KR20220012840A - 경구 전달에 적합한 glp-1 및 gip 수용체에서의 공-작용제 - Google Patents

경구 전달에 적합한 glp-1 및 gip 수용체에서의 공-작용제 Download PDF

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Abstract

장기-작용성 유도체를 포함하여, 경구 전달에 적합한 인간 GLP-1 및 GIP 수용체의 펩티드 공-작용제, 및 비만, 당뇨병 및/또는 간 질환의 치료 및/또는 예방에 있어서의 이들의 의학적 용도가 기술된다.

Description

경구 전달에 적합한 GLP-1 및 GIP 수용체에서의 공-작용제
본 발명은 인간에게 경구 투여하기에 적합한, 연장된 작용 프로파일을 갖는 글루카곤-유사 펩티드 1(GLP-1) 수용체 및 포도당-의존적 인슐린 방출성 폴리펩티드(GIP) 수용체의 작용제인 신규 화합물에 관한 것이다.
서열 목록의 참조에 의한 통합
본 출원은 전자 형식의 서열 목록과 함께 출원된다. 서열 목록의 전체 내용은 참조로서 본원에 통합된다.
글루카곤-유사 펩티드 1(GLP-1)은 장내분비 세포 유래 호르몬이며, 두 가지의 탁월한 내인성 생리학적 인크레틴 중 하나이다. GLP-1은 영양소(포도당)에 반응하여 포도당 의존성 인슐린 분비를 자극함으로써 혈당 조절을 개선하고, 췌장 알파-세포로부터의 글루카곤 분비를 억제하고, 위 배출을 늦추고, 음식 소비를 감소시킴으로써 일차적인 체중 감소를 유도한다. 포도당-의존적 인슐린 방출성 폴리펩티드(GIP)는, 다른 탁월한 인크레틴으로서, 영양소(지방, 포도당)에 반응하여 인슐린 분비를 자극함으로써 혈당 조절을 개선한다. 또한, GIP는 혈장 지질 프로파일을 개선하고 뼈에서 칼슘 축적을 자극하는 것으로 보인다. GLP-1과 대조적으로, GIP의 인크레틴 효과는 제2형 당뇨병 환자에서 심각하게 감소되지만, 최근의 연구는 GIP 효율이 이들 환자에서 치료 후 회복될 수 있으며, 혈당 조절을 개선할 수 있음을 시사한다. 그럼에도 불구하고, 내분비 췌장에서의 직접적인 효과를 넘어 전신 대사를 조절하는 GIP의 역할은, 특히 동물 모델에서 체지방량의 증가를 촉진하는 GIP 작용과 관련이 있기 때문에 논쟁의 여지가 있다. 이러한 결과는 GIPR 길항작용이 체중을 개선시킬 수 있다는 믿음을 조장시켰다. 따라서, 체중을 개선하기 위한 전략으로서, GIP 수용체에서 작용하는 화합물, 특히, 작용 또는 길항의 여부는 여전히 집중적인 과학적 조사의 논쟁의 대상이다(Finan 등, TRENDS Mol Med, 2016, 22(5): 359-376; Killion 등, Endo Rev, 2020, 41(1): 1-21).
장기화된 GIP 유사체는 체중을 낮추고 혈당 조절을 개선하는 것으로 나타났지만, 설치류 모델에서 GLP-1 유사체보다 체중을 낮추는 데 상대적으로 덜 강력하다(Mroz 등, Mol Metab, 2019, 20: 51-62). 또한, GIP 유사체는 이중 투여에서 GLP-1 유사체를 이용한 부가적/상동적 작용에 의해 체중 감소를 유도하며(Finan 등, Sci Transl Med, 2013, 5(209): 209ra151; Nørregaard 등, Diabes Obes Metab, 2018, 20(1): 60-68), 따라서 GLP-1-기반 약리학의 증폭에 적합한 후보를 나타낸다. GIPR 작용은 전임상 동물 모델에서 나타난 바와 같이, 가장 두드러진 체중 감소 및 혈당 조절인, GLP-1 대사 효과를 증폭시키는 단일 분자 공-작용제로서, GLP-1R 작용에 대한 중복되지 않은 파트너로서 모집될 수 있다(Finan 등, Sci Transl Med, 2013, 5(209): 209ra151; Coskun 등, Mol Metab, 2018, 18:3-14). 고효능 이중 인크레틴 수용체 작용을 갖는 두 가지 상이한 펩티드는 다중 투여량 임상 연구로 진행되었다. 임상 결과는 벤치마크 GLP-1 특이적 작용제과 유사한 투여량으로 달성된 것을 초과하는 혈당 조절 및 체중의 개선을 입증하였으며(Frias 등, Cell Metab, 2017, 26(2): 343-352; Frias 등, Lancet, 2018, 392(10160): 2180-2193), 이는 GLP-1 및 GIP 수용체를 공동 표적화하는 번역 양태 및 치료 이점을 입증한다.
GLP-1 유도체의 경구 전달은 경구 투여 후 GLP-1 유도체의 매우 낮은 전형적인 노출 및 생체 이용률을 개선하기 위해 세마글루티드의 1일 1회 정제 및 투과 강화제 나트륨 N-[8-(2-히드록시벤조일)아미노]카프릴레이트(SNAC)(Hedrington & Davis, Exp. Opin. Pharmacother. 2019, 20 (2): 133-141)의 형태로 임상적으로 조사되었다.
GLP-1/GIP 공-작용제 및 이들의 잠재적 의료 용도는 WO 2010/011439, WO 2013/164483, WO 2014/192284, WO 2015/067715, WO 2015/022420, WO 2015/086728, WO 2015/086729, WO 2016/111971, WO 2020/023386, US 9745360, US 2014/162945, 및 US 2014/0357552와 같은 여러 특허 출원에서 기술된다. GLP-1 유도체의 경구 전달을 개시하는 특허 출원은, 예를 들어, WO 2011/080103, WO 2012/080471, WO 2013/189988, 및 WO 2019/149880에 기술되어 있다.
그러나 현재까지 시판 승인을 얻은 공-작용제 제품은 없다.
본 발명은 높은 효능으로 인간 GLP-1 및 GIP 수용체 둘 모두와 반응하고 인간에게 매일 경구 투여하기에 적합한 펩티드 및 치환기를 포함하는 단일 분자 공-작용제에 관한 것이다. 이는, 이산계 지방산과의 단일 부위 아실화를 통한 특정 펩티드 서열 변이체와 치환기의 조합에 의해 달성된다.
본 발명의 일 양태는 다음의 아미노산 서열을 갖는 펩티드에 관한 것이며,
YX2EGTX6TSDYSX12X13LEX16QAAX20X21FX23X24WLLX28GGPX32X33X34X35X36X37X38X39 (서열 번호 36),
이는 C-말단의 선택적인 아미드 변형을 갖고,
여기에서;
X2는 Aib 또는 A이고,
X6은 F 또는 V이고,
X12는 I 또는 Y이고,
X13은 Y, A, L 또는 I이고,
X16은 K 또는 E이고,
X20은 Q, R, E, H이고,
X21은 A 또는 E이고,
X23은 I 또는 V이고,
X24는 E, Q 또는 N이고,
X28은 A 또는 R이고,
X32는 E, S이거나 부재하고,
X33은 S, K이거나 부재하고,
X34는 G이거나 부재하고,
X35는 A이거나 부재하고,
X36은 P이거나 부재하고,
X37은 P이거나 부재하고,
X38은 P이거나 부재하고,
X39는 S이거나 부재한다.
다른 양태에서, 본 발명은 다음의 아미노산 서열을 갖는 펩티드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이며,
YX2EGTX6TSDYSX12X13LEX16QAAX20X21FX23X24WLLX28GGPX32X33X34X35X36X37X38X39 (서열 번호 36)
이는 C-말단의 선택적인 아미드 변형을 갖고,
여기에서;
X2는 Aib 또는 A이고,
X6은 F 또는 V이고,
X12는 I 또는 Y이고,
X13은 Y, A, L 또는 I이고,
X16은 K 또는 E이고,
X20은 Q, R, E, H이고,
X21은 A 또는 E이고,
X23은 I 또는 V이고,
X24는 E, Q 또는 N이고,
X28은 A 또는 R이고,
X32는 E, S이거나 부재하고,
X33은 S, K이거나 부재하고,
X34는 G이거나 부재하고,
X35는 A이거나 부재하고,
X36은 P이거나 부재하고,
X37은 P이거나 부재하고,
X38은 P이거나 부재하고,
X39는 S이거나 부재하며;
치환기는 위치 16 또는 33에서 리신(K)을 통해 펩티드에 부착된다.
본 발명의 또 다른 양태는 본원에 기술된 GLP-1/GIP 공-작용제의 제조 방법에 관한 것이다.
추가의 양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 GLP-1/GIP 공-작용제 화합물을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 본원에 기술된 GLP-1/GIP 공-작용제의 의학적 용도에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 당뇨병, 비만 및/또는 간 질환의 예방 또는 치료를 위한 본원에 기술된 GLP-1/GIP 공-작용제의 용도에 관한 것이다.
다음에서, 그리스 문자는 기호 또는 상응하는 명칭으로 표시될 수 있다(예를 들어, α = 알파; β = 베타; ε = 엡실론; γ = 감마; ω = 오메가 등). 또한, 그리스 문자 μ는 "u"로 표시할 수 있다(예: μl = ul, 또는 μM = uM).
GLP-1/GIP 수용체 공-작용제
본 발명은 GLP-1 수용체 및 GLP 수용체 작용제인 화합물에 관한 것이며, GLP-1/GIP 수용체 공-작용제 또는 단순히 공-작용제로도 지칭된다.
용어 "화합물"은 분자 엔티티를 지칭하도록 본원에서 사용되며, 따라서 "화합물"은 화합물 군의 각 화합물에 대해 정의된 최소 성분 이외에 상이한 구조적 성분을 가질 수 있다. 이는, 화합물이 정의된 구조적 및/또는 기능적 성분을 포함하는 한, 펩티드이거나 이의 유도체일 수 있음을 의미한다.
용어 "화합물"은 또한 이의 약학적으로 관련된 형태, 즉 본원에 정의된 바와 같은 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 아미드 또는 에스테르에 관한 것이다.
용어 "유사체"는 일반적으로, 기준 아미노산 서열과 비교했을 때 하나 이상의 아미노산이 변화된 서열을 가진 펩티드를 의미한다. "유사체"는 N-말단 및/또는 C-말단의 위치에서 아미노산 늘임(elongation)을 포함하고/하거나 N-말단 및/또는 C-말단 위치에서 절단을 포함할 수도 있다.
일반적으로, 아미노산 잔기는 이들의 완전한 명칭, 이들의 1자 코드 및/또는 3자 코드에 의해 식별될 수 있다. 이 세 가지 방법은 완전히 동등하다.
아미노산은 아미노기 및 카르복실산기를 함유하는 분자이며, 종종 측쇄로서 지칭되는 하나 이상의 추가적인 기를 선택적으로 함유한다.
용어 "아미노산"은 (그의 20개 표준 아미노산 중에서) 단백질생성(또는 천연) 아미노산뿐만 아니라, 비단백질생성(또는 비천연) 아미노산을 포함한다. 단백질생성 아미노산은 자연적으로 단백질에 통합되는 것이다.
표준 아미노산은 유전자 코드에 의해 암호화된 것이다. 비단백질생성 아미노산은 단백질에서는 발견되지 않거나, 표준 세포 기구에 의해 생성되지 않는다(즉, 번역 후 변형의 대상이 될 수 있다). 비단백질원성 아미노산의 비제한적인 예에는 Aib(α-아미노이소부티르산 또는 2-아미노시소부티르산), 노르류신, 노르발린뿐만 아니라 단백질원성 아미노산의 D-이성질체도 있다.
다음으로, 광학 이성질체가 언급되지 않은 펩티드의 각 아미노산은 (달리 명시되지 않는 한) L-이성질체를 의미하는 것으로 이해될 것이다.
본원에 기술된 GLP-1/GIP 수용체 공-작용제는 아래에 정의된 바와 같은 펩티드 및 치환기를 포함하거나 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 펩티드는 GLP-1 및 GIP 수용체에서의 활성을 최적화하기 위해 생성된 합성 펩티드이다. GLP-1 수용체 및 GIP 수용체 둘 모두에 대한 적절한 수용체 결합 활성을 갖는 화합물은 본원의 실시예에서 입증된 바와 같이 식별되었다.
화합물은 지방산기를 포함하는 치환기에 의해 수득된 연장된 반감기를 추가로 나타낸다.
일부 구현예에서, 펩티드의 카르복시 말단은 -COOH기를 보유한다. 일부 구현예에서, 화합물은 C-말단에 선택적으로 아미드기(C(=O)-NH2)를 포함할 수 있으며, 이는 천연 Exendin-4에서 볼 수 있는 바와 같이, -NH2로 -OH를 치환하는 자연 발생 변형이다.
펩티드
본원에 기술된 GLP-1/GIP 수용체 공-작용제는 펩티드 및 아래에 정의된 바와 같은 치환기를 포함하며, 여기에서 치환기는 아미노산 잔기를 통해 펩티드 골격에 부착된다.
일부 구현예에서, 펩티드의 아미노산 서열은 다음과 같으며,
YX2EGTX6TSDYSX12X13LEX16QAAX20X21FX23X24WLLX28GX30X31X32X33X34X35X36X37X38X39 (서열 번호 47)
이는 C-말단의 선택적인 아미드 변형을 갖고,
여기에서;
X2는 Aib 또는 A이고,
X6은 F 또는 V이고,
X12는 I 또는 Y이고,
X13은 Y, A, L 또는 I이고,
X16은 K 또는 E이고,
X20은 Q, R, E, H이고,
X21은 A 또는 E이고,
X23은 I 또는 V이고,
X24는 E, Q 또는 N이고,
X28은 A 또는 R이고,
X30은 G이거나 부재하고,
X31은 P이거나 부재하고,
X32는 E, S이거나 부재하고,
X33은 S, K이거나 부재하고,
X34는 G이거나 부재하고,
X35는 A이거나 부재하고,
X36은 P이거나 부재하고,
X37은 P이거나 부재하고,
X38은 P이거나 부재하고,
X39는 S이거나 부재한다.
일부 구현예에서, 펩티드의 아미노산 서열은 다음과 같으며,
YX2EGTX6TSDYSX12X13LEX16QAAX20X21FX23X24WLLX28GGPX32X33X34X35X36X37X38X39 (서열 번호 36)
이는 C-말단의 선택적인 아미드 변형을 갖고,
여기에서;
X2는 Aib 또는 A이고,
X6은 F 또는 V이고,
X12는 I 또는 Y이고,
X13은 Y, A, L 또는 I이고,
X16은 K 또는 E이고,
X20은 Q, R, E, H이고,
X21은 A 또는 E이고,
X23은 I 또는 V이고,
X24는 E, Q 또는 N이고,
X28은 A 또는 R이고,
X32는 E, S이거나 부재하고,
X33은 S, K이거나 부재하고,
X34는 G이거나 부재하고,
X35는 A이거나 부재하고,
X36은 P이거나 부재하고,
X37은 P이거나 부재하고,
X38은 P이거나 부재하고,
X39는 S이거나 부재한다.
일 구현예에서, X39는 부재한다. 일 구현예에서, X38 및 X39는 부재한다. 일 구현예에서, X37, X38 및 X39는 부재한다. 일 구현예에서, X36, X37, X38 및 X39는 부재한다. 일 구현예에서, X35, X36, X37, X38 및 X39는 부재한다. 일 구현예에서, X34, X35, X36, X37, X38 및 X39는 부재한다. 일 구현예에서, X33, X34, X35, X36, X37, X38 및 X39는 부재한다. 일 구현예에서, X32, X33, X34, X35, X36, X37, X38 및 X39는 부재한다. 일 구현예에서, X31, X32, X33, X34, X35, X36, X37, X38 및 X39는 부재한다. 일 구현예에서, X30, X31, X32, X33, X34, X35, X36, X37, X38 및 X39는 부재한다. 추가의 이러한 구현예에서, X32X33X34X35는 SSGA이다. 추가의 이러한 구현예에서, X32X33X34X35는 ESGA이다. 추가의 이러한 구현예에서, X32X33X34X35는 SKGA이다. 이의 추가의 구현예에서, 펩티드는 C-말단의 아미드 변형을 갖는다.
일 구현예에서, 펩티드의 아미노산 서열은 다음과 같으며,
YX2EGTX6TSDYSX12X13LEX16QAAX20X21FX23X24WLLX28GGPSSGAPPPS (서열 번호 37)
여기에서;
X2는 Aib 또는 A이고,
X6은 F 또는 V이고,
X12는 I 또는 Y이고,
X13은 Y, A, L 또는 I이고,
X16은 K 또는 E이고,
X20은 Q, R, E, H이고,
X21은 A 또는 E이고,
X23은 I 또는 V이고,
X24는 E, Q 또는 N이고,
X28은 A 또는 R이다.
일 구현예에서, 펩티드의 아미노산 서열은 다음과 같으며,
YX2EGTX6TSDYSX12X13LEX16QAAX20X21FX23X24WLLX28GGPESGAPPPS (서열 번호 38)
여기에서;
X2는 Aib 또는 A이고,
X6은 F 또는 V이고,
X12는 I 또는 Y이고,
X13은 Y, A, L 또는 I이고,
X16은 K 또는 E이고,
X20은 Q, R, E, H이고,
X21은 A 또는 E이고,
X23은 I 또는 V이고,
X24는 E, Q 또는 N이고,
X28은 A 또는 R이다.
일 구현예에서, 펩티드의 아미노산 서열은 다음과 같으며,
YX2EGTX6TSDYSX12X13LEX16QAAX20X21FX23X24WLLX28GGPSKGAPPPS (서열 번호 39)
여기에서;
X2는 Aib 또는 A이고,
X6은 F 또는 V이고,
X12는 I 또는 Y이고,
X13은 Y, A, L 또는 I이고,
X16은 K 또는 E이고,
X20은 Q, R, E, H이고,
X21은 A 또는 E이고,
X23은 I 또는 V이고,
X24는 E, Q 또는 N이고,
X28은 A 또는 R이다.
일 구현예에서, X2는 Aib이다. 일 구현예에서, X2는 A이다. 일 구현예에서, X6은 F이다. 일 구현예에서, X6은 V이다. 일 구현예에서, X12는 I이다. 일 구현예에서, X12는 Y이다. 일 구현예에서, X13은 Y이다. 일 구현예에서, X13은 A이다. 일 구현예에서, X13은 L이다. 일 구현예에서, X13은 I이다. 일 구현예에서, X16은 K이다. 일 구현예에서, X16은 E이다. 일 구현예에서, X20은 Q이다. 일 구현예에서, X20은 R이다. 일 구현예에서, X20은 E이다. 일 구현예에서, X20은 H이다. 일 구현예에서, X21은 A이다. 일 구현예에서, X21은 E이다. 일 구현예에서, X23은 I이다. 일 구현예에서, X23은 V이다. 일 구현예에서, X24는 E이다. 일 구현예에서, X24는 Q이다. 일 구현예에서, X24는 N이다. 일 구현예에서, X28은 A이다. 일 구현예에서, X28은 R이다. 일 구현예에서, X30은 G이다. 일 구현예에서, X31은 P이다.
일 구현예에서, X13LEX16QAAX20X21FX23X24는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: LLEKQAAREFIN, LLEKQAAREFIE, LLEKQAAQEFIE 및 LLEEQAAREFIE로 이루어진 군으로부터 선택되는, 펩티드. 일 구현예에서, X13LEX16QAAX20X21FX23X24는 LLEKQAAREFIN이다. 일 구현예에서, X13LEX16QAAX20X21FX23X24는 LLEKQAAREFIE이다. 일 구현예에서, X13LEX16QAAX20X21FX23X24는 LLEKQAAQEFIE이다. 일 구현예에서, X13LEX16QAAX20X21FX23X24는 LLEEQAAREFIE이다.
추가의 구현예에서, 펩티드의 아미노산 서열은 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 33, 34 및 35 중 어느 하나이다.
일 구현예에서, 펩티드의 아미노산 서열은 서열 번호 10, 22 또는 25 중 어느 하나이다.
일 구현예에서, 펩티드의 아미노산 서열은 서열 번호 25이다.
일 구현예에서, 펩티드의 아미노산 서열은 서열 번호 18, 20, 23, 24이다.
일 구현예에서, 펩티드의 아미노산 서열은 서열 번호 33, 34 또는 35이다.
이러한 추가의 구현예에서, 펩티드는 C-말단의 아미드 변형을 갖는다.
유도체
일부 구현예에서, GLP-1 및 GIP 수용체 작용제는 펩티드에 공유 결합된 다음에 정의된 바와 같은 치환기를 포함하거나 이로 구성된다.
이러한 화합물은 펩티드의 유도체로서 지칭될 수 있는며, 이는 치환기를 펩티드 골격에 공유 결합시킴으로써 수득되기 때문이다.
본 발명의 일 양태는 펩티드 및 치환기를 포함하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것으로서, 펩티드의 아미노산 서열은 다음과 같으며,
YX2EGTX6TSDYSX12X13LEX16QAAX20X21FX23X24WLLX28GX30X31X32X33X34X35X36X37X38X39 (서열 번호 47)
이는 C-말단의 선택적인 아미드 변형을 갖고,
여기에서;
X2는 Aib 또는 A이고,
X6은 F 또는 V이고,
X12는 I 또는 Y이고,
X13은 Y, A, L 또는 I이고,
X16은 K 또는 E이고,
X20은 Q, R, E, H이고,
X21은 A 또는 E이고,
X23은 I 또는 V이고,
X24는 E, Q 또는 N이고,
X28은 A 또는 R이고,
X30은 G이거나 부재하고,
X31은 P이거나 부재하고,
X32는 E, S이거나 부재하고,
X33은 S, K이거나 부재하고,
X34는 G이거나 부재하고,
X35는 A이거나 부재하고,
X36은 P이거나 부재하고,
X37은 P이거나 부재하고,
X38은 P이거나 부재하고,
X39는 S이거나 부재하며;
치환기는 위치 16 또는 33에서 리신(K)을 통해 펩티드에 부착된다.　
본 발명의 일 구현예는 펩티드 및 치환기를 포함하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것으로서, 펩티드의 아미노산 서열은 다음과 같으며,
YX2EGTX6TSDYSX12X13LEX16QAAX20X21FX23X24WLLX28GGPX32X33X34X35X36X37X38X39 (서열 번호 36)
이는 C-말단의 선택적인 아미드 변형을 갖고,
여기에서;
X2는 Aib 또는 A이고,
X6은 F 또는 V이고,
X12는 I 또는 Y이고,
X13은 Y, A, L 또는 I이고,
X16은 K 또는 E이고,
X20은 Q, R, E, H이고,
X21은 A 또는 E이고,
X23은 I 또는 V이고,
X24는 E, Q 또는 N이고,
X28은 A 또는 R이고,
X32는 E, S이거나 부재하고,
X33은 S, K이거나 부재하고,
X34는 G이거나 부재하고,
X35는 A이거나 부재하고,
X36은 P이거나 부재하고,
X37은 P이거나 부재하고,
X38은 P이거나 부재하고,
X39는 S이거나 부재하며;
치환기는 위치 16 또는 33에서 리신(K)을 통해 펩티드에 부착된다.
추가의 구현예에서, 펩티드는 전술한 바와 같이 정의될 수 있다.
치환기
일 구현예에서, 본원에 기술된 치환기는 위치 16 또는 33에서 리신(K) 잔기를 통해 본원에 기술된 펩티드에 부착된다.
일 구현예에서, 전술한 리신이 위치 16 또는 33에 포함될 경우, 치환기는 리신(K)의 엡실론-아미노기를 통해 펩티드에 부착된다.
일 구현예에서, 치환기는 혈장 알부민과 비공유 복합체를 형성할 수 있는 펩티드에 공유 부착된 화학 구조로서, 이에 의해 혈류와 함께 공-작용제의 순환을 촉진하고, 또한 공-작용제 및 알부민의 복합체가 신장 청소에 의해서만 서서히 제거된다는 사실로 인해 공-작용제의 작용 시간을 연장시키는 효과를 갖는다.
일부 구현예에서, 치환기는 지방산기를 포함한다. 이러한 구현예에서, 지방산기는 적어도 8개의 연속 -CH2-기를 함유하는 탄소 사슬을 포함한다. 일 구현예에서, 지방산기는 적어도 10개의 연속 -CH2-기, 예컨대 적어도 12개의 연속 -CH2-기, 적어도 14개의 연속 -CH2-기, 적어도 16개의 연속 -CH2-기, 또는 적어도 18개의 연속 -CH2-기를 포함한다.
일 구현예에서, 지방산 기는 8 내지 20개의 연속 -CH2-기를 포함한다. 일 구현예에서, 지방산 기는 10 내지 18개의 연속 -CH2-기를 포함한다. 일 구현예에서, 지방산 기는 12 내지 18개의 연속 -CH2-기를 포함한다. 일 구현예에서, 지방산 기는 14 내지 18개의 연속 -CH2-기를 포함한다.
일부 구현예에서, 치환기는 여러 요소, 예컨대 연장기(protractor) 요소 및 하나 이상의 링커 요소로 구성된다. 일 구현예에서, 용어 "연장기"는 치환기의 말단부로서, 화합물의 반감기의 연장을 담당하는 지방산기를 기술하도록 사용된다.
일 구현예에서, 연장기(Prot)는,
화학식 1: HOOC-(CH2)n-CO-*(여기에서, n은 8 내지 20 범위의 정수임)로 정의될 수 있고, 이는 C(n+2) 이산(diacid)으로서 지칭되거나,
화학식 1b:
Figure pct00001
(여기에서, n은 8 내지 20 범위의 정수임)로서 정의될 수 있다.
일 구현예에서, 치환기는 하나 이상의 링커 요소를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 링커 요소는 아미드 결합에 의해 서로 및 연장기에 연결되고, "Z"로 지칭될 수 있다(자세한 내용은 아래 참조).
본원에서 추가로 정의된 바와 같이, 링커 요소의 수는 최대 3개로서, -Z1-Z2-Z3-으로 지칭될 수 있으며, 여기에서 Z1은 연장기(Prot)와 연결되고 마지막 Z 요소는 펩티드와 연결되며, 이 경우 치환기는 Prot-Z1-Z2-Z3-로 지칭될 수 있다. 따라서, 위의 기호 "*"는, 아미드 결합을 통해 결합될 경우에는 질소인 Z1에 대한 부착점을 나타낸다. 일 구현예에서, Z1이 결합인 경우(하기 참조), 기호 *는 이웃하는 Z 요소의 질소에 대한 부착점을 나타낸다.
일 구현예에서, 치환기는, Prot-Z1-Z2-Z3로 정의되고, - 여기에서 Prot-는 화학식 1, 화학식 1b로부터 선택되고, n은 16 내지 20 범위의 정수이다.
특정 구현예에서, 화학식 1 또는 화학식 1b의 n은 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20이다.
특정 구현예에서, 화학식 1 또는 화학식 1b의 n은 14, 15, 16, 17 또는 18이다.
특정 구현예에서, 화학식 1 또는 화학식 1b의 n은 14, 16, 또는 18이다.
특정 구현예에서, 화학식 1 또는 화학식 1b의 n은 16, 17, 18, 19 또는 20이다.
특정 구현예에서, 화학식 1 또는 화학식 1b의 n은 16, 18 또는 20이다.
