KR20220004582A - Atps 특성을 이용한 생체 시료 분리 장치 - Google Patents

Abstract

본 실시예들은 단백질 및 엑소좀이 포함된 샘플 용액을 수성 2상계(Aqueous Two-Phase System, ATPS) 분리 방식을 기반으로 제1 용매에 포함된 단백질과 제2 용매에 포함된 엑소좀을 제1 용매와 제2 용매의 이동 속도에 따라 분리하고 엑소좀을 항체를 통해 분리 및 추출 가능한 ATPS 특성을 이용한 생체 시료 분리 장치를 제공한다.

Description

ATPS 특성을 이용한 생체 시료 분리 장치 {BIOSAMPLE SEPARATION DEVICE USING ATPS CHARACTERISTICS}

본 발명이 속하는 기술 분야는 ATPS 특성을 이용한 생체 시료 분리 장치에 관한 것이다.

이 부분에 기술된 내용은 단순히 본 실시예에 대한 배경 정보를 제공할 뿐 종래기술을 구성하는 것은 아니다.

현대 의학은 단순하게 수명을 연장하는 것이 아니라, 건강하게 오래 사는 건강수명의 연장을 실현하는 것을 목적으로 한다. 따라서 미래의학은 치료의학 중심이 아니라, 예방의학(Preventive Medicine), 예측의학(Predictive Medicine), 맞춤의학(Personalized Medicine)의 3P를 구현하는 것으로 패러다임이 변화하고 있다. 이를 구체적으로 실현하기 위해서는 질병의 조기발견 및 조기 치료 등이 매우 중요한 수단이 되고 있으며, 이를 위한 수단으로서 바이오마커(Biomarker)에 대한 연구가 매우 활발하게 이루어지고 있다.

바이오마커는 정상이나 병적인 상태를 구분할 수 있거나 치료반응을 예측할 수 있고 객관적으로 측정할 수 있는 표지자를 말한다. 바이오마커에는 핵산(DNA, RNA), 단백질, 지방질, 대사물질 등과 그 패턴의 변화 등이 이용되고 있다. 즉, 당뇨병의 진단을 위한 혈중 포도당 같은 간단한 물질부터 글리벡의 치료 타겟인 만성골수성백혈병의 BCR-ABL 유전자 융합 같은 유전자 등이 모두 바이오마커에 해당하며 임상에서 실제적으로 사용하는 바이오마커이다.

핵산 또는 단백질을 분석하여 질병의 발현 및 진행 정도를 파악할 수 있다. 단백질 분석을 위한 기술 및 소자들은 나노 기술을 이용함으로써 소자의 제작이 어렵고 비교적 고가이어서 보급화 되기 어려운 문제점이 있다. 또한, 단백질 분석 장치에 고감도의 센서가 필요하거나 적은 양의 시료로는 정확한 분석이 어렵다는 단점이 있다.

한국등록특허 제10-2056216호 (2019.12.16)

본 발명의 실시예들은 ATPS 특성을 이용한 생체 시료 분리 장치로 단백질 및 엑소좀이 포함된 샘플 용액을 수성 2상계(aqueous two-phase system, ATPS) 분리 방식을 기반으로 제1 용매에 포함된 단백질과 제2 용매에 포함된 엑소좀을 제1 용매와 제2 용매의 이동 속도에 따라 분리하고 엑소좀을 항체를 통해 분리 및 추출하는데 발명의 주된 목적이 있다.

본 발명의 명시되지 않은 또 다른 목적들은 하기의 상세한 설명 및 그 효과로부터 용이하게 추론할 수 있는 범위 내에서 추가적으로 고려될 수 있다.

본 실시예의 일 측면에 의하면, 생체 시료 분리 장치에 있어서, 제1 용매 및 제2 용매가 혼합되며 단백질 및 엑소좀이 포함된 샘플 용액을 수용하는 샘플 영역; 상기 샘플 용액을 수성 2상계(aqueous two-phase system, ATPS) 분리 방식을 기반으로 상기 단백질이 상기 제1 용매에 포함되고 상기 엑소좀이 상기 제2 용매에 포함되어, 상기 제1 용매 및 상기 제2 용매의 이동 속도 차이에 따라 상기 단백질 및 상기 엑소좀을 분리하는 채널; 및 상기 엑소좀을 포획하는 포획자를 포함하는 추출 영역을 포함하는 생체 시료 분리 장치를 제공한다.

상기 샘플 용액은 혈청(Serum)을 포함할 수 있다.

상기 제1 용매는 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol, PEG)를 포함할 수 있다.

