CN113677201B - 用于修复肾脏的方法和装置 - Google Patents

Abstract

用于恢复例如从心脏停搏的尸体摘取的肾脏的方法和装置以及流体，其中肾脏已经暴露于热缺血4小时或更长时间。摘取后，在后桌上，向肾脏注射lys‑纤溶酶原，并且15分钟后注射t‑PA。加入包含白蛋白和电解质的高渗循环流体，并使该高渗循环流体与所述lys‑纤溶酶原和t‑PA一起循环通过肾脏，由此循环压力在30分钟至75分钟内从20mmHg升高至70mmHg，例如以每5分钟5mmHg的步幅升高。然后通过常规标准评估肾脏。

Description

用于修复肾脏的方法和装置

发明领域

本发明涉及摘取(harvesting)肾脏以及肾脏的保存和评估。

背景

目前可用于移植的肾脏库主要限于来自脑死亡时仍暴露于机械呼吸且其中心脏仍在跳动的病人的肾脏。此外，使用来自活体捐献者的肾脏。

来自在被送往医院之前或在送往医院期间死于心脏停搏的患者的肾脏通常不用于移植。在少数情况下，这样的肾脏已被使用，特别是在从心脏停搏到摘取肾脏的时间短，例如少于30分钟到60分钟的情况下。如果从心脏停搏到摘取的时间超过1小时，肾脏通常不适用于移植。如果这样的第二肾脏库可以被使用，可用于移植的肾脏数量可以增加十到百倍。

心脏停搏后，肾脏暴露于热缺血(warm ischemia)，这导致代谢有毒终产物在肾脏中积累。这是由于未能循环氧合血，导致代谢终产物的积累。

在心脏停搏后的早期，凝血系统被活化，并且在微循环中形成纤维蛋白血栓，导致例如如果患者应该接受复苏术并存活下来将需要数小时或数天才能消除的血栓形成事件。

如果发生死亡，肠道中的微生物屏障功能将失灵，导致细菌过度生长，内毒素如LPS和细胞因子的释放开始发生，在一些情况下在5分钟内开始发生。因此，使用死于循环停止的捐献者的肾脏被认为是边缘性(marginal)的，并且在大多数情况下，在循环停止受到控制的情况中使用。热缺血超过两小时的肾脏通常被认为不适用于移植。

如果肾脏被冷却，新陈代谢过程会以每摄氏度约6％的速度下降。在28℃时，新陈代谢过程下降至约50％，并且在22℃时下降至约25％。

尸体的正常冷却以高达每小时2℃发生。因此，5小时后，身体可以具有约27℃的温度。

因此，本领域需要一种在摘取后修复肾脏的方法，随后可以更广泛地使用第二个肾脏库。

专利公布EP0631786A1(摘要)公开了缺血和伴随的再灌注损伤的治疗，其包括施用纤溶酶和纤溶酶形成(plasminforming)蛋白，包括lys-纤溶酶原和类似物质。已经发现可以从glu-纤溶酶原的蛋白水解裂解中获得的lys-纤溶酶原对由缺血条件引起损伤的组织具有保护作用。施用lys-纤溶酶原可用于在再灌注时期和已经发生再灌注之后处理受试者。lys-纤溶酶原也可以与血凝块溶解疗法诸如采用组织纤溶酶原激活剂等的那些疗法联合施用。提到的是，由外科程序引起的缺血状况和随后的再灌注损伤可以用具有lys-纤溶酶原作用的蛋白或lys-纤溶酶原的前体(progenitor)来预防或治疗。这种蛋白甚至可以对已经移植的捐献者器官或组织，以及捐献者和接受者的周围器官和组织具有有益的影响。施用具有lys-纤溶酶原作用的蛋白或lys-纤溶酶原的前体允许器官和组织耐受长时期的缺血以及移植后由再灌注引起的生理应激。通过在外科程序开始前施用具有lys-纤溶酶原作用的蛋白或lys-纤溶酶原的前体，可以减少或完全预防器官和组织损伤。在移植的情况下，可以在取出器官或组织之前向捐献者施用蛋白。在取出该器官或组织之前，可以对捐献者进行全身治疗或进入到供应器官或组织的动脉中的局部治疗。同样，器官或组织的接受者可以在移植前进行治疗，以保护移植区域周围的器官和组织以及将要放置在接受者体内的器官或组织。具有lys-纤溶酶原作用的蛋白或lys-纤溶酶原的前体也可以在再灌注期间或之后施用。因此，该专利公布提出将lys-纤溶酶原添加至仍具有循环的捐献者或受者体内，否则将没有作用。

发明概述

因此，本发明的一个目的是单独或以任何组合来缓和(mitigate)、减轻(alleviate)或消除一个或更多个上述缺陷和缺点。

在一方面，提供了一种恢复从捐献者例如从心脏停搏的捐献者(DCD)摘取的肾脏的方法，包括：在捐献者的循环停止后至少两小时从捐献者取回肾脏；在摘取后向肾脏提供lys-纤溶酶原，其中lys-纤溶酶原包含在第一高渗溶液中；在提供lys-纤溶酶原的同时或在提供lys-纤溶酶原之后，提供组织纤溶酶原激活物(tPA)，其中组织纤溶酶原激活物包含在第二高渗溶液中；在第一恢复步骤中，在5℃与25℃之间的低温，使第三高渗流体循环通过肾脏，所述第三高渗流体包含白蛋白和电解质；在第二恢复步骤中，在30℃至37℃之间的温度，使第四高渗流体循环通过肾脏，所述第四高渗流体包含氧合红细胞(RBC)；用常规标准评估肾脏。

在实施方案中，第一恢复步骤可以包括：使所述第三高渗流体循环通过肾脏，其中所述第三高渗流体包含浓度在50g/L与120g/L之间的白蛋白，由此循环压力在30分钟至75分钟内升高，例如从约20mmHg升高至90mmHg，例如以每5分钟5mmHg的步幅升高。第二恢复步骤可以包括：使所述第四高渗流体循环通过肾脏，其中所述第四高渗流体包含浓度在50g/L与120g/L之间的白蛋白，由此循环压力在30分钟至75分钟内升高，例如从约20mmHg升高至90mmHg，例如以每5分钟5mmHg的步幅升高。

在另一种实施方案中，该方法还可以包括：在4℃与16℃之间的低温存储肾脏，同时在低于30mmHg的压力，在1小时与7小时之间的时间内使保存流体循环通过肾脏。存储步骤可以在第二恢复步骤之后或在恢复步骤之间进行。

在再一种实施方案中，第一高渗流体和第二高渗流体中的至少一种包含白蛋白和生理浓度的电解质，其中第一高渗流体和第二高渗流体包含浓度在50g/L与120g/L之间的白蛋白。

在又其他实施方案中，第一高渗流体、第二高渗流体、第三高渗流体和第四高渗流体中的至少一种还可以包含以下中的至少一种：凝血抑制剂，诸如抗凝血酶III；直接凝血酶抑制剂，诸如阿加曲班；蛋白质C；蛋白质S；和血小板抑制剂诸如阿昔单抗。

在又其他实施方案中，第三高渗流体和第四高渗流体中的至少一种被循环通过白细胞过滤器。此外，第三高渗流体和第四高渗流体中的至少一种可以与细胞因子吸附器诸如Cytosorbent接触，用于吸附细胞因子。此外，第三高渗流体和第四高渗流体中的至少一种与内毒素吸附器诸如LPS Adsorber接触，用于吸附内毒素。

在又其他实施方案中，该方法还可以包括：在捐献者的循环停止至少三小时后，从捐献者取回肾脏，其中该至少三小时包括通过装入捐献者的腹部的冷盐水、冰或冰泥进行的不超过两小时的局部冷却。

在又另一种实施方案中，提供了一种恢复从捐献者例如从心脏停搏的捐献者(DCD)摘取的肾脏的方法，包括：在捐献者的循环停止后至少4小时，从捐献者中取回肾脏；摘取后向肾脏提供lys-纤溶酶原，其中lys-纤溶酶原包含在第一高渗溶液中，该第一高渗溶液包含凝血抑制剂，诸如抗凝血酶III和浓度在50g/L与70g/L之间的白蛋白；在提供lys-纤溶酶原的同时或在提供lys-纤溶酶原之后向肾脏提供组织纤溶酶原激活物(tPA)，其中组织纤溶酶原激活物包含在第二高渗溶液中，第二高渗溶液包含凝血抑制剂，诸如抗凝血酶III和浓度在50g/L与70g/L之间的白蛋白；在第一恢复步骤中，在5℃与25℃之间的低温，在使压力从20mmHg升高至70mmHg与90mmHg之间的同时，使第三高渗流体循环通过所述肾脏，所述第三高渗流体包含电解质和凝血抑制剂诸如抗凝血酶III以及浓度在50g/L与120g/L之间的白蛋白；在第二恢复步骤中，在30℃至37℃之间的温度，使第四高渗流体循环通过肾脏，所述第四高渗流体包含红细胞(RBC)、电解质和凝血抑制剂诸如抗凝血酶III以及浓度在50g/L与120g/L之间的白蛋白；用常规标准评估肾脏。

另一方面，提供了一种用于恢复从捐献者例如从循环停止的捐献者(DCD)摘取的肾脏的装置，包括：用于容纳待处理的肾脏的容器；用于连接到具有静脉开口的肾脏的动脉的连接件；连接在容器和所述连接件之间的用于使存在于容器中的流体循环通过肾脏的循环泵；经由排液阀连接到容器的排液袋；经由流体阀门连接到容器的至少一个袋，用于向容器提供流体；用于使由泵泵送的流体氧合的氧合器；用于控制由泵泵送的流体的温度的加热器/冷却器；用于去除由泵泵送的流体中的白细胞的白细胞过滤器；被布置成去除容器的流体中的内毒素的内毒素吸附器；被布置成去除容器的流体中的细胞因子的细胞因子吸附器；和被布置成去除容器的流体中的白细胞的白细胞过滤器。

在另一个方面，提供了一种用于进行根据权利要求1至11所述的方法中的任一种方法的流体，所述流体包含lys-纤溶酶原、tPA、电解质和浓度在50g/L与120g/L之间的白蛋白。

附图简述

本发明的其他目的、特征和优点将从以下参考附图对本发明实施方案的详细描述中变得明显，其中：

图1是通过切割主动脉和腔静脉整体摘取的两个肾脏的示意图。

图2是肾脏毛细血管系统的示意图。

图3是用于进行所述方法的装置的实施方案的示意性框图。

图4是用于进行所述方法的装置的另一种实施方案的示意性框图。

图5是用于进行所述方法的装置的再一种实施方案的示意性框图。

图5a是用于进行所述方法的装置的又一种实施方案的示意性框图。

图5b是类似于图5a的用于单独处理两个肾脏的示意性框图。

图6是示出了实施例1中动脉血流的变化的图。

图7是示出了实施例1中尿液产生的图。

图8是示出了实施例2中肾动脉血流的图。

图9是示出了实施例3中肾动脉血流的图。

图10是示出了实施例4中移植后的肾动脉流的图。

图11是示出了实施例6中移植后的肾动脉流的图。

图12是示出了实施例7中移植后的肾动脉流的图。

图13是示出了实施例9中移植后的肾动脉流的图。

图14是示出了实施例9中的肾脏的照片。

图15a、图15b、图15c和图15d是示出了根据实施例9的移植的肾的照片。

图16a是示出了主要来自RBC的IL-6水平变化的图。

图16b是示出了也主要来自RBC的IL-8水平变化的图。

图16c是示出了也主要来自RBC的IL-1β水平变化的图。

图16d是示出了也主要来自RBC的TNF-α水平变化的图。

图17是示出了根据实施例12使用约300mosm的渗透压(osmolality)的改良溶液灌注后的流的图。

图18是示出了根据实施例14的压力、流和阻力的图。

图19至图22是示出了根据实施例16在移植前和移植后的肌酸酐的图。

图23和图24是示出了根据实施例16的肾脏的照片。

具体实施方案

下面，将描述本发明的几个实施方案。描述这些实施方案是为了说明目的，以便使技术人员能够实施本发明并公开最佳模式。然而，这样的实施方案不限制本发明的范围。此外，示出并讨论了特征的某些组合。然而，不同特征的其他组合在本发明的范围内是可能的。