특정 구현예에서, 화학식 1 또는 화학식 1b의 n은 18 또는 20이다.
특정 구현예에서, 프로트랙터(Prot)는 C16 이산 또는 C18 이산이다.
특정 구현예에서, 연장기(Prot)는 C18 이산 또는 C20 이산이다.
특정 구현예에서, 연장기(Prot)는 C16, C18 이산 또는 C20 이산이다.
본원에서 사용된 용어 "결합"은 공유 결합을 의미한다. Z1 내지 Z3의 링커 요소가 결합으로서 정의되는 경우, 이는 전술한 링커 요소가 부재하는 상황과 등등하다. Z1 내지 Z3 중 어느 하나가 결합이라는 아래의 표시는 또한 Z1 내지 Z3 중 어느 하나가 부재하는 것으로서 판독될 수 있고, 이전의 Z 요소가 "결합"(또는 부재)이 아닌 다음의 Z 요소에 공유 결합된다.
일부 구현예에서, 링커 요소 Z1 내지 Z3은 Glu, γGlu(감마 Glu 또는 gGlu로도 지칭되며, *-NH-CH-(COOH)-CH2-CH2-CO-*로 정의됨), ε-Lys(엡실론 Lys 또는 eLys로도 지칭되며, *-NH-(CH2)4-CH(NH2)-CO-*로 정의됨), Ser, Ala, Thr, Ado, Aeep 및 Aeeep과 같은 아미노산 유사 모이어티 및 다음에 기술된 추가의 모이어티를 포함하는, 아미드 결합을 형성할 수 있는 화학적 모이어티로부터 개별적으로 선택된다.
일 구현예에서, Z1은 γGlu, Glu, 또는 결합으로부터 선택된다.
일 구현예에서, Z1은 γGlu이다.
일 구현예에서, Z2 및 Z3은 Glu, ε-Lys, γGlu, Gly, Ser, Ala, Thr, Ado, Aeep, Aeeep 및 결합으로부터 서로 독립적으로 선택된다.
Glu, Gly, Ser, Ala, Thr은 당업계에 잘 알려진 아미노산 잔기이다.
ε-Lys는 화학식 2: *-NH-(CH2)4-CH(NH2)-CO-*로 정의되며, 이는 또한
화학식 2b:
Figure pct00002
로 나타낼 수 있다.
γGlu는 화학식 3: *-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*로 정의되며, 이는 또한
화학식 3b:
Figure pct00003
로 나타낼 수 있다.
Ado는 화학식 4: *-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-*로 정의되며, 이는 8-아미노-3,6-디옥사옥타논산으로 지칭될 수도 있고, 이는 또한
화학식 4b:
Figure pct00004
로 나타낼 수 있다.
Aeep는 화학식 5: *NH-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2CO*로 정의되며, 이는 또한
화학식 5b:
Figure pct00005
로 나타낼 수 있다.
Aeeep는 화학식 6: *NH-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2CO*로 정의되며, 이는 또한
화학식 6b:
Figure pct00006
로 나타낼 수 있다.
일 구현예에서, Z2 및 Z3은 Glu, ε-Lys, γGlu, Gly, Ala, Ado, Aeep, Aeeep 및 결합으로부터 서로 독립적으로 선택된다.
일 구현예에서, Z2 및 Z3은 Glu, ε-Lys, γGlu, Gly, Ala, Ado 및 결합으로부터 서로 독립적으로 선택된다.
일 구현예에서, Z2 및 Z3은 Glu, ε-Lys, γGlu, Gly, Ado 및 결합으로부터 서로 독립적으로 선택된다.
일 구현예에서, Z2 및 Z3은 ε-Lys, γGlu, Gly, Ado 및 결합으로부터 서로 독립적으로 선택된다.
일 구현예에서, Z2 및 Z3은 ε-Lys, γGlu, Ado 및 결합으로부터 서로 독립적으로 선택된다.
일 구현예에서, Z2 및 Z3은 ε-Lys 또는 Ado이다.
일 구현예에서, Z2 및 Z3은 Ado이다.
일 구현예에서, Z2 및 Z3은 ε-Lys이다.
일 구현예에서, 치환기는 아래와 같이 정의된 치환기 A, B, C, D 및 E로부터 선택된다.
일 구현예에서, 치환기는 아래과 같이 정의된 치환기 A, B 및 C로부터 선택된다:
Figure pct00007
일부 구현예에서, 치환기는 아실화에 의해, 즉 치환기의 카르복실산기와 리신 잔기의 엡실론-아미노기 사이에 형성된 아미드 결합을 통해 공-작용제의 리신 잔기에 공유 부착된다.
일 구현예에서, 치환기는 아실화에 의해, 즉 치환기의 카르복실산기와 리신 잔기의 엡실론-아미노기 사이에 형성된 아미드 결합을 통해 펩티드 골격의 위치 16의 리신 잔기에 공유 부착된다.
일 구현예에서, 치환기는 아실화에 의해, 즉 치환기의 카르복실산기와 리신 잔기의 엡실론-아미노기 사이에 형성된 아미드 결합을 통해 펩티드 골격의 위치 33의 리신 잔기에 공유 부착된다.
공-작용제는 동일한 분자식 및 결합 원자 서열을 갖는 상이한 입체 이성질체 형태로 존재할 수 있지만, 공간에서의 그 원자의 3차원 배향만 상이할 수 있다. 예시된 공-작용제의 입체 이성질 현상은 표준 명명법을 사용하여, 명칭 및 구조로 실험 섹션에 나타나 있다. 달리 언급하지 않는 한, 본 발명은 구현된 유도체의 모든 입체 이성질체 형태에 관한 것이다.
기능적 수용체 활성화 활성
본원에 기술된 바와 같은 GLP-1/GIP 수용체 작용제의 기능적 활성은 실시예 2에서 본원에 기술된 바와 같이 시험관 내에서 시험될 수 있다.
반치 유효 농도(EC50)는, 투여량 반응 곡선을 참조하여 베이스라인과 최대 값의 절반에 해당하는 반응을 유도하는 농도를 일반적으로 지칭한다. EC50은 화합물의 효능의 척도로서 사용되며, 화합물의 최대 효과의 50%가 관찰되는 농도를 나타낸다.
따라서, 화합물의 시험관 내 효능은 본원에 기술된 바와 같이 결정될 수 있고, EC50이 결정될 수 있다. EC50 값이 낮을수록 효능이 더 좋다.
이러한 화합물을 특성화하기 위해, 각 수용체의 천연 호르몬에 비교하여 시험관 내 효능을 고려하는 것이 더 적절할 수 있다.
시험관 내 효능은, 예를 들어, 적절한 GLP-1 및/또는 GIP 수용체를 발현하는 막을 함유하는 매질에서 및/또는 적절한 GLP-1 및/또는 GIP 수용체를 발현하는 전체 세포를 이용한 검정에서 결정될 수 있다.
예를 들어, 인간 GLP-1 및/또는 GIP 수용체의 기능적 반응은 리포터 유전자 검정에서, 예를 들어, 안정하게 형질감염된 BHK 세포주에서 측정되며, 상기 세포주는 인간 GLP-1 및/또는 GIP 수용체를 발현하고, 프로모터에 결합된 cAMP 반응 요소(CRE)에 대한 DNA 및 반딧불이 루시페라아제(CRE 루시페라아제)에 대한 유전자를 함유한다. GLP-1 및/또는 GIP 수용체의 활성화의 결과로서 cAMP가 생성되는 경우, 이는 결과적으로 루시페라아제의 발현으로 이어진다. 루시페라아제는, 효소에 의해 옥시루시페린으로 전환되고 생체 발광을 생성하는 루시페린을 첨가함으로써 결정될 수 있으며, 이는 시험관 내 효능의 리포터로 측정된다. 이러한 검정의 일례는 본원에 기술된 실시예 2에서 기술된다. 화합물은 알부민에 결합하도록 설계된 치환기를 포함할 수 있기 때문에, 수용체 활성이 분석 매체에서 인간 혈청 알부민(HSA)의 존재 또는 부재에 의해 영향을 받을 수 있다는 것을 인지하는 것 또한 중요하다. HSA의 부재 시의 EC50과 비교하여 EC50의 증가로 표시되는, HSA의 존재 시의 화합물의 효능의 감소는, HSA와 화합물의 상호 작용을 나타내며, 생체 내 작용 시간이 지연될 것으로 예측한다.
일 구현예에서, 화합물은 인간 GLP-1 및 GIP 수용체를 활성화시키는 강력한 시험관 내 효과를 갖는다.
일 구현예에서, 화합물은, HSA 없이 수행될 경우, 본원의 실시예 2에 기술된 바와 같은 CRE 루시페라아제 리포터 검정에서 20 pM 미만의 EC50으로 시험관 내에서 인간 GLP-1 및 GIP 수용체를 활성화시킬 수 있다.
일 구현예에서, 화합물은 100 pM 이하, 보다 바람직하게는 50 pM 미만, 또는 가장 바람직하게는 20 pM 미만의 EC50에 상응하는 실시예 2의 방법을 사용하여 결정된 인간 GLP-1 및 GIP 수용체에서 시험관 내 효능을 갖는다.
일 구현예에서, 인간 GLP-1 및 GIP 수용체 검정에서 EC50은 1 내지 25 pM, 예컨대 1 내지 20 pM, 예컨대 1 내지 15 pM, 또는 예컨대 1 내지 10 pM이다.
약동학적 특성
공-작용성 화합물의 약동학적 특성은 약동학적(PK) 연구를 통해 생체 내에서 추가로 결정될 수 있다. 마우스, 랫트, 원숭이, 개, 또는 돼지와 같은 동물 모델이 이러한 특성화를 수행하는 데 사용될 수 있다.
이러한 연구에서, 동물에게는 일반적으로 약물의 1회 투여량이 연관된 제형으로 정맥내, 피하(s.c.) 또는 경구(p.o.) 투여된다. 투여 후 미리 정의된 시점에 혈액 샘플을 채취하고, 관련된 정량 검정을 사용해 약물 농도에 대해 샘플을 분석한다. 이러한 측정에 기초하여, 연구 화합물에 대한 시간-혈장 농도 프로파일을 도표화하고, 데이터에 대한 소위 비구획 약동학 분석(non-compartmental pharmacokinetic analysis)을 수행한다. 긴 반감기는 화합물의 덜 빈번한 투여가 가능할 수 있음을 나타내기 때문에, 중요한 파라미터는 말단 반감기이다. 생체 내 말단 반감기(t1/2)는 적절한 모델을 사용하여, 예컨대 실시예 3에 기술된 미니피그에서 i.v. 투여 후; 또는 실시예 4에 기술된 개에서 p.o 투여 후 측정될 수 있다.
일 구현예에서, 말단 반감기는, 예를 들어 본원의 실시예 3에 기술된 바와 같이, i.v. 투여 후 미니피그에서의 생체 내 반감기(t1/2)이다.
일 구현예에서, 미니피그에서의 말단 반감기는 적어도 24시간, 예컨대 적어도 30시간, 또는 예컨대 적어도 40시간이다.
일 구현예에서, 말단 반감기는, 예를 들어 본원의 실시예 4에 기술된 바와 같이, p.o. 투여 후 개에서의 생체 내 반감기(t1/2)이다.
일 구현예에서, 개에서의 말단 반감기는 적어도 24시간, 예컨대 적어도 40시간, 또는 예컨대 적어도 50시간이다.
약학적으로 허용 가능한 염
일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 공-작용제는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태이다. 염은 예를 들어, 염기와 산 사이의 화학 반응에 의해 형성된다 (예를 들어, 2NH3 + H2SO4 → (NH4)2SO4). 염은 염기성 염 또는 산성 염이거나, 둘 다 아닐 수도 있다(즉, 중성 염). 염기성 염은 물에서 수산화물 이온과 산성 염 히드로늄 이온을 생성한다. 공-작용제의 염은 각각 음이온성 기 또는 양이온성 기 사이의 부가 양이온 또는 음이온으로 형성될 수 있다. 이들 기는 펩티드 및/또는 유도체의 치환기 내에 위치할 수 있다. 음이온성 기의 비제한적인 예는 치환기 내의, 만약 있다면, 펩티드 내의, 임의의 유리 카르복실산기를 포함한다. 펩티드는 C-말단에서의 유리 카르복실산기를 포함할 수 있으며, 존재하는 경우, Asp 및 Glu와 같은 내부 산성 아미노산 잔기의 임의의 유리 카르복실산기를 포함할 수 있다.
양이온성 기의 비제한적인 예는 치환기 내의, 만약 있다면, 펩티드 내의, 임의의 유리 아미노기를 포함한다. 펩티드는 N-말단에서의 유리 아미노기를 포함할 수 있으며, 존재하는 경우, His, Arg 및 Lys와 같은 내부 염기성 아미노산 잔기의 임의의 유리 아미노기를 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 펩티드 또는 유도체는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태이다.
생산 공정
공-작용제는, 예를 들어, 고전적인 펩티드 합성, 예를 들어, t-Boc 또는 Fmoc 화학 또는 잘 확립된 다른 기술을 사용하여 고상 펩티드 합성에 의해 생성될 수 있다(예를 들어, Greene 및 Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley & Sons, 1999; Florencio Zaragoza Doerwald, "Organic Synthesis on solid Phase", Wiley-VCH Verlag GmbH, 2000, 및 W.C. Chan 및 P.D. White 편집, "Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis", Oxford University Press, 2000 참조).
대안적으로, 화합물은 재조합 방법에 의해서, 즉, 펩티트 서열을 암호화하는 DNA 서열을 함유하고, 펩티드의 발현이 가능한 조건 하에 적절한 영양 배지에서 펩티드를 발현할 수 있는 숙주 세포를 배양함으로써 생성될 수 있다. 이들 펩티드의 발현에 적합한 숙주 세포의 비제한적인 예는, 대장균 세포주, 맥주 효모균(Saccharomyces cerevisiae) 세포주를 비롯하여 포유류 BHK 또는 CHO 세포주이다.
비-천연 아미노산 및/또는 공유 결합된 치환기를 포함하는 공-작용제는 실험 파트에 기술된 바와 같이 생산될 수 있다.
다수의 공-작용제를 제조하는 방법의 구체적인 예는 실험 파트에 포함되어 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 본원에 기술된 펩티드의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 본원에 기술된 GLP-1/GIP 공-작용제의 제조 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 화합물을 제조하는 방법은 고상 펩티드 합성의 단계를 포함한다. 치환기는 고상 펩티드 합성의 일부로서 순차적으로 구축되거나, 펩티드 합성 후 리신 잔기를 통해 별도로 생산되고 부착될 수 있다.
일 구현예에서, 화합물은 2단계 공정에 의해 생산되며, 이에 의해 2개의 펩티드 단편은 펩티드 단편 중 하나에 치환기의 부착 후 연결된다.
약학적 조성물
추가의 양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 GLP-1/GIP 수용체 공-작용제를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 본원의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 조성물은 당업계에 공지된 바와 같이 제조될 수 있다.
용어 "부형제"는 활성 치료 성분(들) 이외의 임의의 성분을 광범위하게 지칭한다. 부형제는 불활성 물질, 비활성 물질, 및/또는 의약적 비활성 물질일 수 있다. 부형제는 다양한 목적으로, 예를 들어, 담체, 운송체, 필러, 결합제, 윤활제, 활택제, 붕해제, 유동 조절제, 결정화 억제제, 가용화제, 안정화제, 착색제, 향미제, 계면활성제, 유화제 또는 이들의 조합으로서 사용될 수 있고/있거나 활성 물질의 흡수를 개선하는 데 사용될 수 있다. 사용된 각각의 부형제의 양은 당업계의 통상적인 범위 내에서 다양할 수 있다. 경구 투여 형태를 제형화하는 데 사용될 수 있는 기술 및 부형제는, Handbook of Pharmaceutical Excipients(예를 들어, 제8판, Sheskey 등 편저, American Pharmaceuticals Association and Pharmaceutical Press, publications department of the Royal Pharmaceutical Society of Great Britain (2017), 및 이후의 판 중 하나); 및 Remington: The Science and Practice of Pharmacy(예를 들어, 제22판, Remington 및 Allen 편저, Pharmaceutical Press (2013), 및 이후의 판 중 하나)에 기술되어 있다.
일 구현예에서, 약학적 조성물은 고체 제형, 예를 들어, 동결 건조되거나 분무 건조된 조성물일 수 있으며, 이들은 그대로 사용할 수 있거나, 사용 전에 의사나 환자가 용제 및/또는 희석제를 이에 첨가한다. 추가의 구현예에서, 약학적 조성물은 활성 성분, N-[8-(2-히드록시벤조일)아미노]카프릴레이트의 염, 및 당업계에 공지된, 예를 들어, WO 2012/080471, WO 2013/189988, 또는 WO 2019/149880에 기술된 제형 중 하나 이상을 사용하는 하나 이상의 추가 부형제로 이루어진 고형 제형일 수 있다.
대안적으로, 약학적 조성물은 수성 제형과 같은 액상 제형이다. 주사에 적합한 액상 조성물은 제약 산업의 종래 기술을 사용하여 제조될 수 있으며, 이는 목적하는 최종 생성물을 수득하기 위해 성분을 적절히 용해시키고 혼합하는 것을 포함한다. 따라서, 하나의 절차에 따르면, 본원에 기술된 바와 같은 GLP-1/GIP 공-작용제는 적절한 pH에서 적절한 완충액에 용해된다. 조성물은, 예를 들어, 무균 여과에 의해 멸균된다.
약학적 징후
본 발명의 또 다른 양태는 본원에서 기술된 바와 같은 GLP-1/GIP 수용체 공-작용제 화합물의 약제로서의 용도에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본원에 기술된 화합물은 다음의 의학적 치료에 사용하기 위한 것이다:
(i) 고혈당증, 2형 당뇨병, 내당능 장애, 1형 당뇨병, 비-인슐린 의존성 당뇨병, MODY(연소자의 성인발증형당뇨병), 임신성 당뇨병 및/또는 HbA1C의 감소와 같은 모든 형태의 당뇨병에 대한 예방 및/또는 치료;
(ii) 2형 당뇨병의 진전과 같은 당뇨성 질병 진전의 지연 또는 예방, 내당능 장애(IGT)의 인슐린 요구성 2형 당뇨병으로의 진전의 지연, 인슐린 내성의 지연 또는 예방, 및/또는 비-인슐린 요구성 2형 당뇨병의 인슐린 요구성 2형 당뇨병으로의 진전의 지연;
(iii) 예를 들어, 음식 섭취량 감소, 체중 감소, 식욕 억제, 포만감 유발에 의한 섭식 장애(예를 들어, 비만)의 예방 및/또는 치료; 향정신 약물 또는 스테로이드의 투여에 의해 유도된 폭식 장애, 신경성 폭식증 및/또는 비만의 치료 또는 예방; 위 운동의 감소; 위 공복의 지연; 신체 운동성의 증가; 및/또는 골관절염 및/또는 요실금과 같은 비만 동반 질환의 예방 및/또는 치료;
(iv) (약물 유도성 또는 식단 조절과 운동에 의한) 성공적인 체중 감량 후의 체중 유지 - 즉, 성공적인 체중 감량 후 체중 증가의 예방;
(v) 간 지방증, 비-알코올성 지방간 질환(NAFLD), 비-알코올성 지방간염(NASH), 간 염증 또는 지방 간 등과 같은 간 장애의 예방 및/또는 치료.
일 구현예에서, 화합물은 당뇨병 및/또는 비만의 예방 및/또는 치료 방법에 사용하기 위한 것이다.
일 구현예에서, 화합물은 당뇨병 및/또는 비만의 치료 방법에 사용하기 위한 것이다.
일 구현예에서, 화합물은 2형 당뇨병의 치료 또는 예방 방법에 사용하기 위한 것이다.
일 구현예에서, 화합물은 2형 당뇨병의 치료 방법에 사용하기 위한 것이다.
일 구현예에서, 화합물은 비만의 치료 또는 예방 방법에 사용하기 위한 것이다.
일 구현예에서, 화합물은 비만의 치료 방법에 사용하기 위한 것이다.
일 구현예에서, 화합물은 체중 관리 방법에 사용하기 위한 것이다. 일 구현예에서, 화합물은 식욕 감소 방법에 사용하기 위한 것이다. 일 구현예에서, 화합물은 음식 섭취량 감소 방법에 사용하기 위한 것이다.
구현예
1. 펩티드 및 치환기를 포함하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로서, 펩티드의 아미노산 서열은 다음과 같으며,
YX2EGTX6TSDYSX12X13LEX16QAAX20X21FX23X24WLLX28GX30X31X32X33X34X35X36X37X38X39 (서열 번호 47)
이는 C-말단의 선택적인 아미드 변형을 갖고,
여기에서;
X2는 Aib 또는 A이고,
X6은 F 또는 V이고,
X12는 I 또는 Y이고,
X13은 Y, A, L 또는 I이고,
X16은 K 또는 E이고,
X20은 Q, R, E, H이고,
X21은 A 또는 E이고,
X23은 I 또는 V이고,
X24는 E, Q 또는 N이고,
X28은 A 또는 R이고,
X30은 G이거나 부재하고,
X31은 P이거나 부재하고,
X32는 E, S이거나 부재하고,
X33은 S, K이거나 부재하고,
X34는 G이거나 부재하고,
X35는 A이거나 부재하고,
X36은 P이거나 부재하고,
X37은 P이거나 부재하고,
X38은 P이거나 부재하고,
X39는 S이거나 부재하며;
치환기는 위치 16 또는 33에서 리신(K)을 통해 펩티드에 부착되는,
화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
2. 구현예 1에 있어서, 펩티드 및 치환기를 포함하되, 펩티드의 아미노산 서열은 다음과 같으며,
YX2EGTX6TSDYSX12X13LEX16QAAX20X21FX23X24WLLX28GGPX32X33X34X35X36X37X38X39 (서열 번호 36)
이는 C-말단의 선택적인 아미드 변형을 갖고,
여기에서;
X2는 Aib 또는 A이고,
X6은 F 또는 V이고,
X12는 I 또는 Y이고,
X13은 Y, A, L 또는 I이고,
X16은 K 또는 E이고,
X20은 Q, R, E, H이고,
X21은 A 또는 E이고,
X23은 I 또는 V이고,
X24는 E, Q 또는 N이고,
X28은 A 또는 R이고,
X32는 E, S이거나 부재하고,
X33은 S, K이거나 부재하고,
X34는 G이거나 부재하고,
X35는 A이거나 부재하고,
X36은 P이거나 부재하고,
X37은 P이거나 부재하고,
X38은 P이거나 부재하고,
X39는 S이거나 부재하며;
치환기는 위치 16 또는 33에서 리신(K)을 통해 펩티드에 부착되는,
화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
3. 구현예 1에 있어서, X36, X37, X38 및 X39는 부재하는, 화합물.
4. 구현예 1에 있어서, X34, X35, X36, X37, X38 및 X39는 부재하는, 화합물.
5. 구현예 1에 있어서, X32, X33, X34, X35, X36, X37, X38 및 X39는 부재하는, 화합물.
6. 구현예 1에 있어서, X30, X31, X32, X33, X34, X35, X36, X37, X38 및 X39는 부재하는, 화합물.
7. 구현예 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 펩티드는 C-말단의 아미드 변형을 갖는, 화합물.
8. 구현예 1, 2 또는 7 중 어느 하나에 있어서, X32X33X34X35는 SSGA, ESGA 및 SKGA로 이루어진 군으로부터 선택되는, 화합물.
9. 구현예 1, 2 또는 7 중 어느 하나에 있어서, X32X33X34X35는 SSGA인, 화합물.
10. 구현예 1, 2 또는 7 중 어느 하나에 있어서, X32X33X34X35는 ESGA인, 화합물.
11. 구현예 1, 2 또는 7 중 어느 하나에 있어서, X32X33X34X35는 SKGA인, 화합물.
12. 구현예 1에 있어서, 펩티드의 아미노산 서열은 다음과 같으며,
YX2EGTX6TSDYSX12X13LEX16QAAX20X21FX23X24WLLX28GGPSSGAPPPS (서열 번호 37)
여기에서;
X2는 Aib 또는 A이고,
X6은 F 또는 V이고,
X12는 I 또는 Y이고,
X13은 Y, A, L 또는 I이고,
X16은 K 또는 E이고,
X20은 Q, R, E, H이고,
X21은 A 또는 E이고,
X23은 I 또는 V이고,
X24는 E, Q 또는 N이고,
X28은 A 또는 R인,
화합물.
13. 구현예 1에 있어서, 펩티드의 아미노산 서열은 다음과 같으며,
YX2EGTX6TSDYSX12X13LEX16QAAX20X21FX23X24WLLX28GGPESGAPPPS (서열 번호 38)
여기에서;
X2는 Aib 또는 A이고,
X6은 F 또는 V이고,
X12는 I 또는 Y이고,
X13은 Y, A, L 또는 I이고,
X16은 K 또는 E이고,
X20은 Q, R, E, H이고,
X21은 A 또는 E이고,
X23은 I 또는 V이고,
X24는 E, Q 또는 N이고,
X28은 A 또는 R인,
화합물.
14. 구현예 1에 있어서, 펩티드의 아미노산 서열은 다음과 같으며,
YX2EGTX6TSDYSX12X13LEX16QAAX20X21FX23X24WLLX28GGPSKGAPPPS (서열 번호 39)
여기에서;
X2는 Aib 또는 A이고,
X6은 F 또는 V이고,
X12는 I 또는 Y이고,
X13은 Y, A, L 또는 I이고,
X16은 K 또는 E이고,
X20은 Q, R, E, H이고,
X21은 A 또는 E이고,
X23은 I 또는 V이고,
X24는 E, Q 또는 N이고,
X28은 A 또는 R인,
화합물.
15. 구현예 1 내지 14 중 어느 하나에 있어서, X13LEX16QAAX20X21FX23X24는 LLEKQAAREFIN, LLEKQAAREFIE, LLEKQAAQEFIE 및 LLEEQAAREFIE로 이루어진 군으로부터 선택되는, 화합물.
16. 구현예 1에 있어서, 펩티드의 아미노산 서열은 서열번호 1 내지 27 또는 33 내지 35 중 어느 하나인, 화합물.
17. 구현예 16에 있어서, 펩티드는 C-말단의 아미드 변형을 갖는, 화합물.
18. 구현예 1 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 실시예 2에 기술된 바와 같은 CRE 루시페라아제 리포터 검정에서 HSA 없이 측정했을 경우, 20 pM 미만의 EC50으로 시험관 내에서 인간 GLP-1 및 GIP 수용체를 활성화시키는, 화합물.
19. 구현예 1 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 미니피그에서 적어도 35시간의 반감기를 갖는, 화합물.
