JP2022533671A - 薬物複合体およびその使用方法 - Google Patents

薬物複合体およびその使用方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2022533671A
JP2022533671A JP2021568852A JP2021568852A JP2022533671A JP 2022533671 A JP2022533671 A JP 2022533671A JP 2021568852 A JP2021568852 A JP 2021568852A JP 2021568852 A JP2021568852 A JP 2021568852A JP 2022533671 A JP2022533671 A JP 2022533671A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
conjugate
fragment
drug
heavy chain
knottin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2021568852A
Other languages
English (en)
Other versions
JPWO2020237078A5 (ja
Inventor
ジェームズ アール. キンツィング、
ジェニファー アール. コクラン、
ケイトリン ミラー、
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Leland Stanford Junior University
Original Assignee
Leland Stanford Junior University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Leland Stanford Junior University filed Critical Leland Stanford Junior University
Publication of JP2022533671A publication Critical patent/JP2022533671A/ja
Publication of JPWO2020237078A5 publication Critical patent/JPWO2020237078A5/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/6415Toxins or lectins, e.g. clostridial toxins or Pseudomonas exotoxins
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/55Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being also a pharmacologically or therapeutically active agent, i.e. the entire conjugate being a codrug, i.e. a dimer, oligomer or polymer of pharmacologically or therapeutically active compounds
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/65Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68031Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being an auristatin
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817Toxins
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6853Carcino-embryonic antigens
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6865Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from skin, nerves or brain cancer cell
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00Antineoplastic agents
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K16/00Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3007Carcino-embryonic Antigens
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K16/00Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77Internalization into the cell
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2319/00Fusion polypeptide
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2319/00Fusion polypeptide
    • C07K2319/30Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

複合体が提供される。特定の態様において、細胞表面分子に結合する操作されたループを含むノッティンペプチド、およびリンカーを介してノッティンペプチドにコンジュゲート化した抗微小管剤を含む薬物複合体が提供される。いくつかの態様において、細胞表面分子に結合する操作されたループを含むノッティンペプチドが抗体サブユニットまたはその断片に融合されたものを含む融合タンパク質を含む薬物複合体が提供される。そのような薬物複合体は、融合タンパク質にコンジュゲート化された薬物をさらに含む。本開示の複合体を含む組成物およびキットも提供される。複合体を、例えば治療目的で使用する方法も提供される。【選択図】図1

