KR20200086467A - Esat-6 다중 결합 구조 단백질 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 ESAT-6 다중 결합 구조 단백질에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 상기 ESAT-6 다중 결합 구조 단백질을 포함하는 항염증용, 결핵 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 ESAT-6 다중 결합 구조 단백질은 대식세포에서 NF-kB 및 MAPKs 신호 전달을 통한 COX-2, NO 및 iNOS 의 조절에 의해 LPS-유도 MMP-9 매개 이동 및 염증을 억제하는 효과를 가지고 있는바, 항염증 분야와, 결핵균의 감염으로 인한 질병의 예방 또는 치료 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.

Description

ESAT-6 다중 결합 구조 단백질 및 이의 용도{ESAT-6 multiple bond structural protein and use thereof}

본 발명은 ESAT-6 다중 결합 구조 단백질에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 상기 ESAT-6 다중 결합 구조 단백질을 포함하는 항염증용, 결핵 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

결핵(Tuberculosis)은 인간의 기침, 재채기 또는 말하기를 통해 전염되는 질병이다. 일반적으로 마이코박테리움 튜버쿨로시스(Mytobacterium tuberculosis, Mtb)의 감염으로 인한 결핵은 활동성 또는 비활동성 형태이다. 활동성 결핵은 정상 개체를 감염시킬 수 있으나, 비활동성 결핵은 전염성이 없다. 이러한 유형에 관계 없이 결핵은 전세계 인구의 3분의 1이 감염된 것으로 알려져 있다. 현재 Mtb를 포함한 마이코박테리아 및 BCG (bacillus Calmette-Guerin) 균의 변이가 자주 발생되며, 변이로 인하여 항생제 내성을 획득한다. 따라서 결핵의 적절한 진단, 예방 및 치료를 위한 기술 개발이 절실하다.

이에 본 발명자들은 결핵의 진단, 예방 및 치료를 위한 기술 개발하기 위하여, ESAT-6의 다중 결합 구조를 갖는 단백질을 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은, ESAT-6 단백질을 구성하는 아미노산이 적어도 2 이상 작동가능하게 연결되어 있는 ESAT-6 다중 결합 구조 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 상기 ESAT-6 다중 결합 구조 단백질을 유효성분으로 포함하는 항염증용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 ESAT-6 다중 결합 구조 단백질을 유효성분으로 포함하는 결핵 예방 또는 치료용 약학적 조성물과 결핵 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 ESAT-6 단백질을 구성하는 아미노산이 적어도 2 이상 작동가능하게 연결되어 있는 ESAT-6 다중 결합 구조 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 ESAT-6 다중 결합 구조 단백질을 유효성분으로 포함하는 항염증용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 ESAT-6 다중 결합 구조 단백질을 유효성분으로 포함하는 결핵 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 ESAT-6 다중 결합 구조 단백질을 유효성분으로 포함하는 결핵 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 ESAT-6 다중 결합 구조 단백질은 대식세포에서 NF-kB 및 MAPKs 신호 전달을 통한 COX-2, NO 및 iNOS의 조절에 의해 LPS-유도 MMP-9 매개 이동 및 염증을 억제하는 효과를 가지고 있는바, 항염증 분야와, 결핵균의 감염으로 인한 질병의 예방 또는 치료 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 2E6D 항원을 보유하는 발현 벡터의 구조 및 이의 염기서열을 표시한 것을 나타내는 도이다.
도 2는 본 발명에 따른 2E6D 단백질의 정제 결과(A) 및 LPS로 염증이 유도된 대식세포에서 2E6D 단백질의 세포독성 평가 결과(B)를 나타내는 도이다.
도 3은 본 발명의 2E6D 단백질 처리에 따른 MMP-9의 단백질 및 mRNA 발현을 분석한 결과를 나타내는 도이다. 상기 분석은 자이모그래피(A), 웨스턴 블롯팅(B) 및 RT-PCR(C) 방법으로 수행되었다.
도 4는 본 발명의 2E6D 단백질 처리에 따른 염증성 사이토카인의 발현을 분석한 결과를 나타내는 도이다. 상기 분석은 산화질소 분석(A), 웨스턴 블롯팅(B) 및 RT-PCR(C) 방법으로 수행되었다.
도 5A 내지 5C는 본 발명의 2E6D 단백질 처리에 따른 NF-κB 전좌 억제 효과를 확인한 결과를 나타내는 도이다. 상기 NF-κB 전좌 억제 효과의 확인은 웨스턴 블롯팅(A 및 B) 및 면역형광염색(C) 방법으로 수행되었다.
도 5D는 본 발명에 따른 2E6D 단백질의 MAPK 신호전달경로 억제 효과를 확인한 결과를 나타내는 도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 양태에 따르면, 본 발명은 ESAT-6 단백질을 구성하는 아미노산이 적어도 2 이상 작동가능하게 연결되어 있는 ESAT-6 다중 결합 구조 단백질을 제공한다.

본 발명에 있어서, “ESAT-6(6-kDa Early Secreted Antigenic Target)”는 마이코박테리움 튜버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) 유래의 분비 단백질을 의미한다. 상기 ESAT-6은 상피세포에서 MMP-9의 발현을 유도하고, 대식세포의 식세포 작용을 억제하여, Mtb의 증식을 증가시키는 것으로 알려져 있으나, 구체적인 효과는 보고되지 않았다. 또한 ESAT-6은 불안정한 구조를 가지고 있으므로 정제하는데 어려움이 있다.

