KR20220014474A - 수축이 감소된 인공 피부 모델 제조용 바이오 잉크 조성물 및 이를 사용한 인공 피부 모델의 제조 방법 - Google Patents

수축이 감소된 인공 피부 모델 제조용 바이오 잉크 조성물 및 이를 사용한 인공 피부 모델의 제조 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20220014474A
KR20220014474A KR1020200094038A KR20200094038A KR20220014474A KR 20220014474 A KR20220014474 A KR 20220014474A KR 1020200094038 A KR1020200094038 A KR 1020200094038A KR 20200094038 A KR20200094038 A KR 20200094038A KR 20220014474 A KR20220014474 A KR 20220014474A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
artificial skin
skin model
tgf
bio
artificial
Prior art date
Application number
KR1020200094038A
Other languages
English (en)
Inventor
김미정
장일호
Original Assignee
주식회사 티앤알바이오팹
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 티앤알바이오팹 filed Critical 주식회사 티앤알바이오팹
Priority to KR1020200094038A priority Critical patent/KR20220014474A/ko
Publication of KR20220014474A publication Critical patent/KR20220014474A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09D—COATING COMPOSITIONS, e.g. PAINTS, VARNISHES OR LACQUERS; FILLING PASTES; CHEMICAL PAINT OR INK REMOVERS; INKS; CORRECTING FLUIDS; WOODSTAINS; PASTES OR SOLIDS FOR COLOURING OR PRINTING; USE OF MATERIALS THEREFOR
    • C09D11/00—Inks
    • C09D11/02—Printing inks
    • C09D11/04—Printing inks based on proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
    • A61L27/24—Collagen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3886—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells comprising two or more cell types
    • A61L27/3891—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells comprising two or more cell types as distinct cell layers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/54—Biologically active materials, e.g. therapeutic substances
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/60—Materials for use in artificial skin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0625—Epidermal cells, skin cells; Cells of the oral mucosa
    • C12N5/0629—Keratinocytes; Whole skin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0697—Artificial constructs associating cells of different lineages, e.g. tissue equivalents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0697—Artificial constructs associating cells of different lineages, e.g. tissue equivalents
    • C12N5/0698—Skin equivalents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1307—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from adult fibroblasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/54—Collagen; Gelatin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)

Abstract

본 발명은 배양 과정에서 발생하는 수축 현상이 감소된 인공 피부 모델을 제조할 수 있는 바이오 잉크 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 인공 피부 모델의 진피층을 형성하는데 사용되는 바이오 잉크 조성물 내에 TGF-β 신호전달 저해제(inhibitor)가 포함됨으로써, 수축 현상이 감소된 인공 피부 모델을 제공하기 위한 것이다. 본 발명의 TGF-β 신호전달 저해제(inhibitor)를 포함하는 바이오잉크를 사용한 인공 피부는 체외에서 장기간 배양이 가능하다. 또한, 본 발명은, 상기 바이오잉크를 사용함으로써 세포분화 및 콜라겐 수축이 방지되며 품질이 균일한 인공 피부 모델을 제조할 수 있다.

Description

수축이 감소된 인공 피부 모델 제조용 바이오 잉크 조성물 및 이를 사용한 인공 피부 모델의 제조 방법{A bio-ink composition for artificial skin model with reduced shrinkage and a preparation method of artificial skin model therewith}
본 발명은 배양 과정에서 발생하는 수축 현상이 감소된 인공 피부 모델을 제조할 수 있는 바이오 잉크 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 인공 피부 모델의 진피층을 형성하는데 사용되는 바이오 잉크 조성물 내에 TGF-β 신호전달 저해제(inhibitor)가 포함됨으로써, 수축 현상이 감소된 인공 피부 모델을 제공하기 위한 것이다.
인공조직은 세포를 체내에서 분리하여 배양한 후, 배양된 세포에 콜라겐 등의 천연 고분자를 추가하여 체외에서 조직화시킨 것으로, 체외에서의 물질 독성 평가 및 이식 등에 사용된다.
인공조직 중 하나인 인공피부(artificial skin)는 피부세포와 피부 구성물질인 콜라겐, 엘라스틴 등을 이용하여 3차원적으로 상기와 같은 피부를 재구성한 것으로서, 살아있는 섬유아세포(fibroblast)와 각질형성세포(keratinocyte)로 구성되어 실제 피부와 유사한 구조적, 기능적 특성을 나타내기 때문에 피부 모사체(skin equivalent 또는 reconstructed skin)라고도 불린다.