Description

関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、2019年5月22日に出願された米国仮特許出願第62/851,443号の利益を主張する。
癌の化学療法薬は、狭い治療ウィンドウ、つまり最小有効量(腫瘍を殺傷する)と最大耐量(重大な副作用を引き起こす)との間の差異によって制限されることがよくある。標的化ドラッグデリバリーは、標的外毒性を減少させながら、腫瘍での局所濃度を増加させる方法を提供する。抗体薬物複合体(ADC:antibody-drug conjugate)は、標的化ドラッグデリバリーの主要な現在のプラットフォームを構成する。ADCは、血液腫瘍に対して実質的な臨床的成功を示しているが、多くの固形腫瘍やその他の困難な腫瘍標的、例えば脳腫瘍、膵臓腫瘍などに対する有効性は限られている。ADCは比較的高分子量(MW)であるため、固形腫瘍に均一に浸透する能力において妨げられている。固形腫瘍および他の困難な腫瘍標的に対する標的療法の有効性を改善するために、薬物動態が変化した代替の標的タンパク質が必要である。
複合体(conjugate)が提供される。特定の態様において、提供されるのは、細胞表面分子に結合する操作された(engineered)ループを含むノッティン(knottin)ペプチド、およびリンカーを介してノッティンペプチドに接合(コンジュゲート化)した抗微小管剤を含む薬物複合体である。いくつかの態様において、提供されるのは、細胞表面分子に結合する操作されたループを含むノッティンペプチドが抗体サブユニットまたはその断片に融合されたものを含む融合タンパク質を含む、薬物複合体である。そのような薬物複合体は、融合タンパク質にコンジュゲート化した薬物をさらに含む。本開示の複合体を含む組成物およびキットも提供される。複合体を使用する方法、例えば治療目的のための方法も提供される。
(a)細胞外で安定であり、細胞内在化時にカテプシンプロテアーゼを介して切断されるMMAEの誘導体であるVal-Cit-PAB-MMAEの概略図。(b)本開示のいくつかの実施形態による、MMAE誘導体に接合したノッティン、ノッティン-Fc、およびノッティン-Ab構築物の概略図。 EETI2.5F、2.5Z、および3CMのアミノ酸配列。EETI-2.5F、EETI-2.5Z、およびEETI3CMの配列においてインテグリン結合ループと置換部位が赤で強調表示され、シスチンノット足場のジスルフィド結合が黄色で強調表示される。位置15(赤X)は、アジド含有非天然アミノ酸である5-アジド-l-ノルバリンが存在する場所を示し、KDCの位置特異的バイオコンジュゲーションを可能にするために置換されている。位置31(赤X)は、UV-Vis分光法を使用した濃度測定の改善を可能にするためにフェニルアラニンがチロシンに置き換えられた部位を示している。 2.5F-Val-Cit-PAB-MMAE KDCの調製。(a)Val-Cit-PAB-MMAEは、細胞外で安定であり細胞内在化時にカテプシンプロテアーゼを介して切断されることが知られているMMAEの誘導体である。(b)ノッティン-薬物複合体(KDC)は、固相ペプチド合成によって調製されたアジド-ノッティンから調製され、銅フリークリックケミストリーを使用してVal-Cit-PAB-MMAEに接合された5-アジドノルバリンを含む。 KおよびKDCのLC-MSおよびUVクロマトグラム。3CMノッティンペプチド(K)の(a)UVクロマトグラムおよび(b)LC-MS。本方法は、16分間での10%から46%への溶媒Bの直線的グラジエントで構成される。3CM-Val-Cit-PAB-MMAEノッティン-薬物複合体(KDC)の(c)UVクロマトグラムおよび(d)LC-MS。本方法は、30%溶媒Bでの2分間のアイソクラティック保持と、それに続く15分間での30%~100%溶媒Bの直線的グラジエントで構成される。 2.5F-Ab-Val-Cit-PAB-MMAE KFDCの調製。(a)Val-Cit-PAB-MMAEはMMAEの誘導体であり、細胞外で安定しており細胞内在化時にカテプシンプロテアーゼを介して切断されることが知られている。(b)ノッティン-Fc-薬物複合体(KFDC)は、HIPSリンカーMMAE誘導体とアルデヒドタグ付きKFcのHydrazino-Pictet-Spenglerライゲーション1によって調製された。 KFDCの生産を確認する質量分析データ。 2.5F-Ab-Val-Cit-PAB-MMAE KADCの調製。(a)Val-Cit-PAB-MMAEはMMAEの誘導体であり、細胞外で安定しており細胞内在化時にカテプシンプロテアーゼを介して切断されることが知られている。(b)ノッティン-Ab-薬物複合体(KADC)は、HIPSリンカーMMAE誘導体とアルデヒドタグ付き(α-FITC)KAbのHydrazino-Pictet-Spenglerライゲーション1によって調製された。 KADCの生産を確認する質量分析データ。 U87MG細胞上のノッティン標的タンパク質の結合親和性。(a)AF488標識K、KFc、およびKAbのU87MG細胞への直接結合(KについてはKd=0.35nM、KFcについては2.5nM、KAbについては2.3nM)。(b)1nMAF488-2.5Fと競合する薬物複合体の間接結合(KDCについてはKi=0.9、KFcについては1.2、KAbについては1.3)。 ノッティンベースのタンパク質の内在化。(a)抗AlexaFluor488クエンチング抗体のみとインキュベートされた細胞、または4℃でインキュベートされた細胞(細胞膜を凍結し、内在化を阻害するため)は、細胞の上方でのみ検出可能な蛍光を示した。(b)AF488標識されたK、KFc、およびKAbの内在化。(c)一価の一アームKFcと比較した二価KFcの内在化。(d)N末端KAbおよびKFcと比較したC末端ノッティン-抗体融合体(AbK)内在化。 内在化に対する変性培地とPBSAの効果。c1qを含む血清タンパク質は、抗体のFc領域と相互作用することができ、細胞内在化に影響を与える可能性がある。血清タンパク質が内在化率に影響を及ぼしているかどうかを試験するために、細胞を完全培地(DMEM)、熱変性DMEM、または0.1%BSA(PBSA)を伴うリン酸緩衝生理食塩水中のAF488標識タンパク質とともにインキュベートした。 内在化に対するFcブロッカーと過剰なKの効果。(a)AF488-K、過剰な非標識K(K’)と同時投与されたAF488-K、および非結合CTRLノッティンの内在化。(b)AF488-KFc、Fcブロッカーと同時投与されたAF488-KFc、過剰なK’と同時投与されたAF488-KFc、および非結合CTRL-Fcの内在化。(c)一アームのモノAF488-KFc、Fcブロッカーと同時投与されたモノAF488-KFc、および過剰なK’と同時投与されたモノAF488-KFcの内在化。
インビトロ細胞増殖のPDC阻害。(a)KDCと非接合K、(b)KFDCと非接合KFc、および(c)KADCと非接合KAbと比較した、MMAEで処理されたU87MG細胞。120時間での細胞増殖は、λ=450nmでCCK8試薬から生じる吸光度を測定することによって評価され、未処理の細胞と比較した最大パーセントとして報告される。すべての薬物複合体は、追加の実験で再度試験され、(d)に一緒にプロットされた。 PDCの経時的な増殖阻害と細胞毒性。RFPを発現するU87MG細胞をMMAEまたは薬物複合体で処理し、IncuCyte画像を介して増殖と細胞毒性(SYTOXグリーンを介して)を経時的に測定した。(a)24時間後に同じ処理条件を含む新鮮な培地で洗浄した細胞間の増殖の比較。(b)24時間後に新鮮な薬物非含有培地で洗浄した細胞間の増殖の比較。(c)24時間後に同じ処理条件を含む新鮮な培地で洗浄した細胞間の細胞毒性の比較。(d)24時間後に新鮮な薬物非含有培地で洗浄した細胞間の細胞毒性の比較。 3時間のインキュベーション後の増殖のPDC阻害。RFPを発現するU87MG細胞をMMAEまたは薬物複合体で処理し、IncuCyte画像を介して増殖を経時的に測定した。3時間後に新鮮な薬物非含有培地で洗浄した細胞間の増殖の比較。 AF680標識PDCSのインビボ画像。U87MG股関節異種移植片を有するマウスに、1.5nmolの(a)AF680-KDC、(b)AF680-KFDC、または(c)AF680-KADCを注射した。マウス(n=3)は、640nmの励起および710nmの発光フィルターを使用して定期的に画像化した。各処置群からの単一のマウスが、クリアランスと局在化率の違いを説明するために、選択された時点で示されている。 PDCの薬物動態。(a)AF680-KDC、(b)AF680-KFDC、または(c)AF680-KADCで処置されたマウスの腫瘍または肩を中心とする同等領域(バックグラウンド)における放射効率の定量化。循環半減期は、二相性指数関数的減衰曲線をバックグラウンドデータに適合させることによって推定された。(d~f)腫瘍対バックグラウンド比は、腫瘍における放射効率を、肩を中心とする同等領域の放射効率で割ったものとして計算された。 PDCの生体内分布。U87MG異種移植腫瘍を有するマウスに、1.5nmolの蛍光標識薬物複合体を注射した。腫瘍、肝臓、腎臓、脾臓、膵臓、心臓、肺、膀胱、大腿四頭筋(筋肉)、および胸骨(骨)を、画像化のために投与の4時間後および24時間後に取り出された。 PBS、KDC、KFDC、またはKADCで週3回3週間処理された、U87MG股関節異種移植片を有するNu/Nuマウスの腫瘍増殖。各用量には、2.38nmolのMMAEに正規化された適切な薬物複合体(約0.6mg/kgのKDC、約5mg/kgのKFDC、約10mg/kgのKADC)が含まれていた。エンドポイント基準は、腫瘍面積>100mmであった。(a)カプランマイヤー生存曲線。(b)各処置群の平均腫瘍面積。安楽死基準に達したマウスは、最後に記録された腫瘍面積として平均に含まれた。(c)各グループ内の個々のマウスの腫瘍測定。(d)開始時の体重に対して正規化された平均体重。 PBS、非接合K、又は1ミリグラム/kgあるいは5mg/kgのKDCで週1回4週間処置した後の、U87MG股関節異種移植片を有するNu/Nuマウスの腫瘍増殖。エンドポイント基準は、腫瘍領域>150mmであった。(a)カプランマイヤー生存曲線。(b)各処置群の平均腫瘍面積。安楽死基準に達したマウスは、最後に記録された腫瘍面積として平均に含まれている。(c)各グループ内の個々のマウスの腫瘍測定。 PBS、非接合KFc、または5mg/kgもしくは10mg/kgのKFDCで週1回4週間処置した、U87MG股関節異種移植片を有するNu/Nuマウスの腫瘍増殖。エンドポイント基準は、腫瘍領域>150mmであった。(a)カプランマイヤー生存曲線。(b)各処置群の平均腫瘍面積。安楽死基準に達したマウスは、最後に記録された腫瘍面積として平均に含まれている。(c)各グループ内の個々のマウスの腫瘍測定。 PBS、非接合(α-CEA)KAb、または5mg/kgもしくは10mg/kgのKADCで週1回4週間処置した、U87MG股関節異種移植片を有するNu/Nuマウスの腫瘍増殖。エンドポイント基準は、腫瘍面積>150mmであった。(a)カプランマイヤー生存曲線。(b)各処置群の平均腫瘍面積。安楽死基準に達したマウスは、最後に記録された腫瘍面積として平均に含まれている。(c)各グループ内の個々のマウスの腫瘍測定。 (a)カプランマイヤー生存曲線。(b)各処置群の平均腫瘍面積。安楽死基準に達したマウスは、最後に記録された腫瘍面積として平均に含まれている。(c)各グループ内の個々のマウスの腫瘍測定。 30mg/kgで投与されたKADCの治療効果。PBS、10mg/kgのKADC、または30mg/kgのKADCで週1回4週間治療した、U87MG股関節異種移植片を有するNu/Nuマウスの腫瘍増殖。エンドポイント基準は、腫瘍領域>150mmであった。(a)カプランマイヤー生存曲線。(b)各処置群の平均腫瘍面積。安楽死基準に達したマウスは、最後に記録された腫瘍面積として平均に含まれている。(c)各グループ内の個々のマウスの腫瘍測定。 KADCとKABの同時投与の治療効果。PBS、10mg/kgのKADC、または20mg/kgのKAbと同時投与された10mg/kgのKADCで4週間週1回治療された、U87MG股関節異種移植片を有するNu/Nuマウスの腫瘍増殖。エンドポイント基準は、腫瘍面積>150mmであった。(a)カプランマイヤー生存曲線。(b)各処置群の平均腫瘍面積。安楽死基準に達したマウスは、最後に記録された腫瘍面積として平均に含まれている。(c)各グループ内の個々のマウスの腫瘍測定。 KDC、KFDC、およびKADCについての肝臓および腎臓の組織学。肝臓と腎臓の代表的なスライスを4%PFAで固定し、細胞構造を視覚化するために、ヘマトキシリンとエオシンで染色した。スライドは独立した獣医病理学者によって採点され、すべての肝臓と腎臓のサンプルには急性毒性の証拠がないことが確認された。 固形腫瘍中への拡散。血管系から離れ固形腫瘍中への薬物複合体のKroughシリンダー拡散を表す概略図。Kroughシリンダーの半径は、拡散係数と細胞の結合および内在化の速度によって限定される。 腫瘍スフェロイドの共焦点画像。細胞RFPを発現するU87MGスフェロイド中へのAF488標識薬物複合体の拡散を示す共焦点画像。赤のチャンネルは、光学密度による信号の減衰を示している。緑のチャンネルは、蛍光標識されたタンパク質の強度を示している。すべての画像は、スフェロイドの表面から約100μmの深さで撮影されている。 腫瘍スフェロイドイメージングの定量化。スフェロイド画像は定性的には有用であるが、光学密度が不均一であるため、定量化は困難である。赤のチャンネルは光学密度による信号の減衰を示し、緑のチャンネルは蛍光標識されたタンパク質を示す。各チャンネルについて、FIJI画像解析ソフトウェアを使用して半径方向の強度を計算し、距離の関数としてプロットした。(a)AF488-KDCで処理されたn=5スフェロイドについての距離の関数としての平均強度。(b)AF488-KFDCで処理されたn=5スフェロイドについての距離の関数としての平均強度。(c)AF488-KADCで処理されたn=5スフェロイドについての距離の関数としての平均強度。(d)AF488-KADCおよび非標識Kで処理されたn=5スフェロイドについての距離の関数としての平均強度。(e)相対的な赤の強度を使用して補正された相対的な緑の強度。(f)100μmで撮影された共焦点画像の総積分強度。 腫瘍スフェロイドのZスタック共焦点画像解析。スフェロイド表面から50~90μmの範囲で10μm間隔で、細胞RFPを発現するU87MGスフェロイド中にAF488標識薬物複合体が拡散することを示す共焦点画像解析。 インビトロでの腫瘍スフェロイドの殺傷。U87MG腫瘍スフェロイドは、さまざまな濃度のKDC、KFDC、KADC、またはMMAEで処置する前に3日間成長させた。4日間のインキュベーション後、細胞毒性を測定するために、SYTOXグリーンを添加し、スフェロイドを攪拌した。スフェロイドの死滅率は、緑色の信号を、溶解バッファーで殺されたスフェロイドと比較することによって推定された。 インビトロでの腫瘍スフェロイドのIncuCyteイメージング。RFPを発現するU87MG腫瘍スフェロイドを3日間成長させた後、100uMのKDC、KADC、またはMMAEで処理した。細胞死はSYTOXグリーンで視覚化される。画像は処置の120時間後に撮影された。
本開示の複合体、組成物、および方法をより詳細に記載する前に、複合体、組成物、および方法は、記載される特定の実施形態に限定されず、当然のことながら変化し得ることが理解されるべきである。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明するためだけのものであり、複合体、組成物、および方法の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書で使用される用語は限定することを意図するものではないこともまた理解されたい。
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限と下限との間の各介在値(文脈上明確に指示されていない限り、下限の単位の10分の1までのもの)、およびその範囲内の記載された他の値または介在値は、複合体、組成物、および方法内に包含されることを理解されたい。これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立してより小さい範囲内に含まれてもよく、記載される範囲内で特に除外される限界を受けることを条件として、やはり複合体、組成物、および方法内に包含される。記載される範囲に1つの限界値または両方の限界値が含まれる場合、その含まれる限界値のいずれかまたは両方を除く範囲も、複合体、組成物、および方法に含まれる。
特定の範囲は、用語「約」が前に付いている数値で本明細書に提示される。「約」という用語は、それが先行する正確な数字、およびその用語が先行する数字に近接または近似する数字に逐語的支持を提供するために本明細書において使用される。数が特定の列挙された数に近いかほぼ等しいかどうかを決定するにあたり、近いまたはほぼ等しい列挙されていない数とは、それが提示されている文脈において具体的に列挙された数と実質的に同等のものを提供する数であり得る。
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、複合体、組成物、および方法が属する分野の当業者に一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似するまたは同等な任意の複合体、組成物および方法もまた、複合体、組成物および方法の実施または試験において使用することができるが、代表的な例示的複合体、組成物および方法をここに記載する。
本明細書に引用されるすべての刊行物および特許は、各個々の刊行物または特許が参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示されているかのように参照により本明細書に組み込まれ、刊行物が引用されるところに関連する方法および/または材料を開示かつ説明するために、参照により本明細書に組み込まれる。任意の刊行物の引用は、本出願日前のその開示についてのものであり、提供される刊行年は、個別に確認を必要とし得る実際の刊行年とは異なる場合があるので、本複合体、組成物および方法は、その刊行物よりも先行する権利がないことを認めるものと解釈されるべきではない。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「a」、「an」、および「the」は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。特許請求の範囲は任意選択的な要素を排除するように起草されてもよいことにさらに留意されたい。このように、この記述は、特許請求の要素の列挙に関連して「専ら」、「のみ」などのような排他的な用語の使用または「負の」限定の使用のための文言的根拠としての役割を果たすことを意図する。
明瞭さのために別々の実施形態の文脈中で記載された、複合体、組成物、および方法の特定の特徴は、単一の実施形態において組み合わされても提供され得ることが認識される。逆に、簡潔にするために単一の実施形態の文脈で説明される、複合体、組成物、および方法の様々な特徴は、別々にまたは任意の適切なサブコンビネーションで提供されてもよい。実施形態のすべての組み合わせは、本開示によって具体的に包含され、そのような組み合わせが実施可能なプロセスおよび/または組成物を包含する限りにおいて、まさに各組み合わせおよびすべての組み合わせが個々にまたは明示的に開示されているかのように、本明細書に開示される。さらに、そのような可変要素を記載している実施形態に列挙されているすべてのサブコンビネーションも、本発明の複合体、組成物および方法によって具体的に包含され、そのような各サブコンビネーションが個々におよび明示的に開示されているかのように、本明細書に開示される。
本開示を読むと当業者には明らかであるように、本明細書に説明され例証された個々の実施形態の各々は、本開示の方法の範囲または趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離され得る、または組み合わせられ得る個別の構成要素および特徴を有する。いかなる列挙された方法も、列挙された事象の順序で、または論理的に可能なあらゆる他の順序で実行され得る。
複合体
上に要約したように、本開示は複合体を提供する。例えば、本明細書に記載されているのは、癌治療のための代替標的剤としての、ペプチドベースの薬物複合体のツールボックスの開発および特徴付けである。従来の癌化学療法剤は、有効用量と毒性用量の間の範囲が狭いことがよくある。有効性を改善し、副作用を最小限に抑えるために、タンパク質-薬物複合体(PDC:
protein-drug conjugate)は、癌性組織に化学療法剤を選択的に送達するのに使用される。
本開示の複合体は、細胞表面分子に結合する操作されたループを含むノッティンペプチドを含む。本開示の複合体で使用されるノッティンペプチドのタイプは、変化し得る。使用できるノッティンペプチドの非限定的な例には、EETI-IIペプチド、AgRPペプチド、ω-コノトキシンペプチド、カラタB1ペプチド、MCoTI-IIペプチド、アガトキシンペプチド、およびクロロトキシンペプチドが含まれる。ノッティンペプチドの三次元構造は、3つのジスルフィド結合の特定の配置によって最小限定義される。この特徴的なトポロジーは、1つのジスルフィド結合が他の2つの鎖内ジスルフィド架橋によって形成された大環状を通過する分子の結び目(knot)を形成する。それらの二次構造含量は通常低いが、ノッティンは、ジスルフィド結合フレームワークによって安定化されている小さな三本鎖逆平行βシートを共有する。ノッティンの折り畳みと機能的活性は、長さもアミノ酸組成も多様であるループ領域によってしばしば媒介される。3つのジスルフィド結合がこのペプチドファミリーのフォールドを定義する最小数であるが、ノッティンは追加のシステイン残基を含むこともでき、これは4つ以上のジスルフィド結合と追加の拘束ループをその構造に持つ分子を生成する。「シスチン」という用語は、硫黄基がジスルフィド結合を介して別のアミノ酸に結合しているCys残基を指す。「システイン」という用語は、その残基の-SH(「ハーフシスチン」)形態を指す。結合ループ部分はシスチンに隣接し得、その結果、結合ループの一次配列に他の介在するシスチンが存在しない。
ノッティンペプチドは、オンラインのKNOTTINデータベースに記載されているペプチドであり得、そこにはシスチンノットモチーフを含むと特定された数千ものポリペプチドの詳細なアミノ酸配列、構造、分類、および機能情報が含まれている。ノッティンは、さまざまな植物、動物、昆虫、菌類に見られる。
ノッティンペプチドは完全長(すなわち、野生型ペプチド/ポリペプチドの長さ)であり得、ノッティンペプチドは、野生型ペプチド/ポリペプチドの長さに対して短縮され得、またはノッティンペプチドは、ペプチドが野生型ペプチド/ポリペプチドの長さに比べてより長くなるような追加のアミノ酸を含み得る。
特定の実施形態によれば、本開示のノッティン薬物複合体(KDC:knottin-drug conjugate)は、Ecballium elateriumトリプシン阻害剤II(EETI-II)ペプチド、アグーチ関連タンパク質(AgRP)ペプチド、ω-コノトキシンペプチド、カラタB1ペプチド、MCoTI-IIペプチド、アグーチキシンペプチド、またはクロロトキシンペプチドのいずれか一つに基づくノッティンペプチドを含み得る。いくつかの実施形態において、ノッティンペプチドは、Ecballium elateriumトリプシン阻害剤II(EETI-II)ペプチドに基づく。いくつかの実施形態において、ノッティンペプチドは、アグーチ関連タンパク質(AgRP)ペプチドに基づく。
「EETI」とは、Protein Data Bank Entry(PDB)2ETIを意味する。KNOTTINデータベースのそのエントリはEETI-IIである。特定の態様において、本開示の複合体のノッティンペプチドは、次のアミノ酸配列を有するEETI-IIペプチドに基づく:
GCPRILMRCKQDSDCLAGCVCGPNGFCG(配列番号1)
「AGRP」とは、PDBエントリ1HYKおよびKNOTTINデータベースエントリSwissProtAGRP_HUMANを意味する。AGRPは、人間の脳のメラノコルチン受容体に結合し、代謝と食欲の調節に関与する132アミノ酸の神経ペプチドである。AgRPの生物学的活性は、5つのジスルフィド結合を含むC末端システインノットドメインによって媒介されるが、4つのジスルフィド結合のみを含む完全に活性な34アミノ酸の短縮型AgRPが開発された。特定の態様において、本開示の複合体のノッティンペプチドは、次のアミノ酸配列を有する短縮型AGRPペプチドに基づく。
CVRLHESCLGQQVPCCDPAATCYCRFFNAFCYCR(配列番号2)
特定の実施形態によれば、本開示の複合体のノッティンペプチドは、次のアミノ酸配列を有するカラタB1ペプチドに基づく。
CGETCVGGTCNTPGCTCSWPVCTRNGLPV(配列番号3)
特定の態様において、本開示の複合体のノッティンペプチドは、次のアミノ酸配列を有するMCoTI-IIペプチドに基づく。
SGSDGGVCPKILKKCRRDSDCPGACICRGNGYCG(配列番号4)
特定の実施形態によれば、本開示の複合体のノッティンペプチドは、次のアミノ酸配列を有するクロロトキシンペプチドに基づく。
MCMPCFTTDHQMARKCDDCCGGKGRGKCYGPQCLCR(配列番号5)
EETI-II、AgRP、ω-コノトキシン、カラタB1、MCoTI-II、アガトキシン、クロロトキシン、および本開示の複合体のノッティンペプチドが基づき得る他のノッティンペプチドの配列および構造(例えば、ループ)情報は、PDB、KNOTTINデータベース、およびその他のタンパク質データベースにおいて見出され得る。
ノッティンペプチドには、細胞表面分子に結合する操作されたループが含まれ、つまり、ループは細胞表面の標的分子に結合するように操作されている。ノッティンは、ループ領域を逆平行βシートのコアに拘束する分子「ノット」に織り込まれた3つのジスルフィド結合を含有する。例えば、野生型EETIは、ループ1(トリプシン結合ループ、残基3~8)、ループ2(残基10~14)、およびループ3(残基22~26)という3つのジスルフィド拘束ループを持つ28アミノ酸で構成されている。プロテアーゼ阻害剤、毒素、および抗菌剤を含むノッティンファミリーメンバーは、コアシステイン残基を除いて、配列相同性をほとんど共有していない。その結果、それらのジスルフィド拘束ループは多くの配列多様性を許容し、ノッティンを、タンパク質の三次元折り畳みを廃止することなくタンパク質に突然変異を導入する必要があるタンパク質工学アプリケーションに適したものにする。
操作されたループは、ノッティンペプチドの既存のループにおけるアミノ酸の置換、挿入、および/または欠失を含み得、または、操作されたループは、ノッティンタンパク質に付加されたループであり得る。すなわち、当該複合体のノッティンペプチドは、野生型ペプチドに存在する1つまたは複数のループに加えてループを含み得る。指向性進化と計算共分散分析を組み合わせることにより、ノッティン足場のループ領域に改変(アミノ酸配列とループ長の両方)を導入するためのガイドラインが解明された。例えば、Lahti et al(2009)PLoS Comput.Biol.5(9):e1000499を参照されたい。