20. 구현예 1 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 치환기는 16Lys를 통해 부착되는, 화합물.
21. 구현예 1 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 치환기는 33Lys를 통해 부착되는, 화합물.
22. 구현예 1 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 치환기는 적어도 하나의 연장기를 포함하는, 화합물.
23. 구현예 22에 있어서, 연장기는 지방산기인, 화합물.
24. 구현예 23에 있어서, 연장기는 화학식 1: HOOC-(CH2)n-CO-로 정의된 이산이고, 여기에서 n은 8 내지 20 범위의 정수, 예를 들어, n = 14, 16 또는 18인, 화합물.
25. 구현예 23에 있어서, 연장기는 화학식 1: HOOC-(CH2)n-CO-로 정의된 이산이고, 여기에서 n은 8 내지 20 범위의 정수, 예를 들어, n = 16 또는 18인, 화합물.
26. 구현예 1 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 치환기는 적어도 하나의 링커 요소를 포함하는, 화합물.
27. 구현예 26에 있어서, 치환기는 최대 3개의 링커 요소를 포함하는, 화합물.
28. 구현예 27에 있어서, 치환기는 -Z1-Z2-Z3-로 지칭되는 최대 3개의 링커 요소를 포함하고, 여기에서 -Z1-은 연장기와 연결되고 -Z3-은 펩티드에 연결되는, 화합물.
29. 구현예 1 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 치환기는 Prot-Z1-Z2-Z3-이고,
여기에서,
Prot은 C16-C20 이산이고,
Z1은 γGlu 또는 결합이고,
Z2는 εLys, γGlu 또는 Ado이고,
Z3은 εLys 또는 Ado인,
화합물.
30. 구현예 29에 있어서, -Z1-은 -γGlu-인, 화합물.
31. 구현예 29 또는 30에 있어서, -Z2-Z3-은 -Ado-Ado-인, 화합물.
32. 구현예 29, 30 또는 31에 있어서, -Z2-Z3-은 -εLys-εLys-인, 화합물.
33. 구현예 1 내지 구현예 17 중 어느 하나에 있어서, 치환기는:
Figure pct00008
로 이루어진 군으로부터 선택되는, 화합물.
34. 구현예 1 내지 구현예 17 중 어느 하나에 있어서, 치환기는:
Figure pct00009
Figure pct00010
로 이루어진 군으로부터 선택되는, 화합물.
35. 구현예 1 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 치환기는 리신(K)의 엡실론-아미노기를 통해 펩티드에 부착되는, 화합물.
36. 구현예 1에 있어서, 화합물은,
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
로 이루어진 군으로부터 선택되는, 화합물.
37. 제1항에 있어서, 화합물은,
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
로 이루어진 군으로부터 선택되는, 화합물.
38. 제1항에 있어서, 화합물은,
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
로 이루어진 군으로부터 선택되는, 화합물.
39. 구현예 1에 있어서, 화합물은,
Figure pct00032
Figure pct00033
인, 화합물.
40. 구현예 1에 있어서, 화합물은,
Figure pct00034
인, 화합물.
41. 의약으로서 사용을 위한, 구현예 1 내지 40 중 어느 하나에 따른, 화합물.
42. 구현예 1 내지 구현예 40 중 어느 하나에 따른 화합물을 포함하는, 약학적 조성물.
43. 구현예 42에 있어서, 전술한 조성물은 수성 액체인, 조성물.
44. 구현예 42에 있어서, 전술한 조성물은 고형 조성물인, 조성물.
45. 당뇨병 및/또는 비만의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한, 구현예 42 내지 구현예 44 중 어느 하나에 따른, 약학적 조성물.
46. 간 지방증, 비-알코올성 지방간 질환(NAFLD), 비-알코올성 지방간염(NASH), 간 염증 및/또는 지방 간과 같은 간 장애의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한, 구현예 42 내지 44 중 어느 하나에 따른, 약학적 조성물.
47. 당뇨병 및/또는 비만의 예방 및/또는 치료 방법으로서, 구현예 1 내지 40 중 어느 하나에 따른 화합물의 약학적 활성량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
48. 간 지방증, 비-알코올성 지방간 질환(NAFLD), 비-알코올성 지방간염(NASH), 간 염증 및/또는 지방 간과 같은 간 장애의 예방 및/또는 치료 방법으로서, 구현예 1 내지 40에 중 어느 하나에 따른 화합물의 약학적 활성량을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
49. 펩티드로서, 펩티드의 아미노산 서열은 다음과 같으며,
YX2EGTX6TSDYSX12X13LEX16QAAX20X21FX23X24WLLX28GX30X31X32X33X34X35X36X37X38X39 (서열 번호 47)
이는 C-말단의 선택적인 아미드 변형을 갖고,
여기에서;
X2는 Aib 또는 A이고,
X6은 F 또는 V이고,
X12는 I 또는 Y이고,
X13은 Y, A, L 또는 I이고,
X16은 K 또는 E이고,
X20은 Q, R, E, H이고,
X21은 A 또는 E이고,
X23은 I 또는 V이고,
X24는 E, Q 또는 N이고,
X28은 A 또는 R이고,
X30은 G이거나 부재하고,
X31은 P이거나 부재하고,
X32는 E, S이거나 부재하고,
X33은 S, K이거나 부재하고,
X34는 G이거나 부재하고,
X35는 A이거나 부재하고,
X36은 P이거나 부재하고,
X37은 P이거나 부재하고,
X38은 P이거나 부재하고,
X39는 S이거나 부재하는,
펩티드.
50. 펩티드로서, 펩티드의 아미노산 서열은 다음과 같으며,
YX2EGTX6TSDYSX12X13LEX16QAAX20X21FX23X24WLLX28GGPX32X33X34X35X36X37X38X39 (서열 번호 36)
이는 C-말단의 선택적인 아미드 변형을 갖고,
여기에서;
X2는 Aib 또는 A이고,
X6은 F 또는 V이고,
X12는 I 또는 Y이고,
X13은 Y, A, L 또는 I이고,
X16은 K 또는 E이고,
X20은 Q, R, E, H이고,
X21은 A 또는 E이고,
X23은 I 또는 V이고,
X24는 E, Q 또는 N이고,
X28은 A 또는 R이고,
X32는 E, S이거나 부재하고,
X33은 S, K이거나 부재하고,
X34는 G이거나 부재하고,
X35는 A이거나 부재하고,
X36은 P이거나 부재하고,
X37은 P이거나 부재하고,
X38은 P이거나 부재하고,
X39는 S이거나 부재하는,
펩티드.
51. 구현예 49에 있어서, X36, X37, X38 및 X39는 부재하는, 펩티드.
52. 구현예 49에 있어서, X34, X35, X36, X37, X38 및 X39는 부재하는, 펩티드.
53. 구현예 49에 있어서, X32, X33, X34, X35, X36, X37, X38 및 X39는 부재하는, 펩티드.
54. 구현예 49에 있어서, X30, X31, X32, X33, X34, X35, X36, X37, X38 및 X39는 부재하는, 펩티드.
55. 구현예 49 또는 50에 있어서, X32X33X34X35는, SSGA, ESGA 및 SKGA의 군으로부터 선택되는, 펩티드.
56. 구현예 55에 있어서, X32X33X34X35는 SSGA인, 펩티드.
57. 구현예 55에 있어서, X32X33X34X35는 ESGA인, 펩티드.
58. 구현예 55에 있어서, X32X33X34X35는 SKGA인, 펩티드.
59. 구현예 47 내지 58 중 어느 하나에 있어서, 펩티드는 C-말단의 아미드 변형을 갖는, 펩티드.
60. 구현예 49에 있어서, 펩티드의 아미노산 서열은 다음과 같으며,
YX2EGTX6TSDYSX12X13LEX16QAAX20X21FX23X24WLLX28GGPSSGAPPPS (서열 번호 37)
여기에서;
X2는 Aib 또는 A이고,
X6은 F 또는 V이고,
X12는 I 또는 Y이고,
X13은 Y, A, L 또는 I이고,
X16은 K 또는 E이고,
X20은 Q, R, E, H이고,
X21은 A 또는 E이고,
X23은 I 또는 V이고,
X24는 E, Q 또는 N이고,
X28은 A 또는 R인,
펩티드.
61. 구현예 48에 있어서, 펩티드의 아미노산 서열은 다음과 같으며,
YX2EGTX6TSDYSX12X13LEX16QAAX20X21FX23X24WLLX28GGPESGAPPPS (서열 번호 38)
여기에서;
X2는 Aib 또는 A이고,
X6은 F 또는 V이고,
X12는 I 또는 Y이고,
X13은 Y, A, L 또는 I이고,
X16은 K 또는 E이고,
X20은 Q, R, E, H이고,
X21은 A 또는 E이고,
X23은 I 또는 V이고,
X24는 E, Q 또는 N이고,
X28은 A 또는 R인,
펩티드.
62. 구현예 49에 있어서, 펩티드의 아미노산 서열은 다음과 같으며,
YX2EGTX6TSDYSX12X13LEX16QAAX20X21FX23X24WLLX28GGPSKGAPPPS (서열 번호 39)
여기에서;
X2는 Aib 또는 A이고,
X6은 F 또는 V이고,
X12는 I 또는 Y이고,
X13은 Y, A, L 또는 I이고,
X16은 K 또는 E이고,
X20은 Q, R, E, H이고,
X21은 A 또는 E이고,
X23은 I 또는 V이고,
X24는 E, Q 또는 N이고,
X28은 A 또는 R인,
펩티드.
63. 구현예 49에 있어서, 펩티드의 아미노산 서열은 서열번호 1 내지 27 또는 33 내지 35 중 어느 하나인, 펩티드.
64. 구현예 63에 있어서, 펩티드는 C-말단의 아미드 변형을 갖는, 펩티드.
65. 구현예 49 내지 64 중 어느 하나에 있어서, X13LEX16QAAX20X21FX23X24는, LLEKQAAREFIN, LLEKQAAREFIE, LLEKQAAQEFIE 및 LLEEQAAREFIE로 이루어진 군으로부터 선택되는, 펩티드.
66. 구현예 49 내지 64 중 어느 하나에 있어서, 펩티드은 실시예 2에 기술된 바와 같은 CRE 루시페라아제 리포터 검정에서 HSA 없이 측정했을 경우, 20 pM 미만의 EC50으로 시험관 내에서 인간 GLP-1 및 GIP 수용체를 활성화시키는, 펩티드.
67. 구현예 49 내지 64 중 어느 하나에 있어서, X16은 K인, 펩티드.
68. 구현예 49 내지 64 중 어느 하나에 있어서, X33은 K인, 펩티드.
69. 구현예 49에 있어서, 펩티드의 아미노산 서열은 서열번호 15, 28, 29, 31, 32 또는 43 중 어느 하나인, 펩티드.
70. 구현예 49에 있어서, 펩티드의 아미노산 서열은 서열번호 31인, 펩티드.
71. 구현예 1 내지 40 중 어느 하나에 따른 화합물을 제조하는, 방법.
72. 구현예 49 내지 64 중 어느 하나에 따른 펩티드를 제조하는, 방법.
73. 구현예 49 내지 70 중 어느 하나에 따른 펩티드를 제조하는, 방법.
방법 및 실시예
약어 목록
알파벳 순서로 나열된 다음의 약어가 하기에서 사용된다:
Ac: 아세틸
Ado(OEG로도 지칭됨): 8-아미노-3,6-디옥사옥탄산
Aib: α-아미노이소부티르산
API: 활성 약학 성분
AUC: 곡선 아래 면적
BG: 혈당
BHK: 새끼 햄스터 신장
Boc: 터트-부틸옥시카르보닐
BW: 체중
CAS: 케미컬 애브스트랙트 서비스(Chemical Abstracts Service)
Cl-HOBt: 6-클로로-1-히드록시벤조티아졸
DCM: 디클로로메탄
DIC: 디이소프로필카르보디이미드
DIPEA: N,N- 디이소프로필에틸아민
DMEM: Dulbecco의 변형된 이글 배지(Dulbecco's Modied Eagle's Medium)
DPBS: Dulbecco 인산염 완충 식염수
EDTA: 에틸렌디아민테트라아세트산
ELISA: 효소-결합 면역흡착 분석
equiv: 몰당량
FBS: 소 태아 혈청
Fmoc: 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐
GIP: 포도당-의존적 인슐린 방출성 폴리펩티드
GIPR: 포도당-의존적 인슐린 방출성 폴리펩티드 수용체
GLP-1: 글루카곤-유사 펩티드 1
GLP-1R: 글루카곤-유사 펩티드 1 수용체
h: 시간
HEPES: 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산
HFIP: 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로-2-프로판올 또는 헥사플루오로이소프로판올
HPLC: 고성능 액상 크로마토그래피
HSA: 인간 혈청 알부민
i.p.: 복강내
IPGTT: 복강내 포도당 내성 시험
i.v.: 정맥 내
LCMS: 액상 크로마토그래피 질량 분광법
LYD: 랜드레이스 요크셔 두록(Landrace Yorkshire Duroc)
MeCN: 아세토니트릴
MeOH: 메탄올
mM: 밀리몰
mmol: 밀리몰
min: 분
Mtt: 4-메틸트리틸
MW: 분자량
nM: 나노몰
NMP: 1-메틸-피롤리딘-2-온
OEG(Ado로도 지칭됨): 8-아미노-3,6-디옥사옥탄산
OtBu: 터트-부틸 에스테르
Oxyma Pure®: 시아노-히드록시이미노-아세트산 에틸 에스테르
Pbf: 2,2,4,6,7-펜타메틸디히드로벤조푸란-5-술포닐
PBS: 인산 완충 식염수
PD: 약력학
PK: 약동학
pM: 피코몰
RP: 역상
RP-HPLC: 역상 고성능 액상 크로마토그래피
rpm: 회전/분
RT: 실온
Rt: 보유 시간
s.c.: 피하
SD: 표준 편차
SEC-HPLC: 크기 배제 고성능 액상 크로마토그래피
SEM: 평균의 표준 오차
SNAC: 나트륨 N-[8-(2-히드록시벤조일)아미노]카프릴레이트
SPPS: 고상 펩티드 합성
tBu: 터트-부틸
TFA: 트리플루오로아세트산
TIS: 트리이소프로필실란
Trt: 트리페닐메틸 또는 트리틸
Trx: 트라넥사민산
일반적인 제조 방법
고상 펩티드 합성 방법(아미노산의 탈보호 방법, 수지로부터 펩티드를 절단하고 정제하는 방법을 포함하는 SPPS 방법)뿐만 아니라 생성된 펩티드를 검출하고 특징을 분석하는 방법(LCMS 방법)이 다음에서 기술된다.
C-말단 펩티드 아미드의 제조에 사용된 수지는 H-Rink Amide-ChemMatrix 수지(예를 들어, 0.5 mmol/g 로딩)였다. 구체적으로 달리 언급되지 않는 한, 사용된 Fmoc 보호된 아미노산 유도체는, 권고된 표준: Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Lys(Mtt)-OH, Fmoc-Aib-OH, 등(예를 들어, AAPPTEC, Anaspec, Bachem, ChemImpex, Iris Biotech, Midwest Biotech, Gyros Protein Technologies에서 공급함)이었다. 다른 것들이 지정되지 않는 경우, 아미노산의 천연 L-형태가 사용된다. 미리 부착된 Boc 기(예를 들어, N-말단에서 Tyr을 갖는 펩티드의 경우 Boc-Tyr(tBu)-OH)를 갖는 시약을 사용하거나, 아미노산을 펩티드 N-말단에 부착한 후 Boc 보호기에 대한 N-말단 Fmoc 보호기를 교환함으로써 N-말단 아미노산을 알파 아미노기에서 Boc 보호하였다.
SPPS를 사용하는 모듈형 알부민 결합 모이어티의 경우, 이하의 적절하게 보호된 빌딩 블록(building block), 예컨대 (이들로 한정되지는 않음) Fmoc-8-아미노-3,6-디옥사옥타논산(Fmoc-Ado-OH), Boc-Lys(Fmoc)-OH, Fmoc-Glu-OtBu, 헥사데칸디온산 모노-터트-부틸 에스테르, 옥타데칸디온산 모노-터트-부틸 에스테르, 노나데칸디온산 모노-터트-부틸 에스테르, 에이코산디온산 모노-터트-부틸 에스테르, 테트라데칸디온산 모노-터트-부틸 에스테르, 또는 4-(9-카르복시노닐옥시) 벤조산 터트-부틸 에스테르를 사용하였다. 다음에 언급된 모든 작업은 0.1 내지 0.2 mmol 합성 규모 범위 내에서 수행하였다.
1. 수지 결합된 보호된 펩티드 골격의 합성
방법: SPPS_A
SPPS는 마이너 수정이 있는 제조업체 제공 프로토콜을 사용하여Protein Technologies SymphonyX 고상 펩티드 합성기에서 Fmoc 기반 화학을 사용하여 수행되었다. 가끔씩 질소로 버블링하여 혼합을 수행하였다. 다음의 단계를 사용하여 단계적 조립을 수행하였다: 1) DMF 중 수지의 사전-팽윤 단계; 2) 각각 10분의 2회 처리에 대해 DMF 중 20% (v/v) 피페리딘의 사용에 의한 Fmoc-탈보호 단계; 3) DMF로 세척하여 피페리딘을 제거하는 단계; 4) 각각 DMF 중 0.6 M 용액으로서의 Fmoc-아미노산(12 당량) 및 Oxyma Pure®(12 당량)의 첨가에 의한 Fmoc-아미노산의 결합, 이어서 DMF 중 1.2 M 용액으로서의 DIC(12 당량)의 첨가, 이어서 DMF를 첨가하여 각 성분의 최종 농도를 0.3 M으로 감소시킨 후 0.5 내지 4시간 동안 혼합하는 단계; 4) DMF로 세척하여 과량의 시약을 제거하는 단계; 5) 조립 완료 시 DCM으로 최종 세척하는 단계. 입체적으로 제약된 아미노산(예를 들어, Aib)에 이어지는 것들과 같은, 그러나 이들로 한정되지 않는 일부 아미노산을 연장된 반응 시간(예를들어, 4시간)을 통해 결합시켜 반응이 완료되도록 하였다.
방법: SPPS_B
Applied Biosystems 431A 고상 펩티드 합성기 상에서 제조업체 제공 일반 Fmoc 프로토콜을 사용하여 Fmoc 전략에 따라 보호된 펩티딜 수지를 합성하였다. 와동과 함께 가끔씩 질소로 버블링하여 혼합을 수행하였다. 다음의 단계를 사용하여 단계적 조립을 수행하였다: 1) NMP 중 1 M 용액으로서의 Cl-HOBt(10 당량) 중 고형 Fmoc-산(10 당량)의 용해에 의한 Fmoc-아미노산의 활성화, 이어서 NMP 중 1 M 용액으로서의 DIC(10 당량) 첨가, 이어서 단계 2 및 3까지 동시에 혼합하는 단계; 2) 3분의 1회 처리, 이어서 15분의 두번째 처리에 대해 NMP 중 20%(v/v) 피페리딘의 사용에 의한 Fmoc-탈보호; 3) NMP로 세척하여 피페리딘을 제거하는 단계; 4) 활성화된 Fmoc-아미노산 용액을 수지에 첨가한 후, 45 내지 90분 동안 혼합하는 단계; 4) NMP로 세척하여 과량의 시약을 제거하는 단계; 5) 조립 완료 시 DCM으로 최종 세척하는 단계. 위에 열거된 표준 보호된 아미노산 유도체를 사전에 칭량한 카트리지(예를 들어, Midwest Biotech 제품)에 공급하고, 비표준 유도체를 수작업으로 칭량하였다. 입체적으로 제약된 아미노산(예를 들어, Aib)에 이어지는 것들과 같은, 그러나 이들로 한정되지 않는 일부 아미노산을 "이중 결합"시켜 반응이 완료되도록 하였는데, 이는 첫 번째 결합(예를 들어, 45분) 후에, 수지를 배출시키고, 더 많은 시약(Fmoc-아미노산, DIC, Cl-HOBt)을 첨가하고, 혼합물을 다시 반응시켰음(예를 들어, 45분)을 의미한다.
방법: SPPS_C
SPPS는 마이너 수정이 있는 제조업체 제공 프로토콜을 사용하여PreludeX 고상 펩티드 합성기에서 Fmoc 기반 화학을 사용하여 수행되었다. 350 rpm에서 진탕하고 가끔씩 질소로 버블링하여 혼합을 수행하였다. 다음의 단계를 사용하여 단계적 조립을 수행하였다: 1) DMF 중 수지의 사전-팽윤 단계; 2) 70℃에서의 3분의 1회 처리에 대해 DMF 중 20% (v/v) 피페리딘의 사용에 의한 Fmoc-탈보호 단계; 3) DMF로 세척하여 피페리딘을 제거하는 단계; 4) 각각 DMF 중 0.4 M 용액으로서의 Fmoc-아미노산(12 당량) 및 Oxyma Pure®(12 당량)의 첨가에 의한 Fmoc-아미노산의 결합, 이어서 DMF 중 1.2 M 용액으로서의 DIC(12 당량)의 첨가, 이어서 70℃에서 5분 동안 혼합하는 단계; 4) DMF로 세척하여 과량의 시약을 제거하는 단계; 5) 조립 완료 시 DCM으로 최종 세척하는 단계. 입체적으로 제약된 아미노산(예를 들어, Aib)에 이어지는 것들과 같은, 그러나 이들로 한정되지 않는 일부 아미노산을 연장된 반응 시간(예를 들어, 15분)을 통해 결합시켜 반응이 완료되도록 하였다.
2. 수지 결합된 보호된 펩티드 골격에 대한 치환기의 부착
방법: SC_A
각각 45분의 2회 처리에 대해 DCM 중 30% HFIP로 수지를 세척한 후, DCM 및 DMF로 세척하여 N-엡실론-리신 보호 Mtt 보호기를 제거하였다. Protein Technologies SymphonyX 고상 펩티드 합성기 상에서, Boc-Lys(Fmoc)-OH, Fmoc-8-아미노-3,6-디옥사옥탄산, Fmoc-Glu-OtBu, 헥사데칸디온산 모노-터트-부틸 에스테르, 옥타데칸디온산 모노-터트-부틸 에스테르, 및 에이코산디온산 모노-터트-부틸-에스테르와 같은, 그러나 이들로 한정되지 않는 빌딩 블록의 단계적인 첨가를 사용하는, 방법 SPPS_A에 기술된 프로토콜을 사용하여 아실화를 수행하였다.
방법: SC_B
각각 45분의 2회 처리에 대해 DCM 중 30% HFIP로 수지를 세척한 후, DCM 및 DMF로 세척하여 N-엡실론-리신 보호 Mtt 보호기를 제거하였다. Applied Biosystems 431A 고상 펩티드 합성기 상에서, Boc-Lys(Fmoc)-OH, Fmoc-8-아미노-3,6-디옥사옥탄산, Fmoc-Glu-OtBu, 헥사데칸디온산 모노-터트-부틸 에스테르, 옥타데칸디온산 모노-터트-부틸 에스테르, 및 에이코산디온산 모노-터트-부틸-에스테르와 같은, 그러나 이들로 한정되지 않는 빌딩 블록의 단계적인 첨가를 사용하는, 방법 SPPS_B에 기술된 프로토콜을 사용하여 아실화를 수행하였다.
방법: SC_C
각각 45분의 2회 처리에 대해 DCM 중 30% HFIP로 수지를 세척한 후, DCM 및 DMF로 세척하여 N-엡실론-리신 보호 Mtt 보호기를 제거하였다. Protein Technologies PreludeX 고상 펩티드 합성기 상에서, Boc-Lys(Fmoc)-OH, Fmoc-8-아미노-3,6-디옥사옥탄산, Fmoc-Glu-OtBu, 헥사데칸디온산 모노-터트-부틸 에스테르, 옥타데칸디온산 모노-터트-부틸 에스테르, 및 에이코산디온산 모노-터트-부틸-에스테르와 같은, 그러나 이들로 한정되지 않는 빌딩 블록의 단계적인 첨가를 사용하는, 방법 SPPS_C에 기술된 프로토콜을 사용하여 아실화를 수행하였다.
3. 수지 결합된 펩티드의 절단 및 정제
방법: CP_A
측쇄 합성을 완료한 후, 펩티딜 수지를 DCM으로 세척하여 건조시킨 후, TFA/물/TIS(95:2.5:2.5 v/v/v)로 약 2시간 동안 처리한 다음, 디에틸 에테르로 침전시켰다. 침전물을 디에틸 에테르로 세척하고, 적절한 용매(예를 들어, 2:1 물/MeCN)에 용해시키고, 모든 불안정한 부가물이 분해될 때까지 그대로 두었다. 정제는 Phenomenex Luna C8(2) 컬럼(10 μM 입자 크기, 100 Å 기공 크기, 250 x 21.2 mm 치수)을 이용해 역상 분취 HPLC(Waters 2545 이진 구배 모듈, Waters 2489 UV/가시광 검출기, Waters 분획 수집기 III)로 수행하였다. 불순물 분리 및 생성물의 용리는 0.1% TFA를 함유하는 물 중 증가하는 MeCN의 구배를 사용하여 달성하였다. 분석 LCMS로 관련 분획을 식별하고 순도를 측정하였다. 순수한 목적하는 생성물을 함유하는 분획을 풀링하고 동결 건조시켜 펩티드의 TFA 염을 백색 고형물로서 수득하였다.
4. TFA에서 나트륨 염으로의 염 교환:
방법: SX_A:
방법 CP_A로부터 단리된 동결 건조된 펩티드를 적절한 수성 완충액(예를 들어, 4:1 물/MeCN, 0.2 M 아세트산 나트륨)에 5 내지 20 mg/mL까지 용해시키고, 필요한 경우 1 M NaOH로 pH 7 내지 8로 조정하여 완전한 용해도를 달성하였다. 펩티드를 함유하는 완충액을 Sep-Pak C18 카트리지(0.5 내지 2 g)를 사용하여 염 교환하였다. 4 컬럼 부피의 이소프로판올, 이어서 4 컬럼 부피의 MeCN, 이어서 8 컬럼 부피의 물을 사용하여 카트리지를 먼저 평형화하였다. 펩티드 용액을 카트리지에 붓고, 흘러 넘친 것들을 다시 부어 펩티드가 완전히 보유되되록 하였다. 카트리지를 4 컬럼 부피의 물로 세척한 다음, NaHCO3, NaOAc, 또는 Na2HPO4와 같은, 그러나 이들로 한정되지 않는 나트륨 염을 함유하는 10 컬럼 부피의 완충액(예를 들어, pH 7.5)으로 세척하였다. 컬럼을 4 컬럼 부피의 물로 세척하고, 펩티드를 5 내지 10 컬럼 부피의 물 중 50 내지 80% MeCN으로 용리시켰다. 펩티드 함유 용리액을 동결 건조시켜 펩티드 나트륨 염을 백색 고형분으로서 수득하였고, 이를 이와 같이 사용하였다.
일반적인 검출 및 특징 분석 방법
LCMS 방법:
방법: LCMS_A
LCMS_A는 Agilent 1260 Infinity 시리즈 UPLC 시스템 및 Agilent Technologies 6120 Quadrupole MS으로 구성된 환경에서 수행되었다. 용리액: A: 물 중 0.05% TFA; B: 9:1 MeCN/물 중 0.05% TFA.
적절한 볼륨의 샘플을 실온에서(컬럼 온도 37℃ 컬럼 상에 주입하고 A와 B의 구배로 용리하여 분석을 수행하였다. 컬럼: Phenomenex Kinetex C8, 2.6 μm, 100 Å, 4.6 x 75 mm. 구배 가동 시간: 1.0 mL/분의 유속으로 10분에 걸쳐 선형 10 내지 80% B. 감지: 214 nm로 설정된 다이오드 어레이 감지기. MS 이온화 모드: API-ES, 양의 극성. MS 스캔 질량 범위: 500 내지 2000 amu. 각 m/z의 가장 풍부한 동위원소가 보고됨.
