KR20220020651A

KR20220020651A - 마이크로튜뷸 아세틸레이션 저해를 통한 삼중음성 유방암 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20220020651A
Application number: KR1020200101232A
Authority: KR
Inventors: 송우근; 권아름; 안진희; 엄수현; 이귀빈; 박태인
Original assignee: 광주과학기술원
Priority date: 2020-08-12
Filing date: 2020-08-12
Publication date: 2022-02-21
Also published as: KR102397817B1

Abstract

본 발명은 마이크로튜뷸 아세틸레이션 저해를 통한 삼중음성 유방암 억제제에 관한 것으로, 구체적으로, 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 삼중음성 유방암 예방 또는 치료용 약학 조성물; 삼중음성 유방암 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물; 및 상기 약학 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 삼중음성 유방암 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.
본 발명의 화합물은 정상세포 또는 수용체가 존재하는 유방암이 아닌 삼중음성 유방암을 타겟으로 하는 우수한 억제 능력을 2D, 3D 세포 배양 및 이종 이식 종양 실험을 통해 확인하였으며, 체중감소와 같은 부작용이 없는 것을 확인하여, 수용체가 존재하지 않아 표적치료에 어려움이 있었던 삼중음성 유방암을 억제, 예방 또는 치료하는데 효과적으로 사용될 수 있을 것이다.

Description

마이크로튜뷸 아세틸레이션 저해를 통한 삼중음성 유방암 예방 또는 치료용 조성물 {Composition for prevention or treatment of triple-negative breast cancer through blocking microtubule acetylation}

본 발명은 마이크로튜뷸 아세틸레이션 저해를 통한 삼중음성 유방암 억제제에 관한 것으로, 구체적으로, 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 삼중음성 유방암 예방 또는 치료용 약학 조성물; 삼중음성 유방암 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물; 및 상기 약학 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 삼중음성 유방암 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.

전세계적으로 100만명을 초과하는 여성이 매년 유방암에 걸리는 것으로 진단된다. 유방암은 조직학적 분류 시스템을 이용하여 구별되는 많은 상이한 유형으로 구성되는 매우 이종성의 질병이다. 환자의 많은 서브타입 및 대부분은 각각 저등급 또는 고등급 조직구조와 함께 에스트로겐 수용체(ER) 발현을 나타내는 것으로 명확히 특성 규명될 수 있는 내강형 A 또는 내강형 B로 조직학적으로 확인된다(Santana-Davila and Perez, 2010). 면역조직화학 방법은 ER-양성 상태와 커플링되는 경우 호르몬 반응성인 것으로 종양의 분류를 가능케 하는 프로게스테론 수용체(PR)의 발현을 측정하는데 사용된다. 또한, 인간 표피 성장 인자 수용체 2(HER2)의 과발현 또는 증폭은 면역조직화학 또는 형광 제자리부합법(FISH)으로 관찰될 수 있다. 일반적으로, 유방 종양에서의 상기 3개의 마커의 발현은 보다 나은 임상 결과와 관련되는데, 이는 타목시펜(tamoxifen), Arimidex™(아나스트로졸(anastrozole)), Aromasin™(엑세메스탄(exemestane)), Femara™(레트로졸(letrozole)), Faslodex™(풀베스트란트(fulvestrant)), Herceptin™(트라스투주맙(trastuzumab)), 또는 Tykerb™(라파티니브(lapatinib))를 포함하는 상기 단백질을 표적으로 하는 환자에 대해 이용 가능한 여러 치료 옵션이 존재하기 때문이다(de Ruijter et al., 2011). 유방암의 또 다른 조직학적 서브타입은 특히 높은 조직학적 등급, 증가된 유사분열 지수 및 높은 Ki67 발현과 관련되는 기저양 암으로 구성된다(Santana-Davila and Perez, 2010). 기저양 암의 대다수는 모든 진단된 유방암 환자의 15 내지 20%를 구성하는 삼중음성 유방암(TNBC) 환자를 포함한다(Ismail-Khan and Bui, 2010).

삼중음성 유방암은 ER, PR의 단백질 발현의 결핍 및 HER2 단백질 과발현의 부재로 정의된다. 기저양 암과 삼중음성 유방암 사이의 관계는 용이하게 설명되지 않는데, 이는 모든 삼중음성 유방암이 기저양은 아니고, 모든 기저양 암이 삼중음성 유방암인 것은 아니지만, 이러한 부류의 환자의 약 75%는 둘 모두의 특징을 공유하기 때문이다. TNBC는 낮은 5년 생존률 및 높은 재발로 구성되는 불량한 예후와 관련된다.

삼중음성 유방암을 갖는 환자는 다른 유방암 서브타입과 비교하여 생애 초기에서 이들의 질병이 발달하며, 폐경 전 단계에서 종종 진단된다(Carey et al., 2006). 삼중음성 유방암은 치료 후의 재발의 증가된 경향을 나타내고, 기저양 유방암 서브타입의 것과 유사한 다른 유방 암종 서브타입보다 더욱 공격적인 것으로 보인다(Nofech-Mozes et al., 2009). 결과로서, 삼중음성 유방암 환자의 전체 5년 생존은 다른 서브타입의 유방암으로 진단된 환자보다 현저하게 낮다.

2015년 Cancer Research에 발표된 바에 따르면 삼중음성 유방암 세포주에서 정상세포 및 다른 subtype의 유방암 세포주에 비해 마이크로튜뷸 아세틸레이션이 증가한다(AE Boggs et al). 또한 이 연구진이 돌연변이형의 유전자를 과발현시켜 마이크로튜뷸 아세틸레이션을 저해시킨 경우, 암세포 이동성이 현저히 감소함을 규명하였다.

한편, 세포 분열, 이동 등에 매우 중요한 역할을 하는 세포골격단백질인 마이크로튜뷸을 제어하는 항암제는 이미 개발되어 있으며 실제 암 환자에게 적용되고 있다. 이러한 약물은 Vinca alkaloid, cholhicine 등과 같이 마이크로튜뷸 중합을 억제하는 그룹과 Docetaxel, Paclitaxel 등의 마이크로튜뷸 안정화 유지 그룹으로 나뉜다. 이 두 약물 모두 세포분열 시 마이크로튜뷸 역할을 억제하는 역할을 하며, 빠른 세포 분열이 일어나는 암세포를 효과적으로 제어할 수 있다.

반면, 이러한 약물은 위 점막세포, 모근세포 등 빠른 세포분열을 보이는 정상세포군에도 작용하기 때문에 구토, 탈모 등의 부작용이 나타났다. 또한 2015년에 발표된 논문에 따르면 유방암 항암제로 많이 알려진 마이크로튜뷸 안정화 약물인 Taxol의 경우, 유방암 환자의 subtype 중 일부인 Her2 양성 유방암에서만 약물 효과를 보여 점차 한계가 드러나고 있다. 그러므로 삼중음성 유방암의 예방, 개선 또는 치료를 위한 삼중음성 유방암 특이적 마이크로튜뷸 억제 효과가 뛰어나고 부작용이 적은 우수한 새로운 삼중음성 유방암 치료제의 개발의 필요성이 증가하고 있다.

