CN117624347A - 抗人补体c5抗体以及其融合蛋白 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种特异性结合补体C5的抗体,以及其融合蛋白。本发明也涉及编码所述抗体或融合蛋白的多核苷酸、表达载体和宿主细胞,及其药物组合物,和治疗C5蛋白相关疾病的方法和用途。
Description
本发明涉及一种特异性结合补体C5的抗体,以及其融合蛋白。本发明也涉及编码所述抗体或融合蛋白的多核苷酸、表达载体和宿主细胞,及其药物组合物,和治疗C5蛋白相关疾病的方法和用途。
背景技术
补体系统由30余种可溶性蛋白分子组成,是天然免疫系统的一部分,其组成成分包括补体固有成分、多种调节因子和补体受体等30多种分子。补体系统可通过3条既相对独立又相互联系的途径被激活,从而发挥调理吞噬、裂解细胞、介导炎症、免疫调节和清除免疫复合物等多种生物学效应,包括增强吞噬作用、增强吞噬细胞的趋化性、增加血管的通透性、中和病毒、细胞溶解作用、免疫反应的调节作用等。虽然补体活化为抵抗潜在病原体提供了有价值的第一线防御力,但促进保护性炎症应答反应的补体激活也可能表现为对宿主的潜在威胁。补体激活和其在靶结构上的沉积也可以间接地引起细胞或组织破坏。在补体途径中的各个点产生介导组织损害的补体激活产物。宿主组织上不适当的补体激活在许多自身免疫病和炎性疾病的病理学中起重要作用。
补体蛋白质包括表示为C1至C9的蛋白质,并且这些蛋白质通过三种不同途径(经典途径、凝集素途径、替代途径/旁路途径)被连续激活,以引起免疫反应。补体C5是补体的第五种成分,炎症和细胞杀伤过程中起重要作用。这种蛋白质由通过二硫键连接的α和β多肽链组成。活化肽C5a是一种过敏毒素,经由C5aR(CD88)和C5L2(GPR77)诱导各种细胞的炎性反应,具有强效的致痉挛和趋化活性,通过用C5转化酶裂解从α多肽中衍生而来。C5b大分子裂解产物可以与C6补体成分形成复合物,而这种复合物是形成膜攻击复合物(MAC)的基础,其中包括额外的补体成分。如果不能适当控制补体系统或该补体系统被过度激活,则补体系统可能会对宿主细胞产生强烈的细胞毒性。
众多研究显示补体激活与多种疾病有关,例如与人补体溶血活性相关的多种疾病。
抗C5单克隆抗体依库利珠单抗(Soliris(注册商标))展示出对补体C5的高亲和性,且通过抑制C5裂解为C5a/C5b及伴随膜攻击复合物的形成来遏制补体的激活。由此,依库利珠单抗展现出对溶血的抑制作用,且因此作为阵发性睡眠性血红蛋白尿症和非典型溶血尿毒综合征的治疗剂。此外,依库利珠单抗被称为全身性重症肌无力(gMG)的治疗剂。
在体外溶血抑制活性检测时,尽管依库利珠单抗展现出了良好的经典途径溶血抑制效果,但其阻断补体旁路途径(AP)的活性不足致使其疗效并不能完全满足患者需求,如在经历依库珠单抗(Soliris)治疗的PNH患者中仍有部分患者因会发生血管外溶血而无法摆脱输血依赖。
此外,由于补体激活缺乏调节或激活不当会导致宿主组织受损,因此补体系统也受到一系列蛋白质(补体调节蛋白)的严格调节。其中,补体激活调节因子(RCA)家族蛋白主要负责补体调节。RCA蛋白包括膜蛋白,例如衰变加速因子(DAF;CD55)、膜辅因子蛋白(MCP;CD46)和补体受体1(CR1;CD35)以及液相蛋白例如因子H(FH或CFH)和C4b-结合蛋白(C4BP)。在结构上,RCA蛋白由补体控制蛋白重复(CCP)模块组成,其中2-4个连续模块有助于称为衰减加速活性(DAA)和辅因子活性(CFA)的调节功能。RCA蛋白通过靶向补体途径的中心酶C3/C5转化酶发挥作用。为了使这些酶失活,RCA蛋白与这些转化酶或其非催化亚基结合并使它们失活。在DAA中,RCA蛋白与转化酶结合并将其不可逆地解离为其亚基,而在CFA中,RCA蛋白与转化酶的非催化亚基(C3b/C4b)结合并募集丝氨酸蛋白酶因子I(FI)切割并使其失活,从而停止其形成C3转化酶的能力。H因子抑制C3b扩增。它是因子I催化的C3b裂解为iC3b的辅助因子,是补体受体2和3的调理素和配体。它加速旁路途径C3转化酶C3bBb的不可逆解离,还可能与因子B竞争在转化酶原形成过程中与C3b结合。FH是可溶性对于保护表面(包括胞外基质ECM)很重要。因子H与肾上腺髓质素(一种肽激素)结合,并可能阻止其降解。FH在管理细胞衰老、应激或损伤中的作用通过与C反应蛋白、五聚蛋白、DNA、组蛋白、膜联蛋白II、蛋白质的丙二醛乙醛加合物和氧化脂质的相互作用。FHL1还具有因子I辅因子活性和C3bBb加速衰减活性(The Complement FactsBook.Edited by:Scott Barnum and TheresaSchein,Copyright2018Elsevier Ltd.All rights reserved.https://doi.org/10.1016/C2015-0-06595-9,第30章)。
DAF通过阻止经典和旁路C3和C5转化酶的形成和加速其衰变,从而抑制C3和C5的切割,从本质上保护宿主细胞免受自体补体攻击。当将纯化的DAF添加到细胞中时,它能够整合到细胞膜中并显示出功能活性。DAF还被发现可以调节T细胞耐受性,从而负调节多种自身免疫性疾病的动物模型(The Complement FactsBook.Edited by:Scott Barnum andTheresa Schein,Copyright2018Elsevier Ltd.All rights reserved.https://doi.org/10.1016/C2015-0-06595-9,第25章)。
因此,存在开发新的抗C5抗体,以及基于抗C5抗体和补体调节蛋白的融合蛋白用于改善C5抗体的活性和药效的需求。
发明内容:
本发明涉及一种能够高效结合人补体C5蛋白的抗体。在一些实施方案中,所述抗体能够有效阻断人补体溶血活性。
在一些实施方案中,本发明的抗体能够有效抑制人补体经典途径溶血和人补体旁路途径溶血。
在一些实施方案中,本发明涉及一种包含抗C5抗体的融合蛋白,其包含抗C5抗体,以及补体调节蛋白(例如补体调节蛋白的杂合蛋白)。在一些实施方案中,相比抗C5抗体,所述融合蛋白(1)进一步提升了补体经典途径(CP)阻断活性,增强了药效;(2)明显改善了补体旁路途径(AP)的阻断活性。在进一步的实施方案中,所述融合蛋白与现有技术已知的C5抗体融合蛋白相比,具有更强的抑制C3b在细胞表面沉积的活性,其中C3b沉积被认为是PNH病人发生血管外溶血的主要原因。
在一些实施方案中,本发明涉及如下具体的实施方案:
1、抗C5抗体或其抗原结合片段,其包含重链可变区VH的3个CDR,HCDR1、HCDR2和HCDR3,以及轻链可变区VL的3个CDR,LCDR1、LCDR2和LCDR3,其中所述HCDR1、HCDR2和HCDR3为如SEQ ID NO:39所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3;且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3为如SEQ ID NO:45所示的VL中所含的三个互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3。
2、抗C5抗体或其抗原结合片段,其包含含有或由SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列组成的HCDR1、含有或由SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列组成的HCDR2、含有或由SEQ IDNO:42所示的氨基酸序列组成的HCDR3;含有或由SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列组成的LCDR1、含有或由SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列组成的LCDR2和含有或由SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列组成的LCDR3。
3、实施方案1或2的抗体或其抗原结合片段,其包含重链可变区VH,其中所述重链可变区(i)包含与SEQ ID NO:39的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成;或者
(ii)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
4、实施方案1-3中任一项的抗体或其抗原结合片段,其包含轻链可变区VL,其中所述轻链可变区
(i)包含与SEQ ID NO:45的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成;或者
(ii)包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
5、实施方案1或2的抗体或其抗原结合片段,其包含重链可变区VH和轻链可变区VL,其中
所述重链可变区包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成;且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
6、实施方案1或2的抗体或其抗原结合片段,其包含重链可变区VH和轻链可变区VL,其中VH包含如SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成,且VL包含如SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
7、实施方案1-6中任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其还包含重链恒定区HC,例如,所述抗体重链恒定区HC为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区,优选的IgG2的重链恒定区或IgG4的重链恒定区,或是IgG2/IgG4杂合型的重链恒定区。
8、实施方案7的抗体或其抗原结合片段,所述重链恒定区
(i)包含与SEQ ID NO:43的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成;或者
(ii)包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成;或者
(iii)包含与SEQ ID NO:43的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个,更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换,更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列由所述氨基酸序列组成。
9、实施方案7或8的抗体或其抗原结合片段,其中所述重链恒定区包含增加与FcRn受体结合的突变,例如YTE突变(M252Y/S254T/T256E)、LA突变(M428L/N434A)或LS突变(M428L/N434S)中的一个或多个,优选地包含LA突变;和/或增加抗体稳定性的突变,例如S228P。
10、实施方案1-9中任一项的抗体或其抗原结合片段,其包含轻链恒定区,例如所述轻链恒定区为lambda或kappa轻链恒定区。
11、实施方案10的抗体或其抗原结合片段,其中所述轻链恒定区
(i)包含与SEQ ID NO:49的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成;或者
(ii)包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成;或者
(iii)包含与SEQ ID NO:49的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个,更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换,更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列由所述氨基酸序列组成。
12、实施方案1-11中任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其包含重链,其中所述重链(i)包含与SEQ ID NO:44的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成;或者
(ii)包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成;或者
(iii)包含与SEQ ID NO:44的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个,更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换,更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列由所述氨基酸序列组成,优选地,所述氨基酸改变不发生在CDR区中,优选地,所述氨基酸改变不发生在重链可变区。
13、实施方案1-12中任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其包含轻链,其中所述轻链(i)包含与SEQ ID NO:50的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成;或者
(ii)包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成;或者
(iii)包含与SEQ ID NO:50的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个,更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换,更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列由所述氨基酸序列组成,优选地,所述氨基酸改变不发生在CDR区中,优选地,所述氨基酸改变不发生在轻链可变区。
14、实施方案12或13所述的抗体或其抗原结合片段,其包含重链和轻链,其中所述重链包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列,或包含与所述氨基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列,或由所述氨基酸序列组成;且所述轻链包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列,或包含与所述氨基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列,或由所述氨基酸序列组成。
15、实施方案14所述的抗体或其抗原结合片段,其包含重链和轻链,其中所述重链包含SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列,或由所述氨基酸序列组成,且所述轻链包含SEQ IDNO:50所示的氨基酸序列,或由所述氨基酸序列组成。
16、实施方案1-15中任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述抗体为人源化抗体或嵌合抗体。
17、实施方案1-16中任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述抗体为单克隆抗体。
18、实施方案1-17中任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述抗原结合片段为选自以下的抗体片段:Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、单链抗体(例如scFv)、(Fab’)2、单结构域抗体例如VHH、dAb(domain antibody)或线性抗体。
19、融合蛋白,其包含抗C5抗体或其抗原结合片段以及杂合蛋白,其中所述杂合蛋白包含或由下述组成
(i)人补体因子H(CFH)的CCP1,
(ii)人衰变加速因子(DAF)的CCP3和CCP4,
其中所述抗体或其抗原结合片段与杂合蛋白经由或不经由接头连接;
优选地,所述抗C5抗体或其抗原结合片段选自
i)实施方案1-18中任一项所述的抗体或其抗原结合片段;
ii)CN113754763A中公开的抗C5抗体或其抗原结合片段;或
iii)Eculizumab、Ravulizumab、Pozelimab、Crovalimab、Tesidolumab或其抗原结合片段。
20、实施方案19所述的融合蛋白,其中DAF的CCP3和CCP4直接连接在一起构成CCP3-4。
21、实施方案19或20的融合蛋白,其中人CFH的CCP1包含人CFH蛋白的第19-82位的氨基酸序列,或由所述氨基酸序列组成,任选地,所述CCP1包含V62I突变,其中所述氨基酸位置对应于SEQ ID NO:3所示的氨基酸位置编号。
22、实施方案19或20的融合蛋白,其中人CFH的CCP1包含人CFH蛋白的第19-84位的氨基酸序列,或由所述氨基酸序列组成,任选地,所述CCP1包含V62I突变,其中所述氨基酸位置对应于SEQ ID NO:3所示的氨基酸位置编号。
23、实施方案19-22中任一项的融合蛋白,其中人DAF的CCP3包括人DAF蛋白的第161-222的氨基酸序列或由其组成,和/或人DAF的CCP4包括人DAF蛋白的第223-285的氨基酸序列或由其组成,其中所述氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1所示的氨基酸位置编号。
24、实施方案19-22中任一项的融合蛋白,其中人DAF的CCP3包括人DAF蛋白的第163-222的氨基酸序列或由其组成,和/或人DAF的CCP4包括人DAF蛋白的第223-285的氨基酸序列或由其组成,其中所述氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1所示的氨基酸位置编号。
