KR20220003001A - 이기능성 인간화 항-c5 항체 및 인자 h 융합 단백질 및 그의 용도 - Google Patents
이기능성 인간화 항-c5 항체 및 인자 h 융합 단백질 및 그의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 항-C5 항체 또는 그의 융합 단백질을 사용하는 보체 신호전달의 억제와 관련된다. 구체적으로, 본 발명은 개체를 그의 항-C5 항체 융합 단백질과 접촉시켜 개체에서 보체 매개 질환 또는 보체 매개 장애를 치료하는 방법과 관련된다.
Description
연방 지원 연구 또는 개발에 관한 진술
본 발명은 NIH(National Institutes of Health)에서 수여한 NIH 과제 번호 AI085596 및 AI117410에 따라 정부 지원으로 만들어졌다. 정부는 본 발명에 대한 특정 권리를 가지고 있다.
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 35 U.S.C. §119(e) 하에 2019년 4월 24일자로 출원된 미국 가특허출원 일련 번호 62/837,853 및 2019년 4월 24일에 출원된 미국 가특허출원 일련번호 62/837,833에 대한 우선권을 주장하며, 이들 출원의 개시내용은 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.
보체계는 숙주 방어에서 핵심적인 역할을 하는 타고난 면역의 일부이다. 일반적으로 보체의 활성화는 숙주 조직에 자가 손상을 일으키지 않도록 주의 깊게 제어된다. 그러나 조절 기전이 결함이 있거나(예를 들어, 보체 조절인자 유전자의 돌연변이) 부적합한 (예를 들어, 조절인자의 능력을 압도하는 대규모 자가항체 또는 감염 유발 보체 활성화가 있는 경우) 특정 상황 하에, 억제되지 않은 보체계에 의한 심각한 및 생명 위협 자가 조직 손상이 발생할 수 있다. 현재 많은 자가면역 및 염증성 질환이 부적절한 보체 활성화에 의해 매개되는 것으로 알려져 있으며, 다양한 보체 매개 질환의 병원성 기전을 이해하고 이러한 장애를 치료하는 약물로서 특정 항보체 억제제를 개발하기 위해 현장에서 많은 노력을 기울이고 있다. 활성화된 보체는 또한 심각한 조직 손상 및 파괴를 일으킬 가능성이 있으며 조절이상 보체 활성은 다수의 희귀 및 보통 질환 예컨대 발작성 야행성 혈색소뇨증 (PNH), 비전형 용혈성 요독 증후군 (aHUS), 류마티스성 관절염, 연령 관련 황반 변성 등과 관련이 있는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 항보체 요법은 이러한 인간 장애를 치료하는 유망한 방법이다.
보체 C5는 보체 활성화의 말단 경로에서 중요한 단백질이며 강력한 전염증성 매개체 C5a 및 세포용해성 막 공격 복합체(MAC)를 생성하기 위한 전구체 단백질이다. C3 활성화는 또한 C5-절단 효소 복합체의 생성을 유도하고 말단 보체 활성화 경로를 개시하여, 세포 용해 및 사멸을 유발할 수 있는 강력한 전염증 매개체 C5a 및 막 공격 복합체 C5b-9의 생성으로 정점에 달한다.
다수의 인간 염증성 및 자가면역 질환은 C5a 및/또는 MAC에 의해 매개되며 C5 활성화를 차단하면 C5a 및 MAC 생성을 예방하고 치료적 가치가 있어야 한다. 인간화 마우스 항인간 C5 mAb인 에쿨리주맙은 두 가지 보체 매개 질환 PNH 및 aHUS를 치료하는 데 사용되어 왔다. 그러나 모든 PNH 환자가 에쿨리주맙 치료에 반응하는 것은 아니며 반응하지 않는 이유 중 하나는 에쿨리주맙에 대한 에피토프 결합이 손실된 인간 C5의 유전적 다형성이다. 또한, 에쿨리주맙은 C5의 높은 혈장 농도 및 표적 매개된 항체의 신속한 제거로 인해 환자에게 고용량 및 빈도로 투여해야 한다.
보체 단백질을 표적으로 하는 약물 개발의 과제 중 하나는 높은 혈장 농도 및/또는 빠른 턴오버(turnover)이다. 예를 들어, 인간 C3 및 C5의 혈장 농도는 각각 약 1 mg/mL 및 80 ug/mL이다. 이는 이러한 단백질에 대한 억제제가 고용량 및/또는 빈번하게 투여될 필요가 있음을 의미한다. 실제로, 항-C5 mAb 약물 에쿨리주맙은 PNH 및 aHUS 환자에서 각각 900 mg 및 1200 mg의 유지 용량으로 정맥 주사를 통해 2주마다 제공되어야 한다. 더 오래 지속되는 2세대 항-C5 mAb 라불리주맙이 주사 빈도를 매 8주로 줄이기 위해 개발되었지만 라불리주맙의 유지 용량은 주사당 3300 mg으로 증가하였다. 또한 에쿨리주맙과 라불리주맙 모두 약 50%의 PNH 치료를 받은 환자에서 LDH와 헤모글로빈 수치를 정상화할 수 없었다. 표준 에쿨리주맙 요법을 받는 PNH 환자에서, 돌발성 용해가 자주 관찰되며 20-30%의 환자는 여전히 수혈 의존적이다. PNH 환자의 이들 미충족 의료 필요는 영향을 받은 혈액 세포에 대한 DAF 및 CD59 결핍으로 인해 C3 활성화 뿐만 아니라 MAC 매개 손상에 취약하다는 사실과 관련이 있다. 에쿨리주맙 및 라불리주맙과 같은 항-C5 mAb는 C5 매개 용혈을 억제할 수 있지만, 이들은 영향을 받은 RBC 상의 C3 활성화를 방지하지 않으며, 그 결과, RBC의 C3b 옵소닌화가 여전히 일어나고, 이는 세망내피계에서 C3B-옵소닌화된 RBC의 포식작용에 의해 야기되는 과정인 혈관외 용혈 (EVH)의 잘 인식된 현상을 초래한다. 또한, 연구에 따르면 C5 단계에서 RBC에 대한 보체 활성화를 차단하는 것은 효능에 한계가 있는 것으로 나타났다. 너무 많은 C5 전환효소가 이미 세포 표면에 조립되어 있으면 유한 결합력의 mAb로 C5 절단을 완전히 차단하는 것이 불가능해지기 때문이다. 이는 에쿨리주맙으로 치료된 PNH 환자에서 돌파 용해 현상을 설명할 수 있고, PNH 및 토끼 RBC 둘 다가 AP를 통한 C3 보체 활성화에 매우 민감하고 표면 상에 풍부한 C5 전환효소를 용이하게 조립할 수 있기 때문에, 항-C5 mAb가 생체외 검정에서 토끼 및 PNH RBC 세포의 완전한 용혈을 방지할 수 없는 이유를 설명할 수 있다. 예를 들어, C3 억제 고리형 펩타이드 또는 인자 H (FH)의 재조합 짧은 변이체의 사용을 통해, 보체 의존성 질환에서 C3 활성화를 표적화하려는 노력이 계속되고 있지만, 이러한 분자는 매우 불량한 약동학을 가지며, 크고 빈번한 (예를 들어, 매일) 투여를 필요로 한다.
따라서, C3 및 C5 활성을 모두 억제하여 말단 보체 매개 병리를 치료하는 데 더 높은 효능을 달성할 수 있을 뿐만 아니라 덜 빈번한 투여의 편리함을 제공할 수 있는 오래 지속되고 이기능성적인 보체 억제제가 당업계에 필요하다. 본 발명은 이들 및 기타 요구를 다루고 충족시킨다.
일 구현예에서, 본 발명은 인간 C5에 특이적으로 결합하는 항체 및 융합 단백질 파트너를 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 일 구현예에서, C5는 인간 C5이다. 일 구현예에서, 항체는 단클론성 항체이다. 일 구현예에서, 항체는 인간화 항체이다. 일 구현예에서, 항체는 키메라 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 전장 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, 및 scFv를 포함하지만 이에 국한되지 않는 항체 단편이다. 일부 구현예에서, 항체는 작제물, 예를 들어 항체 및 표적화 모이어티 또는 효과기 모이어티를 포함하는 융합 작제물의 일부이다. 일부 구현예에서, 항체는 항체 약물 접합체 작제물과 같은 접합체 작제물의 일부이다.
본 발명의 한 측면에서, 항체 융합 단백질은 C5에 대한 pH 의존성 결합을 나타낸다. 일부 구현예에서, pH 의존성 항체 융합 단백질은 보다 산성 pH(예를 들어, 엔도솜에서 발견되는 것과 같은 약 pH 5.8)에서보다 보다 중성인 pH(예를 들어, 혈액에서 발견되는 것과 같은 약 pH 7.4)에서 C5에 더 강하게 결합한다. 일부 구현예에서, pH 의존성 항체 융합 단백질은 중성 pH(예를 들어, 혈액에서 발견되는 것과 같은 약 pH 7.4)에서 보다 산성 pH(예를 들어, 엔도솜에서 발견되는 것과 같은 약 pH 5.8)에서 C5로부터 더 빠르게 해리된다.
일부 구현예에서, 항-C5 항체는 C5에 대한 pH 의존성 결합을 나타낸다. 일부 구현예에서, pH 의존성 항-C5 항체는 보다 산성 pH(예를 들어, 엔도솜에서 발견되는 것과 같은 약 pH 5.8)에서보다 보다 중성인 pH(예를 들어, 혈액에서 발견되는 것과 같은 약 pH 7.4)에서 C5에 더 강하게 결합한다. 일부 구현예에서, pH 의존성 항-C5 항체는 중성 pH(예를 들어, 혈액에서 발견되는 것과 같은 약 pH 7.4)에서 보다 산성 pH(예를 들어, 엔도솜에서 발견되는 것과 같은 약 pH 5.8)에서 C5로부터 더 빠르게 해리된다.
일 구현예에서, 융합 단백질은 보체 조절 단백질 또는 보체 조절 단백질의 단편을 포함한다. 일 구현예에서, 보체 조절 단백질 또는 보체 조절 단백질의 단편은 C3 전환효소의 억제제이다. 일 구현예에서, C3 전환효소는 대체 경로 C3 전환효소 C3bBb이다. 일 구현예에서, C3 전환효소는 전통적 경로 C3 전환효소 C4b2a이다. 일 구현예에서, 보체 조절 단백질 또는 보체 조절 단백질의 단편은 C3 또는 C5 활성화 이외의 보체 활성화 단계의 억제제이다. 다양한 구체예에서, 융합 단백질 파트너는 보체 수용체 1 (CR1) 또는 그의 단편, 멤브레인 보조인자 단백질 (MCP) 또는 그의 인자, C4b-결합 단백질 (C4BP) 또는 그의 단편, 붕괴 촉진 인자 (DAF) 또는 그의 단편, 아포지질단백질 E (ApoE) 또는 그의 단편, FH 단백질 또는 그의 단편, 인간 IgG4 또는 그의 단편, 링커, 또는 그의 임의의 조합을 포함한다. 일 구현예에서, FH의 단편은 FH 단백질의 짧은 공통 반복(SCR) 도메인 1-5를 포함한다. 일 구현예에서, DAF의 단편은 DAF의 세포외 도메인이다. 일 구현예에서, CR1의 단편은 CR1의 세포외 도메인의 선택된 SCR이다.
일 구현예에서, 융합 단백질은 항체에 결합된 융합 단백질 파트너를 포함한다. 일 구현예에서, 융합 단백질은 적어도 하나의 링커를 갖는 항체에 결합된 융합 단백질 파트너를 포함한다. 일 구현예에서, 융합 단백질은 링커 없이 항체에 결합된 융합 단백질 파트너를 포함한다. 일 구현예에서, 융합 단백질은 항체의 C-말단에 결합된 융합 단백질 파트너를 포함한다. 일 구현예에서, 융합 단백질은 항체의 N-말단에 결합된 융합 단백질 파트너를 포함한다.
일 구현예에서, 융합 단백질은 항-C5 mAb에 결합된 융합 단백질 파트너를 포함한다. 일 구현예에서, 융합 단백질은 적어도 하나의 링커로 항-C5 mAb에 결합된 융합 단백질 파트너를 포함한다. 일 구현예에서, 융합 단백질은 링커 없이 항-C5 mAb에 결합된 융합 단백질 파트너를 포함한다. 일 구현예에서, 융합 단백질은 항-C5 mAb의 C-말단에 결합된 융합 단백질 파트너를 포함한다. 일 구현예에서, 융합 단백질은 항-C5 mAb의 N-말단에 결합된 융합 단백질 파트너를 포함한다.
일 구현예에서, 융합 단백질은 항체의 VH 서열에 결합된 융합 단백질 파트너를 포함한다. 일 구현예에서, 융합 단백질은 적어도 하나의 링커로 항체의 VH 서열에 결합된 융합 단백질 파트너를 포함한다. 일 구현예에서, 융합 단백질은 링커 없이 항체의 VH 서열에 결합된 융합 단백질 파트너를 포함한다. 일 구현예에서, 융합 단백질은 항체의 VH 서열의 C-말단에 결합된 융합 단백질 파트너를 포함한다. 일 구현예에서, 융합 단백질은 항체의 VH 서열의 N-말단에 결합된 융합 단백질 파트너를 포함한다.
일 구현예에서, 융합 단백질은 항체의 VL 서열에 결합된 융합 단백질 파트너를 포함한다. 일 구현예에서, 융합 단백질은 적어도 하나의 링커로 항체의 VL 서열에 결합된 융합 단백질 파트너를 포함한다. 일 구현예에서, 융합 단백질은 링커 없이 항체의 VL 서열에 결합된 융합 단백질 파트너를 포함한다. 일 구현예에서, 융합 단백질은 항체의 VL 서열의 C-말단에 결합된 융합 단백질 파트너를 포함한다. 일 구현예에서, 융합 단백질은 항체의 VL 서열의 N-말단에 결합된 융합 단백질 파트너를 포함한다.
일 구현예에서, 항체는 하기 구성된 군으로부터 선택된 상보성-결정 영역 (CDR) 중 적어도 하나: VH-CDR1: 서열번호:3; VH-CDR2: 서열번호:4; VH-CDR3: 서열번호:5; VL-CDR1: 서열번호:8; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:11, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다. 일 구현예에서, 항체는 CDR: VH-CDR1: 서열번호:3; VH-CDR2: 서열번호:4; VH-CDR3: 서열번호:5; VL-CDR1: 서열번호:8; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:11, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다.
일 구현예에서, 항체는 서열번호:2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 또는 그의 변이체를 포함한다. 일 구현예에서, 항체는 서열번호:13의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 그의 변이체를 포함한다. 일 구현예에서, 항체는 서열번호:2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:13의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다.
일 구현예에서, 항체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR 중 적어도 하나: VH-CDR1: 서열번호:3; VH-CDR2: 서열번호:4; VH-CDR3: 서열번호:5; VL-CDR1: 서열번호:14; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다. 일 구현예에서, 항체는 CDR: VH-CDR1: 서열번호:3; VH-CDR2: 서열번호:4; VH-CDR3: 서열번호:5; VL-CDR1: 서열번호:14; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다.
일 구현예에서, 항체는 서열번호:2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 또는 그의 변이체를 포함한다. 일 구현예에서, 항체는 서열번호:16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 그의 변이체를 포함한다. 일 구현예에서, 항체는 서열번호:2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다.
일 구현예에서, 항체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR 중 적어도 하나: VH-CDR1: 서열번호:17; VH-CDR2: 서열번호:4; VH-CDR3: 서열번호:5; VL-CDR1: 서열번호:8; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다. 일 구현예에서, 항체는 CDR: VH-CDR1: 서열번호:17; VH-CDR2: 서열번호:4; VH-CDR3: 서열번호:5; VL-CDR1: 서열번호:8; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다.
일 구현예에서, 항체는 서열번호:19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 또는 그의 변이체를 포함한다. 일 구현예에서, 항체는 서열번호:7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 그의 변이체를 포함한다. 일 구현예에서, 항체는 서열번호:19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다.
일 구현예에서, 항체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR 중 적어도 하나: VH-CDR1: 서열번호:20; VH-CDR2: 서열번호:4; VH-CDR3: 서열번호:5; VL-CDR1: 서열번호:23; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다. 일 구현예에서, 항체는 CDR: VH-CDR1: 서열번호:20; VH-CDR2: 서열번호:4; VH-CDR3: 서열번호:5; VL-CDR1: 서열번호:23; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다.
일 구현예에서, 항체는 서열번호:22의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 또는 그의 변이체를 포함한다. 일 구현예에서, 항체는 서열번호:25의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 그의 변이체를 포함한다. 일 구현예에서, 항체는 서열번호:22의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:25의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다.
일 구현예에서, 항체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR 중 적어도 하나: VH-CDR1: 서열번호:3; VH-CDR2: 서열번호:26; VH-CDR3: 서열번호:5; VL-CDR1: 서열번호:8; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:29, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다. 일 구현예에서, 항체는 CDR: VH-CDR1: 서열번호:3; VH-CDR2: 서열번호:26; VH-CDR3: 서열번호:5; VL-CDR1: 서열번호:8; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:29, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다.
일 구현예에서, 항체는 서열번호:28의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 또는 그의 변이체를 포함한다. 일 구현예에서, 항체는 서열번호:31의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 그의 변이체를 포함한다. 일 구현예에서, 항체는 서열번호:28의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:31의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다.
일 구현예에서, 항체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR 중 적어도 하나: VH-CDR1: 서열번호:3; VH-CDR2: 서열번호:34; VH-CDR3: 서열번호:5; VL-CDR1: 서열번호:8; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다. 일 구현예에서, 항체는 CDR: VH-CDR1: 서열번호:3; VH-CDR2: 서열번호:34; VH-CDR3: 서열번호:5; VL-CDR1: 서열번호:8; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다.
일 구현예에서, 항체는 서열번호:36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 또는 그의 변이체를 포함한다. 일 구현예에서, 항체는 서열번호:7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 그의 변이체를 포함한다. 일 구현예에서, 항체는 서열번호:36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다.
일 구현예에서, 항체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR 중 적어도 하나: VH-CDR1: 서열번호:37; VH-CDR2: 서열번호:38; VH-CDR3: 서열번호:39; VL-CDR1: 서열번호:23; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다. 일 구현예에서, 항체는 CDR: VH-CDR1: 서열번호:37; VH-CDR2: 서열번호:38; VH-CDR3: 서열번호:39; VL-CDR1: 서열번호:23; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다.
일 구현예에서, 항체는 서열번호:41의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 또는 그의 변이체를 포함한다. 일 구현예에서, 항체는 서열번호:25의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 그의 변이체를 포함한다. 일 구현예에서, 항체는 서열번호:41의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:25의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다.
일 구현예에서, 항체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR 중 적어도 하나: VH-CDR1: 서열번호:42; VH-CDR2: 서열번호:43; VH-CDR3: 서열번호:44; VL-CDR1: 서열번호:23; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다. 일 구현예에서, 항체는 CDR: VH-CDR1: 서열번호:42; VH-CDR2: 서열번호:43; VH-CDR3: 서열번호:44; VL-CDR1: 서열번호:23; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다.
일 구현예에서, 항체는 서열번호:46의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 또는 그의 변이체를 포함한다. 일 구현예에서, 항체는 서열번호:25의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 그의 변이체를 포함한다. 일 구현예에서, 항체는 서열번호:46의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:25의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다.
일 구현예에서, 항체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR 중 적어도 하나: VH-CDR1: 서열번호:47; VH-CDR2: 서열번호:48; VH-CDR3: 서열번호:49; VL-CDR1: 서열번호:23; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다. 일 구현예에서, 항체는 CDR: VH-CDR1: 서열번호:47; VH-CDR2: 서열번호:48; VH-CDR3: 서열번호:49; VL-CDR1: 서열번호:23; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다.
일 구현예에서, 항체는 서열번호:51의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 또는 그의 변이체를 포함한다. 일 구현예에서, 항체는 서열번호:25의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 그의 변이체를 포함한다. 일 구현예에서, 항체는 서열번호:51의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:25의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다.
일 구현예에서, 항체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR 중 적어도 하나: VH-CDR1: 서열번호:52; VH-CDR2: 서열번호:53; VH-CDR3: 서열번호:54; VL-CDR1: 서열번호:23; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다. 일 구현예에서, 항체는 CDR: VH-CDR1: 서열번호:52; VH-CDR2: 서열번호:53; VH-CDR3: 서열번호:54; VL-CDR1: 서열번호:23; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다.
일 구현예에서, 항체는 서열번호:56의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 또는 그의 변이체를 포함한다. 일 구현예에서, 항체는 서열번호:25의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 그의 변이체를 포함한다. 일 구현예에서, 항체는 서열번호:56의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:25의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다.
일 구현예에서, 항체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR 중 적어도 하나: VH-CDR1: 서열번호:47; VH-CDR2: 서열번호:57; VH-CDR3: 서열번호:49; VL-CDR1: 서열번호:23; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다. 일 구현예에서, 항체는 CDR: VH-CDR1: 서열번호:47; VH-CDR2: 서열번호:57; VH-CDR3: 서열번호:49; VL-CDR1: 서열번호:23; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다.
일 구현예에서, 항체는 서열번호:59의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 또는 그의 변이체를 포함한다. 일 구현예에서, 항체는 서열번호:25의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 그의 변이체를 포함한다. 일 구현예에서, 항체는 서열번호:59의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:25의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다.
일 구현예에서, 항체는 서열번호:72의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 또는 그의 변이체를 포함한다. 일 구현예에서, 항체는 서열번호:74의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 그의 변이체를 포함한다. 일 구현예에서, 항체는 서열번호:72의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:74의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다.
일 구현예에서, 항체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR 중 적어도 하나: VH-CDR1: 서열번호:37; VH-CDR2: 서열번호:62; VH-CDR3: 서열번호:39; VL-CDR1: 서열번호:23; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다. 일 구현예에서, 항체는 CDR: VH-CDR1: 서열번호:37; VH-CDR2: 서열번호:62; VH-CDR3: 서열번호:39; VL-CDR1: 서열번호:23; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다.
일 구현예에서, 항체는 서열번호:76의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 또는 그의 변이체를 포함한다. 일 구현예에서, 항체는 서열번호:74의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 그의 변이체를 포함한다. 일 구현예에서, 항체는 서열번호:76의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:74의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다.
일 구현예에서, 항체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR 중 적어도 하나: VH-CDR1: 서열번호:42; VH-CDR2: 서열번호:65; VH-CDR3: 서열번호:44; VL-CDR1: 서열번호:23; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다. 일 구현예에서, 항체는 CDR: VH-CDR1: 서열번호:42; VH-CDR2: 서열번호:65; VH-CDR3: 서열번호:44; VL-CDR1: 서열번호:23; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다.
일 구현예에서, 항체는 서열번호:78의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 또는 그의 변이체를 포함한다. 일 구현예에서, 항체는 서열번호:74의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 그의 변이체를 포함한다. 일 구현예에서, 항체는 서열번호:78의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:74의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다.
일 구현예에서, 항체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR 중 적어도 하나: VH-CDR1: 서열번호:52; VH-CDR2: 서열번호:68; VH-CDR3: 서열번호:54; VL-CDR1: 서열번호:23; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다. 일 구현예에서, 항체는 CDR: VH-CDR1: 서열번호:52; VH-CDR2: 서열번호:68; VH-CDR3: 서열번호:54; VL-CDR1: 서열번호:23; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다.
일 구현예에서, 항체는 서열번호:80의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 또는 그의 변이체를 포함한다. 일 구현예에서, 항체는 서열번호:74의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 그의 변이체를 포함한다. 일 구현예에서, 항체는 서열번호:80의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:74의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다.
일 구현예에서, 항체는 mAbs L3-1, L1-2, H1-4, H1-8/L1-9, 및 H2-6/L3-5로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나이다. 일 구현예에서, 항체는 mAb H1-8/L1-9 변형이다.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호:4에 대한 VH CDR2 내의 위치 #4 (즉, P4)에서의 프롤린 잔기의 치환을 포함한다. 다양한 구현예에서, P4에서의 치환은 P4→F4 (즉, P4F), P4→L4 (즉, P4L), P4→M4 (즉, P4M), P4→W4 (즉, P4W), 또는 P4→I4 (즉, P4I)이다.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호:4에 대한 VH CDR2 내의 위치 #9 (즉, T9)에서의 트레오닌 잔기의 치환을 포함한다. 다양한 구현예에서, T9에서의 치환은 T9→H9 (즉, T9H), T9→F9 (즉, T9F), T9→L9 (즉, T9L), T9→M9 (즉, T9M), T9→W9 (즉, T9W), 또는 T9→I9 (즉, T9I)이다.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호:4에 대한 VH CDR2 내의 위치 #4 (즉, P4)에서의 프롤린 잔기의 치환, 및 서열번호:4에 대한 VH CDR2 내의 위치 #9 (즉, T9)에서의 트레오닌 잔기의 치환을 포함한다. 다양한 구현예에서, P4에서의 치환은 P4→F4 (즉, P4F), P4→L4 (즉, P4L), P4→M4 (즉, P4M), P4→W4 (즉, P4W), 또는 P4→I4 (즉, P4I)이고; 그리고 T9에서의 치환은 T9→H9 (즉, T9H), T9→F9 (즉, T9F), T9→L9 (즉, T9L), T9→M9 (즉, T9M), T9→W9 (즉, T9W), 또는 T9→I9 (즉, T9I)이다.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호:5에 대한 VH CDR3 내의 위치 #16 (즉, V16)에서의 발린 잔기의 치환을 포함한다. 다양한 구현예에서, V16에서의 치환은 V16→F16 (즉, V16F), V16→E16 (즉, V16E) 또는 V16→W16 (즉, V16W)이다.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호:20에 대한 VH CDR1 내의 위치 #9 (즉, L9)에서의 류신 잔기의 치환을 포함한다. 다양한 구현예에서, L9에서의 치환은 L9→W9 (즉, L9W), L9→I9 (즉, L9I), L9→V9 (즉, L9V), L9→Y9 (즉, L9Y), 또는 L9→F9 (즉, L9F)이다.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호:4에 대한 VH CDR2 내의 프롤린 4 (즉, P4), 서열번호:4에 대한 VH CDR2 내의 트레오닌 9 (즉, T9), 서열번호:5에 대한 VH CDR3 내의 발린 16 (즉, V16), 및 서열번호:20에 대한 VH CDR1 내의 류신 9 (즉, L9)로 이루어진 군들 중 둘 이상에서의 치환을 포함한다. 다양한 구현예에서, 서열번호:4에 대한 VH CDR2 내의 프롤린 4 (즉, P4), 서열번호:5에 대한 VH CDR3 내의 발린 16 (즉, V16), 및 서열번호:20에 대한 VH CDR1 내의 류신 9 (즉, L9)로 이루어진 군들 중 둘 이상에서의 치환을 포함하는 항-C5 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 L9I/P4M, L9I/P4W, L9I/P4F, L9F/P4M, L9F/P4W, L9F/P4F, L9I/P4M/V16W, L9I/P4W/V16W, L9I/P4F/V16W, L9F/P4M/V16W, L9F/P4W/V16W, L9F/P4F/V16W, L9I/P4M/V16E, L9I/P4W/V16E, L9I/P4F/V16E, L9F/P4M/V16E, L9F/P4W/V16E, L9F/P4F/V16E, L9I/P4M/T9H/V16W, L9I/P4W/T9H/V16W, L9I/P4F/T9H/V16W, L9F/P4M/T9H/V16W, L9F/P4W/T9H/V16W, L9F/P4F/T9H/V16W, L9I/P4M/T9H/V16E, L9I/P4W/T9H/V16E, L9I/P4F/T9H/V16E, L9F/P4M/T9H/V16E, L9F/P4W/T9H/V16E, 및 L9F/P4F/T9H/V16E로 이루어진 군으로부터 선택된 2개 이상의 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 개체에서 보체 경로 매개 질환 또는 장애를 치료하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 항-C5 항체 또는 융합 단백질을 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 질환 또는 장애는 적어도 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 황반 변성 (MD), 연령 관련 황반 변성 (AMD), 허혈 재관류 손상, 관절염, 류마티스성 관절염, 천식, 알러지성 천식, 루푸스, 궤양성 대장염, 뇌졸중, 수술 후 전신 염증 증후군, 만성적 폐쇄성 폐 질환 (COPD), PNH 증후군, 중증 근무력증, 시신경척수염, (NMO), 다발성 경화증, 지연된 이식 기능, 항체 매개 거부, aHUS, 망막 중심 정맥 폐쇄 (CRVO), 망막 중심 동맥 폐색 (CRAO), 수포성 표피박리증, 패혈증, 장기 이식, 염증 (심폐 바이패스 수술 및 신장 투석과 연관된 염증을 포함하지만 이에 국한되지 않음), C3 사구체병증, 막성 신병증, IgA 신병증, 사구체신염 (항-중성구 세포질 항체 (ANCA) 매개 사구체신염, 루푸스 신장염, 및 그의 조합을 포함하지만 이에 국한되지 않음), ANCA 매개 혈관염, 시가 독소 유도된 HUS, 및 항인지질 항체-유도된 임신 손실, 또는 그의 임의의 조합. 일부 구현예에서, AP 매개 질환은 C3 사구체병증이다. 일부 구현예에서, AP 매개 질환은 황반 변성, 예컨대 연령 관련 황반 변성이다. 일 구현예에서, 항-C5 항체 또는 융합 단백질의 투여는 C3a 또는 C3b 단백질의 생성을 억제한다. 일 구현예에서, 융합 단백질의 투여는 C5a 또는 C5b 단백질의 생성을 억제한다. 일 구현예에서, 항-C5 항체 또는 융합 단백질의 투여는 C3a 또는 C3b 단백질의 생성을 억제하거나, C5a 또는 C5b 단백질의 생성을 억제하거나, 또는 그의 임의의 조합이다.
일 구현예에서, 본 발명은 개체의 보체계의 활성을 감소시키는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 장관 투여, 비경구 투여, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 투여 경로를 통해 개체에게 융합 단백질을 투여하는 것을 포함하고, 그리고 융합 단백질은 하기의 아미노산 서열을 갖는 6개의 상보성 결정 영역: VH-CDR1: 서열번호:3; VH-CDR2: 서열번호:4; VH-CDR3: 서열번호:5; VL-CDR1: 서열번호:8; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다. 일 구현예에서, 융합 단백질은 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, scFv, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 단편을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 개체의 보체계의 활성을 감소시키는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 장관 투여, 비경구 투여, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 투여 경로를 통해 개체에게 융합 단백질을 투여하는 것을 포함하고, 그리고 융합 단백질은 하기의 아미노산 서열을 갖는 6개의 상보성 결정 영역: VH-CDR1: 서열번호:3; VH-CDR2: 서열번호:4; VH-CDR3: 서열번호:5; VL-CDR1: 서열번호:8; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:11, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다. 일 구현예에서, 융합 단백질은 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, scFv, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 단편을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 개체의 보체계의 활성을 감소시키는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 장관 투여, 비경구 투여, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 투여 경로를 통해 개체에게 융합 단백질을 투여하는 것을 포함하고, 그리고 융합 단백질은 하기의 아미노산 서열을 갖는 6개의 상보성 결정 영역: VH-CDR1: 서열번호:3; VH-CDR2: 서열번호:4; VH-CDR3: 서열번호:5; VL-CDR1: 서열번호:14; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다. 일 구현예에서, 융합 단백질은 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, scFv, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 단편을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 개체의 보체계의 활성을 감소시키는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 장관 투여, 비경구 투여, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 투여 경로를 통해 개체에게 융합 단백질을 투여하는 것을 포함하고, 그리고 융합 단백질은 하기의 아미노산 서열을 갖는 6개의 상보성 결정 영역: VH-CDR1: 서열번호:17; VH-CDR2: 서열번호:4; VH-CDR3: 서열번호:5; VL-CDR1: 서열번호:8; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다. 일 구현예에서, 융합 단백질은 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, scFv, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 단편을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 개체의 보체계의 활성을 감소시키는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 장관 투여, 비경구 투여, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 투여 경로를 통해 개체에게 융합 단백질을 투여하는 것을 포함하고, 그리고 융합 단백질은 하기의 아미노산 서열을 갖는 6개의 상보성 결정 영역: VH-CDR1: 서열번호:20; VH-CDR2: 서열번호:4; VH-CDR3: 서열번호:5; VL-CDR1: 서열번호:23; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다. 일 구현예에서, 융합 단백질은 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, scFv, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 단편을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 개체의 보체계의 활성을 감소시키는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 장관 투여, 비경구 투여, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 투여 경로를 통해 개체에게 융합 단백질을 투여하는 것을 포함하고, 그리고 융합 단백질은 하기의 아미노산 서열을 갖는 6개의 상보성 결정 영역: VH-CDR1: 서열번호:3; VH-CDR2: 서열번호:26; VH-CDR3: 서열번호:5; VL-CDR1: 서열번호:8; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:29, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다. 일 구현예에서, 융합 단백질은 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, scFv, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 단편을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 개체의 보체계의 활성을 감소시키는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 장관 투여, 비경구 투여, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 투여 경로를 통해 개체에게 융합 단백질을 투여하는 것을 포함하고, 그리고 융합 단백질은 하기의 아미노산 서열을 갖는 6개의 상보성 결정 영역: VH-CDR1: 서열번호:37; VH-CDR2: 서열번호:38; VH-CDR3: 서열번호:39; VL-CDR1: 서열번호:23; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다. 일 구현예에서, 융합 단백질은 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, scFv, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 단편을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 개체의 보체계의 활성을 감소시키는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 장관 투여, 비경구 투여, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 투여 경로를 통해 개체에게 융합 단백질을 투여하는 것을 포함하고, 그리고 융합 단백질은 하기의 아미노산 서열을 갖는 6개의 상보성 결정 영역: VH-CDR1: 서열번호:42; VH-CDR2: 서열번호:43; VH-CDR3: 서열번호:44; VL-CDR1: 서열번호:23; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다. 일 구현예에서, 융합 단백질은 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, scFv, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 단편을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 개체의 보체계의 활성을 감소시키는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 장관 투여, 비경구 투여, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 투여 경로를 통해 개체에게 융합 단백질을 투여하는 것을 포함하고, 그리고 융합 단백질은 하기의 아미노산 서열을 갖는 6개의 상보성 결정 영역: VH-CDR1: 서열번호:47; VH-CDR2: 서열번호:48; VH-CDR3: 서열번호:49; VL-CDR1: 서열번호:23; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다. 일 구현예에서, 융합 단백질은 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, scFv, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 단편을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 개체의 보체계의 활성을 감소시키는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 장관 투여, 비경구 투여, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 투여 경로를 통해 개체에게 융합 단백질을 투여하는 것을 포함하고, 그리고 융합 단백질은 하기의 아미노산 서열을 갖는 6개의 상보성 결정 영역: VH-CDR1: 서열번호:52; VH-CDR2: 서열번호:53; VH-CDR3: 서열번호:54; VL-CDR1: 서열번호:23; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다. 일 구현예에서, 융합 단백질은 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, scFv, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 단편을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 개체의 보체계의 활성을 감소시키는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 장관 투여, 비경구 투여, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 투여 경로를 통해 개체에게 융합 단백질을 투여하는 것을 포함하고, 그리고 융합 단백질은 하기의 아미노산 서열을 갖는 6개의 상보성 결정 영역: VH-CDR1: 서열번호:47; VH-CDR2: 서열번호:57; VH-CDR3: 서열번호:49; VL-CDR1: 서열번호:23; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다. 일 구현예에서, 융합 단백질은 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, scFv, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 단편을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 개체의 보체계의 활성을 감소시키는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 장관 투여, 비경구 투여, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 투여 경로를 통해 항체, 또는 융합 단백질 또는 그의 단편을 개체에게 투여하는 것을 포함하고, 그리고 항체는 하기의 아미노산 서열을 갖는 6개의 상보성 결정 영역: VH-CDR1: 서열번호:37; VH-CDR2: 서열번호:62; VH-CDR3: 서열번호:39; VL-CDR1: 서열번호:23; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다. 일 구현예에서, 항체는 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, scFv, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 단편이다.
일 구현예에서, 본 발명은 개체의 보체계의 활성을 감소시키는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 장관 투여, 비경구 투여, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 투여 경로를 통해 항체, 또는 융합 단백질 또는 그의 단편을 개체에게 투여하는 것을 포함하고, 그리고 항체는 하기의 아미노산 서열을 갖는 6개의 상보성 결정 영역: VH-CDR1: 서열번호:42; VH-CDR2: 서열번호:65; VH-CDR3: 서열번호:44; VL-CDR1: 서열번호:23; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다. 일 구현예에서, 항체는 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, scFv, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 단편이다.
일 구현예에서, 본 발명은 개체의 보체계의 활성을 감소시키는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 장관 투여, 비경구 투여, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 투여 경로를 통해 항체, 또는 융합 단백질 또는 그의 단편을 개체에게 투여하는 것을 포함하고, 그리고 항체는 하기의 아미노산 서열을 갖는 6개의 상보성 결정 영역: VH-CDR1: 서열번호:52; VH-CDR2: 서열번호:68; VH-CDR3: 서열번호:54; VL-CDR1: 서열번호:23; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다. 일 구현예에서, 항체는 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, scFv, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 단편이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 인간 C5에 대한 항체를 포함하는 융합 단백질이고, 항체는 서열번호:2와 약 90% 초과 (예컨대 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것 초과) 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 (VH) 영역, 또는 그의 변이체를 갖는다. 일 구현예에서, 항체는 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, scFv, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 단편이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 인간 C5에 대한 항체를 포함하는 융합 단백질이고, 항체는 서열번호:7과 약 90% 초과 (예컨대 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것 초과) 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 (VL) 영역, 또는 그의 변이체를 갖는다. 일 구현예에서, 항체는 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, scFv, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 단편이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 인간 C5에 대한 항체를 포함하는 융합 단백질에 관한 것이고, 항체는 VH 영역 및 VL 영역을 갖되, VH 영역은 서열번호:2와 약 90% 초과 (예컨대 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것 초과) 동일한 아미노산 서열을 가지며, 그리고 VL 영역은 서열번호:7과 약 90% 초과 (예컨대 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것 초과) 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일 구현예에서, 항체는 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, scFv, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 단편이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 인간 C5에 대한 항체를 포함하는 융합 단백질이고, 항체는 서열번호:13과 약 90% 초과 (예컨대 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것 초과) 동일한 아미노산 서열을 갖는 VL 영역, 또는 그의 변이체를 갖는다. 일 구현예에서, 항체는 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, scFv, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 단편이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 인간 C5에 대한 항체를 포함하는 융합 단백질에 관한 것이고, 항체는 VH 영역 및 VL 영역을 갖되, VH 영역은 서열번호:2와 약 90% 초과 (예컨대 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것 초과) 동일한 아미노산 서열을 가지며, 그리고 VL 영역은 서열번호:13과 약 90% 초과 (예컨대 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것 초과) 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일 구현예에서, 항체는 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, scFv, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 단편이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 인간 C5에 대한 항체를 포함하는 융합 단백질에 관한 것이고, 항체는 서열번호:16과 약 90% 초과 (예컨대 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것 초과) 동일한 아미노산 서열을 갖는 VL 영역을 갖는다. 일 구현예에서, 항체는 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, scFv, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 단편이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 인간 C5에 대한 항체를 포함하는 융합 단백질에 관한 것이고, 항체는 VH 영역 및 VL 영역을 갖되, VH 영역은 서열번호:2와 약 90% 초과 (예컨대 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것 초과) 동일한 아미노산 서열을 가지며, 그리고 VL 영역은 서열번호:16과 약 90% 초과 (예컨대 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것 초과) 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일 구현예에서, 항체는 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, scFv, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 단편이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 인간 C5에 대한 항체를 포함하는 융합 단백질에 관한 것이고, 항체는 서열번호:19와 약 90% 초과 (예컨대 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것 초과) 동일한 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 갖는다. 일 구현예에서, 항체는 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, scFv, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 단편이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 인간 C5에 대한 항체를 포함하는 융합 단백질에 관한 것이고, 항체는 서열번호:7과 약 90% 초과 (예컨대 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것 초과) 동일한 아미노산 서열을 갖는 VL 영역을 갖는다. 일 구현예에서, 항체는 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, scFv, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 단편이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 인간 C5에 대한 항체를 포함하는 융합 단백질에 관한 것이고, 항체는 VH 영역 및 VL 영역을 갖되, VH 영역은 서열번호:19와 약 90% 초과 (예컨대 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것 초과) 동일한 아미노산 서열을 가지며, 그리고 VL 영역은 서열번호:7과 약 90% 초과 (예컨대 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것 초과) 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일 구현예에서, 항체는 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, scFv, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 단편이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 인간 C5에 대한 항체를 포함하는 융합 단백질에 관한 것이고, 항체는 서열번호:22와 약 90% 초과 (예컨대 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것 초과) 동일한 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 갖는다. 일 구현예에서, 항체는 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, scFv, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 단편이다.
일 구현예에서, 본 발명은 인간 C5에 대한 항체를 포함하는 융합 단백질에 관한 것이고, 항체는 서열번호:25와 약 90% 초과 (예컨대 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것 초과) 동일한 아미노산 서열을 갖는 VL 영역을 갖는다. 일 구현예에서, 항체는 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, scFv, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 단편이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 인간 C5에 대한 항체를 포함하는 융합 단백질에 관한 것이고, 항체는 VH 영역 및 VL 영역을 갖되, VH 영역은 서열번호:22와 약 90% 초과 (예컨대 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것 초과) 동일한 아미노산 서열을 가지며, 그리고 VL 영역은 서열번호:25와 약 90% 초과 (예컨대 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것 초과) 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일 구현예에서, 항체는 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, scFv, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 단편이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 인간 C5에 대한 항체를 포함하는 융합 단백질에 관한 것이고, 항체는 서열번호:28과 약 90% 초과 (예컨대 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것 초과) 동일한 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 갖는다. 일 구현예에서, 항체는 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, scFv, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 단편이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 인간 C5에 대한 항체를 포함하는 융합 단백질에 관한 것이고, 항체는 서열번호:31과 약 90% 초과 (예컨대 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것 초과) 동일한 아미노산 서열을 갖는 VL 영역을 갖는다. 일 구현예에서, 항체는 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, scFv, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 단편이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 인간 C5에 대한 항체를 포함하는 융합 단백질에 관한 것이고, 항체는 VH 영역 및 VL 영역을 갖되, VH 영역은 서열번호:28과 약 90% 초과 (예컨대 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것 초과) 동일한 아미노산 서열을 가지며, 그리고 VL 영역은 서열번호:31과 약 90% 초과 (예컨대 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것 초과) 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일 구현예에서, 항체는 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, scFv, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 단편이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 인간 C5에 대한 항체를 포함하는 융합 단백질에 관한 것이고, 항체는 서열번호:41과 약 90% 초과 (예컨대 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것 초과) 동일한 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 갖는다. 일 구현예에서, 항체는 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, scFv, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 단편이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 인간 C5에 대한 항체를 포함하는 융합 단백질에 관한 것이고, 항체는 VH 영역 및 VL 영역을 갖되, VH 영역은 서열번호:41과 약 90% 초과 (예컨대 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것 초과) 동일한 아미노산 서열을 가지며, 그리고 VL 영역은 서열번호:25와 약 90% 초과 (예컨대 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것 초과) 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일 구현예에서, 항체는 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, scFv, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 단편이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 인간 C5에 대한 항체를 포함하는 융합 단백질에 관한 것이고, 항체는 서열번호:46과 약 90% 초과 (예컨대 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것 초과) 동일한 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 갖는다. 일 구현예에서, 항체는 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, scFv, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 단편이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 인간 C5에 대한 항체를 포함하는 융합 단백질에 관한 것이고, 항체는 VH 영역 및 VL 영역을 갖되, VH 영역은 서열번호:46과 약 90% 초과 (예컨대 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것 초과) 동일한 아미노산 서열을 가지며, 그리고 VL 영역은 서열번호:25와 약 90% 초과 (예컨대 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것 초과) 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일 구현예에서, 항체는 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, scFv, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 단편이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 인간 C5에 대한 항체를 포함하는 융합 단백질에 관한 것이고, 항체는 서열번호:51과 약 90% 초과 (예컨대 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것 초과) 동일한 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 갖는다. 일 구현예에서, 항체는 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, scFv, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 단편이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 인간 C5에 대한 항체를 포함하는 융합 단백질에 관한 것이고, 항체는 VH 영역 및 VL 영역을 갖되, VH 영역은 서열번호:51과 약 90% 초과 (예컨대 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것 초과) 동일한 아미노산 서열을 가지며, 그리고 VL 영역은 서열번호:25와 약 90% 초과 (예컨대 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것 초과) 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일 구현예에서, 항체는 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, scFv, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 단편이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 인간 C5에 대한 항체를 포함하는 융합 단백질에 관한 것이고, 항체는 서열번호:56과 약 90% 초과 (예컨대 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것 초과) 동일한 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 갖는다. 일 구현예에서, 항체는 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, scFv, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 단편이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 인간 C5에 대한 항체를 포함하는 융합 단백질에 관한 것이고, 항체는 VH 영역 및 VL 영역을 갖되, VH 영역은 서열번호:56과 약 90% 초과 (예컨대 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것 초과) 동일한 아미노산 서열을 가지며, 그리고 VL 영역은 서열번호:25와 약 90% 초과 (예컨대 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것 초과) 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일 구현예에서, 항체는 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, scFv, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 단편이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 인간 C5에 대한 항체를 포함하는 융합 단백질에 관한 것이고, 항체는 서열번호:59와 약 90% 초과 (예컨대 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것 초과) 동일한 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 갖는다. 일 구현예에서, 항체는 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, scFv, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 단편이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 인간 C5에 대한 항체를 포함하는 융합 단백질에 관한 것이고, 항체는 VH 영역 및 VL 영역을 갖되, VH 영역은 서열번호:59와 약 90% 초과 (예컨대 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것 초과) 동일한 아미노산 서열을 가지며, 그리고 VL 영역은 서열번호:25와 약 90% 초과 (예컨대 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것 초과) 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일 구현예에서, 항체는 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, scFv, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 단편이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 인간 C5에 대한 항체, 인간 C3에 대한 억제 활성을 갖는 항체 융합 단백질, 또는 그의 조합을 포함하는 융합 단백질이고, 항체 또는 항체 융합 단백질은 서열번호:72와 약 90% 초과 (예컨대 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것 초과) 동일한 아미노산 서열을 갖는 VH 영역, 또는 그의 변이체를 갖는다. 일 구현예에서, 항체는 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, scFv, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 단편이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 인간 C5에 대한 항체, 인간 C3에 대한 억제 활성을 갖는 항체 융합 단백질, 또는 그의 조합을 포함하는 융합 단백질이고, 항체 또는 항체 융합 단백질은 서열번호:74와 약 90% 초과 (예컨대 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것 초과) 동일한 아미노산 서열을 갖는 VL 영역, 또는 그의 변이체를 갖는다. 일 구현예에서, 항체는 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, scFv, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 단편이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 인간 C5에 대한 항체, 인간 C3에 대한 억제 활성을 갖는 항체 융합 단백질, 또는 그의 조합을 포함하는 융합 단백질에 관련되고, 항체 또는 항체 융합 단백질은 VH 영역 및 VL 영역을 갖되, VH 영역은 서열번호:72와 약 90% 초과 (예컨대 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것 초과) 동일한 아미노산 서열을 가지며, 그리고 VL 영역은 서열번호:74와 약 90% 초과 (예컨대 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것 초과) 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일 구현예에서, 항체는 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, scFv, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 단편이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 인간 C5에 대한 항체, 인간 C3에 대한 억제 활성을 갖는 항체 융합 단백질, 또는 그의 조합을 포함하는 융합 단백질이고, 항체 또는 항체 융합 단백질은 서열번호:76과 약 90% 초과 (예컨대 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것 초과) 동일한 아미노산 서열을 갖는 VH 영역, 또는 그의 변이체를 갖는다. 일 구현예에서, 항체는 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, scFv, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 단편이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 인간 C5에 대한 항체, 인간 C3에 대한 억제 활성을 갖는 항체 융합 단백질, 또는 그의 조합을 포함하는 융합 단백질에 관련되고, 항체 또는 항체 융합 단백질은 VH 영역 및 VL 영역을 갖되, VH 영역은 서열번호:76과 약 90% 초과 (예컨대 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것 초과) 동일한 아미노산 서열을 가지며, 그리고 VL 영역은 서열번호:74와 약 90% 초과 (예컨대 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것 초과) 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일 구현예에서, 항체는 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, scFv, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 단편이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 인간 C5에 대한 항체, 인간 C3에 대한 억제 활성을 갖는 항체 융합 단백질, 또는 그의 조합을 포함하는 융합 단백질이고, 항체 또는 항체 융합 단백질은 서열번호:78과 약 90% 초과 (예컨대 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것 초과) 동일한 아미노산 서열을 갖는 VH 영역, 또는 그의 변이체를 갖는다. 일 구현예에서, 항체는 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, scFv, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 단편이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 인간 C5에 대한 항체, 인간 C3에 대한 억제 활성을 갖는 항체 융합 단백질, 또는 그의 조합을 포함하는 융합 단백질에 관련되고, 항체 또는 항체 융합 단백질은 VH 영역 및 VL 영역을 갖되, VH 영역은 서열번호:78과 약 90% 초과 (예컨대 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것 초과) 동일한 아미노산 서열을 가지며, 그리고 VL 영역은 서열번호:74와 약 90% 초과 (예컨대 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것 초과) 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일 구현예에서, 항체는 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, scFv, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 단편이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 인간 C5에 대한 항체, 인간 C3에 대한 억제 활성을 갖는 항체 융합 단백질, 또는 그의 조합을 포함하는 융합 단백질이고, 항체 또는 항체 융합 단백질은 서열번호:80과 약 90% 초과 (예컨대 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것 초과) 동일한 아미노산 서열을 갖는 VH 영역, 또는 그의 변이체를 갖는다. 일 구현예에서, 항체는 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, scFv, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 단편이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 인간 C5에 대한 항체, 인간 C3에 대한 억제 활성을 갖는 항체 융합 단백질, 또는 그의 조합을 포함하는 융합 단백질에 관련되고, 항체 또는 항체 융합 단백질은 VH 영역 및 VL 영역을 갖되, VH 영역은 서열번호:80과 약 90% 초과 (예컨대 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것 초과) 동일한 아미노산 서열을 가지며, 그리고 VL 영역은 서열번호:74와 약 90% 초과 (예컨대 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것 초과) 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일 구현예에서, 항체는 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, scFv, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 단편이다.