상기 제2 용매는 염(Salt)을 포함할 수 있다. 상기 제2 용매는 인산염(Phosphate Salt)을 포함할 수 있다.

상기 채널은 평평한 구조로 형성되어 상기 샘플 용액이 수평하게 직선 방향으로 이동하며, 상기 단백질 및 상기 엑소좀이 각각 진행 방향에 따라 분리될 수 있다.

상기 엑소좀은 이종의 엑소좀을 포함하며, 제1 유형의 엑소좀 및 제2 유형의 엑소좀을 포함할 수 있다.

상기 제1 유형의 엑소좀은 신경 엑소좀(Neuronal Exosome)에 해당하고, 상기 제2 유형의 엑소좀은 일반 엑소좀을 포함할 수 있다.

상기 추출 영역에 상기 신경 엑소좀의 표면 단백질을 잡는 제1 항체 및 상기 일반 엑소좀의 표면 단백질을 잡는 제2 항체가 부착될 수 있다.

상기 생체 시료 분리 장치는, 상기 추출 영역에서 분리된 상기 신경 엑소좀 및 상기 일반 엑소좀의 타우(tau), 아밀로이드 베타(amyloid beta), 알파시누클레인(alpha-synuclein), 마이크로RNA(miRNA)의 질량비를 분석하여 진단하는 분석 장치를 포함할 수 있다.

상기 추출 영역은, 상기 신경 엑소좀을 추출하는 제1 레저버; 및 상기 일반 엑소좀을 추출하는 제2 레저버를 포함하며, 상기 제1 레저버와 상기 제2 레저버의 하단에 완충 용액이 각각 위치하고, 상기 제1 레저버와 상기 제2 레저버 각각은 분리 가능한 구조로 형성될 수 있다.

상기 수용 영역은 미리 설정된 높이로 형성될 수 있다.

상기 생체 시료 분리 장치는, 상기 채널에 연결되어, 모세관 현상에 의해 상기 샘플 용액을 이동시키는 흡수 영역을 포함할 수 있다.

상기 생체 시료 분리 장치는, 상기 채널에 부착되며, 하나 이상의 홀을 갖는 보호 케이스를 포함할 수 있다.

이상에서 설명한 바와 같이 본 발명의 실시예들에 의하면, 단백질 및 엑소좀이 포함된 샘플 용액을 수성 2상계(aqueous two-phase system, ATPS) 분리 방식을 기반으로 제1 용매에 포함된 단백질과 제2 용매에 포함된 엑소좀을 제1 용매와 제2 용매의 이동 속도에 따라 분리하고 엑소좀을 항체를 통해 분리 및 추출할 수 있는 효과가 있다.

여기에서 명시적으로 언급되지 않은 효과라 하더라도, 본 발명의 기술적 특징에 의해 기대되는 이하의 명세서에서 기재된 효과 및 그 잠정적인 효과는 본 발명의 명세서에 기재된 것과 같이 취급된다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 생체 시료 분리 장치를 예시한 도면이다.
도 2 및 도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 생체 시료 분리 장치의 동작을 예시한 도면이다.
도 4 내지 도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 생체 시료 분리 장치의 구조를 예시한 도면이다.

이하, 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지기능에 대하여 이 분야의 기술자에게 자명한 사항으로서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략하고, 본 발명의 일부 실시예들을 예시적인 도면을 통해 상세하게 설명한다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 생체 시료 분리 장치를 예시한 도면이다.

생체 시료 분리 장치는 수성 2상계(Aqueous Two-Phase System, ATPS) 분리 방식을 이용하여 생체 시료에서 세포의 소포체(엑소좀)를 분리한다. 생체 시료 분리 장치는 수성 2상계(ATPS)를 이용하여 단백질과 엑소좀을 분리한다.

엑소좀은 여러 종류의 세포들로부터 분비되는 막 구조의 작은 입자로서, 엑소좀(exosome)은 막 구조의 작은 소낭으로, 직경은 대략 30~100nm인 것으로 보고되어 있다. 엑소좀은 정상 상태 및 병적 상태 이 두가지 모든 상태 하에서 다수의 다른 세포 유형으로부터 분리되어 방출된다고 알려져 있다. 엑소좀에는 여러가지 RNA가 포함되어 있으며, 이것의 존재 유무 및 존재량을 검출하여 질병을 진단할 수 있다.

생체 시료 분리 장치(10)는 샘플 영역(100), 채널(200), 추출 영역(300)을 포함한다.

샘플 영역(100)은 제1 용매 및 제2 용매가 혼합되며 단백질 및 엑소좀이 포함된 샘플 용액을 수용한다.

