KR20210151202A - 신장 이식을 위한 방법 및 장치 - Google Patents

Abstract

본 발명은 4시간 이상 동안 온열 허혈에 노출된, 예를 들어, 심장 정지 사체로부터 적출된 신장을 복구하기 위한 방법 및 장치 및 유체에 관한 것이다. 적출 후 백테이블 상에서 신장에 리스-플라스미노겐을 주입하고 15분 후에 t-PA를 주입한다. 알부민 및 전해질을 포함하는 과삼투성 순환액을 첨가한 후, 상기 리스-플라스미노겐 및 t-PA와 함께 신장을 통해 순환시켜, 순환 압력을 30 내지 75분 동안 20mmHg에서 70mmHg로 증가시키되, 예를 들어 5분당 5mmHg의 단계로 증가시킨다. 그 다음, 통상적 기준에 따라 신장을 평가한다.

Description

신장 이식을 위한 방법 및 장치

본 발명은 신장 적출 및 신장 보존 및 평가에 관한 것이다.

현재 이식 가능한 신장 풀은 뇌사시 여전히 기계적 호흡에 노출되어 있고 심장이 여전히 뛰고 있는 환자의 신장으로 주로 제한된다. 추가적으로, 살아 있는 기증자의 신장도 사용된다.

병원으로 이송되기 전이나 이송 중에 심장마비로 사망한 환자의 신장은 일반적으로 이식에 사용되지 않는다. 일부 경우에, 특히 심정지에서 신장 적출까지의 시간이 짧은 경우, 즉 30분에서 60분 미만인 경우, 그러한 신장이 사용된 적도 있다. 심정지에서 적출까지의 시간이 1시간 이상인 경우, 이런 신장은 일반적으로 이식에 적합하지 않다. 이와 같은 두 번째 신장 풀을 사용할 수 있다면, 이식할 수 있는 신장의 수는 10배 내지 100배까지 증가할 수 있다.

심정지 후 신장은 따뜻한 허혈에 노출되어 신장에 대사 독성 최종 생성물이 축적된다. 이는 산소가 공급된 혈액의 순환 장애로 인한 대사 최종 산물의 축적으로 인한 것이다.

심정지 후 초기에, 응고 시스템이 활성화되고 미세순환계에 피브린 혈전이 형성되는데, 이로 인해, 예를 들어 환자가 소생술에 노출되어 생존하는 경우 해결되는데 몇 시간 또는 수일이 걸리는 혈전 이벤트가 발생하게 된다.

사망하게 되면, 장의 미생물 장벽 기능이 가동되지 않아, 일부 경우에 5분 이내에 LPS와 같은 내독소 및 사이토카인 방출을 동반하는 박테리아 과증식이 발생하기 시작한다. 따라서, 순환계가 정지한 사망 기증자의 신장 사용은 한계가 있는 것으로 간주되며, 대부분의 경우 순환 정지가 통제되는 상황에서의 신장이 사용된다. 2시간 이상의 온열 허혈이 있는 신장은 일반적으로 이식에 적합하지 않은 것으로 간주된다.

신장이 냉각되면, 대사 과정이 섭씨 1℃에 약 6%씩 감소한다. 28℃에서는 대사 공정이 약 50%로, 22℃에서는 약 25%로 감소한다.

시체의 정상적인 냉각은 시간당 최대 2℃까지 발생한다. 따라서, 5시간 후 신체와 신장의 온도는 약 27℃가 될 수 있다.

따라서, 신장의 두 번째 풀이 더 광범위하게 사용될 수 있는, 적출 후 신장을 재생하는 방법이 당업계에 필요하다.

특허 공개 EP 0 631 786 A1(초록)는 리스-플라스미노겐(lys-plasminogen) 및 유사 물질을 포함하는 플라스민 및 플라스민 형성 단백질의 투여를 수반하는 허혈 및 수반되는 재관류 손상의 치료에 관해 개시하고 있다. 글루-플라스미노겐(glu-plasminogen)의 단백질 분해 절단으로부터 수득될 수 있는 리스-플라스미노겐은 허혈성 병태에 의해 손상된 조직에 보호 효과가 있는 것으로 밝혀졌다. 리스-플라스미노겐은 재관류 시간 동안 및 재관류가 이미 발생한 후에 개체를 치료하는 데 투여되어 사용될 수 있다. 리스-플라스미노겐은, 또한 조직 플라스미노겐 활성제 등을 사용하는 것과 같은, 혈전 용해 요법과 함께 투여될 수 있다. 외과적 절차로 인한 허혈성 상태 및 후속적인 재관류 손상은 리스-플라스미노겐 또는 리스-플라스미노겐 전구체의 효과를 갖는 단백질로 예방하거나 치료될 수 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 단백질은 이미 이식된 기증자의 장기 또는 조직에 뿐만 아니라 기증자와 수증자의 주변 장기 및 조직에도 유익한 영향을 미칠 수 있다. 리스-플라스미노겐 또는 리스-플라스미노겐 전구체의 효과를 갖는 단백질의 투여에 의해 장기 및 조직이 이식 후 재관류에 의해 야기되는 생리학적 스트레스뿐 아니라 장기간의 허혈을 견딜 수 있다. 외과적 수술을 시작하기 전, 리스-플라스미노겐 또는 리스-플라스미노겐 전구체의 효과가 있는 단백질을 투여함으로써 장기 및 조직 손상을 줄이거나 완전히 예방할 수 있다. 이식의 경우, 장기나 조직을 제거하기 전에 기증자에게 이 단백질을 투여할 수 있다. 기증자는 해당 장기 또는 조직을 제거하기 전에 장기 또는 조직에 공급하는 동맥으로 전신적으로 또는 국부적으로 처치될 수 있다. 마찬가지로, 장기나 조직의 수증자는 이식 전 이식 부위의 주변 장기와 조직뿐 아니라, 수증자 내에 배치될 장기 또는 조직을 보호하기 위해 처치될 수 있다. 리스-플라스미노겐 또는 리스-플라스미노겐 전구체의 효과를 갖는 단백질은 또한 재관류 동안 또는 후에 투여될 수 있다. 따라서, 본 특허문헌은 여전히 순환계가 작동하는 기증자 또는 수증자의 신체에 리스-플라스미노겐을 투여할 것을 제안하며, 그렇지 않으면 효과가 없을 것이다.

따라서, 본 발명의 목적은 상기 확인된 결점 및 단점 중 하나 이상을 단독으로 또는 임의의 조합으로 완화, 경감 또는 제거하는 것이다.

일 양태에서, 본 발명은 기증자로부터, 예를 들어 심정지 기증자(DCD; a cardiac arrest donor)로부터 적출된 신장을 회수하는 방법에 관한 것으로서, 기증자가 순환 정지가 온 후 적어도 2시간에 기증자로부터 신장을 적출하는 단계; 적출 후 신장에 리스-플라스미노겐을 제공하는 단계로서, 리스-플라스미노겐은 제1 과삼투(hyperoncotic) 용액에 포함되는, 단계; 리스-플라스미노겐을 제공함과 동시에 또는 제공 후에 조직 플라스미노겐 활성화제(tPa)를 제공하는 단계로서, 상기 조직 플라스미노겐 활성화제는 제2 과삼투 용액에 포함되는 단계; 제1 회복 단계에서, 5℃ 내지 25℃의 저온에서 알부민 및 전해질을 포함하는 제3 과삼투 액을 신장을 통해 순환시키는 단계; 제2 회복 단계에서, 30℃ 내지 37℃의 온도에서 적혈구(red blood cells; RBC)를 포함하는 제4 과삼투 액을 신장을 통해 순환시키는 단계; 및 통상의 기준에 따라 신장을 평가하는 단계를 포함한다.

일 실시양태에서, 제1 회복 단계는: 신장을 통해 상기 제3 과삼투 액을 순환시키는 것을 포함하되, 상기 제3 과삼투 액은 50g/L 내지 120g/L 농도의 알부민을 포함하여 순환 압력이 증가되는데, 예를 들어, 30 내지 75분 동안 약 20mmHg에서 90mmHg까지, 예를 들어 5분당 5mmHg의 단계로 증가된다. 제2 회복 단계는: 신장을 통해 상기 제4 과삼투 액을 순환시키는 것을 포함하되, 상기 제4 과삼투 액은 50g/L 내지 120g/L의 농도로 알부민을 포함하고, 이에 의해 순환 압력이 증가되는데, 예를 들어, 30 내지 75분 동안 약 20mmHg에서 90mmHg까지, 예를 들어 5분당 5mmHg/L의 단계로 증가된다.

또 다른 실시양태에서, 본 방법은 1시간 내지 7시간의 시간 동안 30mmHg 미만의 압력에서 신장을 통해 보존액을 순환시키면서 4℃ 내지 16℃의 저온에서 신장을 저장하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 저장 단계는 제2 회복 단계 이후 또는 회복 단계들 사이에 수행될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 제1 및 제2 과삼투 액 중 적어도 하나는 생리학적 농도의 전해질 및 알부민을 포함하고, 상기 제1 및 제2 과삼투 액은 50g/L 내지 120g/L 농도의 알부민을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 제1, 제2, 제3 및 제4 과삼투 액 중 적어도 하나는 항트롬빈 III과 같은 응고 억제제; 아르가트로반과 같은 직접 트롬빈 억제제; 단백질 C; 단백질 S; 및 아브식시맙과 같은 혈소판 억제제를 더 포함할 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 제3 및 제4 과삼투 액 중 적어도 하나는 백혈구 필터를 통해 순환된다. 또한, 제3 및 제4 과삼투 액 중 적어도 하나는 사이토카인의 흡착을 위해 사이토흡착제(Cytosorbent)와 같은 사이토카인 흡착제로 접촉될 수 있다. 또한, 제3 및 제4 과삼투 액 중 적어도 하나는 내독소의 흡착을 위해 LPS 흡착제와 같은 내독소 흡착제로 접촉될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 본 방법은 기증자가 3시간 이상 동안 순환 정지를 일으킨 후 기증자로부터 신장을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 상기 3시간 이상은 기증자의 복부에 설치된 차가운 식염수, 얼음 또는 얼음 슬러시에 의한 국소 냉각 시간 2시간 이하를 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 기증자, 예를 들어 심정지 기증자(DCD; cardiac arrest donor)로부터 적출된 신장을 회수하는 방법에 관한 것으로서, 기증자가 순환 정지를 당한 후 적어도 4시간에 기증자로부터 신장을 적출하는 단계; 적출 후 신장에 리스-플라스미노겐을 제공하는 단계로서, 상기 리스-플라스미노겐은 50g/L 내지 70g/L 농도의 알부민 및 항트롬빈 III과 같은 응고 억제제를 포함하는 제1 과삼투 액에 포함되는, 단계; 리스-플라스미노겐을 제공함과 동시에 또는 제공 후에 조직 플라스미노겐 활성화제(tPA)를 신장에 제공하는 단계로서, 상기 조직 플라스미노겐 활성화제는 50g/L 내지 70g/L 농도의 알부민 및 항트롬빈 III과 같은 응고 억제제를 포함하는 제2 과삼투 액에 포함되는 단계; 제1 회복 단계에서, 압력을 20mmHg에서 70mmHg 내지 90mmHg로 증가시키면서, 50g/L 내지 120g/L 농도의 알부민 및 전해질 및 응고 억제제, 예를 들어 항트롬빈 III을 포함하는 제3 과삼투 액을 5℃ 내지 25℃의 저온에서 신장을 통해 순환시키는 단계; 제2 회복 단계에서, 적혈구 세포(RBC), 50g/L 내지 120g/L 농도의 알부민 및 전해질 및 응고 억제제, 예를 들어 항트롬빈 III을 포함하는 제4 과삼투 액을 30℃ - 37℃의 온도에서 신장을 통해 순환시키는 단계; 및 통상의 기준에 따라 신장을 평가하는 단계를 포함한다.

다른 양태에서, 본 발명은 기증자, 예를 들어 순환 정지 기증자(DCD)로부터 적출된 신장을 회수하기 위한 장치에 관한 것으로서, 본 장치는 치료될 신장을 수용하기 위한 용기; 정맥이 개방된 신장의 동맥에 연결하기 위한 커넥터; 용기에 존재하는 순환액을 신장을 통해 순환시키기 위해 용기와 상기 커넥터 사이에 연결된 순환 펌프; 배수 밸브를 통해 용기에 연결된 배수구; 용기에 유체를 제공하기 위한 유체 밸브를 통해 용기에 연결된 적어도 하나의 백; 펌프에 의해 펌핑된 유체에 산소를 공급하기 위한 산소 공급기; 펌프에 의해 펌핑되는 유체의 온도를 제어하기 위한 가열기/냉각기; 상기 펌프에 의해 펌핑된 유체 내의 백혈구를 제거하기 위한 백혈구 필터; 용기의 유체에서 내독소를 제거하도록 배열된 내독소 흡착기; 용기의 유체에서 사이토카인을 제거하도록 배열된 사이토카인 흡착기; 및 상기 용기의 유체 내의 백혈구를 제거하도록 배치된 백혈구 필터를 포함한다.

추가적인 측면에서, 본 발명은 리스-플라스미노겐; tPA; 전해질; 및 50g/L 내지 120g/L 농도의 알부민을 포함하는, 청구항 1 내지 11에 기재된 방법들 중 하나를 수행하기 위한 유체(fluid)에 관한 것이다.

본 발명의 추가 목적, 특징 및 이점은 하기 도면을 참조하여 본 발명의 실시예에 대한 다음의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다.
도 l은 대동맥과 대정맥을 절단하여 앙상블로 적출한 두 개의 신장의 개략도이다.
도 2는 신장의 모세관 시스템의 개략도이다.
도 3은 본 방법을 수행하기 위한 장치의 실시예에 대한 개략적인 블록도이다.
도 4는 본 방법을 수행하기 위한 장치의 다른 실시예에 대한 개략적인 블록도이다.
도 5는 본 방법을 수행하기 위한 장치의 또 다른 실시예에 대한 개략적인 블록도이다.
도 5a는 본 방법을 수행하기 위한 장치의 또 다른 실시예에 대한 개략적인 블록도이다.
도 5b는 2개의 신장의 개별 치료를 위한 도 5a와 유사한 개략적인 블록도이다.
도 6은 실시예 1에서 동맥혈류의 변화를 나타내는 도면이다.
도 7은 실시예 1에서 소변 생성을 나타내는 도면이다.
도 8은 실시예 2에서 신동맥(renal arterial) 혈류를 나타내는 도면이다.
도 9는 실시예 3에서 신동맥 혈류를 나타내는 도면이다.
도 10은 실시예 4에서 이식 후의 신동맥 혈류를 나타내는 도면이다.
도 11은 실시예 6에서 이식 후의 신동맥 혈류를 나타내는 도면이다.
도 12는 실시예 7에서 이식 후의 신동맥 혈류를 나타내는 도면이다.
도 13은 실시예 9에서 이식 후의 신동맥 혈류를 나타내는 도면이다.
도 14는 실시예 9의 신장 사진이다.
도 15a, 15b, 15c 및 15d는 실시예 9에 따라 이식된 신장의 사진이다.
도 16a는 주로 RBC로부터의 IL-6 수준의 변화를 나타내는 도면이다.
도 16b는 또한 주로 RBC로부터의 IL-8 수준의 변화를 보여주는 도면이다.
도 16c는 또한 주로 RBC로부터의 IL-1β 수준의 변화를 보여주는 다이어그램이다.
도 16d는 또한 주로 RBC로부터의 TNF-α 수준의 변화를 보여주는 도면이다.
도 17은 실시예 12에 따라 약 300 mosm의 삼투압 농도를 사용한, 변형된 용액으로 관류한 후의 흐름을 나타내는 다이어그램이다.
도 18은 실시예 14에 따른 압력, 흐름 및 저항을 나타내는 도면이다.
도 19 내지 도 22는 실시예 16에 따른 이식 전후의 크레아티닌을 나타낸 도이다.
도 23 및 24는 실시예 16에 따른 신장 사진이다.