이러한 배경 하에, 본 발명자들은, 신규한 삼중음성 유방암 치료제를 개발하기 위한 노력을 계속한 결과, 본 발명의 화합물이 삼중음성 유방암에 특히 민감하게 작용하여 마이크로튜뷸 아세틸레이션 저해를 통한 암세포의 생장을 저해하고, 체중 감소 등의 부작용이 없는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 삼중음성 유방암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 삼중음성 유방암 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을, 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 삼중음성 유방암 예방 또는 치료방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 실시 양태는 하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 삼중음성 유방암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다:

구체적으로, 상기 조성물은 마이크로튜뷸의 아세틸레이션을 저해하는 것을 목적으로 하며, 보다 구체적으로, 상기 마이크로튜뷸 아세틸레이션 저해는 상기 화학식 1 내지 화학식 3으로 표시되는 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물이 알파-튜뷸린 아세틸트랜스퍼라아제 1(αTAT1)의 마이크로튜뷸 결합 부위에 결합하여 마이크로튜뷸과의 결합 저해가 달성되는 것일 수 있고, 상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 것일 수 있으며, 상기 조성물은 항암제를 추가로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서는 삼중음성 유방암에서 마이크로튜뷸 아세틸레이션이 활발히 일어나는 것을 확인하여, 이를 억제하고자 캠브릿지 라이브러리 (Chembridge small chemical library) 의 30,000개의 화합물을 스크리닝하여 마이크로튜뷸의 아세틸레이션 억제 활성이 우수한 화합물을 선정 및 합성하였다.

이의 합성방법은 도 9 내지 도 10에 나타내었다.

상기 용어, “마이크로튜뷸(microtubule)”은 미세소관이라고도 불리우며, 세포골격(cytoskeleton)의 한 일원으로서 세포질 전역에 널리 퍼져있는 가느다란 튜브형의 세포 모양을 유지하는 골조를 의미한다. 튜뷸린(tubulin)이라고 불리우는 단백질의 중합으로 긴 밧줄의 미세소관을 만드는데 그 길이가 50 마이크로 미터가 넘는 것도 있다. 매우 역동적으로 조립되고 분해되기도 하며, 튜브 밖의 지름은 24 나노미터, 안쪽 지름은 약 12 나노미터이고, 모든 진핵 세포에서 발견되는데, 원핵세포인 몇 몇 세균에서는 미세소관과 비슷한 기능의 유사체가 보고되기도 한다고 알려져 있다.

상기 용어, “아세틸레이션(acetylation)”은 화합물에 아세틸작용기를 치환하는 반응을 의미한다.

상기 용어, “저해(inhibition)”는 효소 활성의 방해 또는 간섭 때문에 활성이 낮아지는 것을 의미하며, 상기 저해는 “억제”와 같은 의미로 사용될 수 있다.

본 발명에서의 용어, “약학적으로 허용 가능한 염”은 양이온과 음이온이 정전기적 인력에 의해 결합하고 있는 물질인 염 중에서도 약학적으로 사용될 수 있는 형태의 염을 의미하며, 통상적으로 금속염, 유기염기와의 염, 무기산과의 염, 유기산과의 염, 염기성 또는 산성 아미노산과의 염 등이 될 수 있다. 예를 들어, 금속염으로는 알칼리 금속염(나트륨염, 칼륨염 등), 알칼리 토금속염(칼슘염, 마그네슘염, 바륨염 등), 알루미늄염 등이 될 수 있고; 유기염기와의 염으로는 트리에틸아민, 피리딘, 피콜린, 2,6-루티딘, 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 시클로헥실아민, 디시클로헥실아민, N,N-디벤질에틸렌디아민 등과의 염이 될 수 있으며; 무기산과의 염으로는 염산, 브롬화수소산, 질산, 황산, 인산 등과의 염이 될 수 있고; 유기산과의 염으로는 포름산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 프탈산, 푸마르산, 옥살산, 타르타르산, 말레인산, 시트르산, 숙신산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, p-톨루엔술폰산 등과의 염이 될 수 있으며; 염기성 아미노산과의 염으로는 아르기닌, 라이신, 오르니틴 등과의 염이 될 수 있고; 산성 아미노산과의 염으로는 아스파르트산, 글루탐산 등과의 염이 될 수 있다. 보다 구체적으로, 본원 발명에서의 바람직한 허용가능한 염은 HCl일 수 있으며, 하기 화학식 3으로 표시될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다:

본 발명에서의 용어, “유효성분”은 단독으로 목적으로 하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체 등과 함께 목적으로 하는 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.

본 발명의 일 실시예에서는, ER, PR, 또는 HER2 수용체를 가지는 유방암 환자의 조직 및 삼중음성 유방암 환자 및 다양한 subtype의 유방암 세포주에 따른 마이크로튜뷸 아세틸레이션 발현을 분석하였으며(도 1 내지 도 2), aTAT1을 knock-out 시킨 MDA-MB-231 세포주에서의 마이크로튜뷸 아세틸레이션 발현을 분석하고(도 3), NOD/SCID 마우스에 MDA-MB-231을 xenograft하여 종양형성을 유도한 뒤 생체 내 종양형성의 변화 및 SPIN90 Knockout mouse embryonic fibroblast의 마이크로튜뷸 아세틸레이션 발현을 비교하였으며(도 4 내지 도 5), 캠브릿지 라이브러리의 30,000개의 화합물을 처리하여 마이크로튜뷸의 아세틸레이션 억제 활성을 확인하여(도 6 내지 도 8), 마이크로튜뷸 아세틸레이션 억제 효능이 우수한 화합물을 선정 및 합성하였으며(도 9 내지 도 10), 이의 마이크로튜뷸 아세틸리에션 억제 활성을 확인하였다(도 11).

본 발명에서의 용어, “삼중음성 유방암(triple-negative breast cancer)”은 세 가지 호르몬 수용체가 없는 유방암의 한 유형으로서, 에스트로겐 수용체(ER), 프로게스테론 수용체(PR), 또는 사람 표피성장인자 수용체2(human epidermal growth factor receptor 2, HER2) 발현이 없어 항호르몬제나 표적치료제에 잘 반응하지 않아 치료가 어렵고, 예후가 좋지 않은 유형이라고 알려져 있어, 이러한 문제점을 극복하기 위한 치료제가 필요한 상황이다.

본 발명에서는 삼중음성 유방암 치료에 특이적인 화합물을 발굴하고자 예의 노력한 결과, 삼중음성 유방암에서 마이크로튜뷸 아세틸레이션이 활발히 일어나는 것을 확인하여, 상기 마이크로튜뷸 아세틸레이션 억제 효능이 있는 화합물을 발굴하고, 이를 삼중음성 유방암에 처리하여 항암 효능이 있는 것을 확인하여, 본 발명의 화합물을 통한 삼중음성 유방암 특이적 치료 효능을 확인하였다.