일 구현예에서, 본 발명은 본원의 다른 곳에 기재된 융합 단백질 중 적어도 하나를 포함하는 세포에 관련된다. 일부 구현예에서, 세포는 본원의 다른 곳에 기재된 융합 단백질 중 적어도 하나를 생성한다. 일 구현예에서, 세포는 하이브리도마이다.
일 구현예에서, 본 발명은 본원의 다른 곳에 기재된 융합 단백질 중 적어도 하나를 포함하는 세포주이다. 일부 구현예에서, 세포주는 본원의 다른 곳에 기재된 융합 단백질 중 적어도 하나를 생성한다. 일부 구현예에서, 세포주는 하이브리도마 세포주이다.
일 구현예에서, 본 발명은 유전적 변형 비-인간 동물에 관련된다. 일 구현예에서, 유전적 변형 비-인간 동물은 인간 C5를 발현한다. 일 구현예에서, 유전적 변형 비-인간 동물은 설치류이다. 일 구현예에서, 유전적 변형 비-인간 동물은 마우스이다. 일 구현예에서, 유전적 변형 비-인간 동물은 NOD/SCID 마우스이다. 일 구현예에서, 유전적 변형 비-인간 동물은 FcRn/SCID 마우스이다.
일 구현예에서, 본 발명은 항-C5 항체 모이어티 및 FH 또는 그의 기능적 단편을 포함하는 융합 단백질에 관련된다. 일부 구현예에서, 항-C5 모이어티는 적어도 하나의 히스티딘 치환을 포함한다. 일 구현예에서, 항-C5 모이어티는 IgG4 사슬을 포함한다. 일 구현예에서, IgG4 사슬은 PLA 돌연변이를 포함한다. 일 구현예에서, FH 또는 그의 기능적 단편은 FH 단백질의 도메인 1-5를 포함한다.
본 발명의 예시적인 구현예에 대한 다음의 상세한 설명뿐만 아니라 전술한 요약은 첨부된 도면과 함께 읽을 때 더 잘 이해될 것이다. 그러나, 본 발명은 도면에 도시된 구현예의 정확한 배열 및 수단으로 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 도면에서:
도 1은 mAb 2G1(인간화 2G1 VH-11801)의 인간화 가변 중쇄(VH) 및 mAb 2G1(인간화 2G1 VL-1901)의 인간화 가변 경쇄(VL)의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 도시한다. 인간화는 뮤린 mAb 2G1 VH로부터 생식계 인코딩된 인간 VH 프레임 (11801)로의 CDR 그레이팅 및 뮤린 mAb 2G1 VL로부터 생식계 인코딩된 인간 VL 프레임 (1901)으로의 CDR 그레이팅에 의해 달성되었다. 신호 펩타이드의 아미노산 서열은 밑줄이 그어져 있고 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열은 굵고 음영으로 표시된다.
도 2는 VL-CDR3에서 Q→H 치환을 갖는 mAb L3-1, 인간화 VH-11801 및 인간화 VL-1901의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 도시한다.
도 3은 VL-CDR1에서 T→H 치환을 갖는 mAb L1-2, 인간화 VH-11801 및 인간화 VL-1901의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 도시한다.
도 4는 VH-CDR1에서 I→H 치환을 갖는 mAb H1-4, 인간화 VH-11801 및 인간화 VL-1901의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 도시한다.
도 5는 VH-CDR1에서 N→H 치환 및 VL-CDR1에서 Y→H 치환을 갖는 mAb H1-8/L1-9, 인간화된 VH-11801 및 인간화된 VL-1901의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 도시한다.
도 6은 VH-CDR2에서 Y→H 치환 및 VL-CDR3에서 E→H 치환을 갖는 mAb H2-6/L3-5, 인간화된 VH-11801 및 인간화된 VL-1901의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 도시한다.
도 7은 pH 5.8 및 pH 7.4에서 모 인간화 mAb 11801(VH-11801(서열번호 2) 및 VL-1901(서열번호 7))의 C5 결합 및 해리의 옥텟 추적을 도시한다.
도 8은 pH 5.8 및 pH 7.4에서 mAb L3-1의 C5 결합 및 해리의 옥텟 추적을 도시한다.
도 9는 pH 5.8 및 pH 7.4에서 mAb L1-2의 C5 결합 및 해리의 옥텟 추적을 도시한 것이다.
도 10은 pH 5.8 및 pH 7.4에서 mAb H1-4의 C5 결합 및 해리의 옥텟 추적을 도시한다.
도 11은 pH 5.8 및 pH 7.4에서 mAb H2-6/L3-5의 C5 결합 및 해리의 옥텟 추적을 도시한 것이다.
도 12는 pH 5.8 및 pH 7.4에서 mAb H1-8/L1-9의 C5 결합 및 해리의 옥텟 추적을 도시한 것이다.
도 13은 모 인간화 mAb 11801 (VH-11801 (서열번호:2) 및 VL-1901 (서열번호:7)), 및 그것의 변이체 mAb L1-2, mAb L3-1, 및 mAb H2-6/L3-5의 C5 억제 효과를 평가하기 위해 전통적 경로 보체 매개 양 적혈구 세포 용해 검정의 결과를 도시한다.
도 14는 모 인간화 mAb 11801 (VH-11801 (서열번호:2) 및 VL-1901 (서열번호:7)) 및 변이체 mAb H1-8/L1-9의 C5 억제 효과를 평가하기 위해 전통적 경로 보체 매개 양 적혈구 세포 용해 검정의 결과를 도시한다.
도 15는 모 인간화 mAb 11801 (VH-11801 (서열번호:2) 및 VL-1901 (서열번호:7)) 및 변이체 mAb H1-4 및 mAb L3-1의 C5 억제 효과를 평가하기 위해 전통적 경로 보체 매개 양 적혈구 세포 용해 검정의 결과를 도시한다.
도 16은 인간 C5를 발현하도록 유전적으로 변형된 NOD/SCID 마우스의 혈장에서 인간 C5의 수준을 평가하는 ELISA 검정의 결과를 도시한다. M1, M3, M4 및 M5는 4개의 대표적인 마우스를 지정한다.
도 17은 재조합 키메라 인간 IgG4 mAbs H1-4, H1-8/L1-9, H2-6/L3-5, L3-1 또는 L1-2를 주사한 후 인간 C5를 발현하도록 유전적으로 변형된 NOD/SCID 마우스의 혈장에서 인간 IgG4의 수준을 평가하는 검정의 결과를 도시한다.
도 18은 인간 C5를 발현하기 위해 유전적으로 변형된 2 마리의 NOD/SCID 마우스 (Mo-03 및 Mo-05)에서 모 인간화 mAb 2G1 (VH-11801 (서열번호:2) 및 VL-1901 (서열번호:7))의 약력학을 평가하는 전통적 경로 보체 매개 닭 적혈구 검정의 결과를 도시한다.
도 19는 인간 C5를 발현하기 위해 유전적으로 변형된 NOD/SCID 마우스에서 재조합 키메라 인간 IgG4 mAbs L3-1, L1-2, H1-4, H1-8/L1-9 및 H2-6/L3-5의 약력학을 평가하는 전통적 경로 보체 매개 닭 적혈구 분석의 결과를 도시한다.
도 20은 서열번호:20에 대한 VH CDR1 내의 류신 9 (즉, L9), 서열번호:4에 대한 VH CDR2 내의 프롤린 4 (즉, P4), 및/또는 서열번호:5에 대한 VH CDR3 내의 발린 16 (즉, V16) (즉, L9→W9 (즉, L9W), L9→I9 (즉, L9I), L9→V9 (즉, L9V), L9→Y9 (즉, L9Y), L9→F9 (즉, L9F), P4→F4 (즉, P4F), P4→L4 (즉, P4L), P4→M4 (즉, P4M), P4→W4 (즉, P4W), P4→I4 (즉, P4I), V16→F16 (즉, V16F), V16→E16 (즉, V16E) 및 V16→W16 (즉, V16W))에서 적어도 하나의 치환을 갖는 MAb H1-8/L1-9 ScFV 변이체의 C5에 대한 pH 7.4에서의 개선된 결합을 입증하는 ELISA 검정의 결과를 도시한다. mAb H1-8/L1-9 ScFV 변이체의 결합은 열 3(OD450) 및 4(OD450 확인)에 나타내고 모 mAb H1-8/L1-9 ScFV의 결합은 열 8(WT/OD450)에 나타낸다.
도 21은 인간 IgG4로서 Expi-CHO 세포에서 발현된 mAb H1-8/L1-9 변이체의 상대적인 C5 결합 친화도를 평가하는 옥텟 검정의 결과를 도시한다. Expi-CHO 세포를 명시된 H1-8 VH 변이체로 형질감염시키고 L1-9 VL (서열번호: 23) 및 세포 배양 상청액을 형질감염 2일 후에 평가하였다. 주어진 세포 배양 상청액에 대해, 항체 결합 반응에 대한 C5 결합 반응의 비율을 계산하고 C5 결합 친화도의 척도로 사용하였다. 서열번호:20에 대한 VH CDR1 내의 류신 9 (즉, L9), 서열번호:4에 대한 VH CDR2 내의 프롤린 4 (즉, P4), 및/또는 서열번호:5에 대한 VH CDR3 내의 발린 16 (즉, V16) (즉, L9→W9 (즉, L9W), L9→I9 (즉, L9I), L9→V9 (즉, L9V), L9→Y9 (즉, L9Y), L9→F9 (즉, L9F), P4→F4 (즉, P4F), P4→L4 (즉, P4L), P4→M4 (즉, P4M), P4→W4 (즉, P4W), P4→I4 (즉, P4I), V16→F16 (즉, V16F), V16→E16 (즉, V16E) 및 V16→W16 (즉, V16W))에서 적어도 하나의 치환을 갖는 mAb H1-8/L1-9 IgG4 변이체를 이용한 형질감염 실험의 2개의 별개의 옥텟 검정으로부터 계산된 비가 도면에 도시되어 있다.
도 22는 각각 C5 및 mAb H1-8/L1-9 변이체의 pH 7.4 및 pH 5.8에서의 해리 속도를 평가하는 옥텟 검정의 결과를 도시한다. 회합 상에서 해리 상으로 전환한 후 피크 C5 결합 반응으로부터 pH 7.4 및 pH 5.8에서 각각의 mAb에 대한 % 감소가 계산되었다. 서열번호:20에 대한 VH CDR1 내의 류신 9 (즉, L9), 서열번호:4에 대한 VH CDR2 내의 프롤린 4 (즉, P4), 및/또는 서열번호:5에 대한 VH CDR3 내의 발린 16 (즉, V16) (즉, L9→W9 (즉, L9W), L9→I9 (즉, L9I), L9→V9 (즉, L9V), L9→Y9 (즉, L9Y), L9→F9 (즉, L9F), P4→F4 (즉, P4F), P4→L4 (즉, P4L), P4→M4 (즉, P4M), P4→W4 (즉, P4W), P4→I4 (즉, P4I), V16→F16 (즉, V16F), V16→E16 (즉, V16E) 및 V16→W16 (즉, V16W))에서 적어도 하나의 치환을 갖는 mAb H1-8/L1-9 IgG4 변이체를 이용한 형질감염 실험의 2개의 별개의 옥텟 검정에서 % 감소를 계산하였다.
도 23은 18개의 조합 치환 변이체 (즉, L9I/P4M, L9I/P4W, L9I/P4F, L9F/P4M, L9F/P4W, L9F/P4F, L9I/P4M/V16W, L9I/P4W/V16W, L9I/P4F/V16W, L9F/P4M/V16W, L9F/P4W/V16W, L9F/P4F/V16W, L9I/P4M/V16E, L9I/P4W/V16E, L9I/P4F/V16E, L9F/P4M/V16E, L9F/P4W/V16E, 및 L9F/P4F/V16E)를 열거한다. 이러한 조합 변이체는 모 H1-8/L1-9 mAb에 비해 개선된 C5 결합 친화도를 나타내고 차등 pH 7.4 및 pH 5.8 해리 속도를 동시에 유지하는 mAb H1-8/L1-9 IgG4 (즉, L9I, L9F, P4M, P4W, P4F, V16E, V16W)의 7개의 단일 변이체로부터 유래되었다 (도 21 및 도 22).
도 24는 인간 IgG4로서 Expi-CHO 세포에서 발현된 mAb H1-8/L1-9 조합 치환 변이체의 상대적인 C5 결합 친화도를 평가하는 옥텟 검정의 결과를 도시한다. Expi-CHO 세포를 H1-8 VH 조합 치환 변이체로 형질감염시키고 세포 배양 상청액을 형질감염 2일 후에 평가하였다. 주어진 세포 배양 상청액에 대해, 항체 결합 반응에 대한 C5 결합 반응의 비율을 계산하고 C5 결합 친화도의 척도로 사용하였다. mAb H1-8/L1-9 조합 치환 변이체 L9I/P4M, L9I/P4W, L9I/P4F, L9F/P4M, L9F/P4W, L9F/P4F, L9I/P4M/V16W, L9I/P4W/V16W, L9I/P4F/V16W, L9F/P4M/V16W, L9F/P4W/V16W, L9F/P4F/V16W, L9I/P4M/V16E, L9I/P4W/V16E, L9I/P4F/V16E, L9F/P4M/V16E, L9F/P4W/V16E, 및 L9F/P4F/V16E를 사용한 형질감염 실험으로부터 계산된 비가 도면에 도시되어 있다.
도 25는 각각 C5 및 mAb H1-8/L1-9 조합 치환 변이체의 pH 7.4 및 pH 5.8에서의 해리 속도를 평가하는 옥텟 검정의 결과를 도시한다. 회합 상에서 해리 상으로 전환한 후 피크 C5 결합 반응으로부터 pH 7.4 및 pH 5.8에서 각각의 mAb에 대한 % 감소가 계산되었다. mAb H1-8/L1-9 IgG4 조합 치환 변이체 L9I/P4M, L9I/P4W, L9I/P4F, L9F/P4M, L9F/P4W, L9F/P4F, L9I/P4M/V16W, L9I/P4W/V16W, L9I/P4F/V16W, L9F/P4M/V16W, L9F/P4W/V16W, L9F/P4F/V16W, L9I/P4M/V16E, L9I/P4W/V16E, L9I/P4F/V16E, L9F/P4M/V16E, L9F/P4W/V16E, 및 L9F/P4F/V16E를 사용한 형질감염 실험에서 % 감소가 도면에서 계산되었다.
도 26은 VH CDR2의 위치 9에서 T에서 H로의 돌연변이에 상응하는 클론 14C6을 포함하는 mAb 1819 친화성 성숙 실험으로부터의 추가 scFV 돌연변이체의 pH 7.4에서의 C5-결합의 친화성을 평가하는 실험의 결과를 도시한다.
도 27은 VH CDR2의 위치 9에서 T에서 H로의 돌연변이에 상응하는 클론 14C6을 포함하는 mAb 1819 친화성 성숙 실험으로부터의 추가 scFV 돌연변이체의 pH 7.4 및 pH 5.8에서의 C5-결합의 차등 친화성을 평가하는 실험의 결과를 도시한다.
도 28은 pH 7.4 및 pH 5.8에서의 차등 결합에 따른 mAb 1819 친화성 성숙 실험으로부터 추가 scFV 돌연변이체의 순위를 매기는 실험의 결과를 도시하며, 클론 14C6이 이 돌연변이체 그룹 중에서 최상위 돌연변이체임을 보여준다. 클론 14C6은 VH CDR2의 위치 9에서 T에서 H로의 돌연변이에 해당한다.
도 29는 mAb H1-8/L1-9 변이체 IWW-VH (상단), VH-CDR1 내의 N→H 및 L→I 치환, VH-CDR2 내의 P→W 치환, 및 VH-CDR3 내의 V→W 치환을 갖는 인간화 VH-11801의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열; 뿐만 아니라 mAb H1-8/L1-9 변이체 IFW-VH (하단), VH-CDR1 내의 N→H 및 L→I 치환, VH-CDR2 내의 P→F 치환, 및 VH-CDR3 내의 V→W 치환을 갖는 인간화 VH-11801의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 도시한다.
도 30은 mAb H1-8/L1-9 변이체 FME-VH (상단), VH-CDR1 내의 N→H 및 L→F 치환, VH-CDR2 내의 P→M 치환, 및 VH-CDR3 내의 V→E 치환을 갖는 인간화 VH-11801의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열; 뿐만 아니라 mAb H1-8/L1-9 변이체 FMW-VH (하단), VH-CDR1 내의 N→H 및 L→F 치환, VH-CDR2 내의 P→M 치환, 및 VH-CDR3 내의 V→W 치환을 갖는 인간화 VH-11801의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 도시한다.
도 31은 mAb H1-8/L1-9 변이체 FMEH-VH, VH-CDR1 내의 N→H 및 L→F 치환, VH-CDR2 내의 P→M 및 T→H 치환, 및 VH-CDR3 내의 V→E 치환을 갖는 인간화 VH-11801의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 도시한다.
도 32는 pH 5.8 및 pH 7.4에서 재조합 키메라 인간 IgG4 mAb H1-8/L1-9, FMW, IFW, FME, 및 IWW의 C5 결합 및 해리의 옥텟 추적을 도시한다.
도 33은 pH 7.4 및 pH 5.8에서 재조합 키메라 인간 IgG4 mAb 11801 (VH-11801 (서열번호: 2) 및 VL-1901 (서열번호: 7), H1-8/L1-9, FMW, IFW, FME, 및 IWW에 대한 피크 값으로부터 해리된 C5 결합의 %를 나타낸다.
도 34는 모 인간화된 재조합 키메라 인간 IgG4 mAb H1-8/L1-9 (VH-11801 (서열번호:22) 및 VL-1901 (서열번호:25)), 및 그것의 변이체 IFW PLA (VH-11801 (서열번호:46) 및 VL-1901 (서열번호:25)), FME PLA (서열번호:51) 및 VL-1901 (서열번호:25)), IWW PLA (서열번호:41) 및 VL-1901 (서열번호:25)), 및 FMW PLA (서열번호:56) 및 VL-1901 (서열번호:25))의 C5 억제 효과를 평가하기 위해 전통적 경로 보체 매개 양 적혈구 세포 용해 검정의 결과를 도시한다.
도 35는 pH 5.8 및 pH 7.4에서 재조합 키메라 인간 IgG4 mAb H1-8/L1-9, FME, FMEH, FMW, 및 IFW의 C5 결합 및 해리의 옥텟 추적을 도시한다.
도 36은 pH 5.8 및 pH 7.4에서 정제된 재조합 키메라 인간 IgG4 PLA (서열번호: 61), mAb H1-8/L1-9, FME, FMEH, FMW, 및 IFW에 대한 피크 값으로부터 해리된 C5 결합의 %를 나타낸다.
도 37은 재조합 키메라 인간 IgG4 mAb FME PLA (서열번호:51) 및 VL-1901 (서열번호:25)), FMEH PLA (서열번호:59) 및 VL-1901 (서열번호:25)), FMW PLA (서열번호:56) 및 VL-1901 (서열번호:25)), 및 IFW PLA (VH-11801 (서열번호:46) 및 VL-1901 (서열번호:25))의 C5 억제 효과를 평가하기 위해 전통적 경로 보체 매개 양 적혈구 세포 용해 검정의 결과를 도시한다.
도 38은 C5 인간화 FcRn/SCID 마우스에서 PK/PD 시험을 위한 재조합 키메라 인간 IgG4 PLA mAb에서 인간 IgG4-Fc 도메인 돌연변이의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 도시한다.
도 39는 인간 C5 cDNA의 유체역학적 주입에 의해 생성된 C5 인간화 마우스의 혈장 C5 수준을 도시한다.
도 40은 재조합 키메라 인간 IgG4 PLA (서열번호: 61) mAbs IFW-PLA, FMW-PLA, 또는 FMEH-PLA를 주사한 후 인간 C5를 발현하도록 유전적으로 변형된 FcRn/SCID 마우스의 혈장에서 전체 인간 C5의 수준을 평가하는 검정의 결과를 도시한다.
도 41은 재조합 키메라 인간 IgG4 PLA (서열번호: 61) mAbs IFW-PLA, FMW-PLA, 또는 FMEH-PLA를 주사한 후 인간 C5를 발현하도록 유전적으로 변형된 FcRn/SCID 마우스의 혈장에서 전체 IgG4의 수준을 평가하는 검정의 결과를 도시한다.
도 42는 인간 C5를 발현하기 위해 유전적으로 변형된 FcRn/SCID 마우스에서 재조합 키메라 인간 IgG4 PLA (서열번호: 61) mAbs IFW-PLA, FMW-PLA, 또는 FMEH-PLA의 약력학을 평가하는 전통적 경로 보체 매개 닭 적혈구 분석의 결과를 도시한다.
도 43은 표적 인식 및 단백질 분해 절단의 캐스케이드를 포함하는 보체 활성화를 초래할 수 있는 3개의 상이한 경로를 도시한다. 모든 경로는 C3 활성화 단계에서 수렴된다.
도 44는 20개의 SCR 도메인으로 이루어진 인간 FH의 구조 및 인간 IgG4 항-C5 mAb/FH SCR1-5 융합 단백질의 구조를 도시한다.
도 45는 mAb H1-8/L1-9 변이체 FMEH-IgG4PLA-FH1-5의 VH 서열, VH-CDR1 내의 N→H 및 L→F 치환, VH-CDR2 내의 P→M 및 T→H 치환, 및 VH-CDR3 내의 V→E 치환을 갖는 인간화 VH-11801의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 도시한다.
도 46은 MAb H1-8/L1-9 변이체 FMEH-IgG4PLA-FH1-5의 VL 서열, VL-CDR1 내의 Y→H 치환을 갖는 인간화된 VL-1901의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 도시한다.
도 47은 항-C5 mAb FMEH-IgG4PLA (레인 1) 및 항-C5 mAb/FH SCR1-5 융합 단백질 (FMEH-IgG4PLA-FH1-5) (레인 2)의 VH 및 VL 사슬을 보여주는 SDS 겔을 도시한다.
도 48은 pH 5.8 및 pH 7.4에서 항-C5 mAb FMEH-IgG4PLA 및 항-C5 mAb/FH SCR1-5 융합 단백질 FMEH-IgG4PLA-FH1-5의 C5 결합 및 해리의 옥텟 추적을 도시한다.
도 49는 pH 7.4 및 pH 5.8에서 항-C5 mAb FMEH-IgG4 및 항-C5 mAb/FH SCR1-5 융합 단백질, FMEH-IgG4PLA-FH1-5에 대한 피크 C5 결합으로부터 % 해리를 도시한다.
도 50은 항-C5 mAb FMEH-IgG4PLA, 항-C5 mAb/FH SCR1-5 융합 단백질, FMEH-IgG4PLA-FH1-5, 및 벤치마크 항-C5 mAbs 에쿨리주맙, 및 라불리주맙의 용혈 활성에 대한 억제 효과를 평가하기 위한 대체 경로 보체 매개 토끼 적혈구 용해 검정의 결과를 도시한다.
도 51은 FMEH-IgG4PLA, FMEH-IgG4PLA-FH1-5, 에쿨리주맙, 및 라불리주맙으로 처리된 용해되지 않은 토끼 RBC 상의 C3 단편 침착 수준을 도시한다.
도 52는 FMEH-IgG4PLA, FMEH-IgG4PLA-FH1-5, 에쿨리주맙, 및 라불리주맙을 주사한 후 다양한 시점에서 C5 인간화 FcRn/SCID 마우스의 혈장에서 인간 IgG4의 수준을 평가하는 검정의 결과를 도시한다.
도 53은 분자의 인간 IgG4 모이어티에 특이적인 검출 mAb를 사용하여 주사 후 다양한 시점에서 C5 인간화 FcRn/SCID 마우스의 혈장에서 FMEH-IgG4PLA-FH1-5의 수준을 평가하는 검정의 결과를 도시한다.
도 54는 분자의 FH SCR1-5 모이어티에 특이적인 검출 mAb를 사용하여 주사한 후 다양한 시점에서 C5 인간화 FcRn/SCID 마우스의 혈장에서 FMEH-IgG4PLA-FH1-5의 수준을 평가하는 검정의 결과를 도시한다.
도 55는 FMEH-IgG4PLA, FMEH-IgG4PLA-FH1-5, 에쿨리주맙, 및 라불리주맙을 주사한 후 다양한 시점에서 C5 인간화 FcRn/SCID 마우스의 혈장 중 인간 C5의 수준을 평가하는 ELISA 검정의 결과를 도시한다.
도 56은 FMEH-IgG4PLA, FMEH-IgG4PLA-FH1-5, 에쿨리주맙, 라불리주맙, 및 C5 고갈 인간 혈청을 주사한 후 다양한 시점에서 C5 인간화 FcRn/SCID 마우스에서 수집된 혈청을 사용하여 하이브리드 분석에서 대체 보체 경로를 통한 토끼 RBC 용해의 %를 도시한다.
도 57은 시험관내 PNH 환자 RBC 용혈에 대한 대표적인 결과를 도시한다(환자 #2). AP 완충액 중의 2E7 PNH 환자 RBC를 다양한 양의 FMEH-IgG4PLA-FH1-5, 에쿨리주맙 또는 라불리주맙의 존재 하에 35% HCl-산성 정상 인간 혈청과 혼합하였다. 혼합물을 37℃에서 40분 동안 인큐베이션하고 OD405에서 용혈을 판독하였다. (OD405(specific ab con.)-OD405(40mM EDTA))/((OD405(ab con.=0)-OD405(40mM EDTA)) *100% 공식을 사용하여 용해 %를 계산하였다. FMEH-IgG4PLA-FH1-5는 시험관 내에서 에쿨리주맙 및 라불리주맙보다 PNH 환자 RBC 용해를 더 강력하게 차단한다. 도 57은 인간 PNH 적혈구 산성화된 정상 인간 혈청 (35% AB 혈액형)의 대체 경로 보체 매개 용해에 대한 FMEH-IgG4PLA-FH1-5, 에쿨리주맙, 라불리주맙, 및 대조 IgG4의 비교 억제 활성 및 IC50 (μg/mL)을 도시한다.
도 58은 시험관내 항-C5 mAb 처리 후 PNH 환자 RBC 상의 C3b 코팅의 대표적인 FACS 분석 결과를 도시한다. 용혈 검정(시험관 내 도 57 PNH 환자 RBC 용혈 참조) 후, 용해되지 않은 RBC를 수집하고 DPBS로 세척하였다. 2E6 세포를 얼음 위에서 30분 동안 항-C3b 항체와 함께 인큐베이션한 후 FACS 분석을 하였다. C3b+/CD59- 세포 집단이 게이팅되고 분석된다. 결과는 PNH 환자 #2의 것이다. ND는 검출불가능을 의미한다. FMEH-IgG4PLA-FH1-5는 PNH 환자 RBC에서 C3b 침착을 효과적으로 차단하는 반면, 에쿨리주맙과 라불리주맙은 차단할 수 없었다. C3b-옵소닌 처리된 PNH 적혈구(Q4)는 에쿨리주맙 또는 라불리주맙으로 처리된 샘플에서 검출되었지만, FMEH-IgG4PLA-FH1-5로 처리된 샘플에서는 검출되지 않았다.
도 59는 시험관내 PNH 환자 RBC 용혈에 대한 대표적인 결과를 도시한다(환자 #3). AP 완충액 중의 5E6 PNH RBC를 지시된 바와 같이 다양한 양의 FMEH-IgG4PLA-FH1-5, 에쿨리주맙 또는 라불리주맙의 존재 하에 50% HCl-산성 정상 인간 혈청과 혼합하였다. 37℃에서 90분간 용혈이 일어났다. OD405에서 분광계를 사용하여 용혈을 판독하였다. 공식 (OD405(특이적 ab con.)-OD405(40mM EDTA))/((OD405(ab con.=0)-OD405(40mM EDTA)) *100%을 사용하여 용해 %를 계산하였다. FMEH-IgG4PLA-FH1-5는 시험관 내에서 에쿨리주맙 및 라불리주맙보다 PNH 환자 RBC 용해를 더 강력하게 차단한다.
도 60은 시험관내 항-C5 mAb 처리 후 PNH 환자 #3 RBC 상의 C3b 코팅의 대표적인 FACS 분석 결과를 도시한다. 5E6 PNH 환자 #3 RBC가 50% HCl-산성 정상 인간 혈청 및 다양한 농도의 특정 항체 및 인큐베이션으로 누락된 용혈 검정 후, 용해되지 않은 RBC를 수집하고 DPBS로 세척하였다. 2E6 용해되지 않은 세포를 얼음 위에서 30분 동안 항-C3b 항체와 함께 인큐베이션한 후 FACS 분석을 하였다. C3b+ 세포 집단이 게이팅되고 분석된다. ND는 검출불가능을 의미한다. FMEH-IgG4PLA-FH1-5는 용량 의존적 방식으로 PNH 환자 RBC에서 C3b 침착을 차단했지만, 에쿨리주맙과 라불리주맙은 차단할 수 없었다.
도 61은 사이노몰구스 원숭이 대체 경로 보체 매개 용해에 대한 FMEH-IgG4PLA 및 FMEH-IgG4PLA-FH1-5 융합 단백질의 효과를 도시한다. 다양한 농도의 FMEH-IgG4PLA 또는 FMEH-IgG4PLA-FH1-5 융합 단백질의 존재 하에 50% 사이노몰구스 원숭이 혈청을 사용하여 토끼 적혈구의 용혈 검정을 수행하였다. 원숭이 C5에 대한 반응성이 없는 2개의 벤치마크 항-인간 C5 mAb(에쿨리주맙 및 라불리주맙)를 음성 대조군으로 사용하였다.
도 62a 및 도 62b를 포함하는 도 62는 pH 6.0에서 인간 FcRn에 대한 FMEH-IgG4PLA의 친화도의 대표적인 Biacore 측정을 도시한다. 정제된 인간 FcRn을 아민 커플링 방법(280RU)을 사용하여 CM5 칩에 커플링시켰다. Biacore-3000 기기에서 Biacore 분석을 수행하였다. 칩은 7.4 pH 완충액을 사용하여 각 결합 사이에 재생되었다. FMHE-IgG4PLA의 kD는 6.47 E-9 M인 것으로 결정되었다. 도 62a는 인간 FcRn에 대한 FMEH 결합을 입증하는 대표적인 결과를 도시한다. 도 62b는 pH 6.0에서 인간 FcRn에 대한 FMEH-IgG4PLA의 친화성의 대표적인 Biacore 측정 및 상응하는 분석을 도시한다.
도 63a 및 도 63b를 포함하는 도 63은 pH 6.0에서 인간 FcRn에 대한 FMEH-IgG4PLA-FH1-5의 친화성의 대표적인 Biacore 측정을 도시한다. 정제된 인간 FcRN을 아민 커플링 방법(280RU)을 사용하여 CM5 칩에 커플링시켰다. Biacore-3000 기기에서 Biacore 분석을 수행하였다. 칩은 7.4 pH 완충액을 사용하여 각 결합 사이에 재생되었다. FMEH-IgG4PLA-FH1-5의 kD는 8.88 E-9 M인 것으로 결정되었다. 도 63a는 FMEH-FH1-5가 인간 FcRn에 결합함을 입증하는 대표적인 결과를 도시한다. 도 63b는 pH 6.0에서 인간 FcRn에 대한 FMEH-IgG4PLA-FH1-5의 친화성의 대표적인 Biacore 측정 및 상응하는 분석을 도시한다.
도 64a 및 도 64b를 포함하는 도 64는 pH 6.0에서 FMEH-IgG4PLA의 Cyno FcRn에 대한 친화도의 대표적인 Biacore 측정을 도시한다. 정제된 Cyno FcRn을 아민 커플링 방법(200RU)을 사용하여 CM5 칩에 커플링하였다. Biacore-3000 기기에서 Biacore 분석을 수행하였다. 칩은 7.4 pH 완충액을 사용하여 각 결합 사이에 재생되었다. FMHE-IgG4PLA의 kD는 1.4 E-8 M인 것으로 결정되었다. 도 64a는 Cyno FcRn에 대한 FMEH 결합을 입증하는 대표적인 결과를 도시한다. 도 64b는 pH 6.0에서 Cyno FcRn에 대한 FMEH-IgG4PLA의 친화성의 대표적인 Biacore 측정 및 상응하는 분석을 도시한다.
도 65a 및 도 65b를 포함하는 도 65는 pH 6.0에서 Cyno FcRn에 대한 FMEH-IgG4PLA-FH1-5의 친화도의 대표적인 Biacore 측정을 도시한다. 정제된 Cyno FcRn을 아민 커플링 방법(200RU)을 사용하여 CM5 칩에 커플링하였다. Biacore-3000 기기에서 Biacore 분석을 수행하였다. 칩은 7.4 pH 완충액을 사용하여 각 결합 사이에 재생되었다. FMEH-IgG4PLA-FH1-5의 kD는 3.91 E-8 M인 것으로 결정되었다. 도 65a는 FMEH-FH1-5가 Cyno FcRn에 결합함을 입증하는 대표적인 결과를 도시한다. 도 65b는 pH 6.0에서 FMEH-IgG4PLA-FH1-5의 Cyno FcRn에 대한 친화도의 대표적인 Biacore 측정 및 상응하는 결과를 도시한다.
도 66은 인간 IgG4 Fc 또는 FH 융합 단백질에 대한 검출 항체를 사용하여 측정한 C5 인간화 FcRn/Scid 마우스(n=2)에서 FMEH-IgG4PLA-FH1-5의 대표적인 약동학을 도시한다. 두 검정 모두에서, 마우스 혈장 내의 FMEH-IgG4PLA-FH1-5는 항-인간 카파 경쇄 항체에 의해 포획되었지만, 분자의 인간 IgG4 부분(왼쪽 패널) 또는 분자의 인간 FH1-5 모이어티 (오른쪽 패널)에 대해 다른 검출 항체가 사용되었다. 표시된 바와 같이 FMEH-IgG4PLA-FH1-5를 주사한 후 다양한 시점에서 마우스 혈장 샘플을 수집하였다. 두 검정 모두 유사한 약동학을 보여주었으며, 이는 항-C5 mAb 및 FH1-5 융합 단백질이 이의 무결성을 유지했음을 시사한다.
도 67a 내지 도 67c를 포함하는 도 67은 SDS-PAGE 및 SEC-HPLC에 의한 FMEH-FH1-5의 특성화에 대한 대표적인 결과를 도시한다. SDS-PAGE 및 SEC-HPLC에 의한 FMEH-IgG4PLA-FH1-5의 특성화. HEK293 세포 형질감염 배지로부터 발현된 FMEH-IgG4PLA-FH1-5를 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 도 67a는 SDS-PAGE를 감소시키기 위한 대표적인 결과를 도시한다. 감소된 SDS-PAGE에서, ~85KDa 및 ~25kDa의 밴딩은 각각 예상되는 중쇄-FH1-5 융합 및 경쇄이다. 도 67b는 비환원 SDS-PAGE에 대한 대표적인 결과를 도시한다. 비환원 SDS-PAGE에서, 200 kDa보다 큰 밴드는 예상되는 온전한 FMEH-IgG4PLA-FH1-5 분자이다. 도 67c는 SEC-HPLC에 대한 대표적인 결과를 도시한다. SEC-HPLC에서, FMEH-IgG4PLA-FH1-5는 6.54분에 용리되었고, 그 순도는 95% 초과이다.
도 68은 FMEH-IgG4PLA-FH1-5의 질량 분광계 분석에 대한 대표적인 결과를 보여준다. HEK293 형질감염 세포 배지로부터 단백질 A로 정제한 FMEH-IgG4PLA-FH1-5를 질량 분광계 분석을 통해 분자량을 측정하였다. FMEH-IgG4PLA-FH1-5의 온전한, 환원된 중쇄, 환원된 경쇄, 탈당화된 온전한, 환원 및 탈당화된 중쇄, 환원 및 탈당화된 경쇄의 질량을 측정하였다. 실험 질량과 이론 질량은 모든 샘플에 대해 일관되게 일치한다. 결과는 FMEH-IgG4PLA-FH1-5에 2개의 글리코실화 변형이 있음을 보여주었다. Fc의 CH2에 있는 표준 N-글리코실화 부위를 고려할 때, FH 도메인 1-5는 글리코실화된 것으로 보이지 않는다.
도 69a 및 도 69b를 포함하는 도 69는 pH 7.4 및 pH 5.8에서 인간 및 사이노 C5 단백질에 대한 FMEH-IgG4PLA-FH1-5의 대표적인 결합 친화도를 도시한다. HEK293 형질감염 세포 배지로부터 정제된 FMEH-IgG4PLA-FH1-5는 Bio-Layer Interferometry, Gator(Probe Life Inc., China)를 사용하여 결합 친화도 결정을 측정하였다. 결합 동역학에 대한 pH의 영향을 결정하기 위해 pH 7.4 또는 pH 5.8 완충액 조건에서 실험을 수행하였다. 데이터는 1:1 결합 모델을 사용하여 Gator 평가 소프트웨어(Probe Life Inc., 중국)로 분석되었다. FMEH-IgG4PLA-FH1-5는 pH 7.4보다 pH 5.8에서 약 10배 더 빠르게 C5 결합 복합체에서 해리된다. 도 69a는 pH 7.4 및 pH 5.8에서 인간 및 사이노 C5 단백질에 대한 FMEH-IgG4PLA-FH1-5의 결합 친화도를 그래프로 나타낸 것이다. 도 69b는 pH 7.4 및 pH 5.8에서 인간 및 사이노 C5 단백질에 대한 FMEH-IgG4PLA-FH1-5의 결합 친화성의 표로 나타낸 표현을 도시한다.
도 1은 mAb 2G1(인간화 2G1 VH-11801)의 인간화 가변 중쇄(VH) 및 mAb 2G1(인간화 2G1 VL-1901)의 인간화 가변 경쇄(VL)의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 도시한다. 인간화는 뮤린 mAb 2G1 VH로부터 생식계 인코딩된 인간 VH 프레임 (11801)로의 CDR 그레이팅 및 뮤린 mAb 2G1 VL로부터 생식계 인코딩된 인간 VL 프레임 (1901)으로의 CDR 그레이팅에 의해 달성되었다. 신호 펩타이드의 아미노산 서열은 밑줄이 그어져 있고 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열은 굵고 음영으로 표시된다.
도 2는 VL-CDR3에서 Q→H 치환을 갖는 mAb L3-1, 인간화 VH-11801 및 인간화 VL-1901의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 도시한다.
도 3은 VL-CDR1에서 T→H 치환을 갖는 mAb L1-2, 인간화 VH-11801 및 인간화 VL-1901의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 도시한다.
도 4는 VH-CDR1에서 I→H 치환을 갖는 mAb H1-4, 인간화 VH-11801 및 인간화 VL-1901의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 도시한다.
도 5는 VH-CDR1에서 N→H 치환 및 VL-CDR1에서 Y→H 치환을 갖는 mAb H1-8/L1-9, 인간화된 VH-11801 및 인간화된 VL-1901의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 도시한다.
도 6은 VH-CDR2에서 Y→H 치환 및 VL-CDR3에서 E→H 치환을 갖는 mAb H2-6/L3-5, 인간화된 VH-11801 및 인간화된 VL-1901의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 도시한다.
도 7은 pH 5.8 및 pH 7.4에서 모 인간화 mAb 11801(VH-11801(서열번호 2) 및 VL-1901(서열번호 7))의 C5 결합 및 해리의 옥텟 추적을 도시한다.
도 8은 pH 5.8 및 pH 7.4에서 mAb L3-1의 C5 결합 및 해리의 옥텟 추적을 도시한다.
도 9는 pH 5.8 및 pH 7.4에서 mAb L1-2의 C5 결합 및 해리의 옥텟 추적을 도시한 것이다.
도 10은 pH 5.8 및 pH 7.4에서 mAb H1-4의 C5 결합 및 해리의 옥텟 추적을 도시한다.
도 11은 pH 5.8 및 pH 7.4에서 mAb H2-6/L3-5의 C5 결합 및 해리의 옥텟 추적을 도시한 것이다.
도 12는 pH 5.8 및 pH 7.4에서 mAb H1-8/L1-9의 C5 결합 및 해리의 옥텟 추적을 도시한 것이다.
도 13은 모 인간화 mAb 11801 (VH-11801 (서열번호:2) 및 VL-1901 (서열번호:7)), 및 그것의 변이체 mAb L1-2, mAb L3-1, 및 mAb H2-6/L3-5의 C5 억제 효과를 평가하기 위해 전통적 경로 보체 매개 양 적혈구 세포 용해 검정의 결과를 도시한다.
도 14는 모 인간화 mAb 11801 (VH-11801 (서열번호:2) 및 VL-1901 (서열번호:7)) 및 변이체 mAb H1-8/L1-9의 C5 억제 효과를 평가하기 위해 전통적 경로 보체 매개 양 적혈구 세포 용해 검정의 결과를 도시한다.
도 15는 모 인간화 mAb 11801 (VH-11801 (서열번호:2) 및 VL-1901 (서열번호:7)) 및 변이체 mAb H1-4 및 mAb L3-1의 C5 억제 효과를 평가하기 위해 전통적 경로 보체 매개 양 적혈구 세포 용해 검정의 결과를 도시한다.
도 16은 인간 C5를 발현하도록 유전적으로 변형된 NOD/SCID 마우스의 혈장에서 인간 C5의 수준을 평가하는 ELISA 검정의 결과를 도시한다. M1, M3, M4 및 M5는 4개의 대표적인 마우스를 지정한다.
도 17은 재조합 키메라 인간 IgG4 mAbs H1-4, H1-8/L1-9, H2-6/L3-5, L3-1 또는 L1-2를 주사한 후 인간 C5를 발현하도록 유전적으로 변형된 NOD/SCID 마우스의 혈장에서 인간 IgG4의 수준을 평가하는 검정의 결과를 도시한다.
도 18은 인간 C5를 발현하기 위해 유전적으로 변형된 2 마리의 NOD/SCID 마우스 (Mo-03 및 Mo-05)에서 모 인간화 mAb 2G1 (VH-11801 (서열번호:2) 및 VL-1901 (서열번호:7))의 약력학을 평가하는 전통적 경로 보체 매개 닭 적혈구 검정의 결과를 도시한다.
도 19는 인간 C5를 발현하기 위해 유전적으로 변형된 NOD/SCID 마우스에서 재조합 키메라 인간 IgG4 mAbs L3-1, L1-2, H1-4, H1-8/L1-9 및 H2-6/L3-5의 약력학을 평가하는 전통적 경로 보체 매개 닭 적혈구 분석의 결과를 도시한다.
도 20은 서열번호:20에 대한 VH CDR1 내의 류신 9 (즉, L9), 서열번호:4에 대한 VH CDR2 내의 프롤린 4 (즉, P4), 및/또는 서열번호:5에 대한 VH CDR3 내의 발린 16 (즉, V16) (즉, L9→W9 (즉, L9W), L9→I9 (즉, L9I), L9→V9 (즉, L9V), L9→Y9 (즉, L9Y), L9→F9 (즉, L9F), P4→F4 (즉, P4F), P4→L4 (즉, P4L), P4→M4 (즉, P4M), P4→W4 (즉, P4W), P4→I4 (즉, P4I), V16→F16 (즉, V16F), V16→E16 (즉, V16E) 및 V16→W16 (즉, V16W))에서 적어도 하나의 치환을 갖는 MAb H1-8/L1-9 ScFV 변이체의 C5에 대한 pH 7.4에서의 개선된 결합을 입증하는 ELISA 검정의 결과를 도시한다. mAb H1-8/L1-9 ScFV 변이체의 결합은 열 3(OD450) 및 4(OD450 확인)에 나타내고 모 mAb H1-8/L1-9 ScFV의 결합은 열 8(WT/OD450)에 나타낸다.
도 21은 인간 IgG4로서 Expi-CHO 세포에서 발현된 mAb H1-8/L1-9 변이체의 상대적인 C5 결합 친화도를 평가하는 옥텟 검정의 결과를 도시한다. Expi-CHO 세포를 명시된 H1-8 VH 변이체로 형질감염시키고 L1-9 VL (서열번호: 23) 및 세포 배양 상청액을 형질감염 2일 후에 평가하였다. 주어진 세포 배양 상청액에 대해, 항체 결합 반응에 대한 C5 결합 반응의 비율을 계산하고 C5 결합 친화도의 척도로 사용하였다. 서열번호:20에 대한 VH CDR1 내의 류신 9 (즉, L9), 서열번호:4에 대한 VH CDR2 내의 프롤린 4 (즉, P4), 및/또는 서열번호:5에 대한 VH CDR3 내의 발린 16 (즉, V16) (즉, L9→W9 (즉, L9W), L9→I9 (즉, L9I), L9→V9 (즉, L9V), L9→Y9 (즉, L9Y), L9→F9 (즉, L9F), P4→F4 (즉, P4F), P4→L4 (즉, P4L), P4→M4 (즉, P4M), P4→W4 (즉, P4W), P4→I4 (즉, P4I), V16→F16 (즉, V16F), V16→E16 (즉, V16E) 및 V16→W16 (즉, V16W))에서 적어도 하나의 치환을 갖는 mAb H1-8/L1-9 IgG4 변이체를 이용한 형질감염 실험의 2개의 별개의 옥텟 검정으로부터 계산된 비가 도면에 도시되어 있다.
도 22는 각각 C5 및 mAb H1-8/L1-9 변이체의 pH 7.4 및 pH 5.8에서의 해리 속도를 평가하는 옥텟 검정의 결과를 도시한다. 회합 상에서 해리 상으로 전환한 후 피크 C5 결합 반응으로부터 pH 7.4 및 pH 5.8에서 각각의 mAb에 대한 % 감소가 계산되었다. 서열번호:20에 대한 VH CDR1 내의 류신 9 (즉, L9), 서열번호:4에 대한 VH CDR2 내의 프롤린 4 (즉, P4), 및/또는 서열번호:5에 대한 VH CDR3 내의 발린 16 (즉, V16) (즉, L9→W9 (즉, L9W), L9→I9 (즉, L9I), L9→V9 (즉, L9V), L9→Y9 (즉, L9Y), L9→F9 (즉, L9F), P4→F4 (즉, P4F), P4→L4 (즉, P4L), P4→M4 (즉, P4M), P4→W4 (즉, P4W), P4→I4 (즉, P4I), V16→F16 (즉, V16F), V16→E16 (즉, V16E) 및 V16→W16 (즉, V16W))에서 적어도 하나의 치환을 갖는 mAb H1-8/L1-9 IgG4 변이체를 이용한 형질감염 실험의 2개의 별개의 옥텟 검정에서 % 감소를 계산하였다.
도 23은 18개의 조합 치환 변이체 (즉, L9I/P4M, L9I/P4W, L9I/P4F, L9F/P4M, L9F/P4W, L9F/P4F, L9I/P4M/V16W, L9I/P4W/V16W, L9I/P4F/V16W, L9F/P4M/V16W, L9F/P4W/V16W, L9F/P4F/V16W, L9I/P4M/V16E, L9I/P4W/V16E, L9I/P4F/V16E, L9F/P4M/V16E, L9F/P4W/V16E, 및 L9F/P4F/V16E)를 열거한다. 이러한 조합 변이체는 모 H1-8/L1-9 mAb에 비해 개선된 C5 결합 친화도를 나타내고 차등 pH 7.4 및 pH 5.8 해리 속도를 동시에 유지하는 mAb H1-8/L1-9 IgG4 (즉, L9I, L9F, P4M, P4W, P4F, V16E, V16W)의 7개의 단일 변이체로부터 유래되었다 (도 21 및 도 22).