いくつかの実施形態において、ノッティンのループは、癌細胞表面分子に結合するように操作される。「癌細胞」とは、例えば、異常な細胞成長、異常な細胞増殖、密度依存性の増殖阻害の喪失、足場非依存性増殖能、免疫無防備状態の非ヒト動物モデルにおいて腫瘍増殖および/または発生を促進する能力、ならびに/または細胞形質転換の適切な指標をのうちの1つまたは複数によって特徴付けられ得る、新生物細胞表現型を示す細胞を意味する。本明細書において「癌細胞」は、「腫瘍細胞」、「悪性細胞」または「癌性細胞」と互換的に使用され得、固形腫瘍、半固形腫瘍、原発腫瘍、転移性腫瘍などのがん細胞を包含する。そのような操作されたループは、ノッティンペプチドに、野生型ペプチドには存在しない癌細胞表面分子認識特性を与える。特定の態様において、癌は、1つ以上の腫瘍関連または腫瘍特異的細胞表面分子(例えば、細胞表面受容体、膜プロテアーゼなど)を有することが知られている癌であり、ノッティンペプチドの操作されたループは、1つまたは複数のそのような腫瘍関連または腫瘍特異的細胞表面分子の細胞外ドメインに結合する。「腫瘍関連細胞表面分子」とは、正常組織の細胞上で発現が制限され悪性細胞上で発現される細胞表面分子、又は正常細胞に比べて悪性細胞上ではるかに高い密度で発現される細胞表面分子を意味する。
任意の腫瘍関連細胞表面分子または腫瘍特異的細胞表面分子が、本開示の複合体のノッティンペプチドによって標的化され得る。特定の態様では、ループが結合するように操作された癌細胞表面上の標的は、HER2、B7-H3(CD276)、CD19、CD20、GD2、CD22、CD30、CD33、CD56、CD66/CEACAM5、CD70、CD74、CD79b、CD123、CD133CD138、CD171、B細胞成熟抗原(BCMA)、ネクチン-4、メソテリン、膜貫通糖タンパク質NMB(GPNMB)、前立腺特異的膜抗原(PSMA)、SLC44A4、CA6、チロシンタンパク質キナーゼMet(c-Met)、表皮成長因子受容体変異体III(EGFRvIII)、ムチン1(MUC1)、エフリンA型受容体2(EphA2)、グリピカン2(GPC2)、グリピカン3(GPC3)、fms様チロシンキナーゼ3(FLT3)、葉酸受容体アルファ(FRα)、IL-13受容体アルファ2(IL13Rα2)、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体1(ROR1)、デルタ様3(DLL3)、κライト鎖、血管内皮増殖因子受容体2(VEGFR2)、栄養芽細胞糖タンパク質(TPBG)、未分化リンパ腫キナーゼ(ALK)、CA-IX、インテグリン、CXCケモカイン受容体タイプ4(CXCR4)、ニューロピリン-1(NRP1)、マトリプターゼ、およびその他の腫瘍関連または腫瘍特異的な目的の分子である。
特定の実施形態によれば、癌細胞表面上の標的は、受容体、例えば、細胞接着受容体、可溶性因子(例えば、成長因子、ケモカイン、または他の可溶性因子受容体)の受容体、免疫細胞受容体、などである。特定の態様において、受容体が細胞接着受容体である場合、受容体はインテグリンである。例えば、本開示の複合体は、αvβ1インテグリン、αvβ3インテグリン、αvβ5インテグリン、αvβ6インテグリン、α5β1インテグリン、またはそれらの任意の組み合わせのいずれか1つに結合するように操作されたループを有するノッティンペプチドを含み得る。特定の実施形態によれば、操作されたループは、αvβ1インテグリン、αvβ3インテグリン、αvβ5インテグリン、αvβ6インテグリン、およびα5β1インテグリンのそれぞれに結合する。
本開示の複合体において使用され得る、αvβ1インテグリン、αvβ3インテグリン、αvβ5インテグリン、αvβ6インテグリン、およびα5β1インテグリンのそれぞれに結合する操作された結合ループを有するEETIベースのノッティンペプチド(EETI-2.5Dと指定)は、次のアミノ酸配列を有する(インテグリン結合ループに下線が引かれている):
GCPQGRGDWAPTSCKQDSDCRAGCVCGPNGFCG(配列番号6)
本開示の複合体において使用され得る、αvβ1インテグリン、αvβ3インテグリン、αvβ5インテグリン、αvβ6インテグリン、およびα5β1インテグリンのそれぞれに結合する操作された結合ループを有するEETIベースのノッティンペプチド(EETI-2.5Fと指定)は、次のアミノ酸配列を有する(インテグリン結合ループに下線が引かれている):
GCPRPRGDNPPLTCSQDSDCLAGCVCGPNGFCG(配列番号7)
いくつかの実施形態において、本開示の複合体のノッティンペプチドは、表1に記載されているような、インテグリン結合EETIベースのノッティンペプチドである。
Figure 2022533671000002
いくつかの実施形態において、本開示の複合体のノッティンペプチドは、表2に記載されているような、インテグリン結合AgRPベースのノッティンペプチドである。
Figure 2022533671000003
いくつかの実施形態において、ノッティンペプチドは、1つ又は複数の非天然アミノ酸を含む。そのような1つまたは複数の非天然アミノ酸は、例えば、薬物のノッティンペプチドへのコンジュゲーションを促進するために使用され得る。例えば、本開示の複合体を調製するために使用される非天然アミノ酸には、アジド、アルキン、アルケン、アミノオキシ、ヒドラジン、アルデヒド、ニトロン、ニトリルオキシド、シクロプロペン、ノルボルネン、イソシアニド、ハロゲン化アリール、およびボロン酸官能基から選択される官能基を有するものが含まれる。本開示のノッティン-薬複合体のノッティンペプチドに組み込まれ、目的の官能基を提供するために選択され得る非天然アミノ酸は公知であり、例えば、Maza et al.(2015)Bioconjug.Chem.26(9):1884-9;Patterson etal.(2014)ACS Chem.Biol.9:592-605;Adumeau et al.(2016)Mol.Imaging Biol.(2):153-65、およびその他に記載されている。
細胞表面分子に結合する操作されたループを有するノッティンペプチドが開発される方法は、変化し得る。合理的(rational)アプローチおよびコンビナトリアルアプローチが、新しい分子認識特性を持つノッティンを設計するために使用されてきた。例えば、ノッティンタンパク質のライブラリーが作成され、(例えば細菌ディスプレイ、ファージディスプレイ、酵母表面ディスプレイ、蛍光活性化細胞選別(FACS)、および/または他の好適なスクリーニング方法によって)スクリーニングされ得る。
酵母表面ディスプレイは、新規の分子認識特性、増加された標的結合親和性、適切な折り畳み、および改善された安定性を有するタンパク質を設計するために使用されてきた強力なコンビナトリアル技術である。このプラットフォームでは、所望の生化学的および生物物理学的特性を有する変異体を単離するために、タンパク質変異体のライブラリーがハイスループット様式で生成およびスクリーニングされる。酵母表面ディスプレイは、真核生物分泌経路、シャペロンの補助による折り畳み、および効率的なジスルフィド結合形成の品質管理機構から利益を得る。
標的の細胞表面分に結合する操作されたループを有するノッティンペプチドを開発するための1つの例示的なアプローチは、酵母接合型凝集素タンパク質Aga2pにペプチドを遺伝子融合することを含み、これは2つのジスルフィド結合によって酵母細胞壁タンパク質Aga1pに連結される。このAga2p融合構築物、および染色体に組み込まれたAga1p発現カセットは、ガラクトース誘導性プロモーター等の好適なプロモーターの制御下で発現させることができる。蛍光標識された一次または二次抗体を使用するフローサイトメトリーによって細胞表面発現レベルを測定するために、N末端またはC末端のエピトープタグを含めることができる。この構築物は、ノッティン(または操作される他のタンパク質)のN末端がAga2に融合された、最も広く使用されているディスプレイフォーマットを表しているが、酵母表面ディスプレイプラスミドのいくつかの代替変形例が記述されてきており、本開示の複合体で使用するノッティンペプチドを開発するために用いられ得る。ファージディスプレイまたはmRNAディスプレイで使用されるパニングに基づく方法に勝る、このスクリーニングプラットフォームの利点の1つは、2色FACSを使用して、希望標的に対する結合親和性がわずか2倍程しか違わないクローンを定量的に識別することが可能であることである。
DNAレベルでノッティンループ領域を選択的に変異させるために、例えばオーバーラップエクステンションPCRを使用したオリゴヌクレオチドアセンブリによって縮重コドンを導入することができる。次いで、酵母における相同組換えのために酵母ディスプレイベクターと十分に重複する隣接プライマーを使用して、遺伝物質が増幅され得る。このアセンブリと増幅の方法により、ノッティンライブラリーを比較的低コストと労力で作成することができる。ライブラリー組成に対する明確な制御を可能にする合成オリゴヌクレオチド・ライブラリーおよび最新の方法が開発されている。
特定の態様では、ディスプレイライブラリー(例えば、酵母ディスプレイライブラリー)は、FACSによって目的の細胞表面分子に対する結合についてスクリーニングされる。FACSによってノッティンライブラリーをスクリーニングする場合、結合剤が富化されたプールは、通常、4~7ラウンドのソートで出現する。2色FACSがライブラリーのスクリーニングに用いられてもよく、一方の蛍光標識をc-mycエピトープタグを検出するために使用することができ、他方の蛍光標識を対象とする結合標的に対するノッティン変異体の相互作用を測定するために使用することができる。単一細胞分解能で2つの蛍光体の励起および発光特性を測定するために、異なる機器レーザーおよび/またはフィルターセットを使用することができる。これにより、結合によって酵母の発現レベルを正規化することが可能になる。すなわち、低い酵母発現を示すが多量の標的に結合するノッティンを、高レベルで発現されるが標的に弱く結合するノッティンと区別することができる。したがって、発現対結合の二次元フローサイトメトリープロットでは、結果として対角線上に標的抗原に結合する酵母細胞の集団が現れる。高親和性結合剤は、ライブラリー選別ゲートを使用して単離することができる。代替的に、最初の選別ラウンドにおいて、完全長タンパク質を発現しない望ましくないクローンのライブラリーを除去することが有用であり得る。スクリーニングで使用される標的は、最終的な用途に構造的および機能的に関連しており、例えば、目的の細胞表面分子を模倣する。
目的の細胞表面分子に対するバインダーについてのノッティンライブラリーの濃縮に続いて、酵母プラスミドが回収され、配列決定される。高い選別ストリンジェンシー下で、さらなるラウンドのFACSを実施することができる。次いで、個々の酵母がディスプレイされたノッティングクローンの結合親和性または動的解離速度を測定することができる。
目的の細胞表面分子に結合する操作されたループを有するノッティンペプチドが表面ディスプレイ(例えば、酵母表面ディスプレイ)によって同定されると、操作されたノッティンは、適切な方法を使用して生成され得る。ノッティンのサイズが小さいため、化学合成と組換え発現の両方による生産が可能となる。特定の実施形態によれば、ノッティンペプチドは、固相ペプチド合成とそれに続くインビトロフォールディングによって生成され得る。化学合成により、非天然アミノ酸または他の化学的ハンドルをノッティンペプチドに容易に組み込むことができる。
大きな異種ドメインに融合されていないノッティンペプチドは、自動シンセサイザーで固相ペプチド化学を使用して容易に合成される。例えば、標準的な9-フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)ベースの固相ペプチド化学が用いられてもよい。次に、線状ペプチドは、システイン側鎖チオールの酸化を促進してジスルフィド結合を形成する条件下で折りたたまれ、続いて、例えば、逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)によって精製され得る。
特定の態様において、ノッティンペプチド、または抗体サブユニットもしくはその断片に融合されたノッティンペプチドを含む融合タンパク質は、組換えDNAアプローチを使用して生成される。様々な宿主細胞型において組換え法を使用してノッティンペプチドまたは融合タンパク質を産生するための任意の適切な戦略を採用することができる。例えば、E.coliのペリプラズム空間における折り畳みを促進し、また有用な精製ハンドルとしての役割を果たすバルナーゼを遺伝子融合パートナーとして用いて、機能的なノッティンが製造されてきた。特定の実施形態によれば、操作されたノッティンペプチドは酵母で発現される。例えば、酵母菌株Pichiapastorisgが、2~10mg/Lの精製された操作されたノッティンを生産するために有効活用されている。酵母発現構築物は、1つ又は複数のタグ(例えば、金属キレートクロマトグラフィー(Ni-NTA)による精製のためのC末端ヘキサヒスタジンタグ)をコードしてもよい。次いで、サイズ排除クロマトグラフィーを、凝集物、誤って折り畳まれた多量体等を除去するために使用することができる。
本開示の態様は、本開示の複合体で使用されるノッティンペプチドおよび融合タンパク質をコードする核酸を含む。すなわち、目的の細胞表面分子に結合する操作されたループを有する、本明細書に記載のノッティンペプチドおよび融合タンパク質のいずれかをコードする核酸が提供される。ある特定の態様において、そのような核酸は発現ベクター中に存在する。発現ベクターは、ノッティンペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含み、プロモーターは、ノッティンペプチドを発現するために選択された宿主細胞の種類に基づいて選択される。本開示のノッティンペプチドをコードする核酸のいずれかを含む宿主細胞、ならびにそれを含む任意の発現ベクターも提供される。
直接結合または競合結合アッセイを使用して、細胞(例えば、哺乳動物の癌細胞などの癌細胞)の表面に発現する分子に対するノッティンの親和性を測定するための方法が利用可能である。直接結合アッセイにおいて、フルオロフォアもしくは放射性同位体に接合されたノッティン、または標識抗体による検出のためのN末端もしくはC末端エピトープタグを含有するノッティンを用いて平衡結合定数(K)を測定することができる。標識またはタグが実行可能でないまたは所望されない場合、競合結合アッセイを使用して最大半量阻害濃度(IC50)を決定することができ、これは標識競合物の最大シグナルの50%が検出可能となる非標識ノッティンの量である。次いで、測定されたIC50値からK値を計算することができる。リガンドの枯渇は、低濃度域で高親和性相互作用を測定する場合により顕著になり、実験で追加する細胞の数を減らす、又は結合反応体積を増やすことで回避または最小限化することができる。
特定の態様において、ノッティンペプチドまたは融合タンパク質は、約0.01nM~100nM、例えば、約0.025nM~75nM、約0.05nM~50nm、約0.075nM~25nM、または約0.1nM~10nMの、細胞表面分子に対する平衡結合定数(K)を有する。いくつかの実施形態において、ノッティンペプチドまたは融合タンパク質は、約0.1nM~10nMの細胞表面分子に対する平衡結合定数(K)を有する。いくつかの実施形態において、ノッティンペプチドまたは融合タンパク質は、約0.1nMの細胞表面分子に対する平衡結合定数(K)を有する。いくつかの実施形態において、ノッティンペプチドまたは融合タンパク質は、約0.5nMの細胞表面分子に対する平衡結合定数(K)を有する。いくつかの実施形態において、ノッティンペプチドまたは融合タンパク質は、約1nMの細胞表面分子に対する平衡結合定数(K)を有する。いくつかの実施形態において、ノッティンペプチドまたは融合タンパク質は、約5nMの細胞表面分子に対する平衡結合定数(K)を有する。いくつかの実施形態において、ノッティンペプチドまたは融合タンパク質は、約10nMの細胞表面分子に対する平衡結合定数(K)を有する。
ノッティンライブラリーの構築とスクリーニング、化学合成と組換え発現によるノッティン生産、さらに直接結合または競合結合アッセイを使用して細胞の表面に発現された分子(例えば、受容体)へのノッティンの親和性を測定するための細胞結合アッセイを含む、酵母表面ディスプレイ技術によるノッティンの操作に関する詳細なガイダンスと特定のプロトコルは、Moore,S.and Cochran,J.(2012)Engineering Knottins as Novel Binding Agents,Methods in Enzymology,503,223-251に記載されている。
ノッティン-薬物複合体
既存のターゲティング剤は、高分子量(MW)タンパク質、つまり抗体にほぼ独占的に依存しており、代替の低MWターゲティングタンパク質の可能性は開拓されていないままである。臨床開発中の約100を超える抗体薬物複合体(ADC:antibody-drug conjugate)候補があるにもかかわらず、FDAによって承認されているADCは4つだけである(Mylotarg(登録商標)、Adcetris(登録商標)、Kadcyla(登録商標)、およびBesponsa(登録商標))。大きな障壁が、依然としてこのクラスの標的治療薬の臨床的成功を妨げている。55以上のADC候補が臨床試験に失敗し、これらの失敗のうち少なくとも23は治療期間が不十分だったことが原因であった。承認されたADCまたは後期臨床開発段階のADCは、血液がんに大きく偏っており、固形腫瘍に対する臨床的成功率が大幅に低下している。抗体の高分子量免疫グロブリンG(IgG)部分は、血管からの効率的な血管外漏出と固形腫瘍全体への拡散という物理的な課題に直面している。さらに、ADCの循環半減期の延長は、もともと腫瘍内の吸収薬物の蓄積を増加させることで完全に有益であると考えられていたが、健康な組織が無傷の複合体および早期に放出されてしまった薬物の両方へ曝露されることを増加させることにより、オフターゲット毒性にも貢献する。
低MWターゲティング剤は、異なる薬物動態プロファイルを提供し、固形腫瘍に対する有効性の制限や、血液脳関門を通過できないため脳腫瘍は標的から除外されるなど、抗体薬物複合体の歴史的な制限を克服する可能性を有する。低MWターゲティングタンパク質の理論上の利点にもかかわらず、このクラスのターゲティング剤は、急速な全身クリアランスまたは毒性のために効果がないという広く受け入れられている仮定が存在する。しかしながら、本明細書に示されるように、本開示の低分子量標的化剤は、予想外に高い効力、例えば、抗腫瘍効力を示す。
低分子量標的化剤の一例では、細胞表面分子に結合する操作されたループを含むノッティンペプチド(上記のノッティンペプチドのいずれかを含むがこれに限定されない)、およびリンカーを介してノッティンペプチドに接合される抗微小管剤を含む複合体が提供される。そのような複合体の非限定的な例が図1、パネルB(右―本明細書ではノッティン薬物複合体(knottin drug conjugate)または「KDC」と呼ばれることもある)に概略的に示されている。
本明細書で使用される場合、「抗微小管剤」とは、微小管の形成を防止する、および/または微小管を破壊する薬剤である。微小管は、細胞分裂、分化、輸送、および運動性を含む、多くの重要な哺乳類細胞機能にとって重要である、動的に不安定な細胞骨格タンパク質ポリマーである。微小管の生物学的機能は、αβ-チューブリンヘテロダイマーの解重合および再重合によって調節され、それに依存している。微小管の非平衡重合は、GDP-チューブリンを放出する「カタストロフィ」と呼ばれる分解プロセスを介して逆転させることができる。逆に、GDPのGTPへの交換は、GTP加水分解を介して重合される活性型のチューブリンを再生成する。したがって、GTP-チューブリン相互作用は、微小管ダイナミクスの細胞調節において重要な役割を果たす。さまざまな細胞機能に対するそれらの中心的な重要性のため、チューブリン二量体および微小管細胞骨格は、有糸分裂を妨害する多数の細胞毒性剤の標的である。
特定の実施形態において、ノッティンペプチドにコンジュゲート化される抗微小管剤は、チューブリン阻害剤である。いくつかの実施形態によれば、チューブリン阻害剤はアウリスタチンである。本開示のノッティン複合体で有用性が見出されるアウリスタチンの非限定的な例には、アウリスタチンEおよびアウリスタチンFが含まれる。特定の実施形態において、アウリスタチンは、モノメチルアウリスタチンF(MMAF)である。いくつかの実施形態によれば、アウリスタチンはモノメチルアウリスタチンE(MMAE-その構造は図1、パネルaに提供されている)である。MMAEはドラスタチン10誘導体であり、親化合物よりも活性が向上し、毒性が増加している。MMAEは、モノメチルバリン(MeVal)、バリン(Val)、ドライソロイイン(Dil)、ドラプロイン(Dap)の4つのアミノ酸と、カルボキシ末端アミンのノルエフェドリンで構成されている。多くのチューブリン阻害剤は、それらが結合するチューブリン二量体の一般的領域によって大まかに分類される。MMAEは、ビンカ部位の有糸分裂阻害剤のカテゴリーに分類される。ビンカ部位の抗有糸分裂剤は、典型的には、二つの長手方向に整列されたチューブリンの二量体の間、すなわちβチューブリンサブユニットと隣接するαチューブリンサブユニットとの間の界面において結合し、これは例えばビンブラスチンおよびエリブリンなどの古典的なアルカロイド微小管不安定化剤により標的化されるドメインである。生物物理学的実験および結晶構造を使用して、MMAEは、ペプチド部位と呼ばれる、ビンカ部位とは構造的に異なる領域に結合することが確認された。MMAEは、α/βチューブリン界面近くのペプチド部位に強固に結合し、GTP加水分解とそれによる重合を効果的にブロックする強力なチューブリン阻害剤である。さらに、MMAEは最近、自然では非秩序的であるβ-チューブリンMループに、秩序的ならせん構造を誘導することが示された95。このコンフォメーション変化は、微小管の重合を立体的にブロックすることにより、微小管の形成をさらに妨害する。
本開示のノッティン-薬物複合体において、抗微小管剤は、リンカーを介してノッティンペプチドに接合される。本開示の複合体に使用され得る非限定的リンカーの例としては、エステルリンカー、アミドリンカー、マレイミドまたはマレイミドベースのリンカー、バリン-シトルリンリンカー、ヒドラゾンリンカー、N-スクシンイミジル-4-(2-ピリジルジチオ)ブチレート(SPDB)リンカー、スクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート(SMCC)リンカー、ビニルスルホンベースのリンカー、テトラエチレングリコールなどのポリエチレングリコール(PEG)を含むがこれらに限定されないリンカー、プロパン酸を含むリンカー、カプロレイン酸を含むリンカー、およびその任意の組み合わせを含むリンカーが挙げられる。特定の態様では、リンカーは、中性pH(血流pH7.3~7.5)で安定であるが、標的細胞(例えば、癌細胞)の弱酸性エンドソーム(pH5.0~6.5)およびリソソーム(pH4.5~5.0)への内在化時に加水分解を受ける酸切断性リンカーなどの、化学的に不安定なリンカーである。化学的に不安定なリンカーには、ヒドラゾン系リンカー、オキシム系リンカー、カーボネート系リンカー、エステル系リンカーなどが含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態によれば、リンカーは、血流中で安定であるが、標的細胞への内在化時に標的細胞(例えば、癌細胞)のリソソーム中の例えばリソソームプロテアーゼ(カテプシンまたはプラスミンなど)によって酵素的切断を受ける、酵素不安定性リンカーなどの酵素不安定性リンカーである。酵素不安定性リンカーには、ペプチド結合を含むリンカー、例えば、バリン-シトルリンリンカー、例えばマレイミドカプロイル-バリン-シトルリン-p-アミノベンジル(MC-vc-PAB)リンカー、バリル-アラニル-パラ-アミノベンジルオキシ(Val-Ala-PAB)リンカーなどのジペプチドベースのリンカーが含まれるが、これらに限定されないリンカーが含まれる。化学的に不安定なリンカー、酵素的に不安定なリンカーおよび切断不可能なリンカーは公知であり、例えば、Ducry&Stump(2010)BioconjugateChem.21:5-13に詳細に記載されている。
特定の実施形態において、本開示の複合体は、バリン-シトルリンジペプチド、バリン-アラニンジペプチド、またはその両方を含むリンカーを含む。いくつかの実施形態によれば、リンカーは、バリンーシトルリンーパラアミノベンジルオキシ(Val-Cit-PAB)リンカーである(図1のパネルaに概略的に示されている)。特定の実施形態において、リンカーは、バリルアラニルパラアミノベンジルオキシ(Val-Ala-PAB)リンカーである。
ノッティン-抗体サブユニット複合体
本開示の態様は、ノッティン-抗体サブユニット複合体をさらに含む。そのような複合体は、抗体サブユニットまたはその断片に融合された、細胞表面分子に結合する操作されたループを含むノッティンペプチド(上記のノッティンペプチドのいずれかを含むがこれに限定されない)を含む融合タンパク質を含む。そのような複合体は、リンカーを介して融合タンパク質に接合された薬物をさらに含む。いくつかの実施形態では、そのような複合体の二量体が提供され、そこでは、抗体サブユニットまたはその断片が二量体化して(例えば、ヒンジ領域(存在する場合)等におけるジスルフィド架橋を介して)、二量体化ノッティン薬物複合体が形成される。
いくつかの実施形態によれば、抗体サブユニットまたはその断片は、抗体重鎖またはその断片である。特定の実施形態において、抗体重鎖またはその断片は、γ、α、δ、ε、もしくはμ抗体重鎖またはその断片を含む。いくつかの実施形態によれば、抗体重鎖またはその断片は、IgG重鎖またはその断片、例えば、ヒトIgG1重鎖またはその断片である。特定の実施形態において、抗体重鎖またはその断片は、重鎖可変領域(V)を含む。そのような抗体重鎖またはその断片は、重鎖定常領域またはその断片をさらに含み得る。例えば、重鎖の定常領域またはその断片が融合タンパク質に含まれる場合、その抗体重鎖定常領域またはその断片は、C1ドメイン、C2ドメイン、および/またはC3ドメインのうちの1つまたは複数を含み得る。いくつかの実施形態によれば、抗体重鎖またはその断片は完全長抗体重鎖であり、すなわち、VH、1ドメイン、C2ドメイン、およびC3ドメインを含む抗体重鎖である。
特定の実施形態において、抗体サブユニットまたはその断片は、Vを含まない抗体重鎖またはその断片である。そのような抗体重鎖またはその断片は、Fc領域を含み得る、本質的にそれからなる、またはFc領域からなり得る。本開示の重鎖(またはその断片)含有複合体のいずれかに含まれ得るFc領域の非限定的な例は次のアミノ酸配列を有する。
Figure 2022533671000004
本開示の複合体が、抗体重鎖またはその断片に融合されたノッティンペプチドを含む場合、ノッティンペプチドは、抗体重鎖またはその断片のN末端に融合され得る。あるいは、ノッティンペプチドは、抗体重鎖またはその断片のC末端に融合され得る。