구현예의 상세한 설명

이하, 본 발명의 여러 구현예가 설명될 것이다. 이들 구현예는 당업자가 본 발명을 수행하고 최상의 모드를 개시할 수 있도록 하기 위한 목적을 예시하기 위해 설명된다. 그러나, 이러한 구현예는 발명의 범위를 제한하지 않는다. 또한, 특징들의 특정 조합이 표시되고 논의된다. 그러나, 본 발명의 범위 내에서 상이한 특징의 다른 조합이 가능하다.

심장 박동이 멈추면 혈액 순환이 중단된다. 이는 혈액 순환을 유지하기 위해 신체에서 일련의 사건을 초래할 수 있다. 이는 뇌 탈출(brain herniation) 후 뇌사의 경우, 자율 카테콜아민 폭풍이라고 하며, 여기서 다량의 아드레날린과 노르아드레날린이 심혈관의 안정성을 유지하기 위한 시도로 체내에서 방출된다. 최종 결과는 뇌사 및 심장 마비이다. 뇌 탈출 전에 심정지가 발생하면 카테콜아민 폭풍 없이 응고 및 염증 시스템에 영향을 미치는 다른 일련의 사건이 뒤따를 것이다. 심정지 및 순환 정지로 인한 사망 이후의 사건에 대해서는 알려진 바가 적다.

심정지 및 사망 후, 15분에서 25분 사이에 팔러 모티스(pallor mortis)라는 과정이 발생하고, 피부가 창백해진다. 팔러 모티스는 전신을 통한 모세혈관 순환의 중단으로 인한 결과이다.

그 다음, 알고르 모티스(algor mortis)라는 과정이 발생하는데, 여기에서는 체온이 주변 온도와 일치할 때까지 변화된다. 약 4시간 후, 체온은 주변 온도에 따라 약 27℃ ~ 29℃ 이하가 되고, 약 9시간 이후 체온은 약 28℃가 된다.

그 후, 리거 모티스(rigor mortis)라는 과정이 발생하는데, 이는 근육이 경직되는 사후 경직이다. 사망 후, 호흡이 중단되어 ATP(아데노신 삼인산) 생성에 사용되는 산소 공급원이 고갈된다. ATP는 근육 이완 동안 액틴-미오신 교차-브리지의 분리를 유발하는 데 필요하다. 그 브리지를 분해할 수 없기 때문에 몸은 리거 모티스 과정으로 들어간다. 리거 모티스에서, 미오신 헤드가 아데노신 이인산(ADP)을 통해 액틴 단백질의 활성 부위와 계속 결합하고 추가적인 효소 활동으로 복합체가 분해될 때까지 근육은 이완될 수 없다.

리거 모티스는 심정지 후 약 1-4시간 후에 시작되어 약 12시간 후에 최고조에 달한다. 이는 신체의 모든 근육과 신장을 포함한 모든 장기에 영향을 미친다.

심정지 환자를 병원에서 멀리 떨어진 곳에서 조달하는 경우, 심정지 기간과 신장에 미치는 영향을 평가하기는 어렵다. 따라서, 원거리 심정지 신체는 일반적으로 이식 목적으로 사용되지 않는다. 본 발명은 이러한 신장을 회복하고 이식 전에 이러한 신장을 복원, 평가 및 저장하는 것을 목적으로 한다.

신장을 일찍 적출할수록 신장의 결과가 더 좋다.

그러나, 본 발명의 실시예에 따른 회수 과정은, 사망 및 순환 정지 후 시간이 길어질수록 결과가 덜 양호하기는 하나, 리거 모티스의 정점 이전 및 정점까지 신장을 재생(recondition)하는 것을 가능케 한다.

위에서 언급한 모든 활동은 심정지 체내의 신장을 간섭한다.

심정지는 혈액의 응고 시스템을 활성화시켜, 궁극적으로 모세혈관에 미세혈전을 생성할 수 있는 응고촉진 상태를 초래할 수 있다. 감소된 체온이 응고 과정의 활성화 및 비활성화 모두에서 응고 과정에 어떤 영향을 미치는지에 대해서는 알려진 바가 거의 없다.

생체의 순환계가 작동할 때, 혈액이 응고되는지 여부는 두 그룹의 물질, 즉 응혈제(procoagulants)라고 하는 응고 촉진제와 항응혈제(anticoagulants)라고 하는 응혈을 저해하는 물질 간의 균형에 달려 있다. 정상적인 혈류에서는, 혈액이 혈관을 순환하는 동안 혈액이 응고되지 않도록 항응혈제가 우세하다.

심정지 후 혈액 순환이 중단될 때 시간이 지남에 따라 응고 시스템에 어떤 일이 발생하는지는 거의 알려진 바가 없다. 어떠한 이론에도 구속되지 않고, 순환 정지가 왔을 때 항응혈제가 하향 조절되고 응혈제가 활성화되며, 이는 또한 순환 정지의 원인에 따라 좌우되는 것으로 여겨진다. 이 과정은 느릴 수 있으며 시간이 지남에 따라 온도가 감소하는 데에도 영향을 받는다.

화학적으로 깨끗한 유리 시험관에 혈액을 모으면 혈액은 일반적으로 6~10분 안에 응고되는 것으로 알려져 있으며, 이는 종종 응고 장애 판정에 사용된다. 그러나 유리관을 실리콘 처리한 용기로 교체하면 혈소판이 활성화되지 않아 1시간 이상 혈액이 응고되지 않을 수 있다. 따라서, 적출된 신장에 갇힌 혈액은 1시간 또는 그 이상이 될 때까지 응고되지 않을 것이라고 여겨진다. 2~4시간 후에 광범위한 응고가 발생한다.

심장의 압력이 멈추면 일부 혈관, 특히 모세 혈관이 좁아지고, 이는 팔러 모티스의 원인이 될 수 있다. 시간이 더 지나면, 혈액에 알부민과 기타 삼투성 물질의 존재로 인해 주변 조직에서 혈관으로 물이 한외여과되어 혈관, 특히 세동맥과 정맥, 더 큰 혈관이 확장된다. 시간이 지남에 따라 적혈구가 분리되어 침강 반응으로 혈관의 가장 낮은 부분으로 가라 앉는다. 백혈구와 혈소판을 포함하는 버피 코트(buffy coat)가 적혈구 위에 형성된다. 버피 코트에는 혈소판 및 기타 단백질 농도가 증가한다. 혈관 확장은 혈소판과 상호작용하고 약 2-4시간 후에 혈소판을 활성화시키는 혈관의 일부를 노출시킬 수 있다. 또한, 혈액 순환이 없기 때문에 혈소판은 내피 세포와 상호 작용할 수 있고, 특히 혈관 표면에서 혈관 손상이 있는 경우, 내피 세포에 부착될 수 있다. 이러한 상호 작용은 내피 세포를 추가로 손상시킬 수 있으며 결국 혈전 형성을 초래할 수 있다. 이러한 혈전은 순환이 없는 혈관의 어느 부분에서든 형성될 수 있다. 온도 감소는 또한 다양한 방식으로 응고 시스템에 영향을 미친다. 일반적으로 온도가 낮을수록 화학 반응은 느려진다. 따라서, 일정 시간 후, 일반적으로 몇 시간, 예를 들어 1 내지 4시간 후에, 혈관은 혈관 벽에 부착되는 복수의 더 작거나 더 큰 혈전을 포함할 수 있다. 이러한 응고는 일반적으로 기증자로부터 신장을 조달한 후에 행하는 신장의 혈관 세척에 의해서는 씻겨 나갈 수 없다. 사실, 높은 압력과 높은 플러싱 흐름으로 혈전을 씻어내려고 시도하면 혈전이 찢겨나간 내피 세포에 손상을 줄 수 있다. 대신, 이러한 혈전은 신장을 적출한 후 이식하기 전에 보관하는 동안 남아 있다. 신장이 궁극적으로 수증자에게 이식되면, 혈관이 수증자의 혈액에 노출되어 혈관의 손상된 부위에 새로운 혈전이 형성될 수 있다. 따라서, 특히 순환 정지 후 2시간, 3시간, 4시간 또는 그 이상과 같이 일정 시간이 지난 후 신장이 기증자로부터 조달된 경우, 가능한 한 빨리 혈전을 제거하는 것이 중요하다. 이러한 혈전은 순환 정지 후 일정 시간이 지나면 생성되기 때문에 4시간 또는 그 이상과 같이 장기간 순환 정지 후에 기증자로부터 적출된 신장에서 더 문제가 된다. 반면, 저온에 의해 이 과정이 느려지므로, 적출하기 전에 기증자 신체를 더 빨리 냉각하면 응고 진행을 줄일 수 있다.

신장은 도 2에서 보는 바와 같이, 두 개의 연속적으로 연결된 모세혈관 시스템인 사구체 모세혈관과 세관 주위 모세혈관(the glomerular capillaries and the peritubular capillaries) 및 두 모세혈관 사이에 배열된 원심성 세동맥을 포함한다는 점에서 특별하다. 따라서, 두 모세혈관 시스템 모두에서 미세 혈전이 형성되었을 수 있다. 또한, 모세혈관 시스템 사이에 동반되는 원심성 세동맥에 더 큰 혈전이 형성되었을 수 있다. 응고 과정은 신장에 영향을 미치고 두 모세혈관 시스템과 그 사이에 존재하는 원심성 세동맥을 차단한다. 따라서, 미세혈전이 형성된 신장에서 혈전을 씻어내는 것은 어렵다.

혈전이 형성되면, 다량의 플라스미노겐이 다른 혈장 단백질과 함께 혈전에 포획된다. 플라스미노겐은 활성화될 때까지 플라스민이 되지 않거나 혈전 용해를 일으키지 않는다. 생체 내에서, 손상된 조직과 혈관 내피는 조직 플라스미노겐 활성화제(tPA)라고 하는 강력한 활성화제를 매우 천천히 방출하여 나중에 플라스미노겐을 플라스민으로 전환시키고, 이는 나머지 혈전을 제거한다. 실제로, 혈전에 의해 혈류가 차단된 많은 작은 혈관이 생체 내에서 이러한 메커니즘에 의해 다시 열린다. 따라서, 플라스민 시스템의 특히 중요한 기능은, 제거할 방법이 없다면 결국 폐색되었을 수백만 개의 작은 말초 혈관으로부터 미세한 혈전을 제거하는 것이다.

혈전에 갇힌 플라스미노겐은 일반적으로 글루-플라스미노겐이며, 이는 tPA에 노출시 천천히 플라스민으로 전환된다. 이로 인해 이 시스템이 천천히 시작된다. 그러나, 시간이 지나면 글루-플라스미노겐이 리스-플라스미노겐으로 전환되며, 이는 훨씬 빠르게 플라스민으로 전환된다. 따라서, 최대 48시간까지 걸릴 수 있는, 초기 시간 이후에 혈전 용해 속도를 증가시키는 양성 증폭 시스템이 있다.

오랜 실험 끝에, 본 발명자는 허혈의 처음 몇 시간 동안 혈전 형성이 신장에 해로울 수 있다는 결론을 내렸다. 혈소판은 혈액의 비-흐름에 의해 활성화되고 형성된 혈전은 혈전 부근의 내피 세포에 영향을 미치고 손상을 줄 수 있다고 여겨진다. 사망 및 순환 정지 후 순환이 없기 때문에, 혈전이 내피 세포에 오랜 시간동안 영향을 미치게 되고, 이는 손상되게 된다.

내인성 용해 시스템은 기증자 신장에서 미세혈전의 용해를 위해 사용될 수 있다. 그러나, 혈전 용해는 느리다. 실제로, 다량의 tPA의 첨가가 플라스미노겐의 플라스민으로의 활성화 속도를 증가시키지는 않을 것이다.

그러나, 리스-플라스미노겐의 첨가와 tPA의 첨가는 혈전의 용해를 향상시키고 과정을 가속화할 것이라고 밝혀졌다. 국소 내피는 섬유소 용해 처리 후 더 취약하기 때문에 재혈전증을 방지하기 위해, 혈전 용해 후 국소 환경에서도 주의를 기울일 필요가 있다.

재생 과정을 검증하기 위해, 4시간 이상 온 허혈에 노출된 돼지의 신장을 실험 목적으로 사용했다. 6시간, 8시간, 10시간, 12시간 또는 그 이상 동안 허혈에 노출된 신장이 회복될 수 있다는 증거가 있다. 또한, 1시간 이하 동안 허혈에 노출된 신장도 다소간 이 공정의 혜택을 받을 수 있으며, 따라서, 연장된 온 또는 냉 허혈 시간으로 인해, 또는 연령, 고혈압, 당뇨병, 저혈압, 중환자실(ICU)에서의 시간, 무뇨증, 높은 실험실 수치, 백테이블에서 신장 관류 불량, 또는 이식을 위해 기증자를 주로 받아들일 수 없는 기타 원인 등과 같은 기타 공동 기반 요인에 의해 한계로 간주되는 뇌사 기증자(BDD)의 신장도 본 공정의 혜택을 받을 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 장시간이나 알 수 없는 시간 동안 온 허혈에 노출된 신장은 아래에 언급된 주요 단계를 사용하여 회복된다. 본 단계들은 정확히 아래에 표시된 순서대로 수행할 필요는 없으며, 이하에서 상세히 설명될 것이다.

제1 단계는 적출 직후 백테이블에서 리스-플라스미노겐 및 tPA를 신장 동맥에 순차적으로 또는 조합하여 주사하거나, 체외, 생체외 관류 장치를 통해 순차적으로 또는 조합하여 주사하는 것을 포함할 수 있다. 리스-플라스미노겐은 생리학적 등장성 전해질 유체인 담체 유체에 포함되며, 가능하게는 과삼투제를 포함한다. 약 5 ~ 20ml의 리스-플라스미노겐을 주입할 수 있다(5~100U/신장 사용). 리스-플라스미노겐은 신장의 혈관에 존재하는 모든 혈전에 부착된다. 약 15분 후(또는 동시에) 약 5 ~ 20ml의 tPA(0.5~10mg/신장 사용)를 동일한 방식으로 동맥에 주사할 수 있다. tPA는 생리학적 등장성 전해질 액인 담체 유체에 포함될 수 있고, 가능하게는 과삼투제(hyperoncotic agent)를 포함한다. 제1 단계는 20℃ 내지 37℃와 같은 실온 이상에서 제공될 수 있다.

신장은 추가로 순환 또는 관류 단계에 노출될 수 있으며, 여기서 신장은 신장의 동맥에 커넥터를 삽입하고 정맥에서 나오는 유체의 수집을 위한 용기에 신장을 배열함으로써 관류 장치에 신장을 연결한다. 용기는 생리학적 등장성 전해질 유체인 순환액 500ml ~ 1500ml를 포함할 수 있고, 과삼투제, 예를 들어 알부민 57g/L를 단독으로 또는 추가의 항삼투제와 조합하여 포함할 수 있다. 순환액은 15℃ ~ 24℃(실온)의 온도에서 35분 이상 동안 신장을 통해 순환되며, 20mmHg의 압력에서 시작하여 5분마다 5mmHg씩 압력을 반복적으로 증가시켜 최대 70mmHg까지 상승시킨 후, 더 낮은 압력, 예를 들어 30mmHg에서 30분 동안 유지한다. 이 시간동안 리스-플라스미노겐과 tPA는 신장에서 더 순환되고 저항은 점진적으로 감소한다. 신장의 색을 검사하고 신장이 창백해지면 압력을 계속 낮추기 위해 고압 치료를 중단할 수 있다.