이러한 인공피부는 주로 피부와 탄력, 강도, 물질 투과 등에 있어 비슷한 물성을 나타내는 고분자 복합체이나, 피부에서 일어나는 생명현상을 나타내지 않는다는 점에서 차이점이 있다. 인공피부는 화상, 외상 등 손상을 입은 피부의 대체(영구생착형) 또는 재생(일시 피복형)을 위해 이용될 뿐만 아니라, 피부 생리연구, 피부 자극 평가, 피부 효능평가 등 다양한 영역에서 이용되고 있다.
인체의 피부조직은 크게 세 부분으로 나뉘는데, 피부의 가장 바깥쪽을 이루는 표피층과 그 아래층의 진피층, 그리고 피하조직으로 이루어진다. 이 중 표피층은 표피층과 진피층이 단단하게 결합할 수 있도록 하는 기저막(basement membrane)으로부터 여러 층으로 분화된 상피세포와 그 밖에 멜라닌세포, 면역세포로 이루어지며, 표피층 아래의 진피층은 주로 섬유아세포(fibroblast)와 이 세포가 분비한 여러 세포외기질(extracellular matrix)로 이루어진다.
인체에서 가장 많은 부분을 차지하고 있는 결합조직(connective tissue)은 세포가 만들어낸 섬유를 주로 가진 조직으로, 세포나 기관 사이 등에 위치하며 콜라겐, 엘라스틴 등을 분비하는 섬유아세포가 결합조직의 주세포이다. 진피층의 90%를 차지하는 주요 단백질인 콜라겐은, 결합 조직을 유지하고, 피부에 탄력을 제공한다.
인공피부를 만들기 위해 체외에서 섬유아세포(fibroblast)를 배양할 경우, 섬유아세포가 분비하는 TGF-β로 인해 섬유아세포가 섬유아세포 표현형(phenotype fibroblast) 또는 근섬유모세포(myofibroblast)로 분화하게 되고, 이러한 근섬유모세포(myofibroblast)의 수축 기능으로 인해, 체외에서 제작된 인공피부가 수축되어 균일한 인공피부를 제작할 수 없는 문제점이 존재한다.
등록특허 제10-1964053호
본 발명은, 이러한 종래 기술의 문제점을 해결하기 위해, 인공 피부 모델을 제작하는데 사용되는 바이오 잉크 내에 TGF-β 신호전달 저해제(inhibitor)를 추가함으로써, 이를 사용하여 제조된 인공 피부 모델의 수축을 방지함으로써, 수축 현상이 감소된 인공 피부 모델을 제공하고자 한다.
본 발명의 일 실시 형태로, TGF-β 신호전달 저해제(inhibitor), 섬유아세포 및 콜라겐을 포함하는 인공 피부 모델 제조용 바이오 잉크를 들 수 있다.
이러한 인공 피부 모델 제조용 바이오 잉크에는, TGF-β 신호전달 저해제가, 1㎍/㎖이상 10㎍/㎖미만의 농도로 포함되고, 섬유아세포가 1×106 cells/ml의 농도로 포함되며, 콜라겐이, 0.5~5wt%의 농도로 포함될 수 있다.
상기 TGF-β 신호전달 저해제로, 하기의 화학식 1로 표시되는 화합물이 사용되는 것이 바람직하며, 바이오 잉크 내에 약 1~10㎍/㎖의 농도, 바람직하게는 약 2~4㎍/㎖, 더욱 바람직하게는 약 3㎍/㎖의 농도로 포함될 수 있다.
Figure pat00001
(화학식 1)
본 발명의 다른 실시 형태로, 이러한 바이오 잉크를 사용하여 인공 피부 모델을 제조하는 방법을 들 수 있는데, 상기 인공 피부 모델 제조용 바이오 잉크를 사용하여 인공 진피층을 형성하는 단계; 및 상기 인공 진피층의 위로 표피층을 추가로 형성하는 단계;를 포함한다.
이때 표피층에는, 5 x 105 cell/ml의 각질형성세포(keratinocyte)가 포함되는 것이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 실시 형태로, 이러한 방법으로 제조된 수축이 감소된 인공 피부 모델을 포함된다.