当心脏停止跳动时，血液循环就停止了。这可能导致来自身体的级联事件，试图维持血液循环，在脑疝后脑死亡的情况下，这被称为自主儿茶酚胺风暴，其中大量肾上腺素和去甲肾上腺素在体内释放，试图维持心血管稳定。最终结果是脑死亡和心脏停搏。当心脏停搏发生在脑疝之前时，其他级联事件将随之发生，影响凝血和炎症系统，而没有儿茶酚胺风暴。对由于心脏停搏和循环停止导致的死亡后的事件了解较少。

心脏停搏和死亡后，在15分钟至25分钟内发生一种称为苍白僵直(pallormortis)的过程，其中皮肤会变得苍白。苍白僵直是全身毛细血管循环停止的结果。

然后，发生一种称为尸冷(algor mortis)的过程，其中身体改变它的温度，直至与环境温度匹配。大约4小时后，取决于周围的温度，体温为约27℃至29℃或更低，并且在约9小时后，体温为约28℃。

然后，发生一种称为尸僵(rigor mortis)的过程，这是死后僵硬(rigidity)，其中肌肉变得僵直(stiff)。死亡后，呼吸停止，剥夺了用于制造三磷酸腺苷(ATP)的氧气的来源。在肌肉松弛过程中，需要ATP引起肌动蛋白-肌球蛋白交叉桥的分离。身体进入尸僵状态，因为它无法打破这些桥。在尸僵中，肌球蛋白头部经由二磷酸腺苷(ADP)继续与肌动蛋白的活性位点结合，并且肌肉不能松弛直到另外的酶活性降解该复合物。

尸僵在心脏停搏后约1小时至4小时开始，并且在约12小时后达到峰值。它影响体内的所有肌肉和所有器官，包括肾脏。

当在远离医院的地方遇到(procure)心脏停搏患者时，难以评估心脏停搏的持续时间和对肾脏的影响。因此，远程心脏停搏体通常不用于移植目的。本发明旨在恢复这样的肾脏，并在移植前恢复、评估和存储这样的肾脏。

肾脏摘取得越早，肾脏的结果就越好。

然而，根据本发明实施方案的恢复过程能够在尸僵峰值之前和直到尸僵峰值时修复肾脏，在死亡和循环停止之后时间越长，结果越不理想。

上述所有行为都会对心脏停搏体内的肾脏产生干扰。

心脏停搏可以活化血液的凝血系统，导致促凝结状态，最终可以在毛细血管系统中产生微血栓。关于下降的体温如何影响凝血过程(凝血过程的活化和去活化两者)知之甚少。

当活体(living body)的循环系统工作时，血液是否会凝结取决于两组物质之间的平衡，一些物质促进凝结，被称为促凝剂，并且一些物质抑制凝结，被称为抗凝剂。在正常血流中，抗凝剂占主导地位，因此血液在血管中循环时不会凝结。

当心脏停搏后血液停止循环时，对凝血系统随着时间的推移会发生什么知之甚少。不受任何理论的束缚，据信当存在循环停止时，抗凝剂被下调，并且促凝剂被活化，这也取决于循环停止的原因。该过程可以是缓慢的，并且也取决于温度随时间的下降。

已知如果在化学清洁的玻璃管中收集血液，血液通常会在6分钟至10分钟内凝结，并且这常用于确定凝血障碍。然而，如果玻璃管被替换为硅化容器，血液可以持续一个小时或更长时间不会凝结，因为血小板没有被活化。因此，据信被截留在摘取的肾脏中的血液通常直到1小时或更长时间才凝结。2小时至4小时后将会发生广泛的凝结。

当来自心脏的压力停止时，一些血管，特别是毛细血管变得更窄，这可能导致苍白僵直。再过一段时间，血液中白蛋白和其他新生物质(oncotic substance)的存在导致水从周围组织超滤进入血管，引起血管扩张，特别是小动脉和小静脉以及更大的血管。随着时间的推移，红细胞被分离，并在沉降反应中下沉至血管的最低部分。包含白细胞和血小板的血沉棕黄层(buffy coat)形成于红细胞之上。血沉棕黄层具有增加浓度的血小板和其他蛋白。血管的扩张可能会暴露血管的某些部分，这些部分与血小板相互作用，并在大约2小时至4小时后活化血小板。此外，因为没有血液循环，血小板也可以与血管表面的内皮细胞相互作用，特别是如果存在血管损伤，并附着在内皮细胞上。这种相互作用可以进一步损伤内皮细胞，并也最终导致形成凝块(clot)。这样的凝块可以在不具有循环的血管的任何部分形成。温度的下降也以不同方式影响凝血系统。通常，较低的温度将减缓化学反应。因此，在一段时间后，通常是几个小时，诸如1小时至4小时，血管可能包含粘附在血管壁上的多个较小或较大的凝块。这些凝块不能通过冲洗肾脏的血管来洗出，冲洗通常发生在从捐献者获得肾脏之后。事实上，如果试图通过高压和大冲洗流量(high flushing flow)来冲出凝块，则可能会对已剥除凝块的内皮细胞造成损伤。相反，这些凝块会在摘取后和移植前的肾脏存储的时期保留。当肾脏最终被移植到接受者体内时，血管暴露于接受者的血液，这可能导致血管受损区域中形成新的凝块。因此，尽快清除凝块是重要的，特别是如果肾脏是在循环停止后一段时间，诸如2小时、3小时、4小时或更长时间后从捐献者处获得的。由于这种凝块是在循环停止后的一段时间产生的，这个问题在从循环停止长时间后，诸如4小时或更长时间后从捐献者摘取的肾脏中更大。另一方面，低温减缓了这一过程，这意味着如果捐献者的身体在摘取前被更迅速地冷却，这可以减少凝血过程。

肾脏的特殊之处在于它包括两个串联的毛细血管系统，肾小球毛细血管和管周毛细血管，在两个毛细血管系统之间布置有出球小动脉，如图2中示出的。因此，两个毛细血管系统中都可能已形成微凝块。此外，在出球小动脉中可能已经形成了较大的凝块，夹在毛细血管系统之间。凝血过程将影响肾脏，并阻塞两个毛细血管系统和存在于它们之间的出球小动脉。因此，很难从已形成微凝块的肾脏中冲洗出凝块。

当凝块形成时，大量纤溶酶原和其他血浆蛋白一起被截留在凝块中。纤溶酶原直到被活化才会变成纤溶酶或导致凝块溶解。在活体中，受伤的组织和血管内皮非常缓慢地释放一种被称为组织纤溶酶原激活物(tPA)的强大激活物，组织纤溶酶原激活物(tPA)后来最终将纤溶酶原转化为纤溶酶，纤溶酶继而移除剩余的血凝块。事实上，其中血流已被凝块堵塞的许多小血管在活体中通过这种机制被重新打开。因此，纤溶酶系统的特别重要的功能是从数百万个微小的外周血管中清除微小的凝块，如果没有办法清除这些微小的凝块，微小的外周血管最终会变得堵塞。

截留在凝块中的纤溶酶原通常是glu-纤溶酶原，其在暴露于tPA时缓慢转化为纤溶酶。这导致系统缓慢启动。然而，一段时间后，glu-纤溶酶原转化为lys-纤溶酶原，lys-纤溶酶原快得多地转化为纤溶酶。因此，存在正向扩增系统(positive amplificationsystem)，在最初的时间(可能长达48小时)后增加凝块的溶解速度。

经过长期实验后，发明人得出结论，在缺血的最初几个小时期间，凝块的形成可能对肾脏有害。据信，血小板被不流动的血液活化，并且形成的凝块可以影响并且损伤凝块附近的内皮细胞。由于在死亡和循环停止后没有循环，凝块将在长时间内影响内皮细胞，使内皮细胞受损。

内源性溶解系统可用于溶解捐献者肾脏中的微凝块。然而，凝块溶解缓慢。事实上，加入大量的tPA将不会增加纤溶酶原活化为纤溶酶的速度。

然而，已经发现添加lys-纤溶酶原和添加tPA将增强凝块的溶解并加速该过程。在凝块溶解后也要注意局部环境，以防止血栓再形成，因为局部内皮在溶纤维蛋白治疗后更脆弱。

为了验证修复过程，将在4小时或更长时期暴露于热缺血的来自猪的肾脏用于实验目的。存在可以修复暴露于缺血6小时、8小时、10小时、12小时或更长时期的肾脏的证据。此外，暴露于缺血持续1小时或更短时间的肾脏也可以或多或少地从该过程中受益，因此包括来自脑死亡捐献者(BDD)的肾脏被认为是边缘性的，要么是由于延长的热缺血或冷缺血时间，要么是其他共同作用因素，诸如年龄、高血压、糖尿病、低血压、在重症监护室(ICU)的时间、无尿、升高的实验室值、后桌(backtable)上肾脏灌注不良或主要不接受捐献者用于移植的任何其他原因。

在本发明的实施方案中，通过使用以下提到的主要步骤来恢复暴露于长时间和未知时期的热缺血的肾脏。如将要进一步解释的，步骤不需要精确地按照以下指示的顺序进行。

第一步可以包括在摘取后不久和在后桌将lys-纤溶酶原和tPA依次或组合注射到肾的动脉中，或者可以通过体外、离体灌注装置依次或组合注射。lys-纤溶酶原包含在是生理等渗电解质流体的载流(carrier fluid)中，生理等渗电解质流体可以包含高渗剂。可以注射约5ml至20ml lys-纤溶酶原(使用5U/肾至100U/肾)。lys-纤溶酶原将附着至存在于肾脏的血管中的任何凝块。约15分钟后(或同时)，可以以相同方式将约5ml至20ml tPA(使用0.5mg/肾至10mg/肾)注射到动脉中。tPA可以包含在是生理等渗电解质流体的载流中，生理等渗电解质流体可以包含高渗剂。第一步可以在室温或更高温度诸如20℃至37℃提供。