다음 중 하나 또는 여러 개를 추가할 수 있다.

항트롬빈 III(ATIII)과 같은 트롬빈 억제제; 아르고바트란, 또는 임의의 다른 직접 트롬빈 억제제, 예를 들어 이노가트란, 멜라가트란(및 그의 전구약물 자이멜라가트란), 다비가트란 또는 히루딘 및 그의 유도체;

알로스테릭 억제제;

당단백질 Ilb/IIIa 수용체 길항제(아브식시맙, 엡티피바타이드, 티로피반)와 같은 혈소판 억제제;

비가역적 사이클로옥시게나제 억제제(아스피린, 트리플루살);

아데노신 이인산(ADP) 수용체 억제제(칸그렐로, 클로피도그렐, 프라수그렐, 티카그렐로, 티클로피딘);

포스포디에스테라제 억제제(실로스타졸);

프로테아제-활성화 수용체-1(PAR-1) 길항제(보라팍사);

아데노신 재흡수 억제제(디피라디몰);

트롬복산 억제제(이페트로반, 피코타미드와 같은 트롬복산 합성효소 억제제 및 테루트로반(terutroban)과 같은 트롬복산 수용체 길항제);

또는, 처리된 혈전의 재혈전화를 방지하기 위해 조합 또는 단독의 임의의 다른 혈소판 억제제. 이들은 제1 주입 단계 또는 제1 순환 단계 또는 다른 단계 중 임의의 단계에서 추가될 수 있다. 헤파린 또는 저분자 헤파린의 추가는 선택 사항이다.

이 공정의 제2 단계는 신장 혈관을 통한 과삼투액의 순환에 의한 순환 시스템의 관류 및 회복을 포함한다. 과삼투압은 혈장 내 단백질에 의해 발생하는 압력으로 정의되지만 덱스트란 또는 PEG(Poly Ethylene Glycol)와 같이 인위적으로 구성될 수도 있다. 공통적인 성질은 그것이 통과하는 신장의 주변 조직보다 더 높은 콜로이드 삼투 압력(colloid oncotic pressure)을 가져야 한다는 것이다.

더 나아가, 이 액은 회복 단계의 일 단계에서 낮은 온도, 예를 들어 12℃ 내지 24℃ 및 낮은 압력, 예를 들어 20mmHg 내지 30mmHg에서 관류될 수 있으며, 회복 단계의 다른 단계에서 더 높은 온도, 예를 들어 18℃ ~ 32℃, 및 관류 압력이 더 높을 수 있는, 예를 들어 25mmHg ~ 70mmHg 또는 ~ 90mmHg의 압력에서 관류될 수 있다. 하나의 과삼투 액은 40g/L ~ 120g/L, 예를 들어 50g/L ~ 80g/L, 예를 들어 57g/L 또는 72g/L의 고농도로 알부민을 포함하지만 유사한 특성을 가진 다른 물질 또는 이런 물질들의 조합을 포함할 수도 있다. 과삼투 액은 정상 세포외 수준과 비교하여 약 10mM 내지 25mM의 많은 양의 칼륨을 포함할 수 있다. 과삼투 액은 또한 삼투막 불투과성 제제인 글루코네이트 및 글루코스를 포함할 수 있지만, 유사한 기능을 갖는 다른 제제를 대신 포함하거나 이들의 조합(Lactobionate, Raffmose, Mannitol)을 포함할 수 있다. 이 액은 정상 대기압에서 산소(O₂ 20%), 이산화탄소(CO₂ 6.5%) 및 질소(N₂ 73.5%)로 구성된 가스에 노출되어 산소화(산소공급)될 수 있고, 산소의 백분율은 혈액 가스 분석 후 대사 필요에 따라 변할 수 있다. 과삼투 액은 신장의 간질 조직에서 물을 제거하고 모세 혈관계를 회복시킨다. 또한, 실패한 대사 과정의 독성 생성물은 세척되고, 중탄산염과 같은 완충 시스템을 사용하여 pH가 회복되지만, 추가로 또는 대안적으로 유사한 기능을 갖는 다른 제제 또는 물질(인산염, 히스티딘/히스티딘-HC)도 포함될 수 있다.

신장이 장시간 동안 허혈에 노출되었기 때문에 저장된 글리코겐이 소모되어 ATP가 부족하게 된다. 따라서, 세포 이온 펌프가 작동하지 않고 세포 내부와 외부의 Na/K 균형이 손상된다. pH가 감소하고 젖산과 피루브산이 생성되어 조직에 축적된다. 과삼투 액은 대사의 기질로서 포도당 및/또는 아데닌을 포함하지만, 추가로 또는 대안적으로 유사한 기능을 갖는 다른 제제(α-케토글루타레이트, 히스티딘, 글루탐산)를 함유할 수 있다. 그러나, 이러한 낮은 온도에서는 대사율이 매우 느리다.

순환은 낮은 펌프 압력에서 수행된다. 순환 중에는 혈관 저항이 연속적으로 감소하고, 혈관 저항이 충분히 낮아질 때까지 순환이 계속되는데, 이는 몇 시간이 걸릴 수 있다.

이 공정의 제3 단계에는 미세 환경의 추가 복원과 신장 평가가 포함된다. 온도는 약 32℃로 증가하고 압력은 30mmHg 또는 최대 70mmHg로 증가한다. 세척된 적혈구(RBC)를 3 내지 20, 예를 들어 5 내지 10, 예를 들어 6 내지 8의 헤마토크릿에 첨가한다. 산소화는 증가된 산소 수준을 갖는 산소 공급기에 의해 수행된다. 일반적으로, 신장은 소변을 생성하기 시작하고 크레아티닌 농축 능력은 기능의 지표로 측정된다. 알려진 양의 크레아티닌을 신장의 여과 능력을 나타내는 지표로 용액에 추가할 수 있다. 또한, 신장을 육안으로 검사한다. 신장이 (큰) 어두운 영역을 포함한다면 이는 신장 기능이 저하되었음을 나타낼 수 있다. 또한, 신장 혈관 저항이 평가된다.

신장이 이식에 적합하다고 판단되면 신장을 직접 이식하거나 4 ~ 15℃의 저온으로 냉각하여 이식할 때까지 보관한다.

제2 단계와 제3 단계 사이에 저장 기간이 배치될 수도 있다.

다른 단계들은 여러 측면에서 수정될 수 있다.

제1 단계는 제2 단계 이후에 하나 또는 여러 개의 제1 단계를 상호배치하여 수정될 수 있다. 예를 들어, 과삼투 액은 1시간 동안 관류될 수 있고, 그 후 리스-플라스미노겐 및 tPA 및 가능하게는 ATIII가 첨가되고, 관류는 또 다른 1시간 동안 계속될 수 있으며, 그 후 리스-플라스미노겐 및 tPA 및 가능하게는 AIII가 다시 첨가될 수 있다.

제2 단계는 약 1시간의 제1 기간 동안 과삼투 액을 관류한 다음, 예를 들어 알부민 농도를 예를 들어 72g/L에서 예를 들어 57g/L로 낮춤으로써 콜로이드 삼투성 압력을 낮춘 후, 또 다른 1-3 시간 동안 상기 액을 순환시킴으로써 변형될 수 있다. 과삼투 액은 추가로 덱스트란 40을 0.1 내지 10%의 용량으로 단독으로 또는 알부민 또는 임의의 다른 과삼투제와 함께 조합되어 포함할 수 있다.

제3 단계는 응고 억제제 및/또는 혈소판 억제제를 포함함으로써 수정되어 처리된 혈전의 재혈전을 방지할 수 있다. 제1 단계와 관련하여 위에서 언급한 것과 동일한 제품을 사용할 수 있다. 이들 제품은 제3 단계에서 신장에 추가되기 전에 RBC 현탁액에 첨가되거나, RBC를 추가하기 전 관류 용액에 첨가되거나, 또는 두 용액에 모두 추가될 수 있다. 미세순환계와 혈관에서 형성된 혈전은 끈적거리고 내피세포에 부착되는 것으로 알고 있다. 혈전이 용해되면 내피 세포와 글리코칼릭스(glycocalyx)에 손상을 남긴다. 이 손상은 적혈구를 씻어도 남아 있는 RBC 현탁액의 가능한 혈소판과 응고 인자를 활성화한다. 이러한 활성화는 동일한 위치에 새로운 혈전 형성을 초래할 수 있으므로 피해야 한다. 항트롬빈 III 또는 직접적인 트롬빈 억제제는 트롬빈과 반응하여 트롬빈을 비활성화하고 제거한다. 압식시맙(Abciximab) 또는 기타 혈소판 억제제는 혈소판이 서로 달라붙는 것과 손상된 내피 세포에 달라붙는 것을 방지한다. 헤파린 또는 저분자 헤파린의 첨가는 선택 사항이다.

제3 단계는 28 내지 37℃ 및 30 내지 90mmHg에서 수행되도록 변형될 수 있다.

세척 단계는 상기 단계들 사이 및 단계들 중에 수행될 수 있다. 세척액은 신장을 통과한 다음 폐기된다. 따라서, 세척액은 신장을 통해 순환되지 않는다.

신장은 가능한 한 빨리 적출되지만, 순환정지나 기타 원인 등으로 인해 신장이 얼마나 오랫동안 허혈에 노출되었는지는 알 수 없고, 허혈시간이 2시간 이상, 예를 들어 약 3시간 또는 4시간 또는 더 길 수 있다. 신장은 도 1에 도시된 바와 같이 신장, 대동맥 및 대정맥을 자유화하고 신장 동맥 및 신장 정맥의 위와 아래의 대동맥 및 대정맥을 절단하여 적출한다. 이 어셈블리를 백테이블에 놓고 대동맥 잔류물과 대정맥 잔류물에서 눈에 보이는 혈전에서 제거한다.

가능한 빨리, 리스-플라스미노겐(5 ~ 100U)을 바늘과 주사기로 신장 동맥에 주입하여, 주사기 앞에서 신장 동맥을 눌러 모든 리스-플라스미노겐이 신장 동맥과 신장 내로 전달되도록 한다. 액이 신장 정맥을 떠나면, 신장이 리스-플라스미노겐에 의해 관류되었음을 나타낸다. 리스-플라스미노겐은 혈관에 있는 혈전과 상호작용하고, 혈전 및 혈전 내 피브린에 결합한다. 그 다음, tPA 주입 시간이 될 때까지 두 신장 동맥뿐만 아니라 신장 정맥도 클램핑된다.

다음으로, 리스-플라스미노겐과 같은 방법으로 tPA를 주입한다. 그러나, 정맥이 클램핑된 상태로 유지되어 신장 내부에 약간의 과압이 생성될 수 있다. 그 다음, 대동맥의 한쪽 끝에서 캐뉼러를 삽입하고 다른 쪽 끝에서 클램핑하여, 생체외 기계 관류를 위한 시스템을 세팅한다. 두 요관에 모두 캐뉼러를 삽입하여 소변을 모니터링할 수 있다.

항트롬빈 III(ATIII) 또는 아르고바트란과 같은 트롬빈 억제제가 리스-플라스미노겐 및/또는 tPA와 함께 첨가될 수 있다.

리스-플라스미노겐의 주입량인 약 10ml는 신장에 정상적으로 포함되는 혈액량의 약 절반에 해당하며, 정상량은 신장당 약 15-30ml이다(신장이 150g의 무게를 가지고 있는 경우) (10 ~ 20ml/100g 신장). tPA의 부피도 약 10ml이고 그 용량은 신장당 5mg에서 10mg이다.

마지막으로, 신장을 도 3에서 보이는 바와 같이 대동맥 잔류물이 걸쳐진 채 폐쇄 용기에 넣고 순환계에 연결한다. 대정맥의 하단을 열어 액이 신장에서 자유롭게 흐를 수 있도록 하되, 액은 용기의 순환계에 의해 대동맥으로 공급된다.

때로는, 신장들을 별개로 처리하는 경우가 있는데, 대동맥을 세로로 두 부분으로 나누고 캐뉼러를 도 3과 같이 분할된 대동맥 패치에서 계속 흘러나오고 있는 신장 동맥에 연결하여, 여러 동맥들을 단일 동맥으로 처리하는 것이 각 신장을 개별적으로 모니터링할 수 있는 가능성이 있다. 인간의 경우 신장당 하나 이상의 동맥이 전체 신장의 30% 이상에서 보여진다. 제안된 기술을 사용하면 문제가 되지 않는다.

도 3에 도시된 바와 같이, 신장(35)의 대동맥 잔류물(33)은 용기(31)에 배열된 커넥터(32)에 연결된다. 대정맥(34)은 파선(36)으로 도시된 바와 같이 용기(31)의 바닥(37)으로 유체를 방출하도록 개방되어 있다. 액 수준(36)은 신장 아래 또는 신장 위 또는 그 사이에 있을 수 있으며, 후자는 도 3에 도시되어 있다.

용기의 바닥(37)은 밸브(42)를 통해 배수 백(41)에 연결된다. 바닥은 또한 제1 스위치 밸브(44)를 통해 펌프(43)에 연결된다. 제1 스위치 밸브(44)는 도 3에 도시된 제1 위치에서 펌프(43)의 입구를 세척액 백(45) 또는 용기(31)의 바닥(37)에 연결한다.

펌프(43)의 출구는 펌프를 통과하는 유체의 온도를 제어하는 가열기/냉각기(48)에 연결된다. 가열기/냉각기(48)의 출구는 제2 스위치 밸브(46)를 통해 산소 공급기(47) 및 백혈구 필터(49)로, 또는 직접 커넥터(32)로, 및 도 3에 도시된 스위치의 제1 위치에서 신장에 연결된다. 표시된 위치에서, 액은 주변 대기(유체에 용해된 산소)에 노출됨으로써 산소만이 공급된다.

따라서, 용기(37)의 바닥에 존재하는 액은 제1 스위치(44)를 통해 펌프(43)로 순환되고, 나아가 가열기/냉각기(48)를 통해 제2 스위치(46)로 및 커넥터(32)로 순환된다. 이 액은 커넥터(32)로부터 신장의 혈관을 통해 대동맥 및 신장으로 진행하고, 더 나아가 신장의 정맥으로 진행하며, 최종적으로 용기의 바닥으로 방출된다.

펌프(43)는 펌프 압력을 원하는 값, 예를 들어 20mmHg로 조정하고 그 흐름이 신장의 저항에 의존하도록 압력 제어식 펌프일 수 있다.

용기(31)의 바닥(37)에 존재하는 액은 도 3에 도시된 바와 같이 여러 개의 백(50, 51, 52, 53, 54)을 통해 제공된다. 각 백은 밸브(55, 56, 57, 58, 59)를 통해 용기(31)에 연결된다. 밸브를 열면 백의 내용물이 중력에 의해 용기 바닥으로 운반된다.

일 실시예에서의 작동은 다음과 같이 될 수 있다:

신장 적출 후, 신장이 백테이블에서 리스-플라스미노겐 및 tPA에 노출된 후, 신장은 용기(31)로 이동되고 대동맥 잔류물은 커넥터(32)에 연결되어 신장이 용기(31) 내부에 매달리게 된다. 정맥은 열려 있고 액이 용기의 바닥(37)으로 직접 배수되도록 한다. 신장은 그물과 같은 지지체(미도시)에 놓일 수 있으며 수평축에 대한 그 위치의 각도가 다를 수 있다. 용기 내 온도는 원하는 시작 온도(예: 18℃ ~ 28℃)로 설정된다. 전해질, 및 가능하게는 57g/L 농도의 알부민을 포함하는 순환 액이 해당 밸브(55)를 개방함으로써 순환 액 백(50)으로부터 용기(31)로 제공될 수 있다. 그 다음, 신장을 관류하여 5분 동안 20mmHg의 압력으로 시작한 후, 50mmHg에서 90mmHg까지, 사전에 결정된 값까지 매 5분마다 5mmHg씩 증가시킨다. 그 다음, 압력을 예를 들어, 20~30mmHg로 낮추고 미리 결정된 추가 기간 동안 관류할 수 있다. 신장의 저항이 감소하고 신장은 이제 일반적으로 어두운 영역이 없거나 단지 작게만 있어 창백해 진다. 이는 신장의 혈관에 있는 혈전이 용해되어 제거되었다는 표시이다. 용기 내부의 액은 이제 배수 밸브(42)를 열어 배수구(41)를 통과한다.