채널(200)은 샘플 용액을 수성 2상계(aqueous two-phase system, ATPS) 분리 방식을 기반으로 단백질 및 엑소좀을 분리한다. 단백질이 제1 용매에 포함되고 엑소좀이 제2 용매에 포함되어, 제1 용매 및 제2 용매의 이동 속도 차이에 따라 단백질 및 엑소좀이 분리된다.

추출 영역(300)은 엑소좀을 포획하는 포획자를 포함한다. 포획자는 물리적 반응, 화학적 반응, 생물학적 반응, 또는 이들의 조합에 의해 형성될 수 있다. 예컨대, 항원-항체 반응일 수 있다.

샘플 영역(100)과 추출 영역(300)은 채널(200)과 일체로 형성되거나 부착될 수 있다.

채널(200)은 물질이 이동하는 경로이며, 채널은 다공성 재료로 형성될 수 있다. 다공성 재료는 종이, 셀룰로스(Cellulose), 나이트로셀룰로스(Nitrocellulose), 폴리에테르설폰, 폴리비닐리딘, 플루오라이드, 나일론, 및 폴리테트라플루오로에틸렌 등을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 다공성 재료는 단독 또는 다른 물질과 조합하여 사용될 수 있다.

종이는 원가가 저렴하고, 탄성 및 성형성이 좋고, 소수성 물질과 흡착, 침투시키는 형태로 종이 내 섬유 조직 위에 일정한 두께를 갖는 코팅층을 형성시키는 것이 용이하며, 소수성 코팅물질과의 결합력도 우수한 장점이 있다. 종이는 파이버 형태로 구성된 친수성 재료로서 파이버 구조에 따라 모세관이 형성되고, 종이 위의 액체는 모세관 현상(모세관력)에 의해 이동하게 된다. 즉, 별도의 외부에서 동력을 제공하지 않더라도, 모세관 현상에 따라 액체가 이동할 수 있기 때문에 생체 분자의 농축이나 성분을 구분하여 이동하기에 용이하다.

도 2 및 도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 생체 시료 분리 장치의 동작을 예시한 도면이다.

생체 시료가 주입되고, 생체 시료에서 세포의 소포체(엑소좀)를 분리하게 되며, 이 때 항원-항체 반응을 이용하게 된다. 먼저 ATPS를 사용하고 이후 항원-항체 반응으로 엑소좀을 추출하게 되는 것이다.

생체 시료 분리 장치에 수용되는 샘플 용액은 혼합물에 해당하며, 샘플 용액은 제1 용매, 제2 용매, 혈청 등이 혼합된 용액일 수 있다.

제1 용매는 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol, PEG)를 포함할 수 있다.

제2 용매는 염(Salt)을 포함할 수 있다. 제2 용매는 인산염(Phosphate Salt)을 포함할 수 있다.

샘플 용액은 신경 단위의 엑소좀(Neuronal exosomes)(E1), 그 외의 엑소좀(The other exosomes)(E2), 단백질(Proteins)(P)을 포함한다.

엑소좀은 이종의 엑소좀을 포함하며, 제1 유형의 엑소좀 및 제2 유형의 엑소좀을 포함할 수 있다. 제1 유형의 엑소좀은 신경 엑소좀(Neuronal Exosome)에 해당하고, 제2 유형의 엑소좀은 일반 엑소좀을 포함할 수 있다.

신경 엑소좀은 엑소좀 표면에 존재하는 CD171 또는 CD56 단백질을 잡는 항체에 의해 반응 가능한 엑소좀일 수 있다.

일반 엑소좀은 엑소좀 표면에 존재하는 CD63 단백질을 잡는 항체에 의해 반응 가능한 엑소좀일 수 있다. 일반 엑소좀은 신경 엑소좀을 포획하고 난 후 신경 엑소좀을 제외한 비신경 엑소좀으로 볼 수 있다.

추출 영역에 신경 엑소좀의 표면 단백질을 잡는 제1 항체 및 일반 엑소좀의 표면 단백질을 잡는 제2 항체가 부착될 수 있다.

채널(channel)에 형성된 추출 영역에 신경 단위의 엑소좀(Neuronal exosomes) 포획 항체(Neuronal exosome capture antibody)와 엑소좀(The other exosomes) 포획 항체(Exosome capture antibody)가 마련된다. 생체 시료 혼합물이 채널을 통해 유동함에 따라 PEG(단백질 포함) 및 염(엑소좀 포함)이 분리된다.

