KR20220002348A - 아이소유제놀로부터의 바닐린의 생합성 - Google Patents

Abstract

본 발명은 아이소유제놀의 생물전환을 통한 바닐린의 생산에 관한 것이다. 생물전환은 세포계(예컨대, 에셰리키아 콜라이 박테리아)에서 또는 세포계 없는 효소 반응 혼합물에서 매개될 수 있다.

Description

아이소유제놀로부터의 바닐린의 생합성

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2019년 4월 29일자로 출원된 미국 특허 가출원 제62/840,284호에 대한 우선권을 주장하며, 이의 내용은 그의 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.

발명의 분야

본 개시내용은 일반적으로 박테리아, 효모 또는 기타 세포계에서, 또는 비세포계에서 아이소유제놀(isoeugenol)의 바닐린(vanillin)으로의 생물전환(bioconversion)을 촉매하는 진균성 아이소유제놀 모노옥시게나제를 이용하기 위한 방법 및 재료에 관한 것이다.

바닐라향은 전세계적으로 가장 빈번하게 사용되는 향료(flavor) 중 일부이다. 이들은 아이스크림, 유제품, 디저트, 제과, 베이커리 제품 및 증류주(spirits)와 같은 많은 식품의 향미료(flavoring)에 사용된다. 이들은 향수, 의약품 및 개인 위생 제품에도 사용된다.

천연 바닐라향은 전통적으로 바닐라 난초(vanilla orchid)의 발효된 꼬투리로부터 얻어져 왔다. 이것은 주로 수확 후에 콩에 존재하는 바닐린 글루코사이드의 가수분해에 의해 콩의 건조 및 발효 과정의 몇 주 동안 형성된다. 바닐라향의 필수 방향 물질은 바닐린(4-하이드록시 3-메톡시벤즈알데하이드)이다.

바닐린(4-하이드록시-3-메톡시벤즈알데하이드)은 가장 일반적인 향미 화학물질 중 하나이고, 식품 및 음료, 향수, 제약 및 의료 산업에서 널리 사용된다. 약 12,000톤의 바닐린이 연간 소비되는데, 그 중 단지 20 내지 50톤만 바닐라 콩에서 추출되고, 나머지는 대부분 구아이아콜 및 리그닌과 같은 석유화학제품으로부터 합성 방식으로 생산된다. 최근 몇 년 동안, 천연 향료에 대한 수요가 증가함에 따라 향료 산업은 생물 전환에 의해 바닐린을 생산하게 되었는데, 이러한 생물전환 제품은 살아있는 세포 및 이들의 효소와 같은 생물학적 공급원으로부터 생산될 때 다양한 규제 및 입법 당국(예컨대, 유럽 공동체 입법)에 의해 천연으로 간주되기 때문에, "천연 제품"으로 판매될 수 있다.

천연 아이소유제놀은 에센셜 오일(essential oil)로부터 추출될 수 있고 효소 전환 또는 미생물 생물전환에 의한 바닐린의 생산에 이용하기 위하여 경제적이다. 아이소유제놀의 전환을 통한 바닐린 생산은, 아스페르길루스 니제르(Aspergillus niger), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 및 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)를 비롯한 많은 미생물에서 광범위하게 보고된 바 있다. 그러나, 이들 미생물에 의해 보고된 역가는 매우 낮아(2 g/ℓ 미만), 산업에서 이 접근법의 실제 응용을 상당히 제한하고 있다. 게다가, 보고된 생물전환 과정은 복합하여, 바닐린 제조 비용을 더욱 증가시킨다.

따라서, 당업계에서는 더 높은 역가 및 전환률로 바닐린을 생산하기 위한 더욱 비용 효율적인 방법에 대한 요구가 있다.

본 발명자들은 바닐린을 생산하는데 사용되던 이미 보고된 아이소유제놀 모노옥시게나제와 매우 낮은 서열 동일성을 갖는 진균성 아이소유제놀 모노옥시게나제를 식별함으로써 전술한 문제를 해소하였다. 식별된 진균성 아이소유제놀 모노옥시게나제(CfIEM)는 아이소유제놀을 바닐린으로 전환시키기 위하여 놀랍게도 높은 활성을 나타내었다. 상기 CfIEM 유전자를 보유하는 발현 플라스미드가 작제되었고, 조작된 숙주 균주가 개발되어, 높은 역가 및 전환률로 아이소유제놀로부터 바닐린을 제조하는데 사용되었다. 상기 CfIEM 유전자에 의해 발현된 재조합 단백질은 또한 단리되고 정제되어, 시험관내에서 아이소유제놀을 바닐린으로 전환시키는데 사용될 수 있다.

따라서, 일 양상에서, 본 개시내용은 바닐린을 생산하는 생물전환 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 혼합물에서 CfIEM 유전자를 발현시키는 단계, 혼합물에 아이소유제놀을 공급하는 단계 및 아이소유제놀을 바닐린으로 전환시키는 단계를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 발현된 CfIEM 유전자는 서열번호 2와 적어도 60% 동일성, 서열번호 2와 적어도 65% 동일성, 서열번호 2와 적어도 70% 동일성, 서열번호 2와 적어도 75% 동일성, 서열번호 2와 적어도 80% 동일성, 서열번호 2와 적어도 85% 동일성, 서열번호 2와 적어도 90% 동일성, 서열번호 2와 적어도 95% 동일성 또는 서열번호 2와 적어도 99% 동일성을 가진 아미노산 서열을 가질 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 발현된 CfIEM 유전자는 서열번호 2와 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다.

다양한 실시형태에서, 생물전환 방법은 시험관내 번역에 의해 CfIEM 유전자를 발현시키는 단계를 포함할 수 있다. 대안적인 실시형태에서, 생물전환 방법은 세포계에서 CfIEM 유전자를 발현시키는 단계를 포함할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 생물전환 방법은 박테리아 또는 효모 세포에서 CfIEM 유전자를 발현시키는 단계를 포함할 수 있다. 생물전환 방법은 CfIEM 유전자를 재조합 단백질로서 발현시키는 단계로부터의 산물을 정제시키는 단계를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 정제된 재조합 단백질은 아이소유제놀을 함유하는 반응 혼합물에 생체촉매(biocatalyst)로서 첨가될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 아이소유제놀은 CfIEM 유전자가 발현되는 혼합물에 직접 공급될 수 있다.

본 명세서에 기재된 생물전환 방법은 혼합물로부터 바닐린을 회수하는 단계를 포함할 수 있다. 바닐린의 회수는 당업계에 공지된 임의의 통상의 단리 또는 정제 방법에 따라서 수행될 수 있다. 상기 방법은, 바닐린의 회수 전에, 또한 혼합물로부터 바이오매스(효소, 세포 물질 등)를 제거하는 단계를 포함할 수 있다.

일 양상에서, 본 개시내용은 단리된 재조합 숙주 세포를 이용해서 바닐린을 생산하는 방법에 관한 것으로, 여기서, 단리된 재조합 숙주 세포는 아이소유제놀 모노옥시게나제를 인코딩할 수 있는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 작제물로 형질전환되었다. 예를 들어, 아이소유제놀 모노옥시게나제는 서열번호 2와 적어도 60% 동일성, 서열번호 2와 적어도 65% 동일성, 서열번호 2와 적어도 70% 동일성, 서열번호 2와 적어도 75% 동일성, 서열번호 2와 적어도 80% 동일성, 서열번호 2와 적어도 85% 동일성, 서열번호 2와 적어도 90% 동일성, 서열번호 2와 적어도 95% 동일성 또는 서열번호 2와 적어도 99% 동일성을 가진 아미노산 서열을 가질 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 아이소유제놀 모노옥시게나제는 서열번호 2와 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 (i) 배지에서 단리된 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계; (ii) 아이소유제놀의 바닐린으로의 생물전환을 개시시키기 위하여 배지에 아이소유제놀을 첨가하는 단계; 및 (iii) 배지로부터 바닐린을 추출하는 단계를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 상기 방법은 (i) 아이소유제놀 모노옥시게나제의 발현을 허용하는 배지에서 단리된 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계; (ii) 아이소유제놀 모노옥시게나제를 단리시키는 단계; (iii) 아이소유제놀을 포함하는 반응 혼합물에 단리된 아이소유제놀 모노옥시게나제를 첨가하는 단계; 및 (iv) 반응 배지로부터 바닐린을 추출하는 단계를 포함할 수 있다.

일 양상에서, 본 개시내용은 아이소유제놀 모노옥시게나제를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 작제물로 형질전환된 단리된 재조합 숙주 세포에 관한 것이며, 여기서 아이소유제놀 모노옥시게나제는 서열번호 2와 적어도 60% 동일성, 서열번호 2와 적어도 65% 동일성, 서열번호 2와 적어도 70% 동일성, 서열번호 2와 적어도 75% 동일성, 서열번호 2와 적어도 80% 동일성, 서열번호 2와 적어도 85% 동일성, 서열번호 2와 적어도 90% 동일성, 서열번호 2와 적어도 95% 동일성 또는 서열번호 2와 적어도 99% 동일성을 가진 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 실시형태에서, 아이소유제놀 모노옥시게나제는 서열번호 2와 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 핵산 작제물은 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 70% 동일한, 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 75% 동일한, 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 80% 동일한, 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한, 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 또는 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 핵산 작제물은 서열번호 1과 동일한 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 단리된 재조합 숙주 세포는 서열번호 5의 단리된 핵산 서열을 함유하는 벡터를 포함할 수 있다. 다양한 실시형태에서, 숙주 세포는 박테리아, 효모, 콜레토트리쿰(Colletotrichum)이 아닌 사상균, 사이아노박테리아, 해조류, 및 식물 세포로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포는 에셰리키아(Escherichia); 살모넬라(Salmonella); 바실러스(Bacillus); 아시네토박터(Acinetobacter); 스트렙토마이세스(Streptomyces); 코리네박테리움(Corynebacterium); 메틸로시누스(Methylosinus); 메틸로모나스(Methylomonas); 로도코커스(Rhodococcus); 슈도모나스(Pseudomonas); 로도박터(Rhodobacter); 시네코시스티스(Synechocystis); 사카로마이세스(Saccharomyces); 자이고 사카로마이세스(ZygoSaccharomyces); 클루이베로마이세스(Kluyveromyces); 칸디다(Candida); 한세눌라(Hansenula); 데바리오마이세스(Debaryomyces); 무코르(Mucor); 피치아(Pichia); 토룰롭시스(Torulopsis); 아스페르길루스(Aspergillus); 아르트로보틀리스(Arthrobotlys); 브레비박테리아(Brevibacteria); 마이크로박테륨(Microbacterium); 아르트로박터(Arthrobacter); 시트로박터(Citrobacter); 클렙시엘라(Klebsiella); 판토에아(Pantoea); 및 클로스트리듐(Clostridium)으로 이루어진 미생물의 군으로부터 선택될 수 있다.

본 명세서에 기재된 방법 및/또는 단리된 재조합 숙주 세포를 이용해서 생산된 바닐린은 수집되어 소모품(consumable product)에 혼입될 수 있다. 예를 들어, 바닐린은 소모품과 혼합될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 바닐린은 소모품에서 바람직한 맛, 향미 또는 감각을 부여, 변형, 상승 또는 증대시키거나, 또는 바람직하지 않은 맛, 향미 또는 감각을 은폐, 변형 또는 최소화하는데 충분한 양으로 소모품에 혼입될 수 있다. 소모품은, 예를 들어, 식품, 식품 성분, 식품 첨가제, 음료, 약물 및 담배로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 바닐린은 소모품에서 바람직한 향기 또는 냄새를 부여, 변형, 상승 또는 증대시키거나, 또는 바람직하지 않은 향기 또는 냄새를 은폐, 변형 또는 최소화하는데 충분한 양으로 소모품에 혼입될 수 있다. 소모품은, 예를 들어, 향수, 화장품, 세면도구, 가정용 바디케어제(home and body care), 세제, 기피제(repellent), 비료, 방향제(air freshener) 및 비누로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 다른 특징 및 이점은, 첨부 도면을 참조하여 취한, 이하의 상세한 설명에서 명확해질 것이다.