어떤 이론에도 구속되지 않고, 신장의 어두운 부분은 혈전이나 다른 이유로 인해 순환이 되지 않는 영역을 나타내는 것이다. 나중에 이러한 어두운 영역에서 순환이 이루어지면 신장은 이 영역을 기능하는 조직으로 회복할 수 있다.

관류 단계에서, 배수 밸브(42)가 닫히고 밸브(56)를 열어 중력을 통해 1000ml의 관류 액(51)이 용기(31)로 전달된다. 용기의 액 수준은 1000ml의 액이 용기 바닥에 축적되면 라인(36) 위로 상승하고, 그 후 밸브(56)가 닫힌다. 제1 스위치 밸브(44)는 도 3에 도시된 제1 위치에 있고, 펌프가 시동되고 20mmHg의 압력에서 펌핑된다. 가열기/냉각기(48)는 온도를 12 내지 18℃로 조절한다. 용기 바닥의 액은 1 ~ 4시간과 같이 몇 시간 동안 20 ~ 30mmHg의 압력으로 순환된다. 관류 단계 동안 신장의 화학적 특성이 회복되고 독성 생성물이 제거된다. 이제 펌프가 중지되고 세척이 수행된다. 관류 단계는 세척 단계 후, 저체온 관류 기간동안 다른 조성의 관류 액으로 반복될 수 있고, 또는 관류는 또한 RBC의 유무에 관계없이 다른 더 높은 온도 동안에 계속될 수도 있다.

평가 단계에서는, 관류 단계의 동일한 용액이 용기의 내용물을 배수구(41)로 배수하기 위해 배수 밸브(42)를 개방한 후 사용될 수 있고, 또는 위에서 설명한 두 번의 세척 단계 후에 배수 밸브(42)를 닫고 500ml의 평가 액(52)이 밸브(57)를 열어 중력에 의해 용기(31)로 전달된다. 500ml의 액이 들어가면 밸브(57)가 닫힌다. 제1 스위치 밸브(44)는 도 3에 도시된 제1 위치에 있고, 펌프가 시동되고 20mmHg의 압력에서 펌핑된다. 가열기/냉각기(48)는 온도를 28 내지 32℃로 증가시킨다. pH 및 환경을 확인하는 5 내지 30분 후, 5 내지 10의 헤마토크릿이 얻어질 때까지 밸브(58)를 열어 백(53)으로부터 적혈구 현탁액(RBC)을 첨가하고, 그 후 밸브(58)를 닫는다. 제2 스위치 밸브(46)는 액 및 적혈구의 산소화를 위한 회로에서 산소 공급기(47)를 포함하는 제2 위치로 이동된다. 순환은 신장이 이식에 사용할 수 있다고 판단될 때까지 30mmHg의 압력으로 1 ~ 4시간 동안 진행된다. 신장은 이제 32 ~ 37℃ 및 70 ~ 90mmHg의 압력에서 15분 동안 평가되며 신장이 얼마나 잘 관류되는지와 관련하여 혈관 저항, 흐름 및 시각적 외관에 주목한다. 외과의사는 신장의 관류가 양호한지, 관류가 보통인지 또는 불량한지를 결정하는데, 보통인 경우 여러개의 검/파란 스팟으로, 불량한 경우 여러 개의 크고 어두운 파랑 또는 검정 영역으로 관류되지 않은 영역을 나타낸다. 소변 생성을 측정하고 유량을 ml/min 및 100g 신장 조직으로 기록한다. 이제 펌프가 정지되고 배수 밸브(42)가 열려 용기 바닥에 있는 모든 유체를 배수구(41)로 배출한다.

임의의 세척 단계는 펌프(43)를 세척 유체 백(45)에 연결하는 제2 위치로 제1 스위치 밸브(44)를 이동함으로써 수행될 수 있다. 펌프가 활성화되어 약 200ml를 신장으로 순환시킨다. 신장을 떠나 용기 바닥으로 가는 액은 개방 밸브(42)를 통해 배수구(41)를 더 통과한다. 이러한 방식으로 모든 적혈구는 신장에서 배수구로 씻겨져 나간다. 이러한 세척 단계는 여러 번 그리고 다른 단계 사이에 수행될 수 있다.

보존 단계에서는, 배수 밸브(42)가 닫히고 밸브(59)를 열어 중력에 의해 500ml의 보존 액(54)이 용기(31)로 통과된다. 500ml의 액이 들어가면 밸브(59)가 닫힌다. 제1 스위치 밸브(44)는 도 3에 도시된 제1 위치에 있고, 펌프가 시동되고 20 ~ 30mmHg의 압력으로 펌핑된다. 가열기/냉각기(48)는 12 내지 15℃와 같이 6 내지 18℃의 온도로 조정한다. 수증자를 찾고 신장이 이식을 위해 준비될 때까지 용기 바닥의 액은 수 시간, 최대 48시간 이상 동안 20~30mmHg의 압력으로 순환된다. 펌프가 정지되고 배수 밸브(42)가 열려 용기 바닥의 모든 액을 배수구(41)로 배수한다. 커넥터(32)에서 신장을 제거한다.

도 3에 설명된 실시예에 사용된 액들은 표 A에서 상세하게 설명된 액들일 수 있다.

백테이블 절차 동안, 리스-플라스미노겐은 표 A의 기본 용액과 동일할 수 있는 담체 액에 포함된다.

일 실시예에서, 담체액, 세척액, 관류액 및 보존액은 동일한 기본 성분들을 가질 수 있다. 이러한 성분들에는 113mM ~ 129mM의 나트륨 함량, 5mM ~ 25mM의 칼륨 함량, 2.5mM ~ 5mM의 마그네슘 함량 및 1mM ~ 5mM의 칼슘 함량이 포함된다. 상기 언급된 전해질에 더하여, 다음 물질 중 하나 또는 그 이상을 포함할 수 있다: 10g/L 내지 120g/L 농도의 알부민, 예를 들어 40g/L 내지 75g/L, 예를 들어 57g/L 또는 72g/L; 선택적으로 덱스트란 40 0g/L 내지 100g/L, 하이드록시 에틸 전분(HES) 0g/L 내지 70g/L, 폴리에틸렌 글리콜(PEG 20) 0g/L ~ 25g/L, 또는 PEG 35 0g/L ~ 3g/L 단독 또는 조합. 덱스트로스 5mM 및 중탄산염 10 - 35mM도 선택 사항이다. 또한, L-아르기닌(산화질소(NO)의 전구체, 생리적 스트레스 동안 혈압 조절), L-류신(단백질 합성), L-글루타민(아미노산 생성에 필요한 L-아르기닌 합성) 또는 다른 아미노산과 같은 아미노산들을 단독으로 또는 조합하여 정상 농도로 첨가할 수 있다(표 A 참조). 추가될 수 있는 다른 물질은 I-이노시톨(막 전위 안정제), 아데닌 및 리보스(아데노신 - ATP의 일부를 만듬)이다. 표 A에 명시된 것과 같은 미량 성분들(보조 인자 및 비타민)도 추가할 수 있다. 노보라피드(Novorapid), T3, T4, 프로게스테론 및 에스트로겐과 같은 자연 발생 호르몬을 생리학적 농도로 추가할 수 있다(표 A). 티에남(Tienam)과 같은 항생제가 추가될 수 있다. 표 A에 따른 이러한 기본 액은 담체액, 세척액, 순환액, 관류액 및 보존액 중 적어도 하나로 사용될 수 있다.

표 A			비타민		mM
성분			L-Ascorbic Acid·Na		0-2
무기 염들		mM	D-Biotin		0.005
CaCl2·2H2O		0-5	Choline Chloride		0-0.05
MgSO4 (무수)		0-10	Folic Acid		0-0.01
KH2PO4		0-60	myo-Inositol		0-0.1
KCl		0-25	Niacinamide		0-0.1
NaHCO3		0-80	D-Panthothenic Acid·½Ca		0-0.01
NaCl		0-140	Pyridoxinhydrochloride		0-0.01
Na2HPO4 (무수)		0-5	Riboflavin		0-0.001
NaGluconate		0-110	Thiamine·HCl		0-0.01
KGluconate		0-25	Vitamin B12		0-0.01
MgGluconate		0-10	호르몬
NaLactobionate		0-110	T3		0-0.0000030
KLactobionate		0-25	T4		0-0.0000030
CaLactobionate		0-10	Cortisol		0-0.0000166
아미노산			Insulin Novorapid (U)		0-40
L-Alanine		0-1	Progesterone		0-0.0100
L-Arginine·HCl		0-1	Estrogen		0-0.1004
L-Asparagine·H20		0-1	기타
L-Aspartic Acid		0-1	Adenosine		0-5
L-Cysteine·HCl·H20		0-0.1	Cytidine		0-0.1
L-Cystine·2HCl		0.5	2'Deoxyadenosine		0-0.1
L-Glutamic Acid/Ketoglutarate		0-5	2'Deoxycytidine·HCl		0-0.1
L-Glutamine		0-15	2'Deoxyguanosine		0-0.1
Glutathione		0-5	Guanosine		0-0.1
Glycine		0-5	Pyruvic Acid		0-5
L-Histidine·HCl·H20		0-210	Thioctic Acid		0-0.01
L-Isoleucine		0-1	Thymidine		0-0.1
L-Leucine		0-1	Uridine		0-0.1
L-Lysine·HCl		0-1	Allupurinol		0-5
L-Methionine		0-1	Dextrose		0-200
L-Phenylalanine		0-1	D-Ribose		0-10
L-Proline		0-1	Raffinose		0-60
L-Serine		0-0.02	Mannitol		0-120
L-Threonine		0-2	과삼투 액
L-Tryptophan		0-4	HES		0-5
L-Tyrosine·2Na·2H20		0-1	PEG35		0-0.5
L-Valine		0-2	Albumin (g/L)		0-120
약물			Dextran 40/70 (%)		0-15
Verapamil
Heparin		0-10000 U
Minirin		0-000000009

관류액은 70g/L 내지 120g/L, 예를 들어 72g/L의 농도로 알부민과 같은 과삼투 용액 및 아마도 덱스트란 40(또는 덱스트란 70) 0g/L ~ 150g/L 또는 기타 알려진 과삼투액을 첨가함으로써 달성되는 높은 삼투압을 가질 수 있다. 칼륨은 13 내지 25mM, 예를 들어 17 내지 22mM, 예를 들어 18mM의 범위에서 정상 혈장보다 높게 유지될 수 있다. 대안적으로, 칼륨 농도는 1mM 내지 13mM과 같이 낮을 수 있다. 칼륨과 나트륨 수치는 생리적 환경과 pH의 정상화로 인해 RBC 단계에서 다양할 수 있다.

평가액은 하기 성분들을 더 포함할 수 있다:

응고 억제제, 예를 들어 아르고바트란(또는 임의의 다른 직접 트롬빈 억제제, 예를 들어 이노가트란, 멜라가트란(및 이의 전구약물 자이멜라가트란), 다비가트란 또는 히루딘 및 이의 유도체, 또는 알로스테릭 억제제);

및 혈소판 억제제, 예를 들어, 당단백질 Ilb/IIIa 수용체 길항제(아브식시맙, 엡티피바타이드, 티로피반),

비가역적 시클로옥시게나제 억제제(아스피린, 트리플루살),

아데노신 이인산(ADP) 수용체 억제제(칸그렐로, 클로피도그렐, 프라수그렐, 티카그렐로, 티클로피딘),

포스포디에스테라제 억제제(실로스타졸),

프로테아제-활성화 수용체-1(PAR-1) 길항제(보라팍사),

아데노신 재흡수 억제제(디피라디몰),

트롬복산 억제제(이페트로반, 피코타미드, 및 테루트로반과 같은 트롬복산 수용체 길항제), 또는

다른 모든 혈소판 억제제 - 처리된 혈전의 재혈전을 방지하기 위해 조합 또는 단독으로.

헤파린, 단백질 C 및 단백질 S는 선택 사항이다.

베라파밀을 첨가할 수도 있다. 도 4는 다른 실시예를 도시한다. 이 실시예는 신장 적출 시설이 구비된 지역 병원에서 사용하기 위한 것이다. 신장은 해당 지역 병원에서 사전처리된 후 수증자에게 이식을 담당하는 중앙 병원으로 이송된다.

지역 병원에서는 심정지 희생자인 기증자가 사망 시점을 알 수 없으나 12시간, 10시간, 8시간, 6시간, 4시간 미만의 시각에 도착한다. 기증자가 도착하자마자 시체는 체내의 해로운 과정, 특히 신진대사와 응고를 늦추기 위해 냉각될 수 있다. 이러한 냉각은, 예를 들어 약 0℃의 공기 온도를 갖는 냉장된 룸 또는 구획에 신체를 넣는다는 점에서 국소적일 수 있다. 냉각의 다른 방법은 얼음 슬러리를 몸 주위나 복강에 배치하거나, 차가운 액체를 복부 및/또는 흉강에 주입하는 것일 수 있다.

적출 팀이 지역 병원에 있는 경우, 냉각 여부에 관계없이 가능한 한 빨리 적출을 수행할 수 있다.

신장을 적출하는 동안, 정상적인 과정이 수행되고 신장은 백테이블에 올려져 일괄 보관되거나 각 신장이 별도로 보관된다. 백테이블에서는, 신장 동맥에 리스-플라스미노겐을 주입하는 제1 단계가 수행된다. 리스-플라스미노겐은 약 15분 이상 동안 신장 혈관에 머물도록 허용되며, 이 시간 동안 커넥터를 신장 동맥 또는 대동맥에 부착하여 신장이 준비가 진행되게 한다.

약 15분 후, 또는 가능한 한 빨리, 신장은 도 4에 도시된 바와 같이 용기 어셈블리(60)로 옮겨진다. 신장(61)의 커넥터(63)는 용기(62)의 상부에서 대응하는 커넥터(64)에 부착되고, 이에 따라 신장(61)은 도 4에 도시된 바와 같이 용기(61) 내부에 달려 있다. 신장의 정맥은 용기(61)의 내부로 직접 개방된다.

커넥터(64)가 여전히 열려 있을 때, 주사기(75)가 연결되고 약 10ml의 tPA(Alteplas)가 커넥터(64)를 통해 신장의 동맥에 주입된다. 리스-플라스미노겐의 첨가는 대안적으로 tPA의 첨가 전에 그리고 백테이블에서의 첨가 대신에 커넥터(64)에 부착된 주사기를 통해 수행될 수 있음을 주목한다. 여전히 대안적으로, 리스-플라스미노겐 및 tPA는 주사기를 통해 커넥터(64)에 동시에 첨가되거나 백테이블에서 동시에 주입될 수 있다.

알테플라스(Alteplas) 대신 스트렙토키나제(streptokinase), 유로키나제(urokinase), 리테플라제(reteplase), 및 테넥테플라제(tenecteplase)와 같은 다른 tPA를 사용할 수 있다.