25、实施方案20的融合蛋白,其中人DAF的CCP3-4包含人DAF蛋白的第161-285位的氨基酸序列,或由其组成,其中所述氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1所示的氨基酸位置编号。
26、实施方案20-22中任一项的融合蛋白,其中人DAF的CCP3-4包含人DAF蛋白的第163-285位的氨基酸序列,或由其组成,其中所述氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1所示的氨基酸位置编号。
27、实施方案20的融合蛋白,其中
(1)人CFH的CCP1包含人CFH蛋白的第19-82位的氨基酸序列,或由所述氨基酸序列组成,且人DAF的CCP3包括人DAF蛋白的第161-222的氨基酸序列或由其组成,和人DAF的CCP4包括人DAF蛋白的第223-285的氨基酸序列或由其组成;
(2)人CFH的CCP1包含人CFH蛋白的第19-84位的氨基酸序列,或由所述氨基酸序列组成,且人DAF的CCP3包括人DAF蛋白的第163-222的氨基酸序列或由其组成,和人DAF的CCP4包括人DAF蛋白的第223-285的氨基酸序列或由其组成;
(3)人CFH的CCP1包含人CFH蛋白的第19-82位的氨基酸序列,或由所述氨基酸序列组成,且人DAF的CCP3-4包含人DAF蛋白的第161-285位的氨基酸序列,或由其组成;或(4)人CFH的CCP1包含人CFH蛋白的第19-84位的氨基酸序列,或由所述氨基酸序列组成,且人DAF的CCP3-4包含人DAF蛋白的第163-285位的氨基酸序列,或由其组成;其中人CFH蛋白的氨基酸位置对应于SEQ ID NO:3所示的氨基酸位置编号,且人DAF蛋白的氨基酸位置对应于SEQID NO:1所示的氨基酸位置编号。
28、实施方案27的融合蛋白,其中人CFH的CCP1具有V62I突变。
29、实施方案19-28中任一项的融合蛋白,其中人CFH蛋白是人天然CFH蛋白或其包含(i)SEQ ID NO:3或5所示的氨基酸序列,
(ii)SEQ ID NO:4或6所示的核酸序列所编码的氨基酸序列;
(iii)与(i)或(ii)所示的氨基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%氨基酸序列;
或由所述(i)至(iii)中任一项所示的氨基酸序列组成。
30、实施方案19-29中任一项的融合蛋白,其中人DAF蛋白是人天然DAF蛋白或其包含(i)SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列,
(ii)SEQ ID NO:2所示的核酸序列所编码的氨基酸序列;
(iii)与(i)或(ii)所示的氨基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%氨基酸序列;
或由所述(i)至(iii)中任一项所示的氨基酸序列组成。
31、实施方案19-30中任一项的融合蛋白,其中
所述人CFH的CCP1包含SEQ ID NO:12、13、14或15的氨基酸序列,或包含与SEQ IDNO:12、13、14或15的氨基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%的统一性的氨基酸序列,或由所述序列组成;
所述人DAF的CCP3包含SEQ ID NO:7或8的氨基酸序列,或包含与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%的统一性的氨基酸序列,或由所述序列组成;
所述人DAF的CCP4包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列,或包含与SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%的统一性的氨基酸序列,或由所述序列组成;和/或所述人DAF的CCP3-4包含SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的氨基酸序列,或包含与SEQID NO:10或SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%的统一性的氨基酸序列,或由所述序列组成。
32、实施方案19-31中任一项的融合蛋白,其中所述融合蛋白包含信号肽,例如在其N末端。
33、实施方案32的融合蛋白,其中所述信号肽为分泌性信号肽,例如其包含SEQ IDNO:17所示的氨基酸序列。
34、实施方案19-33中任一项的融合蛋白,其中所述杂合蛋白包含SEQ ID NO:18-33中任一项的氨基酸序列,或包含与所述氨基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%氨基酸序列,或由其组成。
35、实施方案19-34中任一项的融合蛋白,其中所述一个或多个杂合蛋白(在其N末端或在其C末端)分别与抗C5抗体的重链和/或轻链的N末端和/或C末端连接,通过或不通过接头。
36、实施方案19-35中任一项的融合蛋白,其中所述抗C5抗体或其抗原结合片段包含Fc区,其中所述Fc区在其C末端连接杂合蛋白的N末端,通过或不通过接头。
37、实施方案19-36中任一项的融合蛋白,其中所述接头选自一个或几个甘氨酸(G)n、GS、GnS、GnSn、(GnS)n或者(GSG)n或(G4S)n,其中n是等于或大于1的整数,例如,n是2,3,4,5,6或7的整数,例如,所述接头为G、GSG或G4S。
38、实施方案19-37中任一项的融合蛋白,其包含全长抗C5抗体和杂合蛋白,其中
所述抗C5抗体在其Fc区的C末端与杂合蛋白的N末端连接构成融合蛋白的重链(经由或不经由接头);
所述抗C5抗体的轻链构成融合蛋白的轻链。
39、实施方案38的融合蛋白,其中所述融合蛋白包含两条重链和两条轻链。
40、实施方案38或39的融合蛋白,其中所述融合蛋白的重链包含SEQ ID NO:54、55、56、57或58所示的氨基酸序列,或与所述氨基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的氨基酸序列,或由所述序列组成;和/或所述融合蛋白的轻链包含SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列,或与所述氨基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的氨基酸序列,或由所述序列组成。
41、核酸分子,其编码实施方案1-18中任一项所述的抗体或其抗原结合片段,或实施方案19-40中任一项所述的融合蛋白。
42、表达载体,其包含实施方案41的核酸分子,优选地,所述表达载体为pCDNA3.1。
43、宿主细胞,其包含实施方案41所述的核酸分子或实施方案42所述的表达载体,优选地,所述宿主细胞是原核的或真核的,例如CHO细胞,293细胞,例如Expi293细胞。
44、制备实施方案实施方案1-18中任一项所述的抗体或其抗原结合片段,或实施方案19-40中任一项所述的融合蛋白的方法,所述方法包括,在适合所述抗体或融合蛋白表达的条件下,培养实施方案43的宿主细胞,和任选地还包括从所述宿主细胞或所述宿主细胞培养基分离所述蛋白,和/或纯化所述蛋白。
45、免疫缀合物,其包含实施方案1-18中任一项所述的抗体或其抗原结合片段,或实施方案19-40中任一项所述的融合蛋白,以及其他活性剂,例如抗溶血药或标记。
46、药物组合物或药物或制剂,其包含实施方案1-18中任一项所述的抗体或其抗原结合片段,或实施方案19-40中任一项所述的融合蛋白,以及任选地药用辅料。
47、药物组合产品,其包含
实施方案1-18中任一项所述的抗体或其抗原结合片段,或实施方案19-40中任一项所述的融合蛋白;以及
其它治疗剂。
48、在受试者中预防或治疗补体系统相关疾病或病症的方法,包括向受试者施用有效量的实施方案1-18中任一项所述的抗体或其抗原结合片段,或实施方案19-40中任一项所述的融合蛋白;或实施方案45的免疫缀合物或实施方案46的药物组合物或制剂;或实施方案47的药物组合产品。
49、实施方案48的方法,其中所述疾病或病症是由于补体系统的异常激活或补体系统失调导致的或者是补体C5相关疾病或病症。
50、实施方案49的方法,其中所述补体系统的异常激活或补体系统的失调是由于例如微生物感染或自身免疫抗体的增加,或者是由于补体调节蛋白减少、缺失、失能或功能被干扰、阻断。
51、实施方案49的方法,其中所述补体C5相关疾病或病症包括由未调控的C5功能例如由于失调的C5激活,例如增加的C5激活而导致的疾病表型。
52、实施方案49的方法,其中所述补体C5相关疾病或病症是指这样的疾病或病症,其中所述受试者中具有(例如升高水平的,例如核酸或蛋白质水平的)补体C5蛋白(例如相比健康受试者)或所述受试者的血液或血细胞中具有(例如升高水平的,例如核酸或蛋白质水平的)补体C5蛋白(例如相比健康受试者的血液或血细胞)。
53、实施方案52的方法,其中所述补体系统相关疾病或病症选自需要溶血抑制的疾病,例如需要抑制补体免疫经典途径和/或补体免疫旁路途径的溶血的疾病;或需要抑制C3b沉积活性的疾病。
54、检测补体C5在生物样品中存在的方法,其包括将生物样品与实施方案1-18中任一项所述的抗体或其抗原结合片段,或实施方案19-40中任一项所述的融合蛋白在允许其与补体C5结合的条件下接触,并检测在所述抗体或其抗原结合片段或融合蛋白和补体C5之间是否形成复合物,其中复合物的形成表示存在补体C5。
附图说明
图1显示CFH CCP1-4和DAF CCP1-4晶体结构及杂合蛋白的结构模型。
图2显示各待测蛋白的SDS-PAGE电泳图。
图3显示了杂合蛋白的SEC-HPLC纯度分析结果。
图4显示了各待测蛋白的CP抑制活性。
图5显示了各待测蛋白的AP抑制活性。
图6显示了各待测蛋白抑制C3b在红细胞表面的沉积活性。
图7显示了抗C5抗体与补体C5在不同pH下的ForteBio检测的解离性质。
图8显示了抗C5抗体抑制人C5转基因小鼠血清CP溶血活性。
图9显示了抗C5抗体重链与杂合蛋白连接的示意图。
图10显示了待测融合蛋白的CP抑制活性。
图11显示了待测融合蛋白的AP抑制活性。
图12显示了待测融合蛋白抑制C3b在红细胞表面的沉积活性。
图13显示了待测融合蛋白与补体抑制蛋白C5单克隆抗体Eculizumab和双功能C5抗体FH1-5融合蛋白的CP抑制活性和AP抑制活性。
图14显示了待测融合蛋白与补体抑制蛋白C5单克隆抗体Eculizumab和双功能C5抗体FH1-5融合蛋白的C3b沉积抑制活性(Wieslab法)。
发明详述:
I.定义:
应理解本发明不限于本文中描述的特定方法学、方案和试剂,因为这些可以变化。还应理解本文中使用的术语仅为了描述具体实施方案,而并不意图限制本发明的范围,其仅会由所附权利要求书限制。除非另外定义,本文中使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域中普通技术人员通常的理解具有相同的含义。
衰变加速因子(DAF)
衰变加速因子(DAF,CD55)是一种膜相关调节蛋白,可保护自身细胞免受其表面自体补体的激活。DAF通过快速解离C3和C5转化酶(级联的中心酶)起作用。DAF具有最有效的与补体调节相关的蛋白质的衰减加速活性,并且作用于经典途径(C4b2a和C4b2a3b)和替代途径(C3bBb和C3BbC3b)酶。然而,DAF没有辅因子功能。
DAF的结构分析表明,从其N端开始,它由4个~60个氨基酸长的单元组成,随后是一个富含高度O-糖基化的丝氨酸(S)和苏氨酸(T)的片段(STP),其后连接翻译后添加的糖肌醇磷脂(GPT)锚。
在一些实施方案中,DAF是具有如下登录号的人DAF:Genbank登录号M31516、M15799、M64653、S72858或M643567。
在一些实施方案中,DAF是人DAF。在一些实施方案中,人DAF是人天然DAF。在一些实施方案中,人天然DAF的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示,其各个模块如下表1所示。四个60个氨基酸长的重复单元称为补体控制蛋白重复(CCP)或短共有重复(SCR)。CCP1包括氨基酸35-96。CCP2包括氨基酸96-160;CCP3包括氨基酸161-222,CCP4包括氨基酸223-285。它们提供DAF的所有调节活性。高度O-糖基化区域充当缓冲区,其将CCP定位在表面膜上方适当距离处。GPI锚允许DAF在质膜平面内自由移动,使其能够在转化酶复合物组装的任何地方失活转化酶复合物。在本文中,提及DAF的模块的氨基酸位置时,均为对应于SEQ ID NO:1所示的氨基酸位置编号。
表1:DAF的蛋白质模块(UniProt划分方式)
在一些实施方案中,编码DAF的cDNA的核苷酸序列如SEQ.ID NO:2所示。
因子H(CFH或FH)
“补体因子H”、“因子H”、“FH”、“CFH蛋白”或“CFH”可以互换使用,是指大约150kDa的蛋白质,其是补体激活家族的调节物的成员并且是补体对照蛋白质。CFH是大的可溶性糖蛋白,其在人血浆中循环并用于调节补体系统的旁路途径,确保补体系统针对病原体或其它危险物质并且不损害宿主组织。
因子H主要是单体,但自身缔合性较弱(KD=28μM),并且可能在糖胺聚糖或高浓度金属离子存在的情况下寡聚化。CFH由20个称为补体控制蛋白重复(CCP)(SCR或sushi结构域)的同源单元组成,其中一些重复起细胞附着的作用,而其他重复的功能是从细胞表面消除C3b。20个SCR各自约60个氨基酸长,以头尾相连排列,含有4个半胱氨酸残基,每个模块形成2个二硫键。SCR 19和20参与C3b的结合。
剪接变体FHL-1由前7个CCP组成,随后是C末端序列Ser-Pro-Leu-Thr。每个CCP包含约60个残基,包括四个不变的半胱氨酸,形成CysI-CysIII、CysII-CysIV二硫化物。相邻模块由三到八个残基的序列连接。
在负染色电子显微照片中,FH分子采用多种构象,但主要是对折的;分析超速离心、小角度X射线散射(沉积在PDB中的模块,例如3GAV)和化学交联也表明模块链本身弯曲。确定了如下几个FH片段的高分辨率结构,单独或与其他分子复合(在后括号中提供PDB标识符):CCP 1-2(2RLP)、2-3(2RLQ)、1-4(2WII)、5、6-7(例如,2W80、2YBY)、7(2JGW和2JGX)、6–8(2UWN和2V8E)、9(4K12)、10-11(4B2R)、11-12(4B2S)、12-13(2KMS)、15(1HFI)、16(1HCC)、15-16(1HFH)、18-20(3SWO)、19-20(例如,2BZM、2G7I和4ONT)。每个CCP都类似于一个扁长球体,长轴约为4nm,短轴约为2nm,并且包含与长轴大致对齐的反平行片中的β链。它的N和C末端位于其长轴的任一端,促进具有可变模块间接触、倾斜和扭曲的串联CCP的端到端布置。
在一些实施方案中,CFH是人CFH,例如人天然CFH。在一些是实施方案中,CFH的氨基酸序列具有如下登录号:HGNC:HGNC:4883、Ensembl:ENSG00000000971、HPRD:00601、MIM:134370或Vega:OTTHUMG00000035607。
在一些实施方案中,CFH的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。在一些实施方案中,CFH的各个模块对应的氨基酸位置如下表2所示。
表2:CFH的蛋白质模块(Uniprot划分方式)
在一些实施方案中,编码CFH的cDNA的核苷酸序列如SEQ.ID NO:4所示。
在一些实施方案中,编码CFH的剪接变体FHL-1的蛋白质序列如SEQ ID NO:5所示。在一些实施方案中,编码CFH的剪接变体FHL-1的cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
在本文中,提及CFH的模块的氨基酸位置时,均为对应于SEQ ID NO:3所示的氨基酸位置编号。
其它定义
术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小5%的下限和比指定数字数值大5%的上限的范围内的数字数值。
如本文所用,术语“和/或”意指可选项中的任一项或可选项的两项或多项或全部。
如本文所用,术语“包含”或“包括”意指包括所述的要素、整数或步骤,但是不排除任意其他要素、整数或步骤。在本文中,当使用术语“包含”或“包括”时,除非另有指明,否则也涵盖由所述及的要素、整数或步骤组成的情形。例如,当提及“包含”某个具体序列的蛋白质时,也旨在涵盖由该具体序列组成的蛋白质。
在本文中当提及“第一”“第二”时,仅为了区分两个结构域或两条链,而不以任何方式表明两个结构域的位置。
如本文所用,术语“杂合蛋白”与“嵌合多肽”可互换使用,是指由至少两个异源多肽序列,任选地通过接头,融合形成的更大多肽。杂合蛋白可以通过重组表达产生。
术语“补体C5”或“C5蛋白”或“补体C5蛋白”或“C5补体蛋白”可互换使用,并且还是指不同物种中的补体C5蛋白。人补体C5(Uniprot条目P01031)是一种分泌的多结构域糖蛋白,由通过二硫桥连接的α链(999个氨基酸)和β链(655个氨基酸)组成。α链的Arg751与Leu752之间的肽键被C5转化酶裂解,产生小的74个氨基酸长的C5a片段和大的C5b片段(1580个氨基酸)。C5向C5b的转化涉及大的构象变化并导致随后的C6结合。例如,在一些实施方案中,人C5具有如SEQ ID NO:38中所示的序列。术语“抗原”是指引发免疫应答的分子。这种免疫应答可能涉及抗体产生或特异性免疫细胞的活化,或两者兼有。技术人员将理解,任何大分子,包括基本上所有的蛋白质或肽,都可以用作抗原。此外,抗原可以衍生自重组或基因组DNA。如本文所用,术语“表位”指抗原中与抗体分子特异性相互作用的部分。
如本文所用的术语“抗原结合区”是指融合蛋白的结合特定抗原的部分。抗原结合区可以是例如抗体或免疫球蛋白本身或抗体片段。这种抗原结合区可以具有或可以不具有独立于融合蛋白的剩余部分的三级结构,并且可以作为单独实体结合或不结合其抗原。
当提及“抗原结合区来源于抗体”时,是指构成该抗原结合区的结合结构域为或衍生自该抗体的特异性结合抗原的结合结构域,例如,抗原结合区的重链可变区和/或轻链可变区为或衍生自该抗体的重链可变区和/或轻链可变区,或者该靶标结合区的1个、2个、3个、4个、5个或6个CDR为该抗体的CDR。
术语“衍生自”是指在抗原结合区中的片段与其所来源的抗体的片段基本相同,但是在一个或多个位点处具有突变,例如取代、缺失或添加。在一个具体的实施方案中,所述突变不在抗体的CDR中。
