KR20220007973A

KR20220007973A - 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 약학조성물

Info

Publication number: KR20220007973A
Application number: KR1020200085951A
Authority: KR
Inventors: 이흥규; 정희은
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2020-07-13
Filing date: 2020-07-13
Publication date: 2022-01-20
Also published as: KR102494231B1

Abstract

본 발명은 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 약학조성물에 관한 것이다.
인플루엔자(Influenza)란 오소믹소바이러스과의 인플루엔자 바이러스가 유발하는 감염성 질환으로, 독감(flu)이라고도 명칭된다. 20세기에는 새로운 인플루엔자로 발생된 독감의 세계적 유행이 세 번 있었으며, 수 천 만명에 이르는 사람들이 사망하였다. GTPases의 한 종류인 믹소바이러스 저항성 단백질들이 다양한 RNA 바이러스의 감염에 대한 항바이러스 효과가 있는 것으로 알려졌으나, 자가 응집되는 특성 때문에 세포 간에 원활히 이동하지 못하므로, 항바이러스 제제로 상용화되지 못하고 있는 실정이다.
따라서 본 발명은 본 발명은 상기와 같은 종래의 기술 상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 변성 MxA 단백질은 자연형 MxA 단백질보다 용해도가 높아 세포 간에 효율적으로 이동되고, 우수한 항바이러스 활성을 나타내므로, 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 또는 치료제로서 의학 분야에서 크게 이용될 것으로 기대된다.

Description

인플루엔자 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 약학조성물{Pharmaceutical compositions for the prevention or treatment of influenza virus infection}

본 발명은 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 약학조성물에 관한 것이다.

인플루엔자(Influenza)란 오소믹소바이러스과의 인플루엔자 바이러스가 유발하는 감염성 질환으로, 독감(flu)이라고도 명명된다. 일반적인 증상은 오한, 발열, 인후염, 근육통, 두통, 기침, 무력감과 불쾌감으로, 독감은 이런 비특이적 증상의 정도가 몸살감기보다 심하고, 전격성 폐렴이나 라이증후군 같은 치명적일 수 있는 합병증을 종종 야기하기도 한다. 보통 감염자의 기침이나 재채기를 통해 공기 중으로 나오는, 바이러스가 함유된 연무질을 흡입함으로써 인플루엔자에 감염되고, 조류의 배설물, 침, 콧물, 대변과 혈액으로도 전염될 수 있다. 때때로 변이된 인플루엔자 바이러스는 수 천에서 수 만명이 사망하는 유행성 독감을 전 세계에 걸쳐 일으키는데, 여러 해에 걸쳐 일어난 전 세계적 유행때에는 보통 약 백만명이 사망하였다. 20세기에는 새로운 인플루엔자로 발생된 독감의 세계적 유행이 세 번 있었으며, 수 천 만명에 이르는 사람들이 사망하였다. 이런 변종은 다른 동물에게서 인간으로 감염이 일어날 때, 또는 인간을 숙주로 삼는 종이 다른 동물을 숙주로 삼는 종에게서 유전자를 받았을 때 자주 발생한다. 따라서 인플루엔자 유행을 예방하고자 독감 예방주사가 개발되었으나, 인플루엔자 바이러스가 계속 변이하고 있어 완벽하게 예방되지 못하고 있는 실정이다.

한편, 1962년, 린데만(Lindenmann)에 의해 A2G 계통의 마우스가 인플루엔자 바이러스(Influenza virus) 감염에 저항성을 갖고 있다는 것이 밝혀진 이후, 저항성의 원인을 밝히기 위하여 다양한 후속 연구들이 이루어졌고 이를 통하여, 타입 I 인터페론에 의해 생성이 유도되는 GTPases(Dynamin-like large guanosine triphosphatases)의 한 종류인 Mx(믹소바이러스 저항성, Myxovirus(influenza virus) resistance) 단백질들이 다양한 RNA 바이러스의 감염에 대한 항바이러스 기작을 촉진시키는데 중요한 역할을 하는 것이 밝혀졌다(Genome Res 12, 2002, 527-530). Mx GTPase의 종류는 종에 따라 다양한데, 그 중 MxA 단백질은 광범위한 바이러스에 대한 인터페론 유발 항바이러스 반응의 핵심 매개체이다. MxA 발현은 타입 제 1 형, 및 제 3 형 인터페론에 의해 엄격히 조절되고, 바이러스 또는 다른 자극에 의해서는 직접 유도되지 않는다. MxA는 큰 GTPase의 다이나민 수퍼 패밀리와 많은 특성을 공유하며, 다이나민과 마찬가지로 고순도의 올리고머로 자가 응집(self-assembly)되고, 고리와 같은 구조를 형성하여 바이러스의 vRNP 주위를 둘러싸서 그 기능을 방해한다(J Interferon Cytokine Res. 2011, Jan;31(1):79-87). 이러한 MxA 단백질은 다양한 바이러스의 감염에 대한 선천성 면역 반응에 관여하여 바이러스의 활성화를 저해하고 바이러스의 증식을 억제하여 항바이러스 제제로 사용될 수 있을 것이 기대되었으나, MxA 단백질의 자가 응집되는 특성 때문에 세포 간에 원활히 이동하지 못하고 자가 응집한 상태로 존재한다. 따라서 항바이러스 제제로 상용화되지 못하고 있는 실정이다.

따라서 본 발명은 새로운 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 약학조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 세포간 이동이 촉진되도록 용해성을 증가시킨 변성 MxA 단백질을 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 약학조성물에 관한 것이다. 본 발명의 변성 MxA 단백질은 자연형 MxA 단백질보다 용해도가 높아 세포 간에 효율적으로 이동되고, 우수한 항바이러스 활성을 나타내므로, 의학 분야에서 크게 이용될 것으로 기대된다.

본 발명은 상기와 같은 종래의 기술 상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물, 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에 서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.

명세서에서 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.

