KR20220011725A - 네스티드 다중 pcr 고처리량 시퀀싱 라이브러리의 제조 방법 및 키트 - Google Patents

네스티드 다중 pcr 고처리량 시퀀싱 라이브러리의 제조 방법 및 키트 Download PDF

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팡 천
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엠쥐아이 테크 컴퍼니 엘티디.
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Abstract

네스티드 다중 PCR 고처리량 시퀀싱 라이브러리의 제조 방법 및 키트에 있어서, 상기 방법은, 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 사용하여 타깃 영역을 증폭하되, 정방향 프라이머는 정방향 특이적 서열이고, 역방향 프라이머는 3’말단의 역방향 특이적 서열 및 5’말단의 제1 범용 시퀀싱 서열을 포함하는 단계; 제1 차 PCR 증폭의 생성물을 정제하는 단계; 정제된 생성물을 네스티드 프라이머, 제1 라벨 프라이머 및 제2 범용 프라이머를 사용하여 증폭하되, 네스티드 프라이머는 정방향 프라이머의 다운스트림에 위치하고, 네스티드 프라이머는 5’말단의 제2 범용 시퀀싱 서열 및 3’말단의 특이적 서열을 포함하며, 제1 라벨 프라이머 3’말단 서열과 역방향 프라이머 5’말단의 서열은 부분적으로 또는 완전히 동일하고, 제1 라벨 프라이머는 제1 라벨 서열을 더 포함하며, 제2 범용 프라이머 3’말단 서열과 네스티드 프라이머 5’말단의 서열은 부분적으로 또는 완전히 동일한 단계를 포함한다. 본 발명은 다중 PCR 증폭 과정에서 생성되는 이합체를 효과적으로 방지하고, 네스티드 증폭 방법을 사용하여 PCR 증폭의 특이성을 크게 증가시킨다.

Description

네스티드 다중 PCR 고처리량 시퀀싱 라이브러리의 제조 방법 및 키트
본 발명은 라이브러리 제조 기술분야에 관한 것으로, 구체적으로 네스티드 다중 PCR 고처리량 시퀀싱 라이브러리의 제조 방법 및 키트에 관한 것이다.
시퀀싱 기술의 발전에 따라 게놈 후보 세그먼트의 재시퀀싱에 대한 수요가 증가하고 있고, 서열에 대한 사람들의 관심은 소수의 SNP를 초과하며, 후보 세그먼트의 범위는 5 kb ~ 10 M 사이일 수 있다. 기존의 sanger 방법 또는 타깃 영역 혼성화 캡처 시퀀싱의 사용은 비용이 매우 높지만, 타깃 영역 캡처 시퀀싱을 사용하면 이러한 문제를 잘 해결한다. 타깃 영역 캡처 기술은 크게 두 가지로 나눌 수 있는데, 하나는 혼성화 기반의 캡처 시퀀싱 기술이고, 다른 하나는 다중 PCR 기반의 캡처 기술이다. 이 두 가지 기술은 모두 다중 프로브 또는 프라이머를 통해 관심 유전자 영역을 한 번에 캡처하고, 고처리량 시퀀싱 기술과 결합하여 다중 샘플을 동시에 시퀀싱하여 타깃 영역의 서열 정보를 얻는다. 전체 게놈 시퀀싱에 비해, 타깃 캡처 시퀀싱 기술은 대량의 샘플을 스크리닝하는 동시에 비용을 크게 절감한다. 하지만 전자는 실험 절차가 번거롭고 프로브 비용이 높아 임상 응용에 한계가 있고, 후자는 실험 조작이 간단하고 유연성이 강하여 멘델형 유전성 질환의 스크리닝 및 진단, GWAS 후보 세그먼트 재시퀀싱, QTL 포지셔닝 세그먼트 재시퀀싱, 정밀 의학 연구 및 응용 등 분야에 적용된다.
고처리량 SNP 검출 서비스는 다중 PCR과 고처리량 시퀀싱 기술을 결합하여 검출하고자 하는 부위에 대해 특이적 프라이머를 설계하고, 단일 튜브 내에서 다중 PCR 증폭을 수행하는 것으로, 상이한 샘플은 상이한 바코드(barcode) 프라이머로 구별된다. 샘플을 혼합한 후, 시퀀싱 플랫폼에서, 앰플리콘을 시퀀싱하고, 시퀀싱 결과는 생물 정보학 방법을 사용하여 상이한 샘플을 구별하여 최종적으로 각각의 부위의 SNP 정보를 얻는다. 이러한 방법은 질환 게놈 연구, 종양 게놈 연구, 질환과 유전자의 연관 연구, 임상 분자 진단 등과 같은 다양한 목적을 위한 유전학 연구에 적용되고, 식물 게놈 연구에서, QTL 포지셔닝 및 분자 육종에 사용할 수 있어 대규모 샘플의 SNP 분석에 매우 적합하다.
다중 PCR 실험은 조작이 간단하고 단일 검출 비용이 매우 낮지만, 실험 초기 단계에서 복수 쌍의 프라이머를 반복적으로 테스트하고 최적화해야 하므로, 시간과 노동 집약적이다. 특히 초다중 PCR에서, 프라이머 서열의 복잡성으로 인해 프라이머가 프라이머 이합체를 형성하기 쉽다. 프라이머 이합체의 형성은 PCR 반응 시스템의 원료를 급격하게 소모하여 PCR이 빠르게 안정기에 도달하게 하고, 형성된 프라이머 이합체는 후속의 시퀀싱에서도 시퀀싱되어 유효하지 않은 데이터가 생성되어 데이터 이용 효율에 영향을 미친다. 가장 심각한 것은 프라이머 이합체를 쉽게 형성하는 프라이머가 상기 프라이머에 대응되는 타깃 증폭 영역의 증폭 효율에 심각한 영향을 주어 상기 타깃 시퀀싱 깊이를 감소시키고 최종적으로 전체 증폭 시스템의 균일성에 영향을 미치는 것이다. 이 밖에, 프라이머의 특이성도 다중 증폭의 성능에 큰 영향을 미친다.
다중 증폭에서 프라이머 쌍의 수가 증가함에 따라 프라이머 이합체의 형성은 불가피하므로, 많은 회사에서는 추가적인 효소 처리를 통해 여분의 프라이머 이합체를 제거하며, 예를 들어 Ampliseq 회사는 1단계 특이적 증폭을 먼저 사용한 다음 효소를 통해 프라이머 이합체 및 앰플리콘 중의 특이적 프라이머 서열을 소화하고, 마지막으로 생성물에 대해 라이브러리를 제조하는데, 전제 과정이 번거롭다. 이후, Paragon 회사는 이 방법을 개선하여 특정 효소를 사용하여 다중 PCR 과정에서의 프라이머 이합체만 제거한 다음 범용 프라이머를 사용하여 소화된 생성물에 대해 범용 증폭을 수행하는 Clean Plex 이합체 제거 기술을 발명하였지만, 프라이머의 비특이적 증폭에 대한 더 좋은 해결 방법은 없다.
요약하면, 선행기술의 단점은 다음과 같은 바, (1) 기존의 방법 자체로는 프라이머 이합체의 형성을 감소시킬 수 없고, 이러한 방법은 프라이머 이합체를 생성한 후 효소 소화를 이용하는 이후 프라이머 이합체를 제거하는 방식으로, 다중 PCR 과정에서 생성된 프라이머 이합체는 PCR 증폭의 효율 및 균일성에 큰 영향을 미치며; (2) 기존의 방법은 추가적인 소화 단계가 필요하므로, 조작이 비교적 번거롭고; (3) 통상적인 2개의 프라이머를 사용하여 증폭하면, 일부 특이성이 안좋은 영역에 대해 특이적 프라이머를 설계하기 어려우며; (4) 기존의 방법은 연속 영역 증폭에 대해 복수 개의 PCR 튜브에서 별도로 수행해야 한다.
본 발명은 다중 PCR 증폭 과정에서 생성되는 이합체를 효과적으로 방지하고, 네스티드 증폭 방법을 사용하여 프라이머의 특이성을 크게 증가시키며, 데이터의 이용률을 향상시키고, 중첩 앰플리콘 프라이머 사이의 상호 증폭을 효과적으로 억제할 수 있는 네스티드 다중 PCR 고처리량 시퀀싱 라이브러리의 제조 방법 및 키트를 제공한다.