도 24는 인간 IgG4로서 Expi-CHO 세포에서 발현된 mAb H1-8/L1-9 조합 치환 변이체의 상대적인 C5 결합 친화도를 평가하는 옥텟 검정의 결과를 도시한다. Expi-CHO 세포를 H1-8 VH 조합 치환 변이체로 형질감염시키고 세포 배양 상청액을 형질감염 2일 후에 평가하였다. 주어진 세포 배양 상청액에 대해, 항체 결합 반응에 대한 C5 결합 반응의 비율을 계산하고 C5 결합 친화도의 척도로 사용하였다. mAb H1-8/L1-9 조합 치환 변이체 L9I/P4M, L9I/P4W, L9I/P4F, L9F/P4M, L9F/P4W, L9F/P4F, L9I/P4M/V16W, L9I/P4W/V16W, L9I/P4F/V16W, L9F/P4M/V16W, L9F/P4W/V16W, L9F/P4F/V16W, L9I/P4M/V16E, L9I/P4W/V16E, L9I/P4F/V16E, L9F/P4M/V16E, L9F/P4W/V16E, 및 L9F/P4F/V16E를 사용한 형질감염 실험으로부터 계산된 비가 도면에 도시되어 있다.
도 25는 각각 C5 및 mAb H1-8/L1-9 조합 치환 변이체의 pH 7.4 및 pH 5.8에서의 해리 속도를 평가하는 옥텟 검정의 결과를 도시한다. 회합 상에서 해리 상으로 전환한 후 피크 C5 결합 반응으로부터 pH 7.4 및 pH 5.8에서 각각의 mAb에 대한 % 감소가 계산되었다. mAb H1-8/L1-9 IgG4 조합 치환 변이체 L9I/P4M, L9I/P4W, L9I/P4F, L9F/P4M, L9F/P4W, L9F/P4F, L9I/P4M/V16W, L9I/P4W/V16W, L9I/P4F/V16W, L9F/P4M/V16W, L9F/P4W/V16W, L9F/P4F/V16W, L9I/P4M/V16E, L9I/P4W/V16E, L9I/P4F/V16E, L9F/P4M/V16E, L9F/P4W/V16E, 및 L9F/P4F/V16E를 사용한 형질감염 실험에서 % 감소가 도면에서 계산되었다.
도 26은 VH CDR2의 위치 9에서 T에서 H로의 돌연변이에 상응하는 클론 14C6을 포함하는 mAb 1819 친화성 성숙 실험으로부터의 추가 scFV 돌연변이체의 pH 7.4에서의 C5-결합의 친화성을 평가하는 실험의 결과를 도시한다.
도 27은 VH CDR2의 위치 9에서 T에서 H로의 돌연변이에 상응하는 클론 14C6을 포함하는 mAb 1819 친화성 성숙 실험으로부터의 추가 scFV 돌연변이체의 pH 7.4 및 pH 5.8에서의 C5-결합의 차등 친화성을 평가하는 실험의 결과를 도시한다.
도 28은 pH 7.4 및 pH 5.8에서의 차등 결합에 따른 mAb 1819 친화성 성숙 실험으로부터 추가 scFV 돌연변이체의 순위를 매기는 실험의 결과를 도시하며, 클론 14C6이 이 돌연변이체 그룹 중에서 최상위 돌연변이체임을 보여준다. 클론 14C6은 VH CDR2의 위치 9에서 T에서 H로의 돌연변이에 해당한다.
도 29는 mAb H1-8/L1-9 변이체 IWW-VH (상단), VH-CDR1 내의 N→H 및 L→I 치환, VH-CDR2 내의 P→W 치환, 및 VH-CDR3 내의 V→W 치환을 갖는 인간화 VH-11801의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열; 뿐만 아니라 mAb H1-8/L1-9 변이체 IFW-VH (하단), VH-CDR1 내의 N→H 및 L→I 치환, VH-CDR2 내의 P→F 치환, 및 VH-CDR3 내의 V→W 치환을 갖는 인간화 VH-11801의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 도시한다.
도 30은 mAb H1-8/L1-9 변이체 FME-VH (상단), VH-CDR1 내의 N→H 및 L→F 치환, VH-CDR2 내의 P→M 치환, 및 VH-CDR3 내의 V→E 치환을 갖는 인간화 VH-11801의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열; 뿐만 아니라 mAb H1-8/L1-9 변이체 FMW-VH (하단), VH-CDR1 내의 N→H 및 L→F 치환, VH-CDR2 내의 P→M 치환, 및 VH-CDR3 내의 V→W 치환을 갖는 인간화 VH-11801의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 도시한다.
도 31은 mAb H1-8/L1-9 변이체 FMEH-VH, VH-CDR1 내의 N→H 및 L→F 치환, VH-CDR2 내의 P→M 및 T→H 치환, 및 VH-CDR3 내의 V→E 치환을 갖는 인간화 VH-11801의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 도시한다.
도 32는 pH 5.8 및 pH 7.4에서 재조합 키메라 인간 IgG4 mAb H1-8/L1-9, FMW, IFW, FME, 및 IWW의 C5 결합 및 해리의 옥텟 추적을 도시한다.
도 33은 pH 7.4 및 pH 5.8에서 재조합 키메라 인간 IgG4 mAb 11801 (VH-11801 (서열번호: 2) 및 VL-1901 (서열번호: 7), H1-8/L1-9, FMW, IFW, FME, 및 IWW에 대한 피크 값으로부터 해리된 C5 결합의 %를 나타낸다.
도 34는 모 인간화된 재조합 키메라 인간 IgG4 mAb H1-8/L1-9 (VH-11801 (서열번호:22) 및 VL-1901 (서열번호:25)), 및 그것의 변이체 IFW PLA (VH-11801 (서열번호:46) 및 VL-1901 (서열번호:25)), FME PLA (서열번호:51) 및 VL-1901 (서열번호:25)), IWW PLA (서열번호:41) 및 VL-1901 (서열번호:25)), 및 FMW PLA (서열번호:56) 및 VL-1901 (서열번호:25))의 C5 억제 효과를 평가하기 위해 전통적 경로 보체 매개 양 적혈구 세포 용해 검정의 결과를 도시한다.
도 35는 pH 5.8 및 pH 7.4에서 재조합 키메라 인간 IgG4 mAb H1-8/L1-9, FME, FMEH, FMW, 및 IFW의 C5 결합 및 해리의 옥텟 추적을 도시한다.
도 36은 pH 5.8 및 pH 7.4에서 정제된 재조합 키메라 인간 IgG4 PLA (서열번호: 61), mAb H1-8/L1-9, FME, FMEH, FMW, 및 IFW에 대한 피크 값으로부터 해리된 C5 결합의 %를 나타낸다.
도 37은 재조합 키메라 인간 IgG4 mAb FME PLA (서열번호:51) 및 VL-1901 (서열번호:25)), FMEH PLA (서열번호:59) 및 VL-1901 (서열번호:25)), FMW PLA (서열번호:56) 및 VL-1901 (서열번호:25)), 및 IFW PLA (VH-11801 (서열번호:46) 및 VL-1901 (서열번호:25))의 C5 억제 효과를 평가하기 위해 전통적 경로 보체 매개 양 적혈구 세포 용해 검정의 결과를 도시한다.
도 38은 C5 인간화 FcRn/SCID 마우스에서 PK/PD 시험을 위한 재조합 키메라 인간 IgG4 PLA mAb에서 인간 IgG4-Fc 도메인 돌연변이의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 도시한다.
도 39는 인간 C5 cDNA의 유체역학적 주입에 의해 생성된 C5 인간화 마우스의 혈장 C5 수준을 도시한다.
도 40은 재조합 키메라 인간 IgG4 PLA (서열번호: 61) mAbs IFW-PLA, FMW-PLA, 또는 FMEH-PLA를 주사한 후 인간 C5를 발현하도록 유전적으로 변형된 FcRn/SCID 마우스의 혈장에서 전체 인간 C5의 수준을 평가하는 검정의 결과를 도시한다.
도 41은 재조합 키메라 인간 IgG4 PLA (서열번호: 61) mAbs IFW-PLA, FMW-PLA, 또는 FMEH-PLA를 주사한 후 인간 C5를 발현하도록 유전적으로 변형된 FcRn/SCID 마우스의 혈장에서 전체 IgG4의 수준을 평가하는 검정의 결과를 도시한다.
도 42는 인간 C5를 발현하기 위해 유전적으로 변형된 FcRn/SCID 마우스에서 재조합 키메라 인간 IgG4 PLA (서열번호: 61) mAbs IFW-PLA, FMW-PLA, 또는 FMEH-PLA의 약력학을 평가하는 전통적 경로 보체 매개 닭 적혈구 분석의 결과를 도시한다.
도 43은 표적 인식 및 단백질 분해 절단의 캐스케이드를 포함하는 보체 활성화를 초래할 수 있는 3개의 상이한 경로를 도시한다. 모든 경로는 C3 활성화 단계에서 수렴된다.
도 44는 20개의 SCR 도메인으로 이루어진 인간 FH의 구조 및 인간 IgG4 항-C5 mAb/FH SCR1-5 융합 단백질의 구조를 도시한다.
도 45는 mAb H1-8/L1-9 변이체 FMEH-IgG4PLA-FH1-5의 VH 서열, VH-CDR1 내의 N→H 및 L→F 치환, VH-CDR2 내의 P→M 및 T→H 치환, 및 VH-CDR3 내의 V→E 치환을 갖는 인간화 VH-11801의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 도시한다.
도 46은 MAb H1-8/L1-9 변이체 FMEH-IgG4PLA-FH1-5의 VL 서열, VL-CDR1 내의 Y→H 치환을 갖는 인간화된 VL-1901의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 도시한다.
도 47은 항-C5 mAb FMEH-IgG4PLA (레인 1) 및 항-C5 mAb/FH SCR1-5 융합 단백질 (FMEH-IgG4PLA-FH1-5) (레인 2)의 VH 및 VL 사슬을 보여주는 SDS 겔을 도시한다.
도 48은 pH 5.8 및 pH 7.4에서 항-C5 mAb FMEH-IgG4PLA 및 항-C5 mAb/FH SCR1-5 융합 단백질 FMEH-IgG4PLA-FH1-5의 C5 결합 및 해리의 옥텟 추적을 도시한다.
도 49는 pH 7.4 및 pH 5.8에서 항-C5 mAb FMEH-IgG4 및 항-C5 mAb/FH SCR1-5 융합 단백질, FMEH-IgG4PLA-FH1-5에 대한 피크 C5 결합으로부터 % 해리를 도시한다.
도 50은 항-C5 mAb FMEH-IgG4PLA, 항-C5 mAb/FH SCR1-5 융합 단백질, FMEH-IgG4PLA-FH1-5, 및 벤치마크 항-C5 mAbs 에쿨리주맙, 및 라불리주맙의 용혈 활성에 대한 억제 효과를 평가하기 위한 대체 경로 보체 매개 토끼 적혈구 용해 검정의 결과를 도시한다.
도 51은 FMEH-IgG4PLA, FMEH-IgG4PLA-FH1-5, 에쿨리주맙, 및 라불리주맙으로 처리된 용해되지 않은 토끼 RBC 상의 C3 단편 침착 수준을 도시한다.
도 52는 FMEH-IgG4PLA, FMEH-IgG4PLA-FH1-5, 에쿨리주맙, 및 라불리주맙을 주사한 후 다양한 시점에서 C5 인간화 FcRn/SCID 마우스의 혈장에서 인간 IgG4의 수준을 평가하는 검정의 결과를 도시한다.
도 53은 분자의 인간 IgG4 모이어티에 특이적인 검출 mAb를 사용하여 주사 후 다양한 시점에서 C5 인간화 FcRn/SCID 마우스의 혈장에서 FMEH-IgG4PLA-FH1-5의 수준을 평가하는 검정의 결과를 도시한다.
도 54는 분자의 FH SCR1-5 모이어티에 특이적인 검출 mAb를 사용하여 주사한 후 다양한 시점에서 C5 인간화 FcRn/SCID 마우스의 혈장에서 FMEH-IgG4PLA-FH1-5의 수준을 평가하는 검정의 결과를 도시한다.
도 55는 FMEH-IgG4PLA, FMEH-IgG4PLA-FH1-5, 에쿨리주맙, 및 라불리주맙을 주사한 후 다양한 시점에서 C5 인간화 FcRn/SCID 마우스의 혈장 중 인간 C5의 수준을 평가하는 ELISA 검정의 결과를 도시한다.
도 56은 FMEH-IgG4PLA, FMEH-IgG4PLA-FH1-5, 에쿨리주맙, 라불리주맙, 및 C5 고갈 인간 혈청을 주사한 후 다양한 시점에서 C5 인간화 FcRn/SCID 마우스에서 수집된 혈청을 사용하여 하이브리드 분석에서 대체 보체 경로를 통한 토끼 RBC 용해의 %를 도시한다.
도 57은 시험관내 PNH 환자 RBC 용혈에 대한 대표적인 결과를 도시한다(환자 #2). AP 완충액 중의 2E7 PNH 환자 RBC를 다양한 양의 FMEH-IgG4PLA-FH1-5, 에쿨리주맙 또는 라불리주맙의 존재 하에 35% HCl-산성 정상 인간 혈청과 혼합하였다. 혼합물을 37℃에서 40분 동안 인큐베이션하고 OD405에서 용혈을 판독하였다. (OD405(specific ab con.)-OD405(40mM EDTA))/((OD405(ab con.=0)-OD405(40mM EDTA)) *100% 공식을 사용하여 용해 %를 계산하였다. FMEH-IgG4PLA-FH1-5는 시험관 내에서 에쿨리주맙 및 라불리주맙보다 PNH 환자 RBC 용해를 더 강력하게 차단한다. 도 57은 인간 PNH 적혈구 산성화된 정상 인간 혈청 (35% AB 혈액형)의 대체 경로 보체 매개 용해에 대한 FMEH-IgG4PLA-FH1-5, 에쿨리주맙, 라불리주맙, 및 대조 IgG4의 비교 억제 활성 및 IC50 (μg/mL)을 도시한다.
도 58은 시험관내 항-C5 mAb 처리 후 PNH 환자 RBC 상의 C3b 코팅의 대표적인 FACS 분석 결과를 도시한다. 용혈 검정(시험관 내 도 57 PNH 환자 RBC 용혈 참조) 후, 용해되지 않은 RBC를 수집하고 DPBS로 세척하였다. 2E6 세포를 얼음 위에서 30분 동안 항-C3b 항체와 함께 인큐베이션한 후 FACS 분석을 하였다. C3b+/CD59- 세포 집단이 게이팅되고 분석된다. 결과는 PNH 환자 #2의 것이다. ND는 검출불가능을 의미한다. FMEH-IgG4PLA-FH1-5는 PNH 환자 RBC에서 C3b 침착을 효과적으로 차단하는 반면, 에쿨리주맙과 라불리주맙은 차단할 수 없었다. C3b-옵소닌 처리된 PNH 적혈구(Q4)는 에쿨리주맙 또는 라불리주맙으로 처리된 샘플에서 검출되었지만, FMEH-IgG4PLA-FH1-5로 처리된 샘플에서는 검출되지 않았다.
도 59는 시험관내 PNH 환자 RBC 용혈에 대한 대표적인 결과를 도시한다(환자 #3). AP 완충액 중의 5E6 PNH RBC를 지시된 바와 같이 다양한 양의 FMEH-IgG4PLA-FH1-5, 에쿨리주맙 또는 라불리주맙의 존재 하에 50% HCl-산성 정상 인간 혈청과 혼합하였다. 37℃에서 90분간 용혈이 일어났다. OD405에서 분광계를 사용하여 용혈을 판독하였다. 공식 (OD405(특이적 ab con.)-OD405(40mM EDTA))/((OD405(ab con.=0)-OD405(40mM EDTA)) *100%을 사용하여 용해 %를 계산하였다. FMEH-IgG4PLA-FH1-5는 시험관 내에서 에쿨리주맙 및 라불리주맙보다 PNH 환자 RBC 용해를 더 강력하게 차단한다.
도 60은 시험관내 항-C5 mAb 처리 후 PNH 환자 #3 RBC 상의 C3b 코팅의 대표적인 FACS 분석 결과를 도시한다. 5E6 PNH 환자 #3 RBC가 50% HCl-산성 정상 인간 혈청 및 다양한 농도의 특정 항체 및 인큐베이션으로 누락된 용혈 검정 후, 용해되지 않은 RBC를 수집하고 DPBS로 세척하였다. 2E6 용해되지 않은 세포를 얼음 위에서 30분 동안 항-C3b 항체와 함께 인큐베이션한 후 FACS 분석을 하였다. C3b+ 세포 집단이 게이팅되고 분석된다. ND는 검출불가능을 의미한다. FMEH-IgG4PLA-FH1-5는 용량 의존적 방식으로 PNH 환자 RBC에서 C3b 침착을 차단했지만, 에쿨리주맙과 라불리주맙은 차단할 수 없었다.
도 61은 사이노몰구스 원숭이 대체 경로 보체 매개 용해에 대한 FMEH-IgG4PLA 및 FMEH-IgG4PLA-FH1-5 융합 단백질의 효과를 도시한다. 다양한 농도의 FMEH-IgG4PLA 또는 FMEH-IgG4PLA-FH1-5 융합 단백질의 존재 하에 50% 사이노몰구스 원숭이 혈청을 사용하여 토끼 적혈구의 용혈 검정을 수행하였다. 원숭이 C5에 대한 반응성이 없는 2개의 벤치마크 항-인간 C5 mAb(에쿨리주맙 및 라불리주맙)를 음성 대조군으로 사용하였다.
도 62a 및 도 62b를 포함하는 도 62는 pH 6.0에서 인간 FcRn에 대한 FMEH-IgG4PLA의 친화도의 대표적인 Biacore 측정을 도시한다. 정제된 인간 FcRn을 아민 커플링 방법(280RU)을 사용하여 CM5 칩에 커플링시켰다. Biacore-3000 기기에서 Biacore 분석을 수행하였다. 칩은 7.4 pH 완충액을 사용하여 각 결합 사이에 재생되었다. FMHE-IgG4PLA의 kD는 6.47 E-9 M인 것으로 결정되었다. 도 62a는 인간 FcRn에 대한 FMEH 결합을 입증하는 대표적인 결과를 도시한다. 도 62b는 pH 6.0에서 인간 FcRn에 대한 FMEH-IgG4PLA의 친화성의 대표적인 Biacore 측정 및 상응하는 분석을 도시한다.
도 63a 및 도 63b를 포함하는 도 63은 pH 6.0에서 인간 FcRn에 대한 FMEH-IgG4PLA-FH1-5의 친화성의 대표적인 Biacore 측정을 도시한다. 정제된 인간 FcRN을 아민 커플링 방법(280RU)을 사용하여 CM5 칩에 커플링시켰다. Biacore-3000 기기에서 Biacore 분석을 수행하였다. 칩은 7.4 pH 완충액을 사용하여 각 결합 사이에 재생되었다. FMEH-IgG4PLA-FH1-5의 kD는 8.88 E-9 M인 것으로 결정되었다. 도 63a는 FMEH-FH1-5가 인간 FcRn에 결합함을 입증하는 대표적인 결과를 도시한다. 도 63b는 pH 6.0에서 인간 FcRn에 대한 FMEH-IgG4PLA-FH1-5의 친화성의 대표적인 Biacore 측정 및 상응하는 분석을 도시한다.
도 64a 및 도 64b를 포함하는 도 64는 pH 6.0에서 FMEH-IgG4PLA의 Cyno FcRn에 대한 친화도의 대표적인 Biacore 측정을 도시한다. 정제된 Cyno FcRn을 아민 커플링 방법(200RU)을 사용하여 CM5 칩에 커플링하였다. Biacore-3000 기기에서 Biacore 분석을 수행하였다. 칩은 7.4 pH 완충액을 사용하여 각 결합 사이에 재생되었다. FMHE-IgG4PLA의 kD는 1.4 E-8 M인 것으로 결정되었다. 도 64a는 Cyno FcRn에 대한 FMEH 결합을 입증하는 대표적인 결과를 도시한다. 도 64b는 pH 6.0에서 Cyno FcRn에 대한 FMEH-IgG4PLA의 친화성의 대표적인 Biacore 측정 및 상응하는 분석을 도시한다.
도 65a 및 도 65b를 포함하는 도 65는 pH 6.0에서 Cyno FcRn에 대한 FMEH-IgG4PLA-FH1-5의 친화도의 대표적인 Biacore 측정을 도시한다. 정제된 Cyno FcRn을 아민 커플링 방법(200RU)을 사용하여 CM5 칩에 커플링하였다. Biacore-3000 기기에서 Biacore 분석을 수행하였다. 칩은 7.4 pH 완충액을 사용하여 각 결합 사이에 재생되었다. FMEH-IgG4PLA-FH1-5의 kD는 3.91 E-8 M인 것으로 결정되었다. 도 65a는 FMEH-FH1-5가 Cyno FcRn에 결합함을 입증하는 대표적인 결과를 도시한다. 도 65b는 pH 6.0에서 FMEH-IgG4PLA-FH1-5의 Cyno FcRn에 대한 친화도의 대표적인 Biacore 측정 및 상응하는 결과를 도시한다.
도 66은 인간 IgG4 Fc 또는 FH 융합 단백질에 대한 검출 항체를 사용하여 측정한 C5 인간화 FcRn/Scid 마우스(n=2)에서 FMEH-IgG4PLA-FH1-5의 대표적인 약동학을 도시한다. 두 검정 모두에서, 마우스 혈장 내의 FMEH-IgG4PLA-FH1-5는 항-인간 카파 경쇄 항체에 의해 포획되었지만, 분자의 인간 IgG4 부분(왼쪽 패널) 또는 분자의 인간 FH1-5 모이어티 (오른쪽 패널)에 대해 다른 검출 항체가 사용되었다. 표시된 바와 같이 FMEH-IgG4PLA-FH1-5를 주사한 후 다양한 시점에서 마우스 혈장 샘플을 수집하였다. 두 검정 모두 유사한 약동학을 보여주었으며, 이는 항-C5 mAb 및 FH1-5 융합 단백질이 이의 무결성을 유지했음을 시사한다.
도 67a 내지 도 67c를 포함하는 도 67은 SDS-PAGE 및 SEC-HPLC에 의한 FMEH-FH1-5의 특성화에 대한 대표적인 결과를 도시한다. SDS-PAGE 및 SEC-HPLC에 의한 FMEH-IgG4PLA-FH1-5의 특성화. HEK293 세포 형질감염 배지로부터 발현된 FMEH-IgG4PLA-FH1-5를 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 도 67a는 SDS-PAGE를 감소시키기 위한 대표적인 결과를 도시한다. 감소된 SDS-PAGE에서, ~85KDa 및 ~25kDa의 밴딩은 각각 예상되는 중쇄-FH1-5 융합 및 경쇄이다. 도 67b는 비환원 SDS-PAGE에 대한 대표적인 결과를 도시한다. 비환원 SDS-PAGE에서, 200 kDa보다 큰 밴드는 예상되는 온전한 FMEH-IgG4PLA-FH1-5 분자이다. 도 67c는 SEC-HPLC에 대한 대표적인 결과를 도시한다. SEC-HPLC에서, FMEH-IgG4PLA-FH1-5는 6.54분에 용리되었고, 그 순도는 95% 초과이다.
도 68은 FMEH-IgG4PLA-FH1-5의 질량 분광계 분석에 대한 대표적인 결과를 보여준다. HEK293 형질감염 세포 배지로부터 단백질 A로 정제한 FMEH-IgG4PLA-FH1-5를 질량 분광계 분석을 통해 분자량을 측정하였다. FMEH-IgG4PLA-FH1-5의 온전한, 환원된 중쇄, 환원된 경쇄, 탈당화된 온전한, 환원 및 탈당화된 중쇄, 환원 및 탈당화된 경쇄의 질량을 측정하였다. 실험 질량과 이론 질량은 모든 샘플에 대해 일관되게 일치한다. 결과는 FMEH-IgG4PLA-FH1-5에 2개의 글리코실화 변형이 있음을 보여주었다. Fc의 CH2에 있는 표준 N-글리코실화 부위를 고려할 때, FH 도메인 1-5는 글리코실화된 것으로 보이지 않는다.
도 69a 및 도 69b를 포함하는 도 69는 pH 7.4 및 pH 5.8에서 인간 및 사이노 C5 단백질에 대한 FMEH-IgG4PLA-FH1-5의 대표적인 결합 친화도를 도시한다. HEK293 형질감염 세포 배지로부터 정제된 FMEH-IgG4PLA-FH1-5는 Bio-Layer Interferometry, Gator(Probe Life Inc., China)를 사용하여 결합 친화도 결정을 측정하였다. 결합 동역학에 대한 pH의 영향을 결정하기 위해 pH 7.4 또는 pH 5.8 완충액 조건에서 실험을 수행하였다. 데이터는 1:1 결합 모델을 사용하여 Gator 평가 소프트웨어(Probe Life Inc., 중국)로 분석되었다. FMEH-IgG4PLA-FH1-5는 pH 7.4보다 pH 5.8에서 약 10배 더 빠르게 C5 결합 복합체에서 해리된다. 도 69a는 pH 7.4 및 pH 5.8에서 인간 및 사이노 C5 단백질에 대한 FMEH-IgG4PLA-FH1-5의 결합 친화도를 그래프로 나타낸 것이다. 도 69b는 pH 7.4 및 pH 5.8에서 인간 및 사이노 C5 단백질에 대한 FMEH-IgG4PLA-FH1-5의 결합 친화성의 표로 나타낸 표현을 도시한다.
본 발명은 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이들의 조합을 사용한 보체 신호전달의 억제에 관한 것이다. 본 발명은 부분적으로 C3 및 C5 활성을 모두 억제함으로써 말단 보체 매개 병리를 치료하는 데 더 높은 효능을 달성할 수 있을 뿐만 아니라 덜 빈번한 투여의 편리함을 제공할 수 있는 이기능성 보체 억제제에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 그의 조합은 C5에 대한 pH 의존성 결합을 나타낸다. 일부 구현예에서, pH 의존성 항-C5 항체 또는 융합 단백질은 보다 산성 pH(예를 들어, 엔도솜에서 발견되는 것과 같은 약 pH 5.8)에서보다 보다 중성인 pH(예를 들어, 혈액에서 발견되는 것과 같은 약 pH 7.4)에서 C5에 더 강하게 결합한다. 다양한 구현예에서, 본 발명은 개체를 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이들의 조합과 접촉시킴으로써 개체에서 보체 매개 질환 또는 보체 매개 장애를 치료하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명의 조성물 및 방법으로 치료될 수 있는 보체 매개 병리 및 병태는 MD, AMD, 허혈 재관류 손상, 관절염, 류마티스성 관절염, 루푸스, 궤양성 대장염, 뇌졸중, 수술 후 전신 염증 증후군, 천식, 알러지성 천식, COPD, PNH 증후군, 중증 근무력증, NMO, 다발성 경화증, 지연된 이식 기능, 항체 매개 거부, aHUS, CRVO, CRAO, 수포성 표피박리증, 패혈증, 장기 이식, 염증 (심폐 바이패스 수술 및 신장 투석과 연관된 염증을 포함하지만 이에 국한되지 않음), C3 사구체병증, 막성 신병증, IgA 신병증, 사구체신염 (ANCA 매개 사구체신염, 루푸스 신장염, 및 그의 조합을 포함하지만 이에 국한되지 않음), ANCA 매개 혈관염, 시가 독소 유도된 HUS, 및 항인지질 항체-유도된 임신 손실, 또는 그의 임의의 조합을 포함하지만 이에 국한되지 않는다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 관련 기술 분야의 숙련자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질이 기재되어 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 다음 용어 각각은 이 섹션에서 관련된 의미를 갖는다.
관사 "a" 및 "an"은 본 명세서에서 관사의 문법적 대상 중 하나 또는 하나 이상(즉, 적어도 하나)을 지칭하는 데 사용된다. 예로서, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "억제하다" 및 "억제"는 대조군 값에 대해 적어도 약 10%만큼 활성 또는 기능을 감소하거나, 억제하거나, 줄이거나 또는 차단하는 것을 의미한다. 일부 구현예에서, 활성은 대조군 값과 비교하여 적어도 약 50% 억제되거나 차단된다. 일부 구현예에서, 활성은 적어도 약 75% 억제되거나 차단된다. 일부 구현예에서, 활성은 적어도 약 95% 억제되거나 차단된다.
"유효량" 및 "약제학적 유효량"이라는 용어는 원하는 생물학적 결과를 제공하기에 충분한 양의 제제를 지칭한다. 그 결과는 질환이나 장애의 징후, 증상 또는 원인의 감소 및/또는 완화, 또는 생물학적 시스템의 다른 원하는 변경일 수 있다. 임의의 개별 경우에 적절한 유효량은 일상적인 실험을 사용하여 당업자에 의해 결정될 수 있다.
용어 "환자", "대상체", "개체" 등은 본원에서 상호교환가능하게 사용되며, 병태 또는 그 후유증에 대한 요법에 필요하거나 취약한 인간을 포함하는 보체 시스템을 갖는 임의의 동물, 일부 구현예에서 포유동물, 및 일부 구현예에서 인간을 지칭한다. 개체는 예를 들어 개, 고양이, 돼지, 소, 양, 염소, 말, 래트, 원숭이, 및 마우스 및 인간을 포함할 수 있다.
유기체, 조직, 세포 또는 그의 성분과 관련하여 사용될 때 용어 "비정상"은 "정상적인" (예상/ 항상성) 각각의 특징을 나타내는 유기체, 조직, 세포, 또는 그의 성분으로부터 적어도 하나의 관찰가능한 또는 검출가능한 특징 (예를 들어, 연령, 치료, 하루의 시간 등)이 상이한 유기체, 조직, 세포 및 그의 성분을 지칭한다. 한 세포, 조직 유형 또는 대상체에 대해 정상이거나 예상되는 특성이 다른 세포 또는 조직 유형에 비정상일 수 있다.
"질환"은 대상체의 항상성을 유지할 수 없는 대상체의 건강 상태이며, 여기서 질환이 개선되지 않으면 대상체의 건강이 계속 악화된다.
대조적으로, 대상체의 "장애"는 대상이 항상성을 유지할 수 있지만 대상체의 건강 상태가 장애가 없을 때보다 덜 유리한 건강 상태이다. 치료하지 않고 방치하면 장애가 반드시 대상체의 건강 상태를 추가로 감소시키는 것은 아니다.
질환 또는 장애의 징후 또는 증상의 중증도, 그러한 징후 또는 증상이 환자에 의해 경험되는 빈도 또는 둘 모두가 감소되면 질환 또는 장애가 "완화"된다.
화합물의 "유효량" 또는 "치료 유효량"은 화합물이 투여되는 대상체에게 유익한 효과를 제공하기에 충분한 화합물의 양이다.
본 명세서에 사용된 "지침용 자료"는 본 명세서에 언급된 다양한 질환 또는 장애의 완화를 달성하기 위해 키트에서 본 발명의 화합물, 조성물, 벡터 또는 전달 시스템의 유용성을 전달하는 데 사용할 수 있는 간행물, 기록, 도표 또는 임의의 기타 표현 매체를 포함한다. 선택적으로 또는 대안적으로, 지침용 자료는 포유동물의 세포 또는 조직에서 질환 또는 장애를 완화하는 하나 이상의 방법을 설명할 수 있다. 본 발명의 키트의 지침용 자료는, 예를 들어 본 발명의 확인된 화합물, 조성물, 벡터 또는 전달 시스템을 함유하는 용기에 부착될 수 있거나, 또는 확인된 화합물을 함유하는 용기, 조성물 또는 전달 시스템과 함께 수송될 수 있다. 대안적으로, 지침용 자료는 지침용 자료와 화합물이 수령인에 의해 협력적으로 사용될 의도로 용기와 별도로 배송될 수 있다.
본원에 사용된 "작동가능하게 연결된" 또는 "작동적으로 연결된"은 유전자의 발현이 그것이 공간적으로 연결된 프로모터의 제어 하에 있음을 의미할 수 있다. 프로모터는 제어 하에 있는 유전자의 5'(상류) 또는 3'(하류)에 위치할 수 있다. 프로모터와 유전자 사이의 거리는 그 프로모터와 프로모터가 유래된 유전자에서 조절하는 유전자 사이의 거리와 거의 동일할 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 이 거리의 변화는 프로모터 기능의 손실 없이 수용될 수 있다.
"요법적 치료"는 질환 또는 장애의 징후를 감소시키거나 제거할 목적으로 질환 또는 장애의 징후를 나타내는 대상체에게 투여되는 치료이다.
본원에 사용된 "질환 또는 장애를 치료하는"은 환자가 경험하는 질환 또는 장애의 징후 및/또는 증상의 빈도 및/또는 중증도를 감소시키는 것을 의미한다.
본원에 사용된 "생물학적 샘플", "샘플" 또는 "표본"이라는 문구는 핵산 또는 폴리펩타이드의 발현이 검출될 수 있는 세포, 조직 또는 체액을 포함하는 임의의 샘플을 포함하도록 의도된다. 생물학적 샘플은 원하는 바이오마커를 검출하기에 적합한 임의의 생물학적 물질을 함유할 수 있고, 개체로부터 수득된 세포 및/또는 비-세포 물질을 포함할 수 있다. 이러한 생물학적 샘플의 예는 혈액, 림프, 골수, 생검 및 스미어(smear)이 포함되지만 이에 국한되지는 않는다. 본질적으로 액체인 샘플은 본원에서 "체액"이라고 한다. 생물학적 샘플은 예를 들어 부위를 긁거나 면봉질하거나 바늘을 사용하여 체액을 얻는 것을 포함하는 다양한 기술을 통해 환자로부터 얻을 수 있다. 다양한 신체 샘플을 수집하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
본원에 사용된 용어 "항체"는 항원의 특정 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 분자를 지칭한다. 항체는 천연 공급원 또는 재조합 공급원으로부터 유래된 온전한 면역글로불린일 수 있고 온전한 면역글로불린의 면역반응성 부분일 수 있다. 본 발명의 항체는 예를 들어, 다클론성 항체, 단클론성 항체, 세포내 항체 ("인트라바디"), Fv, Fab, Fab', F(ab)2 및 F(ab')2, 뿐만 아니라 단쇄 항체 (scFv), 중쇄 항체, 예컨대 낙타과 항체, 및 인간화된 항체를 포함하는 다양한 형태로 존재할 수 있다 (Harlow 등, 1999, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow 등, 1989, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston 등, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird 등, 1988, Science 242:423-426).
본원에 사용된 용어 "합성 항체"란 재조합 DNA 기술을 사용하여 생성된 항체, 예를 들어 박테리오파지에 의해 발현되는 항체를 의미한다. 이 용어는 또한 항체를 인코딩하는 DNA 분자의 합성에 의해 생성되고 DNA 분자가 항체 단백질, 또는 항체를 특정하는 아미노산 서열을 발현하는 항체를 의미하는 것으로 해석되어야 하며, 여기서 DNA 또는 아미노산 서열은 이용가능하고 당업계에 잘 알려진 합성 DNA 또는 아미노산 서열 기술을 사용하여 수득된다.
본원에 사용된 용어 "중쇄 항체" 또는 "중쇄 항체들"은 펩타이드를 사용한 면역화 및 후속 혈청 단리, 또는 이러한 항체를 인코딩하는 핵산 서열의 클로닝 및 발현에 의해 낙타과 종으로부터 유래된 면역글로불린 분자를 포함한다. "중쇄 항체" 또는 "중쇄 항체들"이라는 용어는 중쇄 질환이 있는 대상체로부터 단리되거나 대상체로부터 VH(가변 중쇄 면역글로불린) 유전자의 클로닝 및 발현에 의해 제조된 면역글로불린 분자를 추가로 포함한다.
"키메라 항체"는 수용체 항체로부터 유래된 경쇄 및 중쇄 불변 영역과 연합하여 공여자 항체로부터 유래된 자연 발생 가변 영역(경쇄 및 중쇄)을 함유하는 조작된 항체의 유형을 지칭한다.
"인간화 항체"는 비-인간 공여자 면역글로불린으로부터 유래된 CDR을 갖는 조작된 항체 유형을 말하며, 분자의 나머지 면역글로불린 유래 부분은 하나(또는 그 초과) 인간 면역글로불린(들)에서 유래된다. 또한, 프레임워크 지지 잔기는 결합 친화성을 보존하기 위해 변경될 수 있다(예를 들어, 1989, Queen 등, Proc. Natl. Acad Sci USA, 86:10029-10032; 1991, Hodgson 등, Bio/Technology, 9:421를 참조한다). 적합한 인간 수용체 항체는 공여자 항체의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열에 대한 상동성에 의해 통상적인 데이터베이스, 예를 들어 KABAT 데이터베이스, Los Alamos 데이터베이스 및 Swiss Protein 데이터베이스로부터 선택된 것일 수 있다. 공여자 항체의 프레임워크 영역(아미노산 기준)에 대한 상동성을 특징으로 하는 인간 항체는 공여자 CDR의 삽입을 위한 중쇄 불변 영역 및/또는 중쇄 가변 프레임워크 영역을 제공하는 데 적합할 수 있다. 경쇄 불변 또는 가변 프레임워크 영역을 제공할 수 있는 적합한 수용체 항체는 유사한 방식으로 선택될 수 있다. 수용체 항체 중쇄 및 경쇄는 동일한 수용체 항체에서 유래할 필요가 없다는 점에 유의해야 한다. 선행 기술은 이러한 인간화 항체를 생산하는 여러 방법을 기재한다(예를 들어 EP-A-0239400 및 EP-A-054951 참조).
용어 "공여자 항체"는 변경된 면역글로불린 코딩 영역 및 공여자 항체의 항원 특이성 및 중화 활성 특징을 갖는 생성된 발현된 변경된 항체를 제공하기 위해 그의 가변 영역, CDR, 또는 그의 다른 기능적 단편 또는 유사체의 아미노산 서열을 제1 면역글로불린 파트너에 제공하는 항체 (단클론성, 및/또는 재조합)를 지칭한다.
용어 "수용체 항체"는 공여자 항체에 대해 이종인 항체 (단클론성 및/또는 재조합)를 지칭하며, 이는 제1 면역글로불린 파트너에 그의 중쇄 및/또는 경쇄 프레임워크 영역 및/또는 그의 중쇄 또는 경쇄 불변 영역을 코딩하는 아미노산 서열의 전부 (또는 임의의 부분, 그러나 일부 구현예에서는 전부)를 제공한다. 특정 구현예에서, 인간 항체는 수용체 항체이다.
용어 "융합 단백질"은 별개의 단백질로부터 유래된 둘 이상의 폴리펩타이드의 부착을 통해 생성된 단백질을 지칭한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 (예를 들어, 융합 단백질의 각 부분을 인코딩하는 핵산을 부착함으로써) 재조합 DNA 기술을 사용하여 생성되고 일반적으로 생물학적 연구 또는 요법에 사용된다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 융합 단백질의 폴리펩타이드 부분 사이에 링커가 있거나 없는 화학적 접합(예를 들어, 공유 접합 등)을 통해 생성된다.
본원에 사용된 용어 "부착하다" 또는 "부착된"은 2종 이상의 성분을 함께 유지하기 위해 결합, 연결, 힘 또는 타이에 의한 연결 또는 통합을 지칭하며, 이는 예를 들어 제1 폴리펩타이드가 제2 폴리펩타이드 또는 물질에 직접 결합되는 경우, 및 예를 들어 1종 이상의 중간체 화합물 (예를 들어, 아미노산, 펩타이드, 폴리펩타이드 등)이 제1 폴리펩타이드와 제2 폴리펩타이드 또는 물질의 사이에 배치되는 경우 직접 또는 간접 부착을 포괄한다.
"CDR"은 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 초가변 영역인 항체의 상보성 결정 영역 아미노산 서열로 정의된다. 예를 들어 문헌[Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)]을 참조한다. 면역글로불린의 가변 부분에는 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR(또는 CDR 영역)이 있다. 따라서, 본원에 사용된 "CDR"은 모두 3개의 중쇄 CDR 또는 모두 3개의 경쇄 CDR(또는 적절한 경우 모든 중쇄 및 모든 경쇄 CDR 둘 모두)을 지칭한다. 항체의 구조 및 단백질 폴딩은 다른 잔기가 항원 결합 영역의 일부로 간주되고 당업자에 의해 그렇게 이해될 것임을 의미할 수 있다. 예를 들어 문헌[Chothia 등, (1989) Conformations of immunoglobulin hypervariable regions; Nature 342, p 877-883]를 참조한다.
본원에 사용된 "면역검정"은 표적 분자를 검출하고 정량화하기 위해 표적 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 사용하는 임의의 결합 검정을 지칭한다.
항체와 관련하여 본원에 사용된 용어 "특이적으로 결합한다"는 특정 표적 분자를 인식하고 이에 결합하지만, 샘플 내의 다른 분자를 실질적으로 인식하거나 결합하지 않는 항체를 의미한다. 일부 경우에, 용어 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합하는"은 인식 및 결합이 표적 분자 상의 특정 구조(예를 들어, 항원 결정기 또는 에피토프)의 존재에 의존함을 의미하는 데 사용된다. 예를 들어, 항체가 에피토프 "A"에 특이적으로 결합하는 경우, 표지된 "A" 및 항체를 함유하는 반응에서 에피토프 A를 함유하는 표지되지 않은 분자(또는 유리, 표지되지 않은 A)의 존재는 항체에 결합된 표지된 A의 양을 감소시킬 것이다.
유전자의 "코딩 영역"은 유전자의 전사에 의해 생성된 mRNA 분자의 코딩 영역과 상동성이거나 상보적인 유전자의 코딩 가닥의 뉴클레오타이드 잔기 및 유전자의 비-코딩 가닥의 뉴클레오타이드로 이루어진다.
mRNA 분자의 "코딩 영역"은 또한 mRNA 분자의 번역 동안 전달 RNA 분자의 안티코돈 영역과 일치하거나 정지 코돈을 인코딩하는 mRNA 분자의 뉴클레오타이드 잔기로 이루어진다. 따라서, 코딩 영역은 mRNA 분자에 의해 인코딩되는 성숙한 단백질에 존재하지 않는 아미노산 잔기에 대한 코돈을 포함하는 뉴클레오타이드 잔기(예를 들어, 단백질 배출 신호 서열 내의 아미노산 잔기)를 포함할 수 있다.
"차등적으로 감소된 발현" 또는 "하향 조절"은 적어도 10% 이상, 예를 들어, 20%, 30%, 40%, 또는 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이하, 및/또는 2.0 배, 1.8 배, 1.6 배, 1.4 배, 1.2 배, 1.1 배 이하, 및 대조군보다 이들 사이의 임의의 및 모든 전체 또는 부분적 증분인 바이오마커 생성물 수준을 지칭한다.
"차등적으로 증가된 발현" 또는 "상향 조절"은 적어도 10% 이상, 예를 들어, 20%, 30%, 40%, 또는 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상, 및/또는 1.1 배, 1.2 배, 1.4 배, 1.6 배, 1.8 배, 2.0 배 이상, 및 대조군보다 이들 사이의 임의의 및 모든 전체 또는 부분적 증분인 바이오마커 생성물 수준을 지칭한다.
핵산을 지칭하기 위해 본원에 사용된 "상보적"은 2개의 핵산 가닥의 영역 사이 또는 동일한 핵산 가닥의 2개의 영역 사이의 서열 상보성의 광범위한 개념을 지칭한다. 제1 핵산 영역의 아데닌 잔기는 그 잔기가 티민 또는 우라실인 경우 제1 영역에 역평행인 제2 핵산 영역의 잔기와 특이적 수소 결합("염기 짝짓기")을 형성할 수 있는 것으로 알려져 있다. 유사하게, 제1 핵산 가닥의 시토신 잔기는 그 잔기가 구아닌인 경우 제1 가닥에 역평행인 제2 핵산 가닥의 잔기와 염기 짝짓기를 할 수 있는 것으로 알려져 있다. 핵산의 제1 영역은, 2개의 영역이 역평행 방식으로 배열될 때, 제1 영역의 적어도 하나의 뉴클레오타이드 잔기가 제2 영역의 잔기와 염기 쌍형성할 수 있는 경우에, 동일하거나 상이한 핵산의 제2 영역에 상보적이다. 일부 구현예에서, 제1 영역은 제1 부분을 포함하고 제2 영역은 제2 부분을 포함하며, 이에 의해 제1 및 제2 부분이 역평행 방식으로 배열될 때, 제1 부분의 뉴클레오타이드 잔기의 적어도 약 50%, 및 또는 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%는 제2 부분의 뉴클레오타이드 잔기와 염기쌍을 이룰 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 부분의 모든 뉴클레오타이드 잔기는 제2 부분의 뉴클레오타이드 잔기와 염기쌍을 이룰 수 있다.
본원에 사용된 용어 "DNA"는 데옥시리보핵산으로 정의된다.
"인코딩(encoding)"은 뉴클레오타이드의 한정된 서열 (즉, rRNA, tRNA 및 mRNA) 또는 아미노산의 한정된 서열을 갖는 생물학적 과정에서 다른 중합체 및 거대분자의 합성을 위한 주형으로서 작용하는 폴리뉴클레오타이드, 예컨대 유전자, cDNA 또는 mRNA 내의 뉴클레오타이드의 특정 서열의 고유한 특성 및 그로부터 생성된 생물학적 특성을 지칭한다. 따라서 해당 유전자에 상응하는 mRNA의 전사 및 번역이 세포 또는 다른 생물학적 시스템에서 단백질을 생성하는 경우 유전자는 단백질을 인코딩한다. 뉴클레오타이드 서열이 mRNA 서열과 동일하고 통상적으로 서열 목록에 제공되는 코딩 가닥, 및 유전자 또는 cDNA의 전사를 위한 주형으로서 사용되는 비-코딩 가닥 둘 다는 단백질 또는 그 유전자의 다른 생성물 또는 cDNA를 코딩하는 것으로 지칭될 수 있다.
달리 명시되지 않는 한, "아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열"은 서로의 축퇴 버전이고 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 모든 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 단백질 또는 RNA를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이라는 어구는 또한 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 일부 버전에서 인트론(들)을 함유할 수 있는 정도로 인트론을 포함할 수 있다.
"단리된"은 자연 상태에서 변경되거나 제거된 것을 의미한다. 예를 들어, 살아있는 대상체의 정상적인 상황에서 자연적으로 존재하는 핵산 또는 펩타이드는 "단리"되지 않지만, 동일한 핵산 또는 펩타이드는 자연적 맥락의 공존 물질로부터 부분적으로 또는 완전히 분리되어 "단리"된다. 단리된 핵산 또는 단백질은 실질적으로 정제된 형태로 존재할 수 있거나, 예를 들어 숙주 세포와 같은 비-천연 환경에 존재할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "하이브리도마(hybridoma)"는 B-림프구 및 융합 파트터 예컨대 골수종 세포의 융합으로부터 생성된 세포를 지칭한다. 하이브리도마는 세포 배양에서 무한정 클로닝되고 유지될 수 있으며 단일클론 항체를 생산할 수 있다. 하이브리도마는 또한 하이브리드 세포로 간주될 수 있다.
"분리된 핵산"은 자연 발생 상태에서 그에 측접된 서열로부터 분리된 핵산 절편 또는 단편, 즉 단편에 정상적으로 인접한 서열, 즉 자연 발생 게놈 내의 단편에 인접한 서열로부터 제거된 DNA 단편을 지칭한다. 이 용어는 또한 핵산에 자연적으로 수반되는 다른 성분, 즉 세포 내에서 천연적으로 수반하는 RNA 또는 DNA 또는 단백질로부터 실질적으로 정제된 핵산에 적용된다. 따라서, 상기 용어는 예를 들어 벡터 내로, 자가 복제 플라스미드 또는 바이러스 내로, 또는 원핵생물 또는 진핵생물의 게놈 DNA 내로 혼입되거나, 또는 다른 서열과 독립적으로 별도의 분자로서 (즉, PCR 또는 제한 효소 소화에 의해 생성된 cDNA 또는 게놈 또는 cDNA 단편으로서) 존재하는 재조합 DNA를 포함한다. 또한 추가 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하이브리드 유전자의 일부인 재조합 DNA를 포함한다.
본 발명의 맥락에서, 일반적으로 발생하는 핵산 염기에 대해 하기 약어가 사용된다. "A"는 아데노신을 지칭하고, "C"는 시토신을 지칭하고, "G"는 구아노신을 지칭하고, "T"는 티미딘을 지칭하고, 그리고 "U"는 우리딘을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "폴리뉴클레오타이드"는 뉴클레오타이드의 사슬로 정의된다. 또한 핵산은 뉴클레오타이드의 중합체이다. 따라서, 본 명세서에 사용된 핵산 및 폴리뉴클레오타이드는 상호교환가능하다. 당업자는 핵산이 단량체 "뉴클레오타이드"로 가수분해될 수 있는 폴리뉴클레오타이드라는 일반적인 지식을 가지고 있다. 단량체 뉴클레오타이드는 뉴클레오시드로 가수분해될 수 있다. 본원에 사용된 폴리뉴클레오타이드는 비제한적으로 재조합 수단, 즉 통상의 클로닝 기술 및 PCR 등을 사용한 재조합 라이브러리 또는 세포 게놈으로부터의 핵산 서열의 클로닝, 및 합성 수단을 포함한 관련 기술분야에서 이용가능한 임의의 수단에 의해 수득되는 모든 핵산 서열을 포함하나, 이에 국한되지는 않는다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "펩타이드", "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 상호교환적으로 사용되며, 펩타이드 결합에 의해 공유 연결된 아미노산 잔기로 이루어진 화합물을 지칭한다. 단백질 또는 펩타이드는 적어도 2개의 아미노산을 포함해야 하며, 단백질 또는 펩타이드의 서열을 구성할 수 있는 아미노산의 최대 수에는 제한이 없다. 폴리펩타이드는 펩타이드 결합에 의해 서로 연결된 2개 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 펩타이드 또는 단백질을 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 이 용어는 예를 들어 당업계에서 일반적으로 펩타이드, 올리고펩타이드 및 올리고머로 지칭되는 단쇄 및 당업계에서 일반적으로 단백질로 지칭되는 보다 긴 사슬을 지칭하며, 이들 중 많은 유형이 있다. "폴리펩타이드"는 그 중에서도 예를 들어, 생물학적 활성 단편, 실질적으로 상동성 폴리펩타이드, 올리고펩타이드, 동종이량체, 이종이량체, 폴리펩타이드의 변이체, 변형된 폴리펩타이드, 유도체, 유사체, 융합 단백질 또는 변이체 또는 그의 단편을 포함한다. 폴리펩타이드는 천연 펩타이드, 재조합 펩타이드, 합성 펩타이드, 또는 이들의 조합을 포함한다.