术语“全抗体”、“全长抗体”、“完全抗体”和“完整抗体”在本文中可互换地用来指天然存在的包含由二硫键相互连接的至少两条重链(H)和两条轻链(L)的糖蛋白。每条重链由重链可变区(本文中缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由3个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH区和VL区可以进一步再划分为超变区(为互补决定区(CDR),其间插有较保守的区域(为构架区(FR))。每个VH和VL由三个CDR和4个FR组成,从氨基端到羧基端以如下顺序排列:FR1,CDR1,FR2,CDR2,FR3,CDR3,FR4。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合,但是显示出多种效应子功能。在一些实施方案中,本发明的抗体重链恒定区HC为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区,优选的IgG1的重链恒定区。术语“抗体片段”包括完整抗体的一部分。在优选的实施方案中,抗体片段为抗原结合片段。
术语抗体的“抗原结合片段”是比全抗体或全长抗体的氨基酸残基数要少的全长或全抗体的一部分或一段,但其能结合抗原或与全长抗体(即与抗原结合片段所来源的全长抗体)竞争结合抗原。可以通过重组DNA技术、或通过酶或化学切割完整的抗体制备抗原结合片段。抗原结合片段包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、单链Fv、双体抗体(diabody)、单域抗体(sdAb)、纳米抗体。例如,通过木瓜蛋白酶消化全长抗体能够获得Fab片段。此外,通过胃蛋白酶在铰链区的二硫键下面消化完全抗体产生F(ab')2,其为Fab’的二聚体,是二价的抗体片段。F(ab')2可以在中性条件下通过破坏铰链区中的二硫键而被还原,由此将F(ab')2二聚体转化为Fab'单体。Fab'单体基本上是具有铰链区的Fab片段。Fv片段由抗体单臂的VL和VH结构域组成。Fv片段的两个结构域VL和VH可以由独立的基因编码,但是也可以使用重组方法,使用合成性连接肽连接这两个结构域以使其作为单条蛋白链产生,并且在所述单条蛋白链中VL区和VH区配对以形成单链Fv(scFv)。
术语“可变区”或“可变结构域”是指参与抗体与抗原结合的抗体重或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变区通常具有相似的结构,其中每个结构域包含四个保守的框架区(FR)和三个互补决定区。
抗体的“互补决定区”或“CDR区”或“CDR”或“高变区”,是抗体可变结构域(VH或VHH)中在序列上高度可变并且形成在结构上确定的环(“超变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触点”)的区域。CDR主要负责与抗原表位结合。重链和轻链的CDR从N-端开始顺序编号,通常称作CDR1、CDR2和CDR3。位于抗体重链可变结构域内的CDR也称作HCDR1、HCDR2和HCDR3,而位于抗体轻链可变结构域内的CDR则称作LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一个给定的轻链可变区或重链可变区氨基酸序列中,可以采用本领域公知的多种方案确定其CDR序列,例如:基于抗体的三维结构和CDR环的拓扑学的Chothia,基于抗体序列可变性的Kabat(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第4版,U.S.Department ofHealth and Human Services,National Institutes of Health(1987)),AbM(Universityof Bath),Contact(University College London),国际ImMunoGeneTics database(IMGT)(国际免疫遗传学信息系统,万维网imgt.cines.fr/),以及基于利用大量晶体结构的近邻传播聚类(affinity propagation clustering)的North CDR定义(North等,“A NewClustering of Antibody CDR Loop Con格式ions”,Journal of Molecular Biology,406,228-256(2011))。
以下为采用kabat、AbM、Chothia、Contact和IMGT方案定义的CDR的区域范围。
除非另有说明,否则在本发明中,术语“CDR”或“CDR序列”涵盖以上述任一种方式确定的CDR序列。在一些实施方案中,本发明的CDR是基于Kabat方案确定的。
CDR也可以基于与参考CDR序列具有相同的Kabat编号位置而确定。除非另有说明,否则在本发明中,当提及抗体可变区中的残基位置(包括重链可变区残基和轻链可变区残基)时,是指根据Kabat编号系统(Kabat等人,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))的编号位置。
在一个实施方案中,本发明的抗体分子中的CDR是通过Chothia编号规则确定的。
术语“Fc结构域”或“Fc区”在本文中用来定义免疫球蛋白重链的含有至少一部分恒定区的C端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。天然的免疫球蛋白“Fc结构域”或“Fc区”包含两个或三个恒定结构域,即CH2结构域、CH3结构域和可选的CH4结构域。例如,在天然抗体中,免疫球蛋白Fc结构域包含源自IgG、IgA和IgD类抗体的重链的第二和第三恒定结构域(CH2结构域和CH3结构域);或者包含源自IgM和IgE类抗体的两条重链的第二、第三和第四恒定结构域(CH2结构域、CH3结构域和CH4结构域)。除非本文中另外说明,否则Fc区或重链恒定区中的氨基酸残基编号根据如Kabat等人,Sequences of Proteins ofImmunological Interes,第5版,Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD,1991中所述的EU编号体系(也称作EU索引)进行编号。在本文中,术语“Fc区”、“Fc部分”和“Fc片段”不包括免疫球蛋白的重链可变区VH和轻链可变区VL以及重链恒定区CH1和轻链恒定区CL,但在一些情况下可以包括在重链恒定区N端的铰链区。免疫球蛋白的“效应子功能”的例子包括:C1q结合和补体依赖的细胞毒性(CDC)、Fc受体结合作用、抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖的细胞吞噬作用(ADCP)、细胞因子分泌、免疫复合物介导的抗原呈递细胞摄取抗原、下调细胞表面受体(例如B细胞受体)和B细胞活化。
术语“嵌合抗体”是这样的抗体分子,其中(a)将恒定区或其部分改变、替换或交换,从而抗原结合位点与不同的或改变的类别、效应子功能和/或物种的恒定区或赋予嵌合抗体新性能的完全不同的分子(例如,酶、毒素、激素、生长因子、药物)等连接;或(b)将可变区或其部分用具有不同或改变的抗原特异性的可变区改变、替换或交换。例如,小鼠抗体可以通过将其恒定区更换为来自人免疫球蛋白的恒定区进行修饰。由于更换为人类恒定区,该嵌合抗体可以保留其在识别抗原方面的特异性,同时如与原始小鼠抗体相比,具有在人类中降低的免疫原性。
“人源化抗体”是一种保留非人类抗体(例如小鼠单克隆抗体)的抗原特异性反应性,同时作为治疗药对人施用时免疫原性较低的抗体。这可以例如通过保留非人类抗原结合位点并将抗体的剩余部分替换成它们的人类相应部分(即,将恒定区以及可变区中不参与结合的部分替换为人类抗体的相应部分)来实现。
如本文所用,术语“融合蛋白”是指由至少两个异源多肽序列,任选地通过接头,融合形成的更大多肽。融合蛋白可以通过重组表达产生。
在本文中,抗体恒定区或抗体恒定结构域,包括CH1,CL和Fc结构域以及构成Fc结构域的CH2,CH3和可选的CH4结构域,可以根据抗体分子的预期功能进行选择。例如,恒定区可以是IgA,IgD,IgE,IgG或IgM区,尤其是人IgG的免疫球蛋白恒定结构域,例如,人IgG1,IgG2,IgG3或IgG4的恒定结构域,优选人IgG2、IgG4或IgG2/4杂合型的恒定结构域。免疫球蛋白恒定区可以具有天然序列或变体序列。
术语“杂合型的重链恒定区”是指重链恒定区的片段,例如构成恒定区的恒定区结构域(例如CH1、CH2、CH3和任选地CH4)或其部分分别来自不同的IgG、IgA和IgD类抗体。例如,IgG2/IgG4杂合型重链恒定区是指例如该恒定区的CH1和部分CH2来自IgG2,且部分CH2和CH3来自IgG4,例如如C5抗体药物Soliris和Ultomiris的重链恒定区。
如本文所用的术语“接头”是指使得能够直接连接双特异性结合分子的不同部分的任何分子。在不同分子部分之间建立共价连接的接头的实例包括肽接头和非蛋白质聚合物,包括但不限于聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇、聚丙二醇的共聚物。在一些实施方案中,接头是肽接头(又称为“连接肽”),其是指是指由氨基酸组成的短氨基酸序列,例如单独或组合使用的甘氨酸(G)和/或丝氨酸(S)和/或苏氨酸残基(T),或来自免疫球蛋白的铰链区,用于将融合蛋白分子的第一部分的氨基酸序列连接至结合分子的第二部分。例如,肽接头可以将融合蛋白分子的抗体分子和多肽连接。例如,肽接头也可以将抗体的一部分连接至抗体的另一部分,诸如将轻链可变区连接至重链可变区。优选地,所述肽接头具有这样的长度,其足以连接两个实体,其方式使得它们维持它们相对于彼此的构象,使得不妨碍期望的活性。有用的接头还包括甘氨酸-丙氨酸聚合物、甘氨酸-丝氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和其他柔性接头。在一个实施方案中,连接肽具有1-50个氨基酸长度,例如,1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸长度。在一个实施方案中,接头是一个或几个甘氨酸,例如(G)n(SEQ ID NO:62),其中n=1-10的整数,例如1、2、3、4、5或6。在一个实施方案中,接头是例如甘氨酸-丝氨酸聚合物,例如GS(SEQ ID NO:63)、GnS(SEQ ID NO:64)、GSG(SEQ ID NO:65)、GnSn(SEQ ID NO:66)、(GnS)n(SEQ ID NO:67)或(G4S)n(SEQ ID NO:68),其中n=1-10的整数,例如1、2、3、4、5或6。在一个实施方案中,连接肽选自一个或几个甘氨酸、或者“(GSG)n(SEQ ID NO:69)”或(G4S)n,其中n是等于或大于1的整数,例如,n是2,3,4,5,6或7的整数,例如GGGGS(G4S,SEQ ID NO:70)。可以使用计算机程序模拟蛋白和肽的三维结构,或通过噬菌体展示方法,来合理地设计合适的柔性连接肽。
如本文所用,术语“抗”、“结合”或“特异性结合”意指结合作用对抗原是选择性的并且可以与不想要的或非特异的相互作用区别。抗原结合位点与特定抗原结合的能力可以通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)或本领域已知的常规结合测定法如通过放射性免疫测定(RIA)或生物膜薄层干涉测定法或MSD测定法或表面等离子体共振法(SPR)测定。
“亲和力”或“结合亲和力”指反映结合对子的成员之间相互作用的固有结合亲和力。分子X对其配偶物Y的亲和力可以通常由解离常数(KD)代表,解离常数是解离速率常数和缔合速率常数(分别是kdis和kon)的比例。亲和力可以由本领域已知的常见方法测量。用于测量亲和力的一个具体方法是本文中的ForteBio动力学结合测定法。
氨基酸序列的“同一性百分数(%)”是指将候选序列与本说明书中所示的具体氨基酸序列进行比对并且如有必要的话为达到最大序列同一性百分数而引入空位后,并且不考虑任何保守置换作为序列同一性的一部分时,候选序列中与本说明书中所示的具体氨基酸序列的氨基酸残基相同的氨基酸残基百分数。在一些实施方案中,本发明考虑本发明蛋白质或多肽的变体,所述变体相对于在本文中具体公开的多肽或蛋白质而言具有相当程度的同一性,例如同一性为至少80%,85%,90%,95%,97%,98%或99%或更高。所述变体可以包含保守性改变。
对于多肽序列,“保守性改变”包括对多肽序列的置换、缺失或添加,但不实质性改变多肽序列的期望功能活性。例如,保守性置换常常导致某个氨基酸置换为化学上相似的氨基酸。提供功能上相似氨基酸的保守性置换表是本领域熟知的。以下列出了8组含有互为保守替换的氨基酸:1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G);2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E);3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q);4)精氨酸(R)、赖氨酸(K);5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V);6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W);7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T);和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)。在一些实施方案中,术语“保守序列改变”用于指不显著影响或改变亲本杂合蛋白活性的氨基酸修饰。例如保守修改变体相对于亲本多肽或杂合蛋白保持至少80%,85%,90%,95%,98%,99%或更高,例如100-110%或更高的活性。
术语“宿主细胞”指已经向其中引入外源多核苷酸的细胞,包括这类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”,这包括原代转化的细胞和从其衍生的子代。宿主细胞是可以用来产生本发明杂合蛋白的任何类型的细胞系统,包括真核细胞,例如,哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞;和原核细胞,例如,大肠杆菌细胞。宿主细胞包括培养的细胞,也包括转基因动物、转基因植物或培养的植物组织或动物组织内部的细胞。
术语“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体,其包含有效连接要表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包含足够的用于表达的顺式作用元件;用于表达的其它元件可以由宿主细胞提供或在体外表达系统中。表达载体包括本领域已知的所有那些,包括被掺入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如,裸的或包含在脂质体中)和病毒(例如,慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。
术语“个体”或“受试者”可互换地使用,是指哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯化动物(例如,奶牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类(例如,人和非人灵长类如猴)、兔和啮齿类(例如,小鼠和大鼠)。特别地,个体是人。
术语“治疗”包括施用组合物或杂合多肽以预防或延迟疾病的症状、并发症、或生化指征的发作、缓解症状或阻止或抑制疾病、病状或病症的进一步发展。术语“预防”包括对疾病或病症或特定疾病或病症的症状的发生或发展的抑制。
术语“药用辅料”指与活性物质一起施用的稀释剂、佐剂(例如弗氏佐剂(完全和不完全的))、赋形剂、载体或稳定剂等。
术语“药物组合物”指这样的组合物,其以允许包含在其中的活性成分的生物学活性有效的形式存在,并且不包含对施用所述组合物的受试者具有不可接受的毒性的另外的成分。
术语“有效量”指本发明的杂合蛋白或编码其的核酸或组合物或组合的这样的量或剂量,其以单一或多次剂量施用患者后,在需要治疗或预防的患者中产生预期效果。
“治疗有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段,有效实现所需治疗结果的量。治疗有效量也是这样的一个量,其中杂合蛋白或组合物或组合的任何有毒或有害作用不及治疗有益作用。相对于未治疗的对象,“治疗有效量”优选地抑制可度量参数或改善可度量参数至少约40%、甚至更优选地至少约50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%甚至100%。
“预防有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段,有效实现所需预防结果的量。通常,由于预防性剂量在对象中在疾病较早阶段之前或在疾病较早阶段使用,故预防有效量将小于治疗有效量。
如本文所用,术语“补体C5相关疾病或病症”是指这样的疾病或病症,其中未调控的C5功能可能例如由于失调的C5激活,例如增加的C5激活而导致疾病表型。
本文所使用的术语“标记”是指被直接或间接缀合或融合至试剂(诸如多核苷酸探针或抗体)并且促进其所缀合或融合的试剂的检测的化合物或组合物。标记本身可以是可检测的(例如,放射性同位素标记或荧光标记)或在酶促标记的情况下可以催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。术语旨在涵盖通过将可检测物质偶联(即,物理连接)至探针或抗体来直接标记探针或抗体以及通过与直接标记的另一种试剂反应来间接标记探针或抗体。在一些实施方案中,标记是His或生物素。
“受试者/患者/个体样品”指从患者或受试者得到的细胞或流体的集合。组织或细胞样品的来源可以是实体组织,像来自新鲜的、冷冻的和/或保存的器官或组织样品或活检样品或穿刺样品;血液或任何血液组分;体液,诸如泪液、玻璃体液、脑脊液、羊膜液(羊水)、腹膜液(腹水)、或间隙液;来自受试者的妊娠或发育任何时间的细胞。在一些实施方案中,样品是血液或血清。