이후에, 신경 단위의 엑소좀(Neuronal exosomes) 포획 항체에 의해 신경 단위의 엑소좀이 분리되며, 엑소좀(The other exosomes) 포획 항체에 의해 그 외의 엑소좀이 분리된다.

생체 시료 분리 장치는 항원-항체 반응으로 포획된 신경 단위의 엑소좀(Neuronal exosomes)과 그 외의 엑소좀(The other exosomes)을 채널의 각각의 구역에서 분리한다.

바이어 마커 신호를 비교하면 신경 단위의 엑소좀(Neuronal exosomes)과 그 외의 엑소좀(The other exosomes)이 각각 분리된 것을 확인할 수 있다.

도 3을 참조하면, 생체 시료 분리 장치는, 추출 영역에서 분리된 신경 엑소좀 및 일반 엑소좀의 타우(tau), 아밀로이드 베타(amyloid beta), 알파시누클레인(alpha-synuclein), 마이크로RNA(miRNA)의 질량비를 분석하여 진단하는 분석 장치(400)를 포함할 수 있다.

생체 시료 분리 장치는 엑소좀을 추출, 용해 및 자가 표준 진단(Exosome extraction, lysis, and self-standard diagnosis)을 수행할 수 있다.

도 4 내지 도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 생체 시료 분리 장치의 구조를 예시한 도면이다.

채널은 평평한 구조로 형성되어 샘플 용액이 수평하게 직선 방향으로 이동하며, 단백질 및 엑소좀이 각각 진행 방향에 따라 분리될 수 있다.

수용 영역, 추출 영역 등의 각각의 영역들은 패드 형태로 채널 등에 부착될 수 있고, 채널을 가공하는 방식으로 형성될 수도 있다.

수용 영역은 미리 설정된 높이로 형성되어 높이차에 의한 중력을 이용하여 샘플을 이동시킬 수 있다.

생체 시료 분리 장치는, 채널에 연결되어, 모세관 현상에 의해 샘플 용액을 이동시키는 흡수 영역을 포함할 수 있다.

도 5를 참조하면, 생체 시료 분리 장치는, 채널에 부착되며, 하나 이상의 홀을 갖는 보호 케이스를 포함할 수 있다. 추출 영역에 위치하는 홀이 하나이면 한 종류의 엑소좀을 추출하는 경우이고, 복수의 홀을 가지면 복수 종류의 엑소좀을 추출할 수 있다. 예컨대, 플라스틱 카세트(top)를 통해 신경 단위의 엑소좀(Neuronal exosomes)과 그 외의 엑소좀(The other exosomes)이 추출될 수 있다.

도 6을 참조하면, 추출 영역은, 신경 엑소좀을 추출하는 제1 레저버 및 일반 엑소좀을 추출하는 제2 레저버를 포함할 수 있다. 제1 레저버와 제2 레저버의 하단에 완충 용액이 각각 위치하고, 제1 레저버와 제2 레저버 각각은 분리 가능한 구조로 형성될 수 있다.

생체 시료 분리 장치는 ATPS + LFA를 적용한 키트(Kit)의 구조로 형성될 수 있다. 키트의 내측에 제1 용액(예컨대, PEG)(separated protein)이 위치하며, 제2 용액에 대해서 신경 단위의 엑소좀(Neuronal exosomes)을 추출하기 위한 레저버와 그 외의 엑소좀(The other exosomes)을 추출하기 위한 레저버가 각각 위치하며, 레저버의 내부에 완충액(Elution buffer)을 포함한다. 레저버는 상부와 하부가 결합 가능한 구조로 형성될 수 있고, 분리가 가능하다.

생체 시료 분리 장치는 마이크로 플루이딕 칩 형태로 구현될 수 있다.

생체 시료 분리 장치는 시료 주입부(sample inlet), 고정된 포획 항체 영역(capture antibody immobilized zone), 모세관 펌프(capillary pump), 벤트(vent)를 포함할 수 있다. 고정된 포획 항체 영역은 하나 이상의 홀과 홀에 삽입되는 포획부로 구현될 수 있다.

플라스틱 칩의 모세관 현상을 이용하며 유연물질 등을 사출 성형하여 상판과 하판을 생성하고 상판에 마이크로 채널이 형성될 수 있다. 모세관 펌프 부분이 유체를 연속적으로 끌어당기기 위한 구조물 형성 영역이다.

이에 따라, 적용 구조가 유체 채널로 변경되며 캡쳐를 위한 홀에 삽입되는 포획부는 분리가 가능하도록 설계될 수 있다.