도 1은 아이소유제놀의 바닐린으로의 생물전환경로를 도시한다.
도 2는 본 개시내용에 따른 CfIEM-pET21a 작제물의 개략도를 제공한다.
도 3은 본 개시내용에 따른 PpIEM-pET21a 작제물의 개략도를 제공한다.
도 4는 본 개시내용에 따른 pUVAP 플라스미드의 개략도를 제공한다.
도 5는 본 개시내용에 따른 CfIEM-pUVAP 작제물의 개략도를 제공한다.
도 6은 본 개시내용에 따른 PpIEM-pUVAP 작제물의 개략도를 제공한다.
도 7은 SDS-PAGE에 의한 정제된 재조합 단백질인 PpIEM(좌측) 및 CfIEM(우측)의 측정 결과를 도시한 다이어그램이다.
도 8은, PpIEM(상부 패널) 및 변성된 CfIEM(하부 패널)과 비교한, 본 개시내용에 따른 CfIEM(중간 패널)에 의한 아이소유제놀의 바닐린으로의 생물전환을 나타내는 HPLC 크로마토그램을 제공한다.
도 9는, (PpIEM-pUVAP으로 생성된) 이. 콜라이(E. coli) 균주 IEUG-V02-대조군에 비해서 본 개시내용에 따른 (CfIEM-pUVAP로 생성된) 이. 콜라이 균주 IEUG-V02에 의한 바닐린의 생산을 비교한다.
도 10은 본 개시내용에 따른 5-리터 발효기에서 이. 콜라이 균주 IEUG-V02에 의해 기질로서의 아이소유제놀을 이용한 바닐린의 생산을 도시한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태는 문맥이 달리 명확하게 지시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다.

용어 "포함한다(include)", "갖는다" 등이 설명 또는 청구범위에서 사용되는 한, 이러한 용어는 "포함한다(comprise)"가 청구범위에서 이행어로서 사용될 경우 해석되는 것처럼 용어 "포함한다(comprise)"와 유사한 방식으로 포괄적이 되도록 의도된다.

단어 "예시적인"은 예, 사례 또는 예시로서 역할하는 것을 의미하도록 본 명세서에서 사용된다. "예시적인"으로서 본 명세서에 기재된 임의의 실시형태는 반드시 다른 실시형태에 비해서 선호되거나 유리한 것으로 해석되어서는 안된다.

"세포계"는 이소성(ectopic) 단백질의 발현을 위하여 제공되는 임의의 세포이다. 이것에는 박테리아, 효모, 식물 세포 및 동물 세포가 포함된다. 이것은 원핵 세포와 진핵 세포를 둘 다 포함한다. 이것은 리보솜과 같이 세포 성분에 기반한 단백질의 시험관내 발현도 포함한다.

"코딩 서열"은 당업자에게 그의 통상적이면서도 관례적인 의미를 부여하는 것이며, 비제한적으로, 특정 아미노산 서열을 인코딩하는 DNA 서열을 지칭하는 것으로 사용된다.

세포계를 "성장시키는" 또는 "배양하는"은 세포를 증식시키고 분열시키게 하는 적절한 배지를 제공하는 것을 포함한다. 이것은 세포 또는 세포 성분이 번역되어 재조합 단백질을 만들 수 있도록 리소스를 공급하는 것도 포함한다.

"효모"는 진균계 구성원으로서 분류되는 진핵, 단세포 미생물이다. 효모는 다세포 선조로부터 진화한 단세포 유기체이지만, 본 발명에 유용한 일부 종은 가성 균사(pseudo hyphae) 또는 위 균사(false hyphae)로 알려진 연결된 발아 세포의 줄을 형성함으로써 다세포 특징을 전개하는 능력을 갖는 것들이다.

용어 "상보적인"은 당업자에게 통상적이고 관례적인 의미로 주어지며, 비제한적으로 서로 혼성화할 수 있는 뉴클레오타이드 염기 간 관계를 설명하기 위하여 사용된다. 예를 들어, DNA에 관하여, 아데노신은 티민과 상보적이고, 사이토신은 구아닌과 상보적이다. 따라서, 종속 기술은 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 첨부된 서열목록에서 보고된 바와 같은 전체 서열과 상보적인 단리된 핵산 단편도 포함한다.

용어 "핵산" 및 "뉴클레오타이드"는 당업자에게 이의 각각의 통상적이고 관례적인 의미로 주어지며, 비제한적으로 단일쇄 또는 이중쇄 형태의 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 및 이의 중합체를 지칭하기 위하여 사용된다. 구체적으로 제한되지 않는 한, 이 용어는 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 가지며 천연 유래 뉴클레오타이드와 유사한 방식으로 대사되는 천연 뉴클레오타이드의 알려진 유사체를 함유하는 핵산을 포괄한다. 달리 나타내지 않는 한, 특정 핵산 서열은 명시적으로 나타낸 서열뿐만 아니라, 묵시적으로 보존적으로 변형된 서열 또는 이의 축퇴성 변이체(예컨대, 축퇴성 코돈 치환) 및 상보적인 서열 또한 포괄한다.

용어 "단리된"은 당업자에게 통상적이고 관례적인 의미로 주어지는 것으로, 단리된 핵산 또는 단리된 폴리펩타이드의 맥락에서 사용되는 경우, 비제한적으로 인간의 손에 의해, 그 원상태 환경으로부터 벗어나 존재하고 이에 따라 천연 산물이 아닌 핵산 또는 폴리펩타이드를 지칭하기 위하여 사용된다. 단리된 핵산 또는 폴리펩타이드는 정제된 형태로 존재할 수 있거나, 비-원상태 환경에서, 예컨대, 트랜스제닉 숙주 세포에서 존재할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "인큐베이션시키는" 및 "인큐베이션"은 2개 이상의 화학적 또는 생물학적 실체(예컨대, 화학적 화합물 및 효소)를 혼합하고, 이들이 초기 바닐린을 생산하기 위한 바람직한 조건 하에 상호작용하도록 두는 공정을 의미한다.

용어 "축퇴성 변이체"는 하나 이상의 축퇴성 코돈 치환에 의해 참조 핵산 서열과는 상이한 잔기 서열을 갖는 핵산서열을 지칭한다. 축퇴성 코돈 치환은 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 제3 위치가 혼합된 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환되는 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다. 핵산 서열 및 이의 모든 축퇴성 변이체는 동일한 아미노산 또는 폴리펩타이드를 발현할 것이다.

용어 "폴리펩타이드", "단백질" 및 "펩타이드"는 당업자에게 이의 각각의 통상적이고 관례적인 의미로 주어지며; 이러한 3개 용어는 때때로 호환 가능하게 사용되며, 그 크기 또는 기능과 무관하게 비제한적으로 아미노산 또는 아미노산 유사체의 중합체를 나타내기 위하여 사용된다. "단백질"은 종종 상대적으로 큰 폴리펩타이드를 나타내는 데 사용되고 "펩타이드"는 종종 작은 폴리펩타이드를 나타내는 데 사용되지만, 당업계에서 이들 용어의 사용은 중첩되며 상황에 따라 달라진다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "폴리펩타이드"는, 달리 언급되지 않는 한, 펩타이드, 폴리펩타이드 및 단백질을 지칭한다. 용어 "단백질", "폴리펩타이드" 및 "펩타이드"는 폴리뉴클레오타이드 산물을 나타내는 경우 본 명세서에서 호환 가능하게 사용된다. 따라서, 예시적인 폴리펩타이드는 폴리뉴클레오타이드 산물, 천연 발생 단백질, 동족체, 오쏘로그, 파라로그, 단편 및 이의 다른 등가물, 변이체 및 유사체를 포함한다.

참조 폴리펩타이드에 대해 사용되는 경우, 용어 "폴리펩타이드 단편" 및 "단편"은 당업자에게 이의 통상적이고 관례적인 의미로 주어지며, 비제한적으로 아미노산 잔기가 참조 폴리펩타이드 자체에 비해 결실되지만, 잔여 아미노산 서열이 보통 참조 폴리펩타이드에서의 대응 위치와 동일한 폴리펩타이드를 나타내기 위하여 사용된다. 이러한 결실은 참조 폴리펩타이드의 아미노-말단 또는 카복시-말단 또는 대안적으로 둘 다에서 일어날 수 있다.

폴리펩타이드 또는 단백질의 용어 "기능적 단편"은 전장 폴리펩타이드 또는 단백질의 일부이며, 전장 폴리펩타이드 또는 단백질과 실질적으로 동일한 생물학적 활성을 갖거나 실질적으로 동일한 기능을 수행하는(예컨대, 동일한 효소 반응을 수행하는) 펩타이드 단편을 지칭한다.

호환 가능하게 사용되는 용어 "변이체 폴리펩타이드", "변형된 아미노산 서열" 또는 "변형된 폴리펩타이드"는 하나 이상의 아미노산에 의해, 예컨대, 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 및/또는 부가에 의해 참조 폴리펩타이드와는 상이한 아미노산 서열을 나타낸다. 하나의 양상에서, 변이체는 참조 폴리펩타이드의 일부 또는 모든 능력을 보유하는 "기능적 변이체"이다.

용어 "기능적 변이체"는 보존적으로 치환된 변이체를 더 포함한다. 용어 "보존적으로 치환된 변이체"는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환에 의해 참조 펩타이드와는 상이하며 참조 펩타이드의 일부 또는 모든 활성을 유지하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 나타낸다. "보존적 아미노 치환"은 아미노산 잔기의 기능적으로 유사한 잔기로의 치환이다. 보존적 치환의 예는 하나의 비극성(소수성) 잔기, 예컨대, 아이소류신, 발린, 류신 또는 메티오닌의 또 다른 비극성(소수성) 잔기로의 치환; 하나의 하전된 또는 극성(친수성) 잔기의 또 다른 극성(친수성) 잔기, 예컨대, 아르기닌과 라이신 간, 글루타민과 아스파라긴 간, 트레오닌과 세린 간 치환; 하나의 염기성 잔기, 예컨대, 라이신 또는 아르기닌의 또 다른 염기성 잔기로의 치환; 또는 하나의 산성 잔기, 예컨대, 아스파르트산 또는 글루탐산의 또 다른 산성 잔기로의 치환; 또는 하나의 방향족 잔기, 예컨대, 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판의 또 다른 방향족 잔기로의 치환이 포함된다. 이러한 치환은 단백질 또는 폴리펩타이드의 겉보기 분자량 또는 등전점에 대한 효과를 거의 또는 전혀 갖지 않을 것으로 예상된다. 어구 "보존적으로 치환된 변이체"는, 생성 펩타이드가 본 명세서에 기재된 바와 같은 참조 펩타이드의 일부 또는 모든 활성을 유지하는 한, 잔기가 화학적으로 유도체화된 잔기로 대체되는 펩타이드를 또한 포함한다.

주제 기술의 폴리펩타이드에 관한 용어 "변이체"는, 참조 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 및 심지어 100% 동일한 아미노산 서열을 가진 기능적으로 활성인 폴리펩타이드를 더 포함한다.

모든 문법적 형태 및 철자 변형에 있어서의 용어 "상동성(homologous)"은 수퍼 패밀리로부터의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 및 상이한 종으로부터의 상동성 폴리뉴클레오타이드 또는 단백질을 포함하는, "공통 진화 기원"을 보유하는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 간 관계를 나타낸다(Reeck et al., CELL 50:667, 1987). 이러한 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는, 보존된 위치에서의 동일성 백분율 또는 특정 아미노산 또는 모티브의 존재의 관점과 무관하게, 이의 서열 유사성으로 반영되는 서열 상동성을 갖는다. 예를 들어, 2개의 상동성 폴리펩타이드는 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 900 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 및 심지어 100% 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다.