抗体重鎖またはその断片に融合されたノッティンペプチドを含む複合体の場合、薬物は、融合タンパク質のノッティンペプチド部分に接合され得る。あるいは、薬物は、融合タンパク質の抗体重鎖またはその断片の部分に接合され得る。例えば、抗体重鎖またはその断片がFc領域を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる場合、薬物は、Fc領域に接合され得る。これらの実施形態において、薬物は、Fc領域のC1ドメイン、Fc領域のC2ドメイン、またはFc領域のC3ドメイン、例えばFc領域のC末端またはその近くに接合され得る。
いくつかの実施形態によれば、抗体サブユニットまたはその断片は、抗体軽鎖またはその断片である。特定の実施形態において、抗体軽鎖またはその断片は、カッパ(κ)軽鎖またはその断片、あるいはラムダ(λ)軽鎖またはその断片を含む。いくつかの実施形態によれば、抗体軽鎖またはその断片は、軽鎖可変領域(V)を含む。そのような抗体軽鎖またはその断片は、抗体軽鎖定常領域(C)またはその断片をさらに含み得る。特定の実施形態において、抗体軽鎖またはその断片は、完全長抗体軽鎖、すなわち、VおよびCを含む抗体軽鎖である。
本開示の複合体が、抗体軽鎖またはその断片に融合されたノッティンペプチドを含む場合、ノッティンペプチドは、抗体軽鎖またはその断片のN末端に融合され得る。あるいは、ノッティンペプチドを抗体軽鎖またはその断片のC末端に融合され得る。
抗体軽鎖またはその断片に融合されたノッティンペプチドを含む複合体の場合、薬物は、融合タンパク質のノッティンペプチド部分に接合され得る。あるいは、薬物は、融合タンパク質の抗体軽鎖またはその断片の部分に接合され得る。例えば、薬物は、V(存在する場合)またはC(存在する場合)に、例えば、CのC末端またはその近くに接合され得る。
特定の実施形態において、本開示の複合体が、重鎖可変領域(V)または軽鎖可変領域(V)を含む抗体サブユニットまたはその断片に融合されたノッティンペプチドを含む場合、そのVまたはVは、ノッティンの操作されたループが結合する細胞表面分子を含む細胞の表面の抗原には結合しない。特定の実施形態において、本開示の複合体が、重鎖可変領域(V)または軽鎖可変領域(V)を含む抗体サブユニットまたはその断片に融合されたノッティンペプチドを含む場合、ノッティンはそのVまたはVに融合され、そのVまたはVが抗原に結合しないようにする。
抗体サブユニットまたはその断片に融合したノッティンペプチドを含む複合体で使用される薬物は、任意の適切な薬剤であり得、複合体が使用される用途、例えば、殺傷、細胞増殖の防止などに応じて変化する。複合体に含まれ得る薬物の非限定的な例には、毒素、毒素の断片、抗増殖剤、抗腫瘍剤などが挙げられる。特定の態様では、複合体は、細胞増殖の阻害および/または細胞/組織を殺滅させることによって標的細胞/組織の機能を低下させる薬剤を含む。そのような薬剤は、様々であり、細胞増殖抑制剤および細胞傷害性剤、例えば、標的細胞へ内在化されるかどうかに関わらず標的細胞組織を殺滅させることができる薬剤を含み得る。
ある特定の態様において、複合体の薬物は、エンジイン、レキシトロプシン、デュオカルマイシン、タキサン、ピューロマイシン、ドラスタチン、メイタンシノイド、およびビンカアルカロイドから選択される細胞傷害性剤などの細胞傷害性剤である。ある特定の実施形態によれば、細胞傷害性剤は、パクリタキセル、ドセタキセル、CC-1065、CPT-11(SN-38)、トポテカン、ドキソルビシン、モルホリノ-ドキソルビシン、リゾキシン、シアノモルホリノ-ドキソルビシン、ドラスタチン-10、エキノマイシン、コンブレタスタチン、カリケアマイシン、メイタンシン、メイタンシンDM1、メイタンシンDM4、DM-1、アウリスタチンEもしくはアウリスタチンFなどのアウリスタチンもしくは他のドラスタチン誘導体、AEB(AEB-071)、AEVB(5-ベンゾイルバレリン酸-AEエステル)、AEFP(抗体-エンドスタチン融合タンパク質)、MMAE(モノメチルアウリスタチンE)、MMAF(モノメチルアウリスタチンF)、ピロロベンゾジアゼピン(PBD)、エレウテロビン、ネットロプシン、またはこれらの任意の組み合わせである。
ある特定の実施形態によれば、複合体の薬物は、HTI-286等のヘミアステリンおよびヘミアステリン類似体(例えば、参照によりそれらの全開示が本明細書に組み込まれる米国特許第7,579,323号、WO2004/026293号、および米国特許第8,129,407号を参照)、アブリン、ブルシン、シクトキシン、ジフテリア毒素、バトラコトキシン、ボツリヌス毒素、志賀毒素、内毒素、シュードモナス外毒素、シュードモナス内毒素、破傷風毒素、百日咳毒素、炭疽毒素、コレラ毒素、ファルカニントキシン、フモニシンB1、フモニシンB2、α毒素、モーロトキシン、アジトキシン、カリブドトキシン、マーガトキシン、スロトキシン、スキラトキシン、ヘフトキシン、カルシセプチン、タイカトキシン、カルシクルジン、ゲルダナマイシン、ゲロニン、ロトストラリン、オクラトキシンA、パツリン、リシン、ストリキニーネ、トリコテシン、ゼアラレノン、およびテトラドラキシンなどから選択されるタンパク質毒素である。用いることができる酵素的に活性な毒素およびその断片には、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素A鎖(緑膿菌由来)、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシンA鎖、α-サルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質(PAPI、PAPII、およびPAP-S)、ニガウリ阻害剤、クルシン、クロチン、サボン草阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシンおよびトリコテセンが含まれる。
特定の実施形態において、複合体の薬物は、抗微小管剤、チューブリン阻害剤、アウリスタチン、アウリスタチンE、アウリスタチンF、モノメチルアウリスタチンE(MMAE)、モノメチルアウリスタチンF(MMAF)、アウリスタチンW誘導体、メイタンシン、メイタンシン誘導体、N’-デアセチル-N’-(3-メルカプト-1-オキソプロピル)-マイタンシン(DM1)、ラブタンシン(DM4)、ピロロベンゾジアゼピン(PBD)、カリケアマイシン、デュオカルマイシン、ドキソルビシン、SN-38、DXd、リポソームドキソルビシン、およびツブリシンから選択される。
いくつかの実施形態によれば、複合体の薬物はヌクレオシド薬物である。そのようなヌクレオシド薬は、ヌクレオシド類似体であり得る。使用できるヌクレオシド類似体の非限定的な例には、ゲムシタビン、シタラビン、トロキサシタビン、デシタビン、クラドリビン、フルダラビン、クロファラビン、および2’-C-シアノ-2’-デオキシ-1-β-D-アラビノ-ペントフラノシルシトシン(CNDAC)が挙げられる。
任意の適切なリンカーを、抗体重鎖またはその断片に融合したノッティンペプチドを含む複合体に使用することができる。そのようなリンカーの非限定的な例は、ノッティン-薬物複合体に関連する上述部分に記載されており、その説明は、ここに組み込まれるが、簡潔にするためにここでは繰り返されない。特定の実施形態において、抗体重鎖またはその断片に融合されたノッティンペプチドを含む複合体は、バリン-シトルリンジペプチド、バリン-アラニンジペプチド、またはその両方を含むリンカーを含む。いくつかの実施形態によれば、リンカーは、バリルアラニルパラアミノベンジルオキシ(Val-Cit-PAB)リンカーである(図1のパネルaに概略的に示されている)。特定の実施形態において、リンカーは、バリルアラニルパラアミノベンジルオキシ(Val-Ala-PAB)リンカーである。
複合体を作製する方法
本開示の態様は、複合体を作製する方法をさらに含む。そのような方法は、ノッティン-薬物複合体の場合は薬物をノッティンペプチドに接合すること、またはノッティン-抗体サブユニット複合体の場合はノッティンペプチドまたは抗体サブユニットもしくはその断片に薬物を接合することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、薬物をノッティンペプチドまたは抗体サブユニットもしくはその断片に部位特異的に接合させることを含む。例えば、接合させることは、薬物を、ノッティンペプチドまたは抗体サブユニットもしくはその断片の事前に選択されたアミノ酸に部位特異的に接合させることを含み得る。特定の態様では、予め選択されたアミノ酸は、ノッティンペプチドまたは抗体サブユニットもしくはその断片のN末端またはC末端にある。他の態様では、事前に選択されたアミノ酸は、ノッティンペプチドまたは抗体サブユニットもしくはその断片の内部、すなわち、ノッティンペプチドまたは抗体サブユニットもしくはその断片のN末端アミノ酸とC末端アミノ酸との間にある。いくつかの実施形態では、予め選択されたアミノ酸は、非天然アミノ酸である。コンジュゲーションを容易にするためにノッティンペプチド又は抗体サブユニットもしくはその断片に提供され得る非天然アミノ酸の非限定的な例としては、アジド、アルキン、アルケン、アミノオキシ、ヒドラジン、アルデヒド(例えば、ホルミルグリシン、例えば、CatalentPharmaSolutionsのSMARTag(商標)technology)、ニトロン、ニトリルオキシド、シクロプロペン、ノルボルネン、イソシアニド、ハロゲン化アリール、およびボロン酸官能基から選択される官能基を有するものが挙げられる。目的の官能基を提供するために組み込まれ選択され得る非天然アミノ酸は公知であり、例えば、Mazaら(2015)Bioconjug、Chem.26(9):1884-9;Pattersonetal.(2014)ACSChem.Biol.9:592-605;Adumeauetal.(2016)Mol.ImagingBiol.(2):153-65、およびその他に記載されている。
リンカーを介して薬物とノッティンペプチドまたは抗体サブユニットもしくはその断片を接合させるための多くの戦略が利用可能である。例えば、薬物は、その薬物にリンカーを共有結合させることによって誘導体化することができ、そのリンカーは、ノッティンペプチドまたは抗体サブユニットもしくはその断片上の「化学的ハンドル」と反応することができる官能基を有する。また例として、ノッティンペプチドまたは抗体サブユニットもしくはその断片は、そのノッティンペプチドまたは抗体サブユニットもしくはその断片にリンカーを共有結合させることによって誘導体化することができ、そのリンカーは薬物上の「化学的ハンドル」と反応することができる官能基を有する。リンカー上の官能基は様々であり得、ノッティンペプチドまたは抗体サブユニットもしくはその断片における化学的ハンドルとの適合性に基づいて選択され得る。一実施形態によれば、化学的ハンドルは、化学的ハンドルを有する非天然アミノ酸を薬物またはノッティンペプチドまたは抗体サブユニットもしくはその断片に組み込むことによって提供される。いくつかの実施形態において、薬物と、ノッティンペプチドまたは抗体サブユニットもしくはその断片との接合は、銅フリーひずみ促進環化付加、アルキン-アジド環化付加などによるものである。
組成物
上記に要約したように、本開示は組成物を提供する。組成物は、上記の複合体のセクションに記載されているもののいずれかを含む、本開示の複合体のいずれかを含み得、それはここに組み込まれるが簡潔にするために繰り返されない。
特定の態様では、組成物は、液体媒体中に存在する本開示の複合体を含む。液体媒体は、水、緩衝溶液等の水性液体媒体であってもよい。1つ又は複数の添加剤、例えば、塩(例えば、NaCl、MgCl、KCl、MgSO)、緩衝剤(トリス緩衝液、N-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-N’-(2-エタンスルホン酸)(HEPES)、2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)、2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸ナトリウム塩(MES)、3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸(MOPS)、N-トリス[ヒドロキシメチル]メチル-3-アミノプロパンスルホン酸(TAPS)等)、プロテアーゼ阻害剤、グリセロール等が、そのような組成物中に存在してもよい。
医薬組成物もまた提供される。医薬組成物は、本開示の複合体のいずれか、および薬学的に許容される担体を含む。医薬組成物は、通常、治療有効量の複合体を含む。「治療有効量」とは、所望の結果をもたらすのに十分な投与量、例えば、有益なまたは所望の治療(予防を含む)結果、例えば操作されたループが特異的に結合する細胞表面分子に関連する細胞増殖障害(例えば、癌)を有する個体における細胞増殖の減少などをもたらすのに十分な量を意味する。有効量は、1回または複数回の投与で投与され得る。
本開示の複合体は、治療用投与のための種々の製剤に組み込むことができる。より具体的には、複合体は、適切な薬学的に許容される賦形剤または希釈剤との組み合わせによって、医薬組成物に製剤化することができ、錠剤、カプセル、散剤、顆粒、軟膏、溶液、注射剤、吸入剤およびエアロゾルなどの固体、半固体、液体または気体の形態での調製物で製剤化することができる。
個体への投与に好適な(例えば、ヒト投与に好適な)本開示の複合体の製剤は、一般に無菌であり、選択される投与経路に従って個体に投与するには禁忌である検出可能な発熱物質または他の混入物質をさらに含まない状態であり得る。
医薬剤形で、複合体は、単独でまたは他の薬学的に活性な化合物との適切な関連付けおよび組み合わせで、投与することができる。以下の方法および賦形剤は単なる例であり、決して限定するものではない。
経口製剤の場合、ラクトース、マンニトール、コーンスターチまたはジャガイモデンプンなどの従来の添加剤、結晶セルロース、セルロース誘導体、アラビアゴム、コーンスターチまたはゼラチンなどの結合剤、コーンスターチ、ジャガイモデンプンまたはカルボキシメチルセルロースナトリウムなどの崩壊剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、および所望により、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存剤および香味剤を用いて、錠剤、散剤、顆粒またはカプセル剤を製造するために、複合体を単独でまたは適切な添加剤と組み合わせて使用することができる。
複合体は、植物油もしくは他の類似の油、合成脂肪酸グリセリド、高次脂肪酸のエステル、またはプロピレングリコール等の水性溶媒もしくは非水性溶媒に溶解、懸濁または乳化することによって、また、所望な場合、可溶化剤、等張剤、懸濁化剤、乳化剤、安定剤および保存剤等の従来の添加剤を用いて、注射用製剤に製剤化することができる。
医薬組成物は、液体形態、凍結乾燥形態、または凍結乾燥形態から再構成された液体形態であってもよく、凍結乾燥製剤は投与前に滅菌溶液で再構成されるものである。凍結乾燥組成物を再構成するための標準的な手順は、一定量の純水(典型的には、凍結乾燥の際に除去された体積と等量である)を加え戻すことであるが、非経口投与用の医薬組成物の製造のために抗菌剤を含む溶液が使用されてもよい。
複合体の水性製剤は、pH緩衝溶液中、例えば約4.0~約8.0の範囲のpH、約4.5~約7.5など、例えば約5.0~約7.0の範囲のpHで調製され得る。この範囲内のpHに好適である緩衝剤の例には、リン酸緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤、クエン酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、および他の有機酸緩衝剤が含まれる。緩衝剤の濃度は、例えば、緩衝剤および製剤の所望の張性により、約1mM~約100mM、または約5mM~約50mMであり得る。
方法
上記に要約したように、本開示の複合体を使用する方法も提供される。いくつかの実施形態では、当該方法は、上記の複合体のセクションに記載されている複合体のいずれかを使用することを含み、それはここに組み込まれるが簡潔にするためにここでは繰り返さない。
いくつかの実施形態では、治療有効量の本開示のいずれかの複合体またはいずれかの医薬組成物を、それを必要とする個体に投与することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、個体は癌を有し、操作されたループは、個体に存在する癌細胞上の細胞表面分子に結合する。したがって、本開示の態様は、癌を有する個体に、治療有効量のいずれかの本開示の複合体またはいずれかの本開示の医薬組成物を投与することによって癌を治療する方法を含む。様々な個体が当該方法に従って治療可能である。通常、そのような対象は「哺乳動物」または「哺乳類」であり、これらの用語は、肉食目(例えば、イヌおよびネコ)、げっ歯目(例えば、マウス、モルモットおよびラット)、および霊長目(例えば、ヒト、チンパンジー、およびサル)を含む哺乳類綱内の生物を記述するために広く使用される。いくつかの実施形態において、個体はヒトである。いくつかの実施形態では、個体は、マウスモデルなどの動物モデルである。
いくつかの実施形態では、有効量の複合体(またはこれを含む医薬組成物)は、単独で(例えば、単剤療法において)、または1つもしくは複数のさらなる治療薬剤と組み合わせて(例えば、併用療法において)、1回または複数回の用量で投与されたときに、当該複合体または医薬組成物を用いる治療が存在しない状態での個体の症状と比較して、個体の医学的状態(例えば、癌など)の症状を、少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、またはそれ以上、減少させるのに有効な量である。
いくつかの実施形態では、個体は、固形腫瘍、半固形腫瘍、原発腫瘍、転移性腫瘍などの存在を特徴とする癌を有する。いくつかの実施態様では、個体は、乳癌、黒色腫、肺癌、結腸直腸癌、前立腺癌、神経膠腫、膀胱癌、子宮内膜癌、腎臓癌、白血病(例えば、急性骨髄性白血病(AML))肝臓癌(例えば、肝細胞癌(HCC)、例えば、原発性または再発性HCC)、非ホジキンリンパ腫、膵臓癌、甲状腺癌、それらの任意の組み合わせ、およびそれらのサブタイプから選択される癌を有する。
「治療する(treat)」、「治療すること(treating)」または「治療(treatment)」とは、個体の医学的状態(例えば、細胞増殖性障害、例えば、癌)に関連する症状の少なくとも改善を意味し、改善は、例えば症状など、治療中の医学的状態に関連するパラメーターの大きさの少なくとも低下を指すために広義に使用される。したがって、治療はまた、個体がその医学的状態、または少なくともその医学的状態を特徴付ける症状にそれ以上苦しむことがないように、医学的状態または少なくとも医学的状態に関連付けられた症状が完全に阻止された、例えば、発生が防止された、または停止された、例えば、中断された状態を含む。
複合体または医薬組成物は、インビボおよびエクスビボの方法、ならびに全身および局所的な投与経路を含め、薬物送達に好適な任意の利用可能な方法および経路を使用して、個体に投与され得る。従来のおよび医薬的に許容される投与経路としては、鼻腔内、筋肉内、気管内、皮下、皮内、局所適用、眼内、静脈内、動脈内、経鼻、経口、および他の腸内および非経口投与経路が含まれる。いくつかの態様では、投与は非経口投与によるものである。投与経路は、複合体および/または所望の効果に応じて、組み合わせることができ、または必要に応じて調節することができる。複合体または医薬組成物は、単回投与または複数回投与で投与することができる。いくつかの実施形態では、複合体または医薬組成物は、静脈内投与される。いくつかの実施形態では、複合体または医薬組成物は、例えば、全身送達(例えば、静脈内注入)のために、または局所部位に、注射によって投与される。
いくつかの実施形態では、個体は固形腫瘍を有する。いくつかの実施形態では、個体が固形腫瘍を有する場合、方法は、本開示のノッティン薬物複合体(KDC)を個体に投与することを含む。本明細書に示されるように、そのような複合体は、高分子量標的剤と比較して、固形腫瘍への予想外に有益な浸透を示す。
いくつかの実施形態では、個体は、その治療が複合体に血液脳関門(BBB)を通過させることを必要とする癌を有する。そのような癌の非限定的な例は、脳腫瘍、例えば、膠芽腫などである。いくつかの実施形態において、個体が、その治療が複合体にBBBを通過させることを必要とする癌を有する場合、方法は、本開示のノッティン-薬物複合体(KDC)などの、本開示の低分子量複合体を個体に投与することを含む。
キット
本開示の態様は、キットをさらに含む。いくつかの実施形態において、主題キットは、本開示の複合体のいずれか(上記の複合体のセクションに記載されているいずれかのものを含み、それはここに組み込まれるが簡潔にするためにここでは繰り返されない)またはそれを含む医薬組成物と、それを必要とする個人に医薬組成物を投与するための説明書とを含む。
いくつかの実施形態において、複合体または医薬組成物は、1つまたは複数(例えば、2つ以上)の単位投薬量で存在する。「単位投与量」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒトおよび動物対象のための単一投与量として適切な物理的に別個の単位を指し、各単位は、所望の効果をもたらすのに十分な量で計算された所定量の複合体または組成物を含有する。単位用量の量は、当該個人において、使用される特定の複合体、達成されるべき効果、および複合体に関連する薬力学などの様々な要因に依存する。さらに他の実施形態では、キットは、複合体または医薬組成物の単一の複数投与量を含み得る。
キットの成分は、別々の容器内に存在してよく、または複数の成分が単一の容器内に存在してもよい。
キットに含まれる説明書は、適切な記録媒体に記録され得る。例えば、説明書は、紙またはプラスチックなどの基材上に印刷することができる。したがって、説明書は、キット内に含まれる説明書として、キットの容器またはその構成要素にあるラベリング(すなわち、包装またはサブ包装に関連するもの)などに存在し得る。他の実施形態では、説明書は、ポータブルフラッシュドライブ、DVD、CD-ROM、ディスケットなどの適切なコンピュータ可読記憶媒体上に存在する電子記憶データファイルとして存在する。さらに他の実施形態では、実際の説明書はキット中には存在しないが、例えばインターネットを介してリモートソースから説明書を取得するための手段が提供される。この実施形態の一例は、説明書を閲覧および/またはダウンロードすることができるウェブアドレスを含むキットである。説明書の場合と同様に、説明書を得るための手段は、好適な基材上に記録される。
添付の特許請求の範囲にかかわらず、本開示は、以下の実施形態によっても定義される。
1.複合体であって、
細胞表面分子に結合する操作されたループを含むノッティンペプチドと、
リンカーを介してノッティンペプチドに接合された抗微小管剤と、
を含む複合体。
2.前記抗微小管剤が、チューブリン阻害剤である、実施形態1に記載の複合体。
3.前記チューブリン阻害剤が、アウリスタチンである、実施形態2に記載の複合体。
4.前記チューブリン阻害剤が、アウリスタチンEまたはアウリスタチンFである、実施形態3に記載の複合体。
5.前記チューブリン阻害剤が、モノメチルアウリスタチンE(MMAE)またはモノメチルアウリスタチンF(MMAF)である、実施形態4に記載の複合体。
6.前記リンカーが酵素切断可能リンカーである、実施形態1~5のいずれか1つに記載の複合体。
7.前記酵素切断可能リンカーが、プロテアーゼ切断可能リンカーである、実施形態6に記載の複合体。
8.前記リンカーが、バリン-シトルリンジペプチド、バリン-アラニンジペプチド、またはその両方を含む、実施形態7に記載の複合体。
9.前記リンカーが、バリン-シトルリン-パラアミノベンジルオキシ(Val-Cit-PAB)リンカーである、実施形態8に記載の複合体。
10.前記リンカーが、バリルアラニルパラアミノベンジルオキシ(Val-Ala-PAB)リンカーである、実施形態8に記載の複合体。
11.複合体であって、
細胞表面分子に結合する操作されたループを含むノッティンペプチドが、抗体サブユニットまたはその断片に融合されたものを含む、融合タンパク質と、
リンカーを介して前記融合タンパク質に接合された薬物と、
を含む、複合体。
12.前記抗体サブユニットまたはその断片が、抗体重鎖またはその断片である、実施形態11に記載の複合体。
13.前記抗体重鎖またはその断片が、γ、α、δ、ε、もしくはμ抗体重鎖またはその断片を含む、実施形態12に記載の複合体。
14.前記抗体重鎖またはその断片が、IgG重鎖またはその断片である、実施形態13に記載の複合体。
15.前記IgG重鎖またはその断片が、IgG1重鎖またはその断片である、実施形態14に記載の複合体。
16.前記抗体重鎖またはその断片が、重鎖可変領域(V)を含む、実施形態12~15のいずれか1つに記載の複合体。
17.前記抗体重鎖またはその断片が、重鎖定常領域またはその断片をさらに含む、実施形態16に記載の複合体。
18.前記抗体重鎖定常領域またはその断片が、C1ドメインを含む、実施形態17に記載の複合体。
19.前記抗体重鎖定常領域またはその断片が、C2ドメインをさらに含む、実施形態18に記載の複合体。
20.前記抗体重鎖定常領域またはその断片が、C3ドメインをさらに含む、実施形態19に記載の複合体。
21.前記抗体重鎖またはその断片が、完全長の抗体重鎖である、実施形態20に記載の複合体。
22.前記抗体の重鎖またはその断片が、Vを含まない、実施形態12~15のいずれか1つに記載の複合体。
23.前記抗体重鎖またはその断片が、Fc領域を含む、実施形態22に記載の複合体。
24.前記ノッティンペプチドが、抗体重鎖またはその断片のN末端に融合されている、実施形態12~23のいずれか1つに記載の複合体。
25.前記ノッティンペプチドが、抗体重鎖またはその断片のC末端に融合されている、実施形態12~23のいずれか1つに記載の複合体。
26.前記薬物がノッティンペプチドに接合している、実施形態12~25のいずれか1つに記載の複合体。
27.前記薬物が抗体重鎖またはその断片に接合している、実施形態12~25のいずれか1つに記載の複合体。
28.前記抗体重鎖またはその断片が、Fc領域を含み、前記薬物が前記Fc領域に接合している、実施形態27に記載の複合体。
29.前記薬物が、Fc領域のC3ドメインに接合している、実施形態28に記載の複合体。
30.前記薬物が、Fc領域のC2ドメインに接合している、実施形態28に記載の複合体。
31.前記抗体サブユニットまたはその断片が、抗体軽鎖またはその断片である、実施形態11に記載の複合体。
32.前記抗体軽鎖またはその断片が、カッパ(κ)軽鎖またはその断片である、実施形態31に記載の複合体。
33.前記抗体軽鎖またはその断片が、ラムダ(λ)軽鎖またはその断片である、実施形態31に記載の複合体。
34.前記抗体軽鎖またはその断片が、抗体軽鎖可変領域(V)を含む、請求31~33のいずれか1つに記載の複合体。
35.前記抗体軽鎖またはその断片が、抗体軽鎖定常領域(C)またはその断片をさらに含む、実施形態34に記載の複合体。