그 다음, 튜브(65)가 커넥터(64)에 연결된다. 튜브(65)는 나선형 구성으로 배열되고 압력 백(66)을 커넥터(64)에 연결한다. 압력 백(66)은, 예를 들어 용기(64) 위 27cm의 미리 결정된 높이(20mmHg의 압력에 해당)에서 스탠드(67)에 의해 지지된다. 압력 백(66)의 높이 위치는 웜 기어 모터(68)에 의해 스탠드(67)를 따라 조정 가능하다. 튜브(65)의 나선형 구조는 높이 위치에 튜브(65)를 수용한다. 처음에, 이 백은 비어 있다.

순환액 백(76)은 전해질, 및 알부민과 같은 과삼투제를 포함하는 순환액을 포함한다(표 A). 백(76)의 순환액은 화살표(77)로 표시된 대로 용기(62)에 추가된다. 약 1L의 순환액이 있고 용기(62)의 부피는 약 1.3L이며, 이는 용기(62)가 순환액으로 거의 가득 차있음을 의미한다. 순환액은 O₂, CO₂ 및 N₂의 혼합 가스를 1L/min으로 사용하여 산소 공급기를 통해 산소를 공급한다. 이 작업은 실온에서 수행된다. 순환액은 본 시스템에서 리스-플라스미노겐 및 tPA와 함께 순환한다.

순환액의 양이 1L보다 작을 수 있지만, 튜브와 펌프(용기를 제외) 및 신장의 부피보다 커야 한다. 또한, 용기에 담기 위해서는 작은 부피가 필요하다. 이러한 부피는 10ml, 20ml, 50ml 또는 그 이상일 수 있다. 따라서, 예를 들어 150ml 내지 1000ml 순환액이 사용될 수 있다.

펌프(69)는 튜브(70)를 통해 용기(62)에 연결되고 순환액을 용기(62)로부터 압력 백(66)으로 펌핑한다. 레벨 감지기(71)는 용기(62)의 유체 레벨이 미리 결정된 레벨에 도달할 때 펌프(69)를 시동한다. 펌프는 예를 들어 펌프의 회전율에 대응하는 유량을 갖는 연동 펌프이다. 펌프는 압력을 제어할 필요가 없다.

펌프(69)는 1분 동안, 예를 들어 75ml/min의 유속으로 작동될 수 있으며, 이에 따라 75ml의 유체가 용기(62)로부터 압력 백(66)으로 이송된다. 펌프 흐름은 신장의 저항이 충분히 낮다는 것을 나타내는, 신장을 통한 원하는 유속에 해당하도록 선택된다. 신장 100g당 50ml/min의 유속은 일반적으로 충분한 것으로 간주된다. 성인 남성의 정상적인 신장은 약 150g이다.

압력 백(66)은 예를 들어 용기(62) 위의 27cm 높이에 배치되기 때문에 순환액의 흐름은 20mmHg에 해당하는 27cm 물 기둥(pillar)의 압력에서 신장을 통과한다. 신장의 저항이 크면 27cm 물 기둥의 이 압력으로 인해, 신장을 통해, 예를 들어 7.5ml/min의 흐름이 발생할 수 있고 이는 용기(62)의 유체 수위가 10분 내에 레벨 감지기(71)의 수위로 복귀됨을 의미한다. 그 다음, 펌프(69)는 레벨 감지기(71)에 의해 시동되고 이 절차가 반복된다.

압력 백(66)은 웜 기어 모터(68)에 의해 더 높은 위치로 이동될 수 있다. 일 실시예에서, 웜 기어 모터(68)는 압력 백의 높이를 1cm/min만큼 증가시킨다. 예를 들어, 10분 후에 35cm 물 기둥으로 압력이 증가하면, 신장을 통한 흐름은, 예를 들어 15ml/min으로 증가한다. 이는 펌프(69)가 5분 후에 다시 작동됨을 의미한다. 신장을 통한 흐름이 75ml/min이 되도록 압력이 증가하면, 펌프(69)는 계속해서 작동할 것이다. 이는 신장의 저항이 충분히 낮다는 표시이다. 이제 압력 백(66)의 높이 증가가 중단될 것이다.

압력 백의 최대 높이는, 예를 들어 70mmHg의 압력에 해당하는 95cm일 수 있다. 압력 백이 상단 위치에 있기 전에(최대 70분 후) 원하는 유량(150g의 신장에 대해 75ml/분)이 도달하면, 이 절차는 중단된다. 원하는 유량에 도달하지 않으면 70mmHg의 압력(95cm 물 기둥)에서 30분 작동을 계속한다.

지금까지 작업은 18℃ ~ 28℃의 실온에서 수행되었다.

용기(62)에는 용기의 큰 하부를 덮는 재킷(72)이 제공된다. 이제 재킷에는 약 5℃ 내지 18℃, 예컨대 12 내지 15℃의 온도로 용기(62)를 냉각시키기 위한 얼음 슬러리가 제공될 수 있다. 압력 챔버를 25cm로 낮추고 펌프를 작동하여 순환액을 신장을 통해 순환시킨다. 재킷과 압력 백이 있는 용기는 단열 상자(도시되지 않음)에 배치될 수 있으며, 이 어셈블리는 지속하여 처리를 담당하는 주 병원으로 운송된다. 신장은 최대 48시간 또는 그 이상 동안 이 상태로 보관될 수 있다.

이식을 담당하는 주 병원에서, 신장은 추가로 처리된다. 신장은 도 5에 도시된 바와 같이, 동일한 용기(62)에 머물거나 다른 용기(82)로 이송될 수 있다. 용기(82)는 신장이 연결되는 커넥터(84)를 포함한다. 펌프(89)는 튜브(87)를 통해 용기(82)로부터 신장의 입구 동맥으로 유체를 펌핑하고, 이 유체는 앞서 설명된 바와 같이 정맥을 통해 용기(82)로 방출된다. 펌프(89)는 압력이 제어되고 압력을 원하는 값, 예를 들어 20 내지 30mmHg로 유지한다. 가열기/냉각기(미도시)는 온도를 원하는 온도로, 예를 들어 관류 및 보존 동안 12 ~ 32℃로 유지한다. 배수 백(85)은 밸브(86)를 통해 용기(82)의 바닥에 연결된다.

도 5에 따른 장치는 또한 적혈구 현탁액 백(91)을 포함한다. 적혈구 현탁액 백은 병렬로 배열된 3개의 펌프(92, 93, 94)를 포함하는 순환 시스템에 연결된다. 사이토카인-필터(95)는 펌프(92)와 직렬로 배열되고, 내독소-필터(96)는 펌프(93)와 직렬로 배열되고, 산소 공급기(97) 및 백혈구-필터(98)는 펌프(94)와 직렬로 배열된다. 적혈구 현탁액 백(81) 뒤에 배열된 현탁액 밸브(99)가 열리면, 적혈구 현탁액은 펌프(92, 93, 94)에 의해 각 필터(95, 96, 98) 및 산소 공급기(97)를 통해 순환된다. 이 순환은 실온에서 약 30분 동안 수행될 수 있다. 이러한 방식으로, 적혈구 현탁액은 내독소, 사이토카인 및 백혈구가 제거되도록 조절된다. 또한, 적혈구 현탁액은 산소공급된다.

평가 용액은 백(101)에 존재하고 밸브(102)를 통해 용기(82)에 연결된다. 밸브가 열리면 평가 용액이 중력을 통해 컨테이너(82)로 전달되는데, 이는 밸브(86)를 열어 배수구(85)로 미리 비워진다. 평가 용액을 약 32℃의 온도로 가열한다. 평가 용액은 펌프(89)에 의해 신장을 통해 순환되고, 이에 따라 신장은 32℃의 온도로 가정된다. 그 다음, 적혈구 현탁액은 도 5에 도시된 바와 같이 밸브(99) 및 다른 두 개의 밸브(103, 104)를 열어 용기에 첨가된다. 현탁액이 중력을 통해 용기(82)로 이송되면 적혈구 현탁액 밸브(99)가 닫힌다.

이제, 펌프(92, 93, 94)는 개방 밸브(104, 103)와 필터(95, 96, 98) 및 산소 공급기(97)를 통해 용기(82)에 존재하는 유체를 펌핑한다. 이러한 방식으로, 확실히 평가액에는 내독소, 사이토카인 및 백혈구가 포함되지 않게 된다. 또한, 적혈구에 산소가 공급된다. 신장은 이제, 예를 들어, PaO₂, PaCO₂, HCO₃, 산소 포화도, Hb, Hct, 젖산, 포도당, pH 등과 같은 "혈액" 매개변수를 측정하여 평가될 수 있다. 또한, 신장을 광학적으로 검사할 수도 있다. 저항은 펌프 데이터로부터 계산할 수 있다. 평가액에 크레아티닌을 첨가하면, 크레아티닌 농도를 포함하여, 소변 생성을 검사할 수 있다. 이러한 방식으로, 신장이 이식에 적합한지 검사된다.

그 다음, 용기(82)의 내용물은 밸브(86)를 열어 배수구(85)로 이송된다. 밸브(106)를 개방함으로써 보존액(105)이 용기(82) 내로 도입된다. 모든 적혈구를 제거하기 위해 보존액은 20 ~ 30mmHg의 압력과 12 ~ 15℃의 저온에서 펌프(89)에 의해 순환된다. 또한, 신장의 무게가 증가하게 되는데, 보존액은 신장에 축적된 과잉 수분을 제거하기 위한 알부민을 함유하고 있다. 최대 7일(또는 그 이상)의 보관 기간 후에, 신장이 이식된다.

다른 실시예가 도 5a에 도시되어 있다. 이 장치는 적혈구(RBC) 현탁액을 세척하기 위한 장치(110)를 포함한다(모든 세부사항이 도시되지는 않음). 세척된 백(111) 내의 적혈구는 튜브(112) 및 밸브(113)를 통해 컨디셔닝 용기(114)로 이동된다. 용기(114)는 제1 펌프(116), 산소 공급기(117), 사이토카인 흡착기(118), 백혈구 필터(118), 제1 밸브(120) 및 제2 밸브(121)를 포함하는 컨디셔닝 회로(115)를 포함한다. 또한, 밸브를 갖는 제1 컨넥터(122)는 제1 밸브(120)에 연결되고, 밸브를 갖는 제1 컨넥터(123)는 제2 밸브(121)에 연결된다.

제1 및 제2 밸브(120, 121)가 열리고 커넥터(122, 123)의 밸브가 닫힐 때, 컨디셔닝 회로는, 산소 공급기(117), 용기(114) 내부에 존재하는 적혈구 현탁액 내의 백혈구 및 사이토카인을 제거하기 위한 백혈구 필터(119) 및 사이토카인 흡착기(118)를 통해, 컨테이너(114) 내부의 유체를 순환시키기 위한 펌프(116)를 작동함으로써 컨테이너(114) 내의 유체를 컨디셔닝하기 위해 작동한다. 순환이 30분 이상, 예를 들어 60분 또는 그 이상 동안 일어나면 RBC 현탁액이 준비된다.

처리 시스템(130)이 도 5a의 오른쪽에 도시되어 있다. 처리 시스템은 제1 밸브 커넥터(122)에 연결될 수 있는 제3 밸브 커넥터(132), 및 제2 밸브 커넥터(123)에 연결될 수 있는 제4 밸브 커넥터(133)를 갖는 처리 용기(131)를 포함한다.

처리 용기(131)는 밸브가 제공된 튜브를 통해 용기(131)에 연결된 3개의 유체 백(134, 135, 136)을 포함한다. 이러한 밸브를 열면, 해당 유체 백의 유체가 처리 용기 내로 비워질 수 있다. 폐기물 백(137)은 밸브가 제공된 튜브를 통해 처리 용기의 바닥에 연결된다. 밸브를 개방함으로써, 용기(131) 내의 유체는 폐기물 백(137) 내로 비워질 수 있다.

적출한 신장(140)(신장들)에는 대동맥 잔여부(residue) 또는 신장 동맥(동맥들)을 연결하는 신장 커넥터(141)가 제공된다. 신장 컨넥터(141)는 용기에 구비된 용기 컨넥터(142)와 연결될 수 있다. 용기 커넥터(142)는 순환 펌프(143) 및 산소 공급기(144)를 포함하는 신장 순환 시스템에 연결된다. 펌프(143)는 처리 용기 내의 유체를, 펌프 및 산소 공급기를 통해 처리 용기의 하부로부터 용기 커넥터(142) 및 신장의 동맥(140)으로 순환시킨다. 신장 정맥에서 방출된 액은 추가 순환을 위해 용기 내부로 배출된다.

컨디셔닝 시스템은 내독소 흡착기(146) 및 백혈구 필터(147)를 통해 처리 용기(131) 내의 유체를 펌핑하고 처리 용기로 다시 펌핑하기 위해 처리 용기(131)의 바닥에 연결된 제2 펌프(145)를 포함한다.

2개의 의료용 주입 펌프(148, 149)는 신장의 동맥의 흐름 내로 의료용 제제를 주입하기 위해 배열된다. 주입 펌프는 주사기 펌프일 수 있다. 주입되는 약제는 리스-플라스미노겐, tPA, ATIII, 혈소판 억제제, 트롬빈 억제제, 응고 억제제 등일 수 있다. 의료용 주입 펌프(148, 149)는 교체 가능하여 추가 주사기 펌프가 연결될 수 있다.

가열기/냉각기(150)는 처리 용기를 빠져나가는 유체를 가열/냉각하기 위해 배열된다.

시스템 작동은 다음과 같을 수 있다.

RBC 현탁액은 공지된 방법에 따라 세척 시스템(110)에서 세척된다. 세척이 준비되면, RBC 현탁액을 밸브(113)를 열어 중력에 의해 컨디셔닝 용기(114)로 이송한다.

컨디셔닝 용기(114) 내의 유체는 밸브(120 및 121)를 개방하고 펌프(116)를 작동시켜 펌프(116)에 의해 순환되어, 백혈구 필터(119) 및 사이토카인 흡착기(118)를 통해 유체가 순환되고 남아있는 백혈구 및 사이토카인이 제거된다.

한편, 신장(140)을 적출하여 처리 용기(131)에 넣고 신장 커넥터(141)를 통해 용기 커넥터(142)에 연결한다. 이 작업은, 예를 들어 원격지 병원에서, 도 5a에 도시된 시스템의 좌측 부분으로부터 일정 거리를 두고 수행될 수 있다.

처리 용기(131)에 유체 백(134, 135, 136)으로부터 처리 유체가 필요에 따라 제공된다. 사용시, 유체는 폐기물 밸브를 개방함으로써 폐기물 백(137)으로 배출된다.

순환 제2 펌프(145)는, 백혈구 및 엔도톡신을 지속적으로 제거하기 위한, 백혈구 필터(147) 및 엔도톡신 흡착기(146)를 통해 처리 용기 내의 유체를 통과시키기 위해 작동된다.

순환 펌프(143)는 유체를 산소 공급기(144)를 통해 용기로부터, 신장의 동맥으로, 그리고 더 나아가 신장 정맥을 통해, 신장 치료를 위한 용기로 다시 순환시키기 위해 작동되며, 이는 위에서 약술한 바와 같다.

약제 펌프(148, 149)는 약제의 첨가를 위해 사용될 수 있다.

그 다음, 처리 시스템(130)은 밸브형 커넥터(122)를 밸브형 커넥터(132)에, 및 밸브형 커넥터(123)를 밸브형 커넥터(133)에 연결하고 밸브(123)를 제외한 밸브를 개방함으로써 컨디셔닝 시스템(115)에 도킹된다. 제1 밸브(120)가 닫히고 제2 밸브(121)가 열리면, 펌프(116)가 작동되어 컨디셔닝 용기(114) 내의 유체를 커넥터(122, 132)를 통해 처리 용기로 펌핑한다. 이후, 제2 밸브(121)가 닫히고 밸브(123)가 열리면, 펌프(116)가 산소공급기(117), 백혈구 필터(119) 및 사이토카인 흡착기(118)를 통해 처리 용기(131) 내의 처리액을 순환시킨다.