肾脏可以另外地暴露于循环或灌注步骤，其中肾脏通过在肾脏的动脉中插入连接件并且将肾脏布置在用于收集从静脉流出的流体的容器中而连接到灌注装置。该容器可以包含500ml-1500ml的循环流体，该循环流体为生理等渗电解质流体并且还可以包含高渗剂，例如单独的或与另外的高渗剂组合的白蛋白57g/L。循环流体在15℃至24℃的温度(室温)循环通过肾脏持续35分钟或更长时间，从20mmHg的压力开始，并且以每5分钟时间段5mmHg重复地将压力升高到70mmHg的最大值，然后是在较低压力例如30mmHg的30分钟时间段。在此期间，lys-纤溶酶原和tPA在肾脏中进一步循环，并且阻力将逐渐降低。检查肾脏的颜色，并且当肾脏具有苍白的外观时，可以中断在高压的处理，以继续降低压力。

可以组合或单独地添加以下一项或多项：

凝血酶抑制剂，诸如抗凝血酶III(ATIII)；argobatran，或任何其他直接凝血酶抑制剂，诸如伊诺加群(inogatran)、美拉加群(melagatran)(及其前药希美加群(ximelagatran))、达比加群(dabigatran)或水蛭素及其衍生物；

变构抑制剂；

血小板抑制剂，诸如糖蛋白IIb/IIIa受体拮抗剂(阿昔单抗(abiciximab)、依替巴肽(eptifibatide)、替罗非班(tirofiban))；

不可逆环氧酶抑制剂(阿司匹林、三氟柳(triflusal))；

腺苷二磷酸(ADP)受体抑制剂(坎格雷洛(cangrelor)、氯吡格雷(clopidogrel)、普拉格雷(prasugrel)、替格瑞洛(ticagrelor)、噻氯匹定(ticlopidine))；

磷酸二酯酶抑制剂(西洛他唑(cilostazol))；

蛋白酶活化受体-1(PAR-1)拮抗剂(伏拉帕沙(vorapaxar))；

腺苷再摄取抑制剂(dipyradimol)；

血栓素抑制剂(血栓素合酶抑制剂，诸如伊非曲班(ifetroban)、吡考他胺(picotamide)和

血栓素受体拮抗剂，诸如特芦曲班(terutroban))；

或任何其它血小板抑制剂，以防止经处理的凝块的血栓再形成。这些可以在第一注射步骤或第一循环步骤或任何其它步骤中添加。添加肝素或低分子肝素是任选的。

该过程的第二步包括通过使高渗流体循环通过肾脏的血管来灌注和恢复循环系统。高渗被定义为由血浆中的蛋白引起的压力，但可以是人工构建物(artificialconstruct)，诸如葡聚糖或聚乙二醇(PEG)。共同的性质是它应该具有比它流经的肾脏的周围组织更高的胶体渗透压。此外，流体可以在恢复阶段的一个阶段在低温例如12℃至24℃和低压例如20mmHg至30mmHg灌注，并且在恢复阶段的另一个阶段在更高温度例如18℃至32℃灌注，在该另一个阶段灌注压力也可以更高，例如25mmHg至70mmHg或90mmHg。一种高渗流体包含40g/L至120g/L，诸如50g/L至80g/L，例如57g/L或72g/L的高浓度的白蛋白，但也可以包含具有类似性质的其他物质或其组合。与正常胞外水平相比，高渗流体可包含大量的钾，约10mM至25mM。高渗流体也可以包含渗透膜不可渗透的剂-葡萄糖酸盐和葡萄糖，但是可以包含具有类似功能的其他剂来代替或与这些剂(乳糖酸盐、棉子糖、甘露醇)组合。流体可以通过在正常大气压暴露于由氧气(O₂ 20％)、二氧化碳(CO₂ 6.5％)和氮气(N₂ 73.5％)组成的气体被氧合，其中氧气的百分比可以在血气分析后根据代谢需要而改变。高渗流体从肾脏的间质组织中去除水，并且恢复毛细血管系统。此外，使用缓冲系统诸如碳酸氢盐，但可以另外地或可选地包含具有类似功能的其他剂或物质(磷酸盐、组氨酸/组氨酸-HC)，洗出来自失灵代谢过程的有毒产物，并且恢复pH。

由于肾脏长时期暴露于缺血，糖原存储被消耗，导致缺乏ATP。因此，细胞离子泵无法工作，并且细胞内和细胞外的Na/K平衡被破坏。pH降低，并且乳酸盐和丙酮酸盐在组织中产生和积累。高渗流体包含葡萄糖和/或腺嘌呤作为代谢的底物，但是可以另外地或可选地包含具有类似功能的其他剂(α-酮戊二酸盐、组氨酸、谷氨酸)。然而，在如此低的温度，代谢速度非常慢。

循环在低泵压进行。在循环期间，血管阻力连续下降，并且循环继续进行直至血管阻力足够低，这可能需要几个小时。

该过程的第三步包括进一步恢复微环境和评估肾脏。温度升高至约32℃，并且压力升高至30mmHg或高达70mmHg。将洗涤过的红细胞(RBC)添加至血细胞比容为3至20，诸如5至10，例如6至8。氧合是通过具有升高水平的氧气的氧合器进行的。通常，肾脏开始产生尿液，并且浓缩肌酐的能力被测量为功能指标。可以向溶液中加入已知量的肌酐作为肾脏过滤能力的标志物。此外，对肾脏进行可视检查。如果肾脏包含(大的)黑暗区域，它可能是肾脏衰竭的迹象。此外，评估肾脏血管阻力。

如果肾脏被认为适用于移植，则肾脏被直接移植或被冷却至4℃至15℃的低温并被存储直到移植。

也可以在第二步和第三步之间安排存储期。

不同的步骤可以在许多方面进行修改。

第一步可以通过在第二步之后插入一个或几个第一步来修改。例如，高渗流体可以在一个小时内灌注，随后加入lys-纤溶酶原和tPA以及可能的ATIII，并且灌注可以再继续1小时，随后再加入lys-纤溶酶原和tPA以及可能的ATIII，等等。

第二步可以通过在约1小时的第一时期期间灌注高渗流体，并且然后降低胶体渗透压，例如通过将白蛋白浓度从例如72g/L降低至例如57g/L，并使流体再循环1小时至3小时来修改。高渗流体可以另外包含单独的或与白蛋白或任何其他高渗剂组合的剂量为0.1％-10％的葡聚糖40。

第三步可以通过包括凝血抑制剂和/或血小板抑制剂来修改，以防止经处理的凝块的血栓再形成。可以使用上文关于第一步提及的相同产品。在第三步期间添加到肾脏之前，可以将产品添加到RBC悬浮液中，或者在添加RBC之前添加到灌注溶液中，或者添加到两种溶液中。据信，在微循环系统和血管中形成的凝块是粘性的，并粘附在内皮细胞上。当凝块被溶解时，它们会对内皮细胞和糖萼留下损伤。这种损伤将活化RBC悬浮液中即使洗涤红细胞仍然保留的可能的血小板和凝血因子。这种活化可能导致在相同位置处凝块的新形成，这是应当避免的。抗凝血酶III或任何直接凝血酶抑制剂将与凝血酶反应，并使凝血酶失活和去除凝血酶。阿昔单抗或任何其他血小板抑制剂防止血小板粘在一起并粘向受损的内皮细胞。添加肝素或低分子肝素是任选的。

第三步可以修改为在28℃至37℃和30mmHg至90mmHg进行。

冲洗步骤可以在步骤之间和步骤期间实施。冲洗流体通过肾脏，并且然后被丢弃。因此，冲洗流体不会循环通过肾脏。

肾脏被尽快地摘取，然而不清楚肾脏由于循环停止或其他原因而暴露于缺血的时长，但缺血时间超过2小时，诸如约3小时或4小时或更长。如图1所示，通过分离肾脏、主动脉和腔静脉，并在肾动脉和肾静脉的上方和下方切割主动脉和腔静脉来摘取肾脏。将组件放在后桌上，并清除主动脉残余物和腔静脉残余物的可见凝块。

尽快用针和注射器将lys-纤溶酶原(5U至100U)注射到肾动脉中，由此注射器前方的肾动脉被挤压以确保全部lys-纤溶酶原进入肾动脉并进入肾脏内。当流体离开肾静脉时，这是肾脏已经被lys-纤溶酶原灌注的指示。lys-纤溶酶原与血管中的凝块相互作用，并与凝块和凝块中的纤维蛋白结合。然后，夹紧肾静脉以及两个肾动脉，直到tPA注射的时间。

接下来，以与lys-纤溶酶原相同的方式注射tPA。然而，静脉可以保持夹紧，以使肾脏内部产生轻微的过压。然后在主动脉一端插管并在另一端夹紧，建立用于离体机器灌注的系统。两条输尿管均被插管，以允许监测尿液。

凝血酶抑制剂，诸如抗凝血酶III(ATIII)或argobatran可与lys-纤溶酶原一起和/或与tPA一起加入。

应注意的是，lys-纤溶酶原的注射体积(约10ml)相当于通常包含在肾脏内的血液体积(约每个肾脏15ml至30ml)(如果肾脏的重量为150g)(10至20ml/100g肾脏)的约一半。tPa的体积也为约10ml，并且剂量为每肾0.5mg至10mg。

最后，将肾脏放入封闭的容器中，肾脏悬挂在主动脉残余上，并连接到循环系统，如图3所示。腔静脉的下端是开放的，以便流体可以自由流出肾脏，同时流体由容器的循环系统提供给主动脉。

有时，肾脏被分开处理，由此主动脉被纵向分成两部分，并且套管被连接到仍然从分开的主动脉片流出的肾动脉，如图3所示，允许几条动脉作为单条动脉被处理，并且有可能单独监测每个肾脏。在人类中，每个肾脏多于一条动脉可见于超过30％的所有肾脏中。使用建议的技术，这将没有任何问题。

如图3所示，将肾脏35的主动脉残余33连接至布置在容器31中的连接件32。腔静脉34是开放的，以向容器31的底部37排放流体，如虚线36所示。液位(fluid level)36可以在肾脏下方或肾脏上方或两者之间，后者在图3中示出。

容器的底部37经由阀42连接到排液袋41。底部还经由第一开关阀44连接到泵43。在图3所示的第一位置，第一开关阀44将泵43的入口连接到冲洗流体袋45或容器31的底部37。

泵43的出口连接到控制经过泵的流体的温度的加热器/冷却器48。加热器/冷却器48的出口经由第二开关阀46通向氧合器47和白细胞过滤器49，或者在图3所示的开关的第一位置直接通向连接件32和肾脏。在所示位置，流体仅通过暴露于周围环境而被氧合(溶解在流体中的氧气)。

因此，将存在于容器37底部的流体经由第一开关44循环到泵43，并进一步经由加热器/冷却器48循环到第二开关46和连接件32。流体继续从连接件32到主动脉和肾脏，并且通过肾脏的血管，并且进一步到肾脏的静脉，并且最后释放到容器的底部。

泵43可以是压力控制的泵，使得泵压力被调节至例如20mmHg的期望值，并且流动取决于肾脏的阻力。

如图3所示，存在于容器31的底部37的流体经由几个袋50、51、52、53和54提供。每个袋子经由阀55、56、57、58和59连接到容器31。通过打开阀，袋的内容物通过重力被运送到容器的底部。