36.前記抗体軽鎖またはその断片が、完全長の抗体軽鎖である、実施形態31~35のいずれか1つに記載の複合体。
37.前記ノッティンペプチドが、抗体軽鎖またはその断片のN末端に融合している、実施形態31~36のいずれか1つに記載の複合体。
38.前記ノッティンペプチドが、抗体軽鎖またはその断片のC末端に融合している、実施形態31~36のいずれか1つに記載の複合体。
39.前記薬物がノッティンペプチドに接合している、実施形態31~38のいずれか1つに記載の複合体。
40.前記薬物が抗体軽鎖またはその断片に接合している、実施形態31~38のいずれか1つに記載の複合体。
41.前記薬物が細胞毒性剤である、実施形態11~40のいずれか1つに記載の複合体。
42.前記薬物が毒素である、実施形態11~40のいずれか1つに記載の複合体。
43.前記薬物が抗微小管剤である、実施形態11~40のいずれか1つに記載の複合体。
44.前記抗微小管剤が、チューブリン阻害剤である、実施形態43に記載の複合体。
45.前記チューブリン阻害剤が、アウリスタチンである、実施形態44に記載の複合体。
46.前記チューブリン阻害剤が、アウリスタチンEまたはアウリスタチンFである、実施形態45に記載の複合体。
47.前記チューブリン阻害剤が、モノメチルアウリスタチンE(MMAE)またはモノメチルアウリスタチンF(MMAF)である、実施形態46に記載の複合体。
48.前記薬物がヌクレオシド薬物である、実施形態11~40のいずれか1つに記載の複合体。
49.前記ヌクレオシド薬がヌクレオシド類似体である、実施形態48に記載の複合体。
50.前記ヌクレオシド類似体が、ゲムシタビン、シタラビン、トロキサシタビン、デシタビン、クラドリビン、フルダラビン、クロファラビン、および2’-C-シアノ-2’-デオキシ-1-β-D-アラビノ-ペントフラノシルシトシン(CNDAC)からなる群から選択される、実施形態49に記載の複合体。
51.前記リンカーが酵素切断可能リンカーである、実施形態11~50のいずれか1つに記載の複合体。
52.前記酵素切断可能リンカーが、プロテアーゼ切断可能リンカーである、実施形態51に記載の複合体。
53.前記リンカーが、バリン-シトルリンジペプチド、バリン-アラニンジペプチド、またはその両方を含む、実施形態52に記載の複合体。
54.前記リンカーが、バリン-シトルリン-パラアミノベンジルオキシ(Val-Cit-PAB)リンカーである、実施形態53に記載の複合体。
55.前記リンカーが、バリルアラニルパラアミノベンジルオキシ(Val-Ala-PAB)リンカーである、実施形態53に記載の複合体。
56.前記ノッティンペプチドが、EETI-IIペプチド、AgRPペプチド、ω-コノトキシンペプチド、カラタB1ペプチド、MCoTI-IIペプチド、アガトキシンペプチド、およびクロロトキシンペプチドからなる群から選択される、実施形態1~55のいずれか1つに記載の複合体。
57.前記細胞表面分子が癌細胞表面分子である、実施形態1~56のいずれか1つに記載の複合体。
58.前記癌細胞表面分子が、固形腫瘍の癌細胞上に存在する、実施形態57に記載の複合体。
59.前記細胞表面分子が細胞表面受容体である、実施形態1~57のいずれか1つに記載の複合体。
60.前記細胞表面受容体が細胞接着受容体である、実施形態59に記載の複合体。
61.前記細胞接着受容体がインテグリンである、実施形態60に記載の複合体。
62.前記インテグリンが、αvβ1インテグリン、αvβ3インテグリン、αvβ5インテグリン、αvβ6インテグリン、α5β1インテグリン、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、実施形態60に記載の複合体。
63.前記細胞表面受容体がケモカイン受容体である、実施形態59に記載の複合体。
64.前記ケモカイン受容体が、C-X-Cケモカイン受容体タイプ4(CXCR4)である、実施形態63に記載の複合体。
65.前記細胞表面分子が成長因子受容体である、実施形態59に記載の複合体。
66.前記細胞表面受容体が免疫細胞受容体である、実施形態59に記載の複合体。
67.前記免疫細胞受容体が細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4(CTLA-4)である、実施形態66に記載の複合体。
68.前記細胞表面受容体がニューロピリン-1(NRP1)である、実施形態59に記載の複合体。
69.前記細胞表面分子が膜プロテアーゼである、実施形態1~57のいずれか1つに記載の複合体。
70.前記膜プロテアーゼがマトリプターゼである、実施形態69に記載の複合体。
71.実施形態1~70のいずれか1つに記載の複合体を含む組成物。
72.前記組成物が、
前記複合体と、
薬学的に許容される担体と、
を含む、医薬組成物である、実施形態71に記載の組成物。
73.前記医薬組成物が非経口投与のために製剤化されている、実施形態72に記載の組成物。
74.前記医薬組成物が経口投与のために製剤化されている、実施形態72に記載の組成物。
75.治療有効量の、実施形態72に記載の医薬組成物と、
前記医薬組成物を、それを必要とする個体に投与するための説明書と、
を含む、キット。
76.前記医薬組成物が、1つ以上の単位用量で存在する、実施形態75に記載のキット。
77.治療有効量の、実施形態72に記載の前記医薬組成物を、それ必要とする個体に投与することを含む、方法。
78.前記個体が癌を有し、前記操作されたループが、前記個体に存在する癌細胞上の細胞表面分子に結合する、実施形態77に記載の方法。
79.前記細胞表面分子が細胞表面受容体である、実施形態78に記載の方法。
80.前記細胞表面受容体が細胞接着受容体である、実施形態79に記載の方法。
81.前記細胞接着受容体がインテグリンである、実施形態80に記載の方法。
82.前記インテグリンが、αvβ1インテグリン、αvβ3インテグリン、αvβ5インテグリン、αvβ6インテグリン、α5β1インテグリン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、実施形態81に記載の方法。
83.前記個体が、前記癌細胞を含む固形腫瘍を有する、実施形態82に記載の方法。
84.前記固形腫瘍が脳腫瘍である、実施形態83に記載の方法。
以下の実施例は、限定ではなく例示として提供される。
実験
実施例1-ノッティンベースの複合体の製造
タンパク質生物製剤のサイズ範囲にわたるタンパク質-薬物複合体のセットを作成するために、ノッティン(K)、ノッティン-Fc融合(KFc)、およびノッティン-Ab融合(KAb)を生成した(図1B)。ノッティンは、以前に操作されたノッティン、EETI2.5Fに基づいており、濃度測定を容易にするために修飾されている(図2)。ノッティンは、固相ペプチド合成によって生成され、折り畳まれ精製された。次に、KFcを作成するためにEETI2.5FをヒトIgG1Fcドメインに遺伝子融合し、KAbを作成するために、無関係な結合標的に対する完全長ヒトIgG1抗体(抗FITCまたは抗ヒトCEA)のN末端に遺伝子融合した。
ノッティン-薬物複合体(KDC)は、銅フリーひずみ促進環化付加反応を介して、DBCOリンカーを含むVal-Cit-PABMMAE誘導体にKを反応させることによって調製した(図3、図4)。ノッティン-Fc-薬物複合体(KFDC)およびノッティン-抗体-薬物複合体(KADC)は、アルデヒドでタグ付けされたKFcまたはKAbとHIPSリンカーMMAE誘導体のHydrazino-Pictet-Spenglerライゲーション89によって調製した。(図5-8)。
実施例2―インビトロでの特性評価
実施例1に記載の構築物の結合親和性を、U87MG神経膠芽腫細胞を使用して測定した。薬物を含まないタンパク質親和性は、AlexaFluor488コンジュゲートタンパク質を使用して直接測定し、薬物複合体は、AlexaFluor488標識Kを置換する競合結合アッセイを介して測定した。試験したすべての構築物は、低ナノモル親和性でU87MG細胞に結合した(図9A-B)。測定された親和性は以前の研究と一致しており、FcまたはAbへの遺伝子融合もMMAEへの接合も、ノッティンによる腫瘍標的化を、感知できるほどには妨害しないことを示している。
Val-Cit-PABリンカーの切断と、それに続くMMAEの放出および作用機序は、細胞内送達に依存している。したがって、各構築物が効率的に内在化されたことを検証することが重要であった。AlexaFluor488コンジュゲートタンパク質を細胞と37℃でインキュベートすることにより内在化を測定した。4時間のインキュベーション後、表面に結合したタンパク質を、露出したフルオロフォアに結合する抗AF488抗体を使用してクエンチした。図10Aに示されるように、細胞を4℃でインキュベートして原形質膜を凍結することによって内在化が阻害される場合、測定された蛍光はベースラインに戻る。
すべての構築物は、対照を超える実質的な内在化を示した(図10B)。各化合物の相対的な内在化は、最小から最大の順で、K、KFc、次にKAbであった。二価性がKよりもKFcの内在化の増加の主な原因であるかどうかを判断するために、一価の1アームKFcを試験した。この一価のFcは同様の内在化を示し(図10C)、価数が内在化の増加の主要な推進力ではないことを示している。制約されたFcヒンジ領域は、KFcが二価の相互作用を完全に利用したり、複数のインテグリンペアをクラスター化したりする能力を制限する可能性がある。逆に、KAbははるかにより高いノッティン間の柔軟性を有する。ノッティン間の距離と柔軟性を制限すると内在化が減少するかどうかを試験するために、EETI2.5FをN末端ではなくC末端に遺伝的に融合させて、抗体ノッティン(AbK)コンストラクトを構築した。図10Dに示されるように、AbKは、KFcと同様のレベルの内在化を有し、KAbがより容易に複数のインテグリン対に結合しクラスター化させることを示唆している。
KFcとAbKはどちらもKよりも容易に内在化するため、FcはFc受容体または補体を介した経路を介して内在化を促進している可能性があるとの仮説が立てられた。K、KFc、およびKAbの内在化を、熱変性培地およびPBSと0.1%ウシ血清アルブミンの緩衝液中で試験した(図11)。熱変性培地またはPBSでインキュベートしたコンストラクトはいずれも、完全培地でインキュベートしたコンストラクトと比較して内在化を有意に減少させることはなく、培地内の活性タンパク質(c1qなど)は、KFcおよびKAbの内在化の増加にそれほど寄与していないことを示唆している。次に、各K、KFc、一価KFc、およびKAbについて内在化の速度を測定し、これらの構築物をFc遮断タンパク質または過剰の非コンジュゲート化Kの存在下で細胞とインキュベートした場合と比較した(図12)。
各薬物複合体のインビトロ効力を、U87MG細胞増殖の阻害を測定することによって試験した(図13)。非コンジュゲート化タンパク質は忍容性が高く、100nMまで投与した際に有意な細胞死を誘発しなかった(図13A-C)。MMAEは、単独で、16.8nMのED50で適度の効力を示した。KDC、KFDC、およびKADCはすべて、インビトロで少し増加した効力を示し、それぞれのED50値は4.9、6.5、および8.9nMであった(図13D)。
インビボ療法のより代表的なモデルでの各薬物複合体の活性を評価するために、RFP発現U87MG細胞をSYTOXグリーンとインキュベートし4時間ごとに画像化して同様のアッセイを設定した。いくつかの時点の後、細胞を洗浄し、培地を新鮮な薬物含有培地または新鮮な薬物非含有培地のいずれかと交換した(図14)。すべての複合体は、高い効力を維持し、わずか24時間の曝露の後に増殖を阻害した(図14B)。増殖を阻害する各薬物複合体の能力をさらに調査し、KDCがわずか3時間曝露で完全な細胞阻害を示し続けたことを明らかにした(図14C)。細胞増殖の阻害は、測定された細胞毒性を反映していた。すべての複合体は、洗浄なし、薬物含有培地の洗浄あり、または24時間後の洗浄を伴ってインキュベートした場合、ほぼ100%の細胞死を誘導した(図14D、14E)。各コンストラクトは、さらにストリンジェントな条件下でも評価され、3時間の曝露後に洗浄した。KDCは強力な活性を維持し、細胞増殖の95%超の阻害をもたらした(図15)。KFDCとKADCはそれぞれの効力がかなり低下し、それぞれが細胞増殖の約50%までを阻害した。
実施例3―薬物動態
インビボで腫瘍を標的とする各薬物複合体の能力を、U87MG神経膠芽腫股関節異種移植片を有するマウスにAlexaFluor680コンジュゲート化タンパク質を静脈内注射することによって評価した(図16)。蛍光を、IVISスペクトルを使用した非侵襲的近赤外蛍光イメージングによって監視した。各時点で、腫瘍上の関心領域および別のコントロールROIの放射効率を計算して、血液中の蛍光標識薬物複合体のベータ半減期を概算し、それを保持された腫瘍シグナルと比較した。
腫瘍標的ビヒクルの薬物動態プロファイルは、サイズによって部分的に決まる。糸球体濾過のサイズカットオフ(一般的に文献で報告されているのは約70kDa)を下回る低MWビヒクルは、腎臓濾過によって迅速に除去される可能性が高くなる。KDC(約5kDa)は腎クリアランスカットオフをはるかに下回り、ベータ半減期は1.4時間であり、急速な腎クリアランスを示唆している(図17A)。KFDC(約65kDa)は、MWが腎クリアランスカットオフに近く、ベータ半減期が17.7時間であり、Fcを介した半減期の延長によってさらに延長される可能性がある(図17B)。KADC(約150kDa)は、測定された最長のベータ半減期の25.3時間であった(図17C)。各複合体において、腫瘍シグナルはバックグラウンドよりも実質的に高く、バックグラウンドシグナルがベースラインに戻った後も持続した。KDCの場合、最大の腫瘍対バックグラウンド比は、投与の3~5時間後に観察された(図17D)。KFDCは、投与後約10時間で最大の腫瘍対バックグラウンド比を獲得し、数日間高い比を維持した(図17E)。KADCは中程度の腫瘍対バックグラウンド比を維持し、それは1週間にわたりさらに増加すらした(図17F)。
腫瘍対バックグラウンド比をさらに評価するために、各臓器による蛍光標識薬物複合体の取り込みをエクスビボで測定した。U87MG神経膠芽腫股関節異種移植片を有するヌードマウスに、AlexaFluor680コンジュゲート化タンパク質を静脈内注射した。3時間または24時間後にマウスを犠牲にし、画像化のために臓器を取り出した。切除された腫瘍の放射効率は、他のすべての測定された臓器よりも有意に高かった。具体的には、肝臓、腎臓、脾臓、膵臓、心臓、肺、膀胱、大腿四頭筋、および大腿骨(図18)。特に、これらのエクスビボデータは、KDCは腎臓でろ過され、KADCは肝臓で代謝され、KFDCはこれら2つの間のどこかにあるという仮説を裏付けている。KADCは、KFDCまたはKDCよりも実質的に高い肝臓取り込みを示すが、それでも腫瘍内の信号の30%未満である。KDCは腎臓と膀胱への取り込みが高く、腎臓の濾過によるクリアランスと尿中の排泄を示している。
実施例4―インビボでの有効性
インビトロでの高親和性結合、迅速な内在化およびU87MG増殖の強力な阻害は、各薬物複合体がマウスモデルにおいて有意な可能性を有することを示唆した。画像および薬物動態データは、KFDC、および特にKADCは数日間血中に存続する一方、KDCの循環半減期は短いことを示している。したがって、各薬物複合体の性能を評価するために、インビボ治療効果研究を設定した。
MMAF接合KFDCは、5mg/kgで週に3回投与した場合、中程度の効力を示した(データは示していない)。この治療レジメンを出発点として使用して、治療群ごとに5匹のマウスを使用して予備研究を設定した。マウスの右脇腹に5×10のU87MG細胞を接種し、腫瘍がおよそ30mmの面積に到達するまで成長させ確立させた。次に、マウスを、PBS、KDC、KFDC、またはKADCの4つの治療群のうちの1つにランダム化した。各群を同等に保ち、循環半減期の短かさにもかかわらずKDCの有効性を最大限に高めるために、すべての薬物複合体群は週に3回、3週間投与した。各用量には、2.38nmolのMMAEに正規化された適切な薬物複合体(約0.6mg/kgKDC、約5mg/kgKFDC、約10mg/kgKADC)が含まれていた。
すべての薬物複合体は、対照マウスよりも生存を有意に延長した(図19A、19B)。KDCは5匹中1匹のマウスで完全な腫瘍退縮を誘発し、残りの5匹中4匹のマウスで細胞増殖抑制効果を維持した(図19C)。3週間の治療後、これら4匹のマウスの腫瘍は再発した。KFDCおよびKADCの両方は、それぞれの治療群あたり5匹のマウスすべてにおいて完全な腫瘍退縮をもたらした(図19C)。重度の毒性の兆候を監視するために、実験期間中、すべてのマウスの体重も記録した。すべてのグループの重量は区別できず、化合物の忍容性が高いことを示唆している(図19D)。
図19のデータは、すべての薬物複合体が治療効果を発揮できることを示している。各化合物をさらに調査するために、実験計画にいくつかの変更を加えた。KDCの急速な全身クリアランスのために、注射された用量のかなりの部分が失われる可能性が高く、そのため、約0.6mg/kgの用量を大幅に増加させた。化学療法剤の投与量は、従来、患者の体表面積あたりの化学療法剤の質量として決定されるため、等モルの比較よりも、より臨床的に適切な等しい質量の比較が選択された。次に、現実的な臨床投薬の考慮事項と一致するように、週に1回の投薬レジメンが選択された。最後に、腫瘍の成長を促進するために腫瘍をマトリゲルマトリックスと共に移植し、初期の腫瘍壊死を減少させるために注射あたりわずか2.5×10個の細胞を移植した。U87MG股関節異種移植片を有するマウスを、KDC、KFDC、KADC、非コンジュゲート化タンパク質、またはPBS対照の治療グループに均等に分配し、静脈内注射を週に1回、4週間与えた。各薬物複合体を、低用量および高用量でも評価した。
より活発な腫瘍増殖を可能にするように最適化したにもかかわらず、低用量のKDC(1mg/kg)は、パイロット実験と同様に効いた(図20A、20B)。1mg/kgで投与されたKDCは、腫瘍増殖を有意に遅延させたが、腫瘍退縮を引き起こさず、治療終了後、5匹中5匹のマウスで腫瘍が再成長した(図20C)。高用量のKDC(5mg/kg)は非常に効果的であり、5匹中4匹のマウスで腫瘍の完全な退縮を引き起こし、残りのマウスでは腫瘍の成長を有意に遅らせた(図20C)。非コンジュゲート化Kで処理されたマウスは、PBS対照マウスと区別がつかなかった。
パイロット実験とは対照的に、KFDCとKADCは、より攻撃的な腫瘍モデルでは有効性が大幅に低下した。低用量のKFDC(5mg/kg)は、腫瘍の成長を中程度に抑制し(図21A、21B)、5匹中1匹のマウスで腫瘍の退縮を引き起こした。5匹中4匹のマウスで、腫瘍の成長は遅くなったが、止まらなかった(図21C)。高用量のKFDC(10mg/kg)は、5匹中2匹のマウスで腫瘍の完全な退縮を引き起こし、残りの5匹中3匹のマウスで腫瘍増殖を有意に遅らせた(図21C)。非コンジュゲート化KFcで処理されたマウスは、PBS対照マウスと区別がつかなかった。
低用量のKADC(5mg/kg)は最小限の効果しかなかった(図22A、22B)。腫瘍の成長は、5匹中5匹のマウスでわずかに遅くなっただけであった(図22C)。高用量のKADC(10mg/kg)もまた、著しい効力を欠き(図22A、22B)、すべてのマウスにおいて腫瘍増殖を穏やかに遅らせたが、腫瘍退縮の誘発はなかった(図22C)。非コンジュゲート化KAb(抗CEA)で処理されたマウスは、PBS対照マウスと区別がつかなかった。
マウス体重1kgあたりの薬物複合体の質量という臨床的に関連する比較を使用して薬物複合体を比較すると、KDCはKFDCとKADCの両方を有意に上回った(図23)。これらの結果とパイロット研究との間の不一致を理解するために、MAEの等モル用量に近い、はるかに高い用量の30mg/kgで投与されたKADCでもマウスを処置した。この実験では、KADCは非常に効果的であり、5匹中5匹のマウスで完全な腫瘍退縮を誘発した(図24)。
ADCは固形腫瘍(REF)へ腫瘍浸透が限られていることが知られているため、より攻撃的な腫瘍モデルで観察されたKADCの効力の低下は、均一な腫瘍送達の欠如を示唆している。Cilliersらは2018年に、ADCの腫瘍浸透の欠如は、標的結合部位をめぐって競合する非コンジュゲート化抗体との同時投与によって改善できることを実証した。固形腫瘍への不均一な送達が、KADCの限られた有効性を説明する重要な要因であるという仮説を試験するために、次にマウスを、インテグリン受容体を飽和させKADCによる腫瘍浸透の増加を促進させるように、10mg/kg KADCと20mg/kg非コンジュゲート化KAbの組み合わせで処置した。この併用治療は、10mg/kg KADCの有効性を有意に増加させ、それはより高濃度のKADCでの治療に匹敵していた(図25)。
KDCのインビボでの有効性は優れているにもかかわらず、急速な腎濾過およびMMAEの高いモル用量を考慮すると急性毒性の潜在的な懸念がある。治療を受けたマウスでは体重減少は観察されなかったが、治療を受けたマウスの臓器の健康状態をより厳密に評価する必要があった。60日間の実験後、処置したマウスから肝臓と腎臓を採取し、4%パラホルムアルデヒド(PFA)で固定し、組織切片化のためにパラフィンブロックに包埋した。細胞構造を視覚化するために切片はヘマトキシリンおよびエオシンで染色され、急性毒性の証拠について独立した病理学者によって採点された。図26に示される代表的な画像はすべて、毒性の指標がなく、すべての試料は健康なマウスと同じであると採点された。
実施例5―メカニズムの調査
静脈内投与された治療薬の理論的な固形腫瘍取り込みは、循環半減期および腫瘍塊中への拡散という2つの主要な要因の影響を受けると予測される。上記の実施例3に示されているように、各薬物複合体の半減期は、MWで予想される通りである。したがって、観察された有効性の違いの主な要因は、各構築物の拡散性であると仮定された。
高い腫瘍取り込みにもかかわらず、抗体および他の大きな構築物は、拡散性が不十分であり、腫瘍取り込みが不均一であることが知られている。腫瘍標的抗体の大部分は、腫瘍血管系に最も近い腫瘍周辺に蓄積することが示されている。血管外漏出時に、固形腫瘍内の均一な分布は、拡散性および末梢細胞内在化の速度に依存する。図27A~Cに示されるように、インビボ療法研究の結果は、各構築物の予測される拡散性について説明している。KDCの、固形腫瘍への急速な拡散、より遅い内在化速度、および短時間曝露後のその効力のために、この構築物は固形腫瘍を最も効果的に治療することができる。KFDCは、より遅い拡散およびより速い内在化を有し、インビボで観察された生体内での効力のいくらかの低下と一致している。最大の構造であるKADCは、拡散係数が最も低く、内在化の速度が最も速いため、試験された条件下で最悪の性能を示している。
この仮定されたメカニズムはまた、KADCの用量を30mg/kgに増加させること、またはKADCを非コンジュゲート化KAbと同時投与することの効果を説明する(図27D)。提案されたメカニズムによれば、追加のKADCまたはKAbの追加は、効力に同様の影響を及ぼす。いずれの場合も、血漿濃度の増加は血管周囲濃度の増加をもたらし、利用可能なインテグリン受容体のより高い割合に結合することによって、効果として末梢腫瘍細胞による内在化を減少させる。追加のタンパク質がMMAEとコンジュゲート化しているかどうかに関係なく、腫瘍周辺で利用可能なインテグリン受容体の飽和を増加させることが、KADCが血管系から離れてより均一に拡散することを可能にする。
このメカニズムを検証するために、インビトロセットアップを構築して試験し、固形腫瘍での拡散の違いを視覚化した。RFPを発現するU87MG神経膠芽腫細胞の固形腫瘍スフェロイドを超低接着96ウェルプレートで増殖させた。スフェロイドを、直径が約750μmに達するまで成長させた後、200nMのAF488標識KDC、KFDC、またはKADCで処理し、4時間インキュベートした。次に、共焦点顕微鏡を使用して100μmの深さで各スフェロイドの光学スライスを画像化して、各スフェロイド内の標識タンパク質の相対強度を視覚化した。図28Aに示されるように、赤チャンネルのコントロール強度はすべてのグループ間で一貫しているが、緑チャンネルの強度は、AF488-KDCで処理されたスフェロイドの中心で有意に高い。これらのデータは、KDCが固形腫瘍塊中への拡散においてより効果的であるという定性的な視認を提供する。
より定量的な比較を得るために、緑チャンネルの強度の相対的な減衰を、構成的に発現されたRFPからの赤チャンネルの強度と比較した。RFPの発現は安定しているため赤のチャンネルは均一であるはずであり、かつスフェロイドの光学密度によってのみ減衰するため、緑のチャンネルの信号強度を補正するためにこの信号強度を使用した。図29は、この補正を使用すると、AF488-KDCで処理されたスフェロイドの真の強度がスフェロイド全体で均一になり、この薬物複合体が均一なターゲティングを実現し、KFDCとKADCの信号は大幅に低下することを示している。さらに、各スフェロイドの総蛍光強度はすべての複合体で同等であり(図29F)、KDCがスフェロイドに均一に拡散する一方で、KFDCとKADCはスフェロイドの周辺により高度に集中していることをさらに示している。
AF488-KADCと受容体に結合する非コンジュゲート化KまたはKAbとを同時投与することによって、このメカニズムをさらに調査した。等モルのKまたはKAbとインキュベートした場合、AF488-KADCは、スフェロイドの中心に向かって著しく均一な信号を示した(図28、29D、29E)。
図28および29にある結果は、複数の独立した試験にわたる多数の複製実験によって裏付けられた。ただし、この発見をさらに検証し、結果が画像のアーティファクトによるものではないことを確認するために、スフェロイドを同じ方法で蛍光標識タンパク質と再度インキュベートし、複数のz高さで画像化して、信号のドロップオフを深さの関数として視覚化した。図30に示されるように、各光学スライスの中心の緑の強度は、信号のドロップオフがはるかに明白であるKFDCまたはKADCで処理されたものと比較して、KDCで処理されたスフェロイドでは比較的一定のままである。
次に、このインビトロモデルを改変して、共焦点画像解析実験に加えて同様の細胞死滅を視覚化できるかどうかを試験した。スフェロイドを、さまざまな濃度の薬物複合体またはMMAEで処理した。薬物複合体と5日間インキュベートした後、培地をSYTOXグリーンを含む新鮮な培地と交換した。BioTekSynergyH4マイクロタイタープレートリーダーで測定した蛍光を、溶解バッファーで処理したスフェロイドと比較した。100nMでは、KDCはKFDC、KADC、またはMMAEよりも実質的に多くの殺傷を示す(図31)。この殺傷を経時的に視覚化するために、50または100nMの薬物複合体またはMMAEで処理されたスフェロイドを、IncuCyteを使用して4時間ごとに画像化した。プレートリーダーアッセイの結果を確認しているように、KDCは非常に効果的であり、スフェロイド毒性が約100%に達した一方、KADCは大幅に低減された効力を有していた(図32A、32B)。さらに、薬物複合体と非コンジュゲート化ノッティンを同時投与した場合、KFDCおよびKADCは効力が有意に増加した一方で、KDCは非コンジュゲート化ノッティンを添加してもしなくても有効性は同じであった(図32C、32D)。
材料および方法

