｇ／ｋｇのＫＡＤＣ、または２０ｍｇ／ｋｇのＫＡｂと同時投与された１０ｍｇ／ｋｇのＫＡＤＣで４週間週１回治療された、Ｕ８７ＭＧ股関節異種移植片を有するＮｕ／Ｎｕマウスの腫瘍増殖。エンドポイント基準は、腫瘍面積＞１５０ｍｍ２であった。（ａ）カプランマイヤー生存曲線。（ｂ）各処置群の平均腫瘍面積。安楽死基準に達したマウスは、最後に記録された腫瘍面積として平均に含まれている。（ｃ）各グループ内の個々のマウスの腫瘍測定。 ＫＤＣ、ＫＦＤＣ、およびＫＡＤＣについての肝臓および腎臓の組織学。肝臓と腎臓の代表的なスライスを４％ＰＦＡで固定し、細胞構造を視覚化するために、ヘマトキシリンとエオシンで染色した。スライドは独立した獣医病理学者によって採点され、すべての肝臓と腎臓のサンプルには急性毒性の証拠がないことが確認された。 固形腫瘍中への拡散。血管系から離れ固形腫瘍中への薬物複合体のKroughシリンダー拡散を表す概略図。Kroughシリンダーの半径は、拡散係数と細胞の結合および内在化の速度によって限定される。 腫瘍スフェロイドの共焦点画像。細胞ＲＦＰを発現するＵ８７ＭＧスフェロイド中へのＡＦ４８８標識薬物複合体の拡散を示す共焦点画像。赤のチャンネルは、光学密度による信号の減衰を示している。緑のチャンネルは、蛍光標識されたタンパク質の強度を示している。すべての画像は、スフェロイドの表面から約１００μｍの深さで撮影されている。 腫瘍スフェロイドイメージングの定量化。スフェロイド画像は定性的には有用であるが、光学密度が不均一であるため、定量化は困難である。赤のチャンネルは光学密度による信号の減衰を示し、緑のチャンネルは蛍光標識されたタンパク質を示す。各チャンネルについて、ＦＩＪＩ画像解析ソフトウェアを使用して半径方向の強度を計算し、距離の関数としてプロットした。（ａ）ＡＦ４８８－ＫＤＣで処理されたｎ＝５スフェロイドについての距離の関数としての平均強度。（ｂ）ＡＦ４８８－ＫＦＤＣで処理されたｎ＝５スフェロイドについての距離の関数としての平均強度。（ｃ）ＡＦ４８８－ＫＡＤＣで処理されたｎ＝５スフェロイドについての距離の関数としての平均強度。（ｄ）ＡＦ４８８－ＫＡＤＣおよび非標識Ｋで処理されたｎ＝５スフェロイドについての距離の関数としての平均強度。（ｅ）相対的な赤の強度を使用して補正された相対的な緑の強度。（ｆ）１００μｍで撮影された共焦点画像の総積分強度。 腫瘍スフェロイドのＺスタック共焦点画像解析。スフェロイド表面から５０～９０μｍの範囲で１０μｍ間隔で、細胞ＲＦＰを発現するＵ８７ＭＧスフェロイド中にＡＦ４８８標識薬物複合体が拡散することを示す共焦点画像解析。 インビトロでの腫瘍スフェロイドの殺傷。Ｕ８７ＭＧ腫瘍スフェロイドは、さまざまな濃度のＫＤＣ、ＫＦＤＣ、ＫＡＤＣ、またはＭＭＡＥで処置する前に３日間成長させた。４日間のインキュベーション後、細胞毒性を測定するために、ＳＹＴＯＸグリーンを添加し、スフェロイドを攪拌した。スフェロイドの死滅率は、緑色の信号を、溶解バッファーで殺されたスフェロイドと比較することによって推定された。 インビトロでの腫瘍スフェロイドのＩｎｃｕＣｙｔｅイメージング。ＲＦＰを発現するＵ８７ＭＧ腫瘍スフェロイドを３日間成長させた後、１００ｕＭのＫＤＣ、ＫＡＤＣ、またはＭＭＡＥで処理した。細胞死はＳＹＴＯＸグリーンで視覚化される。画像は処置の１２０時間後に撮影された。
本開示の複合体、組成物、および方法をより詳細に記載する前に、複合体、組成物、および方法は、記載される特定の実施形態に限定されず、当然のことながら変化し得ることが理解されるべきである。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明するためだけのものであり、複合体、組成物、および方法の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書で使用される用語は限定することを意図するものではないこともまた理解されたい。
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限と下限との間の各介在値（文脈上明確に指示されていない限り、下限の単位の１０分の１までのもの）、およびその範囲内の記載された他の値または介在値は、複合体、組成物、および方法内に包含されることを理解されたい。これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立してより小さい範囲内に含まれてもよく、記載される範囲内で特に除外される限界を受けることを条件として、やはり複合体、組成物、および方法内に包含される。記載される範囲に１つの限界値または両方の限界値が含まれる場合、その含まれる限界値のいずれかまたは両方を除く範囲も、複合体、組成物、および方法に含まれる。
特定の範囲は、用語「約」が前に付いている数値で本明細書に提示される。「約」という用語は、それが先行する正確な数字、およびその用語が先行する数字に近接または近似する数字に逐語的支持を提供するために本明細書において使用される。数が特定の列挙された数に近いかほぼ等しいかどうかを決定するにあたり、近いまたはほぼ等しい列挙されていない数とは、それが提示されている文脈において具体的に列挙された数と実質的に同等のものを提供する数であり得る。
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、複合体、組成物、および方法が属する分野の当業者に一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似するまたは同等な任意の複合体、組成物および方法もまた、複合体、組成物および方法の実施または試験において使用することができるが、代表的な例示的複合体、組成物および方法をここに記載する。
本明細書に引用されるすべての刊行物および特許は、各個々の刊行物または特許が参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示されているかのように参照により本明細書に組み込まれ、刊行物が引用されるところに関連する方法および／または材料を開示かつ説明するために、参照により本明細書に組み込まれる。任意の刊行物の引用は、本出願日前のその開示についてのものであり、提供される刊行年は、個別に確認を必要とし得る実際の刊行年とは異なる場合があるので、本複合体、組成物および方法は、その刊行物よりも先行する権利がないことを認めるものと解釈されるべきではない。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。特許請求の範囲は任意選択的な要素を排除するように起草されてもよいことにさらに留意されたい。このように、この記述は、特許請求の要素の列挙に関連して「専ら」、「のみ」などのような排他的な用語の使用または「負の」限定の使用のための文言的根拠としての役割を果たすことを意図する。
明瞭さのために別々の実施形態の文脈中で記載された、複合体、組成物、および方法の特定の特徴は、単一の実施形態において組み合わされても提供され得ることが認識される。逆に、簡潔にするために単一の実施形態の文脈で説明される、複合体、組成物、および方法の様々な特徴は、別々にまたは任意の適切なサブコンビネーションで提供されてもよい。実施形態のすべての組み合わせは、本開示によって具体的に包含され、そのような組み合わせが実施可能なプロセスおよび／または組成物を包含する限りにおいて、まさに各組み合わせおよびすべての組み合わせが個々にまたは明示的に開示されているかのように、本明細書に開示される。さらに、そのような可変要素を記載している実施形態に列挙されているすべてのサブコンビネーションも、本発明の複合体、組成物および方法によって具体的に包含され、そのような各サブコンビネーションが個々におよび明示的に開示されているかのように、本明細書に開示される。
本開示を読むと当業者には明らかであるように、本明細書に説明され例証された個々の実施形態の各々は、本開示の方法の範囲または趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離され得る、または組み合わせられ得る個別の構成要素および特徴を有する。いかなる列挙された方法も、列挙された事象の順序で、または論理的に可能なあらゆる他の順序で実行され得る。
複合体
上に要約したように、本開示は複合体を提供する。例えば、本明細書に記載されているのは、癌治療のための代替標的剤としての、ペプチドベースの薬物複合体のツールボックスの開発および特徴付けである。従来の癌化学療法剤は、有効用量と毒性用量の間の範囲が狭いことがよくある。有効性を改善し、副作用を最小限に抑えるために、タンパク質－薬物複合体（ＰＤＣ:
protein-drug conjugate）は、癌性組織に化学療法剤を選択的に送達するのに使用される。
本開示の複合体は、細胞表面分子に結合する操作されたループを含むノッティンペプチドを含む。本開示の複合体で使用されるノッティンペプチドのタイプは、変化し得る。使用できるノッティンペプチドの非限定的な例には、ＥＥＴＩ－ＩＩペプチド、ＡｇＲＰペプチド、ω－コノトキシンペプチド、カラタＢ１ペプチド、ＭＣｏＴＩ－ＩＩペプチド、アガトキシンペプチド、およびクロロトキシンペプチドが含まれる。ノッティンペプチドの三次元構造は、３つのジスルフィド結合の特定の配置によって最小限定義される。この特徴的なトポロジーは、１つのジスルフィド結合が他の２つの鎖内ジスルフィド架橋によって形成された大環状を通過する分子の結び目（knot）を形成する。それらの二次構造含量は通常低いが、ノッティンは、ジスルフィド結合フレームワークによって安定化されている小さな三本鎖逆平行βシートを共有する。ノッティンの折り畳みと機能的活性は、長さもアミノ酸組成も多様であるループ領域によってしばしば媒介される。３つのジスルフィド結合がこのペプチドファミリーのフォールドを定義する最小数であるが、ノッティンは追加のシステイン残基を含むこともでき、これは４つ以上のジスルフィド結合と追加の拘束ループをその構造に持つ分子を生成する。「シスチン」という用語は、硫黄基がジスルフィド結合を介して別のアミノ酸に結合しているＣｙｓ残基を指す。「システイン」という用語は、その残基の－ＳＨ（「ハーフシスチン」）形態を指す。結合ループ部分はシスチンに隣接し得、その結果、結合ループの一次配列に他の介在するシスチンが存在しない。
ノッティンペプチドは、オンラインのＫＮＯＴＴＩＮデータベースに記載されているペプチドであり得、そこにはシスチンノットモチーフを含むと特定された数千ものポリペプチドの詳細なアミノ酸配列、構造、分類、および機能情報が含まれている。ノッティンは、さまざまな植物、動物、昆虫、菌類に見られる。
ノッティンペプチドは完全長（すなわち、野生型ペプチド／ポリペプチドの長さ）であり得、ノッティンペプチドは、野生型ペプチド／ポリペプチドの長さに対して短縮され得、またはノッティンペプチドは、ペプチドが野生型ペプチド／ポリペプチドの長さに比べてより長くなるような追加のアミノ酸を含み得る。
特定の実施形態によれば、本開示のノッティン薬物複合体（ＫＤＣ：knottin-drug conjugate）は、Ecballium elateriumトリプシン阻害剤ＩＩ（ＥＥＴＩ－ＩＩ）ペプチド、アグーチ関連タンパク質（ＡｇＲＰ）ペプチド、ω－コノトキシンペプチド、カラタＢ１ペプチド、ＭＣｏＴＩ－ＩＩペプチド、アグーチキシンペプチド、またはクロロトキシンペプチドのいずれか一つに基づくノッティンペプチドを含み得る。いくつかの実施形態において、ノッティンペプチドは、Ecballium elateriumトリプシン阻害剤ＩＩ（ＥＥＴＩ－ＩＩ）ペプチドに基づく。いくつかの実施形態において、ノッティンペプチドは、アグーチ関連タンパク質（ＡｇＲＰ）ペプチドに基づく。
「ＥＥＴＩ」とは、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ Ｅｎｔｒｙ（ＰＤＢ）２ＥＴＩを意味する。ＫＮＯＴＴＩＮデータベースのそのエントリはＥＥＴＩ－ＩＩである。特定の態様において、本開示の複合体のノッティンペプチドは、次のアミノ酸配列を有するＥＥＴＩ－ＩＩペプチドに基づく：
GCPRILMRCKQDSDCLAGCVCGPNGFCG（配列番号１）
「ＡＧＲＰ」とは、ＰＤＢエントリ１ＨＹＫおよびＫＮＯＴＴＩＮデータベースエントリＳｗｉｓｓＰｒｏｔＡＧＲＰ＿ＨＵＭＡＮを意味する。ＡＧＲＰは、人間の脳のメラノコルチン受容体に結合し、代謝と食欲の調節に関与する１３２アミノ酸の神経ペプチドである。ＡｇＲＰの生物学的活性は、５つのジスルフィド結合を含むＣ末端システインノットドメインによって媒介されるが、４つのジスルフィド結合のみを含む完全に活性な３４アミノ酸の短縮型ＡｇＲＰが開発された。特定の態様において、本開示の複合体のノッティンペプチドは、次のアミノ酸配列を有する短縮型ＡＧＲＰペプチドに基づく。
CVRLHESCLGQQVPCCDPAATCYCRFFNAFCYCR（配列番号２）
特定の実施形態によれば、本開示の複合体のノッティンペプチドは、次のアミノ酸配列を有するカラタＢ１ペプチドに基づく。
CGETCVGGTCNTPGCTCSWPVCTRNGLPV（配列番号３）
特定の態様において、本開示の複合体のノッティンペプチドは、次のアミノ酸配列を有するＭＣｏＴＩ－ＩＩペプチドに基づく。
SGSDGGVCPKILKKCRRDSDCPGACICRGNGYCG（配列番号４）
特定の実施形態によれば、本開示の複合体のノッティンペプチドは、次のアミノ酸配列を有するクロロトキシンペプチドに基づく。
MCMPCFTTDHQMARKCDDCCGGKGRGKCYGPQCLCR（配列番号５）
ＥＥＴＩ－ＩＩ、ＡｇＲＰ、ω－コノトキシン、カラタＢ１、ＭＣｏＴＩ－ＩＩ、アガトキシン、クロロトキシン、および本開示の複合体のノッティンペプチドが基づき得る他のノッティンペプチドの配列および構造（例えば、ループ）情報は、ＰＤＢ、ＫＮＯＴＴＩＮデータベース、およびその他のタンパク質データベースにおいて見出され得る。
ノッティンペプチドには、細胞表面分子に結合する操作されたループが含まれ、つまり、ループは細胞表面の標的分子に結合するように操作されている。ノッティンは、ループ領域を逆平行βシートのコアに拘束する分子「ノット」に織り込まれた３つのジスルフィド結合を含有する。例えば、野生型ＥＥＴＩは、ループ１（トリプシン結合ループ、残基３～８）、ループ２（残基１０～１４）、およびループ３（残基２２～２６）という３つのジスルフィド拘束ループを持つ２８アミノ酸で構成されている。プロテアーゼ阻害剤、毒素、および抗菌剤を含むノッティンファミリーメンバーは、コアシステイン残基を除いて、配列相同性をほとんど共有していない。その結果、それらのジスルフィド拘束ループは多くの配列多様性を許容し、ノッティンを、タンパク質の三次元折り畳みを廃止することなくタンパク質に突然変異を導入する必要があるタンパク質工学アプリケーションに適したものにする。
操作されたループは、ノッティンペプチドの既存のループにおけるアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を含み得、または、操作されたループは、ノッティンタンパク質に付加されたループであり得る。すなわち、当該複合体のノッティンペプチドは、野生型ペプチドに存在する１つまたは複数のループに加えてループを含み得る。指向性進化と計算共分散分析を組み合わせることにより、ノッティン足場のループ領域に改変（アミノ酸配列とループ長の両方）を導入するためのガイドラインが解明された。例えば、Ｌａｈｔｉ ｅｔ ａｌ（２００９）ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．５（９）：ｅ１０００４９９を参照されたい。
いくつかの実施形態において、ノッティンのループは、癌細胞表面分子に結合するように操作される。「癌細胞」とは、例えば、異常な細胞成長、異常な細胞増殖、密度依存性の増殖阻害の喪失、足場非依存性増殖能、免疫無防備状態の非ヒト動物モデルにおいて腫瘍増殖および／または発生を促進する能力、ならびに／または細胞形質転換の適切な指標をのうちの１つまたは複数によって特徴付けられ得る、新生物細胞表現型を示す細胞を意味する。本明細書において「癌細胞」は、「腫瘍細胞」、「悪性細胞」または「癌性細胞」と互換的に使用され得、固形腫瘍、半固形腫瘍、原発腫瘍、転移性腫瘍などのがん細胞を包含する。そのような操作されたループは、ノッティンペプチドに、野生型ペプチドには存在しない癌細胞表面分子認識特性を与える。特定の態様において、癌は、１つ以上の腫瘍関連または腫瘍特異的細胞表面分子（例えば、細胞表面受容体、膜プロテアーゼなど）を有することが知られている癌であり、ノッティンペプチドの操作されたループは、１つまたは複数のそのような腫瘍関連または腫瘍特異的細胞表面分子の細胞外ドメインに結合する。「腫瘍関連細胞表面分子」とは、正常組織の細胞上で発現が制限され悪性細胞上で発現される細胞表面分子、又は正常細胞に比べて悪性細胞上ではるかに高い密度で発現される細胞表面分子を意味する。