제1 양태에 따르면, 일 실시예는 네스티드 다중 PCR 고처리량 시퀀싱 라이브러리의 제조 방법을 제공하고, 상기 방법은,
정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 사용하여 타깃 영역을 증폭하되, 상기 정방향 프라이머는 상기 타깃 영역에 결합된 정방향 특이적 서열이고, 상기 역방향 프라이머는 3’말단의 상기 타깃 영역에 결합된 역방향 특이적 서열 및 5’말단의 제1 범용 시퀀싱 서열을 포함하는 제1 차 PCR 증폭 단계;
상기 제1 차 PCR 증폭의 생성물을 정제하는 증폭 생성물 정제 단계; 및
정제된 생성물을 네스티드 프라이머, 제1 라벨 프라이머 및 제2 범용 프라이머를 사용하여 증폭하되, 상기 네스티드 프라이머는 상기 정방향 프라이머의 다운스트림에 위치하고, 상기 네스티드 프라이머는 5’말단의 제2 범용 시퀀싱 서열 및 3’말단의 특이적 서열을 포함하며, 상기 제1 라벨 프라이머 3’말단 서열과 상기 역방향 프라이머 5’말단의 제1 범용 시퀀싱 서열은 부분적으로 또는 완전히 동일하고, 상기 제1 라벨 프라이머는 제1 라벨 서열을 더 포함하며, 상기 제2 범용 프라이머 3’말단 서열과 상기 네스티드 프라이머 5’말단의 제2 범용 시퀀싱 서열은 부분적으로 또는 완전히 동일한 제2 차 PCR 증폭 단계를 포함한다.
바람직한 실시예에서, 상기 제2 범용 프라이머는 제2 라벨 프라이머이고, 상기 제2 라벨 프라이머 3’말단 서열과 상기 네스티드 프라이머 5’말단의 제2 범용 시퀀싱 서열은 부분적으로 또는 완전히 동일하며, 상기 제2 라벨 프라이머는 제2 라벨 서열을 더 포함한다.
제1 양태에 따르면, 다른 실시예는 네스티드 다중 PCR 고처리량 시퀀싱 라이브러리의 제조 방법을 제공하고, 상기 방법은,
정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 제1 라벨 프라이머를 사용하여 타깃 영역을 증폭하되, 상기 정방향 프라이머는 상기 타깃 영역에 결합된 정방향 특이적 서열이고, 상기 역방향 프라이머는 3’말단의 상기 타깃 영역에 결합된 역방향 특이적 서열 및 5’말단의 제1 범용 시퀀싱 서열을 포함, 상기 제1 라벨 프라이머 3’말단 서열과 상기 역방향 프라이머 5’말단의 제1 범용 시퀀싱 서열은 부분적으로 또는 완전히 동일하고, 상기 제1 라벨 프라이머는 제1 라벨 서열을 더 포함하는 제1 차 PCR 증폭 단계;
상기 제1 차 PCR 증폭의 생성물을 정제하는 증폭 생성물 정제 단계; 및
정제된 생성물을 네스티드 프라이머, 제1 범용 프라이머 및 제2 범용 프라이머를 사용하여 증폭하되, 상기 네스티드 프라이머는 상기 정방향 프라이머의 다운스트림에 위치하고, 상기 네스티드 프라이머는 5’말단의 제2 범용 시퀀싱 서열 및 3’말단의 특이적 서열을 포함하며, 상기 제1 범용 프라이머 3’말단 서열과 상기 제1 라벨 프라이머 5’말단의 서열은 부분적으로 또는 완전히 동일하고, 상기 제2 범용 프라이머 3’말단 서열과 상기 네스티드 프라이머 5’말단의 제2 범용 시퀀싱 서열은 부분적으로 또는 완전히 동일한 제2 차 PCR 증폭 단계를 포함한다.
바람직한 실시예에서, 상기 제2 범용 프라이머는 제2 라벨 프라이머이고, 상기 제2 라벨 프라이머 3’말단 서열과 상기 네스티드 프라이머 5’말단의 제2 범용 시퀀싱 서열은 부분적으로 또는 완전히 동일하며, 상기 제2 라벨 프라이머는 제2 라벨 서열을 더 포함한다.
바람직한 실시예에서, 상기 역방향 프라이머는 분자 인덱스 서열을 더 포함한다.
바람직한 실시예에서, 상기 분자 인덱스 서열은 8 ~ 24 bp의 랜덤 서열이다.
바람직한 실시예에서, 상기 방법은 복수 개의 연속적인 타깃 영역을 증폭하고, 각각의 타깃 영역 모두에는 대응되는 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 네스티드 프라이머가 구비되며, 인접 앰플리콘 영역 사이에는 증폭 중첩이 형성된다.
바람직한 실시예에서, 상기 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 네스티드 프라이머는 모두 상이한 타깃 영역을 각각 표적화하는 복수 개의 프라이머로 구성된 프라이머 풀이다.
바람직한 실시예에서, 각각의 타깃 영역의 정방향 프라이머와 인접 영역의 정방향 프라이머의 증폭 방향, 네스티드 프라이머와 인접 영역의 네스티드 프라이머의 증폭 방향, 역방향 프라이머와 인접 영역의 역방향 프라이머의 증폭 방향은 반대이다.
바람직한 실시예에서, 상기 제1 차 PCR 증폭 및/또는 제2 차 PCR 증폭의 주기 수는 모두 2 ~ 30개 주기이다.
바람직한 실시예에서, 상기 제1 라벨 서열 및/또는 제2 라벨 서열의 길이는 모두 8 ~ 15 bp이다.
제2 양태에 따르면, 일 실시예는 네스티드 다중 PCR 고처리량 시퀀싱 라이브러리의 제조 키트를 제공하고, 상기 키트는 제1 차 PCR 증폭 프라이머 및 제2 차 PCR 증폭 프라이머를 포함하되,
제1 차 PCR 증폭 프라이머는 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 포함하고, 상기 정방향 프라이머는 타깃 영역에 결합된 정방향 특이적 서열이며, 상기 역방향 프라이머는 3’말단의 상기 타깃 영역에 결합된 역방향 특이적 서열 및 5’말단의 제1 범용 시퀀싱 서열을 포함, 상기 제1 차 PCR 증폭 프라이머는 타깃 영역에 대해 제1 차 PCR 증폭을 수행하는데 사용되며;
제2 차 PCR 증폭 프라이머는 네스티드 프라이머, 제1 라벨 프라이머 및 제2 범용 프라이머를 포함하고, 상기 네스티드 프라이머는 상기 정방향 프라이머의 다운스트림에 위치하며, 상기 네스티드 프라이머는 5’말단의 제2 범용 시퀀싱 서열 및 3’말단의 특이적 서열을 포함하고, 상기 제1 라벨 프라이머 3’말단 서열과 상기 역방향 프라이머 5’말단의 제1 범용 시퀀싱 서열은 부분적으로 또는 완전히 동일하며, 상기 제1 라벨 프라이머는 제1 라벨 서열을 더 포함하고, 상기 제2 범용 프라이머 3’말단 서열과 상기 네스티드 프라이머 5’말단의 제2 범용 시퀀싱 서열은 부분적으로 또는 완전히 동일하며, 상기 제2 차 PCR 증폭 프라이머는 정제된 상기 제1 차 PCR 증폭의 생성물에 대해 제2 차 PCR 증폭을 수행하는데 사용된다.
바람직한 실시예에서, 상기 제2 범용 프라이머는 제2 라벨 프라이머이고, 상기 제2 라벨 프라이머 3’말단 서열과 상기 네스티드 프라이머 5’말단의 제2 범용 시퀀싱 서열은 부분적으로 또는 완전히 동일하며, 상기 제2 라벨 프라이머는 제2 라벨 서열을 더 포함한다.
