KR20220015554A - Agr2의 동종이량체를 표적으로 하는 저분자 화합물을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 AGR2(Anterior Gradient 2)의 동종이량체를 표적으로 하는 저분자 화합물을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 조성물에 대한 것으로, 보다 상세하게는, 5-(1H-이미다졸-2-일메틸)-8-메톡시-2-[2-(트리플루오로메틸)페닐]-2,3,4,5-테트라하이드로-1,5-벤조티아제핀)[5-(1H-imidazol-2-ylmethyl)-8-methoxy-2-[2-(trifluoromethyl)phenyl]-2,3,4,5-tetrahydro-1,5-benzothiazepine)]의 AGR2 동량체화 억제 용도 및 항암 용도에 관한 것이다. 상기 화합물은 농도 의존적으로 AGR2 동량체화를 억제함을 확인하였고, 생체 내에서(in vivo) 암세포의 성장을 억제하는 것을 확인하였으므로, 암 예방 및 치료에 유용한 약학조성물 및 건강기능식품으로 이용될 수 있다.

Description

AGR2의 동종이량체를 표적으로 하는 저분자 화합물을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating cancer comprising a small molecule compound targeting the homodimer of AGR2}
본 발명은 AGR2(Anterior Gradient 2)의 동종이량체를 표적으로 하는 저분자 화합물을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 조성물에 대한 것으로, 보다 상세하게는, 5-(1H-이미다졸-2-일메틸)-8-메톡시-2-[2-(트리플루오로메틸)페닐]-2,3,4,5-테트라하이드로-1,5-벤조티아제핀)[5-(1H-imidazol-2-ylmethyl)-8-methoxy-2-[2-(trifluoromethyl)phenyl]-2,3,4,5-tetrahydro-1,5-benzothiazepine)]의 AGR2 동량체화 억제 용도 및 항암 용도에 관한 것이다.
AGR2(Anterior Gradient 2)는 암 전이와 암 생성을 촉진한다고 알려진 샤페론 단백질로, 단백질 이황화 이성질화효소(PDI, protein disulfide isomerase)과에 속해있다. 단백질 이황화 이성질화효소 과에 속해있는 단백질은 단백질 항상성을 유지하기 위해 이황화결합의 산화, 환원, 이성질화 반응을 하는 효소이다. 대부분의 AGR2는 소포체에 존재하고 있으며 소포체 스트레스 신호전달반응과 연관되어 있어서 소포체 스트레스 환경에서 세포가 생존할 수 있도록 돕는다. 따라서 AGR2는 소포체 스트레스 환경일 때 세포 생존을 위해 증가한다.
AGR2는 유방암, 췌장암, 전립선암, 위암, 식도암, 간암, 폐암, 및 결장암과 같은 대부분의 전이성 선암에서 증가하여 존재하고, AGR2는 저산소증(hypoxia), 혈청 감손(serum depletion), 및 소포체 스트레스와 같은 다양한 스트레스에 의하여 생성된다고 알려져 있다. AGR2의 과발현은 생체 내 및 시험관 내(in vitro)에서 종양 성장 및 전이성 표현형을 촉진하고, 세포외 기질(Extracellular matrix)로 분비된 AGR2 동량체가 종양의 신생혈관 발생 및 전이성을 촉진한다.
전이성 종양에서 과발현되는 AGR2는 암 세포주에서 60번 글루탐산(Glutamic acid)(E60), 63번 타이로신(Tyrosine)(Y63) 및 64번 라이신(Lysine)(K64)의 세 종류의 아미노산들이 상호결합을 통해 역평행하게(antiparallel) 동량체화 형태로 존재하고, 상기 AGR2 동량체가 VEGF와 FGF2와 같은 종양성장에 중요한 성장인자들을 활성화시켜 종양 내 신생혈관의 발생(angiogenesis) 및 암의 성장에 주요한 역할을 하므로, 상기 AGR2 동량체화의 특이적 저해제는 암 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
한국공개특허 제10-2016-0006649호 (2016.01.19. 공개)
이에, 본 발명은 AGR2(Anterior Gradient 2)의 동종이량체를 표적으로 하는 저분자 화합물인, 5-(1H-이미다졸-2-일메틸)-8-메톡시-2-[2-(트리플루오로메틸)페닐]-2,3,4,5-테트라하이드로-1,5-벤조티아제핀)[5-(1H-imidazol-2-ylmethyl)-8-methoxy-2-[2-(trifluoromethyl)phenyl]-2,3,4,5-tetrahydro-1,5-benzothiazepine)]의 AGR2 동량체화 억제 용도 및 항암 용도를 제공하는 데에 그 목적이 있다.