在一种实施方案中，操作可以如下：

摘取后，在肾脏在后桌暴露于lys-纤溶酶原和tPA后，肾脏被移至容器31，并且主动脉残余被连接到连接件32，使得肾脏悬挂在容器31内。静脉是开放的，并且允许流体直接向下排放到容器的底部37。肾脏可以搁置在支撑物(未示出)诸如网上，并且其位置可以相对于水平轴具有不同的角度。容器中的温度被设定为期望的起始温度，例如18℃至28℃。通过打开相应的阀55，可以从循环流体袋50向容器31提供包含电解质以及可能的浓度为57g/L白蛋白的循环流体。然后灌注肾脏，开始用20mmHg压力持续5分钟，然后以每5分钟升高5mmHg，直到50mmHg至90mmHg，以事先决定的为准。然后压力可以降低到例如20至30mmHg，并灌注持续事先决定的另外一段时间。肾脏的阻力已经下降，并且现在肾脏是正常的苍白，没有或只有小的暗区域。这是肾脏的血管中的凝块已经被溶解和去除的指示。现在，通过打开排液阀42，容器内的流体流到排液袋41。

不受任何理论的束缚，据信肾脏的暗区域是没有循环的区域的指示，这可能是因为凝块或其他原因。如果随后在这些暗区域中获得了循环，肾脏可以将这些区域恢复为有功能的组织。

在灌注步骤中，排液阀42被关闭，并且通过打开阀56，1000ml的灌注流体51经由重力流到容器31。当1000ml的流体已经积聚在容器的底部时，容器中的液位将上升至高于线36，随后阀56被关闭。第一开关阀44处于图3所示的第一位置，并且泵被启动并以20mmHg的压力泵送。加热器/冷却器48将温度调节至12℃至18℃。容器的底部的流体在几个小时内，诸如1小时至4小时内，以20mmHg至30mmHg的压力循环。在灌注步骤中，肾脏的化学得到恢复，并且有毒产物被去除。现在，停止泵并进行冲洗。在冲洗步骤之后，在低温灌注期间，灌注步骤可以用另一种灌注溶液的组合物重复，或者灌注也可以在另一个更高的温度在有或没有RBC的情况下继续。

在评估步骤中，在打开排液阀42后，可以使用与灌注步骤相同的溶液，以将容器中的内容物排出到排液袋41，或者在上述两个冲洗步骤之后排液阀42被关闭，并且通过打开阀57，500ml评估流体52通过重力流到容器31。当已经进入了500ml流体时，阀57被关闭。第一开关阀44处于图3所示的第一位置，并且泵被启动并以20mmHg的压力泵送。加热器/冷却器48将温度升高至28℃至32℃。在检查pH和环境的5分钟至30分钟后，通过打开阀58从袋53添加红细胞(RBC)悬浮液，直到获得5至10的血细胞比容，随后阀58被关闭。第二开关阀46被移动到其第二位置，包括用于氧合流体和红细胞的回路中的氧合器47。循环在30mmHg的压力进行1小时至4小时的时间段，直到确定肾脏可用于移植目的。现在在32℃至37℃下和70mmHg至90mmHg的压力评估肾脏15分钟，注意与肾脏是否良好灌注相关的血管阻力、流量和视觉外观。外科医生决定肾脏是灌注良好、中度还是不良，中度是几个蓝色/黑色斑点，并且不良是没有被灌注的几个大的深蓝色或黑色区域。测量尿液产生，并将流量记录为ml/min和100g肾组织。现在泵被停止并且排液阀42被打开，以将容器的底部的所有流体排到排液袋41。

任何冲洗步骤可以通过将第一开关阀44移到连接泵43与冲洗流体袋45的其第二位置来进行。泵被启动(activated)，并向肾脏循环约200ml。离开肾脏到容器的底部的流体经由开放阀42进一步流到排液袋41。以这种方式，所有的红细胞都被从肾脏中冲洗出来，并被冲洗到排液袋中。这样的冲洗步骤可以进行几次，并且在其他步骤之间进行。

在保存步骤中，排液阀42被关闭，并且通过打开阀59，500ml保存流体54通过重力流到容器31。当已经进入了500ml流体时，阀59被关闭。第一开关阀44处于图3所示的第一位置，并且泵被启动(started)并以20mmHg至30mmHg的压力泵送。加热器/冷却器48将温度调节至6℃至18℃，诸如12℃至15℃。将容器的底部的流体在20mmHg至30mmHg的压力循环数小时，长达48小时或更长时间，直到找到接受者，并准备肾脏以移植至接受者。泵被停止并且排液阀42被打开，以将容器的底部的所有流体排到排液袋41中。从连接件32取下肾脏。

图3中描述的实施方案中使用的流体可以是表A中详细描述的流体。

在后桌步骤中，lys-纤溶酶原包含在可以与表A中的基础溶液相同的载流中。

在实施方案中，载流、冲洗流体、灌注流体和保存流体可以具有相同的基本成分。这些成分包括113mM至129mM的钠含量、5mM至25mM的钾含量、2.5mM至5mM的镁含量和1mM至5mM的钙含量。除了上述电解质之外，可以包括以下物质中的一种或几种：浓度为10g/L至120g/L诸如40g/L至75g/L，例如57g/L或72g/L的白蛋白；任选单独或组合的，0g/L至100g/L的葡聚糖40、0g/L至70g/L的羟乙基淀粉(HES)、0g/L至25g/L的聚乙二醇20(PEG 20)或0g/L至3g/L的PEG 35。右旋糖5mM和碳酸氢盐10mM至35mM也是任选的。此外，单独的或组合的氨基酸诸如L-精氨酸(一氧化氮(NO)的前体，在生理应激期间调节血压)、L-亮氨酸(蛋白合成)、L-谷氨酰胺(合成L-精氨酸，氨基酸生产所需)或其他可以以正常浓度添加(见表A)。可以添加的其他物质是I-肌醇(膜电位稳定剂)、腺嘌呤和核糖(制造腺苷——ATP的一部分)。也可以添加诸如表A中所述的微量物质(辅因子和维生素)。可以添加生理浓度的天然存在的激素，诸如诺和锐(Novorapid)、T3、T4、孕酮和雌激素(表A)。可以添加抗生素，诸如泰能(Tienam)。根据表A的这种基础流体可以用作以下中的至少一种：载流、冲洗流体、循环流体、灌注流体和保存流体。

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灌注流体可以具有高渗透压，这是通过加入高渗溶液来实现的，诸如添加白蛋白至浓度在70g/L与120g/L之间，例如72g/L，并且可能是在0g/L至150g/L的葡聚糖40(或葡聚糖70)或任何其它已知的高渗流体。钾可以被保持为比正常血浆中高，在13mM至25mM的范围内，诸如17mM至22mM，例如18mM。可选地，钾浓度可以低，诸如1mM至13mM。由于生理环境和pH的正常化(normalization)，钾和钠的水平在RBC阶段将会变化。

评估流体还可以组合或单独地包括:

凝血抑制剂，诸如argobatran(或任何其他直接凝血酶抑制剂，诸如伊诺加群、美拉加群(及其前药希美加群)、达比加群或水蛭素及其衍生物或别构抑制剂)；

和血小板抑制剂，诸如糖蛋白IIb/IIIa受体拮抗剂(阿昔单抗、依替巴肽、替罗非班)，

不可逆环氧酶抑制剂(阿司匹林、三氟柳)，

腺苷二磷酸(ADP)受体抑制剂(坎格雷洛、氯吡格雷、普拉格雷、替格瑞洛、噻氯匹定)，

磷酸二酯酶抑制剂(西洛他唑)，

蛋白酶活化受体-1(PAR-1)拮抗剂(伏拉帕沙)，

腺苷再摄取抑制剂(dipyradimol)，

血栓素抑制剂(血栓素合酶抑制剂，诸如伊非曲班、吡考他胺和

血栓素受体拮抗剂，诸如特芦曲班)或

任何其他血小板抑制剂，以防止经处理凝块的血栓再形成。

肝素、蛋白质C和蛋白质S是任选的。

也可以加入维拉帕米。图4示出了另一种实施方案。该实施方案旨在在具有用于摘取肾脏的设施的当地医院使用。肾脏在所述当地医院被预处理，并且之后被运送到负责移植到接受者的中心医院。

在当地医院，心脏停搏的受害者，即捐献者到达的时间距离死亡是未知的，但短于12小时、10小时、8小时、6小时或4小时。一旦捐献者到达，尸体可以经受冷却以减缓体内的有害程序，特别是代谢和凝血。这样的冷却可以是局部的，因为身体被放置在冷藏的，例如具有约0℃的空气温度的房间或隔室中。其他冷却方法可以是在身体周围或腹腔中布置冰浆(ice slurry)，或者可以在腹部和/或胸腔中滴注冷流体。

如果当地医院有摘取团队，则摘取可以在进行或不进行任何冷却的情况下尽快地进行。

在摘取肾脏的过程中，进行正常程序，并将肾脏放在后桌上，或者整体保存，或者单独保存每一个肾脏。在后桌，进行将lys-纤溶酶原注射到肾动脉的第一步。允许lys-纤溶酶原在肾脏血管中停留约15分钟或更长时间，在此期间，通过将连接件附接到肾动脉或主动脉来进一步准备肾脏。

大约15分钟后，或者尽快，将肾脏转移到容器组件60，如图4所示。将肾脏61的连接件63附接到在容器62的顶部的对应连接件64，随之肾脏61悬挂在容器61内，如图4所示。肾脏的静脉直接开放于容器61的内部。

当连接件64仍然打开时，连接注射器75并且经由连接件64将约10ml的tPA(Alteplas)注射到肾脏的动脉中。注意，lys-纤溶酶原的加入可以可选地在tPA的加入之前经由附接到连接件64的注射器进行，并且代替在后桌加入。还可选地，lys-纤溶酶原和tPA可以经由注射器同时加入到连接件64，或者在后桌同时注射。

可以使用另一种tPA，诸如链激酶、尿激酶、瑞替普酶和替奈普酶代替alteplas。

然后，将管65连接到连接件64。管65以螺旋构型布置，并将压力袋66连接到连接件64。压力袋66由支架67支撑在容器64上方的预定高度，例如27cm(对应于20mmHg的压力)。压力袋66的高度位置是通过蜗轮电机68沿支架67可调节的。管65的螺旋构型将管65调节到该高度位置。初始时，袋是空的。

循环流体袋76包括包含电解质和高渗剂诸如白蛋白(表A)的循环流体。如箭头77所指示的，袋76中的循环流体被加入到容器62。有约1L循环流体，并且容器62的体积为约1.3L，这意味着容器62几乎充满了循环流体。循环流体经由氧合器以1L/分钟的速度使用O₂、CO₂和N₂的气体混合物进行氧合。操作在室温进行。循环流体与lys-纤溶酶原和tPA一起在系统中循环。

循环流体的量可以小于1L，但应大于管和泵(除容器外)以及肾脏的体积。此外，需要小体积用于封装在容器中。这样的体积可以是10ml、20ml、50ml或更大。因此，可以使用例如150ml至1000ml循环流体。

泵69经由管70连接到容器62，并将循环流体从容器62泵送到压力袋66。当容器62的液位达到预定水平时，水平检测器71启动泵69。泵是例如具有对应于泵的转速的流量的蠕动泵。泵不需要是压力控制的。