본 발명에서의 용어, “예방”은 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여에 의해 삼중음성 유방암의 발병을 억제시키거나 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서의 용어, “치료”는 상기 약학 조성물의 투여에 의해 삼중음성 유방암의 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 다른 일 실시예에서는, 본 발명의 화합물 GM-90527, GM-90568, 및 GM-90631의 마이크로튜뷸 아세틸레이션 억제 효능을 세포 실험을 통해 확인하고(도 12), GM-90527, GM-90568, 및 GM-90631을 처리 후 다시 제거 시 마이크로튜뷸 아세틸레이션의 양상 변화를 확인하였으며(도 13), 상기 화합물에 의해 농도의존적으로 삼중음성 유방암 세포주 MDA-MB-231의 콜로니 형성이 억제되는 것을 확인하고(도 14), 정상세포주 (MCF-10A), 수용체가 존재하는 유방암 세포주 (MCF-7), 및 삼중음성 유방암 세포주 (MDA-MB-231)을 2D 환경에서 배양한 뒤, MTT 어세이를 통해 본 발명의 화합물의 유방암 세포의 특이적 억제 효능을 확인하였으며(도 15), Annexin V/PI 염색을 통한 apoptosis 양상을 확인하고(도 16), NOD/SCID 마우스에 삼중음성 유방암 세포주 MDA-MB-231을 xenocraft하여 종양형성을 유도한 뒤, GM-90257 또는 GM-902631을 복강으로 주사하여 종양형성 억제 효능을 확인하였으며(도 17 내지 도 18), 상기 화합물의 마이크로튜뷸 아세틸레이션 억제 메커니즘을 확인하였다(도 19).

이를 통해, 본 발명의 화합물의 in vitro에서의 마이크로튜뷸 아세틸레이션 억제 효능을 확인하고, 동물 모델에서 마이크로튜뷸 아세틸레이션 억제를 통한 우수한 삼중음성 유방암 특이적 치료 효능을 확인하였다.

본 발명에서의 용어, “약학 조성물”은 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있는데, 상기 담체는 비자연적 담체(non-naturally occuring carrier)를 포함할 수 있다.

보다 구체적으로, 상기 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 폴리카프로락톤(polycaprolactone), 폴리락틱액시드(Poly Lactic Acid), 폴리-L-락틱액시드(poly-L-lactic acid), 광물유 등을 들 수 있다.

상기 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 담체의 형태로는 각종 부정형의 담체, 마이크로 스피어, 나노파이버 등을 포함할 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.

경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 추출물과 이의 분획물들에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.

경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물에 포함된 본 발명의 화합물의 함량은 특별히 제한되지 않는다.

본 발명에서의 용어, “항암제”는 암세포의 증식을 억제하기 위하여 사용하는 화학요법 치료제로서, 구체적으로, 메클로에타민(mechloethamine), 클로람부칠(chlorambucil), 페닐알라닌(phenylalanine), 무스타드(mustard), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosfamide), 카르무스틴(carmustine: BCNU), 로무스틴(lomustine: CCNU), 스트렙토조토신(streptozotocin), 부설판(busulfan), 티오테파(thiotepa), 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin), 닥티노마이신(dactinomycin: actinomycin D), 독소루비신(doxorubicin: adriamycin), 다우노루비신(daunorubicin), 이다루비신(idarubicin), 미토크산트론(mitoxantrone), 플리카마이신(plicamycin), 마이토마이신(mitomycin), C 브레오마이신(C Bleomycin); 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 에토포사이드(etoposide), 테니포사이드(teniposide), 토포테칸(topotecan) 및 이리도테칸(iridotecan)으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 실시 양태는 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 삼중음성 유방암 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

이때, 상기 용어, “약학적으로 허용 가능한 염”, “유효성분”, “삼중음성 유방암”, 및 “예방”은 상기에서 서술한 바와 같다.

본 발명에서의 용어, “개선”은 본 발명에 따른 조성물의 투여로 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서의 용어, "건강기능식품"은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, '기능성'은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 한편, 건강식품은 일반식품에 비해 적극적인 건강유지나 증진 효과를 가지는 식품을 의미하고, 건강보조식품은 건강 보조 목적의 식품을 의미하는데, 경우에 따라, 건강기능식품, 건강식품, 건강보조식품의 용어는 혼용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 그대로 첨가되거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.

본 발명의 식품은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조 가능하며, 상기 제조 시에는 당 업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 구체적으로, 상기 식품 조성물은 생리학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있는데, 담체의 종류는 특별히 제한되지 않으며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 또한, 상기 식품 조성물은 방부제, 살균제, 산화방지제, 착색제, 발색제, 표백제, 조미료, 감미료, 향료, 팽창제, 강화제, 유화제, 증점제, 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물을 포함할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용될 수 있다.

또한, 상기 식품의 제형은 식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품용 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고 휴대성이 뛰어나므로, 본 발명의 식품은 삼중음성 유방암의 예방 또는 개선의 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.

본 발명의 조성물은 삼중음성 유방암의 예방 또는 개선 효과를 나타낼 수 있다면 식품조성물에 다양한 중량%로 포함될 수 있다. 구체적으로 식품 조성물의 총 중량 대비 0.00001 내지 100 중량% 또는 0.01 내지 80 중량%로 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 건강 및 위생을 목적으로 장기간 섭취할 경우에는 상기 범위 이하의 함량을 포함할 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 일 실시 양태는 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을, 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 삼중음성 유방암 예방 또는 치료방법을 제공한다.

이때, 상기 용어, “약학적으로 허용 가능한 염”, “유효성분”, “약학 조성물”, “삼중음성 유방암”, “예방” 및 “치료”는 상기에서 서술한 바와 같다.

본 발명에서의 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 조성물 도입하는 것을 의미하며, 상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비 내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 조성물을 매일 투여 또는 간헐적으로 투여해도 좋고, 1일당 투여 횟수는 1회 또는 2~3회로 나누어 투여하는 것이 가능하다. 또한, 단독으로, 또는 다른 약물 치료와 병용하여 사용할 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명에서의 용어, "개체"는 삼중음성 유방암이 발병하였거나 발병할 수 있는 쥐, 생쥐, 가축 등의 모든 동물을 의미한다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 일 실시 양태는 상기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 조성물의 삼중음성 유방암 예방 또는 치료 용도를 제공한다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 일 실시 양태는 상기 화학식 3으로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 조성물의 삼중음성 유방암 예방 또는 치료 용도를 제공한다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 일 실시 양태는 화학식 2로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다.

본 발명에 따른 마이크로튜뷸 아세틸레이션 억제 조성물은 정상세포 또는 수용체가 존재하는 유방암이 아닌 삼중음성 유방암을 타겟으로 하는 우수한 마이크로튜뷸 아세틸레이션 저해 및 생장 억제 능력을 나타내므로, 삼중음성 유방암의 예방 또는 치료를 목적으로 하는 약학 조성물, 예방 또는 개선을 목적으로 하는 식품 조성물에 포함될 수 있으며, 상기 식품 조성물은 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 삼중음성 유방암의 예방 또는 개선에 대하여 높은 효과를 기대할 수 있다.

본 발명의 화합물은 정상세포 또는 수용체가 존재하는 유방암이 아닌 삼중음성 유방암을 타겟으로 하는 우수한 억제 능력을 2D, 3D 세포 배양 및 이종 이식 종양 실험을 통해 확인하였으며, 체중감소와 같은 부작용이 없는 것을 확인하여, 수용체가 존재하지 않아 표적치료에 어려움이 있었던 삼중음성 유방암을 억제, 예방 또는 치료하는데 효과적으로 사용될 수 있을 것이다.