본 명세서에서 "자손"이라는 용어는 후손(descendent) 또는 후손(offspring)을 의미하며, 포유동물의 후손을 포함하며, 모세포로부터 유래된 분화 또는 미분화 죽은 세포도 포함한다. 한 용법에서 자손이라는 용어는 부모와 유전적으로 동일한 자손 세포를 의미한다. 다른 용도에서, 자손이라는 용어는 모체와 유전적으로 및 표현형적으로 동일한 자손 세포를 지칭한다. 또 다른 용법에서, 자손이라는 용어는 모 세포로부터 분화된 자손 세포를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "RNA"는 리보핵산으로 정의된다.
본 명세서에 사용된 용어 "재조합 DNA"는 상이한 소스로부터의 DNA 조각을 연결함으로써 생성된 DNA로 정의된다.
본원에 사용된 용어 "재조합 폴리펩타이드"는 재조합 DNA 방법을 사용하여 생성된 폴리펩타이드로 정의된다.
본원에 사용된 "접합된"은 한 분자의 제2 분자에 대한 공유 부착을 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "변이체"는 각각 참조 핵산 서열 또는 펩타이드 서열과 서열이 다르지만 참조 분자의 필수적인 생물학적 특성을 유지하는 핵산 서열 또는 펩타이드 서열이다. 핵산 변이체의 서열 변화는 참조 핵산에 의해 인코딩된 펩타이드의 아미노산 서열을 변경하지 않거나 아미노산 치환, 추가, 결실, 융합 및 말단절단을 초래할 수 있다. 펩타이드 변이체의 서열 변화는 일반적으로 제한적이거나 보존적이어서 참조 펩타이드와 변이체의 서열은 전반적으로 매우 유사하고 많은 영역에서 동일한다. 변이체 및 참조 펩타이드는 임의의 조합에서 하나 이상의 치환, 추가, 결실에 의해 아미노산 서열이 상이할 수 있다. 핵산 또는 펩타이드의 변이체는 대립유전자 변이체와 같이 자연적으로 발생하거나 자연적으로 발생하는 것으로 알려지지 않은 변이체일 수 있다. 핵산 및 펩타이드의 비천연 발생 변이체는 돌연변이유발 기술 또는 직접 합성에 의해 제조될 수 있다. 다양한 구현예에서, 변이체 서열은 참조 서열과 적어도 99%, 적어도 98%, 적어도 97%, 적어도 96%, 적어도 95%, 적어도 94%, 적어도 93%, 적어도 92%, 적어도 91%, 적어도 90%, 적어도 89%, 적어도 88%, 적어도 87%, 적어도 86%, 적어도 85% 동일하다.
본원에 사용된 용어 "조절하는"은 기질의 수준 또는 활성을 변경하는 임의의 방법을 의미할 수 있다. 단백질과 관련하여 조절하는 비제한적인 예는 발현에 영향을 미치고(전사 및/또는 번역을 포함함), 폴딩에 영향을 미치고, 분해 또는 단백질 턴오버에 영향을 미치고, 그리고 단백질의 국재화에 영향을 미치는 것을 포함한다. 효소에 관한 조절의 비제한적인 예는 효소 활성에 영향을 미치는 것을 추가로 포함한다. "조절인자"는 활성이 기질의 수준 또는 활성에 영향을 미치는 것을 포함하는 분자를 지칭한다. 조절인자는 직접적이거나 간접적일 수 있다. 조절인자는 그 기질을 활성화 또는 억제하거나 달리 조절하는 기능을 할 수 있다.
본원에 사용된 "스캐닝 윈도우"는 서열이 임의의 측접 서열과 독립적으로 평가될 수 있는 다수의 인접 위치의 세그먼트를 지칭한다. 스캐닝 윈도우는 일반적으로 각각의 새로운 세그먼트가 독립적으로 평가되는 평가될 서열의 길이를 따라 점진적으로 이동한다. 증분 이동은 하나 또는 둘 이상의 위치일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "벡터"는 복제 기원을 포함하는 핵산 서열을 의미할 수 있다. 벡터는 플라스미드, 박테리오파지, 박테리아 인공 염색체 또는 효모 인공 염색체일 수 있다. 벡터는 DNA 또는 RNA 벡터일 수 있다. 벡터는 자가 복제 염색체외 벡터 또는 숙주 게놈에 통합되는 벡터일 수 있다.
범위: 본 개시 전반에 걸쳐, 본 발명의 다양한 측면이 범위 형식으로 제시될 수 있다. 범위 형식의 설명은 단지 편의와 간결함을 위한 것이며 본 발명의 범위에 대한 융통성 없는 제한으로 해석되어서는 안 된다는 것을 이해해야 한다. 따라서 범위의 설명은 구체적으로 개시된 모든 가능한 하위범위 뿐만 아니라 그 범위 내의 개별 수치 값을 갖는 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 1에서 6과 같은 범위의 설명은 구체적으로 개시된 하위범위 예컨대 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등, 뿐만 아니라 범위 내의 개별 숫자, 예를 들어, 1, 2, 2.7, 3, 4, 5, 5.3, 및 6을 갖는 것으로 간주되어야 한다. 이것은 범위의 폭에 관계없이 적용된다.
설명
본 발명은 항-C5 항체 또는 이의 융합 단백질을 사용한 보체 신호전달의 억제에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명은 C3 및 C5 활성을 모두 억제할 수 있는 이기능성 보체 억제제를 사용한 보체 신호전달의 억제에 관한 것이다. 다양한 구현예에서, 본 발명은 부분적으로 개체를 그의 항-C5 항체 융합 단백질과 접촉시킴으로써 개체에서 보체 매개 질환 또는 보체 매개 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다.
보체 억제제 및 이기능성 항체
본 발명은 항-인간 C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항-C5 항체 또는 변이체 또는 그의 단편, 항-C5 융합 단백질 항체 또는 변이체 또는 그의 단편, 등)을 사용하는 보체 신호전달 및 보체 관련 장애의 억제와 관련된다. 일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이들의 조합은 C5 및 C3 활성화를 억제할 때 이기능성 활성을 나타낸다. 일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 그의 조합은 C5에 대한 pH 의존성 결합을 나타낸다.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 그의 조합은 C5에 대한 pH 의존성 결합을 나타낸다. 일부 구현예에서, pH 의존성 항-C5 항체, 융합 단백질 또는 그의 조합은 보다 산성 pH(예를 들어, 엔도솜에서 발견되는 것과 같은 약 pH 5.8)에서보다 보다 중성인 pH(예를 들어, 혈액에서 발견되는 것과 같은 약 pH 7.4)에서 C5에 더 강하게 결합한다. 이러한 pH 의존성 결합은 투여된 항체 또는 항체 융합 단백질 분자의 보다 큰 지속성을 제공하는데, 이는 세포에 의해 흡수된 면역 복합체 (즉, C5에 결합된 항-C5 mAb 및/또는 C5에 결합된 항-C5 mAb-FH 융합 단백질)가 엔도솜의 산성 환경에서 해리될 것이고, 유리된 항체 또는 항체의 FH 융합 단백질이 신생아 Fc 수용체 (FcRn)를 통해 세포 밖으로 다시 재순환되게 할 것이며, 여기서 새로운 C5 분자에 결합하는 것이 이용가능하다.
일 구현예에서, 본 발명은 보체 성분 C3 단백질, 또는 단백질 C3a 또는 C3b의 단편을 특이적으로 표적화함으로써 보체 신호전달 캐스케이드를 억제하는 것에 관한 것이다. 일 구현예에서, 본 발명은 보체 성분 C5 단백질, 또는 단백질 C5a 또는 C5b의 단편을 특이적으로 표적화함으로써 보체 신호전달 캐스케이드를 억제하는 것에 관한 것이다. 일 구현예에서, 본 발명은 보체 성분 C3 단백질, 단백질 C3a 또는 C3b의 단편, C5 단백질, 단백질 C5a 또는 C5b의 단편, 또는 이들의 임의의 조합을 특이적으로 표적화함으로써 보체 신호전달 캐스케이드를 억제하는 것에 관한 것이다. 일 구현예에서, 본 발명은 원치 않는 제어되지 않는 과도한 보체 활성화에 의해 매개되는 염증 및 자가면역 질환을 치료 및 예방하는 방법에 관한 것이다. 일 구현예에서, 본 발명은 개체를 항-C5 항체와 접촉시킴으로써 개체의 보체 매개 질환 또는 보체 매개 장애의 치료에 관한 것이다. 일 구현예에서, 본 발명은 개체를 항-C5 융합 단백질 항체와 접촉시킴으로써 개체에서 보체 매개 질환 또는 보체 매개 장애의 치료에 관한 것이다. 일 구현예에서, 본 발명은 개체를 항-C5 항체 또는 항-C5 융합 단백질 항체와 접촉시킴으로써 개체의 보체 매개 질환 또는 보체 매개 장애의 치료에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 개체에서 보체 매개 질환 또는 장애를 치료하는 방법이고, 상기 방법은 상기 개체에게 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 그의 조합을 투여하여, C3a 또는 C3b 단백질의 생성, 및 MAC의 형성을 억제하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명은 개체에서 보체 매개 질환 또는 장애를 치료하는 방법이고, 상기 방법은 상기 개체에게 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 그의 조합을 투여하여, C5a 또는 C5b 단백질의 생성, 및 MAC의 형성을 억제하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명은 개체에서 보체 매개 질환 또는 장애를 치료하는 방법이고, 상기 방법은 상기 개체에게 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 그의 조합을 투여하여, C3a 또는 C3b 단백질의 생성을 억제하고, C5a 또는 C5b 단백질의 생성, 및 MAC의 형성을 억제하는 단계를 포함한다. 본 발명의 방법을 사용하여 치료할 수 있는 보체 매개 병리의 예는 MD, AMD, 허혈 재관류 손상, 관절염, 류마티스성 관절염, 루푸스, 궤양성 대장염, 뇌졸중, 수술 후 전신 염증 증후군, 천식, 알러지성 천식, COPD, PNH 증후군, 중증 근무력증, NMO, 다발성 경화증, 지연된 이식 기능, 항체 매개 거부, aHUS, CRVO, CRAO, 수포성 표피박리증, 패혈증, 장기 이식, 염증 (심폐 바이패스 수술 및 신장 투석과 연관된 염증을 포함하지만 이에 국한되지 않음), C3 사구체병증, 막성 신병증, IgA 신병증, 사구체신염 (ANCA 매개 사구체신염, 루푸스 신장염, 및 그의 조합을 포함하지만 이에 국한되지 않음), ANCA 매개 혈관염, 시가 독소 유도된 HUS, 및 항인지질 항체-유도된 임신 손실, 또는 그의 임의의 조합을 포함하지만 이에 국한되지 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 에쿨리주맙 또는 라불리주맙을 사용한 치료에 적절하게 반응하지 않는 PNH를 갖는 대상체를 비롯한 대상체를 치료하는 데 유용하다. 비제한적인 예로서, 일부 대상체는 에쿨리주맙 또는 라불리주맙의 치료에 내성을 갖게 할 수 있는 C5의 알파 사슬 돌연변이를 가질 수 있다(문헌[Genetic variants in C5 and poor response to eculizumab. Nishimura J, 등, N Engl J Med. 2014 Feb 13;370(7):632-9]을 참조한다).
"자가" 항원과 "비-자가" 항원을 구별하는 면역계의 능력은 침입하는 미생물에 대한 특정 방어로서 면역계의 기능에 치명적이다. 비-자가(non-self) 항원은 대상체 자신의 구성성분과 검출가능하게 상이하거나 외래인 신체에 들어가거나 존재하는 물질 상의 항원인 반면, "자가(self)" 항원은 건강한 대상체에서 그 자신의 구성성분으로부터 검출가능하게 다르거나 외래가 아닌 것들이다. 방법의 다양한 구현예에서, 억제되는 보체 활성화는 미생물 항원, 비생물학적 외부 표면, 변경된 자가 조직, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군 중 적어도 하나에 의해 촉발된 것이다. 비생물학적 외부 표면의 한 예는 심폐 우회 수술 또는 신장 투석에 사용되는 것과 같은 혈액 튜빙이다. 변경된 자가 조직의 예는 세포자멸사, 괴사 및 허혈 스트레스를 받은 조직 및 세포, 기능적 보체 조절 단백질이 결여된 조직 및 세포, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항-C5 항체 (예를 들어, 항-C5 항체, 항-C5 융합 단백질 항체, 항체 단편, 항체 변이체, 등)는 대안적인 보체 경로 (AP), 전통적 경로 (CP), 또는 렉틴 경로 (LP)의 활성화의 다운스트림 효과를 억제한다. 일반적으로 CP는 항원-항체 복합체에 의해 시작되고 LP는 렉틴이 미생물 표면의 당 분자에 결합하여 활성화되는 반면, AP는 구성적으로 낮은 수준에서 활성이지만 조절 단백질의 부족으로 인해 박테리아, 바이러스 및 기생 세포 표면에서 빠르게 증폭될 수 있다. 숙주 세포는 일반적으로 조절 단백질에 의해 AP 보체 활성화로부터 보호된다. 그러나 조절 단백질에 결함이 있거나 없는 경우와 같은 일부 상황에서, AP가 숙주 세포에서 제어할 수 없을 정도로 활성화되어 보체 매개 질환이나 장애를 유발할 수도 있다. CP는 구성요소 C1, C2, C4로 구성되며 C3 활성화 단계에서 AP와 수렴된다. LP는 만노스 결합 렉틴(MBL) 및 MBL 관련 세린 프로테아제(MASP)로 구성되며 CP와 구성요소 C4 및 C2를 공유한다. AP는 구성요소 C3 및 몇 개의 인자, 예컨대 인자 B, 인자 D, 프로페르딘, C5 및 유체상 조절인자 FH로 이루어진다. 보체 활성화는 (a) 인식, (b) 효소 활성화, 및 (c) 세포 사멸로 이어지는 막 공격의 3개의 상으로 이루어진다. CP 보체 활성화의 제1 상은 C1에서 시작된다. C1은 3개의 별개의 단백질로 이루어진다: 칼슘 의존성 사량체 복합체 C1r2 s2에서 함께 결합되는, 인식 서브유닛, C1q, 및 세린 프로테아제 하위구성요소, C1r 및 C1s. 온전한 C1 복합체는 결과적으로 C1의 생리학적 활성화에 필요하다. 활성화는 온전한 C1 복합체가 항원과 복합체를 형성한 면역글로불린에 결합할 때 발생한다. 이 결합은 C1을 활성화시킨 다음, C4 및 C2 단백질을 절단하여C4a 및 C4b, 뿐만 아니라 C2a 및 C2b를 생성한다. C4b 및 C2a 단편은 결합하여 C3 전환효소인 C4b2a를 형성하고, 이는 차례로 C3을 절단하여 C3a 및 C3b를 형성한다. LP의 활성화는 표적 표면 상의 특정 당에 대한 MBL 결합에 의해 개시되고, 이는 이후 CP의 C1의 활성과 유사한 방식으로 C4 및 C2를 절단하는 MASP의 활성화를 촉발하여, C3 전환효소, C4b2a의 생성을 초래한다. 따라서 CP와 LP는 다른 메커니즘에 의해 활성화되지만 동일한 구성요소 C4와 C2를 공유하며 두 경로 모두 동일한 C3 전환효소인 C4b2a를 생성한다. C4b2a에 의한 C3의 C3b 및 C3a로의 절단은 두 가지 이유로 보체 경로의 중심 사건이다. 표면 침착된 C3b가 AP의 중앙 중간체이기 때문에 AP 증폭 루프를 시작한다. C3a와 C3b는 모두 생물학적으로 중요한다. C3a는 염증을 유발하고 C5a와 함께 아나필라톡신이라고 한다. C3b 및 이의 추가 절단 산물은 또한 중성구, 호산구, 단핵구 및 대식세포에 존재하는 보체 수용체에 결합하여 C3b-옵소닌화된 입자의 포식작용 및 청소능을 촉진한다. 마지막으로, C3b는 C4b2a와 회합하여 CP 및 LP의 C5 전환효소를 형성하여 말단 보체 서열을 활성화하여, 강력한 염증 유발 매개체인 C5a의 생성과 용해성 MAC인 C5-C9의 조립을 유도할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 방법을 사용하여 억제되는 보체 경로의 활성은 지질다당류(LPS), 지질올리고당(LOS), 병원체-관련 분자 패턴(PAMP) 및 위험 관련 분자 패턴(DAMP)로부터 선택된 그룹 중 적어도 하나에 의해 유도된 보체 경로 활성화이다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 방법을 사용하여 억제되는 보체 신호전달의 활성은 C5a 단백질의 생성이다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 방법을 사용하여 억제되는 보체 신호전달의 활성은 C5b 단백질의 생성이다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 방법을 사용하여 억제되는 보체 신호전달의 활성은 C3a 단백질의 생성이다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 방법을 사용하여 억제되는 보체 신호전달의 활성은 C3b 단백질의 생성이다. 다양한 구현예에서, 본 발명의 방법을 사용하여 억제되는 보체 신호전달의 활성은 C5a 단백질, C5b 단백질, C3a 단백질, C3b 단백질, 또는 이들의 임의의 조합의 생성이다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 방법을 사용하여 억제되는 보체 신호전달의 활성은 MAC의 형성이다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 방법을 사용하여 억제되는 보체 경로의 활성은 C5 의존적이다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 방법을 사용하여 억제되는 보체 경로의 활성은 C3 의존적이다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 방법을 사용하여 억제되는 보체 경로의 활성은 C3 의존성, C5 의존성, 또는 둘 모두이다.
일 구현예에서, 본 발명은 개체에서 말단 보체 활성화의 개시를 억제하는 방법이고, 상기 방법은 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이들의 조합을 개체에게 투여하여 개체에서 CP, LP 또는 AP 활성화로부터 기원하는 말단 보체 활성화의 개시를 억제하는 단계를 포함한다. 이러한 구체예의 예는 보체 매개 용혈을 앓고 있는 PNH 환자 및 보체 매개 aHUS, 천식, 허혈성/재관류 손상, 류마티스성 관절염 및 ANCA 매개 신장 질환을 앓고 있는 개체이다. 본 발명의 다양한 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법을 사용하여 치료될 수 있는 질환 및 장애는 보체 매개 용혈, 보체 매개 aHUS, C3 사구체병증, 시신경척수염, 중증 근무력증, 천식, 허혈성/재관류 손상, 류마티스성 관절염 및 ANCA 매개 신장 질환 또는 장애를 포함하지만 이에 국한되지 않는다.
다양한 다른 구현예에서, 말단 보체 활성화에 억제 효과를 갖는 잠재적인 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이들의 조합을 확인하는 방법이 본원에 제공된다. 그러한 방법 중 하나는 아래에 설명된 양 적혈구 용해 검정이다. 간단히 말해서, 양 RBC(PBS, Complement Technology Inc.에서 제조된 분석 샘플당 1 x 107 세포)를 젤라틴 베로날 완충액 (GVB2+, Sigma; 총 검정 부피: 100 μl)에서 37℃에서 20분 동안 50% 정상 인간 혈청 (Complement Technology Inc로부터의 NHS)과 함께 인큐베이션하였다. 양 RBC에 첨가하기 전에, NHS를 4℃에서 1시간 동안 항-C5 mAb와 함께 사전 인큐베이션하였다. PBS 중 빙랭 40mM EDTA를 첨가하여 용해 반응을 중단시켰다. 인큐베이션 혼합물을 1500 rpm에서 5분 동안 원심분리하고 상청액을 수집하고 OD405 nm에 대해 측정하였다. NHS가 없거나 EDTA가 첨가된 샘플을 음성 용해 대조군으로 사용하고, 증류수로 완전히 용해된 양 RBC의 샘플을 양성 대조군(100% 용해)으로 사용하여 다른 샘플의 용해 %를 정규화하였다. 항-인간 C5 차단 mAb의 확인 스크리닝에 사용할 수 있는 별도의 방법은 하기의 단계들을 포함한다: a) 플레이트를 LPS로 코팅하는 단계; b) 결합되지 않은 LPS를 제거하기 위해 플레이트를 세척하는 단계; c) 인산염-완충 식염수(PBS)에 소 혈청 알부민(BSA)을 첨가하는 단계; d) 결합되지 않은 BSA를 제거하기 위해 플레이트를 세척하는 단계; e) 혈청과 사전 인큐베이션되고 정상 인간 혈청에 혼합된 후보 항-C5 항체 화합물의 혼합물을 첨가하는 단계; f) 플레이트를 세척하는 단계; g) HRP-접합된 항-인간 C5b-9 또는 항-인간 C6 항체 (항-인간 TCC 항체, 클론 aE11 또는 바이오틴 표지된 항-인간 C6 항체, 둘 다 Quidel로부터)를 첨가하는 단계; h) 플레이트를 세척하여 미결합 항체를 제거하는 단계; i) HRP 기질 시약을 첨가하는 단계; j) 황산을 첨가하여 반응을 정지시키는 단계; k) 450 nm에서 광학 밀도를 측정하는 단계; l) 후보 항-C5 항체 화합물을 함유하는 플레이트의 광학 밀도를 양성 비교 대조군 및 음성 비교 대조군의 광학 밀도와 비교하는 단계로서; 상기 광학 밀도가 양성 비교 대조군과 비교하여 감소될 때, 항-C5 항체가 확인되는 단계.
항-C5 항체 및 항-C5 융합 단백질 항체
일부 구현예에서, 본 발명은 C3 전환효소에 의한 C3의 활성화를 특이적으로 억제하는 항체 또는 융합 단백질을 포함하는 조성물을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 C5 활성화에 특이적으로 결합하고 이를 억제하는 항체 또는 융합 단백질을 포함하는 조성물을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 C3, C5, 또는 둘 모두의 활성화를 특이적으로 억제하는 항체 또는 융합 단백질을 포함하는 조성물을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-C5 항체 또는 융합 단백질은 다클론성 항체, 단클론성 항체, 키메라 항체, 또는 인간화 항체이다.
일부 구현예에서, 항체 또는 융합 단백질은 항체 단편이다. 일부 구현예에서, C3은 인간 C3이다. 일부 구현예에서, C5는 인간 C5이다. 일부 구현예에서, 항-C5 항체 융합 단백질은 FH에 연결된 항-C5 mAb이다. 일부 구현예에서, 항-C5 항체 융합 단백질은 FH의 단편에 연결된 항-C5 mAb이다. 일부 구현예에서, FH는 인간 FH이다. 일부 구현예에서, 항-C5 항체 또는 융합 단백질은 C5에 대한 pH 의존성 결합을 나타낸다. 일부 구현예에서, pH 의존성 항-C5 항체 또는 융합 단백질은 보다 산성 pH(예를 들어, 엔도솜에서 발견되는 것과 같은 약 pH 5.8)에서보다 보다 중성인 pH(예를 들어, 혈액에서 발견되는 것과 같은 약 pH 7.4)에서 C5에 더 강하게 결합한다.
일부 구현예에서, 인간-C5에 대한 항체, 융합 단백질, 또는 항체 단편의 결합은 온전한 유기체에서 보체 활성화 경로에서 C3a 또는 C3b의 생성 및 MAC의 형성의 감소와 관련된다. 일부 구현예에서, 인간-C5에 대한 항체, 융합 단백질, 또는 항체 단편의 결합은 온전한 유기체에서 보체 활성화 경로에서 C5a 또는 C5b의 생성 및 MAC의 형성의 감소와 관련된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 인간 C3의 활성화를 억제할 수 있는 단백질 또는 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 본 발명은 인간 C5에 결합할 수 있고 그의 활성화를 억제할 수 있는 단백질 또는 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 본 발명은 인간 C3, 인간 C5, 또는 둘 모두에 결합하고/하거나 그의 활성화를 억제할 수 있는 단백질 또는 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 항체, 융합 단백질, 또는 항체 단편; 단백질 또는 폴리펩타이드는 인간-C3 전환효소의 관련 부분 또는 분획 또는 에피토프에 결합하고; 그리고 항체, 융합 단백질, 또는 그의 항체 단편, 또는 단백질 또는 폴리펩티드의 상호작용이 인간-C3 전환효소의 관련 부분과 상호작용하는 것은 C3a 또는 C3b의 생성 및 온전한 유기체에서의 MAC의 형성의 감소와 관련된다. 일부 구현예에서, 항체, 융합 단백질 또는 항체 단편; 단백질 또는 폴리펩티드는 인간-C5의 관련 부분 또는 분획 또는 에피토프에 결합하고; 항체, 용융 단백질 또는 그의 항체 단편, 또는 단백질 또는 폴리펩티드의 인간- C5의 관련된 부분에 대한 결합은 C5a 또는 C5b의 생성 및 온전한 유기체에서의 MAC 형성의 감소와 연관된다.
일부 구현예에서, 인간 C3 전환효소에 대한 억제 활성을 갖는 항체, 융합 단백질, 또는 그의 단편은 단백질, 펩타이드 또는 다른 화합물에 추가로 접합된다. 일부 구현예에서, 인간-C3 전환효소 억제 항체, 융합 단백질, 또는 그의 항체 단편은 단백질, 펩타이드 또는 다른 화합물에 접합된다. 일부 구현예에서, 인간-C3 전환효소 억제 항체, 융합 단백질, 또는 그의 항체 단편이 접합된 단백질, 펩타이드 또는 기타 화합물은 표적화 모이어티이다 (즉, 표적화 모이어티는 인간-C3 이외의 분자에 특이적으로 결합한다). 일부 구현예에서, 인간-C3 전환효소 억제 항체, 융합 단백질, 또는 그의 항체 단편이 접합되는 단백질, 펩타이드, 또는 다른 화합물은 효과기 분자 (예를 들어, 세포독성 분자)이다.
일부 구현예에서, 인간-C5 결합 항체, 융합 단백질, 또는 그의 C5 결합 항체 단편은 단백질, 펩타이드 또는 다른 화합물에 추가로 접합된다. 일부 구현예에서, 인간-C5 결합 항체, 융합 단백질, 또는 그의 항체 단편은 단백질, 펩타이드 또는 다른 화합물에 접합된다. 일부 구현예에서, 인간-C5 결합 항체, 융합 단백질, 또는 그의 항체 단편이 접합된 단백질, 펩타이드 또는 기타 화합물은 표적화 모이어티이다 (즉, 표적화 모이어티는 인간-C5 이외의 분자에 특이적으로 결합한다). 일부 구현예에서, 인간-C5 결합 항체, 융합 단백질, 또는 그의 항체 단편이 접합되는 단백질, 펩타이드, 또는 다른 화합물은 효과기 분자 (예를 들어, 세포독성 분자)이다.
일부 구현예에서, 인간-C3 전환효소 억제 및 -C5 결합 항체, 융합 단백질, 또는 그의 C3 전환효소 억제 및 C5 결합 항체 단편은 단백질, 펩타이드 또는 다른 화합물에 추가로 접합된다. 일부 구현예에서, 인간-C3 전환효소 억제 및 -C5 결합 항체, 융합 단백질, 또는 그의 항체 단편은 단백질, 펩타이드 또는 다른 화합물에 접합된다. 일부 구현예에서, 인간-C3 전환효소 억제 및 -C5 결합 항체, 융합 단백질, 또는 그의 항체 단편이 접합된 단백질, 펩타이드 또는 기타 화합물은 표적화 모이어티이다 (즉, 표적화 모이어티는 인간-C3 및 -C5 이외의 분자에 특이적으로 결합한다). 일부 구현예에서, 인간-C3 전환효소 억제 및 -C5 결합 항체, 융합 단백질, 또는 그의 항체 단편이 접합되는 단백질, 펩타이드, 또는 다른 화합물은 효과기 분자 (예를 들어, 세포독성 분자)이다.
다양한 구현예에서, 항체는 융합 단백질이다. 일 구현예에서, 융합 단백질은 보체 대조군 단백질을 포함한다. 일 구현예에서, 융합 단백질은 CR1 또는 그의 단편을 포함한다. 일 구현예에서, 융합 단백질은 MCP 또는 그의 단편을 포함한다. 일 구현예에서, 융합 단백질은 C4BP 또는 그의 단편을 포함한다. 일 구현예에서, 융합 단백질은 DAF 또는 그의 단편을 포함한다. 일 구현예에서, 융합 단백질은 ApoE 또는 그의 단편을 포함한다. 일 구현예에서, 융합 단백질은 FH 단백질 또는 그의 단편을 포함한다. 일 구현예에서, 융합 단백질은 인간 IgG4 또는 그의 단편을 포함한다. 일 구현예에서, 융합 단백질은 링커를 포함한다. 다양한 구현예에서, 융합 단백질은 CR1 또는 그의 단편, MCP 또는 그의 단편, C4BP 또는 그의 단편, DAF 또는 그의 단편, ApoE 또는 그의 단편, FH 단백질 또는 그의 단편, 인간 IgG4 또는 그의 단편, 링커, 또는 그의 임의의 조합을 포함한다.
일 구현예에서, FH의 단편은 FH 단백질의 적어도 1개의 SCR 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, FH의 단편은 FH 단백질의 적어도 2개의 SCR 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, FH의 단편은 FH 단백질의 적어도 3개의 SCR 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, FH의 단편은 FH 단백질의 적어도 4개의 SCR 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, FH의 단편은 FH 단백질의 적어도 5개의 SCR 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, FH의 단편은 FH 단백질의 적어도 6개의 SCR 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, FH의 단편은 FH 단백질의 적어도 7개의 SCR 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, FH의 단편은 FH 단백질의 적어도 8개의 SCR 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, FH의 단편은 FH 단백질의 적어도 9개의 SCR 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, FH의 단편은 FH 단백질의 적어도 10개의 SCR 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, FH의 단편은 FH 단백질의 적어도 11개의 SCR 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, FH의 단편은 FH 단백질의 적어도 12개의 SCR 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, FH의 단편은 FH 단백질의 적어도 13개의 SCR 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, FH의 단편은 FH 단백질의 적어도 14개의 SCR 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, FH의 단편은 FH 단백질의 적어도 15개의 SCR 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, FH의 단편은 FH 단백질의 적어도 16개의 SCR 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, FH의 단편은 FH 단백질의 적어도 17개의 SCR 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, FH의 단편은 FH 단백질의 적어도 18개의 SCR 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, FH의 단편은 FH 단백질의 적어도 19개의 SCR 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, FH의 단편은 FH 단백질의 20개 이상의 SCR 도메인을 포함한다.
일 구현예에서, FH의 단편은 FH 단백질의 SCR 도메인 1-20을 포함한다. 일 구현예에서, FH의 단편은 FH 단백질의 SCR 도메인 1-5를 포함한다. 일 구현예에서, FH의 단편은 FH 단백질의 SCR 도메인 2-5를 포함한다. 일 구현예에서, FH의 단편은 FH 단백질의 SCR 도메인 3-5를 포함한다. 일 구현예에서, FH의 단편은 FH 단백질의 SCR 도메인 4 및 5를 포함한다. 일 구현예에서, FH의 단편은 FH 단백질의 SCR 도메인 5를 포함한다.
일 구현예에서, 융합 단백질은 항체 및 융합 단백질 파트너 (예를 들어, FH 또는 그의 기능적 단편)를 포함한다. 일 구현예에서, 융합 단백질은 항체에 결합된 융합 단백질 파트너 (예를 들어, FH 또는 그의 기능적 단편)를 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 직접적으로 또는 링커를 통해 항체와 융합된(예를 들어, 결합된) 융합 단백질 파트너(예를 들어, FH 또는 이의 기능적 단편)를 포함한다. 일 구현예에서, 융합 단백질은 하나 이상의 링커로 항체에 결합된 융합 단백질 파트너 (예를 들어, FH 또는 그의 기능적 단편)를 포함한다. 일 구현예에서, 링커는 절단가능한 링커가 아니다. 일 구현예에서, 링커는 절단가능한 링커이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 절단가능한 링커는 화학적으로 절단가능한 링커, 효소 절단가능한 링커, 펩타이드 기반 링커, 또는 이들의 임의의 조합이다.
일부 구현예에서, 화학적으로 절단가능한 링커는 산 절단가능한 링커 또는 환원가능한 링커이다. 일 구현예에서, 산 절단가능한 링커는 혈액 순환의 중성 pH에서 안정하게 유지되지만 가수분해를 거쳐 세포 구획의 산성 환경에서 세포독성 약물을 방출하도록 구체적으로 설계된다. 일 구현예에서, 환원성 링커는 혈류의 산소가 풍부한 환경에서 안정하게 유지되도록 설계되고, 세포의 환원 환경에서 선택적으로 절단된다. 또 다른 구현예에서, 펩타이드 기반 링커는 전신 순환에서 온전하게 유지되고 카텝신 B와 같은 특정 세포내 프로테아제에 의해 절단되도록 설계된다. 링커의 예는 리소좀 특이적 프로테아제 절단 부위를 함유하는 링커, 혼합된 이황화물을 함유하는 링커, 아미노에톡시에톡시아세테이트 (AEEA), β-글루쿠로나이드 링커, 세포내 프로테아제, 예를 들어, 리소좀 프로테아제 또는 엔도좀 프로테아제에 의해 절단가능한 펩타이드 링커, 디펩타이드 링커 (예를 들어, 발린-시트룰린 (val-cit) 또는 페닐알라닌-라이신 (phe-lys) 링커), 아미노헥사노에이트, 하이드라존, 티오말레이미드, 및 디벤조사이클로옥틴 (DBCO)을 포함하지만 이에 국한되지 않는다.
일 구현예에서, 융합 단백질은 링커 없이 항체에 결합된 융합 단백질 파트너 (예를 들어, FH 또는 그의 기능적 단편)를 포함한다. 일 구현예에서, 융합 단백질은 항체의 C-말단에 결합된 융합 단백질 파트너 (예를 들어, FH 또는 그의 기능적 단편)를 포함한다. 일 구현예에서, 융합 단백질은 항체의 N-말단에 결합된 융합 단백질 파트너 (예를 들어, FH 또는 그의 기능적 단편)를 포함한다.
일 구현예에서, 융합 단백질은 항-C5 mAb에 결합된 융합 단백질 파트너 (예를 들어, FH 또는 그의 기능적 단편)를 포함한다. 일 구현예에서, 융합 단백질은 하나 이상의 링커로 항-C5 mAb에 결합된 융합 단백질 파트너 (예를 들어, FH 또는 그의 기능적 단편)를 포함한다.
일 구현예에서, 융합 단백질은 링커 없이 항-C5 mAb에 결합된 융합 단백질 파트너 (예를 들어, FH 또는 그의 기능적 단편)를 포함한다. 일 구현예에서, 융합 단백질은 항-C5 mAb의 C-말단에 결합된 융합 단백질 파트너 (예를 들어, FH 또는 그의 기능적 단편)를 포함한다. 일 구현예에서, 융합 단백질은 항-C5 mAb의 N-말단에 결합된 융합 단백질 파트너 (예를 들어, FH 또는 그의 기능적 단편)를 포함한다.
일 구현예에서, 융합 단백질은 항체의 변이체에 결합된 융합 단백질 파트너 (예를 들어, FH 또는 그의 기능적 단편)를 포함한다. 예를 들어, 일 구현예에서, 융합 단백질은 항-C5 mAb의 변이체에 결합된 융합 단백질 파트너 (예를 들어, FH 또는 그의 기능적 단편)를 포함한다. 일 구현예에서, 융합 단백질은 하나 이상의 링커를 갖는 항체의 변이체에 결합된 융합 단백질 파트너 (예를 들어, FH 또는 그의 기능적 단편)를 포함한다.
일 구현예에서, 융합 단백질은 링커 없이 항체의 변이체에 결합된 융합 단백질 파트너 (예를 들어, FH 또는 그의 기능적 단편)를 포함한다. 일 구현예에서, 융합 단백질은 항체의 변이체의 C-말단에 결합된 융합 단백질 파트너 (예를 들어, FH 또는 그의 기능적 단편)를 포함한다. 일 구현예에서, 융합 단백질은 항체의 변이체의 N-말단에 결합된 융합 단백질 파트너 (예를 들어, FH 또는 그의 기능적 단편)를 포함한다.
일 구현예에서, 융합 단백질은 항체의 단편에 융합된(예를 들어, 결합된) 융합 단백질 파트너(예를 들어, FH 또는 그의 기능적 단편)를 포함한다. 일 구현예에서, 융합 단백질은 링커가 있거나 없는 항체의 단편에 융합된 융합 단백질 파트너 (예를 들어, FH 또는 그의 기능적 단편)를 포함한다. 예를 들어, 일 구현예에서, 융합 단백질은 항-C5 mAb의 단편에 융합된 융합 단백질 파트너 (예를 들어, FH 또는 그의 기능적 단편)를 포함한다. 일 구현예에서, 융합 단백질은 하나 이상의 링커를 갖는 항체의 단편에 융합된 융합 단백질 파트너 (예를 들어, FH 또는 그의 기능적 단편)를 포함한다.
일 구현예에서, 융합 단백질은 링커 없이 항체의 단편에 융합된 융합 단백질 파트너 (예를 들어, FH 또는 그의 기능적 단편)를 포함한다. 일 구현예에서, 융합 단백질은 항체 단편의 C-말단에 융합된 융합 단백질 파트너 (예를 들어, FH 또는 그의 기능적 단편)를 포함한다. 일 구현예에서, 융합 단백질은 항체 단편의 N-말단에 융합된 융합 단백질 파트너 (예를 들어, FH 또는 그의 기능적 단편)를 포함한다.
일 구현예에서, 융합 단백질은 항체의 VH 서열에 융합된 융합 단백질 파트너 (예를 들어, FH 또는 그의 기능적 단편)를 포함한다. 예를 들어, 일 구현예에서, 융합 단백질은 항-C5 mAb의 VH 서열에 융합된 융합 단백질 파트너 (예를 들어, FH 또는 그의 기능적 단편)를 포함한다. 일 구현예에서, 융합 단백질은 하나 이상의 링커를 갖는 항체의 VH 서열에 융합된 융합 단백질 파트너 (예를 들어, FH 또는 그의 기능적 단편)를 포함한다.
일 구현예에서, 융합 단백질은 링커 없이 항체의 VH 서열에 융합된 융합 단백질 파트너 (예를 들어, FH 또는 그의 기능적 단편)를 포함한다. 일 구현예에서, 융합 단백질은 항체의 VH 서열의 C-말단에 융합된 융합 단백질 파트너 (예를 들어, FH 또는 그의 기능적 단편)를 포함한다. 일 구현예에서, 융합 단백질은 항체의 VH 서열의 N-말단에 융합된 융합 단백질 파트너 (예를 들어, FH 또는 그의 기능적 단편)를 포함한다.
일 구현예에서, 융합 단백질은 항체의 VL 서열에 융합된 융합 단백질 파트너 (예를 들어, FH 또는 그의 기능적 단편)를 포함한다. 예를 들어, 일 구현예에서, 융합 단백질은 항-C5 mAb의 VL 서열에 융합된 융합 단백질 파트너 (예를 들어, FH 또는 그의 기능적 단편)를 포함한다. 일 구현예에서, 융합 단백질은 하나 이상의 링커를 갖는 항체의 VL 서열에 융합된 융합 단백질 파트너 (예를 들어, FH 또는 그의 기능적 단편)를 포함한다.
일 구현예에서, 융합 단백질은 링커 없이 항체의 VL 서열에 융합된 융합 단백질 파트너 (예를 들어, FH 또는 그의 기능적 단편)를 포함한다. 일 구현예에서, 융합 단백질은 항체의 VL 서열의 C-말단에 융합된 융합 단백질 파트너 (예를 들어, FH 또는 그의 기능적 단편)를 포함한다. 일 구현예에서, 융합 단백질은 항체의 VL 서열의 N-말단에 융합된 융합 단백질 파트너 (예를 들어, FH 또는 그의 기능적 단편)를 포함한다.
일 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR 중 적어도 하나: VH-CDR1: 서열번호:3; VH-CDR2: 서열번호:4; VH-CDR3: 서열번호:5; VL-CDR1: 서열번호:8; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항-C5 항체는 하기로 이루어진 군의 모든 CDR: VH-CDR1: 서열번호:3; VH-CDR2: 서열번호:4; VH-CDR3: 서열번호:5; VL-CDR1: 서열번호:8; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:3의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및 VL-CDR1: 서열번호:8, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체. 일부 구현예에서, 항-C5 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:3의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; 및 VL-CDR1: 서열번호:8.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:4의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및 VL-CDR2: 서열번호:9, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체. 일부 구현예에서, 항-C5 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:4의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 및 VL-CDR2: 서열번호:9.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:5의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체. 일부 구현예에서, 항-C5 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:5의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; 및 VL-CDR3: 서열번호:10.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:3의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:4의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:5의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:8의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:9의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및 서열번호:10의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:3의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:4의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:5의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; 서열번호:8의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:9의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및 서열번호:10의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:3의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; 서열번호:4의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 서열번호:5의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; 서열번호:8의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; 서열번호:9의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 서열번호:10의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:5의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및 VL-CDR3: 서열번호:11, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체. 일부 구현예에서, 항-C5 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:5의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; 및 VL-CDR3: 서열번호:11.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:3의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:4의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:5의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:8의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:9의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및 서열번호:11의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:3의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:4의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:5의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; 서열번호:8의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:9의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및 서열번호:11의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:3의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; 서열번호:4의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 서열번호:5의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; 서열번호:8의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; 서열번호:9의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 서열번호:11의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호:2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 또는 그의 변이체를 포함한다. 다른 구현예에서, 항-C5 항체는 서열번호:13의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 그의 변이체를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항-C5 항체는 mAb L3-1, 또는 그의 변이체이다. 단클론성 항-C5 항체 mAb L3-1는 서열번호:2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:13의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 단클론성 항-C5 항체는 인간화된다. 일부 구현예에서 단클론성 항-C5 항체는 키메라 항체이다.
일 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR 중 적어도 하나: VH-CDR1: 서열번호:3; VH-CDR2: 서열번호:4; VH-CDR3: 서열번호:5; VL-CDR1: 서열번호:14; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항-C5 항체는 하기로 이루어진 군의 모든 CDR: VH-CDR1: 서열번호:3; VH-CDR2: 서열번호:4; VH-CDR3: 서열번호:5; VL-CDR1: 서열번호:14; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:3의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및 VL-CDR1: 서열번호:14, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체. 일부 구현예에서, 항-C5 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:3의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; 및 VL-CDR1: 서열번호:14.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:3의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:4의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:5의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:14의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:9의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및 서열번호:10의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:3의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:4의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:5의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; 서열번호:14의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:9의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및 서열번호:10의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:3의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; 서열번호:4의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 서열번호:5의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; 서열번호:14의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; 서열번호:9의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 서열번호:10의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호:2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 또는 그의 변이체를 포함한다. 다른 구현예에서, 항-C5 항체는 서열번호:16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 그의 변이체를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항-C5 항체는 mAb L1-2, 또는 그의 변이체이다. 단클론성 항-C5 항체 mAb L1-2는 서열번호:2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 단클론성 항-C5 항체는 인간화된다. 일부 구현예에서 단클론성 항-C5 항체는 키메라 항체이다.
일 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR 중 적어도 하나: VH-CDR1: 서열번호:17; VH-CDR2: 서열번호:4; VH-CDR3: 서열번호:5; VL-CDR1: 서열번호:8; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항-C5 항체는 하기로 이루어진 군의 모든 CDR: VH-CDR1: 서열번호:17; VH-CDR2: 서열번호:4; VH-CDR3: 서열번호:5; VL-CDR1: 서열번호:8; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:17의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및 VL-CDR1: 서열번호:8, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체. 일부 구현예에서, 항-C5 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:17의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; 및 VL-CDR1: 서열번호:8.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:17의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:4의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:5의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:8의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:9의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및 서열번호:10의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:17의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:4의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:5의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; 서열번호:8의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:9의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및 서열번호:10의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:17의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; 서열번호:4의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 서열번호:5의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; 서열번호:8의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; 서열번호:9의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 서열번호:10의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호:19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 또는 그의 변이체를 포함한다. 다른 구현예에서, 항-C5 항체는 서열번호:7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 그의 변이체를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항-C5 항체는 mAb H1-4, 또는 그의 변이체이다. 단클론성 항-C5 항체 mAb H1-4는 서열번호:19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 단클론성 항-C5 항체는 인간화된다. 일부 구현예에서 단클론성 항-C5 항체는 키메라 항체이다.
일 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR 중 적어도 하나: VH-CDR1: 서열번호:20; VH-CDR2: 서열번호:4; VH-CDR3: 서열번호:5; VL-CDR1: 서열번호:23; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항-C5 항체는 하기로 이루어진 군의 모든 CDR: VH-CDR1: 서열번호:20; VH-CDR2: 서열번호:4; VH-CDR3: 서열번호:5; VL-CDR1: 서열번호:23; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:20의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및 VL-CDR1: 서열번호:23, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체. 일부 구현예에서, 항-C5 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:20의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; 및 VL-CDR1: 서열번호:23.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:20의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:4의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:5의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:23의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:9의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및 서열번호:10의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:20의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:4의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:5의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; 서열번호:23의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:9의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및 서열번호:10의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:20의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; 서열번호:4의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 서열번호:5의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; 서열번호:23의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; 서열번호:9의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 서열번호:10의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호:22의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 또는 그의 변이체를 포함한다. 다른 구현예에서, 항-C5 항체는 서열번호:25의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 그의 변이체를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항-C5 항체는 mAb H1-8/L1-9, 또는 그의 변이체이다. 단클론성 항-C5 항체 mAb H1-8/L1-9는 서열번호:22의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:25의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 단클론성 항-C5 항체는 인간화된다. 일부 구현예에서 단클론성 항-C5 항체는 키메라 항체이다.
일 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR 중 적어도 하나: VH-CDR1: 서열번호:3; VH-CDR2: 서열번호:26; VH-CDR3: 서열번호:5; VL-CDR1: 서열번호:8; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:29, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항-C5 항체는 하기로 이루어진 군의 모든 CDR: VH-CDR1: 서열번호:3; VH-CDR2: 서열번호:26; VH-CDR3: 서열번호:5; VL-CDR1: 서열번호:8; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:29, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:26의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및 VL-CDR2: 서열번호:9, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체. 일부 구현예에서, 항-C5 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:26의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 및 VL-CDR2: 서열번호:9.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:5의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및 VL-CDR3: 서열번호:29, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체. 일부 구현예에서, 항-C5 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:5의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; 및 VL-CDR3: 서열번호:29.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:3의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:26의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:5의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:8의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:9의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및 서열번호:29의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:3의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:26의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:5의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; 서열번호:8의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:9의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및 서열번호:29의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:3의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; 서열번호:26의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 서열번호:5의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; 서열번호:8의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; 서열번호:9의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 서열번호:29의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호:28의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 또는 그의 변이체를 포함한다. 다른 구현예에서, 항-C5 항체는 서열번호:31의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 그의 변이체를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항-C5 항체는 mAb H2-6/L3-5, 또는 그의 변이체이다. 단클론성 항-C5 항체 mAb H2-6/L3-5는 서열번호:28의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:31의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 단클론성 항-C5 항체는 인간화된다. 일부 구현예에서 단클론성 항-C5 항체는 키메라 항체이다.
일 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR 중 적어도 하나: VH-CDR1: 서열번호:3; VH-CDR2: 서열번호:34; VH-CDR3: 서열번호:5; VL-CDR1: 서열번호:8; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항-C5 항체는 하기로 이루어진 군의 모든 CDR: VH-CDR1: 서열번호:3; VH-CDR2: 서열번호:34; VH-CDR3: 서열번호:5; VL-CDR1: 서열번호:8; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:34의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및 VL-CDR2: 서열번호:9, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체. 일부 구현예에서, 항-C5 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:34의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 및 VL-CDR2: 서열번호:9.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:3의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:34의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:5의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:8의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:9의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및 서열번호:10의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:3의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:34의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:5의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; 서열번호:8의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:9의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및 서열번호:10의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:3의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; 서열번호:34의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2 서열번호:5의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; 서열번호:8의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; 서열번호:9의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 서열번호:10의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호:36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 또는 그의 변이체를 포함한다. 다른 구현예에서, 항-C5 항체는 서열번호:7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 그의 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 단클론성 항-C5 항체는 서열번호:36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 단클론성 항-C5 항체는 인간화된다. 일부 구현예에서 단클론성 항-C5 항체는 키메라 항체이다.