제2 양태에 따르면, 다른 실시예는 네스티드 다중 PCR 고처리량 시퀀싱 라이브러리의 제조 키트를 제공하고, 상기 키트는 제1 차 PCR 증폭 프라이머 및 제2 차 PCR 증폭 프라이머를 포함하되,
제1 차 PCR 증폭 프라이머는 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 제1 라벨 프라이머를 포함하고, 상기 정방향 프라이머는 상기 타깃 영역에 결합된 정방향 특이적 서열이며, 상기 역방향 프라이머는 3’말단의 상기 타깃 영역에 결합된 역방향 특이적 서열 및 5’말단의 제1 범용 시퀀싱 서열을 포함하고, 상기 제1 라벨 프라이머 3’말단 서열과 상기 역방향 프라이머 5’말단의 제1 범용 시퀀싱 서열은 부분적으로 또는 완전히 동일하며, 상기 제1 라벨 프라이머는 제1 라벨 서열을 더 포함하고, 상기 제1 차 PCR 증폭 프라이머는 타깃 영역에 대해 제1 차 PCR 증폭을 수행하는데 사용되며;
제2 차 PCR 증폭 프라이머는 네스티드 프라이머, 제1 범용 프라이머 및 제2 범용 프라이머를 포함하고, 상기 네스티드 프라이머는 상기 정방향 프라이머의 다운스트림에 위치하며, 상기 네스티드 프라이머는 5’말단의 제2 범용 시퀀싱 서열 및 3’말단의 특이적 서열을 포함하고, 상기 제1 범용 프라이머 3’말단 서열과 상기 제1 라벨 프라이머 5’말단의 서열은 부분적으로 또는 완전히 동일하며, 상기 제2 범용 프라이머 3’말단 서열과 상기 네스티드 프라이머 5’말단의 제2 범용 시퀀싱 서열은 부분적으로 또는 완전히 동일하고, 상기 제2 차 PCR 증폭 프라이머는 정제된 상기 제1 차 PCR 증폭의 생성물에 대해 제2 차 PCR 증폭을 수행하는데 사용된다.
바람직한 실시예에서, 상기 제2 범용 프라이머는 제2 라벨 프라이머이고, 상기 제2 라벨 프라이머 3’말단 서열과 상기 네스티드 프라이머 5’말단의 제2 범용 시퀀싱 서열은 부분적으로 또는 완전히 동일하며, 상기 제2 라벨 프라이머는 제2 라벨 서열을 더 포함한다.
바람직한 실시예에서, 상기 역방향 프라이머는 분자 인덱스 서열을 더 포함한다.
바람직한 실시예에서, 상기 분자 인덱스 서열은 8 ~ 24 bp의 랜덤 서열이다.
바람직한 실시예에서, 상기 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 네스티드 프라이머는 모두 복수 개의 연속적인 타깃 영역을 각각 표적화하는 복수 개의 프라이머로 구성된 프라이머 풀이고, 인접 앰플리콘 영역 사이에는 증폭 중첩이 형성된다.
바람직한 실시예에서, 각각의 타깃 영역의 정방향 프라이머와 인접 영역의 정방향 프라이머의 증폭 방향, 네스티드 프라이머와 인접 영역의 네스티드 프라이머의 증폭 방향, 역방향 프라이머와 인접 영역의 역방향 프라이머의 증폭 방향은 반대이다.
바람직한 실시예에서, 상기 제1 라벨 서열 및/또는 제2 라벨 서열의 길이는 모두 8 ~ 15 bp이다.
본 발명의 네스티드 다중 PCR 고처리량 시퀀싱 라이브러리의 제조 방법 및 키트는 다중 PCR 증폭 과정에서 생성되는 프라이머 이합체를 효과적으로 감소시킬 수 있고, 3개의 프라이머의 증폭 방식을 통해 생성물의 특이성을 효과적으로 증가시킨다. 이 밖에, 바람직한 실시예는 연속 영역 증폭에서 생성된 유효하지 않은 증폭 단편을 효과적으로 억제할 수 있고, 분자 인덱스를 사용하여 특이적 프라이머를 라벨링하면 원래 템플릿을 유일하게 라벨링할 수 있음으로써, 원래 템플릿을 추적하고 오류를 수정할 수 있다.
도 1은 선행기술에서 2단계 PCR 증폭 프로세스 모식도이다.
도 2는 본 발명의 실시예에서 네스티드 다중 PCR 증폭 프로세스 모식도이다.
도 3은 본 발명의 실시예에서 네스티드 다중 PCR 연속 영역 증폭 모식도이다.
도 4는 본 발명의 실시예에서 통상적인 네스티드 PCR 프라이머 설계 모식도(a), 분자 인덱스가 도입된 네스티드 PCR 프라이머 설계 모식도(b), 연속 영역 네스티드 PCR 프라이머 설계 모식도(c)이다.
도 5는 본 발명의 실시예에서 상이한 샘플 라벨 도입 방식 모식도이다.
도 6은 본 발명의 실시예에서 상이한 샘플 라벨 도입 방식 모식도이다.
도 7은 본 발명의 실시예에서 상이한 앰플리콘 균일성 실험 결과도이다.
도 8은 본 발명의 실시예에서 네스티드 다중 PCR로 얻은 라이브러리 전기영동도이다.
아래, 도면과 함께 구체적인 실시형태를 통해 본 발명을 더 상세하게 설명한다. 이하 실시형태에서, 본 발명을 더 잘 이해할 수 있도록 많은 상세한 설명이 사용된다. 하지만, 당업자는 일부 특징이 상이한 상황에서 생략될 수 있거나 다른 재료, 방법으로 대체될 수 있음을 쉽게 인식할 수 있다.
이 밖에, 명세서에서 설명된 특징, 조작 또는 특징은 임의의 적절한 방식으로 조합되어 다양한 실시형태를 형성할 수 있다. 아울러, 방법 설명에서의 각 단계 또는 동작은 당업자에게 있어서 자명한 방식에 따라 순차적으로 교환 또는 조정될 수 있다. 따라서, 명세서 및 도면에서의 각 순서는 특정 실시예를 명확하게 설명하기 위한 것일 뿐, 특정 순서를 따라야 한다는 특별한 언급이 없는 한 반드시 필요한 순서를 의미하지는 않는다.
“제1 ”, “제2 ” 등과 같이 본 명세서에서 특징에 대한 일련 번호 자체는 설명된 개체를 구별하기 위한 것일 뿐, 순서 또는 기술적인 의미를 가지지 않는다.
도 1에 도시된 바와 같이, 선행기술에서 2단계 PCR 증폭 프로세스를 나타내고, 특이적 증폭 과정에서, 2개의 특이적 프라이머(도 1에서 특이적 프라이머 1 및 특이적 프라이머 2임)는 각각 2개의 시퀀싱 어댑터의 부분 서열을 가지고 있고, 이 2개의 프라이머는 제1 차 PCR 증폭 과정에서 프라이머 이합체를 형성하며, 이러한 프라이머 이합체는 후속의 제2 차 PCR 범용 증폭에서 증폭되어 대량의 이합체 생성물이 얻어지므로, 시퀀싱 데이터에 영향을 미친다.
본 발명의 방법은 특이적 PCR 증폭 과정에서 생성되는 프라이머 이합체 생성물이 이후의 범용 PCR 증폭 과정에서 증폭되는 문제를 해결한다.
도 2에 도시된 바와 같이, 본 발명의 방법의 특이적 증폭에서, 하나의 특이적 프라이머(이하, 역방향 프라이머라 함)는 제1 범용 시퀀싱 서열을 갖고, 다른 하나의 특이적 프라이머(이하, 정방향 프라이머라 함)는 시퀀싱 서열을 가지지 않는다. 역방향 프라이머와 역방향 프라이머는 프라이머 이합체(도 2에서 프라이머 이합체 3임)를 형성하고, 범용 시퀀싱 서열의 존재로 인해, 이러한 프라이머는 후속의 증폭에서 증폭되지 않고 스템-루프 구조를 형성하며, 정방향 프라이머와 정방향 프라이머, 정방향 프라이머와 역방향 프라이머 사이에 형성된 프라이머 이합체(도 2에서 프라이머 이합체 1 및 프라이머 이합체 2임)는 후속의 범용 프라이머에 의해 이용될 수 없어 증폭될 수 없으므로, 제1 차 PCR 증폭에서 최종 생성물에서의 프라이머 이합체의 비율을 효과적으로 감소시킬 수 있다.
도 2에 도시된 바와 같이, 세미-네스티드 증폭을 사용하여 타깃 영역 증폭의 특이성을 향상시킬 수 있다. 구체적으로, 제2 차 PCR 증폭에서, 정방향 프라이머 다운스트림에 네스티드 프라이머를 설계하고, 상기 네스티드 프라이머는 제2 범용 시퀀싱 서열을 가지며, 이 프라이머 및 제1 라벨 프라이머를 사용하여, 얻은 생성물에 대해 제2 차 PCR 증폭을 수행하여 최종 시퀀싱 라이브러리를 얻는다. 상기 방법은 네스티드 증폭을 사용하며, 제1 차 PCR 증폭 생성물을 기초로 1단계 특이적 선택을 수행하여 최종 생성물의 특이성을 향상시킨다. 상기 단계는 네스티드 프라이머 및 제2 범용 프라이머를 첨가하여 PCR 증폭을 수행하는 단계를 포함하고, 증폭 과정에서 네스티드 프라이머 사이에서만 프라이머 이합체(도 2에서 프라이머 이합체 4임)가 쉽게 형성되며, 네스티드 프라이머 사이에 형성된 프라이머 이합체는 후속의 증폭에서 증폭되지 않고 스템-루프 구조를 형성하므로, 프라이머 이합체의 형성을 현저하게 억제할 수도 있다.