도 1은 ER, PR, 또는 HER2 수용체를 가지는 유방암 환자의 조직 및 삼중음성 유방암 환자의 조직 슬라이드의 면역조직화학염색을 통한 마이크로튜뷸 아세틸레이션 발현을 나타내는 사진 및 그래프이다.
도 2는 다양한 subtype의 유방암 세포주에 따른 마이크로튜뷸 아세틸레이션 발현 양상을 나타내는 사진이다.
도 3A는 αTAT1을 knock-out 시킨 MDA-MB-231 세포주에서의 마이크로튜뷸 아세틸레이션 발현을 나타내는 전기영동 사진이다.
도 3B는 αTAT1을 knock-out 시킨 MDA-MB-231 세포주에서의 마이크로튜뷸 아세틸레이션 발현을 나타내는 사진 및 그래프이다.
도 4는 NOD/SCID 마우스에 MDA-MB-231을 이종 이식하여 종양형성을 유도한 뒤, 생체 내 종양형성의 변화를 비교하는 그래프 및 사진이다.
도 5는 SPIN90 Knockout mouse embryonic fibroblast의 마이크로튜뷸 아세틸레이션 발현을 나타내는 전기영동 사진이다.
도 6은 후보 화합물을 처리하여 마이크로튜뷸의 아세틸레이션 억제를 형광염색을 통해 확인하는 사진이다.
도 7은 20개의 후보 화합물의 마이크로튜뷸 아세틸레이션 억제 활성을 나타내는 사진이다.
도 8은 후보 화합물의 마이크로튜뷸 아세틸레이션 억제 활성을 나타내는 사진이다.
도 9는 화합물 GM-90527의 합성방법을 나타내는 모식도이다.
도 10은 화합물 GM-90527의 유도체 GM-90631 및 GM-90568의 합성방법을 나타내는 모식도이다.
도 11은 후보 화합물 GM-90257 및 GM-90568의 농도별 마이크로튜뷸 아세틸레이션 억제 활성을 나타내는 사진이다.
도 12A는 GM-90527, GM-90568, 및 GM-90631의 마이크로튜뷸 아세틸레이션 억제 효능을 나타내는 사진이다.
도 12B는 GM-90527, GM-90568, 및 GM-90631의 농도별 마이크로튜뷸 아세틸레이션 억제 효능을 나타내는 사진이다.
도 13은 GM-90527, GM-90568, 및 GM-90631을 처리 후 다시 제거 시 마이크로튜뷸 아세틸레이션의 양상 변화를 나타내는 사진이다.
도 14는 본 발명의 화합물에 의해 농도의존적으로 삼중음성 유방암 세포주 MDA-MB-231의 콜로니 형성이 억제되는 것을 나타내는 사진 및 그래프이다.
도 15는 정상세포주 (MCF-10A), 수용체가 존재하는 유방암 세포주 (MCF-7), 및 삼중음성 유방암 세포주 (MDA-MB-231)을 2D 환경에서 배양한 뒤, MTT 어세이를 통해 본 발명의 화합물의 유방암 세포 억제 효능을 나타내는 그래프이다.
도 16은 본 발명의 화합물을 정상세포주 (MCF-10A), 수용체가 존재하는 유방암 세포주 (MCF-7), 및 삼중음성 유방암 세포주 (MDA-MB-231)에 처리한 뒤, Annexin V/PI 염색을 통한 apoptosis 양상을 나타내는 그래프이다.
도 17은 NOD/SCID 마우스에 삼중음성 유방암 세포주 MDA-MB-231을 이종 이식하여 종양형성을 유도한 뒤, GM-90257을 복강으로 주사하여 종양형성 억제 효능 결과를 나타내는 그래프 및 사진이다.
도 18은 NOD/SCID 마우스에 삼중음성 유방암 세포주 MDA-MB-231을 이종 이식하여 종양형성을 유도한 뒤, GM-902631을 복강으로 주사하여 농도별 종양형성 억제 효능 결과를 나타내는 그래프 및 사진이다.
도 19A는 본 발명의 화합물의 binding site에서의 구조를 나타내는 사진이다.
도 19B는 αTAT1을 과발현 시킨 세포에 본 발명의 화합물을 처리하여 형광염색을 통해 αTAT1과 마이크로튜뷸과의 co-localization 변화 결과를 나타내는 사진이다.
도 19C는 OD 값을 통한 마이크로튜뷸 중합 변화를 나타내는 사진이다.
도 19D는 본 발명의 화합물이 αTAT1과 마이크로튜뷸의 상호작용으로 인한 마이크로튜뷸 아세틸레이션을 직접적으로 저해하는 in vitro 실험 결과를 나타내는 사진이다.

이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실험예 1: 환자 조직 준비

파라핀으로 샘플링한 유방암 조직 분석용 슬라이드 및 환자 병리학 적 데이터는 US Biomax 사 (BR10011)로부터 구입하였으며, 인체 유래 조직 슬라이드와 환자 정보를 얻고 분석하기 위하여 광주 과학 기술원 (GIST) 주관 임상시험심사위원회에서 본 연구를 승인받았다. (IRB number : 20191128-BR-49-05-02).

실험예 2: 세포 배양

MDA-MB-231은 10% FBS, 50 μg/ml 의 Streptomicyn, 50 units/ml 의 penicillin이 포함된 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (high glucose, Gibco)에서 배양하였다. ZR-75-1, T47D, HCC-1428, HCC-1419 및 Hs578T는 한국세포주은행에서 구매하였으며, 기관이 제공한 Data sheet에 명시된 방법대로 배양하였다.

실험예 3: 웨스턴 블랏 분석

수집한 세포를 50mM Tris-HCl (pH 7.4), 150mM NaCl, 1% NP-40, 1% SDS, 0.25% sodium deoxycholate, 10mM NaF, 1mM Na₃VO₄ 및 protease inhibitor cocktail (Roche)을 포함하는 RIPA 완충액에 용해시켰다. 1차 항체는 Acetyl-α-tubulin (Sigma, USA), α-tubulin (Sigma, USA), acetyl-histone H3 sampler kit (Cell signaling technology, USA)를 이용하여 실시하였다.

실험예 4: 면역조직 화학염색 (Immunohistochemistry) 분석

이종 이식 유방암 마우스 모델 (xenograft mice) 로부터 collect 한 종양을 10% 포르말린에 고정시키고 파라핀 블록에 embed 시켰다. 이후, 파라핀을 제거하고 에탄올로 re-hydration 시키고, Retrieval solution (IHC World, USA)에서 30 분 동안 가열하여 항원 노출시킨 뒤, acetyl-α-tubulin (Abcam, UK), Ki67 (Sigma, USA), 및 Mayer hematoxylin (Dako, USA)으로 세포핵 염색을 진행하였다. 이후, 염색된 슬라이드 샘플을 Aperio Image Scope (Leica biosystems, Germany)에 의해 스캔하고 분석하였다.

실험예 5: CRISPR-Cas9를 통한 αTAT1 KO 세포 생성 방법

CRISPR-Cas9 시스템을 사용한 αTAT1 knock-out은 하기 논문과 동일한 방법으로 수행하였다 (Oh, You, Ko, Jeong, Keum & Rhee, 2017). 구체적으로, Anealing한 sgRNA를 pLenti-CRISPR v2 플라스미드에 클로닝한 후, lentivirus 생산을 위해, αtat1-targting cloning vector, psPAX2 및 pMD2.G와 polyethyenimine을 HEK293T 세포주로 co-transfection 시켰다. 48시간 배양 후, HEK293T로부터 분비된 lentivirus를 conditioned media (CM) 로부터 수집하였다. Lentivirus를 48 시간 동안 polybrene (8μg/ml)으로 MDA-MB-231에 주입하고 2주 동안 puromycin (1 μg/ml)을 통해 선별하였다.