"적합한 조절 서열"은 당업자에게 통상적이고 관례적인 의미로 주어지며, 비제한적으로 코딩 서열의 상류(5' 비-코딩 서열), 코딩 서열 내 또는 하류(3' 비-코딩 서열)에 위치하고 연관된 코딩 서열의 전사, RNA 가공 또는 안정성 또는 번역에 영향을 미치는 뉴클레오타이드 서열을 나타내기 위하여 사용된다. 조절 서열은 프로모터, 번역 리더 서열, 인트론 및 폴리아데닐화 인식 서열을 포함할 수 있다.

"프로모터"는 당업자에게 통상적이고 관례적인 의미로 주어지며 비제한적으로 코딩 서열 또는 기능적 RNA의 발현을 제어할 수 있는 DNA 서열을 나타내기 위하여 사용된다. 일반적으로, 코딩 서열은 프로모터 서열의 3'에 위치한다. 프로모터는 이의 전체가 원상태 유전자로부터 유래될 수 있거나, 자연에서 확인되는 상이한 프로모터로부터 유래되는 상이한 요소로 이루어질 수 있거나, 심지어 합성 DNA 절편을 포함할 수 있다. 당업자라면 상이한 프로모터가 상이한 조직 또는 세포 유형에서 또는 상이한 발달 단계에서 또는 상이한 환경 조건에 반응하여 유전자의 발현을 지시할 수 있음을 이해한다. 유전자가 대부분의 시기에 대부분의 세포 유형에서 발현되도록 유도하는 프로모터는 일반적으로 "구성적 프로모터"로 지칭된다. 대부분의 경우, 조절 서열의 정확한 경계가 완벽하게 정의되지 않았으므로, 상이한 길이의 DNA 단편이 동일한 프로모터 활성을 가질 수 있음이 추가로 인식된다.

용어 "작동 가능하게 연결된"은 하나의 기능이 다른 기능에 의해 영향받도록 하는 단일 핵산 단편 상에서의 핵산 서열의 회합을 나타낸다. 예를 들어, 프로모터는, 해당 코딩 서열(즉, 프로모터의 전사 제어 하에 있는 코딩 서열)의 발현에 영향을 미칠 수 있는 경우, 코딩 서열과 작동 가능하게 연결된 것이다. 코딩 서열은 센스 또는 안티센스 배향으로 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "발현"은, 당업자에게 통상적이고 관례적인 의미로 주어지며, 비제한적으로, 주제 기술의 핵산 단편으로부터 유래되는 센스(mRNA) 또는 안티센스 RNA의 전사 및 안정한 축적을 나타내기 위하여 사용된다. "과발현"은 정상 또는 형질전환되지 않은 유기체에서의 생산 수준을 초과하는 트랜스제닉 또는 재조합 유기체에서의 유전자 산물의 생산을 나타낸다.

"형질전환(transformation)"은 당업자에게 통상적이고 관례적인 의미로 주어지며, 비제한적으로 표적 세포 내로의 폴리뉴클레오타이드의 전달을 지칭하기 위하여 사용된다. 전달된 폴리뉴클레오타이드는 표적 세포의 게놈 또는 염색체 DNA 내로 혼입되어, 유전적으로 안정한 유전을 야기할 수 있거나, 숙주 염색체와 무관하게 복제할 수 있다. 형질전환된 핵산 단편을 함유하는 숙주 유기체는 "트랜스제닉" 또는 "형질전환된" 또는 "재조합"으로 지칭된다.

숙주 세포와 관련하여 본 명세서에서 사용되는 경우, 용어 "형질전환된", "트랜스제닉" 및 "재조합"은 당업자에게 이의 각각의 통상적이고 관례적인 의미로 주어지며, 비제한적으로 이종성 핵산 분자가 도입된 숙주 유기체의 세포, 예컨대, 식물 또는 미생물 세포를 지칭하기 위하여 사용된다. 핵산 분자는 숙주 세포의 게놈 내로 안정적으로 통합될 수 있거나, 또는 핵산 분자는 염색체외 분자로서 존재할 수 있다. 이러한 염색체외 분자는 자가-복제할 수 있다. 형질전환된 세포, 조직 또는 대상체는 형질전환 공정의 최종 산물뿐만 아니라, 이의 트랜스제닉 자손도 포괄하는 것으로 이해된다.

폴리뉴클레오타이드와 관련하여 본 명세서에서 사용되는 경우, 용어 "재조합", "이종성" 및 "외인성"은 당업자에게 이의 통상적이고 관례적인 의미로 주어지며, 비제한적으로 특정 숙주 세포에 대한 외래 출처에서 기인하는, 또는 동일한 출처로부터인 경우, 그 원래 형태로부터 변형된 폴리뉴클레오타이드(예컨대, DNA 서열 또는 유전자)를 지칭하기 위하여 사용된다. 따라서, 숙주 세포 내의 이종성 유전자는 특정 숙주 세포에 내인성이지만, 예를 들어, 부위-지정 돌연변이화 또는 다른 재조합 기법의 사용을 통해 변형된 유전자를 포함한다. 이 용어는 또한 천연 발생 DNA 서열의 여러 비-천연 발생 카피가 포함된다. 따라서, 이 용어는 세포에 대해 외래이거나 이종성인, 또는 세포와 상동성이지만 요소가 보통 확인되지 않는 숙주 세포 내의 위치에 있거나 형태인 DNA 절편을 나타낸다.

유사하게, 폴리펩타이드 또는 아미노산 서열에 관하여 본 명세서에서 사용되는 경우, 용어 "재조합", "이종성" 및 "외인성"은 특정 숙주 세포에 대해 외래 출처에서 기인하는, 또는 동일한 출처로부터인 경우, 그 원래 형태로부터 변형된 폴리펩타이드 또는 아미노산 서열을 의미한다. 따라서, 재조합 DNA 절편은 숙주 세포에서 발현되어 재조합 폴리펩타이드를 생산할 수 있다.

"단백질 발현"은 유전자 발현 후에 일어난다. 이것은 DNA가 메신저 RNA(mRNA)로 전사된 후의 단계들로 이루어진다. 이어서 mRNA는 폴리펩타이드 사슬로 번역되고, 궁극적으로는 단백질로 접혀진다. DNA는 핵산을 세포에 의도적으로 도입하는 과정인 형질감염(transfection)을 통해서 세포에 존재한다. 이 용어는 종종 진핵 세포에서 비바이러스성 방법에 사용된다. 이것은 또한 다른 방법 및 세포 유형을 지칭할 수도 있지만, 다른 용어가 선호된다: "형질전환"은 박테리아, 식물 세포를 포함하는 비-동물 진핵 세포에서의 비바이러스성 DNA 전달을 설명하기 위해 더 자주 사용된다. 형질전환은 이들 세포에서 암성 상태로의 진행(발암)을 나타내기 위해서도 사용되므로, 동물 세포에서는 형질감염이 선호되는 용어이다. 형질도입(transduction)은 바이러스-매개 DNA 전달을 설명하기 위해 종종 사용된다. 형질전환, 형질도입 및 바이러스 감염이 본 출원에 있어서 형질감염의 정의 하에 포함된다.

용어 "플라스미드", "벡터" 및 "카세트"는 당업자에게 이의 각각의 통상적이고 관례적인 의미로 주어지며, 비제한적으로 종종 세포의 중심 대사의 일부가 아닌 유전자를 운반하고 보통 원형 이중쇄 DNA 분자 형태인 염색체외 요소를 나타내기 위하여 사용된다. 이러한 요소는 임의의 출처로부터 유래되는, 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA 또는 RNA의 선형 또는 원형, 자가 복제 서열, 게놈 통합 서열, 파지 또는 뉴클레오타이드 서열일 수 있고, 여기서 다수의 뉴클레오타이드 서열이 세포 내로 적절한 3' 미번역 서열을 따라 프로모터 단편 및 선택된 유전자 산물에 대한 DNA 서열을 도입할 수 있는 고유한 구성으로 연결되거나 재조합되었다. "형질전환 카세트"는 외래 유전자를 함유하며 특정 숙주 세포의 형질전환을 촉진하는 외래 유전자에 부가하는 요소를 갖는 특정 벡터를 지칭한다. "발현 카세트"는 외래 유전자를 함유하며 외래 숙주에서 그 유전자의 발현 증강을 허용하는 외래 유전자에 부가하는 요소를 갖는 특정 벡터를 지칭한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "서열 동일성"은 2개의 최적으로 정렬된 폴리뉴클레오타이드 또는 펩타이드 서열이 성분, 예컨대, 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 정렬창을 통해서 불변하는 정도를 지칭한다. 시험 서열과 참조 서열의 정렬된 분절에 대한 "동일성 분율"은 2개의 정렬된 서열에 공유되는 동일한 성분의 수를 참조 서열 분절 내의 성분의 총수, 즉, 전체 참조 서열 또는 참조 서열의 보다 작게 정의된 부분으로 나눈 것이다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "퍼센트 서열 동일성" 또는 "퍼센트 동일성"은, 두 서열이 (비교창에 비해서 참조 서열의 총 20 퍼센트 미만의 적절한 뉴클레오타이드 삽입, 결실 또는 갭으로) 최적으로 정렬된 때에 시험("대상") 폴리뉴클레오타이드 분자(또는 이의 상보적 가닥)과 비교해서 참조("예시") 폴리뉴클레오타이드 분자(또는 이의 상보적 가닥)의 선형 폴리뉴클레오타이드 서열 내의 동일한 뉴클레오타이드의 백분율을 지칭한다. 비교창을 정렬시키기 위한 서열의 최적 정렬은 당업자에게 잘 알려져 있고, Smith 및 Waterman의 국소 상동성 알고리즘, Needleman 및 Wunsch의 상동성 정렬 알고리즘, Pearson 및 Lipman의 유사성 방법에 대한 검색에 의해, 그리고 바람직하게는 GCG® Wisconsin Package®(Accelrys Inc., 매사추세츠주 버링턴 소재)의 부분으로서 입수 가능한 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA와 같은 이들 알고리즘의 컴퓨터화된 구현에 의해 수행될 수 있다. 시험 서열 및 참조 서열의 정렬된 분절에 대한 "동일성 분율"은 2개의 정렬된 서열에 공유되는 동일한 성분의 수를 참조 서열 분절 내의 성분의 총수, 즉, 전체 참조 서열 또는 참조 서열의 보다 작게 정의된 부분으로 나눈 것이다. 퍼센트 서열 동일성은 동일성 분율에 100을 곱한 것으로 나타낸다. 1개 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열의 비교는 전장 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 부분에 대해서, 또는 보다 긴 폴리뉴클레오타이드 서열에 대해서 행해질 수 있다. 본 발명의 목적을 위하여, "퍼센트 동일성"은 또한 번역된 뉴클레오타이드 서열의 경우 BLASTX 버전 2.0을 이용해서 그리고 폴리뉴클레오타이드 서열의 경우 BLASTN 버전 2.0을 이용해서 결정될 수 있다.

서열 동일성의 퍼센트는 바람직하게는 Sequence Analysis Software Package™(버전 10; Genetics Computer Group, Inc., 위스콘신주 매디슨 소재)의 "Best Fit" 또는 "Gap" 프로그램을 이용해서 결정된다. "Gap"은, 정합의 수를 최대화하고 갭의 수를 최소화하는 두 서열의 정렬을 발견하기 위하여 Needleman 및 Wunsch의 알고리즘(Needleman and Wunsch, Journal of Molecular Biology 48:443-453, 1970)을 이용한다. "BestFit"은 Smith 및 Waterman의 국소 상동성 알고리즘(Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics, 2:482-489, 1981, Smith et al., Nucleic Acids Research 11:2205-2220, 1983)을 이용해서 매치의 수를 최소화하기 위하여 두 서열 사이의 유사성의 최상의 분절의 최적 정렬을 수행하고 갭을 삽입한다. 퍼센트 동일성은 가장 바람직하게는 "Best Fit" 프로그램을 이용해서 결정된다.