본 발명에 따른 인공 피부의 제조 방법에 따라 제조된 인공 피부 모델은, TGF-β 신호전달 저해제(inhibitor)를 포함하는 바이오잉크를 사용하여 제조됨으로써, 체외에서 장기간 동안 균일한 배양이 가능하다.
또한, TGF-β 신호전달 저해제(inhibitor), 섬유아세포(fibroblast) 및 콜라겐을 포함하는 바이오 잉크를 사용함으로써, 제조된 인공 피부 모델 내의 세포 분화 및 콜라겐 수축이 방지되어, 품질이 균일한 인공 피부 모델을 제조할 수 있다.
본 발명의 효과들은 이상에서 언급한 효과들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 아래의 기재로부터 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 배양한 섬유아세포(fibroblast)에 Live/Dead assay를 실시한 결과이다.
도 2는 본 발명에 따른 바이오잉크를 사용하여 제작한 인공진피를 관찰한 결과이다.
도 3은 본 발명에 따른 바이오잉크를 사용하여 제작한 인공 피부 모델을 관찰한 결과이다.
이하에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 통해 상세히 설명하기에 앞서, 본 명세서의 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정하여 해석되어서는 아니 되며, 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야 함을 밝혀둔다.
본 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 인공 피부 모델 제조용 바이오 잉크는, TGF-β 신호전달 저해제(inhibitor), 섬유아세포(fibroblast) 및 콜라겐을 포함한다.
이때, 상기 인공 피부 모델 제조용 바이오 잉크에 포함되는 콜라겐은, 0.5 내지 5wt%, 바람직하게는 4.5wt%의 농도로 포함될 수 있다. 상기 콜라겐 농도가 5wt%를 초과하면 제조되는 인공 피부와 인간 피부의 유사도가 지나치게 감소하여 인공 피부 모델로 적합하지 않고, 농도가 0.5wt%보다 낮은 경우에는 구조유지 기능을 담당하는 콜라겐의 함량이 부족하여 수축현상이 더 빠르게 일어날 뿐만 아니라 수축 정도도 더 크기 때문에 균일한 인공피부모델을 제작하기에 적합하지 않다는 문제점이 존재한다.
좀 더 구체적으로, 4.5wt% 농도의 콜라겐 용액과 세포의 농도가 1 x 106cells/ml인 인간 진피 유래 섬유아세포(human dermal fibroblasts)가 혼합된 것일 수 있다.
상기 TGF-β(전환성장인자-β, Transforming growth factor-β)는 생체내에서 세포의 증식, 분화, 세포사멸, 이동, 세포외기질(ECM)의 생산, 혈관형성, 발생 등 다양한 생리적 과정을 조절하는 사이토카인이다.
활성형의 TGF-β는 25kDa의 다이머 형태로 존재하며, 세포에서 분비된 TGF-β는 세포막의 타입 I 및 타입 II 수용체로 구성된 두 가지 타입의 수용체의 이종 복합체와 결합하여 Smad 계열을 통한 신호전달을 개시한다.
TGF-β가 항시 활성적인 type Ⅱ 수용체에 결합하게 되면 type Ⅰ 수용체는 이를 인식하여 type Ⅱ 수용체에 결합을 하게 되는데, 이때 type Ⅱ 수용체가 type Ⅰ 수용체의 GS부위를 인산화 시키면 type Ⅰ 수용체의 kinase가 활성화(TGFβ-R1)된다.
TGF-β의 신호전달에 있어서 세포 외의 신호를 핵 내까지 전달하는 매개체 역할을 하는 것이 Smad라고 하는 전사인자인데, 활성화된 TGFβ-R1은 수용체와 관련된 공동 전사 인자인 Smad2/Smad3를 인산화시킴으로써 활성화시키고, 활성화된 Smad2/Smad3 전사 인자는 세포질 내의 Smad4에 결합하여 Smad 복합체를 형성한다.
상기 Smad 복합체는 핵으로 전위되어 DNA-결합 보조인자와 결합하고, 특정 유전자들의 인핸서 및 억제인자 영역에 결합하여 전사를 조절함으로써 다양한 유전자의 발현을 조절한다. 이들 유전자가 발현되면 증식반응을 제어하는 세포주기 조절인자, 또는 외부-내부(out-in) 세포 신호전달, 세포 부착, 이동 및 세포내 상호교통을 매개하는 세포외 매트릭스 단백질의 합성이 유도된다. MAP 키나제-ERK 연쇄증폭반응(cascade)과 같은 기타신호전달 경로 역시 TGF-β 신호전달에 의해 활성화된다.