任意の腫瘍関連細胞表面分子または腫瘍特異的細胞表面分子が、本開示の複合体のノッティンペプチドによって標的化され得る。特定の態様では、ループが結合するように操作された癌細胞表面上の標的は、ＨＥＲ２、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＧＤ２、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５６、ＣＤ６６／ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ネクチン－４、メソテリン、膜貫通糖タンパク質ＮＭＢ（ＧＰＮＭＢ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＳＬＣ４４Ａ４、ＣＡ６、チロシンタンパク質キナーゼＭｅｔ（ｃ－Ｍｅｔ）、表皮成長因子受容体変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ムチン１（ＭＵＣ１）、エフリンＡ型受容体２（ＥｐｈＡ２）、グリピカン２（ＧＰＣ２）、グリピカン３（ＧＰＣ３）、ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）、葉酸受容体アルファ（ＦＲα）、ＩＬ－１３受容体アルファ２（ＩＬ１３Ｒα２）、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、デルタ様３（ＤＬＬ３）、κライト鎖、血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、栄養芽細胞糖タンパク質（ＴＰＢＧ）、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）、ＣＡ－ＩＸ、インテグリン、ＣＸＣケモカイン受容体タイプ４（ＣＸＣＲ４）、ニューロピリン－１（ＮＲＰ１）、マトリプターゼ、およびその他の腫瘍関連または腫瘍特異的な目的の分子である。
特定の実施形態によれば、癌細胞表面上の標的は、受容体、例えば、細胞接着受容体、可溶性因子（例えば、成長因子、ケモカイン、または他の可溶性因子受容体）の受容体、免疫細胞受容体、などである。特定の態様において、受容体が細胞接着受容体である場合、受容体はインテグリンである。例えば、本開示の複合体は、αｖβ１インテグリン、αｖβ３インテグリン、αｖβ５インテグリン、αｖβ６インテグリン、α５β１インテグリン、またはそれらの任意の組み合わせのいずれか１つに結合するように操作されたループを有するノッティンペプチドを含み得る。特定の実施形態によれば、操作されたループは、αｖβ１インテグリン、αｖβ３インテグリン、αｖβ５インテグリン、αｖβ６インテグリン、およびα５β１インテグリンのそれぞれに結合する。
本開示の複合体において使用され得る、αｖβ１インテグリン、αｖβ３インテグリン、αｖβ５インテグリン、αｖβ６インテグリン、およびα５β１インテグリンのそれぞれに結合する操作された結合ループを有するＥＥＴＩベースのノッティンペプチド（ＥＥＴＩ－２．５Ｄと指定）は、次のアミノ酸配列を有する（インテグリン結合ループに下線が引かれている）：
GCPQGRGDWAPTSCKQDSDCRAGCVCGPNGFCG（配列番号６）
本開示の複合体において使用され得る、αｖβ１インテグリン、αｖβ３インテグリン、αｖβ５インテグリン、αｖβ６インテグリン、およびα５β１インテグリンのそれぞれに結合する操作された結合ループを有するＥＥＴＩベースのノッティンペプチド（ＥＥＴＩ－２．５Ｆと指定）は、次のアミノ酸配列を有する（インテグリン結合ループに下線が引かれている）：
GCPRPRGDNPPLTCSQDSDCLAGCVCGPNGFCG（配列番号７）
いくつかの実施形態において、本開示の複合体のノッティンペプチドは、表１に記載されているような、インテグリン結合ＥＥＴＩベースのノッティンペプチドである。
Figure 2022533671000002
いくつかの実施形態において、本開示の複合体のノッティンペプチドは、表２に記載されているような、インテグリン結合ＡｇＲＰベースのノッティンペプチドである。
Figure 2022533671000003
いくつかの実施形態において、ノッティンペプチドは、１つ又は複数の非天然アミノ酸を含む。そのような１つまたは複数の非天然アミノ酸は、例えば、薬物のノッティンペプチドへのコンジュゲーションを促進するために使用され得る。例えば、本開示の複合体を調製するために使用される非天然アミノ酸には、アジド、アルキン、アルケン、アミノオキシ、ヒドラジン、アルデヒド、ニトロン、ニトリルオキシド、シクロプロペン、ノルボルネン、イソシアニド、ハロゲン化アリール、およびボロン酸官能基から選択される官能基を有するものが含まれる。本開示のノッティン－薬複合体のノッティンペプチドに組み込まれ、目的の官能基を提供するために選択され得る非天然アミノ酸は公知であり、例えば、Ｍａｚａ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．２６（９）：１８８４－９；Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ ｅｔａｌ．（２０１４）ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．９：５９２－６０５；Ａｄｕｍｅａｕ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｍｏｌ．Ｉｍａｇｉｎｇ Ｂｉｏｌ．（２）：１５３－６５、およびその他に記載されている。
細胞表面分子に結合する操作されたループを有するノッティンペプチドが開発される方法は、変化し得る。合理的（rational）アプローチおよびコンビナトリアルアプローチが、新しい分子認識特性を持つノッティンを設計するために使用されてきた。例えば、ノッティンタンパク質のライブラリーが作成され、（例えば細菌ディスプレイ、ファージディスプレイ、酵母表面ディスプレイ、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、および／または他の好適なスクリーニング方法によって）スクリーニングされ得る。
酵母表面ディスプレイは、新規の分子認識特性、増加された標的結合親和性、適切な折り畳み、および改善された安定性を有するタンパク質を設計するために使用されてきた強力なコンビナトリアル技術である。このプラットフォームでは、所望の生化学的および生物物理学的特性を有する変異体を単離するために、タンパク質変異体のライブラリーがハイスループット様式で生成およびスクリーニングされる。酵母表面ディスプレイは、真核生物分泌経路、シャペロンの補助による折り畳み、および効率的なジスルフィド結合形成の品質管理機構から利益を得る。
標的の細胞表面分に結合する操作されたループを有するノッティンペプチドを開発するための１つの例示的なアプローチは、酵母接合型凝集素タンパク質Ａｇａ２ｐにペプチドを遺伝子融合することを含み、これは２つのジスルフィド結合によって酵母細胞壁タンパク質Ａｇａ１ｐに連結される。このＡｇａ２ｐ融合構築物、および染色体に組み込まれたＡｇａ１ｐ発現カセットは、ガラクトース誘導性プロモーター等の好適なプロモーターの制御下で発現させることができる。蛍光標識された一次または二次抗体を使用するフローサイトメトリーによって細胞表面発現レベルを測定するために、Ｎ末端またはＣ末端のエピトープタグを含めることができる。この構築物は、ノッティン（または操作される他のタンパク質）のＮ末端がＡｇａ２に融合された、最も広く使用されているディスプレイフォーマットを表しているが、酵母表面ディスプレイプラスミドのいくつかの代替変形例が記述されてきており、本開示の複合体で使用するノッティンペプチドを開発するために用いられ得る。ファージディスプレイまたはｍＲＮＡディスプレイで使用されるパニングに基づく方法に勝る、このスクリーニングプラットフォームの利点の１つは、２色ＦＡＣＳを使用して、希望標的に対する結合親和性がわずか２倍程しか違わないクローンを定量的に識別することが可能であることである。
ＤＮＡレベルでノッティンループ領域を選択的に変異させるために、例えばオーバーラップエクステンションＰＣＲを使用したオリゴヌクレオチドアセンブリによって縮重コドンを導入することができる。次いで、酵母における相同組換えのために酵母ディスプレイベクターと十分に重複する隣接プライマーを使用して、遺伝物質が増幅され得る。このアセンブリと増幅の方法により、ノッティンライブラリーを比較的低コストと労力で作成することができる。ライブラリー組成に対する明確な制御を可能にする合成オリゴヌクレオチド・ライブラリーおよび最新の方法が開発されている。
特定の態様では、ディスプレイライブラリー（例えば、酵母ディスプレイライブラリー）は、ＦＡＣＳによって目的の細胞表面分子に対する結合についてスクリーニングされる。ＦＡＣＳによってノッティンライブラリーをスクリーニングする場合、結合剤が富化されたプールは、通常、４～７ラウンドのソートで出現する。２色ＦＡＣＳがライブラリーのスクリーニングに用いられてもよく、一方の蛍光標識をｃ－ｍｙｃエピトープタグを検出するために使用することができ、他方の蛍光標識を対象とする結合標的に対するノッティン変異体の相互作用を測定するために使用することができる。単一細胞分解能で２つの蛍光体の励起および発光特性を測定するために、異なる機器レーザーおよび／またはフィルターセットを使用することができる。これにより、結合によって酵母の発現レベルを正規化することが可能になる。すなわち、低い酵母発現を示すが多量の標的に結合するノッティンを、高レベルで発現されるが標的に弱く結合するノッティンと区別することができる。したがって、発現対結合の二次元フローサイトメトリープロットでは、結果として対角線上に標的抗原に結合する酵母細胞の集団が現れる。高親和性結合剤は、ライブラリー選別ゲートを使用して単離することができる。代替的に、最初の選別ラウンドにおいて、完全長タンパク質を発現しない望ましくないクローンのライブラリーを除去することが有用であり得る。スクリーニングで使用される標的は、最終的な用途に構造的および機能的に関連しており、例えば、目的の細胞表面分子を模倣する。
目的の細胞表面分子に対するバインダーについてのノッティンライブラリーの濃縮に続いて、酵母プラスミドが回収され、配列決定される。高い選別ストリンジェンシー下で、さらなるラウンドのＦＡＣＳを実施することができる。次いで、個々の酵母がディスプレイされたノッティングクローンの結合親和性または動的解離速度を測定することができる。
目的の細胞表面分子に結合する操作されたループを有するノッティンペプチドが表面ディスプレイ（例えば、酵母表面ディスプレイ）によって同定されると、操作されたノッティンは、適切な方法を使用して生成され得る。ノッティンのサイズが小さいため、化学合成と組換え発現の両方による生産が可能となる。特定の実施形態によれば、ノッティンペプチドは、固相ペプチド合成とそれに続くインビトロフォールディングによって生成され得る。化学合成により、非天然アミノ酸または他の化学的ハンドルをノッティンペプチドに容易に組み込むことができる。
大きな異種ドメインに融合されていないノッティンペプチドは、自動シンセサイザーで固相ペプチド化学を使用して容易に合成される。例えば、標準的な９－フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）ベースの固相ペプチド化学が用いられてもよい。次に、線状ペプチドは、システイン側鎖チオールの酸化を促進してジスルフィド結合を形成する条件下で折りたたまれ、続いて、例えば、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）によって精製され得る。
特定の態様において、ノッティンペプチド、または抗体サブユニットもしくはその断片に融合されたノッティンペプチドを含む融合タンパク質は、組換えＤＮＡアプローチを使用して生成される。様々な宿主細胞型において組換え法を使用してノッティンペプチドまたは融合タンパク質を産生するための任意の適切な戦略を採用することができる。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズム空間における折り畳みを促進し、また有用な精製ハンドルとしての役割を果たすバルナーゼを遺伝子融合パートナーとして用いて、機能的なノッティンが製造されてきた。特定の実施形態によれば、操作されたノッティンペプチドは酵母で発現される。例えば、酵母菌株Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓｇが、２～１０ｍｇ／Ｌの精製された操作されたノッティンを生産するために有効活用されている。酵母発現構築物は、１つ又は複数のタグ（例えば、金属キレートクロマトグラフィー（Ｎｉ－ＮＴＡ）による精製のためのＣ末端ヘキサヒスタジンタグ）をコードしてもよい。次いで、サイズ排除クロマトグラフィーを、凝集物、誤って折り畳まれた多量体等を除去するために使用することができる。
本開示の態様は、本開示の複合体で使用されるノッティンペプチドおよび融合タンパク質をコードする核酸を含む。すなわち、目的の細胞表面分子に結合する操作されたループを有する、本明細書に記載のノッティンペプチドおよび融合タンパク質のいずれかをコードする核酸が提供される。ある特定の態様において、そのような核酸は発現ベクター中に存在する。発現ベクターは、ノッティンペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含み、プロモーターは、ノッティンペプチドを発現するために選択された宿主細胞の種類に基づいて選択される。本開示のノッティンペプチドをコードする核酸のいずれかを含む宿主細胞、ならびにそれを含む任意の発現ベクターも提供される。
直接結合または競合結合アッセイを使用して、細胞（例えば、哺乳動物の癌細胞などの癌細胞）の表面に発現する分子に対するノッティンの親和性を測定するための方法が利用可能である。直接結合アッセイにおいて、フルオロフォアもしくは放射性同位体に接合されたノッティン、または標識抗体による検出のためのＮ末端もしくはＣ末端エピトープタグを含有するノッティンを用いて平衡結合定数（ＫＤ）を測定することができる。標識またはタグが実行可能でないまたは所望されない場合、競合結合アッセイを使用して最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）を決定することができ、これは標識競合物の最大シグナルの５０％が検出可能となる非標識ノッティンの量である。次いで、測定されたＩＣ５０値からＫＤ値を計算することができる。リガンドの枯渇は、低濃度域で高親和性相互作用を測定する場合により顕著になり、実験で追加する細胞の数を減らす、又は結合反応体積を増やすことで回避または最小限化することができる。
特定の態様において、ノッティンペプチドまたは融合タンパク質は、約０．０１ｎＭ～１００ｎＭ、例えば、約０．０２５ｎＭ～７５ｎＭ、約０．０５ｎＭ～５０ｎｍ、約０．０７５ｎＭ～２５ｎＭ、または約０．１ｎＭ～１０ｎＭの、細胞表面分子に対する平衡結合定数（ＫＤ）を有する。いくつかの実施形態において、ノッティンペプチドまたは融合タンパク質は、約０．１ｎＭ～１０ｎＭの細胞表面分子に対する平衡結合定数（ＫＤ）を有する。いくつかの実施形態において、ノッティンペプチドまたは融合タンパク質は、約０．１ｎＭの細胞表面分子に対する平衡結合定数（ＫＤ）を有する。いくつかの実施形態において、ノッティンペプチドまたは融合タンパク質は、約０．５ｎＭの細胞表面分子に対する平衡結合定数（ＫＤ）を有する。いくつかの実施形態において、ノッティンペプチドまたは融合タンパク質は、約１ｎＭの細胞表面分子に対する平衡結合定数（ＫＤ）を有する。いくつかの実施形態において、ノッティンペプチドまたは融合タンパク質は、約５ｎＭの細胞表面分子に対する平衡結合定数（ＫＤ）を有する。いくつかの実施形態において、ノッティンペプチドまたは融合タンパク質は、約１０ｎＭの細胞表面分子に対する平衡結合定数（ＫＤ）を有する。