플라스틱 칩이 상하부에 위치하고 융착이나 접착물질 등으로 상하부를 붙인다. 그 안에 비어있는 채널이 형성되고, 비어있는 채널의 특정 부분에 항체가 고정화되고, 고정화된 부분에서 구멍이 형성될 수 있다. 플라스틱 칩에서 흡수 패드 역할은 모세관 펌프(capillary pump)가 수행한다.

본 실시예들은 본 실시예의 기술 사상을 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예에 의하여 본 실시예의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 본 실시예의 보호 범위는 아래의 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 실시예의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.

10: 생체 시료 분리 장치
100: 샘플 영역
200: 채널
300: 추출 영역

Claims (14)

1. 생체 시료 분리 장치에 있어서,
   제1 용매 및 제2 용매가 혼합되며 단백질 및 엑소좀이 포함된 샘플 용액을 수용하는 샘플 영역;
   상기 샘플 용액을 수성 2상계(Aqueous Two-Phase System, ATPS) 분리 방식을 기반으로 상기 단백질이 상기 제1 용매에 포함되고 상기 엑소좀이 상기 제2 용매에 포함되어, 상기 제1 용매 및 상기 제2 용매의 이동 속도 차이에 따라 상기 단백질 및 상기 엑소좀을 분리하는 채널; 및
   상기 엑소좀을 포획하는 포획자를 포함하는 추출 영역을 포함하는 생체 시료 분리 장치.
2. 제1항에 있어서,
   상기 샘플 용액은 혈청(Serum)을 포함하는 것을 특징으로 하는 생체 시료 분리 장치.
3. 제1항에 있어서,
   상기 제1 용매는 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol, PEG)를 포함하는 것을 특징으로 하는 생체 시료 분리 장치.
4. 제1항에 있어서,
   상기 제2 용매는 염(Salt)을 포함하는 것을 특징으로 하는 생체 시료 분리 장치.
5. 제4항에 있어서,
   상기 제2 용매는 인산염(Phosphate Salt)을 포함하는 것을 특징으로 하는 생체 시료 분리 장치.
6. 제1항에 있어서,
   상기 채널은 평평한 구조로 형성되어 상기 샘플 용액이 수평하게 직선 방향으로 이동하며, 상기 단백질 및 상기 엑소좀이 각각 진행 방향에 따라 분리되는 것을 특징으로 하는 생체 시료 분리 장치.
7. 제1항에 있어서,
   상기 엑소좀은 이종의 엑소좀을 포함하며, 제1 유형의 엑소좀 및 제2 유형의 엑소좀을 포함하는 것을 특징으로 하는 생체 시료 분리 장치.
8. 제7항에 있어서,
   상기 제1 유형의 엑소좀은 신경 엑소좀(Neuronal Exosome)에 해당하고, 상기 제2 유형의 엑소좀은 일반 엑소좀을 포함하는 것을 특징으로 하는 생체 시료 분리 장치.
9. 제8항에 있어서,
   상기 추출 영역에 상기 신경 엑소좀의 표면 단백질을 잡는 제1 항체 및 상기 일반 엑소좀의 표면 단백질을 잡는 제2 항체가 부착되는 것을 특징으로 하는 생체 시료 분리 장치.
10. 제8항에 있어서,
    상기 추출 영역에서 분리된 상기 신경 엑소좀 및 상기 일반 엑소좀의 타우(tau), 아밀로이드 베타(amyloid beta), 알파시누클레인(alpha-synuclein), 마이크로RNA(miRNA)의 질량비를 분석하여 진단하는 분석 장치를 포함하는 것을 특징으로 하는 생체 시료 분리 장치.
11. 제8항에 있어서,
    상기 추출 영역은,
    상기 신경 엑소좀을 추출하는 제1 레저버; 및
    상기 일반 엑소좀을 추출하는 제2 레저버를 포함하며,
    상기 제1 레저버와 상기 제2 레저버의 하단에 완충 용액이 각각 위치하고,
    상기 제1 레저버와 상기 제2 레저버 각각은 분리 가능한 구조로 형성되는 것을 특징으로 하는 생체 시료 분리 장치.
12. 제1항에 있어서,
    상기 수용 영역은 미리 설정된 높이로 형성되는 것을 특징으로 하는 생체 시료 분리 장치.
13. 제1항에 있어서,
    상기 채널에 연결되어, 모세관 현상에 의해 상기 샘플 용액을 이동시키는 흡수 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 생체 시료 분리 장치.
14. 제1항에 있어서,
    상기 채널에 부착되며, 하나 이상의 홀을 갖는 보호 케이스를 포함하는 것을 특징으로 하는 생체 시료 분리 장치.

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