KDCの合成(3CM-MMAE)
第3章で説明されているように、標準のFmoc条件を使用してRinkアミド樹脂上でノッティンペプチドを合成するために固相ペプチド合成を使用した。3CMと呼ばれる、2.5Fの修飾バージョンは、薬物付着のためのコンジュゲート部位を提供するために2.5Fの15位のセリンの代わりに非天然アミノ酸である5-アジド-L-ノルバリンを使用して合成した。ペプチド切断、フォールディング、およびHPLC精製は以前に記述されたように実行した。ペプチドは、固体支持体としてのリンクアミドの使用と一致するC末端アミドを含む。
3CMに関して反応混合物の最終濃度が0.62mMとなるように、3CMペプチド(1eq、1.09umol)を50%DMSO/50%PBS中のDBCO-Val-Cit-PAB-MMAE(1.2eq、1.2umol)と反応させた。反応容器として丸底フラスコを使用し、40℃の油浴中で2日間撹拌しながら加熱した。
15mLファルコンチューブ中で3500xgで5分間遠心分離した後、PTFEシリンジフィルターでろ過することにより、微量固形物を除去した。この時点で、セミプレップC18カラム(ZORBAXEclipseXDB-C18、9.4x250mm)を使用し、流速4mL/min(溶媒A:Milli-Q精製水+0.1%TFA、溶媒B:アセトニトリル+0.1%TFA))でのRP-HPLCにより、反応容量全体を精製した。精製方法は、30%溶媒Bでの2分間のアイソクラティック保持と、それに続く30分にわたる30%から100%溶媒Bへの直線的グラジエントで構成される。生成物は11~12分で溶出する。KDC合成を検証するためにLC-MSを使用し、適切な質量の質量スペクトルがコンジュゲート化を確認した(図4に示される3CM-MMAEUVクロマトグラムおよび質量スペクトル)。LC-MSメソッドは、30%溶媒Bでの2分間のアイソクラティックホールドと、それに続く15分間にわたる30%から100%溶媒Bへの直線グラジエントで構成される。ノッティンペプチド(3CM)およびノッティンペプチド-薬物複合体(3CM-MMAE)は、m/z値に基づく低分解能(ESI-MS)質量分析によって特徴づけられた。
質量分析
LC-MS実験を、6120 Quadrupole MSとPeak Scientific NM32LA窒素発生器に接続されたAgilent Technologies 1260Infinityで実施した。Agilent InfinityLab Poroshell120EC-C18、4.6×50mm分析LCカラムを、流速0.4mL/minで使用した(溶媒A:Milli-Q精製水+0.1%TFA、溶媒B:アセトニトリル+0.1%TFA)。ダイオードアレイ検出器を使用して、210および280nmの波長をモニターした。データは、LC/MSD ChemStation(Agilent Technologies)を使用して処理および分析した。
細胞株および細胞培養
U87MG神経膠芽腫細胞は、AmericanTypeCultureCollection(Manassas,VA)から入手した。赤色蛍光タンパク質をトランスフェクトしたU87MG細胞は、AngioProteomie(Boston,MA)から入手した。細胞は、10%ウシ胎児血清(FBS)および1%ペニシリン-ストレプトマイシン(P/S)を添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)で培養した。
直接結合アッセイ
U87MG細胞を、酵素不含有細胞解離バッファー(Gibco)を使用して剥離した。次に、4×10細胞を、Integrin Binding Buffer(IBB;25mM Tris pH7.4、150mM NaCl、2mM CaCl、1mM MgCl、1mM MnCl、および0.1%bovine serum albumin(BSA))中で、様々な濃度(0.01~200nM)のAlexaFluor488標識タンパク質と共に、内在化を最小限にするために4℃で3時間インキュベートした。細胞をペレット化し、800μLのPBSA(0.1%ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝生理食塩水)で2回洗浄し、残りの表面結合タンパク質の蛍光をGuavaEasyCyte8HT装置(EMD Millipore)を使用したフローサイトメトリーで測定した。得られたデータはFlowJoソフトウェア(TreeStarInc)を使用して評価し、平衡解離定数(Kd)はPrismソフトウェア(GraphPad)を使用して決定した。エラーバーは、3回実行された実験の標準偏差を表す。
間接結合アッセイ
U87MG細胞を、酵素不含有細胞解離バッファー(Gibco)を使用して剥離した。次に、4×10細胞を、IBB中で、競合物質として1nMのAlexaFluor488標識ノッティンおよび様々な濃度(0.01~500nM)のKDC、KFDC、またはKADCと共に、内在化を最小限にするために4℃で3時間インキュベートした。細胞をペレット化し、800μLのPBSA(0.1%ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝生理食塩水)で2回洗浄し、残りの表面結合タンパク質の蛍光をGuavaEasyCyte8HT装置(EMDMillipore)を使用したフローサイトメトリーで測定した。得られたデータはFlowJoソフトウェア(TreeStar Inc)を使用して評価し、平衡解離定数(Kd)はPrismソフトウェア(GraphPad)を使用して決定した。エラーバーは、3回実行された実験の標準偏差を表す。
細胞内在化の測定
U87MG細胞を、ウェルあたり5×10細胞の密度で24ウェルプレート(Corning)に播種した。4時間超細胞を定着させた後、培地を、200nMのアレクサフルオロ488標識タンパク質を含有する新鮮な培地と交換し、1mMのMnClを補充した。次に細胞を37℃で4時間インキュベートした。細胞を500μLのPBSで洗浄し、20μLの0.05%トリプシン/EDTAを使用して剥離した。トリプシンを中和し、各ウェルをエッペンドルフチューブに移した後、細胞を800μLの冷PBSAで洗浄した。次に、表面結合タンパク質をクエンチするために、細胞をペレット化し、氷上で50μLの1:200希釈の抗AlexaFluor488抗体(Invitrogen)に再懸濁した。細胞を800μLのPBSAで再度洗浄し、内在化したタンパク質の蛍光を上記のようにフローサイトメトリーで測定した。
細胞増殖のエンドポイント阻害
U87MG細胞を96ウェルプレート(Corning)にウェルあたり2.5×10細胞の密度で播種し、一晩増殖させた。次に、細胞を、様々な濃度のKDC、KFDC、KADC、またはMMAEを含む100μLの新鮮な培地で処理し、4日間インキュベートした。DokindoCellCountingKit-8を使用して、各ウェルの培地を10%WST8を含む100μLの培地と交換することにより、細胞増殖を測定した。37℃で1時間インキュベートした後、450nmでの吸光度(A)をBioTekSynergyH4マイクロタイタープレートリーダーで測定した。CCK-8のみのバックグラウンドシグナルをすべての試料から差し引いた。次に、細胞増殖を、以下に示すように、未処理の細胞の対照に対する吸光度のパーセンテージとして表した。非線形回帰分析を、GraphPadPrismを使用して実施した。
Figure 2022533671000005
時間の経過に伴う細胞増殖の阻害および細胞毒性
RFPを発現するU87MG細胞を96ウェルプレート(Corning)にウェルあたり2.5×10細胞の密度で播種し、一晩増殖させた。次いで、細胞を、およそのED50である10nM、または100nMの飽和濃度でのKDC、KFDC、KADC、またはMMAE、および10nMのCytoxGreen(ThermoFisher)を含有する新鮮な培地200μLで処理した。細胞をIncuCyteS3生細胞分析システム中で5日間インキュベートし、4時間ごとに画像を収集した。洗浄条件として、3時間後または24時間後に培地を、新鮮な薬物含有培地または新鮮な薬物非含有培地と交換した。
細胞スフェロイドイメージング
丸底96ウェル超低接着プレート(Corning)に4×10細胞/ウェルを播種し、1000×gで10分間遠心分離することによって、RFPを発現するU87MG細胞のスフェロイドを形成した。スフェロイドは、直径750μmに達するまで4日間成長させた。次に、スフェロイドを200nMのAlexaFluor488コンジュゲート化KDC、KFDC、またはKADCを含む新鮮な培地で4時間インキュベートした。インキュベーション後、スフェロイドをPBSで洗浄し、Falcon透明底ポリスチレンマイクロプレート(Corning)に移した。スフェロイドを、倒立LSM780多光子レーザー走査型共焦点顕微鏡(Zeiss)を使用して画像化した。示されている画像は、スフェロイドの基部から100μmの深さで撮影された共焦点スライスである。FIJI画像解析ソフトウェアを使用して定量化を実施した。強度は、各スフェロイドの中心から放射状に計算され、減衰コントロールとしてのRFPの強度に対して補正された緑の強度の相対比としてプロットした。
エンドポイントスフェロイド殺傷アッセイ
丸底96ウェル超低接着プレート(Corning)に4×10細胞/ウェルを播種し、1000×gで10分間遠心分離することによって、U87MG細胞のスフェロイドを形成した。スフェロイドを2日間増殖させた後、培地を10nMCytoxGreen(ThermoFisher)とさまざまな濃度のKDC、KFDC、KADC、またはMMAEを含む200μLの新鮮な培地と交換した。4日後、トリプシン-EDTAを添加し、スフェロイドを破壊するために、細胞を60RPMシェーカーに10分間置いた。緑色蛍光は、BioTekSynergyH4マイクロタイタープレートリーダーを使用して測定した。毒性のパーセントは、溶解緩衝液で処理されたスフェロイドと緑色蛍光を比較することによって計算された。
時間の経過に伴う細胞スフェロイド殺傷アッセイ
丸底96ウェル超低接着プレート(Corning)に4×10細胞/ウェルを播種し、1000×gで10分間遠心分離することによって、RFPを発現するU87MG細胞のスフェロイドを形成した。スフェロイドを2日間増殖させた後、培地を10nMCytoxGreen(ThermoFisher)および0、50、または100nのMKDC、KFDC、KADC、またはMMAEを含む200μLの新鮮な培地と交換した。スフェロイドをIncuCyteS3生細胞分析システム中で5日間インキュベートし、4時間ごとに画像を収集した。
動物実験
腫瘍細胞の移植のために、雌のNu/Nuマウス(Charles River Laboratory)を、1L/分の流速での2.5%イソフルランの吸入により麻酔した。2.5×10個のU87MG細胞を含む50/50のPBS/マトリゲル(コーニング)200μLを、右脇腹に皮下注射した。腫瘍は約35mmの大きさになるまで7日間増殖させた。治療効果の研究のために、マウスを実験グループごとに分け、すべてのグループで同等の平均腫瘍サイズと開始体重を確保した。
インビボ時間経過の画像化
上記のようにU87MG横腹異種移植片を有するマウスに、1.5nmolのAlexaFluor680標識K、KFc、またはKAbを静脈内注射した。IVIS Spectrum(PerkinElmer)を使用してマウスを画像化した。フルオロフォアコンジュゲート化タンパク質を、それぞれ640nmおよび710nmの励起/発光波長を使用して検出した。すべての画像解析は、LivingImageソフトウェア(Caliper Life Sciences)を使用して実行した。
エクスビボ生体内分布
上述のようにU87MG横腹異種移植片を有するマウスに、1.5nmolのAlexa Fluor680標識K、KFc、またはKAbを静脈内注射した。臓器(腫瘍、肝臓、腎臓、脾臓、膵臓、心臓、肺、膀胱、大腿四頭筋、および骨)を4時間および24時間のエンドポイントで収集した。IVISSpectrum(PerkinElmer)を使用して臓器を画像化した。フルオロフォアコンジュゲート化タンパク質を、それぞれ640nmおよび710nmの励起/発光波長を使用して検出した。すべての画像解析は、Living Imageソフトウェア(Caliper Life Sciences)を使用して実行した。
腫瘍への血管外漏出深度の視覚化
上述のようにU87MG横腹異種移植片を有するマウスに、1.5nmolのAlexa Fluor480標識K、KFc、またはKAbを静脈内注射した。4時間後に腫瘍を取り出し、OCT Optimal Cutting Temperature化合物(OCT、ThermoFisher Scientific)中で急速凍結した。安楽死させる15分前には、機能的な血管系を視覚化するために、マウスに15mg/kgのHoechst33342の静脈内注射も行った。OCTブロックを15μmのスライスに切り、Cy5.5標識抗CD31を使用してスライドを染色した。次に、染色されたスライドを、倒立LSM780多光子レーザー走査型共焦点顕微鏡(Zeiss)を使用して画像化した。
治療効果実験
上述のようにU87MG横腹異種移植片を有するマウスに、PBS、KDC、KFDC、KADC、または対照タンパク質を静脈内注射した。処置剤を週に1回4週間投与した。デジタルノギスを使用して腫瘍を週3回測定し、各投与日に動物の体重を記録して、化合物の毒性の尺度として潜在的な体重減少を監視した。腫瘍面積は、腫瘍の最長軸に垂直軸を掛けたものとして計算した。安楽死の基準を、150mmを超える腫瘍面積または20%の体重減少と定義した。
このように、上記は、単に本開示の原理を説明しているに過ぎない。当業者であれば、本明細書では明示的に記載または図示されていないが、本発明の原理を具現化しその趣旨および範囲内に含まれる様々な構成を作ることができることが理解されよう。さらに、本明細書に列挙されたすべての例および条件的文言は、主として本発明の原理および発明者らにより当該技術分野の促進のために寄与された概念を理解する上で読者を助けることを意図しており、このような具体的に列挙された例および条件への限定ではないと解釈されるべきである。また、本発明の原理、態様、および実施形態、ならびにその具体的な例を列挙する本明細書におけるすべての記述は、その構造的および機能的等価物の両方を包含することを意図する。加えて、そのような等価物は、現在知られている等価物および将来開発される等価物の両方、すなわち、構造にかかわらず同じ機能を果たすあらゆる開発要素も含むことが意図される。したがって、本発明の範囲は、本明細書に図示および記載の例示的な実施形態に限定されることを意図しない。