ノッティンライブラリーの構築とスクリーニング、化学合成と組換え発現によるノッティン生産、さらに直接結合または競合結合アッセイを使用して細胞の表面に発現された分子（例えば、受容体）へのノッティンの親和性を測定するための細胞結合アッセイを含む、酵母表面ディスプレイ技術によるノッティンの操作に関する詳細なガイダンスと特定のプロトコルは、Ｍｏｏｒｅ，Ｓ．ａｎｄ Ｃｏｃｈｒａｎ，Ｊ．（２０１２）Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｋｎｏｔｔｉｎｓ ａｓ Ｎｏｖｅｌ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｇｅｎｔｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，５０３，２２３－２５１に記載されている。
ノッティン－薬物複合体
既存のターゲティング剤は、高分子量（ＭＷ）タンパク質、つまり抗体にほぼ独占的に依存しており、代替の低ＭＷターゲティングタンパク質の可能性は開拓されていないままである。臨床開発中の約１００を超える抗体薬物複合体（ＡＤＣ：antibody-drug conjugate）候補があるにもかかわらず、ＦＤＡによって承認されているＡＤＣは４つだけである（Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）、Ａｄｃｅｔｒｉｓ（登録商標）、Ｋａｄｃｙｌａ（登録商標）、およびＢｅｓｐｏｎｓａ（登録商標））。大きな障壁が、依然としてこのクラスの標的治療薬の臨床的成功を妨げている。５５以上のＡＤＣ候補が臨床試験に失敗し、これらの失敗のうち少なくとも２３は治療期間が不十分だったことが原因であった。承認されたＡＤＣまたは後期臨床開発段階のＡＤＣは、血液がんに大きく偏っており、固形腫瘍に対する臨床的成功率が大幅に低下している。抗体の高分子量免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）部分は、血管からの効率的な血管外漏出と固形腫瘍全体への拡散という物理的な課題に直面している。さらに、ＡＤＣの循環半減期の延長は、もともと腫瘍内の吸収薬物の蓄積を増加させることで完全に有益であると考えられていたが、健康な組織が無傷の複合体および早期に放出されてしまった薬物の両方へ曝露されることを増加させることにより、オフターゲット毒性にも貢献する。
低ＭＷターゲティング剤は、異なる薬物動態プロファイルを提供し、固形腫瘍に対する有効性の制限や、血液脳関門を通過できないため脳腫瘍は標的から除外されるなど、抗体薬物複合体の歴史的な制限を克服する可能性を有する。低ＭＷターゲティングタンパク質の理論上の利点にもかかわらず、このクラスのターゲティング剤は、急速な全身クリアランスまたは毒性のために効果がないという広く受け入れられている仮定が存在する。しかしながら、本明細書に示されるように、本開示の低分子量標的化剤は、予想外に高い効力、例えば、抗腫瘍効力を示す。
低分子量標的化剤の一例では、細胞表面分子に結合する操作されたループを含むノッティンペプチド（上記のノッティンペプチドのいずれかを含むがこれに限定されない）、およびリンカーを介してノッティンペプチドに接合される抗微小管剤を含む複合体が提供される。そのような複合体の非限定的な例が図１、パネルＢ（右―本明細書ではノッティン薬物複合体（knottin drug conjugate）または「ＫＤＣ」と呼ばれることもある）に概略的に示されている。
本明細書で使用される場合、「抗微小管剤」とは、微小管の形成を防止する、および／または微小管を破壊する薬剤である。微小管は、細胞分裂、分化、輸送、および運動性を含む、多くの重要な哺乳類細胞機能にとって重要である、動的に不安定な細胞骨格タンパク質ポリマーである。微小管の生物学的機能は、αβ－チューブリンヘテロダイマーの解重合および再重合によって調節され、それに依存している。微小管の非平衡重合は、ＧＤＰ－チューブリンを放出する「カタストロフィ」と呼ばれる分解プロセスを介して逆転させることができる。逆に、ＧＤＰのＧＴＰへの交換は、ＧＴＰ加水分解を介して重合される活性型のチューブリンを再生成する。したがって、ＧＴＰ－チューブリン相互作用は、微小管ダイナミクスの細胞調節において重要な役割を果たす。さまざまな細胞機能に対するそれらの中心的な重要性のため、チューブリン二量体および微小管細胞骨格は、有糸分裂を妨害する多数の細胞毒性剤の標的である。
特定の実施形態において、ノッティンペプチドにコンジュゲート化される抗微小管剤は、チューブリン阻害剤である。いくつかの実施形態によれば、チューブリン阻害剤はアウリスタチンである。本開示のノッティン複合体で有用性が見出されるアウリスタチンの非限定的な例には、アウリスタチンＥおよびアウリスタチンＦが含まれる。特定の実施形態において、アウリスタチンは、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）である。いくつかの実施形態によれば、アウリスタチンはモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ－その構造は図１、パネルａに提供されている）である。ＭＭＡＥはドラスタチン１０誘導体であり、親化合物よりも活性が向上し、毒性が増加している。ＭＭＡＥは、モノメチルバリン（ＭｅＶａｌ）、バリン（Ｖａｌ）、ドライソロイイン（Ｄｉｌ）、ドラプロイン（Ｄａｐ）の４つのアミノ酸と、カルボキシ末端アミンのノルエフェドリンで構成されている。多くのチューブリン阻害剤は、それらが結合するチューブリン二量体の一般的領域によって大まかに分類される。ＭＭＡＥは、ビンカ部位の有糸分裂阻害剤のカテゴリーに分類される。ビンカ部位の抗有糸分裂剤は、典型的には、二つの長手方向に整列されたチューブリンの二量体の間、すなわちβ１チューブリンサブユニットと隣接するα２チューブリンサブユニットとの間の界面において結合し、これは例えばビンブラスチンおよびエリブリンなどの古典的なアルカロイド微小管不安定化剤により標的化されるドメインである。生物物理学的実験および結晶構造を使用して、ＭＭＡＥは、ペプチド部位と呼ばれる、ビンカ部位とは構造的に異なる領域に結合することが確認された。ＭＭＡＥは、α／βチューブリン界面近くのペプチド部位に強固に結合し、ＧＴＰ加水分解とそれによる重合を効果的にブロックする強力なチューブリン阻害剤である。さらに、ＭＭＡＥは最近、自然では非秩序的であるβ－チューブリンＭループに、秩序的ならせん構造を誘導することが示された95。このコンフォメーション変化は、微小管の重合を立体的にブロックすることにより、微小管の形成をさらに妨害する。
本開示のノッティン－薬物複合体において、抗微小管剤は、リンカーを介してノッティンペプチドに接合される。本開示の複合体に使用され得る非限定的リンカーの例としては、エステルリンカー、アミドリンカー、マレイミドまたはマレイミドベースのリンカー、バリン－シトルリンリンカー、ヒドラゾンリンカー、Ｎ－スクシンイミジル－４－（２－ピリジルジチオ）ブチレート（ＳＰＤＢ）リンカー、スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）リンカー、ビニルスルホンベースのリンカー、テトラエチレングリコールなどのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むがこれらに限定されないリンカー、プロパン酸を含むリンカー、カプロレイン酸を含むリンカー、およびその任意の組み合わせを含むリンカーが挙げられる。特定の態様では、リンカーは、中性ｐＨ（血流ｐＨ７．３～７．５）で安定であるが、標的細胞（例えば、癌細胞）の弱酸性エンドソーム（ｐＨ５．０～６．５）およびリソソーム（ｐＨ４．５～５．０）への内在化時に加水分解を受ける酸切断性リンカーなどの、化学的に不安定なリンカーである。化学的に不安定なリンカーには、ヒドラゾン系リンカー、オキシム系リンカー、カーボネート系リンカー、エステル系リンカーなどが含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態によれば、リンカーは、血流中で安定であるが、標的細胞への内在化時に標的細胞（例えば、癌細胞）のリソソーム中の例えばリソソームプロテアーゼ（カテプシンまたはプラスミンなど）によって酵素的切断を受ける、酵素不安定性リンカーなどの酵素不安定性リンカーである。酵素不安定性リンカーには、ペプチド結合を含むリンカー、例えば、バリン－シトルリンリンカー、例えばマレイミドカプロイル－バリン－シトルリン－ｐ－アミノベンジル（ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ）リンカー、バリル－アラニル－パラ－アミノベンジルオキシ（Ｖａｌ－Ａｌａ－ＰＡＢ）リンカーなどのジペプチドベースのリンカーが含まれるが、これらに限定されないリンカーが含まれる。化学的に不安定なリンカー、酵素的に不安定なリンカーおよび切断不可能なリンカーは公知であり、例えば、Ｄｕｃｒｙ＆Ｓｔｕｍｐ（２０１０）ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ．２１：５－１３に詳細に記載されている。
特定の実施形態において、本開示の複合体は、バリン－シトルリンジペプチド、バリン－アラニンジペプチド、またはその両方を含むリンカーを含む。いくつかの実施形態によれば、リンカーは、バリンーシトルリンーパラアミノベンジルオキシ（Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ）リンカーである（図１のパネルａに概略的に示されている）。特定の実施形態において、リンカーは、バリルアラニルパラアミノベンジルオキシ（Ｖａｌ－Ａｌａ－ＰＡＢ）リンカーである。
ノッティン－抗体サブユニット複合体
本開示の態様は、ノッティン－抗体サブユニット複合体をさらに含む。そのような複合体は、抗体サブユニットまたはその断片に融合された、細胞表面分子に結合する操作されたループを含むノッティンペプチド（上記のノッティンペプチドのいずれかを含むがこれに限定されない）を含む融合タンパク質を含む。そのような複合体は、リンカーを介して融合タンパク質に接合された薬物をさらに含む。いくつかの実施形態では、そのような複合体の二量体が提供され、そこでは、抗体サブユニットまたはその断片が二量体化して（例えば、ヒンジ領域（存在する場合）等におけるジスルフィド架橋を介して）、二量体化ノッティン薬物複合体が形成される。
いくつかの実施形態によれば、抗体サブユニットまたはその断片は、抗体重鎖またはその断片である。特定の実施形態において、抗体重鎖またはその断片は、γ、α、δ、ε、もしくはμ抗体重鎖またはその断片を含む。いくつかの実施形態によれば、抗体重鎖またはその断片は、ＩｇＧ重鎖またはその断片、例えば、ヒトＩｇＧ１重鎖またはその断片である。特定の実施形態において、抗体重鎖またはその断片は、重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。そのような抗体重鎖またはその断片は、重鎖定常領域またはその断片をさらに含み得る。例えば、重鎖の定常領域またはその断片が融合タンパク質に含まれる場合、その抗体重鎖定常領域またはその断片は、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、および／またはＣＨ３ドメインのうちの１つまたは複数を含み得る。いくつかの実施形態によれば、抗体重鎖またはその断片は完全長抗体重鎖であり、すなわち、ＶＨ、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む抗体重鎖である。
特定の実施形態において、抗体サブユニットまたはその断片は、ＶＨを含まない抗体重鎖またはその断片である。そのような抗体重鎖またはその断片は、Ｆｃ領域を含み得る、本質的にそれからなる、またはＦｃ領域からなり得る。本開示の重鎖（またはその断片）含有複合体のいずれかに含まれ得るＦｃ領域の非限定的な例は次のアミノ酸配列を有する。
Figure 2022533671000004
本開示の複合体が、抗体重鎖またはその断片に融合されたノッティンペプチドを含む場合、ノッティンペプチドは、抗体重鎖またはその断片のＮ末端に融合され得る。あるいは、ノッティンペプチドは、抗体重鎖またはその断片のＣ末端に融合され得る。
抗体重鎖またはその断片に融合されたノッティンペプチドを含む複合体の場合、薬物は、融合タンパク質のノッティンペプチド部分に接合され得る。あるいは、薬物は、融合タンパク質の抗体重鎖またはその断片の部分に接合され得る。例えば、抗体重鎖またはその断片がＦｃ領域を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる場合、薬物は、Ｆｃ領域に接合され得る。これらの実施形態において、薬物は、Ｆｃ領域のＣＨ１ドメイン、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメイン、またはＦｃ領域のＣＨ３ドメイン、例えばＦｃ領域のＣ末端またはその近くに接合され得る。
いくつかの実施形態によれば、抗体サブユニットまたはその断片は、抗体軽鎖またはその断片である。特定の実施形態において、抗体軽鎖またはその断片は、カッパ（κ）軽鎖またはその断片、あるいはラムダ（λ）軽鎖またはその断片を含む。いくつかの実施形態によれば、抗体軽鎖またはその断片は、軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。そのような抗体軽鎖またはその断片は、抗体軽鎖定常領域（ＣＬ）またはその断片をさらに含み得る。特定の実施形態において、抗体軽鎖またはその断片は、完全長抗体軽鎖、すなわち、ＶＬおよびＣＬを含む抗体軽鎖である。
本開示の複合体が、抗体軽鎖またはその断片に融合されたノッティンペプチドを含む場合、ノッティンペプチドは、抗体軽鎖またはその断片のＮ末端に融合され得る。あるいは、ノッティンペプチドを抗体軽鎖またはその断片のＣ末端に融合され得る。
抗体軽鎖またはその断片に融合されたノッティンペプチドを含む複合体の場合、薬物は、融合タンパク質のノッティンペプチド部分に接合され得る。あるいは、薬物は、融合タンパク質の抗体軽鎖またはその断片の部分に接合され得る。例えば、薬物は、ＶＬ（存在する場合）またはＣＬ（存在する場合）に、例えば、ＣＬのＣ末端またはその近くに接合され得る。
特定の実施形態において、本開示の複合体が、重鎖可変領域（ＶＨ）または軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体サブユニットまたはその断片に融合されたノッティンペプチドを含む場合、そのＶＨまたはＶＬは、ノッティンの操作されたループが結合する細胞表面分子を含む細胞の表面の抗原には結合しない。特定の実施形態において、本開示の複合体が、重鎖可変領域（ＶＨ）または軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体サブユニットまたはその断片に融合されたノッティンペプチドを含む場合、ノッティンはそのＶＨまたはＶＬに融合され、そのＶＨまたはＶＬが抗原に結合しないようにする。
抗体サブユニットまたはその断片に融合したノッティンペプチドを含む複合体で使用される薬物は、任意の適切な薬剤であり得、複合体が使用される用途、例えば、殺傷、細胞増殖の防止などに応じて変化する。複合体に含まれ得る薬物の非限定的な例には、毒素、毒素の断片、抗増殖剤、抗腫瘍剤などが挙げられる。特定の態様では、複合体は、細胞増殖の阻害および／または細胞／組織を殺滅させることによって標的細胞／組織の機能を低下させる薬剤を含む。そのような薬剤は、様々であり、細胞増殖抑制剤および細胞傷害性剤、例えば、標的細胞へ内在化されるかどうかに関わらず標的細胞組織を殺滅させることができる薬剤を含み得る。
ある特定の態様において、複合体の薬物は、エンジイン、レキシトロプシン、デュオカルマイシン、タキサン、ピューロマイシン、ドラスタチン、メイタンシノイド、およびビンカアルカロイドから選択される細胞傷害性剤などの細胞傷害性剤である。ある特定の実施形態によれば、細胞傷害性剤は、パクリタキセル、ドセタキセル、ＣＣ－１０６５、ＣＰＴ－１１（ＳＮ－３８）、トポテカン、ドキソルビシン、モルホリノ－ドキソルビシン、リゾキシン、シアノモルホリノ－ドキソルビシン、ドラスタチン－１０、エキノマイシン、コンブレタスタチン、カリケアマイシン、メイタンシン、メイタンシンＤＭ１、メイタンシンＤＭ４、ＤＭ－１、アウリスタチンＥもしくはアウリスタチンＦなどのアウリスタチンもしくは他のドラスタチン誘導体、ＡＥＢ（ＡＥＢ－０７１）、ＡＥＶＢ（５－ベンゾイルバレリン酸－ＡＥエステル）、ＡＥＦＰ（抗体－エンドスタチン融合タンパク質）、ＭＭＡＥ（モノメチルアウリスタチンＥ）、ＭＭＡＦ（モノメチルアウリスタチンＦ）、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、エレウテロビン、ネットロプシン、またはこれらの任意の組み合わせである。