본 명세서에 있어서, 믹소바이러스 저항성 A(Myxovirus resistance A, MxA) 단백질이란 커다란 GTPase의 다이나민 수퍼 패밀리(dynamin superfamily)에 속하는 항바이러스성 단백질로 오르토믹소바이러스(orthomyxovirus)와 버냐바이러스(bunyaviruses)를 포함한 많은 다른 바이러스에 대해 내재적 항바이러스 활성을 나타내며, 그 발현은 I 형(α/β)이나 III 형(λ) 인터페론에 의해 엄격히 제어된다. 믹소바이러스 저항성 A 단백질은 662개의 아미노산으로 구성되고(서열번호 1), 전체 75.520 Da 크기이며, 고도로 정돈된 올리고머를 자체 조립하여 링과 같은 구조를 형성할 수 있다.

믹소바이러스 저항성 A 단백질은 N 말단으로부터 G도메인(G domain, 또는 GTPase binding domain), 미들도메인(Middle domain), 및 GED(GTPase effect domain)으로 구분되고, 미들도메인과 GED는 α1N, α1C, α2, α3, α4, α6, 및 α1N과 α1C 사이의 L1, α1C와 α2 사이의 L2, α3와 α4 사이의 L3, α3와 α4 사이의 L4 영역으로 구분된다. 특히 GED에 해당하는 L4 및 α4 영역은 믹소바이러스 저항성 A 단백질의 항바이러스 활성 효과를 조절하는 부분으로, 항바이러스 활성에 매우 중요하다(Corinna Patzina 등, THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 289, NO. 9, pp. 6020-6027). 그러나 추가 연구를 통해 상기 MxA 단백질은 300mM 이상의 NaCl 이 포함된 고농도의 salt 조건에서는 수용액 속에 용해되어 존재하나 생리학적 수준(약 150mM)으로 salt 농도를 낮추면 자가응집되어 3MDa 이상의 거대한 올리고머를 형성하며 불용성의 침전을 이루는 것이 확인되었다(Georg Kochs등, THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 277, NO. 16, pp. 14172-14176, 2002). 이렇듯 MxA 단백질은 자가 응집되는 특성 때문에 세포 내에서 자가 응집한 올리고머 상태로 존재하므로, GED 영역의 활성조절, 및 세포간 이동에 제한을 받는다는 것이 알려졌다. 따라서 항바이러스 제제로 상용화되지 못하고 있는 실정이다.

본 명세서에 있어서, 단백질 전달 도메인(Protein transduction domain, PTD)이란 3 내지 30개의 아미노산으로 구성된 펩타이드로 단백질, 펩타이드, DNA 등 다양한 물질과 결합하여 특별한 수용체 없이도 물질들을 세포 내부로 이동시킬 수 있는 펩타이드를 말한다. 바람직하게는 하기 표 1에 기재한 서열, 즉, 아르기닌(Arginine)이 5 내지 10개가 결합된 서열, 전사 트랜스 활성자(Trans-activator of transcription, TAT), ANTP, Vp22, MTS, Pep-1, Pep-2 등일 수 있으나, MxA 단백질과 결합하여 세포막을 통과하여 세포간 이동을 촉진할 수 있는 도메인이라면 제한이 없다.

정의	서열
아르기닌(Arginine)이 5 내지 10개가 결합	RRRRR 내지 RRRRRRRRRR
전사 트랜스 활성자(TAT)	YGRKKRRORRR
ANTP	RQIKIWFQNRRMKWKK
Vp22	DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE
MTS	AAVALLPAVLLALLAPAAADQNQLMP
Pep-1	KETWWETWWTEWSQPKKKRKV
Pep-2	KETWFETWFTEWSQPKKKRKV

본 명세서에 있어서, 항바이러스란 동물, 식물, 세균, 방사균 등 살아있는 세포에 기생하며 세포 내에서만 증식할 수 있는 바이러스 감염에 대한 예방 또는 치료 작용을 의미하며, 상기 바이러스는 본 발명의 변성 MxA 단백질에 의하여 증식이 억제되는 바이러스라면 제한이 없으나, 바람직하게는 오르토믹소바이러스(orthomyxoviridae)과 인플루엔자 바이러스(influenza virus)를 의미한다.

본 명세서에 있어서, 약학조성물이란 특정한 목적을 위해 투여되는 조성물을 의미한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 약학조성물은 인플루엔자 바이러스 감염을 예방 또는 치료하기 위한 것이며, 이에 관여하는 화합물 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 약학 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 본 발명의 유효성분을 0.1 내지 50 중량%로 포함한다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에 있어서, 투여란 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 경구 투여, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여, 강내 투여, 복강 내 투여, 경막 내 투여가 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명에서 유효량은 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 성인의 경우, 상기 치료용 약학조성물을 1회 50ml~500ml의 양으로 체내에 투여 가능하며, 화합물일 경우 0.1ng/kg-10㎎/kg, 모노클로날 항체일 경우 0.1ng/kg-10㎎/kg의 용량으로 투여될 수 있다. 투여간격은 1일 1회 내지 12회일 수 있으며, 1일 12회 투여할 경우에는 2시간마다 1회씩 투여할 수 있다. 또한 본 발명의 약학조성물은 목적하고자 하는 암 줄기세포의 치료를 위해 단독 또는 당업계에 공지된 다른 치료법, 예를 들어 화학요법제, 방사선 및 수술과 같이 투여될 수 있다. 또한 본 발명의 약학조성물은 면역 반응을 증진하기 위하여 고안된 다른 치료, 예를 들어 당업계에 주지된 것과 같은 어쥬번트 또는 사이토카인(또는 사이토카인을 코딩하는 핵산)과 혼합하여 투여될 수 있다. 바이오리스틱(biolistic) 전달 또는 생체 외(ex vivo) 처리와 같은 다른 표준 전달 방법들이 사용될 수도 있다. 생체 외 처리에서 예를 들어 항원제시 세포들(APCs), 수지상세포들, 말초혈액 단핵구 세포들, 또는 골수세포들을 환자 또는 적당한 공여자로부터 얻어서 본 약학조성물로 생체 외에서 활성화된 후 그 환자에게 투여될 수 있다.