서열 동일성을 결정하기 위한 유용한 방법은 또한 미국 20894 메릴랜드주 베서스다에 소재한 미국 국립보건원의 미국 국립 의학 도서관에 있는 미국 국립생물공학정보센터(National Center Biotechnology 정보: NCBI)로부터 공개적으로 입수 가능한 Basic Local 정렬 Search Tool(BLAST) 프로그램에 개시되어 있고; 이에 대해서는 문헌[BLAST Manual, Altschul et al., NCBI, NLM, NIH; Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)]을 참조하고; 버전 2.0 또는 이상의 BLAST 프로그램이 정렬에 간극(결실 및 삽입)의 도입을 허용하고; 펩타이드 서열의 경우 BLASTX가 서열 동일성을 결정하기 위하여 사용될 수 있고; 폴리뉴클레오타이드 서열의 경우 BLASTN이 서열 동일성을 결정하기 위하여 사용될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "상당한 퍼센트 서열 동일성"은 적어도 약 70% 서열 동일성, 적어도 약 80% 서열 동일성, 적어도 약 85% 동일성, 적어도 약 90% 서열 동일성, 또는 심지어 그 이상의 서열 동일성, 예컨대, 약 98% 또는 약 99% 서열 동일성의 퍼센트 서열 동일성을 지칭한다. 따라서, 본 발명의 일 실시형태는 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 70% 서열 동일성, 적어도 약 80% 서열 동일성, 적어도 약 85% 동일성, 적어도 약 90% 서열 동일성, 또는 심지어 그 초과의 서열 동일성, 예컨대, 약 98% 또는 약 99% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드 분자이다. 본 발명의 활성 유전자를 갖는 폴리뉴클레오타이드 분자는 바닐린의 생산을 유도할 수 있고, 본 발명의 범위 내에 포함되고 본 명세서에서 제공되는 폴리뉴클레오타이드 서열과 상당한 퍼센트 서열 동일성을 갖는다.

동일성은 (단지 서열 정보 또는 구조 정보 또는 몇몇 다른 정보를 이용해서 행해질 수 있지만, 통상 서열 정보 단독에 기초하는) 서열의 정렬 후 서열의 상 사이에 동일한 아미노산의 분율이고, 유사성은 일부 유사성 매트릭스를 이용한 정렬에 기초하여 배정된 점수이다. 유사성 인덱스는 이하의 BLOSUM62, PAM250 또는 GONNET, 또는 단백질의 서열 정렬을 위하여 당업자에 의해 이용되는 임의의 매트릭스 중 어느 하나일 수 있다.

동일성은 (서열 사이에 갭이 없는) 두 하위서열 사이의 대응 정도이다. 25% 이상의 동일성은 기능의 유사성을 의미하는 한편, 18 내지 25%는 구조 또는 기능의 유사성을 의미한다. 두 완전히 관련이 없거나 랜덤한 서열(100개 초과의 잔기임)이 20%보다 더 높은 동일성을 가질 수 있는 것을 명심한다. 유사성은 두 서열이 비교되는 경우 이들 간의 유사도이다. 이것은 이들의 동일성에 좌우된다.

코딩 핵산 서열

본 발명은, 본 명세서에 기재된 바와 같은 아이소유제놀 모노옥시게나제를 코딩하고 요구되는 유전공학 조작을 수행하도록 적용될 수 있는 핵산 서열에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 명세서에 구체적으로 개시된 서열과 소정 정도의 "동일성"을 가진 핵산에 관한 것이다. 예를 들어, 본 발명의 양상은 서열번호 1과 적어도 60% 동일성, 서열번호 1과 적어도 65% 동일성, 서열번호 1과 적어도 70% 동일성, 서열번호 1과 적어도 75% 동일성, 서열번호 1과 적어도 80% 동일성, 서열번호 1과 적어도 85% 동일성, 서열번호 1과 적어도 90% 동일성, 서열번호 1과 적어도 95% 동일성, 또는 서열번호 1과 적어도 99% 동일성을 가진 핵산 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 본 발명에 유용한 아이소유제놀 모노옥시게나제를 인코딩하는데 사용되는 핵산 서열은 서열번호 1과 동일한 핵산 서열을 가질 수 있다.

본 발명은 또한 서열번호 2와 적어도 60% 동일성, 서열번호 2와 적어도 65% 동일성, 서열번호 2와 적어도 70% 동일성, 서열번호 2와 적어도 75% 동일성, 서열번호 2와 적어도 80% 동일성, 서열번호 2와 적어도 85% 동일성, 서열번호 2와 적어도 90% 동일성, 서열번호 2와 적어도 95% 동일성 또는 서열번호 2와 적어도 99% 동일성을 가진 아미노산 서열을 갖는 아이소유제놀 모노옥시게나제를 코딩하는 산 서열에 관한 것이다. 몇몇 실시형태에서, 아이소유제놀 모노옥시게나제는 서열번호 2와 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 본 발명은 전술한 것 중 임의의 것과 기능적 등가물을 코딩하는 핵산 서열에 관한 것일 수 있다.

본 발명에 따른 작제물

몇몇 양상에서, 본 발명은 아이소유제놀 모노옥시게나제를 발현시키기 위한 발현 벡터와 같은 작제물에 관한 것이다.

실시형태에서, 발현 벡터는 각종 숙주 세포에서 본 명세서에 기재된 재조합 폴리펩타이드(즉, CfIEM)의 발현을 위한 유전적 요소를 포함한다. 숙주 세포에서 전사 및 번역을 위한 요소는 프로모터, 단백질 복합체에 대한 코딩 영역, 및 전사 종결자를 포함할 수 있다.

당업자라면 발현 벡터의 제조에 이용가능한 분자 생물학 기술을 알고 있을 것이다. 위에서 기재된 바와 같이, 본 기술의 발현 벡터로의 혼입에 사용되는 폴리뉴클레오타이드는, 중합효소 연쇄 반응(PCR)과 같은 통상적인 기술에 의해 제조될 수 있다. 분자 클로닝에서, 벡터는 외래 유전 물질을 다른 세포로 인공적으로 운반하는 운반체(vehicle)로서 사용되는 DNA 분자이고, 여기서 복제 및/또는 발현될 수 있다(예컨대, 플라스미드, 코스미드, 람다 파지). 외래 DNA를 함유하는 벡터는 재조합 DNA인 것으로 간주된다. 4가지 주된 유형의 벡터는 플라스미드, 바이러스 벡터, 코스미드 및 인공 염색체이다. 이들 중 가장 통상적으로 이용되는 벡터는 플라스미드이다. 모든 조작된 벡터에 공통인 것은 복제 기원, 다중 클로닝 부위 및 선택 가능한 마커이다.

상보적 돌출 말단(complementary cohesive terminal)을 통해 DNA를 벡터에 작동 가능하게 연결하기 위해 많은 분자 생물학 기술이 개발되었다. 일 실시형태에서, 상보적 동종중합체 관이 벡터 DNA 내로 삽입될 핵산 분자에 첨가될 수 있다. 이어서, 벡터와 핵산 분자는 상보적 동종중합체 꼬리 사이의 수소 결합에 의해 연결되어 재조합 DNA 분자를 형성한다.

대안적인 실시형태에서, 하나 이상의 제한 부위를 함유하는 합성 링커는 대상 기술의 폴리뉴클레오타이드를 발현 벡터에 작동 가능하게 연결하기 위하여 사용된다. 일 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 제한 엔도뉴클레아제 소화에 의해 생성된다. 일 실시형태에서, 핵산 분자는, 3'-5'-엑소뉴클레오라이틱 활성을 갖는 돌출된 3'-단일-가닥 말단을 제거하고 중합 활성을 갖는 오목한 3'-말단에 채우는 효소인 박테리오파지 T4 DNA 중합효소 또는 이. 콜라이 DNA 중합효소 I로 처리됨으로써, 평활말단(blunt-ended) DNA 분절을 생성한다. 이어서, 평활말단 분절을 평활말단 DNA 분자의 결찰을 촉매할 수 있는 효소, 예컨대, 박테리오파지 T4 DNA 리가제의 존재 하에 몰 과량의 링커 분자와 인큐베이션한다. 따라서, 반응 산물은 그의 말단에 중합체성 링커 서열을 보유하는 폴리뉴클레오타이드이다. 이어서, 이러한 폴리뉴클레오타이드를 적절한 제한 효소로 절단하고, 폴리뉴클레오타이드의 것과 양립 가능한 말단을 생성하는 효소로 절단된 발현 벡터에 결찰시킨다.

대안적으로, 결찰-독립적 클로닝(LIC) 부위를 갖는 벡터가 이용될 수 있다. 이어서, 요구되는 PCR 증폭 폴리뉴클레오타이드는 제한 소화 또는 결찰 없이 LIC 벡터로 클로닝될 수 있다(Aslanidis and de Jong, Nucl. Acid. Res. 18 6069-74, (1990), Haun et al, Biotechniques 13, 515-18 (1992), 이들 각각은 참조에 의해 본 명세서에 원용됨).

일 실시형태에서, 선택된 플라스미드 내로의 삽입을 위해 관심 폴리뉴클레오타이드를 단리 및/또는 변형시키기 위하여, PCR을 사용하는 것이 적합하다. 서열의 PCR 준비에 사용하기 위한 적절한 프라이머는 핵산 분자의 요구되는 코딩 영역을 단리시키고, 제한 엔도뉴클레아제 또는 LIC 부위를 부가하고, 목적하는 해독틀에 코딩 영역을 배치하도록 설계될 수 있다.

일 실시형태에서, 대상 기술의 발현 벡터 내로의 혼입을 위한 폴리뉴클레오타이드는 PCR 적절한 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 이용해서 제조된다. 코딩 영역은 증폭되는 한편, 프라이머 자체는 증폭된 서열 산물에 혼입되게 된다. 일 실시형태에서, 증폭 프라이머는 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위를 함유하고, 이는 증폭된 서열 산물이 적절한 벡터 내로 클로닝되도록 한다.

발현 벡터는 통상의 형질전환 또는 형질감염 기술에 의해 식물 또는 미생물 숙주 세포에 도입될 수 있다. 대상 기술의 발현 벡터를 사용한 적절한 세포의 형질전환은 당업계에 공지된 방법에 의해 달성되고, 전형적으로 벡터 및 세포의 유형 둘 다에 의존한다. 적합한 기술은 인산칼슘 또는 염화칼슘 공침, DEAE-덱스트란 매개 형질감염, 리포펙션, 화학천공법 또는 전기천공법을 포함한다.

성공적으로 형질전환된 세포, 즉, 발현 벡터를 함유하는 세포는 당업계에 잘 알려진 기술에 의해 식별될 수 있다. 예를 들어, 대상 기술의 발현 벡터로 형질감염된 세포를 배양하여 본 명세서에 기재된 폴리펩타이드를 생산할 수 있다. 세포는 당업계에 잘 알려진 기술에 의해 발현 벡터 DNA의 존재에 대해 조사될 수 있다.

숙주 세포는 앞서 기재된 발현 벡터의 단일 카피, 또는 대안적으로 발현 벡터의 다중 카피를 함유할 수 있다,

몇몇 실시형태에서, 형질전환된 세포는 식물 세포, 해조류 세포, 콜레토트리쿰이 아닌 진균 세포, 또는 효모 세포이다. 몇몇 실시형태에서, 세포는 카놀라 식물 세포, 평지씨 식물 세포, 야자 식물 세포, 해바라기 식물 세포, 목면 식물 세포, 옥수수 식물 세포, 땅콩 식물 세포, 아마 식물 세포, 참깨 식물 세포, 대두 식물 세포 및 피튜니아 식물 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 식물 세포이다.