ある特定の実施形態によれば、複合体の薬物は、ＨＴＩ－２８６等のヘミアステリンおよびヘミアステリン類似体（例えば、参照によりそれらの全開示が本明細書に組み込まれる米国特許第７，５７９，３２３号、ＷＯ２００４／０２６２９３号、および米国特許第８，１２９，４０７号を参照）、アブリン、ブルシン、シクトキシン、ジフテリア毒素、バトラコトキシン、ボツリヌス毒素、志賀毒素、内毒素、シュードモナス外毒素、シュードモナス内毒素、破傷風毒素、百日咳毒素、炭疽毒素、コレラ毒素、ファルカニントキシン、フモニシンＢ１、フモニシンＢ２、α毒素、モーロトキシン、アジトキシン、カリブドトキシン、マーガトキシン、スロトキシン、スキラトキシン、ヘフトキシン、カルシセプチン、タイカトキシン、カルシクルジン、ゲルダナマイシン、ゲロニン、ロトストラリン、オクラトキシンＡ、パツリン、リシン、ストリキニーネ、トリコテシン、ゼアラレノン、およびテトラドラキシンなどから選択されるタンパク質毒素である。用いることができる酵素的に活性な毒素およびその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（緑膿菌由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α－サルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ－Ｓ）、ニガウリ阻害剤、クルシン、クロチン、サボン草阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシンおよびトリコテセンが含まれる。
特定の実施形態において、複合体の薬物は、抗微小管剤、チューブリン阻害剤、アウリスタチン、アウリスタチンＥ、アウリスタチンＦ、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、アウリスタチンＷ誘導体、メイタンシン、メイタンシン誘導体、Ｎ２’－デアセチル－Ｎ２’－（３－メルカプト－１－オキソプロピル）－マイタンシン（ＤＭ１）、ラブタンシン（ＤＭ４）、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、カリケアマイシン、デュオカルマイシン、ドキソルビシン、ＳＮ－３８、ＤＸｄ、リポソームドキソルビシン、およびツブリシンから選択される。
いくつかの実施形態によれば、複合体の薬物はヌクレオシド薬物である。そのようなヌクレオシド薬は、ヌクレオシド類似体であり得る。使用できるヌクレオシド類似体の非限定的な例には、ゲムシタビン、シタラビン、トロキサシタビン、デシタビン、クラドリビン、フルダラビン、クロファラビン、および２’－Ｃ－シアノ－２’－デオキシ－１－β－Ｄ－アラビノ－ペントフラノシルシトシン（ＣＮＤＡＣ）が挙げられる。
任意の適切なリンカーを、抗体重鎖またはその断片に融合したノッティンペプチドを含む複合体に使用することができる。そのようなリンカーの非限定的な例は、ノッティン－薬物複合体に関連する上述部分に記載されており、その説明は、ここに組み込まれるが、簡潔にするためにここでは繰り返されない。特定の実施形態において、抗体重鎖またはその断片に融合されたノッティンペプチドを含む複合体は、バリン－シトルリンジペプチド、バリン－アラニンジペプチド、またはその両方を含むリンカーを含む。いくつかの実施形態によれば、リンカーは、バリルアラニルパラアミノベンジルオキシ（Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ）リンカーである（図１のパネルａに概略的に示されている）。特定の実施形態において、リンカーは、バリルアラニルパラアミノベンジルオキシ（Ｖａｌ－Ａｌａ－ＰＡＢ）リンカーである。
複合体を作製する方法
本開示の態様は、複合体を作製する方法をさらに含む。そのような方法は、ノッティン－薬物複合体の場合は薬物をノッティンペプチドに接合すること、またはノッティン－抗体サブユニット複合体の場合はノッティンペプチドまたは抗体サブユニットもしくはその断片に薬物を接合することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、薬物をノッティンペプチドまたは抗体サブユニットもしくはその断片に部位特異的に接合させることを含む。例えば、接合させることは、薬物を、ノッティンペプチドまたは抗体サブユニットもしくはその断片の事前に選択されたアミノ酸に部位特異的に接合させることを含み得る。特定の態様では、予め選択されたアミノ酸は、ノッティンペプチドまたは抗体サブユニットもしくはその断片のＮ末端またはＣ末端にある。他の態様では、事前に選択されたアミノ酸は、ノッティンペプチドまたは抗体サブユニットもしくはその断片の内部、すなわち、ノッティンペプチドまたは抗体サブユニットもしくはその断片のＮ末端アミノ酸とＣ末端アミノ酸との間にある。いくつかの実施形態では、予め選択されたアミノ酸は、非天然アミノ酸である。コンジュゲーションを容易にするためにノッティンペプチド又は抗体サブユニットもしくはその断片に提供され得る非天然アミノ酸の非限定的な例としては、アジド、アルキン、アルケン、アミノオキシ、ヒドラジン、アルデヒド（例えば、ホルミルグリシン、例えば、ＣａｔａｌｅｎｔＰｈａｒｍａＳｏｌｕｔｉｏｎｓのＳＭＡＲＴａｇ（商標）ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ニトロン、ニトリルオキシド、シクロプロペン、ノルボルネン、イソシアニド、ハロゲン化アリール、およびボロン酸官能基から選択される官能基を有するものが挙げられる。目的の官能基を提供するために組み込まれ選択され得る非天然アミノ酸は公知であり、例えば、Ｍａｚａら（２０１５）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ、Ｃｈｅｍ．２６（９）：１８８４－９；Ｐａｔｔｅｒｓｏｎｅｔａｌ．（２０１４）ＡＣＳＣｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．９：５９２－６０５；Ａｄｕｍｅａｕｅｔａｌ．（２０１６）Ｍｏｌ．ＩｍａｇｉｎｇＢｉｏｌ．（２）：１５３－６５、およびその他に記載されている。
リンカーを介して薬物とノッティンペプチドまたは抗体サブユニットもしくはその断片を接合させるための多くの戦略が利用可能である。例えば、薬物は、その薬物にリンカーを共有結合させることによって誘導体化することができ、そのリンカーは、ノッティンペプチドまたは抗体サブユニットもしくはその断片上の「化学的ハンドル」と反応することができる官能基を有する。また例として、ノッティンペプチドまたは抗体サブユニットもしくはその断片は、そのノッティンペプチドまたは抗体サブユニットもしくはその断片にリンカーを共有結合させることによって誘導体化することができ、そのリンカーは薬物上の「化学的ハンドル」と反応することができる官能基を有する。リンカー上の官能基は様々であり得、ノッティンペプチドまたは抗体サブユニットもしくはその断片における化学的ハンドルとの適合性に基づいて選択され得る。一実施形態によれば、化学的ハンドルは、化学的ハンドルを有する非天然アミノ酸を薬物またはノッティンペプチドまたは抗体サブユニットもしくはその断片に組み込むことによって提供される。いくつかの実施形態において、薬物と、ノッティンペプチドまたは抗体サブユニットもしくはその断片との接合は、銅フリーひずみ促進環化付加、アルキン－アジド環化付加などによるものである。
組成物
上記に要約したように、本開示は組成物を提供する。組成物は、上記の複合体のセクションに記載されているもののいずれかを含む、本開示の複合体のいずれかを含み得、それはここに組み込まれるが簡潔にするために繰り返されない。
特定の態様では、組成物は、液体媒体中に存在する本開示の複合体を含む。液体媒体は、水、緩衝溶液等の水性液体媒体であってもよい。１つ又は複数の添加剤、例えば、塩（例えば、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４）、緩衝剤（トリス緩衝液、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－Ｎ’－（２－エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸ナトリウム塩（ＭＥＳ）、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ－トリス［ヒドロキシメチル］メチル－３－アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）等）、プロテアーゼ阻害剤、グリセロール等が、そのような組成物中に存在してもよい。
医薬組成物もまた提供される。医薬組成物は、本開示の複合体のいずれか、および薬学的に許容される担体を含む。医薬組成物は、通常、治療有効量の複合体を含む。「治療有効量」とは、所望の結果をもたらすのに十分な投与量、例えば、有益なまたは所望の治療（予防を含む）結果、例えば操作されたループが特異的に結合する細胞表面分子に関連する細胞増殖障害（例えば、癌）を有する個体における細胞増殖の減少などをもたらすのに十分な量を意味する。有効量は、１回または複数回の投与で投与され得る。
本開示の複合体は、治療用投与のための種々の製剤に組み込むことができる。より具体的には、複合体は、適切な薬学的に許容される賦形剤または希釈剤との組み合わせによって、医薬組成物に製剤化することができ、錠剤、カプセル、散剤、顆粒、軟膏、溶液、注射剤、吸入剤およびエアロゾルなどの固体、半固体、液体または気体の形態での調製物で製剤化することができる。
個体への投与に好適な（例えば、ヒト投与に好適な）本開示の複合体の製剤は、一般に無菌であり、選択される投与経路に従って個体に投与するには禁忌である検出可能な発熱物質または他の混入物質をさらに含まない状態であり得る。
医薬剤形で、複合体は、単独でまたは他の薬学的に活性な化合物との適切な関連付けおよび組み合わせで、投与することができる。以下の方法および賦形剤は単なる例であり、決して限定するものではない。
経口製剤の場合、ラクトース、マンニトール、コーンスターチまたはジャガイモデンプンなどの従来の添加剤、結晶セルロース、セルロース誘導体、アラビアゴム、コーンスターチまたはゼラチンなどの結合剤、コーンスターチ、ジャガイモデンプンまたはカルボキシメチルセルロースナトリウムなどの崩壊剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、および所望により、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存剤および香味剤を用いて、錠剤、散剤、顆粒またはカプセル剤を製造するために、複合体を単独でまたは適切な添加剤と組み合わせて使用することができる。
複合体は、植物油もしくは他の類似の油、合成脂肪酸グリセリド、高次脂肪酸のエステル、またはプロピレングリコール等の水性溶媒もしくは非水性溶媒に溶解、懸濁または乳化することによって、また、所望な場合、可溶化剤、等張剤、懸濁化剤、乳化剤、安定剤および保存剤等の従来の添加剤を用いて、注射用製剤に製剤化することができる。
医薬組成物は、液体形態、凍結乾燥形態、または凍結乾燥形態から再構成された液体形態であってもよく、凍結乾燥製剤は投与前に滅菌溶液で再構成されるものである。凍結乾燥組成物を再構成するための標準的な手順は、一定量の純水（典型的には、凍結乾燥の際に除去された体積と等量である）を加え戻すことであるが、非経口投与用の医薬組成物の製造のために抗菌剤を含む溶液が使用されてもよい。
複合体の水性製剤は、ｐＨ緩衝溶液中、例えば約４．０～約８．０の範囲のｐＨ、約４．５～約７．５など、例えば約５．０～約７．０の範囲のｐＨで調製され得る。この範囲内のｐＨに好適である緩衝剤の例には、リン酸緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤、クエン酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、および他の有機酸緩衝剤が含まれる。緩衝剤の濃度は、例えば、緩衝剤および製剤の所望の張性により、約１ｍＭ～約１００ｍＭ、または約５ｍＭ～約５０ｍＭであり得る。
方法
上記に要約したように、本開示の複合体を使用する方法も提供される。いくつかの実施形態では、当該方法は、上記の複合体のセクションに記載されている複合体のいずれかを使用することを含み、それはここに組み込まれるが簡潔にするためにここでは繰り返さない。
いくつかの実施形態では、治療有効量の本開示のいずれかの複合体またはいずれかの医薬組成物を、それを必要とする個体に投与することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、個体は癌を有し、操作されたループは、個体に存在する癌細胞上の細胞表面分子に結合する。したがって、本開示の態様は、癌を有する個体に、治療有効量のいずれかの本開示の複合体またはいずれかの本開示の医薬組成物を投与することによって癌を治療する方法を含む。様々な個体が当該方法に従って治療可能である。通常、そのような対象は「哺乳動物」または「哺乳類」であり、これらの用語は、肉食目（例えば、イヌおよびネコ）、げっ歯目（例えば、マウス、モルモットおよびラット）、および霊長目（例えば、ヒト、チンパンジー、およびサル）を含む哺乳類綱内の生物を記述するために広く使用される。いくつかの実施形態において、個体はヒトである。いくつかの実施形態では、個体は、マウスモデルなどの動物モデルである。
いくつかの実施形態では、有効量の複合体（またはこれを含む医薬組成物）は、単独で（例えば、単剤療法において）、または１つもしくは複数のさらなる治療薬剤と組み合わせて（例えば、併用療法において）、１回または複数回の用量で投与されたときに、当該複合体または医薬組成物を用いる治療が存在しない状態での個体の症状と比較して、個体の医学的状態（例えば、癌など）の症状を、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、またはそれ以上、減少させるのに有効な量である。
いくつかの実施形態では、個体は、固形腫瘍、半固形腫瘍、原発腫瘍、転移性腫瘍などの存在を特徴とする癌を有する。いくつかの実施態様では、個体は、乳癌、黒色腫、肺癌、結腸直腸癌、前立腺癌、神経膠腫、膀胱癌、子宮内膜癌、腎臓癌、白血病（例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ））肝臓癌（例えば、肝細胞癌（ＨＣＣ）、例えば、原発性または再発性ＨＣＣ）、非ホジキンリンパ腫、膵臓癌、甲状腺癌、それらの任意の組み合わせ、およびそれらのサブタイプから選択される癌を有する。
「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」とは、個体の医学的状態（例えば、細胞増殖性障害、例えば、癌）に関連する症状の少なくとも改善を意味し、改善は、例えば症状など、治療中の医学的状態に関連するパラメーターの大きさの少なくとも低下を指すために広義に使用される。したがって、治療はまた、個体がその医学的状態、または少なくともその医学的状態を特徴付ける症状にそれ以上苦しむことがないように、医学的状態または少なくとも医学的状態に関連付けられた症状が完全に阻止された、例えば、発生が防止された、または停止された、例えば、中断された状態を含む。
複合体または医薬組成物は、インビボおよびエクスビボの方法、ならびに全身および局所的な投与経路を含め、薬物送達に好適な任意の利用可能な方法および経路を使用して、個体に投与され得る。従来のおよび医薬的に許容される投与経路としては、鼻腔内、筋肉内、気管内、皮下、皮内、局所適用、眼内、静脈内、動脈内、経鼻、経口、および他の腸内および非経口投与経路が含まれる。いくつかの態様では、投与は非経口投与によるものである。投与経路は、複合体および／または所望の効果に応じて、組み合わせることができ、または必要に応じて調節することができる。複合体または医薬組成物は、単回投与または複数回投与で投与することができる。いくつかの実施形態では、複合体または医薬組成物は、静脈内投与される。いくつかの実施形態では、複合体または医薬組成物は、例えば、全身送達（例えば、静脈内注入）のために、または局所部位に、注射によって投与される。
いくつかの実施形態では、個体は固形腫瘍を有する。いくつかの実施形態では、個体が固形腫瘍を有する場合、方法は、本開示のノッティン薬物複合体（ＫＤＣ）を個体に投与することを含む。本明細書に示されるように、そのような複合体は、高分子量標的剤と比較して、固形腫瘍への予想外に有益な浸透を示す。