상기 문제점을 해결하기 위해, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 시험관 내(in vitro) AGR2 동량체화 억제용 시약 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 시험관 내에서(in vitro) 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 암세포에 처리하는 단계를 포함하는 AGR2 동량체화 억제 방법을 제공한다.
[화학식 1]
Figure pat00001
본 발명은 AGR2(Anterior Gradient 2)의 동종이량체를 표적으로 하는 저분자 화합물을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 조성물에 대한 것으로, 보다 상세하게는, 5-(1H-이미다졸-2-일메틸)-8-메톡시-2-[2-(트리플루오로메틸)페닐]-2,3,4,5-테트라하이드로-1,5-벤조티아제핀)[5-(1H-imidazol-2-ylmethyl)-8-methoxy-2-[2-(trifluoromethyl)phenyl]-2,3,4,5-tetrahydro-1,5-benzothiazepine)]의 AGR2 동량체화 억제 용도 및 항암 용도에 관한 것이다. 상기 화합물은 농도 의존적으로 AGR2 동량체화를 억제함을 확인하였고, 생체 내에서(in vivo) 암세포의 성장을 억제하는 것을 확인하였으므로, 암 예방 및 치료에 유용한 약학조성물 및 건강기능식품으로 이용될 수 있다.
도 1은 모노머 AGR2의 세 종류의 아미노산들(E60, Y63, K64)에 결합하는 저분자 화합물들을 Zinc database의 화합물 라이브러리(10,292,210개 화합물)를 활용한 가상(virtual) 스크리닝 모식도를 나타낸다.
도 2는 AGR2의 C-말단에 NanoBit 단백질과 펩타이드가 각각 융합된 AGR2를 안정적으로 발현하는 HEK293 세포주(HEK293/pNanoBit-AGR2)를 제작하는 모식도를 나타낸다.
도 3은 Hit compound 5의 AGR2 동량체화 억제 효과 결과를 나타낸다.
도 4는 Hit compound 5의 in vivo 항암효능 평가 결과를 나타낸다.
도 5는 Hit compound 5의 종양 억제 효과 및 쥐의 체중 측정 결과를 나타낸다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure pat00002
바람직하게는, 상기 암은 AGR2(Anterior Gradient 2)가 과발현되는 암일 수 있으며, 보다 바람직하게는, 상기 AGR2가 과발현되는 암은 대장암, 유방암, 췌장암, 전립선암, 위암, 식도암, 간암, 폐암 또는 결장암일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 조성물은 AGR2 동량체화(homo-dimerization)를 억제할 수 있으며, 보다 바람직하게는, AGR2 모노머(monomer)의 E60, Y63 및 K64에 결합하여, AGR2 동량체화를 억제할 수 있다.
상기 약학적으로 허용가능한 염은 상기 약제학적으로 허용가능한 염은 염산염, 브롬산염, 황산염, 인산염, 질산염, 구연산염, 초산염, 젖산염, 주석산염, 말레산염, 글루콘산염, 숙신산염, 포름산염, 트리플루오로아세트산염, 옥살산염, 푸마르산염, 메탄술폰산염, 벤젠술폰산염, 파라톨루엔술폰산염, 캠퍼술폰산염, 나트륨염, 칼륨염, 리튬염, 칼슘염 및 마그네슘염으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 구체적인 화합물 명칭은 5-(1H-이미다졸-2-일메틸)-8-메톡시-2-[2-(트리플루오로메틸)페닐]-2,3,4,5-테트라하이드로-1,5-벤조티아제핀)[5-(1H-imidazol-2-ylmethyl)-8-methoxy-2-[2-(trifluoromethyl)phenyl]-2,3,4,5-tetrahydro-1,5-benzothiazepine)]이고, 본 명세서에서 "Hit compound 5"로 기재한 화합물은 상기 화합물을 의미한다.