처리는 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 따를 수 있다.

도 5b에 도시된 바와 같이, 처리 용기(151)는 2개의 신장을 개별적으로 처리하도록 변형될 수 있지만, 엔-블록(en-block)으로 배열될 수 있다. 2개의 신장에는 도시된 바와 같이, 순환 펌프(163, 173)에 연결된 용기 커넥터(162, 172)에 연결된 2개의 신장 커넥터(161, 171)가 제공된다. 산소 공급기(164)는, 도시된 바와 같이, 2개의 순환 시스템에 대한 공통 라인에 연결된다. 이 시스템으로, 각각의 분리된 신장은 상이한 처리를 위해 의료용 주입 펌프(168, 169 및 178, 179)를 통해 분리된 의료 약제를 제공받을 수 있다.

실시예 1

적출 전 절차: 30마리의 돼지를 마취하고 정상 환기(normoventilation)를 달성한 후, 인공호흡기를 껐다. 약 15분 후에 무수축기(Asystole) 및 순환기 정지가 나타났다. 실온에서 2시간 후, 복부 및 흉강에 차가운 식염수를 넣고, 그 후 1시간 동안 더 이상의 조치를 취하지 않았다.

적출: 순환 정지 후 3시간 후에, 신장을 적출하기 위한 수술이 시작되었으며 평균 45분이 소요되었다.

백테이블 절차: 신장 동맥을 통해 신장당 0.9% 식염수로 20ml로 희석된 0.5 내지 1% 리도카인 10ml 내 약 500U 헤파린을 주사한 후, 백테이블에서 SOLTRAN(신장 관류액, Baxter Healthcare)으로 신장을 플러싱했다.

처리 절차: 신장을 4개의 그룹으로 나누었다: 그룹 A는 11마리의 돼지, 그룹 B는 13마리, 그룹 C는 각 6마리의 돼지에서 한 개의 신장만, 그룹 D는 동일한 6마리의 돼지의 다른 신장을 갖는 그룹이다.

그룹 A는 2시간 동안 냉장보관 후 이식하였다.

그룹 B는 2시간 동안 냉장 보관한 후, 표 B에 표시된 조성의 용액을 세척된 적혈구와 혼합하여 hct가 약 15가 되도록 한 후 사용하여 37℃에서 90분 동안 재생처리하고, 이식했다.

표 B

그룹 C는 제조사(Organ Recovery Systems) 지침에 따라 LifePort Kidney Transporter와 KPS(Kidney Perfusion Solution)를 이용하여 신장 적출 직후 4시간 동안 저체온 관류 처리 후 이식을 시행하였다.

그룹 D는 그룹 C와 동일한 기증자의 신장이지만 2시간 동안 냉장보관 후 이식하였다.

도 6은 재관류 후와 이식 후 90분 관찰 후 동맥혈류량(ml/min)의 변화를 보여준다.

도 7은 이식 후 90분의 평균 소변 생산량(ml/min)을 보여준다. Mann-Whitney U 테스트를 사용하여, 재관류시 재관류된 그룹 B에서 흐름이 더 좋았고(p<0.05)(도 6), 재관류된 그룹 B는 또한 이식 후 90분 후 더 양호한 소변 생성(p<0,05)을 보였다(도 7).

실시예 2

6마리의 돼지를 마취하고 정상 환기를 달성하도록 한 후 인공 호흡기를 껐다. 약 15분 후에 무수축기가 나타났다. 상온에서 2시간 후, 복강과 흉강에 보냉액(Saline)을 넣었다.

신장 적출은 사망 4시간 후에 시작되었다.

신장 동맥을 통해 신장당 0.9% 식염수로 20ml로 희석된 0.5 내지 1% 리도카인 10ml 내 헤파린 약 500U를 주사한 후, 차가운 링거 용액으로 백테이블에서 신장을 플러싱했다.

신장은 도 3에 표시된 유형의 생체외 관류 장치에 연결되었다. 0.4mg의 tPA(alteplas) 및 150U의 아피라제(apyrase)(Sigma Aldrich, purinergic drug - CD39/CD73)를 신장 동맥을 통해 주입하였다. 사용된 용액의 조성은 표 C에서 볼 수 있다.

용액을 산소공급 없이 15℃의 온도 및 20mmHg의 압력에서 30분 동안 관류시켰다. 그 다음, 온도를 32℃로, 압력을 30mmHg로 올리고, 재생 단계에서 추가로 90분 동안 관류를 계속했다. 그 다음, 세척된 백혈구가 여과된 RBC를 첨가하고 평가 동안 추가 90분 동안 관류를 계속했다.

그 후, 신장을 이식했다.

도 8은 재관류 후 및 90분 후의 신장 흐름을 나타낸다. 신장은 미세순환을 완전히 깨끗하게 하지 못했고 신장 표면에서 관류 결함을 보였다. 생체외 시스템에 추가된 섬유소 용해제 및 퓨린제(purinergic drugs)(아피라제 - CD39/CD73)는 혈관 저항과 혈류를 실질적으로 개선하지 못했다.

표 C

실시예 3

또 다른 실험에서는 실시예 2의 프로토콜을 반복했지만, 아피라제는 제공하지 않았다. 대신 리도카인이 관류 용액에 추가되었다. 이러한 아이디어는 리도카인이 가진 Na⁺K⁺ 펌프에 대한 효과의 결과로서, 재생 단계 동안 안정화 효과를 찾기 위한 것이었다. 용액의 조성은 표 D에서 볼 수 있다.

표 D

도 9는 처음 90분 동안 변하지 않은 흐름을 보여주지만, 이는 보통 감소한다. 더욱이, 삼투압이 330 mosm이고 칼륨 수준이 약 5mmol/L라는 사실에도 불구하고 재생의 여러 상이한 단계들 사이에서 중량 변화는 최소화되었다. 실시예 2에서 신장은 관류 시작부터 90분의 재관류 후에 끝날 때까지 중량이 상당히 증가했다.

실시예 4

7마리의 돼지를 마취하고 정상환기를 달성하도록 한 후 인공 호흡기를 껐다. 약 15분 후에 무수축이 나타났다. 상온에서 2시간 후, 복강과 흉강에 보냉액(Saline)을 넣었다.

각 돼지의 두 신장의 적출은 사망 4시간 후에 시작되었다.

실시예 2에 기술된 바와 같이, 신장 동맥을 통해 신장당 0.9% 식염수로 20ml로 희석된 0.5 내지 1% 리도카인 10ml 내 약 500U의 헤파린을 주사한 후, 신장을 차가운 링거 용액으로 백테이블에서 플러싱하였다. 사용된 용액의 조성은 표 E에서 볼 수 있다.

표 E

신장은 생체 외에서 30분 동안, 처음에는 15℃ 및 20mmHg의 압력에서 관류되었다. 그 다음, O₂(20%), CO₂(5.6%) 및 N₂(74.4%)의 가스 혼합물을 사용하여 관류 용액을 산소공급하기 시작했다. 1시간 후, 용액을 표 E에 따른 조성을 갖는 새로운 용액으로 교체하고, 온도를 32℃로 상승시키고, 압력은 30mmHg로 조정하였다. 세척된 백혈구-여과 적혈구를 약 10 내지 15의 hct에 첨가한 후, 5시간 동안 관류시켰다. 그 다음, 관류 시스템에서 하나의 신장을 꺼내어 수증자 돼지에 이식하고(n=7) 90분에서 최대 8시간 동안 관찰했다. 생체 외 관류 시스템의 나머지 신장은 비교를 위해 추가로 90분 동안 관류되었다.

도 10은 이식 후의 신장 동맥 혈류를 나타낸다. 신장은 10시간 이상 동안 기능하여 소변을 생성했다(n=3). 단지 몇 마리의 동물만이 흐름의 확산 증가를 설명하는 10시간까지 추적되었다. 실험은 아직 마취 상태에 있는 돼지로 종료되었다.

실시예 5

또 다른 실험에서, 실시예 4(n=5)와 동일한 프로토콜에 따라 처리하되, 생체외 관류는 6시간이 아닌 11시간 동안 계속하였다. 유속은 재관류 시 104ml/분이었고, 재관류 후 14.5시간 109ml/분이었다. 따라서, 관류 시간을 연장하더라도 상당한 흐름이 발생하여, 신장을 운반하고 수증자가 도착하기를 기다리는 시간을 확보할 수 있다.

표 F

실시예 6

또 다른 실험에서는, 실시예 4에서와 동일한 프로토콜에 따라 7마리의 돼지가 사망한 것으로 선언되었다. 따뜻한 허혈 시간(WIT)은 4 ~ 6시간이었다.

돼지당 2개의 신장은 사망 4시간 후부터 적출되었다.

생체 외 관류는 15℃에서 시작되었다. 처음 1시간 동안, 72g 알부민/L이 사용되었고(표 E에 따른 용액), 관류 동안의 압력은 20mmHg였다. 30분 후에 산소 공급이 시작되었다. 1시간 후, 용액을 배출하고, 온도를 32℃로, 압력을 30mmHg로 올리고 RBC를 첨가한 후, 2시간 동안 알부민/L 80g을 포함하는 새로운 용액(표 F에 따른 용액)을 사용했다.

도 11은 이식 후의 신장 동맥 혈류를 나타낸다. 7개 신장 모두 이식 후 4시간(118.7 ± 15.0 ml/min) 및 8시간(85.0 ± 10.5 ml/min) 동안 양호한 흐름을 보였고 뇨 생성을 유지하였다. 이 실험은 돼지가 아직 마취 상태에 있는 상태에서 8시간 후에 종료되었다. 관찰 시간 동안 흐름이 감소했지만, 신장은 관찰이 끝날 때까지 여전히 좋은 흐름을 보였다. 윤리적 허가에 따라, 우리는 돼지를 깨우도록 허용되지 않았다.

표 G

실시예 7

또 다른 실험에서, 실시예 4에서와 동일한 프로토콜에 따라 4마리의 돼지가 사망한 것으로 선언되었다. 2시간 후에 복부에 얼음을 이용한 국소 냉각을 사용하여, 냉각수로 액을 사용한 25℃ 내지 29℃에 비해 체온을 37℃에서 약 20℃로 변화시켰다.

신장을 적출함에 따라, WIT는 4 ~ 5시간 사이로 변했다.

신장을 과삼투제로서 57g 알부민/L를 포함하는 표 G에 기재된 조성의 용액으로 세척하였다. 신장이 희게 될 때까지 신장을 생체 외 장치에서 20mmHg에서 70mmHg의 압력 및 18℃의 온도하에서 세척하되, 5분마다 5mmHg의 압력을 높였다. 잘 관류된 신장을 얻는 데 평균 2 ~ 3리터의 용액과 최대 50분이 걸렸다.

동일한 용액을 사용하여 온도를 12℃로 낮추고 20mmHg에서 1시간 동안 신장을 관류하였다. 그 다음, 용액을 표 F와 같이 80g albumin/L를 포함하는 용액으로, 온도 28℃ 및 압력 30mmHg로 변경하였다. RBC는 약 10-15의 최종 hct에 참가되었다. 이 용액으로 2시간 동안 신장을 관류시켰다. 그 다음, 온도를 32℃로 높이고 시스템을 배수하고 처음 사용된 57g albumin/L를 포함하는 용액을 다시 추가하기 전에, 추가시간 동안 신장을 관류했다. 이 용액으로, 이식 전 15℃, 압력 20mmHg에서 30분간 관류를 계속하였다.

도 12는 이식 후의 신장 동맥 흐름을 나타낸다. 적출 후 신장을 주의 깊게 세척한 후에, 재관류 후 높은 유량을 얻을 수 있었다. 소변 생성은 수증자에서 장기간 유지될 수 있었지만 관찰 시간이 연장된 후에는 감소하였고, 이는 몇 리터 용량의 플러시가 내피 활성화로 인한 후기 결과에 부정적인 영향을 미칠 수 있음을 나타낸다. 그러나 여전히, 4시간(145.7±29.3ml/min) 및 8시간(96.73±12.8ml/min)에서의 흐름은, 25℃ ~ 29℃의 온도를 달성한 이전 실시예 1 내지 5에서와 같이 복강과 흉강에 보냉액을 넣어 국소 냉각하는 것보다 양호하였다. 이 실험은 윤리적 허가로 인해 아직 마취 상태에 있는 돼지로 종료되었다.

실시예 8

또 다른 실험에서 8마리의 돼지가 실시예 4에 기재된 바와 같이 사망한 것으로 선언되었지만, 국소 냉각은 하지 않았다.

신장을 사망 4시간 후 적출하였고, 200-500ml의 퍼파덱스(Perfadex)로 백테이블에서 관류하였다. 모든 신장이 불량하거나 다소 불량한 관류 및 불량하게 cleared 된 상태를 보였다.

그 다음, 신장을 신장절제된 돼지에게 즉시 이식했다. 재관류 시 평균 유속은 14.15ml/분이었고 90분에는 36.8ml/분이었다. 모든 신장은 90분에 검/파란 색으로 보였고 마지막에는 소변 생성이 없었다. 이 실험은, 예를 들어 본 발명의 실시양태에 따른 냉각 절차 및 기타 처리 없이는, 이전 경험에 따른 이식 환경에서, 4시간의 WIT가 불량한 성능을 초래한다는 것을 보여주는 대조군으로 사용되었다.

실시예 9

또 다른 실험에서, 상기 기술을 사용하여 6마리의 돼지가 사망한 것 것으로 선언되었다.

2시간 후 얼음 슬러시를 복부에 삽입한 국소 냉각을 사용한 결과, 냉각제로 액을 사용한 25 ~ 29℃ 및 얼음을 사용한 20℃에 비해, 체온이 37℃에서 약 10 ~ 12℃로 변화되었다.

4 ~ 5시간 사이의 WIT로 신장을 회수했다.

백테이블 상에서, 적출 후, 10U의 리스-플라스미노겐과 200U의 항트롬빈 III(ATIII)이 혼합된 72g/L 알부민 용액(표 I)을 포함하는 용액 20ml를 신동맥을 통해 정맥을 클램핑 분리한 후 각 신장에 주입하되, 용액이 전달된 후 동맥을 클램핑 분리하였다.

신장을 생체외 장치로 옮겼다. 15분 후, 72g/L 알부민 용액을 포함하는 용액(표 I) 20ml로 희석한 후, 신장당 1mg tPA(alteplas) 및 100U ATIII를 5ml의 4부분으로 나누어 주사하였다. tPA를, 20mmHg에서 시작하여 매번 5mmHg씩 증가시키면서, 20℃의 온도에서 5분 간격으로 신장 동맥에 주사하였다.

tPA 주입 완료 후, 72g 알부민/L를 포함하는 용액으로 신장을 관류하고 압력을 매 5분마다 5mmHg씩 50 ~ 70mmHg까지 또는 신장이 깨끗해질 때까지(둘 중 먼저 도래하는 것) 증가시켰다. 그 다음, 온도를 12℃로 낮추고 20mmHg의 관류 압력에서 1시간 동안 관류를 계속했다.

57g/L 알부민을 포함하는 용액(표 H)으로 세척한 후, 2차 용량의 리스-플라스미노겐에 이어 tPA 및 ATIII를 주입하되, 57g 알부민/L로 용액에 희석하고, 상기 기재된 바와 같이 동맥을 통해 순차적으로 주입하였다.