本发明的这些以及其它方面和实施方案在附图(附图简述紧随其后)和以下的发明详述中得到描述并且示例于以下实施例中。上文以及整个本申请中所论述的任何或所有特征可以在本发明的各种实施方案中组合。以下实施例进一步说明本发明,然而,应理解实施例以说明而非限定的方式来描述,并且本领域技术人员可以进行多种修改。
II.杂合蛋白
本发明涉及一种CFH和DAF的杂合蛋白,其包含至少一个来自CFH的功能单元以及至少一个来自DAF的功能单元。
A.DAF功能单元
在某些实施方案中,本发明的杂合蛋白优选包含来自DAF的功能单元。这种功能单元能够解离C3和C5转化酶,和/或加速针对经典途径C3转化酶和/或旁路途径C3转化酶的衰变加速活性。在一些实施方案中,DAF功能单元包含DAF的CCP3和4。
此类CCP的氨基酸序列可以与DAF的天然或天然存在的氨基酸序列相同。或者,此类CCP的氨基酸序列可以稍微改变,特别是在氨基或羧基末端。当限制酶位点掺入编码CCP的多核苷酸时,就会发生这种改变。当从功能单元的N末端或C末端缺失氨基酸时,也会发生这种改变。例如,在一些实施方案中,可以在CCP3的N末端缺失1-2个氨基酸。
还可以在不影响功能活性的情况下引入序列中的一些氨基酸取代,优选地保守取代。保守取代可以是例如带电荷的氨基酸彼此替代或亲水性氨基酸彼此替代、疏水性氨基酸彼此替代和相似质量的氨基酸彼此替代来进行。
在一个实施方案中,DAF功能单元包含与人DAF蛋白质的CCP 3和/或4(或由CCP3的C末端与CCP4的N末端直接连接在一起的CCP3-4)具有至少95%、96%、97%、98%、99%氨基酸序列。在一些实施方案中,DAF功能单元包含人DAF蛋白质的CCP3和/或4(由CCP3的C末端与CCP4的N末端直接连接在一起的CCP3-4)。在一些实施方案中,DAF功能单元包括人DAF蛋白质的CCP3和4。在一些是实施方案中,DAF功能单元是由CCP3的C末端与CCP4的N末端直接连接在一起的CCP3-4。
在一些实施方案中,人DAF蛋白质是人天然DAF蛋白质。在一些实施方案中,人天然DAF蛋白质包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或由所述序列组成。DAF包含SEQ ID NO:2所示的DNA序列所编码的氨基酸序列或由所述序列组成。
在一些实施方案中,CCP3包含DAF的氨基酸161至222或由其组成。在一些实施方案中,为了连接其他功能单元,可以缺失CCP3的N末端的1-2个氨基酸,例如CCP3包含DAF的氨基酸163至222或由组成。
在一些实施方案中,CCP3包含SEQ ID NO:7或8的氨基酸序列,或包含与SEQ IDNO:7或SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%的同一性的氨基酸序列,或由所述序列组成。
SEQ ID NO:7:
KSCPNPGEIRNGQIDVPGGILFGATISFSCNTGYKLFGSTSSFCLISGSSVQWSDPLPECRE
SEQ ID NO:8:
CPNPGEIRNGQIDVPGGILFGATISFSCNTGYKLFGSTSSFCLISGSSVQWSDPLPECRE。
在一些实施方案中,CCP4包含DAF的氨基酸223至285或由其组成。
在一些实施方案中,CCP4包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列,或包含与SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%的统一性的氨基酸序列,或由所述序列组成。
SEQ ID NO:9:
IYCPAPPQIDNGIIQGERDHYGYRQSVTYACNKGFTMIGEHSIYCTVNNDEGEWSGPPPECRG。
在一些实施方案中,CCP3-4包含DAF的氨基酸161至285或氨基酸163至285或由其组成。在一些实施方案中,DAF功能单元CCP3-4包含SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的氨基酸序列,或包含与SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%的统一性的氨基酸序列,或由所述序列组成。
SEQ ID NO:10:人DAF CCP3-4
KSCPNPGEIRNGQIDVPGGILFGATISFSCNTGYKLFGSTSSFCLISGSSVQWSDPLPECREIYCPAPPQIDNGIIQGERDHYGYRQSVTYACNKGFTMIGEHSIYCTVNNDEGEWSGPPPECRG
SEQ ID NO:11:人DAF CCP3-4(CCP3的N末端缺失2个氨基酸)
CPNPGEIRNGQIDVPGGILFGATISFSCNTGYKLFGSTSSFCLISGSSVQWSDPLPECREIYCPAPPQIDNGIIQGERDHYGYRQSVTYACNKGFTMIGEHSIYCTVNNDEGEWSGPPPECRG
当提及DAF的氨基酸位置时,所述氨基酸序列位置对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置。
B.CFH功能单元
在某些实施方案中,本发明的杂合蛋白包含来自CFH的功能单元。这种功能单元能够解离旁路途径C3转化酶C3bBb和/或结合C3b。在优选的实施方案中,CFH功能单元包含CFH的CCP1。
此类CFH的CCP的氨基酸序列可以与CFH的天然或天然存在的氨基酸序列相同。或者,此类CCP的氨基酸序列可以稍微改变,特别是在氨基或羧基末端。当限制酶位点掺入编码CCP的多核苷酸时,就会发生这种改变。当从功能单元的N末端或C末端缺失或添加氨基酸时,也会发生这种改变。
例如,在一些实施方案中,可以在CCP1的C末端缺失1-2个氨基酸。
在一些实施方案中,还可以将CCP1的C末端添加CCP2的1-2个氨基酸用于连接DAF的功能单元,因此,本文所述的“CCP1”涵盖在C末端添加氨基酸(例如CCP2的1-2个氨基酸)的CCP1。例如在DAF的功能单元的N末端缺失1-2个氨基酸的情况下,可以将CCP1的C末端添加1-2个CCP2的氨基酸用于连接DAF的功能单元。在一些实施方案中,DAF的CCP3缺失KS,而CFH的CCP1的C末端添加RP,连接获得杂合蛋白。
还可以在不影响功能活性的情况下引入序列中的一些氨基酸取代,优选地保守取代。保守取代可以是例如带电荷的氨基酸彼此替代或亲水性氨基酸彼此替代、疏水性氨基酸彼此替代和相似质量的氨基酸彼此替代来进行。例如,本发明的CFH的CCP1可以包含V62I突变。
在一个实施方案中,CFH功能单元包含与人CFH蛋白质的CCP 1具有至少95%、96%、97%、98%、99%的同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,CFH功能单元包含人CFH蛋白质的CCP1。
在一些实施方案中,人CFH蛋白质是人天然CFH蛋白质。在一些实施方案中,人天然CFH蛋白质包含如SEQ ID NO:3或5所示的氨基酸序列或由所述序列组成。在一些实施方案中,CFH包含SEQ ID NO:4或6所示的DNA序列所编码的氨基酸序列或由所述序列组成。
在一些实施方案中,CCP1包含CFH的氨基酸19至82或由其组成。在一些实施方案中,CCP1包含CFH的氨基酸19至84或由其组成。
在一些是实施方案中,CFH功能单元包含SEQ ID NO:12、13、14或15的氨基酸序列,或包含与SEQ ID NO:12、13、14或15的氨基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%的同一性的氨基酸序列,或由所述序列组成。
SEQ ID NO:12:人CFH CCP1(CCP1的C末端添加2个CCP2的N末端氨基酸RP)
EDCNELPPRRNTEILTGSWSDQTYPEGTQAIYKCRPGYRSLGNVIMVCRKGEWVALNP LRKCQKRP
SEQ ID NO:13:人CFH CCP1(CCP1)
EDCNELPPRRNTEILTGSWSDQTYPEGTQAIYKCRPGYRSLGNVIMVCRKGEWVALNP LRKCQK
SEQ ID NO:14:人CFH CCP1(CCP1的C末端添加2个CCP2的N末端氨基酸RP且包含V62I)
EDCNELPPRRNTEILTGSWSDQTYPEGTQAIYKCRPGYRSLGNIIMVCRKGEWVALNPL RKCQKRP
SEQ ID NO:15:人CFH CCP1(CCP1包含V62I)
EDCNELPPRRNTEILTGSWSDQTYPEGTQAIYKCRPGYRSLGNIIMVCRKGEWVALNPL RKCQK
当提及CFH的氨基酸位置时,所述氨基酸序列位置对应于SEQ ID NO:3的氨基酸位置。
C.其他单元
任选地,本发明的杂合蛋白可以进一步包括标签,优选约2至10个氨基酸,其被添加到杂合蛋白的氨基或羧基末端,例如羧基末端。通常,进行此类添加以稳定蛋白质或便于杂合蛋白的分泌表达或纯化。此类标签在本领域中是已知的。此类标签的代表性实例包括编码一系列组氨酸残基(例如2-10个组氨酸,例如2、3、4、5、6或7个组氨酸)、表位标签FLAG、单纯疱疹糖蛋白D、β-半乳糖苷酶、麦芽糖结合蛋白或谷胱甘肽S-转移酶的序列。
在一些实施方案中,所述标签是组氨酸残基,其可以添加在杂合蛋白的氨基末端或羧基末端,例如羧基末端。
在一些实施方案中,所述标签是GHHHHHH(SEQ ID NO:16)的6xHis标签。
任选地,本发明的杂合蛋白还可以包含信号肽,例如MGWSCIILFLVATATGVHS(SEQID NO:17)。
本发明还涵盖其中一个或多个氨基酸通过翻译后过程或合成方法改变的杂合蛋白。此类修饰的实例包括但不限于糖基化、碘化、肉豆蔻酰化和聚乙二醇化。
D.杂合蛋白的实例
在一些实施方案中,本发明的杂合蛋白包含至少一个来自CFH的功能单元以及至少一个来自DAF的功能单元。。
在一些实施方案中,本发明的杂合蛋白包含CFH的CCP1和DAF的CCP3和CCP4。在一些实施方案中,本发明的杂合蛋白由CFH的CCP1和DAF的CCP3和CCP4组成。在一些实施方案中,本发明的杂合蛋白包含CFH的CCP1和DAF的CCP3-4,或由其组成。
在一些实施方案中,CFH的CCP1在其C末端添加1-2个氨基酸(例如CCP2的N末端的1-2个氨基酸)。在一些实施方案中,DAF的CCP3或CCP3-4在其N末端缺失1-2个氨基酸。
在一些实施方案中,本发明的杂合蛋白包含CFH的CCP1和DAF的CCP3-4,其中CCP1在其C末端添加CCP2的N末端的1-2个氨基酸且DAF的CCP3在其N末端相应的缺失1-2个氨基酸。在一些具体的实施方案中,本发明的杂合蛋白包含CFH的CCP1和DAF的CCP3-4,其中CCP1在其C末端添加CCP2的N末端的氨基酸RP且DAF的CCP3在其N末端相应的缺失氨基酸KS。
在一些实施方案中,本发明的CFH的CCP1可以包含V62I突变。
在一些实施方案中,本发明的杂合蛋白还在其N末端包含信号肽,例如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列,和/或在其C末端包含标签,例如组氨酸标签,例如6×His标签,例如GHHHHHH。
在一些实施方案中,DAF的CCP3包括DAF蛋白的氨基酸161-222或由其组成和/或CCP4包括DAF蛋白的氨基酸223-285或由其组成,其中所述氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1所示的氨基酸位置编号。在一些实施方案中,DAF的CCP3在其N末端缺失2个氨基酸,例如包含DAF蛋白的氨基酸163-222,或由其组成,其中所述氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1所示的氨基酸位置编号。在一些实施方案中,DAF的CCP3-4包含DAF蛋白的氨基酸161-285,或由其组成,其中所述氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1所示的氨基酸位置编号。在一些实施方案中,DAF的CCP3-4在其N末端缺失2个氨基酸,例如包含DAF蛋白的氨基酸163-285,或由其组成,其中所述氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1所示的氨基酸位置编号。
在一些实施方案中,CFH的CCP1包含CFH蛋白的氨基酸19-82或由其组成,其中所述氨基酸位置对应于SEQ ID NO:3所示的氨基酸位置编号。在一些实施方案中,CFH的CCP1包含CFH蛋白的氨基酸19-84或由其组成,其中所述氨基酸位置对应于SEQ ID NO:3所示的氨基酸位置编号。
在一些实施方案中,DAF的CCP3-4包含DAF蛋白的氨基酸161-285,或由其组成,其中所述氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1所示的氨基酸位置编号;且CFH的CCP1包含CFH蛋白的氨基酸19-82或由其组成,其中所述氨基酸位置对应于SEQ ID NO:3所示的氨基酸位置编号。
在一些实施方案中,DAF的CCP3-4包含DAF蛋白的氨基酸163-285,或由其组成,其中所述氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1所示的氨基酸位置编号;且CFH的CCP1包含CFH蛋白的氨基酸19-84,或由其组成,其中所述氨基酸位置对应于SEQ ID NO:3所示的氨基酸位置编号。
在一些具体的实施方案中,DAF是人DAF蛋白,例如人天然DAF蛋白。在一些具体的实施方案中,DAF蛋白包含
(i)SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列,
(ii)SEQ ID NO:2所示的核酸序列所编码的氨基酸序列;
(iii)与(i)或(ii)所示的氨基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%氨基酸序列;
或有所述(i)至(iii)中任一项所示的氨基酸序列组成。
在一些具体的实施方案中,CFH是人CFH蛋白,例如人天然CFH蛋白。在一些具体的实施方案中,CFH蛋白包含
(i)SEQ ID NO:3或5所示的氨基酸序列,
(ii)SEQ ID NO:4或6所示的核酸序列所编码的氨基酸序列;
(iii)与(i)或(ii)所示的氨基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%氨基酸序列;
或有所述(i)至(iii)中任一项所示的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中,本发明的杂合蛋白包含SEQ ID NO:18-21中任一项的氨基酸序列,或包含与所述氨基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%氨基酸序列,或由其组成。
>人CFH CCP1或SCR1-人DAF/CD55 CCP3-4或SCR3-4(黑体):
>人CFH CCP1或SCR1-人DAF/CD55 CCP3-4或SCR3-4(黑体),包含V62I突变:
在一些实施方案中,本发明的杂合蛋白包含SEQ ID NO:22-25中任一项的氨基酸序列,或包含与所述氨基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%氨基酸序列,或由其组成。
>人CFH CCP1或SCR1-人DAF/CD55 CCP3-4或SCR3-4(黑体)-6×His(斜体):
>人CFH CCP1或SCR1-人DAF/CD55 CCP3-4或SCR3-4(黑体)-6×His(斜体),包含V62I突变:
在一些实施方案中,本发明的杂合蛋白包含SEQ ID NO:26-29中任一项的氨基酸序列,或包含与所述氨基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%氨基酸序列,或由其组成。
>信号肽-人CFH CCP1或SCR1-人DAF/CD55 CCP3-4或SCR3-4(黑体)-6×His(斜体):
>信号肽-人CFH CCP1或SCR1-人DAF/CD55 CCP3-4或SCR3-4(黑体)-6×His(斜体):
包含V62I突变:
在一些实施方案中,本发明的杂合蛋白包含SEQ ID NO:30-33中任一项的氨基酸序列,或包含与所述氨基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%氨基酸序列,或由其组成。
>信号肽-人CFH CCP1或SCR1-人DAF/CD55 CCP3-4或SCR3-4(黑体):
>信号肽-人CFH CCP1或SCR1-人DAF/CD55 CCP3-4或SCR3-4(黑体):
包含V62I突变:
III.抗C5抗体
本发明一方面提供一种C5抗体,其具有更长时间的体内药效。
在一些实施方案中,本发明的抗C5抗体或其抗原结合片段在酸性条件下较中性条件与C5的解离更快。在一些实施方案中,本发明的抗C5抗体或其抗原结合片段具有pH依赖的抗原结合特性,例如其在偏酸性条件下(~pH5.4-6.0)具有较弱的抗体结合抗原的能力,或者解离更快。在一些实施方案中,本发明的抗C5抗体或其抗原结合片段具有延长的抗体药物体内半衰期。
在一些实施方案中,本发明的C5抗体能够有效抑制人补体经典途径或人补体旁路途径(例如抑制其所述途径的溶血)。在一些实施方案中,本发明的C5抗体能有效抑制人补体经典途径和人补体旁路途径(例如抑制其所述途径的溶血)。在一些实施方案中,本发明的C5抗体具有持久抑制人补体经典途径或人补体旁路途径的活性(例如抑制其所述途径的溶血)。在一些实施方案中,本发明的C5抗体具有持久抑制人补体经典途径和人补体旁路途径的活性(例如抑制其所述途径的溶血)。
在一些实施方案中,本发明的C5抗体,具有pH依赖的抗原结合特异性。在一些实施方案中,所述抗C5抗体在偏酸性条件的pH下结合抗原的能力减弱(即解离速率更快),例如所述pH小于大约7、6.5、或6,例如所述pH在大约4-7.0、4.5-6.5或4.5-6.0之间。在一些实施方案中,所述抗体具有延长的药物半衰期,例如具有延长的抗体药物体内半衰期。
在一些实施方案中,所述抗体具有增加的稳定性。