실험예 6: soft agar colony 형성 분석

anchorage-independent cancer cell growth 를 확인하기 위해, 1% 아가로스 (agarose) 용액 및 2X DMEM 배양액 혼합물을 1:1 비율로 섞은 다음, 각각 1.5㎖ 를 6 well plate에 분배 한 다음 실온에서 30 분 동안 고체화 시켰다. 다음, 배양액에 suspend 된 MDA-MB-231 (각 well 당 5 x 10³세포) 및 40 ℃로 유지되는 0.6 % agarose 용액과 혼합한 뒤, 이전에 준비해 둔 1 % agarose 용액이 굳혀진 6 well plate에 첨가하였다. plate를 실온에서 30 분 동안 굳힌 다음, 300 μl의 완전한 배양액을 후보 화합물과 함께 각 well에 첨가하고 37 ℃에서 3주 동안 배양하였다.

실험예 7: 이종 이식 종양 접종(Xenograft tumor injection) 실험

암컷 NOD/SCID 마우스 (8 ~ 12 주령)를 유방암 이종 이식(xenograft) 모델에 사용하였다. 매트리겔 (Matri-gel)과 혼합된 MDA-MB-231 (1 x 10⁶개의 세포)을 좌측 사타구니 유선 지방 패드 (mammary fat pad)에 주사하고, 발달한 종양을 다음 식으로 정량 하였다 : [V = (L x W2) / 2, L; 길이, W; 폭]. 종양이 100 mm3이 되면, 각 화합물을 2일에 1회 15일 동안 복강 내 주사하였다. 동물에 대한 모든 실험 절차는 GIST의 동물 관리 및 윤리위원회 (GIST-2017-003)의 승인을 받아 수행하였다.

실험예 8: 화합물 스크리닝

10mM 스탁 용액으로서 DMSO(Dimethyl sulfoxide)에 용해된 30,000 개의 small compounds 을 갖는 캠브리지 라이브러리 (Chembride chemical library) (NM1117-1)를 사용하였다. 구체적으로, 일관되게 높은 acetyl-α-tubulin 발현을 갖는 Spin90-KO MEF (You et al., 2017)를 96 well culture plate에서 배양하고 각 화합물을 10 μM 농도로 처리하였다. Acetyl-α-tubulin (Sigma, USA)으로 1차적으로 탐지시킨 후 현미경으로 확인하기 위하여 Alexa 형광 2차 항체로 탐지, 염색하였다. 최종적으로 IX81 형광현미경을 사용하여 개별적으로 분석하였으며, 선별된 20여개의 후보를 웨스턴 블랏을 통해 정량적으로 분석하였다.

실험예 9: 마이크로튜뷸 아세틸레이션 분석

마이크로튜뷸에 아세틸레이션이 되지 않은 αTAT1 KO MDA-MB-231로부터 튜뷸린 단백질을 정제하였다. MTS 완충액은 80mM PIPES, 1mM EGTA, 1mM MgCl₂, 40 % 글리세롤, PMSF 1mM, Na3VO4 1mM 및 NaF 10mM 이 포함되어 있고, 이 용액을 37℃ 인큐베이터에서 20분 동안 세포에 첨가 하였다. MTS 완충액에서 세포를 재현탁 (resuspension) 후, 파클리탁셀을 최종 농도가 20μM이 되도록 첨가하였다. 이후, 용액을 25G 주사기 바늘로 약 3회간 균질화 (homogenizing) 한 다음, 실온에서 10 분 동안 인큐베이션 하였다. Ti-70 로터 (Beckman Coulter, USA)를 사용하여 실온에서 30분 동안 31100 rpm에서 원심 분리하여 침전물(pellet) 및 상층액으로 분리하였다. 그 뒤, Pellet을 20μM 파클리탁셀을 함유하는 MTS 완충액으로 재현탁 시키고, 1 mg/ml의 His-αTAT1, 1uM acetyl-coA 및 각각의 마이크로튜뷸 아세틸레이션 저해 화합물 (1 mM)를 첨가하고 37 ℃에서 30 분 동안 배양 하였다. 4X SDS 샘플 용액을 첨가하여 αTAT1의 효소 활성을 정지시키고 SDS-PAGE에 이어서 웨스턴 블랏으로 분석하였다.

실험예 10: Annexin V/PI 염색 분석

화합물을 사용한 후 암세포의 apoptosis 및 죽은 세포를 분석하기 위하여 annexin V-PI apoptosis kit (BD bioscience, USA)를 사용하여 분석하였다. 화합물을 암 세포주에 처리한 뒤 24시간 인큐베이션 한 후, 세포는 제조사의 프로토콜에 따라 PI-annexin V 염색 후 유세포 분석법 (flow cytometry, BD bioscience, USA)을 사용하여 염색된 세포를 분석하였다.

실험예 11: 면역형광 염색(Immunofluorescence staining) 분석

화합물 처리 후 acetyl-α-tubulin 발현을 검출하기 위해, MDA-MB-231을 4% 파라포름 알데히드 (paraformaldehyde)가 포함된 PBS로 고정시키고 0.1% triton-X 100으로 permeabilization 시켰으며, 0.1% BSA 용액으로 blocking 한 후, 1차 항체인 acetyl-α-tubulin (Sigma, USA)으로 염색하였다. 또한, αTAT1 및 α-tubulin의 co-localization을 분석하기 위해, Dsred2-αTAT1로 transfection 된 MDA-MB-231을 동일한 방식으로 샘플링 하고, 1차 항체인 α-tubulin (Sigma, USA)으로 염색하였다. 공초점 현미경 (FV1000, Olympus)을 사용하여 모든 형광 이미지를 얻었다.

실험예 12: 마이크로튜뷸 중합(polymerization) 분석

돼지의 뇌로부터 정제된 튜뷸린 단백질(Cytoskeleton, USA)을 in vitro 미세 소관 중합 분석에 사용하였다. 튜뷸린 단백질을 3mg/ml로 조정하고 대조군으로서 파클리탁셀 (paclitaxel), 노코다졸 (nocodazole), GM-90257, GM-90631 및 DMSO를 포함하는 화합물과 각각 개별적으로 혼합하였다. 이어서 37℃에서 1시간 동안 중합 반응시키면서 340 nm에서 각각의 OD 값을 30초마다 값을 체크하였다.

실험예 13: 통계 분석

정량이 필요한 데이터는 two-tailed Student's t-test을 사용하여 분석하여 두 그룹 간의 통계적으로 유의미한 차이를 입증했다. 모든 결과는 평균 (n=3)을 막대를 나타내고 평균 ± 표준 편차 (SD) 이 포함되었다. 모든 P 값은 two-sided다. 데이터는 0.05 미만의 P 값에서 통계적으로 중요한 것으로 간주되었다; *, P ≤0.05; **, P ≤0.01; ***, P ≤0.001.