일 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR 중 적어도 하나: VH-CDR1: 서열번호:37; VH-CDR2: 서열번호:38; VH-CDR3: 서열번호:39; VL-CDR1: 서열번호:23; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항-C5 항체는 하기로 이루어진 군의 모든 CDR: VH-CDR1: 서열번호:37; VH-CDR2: 서열번호:38; VH-CDR3: 서열번호:39; VL-CDR1: 서열번호:23; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:37의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및 VL-CDR1: 서열번호:23, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체. 일부 구현예에서, 항-C5 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:37의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; 및 VL-CDR1: 서열번호:23.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:38의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및 VL-CDR2: 서열번호:9, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체. 일부 구현예에서, 항-C5 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:38의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 및 VL-CDR2: 서열번호:9.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:39의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체. 일부 구현예에서, 항-C5 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:39의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; 및 VL-CDR3: 서열번호:10.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:37의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:38의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:39의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:23의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:9의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및 서열번호:10의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:37의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:38의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:39의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; 서열번호:23의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:9의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및 서열번호:10의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:37의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; 서열번호:38의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 서열번호:39의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; 서열번호:23의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; 서열번호:9의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 서열번호:10의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호:41의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 또는 그의 변이체를 포함한다. 다른 구현예에서, 항-C5 항체는 서열번호:25의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 그의 변이체를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항-C5 항체는 mAb H1-8/L1-9, 또는 그의 변이체이다. 단클론성 항-C5 항체 mAb H1-8/L1-9는 서열번호:41의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:25의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 단클론성 항-C5 항체는 인간화된다. 일부 구현예에서 단클론성 항-C5 항체는 키메라 항체이다.
일 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR 중 적어도 하나: VH-CDR1: 서열번호:42; VH-CDR2: 서열번호:43; VH-CDR3: 서열번호:44; VL-CDR1: 서열번호:23; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항-C5 항체는 하기로 이루어진 군의 모든 CDR: VH-CDR1: 서열번호:42; VH-CDR2: 서열번호:43; VH-CDR3: 서열번호:44; VL-CDR1: 서열번호:23; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:42의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및 VL-CDR1: 서열번호:23, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체. 일부 구현예에서, 항-C5 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:42의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; 및 VL-CDR1: 서열번호:23.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:43의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및 VL-CDR2: 서열번호:9, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체. 일부 구현예에서, 항-C5 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:43의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 및 VL-CDR2: 서열번호:9.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:44의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체. 일부 구현예에서, 항-C5 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:44의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; 및 VL-CDR3: 서열번호:10.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:42의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:43의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:44의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:23의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:9의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및 서열번호:10의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:42의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:43의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:44의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; 서열번호:23의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:9의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및 서열번호:10의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:42의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; 서열번호:43의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 서열번호:44의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; 서열번호:23의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; 서열번호:9의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 서열번호:10의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호:46의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 또는 그의 변이체를 포함한다. 다른 구현예에서, 항-C5 항체는 서열번호:25의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 그의 변이체를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항-C5 항체는 mAb H1-8/L1-9, 또는 그의 변이체이다. 단클론성 항-C5 항체 mAb H1-8/L1-9는 서열번호:46의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:25의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 단클론성 항-C5 항체는 인간화된다. 일부 구현예에서 단클론성 항-C5 항체는 키메라 항체이다.
일 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR 중 적어도 하나: VH-CDR1: 서열번호:47; VH-CDR2: 서열번호:48; VH-CDR3: 서열번호:49; VL-CDR1: 서열번호:23; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항-C5 항체는 하기로 이루어진 군의 모든 CDR: VH-CDR1: 서열번호:47; VH-CDR2: 서열번호:48; VH-CDR3: 서열번호:49; VL-CDR1: 서열번호:23; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:47의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및 VL-CDR1: 서열번호:23, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체. 일부 구현예에서, 항-C5 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:47의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; 및 VL-CDR1: 서열번호:23.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:48의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및 VL-CDR2: 서열번호:9, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체. 일부 구현예에서, 항-C5 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:48의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 및 VL-CDR2: 서열번호:9.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:49의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체. 일부 구현예에서, 항-C5 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:49의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; 및 VL-CDR3: 서열번호:10.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:47의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:48의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:49의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:23의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:9의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및 서열번호:10의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:47의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:48의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:49의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; 서열번호:23의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:9의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및 서열번호:10의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:47의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; 서열번호:48의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 서열번호:49의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; 서열번호:23의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; 서열번호:9의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 서열번호:10의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호:51의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 또는 그의 변이체를 포함한다. 다른 구현예에서, 항-C5 항체는 서열번호:25의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 그의 변이체를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항-C5 항체는 mAb H1-8/L1-9, 또는 그의 변이체이다. 단클론성 항-C5 항체 mAb H1-8/L1-9는 서열번호:51의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:25의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 단클론성 항-C5 항체는 인간화된다. 일부 구현예에서 단클론성 항-C5 항체는 키메라 항체이다.
일 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR 중 적어도 하나: VH-CDR1: 서열번호:52; VH-CDR2: 서열번호:53; VH-CDR3: 서열번호:54; VL-CDR1: 서열번호:23; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항-C5 항체는 하기로 이루어진 군의 모든 CDR: VH-CDR1: 서열번호:52; VH-CDR2: 서열번호:53; VH-CDR3: 서열번호:54; VL-CDR1: 서열번호:23; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:52의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및 VL-CDR1: 서열번호:23, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체. 일부 구현예에서, 항-C5 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:52의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; 및 VL-CDR1: 서열번호:23.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:53의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및 VL-CDR2: 서열번호:9, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체. 일부 구현예에서, 항-C5 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:53의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 및 VL-CDR2: 서열번호:9.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:54의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체. 일부 구현예에서, 항-C5 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:54의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; 및 VL-CDR3: 서열번호:10.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:52의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:53의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:54의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:23의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:9의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및 서열번호:10의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:52의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:53의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:54의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; 서열번호:23의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:9의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및 서열번호:10의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:52의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; 서열번호:53의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 서열번호:54의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; 서열번호:23의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; 서열번호:9의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 서열번호:10의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호:56의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 또는 그의 변이체를 포함한다. 다른 구현예에서, 항-C5 항체는 서열번호:25의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 그의 변이체를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항-C5 항체는 mAb H1-8/L1-9, 또는 그의 변이체이다. 단클론성 항-C5 항체 mAb H1-8/L1-9는 서열번호:56의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:25의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 단클론성 항-C5 항체는 인간화된다. 일부 구현예에서 단클론성 항-C5 항체는 키메라 항체이다.
일 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR 중 적어도 하나: VH-CDR1: 서열번호:47; VH-CDR2: 서열번호:57; VH-CDR3: 서열번호:49; VL-CDR1: 서열번호:23; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항-C5 항체는 하기로 이루어진 군의 모든 CDR: VH-CDR1: 서열번호:47; VH-CDR2: 서열번호:57; VH-CDR3: 서열번호:49; VL-CDR1: 서열번호:23; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:57의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및 VL-CDR2: 서열번호:9, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체. 일부 구현예에서, 항-C5 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:57의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 및 VL-CDR2: 서열번호:9.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:47의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:57의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:49의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:23의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:9의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및 서열번호:10의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:47의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:57의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:49의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; 서열번호:23의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:9의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및 서열번호:10의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:47의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; 서열번호:57의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 서열번호:49의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; 서열번호:23의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; 서열번호:9의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 서열번호:10의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호:59의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 또는 그의 변이체를 포함한다. 다른 구현예에서, 항-C5 항체는 서열번호:25의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 그의 변이체를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항-C5 항체는 mAb H1-8/L1-9, 또는 그의 변이체이다. 단클론성 항-C5 항체 mAb H1-8/L1-9는 서열번호:59의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:25의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 단클론성 항-C5 항체는 인간화된다. 일부 구현예에서 단클론성 항-C5 항체는 키메라 항체이다.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호:76의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 또는 그의 변이체를 포함한다. 다른 구현예에서, 항-C5 항체는 서열번호:74의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 그의 변이체를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항-C5 항체는 mAb H1-8/L1-9, 또는 그의 변이체이다. 단클론성 항-C5 항체 mAb H1-8/L1-9는 서열번호:76의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:74의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 단클론성 항-C5 항체는 인간화된다. 일부 구현예에서 단클론성 항-C5 항체는 키메라 항체이다.
일 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR 중 적어도 하나: VH-CDR1: 서열번호:37; VH-CDR2: 서열번호:62; VH-CDR3: 서열번호:39; VL-CDR1: 서열번호:23; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항-C5 항체는 하기로 이루어진 군의 모든 CDR: VH-CDR1: 서열번호:37; VH-CDR2: 서열번호:62; VH-CDR3: 서열번호:39; VL-CDR1: 서열번호:23; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:62의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및 VL-CDR2: 서열번호:9, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체. 일부 구현예에서, 항-C5 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:62의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 및 VL-CDR2: 서열번호:9.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:37의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:62의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:39의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:23의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:9의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및 서열번호:10의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:37의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:62의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:39의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; 서열번호:23의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:9의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및 서열번호:10의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:37의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; 서열번호:62의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 서열번호:39의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; 서열번호:23의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; 서열번호:9의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 서열번호:10의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호:64의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 또는 그의 변이체를 포함한다. 다른 구현예에서, 항-C5 항체는 서열번호:25의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 그의 변이체를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항-C5 항체는 mAb H1-8/L1-9, 또는 그의 변이체이다. 단클론성 항-C5 항체 mAb H1-8/L1-9는 서열번호:64의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:25의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 단클론성 항-C5 항체는 인간화된다. 일부 구현예에서 단클론성 항-C5 항체는 키메라 항체이다.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호:72의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 또는 그의 변이체를 포함한다. 다른 구현예에서, 항-C5 항체는 서열번호:74의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 그의 변이체를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항-C5 항체는 mAb H1-8/L1-9, 또는 그의 변이체이다. 단클론성 항-C5 항체 mAb H1-8/L1-9는 서열번호:72의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:74의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 단클론성 항-C5 항체는 인간화된다. 일부 구현예에서 단클론성 항-C5 항체는 키메라 항체이다.
일 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR 중 적어도 하나: VH-CDR1: 서열번호:42; VH-CDR2: 서열번호:65; VH-CDR3: 서열번호:44; VL-CDR1: 서열번호:23; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항-C5 항체는 하기로 이루어진 군의 모든 CDR: VH-CDR1: 서열번호:42; VH-CDR2: 서열번호:65; VH-CDR3: 서열번호:44; VL-CDR1: 서열번호:23; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:65의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및 VL-CDR2: 서열번호:9, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체. 일부 구현예에서, 항-C5 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:65의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 및 VL-CDR2: 서열번호:9.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:42의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:65의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:44의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:23의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:9의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및 서열번호:10의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:42의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:65의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:44의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; 서열번호:23의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:9의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및 서열번호:10의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:42의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; 서열번호:65의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 서열번호:44의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; 서열번호:23의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; 서열번호:9의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 서열번호:10의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호:67의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 또는 그의 변이체를 포함한다. 다른 구현예에서, 항-C5 항체는 서열번호:25의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 그의 변이체를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항-C5 항체는 mAb H1-8/L1-9, 또는 그의 변이체이다. 단클론성 항-C5 항체 mAb H1-8/L1-9는 서열번호:67의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:25의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 단클론성 항-C5 항체는 인간화된다. 일부 구현예에서 단클론성 항-C5 항체는 키메라 항체이다.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호:78의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 또는 그의 변이체를 포함한다. 다른 구현예에서, 항-C5 항체는 서열번호:74의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 그의 변이체를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항-C5 항체는 mAb H1-8/L1-9, 또는 그의 변이체이다. 단클론성 항-C5 항체 mAb H1-8/L1-9는 서열번호:78의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:74의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 단클론성 항-C5 항체는 인간화된다. 일부 구현예에서 단클론성 항-C5 항체는 키메라 항체이다.
일 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR 중 적어도 하나: VH-CDR1: 서열번호:52; VH-CDR2: 서열번호:68; VH-CDR3: 서열번호:54; VL-CDR1: 서열번호:23; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항-C5 항체는 하기로 이루어진 군의 모든 CDR: VH-CDR1: 서열번호:52; VH-CDR2: 서열번호:68; VH-CDR3: 서열번호:54; VL-CDR1: 서열번호:23; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:68의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및 VL-CDR2: 서열번호:9, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체. 일부 구현예에서, 항-C5 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:68의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 및 VL-CDR2: 서열번호:9.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:52의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:68의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:54의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:23의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:9의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및 서열번호:10의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:52의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:68의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:54의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; 서열번호:23의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 서열번호:9의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2, 또는 최대 약 3개의 (예컨대 1, 2, 또는 3 중 약 임의의 것의) 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및 서열번호:10의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다: 서열번호:52의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; 서열번호:68의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 서열번호:54의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; 서열번호:23의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; 서열번호:9의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 서열번호:10의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호:70의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 또는 그의 변이체를 포함한다. 다른 구현예에서, 항-C5 항체는 서열번호:25의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 그의 변이체를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항-C5 항체는 mAb H1-8/L1-9, 또는 그의 변이체이다. 단클론성 항-C5 항체 mAb H1-8/L1-9는 서열번호:70의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:25의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 단클론성 항-C5 항체는 인간화된다. 일부 구현예에서 단클론성 항-C5 항체는 키메라 항체이다.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호:80의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 또는 그의 변이체를 포함한다. 다른 구현예에서, 항-C5 항체는 서열번호:74의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 그의 변이체를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항-C5 항체는 mAb H1-8/L1-9, 또는 그의 변이체이다. 단클론성 항-C5 항체 mAb H1-8/L1-9는 서열번호:78의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:74의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 단클론성 항-C5 항체는 인간화된다. 일부 구현예에서 단클론성 항-C5 항체는 키메라 항체이다.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호:4에 대한 VH CDR2 내의 위치 #4 (즉, P4)에서의 프롤린의 치환을 포함한다. 다양한 구현예에서, P4에서의 치환은 P4→F4 (즉, P4F), P4→L4 (즉, P4L), P4→M4 (즉, P4M), P4→W4 (즉, P4W), 또는 P4→I4 (즉, P4I)이다.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호:4에 대한 VH CDR2 내의 위치 #9 (즉, T9)에서의 트레오닌의 치환을 포함한다. 다양한 구현예에서, T9에서의 치환은 T9→H9 (즉, T9H), T9는 T9→F9 (즉, T9F), T9→L9 (즉, T9L), T9→M9 (즉, T9M), T9→W9 (즉, T9W), 또는 T9→I9 (즉, T9I)이다.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호:4에 대한 VH CDR2 내의 위치 #4 (즉, P4)에서의 프롤린의 치환; 및 서열번호:4에 대한 VH CDR2 내의 위치 #9 (즉, T9)에서의 트레오닌의 치환을 포함한다. 다양한 구현예에서, P4에서의 치환은 P4→F4 (즉, P4F), P4→L4 (즉, P4L), P4→M4 (즉, P4M), P4→W4 (즉, P4W), 또는 P4→I4 (즉, P4I)이고; 그리고 T9에서의 치환은 T9→H9 (즉, T9H), T9는 T9→F9 (즉, T9F), T9→L9 (즉, T9L), T9→M9 (즉, T9M), T9→W9 (즉, T9W), 또는 T9→I9 (즉, T9I)이다.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호:5에 대한 VH CDR3 내의 위치 #16 (즉, V16)에서의 발린의 치환을 포함한다. 다양한 구현예에서, V4에서의 치환은 V16→F16 (즉, V16F), V16→E16 (즉, V16E) 또는 V16→W16 (즉, V16W)이다.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호:3에 대한 VH CDR1 내의 위치 #8 (즉, N8)에서의 아스파라긴의 치환을 포함한다. 다양한 구현예에서, N8에서의 치환은 N8→H8 (즉, N8H), N8→W8 (즉, N8W), N8→I8 (즉, N8I), N8→V8 (즉, N8V), N8→Y8 (즉, N8Y), 또는 N8→F8 (즉, N8F)이다.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호:20에 대한 VH CDR1 내의 위치 #9 (즉, L9) 에서의 류신의 치환을 포함한다. 다양한 구현예에서, L9에서의 치환은 L9→W9 (즉, L9W), L9→I9 (즉, L9I), L9→V9 (즉, L9V), L9→Y9 (즉, L9Y), 또는 L9→F9 (즉, L9F)이다.
일부 구현예에서, 항-C5 항체, 융합 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호:4에 대한 VH CDR2 내의 프롤린 4 (즉, P4), 서열번호:4에 대한 VH CDR2 내의 트레오닌 9 (즉, T9), 서열번호:5에 대한 VH CDR3 내의 발린 16 (즉, V16), 및 서열번호:20에 대한 VH CDR1 내의 류신 9 (즉, L9)로 이루어진 군들 중 둘 이상의 치환을 포함한다. 다양한 구현예에서, 서열번호:4에 대한 VH CDR2 내의 프롤린 4 (즉, P4), 서열번호:4에 대한 VH CDR2 내의 트레오닌 9 (즉, T9), 서열번호:5에 대한 VH CDR3 내의 발린 16 (즉, V16), 및 서열번호:20에 대한 VH CDR1 내의 류신 9 (즉, L9)로 이루어진 군들 중 둘 이상에서의 치환을 포함하는 항-C5 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 L9I/P4M, L9I/P4W, L9I/P4F, L9F/P4M, L9F/P4W, L9F/P4F, L9I/P4M/V16W, L9I/P4W/V16W, L9I/P4F/V16W, L9F/P4M/V16W, L9F/P4W/V16W, L9F/P4F/V16W, L9I/P4M/V16E, L9I/P4W/V16E, L9I/P4F/V16E, L9F/P4M/V16E, L9F/P4W/V16E, L9F/P4F/V16E, L9I/P4M/T9H/V16W, L9I/P4W/T9H/V16W, L9I/P4F/T9H/V16W, L9F/P4M/T9H/V16W, L9F/P4W/T9H/V16W, L9F/P4F/T9H/V16W, L9I/P4M/T9H/V16E, L9I/P4W/T9H/V16E, L9I/P4F/T9H/V16E, L9F/P4M/T9H/V16E, L9F/P4W/T9H/V16E, 및 L9F/P4F/T9H/V16E로 이루어진 군으로부터 선택된 2개 이상의 치환을 포함한다.
일부 구현예에서, 항체 또는 융합 단백질은 키메라 항체이다. 일부 구현예에서, 항-인간 C5 항체는 상기 명세서에 기재된 가변 영역 CDR 서열과 조합하여 인간 경쇄 및 인간 중쇄 불변 영역을 포함할 수 있다. 당업자는 관심 특정 항체의 관련 도메인을 교환하는 공지된 기술을 사용하여 키메라 항체를 제조하고 얻을 수 있을 것이다. 이러한 항체는 본 출원에 기재된 하나 이상의 CDR 서열을 포함하는 이종 항체 도메인을 이식함으로써 용이하게 제조된다. 공지된 재조합 기술을 사용하여, 인간 중쇄 및 경쇄 불변 영역의 핵산 서열에 의해 코딩되는 중쇄 및 경쇄 불변 영역; 및 본 개시내용에 기재된 CDR 서열에 상응하는 핵산 서열에 의해 코딩된 CDR을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 재조합 항체를 수득하고 제조하는 것이 가능하다. 당업자는 본 개시내용에 기재된 하나 이상의 CDR 서열을 포함하는 항-인간 C5 항체를 제조할 수 있으며, 여기서 경쇄 단독의 부분 또는 중쇄 단독의 부분은 다른 종, 예를 들어 인간에 속하는 항체의 영역으로 대체된다. CDR 영역 외부의 뮤린 또는 비-뮤린 항체 구조 요소와 함께 서열번호: 3-5, 8-11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 34, 37-39, 42-44, 47-49, 52-54, 57, 62, 65, 및 68로부터 선택된 하나 이상의 CDR 서열을 갖는 가변 영역을 포함하는 인간 항-인간-C5 항체 또는 그의 변이체 또는 변이체들은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 당업계에 공지된 기술을 사용하여 추가로 인간화된다.
다양한 구현예에서, 본원에 기재된 가변 영역 중 임의의 것을 갖는 본원에 기재된 항체 또는 융합 단백질 중 임의의 것은 인간 IgG4 불변 중쇄를 포함할 수 있다. 서열번호:32는 인간 IgG4 불변 중쇄의 예시적인 아미노산 서열이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 융합 단백질은 S228P 돌연변이를 갖는 인간 IgG4 불변 중쇄를 포함한다. 서열번호:33은 S228P 돌연변이를 갖는 인간 IgG4 불변 중쇄의 예시적인 아미노산 서열이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 Fc PLA 돌연변이를 갖는 인간 IgG4 불변 중쇄를 포함한다. 서열번호:61은 Fc PLA 돌연변이를 갖는 인간 IgG4 불변 중쇄의 예시적인 아미노산 서열이다.
일부 구현예에서, 항-C5 항체 또는 융합 단백질은 서열번호 3-5, 8-11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 34, 37-39, 42-44, 47-49, 52-54, 57, 62, 65, 및 68에 열거된 본원에 기재된 CDR 서열과 적어도 약 85% (예컨대 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 적어도 약 임의의 것) 아미노산 동일성을 갖는 항체를 포함한다.
일 구현예에서, 본 개시내용은 상기에 기재된 CDR 서열과 적어도 약 85% (예컨대 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 적어도 약 임의의 것) 동일성의 CDR 서열을 갖는 항-C5 항체 또는 융합 단백질을 포괄한다. 일 구현예에서, 인간 C5에 대한 항체는 VH 영역 및 VL 영역을 갖고, VH 영역은 서열번호 2, 19, 22, 28, 36, 41, 46, 51, 56, 및 59로부터 선택된 것과 약 90% 초과 (예컨대 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 약 임의의 것 초과) 동일한 아미노산 서열을 가지며, 그리고 VL 영역은 서열번호 7, 13, 16, 17, 25, 31, 및 74로부터 선택된 것과 약 90% 초과 (예컨대 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 약 임의의 것 초과) 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
일부 구현예에서, 항체 또는 항체 단편이 변형된다. 일부 구현예에서 변형은 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 또 다른 단백질의 부분 또는 단백질 단편과의 융합을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항체 단편은 동일한 생체내 순환 반감기를 증가시키도록 변형된다. 예를 들어, 단편의 항체는 생체내 항체를 안정화시키기 위해 신생아 Fc 수용체로도 알려진 FcRn 분자와 융합될 수 있다. (Nature Reviews Immunology 7:715-725). 일부 구현예에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 효과기 분자 및/또는 다른 표적화 모이어티(예를 들어, 상이한 분자, 상이한 항원 또는 상이한 에피토프를 인식하는 항체 또는 항체 단편)에 접합(예를 들어, 융합)된다.
당업자는 서열번호 3-5, 8-11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 34, 37-39, 42-44, 47-49, 52-54, 57, 62, 65, 및 68로부터 선택된 적어도 하나의 특이적 CDR 서열 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함하는 인간-C5 결합 scFv를 제조할 수 있다. scFv는 서열번호 3-5, 17, 20, 26, 34, 37-39, 42-44, 47-49, 52-54, 57, 62, 65, 및 68로 지정된 중쇄 가변 영역 서열, 또는 그의 변이체 또는 변이체들, 및 서열번호 8-11, 14, 23, 및 29로 지정된 경쇄 가변 영역, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함할 수 있다. 본 개시내용에 기재된 CDR 서열에 대한 적어도 약 85% 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 scFv 내에 혼입된 CDR 서열은 본 개시내용의 범위 내에 포함된다.
일부 구현예에서, 단리된 항체는 인간 C5에 결합하고, 여기서 항체는 인간 C5의 에피토프에 결합한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 인간 C5 항체는 인간 C5의 특이적 에피토프에 결합하는 것이다. 일부 구현예에서, 에피토프는 C5의 α-쇄에 적어도 하나의 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 에피토프는 C5의 β-쇄에 적어도 하나의 아미노산을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 항-C5 항체 모이어티(예를 들어, 본원에 기재된 항-C5 항체 중 임의의 하나) 및 FH 또는 그의 기능적 단편을 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 일부 구현예에서, 항-C5 항체 모이어티는 전장 항체이다. 일부 구현예에서, FH는 (예를 들어, 중쇄(들)의 C-말단 말단에서) 전장 항체의 중쇄 중 하나 또는 둘 모두에 융합된다. 일부 구현예에서, 전장 항체는 IgG4 사슬(예를 들어, PLA 돌연변이를 포함하는 IgG4 사슬)을 포함한다. 예를 들어, 일 구현예에서, PLA 돌연변이를 포함하는 IgG4 사슬은 Fc PLA 돌연변이를 포함하는 인간 IgG4 불변 중쇄를 포함한다. 일 구현예에서, PLA 돌연변이를 포함하는 IgG4 사슬은 서열번호:61에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 항-C5 항체 모이어티(예를 들어, 본원에 기재된 항-C5 항체 중 임의의 하나) 및 FH의 SCR1-5 도메인을 포함하는 FH 또는 그의 기능적 단편을 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 IgG4 사슬 (예를 들어, PLA 돌연변이를 포함하는 IgG4 사슬)을 포함하는 항-C5 항체 모이어티 (예컨대 본원에 기재된 항-C5 항체 중 임의의 하나) 및 FH의 SCR1-5 도메인을 포함하는 FH 또는 그의 기능적 단편을 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 항-C5 항체 모이어티 및 FH 또는 이의 기능적 단편을 포함하는 융합 단백질을 제공하며, 항-C5 항체 모이어티는 pH 민감하다 (예컨대 본원에 기재된 pH 민감한 항-C5 항체 중 임의의 하나). 예를 들어, 일부 구현예에서, pH 민감성 항-C5 항체 모이어티는 pH 5.8에서보다 pH 7.4에서 더 높은 친화도로 C5에 결합하는 항-C5 항체 모이어티이다. 일부 구현예에서, pH 7.4에서 C5(예를 들어, 인간 C5)에 대한 항-C5 항체 모이어티의 결합 친화도는 pH 5.8에서 C5 (예를 들어, 인간 C5)에 대한 항-C5 항체 모이어티의 결합 친화도보다 적어도 약 3 배 (예컨대 4, 5, 6, 7, 8, 또는 10의 적어도 약 임의의 것) 배 더 높다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 항-C5 항체 모이어티 및 FH 또는 그의 기능적 단편을 포함하고, 여기서 항-C5 항체 모이어티는 pH 민감성이고(예컨대, 본원에 기재된 pH 민감성 항-C5 항체 중 임의의 하나), 예를 들어, pH 5.8보다 pH 7.4에서 더 높은 친화도로 C5에 결합하고, 항-C5 모이어티는 IgG4 사슬 (예를 들어, PLA 돌연변이를 포함하는 IgG4 사슬)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 항-C5 항체 모이어티 및 FH 또는 그의 기능적 단편을 포함하고, 여기서 항-C5 항체 모이어티는 pH 민감성(예컨대, 본원에 기재된 pH 민감성 항-C5 항체 중 임의의 하나)이고, 예를 들어, pH 5.8보다 pH 7.4에서 더 높은 친화도로 C5에 결합하고, 여기서 FH 또는 이의 기능적 단편은 FH의 SCR1-5 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 항-C5 항체 모이어티 및 FH 또는 그의 기능적 단편을 포함하고, 여기서 항-C5 항체 모이어티는 pH 민감성이고(예컨대, 본원에 기재된 pH 민감성 항-C5 항체 중 임의의 하나), 예를 들어, pH 5.8보다 pH 7.4에서 더 높은 친화도로 C5에 결합하고, 항-C5 모이어티는 IgG4 사슬 (예를 들어, PLA 돌연변이를 포함하는 IgG4 사슬)을 포함하고, 그리고 FH 또는 그의 기능적 단편은 FH의 SCR1-5 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 항-C5 항체 모이어티(예를 들어, 본원에 기재된 항-C5 항체 중 임의의 하나) 및 FH 또는 그의 기능적 단편을 포함하는 융합 단백질을 제공하며, 여기서 항-C5 모이어티는 그것의 CDR 영역 중 하나 이상 (예컨대 본원에 개시된 히스티딘-함유 항-C5 항체 중 임의의 하나)에서의 히스티딘 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 항-C5 항체 모이어티 및 FH 또는 그의 기능적 단편을 포함하고, 여기서 항-C5 모이어티는 그것의 CDR 영역 중 하나 이상 (예컨대 본원에 개시된 히스티딘-함유 항-C5 항체 중 임의의 하나)에서 히스티딘 치환을 포함하고, 그리고 항-C5 모이어티는 IgG4 사슬 (예를 들어, PLA 돌연변이를 포함하는 IgG4 사슬)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 항-C5 항체 모이어티 및 FH 또는 그의 기능적 단편을 포함하고, 여기서 항-C5 모이어티는 그것의 CDR 영역 중 하나 이상 (예컨대 본원에 개시된 히스티딘-함유 항-C5 항체 중 임의의 하나)에서 히스티딘 치환을 포함하고, 그리고 FH 또는 그의 기능적 단편은 FH의 SCR1-5 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 항-C5 항체 모이어티 및 FH 또는 그의 기능적 단편을 포함하고, 여기서 항-C5 모이어티는 그것의 CDR 영역 중 하나 이상 (예컨대 본원에 개시된 히스티딘-함유 항-C5 항체 중 임의의 하나)에서 히스티딘 치환을 포함하고, 그리고 항-C5 모이어티는 IgG4 사슬 (예를 들어, PLA 돌연변이를 포함하는 IgG4 사슬)을 포함하고, 그리고 FH 또는 그의 기능적 단편은 FH의 SCR1-5 도메인을 포함한다.
다양한 구현예에서, FH 또는 그의 기능적 단편은 보체 FH를 포함한다. 보체 FH는 단일 폴리펩타이드 사슬 혈장 당단백질이다. 단백질은 20개 비드의 스트링과 같은 연속 방식으로 배열된, 대략 60개 아미노산의 20개의 반복적인 SCR 도메인으로 구성된다. 일부 구현예에서, FH는 C3b에 결합하고, 대체 경로 C3-전환효소(C3Bb)의 붕괴를 가속화하고, C3b의 단백분해 불활성화를 위한 보조인자로서 작용한다. FH의 존재 하에, C3b 단백질분해는 C3b의 절단을 초래한다. 일부 구현예에서, FH는 SCR 1-4, SCR 5-8, 및 SCR 19-20 내에 위치하는 C3b에 대한 적어도 3개의 별개의 결합 도메인을 갖는다. 일부 구현예에서, FH의 각 부위는 C3b 단백질 내의 별개의 영역에 결합한다: N-말단 부위는 천연 C3b에 결합하고; FH의 중간 영역에 위치한 제2 부위는 C3c 단편에 결합하고 SCR19 및 20 내에 위치한 부위는 C3d 영역에 결합한다. 일부 구현예에서, FH는 FH의 SCR 7, SCR 5-12, 및 SCR20 내에 위치하고 C3b 결합 부위의 것과 중첩되는 헤파린에 대한 결합 부위를 추가로 함유한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 구조적 및 기능적 분석은 FH의 보체 억제 활성을 위한 도메인이 첫번째 4개의 N-말단 SCR 도메인 내에 위치한다는 것을 보여주었다.
본원에 기재된 FH 또는 그의 기능적 단편은 FH 단백질의 보체 억제 활성의 일부 또는 전부를 갖는 FH 단백질의 임의의 부분을 지칭하고, 아래에 상세히 기재된 바와 같이 전장 FH 단백질, FH 단백질의 생물학적 활성 단편, SCR1-4를 포함하는 FH 단편, 또는 자연 발생 FH 또는 그의 단편의 임의의 동족체를 포함하지만 이에 국한되지는 않는다.
다양한 구현예에서, FH는 서열번호:81, 서열번호:82, 서열번호:83, 또는 서열번호:84에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 전장 인간 FH 단백질이다. 아미노산 1-18는 리더 펩타이드에 해당하고, 아미노산 21-80은 SCR1에 해당하고, 아미노산 85-141는 SCR2에 해당하고, 아미노산 146-205는 SCR3에 해당하고, 아미노산 210-262는 SCR4에 해당하고, 아미노산 267-320는 SCR5에 해당한다.
일부 구현예에서, FH 부분은 하기 특성 중 하나 이상을 갖는다: (1) C-반응성 단백질(CRP)에 결합, (2) C3b에 결합, (3) 헤파린에 결합, (4) 시알산에 결합, (5) 내피 세포 표면에 결합, (6) 세포에 결합 인테그린 수용체, (7) 병원체에 대한 결합, (8) C3b 보조인자 활성, (9) C3b 붕괴 촉진 활성, 및 (10) 대체 보체 경로 억제.
일부 구현예에서, FH 부분은 FH의 첫번째 4개의 N-말단 SCR 도메인(SCR 1-4)을 포함한다. 일부 구현예에서, 작제물은 FH의 첫번째 5개의 N-말단 SCR 도메인(SCR 1-5)을 포함한다. 일부 구현예에서, 작제물은 FH의 처음 6개의 N-말단 SCR 도메인(SCR 1-6)을 포함한다. 일부 구현예에서, FH 부분은 예를 들어, FH의 첫번째 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 그 초과 개의 N-말단 SCR 도메인 중 적어도 임의의 것을 포함하는 FH의 적어도 첫 번째 4개의 N-말단 SCR 도메인을 포함하고 (그리고 일부 구현예에서 그로 구성되거나 그로 본질적으로 구성된다).
일부 구현예에서, FH는 야생형 FH이다. 일부 구현예에서, FH는 자연 발생 FH의 변이체 또는 그의 변이체이다. 자연 발생 FH 단백질의 변이체 또는 그의 단편은, 적어도 하나 또는 몇 개, 비제한적으로 하나 또는 몇 개의 아미노산이 (예를 들어, 글리코실화, 인산화, 아세틸화, 미리스토일화, 프레닐화, 팔미트화, 아미드화 및/또는 글리코실포스파티딜 이노시톨의 첨가에 의해)결실되고 (예를 들어, 절단된 버전의 단백질, 예컨대 펩타이드 또는 단편), 삽입되고, 역전되고, 치환되고/거나 유도체화되도록 자연 발생 FH 또는 그의 단편과 상이한 단백질을 포함한다. 예를 들어, FH 변이체는 자연 발생 FH의 아미노산 서열 (예를 들어, 서열번호:81, 서열번호:82, 서열번호:83, 또는 서열번호:84)과 적어도 약 70% 동일한, 예를 들어 자연 발생 FH의 아미노산 서열 (예를 들어, 서열번호:81, 서열번호:82, 서열번호:83, 또는 서열번호:84)과 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 적어도 약 임의의 것만큼 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, FH 변이체 또는 그의 단편은 자연 발생 FH 또는 그의 단편의 모든 보체 억제 활성을 보유한다. 일부 구현예에서, FH 변이체 또는 그의 단편은 자연 발생 FH 또는 그의 단편의 보체 억제 활성의 적어도 약 50%, 예를 들어, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%의 적어도 약 임의의 것을 보유한다. 일부 구현예에서, FH 또는 그의 단편은 인간 FH의 적어도 아미노산 21 내지 320 (예를 들어, 서열번호:81, 서열번호:82, 서열번호:83, 또는 서열번호:84)을 함유하는 아미노산 서열을 갖는 인간 FH, 예컨대 FH 부분의 적어도 첫 번째 5개의 N-말단 SCR 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, FH 또는 그의 단편은 인간 FH의 아미노산 21 내지 320 (예를 들어, 서열번호:81, 서열번호:82, 서열번호:83, 또는 서열번호:84)과 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 중 적어도 약 임의의 것만큼 동일한 아미노산 서열을 갖는 인간 FH의 적어도 첫 번째 5개의 N-말단 SCR 도메인을 포함한다.
스크리닝 검정
본 발명은 후보 항-C5 항체(예를 들어, 항-C5 항체, 항-C5 융합 단백질 항체 등)가 보체 활성을 억제할 수 있는지 여부를 결정하는 것을 포함하는 다양한 스크리닝 분석에 적용된다.
일부 구현예에서, 후보 항-C5 항체의 존재 하에 보체 활성의 수준은 양성 비교 대조군에서 검출된 보체 활성과 비교된다. 양성 비교 대조군은 시험 화합물이 첨가되지 않은 상태에서 보체 활성화를 포함한다. 일부 구현예에서, 후보 항-C5 항체의 존재 하의 보체 활성이 양성 비교 대조군에서 검출된 보체 활성의 약 70% 미만일 때, 후보 항-C5 항체는 보체의 억제제로서 확인되고; 이는 시험 화합물의 존재 하의 보체 활성의 약 30% 초과의 억제율에 상응한다. 다른 구현예에서, 후보 항-C5 항체의 존재 하의 보체 활성이 양성 비교 대조군에서 검출된 보체 활성의 약 80% 미만일 때, 후보 항-C5 항체는 보체의 억제제로서 확인되고; 이는 시험 화합물의 존재 하의 보체 활성의 약 20% 초과의 억제율에 상응한다. 또 다른 구현예에서, 후보 항-C5 항체의 존재 하의 보체 활성이 양성 비교 대조군에서 검출된 보체 활성의 약 90% 미만일 때, 후보 항-C5 항체는 보체의 억제제로서 확인되고; 이는 시험 화합물의 존재 하의 보체 활성의 약 10% 초과의 억제율에 상응한다. 일부 구현예에서, 후보 항-C5 항체에 의한 보체 억제 수준은 음성 비교 대조군에서 검출된 억제 수준과 비교된다.
경쟁적 및 비경쟁적 면역검정 형식, 항원 포획 검정, 2항체 샌드위치 검정, 및 3항체 샌드위치 검정을 포함하는 다양한 면역검정 포맷이 본 발명의 유용한 방법이다(Self 등, 1996, Curr. Opin. Biotechnol. 7:60-65). 검정이 보체의 억제를 검출할 수 있다면, 본 발명은 공지된 또는 알려지지 않은 검정에 대해 현재까지 알려진 임의의 한 유형으로 제한되는 것으로 해석되어서는 안 된다.
효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)이 본 발명의 방법에 유용하다. 호스라디쉬 과산화효소 (HRP), 알칼리성 포스파타제, 베타-갈락토시다제 또는 우레아제에 제한되지 않는 것과 같은 효소는 예를 들어 본 발명의 방법에 사용하기 위한 항-C5 항체 또는 이차 항체에 연결될 수 있다. 호스라디쉬-과산화효소 검출 시스템은 예를 들어 발색 기질 테트라메틸벤지딘(TMB)과 함께 사용될 수 있으며, 이는 450 nm에서 검출 가능한 과산화수소의 존재 하에 가용성 생성물을 생성한다. 다른 편리한 효소 연결 시스템은 예를 들어 알칼리성 포스파타제 검출 시스템을 포함하고, 이는 발색 기질 p-니트로페닐 포스페이트와 함께 사용하여 405 nm에서 쉽게 검출할 수 있는 가용성 생성물을 생성할 수 있다. 유사하게, 베타-갈락토시다제 검출 시스템은 발색 기질 o-니트로페닐-베타-D-갈락토피라노사이드(ONPG)와 함께 사용하여 410 nm에서 검출가능한 가용성 생성물을 생성할 수 있다. 대안적으로, 우레아제 검출 시스템은 요소-브로모크레졸 퍼플(Sigma Immunochemicals, St. Louis, MO)과 같은 기질과 함께 사용될 수 있다. 유용한 효소 연결 일차 및 이차 항체는 여러 상업적 출처에서 얻을 수 있다.
화학발광 검출은 말단 보체 경로의 억제를 검출하는 데에도 유용한다. 화학발광 이차 항체는 여러 상업적 출처에서 얻을 수 있다.
형광 검출은 말단 보체의 억제를 검출하는 데에도 유용한다. 유용한 형광색소는 DAPI, 플루오레세인, Hoechst 33258, R-파이코시아닌, B-파이코에리트린, R-파이코에리트린, 로다민, 텍사스 레드 및 리스사민- 플루오레세인- 또는 로다민-표지 항체를 포함하지만 이에 국한되지 않는다.
방사선면역검정(RIA)도 본 발명의 방법에 유용하다. 이러한 검정은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 문헌[Brophy 등 (1990, Biochem. Biophys. Res. Comm. 167:898-903) 및 Guechot 등 (1996, Clin. Chem. 42:558-563)]에 기재되어 있다. 방사성면역검정은 예를 들어 요오드-125로 표지된 일차 또는 이차 항체를 사용하여 수행된다(Harlow 등 (상동), 1999).
검출가능한 항체로부터 방출된 신호는, 예를 들어, 발색 기질로부터의 색을 검출하기 위한 분광광도계; 방사선을 검출하기 위한 방사선 계수기, 예컨대 요오드-125의 검출을 위한 감마 계수기; 또는 특정 파장의 광의 존재 하에 형광을 검출하기 위한 형광계를 사용하여 분석된다. 효소 결합 분석을 사용하는 경우, 분광측정기를 사용하여 정량 분석을 수행한다. 본 발명의 분석은 수동으로 수행될 수 있거나, 원하는 경우 자동화될 수 있으며, 다수의 샘플로부터 방출된 신호가 상업적으로 이용가능한 많은 시스템에서 동시에 검출될 수 있음이 이해된다.
본 발명의 방법은 또한 원하는 경우 자동화될 수 있는 모세관 전기영동 기반 면역검정(CEIA)의 사용을 포함한다. 면역검정은 또한 예를 들어 문헌[Schmalzing 등 (1997, Electrophoresis 18:2184-2193) and Bao (1997, J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. 699:463-480)]에 기재된 바와 같이 레이저 유도 형광과 함께 사용될 수 있다. 유동 주입 리포솜 면역검정 및 리포솜 면역센서와 같은 리포솜 면역검정이 또한 본 발명의 방법에 따라 사용될 수 있다(Rongen 등, 1997, J. Immunol. Methods 204:105-133).
정량적 웨스턴 블롯팅은 또한 본 발명의 방법에서 말단 보체 억제 수준을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 웨스턴 블롯은 주사 밀도측정과 같은 잘 알려진 방법을 사용하여 정량화된다(Parra 등, 1998, J. Vasc. Surg. 28:669-675).
투여 방법
본 발명의 방법은 치료 유효량의 적어도 하나의 항-C5 항체 (예를 들어, 항-C5 항체, 항-C5 융합 단백질 항체, 등), 또는 그의 결합 단편 (예컨대 본원의 다른 곳에 기재된 항체 또는 그의 단편 중 임의의 것)을, 보체 매개 질환 또는 장애를 갖는 것으로 확인된 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 한 구현예에서 개체는 보체 시스템을 갖는 포유동물이다. 일 구현예에서, 개체는 인간이다. 다양한 구현예에서, 적어도 하나의 항-C5 항체, 또는 그의 결합 단편은 국부적으로, 국지적으로, 또는 전신으로 투여된다.
다양한 구현예에서, 질환 또는 장애는 하기로 이루어진 군으로부터 적어도 선택된다: MD, AMD, 허혈 재관류 손상, 관절염, 류마티스성 관절염, 루푸스, 궤양성 대장염, 뇌졸중, 수술 후 전신 염증 증후군, 천식, 알러지성 천식, COPD, PNH 증후군, 중증 근무력증, NMO, 다발성 경화증, 지연된 이식 기능, 항체 매개 거부, aHUS, CRVO, CRAO, 수포성 표피박리증, 패혈증, 장기 이식, 염증 (심폐 바이패스 수술 및 신장 투석과 연관된 염증을 포함하지만 이에 국한되지 않음), C3 사구체병증, 막성 신병증, IgA 신병증, 사구체신염 (ANCA 매개 사구체신염, 루푸스 신장염, 및 그의 조합을 포함하지만 이에 국한되지 않음), ANCA 매개 혈관염, 시가 독소 유도된 HUS, 및 항인지질 항체-유도된 임신 손실, 또는 그의 임의의 조합. 일부 구현예에서, 보체 매개 질환은 C3 사구체병증이다. 일부 구현예에서, 보체 매개 질환은 연령 관련 황반 변성과 같은 황반 변성이다. 일 구현예에서, 항-C5 항체 융합 단백질의 투여는 C3a 또는 C3b 단백질의 생성을 억제한다. 일 구현예에서, 항-C5 항체 융합 단백질의 투여는 C5a 또는 C5b 단백질의 생성을 억제한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 에쿨리주맙을 사용한 치료에 반응하지 않는 PNH를 갖는 대상체를 비롯한 대상체를 치료하는 데 유용하다. 비제한적 예로서, 일부 대상체는 에쿨리주맙의 치료에 내성을 갖게 할 수 있는 C5의 알파 사슬 돌연변이를 가질 수 있다 (문헌[Genetic variants in C5 and poor response to eculizumab(Nishimura J, 등, N Engl J Med. 2014 Feb 13;370(7):632-9)]을 참조한다).
본 발명의 방법은 적어도 하나의 항-C5 항체 융합 단백질 또는 그의 결합 단편의 투여를 포함할 수 있지만, 본 발명은 본원에 기재된 항-C5 항체 융합 단백질에 제한되는 것으로 결코 해석되어서는 안 되지만, 오히려 보체 활성화를 줄이거나 감소시키는, 공지되거나 알려지지 않은 임의의 항-C5 항체 융합 단백질을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
본 발명의 방법은 치료적 유효량의 적어도 하나의 항-C5 항체 융합 단백질 또는 그의 결합 단편을 개체에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 본 발명의 조성물은 적어도 하나의 항-C5 항체 융합 단백질, 또는 그의 결합 단편을, 단독으로 또는 적어도 하나의 다른 치료제와 함께 포함한다. 본 발명은 예를 들어 항염증 요법 등과 같은 다른 치료 양식과 조합하여 사용될 수 있다. 본 발명의 방법과 조합하여 사용될 수 있는 항염증 요법의 예는 예를 들어 스테로이드성 약물을 이용하는 요법 및 비스테로이드성 약물을 이용하는 요법을 포함한다.
본 발명의 방법은 치료적 유효량의 항-C5 항체 융합 단백질 또는 그의 항원 결합 단편을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 치료 유효량의 본 발명의 항체 융합 단백질, 또는 치료 유효량의 그의 항체 단편을 투여함으로써 보체 신호전달의 조절장애를 수반하는 보체 관련 질환의 치료 방법을 포괄하고, C3a, C3b, C5a, 또는 C5b 또는 MAC 형성의 감소가 대상체에서 영향을 받는다. 일부 구현예에서, 본 발명은 치료적 유효량의 항체 융합 단백질 또는 항체 단편을 투여함으로써 보체 신호전달의 조절장애를 수반하는 보체 관련 질환의 치료 방법을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 항체 융합 단백질, 항체 단편, 폴리펩타이드, 펩타이드, 접합된 펩타이드의 유효량을 대상체에게 투여함으로써 보체 신호전달의 조절장애를 수반하는 보체 관련 질환의 치료 방법을 포함하며, 개체에서 보체 활성화 경로 활성화가 감소된다. 일부 구현예에서, 치료 방법은 항체 융합 단백질 또는 항체 단편의 전신 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포괄하여, C3a, C3b, C5a, 또는 C5b 또는 MAC 형성의 전신 감소는 대상체에서 영향을 받는다.
본 발명을 실시하는데 유용한 약제학적 조성물은 적어도 약 1 ng/kg, 적어도 약 5 ng/kg, 적어도 약 10 ng/kg, 적어도 약 25 ng/kg, 적어도 약 50 ng/kg, 적어도 약 100 ng/kg, 적어도 약 500 ng/kg, 적어도 약 1 μg/kg, 적어도 약 5 μg/kg, 적어도 약 10 μg/kg, 적어도 약 25 μg/kg, 적어도 약 50 μg/kg, 적어도 약 100 μg/kg, 적어도 약 500 μg/kg, 적어도 약 1 mg/kg, 적어도 약 5 mg/kg, 적어도 약 10 mg/kg, 적어도 약 25 mg/kg, 적어도 약 50 mg/kg, 적어도 약 100 mg/kg, 적어도 약 200 mg/kg, 적어도 약 300 mg/kg, 적어도 약 400 mg/kg, 및 적어도 약 500 mg/대상체 체중 kg의 용량을 전달하기 위해 투여될 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명은 개체에서 적어도 약 1 pM, 적어도 약 10 pM, 적어도 약 100 pM, 적어도 약 1 nM, 적어도 약 10 nM, 적어도 약 100 nM, 적어도 약 1 μM, 적어도 약 2 μM, 적어도 약 3 μM, 적어도 약 4 μM, 적어도 약 5 μM, 적어도 약 6 μM, 적어도 약 7 μM, 적어도 약 8 μM, 적어도 약 9 μM 및 적어도 약 10 μM의 본 발명의 항-C5 항체 융합 단백질의 농도를 초래하는 용량을 투여한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 개체의 혈장에서 적어도 약 1 pM, 적어도 약 10 pM, 적어도 약 100 pM, 적어도 약 1 nM, 적어도 약 10 nM, 적어도 약 100 nM, 적어도 약 1 μM, 적어도 약 2 μM, 적어도 약 3 μM, 적어도 약 4 μM, 적어도 약 5 μM, 적어도 약 6 μM, 적어도 약 7 μM, 적어도 약 8 μM, 적어도 약 9 μM 및 적어도 약 10 μM의 본 발명의 항-C5 항체 융합 단백질의 농도를 초래하는 용량의 투여를 구상한다.