도 3 및 도 4에 도시된 바와 같이, 연속 영역의 경우, 특수한 프라이머 증폭 전략은 중첩 앰플리콘 사이의 중첩 프라이머의 상호 증폭을 방지한다. 구체적으로, 각각의 영역은 정방향 프라이머, 네스티드 프라이머, 역방향 프라이머인 3개의 프라이머로 구성되고, 정방향 프라이머와 다음 인접한 정방향 프라이머 사이에 증폭 중첩이 형성되며, 네스티드 프라이머와 다음 인접한 네스티드 프라이머 사이에 증폭 중첩이 형성되고, 역방향 프라이머와 다음 역방향 프라이머 사이에 증폭 중첩이 형성되도록 설계한다(도 4). 정방향 프라이머 및 정방향 프라이머는 생성물(도 3에서 생성물 4임)을 생성하고, 상기 생성물은 제2 단계 네스티드 증폭에서의 네스티드 프라이머에 의해 이용되어 증폭되지만, 네스티드 프라이머는 모두 제2 범용 시퀀싱 서열을 가지므로, 후속의 증폭에서 스템-루프 구조를 형성하여 억제될 수 있다. 역방향 프라이머 및 역방향 프라이머는 생성물(도 3에서 생성물 2임)을 생성하고, 역방향 프라이머는 모두 제1 범용 시퀀싱 서열을 가지므로, 상기 생성물은 후속의 증폭에서 스템-루프 구조를 형성하여 증폭이 억제될 수 있으므로(도 3), 이러한 중첩된 생성물은 모두 증폭되지 않는다.
도 4a에 도시된 바와 같이, 각각의 앰플리콘에 대해 정방향 프라이머, 네스티드 프라이머, 역방향 프라이머인 3개의 프라이머를 설계하여 2단계 PCR 증폭을 수행한다. 네스티드 프라이머는 정방향 프라이머의 다운스트림 프라이머에 위치하고, 양자는 중첩되거나 분리될 수 있으며, 네스티드 프라이머 5’말단에는 한 세그먼트의 시퀀싱 범용 서열이 있고, 3’말단은 특이적 서열이며, 3’말단의 서열은 증폭될 타깃 영역의 업스트림에 설계된다. 정방향 프라이머는 네스티드 프라이머의 업스트림에 설계되고, 이의 5’말단에는 시퀀싱 범용 서열이 추가되거나 추가되지 않을 수 있다(바람직하게는 추가되지 않음). 역방향 프라이머 5’말단에는 한 세그먼트의 시퀀싱 범용 서열이 있고, 3’말단은 특이적 서열이며, 3’말단의 서열은 증폭될 타깃 영역의 다운스트림에 설계된다.
도 4b에 도시된 바와 같이, 저빈도 돌연변이를 검출해야 하는 경우, 역방향 프라이머에서의 범용 서열과 특이적 서열 사이에 분자 인덱스 서열을 추가해야 하되, 상기 분자 인덱스는 8 ~ 24 bp의 랜덤 서열일 수 있고, 원래 DNA 분자를 라벨링하기 위한 48-24 종의 랜덤 라벨 분자를 생성할 수 있다. 분자 인덱스의 수가 템플릿의 수보다 훨씬 많을 경우, 각각의 템플릿은 하나의 고유 분자 인덱스(Unique molecular index)를 가지며, 이러한 분자 인덱스를 통해 원래 DNA 템플릿을 추적하여 증폭의 중복 및 시퀀싱 오류를 제거할 수 있다. 프라이머에 분자 인덱스를 도입하면 프라이머 사이의 이합체 생성 가능성을 크게 증가시키지만, 본 발명의 방법으로 형성된 프라이머 이합체는 후속의 과정에서 효과적으로 억제될 수 있다.
도 4c에 도시된 바와 같이, 연속 영역의 증폭의 경우, 복수 쌍의 프라이머를 설계하여 연속 영역을 피복하고, 인접 앰플리콘 영역은 중첩된다(앰플리콘 중 프라이머 서열을 제외하고, 이전 증폭의 3’말단은 다음의 앰플리콘의 5’말단의 다운스트림에 위치함). 각각의 영역은 정방향 프라이머, 네스티드 프라이머, 역방향 프라이머인 3개의 프라이머에 의해 증폭된다. 각각의 영역의 정방향 프라이머와 인접 영역의 정방향 프라이머, 네스티드 프라이머와 인접 영역의 네스티드 프라이머, 역방향 프라이머와 인접 영역의 역방향 프라이머는 서로 반대 방향으로 설계된다(증폭 방향이 반대임). 예를 들어, 첫 번째 앰플리콘이 5’에서 3’으로의 방향에서 순차적으로 정방향 프라이머 1, 네스티드 프라이머 1 및 역방향 프라이머 1이면, 두 번째 앰플리콘은 5’에서 3’으로의 방향에서 순차적으로 역방향 프라이머 2, 네스티드 프라이머 2 및 정방향 프라이머 2이고, 세 번째 앰플리콘은 5’에서 3’으로의 방향에서 순차적으로 정방향 프라이머 3, 네스티드 프라이머 3 및 역방향 프라이머 3인데, 모든 앰플리콘이 전체 연속 영역을 피복할 수 있을 때까지 이런 방식으로 유추하고, 두 번째 앰플리콘의 역방향 프라이머 2의 3’말단은 역방향 프라이머 1의 3’말단의 업스트림에 위치하며, 세 번째 앰플리콘의 네스티드 프라이머 3의 3’말단은 네스티드 프라이머 2의 3’말단의 업스트림에 위치하고, 이러한 설계를 통해 연속 영역의 모든 서열을 모두 대응되는 앰플리콘에 증폭할 수 있다.
도 5a에 도시된 바와 같이, 제1 차 PCR 증폭에서, 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 사용하여 2 ~ 30차 PCR 증폭을 수행한다. 얻은 생성물을 정제하여 여분의 프라이머 및 다른 이온을 제거한 다음, 제2 차 PCR 증폭을 수행한다. 제2 차 PCR 증폭에서 네스티드 프라이머, 제1 라벨 프라이머 및 제2 범용 프라이머를 사용하여 2 ~ 30개 주기 동안 증폭하되, 여기서 제1 라벨 프라이머의 3’말단 서열과 역방향 프라이머 5’말단의 서열은 부분적으로 또는 완전히 동일하고, 라벨 프라이머 중간에 8 ~ 15 bp의 라벨 서열이 있으며, 상기 라벨 서열은 상이한 시퀀싱 플랫폼에서 후속의 다중 샘플 혼합 시퀀싱을 위해 상이한 샘플을 구별하는데 사용되는 상이한 고정 서열을 가지고 있다. 제2 범용 프라이머 3’말단 서열과 네스티드 프라이머 5’말단의 서열은 부분적으로 또는 완전히 동일하다. 증폭의 첫 번째 주기에서, 네스티드 프라이머 및 제1 라벨 프라이머를 사용하여 증폭하고, 후속의 주기에서, 네스티드 프라이머, 제1 라벨 프라이머 및 제2 범용 프라이머를 함께 사용하여 타깃 라이브러를 증폭하여, 최종적으로 앰플리콘 라이브러리를 얻는다.
도 5b에 도시된 바와 같이, 이중 샘플 라벨 서열 시퀀싱의 경우, 제2 차 PCR 증폭에서 네스티드 프라이머, 제1 라벨 프라이머 및 제2 라벨 프라이머를 사용하여 2 ~ 30개 주기 동안 증폭하되, 여기서 제1 라벨 프라이머 3’말단의 서열과 역방향 프라이머 5’말단의 서열은 부분적으로 또는 완전히 동일하고, 제2 라벨 프라이머 3’말단의 서열과 네스티드 프라이머의 5’말단의 서열은 부분적으로 또는 완전히 동일하며, 라벨 프라이머 중간에 8 ~ 15 bp의 라벨 서열이 있고, 상기 라벨 서열은 상이한 시퀀싱 플랫폼에서 후속의 다중 샘플 혼합 시퀀싱을 위해 상이한 샘플을 구별하는데 사용되는 상이한 고정 서열을 가지고 있다. 증폭의 첫 번째 주기에서, 네스티드 프라이머 및 제1 라벨 프라이머를 사용하여 증폭하고, 후속의 주기에서, 네스티드 프라이머, 제1 라벨 프라이머 및 제2 라벨 프라이머를 함께 사용하여 타깃 라이브러를 증폭하여, 최종적으로 이중 샘플 라벨의 앰플리콘 라이브러리를 얻는다.