いくつかの実施形態では、個体は、その治療が複合体に血液脳関門（ＢＢＢ）を通過させることを必要とする癌を有する。そのような癌の非限定的な例は、脳腫瘍、例えば、膠芽腫などである。いくつかの実施形態において、個体が、その治療が複合体にＢＢＢを通過させることを必要とする癌を有する場合、方法は、本開示のノッティン－薬物複合体（ＫＤＣ）などの、本開示の低分子量複合体を個体に投与することを含む。
キット
本開示の態様は、キットをさらに含む。いくつかの実施形態において、主題キットは、本開示の複合体のいずれか（上記の複合体のセクションに記載されているいずれかのものを含み、それはここに組み込まれるが簡潔にするためにここでは繰り返されない）またはそれを含む医薬組成物と、それを必要とする個人に医薬組成物を投与するための説明書とを含む。
いくつかの実施形態において、複合体または医薬組成物は、１つまたは複数（例えば、２つ以上）の単位投薬量で存在する。「単位投与量」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒトおよび動物対象のための単一投与量として適切な物理的に別個の単位を指し、各単位は、所望の効果をもたらすのに十分な量で計算された所定量の複合体または組成物を含有する。単位用量の量は、当該個人において、使用される特定の複合体、達成されるべき効果、および複合体に関連する薬力学などの様々な要因に依存する。さらに他の実施形態では、キットは、複合体または医薬組成物の単一の複数投与量を含み得る。
キットの成分は、別々の容器内に存在してよく、または複数の成分が単一の容器内に存在してもよい。
キットに含まれる説明書は、適切な記録媒体に記録され得る。例えば、説明書は、紙またはプラスチックなどの基材上に印刷することができる。したがって、説明書は、キット内に含まれる説明書として、キットの容器またはその構成要素にあるラベリング（すなわち、包装またはサブ包装に関連するもの）などに存在し得る。他の実施形態では、説明書は、ポータブルフラッシュドライブ、ＤＶＤ、ＣＤ－ＲＯＭ、ディスケットなどの適切なコンピュータ可読記憶媒体上に存在する電子記憶データファイルとして存在する。さらに他の実施形態では、実際の説明書はキット中には存在しないが、例えばインターネットを介してリモートソースから説明書を取得するための手段が提供される。この実施形態の一例は、説明書を閲覧および／またはダウンロードすることができるウェブアドレスを含むキットである。説明書の場合と同様に、説明書を得るための手段は、好適な基材上に記録される。
添付の特許請求の範囲にかかわらず、本開示は、以下の実施形態によっても定義される。
１．複合体であって、
細胞表面分子に結合する操作されたループを含むノッティンペプチドと、
リンカーを介してノッティンペプチドに接合された抗微小管剤と、
を含む複合体。
２．前記抗微小管剤が、チューブリン阻害剤である、実施形態１に記載の複合体。
３．前記チューブリン阻害剤が、アウリスタチンである、実施形態２に記載の複合体。
４．前記チューブリン阻害剤が、アウリスタチンＥまたはアウリスタチンＦである、実施形態３に記載の複合体。
５．前記チューブリン阻害剤が、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）またはモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）である、実施形態４に記載の複合体。
６．前記リンカーが酵素切断可能リンカーである、実施形態１～５のいずれか１つに記載の複合体。
７．前記酵素切断可能リンカーが、プロテアーゼ切断可能リンカーである、実施形態６に記載の複合体。
８．前記リンカーが、バリン－シトルリンジペプチド、バリン－アラニンジペプチド、またはその両方を含む、実施形態７に記載の複合体。
９．前記リンカーが、バリン－シトルリン－パラアミノベンジルオキシ（Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ）リンカーである、実施形態８に記載の複合体。
１０．前記リンカーが、バリルアラニルパラアミノベンジルオキシ（Ｖａｌ－Ａｌａ－ＰＡＢ）リンカーである、実施形態８に記載の複合体。
１１．複合体であって、
細胞表面分子に結合する操作されたループを含むノッティンペプチドが、抗体サブユニットまたはその断片に融合されたものを含む、融合タンパク質と、
リンカーを介して前記融合タンパク質に接合された薬物と、
を含む、複合体。
１２．前記抗体サブユニットまたはその断片が、抗体重鎖またはその断片である、実施形態１１に記載の複合体。
１３．前記抗体重鎖またはその断片が、γ、α、δ、ε、もしくはμ抗体重鎖またはその断片を含む、実施形態１２に記載の複合体。
１４．前記抗体重鎖またはその断片が、ＩｇＧ重鎖またはその断片である、実施形態１３に記載の複合体。
１５．前記ＩｇＧ重鎖またはその断片が、ＩｇＧ１重鎖またはその断片である、実施形態１４に記載の複合体。
１６．前記抗体重鎖またはその断片が、重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、実施形態１２～１５のいずれか１つに記載の複合体。
１７．前記抗体重鎖またはその断片が、重鎖定常領域またはその断片をさらに含む、実施形態１６に記載の複合体。
１８．前記抗体重鎖定常領域またはその断片が、ＣＨ１ドメインを含む、実施形態１７に記載の複合体。
１９．前記抗体重鎖定常領域またはその断片が、ＣＨ２ドメインをさらに含む、実施形態１８に記載の複合体。
２０．前記抗体重鎖定常領域またはその断片が、ＣＨ３ドメインをさらに含む、実施形態１９に記載の複合体。
２１．前記抗体重鎖またはその断片が、完全長の抗体重鎖である、実施形態２０に記載の複合体。
２２．前記抗体の重鎖またはその断片が、ＶＨを含まない、実施形態１２～１５のいずれか１つに記載の複合体。
２３．前記抗体重鎖またはその断片が、Ｆｃ領域を含む、実施形態２２に記載の複合体。
２４．前記ノッティンペプチドが、抗体重鎖またはその断片のＮ末端に融合されている、実施形態１２～２３のいずれか１つに記載の複合体。
２５．前記ノッティンペプチドが、抗体重鎖またはその断片のＣ末端に融合されている、実施形態１２～２３のいずれか１つに記載の複合体。
２６．前記薬物がノッティンペプチドに接合している、実施形態１２～２５のいずれか１つに記載の複合体。
２７．前記薬物が抗体重鎖またはその断片に接合している、実施形態１２～２５のいずれか１つに記載の複合体。
２８．前記抗体重鎖またはその断片が、Ｆｃ領域を含み、前記薬物が前記Ｆｃ領域に接合している、実施形態２７に記載の複合体。
２９．前記薬物が、Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインに接合している、実施形態２８に記載の複合体。
３０．前記薬物が、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインに接合している、実施形態２８に記載の複合体。
３１．前記抗体サブユニットまたはその断片が、抗体軽鎖またはその断片である、実施形態１１に記載の複合体。
３２．前記抗体軽鎖またはその断片が、カッパ（κ）軽鎖またはその断片である、実施形態３１に記載の複合体。
３３．前記抗体軽鎖またはその断片が、ラムダ（λ）軽鎖またはその断片である、実施形態３１に記載の複合体。
３４．前記抗体軽鎖またはその断片が、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、請求３１～３３のいずれか１つに記載の複合体。
３５．前記抗体軽鎖またはその断片が、抗体軽鎖定常領域（ＣＬ）またはその断片をさらに含む、実施形態３４に記載の複合体。
３６．前記抗体軽鎖またはその断片が、完全長の抗体軽鎖である、実施形態３１～３５のいずれか１つに記載の複合体。
３７．前記ノッティンペプチドが、抗体軽鎖またはその断片のＮ末端に融合している、実施形態３１～３６のいずれか１つに記載の複合体。
３８．前記ノッティンペプチドが、抗体軽鎖またはその断片のＣ末端に融合している、実施形態３１～３６のいずれか１つに記載の複合体。
３９．前記薬物がノッティンペプチドに接合している、実施形態３１～３８のいずれか１つに記載の複合体。
４０．前記薬物が抗体軽鎖またはその断片に接合している、実施形態３１～３８のいずれか１つに記載の複合体。
４１．前記薬物が細胞毒性剤である、実施形態１１～４０のいずれか１つに記載の複合体。
４２．前記薬物が毒素である、実施形態１１～４０のいずれか１つに記載の複合体。
４３．前記薬物が抗微小管剤である、実施形態１１～４０のいずれか１つに記載の複合体。
４４．前記抗微小管剤が、チューブリン阻害剤である、実施形態４３に記載の複合体。
４５．前記チューブリン阻害剤が、アウリスタチンである、実施形態４４に記載の複合体。
４６．前記チューブリン阻害剤が、アウリスタチンＥまたはアウリスタチンＦである、実施形態４５に記載の複合体。
４７．前記チューブリン阻害剤が、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）またはモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）である、実施形態４６に記載の複合体。
４８．前記薬物がヌクレオシド薬物である、実施形態１１～４０のいずれか１つに記載の複合体。
４９．前記ヌクレオシド薬がヌクレオシド類似体である、実施形態４８に記載の複合体。
５０．前記ヌクレオシド類似体が、ゲムシタビン、シタラビン、トロキサシタビン、デシタビン、クラドリビン、フルダラビン、クロファラビン、および２’－Ｃ－シアノ－２’－デオキシ－１－β－Ｄ－アラビノ－ペントフラノシルシトシン（ＣＮＤＡＣ）からなる群から選択される、実施形態４９に記載の複合体。
５１．前記リンカーが酵素切断可能リンカーである、実施形態１１～５０のいずれか１つに記載の複合体。
５２．前記酵素切断可能リンカーが、プロテアーゼ切断可能リンカーである、実施形態５１に記載の複合体。
５３．前記リンカーが、バリン－シトルリンジペプチド、バリン－アラニンジペプチド、またはその両方を含む、実施形態５２に記載の複合体。
５４．前記リンカーが、バリン－シトルリン－パラアミノベンジルオキシ（Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ）リンカーである、実施形態５３に記載の複合体。
５５．前記リンカーが、バリルアラニルパラアミノベンジルオキシ（Ｖａｌ－Ａｌａ－ＰＡＢ）リンカーである、実施形態５３に記載の複合体。
５６．前記ノッティンペプチドが、ＥＥＴＩ－ＩＩペプチド、ＡｇＲＰペプチド、ω－コノトキシンペプチド、カラタＢ１ペプチド、ＭＣｏＴＩ－ＩＩペプチド、アガトキシンペプチド、およびクロロトキシンペプチドからなる群から選択される、実施形態１～５５のいずれか１つに記載の複合体。
５７．前記細胞表面分子が癌細胞表面分子である、実施形態１～５６のいずれか１つに記載の複合体。
５８．前記癌細胞表面分子が、固形腫瘍の癌細胞上に存在する、実施形態５７に記載の複合体。
５９．前記細胞表面分子が細胞表面受容体である、実施形態１～５７のいずれか１つに記載の複合体。
６０．前記細胞表面受容体が細胞接着受容体である、実施形態５９に記載の複合体。
６１．前記細胞接着受容体がインテグリンである、実施形態６０に記載の複合体。
６２．前記インテグリンが、αｖβ１インテグリン、αｖβ３インテグリン、αｖβ５インテグリン、αｖβ６インテグリン、α５β１インテグリン、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、実施形態６０に記載の複合体。
６３．前記細胞表面受容体がケモカイン受容体である、実施形態５９に記載の複合体。
６４．前記ケモカイン受容体が、Ｃ－Ｘ－Ｃケモカイン受容体タイプ４（ＣＸＣＲ４）である、実施形態６３に記載の複合体。
６５．前記細胞表面分子が成長因子受容体である、実施形態５９に記載の複合体。
６６．前記細胞表面受容体が免疫細胞受容体である、実施形態５９に記載の複合体。
６７．前記免疫細胞受容体が細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）である、実施形態６６に記載の複合体。
６８．前記細胞表面受容体がニューロピリン－１（ＮＲＰ１）である、実施形態５９に記載の複合体。
６９．前記細胞表面分子が膜プロテアーゼである、実施形態１～５７のいずれか１つに記載の複合体。
７０．前記膜プロテアーゼがマトリプターゼである、実施形態６９に記載の複合体。
７１．実施形態１～７０のいずれか１つに記載の複合体を含む組成物。
７２．前記組成物が、
前記複合体と、
薬学的に許容される担体と、
を含む、医薬組成物である、実施形態７１に記載の組成物。
７３．前記医薬組成物が非経口投与のために製剤化されている、実施形態７２に記載の組成物。
７４．前記医薬組成物が経口投与のために製剤化されている、実施形態７２に記載の組成物。
７５．治療有効量の、実施形態７２に記載の医薬組成物と、
前記医薬組成物を、それを必要とする個体に投与するための説明書と、
を含む、キット。
７６．前記医薬組成物が、１つ以上の単位用量で存在する、実施形態７５に記載のキット。
７７．治療有効量の、実施形態７２に記載の前記医薬組成物を、それ必要とする個体に投与することを含む、方法。
７８．前記個体が癌を有し、前記操作されたループが、前記個体に存在する癌細胞上の細胞表面分子に結合する、実施形態７７に記載の方法。
７９．前記細胞表面分子が細胞表面受容体である、実施形態７８に記載の方法。
８０．前記細胞表面受容体が細胞接着受容体である、実施形態７９に記載の方法。
８１．前記細胞接着受容体がインテグリンである、実施形態８０に記載の方法。
８２．前記インテグリンが、αｖβ１インテグリン、αｖβ３インテグリン、αｖβ５インテグリン、αｖβ６インテグリン、α５β１インテグリン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、実施形態８１に記載の方法。
８３．前記個体が、前記癌細胞を含む固形腫瘍を有する、実施形態８２に記載の方法。
８４．前記固形腫瘍が脳腫瘍である、実施形態８３に記載の方法。
以下の実施例は、限定ではなく例示として提供される。
実験
実施例１－ノッティンベースの複合体の製造
タンパク質生物製剤のサイズ範囲にわたるタンパク質－薬物複合体のセットを作成するために、ノッティン（Ｋ）、ノッティン－Ｆｃ融合（ＫＦｃ）、およびノッティン－Ａｂ融合（ＫＡｂ）を生成した（図１Ｂ）。ノッティンは、以前に操作されたノッティン、ＥＥＴＩ２．５Ｆに基づいており、濃度測定を容易にするために修飾されている（図２）。ノッティンは、固相ペプチド合成によって生成され、折り畳まれ精製された。次に、ＫＦｃを作成するためにＥＥＴＩ２．５ＦをヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインに遺伝子融合し、ＫＡｂを作成するために、無関係な結合標的に対する完全長ヒトＩｇＧ１抗体（抗ＦＩＴＣまたは抗ヒトＣＥＡ）のＮ末端に遺伝子融合した。
ノッティン－薬物複合体（ＫＤＣ）は、銅フリーひずみ促進環化付加反応を介して、ＤＢＣＯリンカーを含むＶａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢＭＭＡＥ誘導体にＫを反応させることによって調製した（図３、図４）。ノッティン－Ｆｃ－薬物複合体（ＫＦＤＣ）およびノッティン－抗体－薬物複合体（ＫＡＤＣ）は、アルデヒドでタグ付けされたＫＦｃまたはＫＡｂとＨＩＰＳリンカーＭＭＡＥ誘導体のＨｙｄｒａｚｉｎｏ－Ｐｉｃｔｅｔ－Ｓｐｅｎｇｌｅｒライゲーション８９によって調製した。（図５－８）。
実施例２―インビトロでの特性評価
実施例１に記載の構築物の結合親和性を、Ｕ８７ＭＧ神経膠芽腫細胞を使用して測定した。薬物を含まないタンパク質親和性は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８コンジュゲートタンパク質を使用して直接測定し、薬物複合体は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識Ｋを置換する競合結合アッセイを介して測定した。試験したすべての構築物は、低ナノモル親和性でＵ８７ＭＧ細胞に結合した（図９Ａ－Ｂ）。測定された親和性は以前の研究と一致しており、ＦｃまたはＡｂへの遺伝子融合もＭＭＡＥへの接合も、ノッティンによる腫瘍標的化を、感知できるほどには妨害しないことを示している。
Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢリンカーの切断と、それに続くＭＭＡＥの放出および作用機序は、細胞内送達に依存している。したがって、各構築物が効率的に内在化されたことを検証することが重要であった。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８コンジュゲートタンパク質を細胞と３７℃でインキュベートすることにより内在化を測定した。４時間のインキュベーション後、表面に結合したタンパク質を、露出したフルオロフォアに結合する抗ＡＦ４８８抗体を使用してクエンチした。図１０Ａに示されるように、細胞を４℃でインキュベートして原形質膜を凍結することによって内在化が阻害される場合、測定された蛍光はベースラインに戻る。
すべての構築物は、対照を超える実質的な内在化を示した（図１０Ｂ）。各化合物の相対的な内在化は、最小から最大の順で、Ｋ、ＫＦｃ、次にＫＡｂであった。二価性がＫよりもＫＦｃの内在化の増加の主な原因であるかどうかを判断するために、一価の１アームＫＦｃを試験した。この一価のＦｃは同様の内在化を示し（図１０Ｃ）、価数が内在化の増加の主要な推進力ではないことを示している。制約されたＦｃヒンジ領域は、ＫＦｃが二価の相互作用を完全に利用したり、複数のインテグリンペアをクラスター化したりする能力を制限する可能性がある。逆に、ＫＡｂははるかにより高いノッティン間の柔軟性を有する。ノッティン間の距離と柔軟性を制限すると内在化が減少するかどうかを試験するために、ＥＥＴＩ２．５ＦをＮ末端ではなくＣ末端に遺伝的に融合させて、抗体ノッティン（ＡｂＫ）コンストラクトを構築した。図１０Ｄに示されるように、ＡｂＫは、ＫＦｃと同様のレベルの内在化を有し、ＫＡｂがより容易に複数のインテグリン対に結合しクラスター化させることを示唆している。
ＫＦｃとＡｂＫはどちらもＫよりも容易に内在化するため、ＦｃはＦｃ受容体または補体を介した経路を介して内在化を促進している可能性があるとの仮説が立てられた。Ｋ、ＫＦｃ、およびＫＡｂの内在化を、熱変性培地およびＰＢＳと０．１％ウシ血清アルブミンの緩衝液中で試験した（図１１）。熱変性培地またはＰＢＳでインキュベートしたコンストラクトはいずれも、完全培地でインキュベートしたコンストラクトと比較して内在化を有意に減少させることはなく、培地内の活性タンパク質（c1qなど）は、ＫＦｃおよびＫＡｂの内在化の増加にそれほど寄与していないことを示唆している。次に、各Ｋ、ＫＦｃ、一価ＫＦｃ、およびＫＡｂについて内在化の速度を測定し、これらの構築物をＦｃ遮断タンパク質または過剰の非コンジュゲート化Ｋの存在下で細胞とインキュベートした場合と比較した（図１２）。
各薬物複合体のインビトロ効力を、Ｕ８７ＭＧ細胞増殖の阻害を測定することによって試験した（図１３）。非コンジュゲート化タンパク質は忍容性が高く、１００ｎＭまで投与した際に有意な細胞死を誘発しなかった（図１３Ａ－Ｃ）。ＭＭＡＥは、単独で、１６．８ｎＭのＥＤ５０で適度の効力を示した。ＫＤＣ、ＫＦＤＣ、およびＫＡＤＣはすべて、インビトロで少し増加した効力を示し、それぞれのＥＤ５０値は４．９、６．５、および８．９ｎＭであった（図１３Ｄ）。
インビボ療法のより代表的なモデルでの各薬物複合体の活性を評価するために、ＲＦＰ発現Ｕ８７ＭＧ細胞をＳＹＴＯＸグリーンとインキュベートし４時間ごとに画像化して同様のアッセイを設定した。いくつかの時点の後、細胞を洗浄し、培地を新鮮な薬物含有培地または新鮮な薬物非含有培地のいずれかと交換した（図１４）。すべての複合体は、高い効力を維持し、わずか２４時間の曝露の後に増殖を阻害した（図１４Ｂ）。増殖を阻害する各薬物複合体の能力をさらに調査し、ＫＤＣがわずか３時間曝露で完全な細胞阻害を示し続けたことを明らかにした（図１４Ｃ）。細胞増殖の阻害は、測定された細胞毒性を反映していた。すべての複合体は、洗浄なし、薬物含有培地の洗浄あり、または２４時間後の洗浄を伴ってインキュベートした場合、ほぼ１００％の細胞死を誘導した（図１４Ｄ、１４Ｅ）。各コンストラクトは、さらにストリンジェントな条件下でも評価され、３時間の曝露後に洗浄した。ＫＤＣは強力な活性を維持し、細胞増殖の９５％超の阻害をもたらした（図１５）。ＫＦＤＣとＫＡＤＣはそれぞれの効力がかなり低下し、それぞれが細胞増殖の約５０％までを阻害した。
実施例３―薬物動態
インビボで腫瘍を標的とする各薬物複合体の能力を、Ｕ８７ＭＧ神経膠芽腫股関節異種移植片を有するマウスにＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０コンジュゲート化タンパク質を静脈内注射することによって評価した（図１６）。蛍光を、ＩＶＩＳスペクトルを使用した非侵襲的近赤外蛍光イメージングによって監視した。各時点で、腫瘍上の関心領域および別のコントロールＲＯＩの放射効率を計算して、血液中の蛍光標識薬物複合体のベータ半減期を概算し、それを保持された腫瘍シグナルと比較した。
腫瘍標的ビヒクルの薬物動態プロファイルは、サイズによって部分的に決まる。糸球体濾過のサイズカットオフ（一般的に文献で報告されているのは約７０ｋＤａ）を下回る低ＭＷビヒクルは、腎臓濾過によって迅速に除去される可能性が高くなる。ＫＤＣ（約５ｋＤａ）は腎クリアランスカットオフをはるかに下回り、ベータ半減期は１．４時間であり、急速な腎クリアランスを示唆している（図１７Ａ）。ＫＦＤＣ（約６５ｋＤａ）は、ＭＷが腎クリアランスカットオフに近く、ベータ半減期が１７．７時間であり、Ｆｃを介した半減期の延長によってさらに延長される可能性がある（図１７Ｂ）。ＫＡＤＣ（約１５０ｋＤａ）は、測定された最長のベータ半減期の２５．３時間であった（図１７Ｃ）。各複合体において、腫瘍シグナルはバックグラウンドよりも実質的に高く、バックグラウンドシグナルがベースラインに戻った後も持続した。ＫＤＣの場合、最大の腫瘍対バックグラウンド比は、投与の３～５時間後に観察された（図１７Ｄ）。ＫＦＤＣは、投与後約１０時間で最大の腫瘍対バックグラウンド比を獲得し、数日間高い比を維持した（図１７Ｅ）。ＫＡＤＣは中程度の腫瘍対バックグラウンド比を維持し、それは１週間にわたりさらに増加すらした（図１７Ｆ）。
腫瘍対バックグラウンド比をさらに評価するために、各臓器による蛍光標識薬物複合体の取り込みをエクスビボで測定した。Ｕ８７ＭＧ神経膠芽腫股関節異種移植片を有するヌードマウスに、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０コンジュゲート化タンパク質を静脈内注射した。３時間または２４時間後にマウスを犠牲にし、画像化のために臓器を取り出した。切除された腫瘍の放射効率は、他のすべての測定された臓器よりも有意に高かった。具体的には、肝臓、腎臓、脾臓、膵臓、心臓、肺、膀胱、大腿四頭筋、および大腿骨（図１８）。特に、これらのエクスビボデータは、ＫＤＣは腎臓でろ過され、ＫＡＤＣは肝臓で代謝され、ＫＦＤＣはこれら２つの間のどこかにあるという仮説を裏付けている。ＫＡＤＣは、ＫＦＤＣまたはＫＤＣよりも実質的に高い肝臓取り込みを示すが、それでも腫瘍内の信号の３０％未満である。ＫＤＣは腎臓と膀胱への取り込みが高く、腎臓の濾過によるクリアランスと尿中の排泄を示している。
実施例４―インビボでの有効性
インビトロでの高親和性結合、迅速な内在化およびＵ８７ＭＧ増殖の強力な阻害は、各薬物複合体がマウスモデルにおいて有意な可能性を有することを示唆した。画像および薬物動態データは、ＫＦＤＣ、および特にＫＡＤＣは数日間血中に存続する一方、ＫＤＣの循環半減期は短いことを示している。したがって、各薬物複合体の性能を評価するために、インビボ治療効果研究を設定した。
ＭＭＡＦ接合ＫＦＤＣは、５ｍｇ／ｋｇで週に３回投与した場合、中程度の効力を示した（データは示していない）。この治療レジメンを出発点として使用して、治療群ごとに５匹のマウスを使用して予備研究を設定した。マウスの右脇腹に５×１０６のＵ８７ＭＧ細胞を接種し、腫瘍がおよそ３０ｍｍ２の面積に到達するまで成長させ確立させた。次に、マウスを、ＰＢＳ、ＫＤＣ、ＫＦＤＣ、またはＫＡＤＣの４つの治療群のうちの１つにランダム化した。各群を同等に保ち、循環半減期の短かさにもかかわらずＫＤＣの有効性を最大限に高めるために、すべての薬物複合体群は週に３回、３週間投与した。各用量には、２．３８ｎｍｏｌのＭＭＡＥに正規化された適切な薬物複合体（約０．６ｍｇ／ｋｇＫＤＣ、約５ｍｇ／ｋｇＫＦＤＣ、約１０ｍｇ／ｋｇＫＡＤＣ）が含まれていた。
すべての薬物複合体は、対照マウスよりも生存を有意に延長した（図１９Ａ、１９Ｂ）。ＫＤＣは５匹中１匹のマウスで完全な腫瘍退縮を誘発し、残りの５匹中４匹のマウスで細胞増殖抑制効果を維持した（図１９Ｃ）。３週間の治療後、これら４匹のマウスの腫瘍は再発した。ＫＦＤＣおよびＫＡＤＣの両方は、それぞれの治療群あたり５匹のマウスすべてにおいて完全な腫瘍退縮をもたらした（図１９Ｃ）。重度の毒性の兆候を監視するために、実験期間中、すべてのマウスの体重も記録した。すべてのグループの重量は区別できず、化合物の忍容性が高いことを示唆している（図１９Ｄ）。
図１９のデータは、すべての薬物複合体が治療効果を発揮できることを示している。各化合物をさらに調査するために、実験計画にいくつかの変更を加えた。ＫＤＣの急速な全身クリアランスのために、注射された用量のかなりの部分が失われる可能性が高く、そのため、約０．６ｍｇ／ｋｇの用量を大幅に増加させた。化学療法剤の投与量は、従来、患者の体表面積あたりの化学療法剤の質量として決定されるため、等モルの比較よりも、より臨床的に適切な等しい質量の比較が選択された。次に、現実的な臨床投薬の考慮事項と一致するように、週に１回の投薬レジメンが選択された。最後に、腫瘍の成長を促進するために腫瘍をマトリゲルマトリックスと共に移植し、初期の腫瘍壊死を減少させるために注射あたりわずか２．５×１０６個の細胞を移植した。Ｕ８７ＭＧ股関節異種移植片を有するマウスを、ＫＤＣ、ＫＦＤＣ、ＫＡＤＣ、非コンジュゲート化タンパク質、またはＰＢＳ対照の治療グループに均等に分配し、静脈内注射を週に１回、４週間与えた。各薬物複合体を、低用量および高用量でも評価した。
より活発な腫瘍増殖を可能にするように最適化したにもかかわらず、低用量のＫＤＣ（１ｍｇ／ｋｇ）は、パイロット実験と同様に効いた（図２０Ａ、２０Ｂ）。１ｍｇ／ｋｇで投与されたＫＤＣは、腫瘍増殖を有意に遅延させたが、腫瘍退縮を引き起こさず、治療終了後、５匹中５匹のマウスで腫瘍が再成長した（図２０Ｃ）。高用量のＫＤＣ（５ｍｇ／ｋｇ）は非常に効果的であり、５匹中４匹のマウスで腫瘍の完全な退縮を引き起こし、残りのマウスでは腫瘍の成長を有意に遅らせた（図２０Ｃ）。非コンジュゲート化Ｋで処理されたマウスは、ＰＢＳ対照マウスと区別がつかなかった。
パイロット実験とは対照的に、ＫＦＤＣとＫＡＤＣは、より攻撃的な腫瘍モデルでは有効性が大幅に低下した。低用量のＫＦＤＣ（５ｍｇ／ｋｇ）は、腫瘍の成長を中程度に抑制し（図２１Ａ、２１Ｂ）、５匹中１匹のマウスで腫瘍の退縮を引き起こした。５匹中４匹のマウスで、腫瘍の成長は遅くなったが、止まらなかった（図２１Ｃ）。高用量のＫＦＤＣ（１０ｍｇ／ｋｇ）は、５匹中２匹のマウスで腫瘍の完全な退縮を引き起こし、残りの５匹中３匹のマウスで腫瘍増殖を有意に遅らせた（図２１Ｃ）。非コンジュゲート化ＫＦｃで処理されたマウスは、ＰＢＳ対照マウスと区別がつかなかった。
低用量のＫＡＤＣ（５ｍｇ／ｋｇ）は最小限の効果しかなかった（図２２Ａ、２２Ｂ）。腫瘍の成長は、５匹中５匹のマウスでわずかに遅くなっただけであった（図２２Ｃ）。高用量のＫＡＤＣ（１０ｍｇ／ｋｇ）もまた、著しい効力を欠き（図２２Ａ、２２Ｂ）、すべてのマウスにおいて腫瘍増殖を穏やかに遅らせたが、腫瘍退縮の誘発はなかった（図２２Ｃ）。非コンジュゲート化ＫＡｂ（抗ＣＥＡ）で処理されたマウスは、ＰＢＳ対照マウスと区別がつかなかった。
マウス体重１ｋｇあたりの薬物複合体の質量という臨床的に関連する比較を使用して薬物複合体を比較すると、ＫＤＣはＫＦＤＣとＫＡＤＣの両方を有意に上回った（図２３）。これらの結果とパイロット研究との間の不一致を理解するために、ＭＡＥの等モル用量に近い、はるかに高い用量の３０ｍｇ／ｋｇで投与されたＫＡＤＣでもマウスを処置した。この実験では、ＫＡＤＣは非常に効果的であり、５匹中５匹のマウスで完全な腫瘍退縮を誘発した（図２４）。
ＡＤＣは固形腫瘍（ＲＥＦ）へ腫瘍浸透が限られていることが知られているため、より攻撃的な腫瘍モデルで観察されたＫＡＤＣの効力の低下は、均一な腫瘍送達の欠如を示唆している。Ｃｉｌｌｉｅｒｓらは２０１８年に、ＡＤＣの腫瘍浸透の欠如は、標的結合部位をめぐって競合する非コンジュゲート化抗体との同時投与によって改善できることを実証した。固形腫瘍への不均一な送達が、ＫＡＤＣの限られた有効性を説明する重要な要因であるという仮説を試験するために、次にマウスを、インテグリン受容体を飽和させＫＡＤＣによる腫瘍浸透の増加を促進させるように、１０ｍｇ／ｋｇ ＫＡＤＣと２０ｍｇ／ｋｇ非コンジュゲート化ＫＡｂの組み合わせで処置した。この併用治療は、１０ｍｇ／ｋｇ ＫＡＤＣの有効性を有意に増加させ、それはより高濃度のＫＡＤＣでの治療に匹敵していた（図２５）。
ＫＤＣのインビボでの有効性は優れているにもかかわらず、急速な腎濾過およびＭＭＡＥの高いモル用量を考慮すると急性毒性の潜在的な懸念がある。治療を受けたマウスでは体重減少は観察されなかったが、治療を受けたマウスの臓器の健康状態をより厳密に評価する必要があった。６０日間の実験後、処置したマウスから肝臓と腎臓を採取し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定し、組織切片化のためにパラフィンブロックに包埋した。細胞構造を視覚化するために切片はヘマトキシリンおよびエオシンで染色され、急性毒性の証拠について独立した病理学者によって採点された。図２６に示される代表的な画像はすべて、毒性の指標がなく、すべての試料は健康なマウスと同じであると採点された。
実施例５―メカニズムの調査
静脈内投与された治療薬の理論的な固形腫瘍取り込みは、循環半減期および腫瘍塊中への拡散という２つの主要な要因の影響を受けると予測される。上記の実施例３に示されているように、各薬物複合体の半減期は、ＭＷで予想される通りである。したがって、観察された有効性の違いの主な要因は、各構築物の拡散性であると仮定された。
高い腫瘍取り込みにもかかわらず、抗体および他の大きな構築物は、拡散性が不十分であり、腫瘍取り込みが不均一であることが知られている。腫瘍標的抗体の大部分は、腫瘍血管系に最も近い腫瘍周辺に蓄積することが示されている。血管外漏出時に、固形腫瘍内の均一な分布は、拡散性および末梢細胞内在化の速度に依存する。図２７Ａ～Ｃに示されるように、インビボ療法研究の結果は、各構築物の予測される拡散性について説明している。ＫＤＣの、固形腫瘍への急速な拡散、より遅い内在化速度、および短時間曝露後のその効力のために、この構築物は固形腫瘍を最も効果的に治療することができる。ＫＦＤＣは、より遅い拡散およびより速い内在化を有し、インビボで観察された生体内での効力のいくらかの低下と一致している。最大の構造であるＫＡＤＣは、拡散係数が最も低く、内在化の速度が最も速いため、試験された条件下で最悪の性能を示している。
この仮定されたメカニズムはまた、ＫＡＤＣの用量を３０ｍｇ／ｋｇに増加させること、またはＫＡＤＣを非コンジュゲート化ＫＡｂと同時投与することの効果を説明する（図２７Ｄ）。提案されたメカニズムによれば、追加のＫＡＤＣまたはＫＡｂの追加は、効力に同様の影響を及ぼす。いずれの場合も、血漿濃度の増加は血管周囲濃度の増加をもたらし、利用可能なインテグリン受容体のより高い割合に結合することによって、効果として末梢腫瘍細胞による内在化を減少させる。追加のタンパク質がＭＭＡＥとコンジュゲート化しているかどうかに関係なく、腫瘍周辺で利用可能なインテグリン受容体の飽和を増加させることが、ＫＡＤＣが血管系から離れてより均一に拡散することを可能にする。
このメカニズムを検証するために、インビトロセットアップを構築して試験し、固形腫瘍での拡散の違いを視覚化した。ＲＦＰを発現するＵ８７ＭＧ神経膠芽腫細胞の固形腫瘍スフェロイドを超低接着９６ウェルプレートで増殖させた。スフェロイドを、直径が約７５０μｍに達するまで成長させた後、２００ｎＭのＡＦ４８８標識ＫＤＣ、ＫＦＤＣ、またはＫＡＤＣで処理し、４時間インキュベートした。次に、共焦点顕微鏡を使用して１００μｍの深さで各スフェロイドの光学スライスを画像化して、各スフェロイド内の標識タンパク質の相対強度を視覚化した。図２８Ａに示されるように、赤チャンネルのコントロール強度はすべてのグループ間で一貫しているが、緑チャンネルの強度は、ＡＦ４８８－ＫＤＣで処理されたスフェロイドの中心で有意に高い。これらのデータは、ＫＤＣが固形腫瘍塊中への拡散においてより効果的であるという定性的な視認を提供する。
