JP2008501935A - 診断テスト処理及びサンプルの流れが制御された装置 - Google Patents
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Abstract
垂直型フロースルーアッセイプロセスにおいて用いる装置（１０）及び方法は、サンプルに圧力を加えて、サンプルに力を加え１個以上のリガンドが結合された反応／捕捉膜（１２）を制御された速度で通過させることを特徴とする。前記方法は、通常、サンプル及び検出検体（通常、金コロイド又は蛍光タグに結合された抗体）を一体に結合する前培養工程を包含する。前培養工程は、通常、捕捉膜（１２）の上方に設けられたチャンバ（２６）内で行われる。チャンバのベース部は、多孔疎水性フリット（３４）によって構成される。多孔疎水性フリットは、通常、ポリエチレンから形成される。好適には、チャンバ（２６）は、反応膜（１２）を吸収体パッド（２８）に押し付けるシール（３０）から延びたシリンダ（２４）の上側部分によって構成される。シール（３０）は、反応膜を圧縮して、サンプルの横方向へのウィッキングを防止し、環状シールの外側にサンプルが漏出するのを防止する効果を有する。ピストン（２８）は、チャンバ内に存在する空気を大気圧よりも高くなるように圧縮して、サンプルに力を加えて疎水性フリット（３４）を通過させる。或いは、液圧式アクチュエータ（６０）が、サンプルに直接的に作用して、サンプルに力を加えフリット及び反応膜を所定の速度で通過させてもよい。
Description
本発明は、診断テスト処理及びその装置に関する。具体的には、本発明は、アッセイ（assay ）されるサンプルの流れが制御されたアッセイ処理の実施において用いる装置及びサンプルの流れが制御されたアッセイ処理を実施する方法に関する。
（関連出願の相互参照）
本出願は、2004年６月４日に出願された仮特許出願第2004903009号の優先権を主張する。本明細書中、この仮特許出願の内容を参照によって援用する。
本出願は、2004年６月４日に出願された仮特許出願第2004903009号の優先権を主張する。本明細書中、この仮特許出願の内容を参照によって援用する。
約２０年に亘って、診断アッセイにはラテラルフロー／フロースルー技術が用いられている。ラテラルフロー技術は現在主流の技術である。というのは、ラテラルフロー装置は製造が容易であり、全量血液分離に適用し得る単純な２段階プロセスでアッセイを行うことができるからである。この結果、高速ポイントオブケア診断（rapid point-of care diagnostic）として当該領域において用いられ得る単純な装置が実現される（Cole et al 1996 Tuberc.Lung. Dis. 77:363-368を参照）。しかし、ラテラルフロー技術を用いた多重疾患診断（multiple disease diagnosis）は非常に難しい。というのは、横方向の拡散はサンプル間で差があり、隔離膜のバッチ間で流量に差が出るからである。このことは、抗原又は抗体の信号強度が、テスト内でバラツキが生じ且つテストのバッチ間でバラツキが生じ得、その結果、テストの結果に一貫性がないということを意味している。
ラテラルフローテストでは通常５〜１５分かかるのに比べて、フロースルー診断テストは２分未満で完了する。しかし、この速さの利点は感度を犠牲にすることがある。
フロースルーアッセイの基本原理は、十分に確立されている。テストは、サンプル中における所定の検体／試薬の存在（又は場合によっては量）を判定するように設計されている。多くの場合、試薬はタンパク質であるが、他の試薬をテストすることもできる。アッセイが患者の特定の疾患の存在についてのテストである場合、感染に反応して患者が生成する抗体又は他のタンパク質若しくは疾病の原因となるバクテリア又はウイルス因子に代表されるタンパク質について、患者の体液をテストし得る。通常のフロースルーアッセイでは、試薬を含んでいると考えられる液体のサンプルを、試薬に結合することが知られている検体を捕捉するように結合された膜を介して吸収体パッド内に吸い上げる。その後、通常は、該膜を緩衝液で洗浄する。試薬に結合し且つ検出可能なトレーサー又はマーカーを含む検出検体を含んだ液体を、該膜に適用する。検出検体は、該膜に結合して固定された試薬と結合し、観察又は検出が可能となり、それにより試薬の存在が示される。