도 6a에 도시된 바와 같이, 제1 차 PCR 증폭의 경우, 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 추가하는 이외에, 제1 라벨 프라이머를 추가할 수도 있고, 제1 라벨 프라이머 중간에 8 ~ 15 nt의 라벨 서열이 있으며, 제1 차 PCR 증폭에서 샘플을 구별하여 후속의 다중 샘플 혼합 시퀀싱을 위해 상이한 샘플을 구별할 수 있고, 상기 제1 라벨 프라이머의 3’말단과 역방향 프라이머의 5’말단은 부분적으로 또는 완전히 중첩된다. 증폭의 첫 번째 주기에서, 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 사용하여 증폭하고, 후속의 주기에서, 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 제1 라벨 프라이머를 함께 사용하여 증폭한다. 제2 차 PCR 증폭에서 네스티드 프라이머, 제1 범용 프라이머 및 제2 범용 프라이머를 사용하여 2 ~ 30개 주기 동안 증폭하고, 제1 범용 프라이머의 3’말단과 제1 라벨 프라이머의 5’말단은 부분적으로 또는 완전히 동일하며, 증폭의 첫 번째 주기에서, 먼저 제1 범용 프라이머 및 네스티드 프라이머를 사용하여 증폭하고, 후속의 주기에서, 제1 범용 프라이머, 제2 범용 프라이머 및 네스티드 프라이머를 함께 사용하여 증폭하여 시퀀싱 라이브러리를 얻는다.
도 6b에 도시된 바와 같이, 이중 샘플 라벨 서열 시퀀싱의 경우, 제2 차 PCR 증폭에서 네스티드 프라이머, 제2 라벨 프라이머 및 제1 범용 프라이머를 사용하여 2 ~ 30개 주기 동안 증폭하되, 여기서 제2 라벨 프라이머의 3’말단 서열과 네스티드 프라이머 5’말단의 서열은 부분적으로 또는 완전히 동일하고, 라벨 프라이머 중간에 8 ~ 15 bp의 라벨 서열이 있으며, 상기 라벨 서열은 상이한 시퀀싱 플랫폼에서 후속의 다중 샘플 혼합 시퀀싱을 위해 상이한 샘플을 구별하는데 사용되는 상이한 고정 서열을 가지고 있다. 제1 범용 프라이머의 3’말단 서열과 제1 라벨 프라이머의 5’말단의 서열은 부분적으로 또는 완전히 동일하다. 증폭의 첫 번째 주기에서, 네스티드 프라이머 및 제1 범용 프라이머를 사용하여 증폭하고, 후속의 주기에서, 네스티드 프라이머, 제2 라벨 프라이머 및 제1 범용 프라이머를 함께 사용하여 타깃 라이브러를 증폭하여, 최종적으로 이중 샘플 라벨의 앰플리콘 라이브러리를 얻는다.
아래 구체적인 실시예를 통해 본 발명의 기술적 해결수단을 상세하게 설명하되, 실시예는 예시적일 뿐 본 발명의 보호범위를 한정하는 것으로 이해해서는 아니됨을 이해해야 한다.
실시예 1
프라이머 설계: 종양 약물 관련 부위에 대해 네스티드 다중 PCR 프라이머를 설계하되, 각각의 앰플리콘은 정방향 프라이머, 네스티드 프라이머 및 역방향 프라이머로 구성되며, 역방향 프라이머에 15 nt의 랜덤 서열을 도입하여 템플릿을 추적하고 오류를 수정하며, 이러한 프라이머를 사용하여 표준품 HD701(horizon사)에 대해 다중 PCR 라이브러리를 제조하고 고처리량 시퀀싱을 완료하며, 얻은 데이터를 분석한 후 각각의 타깃 부위의 돌연변이를 검출하였다.
1. 제1 차 PCR 증폭: QIAGEN Multiplex PCR Kit(제품 번호 Cat No./ID: 206143)를 사용하여 PCR 증폭을 수행하였다.
200 μL의 PCR 튜브에 하기 표 1과 같은 시약 시스템을 배치하였다.
성분 용량
이전 단계 반응물(표준품 HD701) 20 μL
2× PCR 반응 효소 25 μL
정방향 프라이머 풀(10 μM) 2.5 μL
역방향 프라이머 풀(10 μM) 2.5 μL
전체의 양 50 μL
# 정방향 프라이머 풀, 역방향 프라이머 풀은 하기 표 2 및 표 3과 같다.
정방향 프라이머 풀
프라이머 서열
정방향 프라이머 01 AATGACATAACAGTTATGATTTTGCAG(SEQ ID NO: 1)
정방향 프라이머 02 TGAGTCCTGGCGCTGTGT(SEQ ID NO: 2)
정방향 프라이머 03 TGTTGGATCATATTCGTCCACAA(SEQ ID NO: 3)
정방향 프라이머 04 CCAGCAGGATGAACCGGG(SEQ ID NO: 4)
정방향 프라이머 05 AGTGGAGAAGCTCCCAACC(SEQ ID NO: 5)
정방향 프라이머 06 GACAACCCCCACGTGTGC(SEQ ID NO: 6)
정방향 프라이머 07 GCAGCCAGGAACGTACTG(SEQ ID NO: 7)
정방향 프라이머 08 CCTTACTCATGGTCGGATCACA(SEQ ID NO: 8)
정방향 프라이머 09 AGGGACTAGGCGTGGGAT(SEQ ID NO: 9)
정방향 프라이머 10 GACAAACTCTACGTCTCCTCC(SEQ ID NO: 10)
정방향 프라이머 11 GCCTCAATTCTTACCATCCACAA(SEQ ID NO: 11)
정방향 프라이머 12 GAGACAATGAATTAAGGGAAAATGACAAAG(SEQ ID NO: 12)
정방향 프라이머 13 CATTCGAAAGACYCTAGCCTTAGATA(SEQ ID NO: 13)
정방향 프라이머 풀은 상기 프라이머의 10 μM 등몰 혼합에 의해 형성되고, Y는 퇴화 염기(degenerate bases)이다.
역방향 프라이머 풀
프라이머 서열
역방향 프라이머 01 CGCTTGGCCTCCGACTTNNNNNNNNNNNNNNNAGGACTTAGCAAGAAGTTATGGAA(SEQ ID NO: 27)
역방향 프라이머 02 CGCTTGGCCTCCGACTTNNNNNNNNNNNNNNNCATGATGGATGTCACGTTCTCAAA(SEQ ID NO: 27)
역방향 프라이머 03 CGCTTGGCCTCCGACTTNNNNNNNNNNNNNNNGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCT(SEQ ID NO: 29)
역방향 프라이머 04 CGCTTGGCCTCCGACTTNNNNNNNNNNNNNNNTGGTTACATCCCTCTCTGCT(SEQ ID NO: 30)
역방향 프라이머 05 CGCTTGGCCTCCGACTTNNNNNNNNNNNNNNNTTATACACCGTGCCGAACGC(SEQ ID NO: 31)
역방향 프라이머 06 CGCTTGGCCTCCGACTTNNNNNNNNNNNNNNNTGTTCCCGGACATAGTCCAG(SEQ ID NO: 32)
역방향 프라이머 07 CGCTTGGCCTCCGACTTNNNNNNNNNNNNNNNGCCTCCTTCTGCATGGTATTCTTT(SEQ ID NO: 33)
역방향 프라이머 08 CGCTTGGCCTCCGACTTNNNNNNNNNNNNNNNGAGAATGGGTACTCACGTTTCCTT(SEQ ID NO: 34)
역방향 프라이머 09 CGCTTGGCCTCCGACTTNNNNNNNNNNNNNNNTGTGGAAAAGTCCCAATGGAACTATC(SEQ ID NO: 35)
역방향 프라이머 10 CGCTTGGCCTCCGACTTNNNNNNNNNNNNNNNCTCTCTCCACCAGAGCGA(SEQ ID NO: 36)
역방향 프라이머 11 CGCTTGGCCTCCGACTTNNNNNNNNNNNNNNNAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACA(SEQ ID NO: 37)
역방향 프라이머 12 CGCTTGGCCTCCGACTTNNNNNNNNNNNNNNNATTTTAGCACTTACCTGTGACTCCA(SEQ ID NO: 38)
역방향 프라이머 13 CGCTTGGCCTCCGACTTNNNNNNNNNNNNNNNTGTGTGGAAGATCCAATCCATT(SEQ ID NO: 39)
역방향 프라이머 풀은 상기 프라이머의 10μM 등몰 혼합에 의해 형성된다. 하기 표 4에 나타낸 프로세스에 따라 제1 차 PCR 증폭을 수행하였다.