방법: LCMS_B
LCMS_B는 Agilent 1260 Infinity 시리즈 UPLC 시스템 및 Agilent Technologies 6120 Quadrupole MS으로 구성된 환경에서 수행되었다. 용리액: A: 물 중 0.05% TFA; B: 9:1 MeCN/물 중 0.05% TFA.
적절한 볼륨의 샘플을 실온에서(컬럼 온도 37℃ 컬럼 상에 주입하고 A와 B의 구배로 용리하여 분석을 수행하였다. 컬럼: Phenomenex Kinetex C8, 2.6 μm, 100 Å, 4.6 x 75 mm. 구배 가동 시간: 1.0 mL/분의 유속으로 10분에 걸쳐 선형 20 내지 100% B. 감지: 214 nm로 설정된 다이오드 어레이 감지기. MS 이온화 모드: API-ES, 양의 극성. MS 스캔 질량 범위: 500 내지 2000 amu. 각 m/z의 가장 풍부한 동위원소가 보고됨.
본 발명의 특정 특징들이 본원에 예시되고 기술되었지만, 많은 변형, 치환, 변경 및 균등물이 이제 당업자에게 발생할 것이다. 따라서, 첨부된 구현예는 본 발명의 진정한 사상 내에 속하는 모든 이러한 수정 및 변경을 포함하도록 의도된 것으로 이해해야 한다.
실시예 1: 화합물의 합성
화합물은 Aib를 제외하고, 단일 문자 아미노산 코드를 사용하여 다음에 기술되어 있다. 치환기는 그것이 부착된 리신(K) 잔기 뒤에 포함된다.
화합물 1
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLE-K[(2S)-2-아미노-6-[[(2S)-2-아미노-6-[[(4S)-4-카르복시-4-(19-카르복시노나데카노일아미노)부타노일]아미노]헥사노일]아미노]헥사노일]-QAAQEFVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
Figure pct00035
C-말단 아미드 변형을 갖는 서열번호 1; 치환기: C; 치환기 위치: K16
합성 방법: SPPS_A; SC_B; CP_A
계산된 분자량(평균): 4873.5 Da
LCMS_A: Rt = 6.0분; [M+3H]3+ 1625.4, [M+4H]4+ 1219.1로 발견됨.
화합물 2
Y-Aib-EGTFTSDYSYYLE-K[(2S)-2-아미노-6-[[(2S)-2-아미노-6-[[(4S)-4-카르복시-4-(19-카로복시노나데카노일아미노)부타노일]아미노]헥사노일]아미노]헥사노일]-QAAQEFVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
Figure pct00036
C-말단 아미드 변형을 갖는 서열번호 2; 치환기: C; 치환기 위치: K16
합성 방법: SPPS_A; SC_B; CP_A
계산된 분자량(평균): 4923.5 Da
LCMS_A: Rt = 6.0분; [M+3H]3+ 1641.8, [M+4H]4+ 1237.5로 발견됨.
화합물 3
Y-Aib-EGTFTSDYSYYLE-K[(2S)-2-아미노-6-[[(2S)-2-아미노-6-[[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데카노일아미노)부타노일]아미노]헥사노일]아미노]헥사노일]-QAAQEFVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
Figure pct00037
C-말단 아미드 변형을 갖는 서열번호 2; 치환기: B; 치환기 위치: K16
합성 방법: SPPS_A; SC_B; CP_A
계산된 분자량(평균): 4895.4 Da
LCMS_A: Rt = 5.7분; [M+3H]3+ 1632.7, [M+4H]4+ 1224.6으로 발견됨.
화합물 4
Y-Aib-EGTFTSDYSYYLE-K[(2S)-2-아미노-6-[[(2S)-2-아미노-6-[[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데카노일아미노)부타노일]아미노]헥사노일]아미노]헥사노일]-QAAQAFVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
Figure pct00038
C-말단 아미드 변형을 갖는 서열번호 3; 치환기: B; 치환기 위치: K16
합성 방법: SPPS_A; SC_B; CP_A
계산된 분자량(평균): 4837.4 Da
LCMS_A: Rt = 5.7분; [M+3H]3+ 1613.3, [M+4H]4+ 1210.1로 발견됨.
화합물 5
Y-Aib-EGTFTSDYSYYLE-K[(2S)-2-아미노-6-[[(2S)-2-아미노-6-[[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데카노일아미노)부타노일]아미노]헥사노일]아미노]헥사노일]-QAAQAFVNWLLAGGPSSGAPPPS-OH
Figure pct00039
서열 번호 3; 치환기: B; 치환기 위치: K16
합성 방법: SPPS_B; SC_B; CP_A
계산된 분자량(평균): 4838.4 Da
LCMS_A: Rt = 5.7분; [M+3H]3+ 1613.6, [M+4H]4+ 1210.4로 발견됨.
화합물 6
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLE-K[(2S)-2-아미노-6-[[(2S)-2-아미노-6-[[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데카노일아미노)부타노일]아미노]헥사노일]아미노]헥사노일]-QAAREFVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
Figure pct00040
C-말단 아미드 변형을 갖는 서열번호 4; 치환기: B; 치환기 위치: K16
합성 방법: SPPS_B; SC_B; CP_A
계산된 분자량(평균): 4873.5 Da
LCMS_A: Rt = 5.6분; [M+3H]3+ 1625.3, [M+4H]4+ 1219.1로 발견됨.
화합물 7
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLE-K[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-QAAREFVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
Figure pct00041
C-말단 아미드 변형을 갖는 서열번호 4; 치환기: A; 치환기 위치: K16
합성 방법: SPPS_B; SC_B; CP_A
계산된 분자량(평균): 4907.4 Da
LCMS_A: Rt = 6.3분; [M+3H]3+ 1636.5, [M+4H]4+ 1227.9로 발견됨.
화합물 8
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLE-K[(2S)-2-아미노-6-[[(2S)-2-아미노-6-[[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데카노일아미노)부타노일]아미노]헥사노일]아미노]헥사노일]-QAAREFINWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
Figure pct00042
C-말단 아미드 변형을 갖는 서열번호 5; 치환기: B; 치환기 위치: K16
합성 방법: SPPS_A; SC_A; CP_A
계산된 분자량(평균): 4887.5 Da
LCMS_A: Rt = 5.7분; [M+3H]3+ 1629.8, [M+4H]4+ 1222.8로 발견됨.
화합물 9
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLE-K[(2S)-2-아미노-6-[[(2S)-2-아미노-6-[[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데카노일아미노)부타노일]아미노]헥사노일]아미노]헥사노일]-QAAREFIEWLLAGGPSSGAPPPS-OH
Figure pct00043
서열 번호 6; 치환기: B; 치환기 위치: K16
합성 방법: SPPS_A; SC_B; CP_A
계산된 분자량(평균): 4903.5 Da
LCMS_A: Rt = 5.8분; [M+3H]3+ 1635.2, [M+4H]4+ 1226.8로 발견됨.
화합물 10
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLE-K[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-QAAREFIEWLLAGGPSSGAPPPS-OH
Figure pct00044
서열 번호 6; 치환기: A; 치환기 위치: K16
합성 방법: SPPS_A; SC_B; CP_A
계산된 분자량(평균): 4937.5 Da
LCMS_A: Rt = 6.5분; [M+3H]3+ 1646.6, [M+4H]4+ 1235.1로 발견됨.
화합물 11
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLE-K[(2S)-2-아미노-6-[[(2S)-2-아미노-6-[[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데카노일아미노)부타노일]아미노]헥사노일]아미노]헥사노일]-QAAREFINWLLAGGPSSGAPPPS-OH
Figure pct00045
서열 번호 5; 치환기: B; 치환기 위치: K16
합성 방법: SPPS_A; SC_C; CP_A
계산된 분자량(평균): 4888.5 Da
LCMS_A: Rt = 5.7분; [M+3H]3+ 1630.2, [M+4H]4+ 1222.9로 발견됨.
화합물 12
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLE-K[(2S)-2-아미노-6-[[(2S)-2-아미노-6-[[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데카노일아미노)부타노일]아미노]헥사노일]아미노]헥사노일]-QAAREFIEWLLRGGPSSGAPPPS-OH
Figure pct00046
합성 방법: SPPS_A; SC_C; CP_A
서열 번호 7; 치환기: B; 치환기 위치: K16
계산된 분자량(평균): 4988.6 Da
LCMS_A: Rt = 5.7분; [M+3H]3+ 1663.6, [M+4H]4+ 1248.0으로 발견됨.
화합물 13
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLE-K[(2S)-2-아미노-6-[[(2S)-2-아미노-6-[[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데카노일아미노)부타노일]아미노]헥사노일]아미노]헥사노일]-QAAREFIEWLLRGGPESGAPPPS-OH
Figure pct00047
서열 번호 8; 치환기: B; 치환기 위치: K16
합성 방법: SPPS_A; SC_C; CP_A
계산된 분자량(평균): 5030.6 Da
LCMS_A: Rt = 5.7분; [M+3H]3+ 1677.7, [M+4H]4+ 1258.4로 발견됨.
화합물 14
Y-Aib-EGTFTSDYSIALE-K[(2S)-2-아미노-6-[[(2S)-2-아미노-6-[[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데카노일아미노)부타노일]아미노]헥사노일]아미노]헥사노일]-QAAREFINWLLAGGPSSGAPPPS-OH
Figure pct00048
서열 번호 9; 치환기: B; 치환기 위치: K16
합성 방법: SPPS_A; SC_C; CP_A
계산된 분자량(평균): 4796.4 Da
LCMS_A: Rt = 5.7분; [M+3H]3+ 1599.6, [M+4H]4+ 1199.8로 발견됨.
화합물 15
Y-Aib-EGTFTSDYSILLE-K[(2S)-2-아미노-6-[[(2S)-2-아미노-6-[[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데카노일아미노)부타노일]아미노]헥사노일]아미노]헥사노일]-QAAREFINWLLAGGPSSGAPPPS-OH
Figure pct00049
서열 번호 10; 치환기: B; 치환기 위치: K16
합성 방법: SPPS_A; SC_A; CP_A; SX_A
계산된 분자량(평균): 4838.5 Da
LCMS_A: Rt = 5.8분; [M+3H]3+ 1613.4, [M+4H]4+ 1210.3으로 발견됨.
화합물 16
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLE-K[(2S)-2-아미노-6-[[(2S)-2-아미노-6-[[(4S)-4-카르복시-4-(19-카르복시노나데카노일아미노)부타노일]아미노]헥사노일]아미노]헥사노일]-QAAREFINWLLAGGPSSGAPPPS-OH
Figure pct00050
서열 번호 5; 치환기: C; 치환기 위치: K16
합성 방법: SPPS_A; SC_A; CP_A
계산된 분자량(평균): 4916.5 Da
LCMS_A: Rt = 6.0분; [M+3H]3+ 1639.6, [M+4H]4+ 1229.9로 발견됨.
화합물 17
YAEGTFTSDYSIYLE-K[(2S)-2-아미노-6-[[(2S)-2-아미노-6-[[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데카노일아미노)부타노일]아미노]헥사노일]아미노]헥사노일]-QAAREFINWLLAGGPSSGAPPPS-OH
Figure pct00051
화합물 18
Y-Aib-EGTFTSDYSILLE-K[(2S)-2-아미노-6-[[(2S)-2-아미노-6-[[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데카노일아미노)부타노일]아미노]헥사노일]아미노]헥사노일]-QAAREFINWLLAG-OH
Figure pct00052
서열 번호 12; 치환기: B; 치환기 위치: K16
합성 방법: SPPS_A; SC_A; CP_A
계산된 분자량(평균): 4003.6 Da
LCMS_A: Rt = 6.2분; [M+3H]3+ 1335.3, [M+4H]4+ 1001.7로 발견됨.
화합물 19
Y-Aib-EGTFTSDYSILLE-K[(2S)-2-아미노-6-[[(2S)-2-아미노-6-[[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데카노일아미노)부타노일]아미노]헥사노일]아미노]헥사노일]-QAAREFINWLLAGGP-OH
Figure pct00053
서열 번호 13; 치환기: B; 치환기 위치: K16
합성 방법: SPPS_A; SC_A; CP_A
계산된 분자량(평균): 4157.8 Da
LCMS_A: Rt = 6.1분; [M+3H]3+ 1386.6, [M+4H]4+ 1040.3으로 발견됨.
화합물 20
Y-Aib-EGTFTSDYSILLE-K[(2S)-2-아미노-6-[[(2S)-2-아미노-6-[[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데카노일아미노)부타노일]아미노]헥사노일]아미노]헥사노일]-QAAREFINWLLAGGPSS-OH
Figure pct00054
서열 번호 14; 치환기: B; 치환기 위치: K16
합성 방법: SPPS_A; SC_A; CP_A
계산된 분자량(평균): 4331.9 Da
LCMS_A: Rt = 5.9분; [M+3H]3+ 1444.7, [M+4H]4+ 1083.7로 발견됨.
화합물 21
Y-Aib-EGTFTSDYSILLE-K[(2S)-2-아미노-6-[[(2S)-2-아미노-6-[[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데카노일아미노)부타노일]아미노]헥사노일]아미노]헥사노일]-QAAR-EFINWLLAGGPSSGA-OH
Figure pct00055
서열 번호 15; 치환기: B; 치환기 위치: K16
합성 방법: SPPS_A; SC_A; CP_A
계산된 분자량(평균): 4460.0 Da
LCMS_A: Rt = 5.9분; [M+3H]3+ 1487.5, [M+4H]4+ 1116.1로 발견됨.
화합물 22
Y-Aib-EGTFTSDYSILLE-K[(2S)-2-아미노-6-[[(2S)-2-아미노-6-[[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데카노일아미노)부타노일]아미노]헥사노일]아미노]헥사노일]-QAAREFVNWLLAGGPSSGAPPPS-OH
Figure pct00056
서열 번호 16; 치환기: B; 치환기 위치: K16
합성 방법: SPPS_A; SC_A; CP_A
계산된 분자량(평균): 4824.4 Da
LCMS_A: Rt = 5.7분; [M+3H]3+ 1608.9, [M+4H]4+ 1206.9로 발견됨.
화합물 23
Y-Aib-EGTFTSDYSILLE-K[(2S)-2-아미노-6-[[(2S)-2-아미노-6-[[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데카노일아미노)부타노일]아미노]헥사노일]아미노]헥사노일]-QAAREFIQWLLAGGPSSGAPPPS-OH
Figure pct00057
서열 번호 17; 치환기: B; 치환기 위치: K16
합성 방법: SPPS_A; SC_A; CP_A
계산된 분자량(평균): 4852.5 Da
LCMS_A: Rt = 5.9분; [M+3H]3+ 1618.4, [M+4H]4+ 1214.1로 발견됨.
화합물 24
Y-Aib-EGTFTSDYSILLE-K[(2S)-2-아미노-6-[[(2S)-2-아미노-6-[[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데카노일아미노)부타노일]아미노]헥사노일]아미노]헥사노일]-QAAQEFINWLLAGGPSSGAPPPS-OH
Figure pct00058
서열 번호 18; 치환기: B; 치환기 위치: K16
합성 방법: SPPS_A; SC_C; CP_A
계산된 분자량(평균): 4810.4 Da
LCMS_A: Rt = 6.0분; [M+3H]3+ 1604.0, [M+4H]4+ 1203.4로 발견됨.
화합물 25
Y-Aib-EGTFTSDYSILLE-K[(2S)-2-아미노-6-[[(2S)-2-아미노-6-[[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데카노일아미노)부타노일]아미노]헥사노일]아미노]헥사노일]-QAAEEFINWLLAGGPSSGAPPPS-OH
Figure pct00059
서열 번호 19; 치환기: B; 치환기 위치: K16
합성 방법: SPPS_A; SC_C; CP_A
계산된 분자량(평균): 4811.4 Da
LCMS_A: Rt = 6.1분; [M+3H]3+ 1604.4, [M+4H]4+ 1203.6으로 발견됨.
화합물 26
Y-Aib-EGTFTSDYSILLE-K[(2S)-2-아미노-6-[[(2S)-2-아미노-6-[[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데카노일아미노)부타노일]아미노]헥사노일]아미노]헥사노일]-QAAHEFINWLLAGGPSSGAPPPS-OH
Figure pct00060
서열 번호 20; 치환기: B; 치환기 위치: K16
합성 방법: SPPS_A; SC_C; CP_A
계산된 분자량(평균): 4819.4 Da
LCMS_A: Rt = 5.8분; [M+3H]3+ 1607.1, [M+4H]4+ 1205.5로 발견됨.
화합물 27
Y-Aib-EGTFTSDYSILLE-K[(2S)-2-아미노-6-[[(2S)-2-아미노-6-[[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데카노일아미노)부타노일]아미노]헥사노일]아미노]헥사노일]-QAAREFIEWLLRGGPSSGAPPPS-OH
Figure pct00061
서열 번호 21; 치환기: B; 치환기 위치: K16
합성 방법: SPPS_A; SC_C; CP_A
계산된 분자량(평균): 4938.6 Da
LCMS_A: Rt = 5.7분; [M+3H]3+ 1646.9, [M+4H]4+ 1235.4로 발견됨.
화합물 28
Y-Aib-EGTFTSDYSILLE-K[(2S)-2-아미노-6-[[(2S)-2-아미노-6-[[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데카노일아미노)부타노일]아미노]헥사노일]아미노]헥사노일]-QAAREFIEWLLRGGPESGAPPPS-OH
Figure pct00062
서열 번호 22; 치환기: B; 치환기 위치: K16
합성 방법: SPPS_A; SC_A; CP_A; SX_A
계산된 분자량(평균): 4980.6 Da
LCMS_A: Rt = 5.8분; [M+3H]3+ 1660.7, [M+4H]4+ 1246.0으로 발견됨.
화합물 29
Y-Aib-EGTFTSDYSILLE-K[(2S)-2-아미노-6-[[(2S)-2-아미노-6-[[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데카노일아미노)부타노일]아미노]헥사노일]아미노]헥사노일]-QAAQEFIEWLLAGGPSSGAPPPS-OH
Figure pct00063
서열 번호 23; 치환기: B; 치환기 위치: K16
합성 방법: SPPS_A; SC_A; CP_A; SX_A
계산된 분자량(평균): 4825.4 Da
LCMS_A: Rt = 6.1분; [M+3H]3+ 1609.3, [M+4H]4+ 1207.0으로 발견됨.
화합물 30
Y-Aib-EGTFTSDYSILLE-K[(2S)-2-아미노-6-[[(2S)-2-아미노-6-[[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데카노일아미노)부타노일]아미노]헥사노일]아미노]헥사노일]-QAAHEFIEWLLAGGPSSGAPPPS-OH
Figure pct00064
서열 번호 24; 치환기: B; 치환기 위치: K16
합성 방법: SPPS_A; SC_A; CP_A
계산된 분자량(평균): 4834.4 Da
LCMS_A: Rt = 5.8분; [M+3H]3+ 1612.1, [M+4H]4+ 1209.3으로 발견됨.
화합물 31
Y-Aib-EGTFTSDYSILLE-K[(2S)-2-아미노-6-[[(2S)-2-아미노-6-[[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데카노일아미노)부타노일]아미노]헥사노일]아미노]헥사노일]-QAAREFIEWLLAGGPSSGAPPPS-OH
Figure pct00065
서열 번호 25; 치환기: B; 치환기 위치: K16
합성 방법: SPPS_A; SC_A; CP_A; SX_A
계산된 분자량(평균): 4853.5 Da
LCMS_A: Rt = 5.9분; [M+3H]3+ 1618.5, [M+4H]4+ 1214.2로 발견됨.
화합물 32
Y-Aib-EGTFTSDYSILLE-K[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-QAAREFIEWLLAGGPSSGAPPPS-OH
Figure pct00066
서열 번호 25; 치환기: A; 치환기 위치: K16
합성 방법: SPPS_A; SC_A; CP_A
계산된 분자량(평균): 4887.4 Da
LCMS_A: Rt = 6.6분; [M+3H]3+ 1629.8, [M+4H]4+ 1222.8로 발견됨.
화합물 33
Y-Aib-EGTVTSDYSILLE-K[(2S)-2-아미노-6-[[(2S)-2-아미노-6-[[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데카노일아미노)부타노일]아미노]헥사노일]아미노]헥사노일]-QAAREFINWLLAGGPSSGAPPPS-OH
Figure pct00067
서열 번호 26; 치환기: B; 치환기 위치: K16
합성 방법: SPPS_A; SC_A; CP_A
계산된 분자량(평균): 4790.4 Da
LCMS_A: Rt = 5.8분; [M+3H]3+ 1597.4, [M+4H]4+ 1198.3으로 발견됨.
화합물 34
Y-Aib-EGTFTSDYSIILE-K[(2S)-2-아미노-6-[[(2S)-2-아미노-6-[[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데카노일아미노)부타노일]아미노]헥사노일]아미노]헥사노일]-QAAREFINWLLAGGPSSGAPPPS-OH
Figure pct00068
서열 번호 27; 치환기: B; 치환기 위치: K16
합성 방법: SPPS_A; SC_A; CP_A
계산된 분자량(평균): 4838.5 Da
LCMS_A: Rt = 5.8분; [M+3H]3+ 1613.4, [M+4H]4+ 1210.3으로 발견됨.
화합물 35
Y-Aib-EGTFTSDYSILLE-K[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-QAAREFINWLLAGGPSSGAPPPS-OH
Figure pct00069
서열 번호 10; 치환기: A; 치환기 위치: K16
합성 방법: SPPS_A; SC_A; CP_A
계산된 분자량(평균): 4872.4 Da
LCMS_A: Rt = 6.6분; [M+3H]3+ 1624.9, [M+4H]4+ 1218.9로 발견됨.
화합물 36
Y-Aib-EGTFTSDYSIILE-K[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-QAAREFINWLLAGGPSSGAPPPS-OH
Figure pct00070
서열 번호 27; 치환기: A; 치환기 위치: K16
합성 방법: SPPS_A; SC_A; CP_A
계산된 분자량(평균): 4872.4 Da
LCMS_A: Rt = 6.5분; [M+3H]3+ 1624.8, [M+4H]4+ 1218.9로 발견됨.
화합물 37