본 발명의 구체예에서, 상기 ESAT-6 다중 결합 구조 단백질은 서열번호 1의 염기서열로 암호화되는 ESAT-6 단백질을 구성하는 아미노산이 적어도 1 이상 작동 가능하게 연결되어 있는 것이 바람직하며, 이중 결합된 것이 더 바람직하다. 구체적으로, 상기 ESAT-6 다중 결합 구조 단백질은 도 1에 나타낸 바와 같이 ESAT-6의 두 코딩영역이 결합되도록 설계하였다. 설계된 ESAT-6 다중 결합 구조 단백질은 서열번호 2의 염기서열로 암호화되며, 2 이상의 ESAT-6의 코딩영역은 제한효소 Hind III의 절단부위(제1 ESAT-6의 286 내지 288 번 염기)를 통해 작동가능하게 연결된 것이며, 6X His tag를 더 포함한다. ESAT-6 다중 결합 구조 단백질의 연결 부위(제한효소의 타겟부위) 및 서열의 구성은 도 1에 나타내었다.

본 발명이 구체예에서, ESAT-6 다중 결합 구조 단백질은 서열번호 2의 염기서열로 암호화될 수 있고, 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다.

상기 "기능적 동등물"이란 염기의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열 번호 1 또는 2의 염기서열과 적어도 80% 이상의, 바람직하게는 90%, 더욱 바람직하게 는 95%이상의 서열 상동성(즉, 동일성)을 갖는 것으로 예를 들면, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 9 4%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%의 서열 상동성을 갖는 염기서열에 의해 암호화되는 단백질을 포함하며, 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열로 암호화되는 ESAT-6 단백질 또는 서열번호 2의 염기서열로 암호화되는 ESAT-6 다중 결합 구조 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다.

또한, 본 발명의 ESAT-6 다중 결합 구조 단백질에는 이의 천연형 아미노산 서열을 갖는 단백질뿐만 아니라 이의 아미노산 서열 변이체가 또한 본 발명의 범위에 포함된다. ESAT-6 다중 결합 구조 단백질의 변이체란 ESAT-6 다중 결합 구조 단백질의 천연 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 상기 ESAT-6 다중 결합 구조 단백질 또는 이의 변이체는 천연에서 추출하거나 합성(Merrifleld, J. Amer. chem. Soc. 85:2149-2156, 1963) 또는 DNA 서열을 기본으로 하는 유전자 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다(Sambrook et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA, 2판, 1989).

또한 상기 서열 상동성은 단백질을 구성하는 아미노산 서열의 유사한 부분을 비교하기 위해 사용되는 일반적인 표준 방법에 의해 결정할 수 있다. BLAST 또는 FASTA와 같은 컴퓨터 프로그램은 두 개 이상의 단백질을 각각 구성하는 아미노산이 최적으로 매칭(matching) 되도록 정렬한다(하나 또는 두 서열의 전장서열을 따라 또는 하나 또는 두 서열의 예측된 부분을 따라). 상기 프로그램은 디펄트 오프닝 패널티(default opening penalty) 및 디펄트 갭 페널티(default gap penalty)를 제공하며 컴퓨터 프로그램과 함께 연계되어 사용될 수 있는 PAM250(표준 스코링 매트릭스; Dayhoff et al., in Atlas of Protein Sequence and Structure, vol 5, supp. 3, 1978)와 같은 스코링 매트릭스를 제공한다. 예를 들어, 백분율로 표시되는 서열 상동성은 다음과 같이 계산할 수 있다: 일치하는 서열(indentical matches)의 총 수에 100을 곱한 다음 대응되는 스팬(machted span) 내의 보다 긴 서열의 길이와 두 서열을 정렬하기 위해 보다 긴 서열내로 도입된 갭(gaps)의 수의 합으로 나눈다.

상기에서 "실질적으로 동질의 생리활성"이란 항염증 활성과, 결핵의 개선, 예방 또는 치료 활성을 의미한다.

또한 상기 기능적 동등물의 범위에는 서열번호 2의 염기서열로 암호화되는 ESAT-6 다중 결합 구조 단백질의 기본골격과 항염증 활성과, 결핵의 개선, 예방 또는 치료 활성을 유지하면서 구성하는 아미노산의 일부 화학 구조가 변형된 유도체가 포함된다. 예를 들어 단백질의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경이 이에 포함된다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 ESAT-6 다중 결합 구조 단백질을 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 항염증용 조성물은 약학적 조성물 또는 식품 조성물일 수 있다.

본 발명의 구체예에서, 항염증용 약학적 조성물은 산화 질소의 생성을 억제하고, 염증 관련 효소인 MMP-9와 염증성 사이토카인 COX-2 및 iNOS의 발현을 억제함으로써 염증성 질환을 예방, 개선 또는 치료하는 것일 수 있다.