또한, 상기 TGF-β는 정상세포를 형질전환세포로의 증식을 촉진하여 연골 생성을 유도하며 콜라겐 등 세포외기질의 생성도 촉진시키는 작용을 한다.
이러한 TGF-β의 신호전달을 억제하는 물질을 TGF-β 신호전달 저해제(inhibitor)라고 하며, SB525334, SB505124, SB431542, LY2157299, LY2109761, GW788388, RepSox, A 77-01, SD-208 등이 있다.
한편, 체외에서 섬유아세포(fibroblast)를 배양하는 경우, 섬유아세포(fibroblast)가 분비하는 TGF-β로 인해 상기 섬유아세포(fibroblast)의 분화가 촉진되거나 섬유아세포의 섬유화 과정이 진행될 수 있다. 분화된 섬유아세포로부터 분비되거나, 섬유아세포(fibroblast)의 섬유화 과정에서 분비된 알파 평활근 액틴(α-SMA, alpha smooth muscle actin)으로 인해 ECM(세포외기질)을 분해하는 효소 유전자들이 비활성화될 뿐만 아니라 ECM에 포함된 콜라겐이 수축될 수 있고, 이러한 수축은 섬유아세포를 배양하여 제작되는 인공 피부 모델의 수축을 유발한다는 문제가 있다.
구체적으로, 섬유아세포가 분비하는 TGF-β로 인해 섬유아세포가 섬유아세포 표현형(phenotype fibroblast) 또는 근섬유모세포(myofibroblast)로 분화될 수 있다. 상기 근섬유모세포(myofibroblast)는 섬유아세포(fibroblast)와 평활근 세포의 중간 형태로 여겨지며 수축기능을 갖고, 상기 근섬유모세포(myofibroblast)는 TGF-β 등에 의해 평활근 세포 표현형으로 분화한다고 알려져 있다.
상기 근섬유모세포(myofibroblast)는 건강한 조직에는 거의 존재하지 않지만, 상처 부위 조직에 상주하는 섬유아세포(resident fibroblast)와 혈관의 원주 상피세포(pericyte)의 중간엽 세포들이 전구 세포로부터 분화되면서 활성화된다. 이러한 근섬유모세포(myofibroblast)의 활성화에는, 손상된 상피, 내피, 골수 유래 섬유소 세포, 면역세포 등에서 분비되는 TGF-β, TNF-α, IL-1, IL-6, PDGF, IL-17A와 IL-13등의 성장인자와 사이토카인 등이 관여한다.
또한, 상기 근섬유모세포는, 섬유성 1,3형 콜라겐으로 이루어진 세포 외 기질의 조직 내 축적을 야기하며, 근섬유모세포 세포 내에서 알파 평활근 액틴(α-SMA)이 발현되고, ECM(세포외기질)을 분해하는 효소 유전자들이 비활성화될 뿐만 아니라 ECM에 포함된 콜라겐의 수축도 발생시킨다.
아울러, 체외에서 섬유아세포(fibroblast)를 배양하는 경우, 세포에서 TGF-β가 분비되어 상기 섬유화 과정이 진행될 수 있다. 배양환경, 외부적인 요인 그리고 다양한 생물학적 원인으로 인해 섬유아세포(fibroblast)의 섬유화가 진행되면, 수 많은 사이토카인이 분비되고, 사이토카인 중 TGF-β가 증가함에 따라 α-SMA가 증가된다. 상기 α-SMA는 근육섬유화의 지표마커로 알려져있는 액틴 단백질이며, 상기 액틴이란 세포골격을 구성하는 섬유인 마이크로필라멘트를 형성하는 구형의 다기능성 단백질 계열을 의미한다. 상기 α-SMA이 증가하면, 세포 퍼짐(cell spreading), 세포 응집(cell aggregation) 등이 일어나면서 ECM에 포함된 콜라겐의 수축이 일어나고, 세포 사멸(cell death)도 발생할 수 있다.
본 발명에 따른 바이오 잉크에는 상기와 같은 섬유아세포(fibroblast)의 분화 또는 섬유화 및 이에 따른 콜라겐 수축을 방지하기 위해 TGF-β 신호전달 저해제(inhibitor)를 포함하는데, 바람직하게는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 TGF-β 신호전달 저해제(inhibitor)로 사용하는 것이 바람직하다.