실시예 1: 유방암 세포 종류에 따른 마이크로튜뷸 아세틸레이션 발현 양상 비교

유방암은 암세포 표면의 수용체를 기준으로 하여 다양한 subtype으로 나누어진다. 이러한 수용체는 표적치료에 사용되기도 하며, 특이적 항암효과를 기대할 수 있으나, 세 가지 수용체가 한 종류도 존재하지 않는 삼중음성 유방암의 경우, 표적치료가 어려울 뿐만 아니라 암세포 이동 및 침습성이 다른 유방암 보다 높기 때문에 전이로 인한 사망률이 높다. 따라서 삼중음성 유방암의 억제 및 치료를 위해, 삼중음성 유방암의 특징 중 하나인 마이크로튜뷸 아세틸레이션 발현 양상을 다른 유방암 세포와 비교하였다.

구체적으로, 유방암 환자의 조직 슬라이드를 실험예 4의 방법의 면역조직 화학염색(immunohistochemistry)을 수행하여 마이크로튜뷸 아세틸레이션 양상을 비교하였다.

그 결과, 도 1에서 볼 수 있듯이, ER, PR, 또는 HER2 수용체를 가지는 유방암 환자의 조직과 달리, 삼중음성 유방암에서 마이크로튜뷸 아세틸레이션이 현저히 증가하는 것을 확인하였다.

또한, 상기 수용체를 기준으로 한 다양한 subtype의 유방암 세포주에 따른 마이크로튜뷸 아세틸레이션 발현 양상을 확인하였다.

Cell line	Surface receptor	Subtype
MCF-10A	-	Normal
MEF-7	ER+, PR+, Her2-	Luminal A
ZR-75-1	ER+, PR+, Her2-	Luminal A
T47D	ER+, PR+, Her2-	Luminal A
HCC-1428	ER+, PR+, Her2-	Luminal A
HCC-1419	ER+, PR-, Her2+	Luminal B
Hs578T	ER-, PR-, Her2-	TNBC
MDA-MB-231	ER-, PR-, Her2-	TNBC

그 결과, 표 1 및 도 2에서 볼 수 있듯이, 삼중음성 유방암 세포주에서 마이크로튜뷸 아세틸레이션이 현저하게 증가하는 것을 확인하였다.

이를 통해, 유방암 환자 조직 슬라이드 비교 및 유방암 세포주 비교에서 모두, 다른 유방암 subtype 보다 삼중음성 유방암에서 마이크로튜뷸 아세틸레이션이 활발하게 발현되는 것을 확인하였다.

실시예 2: 마이크로튜뷸 아세틸레이션 발현에 따른 삼중음성 유방암의 생장 비교

실시예 1에서 삼중음성 유방암 세포 내에서 마이크로튜뷸 아세틸레이션이 활발하게 일어나는 것을 확인한 바, 마이크로튜뷸 아세틸레이션 발현이 삼중음성 유방암의 생장에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 삼중음성 유방암의 한 종류인 MDA-MB-231 세포주에 주요 acetylase인 alpha-tubulin acetyltransferase 1(αTAT1)을 knock-out(KO) 시킨 후, 상기 유방암 세포주의 생장 변화를 분석하였다. 구체적으로, αTAT1 KO 세포 생성은 실험예 5를 통해 실시하였다.

그 결과, 도 3에서 볼 수 있듯이, 주요 acetylase인 αTAT1을 knock-out 시킨 MDA-MB-231 세포주에서 마이크로튜뷸 아세틸레이션 발현이 현저하게 감소한 것을 확인하였으며(도 3A).

또한, 실험예 6의 방법을 통해, soft agar를 이용한 3D 환경에서의 MDA-MB-231 세포의 콜로니 포메이션 실험에서도 형성된 콜로니 수가 현저하게 감소한 것을 확인하였다(도 3B).

또한, 실험예 7의 방법을 통해, NOD/SCID 마우스에 MDA-MB-231을 이종 이식하여 종양형성을 유도한 뒤, 생체 내 종양형성의 변화를 비교하였다.

그 결과, 도 4에서 볼 수 있듯이, αTAT1을 knock-out 시킨 MDA-MB-231 세포주의 종양 크기가 현저하게 줄어들었으며, 이의 무게 역시 knock-out을 시키지 않은 MDA-MB-231 보다 현저하게 감소하는 것을 확인하였다.

이를 통해, 마이크로튜뷸 아세틸레이션 억제가 삼중음성 유방암의 생장을 억제하는 것을 확인하였다.

실시예 3: 마이크로튜뷸 아세틸레이션 억제제 후보 화합물 선정을 위한 1차 스크리닝

상기 실시예 1 내지 2에서 삼중음성 유방암에서 마이크로튜뷸 아세틸레이션 발현이 다른 subtype 암세포주보다 높은 것을 확인하였으며, 상기 마이크로튜뷸 아세틸레이션 발현을 억제시킬 경우, 유방암의 생장이 억제되는 것을 확인하였다. 따라서 삼중음성 유방암의 마이크로튜뷸 아세틸레이션 억제에 효과적인 화합물을 발굴하기 위해, 캠브리지 라이브러리를 통한 30,000여개의 대량 스크리닝을 진행하였다.

구체적으로, 실험예 8의 방법을 통해 진행하였으며, 스크리닝 진행시 마이크로튜뷸 아세틸레이션이 지속적으로 발현하는 것으로 알려져 있고, 세포생장이 빠르고 안정적인 것으로 알려진 SPIN90 Knock-out mouse embryonic fibroblast(SPIN90 KO MEF)를 이용하였다(도 5).

보다 구체적으로, 실험예 9의 방법을 통해, 후보 물질을 처리한 뒤, 마이크로튜뷸의 아세틸레이션을 염색을 통해 현미경으로 관찰하였다.

5342294		9080518
5375229		9083907
7945423		9084483
7945622		9090545
7947446		9093074
7968593		5934703
9130673		7906450
9076292		7905037
9078355		7916195
9079730		7804168

그 결과, 도 6 내지 표 2에서 볼 수 있듯이, 30,000여개의 후보 화합물 중 마이크로튜뷸의 아세틸레이션을 억제능을 보이는 화합물 20개를 확인하였다.

실시예 4: 마이크로튜뷸 아세틸레이션 억제제 후보 화합물 선정을 위한 2차 스크리닝

실시예 3에서 선정한 20개의 후보 화합물을 토대로 2차 스크리닝을 실시하여, 마이크로튜뷸 아세틸레이션 억제 효능을 비교하였다.

구체적으로, 2차 스크리닝은 SPIN90 KO MEF에서 마이크로튜뷸을 분리정제한 뒤, 후보 화합물을 처리하여 아세틸레이션을 실시하고, 전기영동을 통해 마이크로튜뷸의 아세틸레이션 정도를 확인하였다.

그 결과, 도 7에서 볼 수 있듯이, 20개의 후보 화합물 중 5934703번 의 마이크로튜뷸 아세틸레이션 억제 활성이 가장 우수한 것을 확인하였다.

이를 통해, 삼중음성 유방암 세포의 마이크로튜뷸 아세틸레이션 억제 연구를 위한 후보 화합물로 5934703번 화합물을 선정하였다.

실시예 5: 마이크로튜뷸 아세틸레이션 억제제 후보 화합물의 유도체 합성

상기 실시예 4에서 선정한 5934703번 화합물을 토대로 유도체를 합성하여, 이의 효능을 비교하였다.