일부 구현예에서, 본 발명을 실시하는 데 유용한 약제학적 조성물은 약 1 ng/kg 이하, 약 5 ng/kg 이하, 약 10 ng/kg 이하, 약 25 ng/kg 이하, 약 50 ng/kg 이하, 약 100 ng/kg 이하, 약 500 ng/kg 이하, 약 1 μg/kg 이하, 약 5 μg/kg 이하, 약 10 μg/kg 이하, 약 25 μg/kg 이하, 약 50 μg/kg 이하, 약 100 μg/kg 이하, 약 500 μg/kg 이하, 약 1 mg/kg 이하, 약 5 mg/kg 이하, 약 10 mg/kg 이하, 약 25 mg/kg 이하, 약 50 mg/kg 이하, 약 100 mg/kg 이하, 약 200 mg/kg 이하, 약 300 mg/kg 이하, 약 400 mg/kg 이하, 및 약 500 mg/대상체 체중 kg 이하의 용량을 전달하기 위해 투여될 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명은 개체에서 약 1 pM 이하, 약 10 pM 이하, 약 100 pM 이하, 약 1 nM 이하, 약 10 nM 이하, 약 100 nM 이하, 약 1 μM 이하, 약 2 μM 이하, 약 3 μM 이하, 약 4 μM 이하, 약 5 μM 이하, 약 6 μM 이하, 약 7 μM 이하, 약 8 μM 이하, 약 9 μM 이하 및 약 10 μM 이하의 본 발명의 항-C5 항체 융합 단백질의 농도를 초래하는 용량을 투여한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 개체의 혈장에서 약 1 pM 이하, 약 10 pM 이하, 약 100 pM 이하, 약 1 nM 이하, 약 10 nM 이하, 약 100 nM 이하, 약 1 μM 이하, 약 2 μM 이하, 약 3 μM 이하, 약 4 μM 이하, 약 5 μM 이하, 약 6 μM 이하, 약 7 μM 이하, 약 8 μM 이하, 약 9 μM 이하 및 약 10 μM 이하의 본 발명의 항-C5 항체 융합 단백질의 농도를 초래하는 용량을 투여를 구상한다. 또한 본원에 개시된 임의의 용량 사이의 투여량 범위가 고려된다.
전형적으로, 대상체, 일부 구현예에서 인간에게 본 발명의 방법으로 투여될 수 있는 투여량은, 대상체의 체중 킬로그램 당 0.5 μg 내지 약 50 mg 양의 범위이다. 투여되는 정확한 투여량은 대상체의 유형 및 치료되는 질환 상태의 유형, 대상체의 연령 및 투여 경로를 포함하나 이에 국한되지 않는 임의의 수의 인자에 따라 달라질 것이다. 일부 구현예에서, 화합물의 투여량은 대상체의 체중 킬로그램 당 약 1 μg 내지 약 10 mg으로 다양할 것이다. 다른 구현예에서, 투여량은 대상체의 체중 킬로그램 당 약 3 μg 내지 약 1 mg으로 다양할 것이다.
항체 융합 단백질은 매일 몇 번과 같이 빈번하게 대상체에게 투여될 수 있거나, 또는 덜 빈번하게, 예컨대 1일 1회, 1일 2회, 1일 3회, 매주 1회, 매주 2회, 매주 3회, 2주마다 1회, 2주마다 2회, 2주마다 3회, 매월 1회, 매월 2회, 매월 3회, 또는 심지어 덜 빈번하게, 예컨대 몇 개월마다 1회 또는 심지어 1년 1회 또는 수회 또는 그 미만으로 투여될 수 있다. 용량의 빈도는 당업자에게 쉽게 명백할 것이며 치료되는 질환의 유형 및 중증도, 대상체의 유형 및 연령 등과 같은(이에 국한되지 않음) 임의의 수의 요인에 따라 달라질 것이다. 약제학적 조성물의 제형은 약리학 분야에서 공지되거나 이후 개발될 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 이러한 준비 방법에는 활성 성분을 담체 또는 하나 이상의 다른 보조 성분과 결합시킨 다음, 필요하거나 원하는 경우 생성물을 원하는 단일 또는 다중 용량 단위로 성형하거나 포장하는 단계가 포함된다.
본 명세서에 제공된 약제학적 조성물의 설명은 주로 인간에 대한 윤리적 투여에 적합한 약제학적 조성물에 관한 것이지만, 이러한 조성물이 일반적으로 모든 종류의 대상체에 투여하기에 적합하다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 다양한 대상체에 대한 투여에 적합한 조성물을 만들기 위해 인간에 대한 투여에 적합한 약제학적 조성물의 변형은 잘 이해되고, 보통의 숙련된 수의과 약리학자는 그러한 변형을 필요하다면 그저 보통의 실험으로 설계하고 수행할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 투여가 고려되는 개체에는 인간 및 기타 영장류, 상업적으로 관련된 포유동물, 예컨대 비인간 영장류, 소, 돼지, 말, 양, 고양이 및 개를 비롯한 포유동물이 포함되나 이에 국한되지는 않는다.
본 발명의 방법에 유용한 약제학적 조성물은 안과용, 경구, 직장, 질, 비경구, 국소, 폐, 비강내, 협측, 안구내, 유리체내, 근육내, 진피내 및 정맥내 투여 경로에 적합한 제형으로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 다른 고려되는 제형은 투영된 나노입자, 리포솜 제제, 활성 성분을 함유하는 재밀봉된 적혈구, 및 면역학적 기반 제형을 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 단일 단위 용량으로, 또는 복수의 단일 단위 용량으로 대량으로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 단위 용량은 활성 성분의 미리 결정된 양을 포함하는 약제학적 조성물의 개별적인 양이다. 활성 성분의 양은 일반적으로 개인에게 투여될 활성 성분의 투여량 또는 이러한 투여량의 편리한 분획, 예를 들어 이러한 투여량의 1/2 또는 1/3과 동일하다.
본 발명의 약제학적 조성물에서 활성 성분, 약제학적으로 허용 가능한 담체, 및 임의의 추가 성분의 상대적인 양은 치료되는 개체의 동일성, 크기 및 상태에 따라 그리고 추가로 조성물이 투여되는 경로에 따라 달라질 것이다. 예로서, 조성물은 0.1% 내지 100%(w/w)의 활성 성분을 포함할 수 있다. 다양한 구체예에서, 조성물은 적어도 약 1%, 적어도 약 2%, 적어도 약 3%, 적어도 약 4%, 적어도 약 5%, 적어도 약 6%, 적어도 약 7%, 적어도 약 8%, 적어도 약 9%, 적어도 약 10%, 적어도 약 11%, 적어도 약 12%, 적어도 약 13%, 적어도 약 14%, 적어도 약 15%, 적어도 약 16%, 적어도 약 17%, 적어도 약 18%, 적어도 약 19%, 적어도 약 20%, 적어도 약 21%, 적어도 약 22%, 적어도 약 23%, 적어도 약 24%, 적어도 약 25%, 적어도 약 26%, 적어도 약 27%, 적어도 약 28%, 적어도 약 29%, 적어도 약 30%, 적어도 약 31%, 적어도 약 32%, 적어도 약 33%, 적어도 약 34%, 적어도 약 35%, 적어도 약 36%, 적어도 약 37%, 적어도 약 38%, 적어도 약 39%, 적어도 약 40%, 적어도 약 41%, 적어도 약 42%, 적어도 약 43%, 적어도 약 44%, 적어도 약 45%, 적어도 약 46%, 적어도 약 47%, 적어도 약 48%, 적어도 약 49%, 적어도 약 50%, 적어도 약 51%, 적어도 약 52%, 적어도 약 53%, 적어도 약 54%, 적어도 약 55%, 적어도 약 56%, 적어도 약 57%, 적어도 약 58%, 적어도 약 59%, 적어도 약 60%, 적어도 약 61%, 적어도 약 62%, 적어도 약 63%, 적어도 약 64%, 적어도 약 65%, 적어도 약 66%, 적어도 약 67%, 적어도 약 68%, 적어도 약 69%, 적어도 약 70%, 적어도 약 71%, 적어도 약 72%, 적어도 약 73%, 적어도 약 74%, 적어도 약 75%, 적어도 약 76%, 적어도 약 77%, 적어도 약 78%, 적어도 약 79%, 적어도 약 80%, 적어도 약 81%, 적어도 약 82%, 적어도 약 83%, 적어도 약 84%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 100% (w/w)의 활성 성분을 포함한다.
활성 성분 외에, 본 발명의 약제학적 조성물은 하나 이상의 추가의 약제학적 활성제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 제어 또는 지속 방출 제형은 통상적인 기술을 사용하여 제조될 수 있다.
약제학적 조성물의 비경구 투여는 개인의 조직의 물리적 파괴 및 조직의 파괴를 통한 약제학적 조성물의 투여를 특징으로 하는 임의의 투여 경로를 포함한다. 모 투여는 국소적, 지역적 또는 전신일 수 있다. 따라서 비경구 투여는 조성물의 주사, 외과적 절개를 통한 조성물의 적용, 조직 침투 비외과적 상처를 통한 조성물의 적용 등에 의한 약제학적 조성물의 투여를 포함하지만 이에 국한되지 않는다. 특히, 비경구 투여는 정맥내, 안구내, 유리체내, 피하, 복강내, 근육내, 진피내, 흉골내 주사, 및 종양내를 포함하지만 이에 국한되지 않는 것으로 고려된다.
비경구 투여에 적합한 약제학적 조성물의 제형은 멸균수 또는 멸균 등장 식염수와 같은 약제학적으로 허용 가능한 담체와 조합된 활성 성분을 포함한다. 이러한 제형은 볼러스 투여 또는 연속 투여에 적합한 형태로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 주사 가능한 제형은 앰플 또는 보존제를 함유하는 다중 용량 용기와 같은 단위 투여 형태로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제형은 현탁액, 용액, 유성 또는 수성 비히클 중의 에멀젼, 페이스트, 및 이식가능한 지속 방출 또는 생분해성 제형을 포함하지만 이에 국한되지 않는다. 이러한 제형은 현탁제, 안정화제 또는 분산제를 포함하나 이에 국한되지 않는 하나 이상의 추가 성분을 추가로 포함할 수 있다. 비경구 투여용 제형의 일 구현예에서, 활성 성분은 재구성된 조성물의 비경구 투여 전에 적합한 비히클(예를 들어, 무발열원 멸균수)로 재구성하기 위한 건조(즉, 분말 또는 과립) 형태로 제공된다.
약제학적 조성물은 멸균 주사 가능한 수성 또는 유성 현탁액 또는 용액의 형태로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 이러한 현탁액 또는 용액은 공지된 기술에 따라 제형화될 수 있고, 활성 성분 이외에 추가 성분, 예컨대 분산제, 습윤제 또는 현탁제를 포함할 수 있다. 이러한 멸균 주사 가능한 제형은 예를 들어 물 또는 1,3-부탄 디올과 같은 무독성의 비경구적으로 허용 가능한 희석제 또는 용매를 사용하여 제조될 수 있다. 기타 허용 가능한 희석제 및 용매에는 링거 용액, 등장성 염화나트륨 용액 및 합성 모노- 또는 디-글리세리드와 같은 고정 오일이 포함되지만 이에 국한되지는 않는다. 유용한 다른 비경구 투여 가능한 제형은 활성 성분을 미세결정질 형태로, 리포솜 제제로, 또는 생분해성 중합체 시스템의 성분으로 포함하는 것을 포함한다. 서방성 또는 이식용 조성물은 에멀젼, 이온 교환 수지, 난용성 중합체 또는 난용성 염과 같은 약제학적으로 허용 가능한 중합체성 또는 소수성 물질을 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 구강을 통한 폐 투여에 적합한 제형으로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 이러한 제형은 활성 성분을 포함하고 약 0.5 내지 약 7 나노미터, 일부 구현예에서는 약 1 내지 약 6 나노미터 범위의 직경을 갖는 건조 입자를 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 편리하게는 추진제의 스트림이 분말을 분산시키도록 유도될 수 있는 건조 분말 저장소를 포함하는 장치를 사용하거나, 또는 자가-추진 용매/분말-분배 용기, 예컨대 밀봉된 용기에서 저비점 추진제 중에 용해 또는 현탁된 활성 성분을 포함하는 장치를 사용하여 투여하기 위한 건조 분말의 형태이다. 일부 구현예에서, 이러한 분말은 중량 기준으로 입자의 적어도 98%가 0.5 나노미터 초과의 직경을 갖고 개수 기준으로 입자의 적어도 95%가 7 나노미터 미만의 직경을 갖는 입자를 포함한다. 일부 구현예에서, 중량 기준으로 입자의 적어도 95%는 1 나노미터 초과의 직경을 갖고 개수 기준으로 입자의 적어도 90%는 6 나노미터 미만의 직경을 갖는다. 일부 구현예에서, 건조 분말 조성물은 당과 같은 고체 미세 분말 희석제를 포함하고 편리하게 단위 용량 형태로 제공된다.
저비점 추진제는 일반적으로 대기압에서 비등점이 65°F 미만인 액체 추진제를 포함한다. 일반적으로, 추진제는 조성물의 50 내지 99.9%(w/w)를 구성할 수 있고, 활성 성분은 조성물의 0.1 내지 20%(w/w)를 구성할 수 있다. 추진제는 액체 비이온성 또는 고체 음이온성 계면활성제 또는 고체 희석제(일부 구체예에서 활성 성분을 포함하는 입자와 동일한 차수의 입자 크기를 가짐)와 같은 추가 성분을 추가로 포함할 수 있다.
폐 전달용으로 제형화된 본 발명의 약제학적 조성물은 또한 용액 또는 현탁액의 액적 형태로 활성 성분을 제공할 수 있다. 이러한 제형은 활성 성분을 포함하는 수성 또는 희석 알코올성 용액 또는 현탁액(선택적으로 멸균)으로 제조, 포장 또는 판매될 수 있고, 임의의 분무 또는 분무 장치를 사용하여 편리하게 투여될 수 있다. 이러한 제형은 풍미제 예컨대 사카린 나트륨, 휘발성 오일, 완충제, 표면 활성제, 또는 보존제 예컨대 메틸하이드록시벤조에이트를 포함하나 이에 국한되지 않는 하나 이상의 추가 성분을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 투여 경로에 의해 제공된 액적은 약 0.1 내지 약 200 나노미터 범위의 평균 직경을 갖는다.
제형은 또한 본 발명의 약제학적 조성물의 비강내 전달에 유용하다.
비강내 투여에 적합한 또 다른 제형은 활성 성분을 포함하고 약 0.2 내지 500 마이크로미터의 평균 입자를 갖는 조립 분말이다. 이러한 제형은 스너프(snuff)를 취하는 방식, 즉 콧구멍 가까이에 고정된 분말 용기로부터 비강을 통해 빠르게 흡입함으로써 투여된다.
비강 투여에 적합한 제형은 예를 들어 최소 약 0.1%(w/w) 및 최대 100%(w/w) 활성 성분을 포함할 수 있고, 하나 이상의 추가 성분을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 협측 투여에 적합한 제형으로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 이러한 제형은 예를 들어, 통상적인 방법을 사용하여 제조된 정제 또는 로젠지의 형태일 수 있고, 예를 들어 0.1 내지 20%(w/w) 활성 성분일 수 있으며, 밸런스는 경구로 용해성 또는 분해성 조성물 및, 선택적으로, 하나 이상의 추가 성분을 포함한다. 대안적으로, 협측 투여에 적합한 제형은 활성 성분을 포함하는 분말 또는 에어로졸화 또는 분무화된 용액 또는 현탁액을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 분말화, 에어로졸화 또는 에어로졸화 제형은 분산될 때 약 0.1 내지 약 200 나노미터 범위의 평균 입자 또는 액적 크기를 가지며, 하나 이상의 추가 성분을 추가로 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "추가 성분"은 다음 중 하나 이상을 포함하지만 이에 국한되지는 않는다: 표면 활성제; 분산제; 불활성 희석제; 과립화 및 붕해제; 결합제; 윤활제; 감미제; 풍미제; 착색제; 보존제; 생리적으로 분해성 조성물 예컨대 젤라틴; 수성 비히클 및 용매; 유성 비히클 및 용매; 현탁화제; 분산제 또는 습윤제; 유화제, 진통제; 완충액; 염; 증점제; 충전제; 유화제; 항산화제; 항생제; 항진균제; 안정화제; 및 약제학적으로 허용 가능한 중합체성 또는 소수성 물질. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함될 수 있는 다른 "추가 성분"은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 본원에 참조로 포함되어 있는 Remington's Pharmaceutical Sciences(1985, Genaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA)에 기재되어 있다.
항체, 융합 단백질 또는 이의 항원 결합 단편을 생산하는 세포
일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 기재된 항-C5 항체 (예를 들어, 항-C5 항체, 항-C5 융합 단백질 항체, 등), 또는 항원 결합 단편 중 적어도 하나를 생산하는 세포 또는 세포주 (예컨대 숙주 세포)이다. 일 구현예에서, 세포 또는 세포주는 본원에 기재된 항-C5 항체, 또는 항원 결합 단편 중 적어도 하나를 생성하는 유전적 변형 세포이다. 일 구현예에서, 세포 또는 세포주는 본원에 기재된 항-C5 항체, 또는 항원 결합 단편 중 적어도 하나를 생성하는 하이브리도마이다.
하이브리드 세포(하이브리도마)는 일반적으로 B-림프구가 매우 풍부한 뮤린 비장세포와 골수종 "융합 파트너 세포" 사이의 대량 융합에서 생성된다(Alberts 등, Molecular Biology of the Cell (Garland Publishing, Inc. 1994); Harlow 등, Antibodies. A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 1988). 융합에 있는 세포는 원하는 특이성을 가진 항체의 생산을 위해 분석될 수 있는 풀로 연속적으로 분배된다. 양성으로 시험된 풀은 원하는 특이성의 항체를 생성하는 단일 세포 클론이 확인될 때까지 추가로 세분화될 수 있다. 이러한 클론에 의해 생성된 항체를 단클론성 항체라고 한다.
또한, 본원에 개시된 항체 또는 항체 단편 중 임의의 것을 인코딩하는 핵산, 뿐만 아니라 핵산을 포함하는 벡터가 제공된다. 따라서, 본 발명의 항체 및 단편은 재조합 또는 인간화 면역글로불린의 발현에 전형적으로 사용되는 세포 또는 세포주, 예컨대 세포주들에서 핵산을 발현시킴으로써 생성될 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체 및 단편은 또한 핵산을 하나 이상의 발현 벡터로 클로닝하고 벡터를 재조합 또는 인간화 면역글로불린의 발현에 일반적으로 사용되는 세포주 예컨대 세포주들로 형질전환함으로써 생성될 수 있다.
면역글로불린의 중쇄 및 경쇄, 또는 그의 단편을 인코딩하는 유전자는 당업계에 공지된 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 포함하나 이에 국한되지 않는 방법에 따라 조작될 수 있다(예를 들어, 문헌[Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; Berger & Kimmel, Methods in Enzymology, Vol. 152: Guide to Molecular Cloning Techniques, Academic Press, Inc., San Diego, Calif., 1987; Co 등, 1992, J. Immunol. 148:1149]를 참조한다). 예를 들어, 중쇄 및 경쇄, 또는 그의 단편을 인코딩하는 유전자는 항체 분비 세포의 게놈 DNA로부터 클로닝될 수 있거나, cDNA는 세포의 RNA의 역전사에 의해 생성될 수 있다. 클로닝은 클로닝될 유전자, 또는 유전자의 단편에 측접하거나 중복되는 서열에 혼성화하는 PCR 프라이머의 사용을 포함하는 통상적인 기술에 의해 달성된다.
본 발명의 항체, 또는 중쇄 또는 경쇄 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산은 다양한 숙주 세포에서 또는 시험관내 번역 시스템에서 특이적 면역글로불린, 면역글로불린 사슬, 또는 그의 단편 또는 변이체의 생산을 위한 재조합 핵산 기술에 따라 수득되고 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체 인코딩 핵산, 또는 그의 단편은 적합한 원핵 또는 진핵 벡터, 예를 들어, 발현 벡터에 배치될 수 있고, 적절한 방법, 예를 들어 형질전환, 형질감염, 전기천공, 감염에 의해 적합한 숙주 세포 내로 도입될 수 있어서, 핵산은 예를 들어 벡터에서 하나 이상의 발현 조절 요소에 작동가능하게 연결되거나 숙주 세포 게놈에 통합되도록 한다.
일부 구현예에서, 중쇄 및 경쇄, 또는 그의 단편은 수용체 세포를 공동 형질감염시키기 위해 사용될 수 있는 2개의 상이한 발현 벡터에서 조립될 수 있다. 일부 구현예에서, 각각의 벡터는 2개 이상의 선택가능한 유전자를 함유할 수 있는데, 하나는 박테리아 시스템에서 선택을 위한 것이고 다른 하나는 진핵 시스템에서 선택을 위한 것이다. 이러한 벡터는 박테리아 시스템에서 유전자의 생산 및 증폭, 진핵 세포의 후속 공동 형질감염 및 공동 형질감염 세포의 선택을 허용한다. 선택 절차는 진핵 세포 내로 2개의 상이한 DNA 벡터에 도입된 항체 핵산의 발현을 선택하기 위해 사용될 수 있다.
대안적으로, 중쇄 및 경쇄, 또는 그의 단편을 인코딩하는 핵산은 하나의 벡터로부터 발현될 수 있다. 경쇄와 중쇄는 별도의 유전자로 인코딩되지만 재조합 방법을 사용하여 결합할 수 있다. 예를 들어, 2개의 폴리펩타이드는 VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자를 형성하는 단일 단백질 사슬로 만들어질 수 있도록 하는 합성 링커에 의해 연결될 수 있다(scFv로 알려짐; 예를 들어 Bird 등, 1988, Science 242:423-426; and Huston 등, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883를 참조한다).
본 발명은 중쇄 및/또는 경쇄, 뿐만 아니라 그의 단편을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 경쇄 및 중쇄, 또는 그의 단편 둘 모두를 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산 분자는 세포에서 생성될 때 항체 또는 단편의 분비를 위한 합성 신호 서열을 함유하도록 조작될 수 있다. 또한, 핵산 분자는 다른 항체 서열의 삽입을 허용하고 항체 서열에서 일반적으로 발견되는 아미노산을 변경하지 않도록 번역 해독틀을 유지하는 특정 DNA 연결을 포함할 수 있다.
본 발명에 따르면, 항체 인코딩 핵산 서열은 적절한 발현 벡터에 삽입될 수 있다. 다양한 구현예에서, 발현 벡터는 항체 또는 그의 단편의 형성을 위한 항체 서열의 발현을 지시하는 재조합 DNA 분자를 생성하기 위해 삽입된 항체 인코딩 핵산의 전사 및 번역에 필요한 요소를 포함한다.
항체 인코딩 핵산, 또는 그의 단편은 부위 지정 돌연변이유발과 같은 당업자에게 공지된 다양한 재조합 핵산 기술에 적용될 수 있다.
다양한 방법을 사용하여 세포에서 핵산을 발현할 수 있다. 핵산은 여러 유형의 벡터로 클로닝될 수 있다. 그러나, 본 발명은 임의의 특정 벡터에 제한되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 대신, 본 발명은 당업계에 용이하게 입수가능하고/하거나 공지된 다양한 벡터를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 예를 들어, 본 발명의 핵산은 플라스미드, 파아지미드, 파아지 유도체, 동물 바이러스, 및 코스미드를 포함하지만 이에 국한되지 않는 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 특히 관심 있는 벡터에는 발현 벡터, 복제 벡터, 프로브 생성 벡터 및 시퀀싱 벡터가 포함된다.
특정 구현예에서, 발현 벡터는 바이러스 벡터, 박테리아 벡터 및 포유동물 세포 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된다. 상기 논의된 조성물의 적어도 일부 또는 전부를 포함하는 수많은 발현 벡터 시스템이 존재한다. 원핵생물 및/또는 진핵생물 벡터 기반 시스템을 본 발명과 함께 사용하여 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 동족 폴리펩타이드를 생성할 수 있다. 많은 그러한 시스템이 상업적으로 널리 이용 가능한다.
바이러스 벡터 기술은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 문헌[Sambrook 등 (2012), and in Ausubel 등 (1999)], 그리고 다른 바이러스학 및 분자 생물학 매뉴얼에 기재되어 있다. 벡터로서 유용한 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 연관된 바이러스, 헤르페스 바이러스, 및 렌티바이러스를 포함하지만 이에 국한되지 않는다. 일부 구현예에서, 뮤린 줄기 세포 바이러스(MSCV) 벡터를 사용하여 원하는 핵산을 발현시킨다. MSCV 벡터는 세포에서 원하는 핵산을 효율적으로 발현하는 것으로 입증되었다. 그러나, 본 발명은 MSCV 벡터만을 사용하는 것으로 제한되어서는 안 되며, 오히려 임의의 레트로바이러스 발현 방법이 본 발명에 포함된다. 바이러스 벡터의 다른 예는 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 (MoMuLV) 및 인간 면역결핍 바이러스 (HIV)를 기반으로 하는 벡터이다. 일부 구현예에서, 적합한 벡터는 적어도 하나의 유기체에서 기능적인 복제 기원, 프로모터 서열, 편리한 제한 엔도뉴클레아제 부위, 및 하나 이상의 선택가능한 마커를 함유한다(예를 들어, WO 01/96584; WO 01/29058; 및 미국 특허 번호 6,326,193를 참조한다).
추가 조절 요소, 예를 들어 인핸서가 전사 개시의 빈도를 조절하는 데 사용될 수 있다. 프로모터는 코딩 세그먼트 및/또는 엑손의 상류에 위치한 5' 비-코딩 서열을 단리함으로써 수득될 수 있는 바와 같이 유전자 또는 핵산 서열과 자연적으로 연관된 것일 수 있다. 이러한 프로모터는 "내인성"으로 지칭될 수 있다. 유사하게, 인핸서는 그 서열의 하류 또는 상류에 위치한 핵산 서열과 자연적으로 연관된 것일 수 있다. 대안적으로, 자연 환경에서 핵산 서열과 정상적으로 연관되지 않는 프로모터를 지칭하는 재조합 또는 이종 프로모터의 제어 하에 코딩 핵산 세그먼트를 위치시킴으로써 특정 이점을 얻을 수 있다. 재조합 또는 이종 인핸서는 또한 자연 환경에서 핵산 서열과 정상적으로 연관되지 않는 인핸서를 지칭한다. 이러한 프로모터 또는 인핸서는 다른 유전자의 프로모터 또는 인핸서, 및 임의의 다른 원핵생물, 바이러스 또는 진핵생물 세포로부터 단리된 프로모터 또는 인핸서, 및 예를 들어 상이한 전사 조절 영역의 상이한 요소 및/또는 발현을 변경하는 돌연변이를 함유하는 "자연 발생"이 아닌 프로모터 또는 인핸서를 포함할 수 있다. 프로모터 및 인핸서의 핵산 서열을 합성적으로 생성하는 것 외에도, 서열은 본원에 개시된 조성물과 관련하여 PCR을 비롯한 재조합 클로닝 및/또는 핵산 증폭 기술을 사용하여 생성될 수 있다(미국 특허 번호 4,683,202, 미국 특허 번호 5,928,906). 또한, 미토콘드리아, 엽록체 등과 같은 비핵 소기관 내 서열의 전사 및/또는 발현을 지시하는 대조 서열이 또한 사용될 수 있는 것으로 고려된다.
당연히, 발현을 위해 선택된 세포 유형, 소기관 및 유기체에서 DNA 세그먼트의 발현을 효과적으로 지시하는 프로모터 및/또는 인핸서를 사용하는 것이 중요할 것이다. 분자 생물학 분야의 당업자는 일반적으로 단백질 발현을 위해 프로모터, 인핸서 및 세포 유형 조합을 사용하는 방법을 알고 있다(예를 들어, 문헌[Sambrook 등 (2012)]을 참조한다). 사용된 프로모터는 재조합 단백질 및 그의 단편의 대규모 생산에 유리한 것과 같이 도입된 DNA 세그먼트의 고수준 발현을 지시하기 위한 적절한 조건 하에서 구성적, 조직 특이적, 유도성 및/또는 유용할 수 있다.
프로모터의 예는 전초기 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터 서열이다. 이 프로모터 서열은 이에 작동적으로 연결된 임의의 폴리뉴클레오타이드 서열의 높은 수준의 발현을 유도할 수 있는 강력한 구성적 프로모터 서열이다. 그러나, 다른 구성적 프로모터 서열이 또한 사용될 수 있고 유인원 바이러스 40 (SV40) 초기 프로모터, 마우스 유선 종양 바이러스 (MMTV), HIV 긴 말단 반복 (LTR) 프로모터, 몰로니 바이러스 프로모터, 조류 백혈병 바이러스 프로모터, 엡슈타인-바르 바이러스 즉시 초기 프로모터, 루 육종 바이러스 프로모터, 뿐만 아니라 인간 유전자 프로모터 예컨대, 비제한적인 액틴 프로모터, 미오신 프로모터, 헤모글로빈 프로모터, 및 근육 크레아틴 프로모터를 포함하지만 이에 국한되지 않는다. 또한, 본 발명은 구성적 프로모터의 사용으로 제한되어서는 안 된다. 유도성 프로모터가 또한 본 발명의 일부로 고려된다. 본 발명에서 유도성 프로모터의 사용은 그러한 발현이 바람직할 때 작동적으로 연결된 폴리뉴클레오타이드 서열의 발현을 켜거나 발현이 바람직하지 않을 때 발현을 끌 수 있는 분자 스위치를 제공한다. 유도성 프로모터의 예는 메탈로티오닌 프로모터, 글루코코르티코이드 프로모터, 프로게스테론 프로모터, 및 테트라사이클린 프로모터를 포함하지만 이에 국한되지는 않는다. 또한, 본 발명은 원하는 조직 또는 세포에서만 활성인 프로모터인 조직 특이적 프로모터 또는 세포 유형 특이적 프로모터의 용도를 포함한다. 조직 특이적 프로모터는 당업계에 잘 알려져 있고, HER-2 프로모터 및 PSA 관련 프로모터 서열을 포함하지만 이에 국한되지는 않는다.
핵산의 발현을 평가하기 위해, 세포 내로 도입될 발현 벡터는 또한 선별가능한 마커 유전자 또는 리포터 유전자 또는 둘 모두를 함유하여 바이러스 벡터를 통해 형질 감염되거나 감염되고자 하는 세포 집단으로부터 발현 세포의 식별 및 선별을 용이하게 할 수 있다. 다른 구현예에서, 선택가능한 마커는 별도의 핵산에 보유될 수 있고 공동-형질감염 절차에서 사용될 수 있다. 선택 가능한 마커 및 리포터 유전자 모두는 숙주 세포에서 발현을 가능하게 하는 적절한 조절 서열과 측접될 수 있다. 유용한 선택 가능한 마커는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 네오(neo) 등과 같은 항생제 내성 유전자를 포함한다.
리포터 유전자는 잠재적으로 형질감염된 세포를 식별하고 조절 서열의 기능을 평가하는 데 사용된다. 쉽게 검정할 수 있는 단백질을 인코딩하는 리포터 유전자는 당업계에 잘 알려져 있다. 일반적으로, 리포터 유전자는 수령체 유기체 또는 조직에 존재하지 않거나 이에 의해 발현되지 않고 발현이 효소 활성과 같은 일부 쉽게 검출 가능한 특성에 의해 나타나는 단백질을 인코딩하는 유전자이다. 리포터 유전자의 발현은 DNA가 수용 세포에 도입된 후 적절한 시간에 검정된다.
적합한 리포터 유전자는 루시퍼라제, 베타-갈락토시다제, 클로르암페니콜 아세틸 트랜스퍼라제, 분비된 알칼리성 포스파타제, 또는 녹색 형광 단백질 유전자를 인코딩하는 유전자를 포함할 수 있다(예를 들어, Ui-Tei 등, 2000 FEBS Lett. 479:79-82를 참조한다). 적합한 발현 시스템은 잘 알려져 있고 잘 알려진 기술을 사용하여 제조하거나 상업적으로 얻을 수 있다. 일반적으로 리포터 유전자의 발현 수준이 가장 높은 최소 5' 측접 영역을 갖는 작제물이 프로모터로 확인된다. 이러한 프로모터 영역은 리포터 유전자에 연결될 수 있고 프로모터 유도 전사를 조절하는 능력에 대한 제제를 평가하는 데 사용될 수 있다.
핵산을 세포 내로 도입하고 발현시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 발현 벡터의 문맥에서, 벡터는 당업계의 임의의 방법에 의해 숙주 세포, 예를 들어 포유동물, 박테리아, 효모 또는 곤충 세포 내로 용이하게 도입될 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터는 물리적, 화학적 또는 생물학적 수단에 의해 숙주 세포로 전달될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포에 도입하기 위한 물리적 방법은 인산칼슘 침전, 리포펙션, 입자 충격, 미세주입, 전기천공, 레이저천공 등을 포함한다. 벡터 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 세포를 생산하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어 문헌[Sambrook 등 (2012) 및 Ausubel 등(1999)]을 참조한다.
관심 핵산을 숙주 세포에 도입하기 위한 생물학적 방법에는 DNA 및 RNA 벡터의 사용이 포함된다. 바이러스 벡터, 특히 레트로바이러스 벡터는 유전자를 포유동물, 예를 들어 인간 세포에 삽입하기 위해 가장 널리 사용되는 방법이 되었다. 다른 바이러스 벡터는 렌티바이러스, 폭스바이러스, 단순 헤르페스 바이러스 I, 아데노바이러스 및 아데노 관련 바이러스 등으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어 미국 특허 번호 5,350,674 및 5,585,362를 참조한다.
핵산을 숙주 세포에 도입하기 위한 화학적 수단은 콜로이드성 분산물 시스템, 예컨대 거대분자 복합체, 나노캡슐, 마이크로구형체, 비드 및 수중유 에멀젼, 교질입자, 혼합된 교질입자, 및 리포솜을 포함하는 지질 기반 시스템을 포함한다. 시험관내 및 생체내 전달 매개체로 사용하기 위한 바람직한 콜로이드 시스템은 리포솜(예를 들어, 인공 막 소포)이다. 이러한 시스템의 제조 및 사용은 당업계에 잘 알려져 있다.
외인성 핵산을 숙주 세포에 도입하거나 달리 세포를 본 발명의 핵산에 노출시키는 데 사용된 방법에 관계없이, 숙주 세포에서 재조합 DNA 서열의 존재를 확인하기 위해 다양한 검정이 수행될 수 있다. 이러한 검정은 예를 들어 서던 및 노던 블롯팅, RT-PCR 및 PCR과 같은 당업자에게 잘 알려진 "분자 생물학적" 분석; "생화학적" 검정, 예를 들어 면역학적 수단(ELISA 및 웨스턴 블롯)에 의해 또는 본 발명의 범위에 속하는 제제를 확인하기 위해 본원에 기재된 검정에 의한 특정 펩타이드의 존재 또는 부재 검출을 포함한다.
비-인간 동물을 발현하는 인간 C5
본 발명은 또한 인간 C5를 발현하는 유전자 변형된 비인간 동물을 포함한다. 일부 구현예에서, 인간 C5를 발현하는 유전적 변형 비-인간 동물은 또한 비-인간 동물 C5를 발현한다. 일부 구현예에서, 인간 C5를 발현하는 유전적 변형 비-인간 동물은 비-인간 동물 C5를 발현하지 않는다. 일 구현예에서, 본 발명은 비-인간 동물의 내인성 조절 요소로부터 인간 C5를 발현하지만 비-인간 동물 C5를 발현하지 않는 유전적 변형 비-인간 동물이다. 일부 구현예에서, 비인간 동물은 포유동물이다. 일부 구현예에서, 비인간 동물은 설치류이다. 일부 구현예에서, 비-인간 동물은 랫트 또는 마우스이다. 일부 구현예에서, 마우스는 면역결핍 마우스이다. 일부 구현예에서, 마우스는 NOD/SCID 마우스이다. 일부 구현예에서, 마우스는 FcRn/SCID 마우스이다.
유전적 변형 비-인간 동물을 생성하기 위해, 인간 C5 단백질을 인코딩하는 핵산이 숙주 세포에서 인간 C5 단백질의 발현에 적합한 형태로 재조합 발현 벡터에 혼입될 수 있다. 용어 "숙주 세포에서 융합 단백질의 발현에 적합한 형태로"는 재조합 발현 벡터가 비-인간 동물 게놈 내로의 통합을 가능하게 하여 mRNA 내로의 핵산의 안정하고 영구적인 전사 및 인간 C5 단백질 내로의 mRNA의 번역을 야기하는 방식으로 인간 C6 단백질을 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 조절 서열을 포함하는 것을 의미하는 것으로 의도된다. "조절 서열"이라는 용어는 당업계에 인정되고 프로모터, 인핸서 및 기타 발현 조절 요소(예를 들어, 폴리아데닐화 신호, PiggyBac 및 슬리핑 뷰티 트랜스포존 요소)를 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 조절 서열은 당업자에게 공지되어 있으며 문헌[990, Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif and in Nakanishi H, Higuchi Y, Kawakami S, Yamashita F, Hashida M. Mol Ther. 2010 Apr;18(4):707-14. doi: 10.1038/mt.2009.302. Epub 2010 Jan 26.; Hudecek M, Ivics Z. Curr Opin Genet Dev. 2018 Jun 22;52:100-108. doi: 10.1016/j.gde.2018.06.003. [Epub ahead of print] Review]에 기재되어 있다. 발현 벡터의 디자인은 형질감염될 숙주 세포 및 동물의 선택 및/또는 발현될 인간 C5 단백질의 양과 같은 인자에 의존할 수 있음을 이해해야 한다.
유전적 변형 비인간 동물은 예를 들어, 미세주사에 의해 인간 C5 단백질을 인코딩하는 핵산(전형적으로 구성적 또는 조직 특이적 인핸서와 같은 적절한 조절 요소에 연결됨)을 난모세포에 도입함으로써 및 암컷 창시자 마우스에서 난모세포가 발달하도록 하면서 생성될 수 있다. 이러한 동물은 문헌[Suda T, Liu D. Mol Ther. 2007 Dec;15(12):2063-9. Epub 2007 Oct 2. Review]에 기재된 바와 같이 인간 C5 단백질을 인코딩하는 핵산(일반적으로 구성적 또는 조직 특이적 인핸서 및/또는 PiggyBac 및 슬리핑 뷰티 트랜스포존 요소와 같은 적절한 조절 요소에 연결됨)을 꼬리 정맥을 통해 유체역학적 주입을 통해 동물에 도입함으로써 생성될 수 있다. 인트론 서열 및 폴리아데닐화 신호는 또한 전이유전자의 발현 효율을 증가시키기 위해 전이유전자에 포함될 수 있다. 마우스와 같은 유전적 변형 동물을 생성하는 방법은 당업계에서 통상적이 되었으며, 예를 들어 문헌[미국 특허 번호 4,736,866 및 4,870,009 및 1986, Hogan 등, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y., Cold Spring Harbor Laboratory]에 기재되어 있다. 유전자 변형된 창시자 동물은 이식 유전자가 난모세포에 도입되는 경우 전이유전자를 보유하는 추가 대상을 번식시키는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 난모세포 주사를 통해 생성된 C5 단백질을 인코딩하는 전이유전자를 보유하는 유전자 변형 동물은 다른 전이유전자를 보유하는 다른 유전적 변형 동물, 또는 다른 녹아웃 동물, 예를 들어, 뮤린 C5 유전자를 발현하지 않는 녹아웃 마우스로 추가로 육종될 수 있다. 유체역학적 꼬리 정맥 주사를 통해 생성된 C5 단백질을 인코딩하는 전이유전자를 보유하는 유전자 변형 동물은 다른 유전자 녹아웃 또는 형질전환 마우스, 예를 들어 실험용 FcRn/SCID 마우스를 사용하여 쉽게 생산할 수 있다. 유전적 변형 동물에 더하여, 시스템은 다른 인간 C5 발현 대상체를 생성하는데 사용될 수 있음이 이해될 것이다.
일 구현예에서, 비-인간 동물의 조절 요소로부터 인간 C5를 발현하는 유전적 변형 비-인간 동물은 비-인간 동물의 C5 엑손 서열(또는 엑손 및 인트론 서열)을 인간 C5 엑손 서열 (또는 엑손 및 인트론 서열)로 대체하는 시스템을 사용하여 생성되지만, 천연 비-인간 동물의 조절 요소(예를 들어, 프로모터, 인핸서, 측접 영역, 인트론 등) 서열 중 하나 이상, 또는 모두는 변경되지 않은 채로 남겨둔다. 임의의 적합한 시스템이 사용될 수 있지만, 이러한 방식으로 유전자 변형된 비인간 동물을 생산할 수 있는 하나의 예시적인 시스템은 CRISPr/Cas9 시스템이다. "CRISPR/Cas" 시스템은 외래 핵산에 대한 방어를 위한 광범위한 종류의 박테리아 시스템을 나타낸다. CRISPR/Cas 시스템은 광범위한 진정세균 및 고세균 유기체에서 발견된다. CRISPR/Cas 시스템에는 유형 I, II 및 III 하위 유형이 포함된다. 야생형 II형 CRISPR/Cas 시스템은 가이드 및 활성화 RNA와 복합체를 이루는 RNA 매개 뉴클레아제인 Cas9를 활용하여 외래 핵산을 인식하고 절단한다. Cas9 동족체는 다음 분류학 그룹의 박테리아를 포함하지만 이에 국한되지 않는 매우 다양한 진균에서 발견된다. 악티노박테리아, 아퀴피카에, 박테로이데테스- 클로로비, 클라마이디애-베루코마이크로비아, 클로플렉시, 시아노박테리아, 피르미쿠테스, 프로테오박테리아, 스피로차에테스, 및 써모토가에. 예시적인 Cas9 단백질은 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) Cas9 단백질이다. 추가적인 Cas9 단백질 및 이의 상동체는 예를 들어 문헌[Chylinksi, 등, RNA Biol. 2013 May 1; 10(5): 726-737; Nat. Rev. Microbiol. 2011 June; 9(6): 467-477; Hou, 등, Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Sep 24;110(39): 15644-9; Sampson 등, Nature. 2013 May 9;497(7448):254-7; 및 Jinek, 등, Science. 2012 Aug 17;337(6096):816-21]에 기재되어 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 유전적 변형 비-인간 동물은 내인성 프로모터로부터 인간 C5를 발현한다. 본 발명에 유용한 프로모터의 예는 천연 마우스 프로모터, DNA pol II 프로모터, PGK 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, 알부민 프로모터, 글로빈 프로모터, 난백알부민 프로모터, SV40 초기 프로모터, 루 육종 바이러스 (RSV) 프로모터, β-액틴 프로모터, 레트로바이러스 LTR, 및 렌티바이러스 LTR을 포함하지만 이에 국한되지 않는다. 본 발명에 유용한 프로모터 및 인핸서 발현 시스템은 또한 유도성 및/또는 조직 특이적 발현 시스템을 포함한다.
일부 구현예에서, 인간 C5를 발현하는 본 발명의 유전적 변형 비-인간 동물은 항-C5 항체 및 항-C5 mAb 융합 단백질을 스크리닝, 시험, 평가 또는 평가하는데 사용된다. 일부 구현예에서, 인간 C5를 발현하는 본 발명의 유전적 변형 비-인간 동물은 항-C5 항체 및 항-C5 mAb 융합 단백질의 특징, 특성 또는 활성을 스크리닝, 시험, 평가 또는 평가하기 위해 사용된다.
키트
본 발명은 또한 본 발명의 항-C5 항체(예를 들어, 항-C5 항체, 항-C5 융합 단백질 항체 등) 또는 이들의 조합을 포함하는 키트 및 예를 들어 항-C5 항체, 또는 이들의 조합을 본원의 다른 곳에서 기술된 바와 같은 요법적 치료 또는 비-치료 용도로서 개체에게 투여하는 것을 설명하는 교육용 재료를 포함한다. 일 구현예에서, 이 키트는 예를 들어 항체를 개체에게 투여하기 전에 본 발명의 항-C5 항체 또는 그의 조합을 포함하는 치료 조성물을 용해 또는 현탁시키기에 적합한 (임의로 멸균된) 약제학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함한다. 선택적으로, 키트는 항체를 투여하기 위한 도포기를 포함한다.
실험예
본 발명은 이제 하기 실시예를 참조하여 설명된다. 이들 실시예는 단지 예시의 목적으로 제공되며, 본 발명은 이러한 실시예로 제한되는 것으로 결코 해석되어서는 안 되며, 오히려 여기에 제공된 교시의 결과로서 명백해지는 임의의 및 모든 변형을 포괄하는 것으로 해석되어야 한다.
추가 설명 없이, 당업자는 선행 기술 및 하기 예시적인 실시예를 사용하여 본 발명의 화합물을 제조 및 활용하고 청구된 방법을 실시할 수 있다고 여겨진다. 따라서 다음 작업 예는 본 개시내용의 나머지 부분을 어떤 식으로든 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예 1
pH 7.4에서 C5에 대한 개선된 결합 및 pH 5.8에서 C5에 대한 감소된 결합을 갖는 변이체를 개발할 목적으로, 인간화 2G1 (VH-11801 (서열번호:2) 및 VL-1901 (서열번호:7))의 변이체를 생성하였다 (도 1).
본원에 기재된 접근법은 시험관 내에서 측정된 mAb의 친화도 및 차단 효능이 생체 내 반감기, PK 또는 PD와 반드시 상관관계가 있는 것은 아니라는 이해를 기반으로 한다. 이것은 적어도 부분적으로 C5와 같이 혈액에 고농도로 존재하는 가용성 항원이 신체에서 제거를 목표로 하는 면역 복합체(즉, 항원에 결합된 mAb)를 형성하기 때문이다. 따라서, 일반적으로 이러한 가용성 항원의 생체내 활성을 차단하기 위해서는 혈액 내 높은 항체 농도가 필요하다.
본원에 기재된 접근법은 치료 항체의 생체내 효능이 항체 재순환 또는 반감기 (및 따라서 PK)를 증가시킴으로써 및 "pH-의존성" 결합 특성을 보유하는 mAb를 생성함으로써 가속화된 항원 세포내 분해에 의해 증진될 수 있다는 이해에 기초한다. 이와 관련하여 바람직한 특성은 치료용 mAb가 혈액의 pH인 중성 pH(~pH 7.4)에 가까운 상태에서 항원(예를 들어, C5)에 잘 결합할 것이라는 점이다. 이러한 방식으로 항원(예를 들어, C5) 활성을 효과적으로 차단한다. 그런 다음 면역 복합체는 단백질 분해를 위해 엔도솜으로 이동하는 세포에 의해 흡수된다. 초기 엔도솜의 pH는 산성이다(~pH 5.8). 따라서 치료용 mAb가 산성 pH에서 항원에 대한 결합이 불량할 때, mAb는 면역 복합체에서 해리되어 FcRn에 의해 흡수되어 혈장으로 되돌아갈 수 있다. 이러한 방식으로, 항원(예를 들어, C5)만 엔도솜 단백질 분해 경로를 통해 분해되는 반면, FcRn을 통한 mAb의 재순환은 혈장 내 지속성 연장에 기여한다.
산성 pH(H+)에서 양성자화 경향으로 인해, CDR에 히스티딘 잔기를 함유하는 mAb는 산성 pH에서 양성자화 시 결합 친화도가 약화될 수 있다. 본원에 기재된 접근법은 모든 CDR 잔기의 "히스티딘 스캐닝"(즉, 각 CDR 잔기의 히스티딘으로의 치환)을 사용하였다. 그런 다음, Octet 기기(Pall ForteBio)를 사용하여 pH 7.4 및 pH 5.8에서 mAb 및 C5 해리를 측정하여 pH 5.8에서 상대적으로 더 빠른 해리를 갖고 pH 7.4에서 상대적으로 더 느린 해리를 갖는 히스티딘-치환 변이체를 확인하였다.
모 인간화 2G1 mAb (VH-11801 (서열번호:2) 및 VL-1901 (서열번호:7))는 pH 5.8에서 C5에 대해 더 나은 친화성을 갖는 것으로 나타났다(도 7). mAb의 6개 CDR (VH-11801 (서열번호:2) 및 VL-1609 (서열번호:7)) 각각의 각 잔기에서 히스티딘 치환을 갖는 단일-치환 변이체를 생성하고 그것의 pH-의존적 결합 특성에 대해 평가하였다. 각 변이체에 대해, VH 및 VL 플라스미드를 구축한 다음, HEK 세포에 일시적으로 형질감염시켰다. 세포 배양 상청액의 mAb는 pH 5.8 및 pH 7.4에서의 결합에 대해 시험되었다.
이러한 단일 치환 변이체 중에서, 3개(mAb L3-1, L1-2 및 H1-4)는 pH 의존성 결합에서 약간의 개선을 나타내었다. L3-1의 서열은 도 2 (서열번호: 1-5, 8, 9, 및 11-13)에 도시되어 있다. L1-2의 서열은 도 3 (서열번호: 1-5, 9, 10, 및 14-16)에 도시되어 있다. H1-4의 서열은 도 4 (서열번호: 4, 5, 6-10, 및 17-19)에 도시되어 있다.
단일-치환 변이체를 생성하는 것 외에도, 단일-치환 경쇄 및 중쇄를 조합하여 이중-치환 변이체를 생성하였다. 이러한 이중 치환 변이체 중에서, 2개(mAb H1-8/L1-9 및 H2-6/L3-5)는 pH 의존성 결합에서 약간의 개선을 나타내었다. H1-8/L1-9의 서열은 도 5 (서열번호: 4, 5, 9, 10, 및 20-25)에 도시되어 있다. H2-6/L3-5의 서열은 도 6 (서열번호: 3, 5, 8, 9, 및 26-31)에 도시되어 있다.