泵69可以在一分钟内以例如75ml/min的流量运行，随之75ml的流体从容器62转移到压力袋66。泵流量选择为与表明肾脏的阻力足够低的通过肾脏的期望的流量相对应。通常认为每100g肾脏50ml/min的流量是足够的。成年男子的正常肾脏为约150g。

由于压力袋66被布置在容器62上方例如27cm的高度，循环流体的流以对应于20mmHg的所述27cm水柱的压力流过肾脏。如果肾脏的阻力大，则27cm水柱的压力可以导致例如7.5ml/min的流量通过肾脏，这意味着容器62中的液位在10分钟内恢复到水平检测器71的水平。然后，泵69被水平检测器71启动，并重复该程序。

压力袋66可以通过蜗轮电机68移动到更高的位置。在实施方案中，蜗轮电机68以1cm/min增加压力袋的高度。当压力增加时，例如在10分钟后达到35cm水柱，经过肾脏的流量增加，例如增加至15ml/min。这意味着泵69在5分钟后再次运行。当压力增加使得经过肾脏的流量为75ml/min时，泵69将连续运行。这是肾脏的阻力足够低的指示。现在将停止增加压力袋66的高度。

压力袋的最大高度可以是例如95cm，对应于70mmHg的压力。如果在压力袋处于顶部位置之前(最大70分钟之后)已经达到了期望的流量(对于150克的肾脏为75ml/min)，则程序中断。如果没有达到期望的流量，则以70mmHg(95cm水柱)的压力继续运行30分钟。

到目前为止，操作是在18℃到28℃的室温进行的。

容器62提供有覆盖容器下部大部分的外套(jacket)72。外套现在可以提供有冰浆，用于将容器62冷却到约5℃至18℃的温度，诸如12℃至15℃。压力室被降低到25cm，并且操作泵以使循环流体循环通过肾脏。带有外套和压力袋的容器可以布置在保温箱(insulating box)(未示出)中，并且组件被运送到负责继续处理的主要医院。肾脏可以在这种条件下长时间储存，长达48小时或更长时间。

在可以进行移植的主要医院，肾脏被进一步处理。肾脏可以留在同一容器62中，或者移动到另一个容器82中，如图5所示。容器82包括与肾脏连接的连接件84。泵89将流体从容器82经由管87泵送到肾脏的入口动脉，并且流体经由静脉被排放到容器82，如前所述。泵89是压力控制的，并将压力保持在期望值，诸如20mmHg至30mmHg。加热器/冷却器(未示出)在灌注和保存期间将温度保持在期望的温度，诸如12℃至32℃。排液袋85经由阀86连接到容器82的底部。

根据图5的装置还包括红细胞悬液袋91。将红细胞悬液袋连接到包括并行布置的三个泵92、93、94的循环系统。细胞因子过滤器95与泵92串联布置，内毒素过滤器96与泵93串联布置，并且氧合器97和白细胞过滤器98与泵94串联布置。当布置在红细胞悬液袋91之后的悬液阀99被打开时，红细胞悬液由泵92、93、94循环通过各自的过滤器95、96、98和通过氧合器97。循环可以在室温进行约30分钟。以这种方式，红细胞悬液被调节以去除内毒素、细胞因子和白细胞。此外，红细胞悬液被氧合。

评估溶液存在于袋101中，并经由阀102连接到容器82。当阀被打开时，评估溶液经由重力流向之前通过打开阀86而被排空到排液袋85的容器82。评估溶液被加热到约32℃的温度。评估溶液由泵89循环通过肾脏，随之肾脏获得32℃的温度。然后，通过打开阀99和另外两个阀103和104将红细胞悬液加入到容器中，如图5所示。当悬液已经经由重力转移到容器82中时，红细胞悬液阀99被关闭。

现在，泵92、93、94将存在于容器82中的流体泵送经过打开的阀104和103、以及经过过滤器95、96、98和经过氧合器97。以这种方式，确保评估流体不包含任何内毒素、细胞因子和白细胞。此外，红细胞被氧合。现在可以评估肾脏，例如通过测量“血液”参数，诸如paO₂、PaCO₂、HCO₃、氧饱和度、Hb、Hct、乳酸盐、葡萄糖、pH等。此外，可以对肾脏进行光学检查。阻力可以从泵数据计算。可以检查尿液产生，包括肌酐浓度，如果肌酐被添加到评估流体中的话。以这种方式，检查肾脏对于移植的适用度。

然后，通过打开阀86，将容器82的内容物转移到排液袋85。通过打开阀106，将保存流体105引入到容器82中。保存流体由泵89在20mmHg至30mmHg的压力和12℃至15℃的低温循环，以去除所有的红细胞。此外，会发生肾脏增加其重量，并且保存流体包含白蛋白，用于去除肾脏中积累的多余水分。在长达7天(或更长)的储存期后，肾脏被移植。

在图5a中示出了另一种实施方案。该设备包括用于洗涤红细胞(RBC)悬液(未详细示出)的装置110。袋111中经洗涤的RBC经由管112和阀113移到调节容器114。容器114包括调节回路115，调节回路115包括第一泵116、氧合器117、细胞因子吸附器118、白细胞过滤器119、第一阀120和第二阀121。此外，将带有阀的第一连接件122连接到第一阀120，并且将带有阀的第二连接件123连接到第二阀121。

当第一阀120和第二阀121是开放的并且连接件122、123中的阀被关闭时，调节回路通过操作泵116来调节容器114中的流体，通过操作泵116来使容器114内的流体循环通过氧合器117、白细胞过滤器119和细胞因子吸附器118，以去除存在于容器114内的RBC悬液中的白细胞和细胞因子。当循环已经进行至少30分钟，诸如60分钟或更长时，制备RBC悬液。

处理系统130在图5a的右侧显示。处理系统包括具有第三带阀连接件132和第四带阀连接件133的处理容器131，第三带阀连接件132可以连接到第一带阀连接件122，第四带阀连接件133可以连接到第二带阀连接件123。

处理容器131包括三个流体袋134、135、136，流体袋134、135、136经由设有阀的管连接到容器131。通过打开这些阀，可以将相应流体袋的流体排空到处理容器中。废液袋137经由设有阀门的管连接到处理容器的底部。通过打开阀门，容器131中的流体可以被排空到废液袋137中。

摘取的肾脏140(多个肾脏)设有连接到主动脉残余或肾动脉(多条动脉)的肾脏连接件141。肾脏连接件141可以连接到在容器中提供的容器连接件142。将容器连接件142连接到包括循环泵143和氧合器144的肾脏循环系统。泵143使处理容器中的流体从其下部经由所述泵和氧合器循环至所述容器连接件142和肾脏140的动脉。从肾静脉流出的流体被排放到容器内部，用于进一步循环。

调节系统包括连接到处理容器131底部的第二泵145，其用于将处理容器131中的流体泵送通过内毒素吸附器146和白细胞过滤器147并返回到处理容器。

布置两个医用输液泵148、149用于将药剂(medical agent)输注到肾脏的动脉的流中。输液泵可以是注射泵。要输注的药剂可以是lys-纤溶酶原、tPA、ATIII、血小板抑制剂、凝血酶抑制剂、凝血抑制剂等。医用输液泵148、149可以是可更换的，从而可以连接另外的注射泵。

加热器/冷却器150被布置用于加热/冷却流出处理容器的流体。

系统的操作可以如下进行：

根据已知方法在洗涤系统110中洗涤RBC悬液。当洗涤就绪时，通过打开阀113，RBC悬液通过重力转移到调节容器114。

调节容器114中的流体由泵116通过打开阀120和121来循环并操作泵116以使流体循环通过白细胞过滤器119和细胞因子吸附器118，从而去除剩余的白细胞和细胞因子。

同时，摘取肾脏140并放置在处理容器131中，并经由肾脏连接件141连接到容器连接件142。该操作以在距离图5a所示系统的左边部分一定距离处进行，例如在远程医院进行。

处理容器131根据需要设置有来自流体袋134、135、136的处理流体。当使用后，通过打开废液阀，流体被排出到废液袋137。

操作循环第二泵145以使处理容器中的流体通过白细胞过滤器147和内毒素吸附器146，用于连续去除白细胞和内毒素。

操作循环泵143，以使流体从容器经由氧合器144循环并到达肾脏的动脉，并进一步经由肾静脉循环回到用于处理肾脏的容器，如上所述。

药剂泵148、149可用于添加药剂。

然后，通过将带阀连接件122连接到带阀连接件132并将带阀连接件123连接到带阀连接件133并打开除阀123之外的阀，将处理系统130对接到调节系统115。关闭第一阀120并打开第二阀121，随之操作泵116用于将调节容器114中的流体经由连接件122、132泵送到处理容器。然后，关闭第二阀121并打开阀123，随之泵116将处理容器131中的处理流体循环通过氧合器117、白细胞过滤器119和细胞因子吸附器118。

可以根据上述任何一项方法进行处理。

如图5b所示，处理容器151可以被修改以分别处理两个肾脏，尽管它们可以被整体布置。向两个肾脏提供连接到容器连接件162、172的两个肾脏连接件161、171，容器连接件162、172连接到循环泵163、173，如所示的。氧合器164连接在两个循环系统的公共管线中，如所示的。利用该系统，可以经由医用输液泵168、169和178、179向每个单独的肾脏提供单独的药剂用于不同处理。

整个离体灌注装置可以适用于不同的器官。例如，肝脏比肾脏大，并且可能需要更大体积的流体。

实施例1.

取回前的程序：将30只猪麻醉，并允许它们达到正常换气，然后关闭呼吸机。约15分钟后出现心脏停搏和循环停止。在室温中两小时后，将冷盐水置于腹腔和胸腔中，此后一小时内不进行进一步的操作。

取回：循环停止后三小时，开始取回肾脏的外科手术，这平均耗时45分钟。

后桌程序：在向每个肾脏注射用0.9％盐水稀释至20ml的10ml的0.5％至1％的利多卡因中的约500U肝素后，在后桌用SOLTRAN(肾脏灌注流体，Baxter Healthcare)通过肾动脉冲洗肾脏。

处理程序：将肾脏分为四组：A组有11只猪，B组有13只猪，C组有各自来自6只猪的一个肾，且D组有相同6只猪的另一个肾。

A组如下进行处理：冷藏2小时，然后移植。

B组如下进行处理：冷藏2小时，然后使用具有表B中所示的组成并与经洗涤的RBC混合至hct为约15的溶液在37℃修复90分钟，然后移植。

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C组如下进行处理：在取回肾脏后的4小时内使用LifePort Kidney Transporter和KPS(肾脏灌注溶液)根据制造商(Organ Recovery Systems)的说明直接进行低温灌注，然后移植。

D组是来自与C组相同的捐献者的肾脏，但如下进行处理：冷藏2小时，然后移植。

图6示出了再灌注后和移植后观察90分钟后的动脉血流变化(ml/min)。

图7示出了移植后90分钟以ml/min计的平均尿液产生。使用曼恩-惠特尼U检验，再灌注时经修复的B组的流量更好(p<0.05)(图6)，并且经修复的B组在移植后90分钟也有更好的尿液产生(p<0.05)(图7)。