본 명세서에 있어서, 식품조성물이란 본 발명의 목적상, 인플루엔자 바이러스 감염을 예방 또는 개선하기 위한 것이나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 식품조성물은 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 우유, 유산균 함유 유제품, 껌, 차, 비타민 복합제, 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 과자, 떡, 빵 등의 형태로 제조될 수 있다. 본 발명의 식품조성물은 독성 및 부작용이 거의 없는 단백질로 구성된 것이므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있다. 본 발명의 조성물이 식품 조성물에 포함될 때 그 양은 전체 중량의 0.1 내지 100%의 비율로 첨가할 수 있다. 여기서, 상기 식품조성물이 음료 형태로 제조되는 경우 지시된 비율로 상기 식품조성물을 함유하는 것 외에 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러가지 향미제 또는 천연탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 즉, 천연탄수화물로서 포도당 등의 모노사카라이드, 과당 등의 디사카라이드, 전분 등의 폴리사카라이드 및 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜 등을 포함할 수 있다. 상기 향미제로서는 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등) 등을 들 수 있다. 그 외 본 발명의 식품조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성풍미제 및 천연풍미제 등의 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.1 내지 100 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명의 일 구체예에서, 서열번호 1로 표시되는 단백질에서 1개 이상의 류신이 아스파르트산으로 치환된 변성 단백질을 제공하고, 상기 변성 단백질은 서열번호 1의 단백질보다 용해성이 증가한 것인 변성 단백질을 제공하며, 상기 변성 단백질은 서열번호 2로 표시되는 것인 변성 단백질을 제공하며, 상기 변성 단백질은 N 말단에 단백질 전달 도메인(Protein transduction domain, PTD)이 추가로 결합된 것인 변성 단백질을 제공하며, 상기 단백질 전달 도메인은 5개 내지 10개의 아르기닌(Arginine)이 결합된 것, 전사 트랜스 활성자(Trans-activator of transcription, TAT), ANTP, Vp22, MTS, Pep-1, 및 Pep-2로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나인 변성 단백질을 제공하며, 상기 단백질 전달 도메인은 전사 트랜스 활성자(Trans-activator of transcription, TAT)인 변성 단백질을 제공한다.

본 발명의 다른 구체예에서, 상기 중 어느 하나 이상의 변성 단백질을 코딩하는 재조합 유전자를 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기의 재조합 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하고, 상기 벡터는 대장균 과발현 벡터인 재조합 벡터를 제공하며, 상기 벡터는 pET28a 벡터인 재조합 벡터를 제공하며, 상기 벡터는 히스티딘-표지(Histidine-tag) 유전자를 포함하는 것인 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 중 어느 하나 이상의 재조합 벡터로 형질전환된 인간을 제외한 형질전환체를 제공하고, 상기 형질전환체는 미생물인 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 중 어느 하나 이상의 변성 단백질을 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하고, 상기 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 A 바이러스인 것인 약학조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 서열번호 2로 표시되는 변성 단백질을 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하고, 상기 변성 단백질은 서열번호 1의 단백질보다 용해성이 증가한 것인 약학조성물을 제공하며, 상기 인플루엔자 바이러스는 A/Philippines/2/82(H3N2)인 것인 약학조성물을 제공하며, 상기 변성 단백질은 N 말단에 단백질 전달 도메인(Protein transduction domain, PTD)이 추가로 결합된 것인 약학 조성물을 제공하며, 상기 단백질 전달 도메인은 5개 내지 10개의 아르기닌(Arginine)이 결합된 것, 전사 트랜스 활성자(Trans-activator of transcription, TAT), ANTP, Vp22, MTS, Pep-1, 및 Pep-2로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나인 약학 조성물을 제공하며, 상기 단백질 전달 도메인은 전사 트랜스 활성자(Trans-activator of transcription, TAT)인 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 서열번호 2로 표시되는 변성 단백질을 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 또는 개선용 식품조성물을 제공하고, 상기 변성 단백질은 서열번호 1의 단백질보다 용해성이 증가한 것인 식품조성물을 제공하며, 상기 인플루엔자 바이러스는 A/Philippines/2/82(H3N2)인 것인 식품조성물을 제공하며, 상기 변성 단백질은 N 말단에 단백질 전달 도메인(Protein transduction domain, PTD)이 추가로 결합된 것인 식품 조성물을 제공하며, 상기 단백질 전달 도메인은 5개 내지 10개의 아르기닌(Arginine)이 결합된 것, 전사 트랜스 활성자(Trans-activator of transcription, TAT), ANTP, Vp22, MTS, Pep-1, 및 Pep-2로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나인 식품 조성물을 제공하며, 상기 단백질 전달 도메인은 전사 트랜스 활성자(Trans-activator of transcription, TAT)인 식품 조성물을 제공한다.

이하 상기 본 발명을 단계별로 상세히 설명한다.