본 발명의 약학 조성물 또는 복합 제제는 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등의 가용화제를 사용할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 투여를 위해서 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1 종 이상 포함하여 약학 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 약제 제제 형태는 과립제, 산제, 피복정, 정제, 캡슐제, 좌제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 및 활성 화합물의 서방출형 제제 등이 될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 유효성분의 유효량은 질환의 예방 또는 치료 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽 또는 음료의 형태로 제공될 수 있으며, 상기 건강기능식품 조성물은 유효성분 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적 예를 들어 예방, 건강 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
상기 건강기능식품 조성물에 함유된 유효성분의 유효용량은 상기 약학조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.
상기 건강식품의 종류에는 특별한 제한이 없고, 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있다.
본 발명에 따른 조성물에서 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 조성물 전체에 대해서 0.001 ~ 30.0 중량% 함유하며, 상기 함량을 벗어나면 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 암 예방, 개선 또는 치료 등의 약리효과가 나타나지 않거나 함유량 증가에 대한 효과 증대 정도가 미미하며, 제형상의 안전 및 안정성에 문제가 있으며 경제적이지도 못하다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 시험관 내(in vitro) AGR2 동량체화 억제용 시약 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 시험관 내에서(in vitro) 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 암세포에 처리하는 단계를 포함하는 AGR2 동량체화 억제 방법을 제공한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
< 실시예 1> AGR2 동량체화(homo-dimerization)를 억제하는 저분자 화합물 탐색을 위한 가상(virtual) 스크리닝 및 바이오에세이 시스템
AGR2는 60번 글루탐산 (E60), 63번 타이로신 (Y63) 및 64번 라이신 (K64)의 세 종류의 아미노산들이 상호결합을 통해 역평행하게(antiparallel) 동량체화한다는 논문(Patel et al., J. Mol. Biol. (2013) 5:929-943)을 기반으로, 모노머 AGR2의 세 종류의 아미노산들(E60, Y63, K64)에 결합하는 저분자 화합물들을 Zinc database의 화합물 라이브러리(10,292,210개 화합물)를 활용하여 가상(virtual) 스크리닝을 실시하였으며, 최종 스크리닝을 통해 23종류의 후보화합물을 선별하였다(도 1).
선별된 23개의 화합물들의 활성을 측정하기 위해 바이오에세이 시스템을 구축하였다. NanoBit 단백질-단백질 상호작용(NanoBit protein-protein interaction; NanoBit PPI) 시스템을 활용해 AGR2 동량체화를 정량화할 수 있는 최적 조합을 검토한 결과, AGR2의 C-말단에 NanoBiT 단백질이 융합되었을 때 최적 동량체 활성을 보였고, 이 결과를 토대로 유전공학적 방법을 통해 AGR2의 C-말단에 NanoBit 단백질과 펩타이드가 각각 융합된 AGR2를 안정적으로 발현하는 HEK293 세포주(HEK293/pNanoBit-AGR2)를 제작하였다(도 2). 이 세포주는 AGR2를 타겟팅하는 화합물을 HTS로 스크리닝하는데 활용될 수 있다.
< 실시예 2> Hit compound 5의 AGR2 동량체화 억제 효과
AGR2의 동량체화가 세 종류의 아미노산들(E60, Y63, K64) 의존적 상호분자 간 결합임을 확인하기 위해 확립된 NanoBit PPI 시스템을 이용해 AGR2 3M (E60A, Y63A 및 K64A) 돌연변이형 AGR2는 야생형 AGR2와 비교해 동량체를 형성하지 못함을 확인하였다(도 3A).
NanoBiT-AGR2 융합 단백질을 안정적으로 발현하는 HEK293 세포주(HEK293/pNanoBit-AGR2)를 이용해 최종 선별한 23개의 화합물의 AGR2 동량체화를 억제하는 효과를 조사하였고 그 중, 억제효과가 가장 뛰어난 5번 화합물을 발굴하였고(도 3B), 농도 의존적으로 AGR2 동량체화를 억제함을 확인하였다(도 3C).