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLEEQAAR-K[(2S)-2-아미노-6-[[(2S)-2-아미노-6-[[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데카노일아미노)부타노일]아미노]헥사노일]아미노]헥사노일]-FINWLLAGGPSSGAPPPS-OH
Figure pct00071
서열 번호 28; 치환기: B; 치환기 위치: K21
합성 방법: SPPS_A; SC_C; CP_A
계산된 분자량(평균): 4888.5 Da
LCMS_A: Rt = 6.0분; [M+3H]3+ 1630.3, [M+4H]4+ 1223.0으로 발견됨.
화합물 38
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLEE-K[(2S)-2-아미노-6-[[(2S)-2-아미노-6-[[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데카노일아미노)부타노일]아미노]헥사노일]아미노]헥사노일]-AAREFINWLLAGGPSSGAPPPS-OH
Figure pct00072
서열 번호 29; 치환기: B; 치환기 위치: K17
합성 방법: SPPS_C; SC_C; CP_A
계산된 분자량(평균): 4889.5 Da
LCMS_A: Rt = 6.0분; [M+3H]3+ 1630.6, [M+4H]4+ 1223.2로 발견됨.
화합물 39
Y-Aib-EGTFTSDYSILLEEQAAR-K[(2S)-2-아미노-6-[[(2S)-2-아미노-6-[[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데카노일아미노)부타노일]아미노]헥사노일]아미노]헥사노일]-FINWLLAGGPSSGAPPPS-OH
Figure pct00073
서열 번호 30; 치환기: B; 치환기 위치: K21
합성 방법: SPPS_A; SC_C; CP_A
계산된 분자량(평균): 4838.5 Da
LCMS_A: Rt = 6.2분; [M+3H]3+ 1613.5, [M+4H]4+ 1210.4로 발견됨.
화합물 40
Y-Aib-EGTFTSDYS-K[(2S)-2-아미노-6-[[(2S)-2-아미노-6-[[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데카노일아미노)부타노일]아미노]헥사노일]아미노]헥사노일]-LLEEQAAREFIEWLLAGGPSSGAPPPS-OH
Figure pct00074
서열 번호 31; 치환기: B; 치환기 위치: K12
합성 방법: SPPS_A; SC_A; CP_A
계산된 분자량(평균): 4869.4 Da
LCMS_A: Rt = 5.7분; [M+3H]3+ 1623.8, [M+4H]4+ 1218.2로 발견됨.
화합물 41
Y-Aib-EGTFTSDYS-K[(2S)-2-아미노-6-[[(2S)-2-아미노-6-[[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데카노일아미노)부타노일]아미노]헥사노일]아미노]헥사노일]-YLEEQAAREFINWLLAGGPSSGAPPPS-OH
Figure pct00075
서열 번호 32; 치환기: B; 치환기 위치: K12
합성 방법: SPPS_A; SC_A; CP_A
계산된 분자량(평균): 4904.4 Da
LCMS_A: Rt = 5.7분; [M+3H]3+ 1635.4, [M+4H]4+ 1226.7로 발견됨.
화합물 42
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLEEQAAREFINWLLAGGPS-K[(2S)-2-아미노-6-[[(2S)-2-아미노-6-[[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데카노일아미노)부타노일]아미노]헥사노일]아미노]헥사노일]-GAPPPS-OH
Figure pct00076
서열 번호 33; 치환기: B; 치환기 위치: K33
합성 방법: SPPS_A; SC_A; CP_A
계산된 분자량(평균): 4930.5 Da
LCMS_A: Rt = 6.2분; [M+3H]3+ 1644.2, [M+4H]4+ 1233.4로 발견됨.
화합물 43
Y-Aib-EGTFTSDYSILLEEQAAREFIEWLLAGGPS-K[(2S)-2-아미노-6-[[(2S)-2-아미노-6-[[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데카노일아미노)부타노일]아미노]헥사노일]아미노]헥사노일]-GAPPPS-OH
Figure pct00077
서열 번호 34; 치환기: B; 치환기 위치: K33
합성 방법: SPPS_A; SC_A; CP_A
계산된 분자량(평균): 4895.5 Da
LCMS_A: Rt = 6.3분; [M+3H]3+ 1632.4, [M+4H]4+ 1224.6으로 발견됨.
화합물 44
Y-Aib-EGTFTSDYSILLEEQAAREFINWLLAGGPS-K[(2S)-2-아미노-6-[[(2S)-2-아미노-6-[[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데카노일아미노)부타노일]아미노]헥사노일]아미노]헥사노일]-GAPPPS-OH
Figure pct00078
서열 번호 35; 치환기: B; 치환기 위치: K33
합성 방법: SPPS_A; SC_A; CP_A
계산된 분자량(평균): 4880.5 Da
LCMS_A: Rt = 6.2분; [M+3H]3+ 1627.5, [M+4H]4+ 1220.9로 발견됨.
화합물 45
Y-Aib-EGTFTSDYSILLEEQAAREFIEWLLAGGPS-K[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(17-카르복시헵타데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-GAPPPS-OH
Figure pct00079
서열 번호 34; 치환기: A; 치환기 위치: K33
합성 방법: SPPS_A; SC_A; CP_A
계산된 분자량(평균): 4929.5 Da
LCMS_A: Rt = 6.6분; [M+3H]3+ 1643.8, [M+4H]4+ 1233.1로 발견됨.
화합물 46
Y-Aib-EGTFTSDYSILLEEQAAREFIEWLLAGGPS-K[(2S)-2-아미노-6-[[(2S)-2-아미노-6-[[(4S)-4-카르복시-4-(15-카르복시펜타데카노일아미노)부타노일]아미노]헥사노일]아미노]헥사노일]-GAPPPS-OH
Figure pct00080
서열 번호 34; 치환기: E; 치환기 위치: K33
합성 방법: SPPS_A; SC_A; CP_A
계산된 분자량(평균): 4867.5 Da
LCMS_A: Rt = 6.1분; [M+3H]3+ 1623.1, [M+4H]4+ 1217.6으로 발견됨.
화합물 47
Y-Aib-EGTFTSDYSILLEEQAAREFIEWLLAGGPS-K[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-카르복시-4-(15-카르복시펜타데카노일아미노)부타노일]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]아세틸]-GAPPPS-OH
Figure pct00081
서열 번호 34; 치환기: D; 치환기 위치: K33
합성 방법: SPPS_A; SC_A; CP_A
계산된 분자량(평균): 4901.4 Da
LCMS_A: Rt = 6.3분; [M+3H]3+ 1634.6, [M+4H]4+ 1226.1로 발견됨.
실시예 2: 시험관 내 기증적 효능(CRE 루시페라아제; 전세포)
본 실시예의 목적은 인간 GLP-1 및 GIP 수용체에서 시험관 내에서의 화합물의 기능적 활성 또는 효능을 시험하는 것이다. 시험관 내 기능적 효능은 전세포 분석에서 표적 수용체 활성화의 척도이다. 실시예 1의 유도체의 효능을 아래에 기술된 바와 같이 결정하였다. 인간 GLP-1(7-37) 및 인간 GIP를 비교를 위한 적절한 분석에 포함시켰다.
원리
시험관 내 기능적 효능은 개별 세포주를 대상으로 한 리포터 유전자 검정에서 표적 수용체의 반응을 측정하여 결정하였다. 분석은, 다음의 G-단백질 결합 수용체, 인간 GLP-1 수용체 또는 인간 GIP 수용체 중 하나를 발현하는 안정적으로 형질감염된 BHK 세포주에서 수행되었고, 각각의 세포주는 프로모터에 결합된 cAMP 반응 요소(CRE)에 대한 DNA 및 반딧불이 루시페라아제(CRE 루시페라아제)에 대한 유전자를 함유한다. 각각의 수용체가 활성화되면 cAMP가 생성되며, 결과적으로 루시페라아제 단백질이 발현된다. 분석 배양이 완료되면 루시페라아제 기질(루시페린)을 첨가하고, 효소는 루시페린을 옥실루시아린으로 전환시켜 생물발광을 생성한다. 발광은 분석에 대한 판독 값으로서 측정된다.
세포 배양 및 제조
이들 분석에 사용된 세포주는 BHKTS13을 모 세포주로서 갖는 BHK 세포이다. 세포주는 CRE 루시페라아제 요소를 함유하는 클론으로부터 유래된 것으로서, 관련 세포주를 수득하기 위해 각각의 인간 수용체를 이용한 추가 형질감염에 의해 확립하였다. BHK CRE luc2P hGLP-1R 또는 BHK CRE luc2P hGIPR. 세포는 5% CO2 하 37℃의 세포 배양 배지에서 배양하였다. 이들을 분취하여 액체 질소 중에 저장하였다. 세포를 연속 배양 상태로 유지하고 각각의 검정 하루 전에 시딩하였다.
물질
다음의 화학 물질을 분석에 사용하였다: 플루로닉 10% F-68(Gibco 2404), 인간 혈청 알부민(HSA, Sigma A9511), 10% 소 태아 혈청(FBS, Invitrogen 16140-071), 계란 흰자 오브알부민(Sigma A5503), 페놀 레드가 없는 DMEM(Gibco 21063-029), DMEM(Gibco 12430-054), 1 M Hepes(Gibco 15630), Glutamax 100x(Gibco 35050), G418(Invitrogen 10131-027), 히그로마이신(Invitrogen 10687-010), 및 스테디라이트 플러스(steadylite plus, PerkinElmer 6016757).
완충액
GLP-1R 세포 배양 배지는 10% FBS, 500 μg/mL G418, 및 300 μg/mL 히그로마이신을 갖는 DMEM 배지로 구성되었다. GIPR 세포 배양 배지는 10% FBS, 400 μg/mL G418, 및 300 μg/mL 히그로마이신을 갖는 DMEM 배지로 구성되었다. 분석 완충액은 최종 분석 농도의 2배의 HSA를 첨가한, 페놀 레드가 없는 DMEM, 10 mM Hepes, 1 x Glutamax. 1% 오브알부민, 및 0.1% Pluronic F-68로 구성되었다. 분석 완충액을 분석 완충액 중에서 동일한 부피의 시험 화합물과 1:1로 혼합하여 HSA의 최종 분석 농도를 얻었다.
절차
1) 세포를 5000 세포/웰로 플레이팅하고 분석 플레이트에서 밤새 배양하였다.
2) 세포를 DPBS에서 1회 세척하였다.
3) 100 내지 300 μM 범위의 농도에서 시험 화합물 및 기준 화합물의 스톡을 분석 완충액에서 1:150으로 희석시켰다. 이어서, 화합물을 96 딥 웰 희석 플레이트의 컬럼 1에서 1:10으로 희석시키고, 행을 가로질러 운반하여 3.5배, 12점 희석 곡선을 생성하였다.
4) HSA의 유무와 상관없이 분석 완충액(50 μl 분취액)을 분석 플레이트 내 각 웰에 첨가하였다.
5) 50 μl의 화합물 분취액 또는 블랭크를 희석 플레이트에서 HSA를 갖거나 갖지 않는 분석 완충액을 함유하는 분석 플레이트로 옮겼다.
6) 분석 플레이트를 5% CO2하 37℃의 배양기에서 3시간 동안 배양하였다.
7) 세포를 DPBS로 1회 세척하였다.
8) 100 μl의 DPBS 분취액을 분석 플레이트의 각 웰에 첨가하였다.
9) 스테디라이트 플러스 시약(감광성)의 100 μl 분취액을 분석 플레이트의 각 웰에 첨가하였다.
10) 각 분석 플레이트를 알루미늄 호일로 덮어 빛을 차단하고, 실온에서 250 RPM으로 30분 동안 진탕하였다.
11) 각 분석 플레이트를 마이크로역가 플레이트 판독기로 판독하였다.
계산 및 결과
마이크로역가 플레이트 판독기로부터의 데이터를 먼저 엑셀에서 회귀시켜 개별 시험 화합물의 스톡 농도 및 분석의 희석에 기초하여 x-축, 로그 스케일 농도를 계산하였다. 이어서, 그래프 작성 및 통계 분석을 위해 이 데이터를 GraphPad Prism 소프트웨어로 전송하였다. 소프트웨어는 비선형 회귀(로그(작용제) 대 반응)를 수행한다. 소프트웨어에 의해 계산되어 pM 단위로 기록된 EC50 값을 다음의 표 1 내지 3에 나타냈다. 각 샘플에 대해 최소 2회 반복 측정하였다. 기록된 값은 반복 값의 평균이다.
Figure pct00082
Figure pct00083
본 발명의 화합물은 주어진 조건 하에서 인간 GLP-1R 및 인간 GIPR 수용체의 강력한 기능적 활성화를 나타낸다.
실시예 3: 미니피그에서의 약동학 연구
본 실시예의 목적은 미니피그에게 본 발명의 유도체를 정맥 내(i.v.) 투여한 후 이 유도체의 생체 내 반감기, 즉 신체 내에서 이들의 잔류 시간 연장 및 이에 의한 이들의 작용 시간을 결정하는 것이다. 이는 약동학(PK) 연구에서 수행되며, 여기에서 해당 유도체의 최종 반감기가 결정된다. 최종 반감기란, 일반적으로 특정 혈장 농도가 절반으로 줄어드는 데 걸리는 시간을 의미하며, 초기 분포 단계로부터 측정한다.
연구
대략 7 내지 14월령의 암컷 쾨팅겐 미니피그를 Ellegaard Goettingen Minipigs(Dalmose, Denmark)로부터 입수였고, 체중이 대략 16 내지 35 kg인 것들을 연구에 사용하였다. 미니피그를 개별적으로 수용하고 SDS 미니피그 식단(Special Diets Services, Essex, UK)으로 매일 1회 제한적으로 먹이를 주었다.
순응 3주 후, 각 동물에게 2개의 영구 중심 정맥 카테터를 대정맥 뒷면에 이식하였다. 수술 후 1주일 동안 동물을 회복시킨 다음, 반복적인 약동학 연구에 사용하였으며, 연속적으로 유도체를 투여하는 중간에 적절한 휴약 기간(wash-out period)을 두었다.
동물에게 투여 전 약 18시간 동안 및 투여 후 0 내지 4시간 동안 먹이를 주지 않았지만, 전체 기간 동안 물은 자유롭게 마시게 하였다.
실시예 1의 화합물의 나트륨 염을 0.007% 폴리소르베이트 20, 50 mM 인산나트륨, 70 mM 염화나트륨, pH 7.4를 함유하는 완충액 중에 20 내지 40 nmol/mL의 농도로 용해시켰다. 하나의 카테터를 통해 화합물을 정맥 내 주사(일반적으로 1.5 내지 2 nmol/kg에 상응하는 부피, 예를 들어 0.1 ml/kg)하고, 투여 후 14일차까지 미리 정의된 시점에 (바람직하게는 다른 하나의 카테터를 통해) 혈액을 샘플링하였다. 혈액 샘플(예를 들어, 0.8 mL)을 8 mM의 EDTA 완충액에 모은 다음 4℃에서 10분 동안 1942 G로 원심 분리하였다.
샘플링 및 분석
혈장을 드라이아이스 상의 마이크로닉 튜브에 피펫팅하고, ELISA 또는 유사한 항체 기반 검정 또는 LCMS를 사용하여 화합물의 혈장 농도를 분석할 때까지 -20℃에서 보관하였다. 개별 혈장 농도 - 시간 프로파일은 Phoenix WinNonLin ver. 6.4. (Pharsight Inc., Mountain View, CA, USA)의 비구획 모델로 분석되었고, 최종 반감기(조화 평균)가 결정되었다.
결과
Figure pct00084
본 발명의 시험된 화합물은 인간에서 측정된 hGLP-1 및 hGIP의 반감기와 비교하여 매우 긴 반감기를 가지며, 이는 각각 약 2 내지 4분 및 5 내지 7분이다. 미니피그에서 측정된 반감기는 액체 주사를 통한 적어도 주 1회 투여 또는 경구 정제를 통한 적어도 1일 1회 투여에 충분한 인간에서의 반감기를 예측한다.
실시예 5: 개에서의 약동학 연구
본 실시예의 목적은 비글견에게 경구(p.o.) 투여 후 본 발명의 화합물의 생체 내 반감기 및 혈장 노출, 즉 시간에 따라 순환에 도달하는 시험 물질의 최종 반감기 및 농도를 결정하는 것이다. 이는 약동학(PK) 연구에서 수행되었으며, 여기에서 해당 화합물의 이들 파라미터를 결정하였다. 최종 반감기란, 일반적으로 특정 혈장 농도가 절반으로 줄어드는 데 걸리는 시간을 의미하며, 초기 분포 단계로부터 측정한다.
정제 조성물의 제조
시험 물질 및 SNAC(나트륨 N-(8-(2-히드록시벤조일)아미노)카프릴레이트)를 포함하는 정제 조성물은, 예를 들어 WO 2019/149880에 기술된 바와 같이, 시험 물질을 롤러 압축된 SNAC 및 스테아린산 마그네슘과 혼합함으로써 당업자에게 공지된 방법에 따라 제조하였다. 정제 조성물 중 SNAC의 양은 100 내지 300 mg이었고, 정제 조성물 중 스테아린산 마그네슘의 양은 7.7 mg이었고, 정제 조성물 중 각 시험 물질의 목표 양은 3 내지 4 mg이었다.
동물, 투여 및 샘플링
연구 기간 동안 1 내지 7세이고 체중이 9 내지 17 kg인 수컷 비글견을 연구에 포함시켰다. 공복 상태의 개에게 투여하였다. 개들을 무리지어 우리에 수용하고(12시간 채광 : 12시간 차광) 개별적으로 급식하되, 중형견용 사료(Royal Canin Medium Adult dog food, Royal Canin Products, China Branch, 또는 Brogaarden A/S, Denmark)를 1일 1회 제한 급식하였다. 개들을 반복적인 약동학 연구에 사용하였고, 각각의 투여 사이에 적절한 휴약 기간를 두었다. 1차 약동학 연구를 개시하기 전에 적절한 순응 기간을 주었다. 동물의 모든 취급, 투약 및 혈액 채취는 훈련을 받은 숙련된 직원이 수행하였다. 연구 전에 개들을 밤새 굶기고, 투여 후에는 0 내지 4시간 동안 굶겼다. 개들은 투여 1시간 전부터 투여 4시간 후까지 물을 마시지 못하게 하지만, 그렇지 않은 경우에는 전체 기간 동안 언제든지 물을 마실 수 있게 하였다.
조성물은 6 내지 8 마리의 개로 이루어진 군으로 개에게 1회 경구 투여하여 투여하였다. 정제는 다음과 같은 방식으로 투여되었다: 정제 투여 10분 전, 개에게 서열번호 48의 대략 3 nmol/kg을 피하 투여하고, 이어서 정제를 개 구강의 뒤쪽에 넣어 씹는 것을 방지하였다. 이어서, 개의 주둥이를 다물게 하고 정제를 쉽게 삼킬 수 있도록 10 mL의 수돗물을 주사기나 위관으로 주입하였다.
시험 물질의 전체 혈장 농도 - 시간 흡수 프로파일을 적절히 커버하기 위하여, 투여 전 1개의 혈액 샘플을 채취하고, 투여 후 미리 정해진 시점, 예를 들어, 최대 240시간 동안 5, 10, 15, 20, 30 및 45분 후 및 1, 1.5, 2, 4, 7, 10, 24, 48, 72, 120, 144, 168, 192, 216시간 후에 추가 샘플을 채취하였다. 각각의 혈액 샘플링 시점에 대해, EDTA가 코팅된 1.5 mL 튜브에 대략 0.8 mL의 전혈을 채취하고, 튜브를 부드럽게 회전시켜 샘플이 EDTA와 잘 혼합되도록 하였다. 혈액 샘플을 EDTA 완충액(8 mM)에 모은 다음 4℃에서 10분 동안 2000 G로 원심 분리하였다. 혈장을 드라이아이스 상의 마이크로닉 튜브에 피펫팅하고, 분석할 때까지 -20℃ 이하의 온도로 유지시켰다. 혈액 샘플은 적절히 채취하는데, 예를 들어, 첫 2시간 동안은 앞 다리의 요측피정맥(cephalic vein)에 삽입된 벤플론(venflon)을 통해 채취한 다음, 나머지 시점 동안에는 경정맥에서 주사기로 채취한다(첫 몇 방울을 벤플론에서 흘려보내 벤플론의 헤파린 식염수가 샘플에 들어가는 것을 방지한다). 첫 몇 방울을 벤플론에서 흘려보내 벤플론의 헤파린 식염수가 샘플에 들어가는 것을 방지하였다.
모든 혈액 샘플을 안정화를 위해 EDTA를 함유하는 시험관에 수집하고 원심분리 전까지 얼음 위에 두었다. 원심분리로 혈장을 전혈로부터 분리하고, 분석 시까지 -20℃ 이하에서 보관하였다.
분석 및 계산
당업자에게 공지된 LC-MS(액상 크로마토그래피-질량 분광법)를 사용하여 시험 물질에 대해 혈장을 분석하였다. 시스템은, 10-밸브 인터페이스 모듈 TurboFlow 시스템, CTC HTS PAL 자동샘플러, Accela 1250 펌프, 및 Hot Pocket 컬럼 오븐이 장착된 Thermo Fisher QExactive 질량 분광계, 또는 밸브 인터페이스 모듈 TurboFlow 시스템, TriPlus RSI 자동샘플러, Dionex UltiMate 3000 펌프 및 Hot Pocket 컬럼 오븐이 장착된 Thermo Fisher QExactive Plus 질량 분광계로 구성되었다. RP-HPLC 분리는 30℃에서 0.8 mL/분의 유속으로 Phenomenex Onyx Monolitric C18 컬럼(50 x 2.0 mm), 또는 60℃에서 0.4 mL/분의 유속으로 Agilent Poroshell 120 SB-C18 컬럼(50 x 2.1 mm, 2.7 μm)을 사용하여, 1% 수성 포름산 중 1:1 아세토니트릴/메탄올의 선형 구배를 사용하여 이루어졌다. 질량 분광계를 양이온화 SIM 모드 또는 양이온화 PRM 모드로 작동시켰다.
각각의 개별 동물에 대해, PK 분석을 위한 Pharsight Phoenix WinNonLin ver. 6.4 소프트웨어 또는 다른 관련 소프트웨어에서 비구획 모델로 혈장 농도 - 시간 프로파일을 분석하였고, 결과적인 최종 반감기(t1/2), 투여량당 최대 혈장 농도(Cmax/D), 최대 혈장 농도에 대한 시간(tmax), 및 투여량당 무한대까지의 곡선 하 면적(AUC/D)을 결정하였다. 약동학 결과의 요약 통계를 중앙값(tmax), 조화 평균(t1/2), 또는 산술 평균(Cmax, AUC)으로 제시하였다.
결과
Figure pct00085
본 발명의 시험된 화합물은, 혈장 내 화합물의 농도가 경구 투여 후에 검출된 바와 같이 (Cmax/D > 0 및 AUC/D > 0), 본 모델에서 경구 생체이용률을 입증한다. 또한, 본 발명의 시험된 화합물은 인간에서 측정된 hGLP-1 및 hGIP의 반감기와 비교하여 매우 긴 반감기를 추가로 가지며, 이는 각각 약 2 내지 4분 및 5 내지 7분이다.
본 발명의 특정 특징들이 본원에 예시되고 기술되었지만, 많은 변형, 치환, 변경 및 균등물이 이제 당업자에게 발생할 것이다. 