Figure pat00002
(화학식 1)
상기 화학식 1로 표시되는 화합물은, 본 발명에 따른 바이오 잉크 내에 약 1~10 ㎍/㎖의 농도로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 약 3~5 ㎍/㎖, 더욱 바람직하게는 약 3㎍/㎖의 농도로 포함될 수 있다.
본 발명에서는 콜라겐 환경에서 배양된 섬유아세포(fibroblast)에 대해 Live/Dead assay를 실시하여, 섬유아세포(fibroblast)의 세포 퍼짐(cell spreading) 및 Dead cell의 비율이 현저하게 낮아짐을 확인하였고, 그 결과는 도 1에 나타내었다.
[ 제조예 1]
sponge type의 4.5wt%의 콜라겐을 0.001N HCl에 3일 동안 4℃에서 재수화시켰다. NaHCO3(2.2g), HEPES(Hydroxyethyl piperazine Ethane Sulfonicacid) 200mM (4.77g), 0.05M NaOH(0.2g)을 100ml의 멸균된 물에 넣어 중성화 용액을 제조하였다. 재수화시킨 용액, 중성화 용액 및 10X MEM(Minimum Essential Medium)을 8:1:1의 중량비로 혼합하여 콜라겐 혼합물을 제조한 후, pH 7.4로 적정하였다.
pH가 조절된 콜라겐 혼합물과 1 x 106cells/ml 농도의 섬유아세포(fibroblast)를 혼합하거나(비교예), 상기 콜라겐 혼합물과 상기 농도의 섬유아세포(fibroblast) 및 TGF-β 신호전달 저해제(inhibitor)를 혼합하고(실시예) 각각 10일간 배양하여 인공진피를 제작하였다.
상기 TGF-β 신호전달 저해제(inhibitor)로는, 하기의 화학식 1의 구조를 갖는 화합물을 사용하였다.
Figure pat00003
(화학식 1)
TGF-β 신호전달 저해제(inhibitor)를 포함하지 않는 콜라겐 환경에서 배양된 비교예의 경우, Dead cell이 62%, 세포 퍼짐(cell spreading)이 28%만큼 존재하였다.
반면 상기 TGF-β 신호전달 저해제(inhibitor)를 포함하는 콜라겐 혼합물의 경우에는, 배양된 섬유아세포(fibroblast)의 Dead cell 비율이 48~54%, 세포 퍼짐(cell spreading)이 7~14%로 확인되었으며, 이는 세포 퍼짐(cell spreading)의 발생률 및 세포 사멸(cell death)의 가능성이 현저하게 낮아짐을 의미한다.
[ 제조예 2]
제조예 1과 동일한 방법으로 비교예와 실시예를 제작한 후, 각각 배양하여 제조된 인공 진피층에, 5 x 105 cell/ml의 각질형성세포(keratinocyte)를 포함하는 keratinocyte 세포 현탁액 250μL를 분주함으로써 표피층을 제작하였다.
각질형성세포들이 분주된 인공 진피층을, 겔화시킨 매트릭스 위로 위치시킨 후, 상기. 인공 진피층이 약 24시간동안 배양액(LONZA, FGM-2 BulletKit, CC-3131 & CC-4126)에 잠겨진 상태로, 인공진피층에 포함된 섬유아세포를 배양하였다.
공기 중에 노출시키는 과정(ALI, air liquid interface) 중에서, 매트릭스와 인공 진피층의 일부만 배양액 내에 잠기고, 각질형성세포가 분주 된 영역은 공기 중으로 노출되도록 하였다. 피부조직의 경우, 각질형성세포는 배양액에 잠기지 않고 공기 중에 노출시켜야 분화가 되는 특성이 있기 때문에 공기 중에 노출시키는 과정(air liquid interface, ALI)이 필요하고, 약 7~14일 동안, 바람직하게는 10일 동안 공기 중에 노출시킬 수 있다.