Claims (84)

  1. 複合体であって、
    細胞表面分子に結合する操作されたループを含むノッティンペプチドと、
    リンカーを介してノッティンペプチドに接合された抗微小管剤と、
    を含む複合体。
  2. 前記抗微小管剤が、チューブリン阻害剤である、請求項1に記載の複合体。
  3. 前記チューブリン阻害剤が、アウリスタチンである、請求項2に記載の複合体。
  4. 前記チューブリン阻害剤が、アウリスタチンEまたはアウリスタチンFである、請求項3に記載の複合体。
  5. 前記チューブリン阻害剤が、モノメチルアウリスタチンE(MMAE)またはモノメチルアウリスタチンF(MMAF)である、請求項4に記載の複合体。
  6. 前記リンカーが酵素切断可能リンカーである、請求項1~5のいずれか一項に記載の複合体。
  7. 前記酵素切断可能リンカーが、プロテアーゼ切断可能リンカーである、請求項6に記載の複合体。
  8. 前記リンカーが、バリン-シトルリンジペプチド、バリン-アラニンジペプチド、またはその両方を含む、請求項7に記載の複合体。
  9. 前記リンカーが、バリン-シトルリン-パラアミノベンジルオキシ(Val-Cit-PAB)リンカーである、請求項8に記載の複合体。
  10. 前記リンカーが、バリルアラニルパラアミノベンジルオキシ(Val-Ala-PAB)リンカーである、請求項8に記載の複合体。
  11. 複合体であって、
    細胞表面分子に結合する操作されたループを含むノッティンペプチドが、抗体サブユニットまたはその断片に融合されたものを含む、融合タンパク質と、
    リンカーを介して前記融合タンパク質に接合された薬物と、
    を含む、複合体。
  12. 前記抗体サブユニットまたはその断片が、抗体重鎖またはその断片である、請求項11に記載の複合体。
  13. 前記抗体重鎖またはその断片が、γ、α、δ、ε、もしくはμ抗体重鎖またはその断片を含む、請求項12に記載の複合体。
  14. 前記抗体重鎖またはその断片が、IgG重鎖またはその断片である、請求項13に記載の複合体。
  15. 前記IgG重鎖またはその断片が、IgG1重鎖またはその断片である、請求項14に記載の複合体。
  16. 前記抗体重鎖またはその断片が、重鎖可変領域(V)を含む、請求項12~15のいずれか一項に記載の複合体。
  17. 前記抗体重鎖またはその断片が、重鎖定常領域またはその断片をさらに含む、請求項16に記載の複合体。
  18. 前記抗体重鎖定常領域またはその断片が、C1ドメインを含む、請求項17に記載の複合体。
  19. 前記抗体重鎖定常領域またはその断片が、C2ドメインをさらに含む、請求項18に記載の複合体。
  20. 前記抗体重鎖定常領域またはその断片が、C3ドメインをさらに含む、請求項19に記載の複合体。
  21. 前記抗体重鎖またはその断片が、完全長の抗体重鎖である、請求項20に記載の複合体。
  22. 前記抗体の重鎖またはその断片が、Vを含まない、請求項12~15のいずれか一項に記載の複合体。
  23. 前記抗体重鎖またはその断片が、Fc領域を含む、請求項22に記載の複合体。
  24. 前記ノッティンペプチドが、抗体重鎖またはその断片のN末端に融合されている、請求項12~23のいずれか一項に記載の複合体。
  25. 前記ノッティンペプチドが、抗体重鎖またはその断片のC末端に融合されている、請求項12~23のいずれか一項に記載の複合体。
  26. 前記薬物がノッティンペプチドに接合している、請求項12~25のいずれか一項に記載の複合体。
  27. 前記薬物が抗体重鎖またはその断片に接合している、請求項12~25のいずれか一項に記載の複合体。
  28. 前記抗体重鎖またはその断片が、Fc領域を含み、前記薬物が前記Fc領域に接合している、請求項27に記載の複合体。
  29. 前記薬物が、Fc領域のC3ドメインに接合している、請求項28に記載の複合体。
  30. 前記薬物が、Fc領域のC2ドメインに接合している、請求項28に記載の複合体。
  31. 前記抗体サブユニットまたはその断片が、抗体軽鎖またはその断片である、請求項11に記載の複合体。
  32. 前記抗体軽鎖またはその断片が、カッパ(κ)軽鎖またはその断片である、請求項31に記載の複合体。
  33. 前記抗体軽鎖またはその断片が、ラムダ(λ)軽鎖またはその断片である、請求項31に記載の複合体。
  34. 前記抗体軽鎖またはその断片が、抗体軽鎖可変領域(V)を含む、請求31~33のいずれか一項に記載の複合体。
  35. 前記抗体軽鎖またはその断片が、抗体軽鎖定常領域(C)またはその断片をさらに含む、請求項34に記載の複合体。
  36. 前記抗体軽鎖またはその断片が、完全長の抗体軽鎖である、請求項31~35のいずれか一項に記載の複合体。
  37. 前記ノッティンペプチドが、抗体軽鎖またはその断片のN末端に融合している、請求項31~36のいずれか一項に記載の複合体。
  38. 前記ノッティンペプチドが、抗体軽鎖またはその断片のC末端に融合している、請求項31~36のいずれか一項に記載の複合体。
  39. 前記薬物がノッティンペプチドに接合している、請求項31~38のいずれか一項に記載の複合体。
  40. 前記薬物が抗体軽鎖またはその断片に接合している、請求項31~38のいずれか一項に記載の複合体。
  41. 前記薬物が細胞毒性剤である、請求項11~40のいずれか一項に記載の複合体。
  42. 前記薬物が毒素である、請求項11~40のいずれか一項に記載の複合体。
  43. 前記薬物が抗微小管剤である、請求項11~40のいずれか一項に記載の複合体。
  44. 前記抗微小管剤が、チューブリン阻害剤である、請求項43に記載の複合体。
  45. 前記チューブリン阻害剤が、アウリスタチンである、請求項44に記載の複合体。
  46. 前記チューブリン阻害剤が、アウリスタチンEまたはアウリスタチンFである、請求項45に記載の複合体。
  47. 前記チューブリン阻害剤が、モノメチルアウリスタチンE(MMAE)またはモノメチルアウリスタチンF(MMAF)である、請求項46に記載の複合体。
  48. 前記薬物がヌクレオシド薬物である、請求項11~40のいずれか一項に記載の複合体。
  49. 前記ヌクレオシド薬がヌクレオシド類似体である、請求項48に記載の複合体。
  50. 前記ヌクレオシド類似体が、ゲムシタビン、シタラビン、トロキサシタビン、デシタビン、クラドリビン、フルダラビン、クロファラビン、および2’-C-シアノ-2’-デオキシ-1-β-D-アラビノ-ペントフラノシルシトシン(CNDAC)からなる群から選択される、請求項49に記載の複合体。
  51. 前記リンカーが酵素切断可能リンカーである、請求項11~50のいずれか一項に記載の複合体。
  52. 前記酵素切断可能リンカーが、プロテアーゼ切断可能リンカーである、請求項51に記載の複合体。
  53. 前記リンカーが、バリン-シトルリンジペプチド、バリン-アラニンジペプチド、またはその両方を含む、請求項52に記載の複合体。
  54. 前記リンカーが、バリン-シトルリン-パラアミノベンジルオキシ(Val-Cit-PAB)リンカーである、請求項53に記載の複合体。
  55. 前記リンカーが、バリルアラニルパラアミノベンジルオキシ(Val-Ala-PAB)リンカーである、請求項53に記載の複合体。
  56. 前記ノッティンペプチドが、EETI-IIペプチド、AgRPペプチド、ω-コノトキシンペプチド、カラタB1ペプチド、MCoTI-IIペプチド、アガトキシンペプチド、およびクロロトキシンペプチドからなる群から選択される、請求項1~55のいずれか一項に記載の複合体。
  57. 前記細胞表面分子が癌細胞表面分子である、請求項1~56のいずれか一項に記載の複合体。
  58. 前記癌細胞表面分子が、固形腫瘍の癌細胞上に存在する、請求項57に記載の複合体。
  59. 前記細胞表面分子が細胞表面受容体である、請求項1~57のいずれか一項に記載の複合体。
  60. 前記細胞表面受容体が細胞接着受容体である、請求項59に記載の複合体。
  61. 前記細胞接着受容体がインテグリンである、請求項60に記載の複合体。
  62. 前記インテグリンが、αvβ1インテグリン、αvβ3インテグリン、αvβ5インテグリン、αvβ6インテグリン、α5β1インテグリン、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項60に記載の複合体。
  63. 前記細胞表面受容体がケモカイン受容体である、請求項59に記載の複合体。
  64. 前記ケモカイン受容体が、C-X-Cケモカイン受容体タイプ4(CXCR4)である、請求項63に記載の複合体。
  65. 前記細胞表面分子が成長因子受容体である、請求項59に記載の複合体。
  66. 前記細胞表面受容体が免疫細胞受容体である、請求項59に記載の複合体。
  67. 前記免疫細胞受容体が細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4(CTLA-4)である、請求項66に記載の複合体。
  68. 前記細胞表面受容体がニューロピリン-1(NRP1)である、請求項59に記載の複合体。
  69. 前記細胞表面分子が膜プロテアーゼである、請求項1~57のいずれか一項に記載の複合体。
  70. 前記膜プロテアーゼがマトリプターゼである、請求項69に記載の複合体。
  71. 請求項1~70のいずれか一項に記載の複合体を含む組成物。
  72. 前記組成物が、
    前記複合体と、
    薬学的に許容される担体と、
    を含む、医薬組成物である、請求項71に記載の組成物。
  73. 前記医薬組成物が非経口投与のために製剤化されている、請求項72に記載の組成物。
  74. 前記医薬組成物が経口投与のために製剤化されている、請求項72に記載の組成物。
  75. 治療有効量の、請求項72に記載の医薬組成物と、
    前記医薬組成物を、それを必要とする個体に投与するための説明書と、
    を含む、キット。
  76. 前記医薬組成物が、1つ以上の単位用量で存在する、請求項75に記載のキット。
  77. 治療有効量の、請求項72に記載の前記医薬組成物を、それ必要とする個体に投与することを含む、方法。
  78. 前記個体が癌を有し、前記操作されたループが、前記個体に存在する癌細胞上の細胞表面分子に結合する、請求項77に記載の方法。
  79. 前記細胞表面分子が細胞表面受容体である、請求項78に記載の方法。
  80. 前記細胞表面受容体が細胞接着受容体である、請求項79に記載の方法。
  81. 前記細胞接着受容体がインテグリンである、請求項80に記載の方法。
  82. 前記インテグリンが、αvβ1インテグリン、αvβ3インテグリン、αvβ5インテグリン、αvβ6インテグリン、α5β1インテグリン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項81に記載の方法。
  83. 前記個体が、前記癌細胞を含む固形腫瘍を有する、請求項82に記載の方法。
  84. 前記固形腫瘍が脳腫瘍である、請求項83に記載の方法。
JP2021568852A 2019-05-22 2020-05-21 薬物複合体およびその使用方法 Pending JP2022533671A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962851443P 2019-05-22 2019-05-22
US62/851,443 2019-05-22
PCT/US2020/034050 WO2020237078A1 (en) 2019-05-22 2020-05-21 Drug conjugates and methods of using same