구체적으로, 상기 5934703번 화합물에서 salt를 제거한 군 (none), salt를 HCl로 치환한 군 (HCl), 5934703번 화합물 그대로의 형태 (HBr) 및 similarity 분석을 통해 도출한 5931471 (#1) 및 5933489 (#2)의 마이크로튜뷸 아세틸레이션 억제 활성을 상기 실시예 4의 방법을 통해 비교하였다.

그 결과, 도 8에서 볼 수 있듯이, similarity 분석을 통해 도출된 5933489 (#2) 화합물에서 가장 높은 마이크로튜뷸 아세틸레이션 억제 활성이 나타남을 확인하였다.

이를 통해, 삼중음성 유방암 세포의 마이크로튜뷸 아세틸레이션 억제 연구를 위한 후보 화합물로 5933489번 화합물(화학식 1)을 선정하고, 이를 GM-90257이라 명명하였다

[화학식 1]

.

상기 GM-90257의 합성방법은 도 9에 나타내었다.

실시예 6: 마이크로튜뷸 아세틸레이션 억제제 후보 화합물의 유도체의 structure optimization 실시

상기 실시예 5에서 선정하고 명명한 GM-90257의 structure optimization을 실시 후 이의 효능을 측정하였다.

구체적으로, 상기 실시예 4의 실험방법과 동일한 방법으로 이의 효능을 확인하였다.

No.	Chemical structure	Effect
-		+++++
1		++++
2		-
3		-
4		+
5		+
6		-
7		-
8		-
9		-
10		++
11		+
12		+

그 결과, 표 3에서 볼 수 있듯이, structure optimization 실험을 통해서도 실시예 4에서 선정한 5934703 보다 화학식 1로 표시되는 GM-90257의 화합물의 마이크로튜뷸 아세틸레이션 억제 효능이 더 우수한 것을 확인하였다.

이를 통해, 화학식 1로 표시되는 화합물 GM-90257의 우수한 마이크로튜뷸 아세틸레이션 억제 효능을 확인하였다.

실시예 7. 화합물 GM-90257의 유도체의 합성 실시 및 이의 마이크로튜뷸 아세틸레이션 억제 효능 분석

상기 실시예 6에서 선정한 화합물 GM-90257을 토대로 유도체 합성을 실시하였다. 구체적으로, GM-90257의 유도체인 GM-90568 (화학식 2) 및 이의 염(HCl)을 포함하는 GM-90631 (화학식 3)을 합성하였다:

[화학식 2]

[화학식 3]

.

상기 유도체의 합성방법은 도 10에 나타내었다.

이에 따라, 화합물 GM-90257 및 GM-90568의 마이크로튜뷸 아세틸레이션 억제 효능을 비교하였다.

그 결과, 도 11에서 볼 수 있듯이, 화합물 GM-90257의 마이크로튜뷸 아세틸레이션 억제 활성 보다 이를 토대로 합성한 유도체 GM-90568의 마이크로튜뷸 아세틸레이션 억제 활성이 우수한 것을 확인하였다.

이를 통해, 화합물 GM-90568의 우수한 마이크로튜뷸 아세틸레이션 억제 효능을 확인하였다.

실시예 8: 삼중음성 유방암 세포주 내 마이크로튜뷸 아세틸레이션 억제 효능 분석

상기에서 확인한 GM-90257, GM-90568, 및 GM-90631의 삼중음성 유방암 내 마이크로튜뷸 아세틸레이션 억제 효능을 삼중음성 유방암 세포주 MDA-MB-231를 통해 확인하였다.

구체적으로, αTAT1이 knock-out 된 MDA-MB-231 세포주에서 마이크로튜뷸을 분리정제한 뒤, 상기 화합물을 처리하여 아세틸레이션을 실시하고, 실험예 9의 방법을 통해, 마이크로튜뷸의 아세틸레이션 정도를 확인하였다.

그 결과, 도 12에서 볼 수 있듯이, 상기 GM-90527, GM-90568, 및 GM-90631 모두에서 삼중음성 유방암 세포주 MDA-MB-231 내 마이크로튜뷸 아세틸레이션 억제 효능이 있음을 확인하였으며, 또한, GM-90257과 비교하여 GM-90568 및 GM-90631에서 억제능이 보다 우수한 것을 확인하였다(도 12A 내지 12B).

이를 통해, 본 발명의 화합물이 삼중음성 유방암 세포 내에서도 우수한 마이크로튜뷸 아세틸레이션 억제 효능을 보임을 확인하였으며, 또한, structure optimization 및 염(HCl)을 포함하는 GM-90568 및 GM-90631에서, structure optimization 되기 전의 화합물 GM-90257과 비교하여 보다 우수한 마이크로튜뷸 아세틸레이션 억제 효능이 있음을 확인하였다.

또한, 상기 화합물을 처리한 후 이를 다시 제거하여 마이크로튜뷸 아세틸레이션의 발현이 다시 회복되는지를 확인하였다.

그 결과, 도 13에서 볼 수 있듯이, 화합물 처리를 제거하자 마이크로튜뷸 아세틸레이션의 발현이 다시 재개되는 것을 확인하였다. 또한,

이를 통해, 삼중음성 유방암 세포 내 마이크로튜뷸 아세틸레이션 발현이 본 발명의 화합물 처리에 의해 직접적으로 억제되는 것을 확인하였다.

실시예 9: 삼중음성 유방암 세포주 생장 억제 효능 분석

상기 실시예 8에서 GM-90257, GM-90568, 및 GM-90631이 삼중음성 유방암 세포주 MDA-MB-231 내 마이크로튜뷸 아세틸레이션 억제 효능을 확인한 바, 상기 화합물이 실제로 삼중음성 유방암의 생장을 억제하는지를 확인하기 위하여, MDA-MB-231를 통해 이의 효능을 확인하였다.

구체적으로, 실험예 6의 방법과 같이, soft agar를 이용한 3D 환경에서 MDA-MB-231 세포를 배양한 뒤, 화합물에 의한 콜로니 형성 정도 변화를 비교하였다.

그 결과, 도 14에서 볼 수 있듯이, 상기 화합물에 의하여 농도의존적으로 삼중음성 유방암 세포주 MDA-MB-231의 콜로니 형성이 감소하는 것을 확인하였다.

이를 통해, 본 발명의 화합물이 삼중음성 유방암 세포의 생장을 억제하는 효능이 있음을 확인하였다.

또한, 정상세포주 (MCF-10A), 수용체가 존재하는 유방암 세포주 (MCF-7), 및 삼중음성 유방암 세포주 (MDA-MB-231)을 2D 환경에서 배양한 뒤, MTT 어세이를 통해 상기 화합물의 유방암 세포 억제 효능을 확인하였다.

그 결과, 도 15에서 볼 수 있듯이, 정상세포주 및 수용체가 존재하는 MCF-10A, 및 MCF-7에 비하여 MDA-MB-231에서 암세포 생장율이 현저하게 감소한 것을 확인하였다.

이를 통해, 본 발명의 화합물이 삼중음성 유방암을 타겟으로 하는 억제 효능이 뛰어난 것을 확인하였다.