在一些实施方案中,本发明的抗C5抗体或其抗原结合片段包含3个来自重链可变区的互补决定区(HCDR),HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在一些实施方案中,本发明的抗C5抗体或其抗原结合片段包含3个来自轻链可变区的互补决定区(LCDR),LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中,本发明的抗C5抗体或其抗原结合片段包含3个来自重链可变区的互补决定区(HCDR)和3个来自轻链可变区的互补决定区(LCDR)。
在一些方面中,本发明的抗C5抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)。在一些方面中,本发明的抗C5抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区(VH)。在一些方面中,本发明的抗C5抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。在一些实施方案中,所述重链可变区包含3个来自重链可变区的互补决定区(CDR),HCDR1、HCDR2和HCDR3。在一些实施方案中,所述轻链可变区包含3个来自轻链可变区的互补决定区(CDR),LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中,本发明的抗C5抗体或其抗原结合片段还包含抗体重链恒定区HC。在一些实施方案中,本发明抗C5抗体或其抗原结合片段还包含抗体轻链恒定区LC。在一些实施方案中,本发明抗C5抗体或其抗原结合片段还包含重链恒定区HC和轻链恒定区LC。
在一些实施方案中,本发明的抗C5抗体的重链可变区
(i)包含与SEQ ID NO:39的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成;或者
(ii)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成;或者
(iii)包含与SEQ ID NO:39的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个,更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换,更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列由所述氨基酸序列组成,优选地,所述氨基酸改变不发生在CDR区中。
在一些实施方案中,本发明的抗C5抗体的轻链可变区
(i)包含与SEQ ID NO:45的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成;或者
(ii)包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成;或者
(iii)包含与SEQ ID NO:45的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个,更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换,更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列由所述氨基酸序列组成,优选地,所述氨基酸改变不发生在CDR区中。
在一些实施方案中,本发明的抗C5抗体3个来自重链可变区的互补决定区(HCDR),HCDR1、HCDR2和HCDR3选自
(i)如SEQ ID NO:39中所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3,或
(ii)相对于(i)中任一项的序列,在所述三个HCDR区上共包含至少一个且不超过5、4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸置换,优选保守置换)的序列,
例如所述CDR通过Chothia方案确定。
在一些实施方案中,本发明的抗C5抗体3个来自轻链可变区的互补决定区(LCDR),LCDR1、LCDR2和LCDR3选自
(i)如SEQ ID NO:45中所示的VL中所含的三个互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3,或
(ii)相对于(i)中任一项的序列,在所述三个LCDR区上共包含至少一个且不超过5、4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸置换,优选保守置换)的序列,
例如所述CDR通过Chothia方案确定。
在一些实施方案中,HCDR1包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列,或由所述氨基酸序列组成,或者HCDR1包含与SEQ ID NO:40的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换,优选保守置换)的氨基酸序列。
在一些实施方案中,HCDR2包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列,或由所述氨基酸序列组成,或者HCDR2包含与SEQ ID NO:41的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换,优选保守置换)的氨基酸序列。
在一些实施方案中,HCDR3包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列,或由所述氨基酸序列组成,或者HCDR3包含与SEQ ID NO:42的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换,优选保守置换)的氨基酸序列。
在一些实施方案中,LCDR1包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列,或由所述氨基酸序列组成,或者LCDR1包含与SEQ ID NO:46的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换,优选保守置换)的氨基酸序列。
在一些实施方案中,LCDR2包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列,或由所述氨基酸序列组成,或者LCDR2包含与SEQ ID NO:47的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换,优选保守置换)的氨基酸序列。
在一些实施方案中,LCDR3包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列,或由所述氨基酸序列组成,或者LCDR3包含与SEQ ID NO:48的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换,优选保守置换)的氨基酸序列。
在本发明的一些具体实施方案中,本发明的抗C5抗体或其抗原结合片段包含VH和VL,其中所述VH含有SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成,和所述VL含有SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
在本发明的一些具体实施方案中,本发明的抗C5抗体或其抗原结合片段包含含有或由SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列组成的HCDR1、含有或由SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列组成的HCDR2、含有或由SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列组成的HCDR3;含有或由SEQID NO:46所示的氨基酸序列组成的LCDR1、含有或由SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列组成的LCDR2和含有或由SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列组成的LCDR3。
在本发明的一些具体实施方案中,本发明的抗C5抗体或其抗原结合片段包含VH和VL,其中VH包含如SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成,且VL包含如SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
在本发明的一些实施方案中,本发明的抗C5抗体或其抗原结合片段包含重链恒定区。在一些实施方案中,所述重链恒定区来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4,优选是IgG2的重链恒定区或IgG4的重链恒定区,或是IgG2/IgG4杂合型的重链恒定区(例如CH1、铰链区和部分CH2来自IgG2,且部分CH2和CH3区来自IgG4,例如C5抗体药物Soliris和Ultomiris的重链恒定区)。在一些实施方案中,所述重链恒定区
(i)包含与SEQ ID NO:43的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成;或者
(ii)包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成;或者
(iii)包含与SEQ ID NO:43的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个,更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换,更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列由所述氨基酸序列组成。
在本发明的一些实施方案中,本发明的抗C5抗体或其抗原结合片段包含轻链恒定区。在一些实施方案中,本发明的抗C5抗体的轻链恒定区为lambda或kappa轻链恒定区,例如Kapppa轻链恒定区。在一些实施方案中,所述轻链恒定区
(i)包含与SEQ ID NO:49的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成;或者
(ii)包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成;或者
(iii)包含与SEQ ID NO:49的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个,更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换,更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列由所述氨基酸序列组成。
在本发明的一些实施方案中,本发明的抗C5抗体或其抗原结合片段包含重链。在本发明的一些实施方案中,本发明的抗C5抗体或其抗原结合片段包含轻链。在本发明的一些实施方案中,本发明的抗C5抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链。
在一些具体的实施方案中,抗C5抗体的重链
(i)包含与SEQ ID NO:44的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成;或者
(ii)包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成;或者
(iii)包含与SEQ ID NO:44的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个,更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换,更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列由所述氨基酸序列组成,优选地,所述氨基酸改变不发生在CDR区中,优选地,所述氨基酸改变不发生在重链可变区。
在一些具体的实施方案中,抗C5抗体的轻链
(i)包含与SEQ ID NO:50的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成;或者
(ii)包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成;或者
(iii)包含与SEQ ID NO:50的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个,更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换,更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列由所述氨基酸序列组成,优选地,所述氨基酸改变不发生在CDR区中,优选地,所述氨基酸改变不发生在轻链可变区。
在一些具体的实施方案中,抗C5抗体包含重链和轻链,其中所述重链包含SEQ IDNO:44所示的氨基酸序列,或与所述氨基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列,或由所述氨基酸序列组成,且所述轻链包含SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列,或与所述氨基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列,或由所述氨基酸序列组成。
在一些具体的实施方案中,抗C5抗体包含重链和轻链,其中所述重链包含SEQ IDNO:44所示的氨基酸序列,或由所述氨基酸序列组成,且所述轻链包含SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列,或由所述氨基酸序列组成。
在本发明的一个实施方案中,本文所述的抗C5抗体的氨基酸改变包括氨基酸的置换、插入或缺失。在优选的实施方案中,本发明所述的氨基酸改变发生在CDR外的区域(例如在FR中)。更优选地,本发明所述的氨基酸改变发生在重链可变区外和/或轻链可变区外的区域。优选的,本文所述的氨基酸改变为氨基酸置换,优选地保守置换。
在一些实施方案中,本发明的抗C5抗体或其抗原结合片段具有以下一个或多个特性:
(i)显示与本发明抗体对C5相同或相似的结合亲和力和/或特异性;
(ii)抑制(例如,竞争性抑制)本发明抗体与C5的结合;
(iii)与本发明抗体结合相同或重叠的表位;
(iv)与本发明抗体竞争结合C5;
(v)具有本发明抗体的一个或多个生物学特性。
在一些实施方案中,本发明的抗C5抗体是IgG1形式的抗体或IgG2形式的抗体或IgG3形式的抗体或IgG4形式的抗体,例如,为IgG1形式的抗体。在一些实施方案中,本发明的抗C5抗体的轻链恒定区为lambda或kappa轻链恒定区,例如Kapppa轻链恒定区。
在一些实施方案中,抗C5抗体是单克隆抗体。
在一些实施方案中,抗C5抗体是人源化的。
在一些实施方案中,抗C5抗体是嵌合抗体。
在一个实施方案中,本发明的抗C5抗体还涵盖其抗体片段(例如抗原结合片段),优选地选自以下的抗体片段:Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、单链抗体(例如scFv)、(Fab’)2、单结构域抗体例如VHH、dAb(domain antibody)或线性抗体。
IV.融合蛋白
在一些实施方案中,本发明还涉及一种融合蛋白,其包含抗C5抗体或其抗原结合片段,以及本发明的杂合蛋白。
在一些实施方案中,所述融合蛋白包含抗C5抗体或其抗原结合片段和杂合蛋白,其中所述一个或多个杂合蛋白(在其N末端或在其C末端)分别与抗C5抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链的N末端和/或C末端连接,通过或不通过接头。
在一些实施方案中,所述融合蛋白包含抗C5抗体或其抗原结合片段和杂合蛋白,其中所述一个或两个杂合蛋白(例如在其N末端)分别与抗C5抗体或其抗原结合片段的重链的C末端连接。
在一些实施方案中,所述融合蛋白包含全长抗C5抗体。
在一些实施方案中,在所述融合蛋白中,抗C5抗体或其抗原结合片段与杂合蛋白通过接头或不通过接头连接。在一些实施方案中,所述接头选自一个或几个甘氨酸(G)n、GS、GnS、GnSn、(GnS)n或者(GSG)n或(G4S)n,其中n是等于或大于1的整数,例如,n是2,3,4,5,6或7的整数。在一些实施方案中,所述接头为G、GSG或G4S。