따라서, 첨부된 구현예는 본 발명의 진정한 사상 내에 속하는 모든 이러한 수정 및 변경을 포함하도록 의도된 것으로 이해해야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Novo Nordisk A/S <120> CO-AGONISTS AT GLP-1 AND GIP RECEPTORS SUITABLE FOR ORAL DELIVERY <130> 200018 <160> 48 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 1 Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Tyr Leu Glu Lys 1 5 10 15 Gln Ala Ala Gln Glu Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 2 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 2 Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Tyr Tyr Leu Glu Lys 1 5 10 15 Gln Ala Ala Gln Glu Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 3 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 3 Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Tyr Tyr Leu Glu Lys 1 5 10 15 Gln Ala Ala Gln Ala Phe 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<221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 10 Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Leu Leu Glu Lys 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Glu Phe Ile Asn Trp Leu Leu Ala Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 11 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 11 Tyr Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Tyr Leu Glu Lys 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Glu Phe Ile Asn Trp Leu Leu Ala Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 12 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 12 Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Leu Leu Glu Lys 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Glu Phe Ile Asn Trp Leu Leu Ala Gly 20 25 <210> 13 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 13 Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Leu Leu Glu Lys 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Glu Phe Ile Asn Trp Leu Leu Ala Gly Gly Pro 20 25 30 <210> 14 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 14 Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Leu Leu Glu Lys 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Glu Phe Ile Asn Trp Leu Leu Ala Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser <210> 15 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 15 Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Leu Leu Glu Lys 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Glu Phe Ile Asn Trp Leu Leu Ala Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala 35 <210> 16 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 16 Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Leu Leu Glu Lys 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Glu Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 17 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 17 Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Leu Leu Glu Lys 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Glu Phe Ile Gln Trp Leu Leu Ala Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 18 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 18 Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Leu Leu Glu Lys 1 5 10 15 Gln Ala Ala Gln Glu Phe Ile Asn Trp Leu Leu Ala Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 19 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 19 Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Leu Leu Glu Lys 1 5 10 15 Gln Ala Ala Glu Glu Phe Ile Asn Trp Leu Leu Ala Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 20 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 20 Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Leu Leu Glu Lys 1 5 10 15 Gln Ala Ala His Glu Phe Ile Asn Trp Leu Leu Ala Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 21 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 21 Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Leu Leu Glu Lys 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Glu Phe Ile Glu Trp Leu Leu Arg Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 22 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 22 Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Leu Leu Glu Lys 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Glu Phe Ile Glu Trp Leu Leu Arg Gly Gly Pro Glu 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 23 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 23 Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Leu Leu Glu Lys 1 5 10 15 Gln Ala Ala Gln Glu Phe Ile Glu Trp Leu Leu Ala Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 24 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 24 Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Leu Leu Glu Lys 1 5 10 15 Gln Ala Ala His Glu Phe Ile Glu Trp Leu Leu Ala Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 25 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 25 Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Leu Leu Glu Lys 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Glu Phe Ile Glu Trp Leu Leu Ala Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 26 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 26 Tyr Xaa Glu Gly Thr Val Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Leu Leu Glu Lys 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Glu Phe Ile Asn Trp Leu Leu Ala Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 27 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 27 Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Ile Leu Glu Lys 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Glu Phe Ile Asn Trp Leu Leu Ala Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 28 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 28 Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Tyr Leu Glu Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Lys Phe Ile Asn Trp Leu Leu Ala Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 29 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 29 Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Tyr Leu Glu Glu 1 5 10 15 Lys Ala Ala Arg Glu Phe Ile Asn Trp Leu Leu Ala Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 30 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 30 Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Leu Leu Glu Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Lys Phe Ile Asn Trp Leu Leu Ala Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 31 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 31 Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Leu Leu Glu Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Glu Phe Ile Glu Trp Leu Leu Ala Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 32 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 32 Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Glu Phe Ile Asn Trp Leu Leu Ala Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 33 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 33 Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Tyr Leu Glu Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Glu Phe Ile Asn Trp Leu Leu Ala Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Lys Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 34 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 34 Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Leu Leu Glu Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Glu Phe Ile Glu Trp Leu Leu Ala Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Lys Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 35 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 35 Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Leu Leu Glu Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Glu Phe Ile Asn Trp Leu Leu Ala Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Lys Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 36 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is Aib or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is Phe or Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa is Ile or Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa is Tyr, Ala, Leu or Ile <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa is Lys or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Xaa is Gln, Arg, Glu or His <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Xaa is Ala or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(23) <223> Xaa is Ile or Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa is Glu, Gln or Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa is Ala or Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (32)..(32) <223> Xaa is Glu, Ser or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (33)..(33) <223> Xaa is Ser, Lys or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (34)..(34) <223> Xaa is Gly or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (35)..(35) <223> Xaa is Ala or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (36)..(36) <223> Xaa is Pro or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (37)..(37) <223> Xaa is Pro or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (38)..(38) <223> Xaa is Pro or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (39)..(39) <223> Xaa is Ser or absent <400> 36 Tyr Xaa Glu Gly Thr Xaa Thr Ser Asp Tyr Ser Xaa Xaa Leu Glu Xaa 1 5 10 15 Gln Ala Ala Xaa Xaa Phe Xaa Xaa Trp Leu Leu Xaa Gly Gly Pro Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 <210> 37 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is Aib or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is Phe or Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa is Ile or Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa is Tyr, Ala, Leu or Ile <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa is Lys or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Xaa is Gln, Arg, Glu or His <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Xaa is Ala or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(23) <223> Xaa is Ile or Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa is Glu, Gln or Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa is Ala or Arg <400> 37 Tyr Xaa Glu Gly Thr Xaa Thr Ser Asp Tyr Ser Xaa Xaa Leu Glu Xaa 1 5 10 15 Gln Ala Ala Xaa Xaa Phe Xaa Xaa Trp Leu Leu Xaa Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 38 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is Aib or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is Phe or Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa is Ile or Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa is Tyr, Ala, Leu or Ile <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa is Lys or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Xaa is Gln, Arg, Glu or His <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Xaa is Ala or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(23) <223> Xaa is Ile or Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa is Glu, Gln or Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa is Ala or Arg <400> 38 Tyr Xaa Glu Gly Thr Xaa Thr Ser Asp Tyr Ser Xaa Xaa Leu Glu Xaa 1 5 10 15 Gln Ala Ala Xaa Xaa Phe Xaa Xaa Trp Leu Leu Xaa Gly Gly Pro Glu 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 39 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is Aib or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is Phe or Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa is Ile or Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa is Tyr, Ala, Leu or Ile <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa is Lys or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Xaa is Gln, Arg, Glu or His <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Xaa is Ala or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(23) <223> Xaa is Ile or Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa is Glu, Gln or Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa is Ala or Arg <400> 39 Tyr Xaa Glu Gly Thr Xaa Thr Ser Asp Tyr Ser Xaa Xaa Leu Glu Xaa 1 5 10 15 Gln Ala Ala Xaa Xaa Phe Xaa Xaa Trp Leu Leu Xaa Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Lys Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 40 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 40 Ser Ser Gly Ala 1 <210> 41 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 41 Glu Ser Gly Ala 1 <210> 42 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 42 Ser Lys Gly Ala 1 <210> 43 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 43 Leu Leu Glu Lys Gln Ala Ala Arg Glu Phe Ile Asn 1 5 10 <210> 44 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 44 Leu Leu Glu Lys Gln Ala Ala Arg Glu Phe Ile Glu 1 5 10 <210> 45 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 45 Leu Leu Glu Lys Gln Ala Ala Gln Glu Phe Ile Glu 1 5 10 <210> 46 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 46 Leu Leu Glu Glu Gln Ala Ala Arg Glu Phe Ile Glu 1 5 10 <210> 47 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is Aib or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is Phe or Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa is Ile or Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa is Tyr, Ala, Leu or Ile <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa is Lys or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Xaa is Gln, Arg, Glu or His <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Xaa is Ala or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(23) <223> Xaa is Ile or Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa is Glu, Gln or Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa is Ala or Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Xaa is Gly or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> Xaa is Pro or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (32)..(32) <223> Xaa is Glu, Ser or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (33)..(33) <223> Xaa is Ser, Lys or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (34)..(34) <223> Xaa is Gly or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (35)..(35) <223> Xaa is Ala or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (36)..(36) <223> Xaa is Pro or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (37)..(37) <223> Xaa is Pro or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (38)..(38) <223> Xaa is Pro or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (39)..(39) <223> Xaa is Ser or absent <400> 47 Tyr Xaa Glu Gly Thr Xaa Thr Ser Asp Tyr Ser Xaa Xaa Leu Glu Xaa 1 5 10 15 Gln Ala Ala Xaa Xaa Phe Xaa Xaa Trp Leu Leu Xaa Gly Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 <210> 48 <211> 29 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser 1 5 10 15 Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr 20 25