그 다음, 관류를 압력은 20mmHg, 온도는 12℃에서 30분 동안 계속하였다. 온도는 28℃로, 압력은 30mmHg로 증가시킨 후 적혈구를 hct 5에서 10까지 첨가했다. RBC는 외부 펌프에 의해 2시간 동안 전처리되었고, 용액에 첨가하기 전에 백혈구 필터를 통해 순환시켰다. 이는 백혈구가 신장과 접촉하기 전에 감소하도록 하기 위해 수행되었다. 결합된 알부민 용액(57g 알부민/L, 표 H) 및 RBC를 사용한 관류를 1시간 동안 계속하였다. 그 다음, 평가하는 동안 1시간 동안 온도를 37℃로, 압력을 70 ~ 90mmHg로 올렸다. RBC 함유 용액에서 신장을 세척하였고 새로운 57g/L 알부민 용액을 채우고 온도를 15℃로 낮추고 이식을 진행했다.

신장 이식 직전에 본 신장을 절제한 돼지에게 이식을 수행하였다. 3 마리의 동물이 마취에서 깨어날 수 있었다(윤리적으로 10일 동안 관찰할 수 있도록 허가되었다). 3일째, 1마리의 동물을 신장 및 새 혈액 샘플 검사하기 위해 조사했다. 주어진 유일한 면역억제는 재관류 시 스테로이드였다. 신장은 양호하게 보였고 혈액 내 크레아티닌은 615μmol/L이었다. 또 다른 돼지는 4일째에 조사를 받았고 신장도 좋아 보였고 혈액 내 크레아티닌은 884μmol/L였다. 세 번째 돼지는 5일째부터 샘플을 채취하여 총 8일 동안 추적 관찰하였다. 돼지 3마리 모두 지연된 이식 기능(DGF)의 징후를 보인한 사례에서, 1마리는 요독증을 보이며 8일 후에 사망했고, 다른 두 마리는 3일과 4일에 혈액 내 크레아티닌 상승 및 소변 농축 능력의 징후로서 소변 내 높은 크레아티닌으로 희생되었다.

도 13은 재관류 후 및 90분 후의 6마리 돼지 각각에 대한 동맥 흐름을 나타낸다. 리스-플라스미노겐과 tPA를 첨가하면 이전보다 신장이 더 깨끗해졌으며, 결과적으로 저항이 감소하고 미세 순환이 개선되었다.

도 14는 일부 신장이 재관류 후 표면에 패치를 보여, 이식 후 몇 시간이 지나면 관류가 잘되지 않는 검/파란 색 신장으로 발전하였음을 보여주는데, 이는 응고 시스템으로 인한 재혈전증 또는 내피에서의 혈소판/RBC 유도 작용을 나타내는 것이다.

실시예 10

3마리 이상의 돼지에서 몇 가지 예외를 제외하고는 실시예 9의 프로토콜을 반복하였다.

적출 후 백테이블 상에서 리스-플라스미노겐의 주입을 상기 기술한 바에 따라 수행했다. 15분 후, 57g 알부민/L를 포함하는 용액(표 H) 500ml 내 2mg의 tPA(알테플라스)를 생체외 장치로 가져오기 전에 신장을 통해 플러싱했다.

생체외 장치에서, 신장은 24℃에서 72g/L 알부민(표 I)을 포함하는 용액에서 관류되었고 압력은 20mmHg에서 50 내지 70mmHg로 증가했다. 동일한 용액을 사용하여 12℃ 및 20mmHg의 압력에서 2시간 동안 관류를 계속했다.

배수 및 세척 후, 57g 알부민/L를 포함하는 용액(표 H)을 세척된 적혈구와 함께 약 5 내지 10의 hct로 첨가하고, 온도는 28℃로, 압력은 30mmHg로 변경하였다. 새로운 용량의 리스-플라스미노겐, tPA 2mg 및 ATIII 200U를 첨가하였고, 평가를 위해 온도를 32℃로 증가시킨 후 70mmHg의 압력에서 15분 동안 관류시켰다. 헹구고 세척한 후, 57g/L 알부민을 포함하는 용액(표 H)을 첨가하고 온도를 15℃로 낮추었다. 3 마리의 돼지 모두 마취를 풀고 관찰하였다. 2 마리의 동물이 10일 동안 생존했으며, 실험 종료시, 한 마리는 혈액 내 166 μmol/L, 다른 한 마리는 174 μmol/L의 크레아티닌을 함유했고, 신장은 정상으로 보였다. 세 번째 돼지는 이식 기능이 지연되어 6일째에 희생되었으며, 혈액 내 크레아티닌은 1231 μmol/L, 소변 내 2000 μmol/L 이상으로 소변 농축 능력을 보였다. 모든 수증 동물들은 면역 억제의 유일한 수단으로 스테로이드를 받았다. 동종거부반응의 조직학적 연구를 위해 샘플을 수집했다.

도 15a는 이식 10일 후의 정상적으로 보이는 신장 이식을 보여준다. 거시적인 거부 징후가 없다.

도 15b는 도 15a의 이식된 신장의 절단면을 나타내며, 이는 정상적인 거시적 구조를 나타낸다.

도 15c는 10일 동안 생존한 두 번째 신장의 표면을 보여주며, 어두운 반점 영역은 영향을 받는 미세순환을 나타낸다.

도 15d는 도 15c의 이식된 신장의 절단면을 나타내며, 하부 극에서 순환에 영향을 받는 어두운 영역을 보여준다. 이 데이터는 본 처리가 기능과 구조를 모두 회복할 수 있음을 나타낸다.

실시예 11

19마리의 돼지를 포함하는 추가 실험에서, 사이토카인 수준은 3 그룹으로 측정되었다. 사이토카인의 흡착제가 없이 72g/L 알부민 용액(표 I)으로 관류된 살아있는 기증자 신장을 포함하는 그룹 A(n=5)에서는, 샘플을 관류 시작 시, 3시간 시, 및 37℃의 종료 시 채취하였다. 사이토카인의 흡착제가 없이 57g/L 알부민 용액(표 H)으로 관류된 살아있는 기증자 신장을 포함하는 그룹 B(n=5)에서는, 샘플을 관류 시작 시, 3시간 시, 및 37℃의 종료 시 채취하였다. 그룹 C(n=9)에서는, RBC 및 37℃에서 관류 전, 90분 동안 72g/L 알부민 용액으로 및 90분 동안 57g/L 알부민 용액으로 관류된 DCD 신장을 포함하며, 이 모든 동안 사이토카인 흡착제(Cytosorb , Cytosorbents)를 사용했다. 분석을 위해 ELISA 키트(Quantikine ELISA 키트, R&D Biosystems)를 사용하였다. 검출 수준 미만의 수준은 0으로 설정하고 각 그룹 내에서 측정된 수준에 대한 평균 수준을 계산했다.

도 16a는 주로 RBC로부터의 IL-6 수준의 변화를 나타내는 도면이다. 흡착제(그룹 C)는 IL-6의 모든 징후를 효과적으로 제거했다.

도 16b는 주로 RBC, 및 72g/L 알부민 용액보다 57g/L 미만으로부터의 IL-8 수준의 변화를 보여주는 도면이다. 흡착제는 IL-8(그룹 C)을 제거했다.

도 16c는, 또한 주로 RBC로부터의 IL-1ß 수준의 변화를 보여주는 다이어그램이다. 흡착제는 다시 신장 자체 또는 첨가된 RBC에서 기여한 사이토카인의 모든 징후를 제거했다.

도 16d는, 또한 주로 적혈구로부터의 TNF-α 수준의 변화를 보여주는 다이어그램이다. 흡착제는 다시 신장 자체 또는 첨가된 RBC에서 기여한 사이토카인의 모든 징후를 제거했다. 표시되지 않은 데이터에는 IL-10 수준에 대한 분석이 포함되어 있어, 어느 그룹에서도 수준을 감지할 수 없었다.

실시예 12

또 다른 실험에서, 돼지들이 상기 프로토콜에 따라 사망 선언되었는데, 2시간 후에 얼음 슬러시로 국소 냉각하고 4시간 후에 신장 적출을 시작하였다.

신장은 4.5-5시간의 WIT로 적출되었다.

백테이블에서, 신장에 각각 15ml 용액 내 10U 리스-플라스미노겐 및 2mg tPA를 주사했다.

신장을 생체외 장치에 배치하고 관류하였다. 관류 용액은 57g 알부민/L 농도의 알부민과 함께 표 J에 나타난 성분을 포함하고, 압력을 20mmHg에서 70mmHg까지, 5분마다 5mmHg로 증가시켰다. 600U의 ATIII을 2mg 압식시맙(혈소판 억제제)와 함께 관류 단계(20℃) 동안 사용하였다.

57g 알부민/L를 포함하는 표 J에 따른 용액 250ml로 배수 및 세척을 2회 실행한 후, 15℃에서 2시간 동안 57g 알부민/L를 포함하는 표 J에 따른 용액으로 관류를 계속하였다.

그 다음, 압력을 30mmHg로 높이고 온도를 28℃로 올린 다음, 30분 동안 관류후 RBC를 첨가했다. RBC는 2mg 압식시맙과 함께 800U의 ATIII로 전처리되었고 용액과 혼합되기 전에 백혈구 필터를 통해 관류되었다. 신장은 패치나 영향을 받은 순환 없이 본 처리로 완전히 깨끗해졌다.

신장을 이식하고 2마리의 돼지를 7일 동안 추적한 후 희생시켰다. 하나의 신장이 감염되었다. 두 돼지 모두 7일째에 혈중 크레아티닌이 1115 μmol/L, 1305 μmol/L, 뇨중 크레아티닌이 1790 μmol/L, 4530 μmol/L로 상승한 크레아티닌 농도를 나타냈다.

도 17은 300 mosm 정도의 삼투압을 갖는 용액과 ATIII 및 혈소판 억제제를 첨가하여 관류한 후의 흐름을 나타내는 도면이다. 이 다이어그램은 이전 실험에서 볼 수 있었던 재관류 시 더 높은 초기 흐름을 보여준다.

실시예 13

또 다른 실험에서, 실시예 12에서와 유사한 프로토콜을 사용하였다.

백테이블에서, 신장에 각각 15ml 용액 내 15U 리스-플라스미노겐 및 3mg tPA를 주입했다.

신장을 생체외 장치에 배열하고 57g 알부민/L 농도의 알부민과 함께 표 J에 기재된 성분을 포함하는 용액으로 관류시켰다. 600U의 ATIII을 3mg 압식시맙과 함께 관류 단계(20℃) 동안 사용하였다. 20mmHg에서 70mmHg까지 5분마다 5mmHg씩 압력을 높였다.

57g 알부민/L를 포함하는 표 J에 따른 용액 250ml로 배수 및 2회 헹구어낸 후, 15℃에서 2시간 동안 57g 알부민/L를 포함하는 표 J에 따른 용액으로 관류를 계속하였다. 이 단계에서 추가 용량의 ATIII 600U와 압식시맙 3mg을 첨가했다.

그 다음, 압력을 30mmHg로 높이고 온도를 28℃로 올린 다음 30분 동안 관류하고, RBC를 첨가했다. RBC는 3mg 압식시맙과 함께 800U의 ATIII로 전처리되었고 용액과 혼합되기 전에 백혈구 필터를 통해 관류되었다.

2.5시간 동안 관류한 후, 30mmHg 압력에서 흐름은 147ml/min에서 138ml/min으로 감소하고 저항이 증가했다. 또 다른 800U의 ATIII 및 3mg의 압식시맙을 용액에 첨가하였다. 흐름과 저항은 30분 동안 정체된 상태를 유지한 다음 흐름이 증가하고 저항이 감소했다.

실시예 14

6마리의 돼지를 사용한 다른 실험에서는 하기 프로토콜이 사용되었다.

첫째, 살아있는 기증자의 오른쪽 신장을 제거하고 폐기하였고 기증자의 왼쪽 신장은 기능하는 상태로 남겨 두었다.

둘째, 수증자의 왼쪽 신장을 적출하여 오른쪽 신장이 제거된 살아있는 기증자에게 직접 이식하였다.

수증자의 복부를 닫았고, 수증자는 후속 이식을 기다리며 수증자의 오른쪽 신장이 여전히 작동하는 상태로 잠들게 두었다.

살아있는 기증자에서, 기증자에게 이식된 왼쪽 신장을 기증자의 혈액으로 재관류하고 소변이 나올 때까지 관찰했다. 기증자의 복부를 닫았다.

그런 다음, 이전 실시예와 같이 기증자의 심정지를 발생시켰다.

기증자에게 이식되었던 수증자의 왼쪽 신장은 4.5 ~ 5시간의 WIT 후 적출되었다.

백테이블 상에서, 동맥과 정맥을 모두 클램핑한 상태에서 신장에 20U 리스-플라스미노겐과 600U ATIII를 주입했다. 15분 후, 4mg의 tPa를 다른 600U ATIII와 함께 주입했다. 15분 후, 신장을 생체외 관류 기계에 연결했다.

생체외 관류 기계에서, 57g 알부민/L가 포함된 표 K에 따른 용액으로 신장을 관류했다. 70mmHg의 압력에서 5분간 관류한 후, 관류압을 30mmHg로 낮추고 30분간 신장을 관류시켰다. 그 다음, 압력을 20mmHg로 낮추고 온도를 15℃로 낮추며 신장을 2시간 동안 관류시켰다.

동시에, 세척된 적혈구를 외부 백혈구 필터를 통해 실온에서 1시간 동안 순환시켰다. 1000 U ATIII, 3mg 압식시맙 및 4mg 아르가트로반(직접 항트롬빈 억제제)을 순환 적혈구에 첨가하였다.

사이토카인을 흡착하는 Cytosorb® 필터 및 내독소를 흡착하는 Alteco® 필터를 NaCl 및 표 K에 따른 용액으로 세척한 다음, 관류 기계에 부착하였다.

30분 동안 관류 용액의 온도를 28℃로 증가시키고, 압력을 30mmHg로 증가시켰다. 상기 언급한 RBC를 용액에 첨가하고, 예를 들어, 도 5에 도시된 바와 같이, 필터를 연결했다. 28℃에서 환경을 안정화시킨 후, 온도를 32℃로 올렸다. 신장을 이 온도에서 3시간 동안 관류시켰다.

그 다음, 1000U ATIII, 3mg 압식시맙 및 8mg 아르가트로반을 용액에 첨가했다. 32℃에서 1.5시간 관류한 후, 1.5mg 압식시맙, 4mg 아르가트로반 및 1000U ATIII를 용액에 첨가했다. 그 다음 온도를 15℃로 낮추고 압력을 20mmHg로 낮추며 신장을 30분 동안 관류했다.

그 후, 신장을 꺼내 수증자 신장을 수증자에게 다시 이식하고 남은 수증자 고유 신장을 제거했다. 흐름과 저항은 도 18에 도시된 바와 같다.

실시예 15

9마리의 돼지를 사용한 다른 실험에서는 실시예 14와 동일한 프로토콜을 사용하였다.

기증자에게 이식된 수증자의 왼쪽 신장은 4.5 ~ 5시간의 WIT 후에 적출되었다.

백테이블 상에서, 동맥과 정맥을 모두 클램핑한 상태에서 신장에 30U 리스-플라스미노겐과 600U ATIII를 주입했다. 15분 후, 6mg tPa를 다른 600U ATIII와 함께 주입했다. 추가 15분 후, 신장을 관류 기계에 연결했다.

생체외 관류 기계에서, 57g 알부민/L가 포함된 표 K에 따른 용액으로 신장을 관류시켰다. 75mmHg의 압력에서 5분간 관류한 후, 관류압을 25mmHg로 낮추고 신장을 30분간 관류시켰다. 압력을 20mmHg로 낮추고 온도를 15℃로 낮추며 신장을 2시간 동안 관류했다.

동시에, 세척된 적혈구를 외부 백혈구 필터를 통해 실온에서 1시간 동안 순환시켰다. 1000 U ATIII, 3mg 압식시맙 및 4mg 아르가트로반을 순환 적혈구에 첨가했다.