实施例2

将6只猪麻醉，并允许它们达到正常换气，然后关闭呼吸机。心脏停搏在约15分钟后出现。在室温两小时后，将冷保存溶液(盐水)置于腹腔和胸腔中。

肾脏取回在死亡后4小时开始。

通过肾动脉向每个肾脏注射用0.9％盐水稀释至20ml的10ml的0.5％至1％的利多卡因中的约500U肝素后，在后桌上用冷林格溶液冲洗肾脏。

将肾脏连接到图3所示类型的离体灌注装置。经肾动脉注射0.4mg tPA(alteplas)和150U腺苷三磷酸双磷酸酶(Sigma Aldrich，嘌呤药物-CD39/CD73)。所用溶液的组成可见于表C。

在15℃的温度和无氧合的20mmHg的压力，灌注溶液30分钟。然后将温度升至32℃，压力升至30mmHg，并使灌注在修复阶段再继续90分钟。然后加入经洗涤的过滤掉白细胞的RBC(washed leucocyte filtered RBC)，并且灌注在评估期间再继续90分钟。

然后移植肾脏。

图8示出了再灌注后和90分钟后的肾流量。肾脏没有完全使微循环畅通，并且在肾脏表面显示灌注缺损。加入到离体系统的纤溶药物和嘌呤药物(腺苷三磷酸双磷酸酶-CD39/CD73)没有显著改善血管阻力和流量。

实施例3

在另一个实验中，重复实施例2中的方案，但是没有给予腺苷三磷酸双磷酸酶。取而代之的是，将利多卡因添加到灌注溶液中。该想法是为了研究在修复阶段的稳定效果，这一效果是利多卡因已经显示出具有对Na+K+泵的影响的结果。溶液的组成可见于表D。

图9示出了在最初90分钟内不变的流量，而其通常是下降的。此外，尽管渗透压为330mosm，并且钾水平为约5mmol/L，但在修复的不同阶段之间重量变化极小。在实施例2中，从灌注开始到90分钟的再灌注后结束，肾脏的重量明显增加。

实施例4

将7只猪麻醉，并允许它们达到正常换气，然后关闭呼吸机。心脏停搏在约15分钟后出现。在室温两小时后，将冷保存溶液(盐水)置于腹腔和胸腔中。

每只猪的双肾的取回在死亡后4小时开始。

如实施例2描述，通过肾动脉向每个肾脏注射用0.9％盐水稀释至20ml的10ml的0.5％至1％的利多卡因中的约500U肝素后，在后桌用冷林格溶液冲洗肾脏。所用溶液的组成可见于表E。

首先在15℃和20mmHg的压力离体灌注肾脏30分钟。然后，从O₂(20％)、CO₂(5.6％)和N₂(74.4％)的气体混合物开始，对灌注溶液进行氧合。1小时后，将溶液交换成具有根据表E的组成的新溶液，温度升高至32℃，并且压力调节至30mmHg。加入经洗涤的过滤掉白细胞的RBC至hct为约10至15，然后在5小时内灌注。然后从灌注系统中取出一个肾脏，移植(n＝7)到受者猪体内，并观察90分钟至长达8小时。将离体灌注系统中剩余的肾脏再灌注90分钟进行比较。

图10示出了移植后的肾动脉血流。肾脏正常工作，产生尿液，持续超过10小时(n＝3)。只有少数动物被追踪长达10小时，这解释了增加的血流扩散(increased spread inflows)。实验结束时猪仍处于麻醉。

实施例5

在另一个实验中，根据与实施例4相同的方案进行处理(n＝5)，但是离体灌注持续11小时而不是6小时。再灌注时的流量为104ml/min，并且再灌注后14.5小时流量为109ml/min。因此，即使延长灌注时间也可以导致明显的流，从而留出时间运输肾脏并等待接受者到达。

实施例6

在另一个实验中，7只猪根据与实施例4相同的方案被宣布死亡。热缺血时间(WIT)为4小时至6小时。

在死亡后4小时开始取回每只猪的双肾。

离体灌注在15℃开始。在第一个小时内，使用72g白蛋白/L(根据表E的溶液)，并且在灌注期间压力为20mmHg。氧合在30分钟后开始。1小时后，排出溶液，并且在将温度升至32℃、压力升至30mmHg和加入RBC后的2小时内，使用具有80g白蛋白/L的新溶液(根据表F的溶液)。

图11示出了移植后的肾动脉血流。所有7个肾脏在肾移植后4小时(118.7±15.0ml/min)和8小时(85.0±10.5ml/min)表现出良好的流量，并保持了尿产生。实验在8小时后结束，猪仍处于麻醉。虽然在观察期间流量在下降，但在观察结束时肾脏仍有良好的流量。伦理许可不允许我们让猪醒来。

实施例7

在另一个实验中，4只猪根据与实施例4相同的方案被宣布死亡。2小时后在腹部使用冰进行局部冷却，导致体温从37℃变化至约20℃，相比之下，使用流体作为冷却剂体温变化至25℃至29℃。

取回肾脏，由此WIT在4小时至5小时之间变化。

用表G中描述的溶液与作为高渗剂的57g白蛋白/L的组合物冲洗肾脏。在离体装置中使用20mmHg至高达70mmHg的压力冲洗肾脏，每5分钟压力升高5mmHg，并且温度为18℃，直到肾脏变白。平均需要2升到3升的溶液和长达50分钟以获得良好灌注的肾脏。

使用相同的溶液，温度降低到12℃，并且肾脏在1小时内以20mmHg灌注。然后将溶液变成包含80g白蛋白/L的溶液，如表F所示，温度28℃，并且压力为30mmHg。添加RBC至最终hc为约10至15。用这种溶液灌注肾脏持续2小时。然后将温度升至32℃，并且再灌注肾脏持续1小时，然后排空系统并再次加入最初使用的包含57g白蛋白/L的溶液。用这种溶液在15℃和20mmHg的压力继续灌注30分钟，然后移植。

图12示出了移植后的肾动脉流量。可以在取回后仔细冲洗肾脏后实现再灌注后的高流量。接受者中的尿液产生可以维持延长的时间，但在延长的观察时间后下降，表明用几升的体积冲洗可能会由于内皮活化而对后期结果产生负面影响。尽管如此，在4小时(145.7±29.3ml/min)和8小时(96.73±12.8ml/min)时，流量好于如之前的实施例1-5中用装入腹腔和胸腔中的冷保存溶液的局部冷却达到25℃至29℃温度。由于伦理许可，实验结束时猪仍处于麻醉状态。

实施例8

在另一个实验中，8只猪如以上实施例4描述的被宣布死亡，然而，没有给予局部冷却。

肾脏在死亡后4小时取回并在后桌上用200至500ml的Perfadex灌注。所有均表现为不良灌注至中度不良灌注以及畅通度差的肾脏。

然后立即将肾脏移植到肾切除的猪身上。再灌注时的平均流量为14.15ml/min，并且在90分钟时平均流量为36.8ml/min。在90分钟时所有肾脏看起来呈蓝色/黑色，最后没有尿液产生。本实验用作对照，表明在没有任何冷却程序和例如根据本发明的实施方案的其他处理的情况下，4小时的WIT导致移植环境中的不良表现，与先前的经验一致。

实施例9

在另一个实验中，6只猪被使用上述技术宣布死亡。2小时后，使用插入腹部的冰泥进行局部冷却，导致体温从37℃变化至约10℃至12℃，相比之下，使用流体作为冷却剂导致体温变化至25℃至29℃，以及使用冰导致体温变化至20℃。

取回肾脏，WIT在4至5小时之间变化。

在后桌上且在取回后，在夹住静脉后，通过肾动脉将20ml包含与10Ulys-纤溶酶原和200U抗凝血酶III(ATIII)混合的72g/L白蛋白溶液(表I)的溶液注射到每个肾脏中，并且然后在递送溶液后夹住动脉。

肾脏被移至离体装置。15分钟后，注射在稀释到20ml包含72g/L白蛋白溶液(表I)的溶液中后分成4份5ml的1mg tPA(alteplas)和100U ATIII到每个肾中。在20℃的温度，从20mmHg开始并且每次增加5mmHg，间隔5分钟将tPA注射到肾动脉中。

完成tPA输注后，用包含72g白蛋白/L的溶液灌注肾脏，并且压力以每5分钟5mmHg增加，最高达50mmHg至70mmHg，或直到肾脏畅通，以先到者为准。然后将温度降至12℃，并在20mmHg的灌注压力继续灌注1小时。

在用包含57g/L白蛋白的溶液(表H)冲洗后，通过动脉给予在具有57g白蛋白/L的溶液中稀释的第二剂lys-纤溶酶原以及随后的tPA和ATIII，并如上文描述的依次给予。

然后，继续灌注持续30分钟，压力20mmHg，温度12℃。将温度升高至28℃，并且将压力升高至30mmHg，然后添加RBC至hct为5至10。RBC已经用外部泵预处理了2小时，并在加入到溶液之前循环通过白细胞过滤器。这样做是为了在接触肾脏之前减少白细胞。使用合并的白蛋白溶液(57g白蛋白/L，表H)和RBC继续灌注1小时。然后在评估过程中将温度升至37℃，并且压力升至70mmHg至90mmHg，持续1小时。在从肾脏冲洗掉包含RBC的溶液后，注入新的57g/L白蛋白溶液，并将温度降至15℃，进行移植。

向其中在临进行肾移植之前对自体肾脏进行肾切除的猪进行移植。三只动物被允许从麻醉中醒来(新的伦理许可允许十天的观察)。在第三天对一只动物进行了探查，用于检查肾脏和新的血液样本。给予的唯一免疫抑制是再灌注时的甾体。肾脏看起来良好，血液中的肌酐为615μmol/L。在第4天探查另一只猪，肾脏也看起来良好，血液中的肌酐为884μmol/L。第三只猪从第5天开始取样，并且总共跟踪8天。所有三只猪均表现出移植物功能延迟(delayed graft function，DGF)的迹象，在一例中造成尿毒症并在8天后死亡，在另外两例中，动物在第3天和第4天处死，具有升高的血液中的肌酐和更高的尿液中的肌酐作为浓缩尿液的能力的标志。

图13示出了再灌注后和90分钟后六只猪中的每一只的动脉流量。加入lys-纤溶酶原和tPA能比之前所见更好地使肾脏畅通，具有降低阻力和改善微循环的结果。

图14示出了一些肾脏在再灌注后在表面显示出斑块，有时在移植后几小时发展为蓝色/黑色的灌注不良的肾脏，表明由于凝血系统导致血栓再形成或血小板/RBC诱导的对内皮的作用。

实施例10

在另外三只猪中重复实施例9中的方案，除少数例外。

取回后并且在后桌上，如上文所述进行lys-纤溶酶原注射。15分钟后，将500ml包含57g白蛋白/L的溶液(表H)中的2mg tPA(alteplas)冲洗通过肾脏，然后将肾脏送至离体装置。

在离体装置，在24℃，使肾脏灌注包含72g/L白蛋白的溶液(表I)，压力从20mmHg增加到50mmHg与70mmHg之间。使用相同溶液，在12℃和20mmHg的压力继续灌注持续2小时。