在一些实施方案中,适用于本发明融合蛋白的抗C5抗体或其抗原结合片段可以是任何抗C5抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中,抗C5抗体或其抗原结合片段是特异性结合C5的抗体或其抗原结合片段,例如CN113754763A中公开的抗C5抗体或其抗原结合片段,或Eculizumab、Ravulizumab、Pozelimab、Crovalimab、Tesidolumab或其抗原结合片段。在一些实施方案中,抗C5抗体或其抗原结合片段包含特异性结合C5的抗体例如CN113754763A中公开的抗C5抗体、Eculizumab、Ravulizumab、Pozelimab、Crovalimab或Tesidolumab的1、2、3、4、5、或6个CDR。在一些实施方案中,抗C5抗体或其抗原结合片段包含特异性结合C5的抗体例如CN113754763A中公开的抗C5抗体、Eculizumab、Ravulizumab、Pozelimab、Tesidolumab或Crovalimab的1、2和3个重链可变区CDR,即HCDR1、HCDR2和HCDR3。在一些实施方案中,抗C5抗体或其抗原结合片段包含特异性结合C5的抗体例如CN113754763A中公开的抗C5抗体、Eculizumab、Ravulizumab、Pozelimab、Tesidolumab或Crovalimab的1、2和3个轻链可变区CDR,即LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些实施方案中,抗C5抗体或其抗原结合片段包含特异性结合C5的抗体例如CN113754763A中公开的抗C5抗体、Eculizumab、Ravulizumab、Pozelimab、Tesidolumab或Crovalimab的3个重链可变区CDR和3个轻链可变区CDR。在一些实施方案中,抗C5抗体或其抗原结合片段包含特异性结合C5的抗体例如CN113754763A中公开的抗C5抗体、Eculizumab、Ravulizumab、Pozelimab、Tesidolumab或Crovalimab的重链可变区。在一些实施方案中,抗C5抗体或其抗原结合片段包含已知的特异性结合C5的抗体例如CN113754763A中公开的抗C5抗体、Eculizumab、Ravulizumab、Pozelimab、Tesidolumab或Crovalimab的轻链可变区。在一些实施方案中,抗C5抗体或其抗原结合片段包含特异性结合C5的抗体例如CN113754763A中公开的抗C5抗体、Eculizumab、Ravulizumab、Pozelimab、Tesidolumab或Crovalimab的重链可变区和轻链可变区。在一些实施方案中,抗C5抗体或其抗原结合片段包含特异性结合C5的抗体例如CN113754763A中公开的抗C5抗体、Eculizumab、Ravulizumab、Pozelimab、Tesidolumab或Crovalimab的重链。在一些实施方案中,抗C5抗体或其抗原结合片段包含特异性结合C5的抗体例如CN113754763A中公开的抗C5抗体、Eculizumab、Ravulizumab、Pozelimab、Tesidolumab或Crovalimab的轻链。在一些实施方案中,抗C5抗体或其抗原结合片段包含特异性结合C5的抗体例如CN113754763A中公开的抗C5抗体、Eculizumab、Ravulizumab、Pozelimab、Tesidolumab或Crovalimab的重链和轻链。
在一些实施方案中,抗C5抗体是第III部分描述的抗C5抗体。
在一些实施方案中,抗C5抗体或其抗原结合片段或融合蛋白包含Fc区。在一些实施方案中,所述融合蛋白包含Fc区二聚化形成的二聚Fc。在一些实施方案中,第一和第二Fc区相同。在另一些实施方案中,第一Fc区和第二Fc区不同,两者配对并异二聚化。在一些实施方案中,所述融合蛋白的Fc区在其C末端连接本发明的杂合蛋白(例如其N末端),例如第一Fc区和/或第二Fc区与本发明的杂合蛋白经由或不经由接头连接。
适用于抗C5抗体或融合蛋白的Fc区片段可以是任何抗体Fc区。Fc区可以包括天然序列Fc区和变体Fc区。天然序列Fc结构域涵盖天然存在的各种免疫球蛋白Fc序列,例如各种Ig亚型以及其同种异型的Fc区(Gestur Vidarsson等,IgG subclasses and allotypes:from structure to effector functions,20October 2014,doi:10.3389/fimmu.2014.00520.)。例如,本发明抗体的Fc区可以包含两个或三个恒定结构域,即CH2结构域、CH3结构域和可选的CH4结构域。在一些实施方案中,抗体Fc区还可以在N端带有IgG铰链区或部分IgG铰链区,例如,IgG1铰链区或部分IgG1铰链区。在所述铰链区中可以含有突变。在一些实施方案中,铰链区可以是EPKSS或EPKSC。
优选地,本发明抗体或融合蛋白的Fc区从N端到C端包含:CH2-CH3,或从N端到C端包含:铰链区-CH2-CH3。在一些实施方案中,适用于本发明抗体或融合蛋白的Fc区为人的IgG Fc,例如,人IgG1 Fc,人IgG2 Fc,人IgG3或人IgG4 Fc,例如人IgG2或人IgG4Fc区,或人IgG2/IgG4杂合型Fc区(例如部分CH2来自IgG2,部分CH2和CH3来自IgG4,例如C5抗体药物Soliris和Ultomiris的Fc区)。
可以将本发明的抗体或融合蛋白中的Fc区进行突变以获得所需的特性。本领域已知对Fc区的突变。
在一个实施方案中,所述Fc区包含增加抗体稳定性,特别是IgG4型抗体稳定性的突变,例如S228P。
在一个实施方案中,在Fc区的效应子功能(例如Fc区的补体激活功能)的特性上修饰Fc区。在一个实施方案中,所述效应子功能相对于野生同种型Fc区已经被降低或消除。在一个实施方案中,通过选自以下的方法来降低或消除效应子功能:使用天然具有降低或消除的效应子功能的Fc同种型、和Fc区修饰。
在一个优选的实施方案中,Fc区具有减少的由Fc区介导的效应子功能,例如减少的或消除的ADCC或ADCP或CDC效应子功能,例如包含实现上述功能的突变。
如本领域技术人员理解的,根据本发明抗体分子的预期用途,本发明抗体分子也可以在Fc结构域中包含改变对一种或多种Fc受体的结合亲和力的修饰。在一个实施方案中,所述Fc受体是Fcγ受体,特别地是人Fcγ受体。
在一些实施方案中,所述Fc区包含降低与Fcγ受体结合的突变。例如,在一些实施方案中,用于本发明的Fc区具有降低与Fcγ受体结合的L234A/L235A突变(LALA突变)。
在一个实施方案中,所述Fc区包含延长抗体半衰期(例如体内半衰期)的突变,例如所述Fc区包含增加与FcRn受体结合的突变。例如,在一些实施方案中,用于本发明的Fc区具有用于增加与FcRn受体结合的突变,例如YTE突变(M252Y/S254T/T256E)、LA突变(M428L/N434A)或LS突变(M428L/N434S)中的一个或多个。在一些实施方案中,用于本发明的Fc区具有降低与Fcγ受体结合的LA突变、YTE突变和LS突变。
在一个实施方案中,Fc区包含氨基酸序列SEQ ID NO:59或与其具有至少90%同一性,例如95%,96%,97%,99%或更高的同一性的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中,包含增加与Fcγ受体结合的突变的Fc区包含与SEQ ID NO:59具有至少90%同一性,例如95%,96%,97%,99%或更高的同一性的氨基酸序列且包含M428L和N434A。
在一些实施方案中,适用于本发明的Fc区包含与SEQ ID NO:59具有至少至少90%同一性,例如95%,96%,97%,99%或更高的同一性的氨基酸序列且包含S228P、M428L和N434A突变。
在Fc区不同的情况下,可以在本发明融合蛋白所包含的Fc区中包含利于异二聚化的突变。在一个实施方案中,在两个Fc区的CH3区中引入突变。本领域已知促进Fc区异二聚化的方法。例如,第一Fc区的CH3区和第二Fc区的CH3区以互补方式进行工程化改造使得每个CH3区(或包含它的重链)不再能与其自身同二聚化但被迫与互补工程化改造的其它CH3区异二聚化(使得第一和第二CH3区异二聚化且两个第一CH3区或两个第二CH3区之间不形成同二聚体)。优选地,基于结入扣(Knob-in-Hole)技术,在第一单体Fc区和第二单体Fc区中分别引入相应的结(knob)突变和扣(Hole)突变。此技术参见例如Merchant,A.M.,et al.(1998)."An efficient route to human bispecific IgG."Nat Biotechnol 16(7):677-681。
在本发明的一些实施方案中,本发明提供了一种融合蛋白,其包含全长抗C5抗体和杂合蛋白,其中杂合蛋白与抗C5抗体连接(经由或不经由接头)。
在本发明的一些实施方案中,本发明提供了一种融合蛋白,其包含全长抗C5抗体和杂合蛋白,其中杂合蛋白与抗C5抗体重链在其C末端或N末端连接(经由或不经由接头)。
在本发明的一些实施方案中,本发明提供了一种融合蛋白,其包含全长抗C5抗体和杂合蛋白,其中
所述抗C5抗体在其Fc区的C末端与杂合蛋白的N末端连接构成融合蛋白的重链(经由或不经由接头);
所述抗C5抗体的轻链构成融合蛋白的轻链;
例如,所述接头选自一个或几个甘氨酸(G)n、GS、GnS、GnSn、(GnS)n或者(GSG)n或(G4S)n,其中n是等于或大于1的整数,例如,n是2,3,4,5,6或7的整数,例如,所述接头为G、GSG或G4S。
在一些实施方案中,所述融合蛋白包含两条重链和两条轻链。
在一些实施方案中,所述融合蛋白的重链包含SEQ ID NO:54、55、56、57或58所示的氨基酸序列,或与所述氨基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的氨基酸序列,或由所述序列组成。
在一些实施方案中,所述融合蛋白的轻链包含SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列,或与所述氨基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的氨基酸序列,或由所述序列组成。
在一些实施方案中,所述融合蛋白包含重链和轻链,其中重链包含SEQ ID NO:54、55、56、57或58所示的氨基酸序列,或与所述氨基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的氨基酸序列,或由所述序列组成,且所述轻链包含SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列,或与所述氨基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的氨基酸序列,或由所述序列组成。
在一些实施方案中,所述融合蛋白包含重链和轻链,其中重链包含SEQ ID NO:54、55、56、57或58所示的氨基酸序列或由其组成,其所述轻链包含SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中,本发明的融合蛋白还在包含信号肽(例如在其N末端,例如重链N末端),例如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列。
在一个方面中,本发明还提供了包含本发明的分子(抗C5抗体或其抗原结合片段或其融合蛋白)的免疫缀合物,其中本发明的分子与其他活性剂(例如抗溶血药物)或标记缀合形成免疫缀合物。
V.多核苷酸、载体和宿主
本发明提供编码以上任何本发明分子(抗C5抗体或其抗原结合片段或其融合蛋白)的核酸。还提供包含所述核酸的载体。在一个实施方案中,载体是表达载体(例如pCDNA载体,例如pCDNA3.1)。还提供包含所述核酸或所述载体的宿主细胞。在一个实施方案中,宿主细胞是真核的。在另一个实施方案中,宿主细胞选自酵母细胞、哺乳动物细胞(例如CHO细胞或293细胞,例如293FT或Expi293细胞)。在另一个实施方案中,宿主细胞是原核的。
在一方面,本发明提供编码以上任何抗C5抗体或其抗原结合片段或其融合蛋白的核酸。
为了便于生产和纯化,抗C5抗体或其抗原结合片段或其融合蛋白可以在N端融合分泌性信号肽,和/或利于纯化的标签肽,如六组氨酸标签或生物素标记。
如本领域技术人员明了的,因为密码子简并性,每一个抗体或多肽氨基酸序列可以由多种核酸序列编码。
在一些实施方案中,本发明的核酸包含编码选自SEQ ID NO:39、44、45、50、54-58中任一项所示氨基酸序列的核酸,或编码与选自SEQ ID NO:39、44、45、50、54-58中任一项所示的氨基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的氨基酸序列的核酸。
编码本发明分子的核酸序列可以采用本领域熟知的方法,例如通过从头固相DNA合成,或通过PCR扩增而产生。
在一个实施方案中,提供包含本发明核酸的一个或多个载体。在一个实施方案中,载体是表达载体,例如原核表达载体或真核表达载体。载体包括但不限于病毒、质粒、粘粒、λ噬菌体或酵母人工染色体(YAC)。在优选的实施方案,表达载体是pCDNA,例如pCDNA3.1。
在一个实施方案中,提供了包含一种或多种本发明多核苷酸的宿主细胞。在一些实施方案中,提供了包含本发明表达载体的宿主细胞。如本文所用,术语“宿主细胞”指可以工程化以产生本发明的抗体分子的任何种类的细胞系统。适于复制和支持本发明的抗体分子表达的宿主细胞是本领域熟知的。根据需要,这类细胞可以用特定表达载体转染或转导,并且可以培育大量含有载体的细胞用于接种大规模发酵器以获得足够量的本发明分子用于临床应用。合适的宿主细胞包括原核微生物,如大肠杆菌,真核微生物如丝状真菌或酵母,或各种真核细胞,如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、昆虫细胞等。可以使用适于悬浮培养的哺乳动物细胞系。有用的哺乳动物宿主细胞系的例子包括SV40转化的猴肾CV1系(COS-7);人胚肾系(HEK 293或293F细胞或293FT细胞或Expi293细胞)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、猴肾细胞(CV1)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76)、人宫颈癌细胞(HELA)、犬肾细胞(MDCK)、布法罗大鼠肝脏细胞(BRL 3A)、人肺细胞(W138)、人肝脏细胞(Hep G2)、CHO细胞、NSO细胞、骨髓瘤细胞系如YO、NS0、P3X63和Sp2/0等。本领域已知适合产生抗体的哺乳动物宿主细胞系。在一个优选的实施方案中,所述宿主细胞是CHO或HEK293细胞或293FT细胞或Expi293细胞。
V.本发明分子的生产和纯化
再一方面,本发明提供用于生产本发明的分子(抗C5抗体或其抗原结合片段或其融合蛋白)的方法,所述方法包括:在适于表达所述分子的多肽链的条件下培养包含编码所述多肽链的宿主细胞;任选地还包括在适于所述多肽链装配为所述分子的条件下使多肽链装配产生所述分子。
为了重组生产,可以将编码本发明分子的多肽链的多核苷酸插入一个或多个载体中以便进一步在宿主细胞中克隆和/或表达。可以使用本领域技术人员熟知的方法来构建表达载体。表达载体包括但不限于病毒、质粒、粘粒、λ噬菌体或酵母人工染色体(YAC)。一旦已经制备了用于表达的包含本发明的一种或多种多核苷酸的表达载体,则可以将表达载体转染或引入适宜的宿主细胞中。多种技术可以用来实现这个目的,例如,原生质体融合、磷酸钙沉淀、电穿孔、逆转录病毒的转导、病毒转染、基因枪、基于脂质体的转染或其他常规技术。
如本文所述制备的分子可以通过已知的现有技术如高效液相色谱、离子交换层析、凝胶电泳、亲和层析(例如Protein A亲和层析)、大小排阻层析等纯化。用来纯化特定蛋白质的实际条件还取决于如净电荷、疏水性、亲水性等因素,并且这些对本领域技术人员是显而易见的。
可以通过多种熟知分析方法中的任一种方法确定本发明的分子的纯度,所述熟知分析方法包括大小排阻层析、凝胶电泳、高效液相色谱等。可以通过本领域已知的多种测定法,鉴定、筛选或表征本文提供的抗体分子的物理/化学特性和/或生物学活性。
VI.测定法
可以通过本领域中已知的多种测定法对本文中提供的分子(抗C5抗体或其抗原结合片段或其融合蛋白)进行鉴定,筛选,或表征其物理/化学特性和/或生物学活性。
对于本发明分子与人补体C5蛋白的结合或解离性质,可以通过本领域已知的方法,诸如ELISA,Western印迹、ForteBio等,或本文实施例5公开的例示性方法来测定。
对于本发明分子的抑制溶血的作用,可以通过本领域已知的方法,诸如体外试验和/或细胞实验来测量。例如,可以使用溶血实验,例如实施例4所示的方法,并检测分子对补体免疫经典途径和/或补体免疫旁路途径的溶血抑制作用。
VII.药物组合物、药物联合和试剂盒
在一个方面,本发明提供了组合物,例如,药物组合物、药物或制剂,所述组合物包含本发明分子(例如抗C5抗体或其抗原结合片段或其融合蛋白,或免疫缀合物等)。
在一个实施方案中,所述组合物还包含药用辅料,如本领域中已知的药用载体、药用赋形剂,包括缓冲剂。
如本文所用,“药用载体”包括生理上相容的任何和全部溶剂、分散介质、等渗剂和吸收延迟剂等。对于药用辅料的使用及其用途,亦参见“Handbook of PharmaceuticalExcipients”,第八版,R.C.Rowe,P.J.Seskey和S.C.Owen,Pharmaceutical Press,London,Chicago。
本发明的组合物或药物或制剂可以处于多种形式。这些形式例如包括液体、半固体和固体剂型,如液态溶液剂(例如,注射液)、散剂或混悬剂、脂质体剂和栓剂。优选的形式取决于预期的施用模式和治疗用途。
本发明的组合物或药物或制剂还可以除了本发明的一种或多种分子外,包含其它的治疗剂,所述其它的治疗剂是被治疗的特定适应证所需的,优选不会彼此不利的影响活性。因此,在一个实施方案中,组合物或制剂或药物,例如,药物组合物,包含一种或多种本发明分子,以及一种或多种其它治疗剂的组合。
本发明的组合物或药物或制剂可以处于多种形式。这些形式例如包括液体、半固体和固体剂型,如液态溶液剂(例如,注射液)、散剂或混悬剂、脂质体剂和栓剂。本发明的组合物或药物或制剂适于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、直肠、脊髓或表皮施用(例如,通过注射或输注)。优选的形式取决于预期的施用模式和治疗用途。
本发明还提供了药物组合或药物组合产品,其包含本发明的分子(抗C5抗体或其抗原结合片段或其融合蛋白或其免疫缀合物)。任选地,所述药物组合或药物组合产品还包含一种或多种其它治疗剂(例如抗溶血剂)。
本发明还提供了包含所述药物组合的成套药盒,例如所述成套药盒在同一包装内包含:
-含有包含本发明的分子(抗C5抗体或其抗原结合片段或其融合蛋白或其免疫缀合物)的药物组合物的第一容器;
-任选地,还含有包含一种或多种其它治疗剂(例如抗溶血剂)的药物组合物的第二容器(在一些实施方案中,两种或多种其它治疗剂处于相同的容器中,或分别处于不同的容器中)。
VIII.用途和方法
本发明一方面提供了在受试者中预防或治疗补体系统相关疾病或病症的方法,包括向受试者施用有效量的本发明的分子(例如抗C5抗体或其抗原结合片段或其融合蛋白或其免疫缀合物等),或包含其的组合物或药物或制剂。
在一些实施方案中,所述补体系统相关疾病是由于补体系统的异常激活或补体系统失调导致的。在一些实施方案中,补体系统的异常激活或补体系统的失调是由于例如微生物感染或自身免疫抗体的增加,或者是由于补体调节蛋白减少、缺失、失能或功能被干扰、阻断等。在一些实施方案中,所述疾病治疗将受益于抑制补体系统的活性。