国際特許出願PCT/AU02/01119は、アッセイプロセスにおいて用いる改良されたフロースルー装置を開示している。この装置は、サンプル及び検出検体がフロースルーを経て捕捉膜に達するよりも前に互いに結合する前培養工程を提供することを特徴とする。この装置は、既存の垂直型フロースルー装置よりも感度が向上しており、アッセイに必要なサンプルの量がより少なくて済むというさらなる利点を有する。さらに、より多量のサンプル量（例えば、数ミリリットルの血液）を分析することが可能であり、したがって低濃度の試薬を検出することが可能であるという利点を有する。しかし、PCT/AU02/01119に開示された装置及び方法は既存の垂直型フロースルーの改良物であるが、結果にかなりのバラツキが生じることがわかっている。このバラツキは、捕捉検体が結合する膜（通常ニトロセルロース膜）の特性及び多孔度のバラツキが原因であると考えられる。
本明細書に含まれる文書、行為、材料、装置、記事などの説明は、本発明の技術背景を提供するためのものに過ぎない。これらのいずれか又は全てが、従来技術の基礎を構成するとか、本発明に関連する技術分野において本出願の各請求項の優先日以前にオーストラリア又はその他の地域において存在した一般に公知の事項であるなどと認めるものではない。
従来技術は用語に一貫性がないので、誤解を避け且つ明確に説明するため、本明細書中において用いる以下の用語は次のように定義される。「試薬（reagent）」は、アッセイによって検出しようとする化合物、タンパク質等を指す。「捕捉検体（capture analyte）」は、膜に結合され且つ試薬が結合する化合物を指す。「検出検体（detection analyte）」は、試薬に結合し且つトレーサーを担持する化合物若しくはその存在が可視光下であるか蛍光下であるかに拘わらず検出され得る（通常は視覚的に検出され得る）その他の元素を指す。
第１の広範な局面において、本発明は、サンプルを加圧して制御された速度で該サンプルに力を加えることによって１個以上のリガンドが結合された反応／捕捉膜を通過させることを特徴とする、垂直型フロースルーアッセイプロセスにおいて用いる装置及び方法を提供する。該方法は、サンプル及び検出検体（通常、金コロイド又は蛍光タグに結合された抗体）を一体に結合する前培養工程を包含することが好ましい。
より詳細には、本発明のある局面において、アッセイプロセスに用いる装置において、検出しようとする試薬に結合する捕捉検体が結合した多孔性反応膜であって、上側表面及び下側表面を有する多孔性反応膜と、前記反応膜の前記下側表面の下側に、前記下側表面に接触するように配置されたティッシュペーパー等の吸収材料体と、第１の部材上に設けられたチャンバであって、前記チャンバは側壁と第２の膜によって構成されたベース部とを有し、前記チャンバは前記第１の部材の上方に略垂直に支持され、加圧下で前記チャンバ内に収容された液体サンプルに力を加えて前記チャンバのベース部を通過させて前記反応膜に達するようにする手段を特徴とするチャンバとを備えた装置が提供される。
ある好適な実施形態において、前記部材のベース部は多孔疎水性フリットによって構成され、多孔疎水性フリットは通常ポリエチレンから形成される。
チャンバは、反応膜を吸収体パッドに押し付けるシールから延びたシリンダの上側部分によって構成され得る。シールは、反応膜を圧縮して、サンプルの横方向へのウィッキングを防止し、環状シールの外側にサンプルが漏出するのを防止する効果を有する。
ある実施形態において、サンプルを加圧する手段はピストン手段を含み得る。ピストン手段は、チャンバ内に存在するガス（通常は空気）を圧縮して、チャンバを加圧し、サンプルに力を加えて疎水性フリットを通過させるように用い得る。