ALI 배양과 동시에 배양액에 1.8mM의 CaCl2를 넣고 이온채널로 각질형성세포를 분화시켰다. 3일에 한 번 배양액을 교체하고 10일간 세포분화를 유도하였으며, 상기 세포분화로 인해 기저층부터 가시층, 과립층, 각질층 등 대표적인 피부층으로 계층적 분화가 진행된 인공 피부 모델이 제조되었다. 이때, 배양기간이 10일로 제한되는 것은 아니며, 이는 배양목적 또는 배양환경 등에 따라 적절하게 조절될 수 있다.
본 발명의 일 실시에 따르면 상기와 같이 제조된 인공 피부 모델은, 섬유아세포(fibroblast) 분화에 따른 콜라겐 수축이 방지되어 균일한 품질을 갖는 것으로 확인되었다.
이하에서는, 본 발명의 구체적인 실시예를 중심으로 설명하고자 한다. 그러나 본 발명의 범위가 이하의 실시예에만 한정되는 것은 아니며, 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위해 예시적으로 제시된 것일 뿐, 통상의 기술자라면 본 발명의 권리범위 내에서 본 명세서에 기재된 내용의 여러 가지 변형된 형태를 실시할 수 있음을 밝혀두고자 한다.
[실험예 1]
TGF-β 신호전달 저해제(inhibitor)의 존재 여부에 따라 섬유아세포(fibroblast)의 분화 정도를 확인하기 위해, 제조예 1에 따른 콜라겐 혼합물과 섬유아세포(fibroblast)를 혼합한 후 배양하였다.
TGF-β 신호전달 저해제(inhibitor)의 유/무에 따라 배양된 섬유아세포(fibroblast)의 Live/Dead assay를 실시한 결과(배양기간 10일)는 도 1과 같으며, 구체적인 실험 결과를 표 1에 정리하였다.
이때 사용된 섬유아세포의 농도는 1 x 106 cells/ml이고, 콜라겐은 4.5wt%를 사용하였다.
TGF-β 신호전달 저해제[㎍/㎖] Dead cell 비율
(%)		 Spreading cell 비율
(%)
- 62 28
1 54 14
3 48 7
상기 표 1에서 확인되듯이, TGF-β 신호전달 저해제(inhibitor)를 포함하지 않는 경우, 배양된 섬유아세포(fibroblast)의 Dead cell 비율이 62%, 세포 퍼짐(cell spreading) 비율은 28%로 가장 높았다. 반면, 1㎍/㎖의 TGF-β 신호전달 저해제가 포함된 바이오잉크를 사용하여 배양된 섬유아세포(fibroblast)의 경우, Dead cell 비율이 54%로, 세포 퍼짐(cell spreading) 비율은 14%로 나타났고, 3㎍/㎖의 TGF-β 신호전달 저해제가 포함된 바이오 잉크를 사용하여 배양된 섬유아세포의 경우에는 Dead cell 비율은 48%로, 세포 퍼짐(cell spreading) 비율은 7%로 줄어드는 것이 확인되었다.
따라서 TGF-β 신호전달 저해제(inhibitor)를 포함함으로써 세포 퍼짐(cell spreading) 또는 세포 사멸(cell death)의 가능성이 현저히 낮아짐을 확인하였다.
[실험예 2]
수축을 방지하는 TGF-β 신호전달 저해제(inhibitor)의 가장 바람직한 농도를 확인하기 위해, 하기의 표 2와 같은 농도의 TGF-β 신호전달 저해제를 포함하는 바이오잉크(섬유아세포의 농도 1 x 106 cells/ml, 콜라겐 4.5wt%)를 사용하여 제조예 1과 동일하게 인공진피를 제작하였으며, 이후 제조예 2에 따라 인공 피부 모델을 제조하였다.
상기 인공 피부 모델의 진피 직경을 측정한 결과는 도 2와 같으며, 구체적인 직경의 측정 결과를 하기의 표 2로 정리하였다. 이러한 진피 직경 측정값(제작된 인공 피부 모델의 초기 직경 = 6.4mm)은 조성 별로 각각 3개의 인공 피부를 제조하여 확인된 평균값이다.