본 발명은 새로운 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 약학조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 세포간 이동이 촉진되도록 용해성을 증가시킨 변성 MxA 단백질을 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 약학조성물에 관한 것이다. 본 발명의 변성 MxA 단백질은 자연형 MxA 단백질보다 용해도가 높아 세포 간에 효율적으로 이동되고, 우수한 항바이러스 활성을 나타내므로, 의학 분야에서 크게 이용될 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른, PTD TAT(YGRKKRRQRRR) 결합된 WT, 또는 Mut 단백질의 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른, PTD-WT, 및 PTD-Mut 단백질의 용해도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른, 세포 내 PTD-WT, 또는 PTD-Mut 단백질의 크기와 위치를 공초점 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른, PTD-WT, 및 PTD-Mut 단백질의 항-바이러스 효과를 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른, A/Philippines/2/82(H3N2) 바이러스 감염된 세포에서 사후 PTD-Mut 단백질투여의 바이러스 부하 조절능을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른, RSV 또는 HSV-2 바이러스 감염된 세포에서 사후 PTD-Mut 단백질투여의 바이러스 부하 조절능을 확인한 결과를 나타낸 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: pET28a-PTD-WT, 및 pET28a-PTD-Mut 벡터 제작

본 발명자들은 서열번호 1로 표시되는 자연형 단백질에서 아미노산 류신(Leucine, L) 하나가 아스파르트산(Aspartic acid, D)으로 치환되어 자연형 단백질보다 용해성이 증가한 변성 단백질(서열번호 2)을 제조하였다(표 2). 상기 자연형 단백질(WT), 및 변성 단백질(Mut)의 일측에는 단백질 전달 도메인(Protein transduction domain) 서열을 결합하였다.

서열번호	염기 정보
서열번호 1	MVVSEVDIAKADPAAASHPLLLNGDATVAQKNPGSVAENNLCSQYEEKVRPCIDLIDSLRALGVEQDLALPAIAVIGDQSSGKSSVLEALSGVALPRGSGIVTRCPLVLKLKKLVNEDKWRGKVSYQDYEIEISDASEVEKEINKAQNAIAGEGMGISHELITLEISSRDVPDLTLIDLPGITRVAVGNQPADIGYKIKTLIKKYIQRQETISLVVVPSNVDIATTEALSMAQEVDPEGDRTIGILTKPDLVDKGTEDKVVDVVRNLVFHLKKGYMIVKCRGQQEIQDQLSLSEALQREKIFFENHPYFRDLLEEGKATVPCLAEKLTSELITHICKSLPLLENQIKETHQRITEELQKYGVDIPEDENEKMFFLIDKINAFNQDITALMQGEETVGEEDIRLFTRLRHEFHKWSTIIENNFQEGHKILSRKIQKFENQYRGRELPGFVNYRTFETIVKQQIKALEEPAVDMLHTVTDMVRLAFTDVSIKNFEEFFNLHRTAKSKIEDIRAEQEREGEKLIRLHFQMEQIVYCQDQVYRGALQKVREKELEEEKKKKSWDFGAFQSSSATDSSMEEIFQHLMAYHQEASKRISSHIPLIIQFFMLQTYGQQLQKAMLQLLQDKDTYSWLLKERSDTSDKRKFLKERLARLTQARRRLAQFPG
서열번호 2	MVVSEVDIAKADPAAASHPLLLNGDATVAQKNPGSVAENNLCSQYEEKVRPCIDLIDSLRALGVEQDLALPAIAVIGDQSSGKSSVLEALSGVALPRGSGIVTRCPLVLKLKKLVNEDKWRGKVSYQDYEIEISDASEVEKEINKAQNAIAGEGMGISHELITLEISSRDVPDLTLIDLPGITRVAVGNQPADIGYKIKTLIKKYIQRQETISLVVVPSNVDIATTEALSMAQEVDPEGDRTIGILTKPDLVDKGTEDKVVDVVRNLVFHLKKGYMIVKCRGQQEIQDQLSLSEALQREKIFFENHPYFRDLLEEGKATVPCLAEKLTSELITHICKSLPLLENQIKETHQRITEELQKYGVDIPEDENEKMFFLIDKINAFNQDITALMQGEETVGEEDIRLFTRLRHEFHKWSTIIENNFQEGHKILSRKIQKFENQYRGRELPGFVNYRTFETIVKQQIKALEEPAVDMLHTVTDMVRLAFTDVSIKNFEEFFNLHRTAKSKIEDIRAEQEREGEKLIRLHFQMEQIVYCQDQVYRGALQKVREKELEEEKKKKSWDFGAFQSSSATDSSMEEIFQHLMAYHQEASKRISSHIPLIIQFFMLQTYGQQLQKAMDQLLQDKDTYSWLLKERSDTSDKRKFLKERLARLTQARRRLAQFPG

보다 구체적으로, 서열번호 1을 코딩하는 전장 cDNA를 OriGene(Clone SC118603)으로부터 수득한 후, QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit(Agilent, Santa Clara, CA)를 사용하여 점 돌연변이를 제조하였다. 이 때 사용한 프라이머 정보를 하기 표 3에 기재하였다.

Primer Description	Primer sequence (5`-3`)
Mut - Primer 1	TGTCCTGCAGGAGCTGGTCCATGGCCTTCTGAAGC
Mut - Primer 2	GCTTCAGAAGGCCATGGACCAGCTCCTGCAGGACA

His-tag 융합 단백질을 발현시키기 위해 대장균 발현 벡터 pET28a(HM Kim, KAIST, Korea, Korea)를 사용하였고, PTD TAT(YGRKKRRQRRR) 결합된 WT, 또는 Mut 단백질을 함유하는 삽입 DNA를 제조하기 위해, 하기 표 4의 프라이머를 사용하였다. 상기 PTD TAT(YGRKKRRQRRR) 결합된 WT, 또는 Mut 단백질의 모식도를 도 1에 나타내었다.

Primer Description	Primer sequence (5`-3`)
Forward Primer	CTAGCTAGCTATGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGAGGAGAAGAGTTGTTTCCGAAGTGGA CATC
Reverse Primer	ATAAGAATGCGGCCGCTTAACCGGGGAACTGGGC

삽입된 DNA를 증폭하기 위해 PrimeSTAR HS DNA Polymerase(TAKARA, Shiga, Japan)를 사용하였고, 증폭된 PCR 산물은 Gel Extraction Kit(TAKARA)로 정제하였다. 목적하는 단백질 단편을 Nhe I 및 Not I 제한 효소(NEB, Ipswich, MA)로 분해하고, T4 리가아제(NEB)를 사용하여 pET28a 벡터에 삽입하였다. 재조합된 pET28a-PTD-WT, 또는 pET28a-PTD-Mut 벡터를 DH5α-chemically competent E. coli(Enzynomics, Daejeon, Korea)에서 제조자의 가이드에 따라 증폭시켰다. 이후, 이어서, BL21(DE3) E.coli(Enzynomics) 세포를 pET28a-PTD-WT, 또는 pET28a-PTD-Mut 융합 DNA 서열을 포함하는 pET28a 벡터로 형질 전환시켰다.