상기 염증성 질환은 염증을 주병변으로 하는 질병을 총칭하는 의미로서, 이에 제한되지는 않는다. 상기 염증성 질환의 예로는, 알러지성 천식, 알러지성 비염, 알러지성 점막염, 두드러기 및 아나필락스(anaphylax)를 포함하는 알러지성 질환, 경피증(systemic sclerosis), 피부근염(dermatomyositis) 및 포함체 근육염(inclusion body myositis)을 포함하는 근병증, 관절염, 아토피성 피부염, 건선, 천식, 다발성 경화증, 패혈증, 다발성연골염, 경피증, 습진, 통풍, 치주질환, 베체트 증후군, 부종, 맥관염, 가와사키병, 당뇨병성 망막염, 자가 면역 췌장염, 혈관염, 사구체 신염, 급성 및 만성 기관지염, 인플루엔자 감염증 등이 있다.

본 발명에 있어서 약학적 조성물은 통상의 방법에 따라 다양한 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 예컨대, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 경구형 제형으로 제형화할 수 있고, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 투여를 위해서 상기 유효성분 이외에 추가로 약학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 상기 약학적 조성물의 제제화 방법, 투여 방식, 투여 시간 및/또는 투여 경로 등에 의해 다양해질 수 있으며, 상기 약학적 조성물의 투여로 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 투여 대상이 되는 개체의 종류, 연령, 체중, 일반적인 건강 상태, 질병의 증세나 정도, 성별, 식이, 배설, 해당 개체에 동시 또는 이시에 함께 사용되는 약물 기타 조성물의 성분 등을 비롯한 여러 인자 및 의약 분야에서 잘 알려진 유사 인자에 따라 다양해질 수 있으며, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 예를 들어, 1일 1 mg/kg 내지 1,000 mg/kg일 수 있으나, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물의 투여 경로 및 투여 방식은 각각 독립적일 수 있으며, 그 방식에 있어 특별히 제한되지 아니하며, 목적하는 해당 부위에 상기 약학적 조성물이 도달할 수 있는 한 임의의 투여 경로 및 투여 방식에 따를 수 있다.

상기 약학적 조성물은 경구 투여 또는 비경구 투여 방식으로 투여할 수 있다. 상기 비경구 투여 방식으로는 예를 들어 정맥 내 투여, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 경피 투여 또는 피하 투여 등이 포함되며, 상기 약학적 조성물을 질환 부위에 도포하거나 분무, 흡입하는 방법 또한 이용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 구체예에서, 항염증용 식품 조성물은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조 시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 식품 조성물의 제형 또한 식품 조성물로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 식품으로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품 등이 있다. 또한 식품에는 특수영양식품 (예, 조제유류, 영, 유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류 (예, 라면류, 국수류 등), 빵류, 건강보조식품, 조미식품 (예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류 (예, 스넥류), 캔디류, 쵸코렛류, 껌류, 아이스크림류, 유가공품 (예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품 (각종 김치류, 장아찌 등), 음료 (예, 과실 음료, 채소류 음료, 두유류, 발효음료류 등), 천연조미료 (예, 라면 스프 등), 식품첨가제 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 상기 식품, 음료 또는 식품첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.

본 발명의 조성물을 건강기능식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 건강기능식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 바람직하게는 50 중량부 이하, 보다 바람직하게는 25 중량부 이하의 양으로 첨가할 수 있다. 그러나, 건강 조절 및 위생을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안정성 면에서 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 유효성분인 ESAT-6 다중 결합 구조 단백질을 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당 알코올이다. 상술한 향미제는 천연 향미제 (타우마틴), 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.

또한, 상기 식품 조성물은 ESAT-6 다중 결합 구조 단백질 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 ESAT-6 다중 결합 구조 단백질을 유효성분으로 포함하는 결핵 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, “예방”은 본 발명에 따른 ESAT-6 다중 결합 구조 단백질로 결핵의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다. 또한, “치료”는 본 발명에 따른 ESAT-6 다중 결합 구조 단백질의 투여로 결핵의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미하며, "개선"은 본 발명의 ESAT-6 다중 결합 구조 단백질을 개체에 투여하거나 섭취시켜 결핵의 나쁜 상태를 좋게 하는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 결핵 예방, 개선 또는 치료용 조성물은 약학적 조성물 또는 식품 조성물일 수 있다.

본 발명의 ESAT-6 다중 결합 구조 단백질은 결핵의 병원체인 마이코박테리움 튜버쿨로시스가 감염된 대식세포에서 염증 관련 효소 및 염증성 사이토카인의 발현을 현저히 감소시키는바, 결핵의 병태를 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.

이하, 실험예, 실시예 및 제조예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들은 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실험예, 실시예 및 제조예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

재료

MTT(3-(4,5-dimethylthiazol- 2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 용액, 그리스 시약(Griess reagent), LPS(Escherichia coli 0111:B4), 쿠마시 블루 R250, DAPI 용액 및 젤라틴은 모두 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO,USA) 사로부터 구입하였다. 또한 듀얼 루시퍼라제 분석 키트는 Promega(Madison, WI, USA) 사로부터 구입하였다. 세포배양용 배지인 DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium), FBS(fetal bovine serum), 페니실린-스트렙토마이신은 WelGENE(Daegu, Korea) 사로부터 구입하였다. ERK, pERK, p-p38, pJNK, JNK 및 p-IκB에 대한 항체는 cell signaling technology(Berverly, MA, USA) 사로부터 구입하였고, p38, NF-κB, LaminB, β-actin, MMP-9, COX-2 및 iNOS는 Santa Cruz Biotechnology(Paso Robles, CA, USA) 사로부터 구입하였다. SP600125는 Calbiochem(La Jolla, CA, USA) 사에서 얻었으며, 단백질 분자량 마커는 Thermo Fisher Scientific(Massachusetts, USA)로부터 얻었다.