TGF-β 신호전달 저해제
[㎍/㎖]		 제작된 인공 피부의 진피 직경(단위 mm)
1일 후 10일 후
- 3.70 3.20
1 3.71 3.48
2 3.85 3.51
3 5.03 4.88
4 4.21 3.70
5 4.67 3.74
7 4.91 3.15
10 5.07 3.05
상기 표 2에서 확인되듯이, 제조된 인공 피부 모델은 모두 초기 직경이 6.4mm였으며, TGF-β 신호전달 저해제(inhibitor)를 포함하지 않는 경우에는 10일 후 인공 피부의 진피 직경이 초기값의 절반인 3.2mm로 줄어들었다. 1㎍/㎖의 TGF-β 신호전달 저해제(inhibitor)가 포함되어 제조된 인공 피부의 진피 직경 측정 결과도 이와 비슷하여, 인공 피부의 수축 방지 효과가 크지 않은 것으로 확인되었다. 반면, 10㎍/㎖의 TGF-β 신호전달 저해제(inhibitor)가 포함된 인공 피부의 경우, 1일 후 진피 직경이 5.07mm로 측정되어 초기에는 수축 방지 효과가 뛰어났으나, 10일 후 진피 직경이 3.05mm로 줄어들어 인공 피부를 장기간 배양하는 경우에는 더 이상 수축 방지 효과가 없는 것으로 확인되었다.
TGF-β 신호전달 저해제(inhibitor)가 5㎍/㎖ 포함된 인공 피부도 수축 방지 효과는 있었으나, 3㎍/㎖의 TGF-β 신호전달 저해제(inhibitor)가 포함된 인공 피부의 진피 직경이 가장 적게 줄어들었으므로, 수축을 방지하는 인공 피부 모델 제조용 바이오 잉크에 포함되는 TGF-β 신호전달 저해제(inhibitor)의 가장 바람직한 농도는 3㎍/㎖임을 확인하였다.
[실험예 3]
TGF-β 신호전달 저해제(inhibitor)를 포함하지 않는 경우(TGF-β inhibitor (-))와 TGF-β 신호전달 저해제(inhibitor)가 하기의 표 3에 기재된 농도로 사용된 진피층을 포함하는 인공 피부 모델의 각각에 대해서, 10일 후의 최종 직경 값에 대한 표준 편차를 각각 측정한 결과를 하기의 표 3과 같이 정리하였다. 보다 정확한 직경값 측정을 위해 실험예 2에 비해 더 크게 시료를 제작하였으며(인공 피부 모델의 초기 직경 = 8.5mm), 섬유아세포의 농도는 1 x 106 cells/ml, 콜라겐 4.5wt%을 사용하여 제조예 1 및 2에 따라 실시하였다.
도 3과 같이 TGF-β 신호전달 저해제가 포함된 시료의 경우, 10일 이후에도 가장 균일한 직경 분포를 갖고 있음을 알 수 있었다.
TGF-β 신호전달 저해제
[㎍/㎖]		 10일 후 인공 피부의 10일 후 진피 직경 표준편차
[%]
- 8.2
1㎍/㎖ 5.3
3㎍/㎖ 3.8
5㎍/㎖ 3.9
10㎍/㎖ 7.2
상기 표 3에서 확인되듯이, 3㎍/㎖의 TGF-β 신호전달 저해제가 포함된 인공진피를 포함하는 인공 피부 모델이 가장 우수하고 균일한 수축 특성을 갖고 있음을 알 수 있다.

Claims (7)

  1. TGF-β 신호전달 저해제(inhibitor), 섬유아세포 및 콜라겐을 포함하는, 인공 피부 모델 제조용 바이오 잉크.
  2. 제1항에 있어서, 상기 인공 피부 모델 제조용 바이오잉크에는,
    TGF-β 신호전달 저해제가, 1㎍/㎖이상 10㎍/㎖미만의 농도로 포함되고,
    섬유아세포가, 1×106 cells/ml의 농도로 포함되며,
    콜라겐이, 0.5~5wt%의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는, 인공 피부 모델 제조용 바이오 잉크.
  3. 제1항에 있어서, 상기 TGF-β 신호전달 저해제는,
    하기의 화학식 1로 표시되는 것을 특징으로 하는, 인공 피부 모델 제조용 바이오 잉크.
    Figure pat00004
    (화학식 1)
  4. 바이오 잉크를 사용하여 인공 피부 모델을 제조하는 방법에 있어서,
    제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 인공 피부 모델 제조용 바이오 잉크를 사용하여 인공 진피층을 형성하는 단계; 및
    상기 인공 진피층의 위로 표피층을 추가로 형성하는 단계;를 포함하는, 수축이 감소된 인공 피부 모델의 제조 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 표피층은, 5 x 105 cell/ml의 각질형성세포(keratinocyte)가 포함되는 것을 특징으로 하는, 수축이 감소된 인공 피부 모델의 제조 방법.