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2022533671A true JP2022533671A (ja) 2022-07-25
JPWO2020237078A5 JPWO2020237078A5 (ja) 2023-05-26

Family

ID=73458657

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2021568852A Pending JP2022533671A (ja) 2019-05-22 2020-05-21 薬物複合体およびその使用方法

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20220211861A1 (ja)
EP (1) EP3972647A4 (ja)
JP (1) JP2022533671A (ja)
KR (1) KR20220012278A (ja)
CN (1) CN113891731A (ja)
AU (1) AU2020277470A1 (ja)
CA (1) CA3138933A1 (ja)
SG (1) SG11202112129SA (ja)
WO (1) WO2020237078A1 (ja)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2020357806A1 (en) * 2019-09-30 2022-05-26 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Knottin-immunostimulant conjugates and related compositions and methods
CA3229925A1 (en) * 2021-08-27 2023-03-02 David CAIANIELLO Molecular degraders of extracellular proteins
WO2023150543A1 (en) * 2022-02-02 2023-08-10 Cancer Targeted Technology Llc Phosphoramidate-based psma-targeted small-molecule drug conjugates
WO2024012524A1 (zh) * 2022-07-14 2024-01-18 苏州宜联生物医药有限公司 抗体药物偶联物及其制备方法和用途

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1958957A1 (en) * 2007-02-16 2008-08-20 NascaCell Technologies AG Polypeptide comprising a knottin protein moiety
LT3415531T (lt) * 2011-05-27 2023-09-25 Glaxo Group Limited Bcma (cd269/tnfrsf17) – surišantys baltymai
UA112434C2 (uk) * 2011-05-27 2016-09-12 Ґлаксо Ґруп Лімітед Антигензв'язувальний білок, який специфічно зв'язується з всма
WO2016102679A1 (en) * 2014-12-23 2016-06-30 Nbe-Therapeutics Ag Binding protein drug conjugates comprising anthracycline derivatives
WO2016165762A1 (en) * 2015-04-15 2016-10-20 Ganymed Pharmaceuticals Ag Drug conjugates comprising antibodies against claudin 18.2
AU2016283391A1 (en) * 2015-06-26 2017-11-30 Fred Hutchinson Cancer Research Center Therapeutic peptides and methods of use thereof
WO2017160879A1 (en) * 2016-03-15 2017-09-21 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Knottin-drug conjugates and methods of using the same
US20190292243A1 (en) * 2016-08-22 2019-09-26 Fred Hutchinson Cancer Research Center Peptides and methods of use thereof
AU2018207303A1 (en) * 2017-01-10 2019-07-25 xCella Biosciences, Inc. Combination tumor treatment with an integrin-binding-Fc fusion protein and immune modulator
TWI804499B (zh) * 2017-06-23 2023-06-11 美商維洛斯生物公司 Ror1抗體免疫接合物

Also Published As

Publication number Publication date
CA3138933A1 (en) 2020-11-26
EP3972647A1 (en) 2022-03-30
US20220211861A1 (en) 2022-07-07
EP3972647A4 (en) 2023-05-03
SG11202112129SA (en) 2021-11-29
CN113891731A (zh) 2022-01-04
AU2020277470A1 (en) 2022-01-27
WO2020237078A1 (en) 2020-11-26
KR20220012278A (ko) 2022-02-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7254861B2 (ja) エリブリンをベースとする抗体-薬物コンジュゲート及び使用方法
JP2022533671A (ja) 薬物複合体およびその使用方法
Bernardes et al. A traceless vascular‐targeting antibody–drug conjugate for cancer therapy
CN105979971B (zh) 抗体-药物缀合物和免疫毒素
KR20220144753A (ko) 글리신 기반 링커를 사용한 트랜스글루타미나제 컨쥬게이션 방법
CN109563128B (zh) 恶性肿瘤靶向肽
US10765625B2 (en) Knottin-drug conjugates and methods of using the same
JP6585600B2 (ja) C末端軽鎖ポリペプチド伸長を含有する抗体、ならびにその複合体及びその使用方法
TW201116300A (en) DR5 Ligand Drug Conjugates
CA2891190C (en) Aprotinin-derived polypeptide-antibody conjugates
RU2689689C2 (ru) Конъюгаты антитело-уреаза для терапевтических целей
CN110575548A (zh) 靶向于cd73的抗体-药物偶联物及其制法和用途
CA3166699A1 (fr) Conjugues anticorps-medicament anti-cd56 et leur utilisation en therapie
Krzyscik et al. Site-specific, stoichiometric-controlled, pegylated conjugates of fibroblast growth factor 2 (FGF2) with hydrophilic auristatin y for highly selective killing of cancer cells overproducing fibroblast growth factor receptor 1 (FGFR1)
Knewtson et al. Antibody–Drug Conjugate that Exhibits Synergistic Cytotoxicity with an Endosome–Disruptive Peptide
JP7257680B2 (ja) 毛様体神経栄養因子受容体リガンド結合剤およびその使用方法
Bocci et al. In vivo activation of FAP-cleavable small molecule-drug conjugates for the targeted delivery of camptothecins and tubulin poisons to the tumor microenvironment
Mao et al. Development of a MMAE-based antibody-drug conjugate targeting B7–H3 for glioblastoma
US20200390898A1 (en) Knottin-drug conjugates and methods of using the same
US20240091372A1 (en) Anti-doppel antibody drug conjugates
EP4198058A1 (en) Antibody targeting intracellular tumor-inducing protein, or fusion protein of single strand variable fragment thereof and cancer-cell-penetrating peptide, and use thereof
US20240115717A1 (en) Chlorotoxin derivatives and use thereof
Millul Drug Conjugates Specific to Fibroblast Activation Protein and Carbonic Anhydrase IX for Applications in Oncology
TW202345907A (zh) 抗gd2抗體、其免疫結合物及治療用途
Guillemard Design and chemical synthesis of selective cancer therapeutics

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230518

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20230518