실험예 1. 세포배양

마우스의 대식세포주인 RAW264.7은 ATCC(American Type Culture Collection)(Manassas, VA, USA)에서 구입하였다. RAW264.7 세포는 37 ℃에서 5 % CO₂ 조건을 갖춘 배양기에서 배양하였다. 상기 배양은 페니실린-스트렙토마이신 및 10 % FBS가 첨가된 DMEM 배지에서 유지되었으며, 상기 배지는 2 일 간격으로 교체하였다.

실험예 2. MTT 분석

세포 생존율은 MTT 분석을 통해 분석하였다. 마우스 대식세포주인 RAW264.7을 96-웰 플레이트에 분주하였다. 상기 세포에 2E6D 및 100 ng/ml LPS를 함께 처리하여 24 시간 동안 배양하였다. 대조군은 세포에 100 ng/ml LPS만을 처리한 것이다. 배양 종료 후 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) 용액을 웰 내부의 최종 농도가 0.5 mg/ml이 되도록 첨가한 후 4 시간 동안 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고, DMSO를 첨가하여 보라색 포마잔을 용해시켰으며, 벌마이크로 플레이트 리더(Molecular Devices, CA, USA)를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.

실험예 3. SDS-PAGE

2E6D 단백질 및 분자량 마커를 10 % 폴리아크릴아미드 겔에 로딩한 후, SDS-PAGE를 수행하였다. 상기 폴리아크릴아미드 겔을 45 % 증류수, 10 % 아세트산, 45 % MeOH 혼합용액에 포함된 쿠마시 블루 R250을 이용하여 1 시간 동안 염색하였다. 염색된 겔을 60 % 증류수, 30 % MeOH 및 10 % 아세트산을 포함하는 탈색용액에 담가 탈색시켰다.

실험예 4. 자이모그래피

마우스 대식세포인 RAW264.7을 6-웰 플레이트에 접종하였다. 무혈청 DMEM 배지에서 상기 세포에 2E6D 및 100 ng/ml LPS를 함께 처리한 후 24 시간 동안 배양하였다. 대조군은 세포에 100 ng/ml LPS만을 처리한 세포이다. 배지를 제거한 후 동량의 샘플 버퍼를 로딩하였다. 샘플이 로딩된 겔을 2.5 % TrptonX-100 완충액으로 3 회 세척한 후, 0.01 % NaN₃, 50 mM Tris- HCl(pH 7.6) 및 10 mM CaCl₂에서 밤새 배양 하였다. 쿠마시 블루 R250 용액(in 45 % 증류수, 10 % 아세트산, 45 % MeOH 혼합용액)을 이용하여, 배양된 폴리아크릴아미드 겔을 1 시간 동안 염색하였다. 염색된 겔을 60 % 증류수, 30 % MeOH 및 10 % 아세트산을 포함하는 탈색용액에 담가 탈색시켰다.

실험예 5. 웨스턴 블롯팅

웨스턴 블롯팅을 수행하기 위하여, 세포 핵 및 세포질 단백질을 각각 추출하였다. 구체적으로, RAW264.7 세포에 2E6D 및 100 ng/ml LPS를 함께 처리한 후 24 시간 동안 배양하였다. 대조군은 세포에 100 ng/ml LPS만을 처리한 세포이다. 전체 세포 용해물은 NP-40 완충액을 이용하여 추출하였다. 상기 NP-40 완충액은 1M HEPES(pH 7.45), 100mM Na-오르토바나데이트, 1.5M NaCl, 100mM Na-피로포스페이트, 100mM NaF 및 프로테아제 억제제 칵테일 타블렛을 포함한다.

세포질 단백질을 추출하기 위하여, 상기 전체 세포 용해물에 용해 완충액(1 mM DTT, 0.5 mM PMSF, 0.1 mM EDTA, 0.1 mM EGTA, 10 mM HEPES(pH7.9) 및 10 mM KCL(in 10 % NP-40)을 처리하였다. 상기 용해물을 원심분리하여 세포질 단백질이 함유된 상등액을 얻었다.

상등액을 취한 후 잔존하는 펠릿은 핵 단백질을 추출하는 데에 사용하였다. 상기 펠릿에 핵 용해 완충액을 첨가하고, 15 분 동안 볼텍싱하였으며, 13000 rpm으로 원심분리하였다. 상기 핵 용해 완충액은 0.5 mM PMSF, 1 mM DTT, 1 mM EDTA, 0.4 M NaCl, 1 mM EGTA 및 20 mM HEPES(pH 7.9)을 포함한다. 원심분리 후, 핵 단백질이 함유된 상등액을 얻었다.

수득된 핵 및 세포질 단백질은 Bio-Rad 단백질 분석법으로 정량하였고, 동량의 단백질을 SDS-폴리아크릴아미드 겔에 로딩 및 전기영동하였다. 상기 겔을 PVDF 멤브레인으로 옮긴(transfer) 후 TBST 완충액(2 M Tris-HCl, 4 M NaCl, pH 7.5, 0.01 % Tween 20)으로 세척하였다. 세척된 멤브레인을 스킴밀크로 블로킹한 후 세척하였다. 세척된 멤브레인을 검출하고자하는 단백질에 특이적인 1차 항체로 밤새도록 배양하였다. 배양 후 TBST 완충액으로 3 회 세척하였으며, HRP가 결합된 2차 항체와 함께 배양하였다. 2차 항체와 반응한 단백질의 검출은 ECL(enhanced chemiluminescence) 시스템을 이용하였다.