또한, 상기 화합물을 정상세포주 (MCF-10A), 수용체가 존재하는 유방암 세포주 (MCF-7), 및 삼중음성 유방암 세포주 (MDA-MB-231)에 처리한 뒤, 실험예 10의 방법을 통해, Annexin V/PI 염색을 하여 apoptosis 양상을 확인하였다.

그 결과, 도 16에서 볼 수 있듯이, 정상세포주 및 수용체가 존재하는 MCF-10A, 및 MCF-7에 비하여 MDA-MB-231에서 apoptosis 양상이 월등히 증가한 것을 확인하였으며, MDA-MB-231에서 상기 화합물을 제거하자 증가했던 apoptosis 양상이 다시 감소하는 것을 확인하였다.

이를 통해, 본 발명의 화합물이 삼중음성 유방암의 apoptosis를 효과적으로 유도하는 것을 확인하였으며, 화합물을 제거하자 다시 apoptosis가 감소하는 것을 통해, 본 발명의 화합물이 삼중음성 유방암의 생장 및 apoptosis에 직접적으로 작용하는 것을 확인하였다.

실시예 10: 이종 이식(Xenocraft)를 통한 삼중음성 유방암 억제 효능 분석

상기 실시예 9에서 GM-90257, GM-90568, 및 GM-90631이 삼중음성 유방암 세포주의 생장 억제 효능을 확인한 바, 이종 이식을 통해 이의 효능을 확인하였다.

구체적으로, 실험예 7의 방법을 통해, NOD/SCID 마우스에 삼중음성 유방암 세포주 MDA-MB-231을 이종 이식 종양 접종을 통해 종양형성을 유도한 뒤, GM-90257 및 GM-90631을 복강으로 주사하여 종양형성 억제 효능을 확인하였다.

그 결과, 도 17에서 볼 수 있듯이, GM-90257을 주입하자 대조군과 비교하여 현저하게 종양의 크기 및 무게가 현저하게 감소하는 것을 확인하였으며, 체중 감소와 같은 부작용이 없는 것을 확인하였다.

또한, 도 17에서 볼 수 있듯이, GM-90631을 주입하자 농도의존적으로 종양의 크기 및 무게가 현저하게 감소하는 것을 확인하였으며, 체중 감소와 같은 부작용이 없는 것을 확인하였다.

이를 통해, 본 발명의 화합물이 체중 감소와 같은 부작용이 없이 종양 형성을 억제하는 것을 확인하여, 삼중음성 유방암을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다.

실시예 11: 화합물의 기작 분석

본 발명의 화합물의 기작을 확인하기 위하여, 이들의 구조를 분석하였다

구체적으로, 실험예 11의 방법을 통해 이를 확인하였다.

그 결과, 도 19A에서 볼 수 있듯이, 상기 화합물이 마이크로튜뷸의 subunit인 alpha-tubulin의 αTAT1 binding site에 부착하는 것을 확인하였으며, GM-90257은 binding affinity가 -16.452인 반면, GM-90568은 -21.217인 것을 확인하였다.

이를 통해, 본 발명의 화합물이 αTAT1 binding site에 부착하여, αTAT1과 마이크로튜뷸린의 binding을 저해하는 것을 확인하였으며, binding affinity 값을 통해 GM-90568의 저해능이 GM-90257과 비교하여 보다 우수한 것을 확인하였다.

또한, αTAT1을 과발현 시킨 후, 형광염색을 통해 αTAT1과 마이크로튜뷸과의 co-localization을 확인하였다.

그 결과, 도 19B에서 볼 수 있듯이, 대조군에서는 αTAT1과 마이크로튜뷸의 사진이 일치함을 통해, co-localization이 잘 일어난 것을 확인하였으나, 상기 화합물을 처리한 경우, co-localization이 억제된 것을 확인하였다.

이를 통해, 본 발명의 화합물이 αTAT1과 마이크로튜뷸의 binding을 저해한 것을 확인하였다.

또한, 실험예 12의 방법을 통해, 종래의 마이크로튜뷸 중합 작용을 조절하는 taxol, 및 nocodazole과 본 발명의 화합물 GM-90257, 및 GM-90568을 처리하여 OD 값을 통해 마이크로튜뷸 중합 변화를 확인하였다.

그 결과, 도 19C에서 볼 수 있듯이, 상기 화합물은 taxol, 및 nocodazole과 달리 마이크로튜뷸의 중합 자체에는 관여하지 않는 것을 확인하였다.

이를 통해, 본 발명의 화합물이 마이크로튜뷸의 중합 자체에는 관여하지 않으면서, αTAT1 binding site에 부착하여 αTAT1과 마이크로튜뷸의 binding을 저해함으로써, 마이크로튜뷸 아세틸레이션 억제능이 있는 것을 확인하였다.

다시 말해, ER, PR, HER2 수용체가 없어 표적치료가 어려울 뿐만 아니라 전이력이 강하여 위험한 삼중음성 유방암의 효과적인 치료를 위해, 마이크로튜뷸 아세틸레이션 억제 효능이 우수한 본 발명의 화합물을 제조하였으며, 이는 정상세포 또는 수용체가 존재하는 유방암이 아닌 삼중음성 유방암을 타겟으로 하는 우수한 생장 억제 능력을 2D, 3D 세포 배양 및 이종 이식 종양 실험을 통해 확인하였으며, 체중감소와 같은 부작용이 없는 것을 확인하여, 표적치료에 어려움이 있었던 삼중음성 유방암을 억제, 예방 또는 치료하는데 효과적으로 사용될 수 있음을 확인하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 삼중음성 유방암 예방 또는 치료용 약학 조성물:
[화학식 1]

[화학식 2]

.
제1항에 있어서, 화학식 2로 표시되는 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염은 하기 화학식 3으로 표시되는 것인, 삼중음성 유방암 예방 또는 치료용 약학 조성물:
[화학식 3]

.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 삼중음성 유방암 예방 또는 치료는 마이크로튜뷸 아세틸레이션 저해를 통해 달성되는 것인, 약학 조성물.
제3항에 있어서, 상기 마이크로튜뷸 아세틸레이션 저해는 상기 화학식 1 내지 화학식 3으로 표시되는 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물이 알파-튜뷸린 아세틸트랜스퍼라아제 1(αTAT1)의 마이크로튜뷸 결합 부위에 결합하여 마이크로튜뷸과의 결합 저해가 달성되는 것인, 약학 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 것인, 약학 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물은 항암제를 추가로 포함하는 것인, 약학 조성물.
하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 삼중음성 유방암 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물:
[화학식 1]

[화학식 2]

.
제7항에 있어서, 상기 화학식 2로 표시되는 화합물의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 것은, 하기 화학식 3으로 표시되는 것인, 건강기능식품 조성물:
[화학식 3]

.
하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을, 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 삼중음성 유방암 예방 또는 치료방법:
[화학식 1]

[화학식 2]

.
제9항에 있어서, 상기 화학식 2로 표시되는 화합물의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 것은, 하기 화학식 3으로 표시되는 것인, 삼중음성 유방암 예방 또는 치료방법:
[화학식 3]

.
하기 화학식 2로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:
[화학식 2]

.
제11항에 있어서, 상기 약학적으로 허용 가능한 염은, 하기 화학식 3으로 표시되는 것인, 화합물:
[화학식 3]

.