Claims (15)

  1. 펩티드 및 치환기를 포함하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로서, 상기 펩티드의 아미노산 서열은 다음과 같으며,
    YX2EGTX6TSDYSX12X13LEX16QAAX20X21FX23X24WLLX28GX30X31X32X33X34X35X36X37X38X39 (서열 번호 47)
    이는 C-말단의 선택적인 아미드 변형을 갖고,
    여기에서;
    X2는 Aib 또는 A이고,
    X6은 F 또는 V이고,
    X12는 I 또는 Y이고,
    X13은 Y, A, L 또는 I이고,
    X16은 K 또는 E이고,
    X20은 Q, R, E, H이고,
    X21은 A 또는 E이고,
    X23은 I 또는 V이고,
    X24는 E, Q 또는 N이고,
    X28은 A 또는 R이고,
    X30은 G이거나 부재하고,
    X31은 P이거나 부재하고,
    X32는 E, S이거나 부재하고,
    X33은 S, K이거나 부재하고,
    X34는 G이거나 부재하고,
    X35는 A이거나 부재하고,
    X36은 P이거나 부재하고,
    X37은 P이거나 부재하고,
    X38은 P이거나 부재하고,
    X39는 S이거나 부재하며;
    상기 치환기는 위치 16 또는 33에서 리신(K)을 통해 펩티드에 부착되는,
    화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  2. 제1항에 있어서, X32X33X34X35는 SSGA, ESGA 및 SKGA의 군으로부터 선택되는, 화합물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 펩티드의 아미노산 서열은 다음과 같으며,
    YX2EGTX6TSDYSX12X13LEX16QAAX20X21FX23X24WLLX28GGPSSGAPPPS (서열 번호 37)
    여기에서;
    X2는 Aib 또는 A이고,
    X6은 F 또는 V이고,
    X12는 I 또는 Y이고,
    X13은 Y, A, L 또는 I이고,
    X16은 K 또는 E이고,
    X20은 Q, R, E, H이고,
    X21은 A 또는 E이고,
    X23은 I 또는 V이고,
    X24는 E, Q 또는 N이고,
    X28은 A 또는 R인,
    화합물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, X13LEX16QAAX20X21FX23X24는 LLEKQAAREFIN, LLEKQAAREFIE, LLEKQAAQEFIE 및 LLEEQAAREFIE로 이루어진 군으로부터 선택되는, 화합물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 펩티드의 아미노산 서열은 서열번호 1 내지 27 또는 33 내지 35 중 어느 하나인, 화합물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 펩티드는 C-말단의 아미드 변형을 갖는, 화합물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치환기는,
    Figure pct00086