실험예 6. 산화질소 분석

마우스 대식세포 RAW264.7을 6-웰 플레이트에 분주한 후, 2E6D 및 100 ng/ml LPS를 함께 처리하여 24 시간 동안 배양하였다. 배양된 세포에 배지와 동량의 그리스 시약(Griess reagent)을 첨가하고, 실온에서 10 분 동안 배양하였다. 배양 후, 마이크로플레이트 리더를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정함으로써, 산화질소(NO)의 농도를 측정하였다. 상기 산화질소의 농도는 NaNO₂ 표준 곡선을 사용하여 분석하였다. 본 실험예의 대조군은 세포에 100 ng/ml LPS만을 처리한 세포이다.

실험예 7. 역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction, RT- PCR )

전체 RNA는 세포에 TRizol을 처리하여 분리하였다. 추출된 RNA 샘플, RT-프리믹스(Bioneer, 대전, 한국) 및 올리고 dT 프라이머를 이용하여, 추출된 RNA를 주형으로 하는 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA 및 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 상기 PCR에 사용한 프라이머는 표 1과 같다.

타겟	프라이머 서열
GAPDH	정방향 5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’ 역방향 5’-AATGTGTCCGTCGTGGATCT-3‘
MMP-9	정방향 5’-CCTGTGTGTTCCCGTTCATCT-3’ 역방향 5’-CGCTGGAATGATCTAAGCCCA-3’
iNOS	정방향 5’-ATGTCCGAAGCAAACATCAC-3’ 역방향 5’-TAATGTCCAGGAAGTAGGTG-3’
COX-2	정방향 5’-GGAGAGACTATCAAGATAGT-3’ 역방향 5’-TGATCTTCATTTTTTACGCGTGAATT-3’

실험예 8. 면역형광염색

마우스 대식세포 RAW264.7을 배양 플레이트의 커버슬립에 분주한 후. 2E6D 및 100 ng/ml LPS를 함께 처리하여 24 시간 동안 배양하였다. 본 실험예의 대조군은 세포에 100 ng/ml LPS만을 처리한 세포이다. 배양된 세포를 4 % 파라포름알데히드를 사용하여 15 분 동안 고정시켰다. 세포의 투과성을 증가시키기 위하여, 고정된 세포에 0.2 % Triton X 100을 처리하여 20 분 동안 배양하였다. 그 후, 소혈청알부민(BSA)을 첨가하여 2 시간 동안 반응시켰다. 상기 세포를 4 ℃에서 밤새도록 특이 항체로 배양하였고, FITC-결합된 항-토끼 항체와 1 시간 동안 배양하였다. 배양된 세포를 DAPI 용액과 10 분 동안 반응시킴으로써 세포 핵을 면역형광 염색하였다. 염색된 세포는 공초점 레이저 현미경을 이용하여 관찰하였다.

실험예 9. 루시퍼라제 분석

마우스 대식세포 RAW264.7을 배양 플레이트에 분주하였다. 분주된 세포를 무혈청 배지에서 배양하였으며, 상기 세포에 pGL-NF-κB-luc 플라스미드 및 β-갈락토시다제 플라스미드를 이용하여 루시퍼라제 유전자를 형질감염시켰다. 형질감염 24 시간 후, 세포를 2E6D 및 100 ng/ml LPS를 함께 처리하여 24 시간 동안 배양하였다. 본 실험예의 대조군은 세포에 100 ng/ml LPS만을 처리한 세포이다. 듀얼 루시퍼라제 분석 시스템을 사용하는 마이크로 플레이트 루미노미터(Microplate Luminometer)를 이용하여, 세포의 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 루시퍼라제의 활성은 β-갈락토시다제의 활성을 통해 정량하였다.

전술한 실험예 1 내지 9의 모든 데이터는 최소 3 회의 독립적인 실험을 통해 수득하였다. 실험 데이터의 통계 분석은 GraphPad Prism 소프트웨어 5.0으로 수행하였으며, 통계적 유의성은 t-테스트를 사용하여 결정하였다.

실시예 1. ESAT -6 이중 결합 구조 단백질( 2E6D ) 제조

Escherichia coli BL21에서 2E6D 항원을 보유하는 발현 벡터 구축

마이코박테리아 항원 2E6D는 서열번호 1의 염기서열로 암호화되는 ESAT-6(6-kDa Early Secreted Antigenic Target) 단백질이 이중으로 결합된 것으로, ESAT-6의 두 코딩영역을 발현하도록 설계하였다. 상기 ESAT-6은 결핵연구원의 김정란 박사로부터 제공받은 것이다. 상기 ESAT-6의 코딩영역은 Hind III의 타겟부위인 286 내지 288 번 염기를 통해 결합된 것이며, 6X His tag를 더 포함한다. 상기 2E6D는 서열번호 2의 염기서열로 암호화되며, 제한효소의 타겟부위 및 서열의 구성은 도 1에 나타내었다.