사이토카인을 흡착하는 Cytosorb® 필터 및 내독소를 흡착하는 Alteco® 필터를 NaCl 및 표 K에 따른 용액으로 세척한 다음 관류 기계에 부착하였다.

30분 동안 관류 용액의 온도를 28℃로 증가시키고 압력을 30mmHg로 증가시켰다. 상기 언급한 RBC를 용액에 첨가하고 필터를 연결했다. 28℃에서 환경을 안정화시킨 후, 온도를 32℃로 올렸다. 신장을 이 온도에서 3시간 동안 관류시켰다.

그 다음, 1000U ATIII, 3mg 압식시맙 및 8mg 아르가트로반을 신장에 첨가했다. 32℃에서 1.5시간 관류한 후, 1.5mg 압식시맙, 4mg 아르가트로반 및 1000U ATIII를 신장에 첨가했다.

실시예 16

실시예 15와 유사하게, 8마리의 돼지를 사용한 또 다른 실험에서는, 돼지들을 이전 실시예 14 및 15에서와 동일한 프로토콜에 따라 처리하였다. 이식 후, 돼지는 마취에서 회복되도록 하고 최대 3개월 동안 추적 관찰했다. 10일 및 3개월 시점의 혈장 내 크레아티닌 및 같은 시점의 소변 내 크레아티닌은 도 19 및 도 22에 도시된 바와 같은 데이터를 따랐다. 크레아티닌은 첫 주 이내에 정상화되었으며 투석할 필요 없이 생존 3개월 동안 정상을 유지했다. 도 23은 재생 및 이식 후 3개월 동안 탐색한 전형적인 신장을 보여주며, 섬유증이나 위축의 징후 없이 잘 관류됨을 나타낸다. 도 24에서는 신장을 제거하고 곡률을 따라 절단한 후에, 정상적인 신장 유조직(실질, parenchyma)을 보여준다.

논의

실시예 1에서는, 순환성 사망(DCD) 후 4시간을 초과하는 온허혈 시간(WIT) 대상의 기증자로부터 신장을 재생하는 기본 원리를, 최소 필수 배지(MEM)와 과삼투제로서 알부민을 포함하는 용액을 사용하여 조사했다. 생체외 정상 체온(normothermic) 관류는 LifePort(LP) 또는 저온 저장(CS) 보존 대조군보다 훨씬 더 나은 혈류 및 소변 생성을 보였다.

실시예 2에서는, 동맥 및 관류 용액 모두에 헤파린, 조직에서 ATP를 제거하는 퓨린성 억제제인 아피라제 및 tPA(알테플라스)를 주입하도록 적용한 후 적출된 DCD 신장의 광범위한 플러싱은 혈관 저항 및 혈류를 약간만 개선하였고 유사한 성분의 관류 용액을 사용하여 신장을 완전히 깨끗하게 하지는 못했다. 미세순환으로 섬유소 응고가 제거된 후 아피라제가 신장으로 전달될 수 있다.

실시예 3에서는, 리도카인을 첨가하여 90분에 혈류를 개선시켰는데, 이는 Na⁺K⁺ 펌프의 억제를 통해 막 기능이 가능하게 안정화되었음을 시사한다.

실시예 4에서는, 32℃에서 적혈구를 이용한 관류시간 연장이 가능하였고, 수증 돼지에게 이식 후 8시간 동안 일부 신장이 관찰되었음에 더 주목하였고, 다음 실시예 5에서는, 관류시간을, 이식된 신장에서 기능을 유지하며, 11시간으로 연장하였음에 주목하였다.

실시예 6에서는, 더 높은 콜로이드 삼투압을 갖는 제제(알부민 80g/L)가 4 내지 6시간의 WIT로 115ml/min 이상의 양호한 신장 흐름을 갖는 신장을 생성하는 것으로 밝혀졌다. 이식 후 8시간 동안 수증자를 추적하였다.

실시예 7에서는, 국소 냉각을 콜드 링거 용액에서 사망 2시간 후 얼음으로 변경하였다. 이는, 콜드 링거를 사용하여 25℃에서 29℃까지 체온을 낮추는 것에 비해 코어 체온을 20℃까지 낮추었다. 혈류는 이식 후 4시간과 8시간 모두에서 유의하게 개선되었다.

국소 냉각을 받지 않고(실시예 8 참조) 바로 백테이블 관류를 받은 돼지는 재관류(14.15ml/분)시 또는 90분(36.8ml/분)에서 양호한 흐름을 나타내지 않았다.

실시예 9 및 10에서는, 일반 얼음 대신 얼음 슬러시를 도입할 뿐만 아니라 온도 및 콜로이드 삼투압을 변화시켰다. 이제, 적출하기 전에 체온이 10 ~ 12℃까지 내려갈 수 있었다. tPA와 함께 리스-플라스미노겐으로 신장을 처리함으로써, 신장이 훨씬 더 깨끗해지고 혈관 저항이 크게 개선되었다. ATIII는 섬유소 용해 처리 대상 혈관의 재혈전을 예방하기 위해 투여되었다. 우리는 알테플라스(alteplas)를 사용했지만 스트렙토키나아제, 유로키나아제, 레테플라아제 및 테넥테플라아제(tenecteplase)와 같은 섬유소 용해제를 사용할 수 있었다. 이러한 변형된 적용으로 이전 실시예에서 볼 수 있는 것보다 더 양호하게 신장을 깨끗하게 만들 수 있었다. 이들 신장 중 몇몇은 이식 당시 자연 신장의 신장 절제술을 수행한 후 기능 신장으로 10일 동안 생존하여 사망 4시간 후 DCD 기증자의 신장을 사용할 수 있음을 입증했다. 평가 기간 동안의 RBC 처리는 모두 염증성 사건 및 허혈 재관류에 참여하는 IL-6, IL-8, IL-Iβ 및 TNF-α와 같은 사이토카인의 방출에 기여할 수 있음이 밝혀졌다. 특정 흡착제(Cytosorb)를 사용하면, 이러한 사이토카인을 완전히 제거할 수 있다(실시예 11 참조).

다음으로 실시예 12 및 13에서는, 압식시맙과 같은 혈소판 억제제가 관류 용액과 혼합되기 전에 보존 용액 및 RBC에 첨가되어 매우 양호한 흐름을 생성한다는 점에 주목했다. 더 나아가, ATIII 및 압식시맙을 용액에 추가함으로써 적혈구로 연장된 관류 동안 혈관 저항 증가의 징후가 개선될 수 있으며, 이는 섬유소 용해가 끝난 후, 응고 시스템과 혈소판 부착 모두에 의해 재혈전을 방지하는 것이 바람직하다는 것을 나타낸다. ATIII의 투여량은 이전 실시예와 비교하여 이들 실시예에서 증가되었다.

실시예 14 및 15에서는, RBC 단계 동안 감소된 혈류 및 증가된 혈관 저항의 위험을 피하면서, 아르가트로반으로서 직접 트롬빈 억제제를 첨가함으로써 결과가 더욱 개선되었다.

실시예 16에서는, 우리는 실시예 14 및 15에 따라 재생된 신장을 성공적으로 이식했고 최대 3개월까지 추적하여 재생된 신장이 또한 관련 임상 환경에서도 잘 작동함을 입증하였다. 실시예 14, 15, 16에서 사용된 신규 이식 모델은 초기에 이식된 신장이 심장사가 유발되기 전에 수증자에서 기증자에게로 옮겨졌기 때문에 동종 거부반응 기전이 제거되었음을 의미한다. 재생된 신장이 수증자 돼지의 유일한 신장 기능이라는 사실에도 불구하고 돼지는 투석 없이 생존했다.

청구범위에서 "포함하는/포함하는"이라는 용어는 다른 요소 또는 단계의 존재를 배제하지 않다. 또한, 개별적으로 나열되지만, 복수의 수단, 요소 또는 방법 단계는 예를 들어 단일 단위에 의해 구현될 수 있다. 또한, 개별 특징이 상이한 청구범위 또는 실시예에 포함될 수 있지만, 이들은 유리하게 결합될 수 있고, 다른 청구항에 포함된다고 해서 특징들의 조합이 실현가능하지 않고/하거나 유리하지 않다는 것을 의미하지는 않는다. 또한, 단수 참조는 복수를 배제하지 않는다. 용어 "a", "an", "first", "second" 등은 복수를 배제하지 않는다. 청구범위의 참조 부호는 단지 명확한 예로서 제공되며 청구범위의 범위를 어떤 식으로든 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.

이상에서, 본 발명은 특정 실시예 및 실험을 참조하여 설명되었지만, 본 명세서에서 설명하는 특정 형태에 한정되는 것은 아니다. 오히려, 본 발명은 첨부된 청구범위에 의해서만 제한되며, 위에서 명시된 것 이외의 다른 실시예는 이러한 첨부된 청구범위의 범위 내에서 동등하게 가능하다.

Claims (15)

1. 기증자가 순환 정지를 당한 후 적어도 2시간 후에 기증자로부터 신장을 적출하는 단계;
   적출 후 신장에 리스-플라스미노겐을 제공하는 단계로서, 리스플라스미노겐은 제1 과삼투 용액에 포함되는, 단계;
   리스-플라스미노겐을 제공함과 동시에 또는 제공한 후에 조직 플라스미노겐 활성화제(tPA)를 제공하는 단계로서, 조직 플라스미노겐 활성화제는 제2 과삼투 용액에 포함되는, 단계;
   제1 회복 단계에서, 5℃ 내지 25℃의 저온에서 알부민 및 전해질을 포함하는 제3 과삼투 액을 신장을 통해 순환시키는 단계;
   제2 회복 단계에서, 30℃ 내지 37℃의 온도에서 적혈구(RBC)를 포함하는 제4 과삼투 액을 신장을 통해 순환시키는 단계; 및
   통상적 기준에 따라 신장을 평가하는 단계
   를 포함하는, 기증자로부터, 예를 들어 순환 정지 기증자(DCD)로부터 적출된 신장의 복구 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 제1 회복 단계가 신장을 통해 상기 제3 과삼투 액을 순환시키는 것을 포함하고,
   상기 제3 과삼투 액은 50g/L 내지 120g/L 농도의 알부민을 포함하고, 이에 의해 순환 압력은 증가하되, 예를 들어, 30 내지 75분 동안, 약 20mmHg에서 90mmHg로 증가하며, 예를 들어 5분당 5mmHg의 단계로 증가하는, 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 제2 회복 단계는 신장을 통해 상기 제2 과삼투 액을 순환시키는 것을 포함하고,
   상기 제4 과삼투 액은 50g/L 내지 120g/L 농도의 알부민을 포함하고, 이에 의해 순환 압력은 30 내지 75분 동안, 약 20mmHg에서 90mmHg로 증가하며, 예를 들어 5분당 5mmHg의 단계로 증가하는, 방법.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
   1 내지 7시간 동안 30mmHg 미만의 압력에서 신장을 통해 보존액을 순환시키면서, 4 내지 16℃의 저온에서 신장을 저장하는 단계를 더 포함하는, 방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 저장 단계는 제2 회복 단계 이후 또는 회복 단계들 사이에서 수행되는, 방법.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 과삼투 액 중 적어도 하나는 생리학적 농도의 전해질 및 알부민을 포함하는, 방법.
7. 제6항에 있어서, 제1 및 제2 과삼투 액이 50g/L 내지 120g/L 농도의 알부민을 포함하는, 방법.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 제1, 제2, 제3 및 제4 과삼투 액 중 적어도 하나는 항트롬빈 III과 같은 응고 억제제; 아르가트로반과 같은 직접 트롬빈 억제제; 단백질 C; 단백질 S; 및 아브식시맙과 같은 혈소판 억제제를 더 포함하는, 방법.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 및 제4 과삼투 액 중 적어도 하나는 백혈구 필터를 통해 순환되는, 방법.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 및 제4 과삼투 액 중 적어도 하나는 사이토카인의 흡착을 위하여, 사이토흡착제(Cytosorbent)와 같은 사이토카인 흡착제에 의해 접촉되는, 방법.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 및 제4 과삼투 액 중 적어도 하나는 내독소의 흡착을 위하여, LPS 흡착제와 같은 내독소 흡착제에 의해 접촉되는, 방법.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    기증자가 3시간 이상 동안 순환 정지를 당한 후 기증자로부터 신장을 회수하는 단계를 추가로 포함하고,
    상기 3시간 이상은 기증자의 복부에 넣은 냉각 식염수, 얼음 또는 얼음 슬러시에 의한 국소 냉각의 2시간 이하를 포함하는 것인, 방법.
13. 기증자가 순환 정지를 당한 후, 적어도 4시간 후에 기증자로부터 신장을 적출하는 단계;
    적출 후 신장에 리스-플라스미노겐을 제공하는 단계로서, 리스플라스미노겐은 50g/L 내지 70g/L 농도의 알부민 및 항트롬빈 III과 같은 응고 억제제를 포함하는 제1 과삼투 용액에 포함되는, 단계;
    리스-플라스미노겐을 제공함과 동시에 또는 제공 후에, 신장에 조직 플라스미노겐 활성화제(tPA)를 제공하는 단계로서, 조직 플라스미노겐 활성화제는 50g/L 내지 70g/L 농도의 알부민 및 항트롬빈 III과 같은 응고 억제제를 포함하는 제2 과삼투 용액에 포함되는, 단계;
    제1 회복 단계에서, 압력을 20mmHg에서 70mmHg 내지 90mmHg로 증가시키면서, 5℃ 내지 25℃의 저온에서 50g/L 내지 120g/L 농도의 알부민 및 전해질 및 항트롬빈 III과 같은 응고 억제제를 포함하는 제3 과삼투 액을 신장을 통해 순환시키는 단계;
    제2 회복 단계에서, 30℃ 내지 37℃의 온도에서, 적혈구(RBC), 50g/L 내지 120g/L 농도의 알부민, 전해질, 및 항트롬빈 III과 같은 응고 억제제를 포함하는 제4 과삼투 액을 신장을 통해 순환시키는 단계; 및
    통상적 기준에 따라 신장을 평가하는 단계
    를 포함하는, 기증자로부터, 예를 들어 심정지 기증자(cardiac arrest donor; DCD)로부터 적출된 신장의 복구 방법.
14. 처리될 신장을 담기 위한 용기(31);
    정맥이 개방된 신장의 동맥에 연결하기 위한 커넥터(32);
    상기 용기와 상기 커넥터(32) 사이에 연결되어, 상기 용기에 존재하는 유체를 신장을 통해 순환시키는 순환 펌프(43);
    배수 밸브(42)를 통해 용기에 연결된 배수구(41);
    용기에 유체를 제공하기 위한, 유체 밸브(55, 56, 57, 58, 59)를 통해 용기(31)에 연결된 적어도 하나의 백(50, 51, 52, 53, 54);
    펌프(43)에 의해 펌핑된 유체에 산소공급하기 위한 산소 공급기(47);
    펌프에 의해 펌핑된 유체의 온도를 제어하기 위한 가열기/냉각기(48);
    펌프에 의해 펌핑된 유체에서 백혈구를 제거하기 위한 백혈구 필터(49);
    용기의 유체에서 내독소를 제거하도록 배열된 내독소 흡착기(95);
    용기의 유체에서 사이토카인을 제거하도록 배열된 사이토카인 흡착기(96); 및
    용기의 유체에서 백혈구를 제거하도록 배열된 백혈구 필터(98)
    를 포함하는, 기증자, 예를 들어 순환 정지 기증자(DCD)로부터 적출된 신장을 복구하기 위한 장치.
15. 리스-플라스미노겐;
    tPA;
    전해질; 및
    50g/L 내지 120g/L 농도의 알부민
    을 포함하는, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 방법을 수행하기 위한 유체.

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