別の実施形態において、サンプルに力を加えてチャンバのベース部を通過させる手段は、サンプルに直接的に作用して、サンプルに力を加えフリット及び反応膜を所定の速度で通過させる液圧式アクチュエータを備え得る。
吸収体及び反応膜は、ハウジング内に配置され得る。ハウジングは、少なくとも１つのブリード孔を有して、ケーシング内の圧力の増大が防止される。
ある特定の好適な実施形態において、複数の上記装置を一体に連結し、複数のピストンを用いてサンプルに力を加え、同時且つ同一速度でフリットを通過させて膜に達するようにする。
以下、本発明の特定的な実施形態を、添付の図面を参照しつつ、例示のみにより説明する。
抗原又は抗体等のリガンドの形態の捕捉検体が、タンパク質捕捉膜マトリクス上に印刷される。より具体的には、圧電化学印刷技術又はシリンジポンプなどの他の印刷技術を用いて、適切なサイズのアレイ状に形成されたニトロセルロース膜上に印刷される。適した化学印刷システムは、DNA診断又は「CHEM-JET」と呼ばれるCombion社の合成プロセスにおいて微少供給流体のために圧電ドロップオンデマンドインクジェット印刷技術を用いることを包含する。イメージング手段を含むそのような装置は、本出願と同一出願人の国際特許出願PCT/AU98/00265にも記載されている。本明細書中、PCT/AU98/00265の全内容を参照によって援用する。記載された実施形態において、１００PLの液滴状の抗原が反応膜上に印刷されるか、又は、それら液滴を１mm離して複数印刷する。しかし、これらの量及び距離は、選択された抗原滴定量及びアレイサイズに応じて増加／減少され得る。
ある特定の実施形態において、抗原又は抗体は、０．２２ミクロンの孔サイズを有するニトロセルロース膜上に、列状に配置されたドットからなるマトリクス状に印刷される。供給された抗原を乾燥した後、ニトロセルロース膜上の利用可能な部位をブロックする緩衝液を用いることにより、ニトロセルロース膜上の非特異的タンパク質結合部位がブロックされる。
ここで図面を参照すると、図１は、上記で説明したニトロセルロース膜１２を用いるフロースルーアッセイ装置１０を示す。装置１０は、２つの部材（上側部材１４ａ及び下側部材１４ｂ）からなるカセット又はハウジング１４を備えている。ブリード孔１６は、下側部材１４ｂのベース部に設けられている。ケーシングの上側部材１４ａは、ウェルのベース部にシリンダアパチャ１８を有する。シリンダアパチャ１８の側部は、略円柱状のインサート部２４に設けられた差込嵌合部２２を受け取る凹部２０を有する。特に、インサート部２４は前培養チャンバ２６を構成する。
ニトロセルロースインサート部は、ケーシング内部の、インサート部２４のベース部の、吸収体マトリクス２８の頂部上に配置される。吸収体マトリクスは、通常、複数層の吸収体ティッシュ又は吸取紙等の吸収体パッドを備えている。
図１からわかるように、インサート部２４のベース部３０は膜１２に押し付けられ、シール３０として働き、膜１２内でサンプルがシールを越えて横方向へ流出（ウィッキング）するのを防止する。フランジ３２は、インサート部２４のベース部に近い位置でその内側に沿って設けられており、多孔疎水性ポリエチレンフリット３４を担持する。多孔疎水性ポリエチレンフリット３４は、前培養チャンバのベース部を構成する。フリット３４の孔サイズは１０〜２００ミクロンであり、これは、膜１２の孔サイズの約１００〜１０００倍にあたる。インサート部２４の上端部は、外側フランジ３６を構成している。
円柱状のピストン／プランジャ３８の外径は、前培養チャンバの内径に等しい。プランジャの頂部は外側フランジ４０を構成しており、外側フランジ４０から下方に突出したスナップ嵌合機構が設けられている。シール４４がプランジャの底部に設けられている。
図３〜図６を参照すると、使用時、アッセイを行うサンプルは、図３に示すように、検出検体と共に前培養チャンバ２６内に投入される。サンプルの量は、通常、約１．５〜２mlである。フリットは疎水性なので、溶液はフリットを通過せず、培養チャンバ内に留まる。前培養に所定の時間がかかる。通常は３０秒間である。