실시예 2: PTD-WT, 및 PTD-Mut 단백질의 발현 및 정제

형질 전환된 BL21 세포를 37 ℃에서 3시간 동안 30 ㎍/㎖의 카나마이신(LPS Solution, Daejeon, Korea)을 함유하는 Circlegrow® Bacterial Growth Medium(MP Biomedicals, Santa Ana, CA)에서 배양한 후, 0.125 mM 이소프로필-티오갈락토시드(isopropyl-thiogalactoside; IPTG)를 첨가하여 18 ℃에서 72시간 동안 추가 배양하였다. 이후, 세포를 원심 분리하고 50 mM HEPES(pH 7.5), 400 mM NaCl, 30mM 이미다졸, 6 mM MgCl₂, 1 mM DNAse, 2.5 mM β-머켑토에탄올(β-ME), 및 1 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드(phenylmethylsufonyl fluoride; PMSF)를 함유하는 완충액에 재현탁시켰다. 상기 세포 현탁액을 얼음 위에서 20초 간격으로 90 x 10 초간 초음파 처리하여 용해시키고, 용해물을 4 ℃에서 8000 RPM으로 30 분간 원심 분리하고, His-tagged PTD-WT, 또는 His-tagged PTD-Mut 단백질을 Ni-NTA 수지(Incospharm, 대전, 한국)로 정제하였다. 칼럼은 20 mM HEPES(pH 7.5), 800 mM NaCl, 30 mM 이미다졸, 5 mM MgCl₂, 2.5 mM β-ME, 1 mM ATP, 및 10 mM KCl을 포함하는 용액으로 2회 세척하였고, 20 mM HEPES(pH 7.5), 400 mM NaCl, 80 mM 이미다졸, 5 mM MgCl₂, 및 2.5 mM β-ME을 포함하는 용액으로 단시간 추가 세척하였다. 이어서, 결합된 단백질을 20 mM HEPES(pH 7.5), 400 mM NaCl, 300 mM 이미다졸, 5 mM MgCl₂, 및 2.5 mM β-ME을 포함하는 용액으로 용출하였고, 정제된 PTD-WT, 또는 PTD-Mut 융합 단백질을 내 독소를 제거하기 위해 Pierce High Capacity Endotoxin Removal Resin (Thermo, Waltham, MA)으로 처리하였으며, 20 mM HEPES(pH 7.5), 100 mM NaCl, 1.5 mM MgCl_2, 및 2.5 mM β-ME을 포함하는 용액으로 4 ℃에서 하룻밤 투석하였다. 마지막으로, 시료를 4-20% Mini-PROTEAN® TGX Stain-Free ™ Protein Gels(Bio-rad, Hercules, CA)을 사용하여 SDS-PAGE로 분리하고, 단백질 밴드는 ChemiDoc ™ 겔 이미징 시스템(Bio-rad)을 사용하여 검출하였다.

실시예 3: PTD-WT, 및 PTD-Mut 단백질의 용해도 확인

PTD-WT 및 PTD-Mut 단백질의 용해도를 비교하기 위해 투석한 시료를 1.5 ml 마이크로 튜브에 옮긴 후 4 ℃에서 30 분 간 기다려 불용해성 단백질의 침전 정도를 확인하였다. 대조군으로서 PTD가 결합되지 않은 WT 단백질을 이용하였다. 실험 결과, WT 및 PTD-WT의 경우 단백질이 고차원 올리고머를 이루어 불용성 응집체 상태로 마이크로 튜브 바닥으로 가라앉는 것이 확인되었으나 PTD-Mut 단백질은 동일한 시간 동안 수용성 상태를 유지하고 불용성 응집체를 이루지 않았다. 상기 결과를 도 2에 나타내었다.

실시예 4: PTD-WT, 및 PTD-Mut 단백질의 세포간 이동성 확인

PTD-WT, 및 PTD-Mut 단백질의 세포간, 또는 세포내 이동성을 확인하기 위해 4 x 10⁴ MDCK 세포를 25 ㎍/㎖ PTD-WT, 또는 PTD-Mut 단백질과 함께 배양하였다. 3시간 후, MDCK 세포 내의 PTD-WT, 또는 PTD-Mut 단백질을 공초점 현미경으로 관찰하였다. 간단하게, 세포를 원형질막 염색하기 위해 5 ㎍/㎖의 Alexa Fluor ™ 633이 결합된 Wheat Germ Agglutinin(WGA, Thermo Fisher, Waltham, MA)과 함께 37 ℃에서 10분간 배양하고, 예열된 HBSS로 3회 세척한 후에 Dulbecco's phosphate-buffered saline(DPBS)으로 희석한 4% 파라포름알데히드 용액으로 고정시켰다. 이후, 세포를 DPBS에 희석된 0.2% Triton-X100 용액으로 투과시키고, 1% 소 혈청 알부민(BSA) 및 3% 염소 혈청을 사용하여 블록하였다. 항-MxA 항체(Santa Cruz, Dallas, TX)로 상온에서 2시간 반응시키고, 이어서 Cy3-결합된 염소 항-마우스 IgG(Jackson Immunoresearch, West Grove, PA)로 반응시켰다. DPBS로 3회 세척한 후, DAPI(Abcam, Cambridge, UK)를 포함하는 Fluoroshield 봉입제로 커버 슬립을 정착하였다. 마지막으로, 세포 내 PTD-WT, 또는 PTD-Mut 단백질의 크기와 위치를 LSM800(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany) 현미경으로 관찰하였다.