より定量的な比較を得るために、緑チャンネルの強度の相対的な減衰を、構成的に発現されたＲＦＰからの赤チャンネルの強度と比較した。ＲＦＰの発現は安定しているため赤のチャンネルは均一であるはずであり、かつスフェロイドの光学密度によってのみ減衰するため、緑のチャンネルの信号強度を補正するためにこの信号強度を使用した。図２９は、この補正を使用すると、ＡＦ４８８－ＫＤＣで処理されたスフェロイドの真の強度がスフェロイド全体で均一になり、この薬物複合体が均一なターゲティングを実現し、ＫＦＤＣとＫＡＤＣの信号は大幅に低下することを示している。さらに、各スフェロイドの総蛍光強度はすべての複合体で同等であり（図２９Ｆ）、ＫＤＣがスフェロイドに均一に拡散する一方で、ＫＦＤＣとＫＡＤＣはスフェロイドの周辺により高度に集中していることをさらに示している。
ＡＦ４８８－ＫＡＤＣと受容体に結合する非コンジュゲート化ＫまたはＫＡｂとを同時投与することによって、このメカニズムをさらに調査した。等モルのＫまたはＫＡｂとインキュベートした場合、ＡＦ４８８－ＫＡＤＣは、スフェロイドの中心に向かって著しく均一な信号を示した（図２８、２９Ｄ、２９Ｅ）。
図２８および２９にある結果は、複数の独立した試験にわたる多数の複製実験によって裏付けられた。ただし、この発見をさらに検証し、結果が画像のアーティファクトによるものではないことを確認するために、スフェロイドを同じ方法で蛍光標識タンパク質と再度インキュベートし、複数のｚ高さで画像化して、信号のドロップオフを深さの関数として視覚化した。図３０に示されるように、各光学スライスの中心の緑の強度は、信号のドロップオフがはるかに明白であるＫＦＤＣまたはＫＡＤＣで処理されたものと比較して、ＫＤＣで処理されたスフェロイドでは比較的一定のままである。
次に、このインビトロモデルを改変して、共焦点画像解析実験に加えて同様の細胞死滅を視覚化できるかどうかを試験した。スフェロイドを、さまざまな濃度の薬物複合体またはＭＭＡＥで処理した。薬物複合体と５日間インキュベートした後、培地をＳＹＴＯＸグリーンを含む新鮮な培地と交換した。ＢｉｏＴｅｋＳｙｎｅｒｇｙＨ４マイクロタイタープレートリーダーで測定した蛍光を、溶解バッファーで処理したスフェロイドと比較した。１００ｎＭでは、ＫＤＣはＫＦＤＣ、ＫＡＤＣ、またはＭＭＡＥよりも実質的に多くの殺傷を示す（図３１）。この殺傷を経時的に視覚化するために、５０または１００ｎＭの薬物複合体またはＭＭＡＥで処理されたスフェロイドを、ＩｎｃｕＣｙｔｅを使用して４時間ごとに画像化した。プレートリーダーアッセイの結果を確認しているように、ＫＤＣは非常に効果的であり、スフェロイド毒性が約１００％に達した一方、ＫＡＤＣは大幅に低減された効力を有していた（図３２Ａ、３２Ｂ）。さらに、薬物複合体と非コンジュゲート化ノッティンを同時投与した場合、ＫＦＤＣおよびＫＡＤＣは効力が有意に増加した一方で、ＫＤＣは非コンジュゲート化ノッティンを添加してもしなくても有効性は同じであった（図３２Ｃ、３２Ｄ）。
材料および方法

ＫＤＣの合成（３ＣＭ－ＭＭＡＥ）
第３章で説明されているように、標準のＦｍｏｃ条件を使用してＲｉｎｋアミド樹脂上でノッティンペプチドを合成するために固相ペプチド合成を使用した。３ＣＭと呼ばれる、２．５Ｆの修飾バージョンは、薬物付着のためのコンジュゲート部位を提供するために２．５Ｆの１５位のセリンの代わりに非天然アミノ酸である５－アジド－Ｌ－ノルバリンを使用して合成した。ペプチド切断、フォールディング、およびＨＰＬＣ精製は以前に記述されたように実行した。ペプチドは、固体支持体としてのリンクアミドの使用と一致するＣ末端アミドを含む。
３ＣＭに関して反応混合物の最終濃度が０．６２ｍＭとなるように、３ＣＭペプチド（１ｅｑ、１．０９ｕｍｏｌ）を５０％ＤＭＳＯ／５０％ＰＢＳ中のＤＢＣＯ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ（１．２ｅｑ、１．２ｕｍｏｌ）と反応させた。反応容器として丸底フラスコを使用し、４０℃の油浴中で２日間撹拌しながら加熱した。
１５ｍＬファルコンチューブ中で３５００ｘｇで５分間遠心分離した後、ＰＴＦＥシリンジフィルターでろ過することにより、微量固形物を除去した。この時点で、セミプレップＣ１８カラム（ＺＯＲＢＡＸＥｃｌｉｐｓｅＸＤＢ－Ｃ１８、９．４ｘ２５０ｍｍ）を使用し、流速４ｍＬ／ｍｉｎ（溶媒Ａ：Ｍｉｌｌｉ－Ｑ精製水＋０．１％ＴＦＡ、溶媒Ｂ：アセトニトリル＋０．１％ＴＦＡ））でのＲＰ－ＨＰＬＣにより、反応容量全体を精製した。精製方法は、３０％溶媒Ｂでの２分間のアイソクラティック保持と、それに続く３０分にわたる３０％から１００％溶媒Ｂへの直線的グラジエントで構成される。生成物は１１～１２分で溶出する。ＫＤＣ合成を検証するためにＬＣ－ＭＳを使用し、適切な質量の質量スペクトルがコンジュゲート化を確認した（図４に示される３ＣＭ－ＭＭＡＥＵＶクロマトグラムおよび質量スペクトル）。ＬＣ－ＭＳメソッドは、３０％溶媒Ｂでの２分間のアイソクラティックホールドと、それに続く１５分間にわたる３０％から１００％溶媒Ｂへの直線グラジエントで構成される。ノッティンペプチド（３ＣＭ）およびノッティンペプチド－薬物複合体（３ＣＭ－ＭＭＡＥ）は、ｍ／ｚ値に基づく低分解能（ＥＳＩ－ＭＳ）質量分析によって特徴づけられた。
質量分析
ＬＣ－ＭＳ実験を、６１２０ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ ＭＳとＰｅａｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＮＭ３２ＬＡ窒素発生器に接続されたＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ １２６０Ｉｎｆｉｎｉｔｙで実施した。Ａｇｉｌｅｎｔ ＩｎｆｉｎｉｔｙＬａｂ Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ１２０ＥＣ－Ｃ１８、４．６×５０ｍｍ分析ＬＣカラムを、流速０．４ｍＬ／ｍｉｎで使用した（溶媒Ａ：Ｍｉｌｌｉ－Ｑ精製水＋０．１％ＴＦＡ、溶媒Ｂ：アセトニトリル＋０．１％ＴＦＡ）。ダイオードアレイ検出器を使用して、２１０および２８０ｎｍの波長をモニターした。データは、ＬＣ／ＭＳＤ ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して処理および分析した。
細胞株および細胞培養
Ｕ８７ＭＧ神経膠芽腫細胞は、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手した。赤色蛍光タンパク質をトランスフェクトしたＵ８７ＭＧ細胞は、ＡｎｇｉｏＰｒｏｔｅｏｍｉｅ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）から入手した。細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。
直接結合アッセイ
Ｕ８７ＭＧ細胞を、酵素不含有細胞解離バッファー（Ｇｉｂｃｏ）を使用して剥離した。次に、４×１０４細胞を、Ｉｎｔｅｇｒｉｎ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（ＩＢＢ；２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＭｎＣｌ２、および０．１％ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ））中で、様々な濃度（０．０１～２００ｎＭ）のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識タンパク質と共に、内在化を最小限にするために４℃で３時間インキュベートした。細胞をペレット化し、８００μＬのＰＢＳＡ（０．１％ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝生理食塩水）で２回洗浄し、残りの表面結合タンパク質の蛍光をＧｕａｖａＥａｓｙＣｙｔｅ８ＨＴ装置（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用したフローサイトメトリーで測定した。得られたデータはＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒＩｎｃ）を使用して評価し、平衡解離定数（Ｋｄ）はＰｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して決定した。エラーバーは、３回実行された実験の標準偏差を表す。
間接結合アッセイ
Ｕ８７ＭＧ細胞を、酵素不含有細胞解離バッファー（Ｇｉｂｃｏ）を使用して剥離した。次に、４×１０４細胞を、ＩＢＢ中で、競合物質として１ｎＭのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識ノッティンおよび様々な濃度（０．０１～５００ｎＭ）のＫＤＣ、ＫＦＤＣ、またはＫＡＤＣと共に、内在化を最小限にするために４℃で３時間インキュベートした。細胞をペレット化し、８００μＬのＰＢＳＡ（０．１％ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝生理食塩水）で２回洗浄し、残りの表面結合タンパク質の蛍光をＧｕａｖａＥａｓｙＣｙｔｅ８ＨＴ装置（ＥＭＤＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用したフローサイトメトリーで測定した。得られたデータはＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ Ｉｎｃ）を使用して評価し、平衡解離定数（Ｋｄ）はＰｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して決定した。エラーバーは、３回実行された実験の標準偏差を表す。
細胞内在化の測定
Ｕ８７ＭＧ細胞を、ウェルあたり５×１０４細胞の密度で２４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種した。４時間超細胞を定着させた後、培地を、２００ｎＭのアレクサフルオロ４８８標識タンパク質を含有する新鮮な培地と交換し、１ｍＭのＭｎＣｌ２を補充した。次に細胞を３７℃で４時間インキュベートした。細胞を５００μＬのＰＢＳで洗浄し、２０μＬの０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡを使用して剥離した。トリプシンを中和し、各ウェルをエッペンドルフチューブに移した後、細胞を８００μＬの冷ＰＢＳＡで洗浄した。次に、表面結合タンパク質をクエンチするために、細胞をペレット化し、氷上で５０μＬの１：２００希釈の抗ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に再懸濁した。細胞を８００μＬのＰＢＳＡで再度洗浄し、内在化したタンパク質の蛍光を上記のようにフローサイトメトリーで測定した。
細胞増殖のエンドポイント阻害
Ｕ８７ＭＧ細胞を９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）にウェルあたり２．５×１０３細胞の密度で播種し、一晩増殖させた。次に、細胞を、様々な濃度のＫＤＣ、ＫＦＤＣ、ＫＡＤＣ、またはＭＭＡＥを含む１００μＬの新鮮な培地で処理し、４日間インキュベートした。ＤｏｋｉｎｄｏＣｅｌｌＣｏｕｎｔｉｎｇＫｉｔ－８を使用して、各ウェルの培地を１０％ＷＳＴ８を含む１００μＬの培地と交換することにより、細胞増殖を測定した。３７℃で１時間インキュベートした後、４５０ｎｍでの吸光度（Ａ）をＢｉｏＴｅｋＳｙｎｅｒｇｙＨ４マイクロタイタープレートリーダーで測定した。ＣＣＫ－８のみのバックグラウンドシグナルをすべての試料から差し引いた。次に、細胞増殖を、以下に示すように、未処理の細胞の対照に対する吸光度のパーセンテージとして表した。非線形回帰分析を、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍを使用して実施した。
Figure 2022533671000005
時間の経過に伴う細胞増殖の阻害および細胞毒性
ＲＦＰを発現するＵ８７ＭＧ細胞を９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）にウェルあたり２．５×１０３細胞の密度で播種し、一晩増殖させた。次いで、細胞を、およそのＥＤ５０である１０ｎＭ、または１００ｎＭの飽和濃度でのＫＤＣ、ＫＦＤＣ、ＫＡＤＣ、またはＭＭＡＥ、および１０ｎＭのＣｙｔｏｘＧｒｅｅｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を含有する新鮮な培地２００μＬで処理した。細胞をＩｎｃｕＣｙｔｅＳ３生細胞分析システム中で５日間インキュベートし、４時間ごとに画像を収集した。洗浄条件として、３時間後または２４時間後に培地を、新鮮な薬物含有培地または新鮮な薬物非含有培地と交換した。
細胞スフェロイドイメージング
丸底９６ウェル超低接着プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に４×１０３細胞／ウェルを播種し、１０００×ｇで１０分間遠心分離することによって、ＲＦＰを発現するＵ８７ＭＧ細胞のスフェロイドを形成した。スフェロイドは、直径７５０μｍに達するまで４日間成長させた。次に、スフェロイドを２００ｎＭのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８コンジュゲート化ＫＤＣ、ＫＦＤＣ、またはＫＡＤＣを含む新鮮な培地で４時間インキュベートした。インキュベーション後、スフェロイドをＰＢＳで洗浄し、Ｆａｌｃｏｎ透明底ポリスチレンマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に移した。スフェロイドを、倒立ＬＳＭ７８０多光子レーザー走査型共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）を使用して画像化した。示されている画像は、スフェロイドの基部から１００μｍの深さで撮影された共焦点スライスである。ＦＩＪＩ画像解析ソフトウェアを使用して定量化を実施した。強度は、各スフェロイドの中心から放射状に計算され、減衰コントロールとしてのＲＦＰの強度に対して補正された緑の強度の相対比としてプロットした。
エンドポイントスフェロイド殺傷アッセイ
丸底９６ウェル超低接着プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に４×１０３細胞／ウェルを播種し、１０００×ｇで１０分間遠心分離することによって、Ｕ８７ＭＧ細胞のスフェロイドを形成した。スフェロイドを２日間増殖させた後、培地を１０ｎＭＣｙｔｏｘＧｒｅｅｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）とさまざまな濃度のＫＤＣ、ＫＦＤＣ、ＫＡＤＣ、またはＭＭＡＥを含む２００μＬの新鮮な培地と交換した。４日後、トリプシン－ＥＤＴＡを添加し、スフェロイドを破壊するために、細胞を６０ＲＰＭシェーカーに１０分間置いた。緑色蛍光は、ＢｉｏＴｅｋＳｙｎｅｒｇｙＨ４マイクロタイタープレートリーダーを使用して測定した。毒性のパーセントは、溶解緩衝液で処理されたスフェロイドと緑色蛍光を比較することによって計算された。
時間の経過に伴う細胞スフェロイド殺傷アッセイ
丸底９６ウェル超低接着プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に４×１０３細胞／ウェルを播種し、１０００×ｇで１０分間遠心分離することによって、ＲＦＰを発現するＵ８７ＭＧ細胞のスフェロイドを形成した。スフェロイドを２日間増殖させた後、培地を１０ｎＭＣｙｔｏｘＧｒｅｅｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）および０、５０、または１００ｎのＭＫＤＣ、ＫＦＤＣ、ＫＡＤＣ、またはＭＭＡＥを含む２００μＬの新鮮な培地と交換した。スフェロイドをＩｎｃｕＣｙｔｅＳ３生細胞分析システム中で５日間インキュベートし、４時間ごとに画像を収集した。
動物実験
腫瘍細胞の移植のために、雌のＮｕ／Ｎｕマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を、１Ｌ／分の流速での２．５％イソフルランの吸入により麻酔した。２．５×１０６個のＵ８７ＭＧ細胞を含む５０／５０のＰＢＳ／マトリゲル（コーニング）２００μＬを、右脇腹に皮下注射した。腫瘍は約３５ｍｍ２の大きさになるまで７日間増殖させた。治療効果の研究のために、マウスを実験グループごとに分け、すべてのグループで同等の平均腫瘍サイズと開始体重を確保した。
インビボ時間経過の画像化