次に、図４に示すように、プランジャが円柱状の前培養チャンバ２６の開口端部に挿入され、スナップ嵌合機構４２が前培養チャンバの頂部のフランジ３６の後側にスナップ嵌合するまでピストンの外側フランジが押し下げられる。それ以降、ピストンのさらなる移動は起こらない。ピストンは、所定の量（Ｖ）の空気を前培養チャンバ内に押し込み、サンプルを加圧してサンプルに力を加えることによりフリット３４を通過させる。フリット３４を通過したサンプルは、図４に示すように、膜１２上に達する。
その後、サンプルは依然上昇された圧力下（大気圧よりも高い圧力）にあるので、図５に示すようにニトロセルロース膜１２を通過する。圧力の上昇によって結果が向上すると考えられる。なぜなら、サンプルは、重力下で普通に吸い上げられるのと比べて、圧力によってニトロセルロース膜をより素早く且つ均等に通過するからである。所定量の空気を圧縮し、その圧力下でサンプルを通過させるようにすることで、診断テストの精度及び安定性が向上する。サンプルは約１０秒以内にフリットを素早く通過し、その後、より遅いスピード（通常約５０秒）でニトロセルロース膜を通過する。異なる疎水度及び孔サイズを有し得る異なるバッチから得た膜を用いた場合であっても、通過時間は略一定である。パッド２８と膜１２との接触は、圧力を増大することによって向上する。このことは、装置の再現性を向上する上での１つの要素であると考えられる。
次に、図６に示すように、前培養チャンバ２４及びピストン３８が一体的に取り外される。次に、２、３滴の洗浄液をニトロセルロース膜１２に与える。その後、読み取り器（図示せず）にて結果を解読する。
図７〜図１３は、垂直型フロースルーアッセイ装置１０ｂの第２の実施形態を示す。装置１０ｂでは、スクリュー駆動アクチュエータ６０の形態の流体制御デバイスによって、制御フロースルーが達成される。該装置の設計は、図１〜図６に示した実施形態の設計に非常に似ており、同じ構成部材を多数用いている。よって、同一の構成部材は同じ参照符号で示し、その詳細な説明を省略する。
第２の実施形態において、円柱状インサート部２４ｂ／前培養チャンバ２６ｂの形状は、第１の実施形態と設計が少し異なる。具体的には、インサート部の上側部分６２が、下側部分と比べて幅広である。また、上側部分６２は、ピストン３８の直径と比べて幅広である。本実施形態において、サンプルは、スクリュー駆動アクチュエータを用いて所定の流量で押し込まれる。
図９〜図１３は、流体制御デバイス６０を用いて診断テストを実施する様子を示す。具体的には、図９は、サンプル５０及び検出検体（共役体）が、前培養チャンバ２６内に、前培養チャンバの幅広部６２の高さにまで投入された様子を示す。
図１０は、スクリュー駆動アクチュエータ６０の動作によって前培養チャンバ内に押し込まれたピストンを示す。なお、スクリュー駆動アクチュエータ６０は、サンプルがフリット及びニトロセルロース膜を公知の流量で通過するように、所定の速度で下方に移動するように設定されている。通常、好適な流量は１時間あたり９０mlである。この流量は、１．５mlのサンプルが約１分以内にフリット及びニトロセルロース膜を通過することに相当する。少なくとも前培養チャンバの幅広部６２にまでサンプルを投入することにより、気泡が防止される。但しこの場合、サンプルの一部が無駄になる。定量分析のために、正確な量のサンプルが投入され、その場合はサンプルの無駄が生じない。図１１は、サンプルがフリット３４及び膜１２を通過した後の様子を示す。
図１２は、スクリュー駆動アクチュエータ６０の取り外しを示す。図１３は、続いて行われる前培養チャンバ２６ｂ及びプランジャ３８の取り外しを示す。これにより、ニトロセルロース膜１２の洗浄及び結果の読み取りが可能になる。
上記の制御されたフロースルー診断テストを用いることによって、異なるバッチから得た膜を用いたテストにおいて再現性が向上し且つ安定性が大いに増し、結果が大幅に向上するということがわかっている。ニトロセルロース膜は疎水性及び孔サイズにかなりのバラツキが有り得、サンプルの流れを制御せずに単純な垂直型フロースルーテストを行った場合、このバラツキがテスト結果の質（再現性など）に大きな影響を与えるということがわかっている。