실험 결과, PTD-WT의 경우 단백질이 고차원 올리고머를 형성하여 크게 응집된 채로 세포막 부근에 존재하였으나, PTD-Mut의 경우에는 PTD-WT와 비교하여 응집된 크기가 현저하게 작고 세포질 내에 고르게 분산되어 있는 것을 확인하였다. 상기 결과를 도 3에 나타내었다.

실시예 5: PTD-WT, 및 PTD-Mut 단백질의 항-바이러스 효과 확인

PTD-WT, 및 PTD-Mut 단백질의 항-인플루엔자 활성을 시험하기 위해서 3 x 10⁵ MDCK 세포를 감염 3시간 전부터 50 ㎍/㎖ PTD-WT, 또는 PTD-Mut 단백질과 함께 배양하였다. 이후, 세포를 IAV PR8(H1N1)의 0.01 감염다중도(multiplicity of infection; MOI) 바이러스(gifted from Akiko Iwasaki, Yale University, New Haven, CT)와 함께 24시간 배양하였다. 감염된 세포의 바이러스 증식은 vRNA 발현을 RT-qPCR로 평가하였다. 그 결과 PTD-WT 또는 PTD-Mut 단백질을 감염 전에 처리하면 유의적으로 세포 내 vRNA의 발현이 감소하는 것이 관찰되었으며, PTD-WT과 PTD-Mut간의 항-바이러스 효과에는 큰 차이가 없는 것이 확인되었다. 이로서 용해성을 증진시킨 PTD-Mut가 PTD-WT 수준의 항-바이러스 효과를 유지하는 것을 확인할 수 있었으며, 상기 결과를 도 4에 나타내었다.

또한 인플루엔자에 감염된 세포에서 사후 PTD-Mut 단백질투여가 바이러스 부하를 조절할 수 있는지 알아보기 위해서 PTD-Mut 단백질의 A/Philippines/2/82(H3N2) 인플루엔자 바이러스에 대한 항-인플루엔자 활성을 시험하기 위해서 3 x 10⁵ MDCK 세포를 A/Philippines/2/82(H3N2) 인플루엔자 바이러스에 0.01 MOI로 4시간 동안 감염시킨 후, 140 ㎍/㎖의 PTD-Mut 단백질을 첨가하고 48시간 추가 배양한 후 배양액 상층 내의 바이러스 역가를 플라크 분석법으로 측정하였다. 그 결과 PTD-Mut 단백질은 A/Philippines/2/82(H3N2)에 감염된 세포에서 바이러스의 증식을 효과적으로 억제하는 것이 확인되었으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다.

추가로 PTD-Mut 단백질이 RSV 또는 HSV-2 바이러스의 전파를 억제할 수 있는지 확인하기 위해서 3 x 10⁵ Hep G2 세포, 또는 vero 세포를 RSV(provided by Dr. Jun Chang, Ewha Womans University, Seoul, Korea), 또는 HSV-2 (gifted from Akiko Iwasaki, Yale University)의 1 MOI로 감염시킨 후, 4시간 동안 80 ㎍/㎖의 PTD-Mut 단백질로 치료하였다. vRNA 활성은 감염 24시간 후에 RT-qPCR로 평가하였다. 그 결과, A/Philippines/2/82(H3N2) 바이러스에서와는 달리, MxA가 항-바이러스 효과를 보이지 않는 것으로 알려진 RSV 혹은 HSV-2 감염에 대해서는 PTD-Mut 단백질이 항-바이러스 효과를 보이지 않는 것이 관찰되었다. 상기 결과를 도 6에 나타내었다.

상기 실시예 1 내지 5의 결과로부터, 서열번호 1로 표시되는 자연형 단백질(WT)에서 아미노산 류신(Leucine, L) 하나를 아스파르트산(Aspartic acid, D)으로 치환한 변성 단백질(Mut, 서열번호 2)이 자연형 단백질(WT)에 비하여 용해도가 현저하게 증가하였으며, 이 변성단백질의 항바이러스 효과는 자연형 단백질 수준으로 유지되는 것이 확인되었다. 이는 본 발명에서 제조한 서열번호 2의 단백질이 효과적인 항바이러스 제제로서 유용하게 사용될 수 있음을 의미한다.