온도 시간 주기 수
95 ℃ 2 min 1개 주기
95 ℃ 10 s
2개 주기
62 ℃ 2 min
72 ℃ 30 s
72 ℃ 5 min 1개 주기
얻은 PCR 생성물에 80 μL의 XP 비드(beads)를 첨가하여 정제하고(beckman사의 Agencourt AMPure XP 비드, 제품 번호 A63881), 얻은 생성물을 20 μL의 TE 용액에 용해시켰다.
2. 제2 차 PCR 증폭: QIAGEN Multiplex PCR Kit(제품 번호 Cat No./ID: 206143)를 사용하여 PCR 증폭을 수행하였다.
200 μL의 PCR 튜브에 하기 표 5와 같은 시약 시스템을 배치하였다.
성분 용량
이전 단계 반응물 20 μL
2× PCR 반응 효소 25 μL
네스티드 프라이머 풀 2.5 μL
제2 범용 프라이머 2.5 μL
제1 라벨 프라이머 2.5 μL
전체의 양 50 μL
# 네스티드 프라이머 풀은 표 6과 같다.
네스티드 프라이머 풀
프라이머 서열
네스티드 프라이머 01 ACATGGCTACGATCCGACTTTCAGTGTTACTTACCTGTCTTGTC(SEQ ID NO: 14)
네스티드 프라이머 02 ACATGGCTACGATCCGACTTTCAGGATGGTGGATGTGGG(SEQ ID NO: 15)
네스티드 프라이머 03 ACATGGCTACGATCCGACTTGCTGTATCGTCAAGGCACTC(SEQ ID NO: 16)
네스티드 프라이머 04 ACATGGCTACGATCCGACTTACCCCAATGCAGCGAACAA(SEQ ID NO: 17)
네스티드 프라이머 05 ACATGGCTACGATCCGACTTAGCTCTCTTGAGGATCTTGAAGG(SEQ ID NO: 18)
네스티드 프라이머 06 ACATGGCTACGATCCGACTTCTGCCTCACCTCCACCGT(SEQ ID NO: 19)
네스티드 프라이머 07 ACATGGCTACGATCCGACTTAACACCGCAGCATGTCAA(SEQ ID NO: 20)
네스티드 프라이머 08 ACATGGCTACGATCCGACTTTGTGATTTTGGTCTAGCCAGAG(SEQ ID NO: 21)
네스티드 프라이머 09 ACATGGCTACGATCCGACTTGATGATGGGCTCCCGGAA(SEQ ID NO: 22)
네스티드 프라이머 10 ACATGGCTACGATCCGACTTCGTCTCCTCCGACCACTGT(SEQ ID NO: 23)
네스티드 프라이머 11 ACATGGCTACGATCCGACTTGATCCAGACAACTGTTCAAACTG(SEQ ID NO: 24)
네스티드 프라이머 12 ACATGGCTACGATCCGACTTGCAATTTCTACACGAGATCCTCT(SEQ ID NO: 25)
네스티드 프라이머 13 ACATGGCTACGATCCGACTTGCAAGAGGCTTTGGAGTATTTCATG(SEQ ID NO: 26)
네스티드 프라이머 풀은 상기 프라이머의 10μM 등몰 혼합에 의해 형성된다. 제1 라벨 프라이머는,
TGTGAGCCAAGGAGTTNNNNNNNNNN#TTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTT(SEQ ID NO: 40)이고,
# 여기서 N은 라벨 서열로, 랜덤 염기이다.
제2 범용 프라이머는 /5Phos/#GAACGACATGGCTACGATCCGACTT(SEQ ID NO: 41)이고, 프라이머 5’말단을 인산화하여 MGI 플랫폼의 고리화에 사용하였다.
하기 표 7에 나타낸 프로세스에 따라 제1 차 PCR 증폭을 수행하였다.
온도 시간 주기 수
95 ℃ 2 min 1개 주기
95 ℃ 10 s
24개 주기
62 ℃ 2 min
72 ℃ 30 s
72 ℃ 5 min 1개 주기
얻은 PCR 생성물에 80 μL의 XP 비드(beads)를 첨가하여 정제하고(beckman사의 Agencourt AMPure XP 비드, 제품 번호 A63881), 얻은 생성물을 20 μL의 TE 용액에 용해시켰다.
3. 라이브러리 품질 검사
라이브러리를 검출한 결과 밴드 범위는 150 ~ 200 bp 사이이고, 결과는 도 8에 도시된 바와 같다.
4. 온라인 시퀀싱
얻은 모든 생성물을 표준화하고, 동일한 양으로 혼합하여 얻은 라이브러리를 병렬 시퀀싱하되, 시퀀싱 플랫폼은 MGISEQ-2000이며, 시퀀싱 타입은 PE100이다.
5. 데이터 분석
분석 단계는 어댑터 프라이머 서열을 여과하고 비교하는 등 기본 단계를 포함하고, 얻은 기본 정보는 표 8과 같으며, 그 후 GATK를 사용하여 타깃 부위의 돌연변이를 검출하였다(표 9).
오프라인 데이터 통계
번호 원시 데이터 비교율 캡처율 평균 깊이 균일성 0.2×
샘플 1 8349037 99.85 % 99.72 % 1277933 100 %
샘플 2 11265885 99.85 % 99.68 % 1711470 100 %
샘플 3 10184135 99.88 % 99.73 % 1542768 100 %
샘플 4 15748586 99.89 % 99.75 % 2389774 100 %
돌연변이 부위 검출
돌연변이 부위 이론 검출값 실제 검출값 1 실제 검출값 2 실제 검출값 3 실제 검출값 4
E545K 9.0 % 9.7 % 9.3 % 9.6 % 8.6 %
H1047R 17.5 % 18.7 % 18.4 % 17.2 % 15.8 %
D816V 10.0 % 9.2 % 11.0 % 9.2 % 10.2 %
G719S 24.5 % 26.7 % 23.5 % 24.5 % 26.5 %
T790M 1.0 % 0.9 % 1.0 % 1.0 % 1.0 %
L858R 3.0 % 3.1 % 2.9 % 3.3 % 3.1 %
V600E 10.5 % 9.6 % 11.2 % 9.8 % 10.3 %
G13D 15.0 % 14.7 % 14.7 % 16.5 % 13.8 %
G12D 6.0 % 6.5 % 6.3 % 6.4 % 6.2 %
도 8로부터 알 수 있는 바, 네스티드 다중 PCR로 얻은 생성물은 프라이머 이합체 및 비특이적 생성물이 없다. 표 8은 오프라인 데이터의 비교율, 캡처율이 모두 99 %에 도달할 수 있고, 0.2× 평균 깊이의 균일성이 100 %에 도달할 수 있으며, 그 중 각 앰플리콘 깊이가 7배 이내임을 나타내는데(표 7), 이는 증폭 성능이 우수함을 설명한다. 타깃 부위에 대해 돌연변이 검출을 수행한 결과, 모든 샘플에서 실제적으로 검출된 돌연변이 빈도는 표준품 돌연변이 검출 빈도에 가깝고, 실제값은 이론값의 약 1±0.1배이다(표 9).이상 구체적인 예를 사용하여 본 발명을 설명하였으며, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명을 한정하지 않는다. 당업자는 또한 본 발명의 사상에 따라 다양한 간단한 추론, 변형 또는 대체를 진행할 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> 심천엠지아이과학기술유한회사 <120> 네스티드 다중 PCR 고처리량 시퀀싱 라이브러리의 제조 방법 및 키트 <130> 19P28353 <160> 41 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> 인공서열 <400> 1 aatgacataa cagttatgat tttgcag 27 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> 인공서열 <400> 2 tgagtcctgg cgctgtgt 18 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> 인공서열 <400> 3 tgttggatca tattcgtcca caa 23 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> 인공서열 <400> 4 ccagcaggat gaaccggg 18 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> 인공서열 <400> 5 agtggagaag ctcccaacc 19 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> 인공서열 <400> 6 gacaaccccc acgtgtgc 18 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> 인공서열 <400> 7 gcagccagga acgtactg 18 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> 인공서열 <400> 8 ccttactcat ggtcggatca ca 22 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> 인공서열 <400> 9 agggactagg cgtgggat 18 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> 인공서열 <400> 10 gacaaactct acgtctcctc c 21 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> 인공서열 <400> 11 gcctcaattc ttaccatcca caa 23 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> 인공서열 <400> 12 gagacaatga attaagggaa aatgacaaag 30 <210> 13 <211> 26 <212> DNA <213> 인공서열 <400> 13 cattcgaaag acyctagcct tagata 26 <210> 14 <211> 56 <212> DNA <213> 인공서열 <220> <221> misc_feature <222> (18)..