미생물 숙주 세포 발현 시스템 및 발현 벡터는 당업자에게 잘 알려진 외래 단백질의 고수준 발현을 지시하는 조절 서열을 함유한다. 이들 중 임의의 것은 미생물 숙주 세포에서 대상 기술의 재조합 폴리펩타이드의 발현을 위한 벡터를 작제하는데 사용될 수 있었다. 이어서, 이들 벡터는 형질전환을 통해 적절한 미생물에 도입되어, 대상 기술의 재조합 폴리펩타이드의 고수준 발현을 허용할 수 있었다.

적합한 미생물 숙주 세포의 형질전환에 유용한 벡터 또는 카세트는 당업계에 잘 알려져 있다. 전형적으로 벡터 또는 카세트는 관련 폴리뉴클레오타이드의 전사 및 번역을 지시하는 서열, 선택 가능한 마커, 및 자율 복제 또는 염색체 통합을 허용하는 서열을 함유한다. 적합한 벡터는 전사 개시 조절을 보유하는 폴리뉴클레오타이드의 영역 5' 및 전사 종결을 조절하는 DNA 단편의 영역 3'을 포함한다. 두 제어 영역이 형질전환된 숙주 세포와 상동성인 유전자로부터 유래하는 것이 바람직하지만, 그러한 제어 영역이 숙주로서 선택된 특정 종에 고유한 유전자로부터 유래될 필요는 없다는 것이 이해되어야 한다.

종결 제어 영역은 또한 미생물 숙주에 고유한 각종 유전자로부터 유래될 수 있다. 종결 부위는 선택적으로 본 명세서에 기재된 미생물 숙주에 대해서 포함될 수 있다.

바람직한 숙주 세포는 아이소유제놀로부터 바닐린을 생산하는 능력을 갖는 것으로 알려진 것들을 포함한다. 예를 들어, 바람직한 숙주 세포는 에셰리키아 및 슈도모나스(Pseudomonas) 속의 박테리아를 포함할 수 있다.

바닐린의 발효 생산

아이소유제놀은 폴리페닐벤젠의 곁사슬의 산화를 수반하는 에폭사이드-다이올 경로를 통해서 바닐린으로 대사된다(도 1). 본 발명자들은 놀랍게도 콜레토트리쿰 피오리니아에(Colletotrichum fioriniae)(CfIEM)로부터 추정되는 아이소유제놀 모노옥시게나제가 이전에 보고된 박테리아 IEM과 비교하여 이소유제놀의 바닐린으로의 생물전환에서 놀랍게도 높은 활성을 나타냈다는 것을 발견하였다. 더욱 구체적으로, 본 발명자들은, CfIEM 유전자를 보유하는 숙주 균주를 조작하고 아이소유제놀을 포함하는 혼합물에서 조작된 숙주 균주를 배양함으로써, 90%보다 높은 전환율로 10 g/ℓ보다 높은 역가에서 바닐린 생산을 달성할 수 있었다. 다른 조효소 및/또는 하위 인자를 사용하지 않고도 높은 역가 및 높은 전환율이 얻어졌다.

숙주 세포의 배양은 통상적인 영양 물질의 존재 하에 수성 배지에서 수행될 수 있다. 적합한 배양 배지는, 예를 들어, 탄소원, 유기 또는 무기 질소원, 무기 염 및 성장 인자를 함유할 수 있다. 배양 배지의 경우, 글루코스가 바람직한 탄소 공급원일 수 있다. 효모 추출물은 유용한 질소 공급원이 될 수 있다. 인산염, 성장 인자 및 미량 원소가 첨가될 수 있다.

배양액(culture broth)은 생물반응기에서 준비하고 살균할 수 있다. 이어서, 본 발명에 따른 조작된 숙주 균주를 배양액에 접종하여 성장 단계를 개시할 수 있다. 성장 단계의 적절한 기간은 약 5 내지 40시간, 바람직하게는 약 10 내지 35시간, 가장 바람직하게는 약 10 내지 20시간일 수 있다.

성장 단계의 종료 후, 발효액(fermentation broth)의 pH를 8.0 이상의 pH로 전환할 수 있으며 기질인 아이소유제놀을 배양물에 공급할 수 있다. 기질-공급물의 적합한 양은 발효액 0.1 내지 40 g/ℓ, 바람직하게는 약 0.3 내지 30 g/ℓ일 수 있다. 기질은 고체 물질로서 또는 수용액 또는 현탁액으로서 공급될 수 있다. 기질의 총량은 한 단계, 두 개 이상의 공급 단계 또는 연속적으로 공급될 수 있다.

생물전환 단계는 기질 공급의 시작으로 개시되어, 약 5 내지 50시간, 바람직하게는 10 내지 40시간, 가장 바람직하게는 15 내지 30시간, 즉, 모든 기질이 생성물 및 부산물로 전환될 때까지 지속된다.

종결된 생물전환 단계 후, 바이오매스는 원심분리 또는 막 여과 등과 같은 공지된 방법에 의해 발효액으로부터 분리되어 무세포 발효액을 얻을 수 있다.

추출 단계는, 예컨대, 수불혼화성 - 유기 용매, 식물 오일 또는 임의의 고체 추출제, 예컨대, 수지, 바람직하게는 중성 수지를 사용하여 발효액에 첨가될 수 있다. 발효액은 추가로 멸균 또는 저온 살균될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 발효액은 농축될 수 있다. 발효액으로부터, 바닐린은, 예를 들어, 연속 액-액 추출 공정 또는 회분식 추출 공정을 사용하여 선택적으로 추출될 수 있다.

본 발명의 이점은 무엇보다도 동일한 배지에서 성장 단계 및 후속의 생물전환 단계 둘 다를 수행할 수 있는 능력을 포함한다. 이는 생산 공정을 매우 단순화하여, 공정을 효율적이고 경제적으로 만들어, 산업 생산 수준으로 확장시킬 수 있다.

당업자라면, 본 명세서에 기재된 방법에 의해 생산된 바닐린 조성물이 더욱 정제되어 위에서 기재된 바와 같은 방향 및/또는 착향 소모품뿐만 아니라, 영양을 위한 것뿐만 아니라 의약품에서 식이보충제, 의약 조성물, 기능성 화장품과 혼합될 수 있음을 인식할 것이다.

본 개시내용은 이하의 비제한적인 실시예를 고려해서 더욱 완전히 이해될 것이다. 주제 기술의 바람직한 실시형태를 나타내는 한편 이러한 실시예가 단지 예시로써 부여되는 것이 이해되어야 한다. 상기 논의 및 이러한 실시예로부터 당업자라면 주제 기술의 정신과 범위로부터 벗어나는 일 없이 주제 기술의 본질적인 특징을 확인할 수 있고, 각종 용도 및 조건에 적응시키도록 주제 기술의 각종 변화와 변경을 행할 수 있다.

실시예

박테리아 균주, 플라스미드 및 배양 조건.

DH5a 및 BL21(DE3)의 이. 콜라이 균주는 Invitrogen사로부터 구입하였다. 이. 콜라이 균주 W3110은 예일대학교의 E. coli Genetic Resources의 Coli Genetic Stock Center(http://cgsc2.biology.yale.edu/)에서 입수하였다. 플라스미드 pET21a는 EMD Millipore사(미국 매사추세츠주 빌레리카 소재)로부터 구입하였다. 플라스미드 pUVAP는 서열번호 5에 열거된 뉴클레오타이드 서열 및 도 4에 도시된 맵으로부터 본 발명자들에 의해 작제되었고, 이는 유전자 클로닝 및 유전자 발현 목적 둘 다에 사용되었다.

DNA 조작.

모든 DNA 조작은 표준 절차에 따라 수행되었다. 제한 효소인 T4 DNA 리가제는 New England Biolabs사로부터 구입하였다. 모든 PCR 반응은 제조사의 지침에 따라 New England Biolabs의 Phusion PCR 시스템으로 수행되었다.

실시예 1: 표적 유전자의 식별

1431 bp의 전체 ORF(개방형 해독틀)를 가진 DNA 단편, 즉, 진균 콜레토트리쿰 피오리니아에 PJ7로부터의 CfIEM은 NCBI 데이터베이스(EXF85749.1)로부터 식별되었다. 이것은 아이소유제놀 모노옥시게나제인 것으로 주석이 붙어 있었다. ORF는 539개의 아미노산(서열번호 2), 60.80 kDa의 이론적 분자량 및 5.47의 계산된 등전점(pI)을 갖는 단백질을 인코딩한다. 대응하는 뉴클레오타이드는 에셰리키아 콜라이(Escherichia coli)(서열번호 1)에서 발현을 위한 코돈 최적화 후에 GeneUniversal Inc. Company(미국 뉴저지주 뉴어크 소재)에서 합성되었다.

슈도모나스 푸티다, GenBank 수탁 번호 AB291707.1로부터의 아이소유제놀 모노옥시게나제인 PpIEM은 기능적 특성이 규명되었으며 이전에 바닐린 생산에 사용되었다. 이에 대해서는 문헌[Yamada et al., "Biotransformation of Isoeugenol to Vanillin by Pseudomonas putida IE27 cells," Appl. Microbiol. Biotechnol., 73(5): 1025-1030 (2007), 및 Yamada et al., "Vanillin production using Escherichia coli cells over-expressing isoeugenol monooxygenase of Pseudomonas putida," Biotechnol. Lett., 30:665-670 (2008)]을 참조한다. 아이소유제놀을 바닐린으로 전환함에 있어서 CfIEM의 활성을 PpIEM의 활성과 비교하기 위하여, PpIEM은, 서열번호 3으로 열거된 뉴클레오타이드 서열을 사용해서, GeneUniversal Inc Company(미국 뉴저지주 뉴어크 소재)에서 합성되었다. 대응하는 아미노산 서열은 서열번호 4로 열거되어 있다.

생물정보 분석은 CfIEM이 슈도모나스 종으로부터 보고된 아이소유제놀 모노옥시게나제와 낮은 동일성을 보이는 것을 나타낸다. 구체적으로, 생물정보 분석은, CfIEM이 단독으로 슈도모나스 푸티다로부터의 IEM인 PpIEM 및 슈도모나스 나이트로레두센스(Pseudomonas nitroreducens)로부터의 IEM인 PnIEM와 각각 34% 및 35% 동일성을 갖는 것을 나타낸다.

실시예 2: 플라스미드의 작제

재조합 단백질이 C-말단에 6XHis 태그를 갖도록 CfIEM의 개방형 해독틀(ORF)을 정지 코돈을 제거하여 pET21a의 Nde I/Not I 제한 부위에 클로닝하였다. CfIEM의 ORF는 표 1의 CfIEM-NdeI-F와 CfIEM-NotI-R1의 프라이머 쌍을 사용하여 5'-말단에 Nde I 제한 부위의 도입 및 3'-말단에 Not I 부위의 도입으로 증폭시켰다. Nde I 및 Not I로 소화 후, PCR 단편을 발현 벡터 pET21a의 Nde I 및 Not I의 제한 부위에 결찰시키고, DH5알파 컴피턴트 세포(competent cell)로 형질전환시켜, CfIEM-pET21a의 플라스미드를 생성하였다(도 2). 시퀀싱 확인 후, 플라스미드는 에셰리키아 콜라이 균주 BL21(DE3)로 형질전환될 준비가 되었다.

대조군으로서, 재조합 단백질이 위에서와 같은 유사한 프로토콜로 C-말단에 6XHis 태그를 갖도록 PpIEM을 정지 코돈을 제거하여 pET21a의 Nde I/Not I 제한 부위에 클로닝하였다. PpIEM의 ORF는 표 1의 PpIEM-NdeI-F 및 PpIEM-NotI-R1의 프라이머 쌍을 사용하여 5'-말단에 Nde I 제한 부위의 도입 및 3'-말단에 Not I 부위의 도입으로 증폭시켰다. Nde I 및 Not I로 소화 후, PCR 단편을 발현 벡터 pET21a의 Nde I 및 Not I의 제한 부위에 결찰시키고, DH5alpha 컴피턴트 세포로 형질전환시켜, PpIEM-pET21a의 플라스미드를 생성하였다(도 3). 시퀀싱 확인 후, 플라스미드는 에셰리키아 콜라이 균주 BL21(DE3)로 형질전환될 준비가 되었다.