<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Pharmaceutical compositions for the prevention or treatment of influenza virus infection <130> PDPB204101 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 662 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Val Val Ser Glu Val Asp Ile Ala Lys Ala Asp Pro Ala Ala Ala 1 5 10 15 Ser His Pro Leu Leu Leu Asn Gly Asp Ala Thr Val Ala Gln Lys Asn 20 25 30 Pro Gly Ser Val Ala Glu Asn Asn Leu Cys Ser Gln Tyr Glu Glu Lys 35 40 45 Val Arg Pro Cys Ile Asp Leu Ile Asp Ser Leu Arg Ala Leu Gly Val 50 55 60 Glu Gln Asp Leu Ala Leu Pro Ala Ile Ala Val Ile Gly Asp Gln Ser 65 70 75 80 Ser Gly Lys Ser Ser Val Leu Glu Ala Leu Ser Gly Val Ala Leu Pro 85 90 95 Arg Gly Ser Gly Ile Val Thr Arg Cys Pro Leu Val Leu Lys Leu Lys 100 105 110 Lys Leu Val Asn Glu Asp Lys Trp Arg Gly Lys Val Ser Tyr Gln Asp 115 120 125 Tyr Glu Ile Glu Ile Ser Asp Ala Ser Glu Val Glu Lys Glu Ile Asn 130 135 140 Lys Ala Gln Asn Ala Ile Ala Gly Glu Gly Met Gly Ile Ser His Glu 145 150 155 160 Leu Ile Thr Leu Glu Ile Ser Ser Arg Asp Val Pro Asp Leu Thr Leu 165 170 175 Ile Asp Leu Pro Gly Ile Thr Arg Val Ala Val Gly Asn Gln Pro Ala 180 185 190 Asp Ile Gly Tyr Lys Ile Lys Thr Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Gln Arg 195 200 205 Gln Glu Thr Ile Ser Leu Val Val Val Pro Ser Asn Val Asp Ile Ala 210 215 220 Thr Thr Glu Ala Leu Ser Met Ala Gln Glu Val Asp Pro Glu Gly Asp 225 230 235 240 Arg Thr Ile Gly Ile Leu Thr Lys Pro Asp Leu Val Asp Lys Gly Thr 245 250 255 Glu Asp Lys Val Val Asp Val Val Arg Asn Leu Val Phe His Leu Lys 260 265 270 Lys Gly Tyr Met Ile Val Lys Cys Arg Gly Gln Gln Glu Ile Gln Asp 275 280 285 Gln Leu Ser Leu Ser Glu Ala Leu Gln Arg Glu Lys Ile Phe Phe Glu 290 295 300 Asn His Pro Tyr Phe Arg Asp Leu Leu Glu Glu Gly Lys Ala Thr Val 305 310 315 320 Pro Cys Leu Ala Glu Lys Leu Thr Ser Glu Leu Ile Thr His Ile Cys 325 330 335 Lys Ser Leu Pro Leu Leu Glu Asn Gln Ile Lys Glu Thr His Gln Arg 340 345 350 Ile Thr Glu Glu Leu Gln Lys Tyr Gly Val Asp Ile Pro Glu Asp Glu 355 360 365 Asn Glu Lys Met Phe Phe Leu Ile Asp Lys Ile Asn Ala Phe Asn Gln 370 375 380 Asp Ile Thr Ala Leu Met Gln Gly Glu Glu Thr Val Gly Glu Glu Asp 385 390 395 400 Ile Arg Leu Phe Thr Arg Leu Arg His Glu Phe His Lys Trp Ser Thr 405 410 415 Ile Ile Glu Asn Asn Phe Gln Glu Gly His Lys Ile Leu Ser Arg Lys 420 425 430 Ile Gln Lys Phe Glu Asn Gln Tyr Arg Gly Arg Glu Leu Pro Gly Phe 435 440 445 Val Asn Tyr Arg Thr Phe Glu Thr Ile Val Lys Gln Gln Ile Lys Ala 450 455 460 Leu Glu Glu Pro Ala Val Asp Met Leu His Thr Val Thr Asp Met Val 465 470 475 480 Arg Leu Ala Phe Thr Asp Val Ser Ile Lys Asn Phe Glu Glu Phe Phe 485 490 495 Asn Leu His Arg Thr Ala Lys Ser Lys Ile Glu Asp Ile Arg Ala Glu 500 505 510 Gln Glu Arg Glu Gly Glu Lys Leu Ile Arg Leu His Phe Gln Met Glu 515 520 525 Gln Ile Val Tyr Cys Gln Asp Gln Val Tyr Arg Gly Ala Leu Gln Lys 530 535 540 Val Arg Glu Lys Glu Leu Glu Glu Glu Lys Lys Lys Lys Ser Trp Asp 545 550 555 560 Phe Gly Ala Phe Gln Ser Ser Ser Ala Thr Asp Ser Ser Met Glu Glu 565 570 575 Ile Phe Gln His Leu Met Ala Tyr His Gln Glu Ala Ser Lys Arg Ile 580 585 590 Ser Ser His Ile Pro Leu Ile Ile Gln Phe Phe Met Leu Gln Thr Tyr 595 600 605 Gly Gln Gln Leu Gln Lys Ala Met Leu Gln Leu Leu Gln Asp Lys Asp 610 615 620 Thr Tyr Ser Trp Leu Leu Lys Glu Arg Ser Asp Thr Ser Asp Lys Arg 625 630 635 640 Lys Phe Leu Lys Glu Arg Leu Ala Arg Leu Thr Gln Ala Arg Arg Arg 645 650 655 Leu Ala Gln Phe Pro Gly 660 <210> 2 <211> 662 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutent MxA protein <400> 2 Met Val Val Ser Glu Val Asp Ile Ala Lys Ala Asp Pro Ala Ala Ala 1 5 10 15 Ser His Pro Leu Leu Leu Asn Gly Asp Ala Thr Val Ala Gln Lys Asn 20 25 30 Pro Gly Ser Val Ala Glu Asn Asn Leu Cys Ser Gln Tyr Glu Glu Lys 35 40 45 Val Arg Pro Cys Ile Asp Leu Ile Asp Ser Leu Arg Ala Leu Gly Val 50 55 60 Glu Gln Asp Leu Ala Leu Pro Ala Ile Ala Val Ile Gly Asp Gln Ser 65 70 75 80 Ser Gly Lys Ser Ser Val Leu Glu Ala Leu Ser Gly Val Ala Leu Pro 85 90 95 Arg Gly Ser Gly Ile Val Thr Arg Cys Pro Leu Val Leu Lys Leu Lys 100 105 110 Lys Leu Val Asn Glu Asp Lys Trp Arg Gly Lys Val Ser Tyr Gln Asp 115 120 125 Tyr Glu Ile Glu Ile Ser Asp Ala Ser Glu Val Glu Lys Glu Ile Asn 130 135 140 Lys Ala Gln Asn Ala Ile Ala Gly Glu Gly Met Gly Ile Ser His Glu 145 150 155 160 Leu Ile Thr Leu Glu Ile Ser Ser Arg Asp Val Pro Asp Leu Thr Leu 165 170 175 Ile Asp Leu Pro Gly Ile Thr Arg Val Ala Val Gly Asn Gln Pro Ala 180 185 190 Asp Ile Gly Tyr Lys Ile Lys Thr Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Gln Arg 195 200 205 Gln Glu Thr Ile Ser Leu Val Val Val Pro Ser Asn Val Asp Ile Ala 210 215 220 Thr Thr Glu Ala Leu Ser Met Ala Gln Glu Val Asp Pro Glu Gly Asp 225 230 235 240 Arg Thr Ile Gly Ile Leu Thr Lys Pro Asp Leu Val Asp Lys Gly Thr 245 250 255 Glu Asp Lys Val Val Asp Val Val Arg Asn Leu Val Phe His Leu Lys 260 265 270 Lys Gly Tyr Met Ile Val Lys Cys Arg Gly Gln Gln Glu Ile Gln Asp 275 280 285 Gln Leu Ser Leu Ser Glu Ala Leu Gln Arg Glu Lys Ile Phe Phe Glu 290 295 300 Asn His Pro Tyr Phe Arg Asp Leu Leu Glu Glu Gly Lys Ala Thr Val 305 310 315 320 Pro Cys Leu Ala Glu Lys Leu Thr Ser Glu Leu Ile Thr His Ile Cys 325 330 335 Lys Ser Leu Pro Leu Leu Glu Asn Gln Ile Lys Glu Thr His Gln Arg 340 345 350 Ile Thr Glu Glu Leu Gln Lys Tyr Gly Val Asp Ile Pro Glu Asp Glu 355 360 365 Asn Glu Lys Met Phe Phe Leu Ile Asp Lys Ile Asn Ala Phe Asn Gln 370 375 380 Asp Ile Thr Ala Leu Met Gln Gly Glu Glu Thr Val Gly Glu Glu Asp 385 390 395 400 Ile Arg Leu Phe Thr Arg Leu Arg His Glu Phe His Lys Trp Ser Thr 405 410 415 Ile Ile Glu Asn Asn Phe Gln Glu Gly His Lys Ile Leu Ser Arg Lys 420 425 430 Ile Gln Lys Phe Glu Asn Gln Tyr Arg Gly Arg Glu Leu Pro Gly Phe 435 440 445 Val Asn Tyr Arg Thr Phe Glu Thr Ile Val Lys Gln Gln Ile Lys Ala 450 455 460 Leu Glu Glu Pro Ala Val Asp Met Leu His Thr Val Thr Asp Met Val 465 470 475 480 Arg Leu Ala Phe Thr Asp Val Ser Ile Lys Asn Phe Glu Glu Phe Phe 485 490 495 Asn Leu His Arg Thr Ala Lys Ser Lys Ile Glu Asp Ile Arg Ala Glu 500 505 510 Gln Glu Arg Glu Gly Glu Lys Leu Ile Arg Leu His Phe Gln Met Glu 515 520 525 Gln Ile Val Tyr Cys Gln Asp Gln Val Tyr Arg Gly Ala Leu Gln Lys 530 535 540 Val Arg Glu Lys Glu Leu Glu Glu Glu Lys Lys Lys Lys Ser Trp Asp 545 550 555 560 Phe Gly Ala Phe Gln Ser Ser Ser Ala Thr Asp Ser Ser Met Glu Glu 565 570 575 Ile Phe Gln His Leu Met Ala Tyr His Gln Glu Ala Ser Lys Arg Ile 580 585 590 Ser Ser His Ile Pro Leu Ile Ile Gln Phe Phe Met Leu Gln Thr Tyr 595 600 605 Gly Gln Gln Leu Gln Lys Ala Met Asp Gln Leu Leu Gln Asp Lys Asp 610 615 620 Thr Tyr Ser Trp Leu Leu Lys Glu Arg Ser Asp Thr Ser Asp Lys Arg 625 630 635 640 Lys Phe Leu Lys Glu Arg Leu Ala Arg Leu Thr Gln Ala Arg Arg Arg 645 650 655 Leu Ala Gln Phe Pro Gly 660