在排液和冲洗后，将包含57g白蛋白/L的溶液(表H)与经洗涤的RBC一起加入至hct为约5至10，温度变化至28℃，压力变化至30mmHg。加入新剂量的lys-纤溶酶原、tPA 2mg和ATIII 200U，并且将温度升至32℃，然后在70mmHg的压力灌注15分钟以进行评估。冲洗和洗涤后，加入包含57g/L白蛋白的溶液(表H)并将温度降至15℃。将所有三只猪去麻醉并观察。两只动物存活了10天，在实验结束时一只具有166μmol/L的血液中的肌酐并且另一只具有174μmol/L的血液中的肌酐，肾脏外观正常。第三只猪具有移植物功能延迟，在第6天被处死，具有1231μmol/L的血液中的肌酐，但尿液中的肌酐超过2000μmol/L，显示出浓缩尿液的能力。所有接受者都接受甾体作为唯一的免疫抑制的手段。收集样本用于同种异体排斥的组织学研究。

图15a示出了移植10天后外观正常的肾移植物。没有肉眼可见的排斥迹象。

图15b示出了图15a中的移植肾的切面，示出了正常的肉眼可见的结构。

图15c示出了存活10天的第二个肾的表面，示出了黑斑区域，指示受影响的微循环。

图15d示出了图15c中的移植肾的切面，示出了下极中受影响的循环的黑暗区域。数据表明，处理可以恢复功能和结构，尽管仍存在微循环局部损伤的风险。

实施例11

在包括19只猪的进一步实验中，在三组中测量了细胞因子水平。在组A(n＝5)中，包括用没有任何细胞因子吸附器的72g/L白蛋白溶液(表I)灌注的活体捐献者的肾脏，在灌注开始、3小时和37℃结束时取样。在组B(n＝5)中，包括用没有任何细胞因子吸附器的57g/L白蛋白溶液(表H)灌注的活体捐献者的肾脏，在灌注开始、3小时和37℃结束时取样。在组C(n＝9)中，包括在RBC之前和在37℃灌注之前用72g/L白蛋白溶液灌注90分钟和用57g/L白蛋白灌注90分钟的DCD肾，在所有这些过程中使用细胞因子吸附器(Cytosorb,Cytosorbents)。使用ELISA试剂盒(Quantikine ELISA kit,R&D Biosystems)进行分析。将低于检测水平的水平设置为0，并且然后计算各组内测量水平的平均水平。

图16a是示出了主要来自RBC的IL-6水平的变化的图。吸附器(组C)有效地去除了IL-6的所有迹象。

图16b是示出了IL-8水平的变化的图，IL-8水平也主要来自RBC，并且来自57g/L白蛋白溶液的IL-8水平低于来自72g/L白蛋白溶液的IL-8水平。吸附器去除了IL-8(组C)。

图16c是示出了也主要来自RBC的IL-1β水平的变化的图。吸附器再次去除了由肾脏本身或加入的RBC贡献的细胞因子的所有迹象。

图16d是示出了也主要来自RBC的TNF-α水平的变化的图。吸附器再次去除了由肾脏本身或加入的RBC贡献的细胞因子的所有迹象。未显示的数据包括IL-10水平的分析，在IL-10水平的分析中，在任何组中都没有检测到任何水平。

实施例12

在另一个实验中，根据上述方案宣布猪死亡，2小时后用冰泥局部冷却，并且4小时后开始肾取回。

取回肾的WIT为4.5小时至5小时。

在后桌上，肾脏被注射各自在15ml溶液中的10U lys-纤溶酶原和2mg tPA。

将肾脏布置在离体装置中并灌注。灌注溶液包含表J中所示的成分，白蛋白浓度为57g白蛋白/L，并且压力以每5分钟5mmHg从20mmHg升高至70mmHg。在灌注阶段(20℃)期间，使用了600U ATIII和2mg阿昔单抗(血小板抑制剂)。

在排液和用250ml根据表J的具有57g白蛋白/L的溶液冲洗两次后，在15℃用根据表J的具有57g白蛋白/L的溶液继续灌注2小时。

然后，压力升高至30mmHg，并且温度升高至28℃，接着灌注30分钟，随之加入RBC。在与溶液混合之前，RBC已经用800U ATIII和2mg阿昔单抗进行预处理并灌注通过白细胞过滤器。经过处理，肾脏完全畅通，没有斑块或受影响的循环。

移植肾脏并且两只猪被追踪7天，然后处死。一只肾脏具有感染。两只猪在第7天都具有升高的肌酐，血液中的肌酐为1115μmol/L、1305μmol/L，尿液中的肌酐为1790μmol/L、4530μmol/L——这可以被解释为DGF但是浓缩尿液的肾功能得到改善的迹象。

图17是示出了用具有约300mosm渗透压的溶液灌注并加入ATIII和血小板抑制剂后的流量的图。该图示出了比之前的实验中见到的更高的再灌注时的初始流量。

实施例13

在另一个实验中，使用了与实施例12相似的方案。

在后桌上，肾脏被注射各自在15ml溶液中的15U lys-纤溶酶原和3mg tPA。

将肾脏布置在离体装置中并用包含表J中所示的成分、白蛋白浓度为57g白蛋白/L的溶液灌注。在灌注阶段(20℃)期间，使用了600U ATIII和3mg阿昔单抗。压力以每5分钟5mmHg从20mmHg升高至70mmHg。

在排液和用250ml根据表J的具有57g白蛋白/L的溶液冲洗两次后，在15℃用根据表J的具有57g白蛋白/L的溶液继续灌注2小时。在这一阶段加入了另外剂量的600U ATIII和3mg阿昔单抗。

然后，压力升高至30mmHg，并且温度升高至28℃，接着灌注30分钟，随之加入RBC。在与溶液混合之前，RBC已经用800U ATIII和3mg阿昔单抗进行预处理并灌注通过白细胞过滤器。

灌注2.5小时后，在30mmHg压力的流量从147ml/min降至138ml/min，并且阻力增加。向溶液中加入另外的800U ATIII和3mg阿昔单抗。流量和阻力保持恒定持续30分钟，并且然后流量增加并且阻力减小。

实施例14

在另一个包括6只猪的实验中，使用了以下方案。

首先，活体捐献者的右肾被取出并丢弃，而捐献者的左肾被留下工作。

其次，取回接受者的左肾，并直接移植到右肾已被取出的活体捐献者。

关闭接受者的腹部并让接受者处于睡眠状态等待之后的移植，并且接受者的右肾仍在工作。

在活体捐献者中，移植到捐献者的接受者的左肾重新灌注捐献者的血液，并观察直到它产生尿液。关闭捐献者的腹部。

然后，像之前的实施例一样产生捐献者的心脏停搏。

移植到捐献者的接受者的左肾在经过4.5小时至5小时的WIT后取回。

在后桌上，向肾脏注射20U Lys-纤溶酶原和600U ATIII，同时保持动脉和静脉被夹住。15分钟后，将4mg tPa与另外的600U ATIII一起注射。15分钟后，将肾脏连接至离体灌注机。

在离体灌注机中，用根据表K的具有57g白蛋白/L的溶液灌注肾脏。在70mmHg的压力灌注5分钟后，将灌注压力降低至30mmHg并且灌注肾脏30分钟。然后，将压力降至20mmHg并且将温度降至15℃，并且灌注肾脏2小时。

同时，在室温将经洗涤的RBC循环通过外部白细胞过滤器持续1小时。向循环的RBC中加入1000U ATIII、3mg阿昔单抗和4mg阿加曲班(直接抗凝血酶抑制剂)。

用NaCl和根据表K的溶液冲洗吸附细胞因子的过滤器和吸附内毒素的-过滤器，并且然后连接到灌注机上。

灌注溶液的温度升高至28℃并且压力升高至30mmHg，持续30分钟。将上述RBC加入到溶液中并连接过滤器，例如如图5所示的。将环境稳定在28℃后，将温度升高至32℃。在此温度灌注肾脏持续3小时。

然后，向溶液中加入1000U ATIII、3mg阿昔单抗和8mg阿加曲班。在32℃灌注1.5小时后，向溶液中加入1.5mg阿昔单抗、4mg阿加曲班和1000U ATIII。然后将温度降至15℃以及压力降至20mmHg，并灌注肾脏30分钟。

然后取出肾脏并将接受者肾脏移植回接受者体内，并取出留存的接受者自体肾脏。可以在图18中看到流速和阻力。

实施例15

在另一个包括9只猪的实验中，使用了与实施例14相同的方案。

移植到捐献者的接受者的左肾在4.5小时至5小时的WIT后取回。

在后桌上，向肾脏注射30U Lys-纤溶酶原和600U ATIII，同时保持动脉和静脉均被夹住。15分钟后，与另外的600U ATIII一起注射6mg tPa。再过15分钟后，将肾脏连接到灌注机。

在离体灌注机中，用根据表K的具有57g白蛋白/L的溶液灌注肾脏。在75mmHg的压力灌注5分钟后，将灌注压力降低至25mmHg并且灌注肾脏30分钟。将压力降低至20mmHg并将温度降低至15℃，并且灌注肾脏2小时。

同时，在室温将经洗涤的RBC循环通过外部白细胞过滤器持续1小时。向循环的RBC中加入1000U ATIII、3mg阿昔单抗和4mg阿加曲班。

用NaCl和根据表K的溶液冲洗吸附细胞因子的过滤器和吸附内毒素的-过滤器，并且然后连接到灌注机上。

将灌注溶液的温度升高至28℃并且将压力升高至30mmHg，持续30分钟。将上述RBC加入到溶液中并连接过滤器。将环境稳定在28℃后，将温度升高至32℃。在此温度灌注肾脏持续3小时。

然后，向肾脏中加入1000U ATIII、3mg阿昔单抗和8mg阿加曲班。在32℃灌注1.5小时后，向肾脏中加入1.5mg阿昔单抗、4mg阿加曲班和1000U ATIII。

实施例16

在包括8只猪的另一个实验中，类似于实验15，根据与前述实施例14和15相同的方案处理猪。移植后，猪然后被允许从麻醉中恢复，并追踪长达三个月。追踪在10天和3个月时血浆中的肌酐以及同一时间点时尿液中的肌酐，数据如图19至图22所示。肌酐在第一周内正常化并在存活三个月期间保持正常，无需透析。图23示出了一个典型的肾脏，在修复和移植后三个月被探查，灌注良好，没有纤维化或萎缩的迹象。在图24中，肾脏被摘取并沿着弯曲切开，显示正常的肾实质。

讨论

在实施例1中，使用包含最低必需培养基(MEM)和白蛋白作为高渗剂的溶液，研究了修复来自在循环死亡(DCD)后经受热缺血时间(WIT)超过4小时的捐献受试者的肾脏的基本原理。离体常温灌注导致比LifePort(LP)或冷藏(CS)保存的对照显著更好的血流和尿液产生。

在实施例2中，在应用肝素、腺苷三磷酸双磷酸酶(一种从组织中去除ATP的嘌呤抑制剂)和tPA(alteplas)(注射在动脉中和注射在灌注溶液中)后，使用类似组合的灌注溶液充分冲洗取回的DCD肾脏略微改善了血管阻力和血流，并且没有完全使肾脏畅通。腺苷三磷酸双磷酸酶可以在已经清除了微循环的纤维蛋白凝块后被递送到肾脏。

在实施例3中，加入利多卡因，这改善了90分钟时的血流，表明可能通过抑制Na+K+泵稳定膜功能。

在实施例4中，还注意到在32℃使用RBC的延长时间灌注是可能的，一些肾脏在移植入接受者猪后被观察持续8小时，并且在接下来的实施例5中，灌注时间延长至11小时，在移植的肾脏中保持功能。