발효기에서 아이소유제놀의 바닐린으로의 생물전환을 위한 에셰리키아 콜라이 균주를 생성하기 위하여, CfIEM의 개방형 해독틀을, 사용된 프라이머가 CfIEM-Nde-F 및 CfIEM-NotI-R2인 것을 제외하고 상기와 동일한 절차를 이용해서 pUVAP 벡터의 Nde I/Not I 부위(도 4)에 클로닝하여 CfIEM-pUVAP의 발현 벡터(도 5)를 생성하였다. 이 벡터를 가진 발현된 CfIEM은 His-태그를 갖지 않는다.

대조군으로서, 사용된 프라이머가 PpIEM-Nde-F 및 PpIEM-NotI-R2인 것을 제외하고 위에서 기재된 동일한 절차를 이용해서, PpIEM을 pUVAP 벡터의 Nde I/Not I 부위에 클로닝하여 PpIEM-pUVAP의 발현 벡터를 생성하였다(도 6). 이 벡터를 가진 발현된 PpIEM은 His-태그를 갖지 않는다.

실시예 3: 개발된 작제물을 사용한 이. 콜라이 세포의 형질전환.

ISEG-V01의 균주를 생성하기 위하여 CfIEM-pET21a의 작제물을 표준 화학적 형질전환 프로토콜로 이. 콜라이 BL21(DE3) 세포에 도입하였다. 동일한 프로토콜로, ISEG-V01-대조군의 균주를 PpIEM-pET21a로 생성하였다. ISEG-V01 및 ISEG-V01-대조군의 균주는 재조합 단백질의 발현 및 재조합 단백질의 기능 특성규명에 사용하였다.

IEUG-V02의 균주를 생성하기 위하여 CfIEM-pUVAP의 플라스미드를 표준 화학적 형질전환 프로토콜로 이. 콜라이 W3110 컴피턴트 세포에 도입하였다. IEUG-V02-대조군의 대조군 균주는 동일한 절차를 이용해서 PpIEM-pUVAP의 플라스미드를 이. 콜라이 W3110 컴피턴트 세포에 도입함으로써 개발하였다. IEUG-V02 및 IEUG-02-대조군의 균주는 전체 세포를 사용하여 아이소유제놀의 바닐린으로의 생물전환에 사용하였다.

실시예 4: 이. 콜라이에서의 CfIEM의 이종 발현 및 재조합 단백질의 정제

이. 콜라이 균주 ISEG-V01의 단일 콜로니를 37℃에서 하룻밤 100 ㎎/ℓ의 암피실린을 가진 5㎖의 LB 배지로 성장시켰다. 이 종자 배지를 100 ㎎/ℓ의 암피실린을 가진 200㎖의 LB 배지로 옮겼다. 세포를 37℃에서 250 rpm에서 0.6 내지 0.8의 OD600으로 성장시키고, 이어서 IPTG를 0.5mM의 최종 농도로 첨가하고, 성장 온도는 16℃로 변화시켰다. 이. 콜라이 세포를 4℃에서 15분 동안 4000g에서 원심분리하여 IPTG 유도 16시간 후에 수거하였다. 얻어진 펠릿을 5㎖의 100mM Tris-HCl, pH 7.4, 100mM NaOH, 10% 글리세롤(v/v)에 재현탁시키고, 얼음 위에서 2분 동안 초음파처리하였다. 이 혼합물을 4℃에서 20분 동안 4000g에서 원심분리하였다. 상청액 중 재조합 단백질 CfIEM을 제조사의 프로토콜에 따라서 Clonetech Inc.로부터의 His60 Ni Superflow 수지로 정제하였다. 동일한 절차를 사용하여 이. 콜라이 균주 ISEG-V01-대조군의 단일 콜로니를 성장시켜 재조합 단백질 PpIEM을 얻었다. 두 재조합 단백질의 정제는 SDS-PAGE에 의해 점검하였다(도 7).

실시예 5: 시험관내 효소 검정

두 정제된 아이소유제놀 모노옥시게나제는 기질로서의 아이소유제놀을 이용하는 효소 측정 혼합물 중에서 바닐린의 형성을 측정함으로써 검정하였다. 이 반응 혼합물은, 1㎖의 총 용적으로, 10mM 아이소유제놀, 100mM 인산칼륨 완충액(pH 7.0), 10% (v/v) 에탄올 및 적절한 양의 효소를 함유하였다. 반응을 에탄올 용액으로서 아이소유제놀을 첨가함으로써 개시시키고, 왕복 진탕(160 스트로크 분^-1)으로 30℃에서 10분 동안 수행하고, 1㎖의 메탄올로 중지시켰다. 21,500g에서의 원심분리 후, 상청액은 아이소유제놀, 바닐린 및 바닐릴 알코올의 결정을 위하여 HPLC에 의해 분석하였다. 5분 동안 비등수로 처리된 CfIEM 효소는 음성 대조군으로 사용하였다.

도 8은 정제된 PpIEM(상부 패널), 정제된 CfIEM(중간 패널), 및 음성 대조군 변성 CfIEM(하부 패널)을 사용하는 실험으로부터 상청액으로 얻어진 HPLC 크로마토그램을 도시한다. 도시된 바와 같이, 정제된 CfIEM은 아이소유제놀에 대해 높은 활성을 보였다. 반응 혼합물에 첨가된 거의 모든 아이소유제놀은 바닐린으로 전환되었다(중간 패널). 비교로써, 정제된 PpIEM은 단지 첨가된 아이소유제놀의 작은 부분을 바닐린으로 전환시켰다(상부 패널). 예상된 바와 같이, 음성 대조군에서는 바닐린이 생산되지 않았다(하부 패널).

실시예 6: 진탕 플라스크를 이용한 생체내 아이소유제놀의 바닐린으로의 생물전환

IEUG-V02 및 IEUG-V02-대조군의 이. 콜라이 W3110 균주는 종자 배지로서 37℃에서 하룻밤 3㎖ LB에 50 ㎍/ℓ 암피실린을 가진 LB 배지에서 성장시켰다. 0.2㎖의 종자 배지를 125㎖의 진탕 플라스크 내에 5 g/ℓ의 효모 추출물 및 50 ㎍/ℓ 암피실린을 포함하는 20㎖ M9 배지에 접종하였다. 세포를 30℃에서 6시간 동안 250 rpm의 진탕 속도로 진탕기에서 성장시키고, 이어서 플라스크에 400㎕의 20% 아이소유제놀(DMSO 중 v/v)을 첨가하였다. 배양물에 2회 초과의 200㎕의 20% 아이소유제놀(DMSO 중 v/v) 첨가는 초회 첨가 12 및 24시간 후에 수행하였다. 100㎕의 배양 혼합물을 각각 표시된 시간 간격에서 플라스크로부터 취해서 와류에 의해 900㎕의 메탄올로 잘 혼합하고 나서, 15분 동안 20,000g에서 원심분리하였다. 얻어진 상청액 50 uL를 HPLC 분석을 위하여 HPLC 샘플 바이알에 취하였다. 실험은 세 벌로 수행하였다.

도 9는 (PpIEM-pUVAP로 생성된) 이. 콜라이 균주 IEUG-V02-대조군에 대해서 (CfIEM-pUVAP로 생성된) 이. 콜라이 균주 IEUG-V02에 의한 바닐린의 생산을 비교한다. 도 9에 도시된 바와 같이, CfIEM 및 PpIEM을 각각 보유하는 두 균주는, 배양 배지에서 아이소유제놀을 바닐린으로 전환시켰다. 그러나, CfIEM을 보유하는 IEUG-V02의 전환률은 놀랍게도 PpIEM을 보유하는 균주보다 상당히 높았다. PpIEM을 보유하는 균주(IEUG-V02-대조군)는 아이소유제놀의 첨가 후 거의 50시간에 단지 약 1 g/ℓ의 바닐린을 생산하였다. 비교로써, CfIEM을 보유하는 균주(IEUG-V02)는 동일한 조건 하에 생물전환 기간의 종료 시에 6 g/ℓ가 넘는 바닐린을 생산하였다.

실시예 7: 발효기에서 아이소유제놀의 바닐린으로의 생물 전환

발효 과정은 발효기에서 기질로서 천연 아이소유제놀을 사용해서 천연 바닐닐을 생산하기 위하여 IEUG-V02 균주를 사용하도록 개발되었다. 구체적으로, 1㎖의 ISEG-V02의 글리세롤 스톡을 500㎖ 플라스크 내 100㎖의 종자 배양 배지(5 g/ℓ 효모 추출물, 10 g/ℓ 트립톤, 10 g/ℓ NaCl 및 50 ㎎/ℓ 암피실린을 가진 Luria-Bertani 배지)에 접종하였다. 이 종자를 37℃에서 8시간 동안 200rpm의 진탕 속도로 진탕기에서 배양하고, 이어서 5-리터 발효기 내의 Luria-Bertani 배지 + 10 g/ℓ 개시 글루코스, 50 ㎎/ℓ 암피실린의 3리터 발효 배지에 옮겼다.

5-리터 바닐린 발효기 과정은 2단계, 즉, 세포 성장 단계와 생물전환 단계를 갖는다. 세포 성장 단계는 경과된 발효 시간(elapsed fermentation time: EFT) 0시간 내지 약 EFT 16.5시간이었다. 발효 파라미터는 다음과 같이 설정되었다: 기류: 0.6vvm; pH는 4N NaOH를 이용해서 제어된 7.1보다 낮지 않았다. 성장 온도는 30℃로 설정되었고, 교반은 300 내지 500 rpm으로 설정되었다. 용존 산소량(dissolved oxygen: DO)은 교반으로 떨어뜨려 30%보다 높게 유지시켰다. 성장 시간은 약 16 내지 17시간이었다.

생물전환 단계는 EFT 16.5시간 내지 46.5시간이었다. 발효 파라미터는 다음과 같이 설정되었다: 기류: 0.4vvm. pH는 4N NaOH로 8.0보다 낮지 않게 제어되었고, 온도는 30℃였다. 교반은 250 내지 500 rpm으로 설정되었고, DO는 교반으로 떨어뜨려 30%보다 높게 유지시켰다. 아이소유제놀을 EFT 16.5시간에 0.6 g/ℓ의 공급속도로 공급하고, 이어서 이 공급 속도는 EFT 44시간이 될 때까지 EFT 27.5시간에 0.4 g/ℓ로 저감시켰고, 발효 단계는 EFT 46 내지 47시간에 완결되었다.

배양 혼합물은 표시된 시간 간격에서 발효기로부터 취하였다. 아이소유제놀, 바닐린 및 바닐릴 알코올의 HPLC 분석은 Vanquish Ultimate 3000 시스템으로 수행되었다. 중간체는 0.6 ㎖/분의 유량으로 그리고 10 내지 40%(vol/vol) 용리액 B의 범위에서 0.2%(용적/용적)(용리액 B)의 아세토나이트릴 및 0.2%(용적/용적) 트라이플루오르산(용리액 A)의 구배로 Dionex Acclaim 120 C18 칼럼(입자 크기 3㎛; 150×2.1㎜) 상에서의 역상 크로마토그래피에 의해 분리시켰다. 정량화를 위하여, 모든 중간체는 외부 표준품으로 교정하였다. 화합물은 체류 시간뿐만 아니라, 대응하는 스펙트럼에 의해 식별되었으며, 이는 시스템 내 다이오드 어레이 검출기로 식별되었다.

도 10은, EFT 16.5시간 내지 46.5시간의 생물전환 단계에 걸쳐서, 생산된 아이소유제놀 및 바닐릴 알코올의 양에 대한, 생산된 바닐린의 양을 도시한다. 도 10에 도시된 바와 같이, 바닐린 생산 역가는 10 g/ℓ를 상회하여 도달했고, 아이소유제놀로부터의 전환율은 90%를 상회했다.