(32) <223> n is a, c, g, or t <400> 14 cgcttggcct ccgacttnnn nnnnnnnnnn nnaggactta gcaagaagtt atggaa 56 <210> 15 <211> 56 <212> DNA <213> 인공서열 <220> <221> misc_feature <222> (18)..(32) <223> n is a, c, g, or t <400> 15 cgcttggcct ccgacttnnn nnnnnnnnnn nncatgatgg atgtcacgtt ctcaaa 56 <210> 16 <211> 59 <212> DNA <213> 인공서열 <220> <221> misc_feature <222> (18)..(32) <223> n is a, c, g, or t <400> 16 cgcttggcct ccgacttnnn nnnnnnnnnn nngaatataa acttgtggta gttggagct 59 <210> 17 <211> 52 <212> DNA <213> 인공서열 <220> <221> misc_feature <222> (18)..(32) <223> n is a, c, g, or t <400> 17 cgcttggcct ccgacttnnn nnnnnnnnnn nntggttaca tccctctctg ct 52 <210> 18 <211> 52 <212> DNA <213> 인공서열 <220> <221> misc_feature <222> (18)..(32) <223> n is a, c, g, or t <400> 18 cgcttggcct ccgacttnnn nnnnnnnnnn nnttatacac cgtgccgaac gc 52 <210> 19 <211> 52 <212> DNA <213> 인공서열 <220> <221> misc_feature <222> (18)..(32) <223> n is a, c, g, or t <400> 19 cgcttggcct ccgacttnnn nnnnnnnnnn nntgttcccg gacatagtcc ag 52 <210> 20 <211> 56 <212> DNA <213> 인공서열 <220> <221> misc_feature <222> (18)..(32) <223> n is a, c, g, or t <400> 20 cgcttggcct ccgacttnnn nnnnnnnnnn nngcctcctt ctgcatggta ttcttt 56 <210> 21 <211> 56 <212> DNA <213> 인공서열 <220> <221> misc_feature <222> (18)..(32) <223> n is a, c, g, or t <400> 21 cgcttggcct ccgacttnnn nnnnnnnnnn nngagaatgg gtactcacgt ttcctt 56 <210> 22 <211> 58 <212> DNA <213> 인공서열 <220> <221> misc_feature <222> (18)..(32) <223> n is a, c, g, or t <400> 22 cgcttggcct ccgacttnnn nnnnnnnnnn nntgtggaaa agtcccaatg gaactatc 58 <210> 23 <211> 50 <212> DNA <213> 인공서열 <220> <221> misc_feature <222> (18)..(32) <223> n is a, c, g, or t <400> 23 cgcttggcct ccgacttnnn nnnnnnnnnn nnctctctcc accagagcga 50 <210> 24 <211> 57 <212> DNA <213> 인공서열 <220> <221> misc_feature <222> (18)..(32) <223> n is a, c, g, or t <400> 24 cgcttggcct ccgacttnnn nnnnnnnnnn nnaataggtg attttggtct agctaca 57 <210> 25 <211> 57 <212> DNA <213> 인공서열 <220> <221> misc_feature <222> (18)..(32) <223> n is a, c, g, or t <400> 25 cgcttggcct ccgacttnnn nnnnnnnnnn nnattttagc acttacctgt gactcca 57 <210> 26 <211> 54 <212> DNA <213> 인공서열 <220> <221> misc_feature <222> (18)..(32) <223> n is a, c, g, or t <400> 26 cgcttggcct ccgacttnnn nnnnnnnnnn nntgtgtgga agatccaatc catt 54 <210> 27 <211> 44 <212> DNA <213> 인공서열 <400> 27 acatggctac gatccgactt tcagtgttac ttacctgtct tgtc 44 <210> 28 <211> 39 <212> DNA <213> 인공서열 <400> 28 acatggctac gatccgactt tcaggatggt ggatgtggg 39 <210> 29 <211> 40 <212> DNA <213> 인공서열 <400> 29 acatggctac gatccgactt gctgtatcgt caaggcactc 40 <210> 30 <211> 39 <212> DNA <213> 인공서열 <400> 30 acatggctac gatccgactt accccaatgc agcgaacaa 39 <210> 31 <211> 43 <212> DNA <213> 인공서열 <400> 31 acatggctac gatccgactt agctctcttg aggatcttga agg 43 <210> 32 <211> 38 <212> DNA <213> 인공서열 <400> 32 acatggctac gatccgactt ctgcctcacc tccaccgt 38 <210> 33 <211> 38 <212> DNA <213> 인공서열 <400> 33 acatggctac gatccgactt aacaccgcag catgtcaa 38 <210> 34 <211> 42 <212> DNA <213> 인공서열 <400> 34 acatggctac gatccgactt tgtgattttg gtctagccag ag 42 <210> 35 <211> 38 <212> DNA <213> 인공서열 <400> 35 acatggctac gatccgactt gatgatgggc tcccggaa 38 <210> 36 <211> 39 <212> DNA <213> 인공서열 <400> 36 acatggctac gatccgactt cgtctcctcc gaccactgt 39 <210> 37 <211> 43 <212> DNA <213> 인공서열 <400> 37 acatggctac gatccgactt gatccagaca actgttcaaa ctg 43 <210> 38 <211> 43 <212> DNA <213> 인공서열 <400> 38 acatggctac gatccgactt gcaatttcta cacgagatcc tct 43 <210> 39 <211> 45 <212> DNA <213> 인공서열 <400> 39 acatggctac gatccgactt gcaagaggct ttggagtatt tcatg 45 <210> 40 <211> 58 <212> DNA <213> 인공서열 <220> <221> misc_feature <222> (17)..(26) <223> n is a, c, g, or t <400> 40 tgtgagccaa ggagttnnnn nnnnnnttgt cttcctaaga ccgcttggcc tccgactt 58 <210> 41 <211> 25 <212> DNA <213> 인공서열 <400> 41 gaacgacatg gctacgatcc gactt 25

Claims (20)

  1. 네스티드 다중 PCR 고처리량 시퀀싱 라이브러리의 제조 방법으로서,
    정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 사용하여 타깃 영역을 증폭하되, 상기 정방향 프라이머는 상기 타깃 영역에 결합된 정방향 특이적 서열이고, 상기 역방향 프라이머는 3’말단의 상기 타깃 영역에 결합된 역방향 특이적 서열 및 5’말단의 제1 범용 시퀀싱 서열을 포함하는 제1 차 PCR 증폭 단계;
    상기 제1 차 PCR 증폭의 생성물을 정제하는 증폭 생성물 정제 단계; 및
    정제된 생성물을 네스티드 프라이머, 제1 라벨 프라이머 및 제2 범용 프라이머를 사용하여 증폭하되, 상기 네스티드 프라이머는 상기 정방향 프라이머의 다운스트림에 위치하고, 상기 네스티드 프라이머는 5’말단의 제2 범용 시퀀싱 서열 및 3’말단의 특이적 서열을 포함하며, 상기 제1 라벨 프라이머 3’말단 서열과 상기 역방향 프라이머 5’말단의 제1 범용 시퀀싱 서열은 부분적으로 또는 완전히 동일하고, 상기 제1 라벨 프라이머는 제1 라벨 서열을 더 포함하며, 상기 제2 범용 프라이머 3’말단 서열과 상기 네스티드 프라이머 5’말단의 제2 범용 시퀀싱 서열은 부분적으로 또는 완전히 동일한 제2 차 PCR 증폭 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제2 범용 프라이머는 제2 라벨 프라이머이고, 상기 제2 라벨 프라이머 3’말단 서열과 상기 네스티드 프라이머 5’말단의 제2 범용 시퀀싱 서열은 부분적으로 또는 완전히 동일하며, 상기 제2 라벨 프라이머는 제2 라벨 서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 네스티드 다중 PCR 고처리량 시퀀싱 라이브러리의 제조 방법으로서,