  6. 제4항에 기재된 제조 방법으로 제조된 수축이 감소된 인공 피부 모델.
  7. 제5항에 기재된 제조 방법으로 제조된 수축이 감소된 인공 피부 모델.
KR1020200094038A 2020-07-28 2020-07-28 수축이 감소된 인공 피부 모델 제조용 바이오 잉크 조성물 및 이를 사용한 인공 피부 모델의 제조 방법 KR20220014474A (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200094038A KR20220014474A (ko) 2020-07-28 2020-07-28 수축이 감소된 인공 피부 모델 제조용 바이오 잉크 조성물 및 이를 사용한 인공 피부 모델의 제조 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200094038A KR20220014474A (ko) 2020-07-28 2020-07-28 수축이 감소된 인공 피부 모델 제조용 바이오 잉크 조성물 및 이를 사용한 인공 피부 모델의 제조 방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20220014474A true KR20220014474A (ko) 2022-02-07

Family

ID=80253227

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020200094038A KR20220014474A (ko) 2020-07-28 2020-07-28 수축이 감소된 인공 피부 모델 제조용 바이오 잉크 조성물 및 이를 사용한 인공 피부 모델의 제조 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR20220014474A (ko)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101964053B1 (ko) 2016-08-01 2019-08-01 주식회사 티앤알바이오팹 통합형 3차원 세포 프린팅 기술을 이용한 세포 배양체 및 이의 제조방법

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101964053B1 (ko) 2016-08-01 2019-08-01 주식회사 티앤알바이오팹 통합형 3차원 세포 프린팅 기술을 이용한 세포 배양체 및 이의 제조방법

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zhu et al. Modulation of macrophages by bioactive glass/sodium alginate hydrogel is crucial in skin regeneration enhancement
Schneider et al. The role of biomaterials in the direction of mesenchymal stem cell properties and extracellular matrix remodelling in dermal tissue engineering
Smola et al. Mutual induction of growth factor gene expression by epidermal-dermal cell interaction
Eisinger et al. Growth regulation of skin cells by epidermal cell-derived factors: implications for wound healing.
KR101566450B1 (ko) 중간엽 줄기세포에서 단백질의 대량 생산 방법
CA2349875A1 (en) Dna encoding a growth factor specific for epithelial cells
JP5651856B2 (ja) 人工皮膚の製造方法
AU2004253508A1 (en) Conditioned matrix compositions for tissue restoration
CN109789166A (zh) 营养因子释放剂及炎症疾病处置剂
Brennan et al. Biomimetic versus sintered macroporous calcium phosphate scaffolds enhanced bone regeneration and human mesenchymal stromal cell engraftment in calvarial defects
Liu et al. Differential effects of the PI3K/AKT pathway on antler stem cells for generation and regeneration of antlers in vitro
KR20220014474A (ko) 수축이 감소된 인공 피부 모델 제조용 바이오 잉크 조성물 및 이를 사용한 인공 피부 모델의 제조 방법
CN111836884B (zh) 源自干细胞的泪腺组织的制作方法
EP3766506A1 (en) Angiogenesis-inducing method using neural stem cell
CN109722410B (zh) 一种3d全层皮肤模型及用于其形成的培养基、制备方法
RU2342164C2 (ru) Эквивалент кожи и способ его получения
US20220195382A1 (en) A novel human-material-based platfom technology for tissue engineering
KR102563352B1 (ko) Il-17a를 이용하여 3차원 건선 피부 모델을 제조하는 방법
KR100536478B1 (ko) 인공장기 제조를 위한 생분해성 콜라겐 필름 및 그의제조방법
Agrez Human colon cancer and fibroblast cell lines cultured in and on collagen gels
US20220175847A1 (en) Salivary Gland Cell Sheets and Methods for their Production and Use
KR102250231B1 (ko) 심혈관 질환 예방 또는 치료용 조성물
KR20030041389A (ko) 조직재생을 위한 돼지의 소장점막하 조직의 제조와 응용방법
Liu et al. Artificial skin preparation using three-dimensional printing in vitro
KR20160022470A (ko) 조류 콜라겐을 포함하는 인공피부 및 이의 제조방법

Legal Events

Date Code Title Description
E601 Decision to refuse application