VH-11801 서열번호:2 및 VL-1901 서열번호:7을 갖는 모 인간화 mAb 2G1의 C5 결합 및 해리의 옥텟 추적, 및 다양한 단일 및 이중 히스티딘 돌연변이체는 도 7 내지 도 12에 도시되어 있다. C5 기능을 차단하는 이들의 상대적 활성을 모 인간화 2G1 mAb(VH-11801/VL-1901)와 비교하고 양 적혈구 세포 용해 검정을 사용하여 도 13 및 도 14에 나타내었다. 모 인간화 2G1 mAb에 비해 동등하거나 개선된 활성을 나타낸 mAb L3-1을 제외하고, 다른 모든 돌연변이체는 감소된 활성을 나타내었다. 두 개의 이중 치환 변이체의 경우, H1-8/L1-9가 본질적으로 모든 C5 차단 활성을 상실하여 활성이 크게 감소한다. mAb H1-8/L1-9 및 H2-6/L3-5에 대해 pH 5.8에서 일부 바람직한 더 빠른 해리를 관찰했지만 pH 7.4에서 해리도 극적으로 가속화되기 때문에 이것은 놀라운 일이 아니다(이는 활성 손실을 설명함).
상기 히스티딘 치환 변이체가 시험관 내에서 덜 활성이 되더라도, 생체 내 반감기가 개선될 수 있으며, 따라서 pH 의존성 결합으로 인한 감소된 분해로 인해 모 mAb보다 PK/PD 특성이 개선될 수 있다.
생체 내 PK/PD를 시험하기 위해, 슬리핑 뷰티 트랜스포존 요소를 함유하는 인간 C5 cDNA의 꼬리 정맥을 통한 유체역학적 주입을 통해 인간 C5를 영구적으로 발현하는 NOD/SCID 마우스를 만들어 C5 인간화 마우스를 개발하였다. NOD 마우스는 자연적으로 C5가 결핍되어 있으므로, 내인성 마우스 C5는 약력학(PD) 검정을 방해하지 않는다. SCID 유전적 배경은 형질전환으로 발현된 인간 C5가 인간 C5에 대한 면역 반응을 유도하지 않을 것임을 보장한다. C5 인간화 마우스는 안정적인 게놈 통합을 위해 슬리핑 뷰티 트랜스포존 서열 요소를 함유하는 인간 C5 플라스미드의 유체역학적 주입에 의해 개발되었다. NOD/SCID 마우스에서 높은 수준의 인간 C5 발현의 대표적인 데이터는 도 16에 도시되어 있다. 일반적으로 50~120 μg/mL 범위의 C5 혈장 농도가 관찰되었다. 이것은 약 80 μg/mL인 인간 혈장의 C5 농도와 비슷한다.
5개의 히스티딘-치환 변이체(즉, mAb L3-1, L1-2, H1-4, H1-8/L1-9 및 H2-6/L3-5)를 PK/PD에 대해 평가하였다. 2개의 이중 치환 변이체(즉, mAb H1-8/L1-9 및 H2-6/L3-5)가 가장 큰 지속성을 나타내었다. 3개의 단일 치환 변이체 중 mAb H1-4 및 L1-2는 mAb L3-1보다 더 나은 지속성을 나타내었다(도 17). 따라서 L3-1은 인간 C5에 대해 pH 7.4 친화도 및 시험관 내 차단 활성이 가장 우수하지만 반감기가 가장 짧다. 흥미롭게도, 생체내 차단 활성을 나타내지 않은 mAb H1-8/L1-9를 제외하고, 다른 모든 변이체는 모 인간화 2G1 mAb(VH-11801, VL-1901)에 비해 PD 프로파일이 개선되었다(도 18 및 도 19).
변이체 mAb H1-8/L1-9가 최상의 pH-결합 차이를 나타내었지만 (즉, 항원 해리는 pH 7.4보다 pH 5.8에서 훨씬 더 빠르게 발생하지만 (도 12)), 그의 C5 차단 활성을 많이 상실하였다 (pH 7.4에서의 항원 해리 또한 증가하기 때문임)는 것을 고려하여, (H1-8 및 L1-9의 히스티딘 치환을 보존하면서) H1-8 / L1-9의 6개의 CDR 내의 각각의 잔기를 무작위로 치환하기 위해 다양한 돌연변이유발을 수행하였다. ScFV 작제물의 ELISA 플레이트 검정에서 pH 7.4 결합을 상당히 개선시킨 3개의 "핫스팟"이 VH에서 확인되었다. 이들 잔기는 서열번호:20에 대한 VH CDR1 내의 위치 #9 (즉, L9)에서의 류신, 서열번호:4에 대한 VH CDR2 내의 위치 #4 (즉, P4)에서의 프롤린, 및 서열번호:5에 대한 VH CDR3 내의 위치 #16 (즉, V16)에서의 발린이었다. 가장 크게 개선된 결합을 나타내는 치환은 L9→W9 (즉, L9W), L9→I9 (즉, L9I), L9→V9 (즉, L9V), L9→Y9 (즉, L9Y), L9→F9 (즉, L9F), P4→F4 (즉, P4F), P4→L4 (즉, P4L), P4→M4 (즉, P4M), P4→W4 (즉, P4W), P4→I4 (즉, P4I), V16→F16 (즉, V16F), V16→E16 (즉, V16E) 및 V16→W16 (즉, V16W)이었다(도 20).
이들 13개의 치환 (즉, L9→W9 (즉, L9W), L9→I9 (즉, L9I), L9→V9 (즉, L9V), L9→Y9 (즉, L9Y), L9→F9 (즉, L9F), P4→F4 (즉, P4F), P4→L4 (즉, P4L), P4→M4 (즉, P4M), P4→W4 (즉, P4W), P4→I4 (즉, P4I), V16→F16 (즉, V16F), V16→E16 (즉, V16E) 및 V16→W16 (즉, V16W))을 생성하고 IgG4로서 이들의 pH 의존성 결합 특성에 대해 평가하였다. 각 변이체에 대해, VH 및 VL 플라스미드를 구축한 다음, Expi-CHO 세포에 일시적으로 형질감염시켰다. 세포 배양 상청액의 mAb는 pH 5.8 및 pH 7.4에서의 결합에 대해 시험되었다. 도 21 및 도 22는 이들 변이체의 C5 결합 특성을 요약한 것이다. 도 21은 mAb 결합 신호에 대한 C5 결합의 비율을 도시하고, 도 22는 회합 상에서 해리 상으로 전환한 후 pH 7.4 및 pH 5.8에서 피크 값으로부터 결합 신호의 % 감소를 도시한다. 주어진 돌연변이체의 경우, 도 21의 높은 비율이 바람직하고; 그리고 도 22에서 pH 7.4에서 더 낮은 해리 %(망상선 막대) 및 pH 5.8에서 더 높은 해리 %(바둑판 무늬 막대)가 바람직하다.
13개의 mAb H1-8/L1-9 단일 히스티딘 치환 변이체의 스크린으로부터, 도 23에 나열된 18개의 조합 치환 변이체 (즉, L9I/P4M, L9I/P4W, L9I/P4F, L9F/P4M, L9F/P4W, L9F/P4F, L9I/P4M/V16W, L9I/P4W/V16W, L9I/P4F/V16W, L9F/P4M/V16W, L9F/P4W/V16W, L9F/P4F/V16W, L9I/P4M/V16E, L9I/P4W/V16E, L9I/P4F/V16E, L9F/P4M/V16E, L9F/P4W/V16E, 및 L9F/P4F/V16E)를 생성하기 위해 7개의 변이체가 선택되었다. 이들 18개의 조합 치환 변이체를 생성하고 이들의 pH 의존성 결합 특성에 대해 평가하였다. 각 변이체에 대해, VH 및 VL 플라스미드를 구축한 다음, Expi-CHO 세포에 일시적으로 형질감염시켰다. 세포 배양 상청액의 mAb는 pH 5.8 및 pH 7.4에서의 결합에 대해 시험되었다.
도 24 및 도 25는 이들 18개 조합 치환 변이체의 C5 결합 특성을 요약한 것이다. 도 24는 mAb 결합 신호에 대한 C5 결합의 비율을 나타내고, 도 25는 회합 상에서 해리 상으로 전환한 후 각각 pH 7.4 및 pH 5.8에서 피크 값으로부터 결합 신호의 % 감소를 도시한다. 주어진 돌연변이체의 경우, 도 24의 높은 비율이 바람직하고; 그리고 도 25에서 pH 7.4에서 더 낮은 해리 %(망상선 막대) 및 pH 5.8에서 더 높은 해리 %(바둑판 무늬 막대)가 바람직하다.
실시예 2
최대 pH 7.4 대 pH 5.8 결합 차이 및 최상의 pH 7.4 결합을 기반으로, 변이체 IWW, IFW, FME 및 FMW를 추가 특성화를 위해 V1-8/L1-9의 상위 4개 삼중 돌연변이 클론으로 선택하였다. 친화성 성숙 프로젝트의 추가 분석 및 데이터 마이닝을 수행하고 V1-8/L1-9의 pH 7.4 결합을 복구하기 위한 또 다른 유망한 무작위 돌연변이로서 CDR2 위치 9에서 T에서 His로의 돌연변이를 확인하였다(도 26 내지 도 28). IWW, IFW, FME 및 FMW는 V1-8/L1-9의 상위 4개 삼중 돌연변이 클론으로 선택되었다. IWW, IFW, FME 및 FMW를 발현시키고 단백질을 정제하여 pH 의존성 결합 특성을 확인하였다. 용혈성 검정에서 C5 억제 활성도 시험하였다(도 29, 도 30, 도 32 내지 도 34). 상기 4개의 삼중 돌연변이체를 새로운 His 돌연변이(VH의 CDR2, 위치 9, T에서 H로의 돌연변이)와 추가로 조합하여 4개의 사중 돌연변이체(IWWH, IFWH, FMEH 및 FMWH; 예를 들어, 도 31)를 생성하였다. 이 새로운 돌연변이체는 pH 의존성 결합 특성과 C5 억제 활성에 대해 시험되었다. 이들 중에서, 사중 돌연변이 FMEH는 삼중 돌연변이 모분자 FME보다 개선된 돌연변이로 확인되었다(도 35 내지 도 37).
실시예 1에 기재되고 항-C5 mAb의 조작된 돌연변이체 중 일부의 생체내 PK/PD를 시험하기 위해 유체역학적 주입에 의해 생성된 NOD/SCID 마우스 상의 C5 인간화 마우스 이외에, SCID/FcRn 형질전환 마우스 상의 C5 인간화 마우스 (인간 FcRn 트랜스제닉 및 마우스 FcRn 녹아웃) 배경도 생성되었다. 후자의 균주는 pH 의존성 항-C5 mAb 돌연변이체와 IgG4 항체 작제물의 추가 조작된 Fc 도메인(Fc 도메인에서 3개의 돌연변이)과의 조합 효과의 시험을 가능하게 하였다(도 38 및 도 39).
SCID/FcRn 형질전환 배경 상의 C5 인간화 마우스를 사용하여, H1-8/L1-9 삼중 돌연변이체 IFW, FMW 및 FMEH의 PK/PD를 Fc 도메인(PLA)에 3개의 잔기 돌연변이가 있는 IgG4 형식으로 시험하였다. 데이터는 원래의 인간화 항-C5 mAb 11801(이로부터 H1-8/L1-9가 유래됨)에 비해 상당히 개선된 PK/PD 활성을 보여주었다(도 40 내지 도 42).
실시예 3
보체 활성화는 표적 인식 및 단백질 분해 절단의 캐스케이드를 포함한다. 이는 3개의 다른 경로를 통해 활성화될 수 있으며, 모두 C3 활성화 단계에서 수렴된다(도 43). 이러한 경로는 전통적, 대체 및 렉틴 경로이다(도 43). CP는 항원-항체 복합체에 의해 활성화되고 C3 활성화 단계에서 다른 경로와 병합되기 전에 C1 및 C4/C2의 순차적 활성화를 수반한다. LP는 미생물 표면 당 분자에 결합할 때 MBL, 콜렉틴 및 피콜린과 같은 특정 패턴 인식 분자에 의해 촉발된다. 이는 MASP의 활성화를 포함하고 C4/C2를 절단하고 C3 활성화 단계에서 다른 경로에 합류한다(도 43). AP는 자발적인 가수분해와 C3(H2O)를 생성하기 위한 C3의 활성화로 인해 낮은 수준에서 구성적으로 활성이다. 후자는 인자 B와 회합할 수 있고 인자 D에 의한 단백질 분해 활성화 시, 초기 C3 절단 효소 복합체 C3(H2O)Bb를 생성한다(도 43). 조절 단백질이 없을 때, C3(H2O)Bb 복합체의 생성물인 C3b는 C3(H2O)가 하는 것과 같은 방식으로 인자 B와 회합할 수 있으며 따라서 자가 증폭 C3 활성화의 또 다른 주기가 시작된다.
3개의 경로 중 하나에 의한 C3의 활성화는 항상 대체 경로를 촉발한다. 따라서 많은 보체 매개 질환에서, 대체 경로 활성화를 억제하는 것이 핵심이다. C3 활성화는 또한 C5-절단 효소 복합체의 생성을 유도하고 말단 보체 활성화 경로를 개시하여, 세포 용해 및 사멸을 유발할 수 있는 강력한 전염증 매개체 C5a 및 막 공격 복합체 C5b-9의 생성으로 정점에 달한다. 보체가 무차별 손상을 일으키는 것을 방지하기 위해, 숙주 세포는 보체 활성화 및 증폭을 차단하는 기능을 하는 다수의 막 고정 조절인자를 발현한다. 붕괴 촉진 인자(DAF, CD55) 및 MCP를 포함한 이러한 조절제 중 일부는 C3 활성화를 억제하는 반면, CD59와 같은 다른 조절제는 보체 활성화 캐스케이드의 다른 단계에서 작동한다. 막 고정 보체 조절인자 외에, 혈액에는 숙주 조직을 우선적으로 보호하는 역할을 하는 유체상 조절인자가 있다. 유체상 억제제는 보체 활성화의 대체 경로의 중요한 억제제인 FH 및 인자 I(FI), 및 전통적 경로 보체 활성화를 억제하는 C4BP 및 C1 억제제(C1INH)를 포함한다. 유체상 및 막 고정 보체 조절 단백질은 종종 다수의 보존된 SCR 도메인으로 구성된다. 예를 들어, FH는 20개의 SCR로 구성되고(도 44), DAF(CD55)의 세포외 부분은 5개의 SCR 도메인을 함유한다.
FH는 C3b의 FI 매개 절단에 대한 보조인자 역할을 하고 C3bBb 복합체의 붕괴를 가속화함으로써 대체 경로 보체 활성화를 억제하며, 두 메커니즘 모두 AP의 증폭 루프를 방지한다. 구조-기능 연구는 FH 내에서 보체 조절 활성이 SCR1-5에 위치하는 반면, 다른 SCR 도메인, 특히 SCR19-20은 숙주 세포 및 표면 침착된 C3b를 인식하는 데 중요한 역할을 한다는 것이 밝혀졌다. 마찬가지로, DAF(CD55) 및 MCP(CD46)의 세포외 SCR 도메인은 이들의 보체 억제 활성에 대한 책임이 있는 것으로 나타났으며 DAF 및 MCP 또는 이들의 뮤린 상동체의 가용성 형태는 보체 조절 활성을 갖는 것으로 입증되었다. 보체 조절 단백질의 발현 부재 또는 기능 결함으로 이어지는 돌연변이는 여러 보체 의존성 질환과 연관된다. 예를 들어, GPI 앵커 생합성에 관여하는 효소의 유전자 돌연변이는 PNH 환자의 영향을 받는 조혈 줄기 세포 및 상응하는 적혈구(RBC), 혈소판 및 백혈구에서 DAF 및 CD59의 발현 부족을 초래한다. 이것은 대체 경로 매개 보체 공격 및 영향을 받은 PNH RBC의 용해 및 혈소판 활성화로 이어져, PNH 환자에서 빈혈 및 혈전증과 같은 치명적인 질환 병리를 유발한다. 마찬가지로, FH 및 MCP를 인코딩하는 유전자의 돌연변이는 HUS와 연관된다. PNH와 aHUS는 현재 임상에서 표준 요법으로 인간화된 항-C5 mAb 약물 에쿨리주맙으로 치료된다. 그러나, 여전히 충족되지 않은 의학적 요구가 상당하고 PNH 및 aHUS의 치료 및 기타 보체 매개 질환 모두에서 보다 효과적이고 편리한 항-보체 약물을 개발하는 것이 여전히 바람직한다.
보체 단백질을 표적으로 하는 약물 개발의 과제 중 하나는 높은 혈장 농도 및/또는 빠른 턴오버(turnover)이다. 예를 들어, 인간 C3 및 C5의 혈장 농도는 각각 약 1 mg/mL 및 80 ug/mL이다. 이는 이러한 단백질에 대한 억제제가 고용량 및/또는 빈번하게 투여될 필요가 있음을 의미한다. 실제로, 항-C5 mAb 약물 에쿨리주맙은 PNH 및 aHUS 환자에서 각각 900 mg 및 1200 mg의 유지 용량으로 정맥 주사를 통해 2주마다 제공되어야 한다. 더 오래 지속되는 2세대 항-C5 mAb 라불리주맙이 주사 빈도를 매 8주로 줄이기 위해 개발되었지만 라불리주맙의 유지 용량은 주사당 3600 mg으로 증가하였다. 또한 에쿨리주맙과 라불리주맙 모두 PNH 환자에서 LDH와 헤모글로빈 수치를 정상화할 수 없었다. 표준 에쿨리주맙 요법을 받는 PNH 환자에서, 돌발성 용해가 자주 관찰되며 20-30%의 환자는 여전히 수혈 의존적이다. PNH 환자의 이들 미충족 의료 필요는 영향을 받은 혈액 세포에 대한 DAF 및 CD59 결핍으로 인해 C3 활성화 뿐만 아니라 MAC 매개 손상에 취약하다는 사실과 관련이 있다. 에쿨리주맙 및 라불리주맙과 같은 항-C5 mAb는 C5 매개 용혈을 억제할 수 있지만, 이들은 영향을 받은 RBC 상의 C3 활성화를 방지하지 않으며, 그 결과, RBC의 C3b 옵소닌화가 여전히 일어나고, 이는 세망내피계에서 C3B-옵소닌화된 RBC의 포식작용에 의해 야기되는 과정인 EVH의 잘 인식된 현상을 초래한다. 또한, 연구에 따르면 C5 단계에서 RBC에 대한 보체 활성화를 차단하는 것은 효능에 한계가 있는 것으로 나타났다. 너무 많은 C5 전환효소가 이미 세포 표면에 조립되어 있으면 유한 결합력의 mAb로 C5 절단을 완전히 차단하는 것이 불가능해지기 때문이다. 이는 에쿨리주맙으로 치료된 PNH 환자에서 돌파 용해 현상을 설명할 수 있고, PNH 및 토끼 RBC 둘 다가 AP를 통한 C3 보체 활성화에 매우 민감하고 표면 상에 풍부한 C5 전환효소를 용이하게 조립할 수 있기 때문에, 항-C5 mAb가 생체외 검정에서 토끼 및 PNH RBC 세포의 완전한 용혈을 방지할 수 없는 이유를 설명할 수 있다. 예를 들어, C3-억제 고리형 펩타이드 또는 FH의 재조합 짧은 변이체의 사용을 통해, 보체 의존성 질환에서 C3 활성화를 표적화하려는 노력이 계속되고 있지만, 이러한 분자는 매우 불량한 약동학을 가지며, 크고 빈번한 (예를 들어, 매일) 투여를 필요로 한다.
본 발명은 부분적으로 mAb의 C5 차단 활성을 손상시키지 않으면서 약동학을 개선하기 위해 인간 C5에 대한 pH 의존성 결합을 얻기 위해 VH 및 VL에 돌연변이를 도입함으로써 인간화 항-C5 mAb 약물의 개선을 기재한다. VH 및 VL 내의 이러한 돌연변이는, IgG4 Fc 도메인 돌연변이와 조합될 때, SCID/인간 FcRn 형질전환 마우스 상의 C5 인간화 마우스에서 평가된 바와 같이 상당히 개선된 약동학 및 약력학을 생성하였다.
본 발명의 전략은 부분적으로 항-C5 mAb-FH 융합 단백질의 개념에 기초한다. SCR 도메인 1-5는 상기에 도입된 바와 같이 C3 활성화 조절에 관여하는 도메인인 FH에서 사용되었다. 목표는 전장 FH를 갖는 융합 단백질을 제조하는 것이 아닌데, 그 이유는 이것이 매우 크고 복잡한 당단백질이고 항-C5 mAb를 갖는 완전한 융합 단백질이 제조상의 도전을 가질 것이기 때문이다. FH의 N-말단 SCR 1-5는 인간 IgG4의 Fc 도메인의 C-말단에 부착되었다(도 44). Fc와 FH 단편 사이에 링커가 추가되지 않고, IgG4 Fc의 마지막 아미노산 이후에, 성숙 FH의 N-말단 서열에 직접 연결된다. 이 항-C5 mAb 융합 단백질은 이기능성이며, C5 활성을 차단하기 위해 규칙적 항-C5 mAb로 기능하고 FH 도메인은 C3 보체 활성화 억제제로 작용한다.
이 작제물의 다른 중요한 이점은 FH 융합 단백질을 구축하기 위해 오래 지속되는(재순환) 항-C5 mAb를 사용했다는 것이다. 오래 지속되는 항-C5 mAb는 IgG4 Fc 도메인 돌연변이(S228P, M428L 및 N434A, PLA로 지칭됨)와 결합된 C5에 대한 pH 의존성 결합(pH 7.4보다 pH 5.8에서 C5로부터 더 빠른 해리)을 갖도록 조작된다.
본원에 제공된 데이터는 항-C5 mAb FMEH-IgG4PLA에 기초한 항-C5 mAb-FH 융합 단백질의 VH 및 VL 서열을 포함한다(도 45 및 도 46). SDS 겔은 예상되는 더 큰 크기를 나타내는 융합 단백질의 발현 VH 사슬을 나타내었고 양호한 무결성을 가졌다(도 47).
mAb-FH 융합 단백질은 여전히 모 항-C5 mAb의 pH 의존성 결합 특성을 유지했으며(도 48 및 도 49), 이는 이러한 융합 단백질이 모 항-C5 mAb (예를 들어, FMEH)와 유사하게 오래 지속되는 약물로 거동할 필요가 있기 때문에 중요하다. 항-C5 mAb-FH 융합 단백질은 토끼 RBC (도 50) 및 PNH RBC 용해 (도 57)의 억제에 있어 해당 모체 mAb (예를 들어, FMEH-IgG4PLA 대 FMEH-IgG4PLA-FH SCR1-5) 및 벤치마크 규칙적 항-C5 mAbs (에쿨리주맙 및 라불리주맙)보다 훨씬 더 강력하였다. 상응하는 모체 항-mAb 또는 벤치마크 항-C5 mAbs (에쿨리주맙 및 라불리주맙)가 아닌 항-C5 mAb-융합 단백질은 토끼 및 PNH RBC의 C3 옵소닌화를 억제하는 것으로 추가로 나타났다(도 51 및 도 58).
더욱이, 항-C5 mAb-FH 융합 단백질은 기존의 벤치마크 항-C5 mAb(에쿨리주맙)보다 C5 인간화 마우스에서 더 나은 PK(반감기)를 갖고 2세대 오래 지속되는 벤치마크 항-C5 mAb(라불리주맙)와 유사한 PK, 그러나 (이관능성 특성으로 인해) 벤치마크 항-C5 mAb 둘 다보다 토끼 RBC 용해 시험에서 더 우수한 PD (약력학)를 갖는 것으로 입증되었다 (도 52 내지 도 56).
이 실시예에 사용된 물질 및 방법이 이제 설명된다.
마우스에서 인간 C5의 검출을 위한 샌드위치 ELISA: 인간 C5 cDNA 플라스미드의 유체역학적 주입 후 인간 C5를 발현하는 NOD/SCID 또는 FcRn/SCID 마우스에서 인간 C5의 검출을 위한 샌드위치 ELISA: 96-웰 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 중탄산염 완충액에서 2 μg/mL의 최종 농도로 항-인간 C5 항체(Quidel, A217)로 코팅하였다. 0.05% Tween-20을 함유하는 PBS로 세척한 후, 플레이트를 1시간 동안 실온에서 차단 용액 중 희석된 혈장 샘플과 함께 인큐베이션하였다. 세척 후, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 차단 용액에서 바이오티닐화된 항-인간 C5 mAb 9G6)과 함께 인큐베이션하고, 다시 세척하고, 차단 용액에서 1시간 동안 실온에서 호스라디쉬 과산화효소 (BD pharmigen)에 접합된 아비딘 또는 스트렙타비딘과 함께 인큐베이션하였다. 최종 세척 후, 플레이트를 HRP 기질로 3분 동안 전개하였다. 반응을 2N H2SO4로 중단하고 플레이트를 마이크로 플레이트 판독기에서 450 nm에서 판독하였다. 마우스에서 인간 IgG4의 검출을 위한 샌드위치 ELISA.
인간 IgG4 검출을 위한 샌드위치 ELISA: 항-인간 C5 IgG4 mAb 또는 항-C5 mAb-FH SCR1-5 융합 단백질로 처리된 마우스에서 인간 IgG4의 검출을 위한 샌드위치 ELISA: 96웰 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 중탄산염 완충액에서 2μg/mL의 최종 농도로 항-인간 카파 경쇄 항체(Antibody Solutions, AS75-P)로 코팅하였다. 0.05% Tween-20을 함유하는 PBS로 3회 세척한 후, 플레이트를 1시간 동안 실온에서 차단 용액 중 희석된 혈장 샘플과 함께 인큐베이션하였다. 세척 후, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 차단 용액에서 항-인간 IgG4 HRP(1:2000 희석, Invitrogen, A10654)와 함께 인큐베이션하였다. 세척 후, 플레이트를 HRP 기질로 3분 동안 전개하였다. 반응을 2N H2SO4로 중단하고 플레이트를 마이크로 플레이트 판독기에서 450 nm에서 판독하였다.
항-인간 C5 IgG4 -FH1-5 융합으로 처리된 마우스에서 인간 IgG4 -FH1-5 융합의 검출을 위한 샌드위치 ELISA: 96웰 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 중탄산염 완충액에서 2μg/mL의 최종 농도로 항-인간 카파 경쇄 항체(Antibody Solutions, AS75-P)로 코팅하였다. 0.05% Tween-20을 함유하는 PBS로 3회 세척한 후, 플레이트를 차단 용액과 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 플레이트를 1시간 동안 실온에서 차단 용액 중 희석된 혈장 샘플과 함께 인큐베이션하였다. 세척 후, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 차단 용액에서 바이오틴-접합된 항-인간 FH(1:100 희석, Thermo Scientific, MA5-17735)와 함께 인큐베이션하였다. 세척 후, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 차단 용액에서 스트렙타비딘-HRP(1:1000 희석, BD Biosciences, 554066)와 함께 인큐베이션하였다. 세척 후, 플레이트를 HRP 기질(Thermo Scientific, 34029)로 3분 동안 전개하였다. 반응을 2N H2SO4로 중단하고 플레이트를 마이크로 플레이트 판독기에서 450 nm에서 판독하였다.
마우스 혈장 샘플에서 온전한 FMEH - IgG4PLA -FH1-5 융합 단백질의 검출을 위한 샌드위치 ELISA: 96웰 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 중탄산염 완충액에서 2μg/mL의 최종 농도로 항-인간 카파 경쇄 항체(Antibody Solutions, AS75-P)로 코팅하였다. 0.05% Tween-20을 함유하는 PBS로 3회 세척한 후, 플레이트를 차단 용액과 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 플레이트를 1시간 동안 실온에서 차단 용액 중 희석된 혈장 샘플과 함께 인큐베이션하였다. 세척 후, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 차단 용액에서 바이오틴-접합된 항-인간 인자-H 항체(1:100 희석, Thermo Scientific, MA5-17735)와 함께 인큐베이션하였다. 세척 후, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 차단 용액에서 스트렙타비딘-HRP(1:1000 희석, BD Biosciences, 554066)와 함께 인큐베이션하였다. 세척 후, 플레이트를 HRP 기질(Thermo Scientific, 34029)로 3분 동안 전개하였다. 반응을 2N H2SO4로 중단하고 플레이트를 마이크로 플레이트 판독기에서 450 nm에서 판독하였다.
양 적혈구 용해 시험: 양 RBC(PBS, Complement Technology Inc.에서 제조된 분석 샘플당 1 x 107 세포)를 젤라틴 베로날 완충액 (GVB2+, Sigma; 총 검정 부피: 100 μl)에서 37℃에서 20분 동안 50% 정상 인간 혈청 (Complement Technology Inc로부터의 NHS)과 함께 인큐베이션하였다. 양 RBC에 첨가하기 전에, NHS를 4℃에서 1시간 동안 항-C5 mAb와 함께 사전 인큐베이션하였다. PBS 중 빙랭 40mM EDTA를 첨가하여 용해 반응을 중단시켰다. 인큐베이션 혼합물을 1500 rpm에서 5분 동안 원심분리하고 상청액을 수집하고 OD405 nm에 대해 측정하였다. NHS가 없거나 EDTA가 첨가된 샘플을 음성 용해 대조군으로 사용하고, 증류수로 완전히 용해된 양 RBC의 샘플을 양성 대조군(100% 용해)으로 사용하여 다른 샘플의 용해 %를 정규화하였다.
닭 적혈구 용해 검정: 닭 RBC(Rockland Immunochemicals Inc #R401-0050)를 항 닭 토끼 RBC 항체(Rockland Immunochemicals Inc #103-4139)(150ug/mL)로 30분 동안 감작하고 GVB 완충액으로 2회 세척하였다. 뮤린 C5 활성을 차단하기 위해 mAb BB5.1로 전처리된 C5 인간화 마우스 레피루딘 혈장 및 C5 고갈된 인간 혈청(Quidel #A501) 샘플을 GVB 완충액(즉, 5 mL 내지 50 mL 최종 검정 부피)에서 10%로 희석하고, 5 mL의 항체 감작 cRBC 세포 ul(5 x 108/mL)을 최종 부피 50 mL로 혼합하고 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 반응은 PBS 중 100 mL의 차가운 10 mM EDTA로 중단되었다. 세포를 4℃에서 5분 동안 1500rpm으로 원심분리하였다. 수집된 상층액은 405에서 OD를 측정하였다.
토끼 적혈구 용해 시험: 토끼 RBC (Rockland Immunochemicals Inc cat# R403-0100) (PBS, Complement Technology Inc에서 제조된 검정 샘플 당 1 x 107개 세포)를 37℃에서 30분 동안 젤라틴 베로날 완충제 (GVB2 + EGTA, Sigma; 총 검정 부피: 100 μL) 중 25% 정상 인간 혈청 (NHS, International Technology Inc로부터의 것) 또는 50% 시노몰구스 원숭이 혈청 (CMS, Innovative research)과 함께 인큐베이션하였다. 토끼 RBC에 추가하기 전에, NHS 또는 CMS를 4℃에서 1시간 동안 항-C5 mAb 또는 항-C5 mAb-fH SCR1-5 융합 단백질과 함께 사전 인큐베이션하였다. PBS 중 빙랭 40mM EDTA를 첨가하여 용해 반응을 중단시켰다. 인큐베이션 혼합물을 1500 rpm에서 5분 동안 원심분리하고 상청액을 수집하고 OD405 nm에 대해 측정하였다. NHS 또는 CMS가 없거나 EDTA가 첨가된 샘플을 음성 용해 대조군으로 사용하고, 증류수로 완전히 용해된 토끼 RBC의 샘플을 양성 대조군(100% 용해)으로 사용하여 다른 샘플의 용해 %를 정규화하였다.
약력학 연구를 위한 하이브리드 인간 및 마우스 보체 시스템을 사용한 토끼 적혈구 용해 시험: C5 인간화 FcRn/SCID 마우스에서 다양한 항-hC5 mAb 및 이들의 fH SCR1-5 융합의 약력학을 시험하기 위해, (인간 C5의 공급원으로서) 시험 C5 인간화 FcRn/SCID 마우스의 혈장과 혼합된 C5-고갈 인간 혈청을 사용하여 rRBC 용해 검정을 수행하였다. 검정 혼합물의 마우스 C5는 2개의 항-마우스 C5 항체 BB5.1 및 21A9(최종 반응에서 각각 400ug/mL)로 차단되었다. 마우스 레피루딘 혈장 및 C5 고갈 인간 혈청(Quidel #A501) 샘플을 GVB EGTA 완충액에서 10%로 희석하고, 50 uL의 최종 부피에서 5 uL의 토끼 RBC 세포 ul (5 x 108/mL)와 혼합하고 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 반응은 PBS 중 100 uL의 차가운 10mM EDTA로 중단되었다. 세포를 4℃에서 5분 동안 1500rpm으로 원심분리하였다. 수집된 상층액은 405에서 OD를 측정하였다.
인간 C5 트랜스포존 플라스미드 구축: EcoRI 부위에서 pCAGGS 벡터로 서브클로닝된 pCMV Sport6의 C5 cDNA. Hinc II 부위 SB IR/DR(L) 트랜스포존 인식 서열에서 인핸서의 5' 부위와 rBG Stu I 부위 이후 3' 부위에서 SB IR/DR(R) 인식 서열을 주입 클로닝 방법으로 클로닝하였다. NOD/SCD 마우스에 유체역학적 주입을 위해, 2 μg의 pCMV-T7-SB100 플라스미드 및 트랜스포존 부위가 있는 pCAGGS 중 25 μg의 hC5를 꼬리 정맥으로 주입하였다. hC5 ELISA에 의해 1일 후 형질감염 효율을 확인하였다. 안정적인 통합은 주사 후 2주까지 hC5 ELISA를 다시 확인하였다.
히스티딘 스캐닝: 24웰 플레이트에서 인간화 mAb 2G1(VH-11801 및 VL-1901):HEK 세포의 히스티딘 스캐닝 및 8 μL의 X-TremeGene HP DNA 형질감염 시약 (Roche#6366546001)을 사용하여 1μg의 VH 및 2μg의 VL 플라스미드로 형질감염됨. Supt는 형질감염 2일 후에 수집되었고 옥텟 검정에 사용되었다. 11801 히스티딘 돌연변이체의 pH 의존성 해리를 Octet Red E 기기(ForteBio Inc.)에서 Biolayer 간섭법으로 분석하였다. 항-인간 IgG 바이오센서(ForteBio# 18-5060). 항체를 600초 동안 200 μL의 형질감염 상청액에 딥핑하여 센서 상에서 포착하였다. 나중에 이러한 바이오센서를 pH 7.4 및 pH 5.8에서 해리되어 600초 동안 hC5와 함께 인큐베이션하였다.
인색한(parsimonious) 돌연변이 유발: pH 7.4에서 C5 결합을 개선하는 점 아미노산 치환 돌연변이를 확인하기 위해, mAb H1-8/L1-9의 모든 6개 상보적 결정 영역(CDR)을 부위 지정 돌연변이 유발 방법에 의해 다른 19개 아미노산으로 개별적으로 돌연변이시켰다. 각 위치에 대해 설계된 돌연변이를 인코딩하는 올리고뉴클레오타이드는 QuikChange® (Agilent) 또는 Q5® Site-Directed Mutagenesis (NEB)에 의해 표적 CDR 위치에 돌연변이를 도입하는 데 사용된다. 결합 개선된 변이체를 스크리닝하기 위해, 각각의 형질감염된 반응으로부터 88개의 클론을 채취하고 E. 콜라이 세포 배지로부터 분비된 scFv를 포획 ELISA에서 시험하였다. 포획 ELISA에서, 적정량의 항-Fd 항체는 박테리아 상청액으로부터 scFv를 포획하기 위해 웰을 코팅하는 데 사용된다. 그 다음 비오틴화된 항원과 함께 인큐베이션하였다. 결합 신호는 HRP 접합된 항-Lc 항체를 사용하여 검출한 후 TMB 기질과 함께 인큐베이션한다. 반응을 0.2 M H2SO4로 켄칭하고 플레이트를 450 nm에서 판독하였다. 모 클론보다 더 큰 광학 밀도(OD) 450 nm 신호를 나타내는 클론을 채취하였다. 재성장 상층액의 ScFv는 양성 결과를 확인하기 위해 이중으로 ELISA(위와 같이)에 의해 재검정된다. 결합 개선된 클론은 항원이 ELISA 웰에 코팅된 직접 결합 ELISA에서 추가로 확인되고, scFv 정량적 ELISA에 의해 결정된 계산된 scFv 양이 사용된다. 반복적으로 모 scFv 결합보다 더 큰 결합을 나타내는 클론을 시퀀싱하였다.
pH 의존성 결합/해리의 측정: 친화성 성숙 H1-8L1-9 항-C5 mAb 돌연변이체 및 상응하는 FH SCR 1-5 융합 단백질의 pH 의존성 결합: 2-3 x 106/mL ExpiCHO를 24웰 플레이트에 씨딩하고 8μL의 X-TremeGene HP DNA 형질감염 시약(Roche#6366546001)을 사용하여 2 μg의 VH 및 4 μg의 VL 플라스미드로 형질감염시켰다. Supt는 형질감염 2일 후에 수집되었고 옥텟 검정에 사용되었다. 히스티딘 돌연변이체의 pH 의존성 해리를 Octet Red E 기기(ForteBio Inc.)에서 Biolayer 간섭법으로 분석하였다. 스트렙타비딘 바이오센서(ForteBio# 18-5019)를 250-300초 동안 3 μg/Ml의 포획-선택 바이오틴 항 인간 IgG 4 fab (Thermo fisher #7102902100)로 코팅하고 600초 동안 2mM 바이오시틴으로 켄칭하였다. 이 바이오센서는 hC5의 바이오센서에 대한 비특이적 결합을 포화시키기 위해 600초 동안 10μg/mL의 hC5(Complement tech#A320)와 함께 인큐베이션되었다. 항체를 600초 동안 200 μL의 형질감염 상청액에 딥핑하여 센서 상에서 포착하였다. 나중에 이러한 바이오센서를 pH 7.4 및 pH 5.8에서 해리되어 600초 동안 hC5와 함께 인큐베이션하였다.
대규모 형질감염: 대규모 ExpiCHO 형질감염 프로토콜: 생체 내 연구를 위한 mAb 및 mAb-FH 융합 단백질의 대규모 생산을 위해, 최대 역가 프로토콜을 사용하는 제조업체 지침에 따라 ExpiCHO 형질감염 시스템(Gibco#A29133)을 사용하였다. 200 mL의 Expi CHO 배지에 대해, 150 μg VH 및 300 μg VL을 형질감염에 사용하였다.
인간 또는 시노몰구스 FcRn에 대한 FMEH - IgG4PLA 및 FMEH - IgG4PLA -FH1-5의 친화성 분석: BIAcore 3000 기기(Biacore AB, Uppsala, Sweden)를 사용하여 고정된 인간 또는 Cyno FcRn에 대한 FMEH-IgG4PLA 및 FMEH-IgG4PLA-FH1-5의 결합에 대한 결합 및 해리 속도 상수를 측정하기 위해 표면 플라즈몬 공명 분석을 사용하였고, 모든 Biacore 실험을 25℃에서 수행하였다. CM5 센서 칩의 카르복실화된 덱스트란 매트릭스를 사용하여 정제된 인간 또는 Cyno FcRn을 아민 커플링 화학에 의해 커플링하여 각각 280RU 또는 200RU 표면 밀도를 얻었다. FMEH-IgG4PLA 또는 FMHE-IgG4PLA-FH1-5를 HBS(HEPES 완충 식염수) 완충액에서 200, 100, 50, 25, 12.5 및 0 nM으로 희석하고 샘플을 200초 동안 주입하고 결합된 분석물의 해리를 300초 동안 진행하도록 하였다. 2가 결합 모델을 가정하여 BIA 평가 소프트웨어 3.2에 의해 데이터를 분석하였다.
온전한 FMEH - IgG4PLA -FH1-5 융합 단백질의 C5-인간화 마우스에서의 약동학 측정: C5 및 FcRn 인간화 SCID 마우스에 40 mg/kg 용량의 FMEH-IgG4PLA-FH1-5 융합 단백질을 안와후 경로를 통해 주사하였다. 데이터 그래프에 표시된 바와 같이 약물 투여 후 다양한 시점에서 EDTA 혈장을 수집하였다.
SDS-PAGE에 의한 FMEH - IgG4PLA -FH1-5의 특성화: SDS-PAGE(나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동)를 사용하여 FMEH-IgG4PLA-FH1-5 단백질을 특성화하였다. FMEH-IgG4PLA-FH1-5는 환원제가 있거나 없는 PBS 완충액에 있다. 샘플을 99℃에서 10분 동안 가열하고 5 ug의 단백질 마커와 2 ug의 환원 및 비환원 샘플을 12% SDS-PAGE 겔에 로딩하였다. 겔을 80 v에서 30분 동안 실행한 다음, 170 v에서 1시간 동안 실행한 다음, Coomasie Brilliant Blue-R-250 용액에서 겔을 염색하였다. Gel Doc XR Imaging 시스템(Bio-Rad Laboratories, Inc., USA)을 사용하여 겔을 탈염색하고 이미지화하였다.
SEC- HPLC에 의한 FMEH - IgG4PLA -FH1-5의 순도 분석: SEC-HPLC(크기 배제 크로마토그래피 - 고성능 액체 크로마토그래피)를 사용하여 FMEH-IgG4PLA-FH1-5 단백질의 순도를 측정하였다. LC-20AT HPLC 시스템(Shimadzu Scientific Instruments, Japan)과 TSK 겔 G3000SWXL 컬럼(Tosoh Corporation, Japan)을 실험에 사용하였다. SEC-HPLC 실험은 오븐 온도 35℃, 유속 1mL/min 및 이동상 PBS(인산염-완충 식염수)의 실행 조건에서 수행되었다. TSK 겔 G3000SWXL 컬럼을 LC-20AT HPLC 시스템에 연결하고 PBS로 평형화시켰다. 0.242 mg의 FMEH-IgG4PLA-FH1-5 단백질 용액을 주입하고 15분 동안 214 nm에서의 흡광도를 검출하였다. 데이터는 Lab Solutions 소프트웨어로 분석되었다.
인간 및 시노몰구스 C5에 대한 FMEH - IgG4PLA -FH1-5의 결합 친화도 분석: Bio-Layer Interferometry를 사용하여 FMEH-IgG4PLA 및 FMEH-IgG4PLA-FH1-5의 가용성 인간 및 Cynomolgus C5에 대한 결합 연합 및 해리 속도 상수를 측정하였다. Bio-Layer Interferometry Gator(Probe Life Inc., China)를 사용하였고 모든 실험은 30℃에서 수행하였다. HFC(Anti-HIgG Fc) 프로브를 K 완충액(인산염-완충 식염수, 소 혈청 알부민 함유)에 300초 동안 딥핑하였다. 그런 다음 HFC 프로브를 FMEH-IgG4PLA-FH1-5에 딥핑하여 1 nm의 표면 밀도를 얻었다. K 완충액에 200초 기준선 딥(dip) 후, HFC 프로브를 다양한 농도(40, 20, 10, 5, 2.5, 1.25 및 0.625 nM)에서 정제된 인간 또는 사이노몰구스 C5를 함유하는 용액에 600초 동안, K 완충액에서 600초 해리 기간 동안 딥핑하였다. 결합 동역학에 대한 pH의 영향을 결정하기 위해 pH 7.4 또는 pH 5.8 완충액 조건에서 실험을 수행하였다. 데이터는 1:1 결합 모델을 사용하여 Gator 평가 소프트웨어(Probe Life Inc., 중국)로 분석되었다.
FMEH - IgG4PLA -FH1-5의 분자량 분석: 질량 분광계를 사용하여 FMEH-IgG4PLA-FH1-5의 분자량을 측정하였다. U3000 UPLC 시스템과 Q Exactive Plus 질량분석기(Thermo Fisher Scientific Inc., USA)을 실험에 사용하였다. 탈당화된 FMEH-IgG4PLA-FH1-5를 펩타이드-N-글리코시다제 F를 사용하여 제조하였고 환원된 FMEH-IgG4PLA-FH1-5를 디티오트레이톨을 사용하여 제조하였다. 온전한, 탈당화된, 환원된 FMEH-IgG4PLA-FH1-5를 제조업체가 설명한 대로 각각 LC-MASS로 분리하고 검출하였다. 데이터를 Biopharma Finder 소프트웨어(Thermo Fisher Scientific Inc., USA)로 분석하였다.
PNH 환자 RBC 용해 검정: PNH RBC를 AP 완충액(GVB + 5mM Mg2 + + 20mM EGTA, pH 6.4)에 현탁한 다음, 젤라틴 베로날 완충액(Complement Technology, Texas USA)에서 0.2 M HCl 산성화된 정상 인간 혈청과 함께37℃에서 40분 동안 인큐베이션하였다. NHS를 FMEH-IgG4PLA-FH1-5, 에쿨리주맙 또는 라불리주맙과 함께 4℃에서 1시간 동안 사전 인큐베이션하였다. HCl 처리된(0.2M) PNH RBC와 사전 인큐베이션된 항체 혈청을 혼합하고 튜브에서 xxx분 동안 인큐베이션하였다. 총 반응 부피는 50 ul이다. PBS 중 빙랭 40mM EDTA를 첨가하여 용해 반응을 중단시켰다. 인큐베이션 혼합물을 1500 rpm에서 5분 동안 원심분리하고 상청액을 수집하고 OD405 nm에 대해 측정하였다. EDTA가 첨가된 샘플을 음성 용해 대조군으로 사용하였고, 증류수로 완전히 용해된 PNH RBC의 샘플을 양성 대조군(100% 용해)으로 사용하였다. 공식 (OD405(특정 ab con.)-OD405(40 mM EDTA ))/((OD405(물)-OD405( 40mM EDTA )) *100%를 사용하여 용해의 %를 계산하였다.
C3b 침착 분석: RBC 용해 검정 후 용해되지 않은 RBC를 원심분리에 의해 수집하였다. 세포를 PBS로 세척한 다음, PBS 완충액에 재현탁시켰다. APC 표지 항-C3b 항체(Biolegend, California USA)를 첨가하고 암실에서 30분 동안 얼음 위에서 인큐베이션하였다. C3b+ 염색 세포를 게이팅하고 유동 세포측정기 CytoFLEX(Beckman Coulter, Suzhou, China) 또는 FACSCelesta(BD Biosciences, California USA)를 사용하여 분석하였다. ND는 검출불가능을 의미한다.
여기에 인용된 각각의 모든 특허, 특허 출원 및 간행물의 개시 내용은 그 전체가 참고로 여기에 포함된다.
본 발명이 특정 구현예를 참조하여 개시되었지만, 본 발명의 진정한 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 본 발명의 다른 구현예 및 변형이 당업자에 의해 고안될 수 있음이 명백하다. 첨부된 청구범위는 이러한 모든 구현예 및 등가 변형을 포함하는 것으로 해석되도록 의도된다.