상기 설명으로부터 명백한 바와 같이, 본 개시내용의 소정의 양상은 본 명세서에서 제공되는 실시예의 특정 상세에 의해 제한되지 않고, 따라서 기타 변형과 응용, 또는 이의 등가물이 당업자에게 떠오를 것임이 상정된다. 청구범위는 본 개시내용의 정신과 범위로부터 벗어나지 않는 이러한 모든 변형과 응용을 포함하는 것으로 의도된다.

나아가, 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시내용이 속하는 기술분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기재된 것 또는 것들과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료는 본 개시내용의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료는 위에서 기재되어 있다.

관심 서열

서열번호 1: CfIEM의 핵산 서열

서열번호 2: CfIEM의 아미노산 서열

서열번호 3: PpIEM의 핵산 서열

서열번호 4: PpIEM의 아미노산 서열

서열번호 5: 플라스미드 pUVAP의 핵산 서열

SEQUENCE LISTING <110> Conagen Inc. <120> Biosynthesis of Vanillin from Isoeugenol <130> WO2020223418 <150> PCT/US2020/030575 <151> 2020-04-29 <150> US 62/840,284 <151> 2019-04-29 <160> 11 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1620 <212> DNA <213> Colletotrichum fioriniae <400> 1 atggcaccgg gtcgtaccga tgatgaagca gcagaagttg caaccagcag caaaacccat 60 gcaattagca attatggtct gaccaccaaa tggcctgaag catacgatct ggcaggtagc 120 aatctgccgt gtcgtctgga aggtgaaatt ggtgatctgg ttgttctggg tgaaattccg 180 aaagaaattg atggcacctt ttatcgtgtt atgaccgatc cgtttgttcc gcctcatccg 240 aataatgttc cgctggatgg tgatggtaat attagcgcat ttcgcattaa agatggtcgc 300 gtggatatga aaatgcgtta tgttgaaacc gagcgctata aactggaacg caaagcaaat 360 aaagcactgt ttggtctgta tcgcaatccg tttacacatc atccgtgtgt tcgtgcagca 420 gttgatagca ccgcaaatac caatgttgtt ctgtgggcag atcattttct ggcactgaaa 480 gaaggtggtc tgccgtatag cgttgatccg cagacactgg aaaccatcaa atatgatcct 540 tttggccaga tcaaagccaa aacctttacc gcacatccga aaattgatcc gtataccaat 600 gaactggtgg 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tttcgaaaaa ccgattgcag ttattcagct gccgtttcat 1500 gttaaagcac aggttcatgg taattgggtt gatcagcgtc gtctgaaagc atggcagaaa 1560 ctggcacgtg atgcagtgcc ggaaccgatt agcggtcagg gtgcactgga accgctgtaa 1620 <210> 2 <211> 539 <212> PRT <213> Colletotrichum fioriniae <400> 2 Met Ala Pro Gly Arg Thr Asp Asp Glu Ala Ala Glu Val Ala Thr Ser 1 5 10 15 Ser Lys Thr His Ala Ile Ser Asn Tyr Gly Leu Thr Thr Lys Trp Pro 20 25 30 Glu Ala Tyr Asp Leu Ala Gly Ser Asn Leu Pro Cys Arg Leu Glu Gly 35 40 45 Glu Ile Gly Asp Leu Val Val Leu Gly Glu Ile Pro Lys Glu Ile Asp 50 55 60 Gly Thr Phe Tyr Arg Val Met Thr Asp Pro Phe Val Pro Pro His Pro 65 70 75 80 Asn Asn Val Pro Leu Asp Gly Asp Gly Asn Ile Ser Ala Phe Arg Ile 85 90 95 Lys Asp Gly Arg Val Asp Met Lys Met Arg Tyr Val Glu Thr Glu Arg 100 105 110 Tyr Lys Leu Glu Arg Lys Ala Asn Lys Ala Leu Phe Gly Leu Tyr Arg 115 120 125 Asn Pro Phe Thr His His Pro Cys Val Arg Ala Ala Val Asp Ser Thr 130 135 140 Ala Asn Thr Asn Val Val Leu Trp Ala Asp His Phe Leu Ala Leu Lys 145 150 155 160 Glu Gly Gly Leu Pro Tyr Ser Val Asp Pro Gln Thr Leu Glu Thr Ile 165 170 175 Lys Tyr Asp Pro Phe Gly Gln Ile Lys Ala Lys Thr Phe Thr Ala His 180 185 190 Pro Lys Ile Asp Pro Tyr Thr Asn Glu Leu Val Val Phe Gly Tyr Glu 195 200 205 Ala Arg Gly Leu Ala Ser Leu Asp Ile Val Ile Tyr Ala Leu Asp Ser 210 215 220 Asn Gly Val Lys His Asp Glu Gln Trp Ile Lys Ser Pro Trp Cys Ala 225 230 235 240 Pro Ile His Asp Cys Ala Ile Thr Pro Asn Trp Ile Ile Leu Ala Leu 245 250 255 Trp Pro Phe Glu Ala Ser Val Asp Arg Met Lys Lys Gly Gly His His 260 265 270 Trp Ala Trp Asp Tyr Asp Leu Pro Ala Thr Phe Ile Val Ala Pro Arg 275 280 285 Arg Ser Ser Thr Lys Leu Pro Pro Gly Trp Gln Pro Gly Glu Ser Arg 290 295 300 Val Tyr Ser Trp Lys Asn Cys Met Leu Ile His Thr Gly Gly Ala Trp 305 310 315 320 Glu Ser Glu Asp Gly Gln Thr Leu Phe Met Glu Thr Thr Arg Val His 325 330 335 Asp Asn Gly Phe Pro Phe Phe Pro Thr Asn Glu Gly Val Tyr Pro Ala 340 345 350 Pro Asp Pro Lys Ser Asp Tyr Val Arg Trp Thr Phe Asp Leu Ser Gln 355 360 365 Pro Thr Asn Ser Lys Val Pro Asp Pro Glu Ile Ile Leu Asp Met Pro 370 375 380 Ala Glu Phe Pro Arg Leu Asp Glu Arg Phe Leu Ser Lys Ser Tyr Asn 385 390 395 400 Tyr Val Trp Ile Asn Val Tyr Ile His Glu Asp Gln Asn Gly Asp Gly 405 410 415 His Thr Ile Val Glu Gly Leu Asn Gly Leu Ala Met His Asn Ser Lys 420 425 430 Thr Lys Glu Thr Lys Cys Phe Asn Ala Gly Ala Glu Ser Phe Cys Gln 435 440 445 Glu Pro Ile Phe Ile Pro Arg Ser Asp Asp Ala Pro Glu Gly Asp Gly 450 455 460 Trp Val Met Thr Met Val Glu Arg Arg Gly Ala Asn Arg Asn Glu Ile 465 470 475 480 Val Val Leu Asp Thr Lys Asp Phe Glu Lys Pro Ile Ala Val Ile Gln 485 490 495 Leu Pro Phe His Val Lys Ala Gln Val His Gly Asn Trp Val Asp Gln 500 505 510 Arg Arg Leu Lys Ala Trp Gln Lys Leu Ala Arg Asp Ala Val Pro Glu 515 520 525 Pro Ile Ser Gly Gln Gly Ala Leu Glu Pro Leu 530 535 <210> 3 <211> 1437 <212> DNA <213> Pseudomonas putida <400> 3 atggcgagac tcaaccgcaa cgacccgcaa ttagtaggaa cacttctccc cacccgtatc 60 gaggcagact tgttcgatct agaggttgac ggcgaaatcc caaaatcaat aaatggaacg 120 ttctaccgta atacgccaga acctcaagtt accccgcaaa aattccacac cttcatagat 180 ggagatggaa tggcctctgc cttccacttc gaagatggtc atgtcgactt catcagtcgc 240 tgggttaaaa ccgctcgatt cacggccgaa cgactagcgc gaaaatcgct atttggcatg 300 tacagaaacc cctataccga cgacaccagt gtaaaaggac tagaccgcac cgttgccaat 360 acaagcatca ttagccatca cggcaaggtg ctggcggtga aggaagacgg cctaccgtac 420 gaactggatc ctcgtacact tgaaactcgc ggacgcttcg actacgacgg ccaagttacc 480 agccaaaccc acaccgccca tccaaaatat gacccggaaa cgggtgactt gttgttcttc 540 ggttcggcag ctaagggcga agcaactcca gacatggcct attacattgt cgacaagcac 600 ggcaaggtga cacatgaaac ttggtttgag cagccctatg gcgcattcat gcacgacttt 660 gccattaccc gaaattggtc cattttccca attatgccgg ccaccaacag cctgtcccgc 720 ctcaaggcga aacagccaat ttatatgtgg gagccggaac tgggcagcta cattggcgta 780 ctgccgcgcc gcggccaggg cagtcagatt cgctggctca aggcaccggc gctctgggta 840 tttcatgttg tgaatgcttg ggaagtcgga accaagattt atatcgacct tatggaaagt 900 gaaatcctgc cgttcccctt ccccaactca caaaaccaac ccttcgcccc tgagaaagcc 960 gtaccacgcc tgactcgttg ggaaattgac ctcgatagca gcagcgacga gatcaagcga 1020 acccggctac acgatttctt tgcggaaatg ccaatcatgg attttcgctt cgccctgcaa 1080 tgcaaccgct atggctttat gggggtggac gatccacgca aaccacttgc gcatcagcag 1140 gccgagaaga tatttgcgta caactcactc ggcatctggg acaaccaccg aggtgactac 1200 gacctctggt actccggaga agcctcggcg gcccaggagc cggccttcgt ccctagaagt 1260 ccgaccgccg ccgaaggtga tgggtacttg ctgaccgtgg ttggtcgtct cgatgaaaat 1320 cgcagtgatc tggtaattct cgacactcaa gacatccagt ctggtcccgt ggcaaccatc 1380 aagctgccat tccggttaag ggccgctctc catggctgct gggtacccag accttaa 1437 <210> 4 <211> 478 <212> PRT <213> Pseudomonas putida <400> 4 Met Ala Thr Phe Asp Arg Asn Asp Pro Gln Leu Ala Gly Thr Met Phe 1 5 10 15 Pro Thr Arg Ile Glu Ala Asn Val Phe Asp Leu Glu Ile Glu Gly Glu 20 25 30 Ile Pro Arg Ala Ile Asn Gly Ser Phe Phe Arg Asn Thr Pro Glu Pro 35 40 45 Gln Val Thr Thr Gln Pro Phe His Thr Phe Ile Asp Gly Asp Gly Leu 50 55 60 Ala Ser Ala Phe His Phe Glu Asp Gly Gln Val Asp Phe Val Ser Arg 65 70 75 80 Trp Val Cys Thr Pro Arg Phe Glu Ala Glu Arg Ser Ala Arg Lys Ser 85 90 95 Leu Phe Gly Met Tyr Arg Asn Pro Phe Thr Asp Asp Pro Ser Val Glu 100 105 110 Gly Ile Asp Arg Thr Val Ala Asn Thr Ser Ile Ile Thr His His Gly 115 120 125 Lys Val Leu Ala Ala Lys Glu Asp Gly Leu Pro Tyr Glu Leu Asp Pro 130 135 140 Gln Thr Leu Glu Thr Arg Gly Arg Tyr Asp Tyr Lys Gly Gln Val Thr 145 150 155 160 Ser His Thr His Thr Ala His Pro Lys Phe Asp Pro Gln Thr Gly Glu 165 170 175 Met Leu Leu Phe Gly Ser Ala Ala Lys Gly Glu Arg Thr Leu Asp Met 180 185 190 Ala Tyr Tyr Ile Val Asp Arg Tyr Gly Lys Val Thr His Glu Thr Trp 195 200 205 Phe Lys Gln Pro Tyr Gly Ala Phe Met His Asp Phe Ala Val Thr Arg 210 215 220 Asn Trp Ser Ile Phe Pro Ile Met Pro Ala Thr Asn Ser Leu Glu Arg 225 230 235 240 Leu Lys Ala Lys Gln Pro Ile Tyr Met Trp Glu Pro Glu Arg Gly Ser 245 250 255 Tyr Ile Gly Val Leu Pro Arg Arg Gly Gln Gly Lys Asp Ile Arg Trp 260 265 270 Phe Arg Ala Pro Ala Leu Trp Val Phe His Val Val Asn Ala Trp Glu 275 280 285 Glu Gly Asn Arg Ile Leu Ile Asp Leu Met Glu Ser Glu Ile Leu Pro 290 295 300 Phe Pro Phe Pro Asn Ser Gln Asn Leu Pro Phe Asp Pro Ser Lys Ala 305 310 315 320 Val Pro Arg Leu Thr Arg Trp Glu Ile Asp Leu Asn Ser Gly Asn Asp 325 330 335 Glu Met Lys Arg Thr Gln Leu His Glu Tyr Phe Ala Glu Met Pro Ile 340 345 350 Met Asp Phe Arg Phe Ala Leu Gln Asp His Arg Tyr Ala Tyr Met Gly 355 360 365 Val Asp Asp Pro Arg Arg Pro Leu Ala His Gln Gln Ala Glu Lys Ile 370 375 380 Phe Ala Tyr Asn Ser Leu Gly Val Trp Asp Asn His Arg Lys Asp Tyr 385 390 395 400 Glu Leu Trp Phe Thr Gly Lys Met Ser Ala Ala Gln Glu Pro Ala Phe 405 410 415 Val Pro Arg Ser Pro Asp Ala Pro Glu Gly Asp Gly Tyr Leu Leu Ser 420 425 430 Val Val Gly Arg Leu Asp Glu Asp Arg Ser Asp Leu Val Ile Leu Asp 435 440 445 Thr Gln Cys Leu Ala Ala Gly Pro Val Ala Thr Val Lys Leu Pro Phe 450 455 460 Arg Leu Arg Ala Ala Leu His Gly Cys Trp Gln Ser Lys Asn 465 470 475 <210> 5 <211> 2325 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Plasmid <400> 5 ggcagtgagc gcaacgcaat taatgtgagt tagctcactc attaggcacc atcgtttagg 60 caccccaggc tttacacttt atgcttccgg ctcgtataat gtgtggaatt gtgagcggat 120 aacaatttca actataagaa ggagatatac atatggcgga tccgaattcg gcgcgccaga 180 tctcaattgg atatcggccg gccgacgtcg gtaccgcggc cgccaccgct gagcaataac 240 tagcataacc ccttggggcc tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa 300 ctatatccgg gtaacgaatt caagcttgat atcattcagg acgagcctca gactccagcg 360 taactggact gcaatcaact cactggctca ccttcacggg tgggcctttc ttcggtagaa 420 aatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa 480 aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc 540 gaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg ttcttctagt gtagccgtag 600 ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg 660 ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga 720 tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc 780 ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc 840 acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga 900 gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt 960 cgccacctct gacttgagca tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg 1020 aaaaacgcca gcaacgcaga aaggcccacc cgaaggtgag ccaggtgatt acatttgggc 1080 cctcatcaga ggttttcacc gtcatcaccg aaacgcgcga ggcagctgcg gtaaagctca 1140 tcagcgtggt cgtgaagcga ttcacagatg tctgcctgtt catccgcgtc cagctcgttg 1200 agtttctcca gaagcgttaa tgtctggctt ctgataaagc gggccatgtt aagggcggtt 1260 ttttcctgtt tggtcattta ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt 1320 ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag 1380 ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca 1440 gatttatcag caataaacca gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact 1500 ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca 1560 gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg 1620 tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc 1680 atgttgtgca aaaaagcggt tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg 1740 gccgcagtgt tatcactcat ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca 1800 tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt 1860 atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc 1920 agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc 1980 ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca 2040 tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa 2100 aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga atactcatag ctcctgaaaa tctcgataac 2160 tcaaaaaata cgcccggtag tgatcttatt tcattatggt gaaagttgga acctcttacg 2220 tgccgatcaa gtcaaaagcc tccggtcgga ggcttttgac tttctgctat ggaggtcagg 2280 tatgatttaa atggtcagta ttgagcgata tctagagaat tcgtc 2325 <210> 6 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 ggaattccat atggcaccgg gtcgtaccga tgatgaagc 39 <210> 7 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 aaggaaaaaa gcggccgcca gcggttccag tgcaccctga cc 42 <210> 8 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 aaggaaaaaa gcggccgctt acagcggttc cagtgcaccc tgacc 45 <210> 9 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 9 ggaattccat atgagcgcac cggaagaaca tcatgg 36 <210> 10 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 10 aaggaaaaaa gcggccgctg ccagcggttc cagtgcacca cg 42 <210> 11 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 11 aaggaaaaaa gcggccgctt atgccagcgg ttccagtgca ccacg 45