在实施例6中，发现具有更高胶体渗透压的剂(白蛋白80g/L)在WIT 4小时至6小时的情况下产生具有高于115ml/min的良好肾流量的肾脏。移植后接受者被追踪持续8小时。

在实施例7中，死亡后2小时的局部冷却从林格溶液改变为冰。这将核心体温降低至20℃，相比之下，使用冷的林格将核心体温降低到25℃至29℃。血流在移植后4小时和8小时都显著改善。

参见实施例8，没有接受局部冷却并且仅接受后桌灌注的猪在再灌注时(14.15ml/min)或在90分钟时(36.8ml/min)没有表现出良好的流量。

在实施例9和实施例10中，改变温度和胶体渗透压以及引入冰泥代替常规冰。现在在摘取之前，可以达到低至10℃到12℃的体温。通过用lys-纤溶酶原联合tPA处理肾脏，使肾脏更好地畅通并且血管阻力大大改善。给予ATIII以防止经受纤维蛋白溶解处理的血管的血栓再形成。我们使用了alteplas，但可以使用任何纤维蛋白溶解剂，如链激酶、尿激酶、瑞替普酶和替奈普酶。这种修改比之前实施例中所示更好地使肾脏畅通。在移植时对本体肾脏进行了肾切除术后，这些肾脏中的一些肾脏存活了10天，具有功能正常的肾脏，证明了来自死亡后4小时的DCD捐献者的肾脏可以被使用。发现评估期期间的RBC处理可能有助于释放细胞因子，诸如IL-6、IL-8、IL-1β和TNF-α，它们全部参与炎症事件和缺血再灌注。通过使用特定的吸附器(Cytosorb)，可以完全去除这些细胞因子，参见实施例11。

在接下来的实施例12和实施例13中，我们注意到在保存溶液和RBC与灌注溶液混合之前，加入到保存溶液和RBC中的血小板抑制剂，诸如阿昔单抗产生非常好的流量。此外，通过向溶液中加入ATIII和阿昔单抗可以改善RBC延长灌注期间增加的血管阻力的迹象，表明在纤维蛋白溶解结束后，需要通过凝血系统和血小板粘附来防止血栓再形成。与之前的实施例相比，在这些实施例中增加了ATIII的剂量。

在实施例14和实施例15中，通过添加直接凝血酶抑制剂如阿加曲班，结果得到进一步改善，避免了RBC阶段期间流量减小和血管阻力增加的风险。

在实施例16中，我们成功移植了根据实施例14和实施例15修复的肾脏，并对它们进行了长达3个月的跟踪，证明修复的肾脏在相关临床环境中也是有功能的。实施例14、15和16中使用的新移植模型意味着由于在诱发心脏死亡之前移植的肾脏最初是从接受者转移到捐献者的事实，消除了同种异体排斥机制。尽管事实上修复的肾脏是接受者猪的唯一的肾功能，但猪在不需要透析的情况下存活。

在权利要求中，术语“包含(comprises/comprising)”不排除其他要素或步骤的存在。此外，尽管单独列出，但是多于一个方法、要素或方法步骤可以由例如单个单元实现。另外，尽管单个特征可以包括在不同的权利要求或实施方案中，这些特征可以尽可能有利地组合，并且包括在不同的权利要求中并不意味着特征的组合是不可行的和/或不利的。此外，单数引用不排除复数。术语“一(a)”、“一(an)”、“第一(first)”、“第二(second)”等。不排除多于一个。权利要求中的附图标记仅仅是作为说明性的示例提供，并且不应该被解释为以任何方式限制权利要求的范围。

尽管以上已经参考具体实施方案和实验描述了本发明，但是本发明并不局限于本文阐述的具体形式。相反，该发明仅受所附权利要求的限制，并且在这些所附权利要求的范围内，除了以上指定的实施方案之外的其他实施方案同样是可能的。

Claims (30)

1.一种用于在从死亡捐献者摘取之后并且在移植到另一主体之前恢复肾脏的方法，所述方法包括：

在摘取后向所述肾脏提供lys-纤溶酶原，其中所述肾脏在所述捐献者的循环停止后至少两小时从所述捐献者取回，并且其中所述lys-纤溶酶原包含在第一高渗流体中；

在提供lys-纤溶酶原的同时或在提供lys-纤溶酶原之后，提供组织纤溶酶原激活物(tPA)，其中所述组织纤溶酶原激活物包含在第二高渗流体中；

在第一恢复步骤中，在5℃与25℃之间的低温，使第三高渗流体循环通过所述肾脏，所述第三高渗流体包含白蛋白和电解质；

在第二恢复步骤中，在30℃至37℃之间的温度，使第四高渗流体循环通过所述肾脏，所述第四高渗流体包含红细胞(RBC)；

评估所述肾脏的移植适用度。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述捐献者是心脏停搏的捐献者(DCD)。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第一恢复步骤包括：

使所述第三高渗流体循环通过所述肾脏，其中所述第三高渗流体包含浓度在50g/L与120g/L之间的白蛋白，由此使循环压力在30分钟至75分钟内升高。

4.根据权利要求3所述的方法，其中循环压力从20mmHg升高至90mmHg。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其中循环压力以每5分钟5mmHg的步幅升高。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述第二恢复步骤包括：

使所述第四高渗流体循环通过所述肾脏，其中所述第四高渗流体包含浓度在50g/L与120g/L之间的白蛋白，由此使循环压力在30分钟至75分钟内升高。

7.根据权利要求6所述的方法，其中循环压力从20mmHg升高至90mmHg。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其中循环压力以每5分钟5mmHg的步幅升高。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括：

在4℃与16℃之间的低温存储所述肾脏，同时在低于30mmHg的压力，在1小时与7小时之间的时间内使保存流体循环通过所述肾脏。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述存储步骤在所述第二恢复步骤之后进行或在所述第一恢复步骤和所述第二恢复步骤之间进行。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一高渗流体和所述第二高渗流体中的至少一种包含白蛋白和生理浓度的电解质。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述第一高渗流体和所述第二高渗流体包含浓度在50g/L与120g/L之间的白蛋白。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一高渗流体、所述第二高渗流体、所述第三高渗流体和所述第四高渗流体中的至少一种还包含以下中的至少一种：凝血抑制剂；直接凝血酶抑制剂；蛋白质C；蛋白质S；和血小板抑制剂。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述凝血抑制剂是抗凝血酶III。

15.根据权利要求13或14所述的方法，其中所述直接凝血酶抑制剂是阿加曲班。

16.根据权利要求13-15中任一项所述的方法，其中所述血小板抑制剂是阿昔单抗。

17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第三高渗流体和所述第四高渗流体中的至少一种被循环通过白细胞过滤器。

18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第三高渗流体和所述第四高渗流体中的至少一种与细胞因子吸附器接触，用于吸附细胞因子。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述细胞因子吸附器是Cytosorbent。

20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第三高渗流体和所述第四高渗流体中的至少一种与内毒素吸附器接触，用于吸附内毒素。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述内毒素吸附器是LPS Adsorber。

22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述肾脏在所述捐献者的循环停止至少三小时后从所述捐献者取回，并且其中所述至少三小时包括通过装入所述捐献者的腹部的冷盐水、冰或冰泥进行的不超过两小时的局部冷却。

23.一种用于在从死亡捐献者摘取之后并且在移植到另一主体之前恢复肾脏的方法，所述方法包括：

摘取后向所述肾脏提供lys-纤溶酶原，其中所述肾脏在捐献者的循环停止后至少4小时从所述捐献者取回，并且其中所述lys-纤溶酶原包含在第一高渗流体中，所述第一高渗流体包含凝血抑制剂和浓度在50g/L与70g/L之间的白蛋白；

在提供lys-纤溶酶原的同时或在提供lys-纤溶酶原之后，向所述肾脏提供组织纤溶酶原激活物(tPA)，其中所述组织纤溶酶原激活物包含在第二高渗流体中，所述第二高渗流体包含凝血抑制剂和浓度在50g/L与70g/L之间的白蛋白；

在第一恢复步骤中，在5℃与25℃之间的低温，在使压力从20mmHg升高至70mmHg与90mmHg之间的同时，使第三高渗流体循环通过所述肾脏，所述第三高渗流体包含电解质和凝血抑制剂以及浓度在50g/L与120g/L之间的白蛋白；

在第二恢复步骤中，在30℃至37℃之间的温度，使第四高渗流体循环通过所述肾脏，所述第四高渗流体包含红细胞(RBC)、电解质和凝血抑制剂以及浓度在50g/L与120g/L之间的白蛋白；

评估所述肾脏的移植适用度。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述捐献者是心脏停搏的捐献者(DCD)。

25.根据权利要求23或24所述的方法，其中所述凝血抑制剂是抗凝血酶III。

26.流体在根据权利要求1至25中任一项所述的方法中的用途，所述流体包含以下的至少一种：lys-纤溶酶原和组织纤溶酶原激活物(tPA)。

27.装置用于执行根据权利要求1至25中任一项所述的方法的用途。

28.根据权利要求27所述的用途，其中所述装置被构建用于：

在摘取后向所述肾脏提供lys-纤溶酶原，其中所述lys-纤溶酶原包含在第一高渗流体中；

在提供lys-纤溶酶原的同时或在提供lys-纤溶酶原之后，提供组织纤溶酶原激活物(tPA)，其中所述组织纤溶酶原激活物包含在第二高渗流体中；

在第一恢复步骤中，在5℃与25℃之间的低温，使第三高渗流体循环通过所述肾脏，所述第三高渗流体包含白蛋白和电解质；

在第二恢复步骤中，在30℃至37℃之间的温度，使第四高渗流体循环通过所述肾脏，所述第四高渗流体包含红细胞(RBC)。

29.根据权利要求27或28所述的用途，其中所述装置包括：

容器(31)，用于容纳待处理的肾脏；

连接件(32)，用于连接到具有静脉开口的所述肾脏的动脉；

循环泵(43)，所述循环泵(43)连接在所述容器和所述连接件(32)之间，用于使存在于所述容器中的流体循环通过所述肾脏；

排液袋(41)，所述排液袋(41)经由排液阀(42)连接到所述容器；

至少一个袋(50，51，52，53，54)，所述袋经由流体阀门(55，56，57，58，59)连接到所述容器(31)，用于向所述容器提供流体；

氧合器(47)，用于使所述循环泵(43)泵送的流体氧合；

加热器/冷却器(48)，用于控制所述循环泵泵送的流体的温度；

白细胞过滤器(49)，用于去除所述循环泵泵送的流体中的白细胞；

内毒素吸附器(95)，所述内毒素吸附器(95)被布置成去除所述容器的流体中的内毒素；

细胞因子吸附器(96)，所述细胞因子吸附器(96)被布置成去除所述容器的流体中的细胞因子；和

白细胞过滤器(98)，所述白细胞过滤器(98)被布置成去除所述容器的流体中的白细胞。

30.流体用于执行根据权利要求1至25中任一项所述的方法的用途，其中所述流体包含lys-纤溶酶原；组织纤溶酶原激活物(tPA)；电解质；和浓度在50g/L与120g/L之间的白蛋白。