SEQUENCE LISTING
<110> The Trustees of the University of Pennsylvania
Song, Wenchao
Miwa, Takashi
Gullipalli, Damodar
Sato, Sayaka
Tsui, Ping
Zhu, Yingjie
Zhu, Xihua
<120> BI-FUNCTIONAL HUMANIZED ANTI-C5 ANTIBODIES AND FACTOR H FUSION
PROTEINS AND USES THEREOF
<130> 046483-6180-00WO
<150> US 62/837,853
<151> 2019-04-24
<160> 84
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 482
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Humanized 2G1 VH-11801
<400> 1
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cctgggtctt tctcttcctc ctgtcagtaa ctgcaggtgt ccactcccag gttcagctgg 120
tgcagtctgg agctgaggtg aagaagcctg gggcctcagt gaaggtctcc tgcaaggctt 180
ctggatacac aatcacagac tacaatttgg actgggtgcg acaggcccct ggacaagggc 240
ttgagtggat gggagatatt agtcctaact atggttatac tatctacaac cagaaattca 300
aggacagagt caccatgacc acagacacat ccacgagcac agcctacatg gagctgagga 360
gcctgagatc tgacgacacg gccgtgtatt actgtgcgag aagggacatt cgttactccg 420
gtaattccta caaatggtac ttcgatgtct ggggccaagg gacaatggtc accgtctctt 480
ca 482
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Humanized 2G1 VH-11801 (amino acid)
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Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
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100 105 110
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<212> DNA
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cccagtctcc atccttcctg tctgcatctg taggagacag agtcaccatc acttgcagga 180
caagtaagag cataagcaaa tatttagcct ggtatcagca aaaaccaggg aaagccccta 240
agctcctgat ctattctgga tccaccttgc aatctggggt cccatcaagg ttcagcggca 300
gtggatctgg gacagaattc actctcacaa tcagcagcct gcagcctgaa gattttgcaa 360
cttattactg tcaacaacat aatgaatacc cgtacacgtt tggccagggg accaagctgg 420
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<212> PRT
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Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Lys Ser
35 40 45
Ile Ser Lys Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
50 55 60
Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
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Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn
100 105 110
Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR2 Humanized 2G1 VL-1901 (amino acid)
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<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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1 5
<210> 11
<211> 9
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<220>
<223> CDR3 Humanized 2G1 VL-1901 variant (Q->H mutation in CDR3) (amino
acid)
<400> 11
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<211> 428
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Humanized 2G1 VL-1901 variant (Q->H mutation in CDR3)
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ctcagcttct cttcctcctg ctactctggc tcccagatac caccggagac atccagttga 120
cccagtctcc atccttcctg tctgcatctg taggagacag agtcaccatc acttgcagga 180
caagtaagag cataagcaaa tatttagcct ggtatcagca aaaaccaggg aaagccccta 240
agctcctgat ctattctgga tccaccttgc aatctggggt cccatcaagg ttcagcggca 300
gtggatctgg gacagaattc actctcacaa tcagcagcct gcagcctgaa gattttgcaa 360
cttattactg tcatcaacat aatgaatacc cgtacacgtt tggccagggg accaagctgg 420
agatcaaa 428
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<211> 127
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Humanized 2G1 VL-1901 variant (Q->H mutation in CDR3) (amino
acid)
<400> 13
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20 25 30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Lys Ser
35 40 45
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50 55 60
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100 105 110
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<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR1 Humanized 2G1 VL-1901 variant (T->H mutation in CDR1) (amino
acid)
<400> 14
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1 5 10
<210> 15
<211> 428
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<213> Artificial Sequence
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<223> Humanized 2G1 VL-1901 variant (T->H mutation in CDR1)
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atagtaagag cataagcaaa tatttagcct ggtatcagca aaaaccaggg aaagccccta 240
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agatcaaa 428
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Humanized 2G1 VL-1901 variant (T->H mutation in CDR1) (amino
acid)
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Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro
1 5 10 15
Asp Thr Thr Gly Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser
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Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg His Ser Lys Ser
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Ile Ser Lys Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
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100 105 110
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(amino acid)
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<223> Humanized 2G1 VH-11801 variant (I->H mutation in CDR1)
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ca 482
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Humanized 2G1 VH-11801 variant (I->H mutation in CDR1) (amino
acid)
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Met Asp Trp Thr Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly
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Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR1 Humanized 2G1 VH-11801 variant (N->H mutation in CDR1)
(amino acid)
<400> 20
Gly Tyr Thr Ile Thr Asp Tyr His Leu Asp
1 5 10
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<211> 481
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Humanized 2G1 VH-11801 variant (N->H mutation in CDR1)
<400> 21
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c 481
<210> 22
<211> 144
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Humanized 2G1 VH-11801 variant (N->H mutation in CDR1) (amino
acid)
<400> 22
Met Asp Trp Thr Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly
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Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Ile
35 40 45
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Glu Trp Met Gly Asp Ile Ser Pro Asn Tyr Gly Tyr Thr Ile Tyr Asn
65 70 75 80
Gln Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Asp Ile Arg Tyr Ser Gly Asn Ser Tyr Lys
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<210> 23
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR1 Humanized 2G1 VL-1901 variant (Y->H mutation in CDR1) (amino
acid)
<400> 23
Arg Thr Ser Lys Ser Ile Ser Lys His Leu Ala
1 5 10
<210> 24
<211> 428
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Humanized 2G1 VL-1901 variant (Y->H mutation in CDR1)
<400> 24
gtcagagccc tggggaggaa ctgctcagtt aggacccaga gggaaccatg gaagccccag 60
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cccagtctcc atccttcctg tctgcatctg taggagacag agtcaccatc acttgcagga 180
caagtaagag cataagcaaa catttagcct ggtatcagca aaaaccaggg aaagccccta 240
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agatcaaa 428
<210> 25
<211> 127
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Humanized 2G1 VL-1901 variant (Y->H mutation in CDR1) (amino
acid)
<400> 25
Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro
1 5 10 15
Asp Thr Thr Gly Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Lys Ser
35 40 45
Ile Ser Lys His Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
50 55 60
Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser
85 90 95
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn
100 105 110
Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
115 120 125
<210> 26
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR2 Humanized 2G1 VH-11801 variant (Y->H mutation in CDR2)
<400> 26
Asp Ile Ser Pro Asn His Gly Tyr Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 27
<211> 482
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Humanized 2G1 VH-11801 variant (Y->H mutation in CDR2)
<400> 27
cagcatatga tcagtgtcct ctccaaagtc cttgaacata gactctaacc atggactgga 60
cctgggtctt tctcttcctc ctgtcagtaa ctgcaggtgt ccactcccag gttcagctgg 120
tgcagtctgg agctgaggtg aagaagcctg gggcctcagt gaaggtctcc tgcaaggctt 180
ctggatacac aatcacagac tacaatttgg actgggtgcg acaggcccct ggacaagggc 240
ttgagtggat gggagatatt agtcctaacc atggttatac tatctacaac cagaaattca 300
aggacagagt caccatgacc acagacacat ccacgagcac agcctacatg gagctgagga 360
gcctgagatc tgacgacacg gccgtgtatt actgtgcgag aagggacatt cgttactccg 420
gtaattccta caaatggtac ttcgatgtct ggggccaagg gacaatggtc accgtctctt 480
ca 482
<210> 28
<211> 144
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Humanized 2G1 VH-11801 variant (Y->H mutation in CDR2) (amino
acid)
<400> 28
Met Asp Trp Thr Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Ile
35 40 45
Thr Asp Tyr Asn Leu Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Asp Ile Ser Pro Asn His Gly Tyr Thr Ile Tyr Asn
65 70 75 80
Gln Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Asp Ile Arg Tyr Ser Gly Asn Ser Tyr Lys
115 120 125
Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
130 135 140
<210> 29
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR3 Humanized 2G1 VL-1901 variant (E->H mutation in CDR3) (amino
acid)
<400> 29
Gln Gln His Asn His Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 30
<211> 428
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Humanized 2G1 VL-1901 variant (E->H mutation in CDR3)
<400> 30
gtcagagccc tggggaggaa ctgctcagtt aggacccaga gggaaccatg gaagccccag 60
ctcagcttct cttcctcctg ctactctggc tcccagatac caccggagac atccagttga 120
cccagtctcc atccttcctg tctgcatctg taggagacag agtcaccatc acttgcagga 180
caagtaagag cataagcaaa tatttagcct ggtatcagca aaaaccaggg aaagccccta 240
agctcctgat ctattctgga tccaccttgc aatctggggt cccatcaagg ttcagcggca 300
gtggatctgg gacagaattc actctcacaa tcagcagcct gcagcctgaa gattttgcaa 360
cttattactg tcaacaacat aatcattacc cgtacacgtt tggccagggg accaagctgg 420
agatcaaa 428
<210> 31
<211> 127
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Humanized 2G1 VL-1901 variant (E->H mutation in CDR3) (amino
acid)
<400> 31
Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro
1 5 10 15
Asp Thr Thr Gly Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Lys Ser
35 40 45
Ile Ser Lys Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
50 55 60
Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser
85 90 95
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn
100 105 110
His Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
115 120 125
<210> 32
<211> 327
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human IgG4 Constant Heavy chain region (amino acid)
<400> 32
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 33
<211> 327
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human IgG4 Constant Heavy chain region with S228P mutation (amino
acid)
<400> 33
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 34
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR2 Humanized 2G1 VH-11801 variant (T->H mutation in CDR2)
<400> 34
Asp Ile Ser Pro Asn Tyr Gly Tyr His Ile Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 35
<211> 482
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Humanized 2G1 VH-11801 variant (T->H mutation in CDR2)
<400> 35
cagcatatga tcagtgtcct ctccaaagtc cttgaacata gactctaacc atggactgga 60
cctgggtctt tctcttcctc ctgtcagtaa ctgcaggtgt ccactcccag gttcagctgg 120
tgcagtctgg agctgaggtg aagaagcctg gggcctcagt gaaggtctcc tgcaaggctt 180
ctggatacac aatcacagac tacaatttgg actgggtgcg acaggcccct ggacaagggc 240
ttgagtggat gggagatatt agtcctaact atggttatca tatctacaac cagaaattca 300
aggacagagt caccatgacc acagacacat ccacgagcac agcctacatg gagctgagga 360
gcctgagatc tgacgacacg gccgtgtatt actgtgcgag aagggacatt cgttactccg 420
gtaattccta caaatggtac ttcgatgtct ggggccaagg gacaatggtc accgtctctt 480
ca 482
<210> 36
<211> 144
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Humanized 2G1 VH-11801 variant (T->H mutation in CDR2) (amino
acid)
<400> 36
Met Asp Trp Thr Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Ile
35 40 45
Thr Asp Tyr Asn Leu Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Asp Ile Ser Pro Asn Tyr Gly Tyr His Ile Tyr Asn
65 70 75 80
Gln Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Asp Ile Arg Tyr Ser Gly Asn Ser Tyr Lys
115 120 125
Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
130 135 140
<210> 37
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR1 IWW-VH (amino acid)
<400> 37
Gly Tyr Thr Ile Thr Asp Tyr His Ile Asp
1 5 10
<210> 38
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR2 IWW-VH (amino acid)
<400> 38
Asp Ile Ser Trp Asn Tyr Gly Tyr Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 39
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR3 IWW-VH (amino acid)
<400> 39
Arg Asp Ile Arg Tyr Ser Gly Asn Ser Tyr Lys Trp Tyr Phe Asp Trp
1 5 10 15
<210> 40
<211> 482
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IWW-VH
<400> 40
cagcatatga tcagtgtcct ctccaaagtc cttgaacata gactctaacc atggactgga 60
cctgggtctt tctcttcctc ctgtcagtaa ctgcaggtgt ccactcccag gttcagctgg 120
tgcagtctgg agctgaggtg aagaagcctg gggcctcagt gaaggtctcc tgcaaggctt 180
ctggatacac aatcacagac taccatatcg actgggtgcg acaggcccct ggacaagggc 240
ttgagtggat gggagatatt agttggaact atggttatac tatctacaac cagaaattca 300
aggacagagt caccatgacc acagacacat ccacgagcac agcctacatg gagctgagga 360
gcctgagatc tgacgacacg gccgtgtatt actgtgcgag aagggacatt cgttactccg 420
gtaattccta caaatggtac ttcgattggt ggggccaagg gacaatggtc accgtctctt 480
ca 482
<210> 41
<211> 144
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IWW-VH (amino acid)
<400> 41
Met Asp Trp Thr Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Ile
35 40 45
Thr Asp Tyr His Ile Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Asp Ile Ser Trp Asn Tyr Gly Tyr Thr Ile Tyr Asn
65 70 75 80
Gln Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Asp Ile Arg Tyr Ser Gly Asn Ser Tyr Lys
115 120 125
Trp Tyr Phe Asp Trp Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
130 135 140
<210> 42
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR1 IFW-VH (amino acid)
<400> 42
Gly Tyr Thr Ile Thr Asp Tyr His Ile Asp
1 5 10
<210> 43
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR2 IFW-VH (amino acid)
<400> 43
Asp Ile Ser Phe Asn Tyr Gly Tyr Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 44
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR3 IFW-VH (amino acid)
<400> 44
Arg Asp Ile Arg Tyr Ser Gly Asn Ser Tyr Lys Trp Tyr Phe Asp Trp
1 5 10 15
<210> 45
<211> 482
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IFW-VH
<400> 45
cagcatatga tcagtgtcct ctccaaagtc cttgaacata gactctaacc atggactgga 60
cctgggtctt tctcttcctc ctgtcagtaa ctgcaggtgt ccactcccag gttcagctgg 120
tgcagtctgg agctgaggtg aagaagcctg gggcctcagt gaaggtctcc tgcaaggctt 180
ctggatacac aatcacagac taccatatcg actgggtgcg acaggcccct ggacaagggc 240
ttgagtggat gggagatatt agtttcaact atggttatac tatctacaac cagaaattca 300
aggacagagt caccatgacc acagacacat ccacgagcac agcctacatg gagctgagga 360
gcctgagatc tgacgacacg gccgtgtatt actgtgcgag aagggacatt cgttactccg 420
gtaattccta caaatggtac ttcgattggt ggggccaagg gacaatggtc accgtctctt 480
ca 482
<210> 46
<211> 144
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IFW-VH (amino acid)
<400> 46
Met Asp Trp Thr Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Ile
35 40 45
Thr Asp Tyr His Ile Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Asp Ile Ser Phe Asn Tyr Gly Tyr Thr Ile Tyr Asn
65 70 75 80
Gln Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Asp Ile Arg Tyr Ser Gly Asn Ser Tyr Lys
115 120 125
Trp Tyr Phe Asp Trp Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
130 135 140
<210> 47
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR1 FME-VH (amino acid)
<400> 47
Gly Tyr Thr Ile Thr Asp Tyr His Phe Asp
1 5 10
<210> 48
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR2 FME-VH (amino acid)
<400> 48
Asp Ile Ser Met Asn Tyr Gly Tyr Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 49
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR3 FME-VH (amino acid)
<400> 49
Arg Asp Ile Arg Tyr Ser Gly Asn Ser Tyr Lys Trp Tyr Phe Asp Glu
1 5 10 15
<210> 50
<211> 482
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FME-VH
<400> 50
cagcatatga tcagtgtcct ctccaaagtc cttgaacata gactctaacc atggactgga 60
cctgggtctt tctcttcctc ctgtcagtaa ctgcaggtgt ccactcccag gttcagctgg 120
tgcagtctgg agctgaggtg aagaagcctg gggcctcagt gaaggtctcc tgcaaggctt 180
ctggatacac aatcacagac taccatttcg actgggtgcg acaggcccct ggacaagggc 240
ttgagtggat gggagatatt agtatgaact atggttatac tatctacaac cagaaattca 300
aggacagagt caccatgacc acagacacat ccacgagcac agcctacatg gagctgagga 360
gcctgagatc tgacgacacg gccgtgtatt actgtgcgag aagggacatt cgttactccg 420
gtaattccta caaatggtac ttcgatgagt ggggccaagg gacaatggtc accgtctctt 480
ca 482
<210> 51
<211> 144
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FME-VH (amino acid)
<400> 51
Met Asp Trp Thr Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Ile
35 40 45
Thr Asp Tyr His Phe Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Asp Ile Ser Met Asn Tyr Gly Tyr Thr Ile Tyr Asn
65 70 75 80
Gln Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Asp Ile Arg Tyr Ser Gly Asn Ser Tyr Lys
115 120 125
Trp Tyr Phe Asp Glu Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
130 135 140
<210> 52
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR1 FMW-VH (amino acid)
<400> 52
Gly Tyr Thr Ile Thr Asp Tyr His Phe Asp
1 5 10
<210> 53
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR2 FMW-VH (amino acid)
<400> 53
Asp Ile Ser Met Asn Tyr Gly Tyr Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 54
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR3 FMW-VH (amino acid)
<400> 54
Arg Asp Ile Arg Tyr Ser Gly Asn Ser Tyr Lys Trp Tyr Phe Asp Trp
1 5 10 15
<210> 55
<211> 482
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FMW-VH
<400> 55
cagcatatga tcagtgtcct ctccaaagtc cttgaacata gactctaacc atggactgga 60
cctgggtctt tctcttcctc ctgtcagtaa ctgcaggtgt ccactcccag gttcagctgg 120
tgcagtctgg agctgaggtg aagaagcctg gggcctcagt gaaggtctcc tgcaaggctt 180
ctggatacac aatcacagac taccatttcg actgggtgcg acaggcccct ggacaagggc 240
ttgagtggat gggagatatt agtatgaact atggttatac tatctacaac cagaaattca 300
aggacagagt caccatgacc acagacacat ccacgagcac agcctacatg gagctgagga 360
gcctgagatc tgacgacacg gccgtgtatt actgtgcgag aagggacatt cgttactccg 420
gtaattccta caaatggtac ttcgattggt ggggccaagg gacaatggtc accgtctctt 480
ca 482
<210> 56
<211> 144
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FMW-VH (amino acid)
<400> 56
Met Asp Trp Thr Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Ile
35 40 45
Thr Asp Tyr His Phe Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Asp Ile Ser Met Asn Tyr Gly Tyr Thr Ile Tyr Asn
65 70 75 80
Gln Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Asp Ile Arg Tyr Ser Gly Asn Ser Tyr Lys
115 120 125
Trp Tyr Phe Asp Trp Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
130 135 140
<210> 57
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR2 FMEH-VH (amino acid)
<400> 57
Asp Ile Ser Met Asn Tyr Gly Tyr His Ile Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 58
<211> 482
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FMEH-VH
<400> 58
cagcatatga tcagtgtcct ctccaaagtc cttgaacata gactctaacc atggactgga 60
cctgggtctt tctcttcctc ctgtcagtaa ctgcaggtgt ccactcccag gttcagctgg 120
tgcagtctgg agctgaggtg aagaagcctg gggcctcagt gaaggtctcc tgcaaggctt 180
ctggatacac aatcacagac taccatttcg actgggtgcg acaggcccct ggacaagggc 240
ttgagtggat gggagatatt agtatgaact atggttatca tatctacaac cagaaattca 300
aggacagagt caccatgacc acagacacat ccacgagcac agcctacatg gagctgagga 360
gcctgagatc tgacgacacg gccgtgtatt actgtgcgag aagggacatt cgttactccg 420
gtaattccta caaatggtac ttcgatgagt ggggccaagg gacaatggtc accgtctctt 480
ca 482
<210> 59
<211> 144
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FMEH-VH (amino acid)
<400> 59
Met Asp Trp Thr Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Ile
35 40 45
Thr Asp Tyr His Phe Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Asp Ile Ser Met Asn Tyr Gly Tyr His Ile Tyr Asn
65 70 75 80
Gln Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Asp Ile Arg Tyr Ser Gly Asn Ser Tyr Lys
115 120 125
Trp Tyr Phe Asp Glu Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
130 135 140
<210> 60
<211> 984
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human IgG4 Fc PLA domain mutation
<400> 60
gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag 60
agcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacgaagacc 240
tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagtcc 300
aaatatggtc ccccatgccc accatgccca gcacctgagt tcctgggggg accatcagtc 360
ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg 420
tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat 480
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac 540
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 600
tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 660
gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag 720
aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 780
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 840
gacggctcct tcttcctcta cagcaggctc accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg 900
aatgtcttct catgctccgt gctgcatgag gctctgcacg cccactacac acagaagagc 960
ctctccctgt ctctgggtaa atga 984
<210> 61
<211> 327
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human IgG4 Fc PLA domain mutation (amino acid)
<400> 61
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Ala His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 62
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR2 IWWH-VH (amino acid)
<400> 62
Asp Ile Ser Trp Asn Tyr Gly Tyr His Ile Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 63
<211> 482
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IWWH-VH
<400> 63
cagcatatga tcagtgtcct ctccaaagtc cttgaacata gactctaacc atggactgga 60
cctgggtctt tctcttcctc ctgtcagtaa ctgcaggtgt ccactcccag gttcagctgg 120
tgcagtctgg agctgaggtg aagaagcctg gggcctcagt gaaggtctcc tgcaaggctt 180
ctggatacac aatcacagac taccatatcg actgggtgcg acaggcccct ggacaagggc 240
ttgagtggat gggagatatt agttggaact atggttatca tatctacaac cagaaattca 300
aggacagagt caccatgacc acagacacat ccacgagcac agcctacatg gagctgagga 360
gcctgagatc tgacgacacg gccgtgtatt actgtgcgag aagggacatt cgttactccg 420
gtaattccta caaatggtac ttcgattggt ggggccaagg gacaatggtc accgtctctt 480
ca 482
<210> 64
<211> 144
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IWWH-VH (amino acid)
<400> 64
Met Asp Trp Thr Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Ile
35 40 45
Thr Asp Tyr His Ile Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Asp Ile Ser Trp Asn Tyr Gly Tyr His Ile Tyr Asn
65 70 75 80
Gln Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Asp Ile Arg Tyr Ser Gly Asn Ser Tyr Lys
115 120 125
Trp Tyr Phe Asp Trp Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
130 135 140
<210> 65
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR2 IFWH-VH (amino acid)
<400> 65
Asp Ile Ser Phe Asn Tyr Gly Tyr His Ile Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 66
<211> 482
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IFWH-VH
<400> 66
cagcatatga tcagtgtcct ctccaaagtc cttgaacata gactctaacc atggactgga 60
cctgggtctt tctcttcctc ctgtcagtaa ctgcaggtgt ccactcccag gttcagctgg 120
tgcagtctgg agctgaggtg aagaagcctg gggcctcagt gaaggtctcc tgcaaggctt 180
ctggatacac aatcacagac taccatatcg actgggtgcg acaggcccct ggacaagggc 240
ttgagtggat gggagatatt agtttcaact atggttatca tatctacaac cagaaattca 300
aggacagagt caccatgacc acagacacat ccacgagcac agcctacatg gagctgagga 360
gcctgagatc tgacgacacg gccgtgtatt actgtgcgag aagggacatt cgttactccg 420
gtaattccta caaatggtac ttcgattggt ggggccaagg gacaatggtc accgtctctt 480
ca 482
<210> 67
<211> 144
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IFWH-VH (amino acid)
<400> 67
Met Asp Trp Thr Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Ile
35 40 45
Thr Asp Tyr His Ile Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Asp Ile Ser Phe Asn Tyr Gly Tyr His Ile Tyr Asn
65 70 75 80
Gln Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Asp Ile Arg Tyr Ser Gly Asn Ser Tyr Lys
115 120 125
Trp Tyr Phe Asp Trp Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
130 135 140
<210> 68
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR2 FMWH-VH (amino acid)
<400> 68
Asp Ile Ser Met Asn Tyr Gly Tyr His Ile Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 69
<211> 482
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FMWH-VH
<400> 69
cagcatatga tcagtgtcct ctccaaagtc cttgaacata gactctaacc atggactgga 60
cctgggtctt tctcttcctc ctgtcagtaa ctgcaggtgt ccactcccag gttcagctgg 120
tgcagtctgg agctgaggtg aagaagcctg gggcctcagt gaaggtctcc tgcaaggctt 180
ctggatacac aatcacagac taccatttcg actgggtgcg acaggcccct ggacaagggc 240
ttgagtggat gggagatatt agtatgaact atggttatca tatctacaac cagaaattca 300
aggacagagt caccatgacc acagacacat ccacgagcac agcctacatg gagctgagga 360
gcctgagatc tgacgacacg gccgtgtatt actgtgcgag aagggacatt cgttactccg 420
gtaattccta caaatggtac ttcgattggt ggggccaagg gacaatggtc accgtctctt 480
ca 482
<210> 70
<211> 144
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FMWH-VH (amino acid)
<400> 70
Met Asp Trp Thr Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Ile
35 40 45
Thr Asp Tyr His Phe Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Asp Ile Ser Met Asn Tyr Gly Tyr His Ile Tyr Asn
65 70 75 80
Gln Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Asp Ile Arg Tyr Ser Gly Asn Ser Tyr Lys
115 120 125
Trp Tyr Phe Asp Trp Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
130 135 140
<210> 71
<211> 2384
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VH sequence of FMEH-IgG4PLA-FH1-5
<400> 71
cagcatatga tcagtgtcct ctccaaagtc cttgaacata gactctaacc atggactgga 60
cctgggtctt tctcttcctc ctgtcagtaa ctgcaggtgt ccactcccag gttcagctgg 120
tgcagtctgg agctgaggtg aagaagcctg gggcctcagt gaaggtctcc tgcaaggctt 180
ctggatacac aatcacagac taccatttcg actgggtgcg acaggcccct ggacaagggc 240
ttgagtggat gggagatatt agtatgaact atggttatca tatctacaac cagaaattca 300
aggacagagt caccatgacc acagacacat ccacgagcac agcctacatg gagctgagga 360
gcctgagatc tgacgacacg gccgtgtatt actgtgcgag aagggacatt cgttactccg 420
gtaattccta caaatggtac ttcgatgagt ggggccaagg gacaatggtc accgtctctt 480
cagctagcac caagggccca tcggtcttcc ccctggcgcc ctgctccagg agcacctccg 540
agagcacagc cgccctgggc tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg gtgacggtgt 600
cgtggaactc aggcgccctg accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc ctacagtcct 660
caggactcta ctccctcagc agcgtggtga ccgtgccctc cagcagcttg ggcacgaaga 720
cctacacctg caacgtagat cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag agagttgagt 780
ccaaatatgg tcccccatgc ccaccatgcc cagcacctga gttcctgggg ggaccatcag 840
tcttcctgtt ccccccaaaa cccaaggaca ctctcatgat ctcccggacc cctgaggtca 900
cgtgcgtggt ggtggacgtg agccaggaag accccgaggt ccagttcaac tggtacgtgg 960
atggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagttc aacagcacgt 1020
accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaacggc aaggagtaca 1080
agtgcaaggt ctccaacaaa ggcctcccgt cctccatcga gaaaaccatc tccaaagcca 1140
aagggcagcc ccgagagcca caggtgtaca ccctgccccc atcccaggag gagatgacca 1200
agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta ccccagcgac atcgccgtgg 1260
agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact 1320
ccgacggctc cttcttcctc tacagcaggc tcaccgtgga caagagcagg tggcaggagg 1380
ggaatgtctt ctcatgctcc gtgctgcatg aggctctgca cgcccactac acacagaaga 1440
gcctctccct gtctctgggt aaagaggatt gtaatgaact gcctccaaga aggaacacag 1500
aaattttgac cgggtcctgg tccgatcaaa cctaccctga aggaactcaa gctatataca 1560
agtgcagacc tggttataga tcactgggca acattatcat ggtatgtcgc aaaggagaat 1620
gggtggctct gaatcccctc agaaaatgcc agaaacggcc atgtggacac cccggcgata 1680
ccccattcgg gacatttacc ttgactggag gcaatgtatt cgagtatggc gtgaaagctg 1740
tctatacctg taacgaaggt taccaattgt tgggagaaat aaattacaga gaatgtgata 1800
ccgatggatg gaccaacgat attcccatat gcgaggttgt taagtgcttg cctgtcactg 1860
caccagaaaa cgggaaaatc gtatctagcg caatggagcc agaccgcgaa taccatttcg 1920
ggcaggcagt gaggtttgtt tgcaattccg gttataagat agaaggggat gaggagatgc 1980
actgtagcga cgatggtttt tggtccaagg aaaagcccaa gtgcgtcgaa ataagttgca 2040
agtcacctga cgtcataaac gggagcccca tatcccaaaa gataatttac aaggagaacg 2100
aacgatttca atataagtgt aatatggggt atgaatactc cgagagaggt gatgccgtct 2160
gtaccgaaag tggatggcga ccactcccct catgcgaaga gaagtcctgt gataatccat 2220
acatccctaa tggtgattat tccccccttc gaataaagca tcggacagga gacgagatca 2280
catatcagtg tcgcaacgga ttctatccag ccaccagagg caacactgca aagtgtacat 2340
ctacaggatg gatacctgcc ccacgatgta ccttgaagcc ctga 2384
<210> 72
<211> 777
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VH sequence of FMEH-IgG4PLA-FH1-5 (amino acid)
<400> 72
Met Asp Trp Thr Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Ile
35 40 45
Thr Asp Tyr His Phe Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Asp Ile Ser Met Asn Tyr Gly Tyr His Ile Tyr Asn
65 70 75 80
Gln Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Asp Ile Arg Tyr Ser Gly Asn Ser Tyr Lys
115 120 125
Trp Tyr Phe Asp Glu Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
130 135 140
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
145 150 155 160
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
165 170 175
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
180 185 190
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
195 200 205
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
210 215 220
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
225 230 235 240
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
245 250 255
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
260 265 270
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
275 280 285
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
290 295 300
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
305 310 315 320
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
325 330 335
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
340 345 350
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
355 360 365
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
370 375 380
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
385 390 395 400
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
405 410 415
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
420 425 430
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
435 440 445
Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Ala His Tyr Thr Gln Lys Ser
450 455 460
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Glu Asp Cys Asn Glu Leu Pro Pro Arg
465 470 475 480
Arg Asn Thr Glu Ile Leu Thr Gly Ser Trp Ser Asp Gln Thr Tyr Pro
485 490 495
Glu Gly Thr Gln Ala Ile Tyr Lys Cys Arg Pro Gly Tyr Arg Ser Leu
500 505 510
Gly Asn Ile Ile Met Val Cys Arg Lys Gly Glu Trp Val Ala Leu Asn
515 520 525
Pro Leu Arg Lys Cys Gln Lys Arg Pro Cys Gly His Pro Gly Asp Thr
530 535 540
Pro Phe Gly Thr Phe Thr Leu Thr Gly Gly Asn Val Phe Glu Tyr Gly
545 550 555 560
Val Lys Ala Val Tyr Thr Cys Asn Glu Gly Tyr Gln Leu Leu Gly Glu
565 570 575
Ile Asn Tyr Arg Glu Cys Asp Thr Asp Gly Trp Thr Asn Asp Ile Pro
580 585 590
Ile Cys Glu Val Val Lys Cys Leu Pro Val Thr Ala Pro Glu Asn Gly
595 600 605
Lys Ile Val Ser Ser Ala Met Glu Pro Asp Arg Glu Tyr His Phe Gly
610 615 620
Gln Ala Val Arg Phe Val Cys Asn Ser Gly Tyr Lys Ile Glu Gly Asp
625 630 635 640
Glu Glu Met His Cys Ser Asp Asp Gly Phe Trp Ser Lys Glu Lys Pro
645 650 655
Lys Cys Val Glu Ile Ser Cys Lys Ser Pro Asp Val Ile Asn Gly Ser
660 665 670
Pro Ile Ser Gln Lys Ile Ile Tyr Lys Glu Asn Glu Arg Phe Gln Tyr
675 680 685
Lys Cys Asn Met Gly Tyr Glu Tyr Ser Glu Arg Gly Asp Ala Val Cys
690 695 700
Thr Glu Ser Gly Trp Arg Pro Leu Pro Ser Cys Glu Glu Lys Ser Cys
705 710 715 720
Asp Asn Pro Tyr Ile Pro Asn Gly Asp Tyr Ser Pro Leu Arg Ile Lys
725 730 735
His Arg Thr Gly Asp Glu Ile Thr Tyr Gln Cys Arg Asn Gly Phe Tyr
740 745 750
Pro Ala Thr Arg Gly Asn Thr Ala Lys Cys Thr Ser Thr Gly Trp Ile
755 760 765
Pro Ala Pro Arg Cys Thr Leu Lys Pro
770 775
<210> 73
<211> 752
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VL sequence of FMEH-IgG4-FH1-5
<400> 73
gtcagagccc tggggaggaa ctgctcagtt aggacccaga gggaaccatg gaagccccag 60
ctcagcttct cttcctcctg ctactctggc tcccagatac caccggagac atccagttga 120
cccagtctcc atccttcctg tctgcatctg taggagacag agtcaccatc acttgcagga 180
caagtaagag cataagcaaa catttagcct ggtatcagca aaaaccaggg aaagccccta 240
agctcctgat ctattctgga tccaccttgc aatctggggt cccatcaagg ttcagcggca 300
gtggatctgg gacagaattc actctcacaa tcagcagcct gcagcctgaa gattttgcaa 360
cttattactg tcaacaacat aatgaatacc cgtacacgtt tggccagggg accaagctgg 420
agatcaaacg tacggtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct gatgagcagt 480
tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc agagaggcca 540
aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag agtgtcacag 600
agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg agcaaagcag 660
actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg agctcgcccg 720
tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtt ag 752
<210> 74
<211> 234
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VL sequence of FMEH-IgG4-FH1-5 (amino acid)
<400> 74
Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro
1 5 10 15
Asp Thr Thr Gly Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Lys Ser
35 40 45
Ile Ser Lys His Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
50 55 60
Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser
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Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Asp Ile Arg Tyr Ser Gly Asn Ser Tyr Lys
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Trp Tyr Phe Asp Trp Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
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Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
145 150 155 160
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
165 170 175
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
180 185 190
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
195 200 205
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
210 215 220
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245 250 255
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
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450 455 460
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485 490 495
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500 505 510
Gly Asn Ile Ile Met Val Cys Arg Lys Gly Glu Trp Val Ala Leu Asn
515 520 525
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530 535 540
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545 550 555 560
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580 585 590
Ile Cys Glu Val Val Lys Cys Leu Pro Val Thr Ala Pro Glu Asn Gly
595 600 605
Lys Ile Val Ser Ser Ala Met Glu Pro Asp Arg Glu Tyr His Phe Gly
610 615 620
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660 665 670
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<211> 1231
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 81
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<400> 82
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450 455 460
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<211> 449
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino Acid sequence of P08603-2; Human Complement Factor H
Isoform 2, precursor
<400> 83
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Ile Ile Tyr Lys Glu Asn Glu Arg Phe Gln Tyr Lys Cys Asn Met Gly
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275 280 285
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290 295 300
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Leu
<210> 84
<211> 431
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino Acid sequence of P08603-2; Human Complement Factor H
Isoform 2
<400> 84
Glu Asp Cys Asn Glu Leu Pro Pro Arg Arg Asn Thr Glu Ile Leu Thr
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195 200 205
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210 215 220
Tyr Ser Glu Arg Gly Asp Ala Val Cys Thr Glu Ser Gly Trp Arg Pro
225 230 235 240
Leu Pro Ser Cys Glu Glu Lys Ser Cys Asp Asn Pro Tyr Ile Pro Asn
245 250 255
Gly Asp Tyr Ser Pro Leu Arg Ile Lys His Arg Thr Gly Asp Glu Ile
260 265 270
Thr Tyr Gln Cys Arg Asn Gly Phe Tyr Pro Ala Thr Arg Gly Asn Thr
275 280 285
Ala Lys Cys Thr Ser Thr Gly Trp Ile Pro Ala Pro Arg Cys Thr Leu
290 295 300
Lys Pro Cys Asp Tyr Pro Asp Ile Lys His Gly Gly Leu Tyr His Glu
305 310 315 320
Asn Met Arg Arg Pro Tyr Phe Pro Val Ala Val Gly Lys Tyr Tyr Ser
325 330 335
Tyr Tyr Cys Asp Glu His Phe Glu Thr Pro Ser Gly Ser Tyr Trp Asp
340 345 350
His Ile His Cys Thr Gln Asp Gly Trp Ser Pro Ala Val Pro Cys Leu
355 360 365
Arg Lys Cys Tyr Phe Pro Tyr Leu Glu Asn Gly Tyr Asn Gln Asn Tyr
370 375 380
Gly Arg Lys Phe Val Gln Gly Lys Ser Ile Asp Val Ala Cys His Pro
385 390 395 400
Gly Tyr Ala Leu Pro Lys Ala Gln Thr Thr Val Thr Cys Met Glu Asn
405 410 415
Gly Trp Ser Pro Thr Pro Arg Cys Ile Arg Val Ser Phe Thr Leu
420 425 430
Claims (84)
- 인간 C5에 특이적으로 결합하는 항체 및 융합 단백질 파트너를 포함하는 융합 단백질.
- 청구항 1에 있어서, 항체의 결합은 pH 의존적이며, 항체가 산성 pH에서보다 중성 pH에서 C5에 더 강하게 결합하는, 융합 단백질.
- 청구항 1 또는 2에 있어서, 항체는 이기능성 항체 융합 단백질인, 융합 단백질.
- 청구항 3에 있어서, 항체 융합 단백질은 C3 활성화를 억제하는, 융합 단백질.
- 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 융합 단백질은 보체 조절 단백질을 포함하는, 융합 단백질.
- 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 융합 단백질 파트너는 보체 수용체 1 (CR1) 또는 그의 단편, 멤브레인 보조인자 단백질 (MCP) 또는 그의 인자, C4b-결합 단백질 (C4BP) 또는 그의 단편, 붕괴 촉진 인자 (DAF) 또는 그의 단편, 아포지질단백질 E (ApoE) 또는 그의 단편, 인자 H (FH) 단백질 또는 그의 단편, 인간 IgG4 또는 그의 단편, 링커, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나를 포함하는, 융합 단백질.
- 청구항 6에 있어서, FH의 단편은 FH 단백질의 짧은 공통 반복 (SCR) 도메인 1-5을 포함하는, 융합 단백질.
- 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 CDR: VH-CDR1: 서열번호:3; VH-CDR2: 서열번호:4; VH-CDR3: 서열번호:5; VL-CDR1: 서열번호:8; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:11, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함하는, 융합 단백질.
- 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 서열번호:2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 또는 그의 변이체를 포함하는, 융합 단백질.
- 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 서열번호:13의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 그의 변이체를 포함하는, 융합 단백질.
- 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 서열번호:2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:13의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함하는, 융합 단백질.
- 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 CDR: VH-CDR1: 서열번호:3; VH-CDR2: 서열번호:4; VH-CDR3: 서열번호:5; VL-CDR1: 서열번호:14; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함하는, 융합 단백질.
- 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 서열번호:2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 또는 그의 변이체를 포함하는, 융합 단백질.
- 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 서열번호:16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 그의 변이체를 포함하는, 융합 단백질.
- 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 서열번호:2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함하는, 융합 단백질.
- 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 CDR: VH-CDR1: 서열번호:17; VH-CDR2: 서열번호:4; VH-CDR3: 서열번호:5; VL-CDR1: 서열번호:8; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함하는, 융합 단백질.
- 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 서열번호:19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 또는 그의 변이체를 포함하는, 융합 단백질.
- 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 서열번호:7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 그의 변이체를 포함하는, 융합 단백질.
- 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 서열번호:19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함하는, 융합 단백질.
- 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 CDR: VH-CDR1: 서열번호:20; VH-CDR2: 서열번호:4; VH-CDR3: 서열번호:5; VL-CDR1: 서열번호:23; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함하는, 융합 단백질.
- 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 서열번호:22의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 또는 그의 변이체를 포함하는, 융합 단백질.
- 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 서열번호:25의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 그의 변이체를 포함하는, 융합 단백질.
- 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 서열번호:22의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:25의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함하는, 융합 단백질.
- 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 CDR: VH-CDR1: 서열번호:3; VH-CDR2: 서열번호:26; VH-CDR3: 서열번호:5; VL-CDR1: 서열번호:8; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:29, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함하는, 융합 단백질.
- 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 서열번호:28의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 또는 그의 변이체를 포함하는, 융합 단백질.
- 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 서열번호:31의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 그의 변이체를 포함하는, 융합 단백질.
- 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 서열번호:28의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:31의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함하는, 융합 단백질.
- 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 CDR: VH-CDR1: 서열번호:3; VH-CDR2: 서열번호:34; VH-CDR3: 서열번호:5; VL-CDR1: 서열번호:8; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함하는, 융합 단백질.
- 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 서열번호:36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 또는 그의 변이체를 포함하는, 융합 단백질.
- 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 서열번호:36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함하는, 융합 단백질.
- 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 CDR: VH-CDR1: 서열번호:37; VH-CDR2: 서열번호:38; VH-CDR3: 서열번호:39; VL-CDR1: 서열번호:23; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함하는, 융합 단백질.
- 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 서열번호:41의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 또는 그의 변이체를 포함하는, 융합 단백질.
- 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 서열번호:41의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:25의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함하는, 융합 단백질.
- 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 CDR: VH-CDR1: 서열번호:42; VH-CDR2: 서열번호:43; VH-CDR3: 서열번호:44; VL-CDR1: 서열번호:23; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함하는, 융합 단백질.
- 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 서열번호:46의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 또는 그의 변이체를 포함하는, 융합 단백질.
- 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 서열번호:46의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:25의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함하는, 융합 단백질.
- 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 CDR: VH-CDR1: 서열번호:47; VH-CDR2: 서열번호:48; VH-CDR3: 서열번호:49; VL-CDR1: 서열번호:23; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함하는, 융합 단백질.
- 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 서열번호:51의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 또는 그의 변이체를 포함하는, 융합 단백질.
- 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 서열번호:51의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:25의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함하는, 융합 단백질.
- 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 CDR: VH-CDR1: 서열번호:52; VH-CDR2: 서열번호:53; VH-CDR3: 서열번호:54; VL-CDR1: 서열번호:23; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함하는, 융합 단백질.
- 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 서열번호:56의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 또는 그의 변이체를 포함하는, 융합 단백질.
- 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 서열번호:56의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:25의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함하는, 융합 단백질.
- 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 CDR: VH-CDR1: 서열번호:47; VH-CDR2: 서열번호:57; VH-CDR3: 서열번호:49; VL-CDR1: 서열번호:23; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함하는, 융합 단백질.
- 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 서열번호:59의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 또는 그의 변이체를 포함하는, 융합 단백질.
- 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 서열번호:59의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:25의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함하는, 융합 단백질.
- 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 서열번호:72의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 또는 그의 변이체를 포함하는, 융합 단백질.
- 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 서열번호:74의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 그의 변이체를 포함하는, 융합 단백질.
- 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 서열번호:72의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:74의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함하는, 융합 단백질.
- 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 CDR: VH-CDR1: 서열번호:37; VH-CDR2: 서열번호:62; VH-CDR3: 서열번호:39; VL-CDR1: 서열번호:23; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함하는, 융합 단백질.
- 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 서열번호:76의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 또는 그의 변이체를 포함하는, 융합 단백질.
- 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 서열번호:76의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:74의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함하는, 융합 단백질.
- 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 CDR: VH-CDR1: 서열번호:42; VH-CDR2: 서열번호:65; VH-CDR3: 서열번호:44; VL-CDR1: 서열번호:23; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함하는, 융합 단백질.
- 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 서열번호:78의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 또는 그의 변이체를 포함하는, 융합 단백질.
- 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 서열번호:78의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:74의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함하는, 융합 단백질.
- 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 CDR: VH-CDR1: 서열번호:52; VH-CDR2: 서열번호:68; VH-CDR3: 서열번호:54; VL-CDR1: 서열번호:23; VL-CDR2: 서열번호:9; 및 VL-CDR3: 서열번호:10, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함하는, 융합 단백질.
- 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 서열번호:80의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 또는 그의 변이체를 포함하는, 융합 단백질.
- 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 서열번호:80의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호:74의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 그의 변이체 또는 변이체들을 포함하는, 융합 단백질.
- 청구항 8, 12, 16, 20, 24, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 49, 52, 또는 55에 있어서, 항체는 서열번호:4에 대한 VH CDR2 내의 프롤린 4 (P4)에서의 치환을 포함하는, 융합 단백질.
- 청구항 58에 있어서, 프롤린 4 (P4)에서의 치환은 P4→F4 (P4F), P4→L4 (P4L), P4→M4 (P4M), P4→W4 (P4W), 및 P4→I4 (P4I)로 이루어진 군으로부터 선택된 1개의 치환인, 융합 단백질.
- 청구항 59에 있어서, 항체는 서열번호:4에 대한 VH CDR2 내의 프롤린 4 (P4)에서의 치환, 및 서열번호:4에 대한 VH CDR2 내의 트레오닌 9에서의 치환을 포함하는, 융합 단백질.
- 청구항 60에 있어서, 프롤린 4 (P4)에서의 치환은 P4→F4 (P4F), P4→L4 (P4L), P4→M4 (P4M), P4→W4 (P4W), 및 P4→I4 (P4I)로 이루어진 군으로부터 선택된 1개의 치환이고; 그리고 트레오닌 9 (T9)에서의 치환은 T9→H9 (T9H), T9→F9 (T9F), T9→L9 (T9L), T9→M9 (T9M), T9→W9 (T9W), 및 T9→I9 (T9I)로 이루어진 군으로부터 선택된 1개의 치환인, 융합 단백질.
- 청구항 8, 12, 16, 20, 24, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 49, 52, 또는 55에 있어서, 항체는 서열번호:5에 대한 VH CDR3 내의 발린 16 (V16)에서의 치환을 포함하는, 융합 단백질.
- 청구항 62에 있어서, 발린 16 (V16)에서의 치환은 V16→F16 (V16F), V16→E16 (V16E) 및 V16→W16 (V16W)로 이루어진 군으로부터 선택된 1개의 치환인, 융합 단백질.
- 청구항 8, 12, 16, 20, 24, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 49, 52, 또는 55에 있어서, 항체는 서열번호:20에 대한 VH CDR1 내의 류신 9 (L9)에서의 치환을 포함하는, 융합 단백질.
- 청구항 64에 있어서, 류신 9 (L9)에서의 치환은 L9→W9 (L9W), L9→I9 (L9I), L9→V9 (L9V), L9→Y9 (L9Y), 및 L9→F9 (L9F)로 이루어진 군으로부터 선택된 1개의 치환인, 융합 단백질.
- 청구항 8, 12, 16, 20, 24, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 49, 52, 또는 55에 있어서, 항체는 서열번호:4에 대한 VH CDR2 내의 프롤린 4 (P4), 서열번호:4에 대한 VH CDR2 내의 트레오닌 9 (T9), 서열번호:5에 대한 VH CDR3 내의 발린 16 (V16), 및 서열번호:20에 대한 VH CDR1 내의 류신 9 (L9)로 이루어진 군으로부터 선택된 2개 이상의 치환 중 치환을 포함하는, 융합 단백질.
- 청구항 66에 있어서, 항체는 L9I/P4M, L9I/P4W, L9I/P4F, L9F/P4M, L9F/P4W, L9F/P4F, L9I/P4M/V16W, L9I/P4W/V16W, L9I/P4F/V16W, L9F/P4M/V16W, L9F/P4W/V16W, L9F/P4F/V16W, L9I/P4M/V16E, L9I/P4W/V16E, L9I/P4F/V16E, L9F/P4M/V16E, L9F/P4W/V16E, L9F/P4F/V16E, L9I/P4M/T9H/V16W, L9I/P4W/T9H/V16W, L9I/P4F/T9H/V16W, L9F/P4M/T9H/V16W, L9F/P4W/T9H/V16W, L9F/P4F/T9H/V16W, L9I/P4M/T9H/V16E, L9I/P4W/T9H/V16E, L9I/P4F/T9H/V16E, L9F/P4M/T9H/V16E, L9F/P4W/T9H/V16E, 및 L9F/P4F/T9H/V16E로 이루어진 군으로부터 선택된 2개 이상의 치환을 포함하는, 융합 단백질.
- 개체에서 보체 경로 매개 질환 또는 장애를 치료하는 방법으로서, 청구항 1 내지 67 중 어느 한 항의 융합 단백질을 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
- 청구항 68에 있어서, 질환 또는 장애는 적어도 하기로 이루어진 군으로서 선택되는, 방법: 황반 변성 (MD), 연령 관련 황반 변성 (AMD), 허혈 재관류 손상, 관절염, 류마티스성 관절염, 루푸스, 궤양성 대장염, 뇌졸중, 수술 후 전신 염증 증후군, 천식, 알러지성 천식, 만성적 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 발작성 야행성 혈색소뇨증 (PNH) 증후군, 중증 근무력증, 시신경척수염, (NMO), 다발성 경화증, 지연된 이식 기능, 항체 매개 거부, 비전형 용혈성 요독 (aHUS) 증후군, 망막 중심 정맥 폐쇄 (CRVO), 망막 중심 동맥 폐색 (CRAO), 수포성 표피박리증, 패혈증, 장기 이식, 염증 (심폐 바이패스 수술 및 신장 투석과 연관된 염증을 포함하지만 이에 국한되지 않음), C3 사구체병증, 막성 신병증, IgA 신병증, 사구체신염 (항-중성구 세포질 항체 (ANCA) 매개 사구체신염, 루푸스 신장염, 및 그의 조합을 포함하지만 이에 국한되지 않음), ANCA 매개 혈관염, 시가 독소 유도된 HUS, 및 항인지질 항체-유도된 임신 손실, 또는 그의 임의의 조합.
- 개체의 보체계의 활성을 감소시키는 방법으로서, 장관 투여, 비경구 투여, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 투여 경로를 통해 개체에게 항체를 투여하는 것을 포함하고, 그리고 상기 항체는 청구항 1 내지 67 중 어느 한 항의 융합 단백질인, 방법.
- 청구항 70에 있어서, 항체는 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, scFv, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 단편인, 방법.
- 청구항 1 내지 67 중 적어도 한 항의 융합 단백질을 포함하는 세포.
- 청구항 72에 있어서, 세포는 청구항 1 내지 67 중 적어도 한 항의 융합 단백질을 생성하는, 세포.
- 청구항 73에 있어서, 세포는 하이브리도마인, 세포.
- 인간 C5를 발현하는 유전적 변형 비-인간 동물.
- 청구항 75에 있어서, 비-인간 동물은 설치류인, 유전적 변형 비-인간 동물.
- 청구항 76에 있어서, 비-인간 동물은 마우스인, 유전적 변형 비-인간 동물.
- 청구항 76에 있어서, 비-인간 동물은 NOD/SCID 마우스인, 유전적 변형 비-인간 동물.
- 청구항 76에 있어서, 비-인간 동물은 FcRn/SCID 마우스인, 유전적 변형 비-인간 동물.
- 항-C5 항체 모이어티 및 FH 또는 그의 기능적 단편을 포함하는 융합 단백질.
- 청구항 80에 있어서, 항-C5 모이어티는 적어도 하나의 히스티딘 치환을 포함하는, 단백질.
- 청구항 80에 있어서, 항-C5 모이어티는 IgG4 사슬을 포함하는, 단백질.
- 청구항 82에 있어서, IgG4 사슬은 PLA 돌연변이를 포함하는, 단백질.
- 청구항 80에 있어서, FH 또는 그의 기능적 단편은 FH 단백질의 도메인 1-5를 포함하는, 단백질.
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