Hit compound 5가 AGR2 모노머(monomer)의 세 종류의 아미노산(E60, Y63, K64)과 안정적으로 결합하는 것을 확인 하였다(도 3D).
Hit compound 5가 AGR2의 동량체화를 억제하는 것을 생화학적으로 확인하기위해, Hit compound 5로 전처리한 인간 대장암 세포주 DLD1에 세포내 화학적 가교제(chemical crosslinker)인 디숙신이미딜 수베르산(Discuccinimidyl suberate; DSS)를 처리한 후, DLD1 세포추출물을 항 AGR2 항체를 이용해 웨스턴 블랏팅을 수행하였다. 그 결과, 도 3E에 나타낸 바와 같이, DMSO와 비교해 hit compound 5가 AGR2의 이량체(dimer) 형성을 억제하는 것을 확인하였다. 또한, FLAG와 MYC로 태그된 AGR2 야생형 단백질을 HEK293T 세포에서 공발현 시키고, hit compound 5를 처리한 후, 상기 세포추출물을 항 FLAG M2 친화성(affinity) 젤(gel)로 면역침강 후 항 MYC 항체로 웨스턴 블랏팅을 수행한 결과, hit compound 5는 AGR2 상호 간의 결합을 억제하였다(도 3F). 인간 종양에서 hit compound 5의 효능을 조사하기 위해 종양의 스페로이드 형성능을 이용하였다. 구체적으로 인간 대장암 세포주 DLD1 세포(1.5×103 세포/웰)를 0, 5, 10, 15 μM 농도로 hit compound 5를 3일에 한번씩 처리하면서 15일간 배양한 후 스페로이드의 크기 및 수를 계산하였다. 그 결과, hit compound 5는 농도 의존적으로 인간 대장암세포 DLD1의 스페로이드 형성을 억제하였다(도 3G).
< 실시예 3> Hit compound 5의 in vivo 항암효능 평가
DLD1/Luc 세포 5×106 개를 8주령 Balb/c nude mice 등의 복강에 이식하고 이틀 후부터, hit compound 5 화합물을 100 mg/kg, 농도로 주 3회 주사하여 총 14회 주사하였다. 실험 종료 후 종양을 분리하여 무게를 측정하였다. 실험동물의 체중 및 종양 크기는 매주 측정하였다.
AGR2의 발현이 높은 DLD1/Luc 세포를 쥐에 이식(xenograft)한 후, hit compound 5 화합물을 100 mg/kg으로 투여한 결과, hit compound 5 화합물은 암세포의 성장을 억제하는 것을 알 수 있었다(도 4). 한편, 이러한 종양 억제효과는 종양의 무게에서도 동일하게 확인되었다(도 5). 실험 진행과정 동안에 쥐의 체중에는 아무런 영향이 없었다(도 5).
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (8)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
    [화학식 1]
    Figure pat00003
  2. 제1항에 있어서, 상기 암은 AGR2(Anterior Gradient 2)가 과발현되는 암인 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 AGR2가 과발현되는 암은 대장암, 유방암, 췌장암, 전립선암, 위암, 식도암, 간암, 폐암 또는 결장암인 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 AGR2 동량체화(homo-dimerization)를 억제하는 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 조성물은 AGR2 모노머(monomer)의 E60, Y63 및 K64에 결합하여, AGR2 동량체화를 억제하는 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  6. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
    [화학식 1]
    Figure pat00004
  7. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 시험관 내(in vitro) AGR2 동량체화 억제용 시약 조성물.
    [화학식 1]
    Figure pat00005
  8. 시험관 내에서(in vitro) 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 암세포에 처리하는 단계를 포함하는 AGR2 동량체화 억제 방법.
    [화학식 1]
    Figure pat00006
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KR20020008407A (ko) * 1999-05-19 2002-01-30 가네꼬 노보루 1,4-벤조티아제핀유도체의 항암제 내성극복용의약으로서의 용도
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