설계된 2E6D를 제조하기 위하여, ESAT-6을 합성한 마이코박테리움 튜버쿨로시스의 유전체DNA를 주형으로 하는 PCR을 수행하였다. 상기 PCR은 올리고 뉴클레오타이드 프라이머(정방향 프라이머 Nde I F: AAGGAGATATACATATGACAGAGCAGCAGTGG 및 Hind III F: CCCAAGCTTATGACAGAGCAGCAGTGGAA; 역방향 프라이머 Hind II: GCTCTGTCATAAGCTTTGCGAACATCCCAGTGAC 및 Xho I: CCGCTCGAGTGC GAACATCCCAGTGACG)를 사용하였다. PCR 산물은 6019 bp였으며, 이를 제한효소 Nde I 및 Xho I로 절단한 후 C-터미널 His-태그 발현 벡터 pET21a(Novagen, Madison, WI)에 삽입하여, 2E6D 항원을 보유하는 발현 벡터를 구축하였다(pET-21a-2E6D(ESAT-6)-6XHis). 상기 발현 벡터로부터 생산되는 2E6D의 예상 분자량은 약 16 kDa이다.

구축된 발현 벡터 pET-21a-2E6D(ESAT-6)-6XHis로 대장균 BL21 균주를 형질전환시켰다. 형질전환된 대장균 BL21을 37 ℃에서 엠피실린(50 μg/mL)을 함유하는 YT 배지에서 OD₆₀₀이 0.5s 내지 0.6이 될 때까지 진탕 배양하였다. 진탕 배양된 형질전환 대장균으로부터 0.4 mM IPTG(isopropyl β-D-thiogalactopyranoside)을 이용하여 2E6D 단백질의 발현을 유도하였다.

2E6D 단백질 정제

대장균 펠렛을 His 결합 완충액(20 mM 인산나트륨, 0.5 M NaCl, 20 mM 이미다졸, pH 7.4)에 재현탁시켰다. 재현탁된 대장균을 얼음 위에서 10 분 동안 초음파 처리하였다. 제조사의 매뉴얼에 따라 His 친화성 칼럼(HiTrap HP, GE Healthcare Bio-Sciences, Uppsala, Sweden)을 사용하여 재조합 단백질 2E6D를 정제하였다. 2E6D 단백질의 정제 결과는 상기 실험예 3의 SDS-PAGE를 통해 확인하였으며, 그 결과는 도 2A에 나타내었다.

도 2A에 나타낸 바와 같이, 2E6D 단백질이 성공적으로 정제되었음을 확인하였다. 또한 정제된 2E6D 단백질은 서열번호 2의 염기서열로 암호화되며, 16 kDa임을 확인하였다.

실시예 2. ESAT -6 이중 결합 구조 단백질( 2E6D )의 세포독성 확인

종래 ESAT-6은 인간 상피세포에서 MMP-9의 발현 수준을 유도하여 세균의 증식을 촉진한다고 알려져 있다. 그러나 대식세포에서 ESAT-6의 효과에 대한 정보는 알려져 있지 않다. 본 실시예에서는 상기 실시예 1에서 제조한 2E6D의 세포독성을 확인하였다.

구체적으로, 마우스 대식세포 RAW264.7는 상기 실험예 1과 같이 배양하여 준비하였다. 준비된 세포에 다양한 농도의 2E6D(2.5, 5 및 10 μg/ml)를 처리하였다(실험군 1). 2E6D가 처리된 세포는 상기 실험예 2의 MTT 분석을 통해 세포 생존율을 분석하였다.

또한 준비된 마우스 대식세포 RAW264.7에 염증 유도제인 LPS(100 ng/ml) 및 다양한 농도의 2E6D를 함께 처리하였으며(실험군 2), 상기 실험예 2의 MTT 분석을 통해 세포 생존율을 분석하였다.

대식세포에 대한 2E6D의 세포독성을 확인한 결과는 도 2B에 나타내었다.

도 2B에 나타낸 바와 같이, 실험군 1 및 2는 대식세포에서 세포독성을 나타내지 않는 것을 확인하였다.

실시예 3. ESAT -6 이중 결합 구조 단백질( 2E6D ) 처리에 따른 MMP -9 발현 확인

마이코박테리움 튜버쿨로시스에 감염된 대식세포는 이동을 통해 마이코박테리움 튜버쿨로시스를 운반한다고 알려져 있다. 대식세포의 이동은 조직 파괴, 염증 및 운동성에 관여하는 효소인 MMP-9에 의해 조절된다. 이에, 본 실시예에서는 2E6D가 대식세포에서 LPS로 유도된 세포 이동에 미치는 영향을 분석하였다. 상기 LPS로 유도된 세포 이동은 MMP-9의 mRNA 및 단백질 수준의 발현을 확인함으로써 분석하였다.

구체적으로, 상기 실험예 1의 방법으로 마우스 대식세포 RAW264.7 세포를 배양하였으며, 배양된 세포에 LPS를 이용하여 염증을 유도하였다. 이 때, 실험군은 LPS와 함께 2E6D를 처리하였다. LPS로 유도된 대식세포를 이용하여 자이모그래피(zymography)(실험예 4), 웨스턴 블롯팅(실험예 5) 및 RT-PCR(실험예 7)을 각각 수행하였다. 상기 실험 결과는 각각 도 3A 내지 3C에 나타내었다.