在一些实施方案中,所述补体系统相关疾病或病症是补体C5或C3相关疾病或病症。在一些实施方案中,所述受试者中具有(例如升高水平的,例如核酸或蛋白质水平的)补体C5或C3蛋白或C5a或C3a蛋白(例如相比健康受试者)。在一些实施方案中,所述受试者的血液或血细胞中具有(例如升高水平的,例如核酸或蛋白质水平的)补体C5或C3蛋白或C5a或C3a蛋白(例如相比健康受试者的血液或血细胞)。在一些实施方案中,所述疾病治疗将受益于抑制核酸或蛋白质水平的补体C5或C3蛋白或C5a或C3a蛋白。
在一些实施方案中,所述补体相关疾病或病症可以是需要溶血抑制的疾病,例如需要抑制补体免疫经典途径和/或补体免疫旁路途径的溶血的疾病。
在一些实施方案中,所述补体系统相关疾病或病症是需要抑制C3b生成或沉积活性的疾病。
在一些实施方案中,本发明的分子或包含其的组合物或药物或制剂会延迟病症和/或与病症相关的症状的发作。
在一些实施方案中,本发明的分子或包含其的组合物或药物或制剂还能与一种或多种其它疗法例如治疗方式和/或其它治疗剂组合施用,用于本文所述的用途,例如用于预防和/或治疗本文提及的相关疾病或病症。
本发明的分子或包含其的组合物或药物或制剂的施用途径是根据已知方法,例如,注射或输注。
在其他方面,本发明提供本发明的分子或包含其的组合物在生产或制备药物中的用途,所述药物用于本文所述的用途,例如用于预防或治疗本文提及的补体系统相关疾病或病症。
IV.诊断和检测
在某些实施方案中,本文中提供的分子(例如抗C5抗体或其抗原结合片段或其融合蛋白或其免疫缀合物等)可以用于检测补体C5在生物样品中的存在。
术语“检测”用于本文中时,包括定量或定性检测,示例性的检测方法可以涉及免疫组织化学、免疫细胞化学、流式细胞术(例如,FACS)、抗体分子复合的磁珠、ELISA测定法、PCR-技术(例如,RT-PCR)。在某些实施方案中,生物样品是体液。
在某些实施方案中,所述方法包括将生物样品与如本文所述的分子在允许其与补体C5结合的条件下接触,并检测在该分子和补体C5之间是否形成复合物,其中复合物的形成表示存在补体C5。该方法可以是体外或体内方法。在一个实施方案中,本发明的分子用于选择适合利用针对补体C5的抑制剂(例如针对补体C5的抗体,例如本发明的抗C5抗体或其抗原结合片段或其融合蛋白或其免疫缀合物等)治疗的受试者,例如其中补体C5是用于选择所述受试者的生物标记物。
在某些实施方案中,提供标记的本发明的分子(例如本发明的例如抗C5抗体或其抗原结合片段或其融合蛋白或其免疫缀合物等)。标记包括但不限于,被直接检测的标记或部分(如荧光标记、发色团标记、电子致密标记、化学发光标记和放射性标记),以及被间接检测的部分,如酶或配体,例如,通过酶促反应或分子相互作用。
在一些实施方案中,所述标记例如生物素或His标签等标记物。
在本文中提供的一些实施方案中,样品是在用本发明的分子或包含其的组合物、药物或制剂治疗之前获得的。在一些实施方案中,样品是在用其他疗法之前获得的。在一些实施方案中,样品是在用其他疗法治疗过程中,或者用其他疗法治疗后获得的。
在一些实施方案中,在治疗之前,例如,在起始治疗之前或在治疗间隔后的某次治疗之前检测补体C5。
在一些实施方案中,提供了一种治疗本发明疾病的方法,所述方法包括:对受试者(例如,样品)(例如,受试者样品)检验补体C5的存在,因而确定补体C5值,将补体C5值与对照值(例如正常个体中的值)比较,并且如果补体C5值大于对照值,则向受试者施用治疗有效量的任选与一种或多种其他疗法组合的本发明的分子或包含其的组合物、药物或制剂,因而治疗所述疾病。
实施例
实施例1.杂合蛋白分子构建
为构建本发明涉及的杂合分子和现有技术的补体调节分子的蛋白表达载体,运用常规分子克隆技术的方法,以合成的基因DNA(苏州金唯智生物/上海生工生物合成)为模板,将编码各蛋白的DNA亚克隆至pCDNA3.1表达载体(购自生物风),质粒经测序验证正确后,用于蛋白瞬时表达。各编码蛋白均在N末端加入了信号肽:MGWSCIILFLVATATGVHS和C末端加入GHHHHHH的6xHis标签,方便后续使用哺乳动物细胞分泌表达和镍柱纯化。
各蛋白的氨基酸序列如下:
>CR13m(人CR1 CCP1-3或SCR1-3,包含N29K,S37Y,G79D和D109N突变,序列来源于专利US9988611_B2):SEQ ID NO:34
QCNAPEWLPFARPTNLTDEFEFPIGTYLKYECRPGYYGRPFSIICLKNSVWTGAKDRCRRKSCRNPPDPVN
GMVHVIKDIQFGSQIKYSCTKGYRLIGSSSATCIISGNTVIWDNETPICDRIPCGLPPTITNGDFISTNRENFH
YGSVVTYRCNPGSGGRKVFELVGEPSIYCTSNDDQVGIWSGPAPQCIGHHHHHH
>D24(人DAF/CD55 CCP2-4或SCR2-4,序列参考Hui-fen Zhang等THE JOURNAL OFBIOLOGICAL CHEMISTRY,Vol.276,No.29,Issue of July 20,pp.27290-27295,2001):SEQID NO:35
>FH15(人CFH CCP1-5或SCR1-5,包含V62I突变,序列参考Masha Fridkis-Hareli等Blood.2011Oct 27;118(17):4705-4713和Agustín Tortajada等Hum MolGenet.2009September15;18(18):3452-3461):SEQ ID NO:36
EDCNELPPRRNTEILTGSWSDQTYPEGTQAIYKCRPGYRSLGNIIMVCRKGEWVALNPLRKCQKRPCGHPGDTPFGTFTLTGGNVFEYGVKAVYTCNEGYQLLGEINYRECDTDGWTNDIPICEVVKCLPVTAPENGKIVSSAMEPDREYHFGQAVRFVCNSGYKIEGDEEMHCSDDGFWSKEKPKCVEISCKSPDVINGSPISQKIIYKENERFQYKCNMGYEYSERGDAVCTESGWRPLPSCEEKSCDNPYIPNGDYSPLRIKHRTGDEITYQCRNGFYPATRGNTAKCTSTGWIPAPRCTLKPGHHHHHH
>F1D34-1(人CFH CCP1或SCR1-人DAF/CD55 CCP3-4或SCR3-4):SEQ ID NO:22
EDCNELPPRRNTEILTGSWSDQTYPEGTQAIYKCRPGYRSLGNVIMVCRKGEWVALNPLRKCQKRPCPNPGEIRNGQIDVPGGILFGATISFSCNTGYKLFGSTSSFCLISGSSVQWSDPLPECREIYCPAPPQIDNGIIQGERDHYGYRQSVTYACNKGFTMIGEHSIYCTVNNDEGEWSGPPPECRGGHHHHHH
>F1D34-2i(人CFH CCP1或SCR1 -人DAF/CD55 CCP3-4或SCR3-4,包含V62I突变):SEQ ID NO:24
EDCNELPPRRNTEILTGSWSDQTYPEGTQAIYKCRPGYRSLGNIIMVCRKGEWVALNPLRKCQKKSCPNPGEIRNGQIDVPGGILFGATISFSCNTGYKLFGSTSSFCLISGSSVQWSDPLPECREIYCPAPPQIDNGIIQGERDHYGYRQSVTYACNKGFTMIGEHSIYCTVNNDEGEWSGPPPECRGGHHHHHH
>CR15D34(人CR1 CCP15或SCR15 -人DAF/CD55 CCP3-4或SCR3-4):SEQ ID NO:37
>FH13(人CFH CCP1-3或SCR1-3,包含V62I突变,C末端多两个氨基酸用于连接His纯化标签):SEQ ID NO:60
EDCNELPPRRNTEILTGSWSDQTYPEGTQAIYKCRPGYRSLGNIIMVCRKGEWVALNPLRKCQKRPCGHPGDTPFGTFTLTGGNVFEYGVKAVYTCNEGYQLLGEINYRECDTDGWTNDIPICEVVKCLPVTAPENGKIVSSAMEPDREYHFGQAVRFVCNSGYKIEGDEEMHCSDDGFWSKEKPKCVEISGHHHHHH
>D14(人DAF/CD55 CCP1-4或SCR1-4,无前导序列,C末端多两个氨基酸用于连接His纯化标签):SEQ ID NO:61
DCGLPPDVPNAQPALEGRTSFPEDTVITYKCEESFVKIPGEKDSVICLKGSQWSDIEEFCNRSCEVPTRLNSASLKQPYITQNYFPVGTVVEYECRPGYRREPSLSPKLTCLQNLKWSTAVEFCKKKSCPNPGEIRNGQIDVPGGILFGATISFSCNTGYKLFGSTSSFCLISGSSVQWSDPLPECREIYCPAPPQIDNGIIQGERDHYGYRQSVTYACNKGFTMIGEHSIYCTVNNDEGEWSGPPPECRGKSGHHHHHH
实施例2.杂合蛋白表达及纯化
质粒经DH5α菌株(翊圣生物)扩增后,使用NucleoBond Xtra Midi Plus(MACHEREY-NAGEL,详见产品手册)质粒中抽试剂盒制备质粒。制备好的质粒使用PEI(PolyScience)转染Expi293细胞(购自Thermo fisher),瞬时表达蛋白(方法参考V.,等.BMC Biotechnol 13,52,2013.)。收获的上清经镍离子预装柱亲和纯化(GE lifesciences,HisTrap HP,详见产品手册),先用20mM咪唑缓冲液洗杂后再用500mM咪唑缓冲液将蛋白样品洗脱,使用超滤浓缩管(/>Ultra,Merck Millipore)将蛋白样品换液至PBS缓冲液,换液蛋白样品通过0.2μm滤器过滤除菌,使用NanoDrop(Thermofisher)A280法根据理论消光系数进行蛋白定量。/>
实施例3.蛋白纯度检测
SDS-PAGE
各取2.5μg蛋白按比例分别加入含有还原剂和不含还原剂的上样缓冲液(生工生物),加含有还原剂上样缓冲液的样品,经95℃煮沸5分钟,使蛋白充分变性,加不含有还原剂上样缓冲液的样品,不进行热处理。使用10% Precast-GLgel Tris-Glycine电泳预制胶(生工生物),在Tetra电泳系统(BioRad)中进行电泳,完成电泳后,胶使用0.1%考马斯亮蓝染色液进行染色,使用乙醇-冰乙酸溶液进行脱色。
SDS-PAGE电泳结果显示,除D14蛋白条带略有弥散外,其余蛋白条带均较为清晰,说明各蛋白在还原和非还原条件下纯度良好(如图2所示)。另外,由于蛋白还原、变性和修饰状态以及电泳条件的差异,电泳分子量与理论分子量存在一定的差异。
SEC-HPLC
蛋白纯度分析使用尺寸排阻色谱法(SEC),将在PBS中的纯化蛋白样品施加于TSKgel Super SW3000的300×4.6mm,5μm柱(TOSOH)上,使用U3000型HPLC仪器(DIONEX)进行SEC,洗脱是以0.25mL/min流速进行的等度洗脱。所有蛋白质都使用UV检测,在280nm和214nm下测定。使用仪器自带软件进行组分分析。
分析结果显示,杂合蛋白F1D34-1和F1D34-2i在溶液状态下的单体纯度分别达到了92%和95%(图3A/B),单体纯度良好。
实施例4.补体抑制活性检测
4.1补体经典途径(CP)抑制活性检测
本实验通过检测不同浓度待测蛋白,对由正常人血清补体活性引起的溶血素介导的绵羊红细胞溶血的抑制程度,分析并比较各蛋白对补体CP的抑制活性。
实验过程简述如下:
(1)蛋白梯度稀释:用GVB++缓冲液(含Ca2+及Mg2+的明胶弗洛拿缓冲液,货号:25-02080,天恩泽)将蛋白配制成12000nM的溶液,然后进行4倍梯度稀释,一共7个梯度;
(2)血清的稀释:将正常人血清NHS(上海儒百生物)从-70℃冰箱中取出,在4℃下自然解冻后用GVB++缓冲液将血清稀释至4%;
(3)绵羊红细胞的激活:将绵羊红细胞(南京森贝伽生物)用GVB++缓冲液洗涤至上清透明,然后用GVB++缓冲液重悬,向红细胞悬液中1:4000加入溶血素(BM351Y,北京博尔西),在4℃孵育15分钟激活绵羊红细胞,激活后的绵羊红细胞用GVB++洗涤2次后,用GVB++缓冲液重悬;
(4)孵育:将稀释好的蛋白与血清各取25μL于96孔板中混合,然后加入50μL步骤(3)中获得的红细胞悬浮液,使蛋白起始终浓度为3000nM,血清终浓度为1%,充分混匀后将其放在37℃恒温培养箱中孵育1小时,并设置阴性对照(仅含血清)和阳性对照(仅含血清和红细胞);
(5)终止:孵育结束以后,向每个反应孔中加入100μL 20mM EDTA-GVB buffer(GVBE)终止反应;
(6)读值:将96孔板3000rpm离心5分钟,取100μL上清至新的96孔平底板中,在多功能读板机中检测OD405nm处的吸光值,并保存数据;
(7)数据处理:将所得的OD405nm读值代入以下公式计算红细胞溶血抑制率,其计算公式为:
溶血抑制率(%)=(阳性对照读值-实验组读值)/(阳性对照读值-阴性对照读值)*100%
然后以蛋白终浓度为横坐标,溶血抑制率为纵坐标,进行四参数拟合作图,计算蛋白的IC50值。结果见图4。
CP溶血抑制活性实验检测结果显示,CFH与DAF的杂合蛋白F1D34-1和F1D34-2i均具有强效的CP抑制活性,其活性与CR1活性增强片段CR13m和DAF片段D24相当,明显优于CFH片段FH15和DAF片段D14,也远远优于CR1与DAF的杂合蛋白CR15D34,CR15D34仅检测到微弱的CP抑制活性,而CFH片段FH13则基本没有活性(如图4所示)。说明通过结构域杂合获得的杂合蛋白具有优异的CP抑制活性。
4.2补体替代途径(AP)抑制活性检测
本实验通过测定不同浓度待测蛋白,对正常人血清补体活性引起的兔红细胞溶血的抑制程度,分析并比较各蛋白对补体AP的抑制活性。
实验过程简述如下:
(1)蛋白梯度稀释:用GVBMG缓冲液(含Mg2+及EGTA的明胶弗洛拿缓冲液,货号:25-02090,天恩泽)将蛋白配制成28000nM溶液,然后进行4倍梯度稀释,一共7个梯度;
(2)血清的稀释:将正常人血清NHS(上海儒百生物)从-70℃冰箱中取出,在4℃下自然解冻后用GVBMG稀释至60%;
(3)兔红细胞准备:将兔红细胞(南京森贝伽生物)用GVBMG洗涤至上清透明,然后用GVBMG重悬红细胞;
(4)孵育:将稀释好的蛋白与血清各取25μL于96孔板中混合,然后加入50μL步骤(3)中获得的红细胞悬浮液,使蛋白起始终浓度为7000nM,血清终浓度为15%,充分混匀后将其放在37℃恒温培养箱中孵育1小时,并设置阴性对照(仅含血清)和阳性对照(仅含血清和红细胞);
(5)终止:孵育结束以后,向每个反应孔中加入100μL 10mM EDTA-GVB buffer(GVBE)终止反应;
(6)读值:将96孔板3000rpm离心5分钟,取100μL上清至新的96孔平底板中,在多功能读板机中检测OD405nm处的吸光值,并保存数据;
(7)数据处理:将所得的OD405nm读值代入以下公式计算红细胞溶血抑制率,其计算公式为:
溶血抑制率(%)=(阳性对照读值-实验组读值)/(阳性对照读值-阴性对照读值)*100%
然后以蛋白终浓度为横坐标,溶血抑制率为纵坐标,进行四参数拟合作图,计算抗体的IC50值。结果见图5。
AP溶血抑制活性实验检测结果显示,CFH与DAF的杂合蛋白F1D34-1和F1D34-2i均具有强效的AP抑制活性,优于CFH片段FH15、FH13和DAF片段D24、D14,也优于CR1与DAF的杂合蛋白CR15D34以及CR1活性增强片段CR13m(如图5所示)。说明通过结构域杂合获得的杂合蛋白具有更优的AP抑制活性。
4.3补体C3b沉积抑制活性检测
本实验通过检测不同补体调节蛋白抑制人补体激活后C3b在兔红细胞表面的沉积,分析并比较各蛋白对C3b沉积的抑制活性。
实验过程简述如下:
(1)蛋白梯度稀释:用GVBMG缓冲液(含Mg2+及EGTA的明胶弗洛拿缓冲液,货号:25-02090,天恩泽)将蛋白配制成1400nM溶液,然后进行3倍梯度稀释,一共7个梯度;
(2)血清的稀释:为防止补体激活造成兔红细胞溶血破裂,导致无法精确检测C3b在细胞表面的沉积,使用C5去除的正常人血清用于实验。将C5-Dpl NHS(ComplementTechnology)从-70℃冰箱中取出,在4℃下自然解冻后用GVBMG稀释至40%;
(3)兔红细胞准备:将4%兔红细胞(南京森贝伽生物)用GVBMG洗涤至上清透明,然后用GVBMG重悬至细胞密度1x107细胞/mL;
(4)孵育:将稀释好的蛋白与血清各取25μL于96孔板中混合,然后加入50μL步骤(3)中获得的红细胞悬浮液,使蛋白起始终浓度为350nM,血清终浓度为10%,充分混匀后将其放在37℃恒温培养箱中孵育1小时,并设置阴性对照(仅含补体灭活血清和红细胞)和阳性对照(仅含正常血清和红细胞);
(5)终止:孵育结束以后,向每个反应孔中加入100μL 10mM EDTA-GVB buffer(GVBE)终止反应;
(6)检测:将孵育好的细胞用PBS清洗3次后加入荧光素标记的抗人C3b/iC3b抗体进行染色(APC anti-complement C3b/iC3b Antibody,Biolegend),4℃孵育30分钟后将细胞再次清洗3次,使用流式细胞仪(Cytoflex,Beckman)检测各样品APC荧光MFI(平均荧光强度),并保存数据;
(7)数据处理:使用以下公式计算C3b在红细胞表面的沉积率,其计算公式为:
沉积率(%)=实验组MFI值/阳性对照MFI值*100%
然后以蛋白终浓度为横坐标,沉积率为纵坐标,进行四参数拟合作图,计算抗体的IC50值。结果见图6。
C3b沉积的实验检测结果显示,CFH与DAF的杂合蛋白F1D34-1和F1D34-2i均具有强效的C3b沉积抑制活性,优于CFH片段FH15、FH13和DAF片段D24、D14,也优于CR1与DAF的杂合蛋白CR15D34以及CR1活性增强片段CR13m(如图6所示)。说明通过结构域杂合获得的杂合蛋白具有更优的C3b沉积抑制活性。
实施例5:抗C5抗体的制备和活性
5.1抗C5抗体制备
抗人C5抗体经小鼠免疫、杂交瘤筛选获得,并经人源化改造,其序列及制备方法参见CN113754763A(16H46L39am)。
5.2抗C5抗体pH依赖改造
已有的报道表明,具有pH依赖解离特性的分子在内吞体内能够快速与靶分子解离,从而减少靶标介导的清除(TMDD)延长体内半衰期,并且通过“组氨酸替换”可以快速获得具有pH依赖特性的结合分子(Casim A.Sarkar等,Nat Biotechnol.2002Sep;20(9):908-13.doi:10.1038/nbt725;Tomoyuki Igawa等,Nat Biotechnol.2010Nov;28(11):1203-7.doi:10.1038/nbt.1691.)。