圧力によってニトロセルロース膜と吸収体パッドとの間の接触が大きくなり、横方向への流出（ウィッキング）の影響が低減されるということを含む多数の特徴によって、改良された結果が得られると考えられる。シール３０はまた、サンプルを制限してウィックを下方に流れるようにする。また、圧力によって、ニトロセルロース膜の孔サイズのバラツキが克服されることがわかっている。ピストン／プランジャを用いることにより、サンプルの跳ね返りを防止する。
図１４は、本発明の別の実施形態を示す。この実施形態において、図１〜図６のデバイスに類似の、１２×８のアレイ状に配置された９６個の診断テストデバイスを開示する。各テストデバイスは上記と同様に動作する。
装置９０は、１つのニトロセルロース膜１２及び１つの吸取紙ウィック２８を用いる。アレイ状に配置された９６（１２×８）個のウェル９２が装置内に設けられている。図１〜図６の実施形態と同様に、各ウェル９２のベース部に環状のシール３０が設けられ、これにより隣接するサンプル間における相互汚染が防止される。９６個のウェルに対応する９６個の前培養チャンバ９４からなるアレイが、支持プレート９６に取り付けられている。このアレイは１２×８のアレイである。各チャンバのベース部はやはり、多孔性フリット３４によって規定される。これに対応する９６個のピストン１０２からなるアレイ１００が、支持プレート１０４に取り付けられている。ピストン１０２は、装置９０の前培養チャンバ９４内に配置されており、サンプルを加圧するものである。この装置を用いて９６種類の診断テストを同時に行うことができる。前培養はピストンを押し下げる前に行われる。このシステムの大きな利点は、膜及び膜の試薬のストライプが全てのテストについて均一であり、プロセス中、サンプル以外のものが全て同一である点にある。したがって、短時間でテストを行えるだけでなく、非常に安定した結果を期待できる。
当業者は、概説した本発明の趣旨及び範囲から逸れることなく、具体的な実施形態に示すように、本発明に対してさまざまな改変及び／又は修正を行い得ることを理解する。したがって、本明細書に記載の実施形態は、あらゆる点について、本発明を説明するものであり、本発明を限定するものではないと理解されねばならない。
Claims (23)
- アッセイプロセスに用いる装置において、
検出しようとする試薬に結合する捕捉検体が結合した多孔性反応膜であって、上側表面及び下側表面を有する多孔性反応膜と、
前記反応膜の前記下側表面の下側に、前記下側表面に接触するように配置されたティッシュペーパー等の吸収材料体と、
第１の部材上に設けられた液体サンプルを容れるためのチャンバであって、前記チャンバは側壁と第２の膜によって構成されたベース部とを有し、前記チャンバは前記第１の部材の上方に略垂直に支持され、使用時に、加圧下で前記チャンバ内に収容された液体サンプルに力を加えて前記チャンバのベース部を通過させて前記反応膜に達するようにする手段を特徴とするチャンバと
を備えたことを特徴とする装置。 - 請求項１に記載の装置において、
前記第２の膜は多孔疎水性フリットを含む
ことを特徴とする装置。 - 請求項２に記載の装置において、
前記多孔疎水性フリットはポリエチレンから形成される
ことを特徴とする装置。 - 請求項１〜３のいずれか１つに記載の装置において、
前記多孔性反応膜及び前記吸収材料体はハウジング内に保持され、前記ハウジングの上部表面は、前記チャンバを挿入するための開口部を有し且つ前記チャンバを前記ハウジングに取り外し可能に固定する手段を備えている
ことを特徴とする装置。 - 請求項４に記載の装置において、
前記チャンバはシリンダの上側部分によって構成され、前記シリンダは、前記ハウジング内で前記反応膜を前記吸収体パッドに押し付けるように構成された環状ベース部を有し、それにより、前記サンプルの横方向へのウィッキングを防止する環状シールが構成され、前記環状シールの外側にサンプルが漏出することが防止される
ことを特徴とする装置。 - 請求項１〜５のいずれか１つに記載の装置において、
前記液体サンプルに力を加える手段は、空気式の手段を含む
ことを特徴とする装置。 - 請求項１〜６のいずれか１つに記載の装置において、