도 3A에 나타낸 바와 같이, 자이모그래피를 통해 2E6D가 LPS에 의해 유도된 MMP-9 효소의 활성을 감소시킨다는 것을 확인하였다.

도 3B 및 3C에 나타낸 바와 같이, 2E6D는 LPS에 의해 유도된 MMP-9 효소 및 이의 mRNA 발현을 농도의존적으로 감소시키는 것을 확인하였다.

상기 결과로부터 2E6D가 LPS로 유도된 대식세포의 MMP-9 효소의 발현을 감소시키는 것을 확인하였으며, 이는 2E6D가 마이코박테리움 튜버쿨로시스의 운반 및 확산을 억제할 수 있음을 의미한다.

실시예 4. ESAT -6 이중 결합 구조 단백질( 2E6D ) 처리에 따른 염증성 사이토카인의 발현 확인

마이코박테리움 튜버쿨로시스에 감염된 대식세포는 MMP-1를 비롯하여, 산화질소(NO) 및 염증성 사이토카인의 생성을 포함하는 염증반응을 일으킨다. 본 실시예에서는 2E6D가 LPS로 염증이 유도된 대식세포에서 산화질소의 양과, 염증성 사이토카인인 COX-2 및 iNOS의 발현에 미치는 영향을 확인하였다.

구체적으로, 상기 실험예 1의 방법으로 마우스 대식세포 RAW264.7 세포를 배양하였으며, 배양된 세포에 LPS를 이용하여 염증을 유도하였다. 이 때, 실험군은 LPS와 함께 2E6D를 처리하였다. LPS로 유도된 대식세포를 이용하여 산화질소 분석(실험예 6), 웨스턴 블롯팅(실험예 5) 및 RT-PCR(실험예 7)을 각각 수행하였다. 상기 실험 결과는 도 4A 내지 4C에 나타내었다.

도 4A에 나타낸 바와 같이, LPS로 염증이 유발된 세포에서 산화질소가 유발되며, 상기 세포에 2E6D를 처리하는 경우 농도의존적으로 산화질소를 감소시키는 것을 확인하였다.

도 4B 및 4C에 나타낸 바와 같이, LPS로 염증이 유발된 세포에서 염증성 사이토카인 COX-2 및 iNOS의 단백질 및 mRNA 발현이 증가되는 것을 확인하였다. 반면에, 상기 세포에 2E6D를 처리하는 경우 COX-2 및 iNOS의 단백질 및 mRNA 발현이 농도의존적으로 감소되는 것을 확인하였다.

상기 결과는 2E6D가 염증이 유발된 세포에서 산화질소 및 염증성 사이토카인의 신호전달 경로를 억제함으로써, MMP-9의 발현 및 염증을 억제한다는 것을 의미한다.

실시예 5. ESAT -6 이중 결합 구조 단백질( 2E6D )의 NF - κB 전좌 억제 효과 확인

NF-κB는 LPS로 염증이 유도된 MMP-9의 발현과, 산화질소, COX-2 및 iNOS와 같은 염증 관련 인자의 전사인자이다. NF-κB의 핵 전좌는 IκB의 인산화 및 분해 후에 활성화된다. 이에, 본 실시예에서는 LPS로 염증이 유도된 대식세포의 핵 및 세포질 단백질을 각각 분리하여 NF-κB의 전좌 여부를 분석하였다. 구체적으로, 상기 실험예 1의 방법으로 마우스 대식세포 RAW264.7 세포를 배양하였으며, 배양된 세포에 LPS를 이용하여 염증을 유도하였다. 이 때, 실험군은 LPS와 함께 2E6D를 처리하였다. LPS로 유도된 대식세포를 이용하여 실험예 5의 방법으로 핵 및 세포질 단백질을 분리하였으며, 분리된 단백질을 이용하여 웨스턴 블롯팅을 수행하였다. 상기 웨스턴 블롯팅 결과는 도 5A 및 5B에 나타내었다.

도 5A 및 5B에 나타낸 바와 같이, LPS로 염증이 유도된 대식세포의 핵 및 세포질에서 NF-κB 및 IκB의 전좌가 발생하는 것을 확인하였다. 반면에, 상기 세포에 2E6D를 처리한 경우 NF-κB 및 IκB의 전좌가 억제되는 것을 확인하였다.

추가적으로, 상기 실험예 8의 면역형광염색을 통해 LPS로 염증이 유도된 대식세포의 핵에서 NF-κB의 전좌 여부를 분석하였으며, 그 결과는 도 5C에 나타내었다.

도 5C에 나타낸 바와 같이, LPS로 염증이 유도된 대식세포에 2E6D를 처리한 실험군에서 NF-κB의 전좌가 억제되는 것을 확인하였다.

상기 결과는 2E6D는 염증이 유도된 세포에서 NF-κB의 신호전달경로를 억제한다는 것을 의미한다.

실시예 6. ESAT -6 이중 결합 구조 단백질( 2E6D )의 MAPK 신호전달경로 억제 효과 확인

NF-κB 및 MMP-9의 업-레귤레이터(up-regulator)인, MAPK(JNK, p38 및 ERK)는 세포 증식, 암전이 및 염증 등의 과정에 관여한다고 알려져 있다. 이에 본 실시예에서는 2E6D가 MAPK 신호전달을 조절하여 LPS로 유도된 MMP-9 및 염증 반응을 조절하는지 분석하였다.