Claims (25)

1. 바닐린(vanillin)을 생산하는 생물전환 방법(bioconversion method)으로서,
   a. 혼합물에서 CfIEM 유전자를 발현시키는 단계로서, 발현된 CfIEM 유전자는 상기 혼합물에서 서열번호 2와 적어도 70% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는, 상기 발현시키는 단계;
   b. 상기 혼합물에 아이소유제놀(isoeugenol)을 공급하는 단계; 및
   c. 상기 아이소유제놀을 바닐린으로 전환시키는 단계
   를 포함하는, 바닐린을 생산하는 생물전환방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 발현된 CfIEM 유전자는 서열번호 2와 적어도 80% 동일성을 가진 아미노산 서열을 갖는, 바닐린을 생산하는 생물전환방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 발현된 CfIEM 유전자는 서열번호 2와 적어도 90% 동일성을 가진 아미노산 서열을 갖는, 바닐린을 생산하는 생물전환방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 발현된 CfIEM 유전자는 서열번호 2와 적어도 95% 동일성을 가진 아미노산 서열을 갖는, 바닐린을 생산하는 생물전환방법.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CfIEM 유전자를 발현시키는 단계는 시험관내 번역(in vitro translation)에 의해 상기 유전자를 발현시키는 단계; 세포계에서 상기 유전자를 발현시키는 단계; 및 박테리아 또는 효모 세포에서 상기 유전자를 발현시키는 단계로 이루어진 군으로부터 선택되는, 바닐린을 생산하는 생물전환방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 CfIEM 유전자를 재조합 단백질로서 발현시키는 단계로부터의 산물을 정제시키는 단계를 더 포함하는, 바닐린을 생산하는 생물전환방법.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바닐린을 수집하는 단계를 더 포함하는, 바닐린을 생산하는 생물전환방법.
8. 제7항에 있어서, 아이소유제놀로부터 바닐린으로의 전환율이 80%보다 높은, 바닐린을 생산하는 생물전환방법.
9. 제7항에 있어서, 아이소유제놀로부터 바닐린으로의 전환율이 85%보다 높은, 바닐린을 생산하는 생물전환방법.
10. 제7항에 있어서, 아이소유제놀로부터 바닐린으로의 전환율이 90%보다 높은, 바닐린을 생산하는 생물전환방법.
11. 단리된 재조합 숙주 세포를 이용해서 바닐린을 생산하는 방법으로서,
    (i) 배지에서 단리된 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계; (ii) 아이소유제놀의 바닐린으로의 생물전환을 개시시키기 위하여 (i)의 상기 배지에 아이소유제놀을 첨가하는 단계; 및 (iii) 상기 배지로부터 바닐린을 추출하는 단계를 포함하되, 상기 단리된 재조합 숙주 세포는 아이소유제놀 모노옥시게나제를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 작제물로 형질전환되었고, 상기 아이소유제놀 모노옥시게나제는 서열번호 2와 적어도 70% 동일성을 가진 아미노산 서열을 갖는, 바닐린을 생산하는 생물전환방법.
12. 제11항에 있어서, 상기 아이소유제놀 모노옥시게나제는 서열번호 2와 적어도 80% 동일성을 가진 아미노산 서열을 갖는, 바닐린을 생산하는 생물전환방법.
13. 제11항에 있어서, 상기 아이소유제놀 모노옥시게나제는 서열번호 2와 적어도 90% 동일성을 가진 아미노산 서열을 갖는, 바닐린을 생산하는 생물전환방법.
14. 제11항에 있어서, 상기 아이소유제놀 모노옥시게나제는 서열번호 2와 적어도 95% 동일성을 가진 아미노산 서열을 갖는, 바닐린을 생산하는 생물전환방법.
15. 소모품을 제조하는 방법으로서,
    제1항 또는 제11항의 방법에 따라서 바닐린을 생산하는 단계; 상기 바닐린을 수집하는 단계; 및 상기 바닐린을 소모품에 혼입시키는 단계를 포함하는, 소모품을 제조하는 방법.
16. 제15항에 있어서, 상기 바닐린을 상기 소모품과 혼합하는 단계를 포함하는, 소모품을 제조하는 방법.
17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 바닐린은 향기 노트(flavor note)를 부여하는데 충분한 양으로 상기 소모품에 혼입되는, 소모품을 제조하는 방법.
18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소모품은 착향제품(flavored product), 식료품(food product), 식품 전구체 제품, 식재(foodstuff)의 제제에 이용되는 첨가제, 약제학적 조성물, 식이보충제, 영양 제품 및 화장품으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 소모품을 제조하는 방법.
19. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 바닐린은 향 노트(fragrance note)를 부여하는데 충분한 양으로 상기 소모품에 혼입되는, 소모품을 제조하는 방법.
20. 제15항, 제16항, 제19항 및 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소모품은 방향제품(fragrant product), 화장품, 세면용품 및 가정용 세정 제품으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 소모품을 제조하는 방법.
21. 핵산 작제물로 형질전환된 단리된 재조합 숙주 세포로서,
    아이소유제놀 모노옥시게나제를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 상기 아이소유제놀 모노옥시게나제는 서열번호 2와 적어도 70% 동일성을 가진 아미노산 서열을 갖는, 단리된 재조합 숙주 세포.
22. 제21항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는, 단리된 재조합 숙주 세포.
23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 서열번호 5의 단리된 핵산 서열을 함유하는 벡터를 더 포함하는, 단리된 재조합 숙주 세포.
24. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포는 박테리아, 효모, 콜레토트리쿰(Colletotrichum)이 아닌 사상균, 사이아노박테리아, 해조류 및 식물 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는, 단리된 재조합 숙주 세포.
25. 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포는 에셰리키아(Escherichia); 살모넬라(Salmonella); 바실러스(Bacillus); 아시네토박터(Acinetobacter); 스트렙토마이세스(Streptomyces); 코리네박테리움(Corynebacterium); 메틸로시누스(Methylosinus); 메틸로모나스(Methylomonas); 로도코커스(Rhodococcus); 슈도모나스(Pseudomonas); 로도박터(Rhodobacter); 시네코시스티스(Synechocystis); 사카로마이세스(Saccharomyces); 자이고 사카로마이세스(ZygoSaccharomyces); 클루이베로마이세스(Kluyveromyces); 칸디다(Candida); 한세눌라(Hansenula); 데바리오마이세스(Debaryomyces); 무코르(Mucor); 피치아(Pichia); 토룰롭시스(Torulopsis); 아스페르길루스(Aspergillus); 아르트로보틀리스(Arthrobotlys); 브레비박테리아(Brevibacteria); 마이크로박테륨(Microbacterium); 아르트로박터(Arthrobacter); 시트로박터(Citrobacter); 클렙시엘라(Klebsiella); 판토에아(Pantoea); 및 클로스트리듐(Clostridium)으로 이루어진 미생물의 군으로부터 선택되는, 단리된 재조합 숙주 세포.

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