    로 이루어진 군으로부터 선택되는, 화합물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 화합물은,
    Figure pct00087

    Figure pct00088

    Figure pct00089

    Figure pct00090

    Figure pct00091

    Figure pct00092

    Figure pct00093

    Figure pct00094

    Figure pct00095

    Figure pct00096

    Figure pct00097

    Figure pct00098

    Figure pct00099

    Figure pct00100

    로 이루어진 군으로부터 선택되는, 화합물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 화합물은,
    Figure pct00101

    Figure pct00102

    Figure pct00103

    로 이루어진 군으로부터 선택되는, 화합물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 화합물은,
    Figure pct00104

    인, 화합물.
  11. 의약으로서의 사용을 위한, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른, 화합물.
  12. 당뇨병 및/또는 비만의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 화합물을 포함하는, 약학적 조성물.
  13. 간 지방증, 비-알코올성 지방간 질환(NAFLD), 비-알코올성 지방간염(NASH), 간 염증 및/또는 지방 간과 같은 간 장애의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른, 약학적 조성물.
  14. 하기 아미노산 서열을 갖는 펩티드로서,
    YX2EGTX6TSDYSX12X13LEX16QAAX20X21FX23X24WLLX28GX30X31X32X33X34X35X36X37X38X39 (서열 번호 47)
    이는 C-말단의 선택적인 아미드 변형을 갖고,
    여기에서;
    X2는 Aib 또는 A이고,
    X6은 F 또는 V이고,
    X12는 I 또는 Y이고,
    X13은 Y, A, L 또는 I이고,
    X16은 K 또는 E이고,
    X20은 Q, R, E, H이고,
    X21은 A 또는 E이고,
    X23은 I 또는 V이고,
    X24는 E, Q 또는 N이고,
    X28은 A 또는 R이고,
    X30은 G이거나 부재하고,
    X31은 P이거나 부재하고,
    X32는 E, S이거나 부재하고,
    X33은 S, K이거나 부재하고,
    X34는 G이거나 부재하고,
    X35는 A이거나 부재하고,
    X36은 P이거나 부재하고,
    X37은 P이거나 부재하고,
    X38은 P이거나 부재하고,
    X39는 S이거나 부재하는,
    펩티드.
  15. 제14항에 있어서, 상기 펩티드의 아미노산 서열은 서열번호 1 내지 27 또는 33 내지 35 중 어느 하나인, 펩티드.
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