前記液体サンプルに力を加える手段は、前記チャンバ内に受容可能なピストン手段を含み、前記ピストン手段は、前記チャンバ内のガスを圧縮して大気圧よりも高い圧力にまで昇圧し、前記サンプルに力を加えて加圧下で前記第２の膜を通過させる
ことを特徴とする装置。 - 請求項１〜５のいずれか１つに記載の装置において、
前記液体サンプルに力を加える手段は、液圧式の手段を含む
ことを特徴とする装置。 - 請求項１〜５及び８のいずれか１つに記載の装置において、
前記液体サンプルに力を加える手段は、前記サンプル量に直接的に作用し且つ前記サンプルに力を加えて所定の速度で前記第２の膜を通過させる液圧式アクチュエータを含み、前記所定の速度は前記アクチュエータによって規定される
ことを特徴とする装置。 - 請求項４〜９のいずれか１つに記載の装置において、
前記ハウジングは、少なくとも１つのブリード孔を有して、前記ケーシング内の圧力の増大を防止するように構成されている
ことを特徴とする装置。 - 前記請求項のいずれかに記載の装置において、
前記捕捉膜に複数の異なる捕捉検体が結合されている
ことを特徴とする装置。 - 請求項１１に記載の装置において、
前記複数の異なる捕捉検体は、ストライプ又は点の形で設けられている
ことを特徴とする装置。 - 診断テスト装置であって、
請求項７に記載の装置を複数個連結してなるアレイを備え、
前記装置は、サンプルに力を加えて前記アレイ内の各チャンバの第２の膜を同時に通過させるように連結されたピストンを備えている
ことを特徴とする診断テスト装置。 - 請求項１３に記載の診断テスト装置において、
１つの反応膜が、前記アレイ内の複数又は全てのチャンバの前記第２の膜の下側に配置されている
ことを特徴とする診断テスト装置。 - 垂直型フロースルーアッセイプロセスを実施する方法であって、
膜によって構成されたベース部を有するチャンバ内にサンプルを投入する工程であって、前記膜は多孔性反応膜の上方に設けられ、前記多孔性反応膜には前記サンプル内に検出しようとする試薬に結合する捕捉検体が結合されており、前記膜は前記反応膜の下側に前記反応膜に接触するように配置されている、サンプル投入工程と、
サンプルに圧力を加えて、前記サンプルに力を加え前記反応捕捉膜を制御された速度で通過させる加圧工程と
を包含することを特徴とする方法。 - 請求項１５に記載の方法において、
前記サンプル及び通常、金コロイド又は蛍光タグに結合された抗体である検出検体を、加圧の前に、所定の時間の間、前記チャンバ内に一緒に投入しておく前培養工程を包含することを特徴とする方法。 - 請求項１５又は１６に記載の方法において、
前記加圧工程は、前記チャンバ内の前記サンプル上に配置された所定の体積の空気を圧縮することを含む
ことを特徴とする方法。 - 請求項１５〜１６のいずれか１つに記載の方法において、
前記サンプルを加圧する工程は空気圧により実施される
ことを特徴とする方法。 - 請求項１５〜１６のいずれか１つに記載の方法において、
前記サンプルを加圧する工程は液圧により実施される
ことを特徴とする方法。 - 請求項１５〜１９のいずれか１つに記載の垂直型フロースルーアッセイプロセスを実施する方法において、
前記ベース部上に複数のチャンバが設けられ、複数のアッセイが同時に実施される
ことを特徴とする方法。 - 請求項１５〜２０のいずれか１つに記載の垂直型フロースルーアッセイプロセスを実施する方法において、
複数の異なる試薬について同時にテストを行うために、複数の異なる捕捉検体が前記捕捉膜に結合されている
ことを特徴とする方法。 - 請求項１６〜２１のいずれか１つに記載の垂直型フロースルーアッセイプロセスを実施する方法において、
前記前培養工程は、少なくとも約３０秒間実施される
ことを特徴とする方法。 - 請求項１５〜２２のいずれか１つに記載の垂直型フロースルーアッセイプロセスを実施する方法において、
前記サンプルは約１．５〜２mlの体積を有する
ことを特徴とする方法。
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