经抗体CDR区域“组氨酸替换”筛选,最终获得具有pH依赖解离特性的C5抗体phAb,序列参见表1。
使用ForteBio Octet K2检测抗体pH依赖解离特性,检测流程简述如下:
使用ANTI-HUMAN IgG FC sensor(FORTEBIO,18-5060)在pH中性缓冲液中loading抗体,抗体浓度为10μg/mL,baseline后,结合C5抗原(Complement Technology,A120),抗原浓度为10μg/mL,然后分别在pH7.4缓冲液和pH5.4缓冲液中解离,pH5.4缓冲液可以使用磷酸盐缓冲液或柠檬酸缓冲液调节pH值获得。参数设置为:上样(loading)180s,基线(baseline)60s,结合(association)180s,解离(dissociation)500s。详细方法可以参考ForteBio Octet使用说明。
检测结果如图7所示,相比在pH7.4缓冲液,改造后的C5抗体phAb在pH5.4缓冲液中更快与C5解离。
5.3pH依赖C5抗体体内活性检测
为验证pH依赖C5抗体在动物体内的补体抑制活性,使用人C5转基因小鼠进行检测。具体地,分别采集人C5转基因小鼠(南方模式动物中心)血清,使用ELISA法检测血清中人C5含量,根据血清中人C5含量按照每105μg/mL C5给药1mg C5抗体进行尾静脉注射,其中phAb为本申请具有pH依赖特性的C5抗体,Ab为CN113754763A中公开的16H46L39am,二者均采用相同的人IgG4恒定区序列(带有S228P和LA突变(M428L/N434A))。并在注射前和注射后(1小时,3天,6天,12天,15天,20天和23天)进行血清采集,按照以下流程进行血清补体活性检测:
(1)取1mL鸡红细胞(SBJ-RBC-C003,南京森贝伽生物科技公司)用GVB++(含Ca2+及Mg2+的明胶弗洛拿缓冲液,货号:25-02080,天恩泽)洗3次,重悬后加入抗鸡红细胞抗体(1ug/mL,anti-cRBCs,货号:203-4139,Rockland)4℃孵育15分钟后激活鸡红细胞,离心,用GVB++洗3次,1mL GVB++重悬红细胞。
(2)使用终浓度10% C5去除的人血清(C5-deplet NHS,CompTech)与终浓度6.25%转基因小鼠血清样本混合,稀释液均为GVB++。设置Control 1仅含有血清(ODctrl1)和GVB++,Control 2为注射抗体前的血清样本(ODctrl2),其溶血程度作为100%溶血的对照。
(3)移液30ul激活后的鸡红细胞至血清中,37℃孵育1h。离心后吸取80ul上清在多功能读板机读取OD405。
溶血率(%)=(OD样本-ODctrl1)/(ODctrl2-ODctrl1)x100
检测结果如图8所示,根据检测结果,pH依赖C5抗体phAb具有更持久的补体抑制活性。
表1,抗C5抗体序列
实施例6融合蛋白分子构建、蛋白表达、纯化及纯度分析
6.1分子构建
为构建具有更强补体抑制活性的抗体融合蛋白,将抗C5抗体重链C末端通过或不通过连接肽与杂合蛋白的N末端连接(如图9所示),设计并构建了一系列如下蛋白分子:
表2:融合蛋白分子构建
融合蛋白的轻链为抗C5抗体的轻链SEQ ID NO:50,融合蛋白的重链序列如下:
表3:融合蛋白重链序列
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/>
编码融合蛋白重链和轻链的基因由苏州金唯智生物和南京擎科生物合成,为进行分泌表达,融合蛋白的N端均加入了信号肽,序列为:MGWSCIILFLVATATGVHS(SEQ ID NO:17)。采用标准的分子生物学技术将基因克隆至真核表达载体中(pCDNA3.1,购自淼灵生物),经测序验证正确后使用质粒中提试剂盒(NucleoBond Xtra Midi Plus,MACHEREY-NAGEL)准备质粒(具体流程参见制造商说明书),用于蛋白表达。
6.2蛋白表达、纯化及纯度分析
蛋白表达使用Expi293(购自Thermo fisher)细胞瞬时转染表达,将制备好的重链和轻链质粒使用PEI-MW40000(PolySciences)共转Expi293细胞,瞬时表达所需蛋白,PEI配制及使用方法可参见PolySciences PEI MAX使用说明。Expi293细胞培养及转染流程可参见Thermofisher Expi293表达系统使用说明。瞬时转染后5-7天离心收获细胞上清,上清经0.45μm滤器过滤后准备蛋白纯化。
使用protein A预装柱(GE Lifesciences)纯化瞬时表达的蛋白,使用流程可参见制造商使用说明。收获的洗脱液蛋白样品经透析或超滤换液至PBS缓冲体系,再通过0.22μm滤器将样品过滤除菌,以获得待测试的蛋白样品。使用NanoDropTM分光光度计(ThermoScientific),融合蛋白的理论消光系数对蛋白样品进行定量。
蛋白纯度分析使用尺寸排阻色谱法(SEC),将在PBS中的纯化的样品施加于TSKgelSuperSW3000的300×4.6mm,5μm柱(TOSOH)上。使用U3000型HPLC仪器(DIONEX)进行SEC。所有蛋白质都使用UV检测,在280nm和214nm下测定。洗脱是以0.25mL/min流速进行的等度洗脱。分析结果显示,使用Protein A一步纯化的融合蛋白在溶液状态下的单体纯度良好,单体纯度均大于90%(表4),说明了融合蛋白在溶液状态下作为单体蛋白质的物理均质性。
表4融合蛋白SEC-HPLC纯度
蛋白编号 | 主峰% | HMWS% | LMWS% |
DB395 | 96.9 | 1.5 | 1.5 |
DB476 | 98.6 | 1.4 | ND |
DB620 | 96.8 | 2.1 | 1.1 |
DB621 | 96 | 2.1 | 1.9 |
DB623 | 90.2 | 8.0 | 1.8 |
DB517 | 98.1 | 1.7 | 0.2 |
DB624 | 90.3 | 7.9 | 1.8 |
DB625 | 90.8 | 7.4 | 1.8 |
DB626 | 91.4 | 6.8 | 1.8 |
实施例7融合蛋白补体抑制活性
7.1经典途径(CP)溶血抑制活性
本实验通过检测不同浓度待测融合蛋白对在15%正常人血清中由激活的鸡红细胞引起的补体经典途径溶血的抑制程度,分析并比较各融合蛋白在补体经典途径溶血的抑制活性。
实验过程简述如下:
(1)蛋白梯度稀释:用GVB++缓冲液(含Ca2+及Mg2+的明胶弗洛拿缓冲液,货号:25-02080,天恩泽)将各融合蛋白配制成600nM的溶液,然后进行3倍梯度稀释,一共7个梯度;
(2)血清的稀释:将正常人血清NHS(上海儒百生物)从-70℃冰箱中取出,在4℃下自然解冻后用GVB++缓冲液将血清稀释至25%;
(3)鸡红细胞的激活:将鸡红细胞(SBJ-RBC-C003,南京森贝伽生物)用GVB++缓冲液洗涤至上清透明,然后用GVB++缓冲液等体积重悬,然后向每1ml鸡红细胞中加入0.2μL的抗鸡红细胞抗体(203-4139,Rockland),在4℃孵育15分钟激活鸡红细胞,激活后的鸡红细胞用GVB++洗涤2次后,用GVB++缓冲液重悬;
(4)孵育:将稀释好的蛋白与血清各取25μL于96孔板中混合,然后加入50μL步骤(3)中获得的红细胞悬浮液,使蛋白起始终浓度为150nM,血清终浓度为6.25%,充分混匀后将其放在37℃恒温培养箱中孵育1小时,并设置阴性对照(含灭活血清)和阳性对照(仅含血清和红细胞);
(5)终止:孵育结束以后,向每个反应孔中加入100μL 20mM EDTA-GVB buffer(GVBE)终止反应;
(6)读值:将96孔板3000rpm离心5分钟,取100μL上清至新的96孔平底板中,在多功能读板机中检测OD405nm处的吸光值,并保存数据;
(7)数据处理:将所得的OD405nm读值代入以下公式计算红细胞溶血抑制率,其计算公式为:
溶血抑制率(%)=(阳性对照读值-实验组读值)/(阳性对照读值-阴性对照读值)*100%
然后以蛋白终浓度为横坐标,溶血抑制率为纵坐标,进行四参数拟合作图,计算蛋白的IC50值。结果见图10。
鸡红细胞溶血实验检测结果显示,F1D34系列融合蛋白(DB621、DB623、DB624、DB625和DB626)溶血抑制活性良好,且各组之间差异不大,溶血抑制的IC50达到了5nM左右,但与C15D34融合蛋白DB476和FH1-5融合蛋白DB395相比则显示出了一定的优势,实验结果如图10所示。
7.2替代途径(AP)溶血抑制活性
融合蛋白补体AP抑制活性检测方法同4.2。
融合蛋白终浓度从350nM开始3倍梯度稀释,共7个浓度。
实验结果显示,各融合蛋白均有良好的AP抑制活性,且在高浓度时均能达到完全抑制效果,克服了单独C5抗体无法完全抑制AP活性的问题(如Eculizumab,见图13B,或参见In Vitro Combination Studies of ACH-4471with Eculizumab to Assess a Potential“Switch”Treatment Approach for Paroxysmal Nocturnal Hemoglobinuria.Blood,Volume 130,Supplement 1,2017,Page 2198),显示了融合蛋白的活性优势。
另一方面,F1D34系列融合蛋白的抑制活性基本一致,且与D24融合蛋白活性相当,略好于FH1-5融合蛋白,实验结果如图11所示。
7.3C3b沉积抑制活性
实验方法同4.3,不同之处在于所用蛋白终浓度从700nM进行2倍梯度稀释,共7个浓度。
根据检测结果,F1D34融合蛋白抑制C3b细胞表面沉积的活性明显优于C15D34融合蛋白和D2-4融合蛋白,且均优于FH1-5融合蛋白,实验结果如图12所示。
实施例8融合蛋白补体抑制活性比较
为进一步证明本发明融合蛋白的活性优势,分别选取现有技术补体抑制蛋白C5单克隆抗体Eculizumab和双功能C5抗体FH1-5融合蛋白进行活性比较。Eculizumab序列来源于Recommended INN list R49(2003)由本实验室自行表达(方法同上)或采购自Alexion(Soliris);双功能C5抗体FH1-5融合蛋白FMEH-IgG4PLA-FH1-5序列来源于专利WO2020219922A1由本实验室自行表达(方法同上),蛋白纯度使用SEC-HPLC检测,单体纯度在95%以上。
补体CP和AP抑制活性检测方法同4.1和4.2,不同之处在于:
对于CP抑制检测,血清终浓度为5%,融合蛋白终浓度从150nM开始4倍梯度稀释,共7个浓度;对于AP抑制检测,血清终浓度为10%,融合蛋白终浓度从300nM开始3倍梯度稀释,共7个浓度。
检测结果显示,对于绵羊红细胞的CP溶血抑制,F1D34融合蛋白phAb-GSG-F1D34-2i具有更强的活性,明显优于Eculizumab和FMEH-IgG4PLA-FH1-5,而Eculizumab则优于FMEH-IgG4PLA-FH1-5(如图13A所示);另一方面,对于兔红细胞的AP溶血抑制,F1D34融合蛋白phAb-GSG-F1D34-2i则略好于FMEH-IgG4PLA-FH1-5,二者均优于Eculizumab,且均克服了Eculizumab AP溶血抑制不足的问题(如图13B所示)。
C3b沉积抑制活性比较(Wieslab法)
使用Complement System Alternative Pathway试剂盒(Svar,COMPLAP330RUO),将最终C5b-9(MAC)检测抗体更换为C3b抗体(自行制备,序列参见US2012/0128674 A1中的SEQ ID NO:1和5),以检测补体系统激活后生成的C3b在酶标板底部沉积的情况,以及加入抗体或融合蛋白后对C3b生成或板底表面沉积的影响。
检测流程简述如下:使用试剂盒提供的缓冲液稀释正常人血清(NHS,上海儒百生物)和待测蛋白样品,分别取50μL稀释好的NHS和待测蛋白样品(phAb-GSG-F1D34-2i、Eculizumab和FMEH-IgG4PLA-FH1-5),混匀后加入到试剂盒提供的酶标板中,血清终浓度为5%,待测蛋白样品终浓度为900、300、100、33.33、11.11和3.7nM,同时按说明设置Blank、PC和NC。37℃孵育1小时后,使用wash solution清洗3次,加入终浓度为1μg/mL的鼠源C3b抗体37℃孵育1小时,使用wash solution清洗3次后加入Goat Anti-Mouse IgG-Fc SecondaryAntibody(HRP)(1:2000稀释,义翘神州,SSA006),使用wash solution清洗3次后加入底物显色并终止,使用酶标仪检测OD405nm吸光值,并计算抑制率:
%complement inhibition:[1-(Sample-NC)/(PC-NC)]x100
实验结果显示,F1D34融合蛋白phAb-GSG-F1D34-2i具有更强的活性,明显优于FMEH-IgG4PLA-FH1-5,而Eculizumab则基本没有C3b沉积抑制活性(如图14所示)。
序列表
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Claims (10)
1.抗C5抗体或其抗原结合片段,其包含重链可变区VH的3个CDR,HCDR1、HCDR2和HCDR3,以及轻链可变区VL的3个CDR,LCDR1、LCDR2和LCDR3,其中所述HCDR1、HCDR2和HCDR3为如SEQID NO:39所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3;且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3为如SEQ ID NO:45所示的VL中所含的三个互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3。
2.抗C5抗体或其抗原结合片段,其包含含有或由SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列组成的HCDR1、含有或由SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列组成的HCDR2、含有或由SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列组成的HCDR3;含有或由SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列组成的LCDR1、含有或由SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列组成的LCDR2和含有或由SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列组成的LCDR3。
3.权利要求1或2的抗体或其抗原结合片段,其包含重链可变区VH,其中所述重链可变区
(i)包含与SEQ ID NO:39的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成;或者
(ii)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
4.权利要求1-3中任一项的抗体或其抗原结合片段,其包含轻链可变区VL,其中所述轻链可变区
(i)包含与SEQ ID NO:45的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成;或者
(ii)包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
5.权利要求1或2的抗体或其抗原结合片段,其包含重链可变区VH和轻链可变区VL,其中
所述重链可变区包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成;且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
6.权利要求1或2的抗体或其抗原结合片段,其包含重链可变区VH和轻链可变区VL,其中VH包含如SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成,且VL包含如SEQ IDNO:45所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
7.权利要求1-6中任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其还包含重链恒定区HC,例如,所述抗体重链恒定区HC为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区,优选的IgG2的重链恒定区或IgG4的重链恒定区,或是IgG2/IgG4杂合型的重链恒定区。
8.权利要求7的抗体或其抗原结合片段,所述重链恒定区
(i)包含与SEQ ID NO:43的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成;或者
(ii)包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成;或者
(iii)包含与SEQ ID NO:43的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个,更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换,更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列由所述氨基酸序列组成。
9.权利要求7或8的抗体或其抗原结合片段,其中所述重链恒定区包含增加与FcRn受体结合的突变,例如YTE突变(M252Y/S254T/T256E)、LA突变(M428L/N434A)或LS突变(M428L/N434S)中的一个或多个,优选地包含LA突变;和/或增加抗体稳定性的突变,例如S228P。
10.权利要求1-9中任一项的抗体或其抗原结合片段,其包含轻链恒定区,例如所述轻链恒定区为lambda或kappa轻链恒定区。
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