上記のようにＵ８７ＭＧ横腹異種移植片を有するマウスに、１．５ｎｍｏｌのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０標識Ｋ、ＫＦｃ、またはＫＡｂを静脈内注射した。ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用してマウスを画像化した。フルオロフォアコンジュゲート化タンパク質を、それぞれ６４０ｎｍおよび７１０ｎｍの励起／発光波長を使用して検出した。すべての画像解析は、ＬｉｖｉｎｇＩｍａｇｅソフトウェア（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して実行した。
エクスビボ生体内分布
上述のようにＵ８７ＭＧ横腹異種移植片を有するマウスに、１．５ｎｍｏｌのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６８０標識Ｋ、ＫＦｃ、またはＫＡｂを静脈内注射した。臓器（腫瘍、肝臓、腎臓、脾臓、膵臓、心臓、肺、膀胱、大腿四頭筋、および骨）を４時間および２４時間のエンドポイントで収集した。ＩＶＩＳＳｐｅｃｔｒｕｍ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して臓器を画像化した。フルオロフォアコンジュゲート化タンパク質を、それぞれ６４０ｎｍおよび７１０ｎｍの励起／発光波長を使用して検出した。すべての画像解析は、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅソフトウェア（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して実行した。
腫瘍への血管外漏出深度の視覚化
上述のようにＵ８７ＭＧ横腹異種移植片を有するマウスに、１．５ｎｍｏｌのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８０標識Ｋ、ＫＦｃ、またはＫＡｂを静脈内注射した。４時間後に腫瘍を取り出し、ＯＣＴ Ｏｐｔｉｍａｌ Ｃｕｔｔｉｎｇ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ化合物（ＯＣＴ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で急速凍結した。安楽死させる１５分前には、機能的な血管系を視覚化するために、マウスに１５ｍｇ／ｋｇのＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２の静脈内注射も行った。ＯＣＴブロックを１５μｍのスライスに切り、Ｃｙ５．５標識抗ＣＤ３１を使用してスライドを染色した。次に、染色されたスライドを、倒立ＬＳＭ７８０多光子レーザー走査型共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）を使用して画像化した。
治療効果実験
上述のようにＵ８７ＭＧ横腹異種移植片を有するマウスに、ＰＢＳ、ＫＤＣ、ＫＦＤＣ、ＫＡＤＣ、または対照タンパク質を静脈内注射した。処置剤を週に１回４週間投与した。デジタルノギスを使用して腫瘍を週３回測定し、各投与日に動物の体重を記録して、化合物の毒性の尺度として潜在的な体重減少を監視した。腫瘍面積は、腫瘍の最長軸に垂直軸を掛けたものとして計算した。安楽死の基準を、１５０ｍｍ２を超える腫瘍面積または２０％の体重減少と定義した。
このように、上記は、単に本開示の原理を説明しているに過ぎない。当業者であれば、本明細書では明示的に記載または図示されていないが、本発明の原理を具現化しその趣旨および範囲内に含まれる様々な構成を作ることができることが理解されよう。さらに、本明細書に列挙されたすべての例および条件的文言は、主として本発明の原理および発明者らにより当該技術分野の促進のために寄与された概念を理解する上で読者を助けることを意図しており、このような具体的に列挙された例および条件への限定ではないと解釈されるべきである。また、本発明の原理、態様、および実施形態、ならびにその具体的な例を列挙する本明細書におけるすべての記述は、その構造的および機能的等価物の両方を包含することを意図する。加えて、そのような等価物は、現在知られている等価物および将来開発される等価物の両方、すなわち、構造にかかわらず同じ機能を果たすあらゆる開発要素も含むことが意図される。したがって、本発明の範囲は、本明細書に図示および記載の例示的な実施形態に限定されることを意図しない。

Claims (84)

  1. 複合体であって、
    細胞表面分子に結合する操作されたループを含むノッティンペプチドと、
    リンカーを介してノッティンペプチドに接合された抗微小管剤と、
    を含む複合体。
  2. 前記抗微小管剤が、チューブリン阻害剤である、請求項１に記載の複合体。
  3. 前記チューブリン阻害剤が、アウリスタチンである、請求項２に記載の複合体。
  4. 前記チューブリン阻害剤が、アウリスタチンＥまたはアウリスタチンＦである、請求項３に記載の複合体。
  5. 前記チューブリン阻害剤が、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）またはモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）である、請求項４に記載の複合体。
  6. 前記リンカーが酵素切断可能リンカーである、請求項１～５のいずれか一項に記載の複合体。
  7. 前記酵素切断可能リンカーが、プロテアーゼ切断可能リンカーである、請求項６に記載の複合体。
  8. 前記リンカーが、バリン－シトルリンジペプチド、バリン－アラニンジペプチド、またはその両方を含む、請求項７に記載の複合体。
  9. 前記リンカーが、バリン－シトルリン－パラアミノベンジルオキシ（Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ）リンカーである、請求項８に記載の複合体。
  10. 前記リンカーが、バリルアラニルパラアミノベンジルオキシ（Ｖａｌ－Ａｌａ－ＰＡＢ）リンカーである、請求項８に記載の複合体。
  11. 複合体であって、
    細胞表面分子に結合する操作されたループを含むノッティンペプチドが、抗体サブユニットまたはその断片に融合されたものを含む、融合タンパク質と、
    リンカーを介して前記融合タンパク質に接合された薬物と、
    を含む、複合体。
  12. 前記抗体サブユニットまたはその断片が、抗体重鎖またはその断片である、請求項１１に記載の複合体。
  13. 前記抗体重鎖またはその断片が、γ、α、δ、ε、もしくはμ抗体重鎖またはその断片を含む、請求項１２に記載の複合体。
  14. 前記抗体重鎖またはその断片が、ＩｇＧ重鎖またはその断片である、請求項１３に記載の複合体。
  15. 前記ＩｇＧ重鎖またはその断片が、ＩｇＧ１重鎖またはその断片である、請求項１４に記載の複合体。
  16. 前記抗体重鎖またはその断片が、重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の複合体。
  17. 前記抗体重鎖またはその断片が、重鎖定常領域またはその断片をさらに含む、請求項１６に記載の複合体。
  18. 前記抗体重鎖定常領域またはその断片が、ＣＨ１ドメインを含む、請求項１７に記載の複合体。
  19. 前記抗体重鎖定常領域またはその断片が、ＣＨ２ドメインをさらに含む、請求項１８に記載の複合体。
  20. 前記抗体重鎖定常領域またはその断片が、ＣＨ３ドメインをさらに含む、請求項１９に記載の複合体。
  21. 前記抗体重鎖またはその断片が、完全長の抗体重鎖である、請求項２０に記載の複合体。
  22. 前記抗体の重鎖またはその断片が、ＶＨを含まない、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の複合体。
  23. 前記抗体重鎖またはその断片が、Ｆｃ領域を含む、請求項２２に記載の複合体。
  24. 前記ノッティンペプチドが、抗体重鎖またはその断片のＮ末端に融合されている、請求項１２～２３のいずれか一項に記載の複合体。
  25. 前記ノッティンペプチドが、抗体重鎖またはその断片のＣ末端に融合されている、請求項１２～２３のいずれか一項に記載の複合体。
  26. 前記薬物がノッティンペプチドに接合している、請求項１２～２５のいずれか一項に記載の複合体。
  27. 前記薬物が抗体重鎖またはその断片に接合している、請求項１２～２５のいずれか一項に記載の複合体。
  28. 前記抗体重鎖またはその断片が、Ｆｃ領域を含み、前記薬物が前記Ｆｃ領域に接合している、請求項２７に記載の複合体。
  29. 前記薬物が、Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインに接合している、請求項２８に記載の複合体。
  30. 前記薬物が、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインに接合している、請求項２８に記載の複合体。
  31. 前記抗体サブユニットまたはその断片が、抗体軽鎖またはその断片である、請求項１１に記載の複合体。
  32. 前記抗体軽鎖またはその断片が、カッパ（κ）軽鎖またはその断片である、請求項３１に記載の複合体。
  33. 前記抗体軽鎖またはその断片が、ラムダ（λ）軽鎖またはその断片である、請求項３１に記載の複合体。
  34. 前記抗体軽鎖またはその断片が、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、請求３１～３３のいずれか一項に記載の複合体。
  35. 前記抗体軽鎖またはその断片が、抗体軽鎖定常領域（ＣＬ）またはその断片をさらに含む、請求項３４に記載の複合体。
  36. 前記抗体軽鎖またはその断片が、完全長の抗体軽鎖である、請求項３１～３５のいずれか一項に記載の複合体。
  37. 前記ノッティンペプチドが、抗体軽鎖またはその断片のＮ末端に融合している、請求項３１～３６のいずれか一項に記載の複合体。
  38. 前記ノッティンペプチドが、抗体軽鎖またはその断片のＣ末端に融合している、請求項３１～３６のいずれか一項に記載の複合体。
  39. 前記薬物がノッティンペプチドに接合している、請求項３１～３８のいずれか一項に記載の複合体。
  40. 前記薬物が抗体軽鎖またはその断片に接合している、請求項３１～３８のいずれか一項に記載の複合体。
  41. 前記薬物が細胞毒性剤である、請求項１１～４０のいずれか一項に記載の複合体。
  42. 前記薬物が毒素である、請求項１１～４０のいずれか一項に記載の複合体。
  43. 前記薬物が抗微小管剤である、請求項１１～４０のいずれか一項に記載の複合体。
  44. 前記抗微小管剤が、チューブリン阻害剤である、請求項４３に記載の複合体。
  45. 前記チューブリン阻害剤が、アウリスタチンである、請求項４４に記載の複合体。
  46. 前記チューブリン阻害剤が、アウリスタチンＥまたはアウリスタチンＦである、請求項４５に記載の複合体。
  47. 前記チューブリン阻害剤が、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）またはモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）である、請求項４６に記載の複合体。
  48. 前記薬物がヌクレオシド薬物である、請求項１１～４０のいずれか一項に記載の複合体。
  49. 前記ヌクレオシド薬がヌクレオシド類似体である、請求項４８に記載の複合体。
  50. 前記ヌクレオシド類似体が、ゲムシタビン、シタラビン、トロキサシタビン、デシタビン、クラドリビン、フルダラビン、クロファラビン、および２’－Ｃ－シアノ－２’－デオキシ－１－β－Ｄ－アラビノ－ペントフラノシルシトシン（ＣＮＤＡＣ）からなる群から選択される、請求項４９に記載の複合体。
  51. 前記リンカーが酵素切断可能リンカーである、請求項１１～５０のいずれか一項に記載の複合体。
  52. 前記酵素切断可能リンカーが、プロテアーゼ切断可能リンカーである、請求項５１に記載の複合体。
  53. 前記リンカーが、バリン－シトルリンジペプチド、バリン－アラニンジペプチド、またはその両方を含む、請求項５２に記載の複合体。
  54. 前記リンカーが、バリン－シトルリン－パラアミノベンジルオキシ（Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ）リンカーである、請求項５３に記載の複合体。
  55. 前記リンカーが、バリルアラニルパラアミノベンジルオキシ（Ｖａｌ－Ａｌａ－ＰＡＢ）リンカーである、請求項５３に記載の複合体。
  56. 前記ノッティンペプチドが、ＥＥＴＩ－ＩＩペプチド、ＡｇＲＰペプチド、ω－コノトキシンペプチド、カラタＢ１ペプチド、ＭＣｏＴＩ－ＩＩペプチド、アガトキシンペプチド、およびクロロトキシンペプチドからなる群から選択される、請求項１～５５のいずれか一項に記載の複合体。
  57. 前記細胞表面分子が癌細胞表面分子である、請求項１～５６のいずれか一項に記載の複合体。
  58. 前記癌細胞表面分子が、固形腫瘍の癌細胞上に存在する、請求項５７に記載の複合体。
  59. 前記細胞表面分子が細胞表面受容体である、請求項１～５７のいずれか一項に記載の複合体。
  60. 前記細胞表面受容体が細胞接着受容体である、請求項５９に記載の複合体。
  61. 前記細胞接着受容体がインテグリンである、請求項６０に記載の複合体。
  62. 前記インテグリンが、αｖβ１インテグリン、αｖβ３インテグリン、αｖβ５インテグリン、αｖβ６インテグリン、α５β１インテグリン、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項６０に記載の複合体。
  63. 前記細胞表面受容体がケモカイン受容体である、請求項５９に記載の複合体。
  64. 前記ケモカイン受容体が、Ｃ－Ｘ－Ｃケモカイン受容体タイプ４（ＣＸＣＲ４）である、請求項６３に記載の複合体。
  65. 前記細胞表面分子が成長因子受容体である、請求項５９に記載の複合体。
  66. 前記細胞表面受容体が免疫細胞受容体である、請求項５９に記載の複合体。
  67. 前記免疫細胞受容体が細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）である、請求項６６に記載の複合体。
  68. 前記細胞表面受容体がニューロピリン－１（ＮＲＰ１）である、請求項５９に記載の複合体。
  69. 前記細胞表面分子が膜プロテアーゼである、請求項１～５７のいずれか一項に記載の複合体。
  70. 前記膜プロテアーゼがマトリプターゼである、請求項６９に記載の複合体。
  71. 請求項１～７０のいずれか一項に記載の複合体を含む組成物。
  72. 前記組成物が、
    前記複合体と、
    薬学的に許容される担体と、
    を含む、医薬組成物である、請求項７１に記載の組成物。
  73. 前記医薬組成物が非経口投与のために製剤化されている、請求項７２に記載の組成物。
  74. 前記医薬組成物が経口投与のために製剤化されている、請求項７２に記載の組成物。
  75. 治療有効量の、請求項７２に記載の医薬組成物と、
    前記医薬組成物を、それを必要とする個体に投与するための説明書と、
    を含む、キット。
  76. 前記医薬組成物が、１つ以上の単位用量で存在する、請求項７５に記載のキット。
  77. 治療有効量の、請求項７２に記載の前記医薬組成物を、それ必要とする個体に投与することを含む、方法。
  78. 前記個体が癌を有し、前記操作されたループが、前記個体に存在する癌細胞上の細胞表面分子に結合する、請求項７７に記載の方法。
  79. 前記細胞表面分子が細胞表面受容体である、請求項７８に記載の方法。
  80. 前記細胞表面受容体が細胞接着受容体である、請求項７９に記載の方法。
  81. 前記細胞接着受容体がインテグリンである、請求項８０に記載の方法。
  82. 前記インテグリンが、αｖβ１インテグリン、αｖβ３インテグリン、αｖβ５インテグリン、αｖβ６インテグリン、α５β１インテグリン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項８１に記載の方法。
  83. 前記個体が、前記癌細胞を含む固形腫瘍を有する、請求項８２に記載の方法。
  84. 前記固形腫瘍が脳腫瘍である、請求項８３に記載の方法。
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