구체적으로, 상기 실험예 1의 방법으로 마우스 대식세포 RAW264.7 세포를 배양하였으며, 배양된 세포에 LPS를 이용하여 염증을 유도하였다. 이 때, 실험군은 LPS와 함께 2E6D를 처리하였다. 상기 세포를 이용하여 실험예 9의 루시퍼라제 분석을 수행하였다. 루시퍼라제 분석 결과는 도 5D에 나타내었다.

도 5D에 나타낸 바와 같이, LPS로 염증이 유도된 세포에서 JNK, p38 및 ERK의 인산화가 확인되었다. 반면에, LPS로 염증이 유도된 세포에 2E6D를 처리한 실험군은 JNK, p38 및 ERK 모두 인산화가 억제된 것을 알 수 있다. 상기 결과는 2E6D에 의한 MAPK 신호전달의 억제가 LPS로 유도된 염증반응 및 MMP-9의 발현을 억제한다는 것을 의미한다.

종합적으로 본 발명자들은 ESAT-6 이중 결합 구조 단백질인 2E6D를 개발하고, 대식세포에서 NF-kB 및 MAPKs 신호 전달을 통한 COX-2, NO 및 iNOS 의 조절에 의해 LPS-유도 MMP-9 매개 이동 및 염증을 억제하는 효과를 확인하였다. 본 발명의 2E6D는 항염증 분야와, 결핵균의 감염으로 인한 질병의 예방 또는 치료 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.

이하, 제제예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 제제예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 제제예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는다.

제제예 1. 약학적 조성물의 제조

1-1. 산제의 제조

ESAT-6 다중 결합 구조 단백질 20 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

1-2. 정제의 제조

ESAT-6 다중 결합 구조 단백질 10 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

1-3. 캡슐제의 제조

ESAT-6 다중 결합 구조 단백질 10 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

1-4. 주사제의 제조

ESAT-6 다중 결합 구조 단백질 10 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

Na2HPO42H2O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당 (2 ml) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

1-5. 액제의 제조

ESAT-6 다중 결합 구조 단백질 20 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100ml로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

<110> Davinchi Q Co., Ltd <120> ESAT-6 multiple bond structural protein and use thereof <130> 1-2P <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 285 <212> DNA <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 1 atgacagagc agcagtggaa tttcgcgggt atcgaggccg cggcaagcgc aatccaggga 60 aatgtcacgt ccattcattc cctccttgac gaggggaagc agtccctgac caagctcgca 120 gcggcctggg gcggtagcgg ttcggaggcg taccagggtg tccagcaaaa atgggacgcc 180 acggctaccg agctgaacaa cgcgctgcag aacctggcgc ggacgatcag cgaagccggt 240 caggcaatgg cttcgaccga aggcaacgtc actgggatgt tcgca 285 <210> 2 <211> 603 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2E6D <400> 2 atgacagagc agcagtggaa tttcgcgggt atcgaggccg cggcaagcgc aatccaggga 60 aatgtcacgt ccattcattc cctccttgac gaggggaagc agtccctgac caagctcgca 120 gcggcctggg gcggtagcgg ttcggaggcg taccagggtg tccagcaaaa atgggacgcc 180 acggctaccg agctgaacaa cgcgctgcag aacctggcgc ggacgatcag cgaagccggt 240 caggcaatgg cttcgaccga aggcaacgtc actgggatgt tcgcaaagct tatgacagag 300 cagcagtgga atttcgcggg tatcgaggcc gcggcaagcg caatccaggg aaatgtcacg 360 tccattcatt ccctccttga cgaggggaag cagtccctga ccaagctcgc agcggcctgg 420 ggcggtagcg gttcggaggc gtaccagggt gtccagcaaa aatgggacgc cacggctacc 480 gagctgaaca acgcgctgca gaacctggcg cggacgatca gcgaagccgg tcaggcaatg 540 gcttcgaccg aaggcaacgt cactgggatg ttcgcactcg agcaccacca ccaccaccac 600 tag 603

Claims (8)

1. ESAT-6(6-kDa Early Secreted Antigenic Target) 단백질을 구성하는 아미노산이 적어도 2 이상 작동가능하게 연결되어 있는, ESAT-6 다중 결합 구조 단백질.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 ESAT-6 단백질은 마이코박테리움 튜버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) 유래인, ESAT-6 다중 결합 구조 단백질.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 ESAT-6 단백질은 서열번호 1의 염기서열로 암호화되는 것인, ESAT-6 다중 결합 구조 단백질.
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 ESAT-6 다중 결합 구조 단백질은 서열번호 2의 염기서열로 암호화되는 것인, ESAT-6 다중 결합 구조 단백질.
   
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 ESAT-6 다중 결합 구조 단백질을 유효성분으로 포함하는, 항염증용 약학적 조성물.
   
6. 제5항에 있어서,
   상기 조성물은 ESAT-6 다중 결합 구조 단백질을 0.1 내지 100 μg/ml의 농도로 포함하는, 항염증용 약학적 조성물.
   
7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 ESAT-6 다중 결합 구조 단백질을 유효성분으로 포함하는, 결핵 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 ESAT-6 다중 결합 구조 단백질을 유효성분으로 포함하는, 결핵 예방 또는 개선용 식품 조성물.

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