    정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 제1 라벨 프라이머를 사용하여 타깃 영역을 증폭하되, 상기 정방향 프라이머는 상기 타깃 영역에 결합된 정방향 특이적 서열이고, 상기 역방향 프라이머는 3’말단의 상기 타깃 영역에 결합된 역방향 특이적 서열 및 5’말단의 제1 범용 시퀀싱 서열을 포함하며, 상기 제1 라벨 프라이머 3’말단 서열과 상기 역방향 프라이머 5’말단의 제1 범용 시퀀싱 서열은 부분적으로 또는 완전히 동일하고, 상기 제1 라벨 프라이머는 제1 라벨 서열을 더 포함하는 제1 차 PCR 증폭 단계;
    상기 제1 차 PCR 증폭의 생성물을 정제하는 증폭 생성물 정제 단계; 및
    정제된 생성물을 네스티드 프라이머, 제1 범용 프라이머 및 제2 범용 프라이머를 사용하여 증폭하되, 상기 네스티드 프라이머는 상기 정방향 프라이머의 다운스트림에 위치하고, 상기 네스티드 프라이머는 5’말단의 제2 범용 시퀀싱 서열 및 3’말단의 특이적 서열을 포함하며, 상기 제1 범용 프라이머 3’말단 서열과 상기 제1 라벨 프라이머 5’말단의 서열은 부분적으로 또는 완전히 동일하고, 상기 제2 범용 프라이머 3’말단 서열과 상기 네스티드 프라이머 5’말단의 제2 범용 시퀀싱 서열은 부분적으로 또는 완전히 동일한 제2 차 PCR 증폭 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 제2 범용 프라이머는 제2 라벨 프라이머이고, 상기 제2 라벨 프라이머 3’말단 서열과 상기 네스티드 프라이머 5’말단의 제2 범용 시퀀싱 서열은 부분적으로 또는 완전히 동일하며, 상기 제2 라벨 프라이머는 제2 라벨 서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 역방향 프라이머는 분자 인덱스 서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 분자 인덱스 서열은 8 ~ 24 bp의 랜덤 서열인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 복수 개의 연속적인 타깃 영역을 증폭하고, 각각의 타깃 영역 모두에는 대응되는 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 네스티드 프라이머가 구비되며, 인접 앰플리콘 영역 사이에는 증폭 중첩이 형성되는 특징으로 하는 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 네스티드 프라이머는 모두 상이한 타깃 영역을 각각 표적화하는 복수 개의 프라이머로 구성된 프라이머 풀인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제7항에 있어서,
    각각의 타깃 영역의 정방향 프라이머와 인접 영역의 정방향 프라이머의 증폭 방향, 네스티드 프라이머와 인접 영역의 네스티드 프라이머의 증폭 방향, 역방향 프라이머와 인접 영역의 역방향 프라이머의 증폭 방향은 반대인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 차 PCR 증폭 및/또는 제2 차 PCR 증폭의 주기 수는 모두 2 ~ 30개 주기인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 라벨 서열 및/또는 제2 라벨 서열의 길이는 모두 8 ~ 15 bp인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 네스티드 다중 PCR 고처리량 시퀀싱 라이브러리의 제조 키트로서,
    상기 키트는 제1 차 PCR 증폭 프라이머 및 제2 차 PCR 증폭 프라이머를 포함하되,
    제1 차 PCR 증폭 프라이머는 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 포함하고, 상기 정방향 프라이머는 타깃 영역에 결합된 정방향 특이적 서열이며, 상기 역방향 프라이머는 3’말단의 상기 타깃 영역에 결합된 역방향 특이적 서열 및 5’말단의 제1 범용 시퀀싱 서열을 포함하고, 상기 제1 차 PCR 증폭 프라이머는 타깃 영역에 대해 제1 차 PCR 증폭을 수행하는데 사용되며;
    제2 차 PCR 증폭 프라이머는 네스티드 프라이머, 제1 라벨 프라이머 및 제2 범용 프라이머를 포함하고, 상기 네스티드 프라이머는 상기 정방향 프라이머의 다운스트림에 위치하며, 상기 네스티드 프라이머는 5’말단의 제2 범용 시퀀싱 서열 및 3’말단의 특이적 서열을 포함하고, 상기 제1 라벨 프라이머 3’말단 서열과 상기 역방향 프라이머 5’말단의 제1 범용 시퀀싱 서열은 부분적으로 또는 완전히 동일하며, 상기 제1 라벨 프라이머는 제1 라벨 서열을 더 포함하고, 상기 제2 범용 프라이머 3’말단 서열과 상기 네스티드 프라이머 5’말단의 제2 범용 시퀀싱 서열은 부분적으로 또는 완전히 동일하며, 상기 제2 차 PCR 증폭 프라이머는 정제된 상기 제1 차 PCR 증폭의 생성물에 대해 제2 차 PCR 증폭을 수행하는데 사용되는 것을 특징으로 하는 키트.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 제2 범용 프라이머는 제2 라벨 프라이머이고, 상기 제2 라벨 프라이머 3’말단 서열과 상기 네스티드 프라이머 5’말단의 제2 범용 시퀀싱 서열은 부분적으로 또는 완전히 동일하며, 상기 제2 라벨 프라이머는 제2 라벨 서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  14. 네스티드 다중 PCR 고처리량 시퀀싱 라이브러리의 제조 키트로서,
    상기 키트는 제1 차 PCR 증폭 프라이머 및 제2 차 PCR 증폭 프라이머를 포함하되,
    제1 차 PCR 증폭 프라이머는 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 제1 라벨 프라이머를 포함하고, 상기 정방향 프라이머는 상기 타깃 영역에 결합된 정방향 특이적 서열이며, 상기 역방향 프라이머는 3’말단의 상기 타깃 영역에 결합된 역방향 특이적 서열 및 5’말단의 제1 범용 시퀀싱 서열을 포함하고, 상기 제1 라벨 프라이머 3’말단 서열과 상기 역방향 프라이머 5’말단의 제1 범용 시퀀싱 서열은 부분적으로 또는 완전히 동일하며, 상기 제1 라벨 프라이머는 제1 라벨 서열을 더 포함하고, 상기 제1 차 PCR 증폭 프라이머는 타깃 영역에 대해 제1 차 PCR 증폭을 수행하는데 사용되며;
    제2 차 PCR 증폭 프라이머는 네스티드 프라이머, 제1 범용 프라이머 및 제2 범용 프라이머를 포함하고, 상기 네스티드 프라이머는 상기 정방향 프라이머의 다운스트림에 위치하며, 상기 네스티드 프라이머는 5’말단의 제2 범용 시퀀싱 서열 및 3’말단의 특이적 서열을 포함하고, 상기 제1 범용 프라이머 3’말단 서열과 상기 제1 라벨 프라이머 5’말단의 서열은 부분적으로 또는 완전히 동일하며, 상기 제2 범용 프라이머 3’말단 서열과 상기 네스티드 프라이머 5’말단의 제2 범용 시퀀싱 서열은 부분적으로 또는 완전히 동일하고, 상기 제2 차 PCR 증폭 프라이머는 정제된 상기 제1 차 PCR 증폭의 생성물에 대해 제2 차 PCR 증폭을 수행하는데 사용되는 것을 특징으로 하는 키트.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 제2 범용 프라이머는 제2 라벨 프라이머이고, 상기 제2 라벨 프라이머 3’말단 서열과 상기 네스티드 프라이머 5’말단의 제2 범용 시퀀싱 서열은 부분적으로 또는 완전히 동일하며, 상기 제2 라벨 프라이머는 제2 라벨 서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  16. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 역방향 프라이머는 분자 인덱스 서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 분자 인덱스 서열은 8 ~ 24 bp의 랜덤 서열인 것을 특징으로 하는 키트.
  18. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 네스티드 프라이머는 모두 복수 개의 연속적인 타깃 영역을 각각 표적화하는 복수 개의 프라이머로 구성된 프라이머 풀이고, 인접 영역 사이에는 증폭 중첩이 형성되는 것을 특징으로 하는 키트.
  19. 제18항에 있어서,
    각각의 타깃 영역의 정방향 프라이머와 인접 영역의 정방향 프라이머의 증폭 방향, 네스티드 프라이머와 인접 영역의 네스티드 프라이머의 증폭 방향, 역방향 프라이머와 인접 영역의 역방향 프라이머의 증폭 방향은 반대인 것을 특징으로 하는 키트.
  20. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 라벨 서열 및/또는 제2 라벨 서열의 길이는 모두 8 ~ 15 bp인 것을 특징으로 하는 키트.
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