Claims

서열번호 2로 표시되는 변성 단백질을 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 약학조성물.
제 1항에 있어서,
상기 변성 단백질은 서열번호 1의 단백질보다 용해성이 증가한 것인, 약학조성물.
제 1항에 있어서,
상기 인플루엔자 바이러스는 A/Philippines/2/82(H3N2)인 것인, 약학조성물.
제 1항에 있어서,
상기 변성 단백질은 N 말단에 단백질 전달 도메인(Protein transduction domain, PTD)이 추가로 결합된 것인, 약학 조성물.
제 4 항에 있어서,
상기 단백질 전달 도메인은 5개 내지 10개의 아르기닌(Arginine)이 결합된 것, 전사 트랜스 활성자(Trans-activator of transcription, TAT), ANTP, Vp22, MTS, Pep-1, 및 Pep-2로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나인, 약학 조성물.
제 5 항에 있어서,
상기 단백질 전달 도메인은 전사 트랜스 활성자(Trans-activator of transcription, TAT)인, 약학 조성물.
서열번호 2로 표시되는 변성 단백질을 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 또는 개선용 식품조성물.
제 7항에 있어서,
상기 변성 단백질은 서열번호 1의 단백질보다 용해성이 증가한 것인, 식품조성물.
제 7항에 있어서,
상기 인플루엔자 바이러스는 A/Philippines/2/82(H3N2)인 것인, 식품조성물.
제 7항에 있어서,
상기 변성 단백질은 N 말단에 단백질 전달 도메인(Protein transduction domain, PTD)이 추가로 결합된 것인, 식품 조성물.
제 10 항에 있어서,
상기 단백질 전달 도메인은 5개 내지 10개의 아르기닌(Arginine)이 결합된 것, 전사 트랜스 활성자(Trans-activator of transcription, TAT), ANTP, Vp22, MTS, Pep-1, 및 Pep-2로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나인, 식품 조성물.
제 11 항에 있어서,
상기 단백질 전달 도메인은 전사 트랜스 활성자(Trans-activator of transcription, TAT)인, 식품 조성물.